KR20160106108A - 치료제를 평가하고 전이 능력을 예측하기 위해 침습성 및 전이성 세포를 분리하기 위한 방법 및 장치 - Google Patents

치료제를 평가하고 전이 능력을 예측하기 위해 침습성 및 전이성 세포를 분리하기 위한 방법 및 장치 Download PDF

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제트프리딕타, 인코포레이티드
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Abstract

실시형태는 원발성 종양 부위, 이차성 먼 장기 및 순환계의 사람의 미소환경을 시험관내 의태하는 조립체를 제조하는 방법을 제공한다. 전이성 암에 적용되었을 때 치료제 효능의 평가 및 진단에 사용될 수 있도록 원발성 종양, 침습성, 및 전이성 세포의 분리를 위한 플랫폼을 제공하는 방법 및 장치가 또한 제공된다.

Description

치료제를 평가하고 전이 능력을 예측하기 위해 침습성 및 전이성 세포를 분리하기 위한 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR ISOLATING INVASIVE AND METASTATIC CELLS FOR EVALUATING THERAPEUTICS AND PREDICTION OF METASTATIC CAPACITY}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2014년 1월 22일자로 제출된 미국 임시 출원 No. 61/930,390 및 2015년 1월 6일자로 제출된 No. 62/100,375의 이익을 주장하며, 이들은 그 전체가 여기 참고로 포함된다.
기술분야
여기 실시형태들은 세포를 배양하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 원발성, 인시튜, 침습성, 전이성, 및 재발성 암을 위한 암 치료제의 조사 및 진단 및 예후예측 전략의 개발을 위해 원발성 종양 부위, 먼 전이성 부위, 및 순환계의 사람의 미소환경을 의태하는 조건하에서 암세포를 배양하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
전이는 복잡한 다단계 과정으로서, 이에 의해서 악성 세포가 원발성 종양으로부터 벗어나 조직의 기저막으로 침투하여 정착-독립 조건하에 순환계에서 생존하며, 이차성 부위에서 외부 미소환경을 콜로니화한다(Gupta GP, et al., Cell, 127: 679 (2006); Mehlen P, et. al., Nature Reviews Cancer, 6:449 (2006)).
전이는 암과 관련된 상당한 이환율을 초래하며, 암-관련 사망의 90%를 차지한다(Gupta GP, et al., Cell, 127:679 (2006); Mehlen P, et al., Nature Reviews Cancer, 6:449 (2006)). 새로운 치료 전략의 개발에도 불구하고 대부분의 암에서 먼 부위 전이를 나타내는 환자의 5년 생존율은 30 퍼센트 이하로 유지된다(Society AC. Cancer Facts & Figures, American Cancer Society (2013)). 전이로 인한 이러한 높은 사망률의 그럴듯한 이유는 효과적인 치료제 및 상당히 약물 내성이며 전이성인 세포를 구체적으로 확인하여 표적화하는 조기 진단 전략의 부재이다.
이차성 부위를 성공적으로 콜로니화하기 위해 전이성 세포는 이들의 생존 및 성장을 지원하는 틈새를 찾아야 한다. 이러한 틈새는 특정 조직의 세포외 바탕질, 기질, 면역, 및 다른 세포 성분, 및 분비된 인자들로 이루어진다.
스크래치 분석, 트랜스웰 이주 분석, 및 침습 분석과 같은 시험관내 방법들은 고상 기질층 상에서 또는 고상 기질층을 통하여 세포가 이주하는 능력을 평가할 뿐이며, 순환계를 통한 전이성 전파에 필요한 정착-독립을 설명하지는 않는다(Kam Y, at al., BMC Cancer, 8:198 (2008); Kramer N, et al., Mutation Research/ Reviews in Mutation Research (2012); Liang C-C, et al., Nature Protocols. 2: 329 (2007)). 또한, Matrigel 침습과 같은 침습 분석은 원발성 부위와 이차성 부위의 세포외 바탕질 조성의 차이를 설명하지 못한다(Ioachim E, et al., European Journal of Cancer, 38:2362 (2002)). 이런 단점은, 둘 다에 대해서는 아니어도, 원발성 부위로부터 종양 세포의 전파나 이차성 장기의 침습의 연구에서 표준 시험관내 방법의 사용을 상당히 제한한다. 전이의 마우스 모델은 이들이 사람의 질환을 충실히 설명하지 않기 때문에 전임상 사용에는 똑같이 불충분하다.
본 개시는 원발성 종양 부위, 이차성 먼 장기, 및 순환계의 사람의 미소환경을 시험관내 의태하는 포괄적 시스템인 세포 배양 조립체에 관한 것이다. 이 세포 배양 조립체는 여기서 때로 재구성된 전이 모델 또는 "rMrt" 시스템, 배양, 플랫폼 또는 모델로서 언급된다. 여기 제공된 데이터는 rMet 시스템이 종양형성(즉, 원발성 종양, 침습성, 전이성 및 재발성 암)의 모든 단계를 설명한다는 것과, 전이성 전파의 주요 단계가 1) 원발성 부위를 벗어나고, 2) 기저막으로 침투하고, 3) 정착-독립 조건하에 생존하고, 및 4) 이차성 부위의 침습/콜로니화임을 나타낸다. 또한, rMet 시스템은 원발성 부위와 이차성 부위 모두의 세포외 바탕질을 고려하여 설계되며, 이로써 현재 사용되는 시스템의 주요 제한들을 극복한다.
한 실시형태에서, a) 척추동물로부터 유래된 유체와 선택적으로 원발성 부위 성장 바탕질을 포함하는 제1 성분, b) 생물학적 바탕질 의태물을 포함하는 제2 성분, 및 c) 척추동물로부터 합성되거나 유래된 이차성 부위 성장 배지를 포함하는 동적 유체 성분을 포함하는 세포 배양 조립체가 제공되며, 여기서 유체 성분은 제1 및 제2 성분과 유체 접촉한다. 일부 실시형태에서, 이차성 부위 성장 배지는 유체보다 높은 혈청 농도를 가진다. 예를 들어, 이차성 부위 성장 배지는 10-30% 범위의 혈청(또는 혈청 대용물이나 혈청 치환물) 농도를 가질 수 있지만, 유체는 0% 내지 5%의 혈청 농도를 가진다.
다른 실시형태에서, a) 여기 설명된 세포 배양 조립체에 잠재적 항암 치료제를 포함하는 용액을 가하는 단계로서, 여기서 세포 배양 조립체의 제2 성분은, 제한은 아니지만 원발성 종양 세포, 침습성 세포, 및/또는 전이성 세포를 포함하는 암세포의 검출가능한 양을 포함하는 단계, b) 잠재적 항암 치료제를 가하기 전후에 세포 배양 조립체에 존재하는 원발성 종양 세포, 침습성 세포, 및/또는 전이성 세포의 양을 검출하는 단계, 및 c) 잠재적 항암 치료제를 확인하는 단계를 포함하는 항암 치료제를 확인하는 방법이 제공된다.
다른 실시형태에서, a) 여기 설명된 세포 배양 조립체의 제1 성분에 잠재적 항암 치료제를 포함하는 용액을 가하는 단계로서, 여기서 세포 배양 조립체의 제2 성분은, 제한은 아니지만 원발성 종양 세포, 침습성 세포, 및/또는 전이성 세포를 포함하는 암세포의 검출가능한 양을 포함하는 단계, b) 잠재적 항암 치료제를 가하기 전후에 제2 성분에 존재하는 원발성 종양 세포, 침습성 세포, 및/또는 전이성 세포의 양을 검출하는 단계, 및 c) 잠재적 항암 치료제의 효능을 확인하는 단계를 포함하는 환자에 대한 항암 치료제의 효능을 확인하는 방법이 제공된다.
다른 실시형태에서, a) 여기 설명된 세포 배양 조립체의 제1 성분에 환자로부터 획득된 암세포를 포함하는 용액을 가하는 단계로서, 여기서 세포 배양 조립체의 제2 성분은 환자로부터의 암세포의 검출가능한 양을 포함하는 단계, 및 b) 충분한 시간 기간 후에 세포 배양 조립체의 제1 성분에서 전이성 암세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 환자에서 암의 전이성 전파를 예측 및/또는 확인하는 방법이 제공된다.
추가의 실시형태들은 본 설명 전체에서 찾을 수 있다.
본 발명의 실시형태들은 첨부한 도면과 함께 이후의 상세한 설명에 의해서 쉽게 이해될 것이다. 본 발명의 실시형태들은 첨부한 도면에서 제한이 아닌 예시의 방식으로 도시된다.
도 1a-d는 다양한 실시형태에 따라서 원발성 조직 및 이차성 장기의 생체내 미소환경을 의태하도록 설계된 rMet 모델의 조립체를 도시한다. 도 1a는 조립체 내의 유체를 교반하는 선택적 장치를 가진 원발성 부위(삽입물) 및 이차성 부위(조직 배양 플레이트의 웰)를 의태하는 조직 배양 장치로서 rMet 모델의 조립체를 보여준다. 도 1b는 고화된 Matrigel("원발성 부위" 세포외 바탕질)의 극저온-스캔 전자 현미경 이미지를 도시한다. 도 1c는 중합된 재구성된 골수(rBM) 바탕질의 극저온-스캔 전자 현미경 이미지를 도시한다. 도 1d는 rMet 배양에서 시간 기간 후 세포 분포를 도시한다.
도 2는 rMet 모델의 또 다른 조립체를 도시하는데, 여기서는 원발성 조직 및/또는 이차성 부위가 별도의 용기들에 설치되며, 이들은 용기들 간 유체를 이동시키는 공급원에 의해서 연결된다.
도 3a-d는 rMet 모델이 고상 종양 전이의 복잡성을 설명함을 도시한다. 도 3a는 rMet에서 배양된 유방암세포에 의한 종양-유사, 침습성, 및 전이성 세포 집단의 형성을 도시한다. 도 3b는 rMet에서 배양된 원발성 유방암세포에 의한 종양-유사 및 전이성 세포 집단의 형성을 도시한다. 도 3c는 rMet에서 배양된 전립선암세포에 의한 종양-유사, 침습성, 및 전이성 세포 집단의 형성을 도시한다. 도 3d는 rMet에서 배양된 폐, 위, 췌장, 결장, 난소, 흑색종 및 고환 암세포에 의한 종양-유사, 침습성, 및 전이성 세포의 형성을 도시한다.
도 4는 종양 타입에 기초한 "전이성 부위"의 콜로니화 시기를 도시한다.
도 5는 rMet의 "전이성 부위"에서 바탕질 기질층에 기초하여 전이성 콜로이화를 확립하는 세포의 경향을 도시한다.
도 6은 rMet에서 전이성 세포가 생육성을 유지함을 증명한다.
도 7a-b는 rMet로부터 분리된 세포의 전이 능력을 도시한다. 도 7a는 rMet 모델로부터 분리된 전이성 세포는 전이를 유도하지만, 종양-유사 세포는 생체내 전파하는 능력이 심각하게 감퇴된 것을 도시한다. 도 7b는 다양한 이차성 부위에서 전이성 병소의 출현을 도시한다.
도 8은 종래의 배양 방법과 비교하여 효능 시험에서 rMet 플랫폼을 사용한 이점을 증명한다.
다음의 상세한 설명에서는 첨부한 도면을 참조하며, 도면은 본 발명의 일부를 형성하고, 실시될 수 있는 예시 실시형태의 방식으로 도시된다. 다른 실시형태들도 이용될 수 있으며, 범위를 벗어나지 않는 구조적이거나 논리적인 변화가 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 다음의 상세한 설명은 제한의 의미로 해석되어서는 안 되며, 실시형태의 범위는 첨부된 청구항과 그것의 등가물에 의해서 한정된다.
다양한 작업은 실시형태의 이해에 도움이 될 수 있는 방식으로 다수의 분리된 작업들로 차례로 설명될 수 있지만, 설명의 순서가 이들 작업이 순서 의존적임을 내포하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
설명은 상향/하향, 위/아래, 뒤/앞, 및 상부/하부와 같은 시점-기반 설명을 사용할 수 있다. 이러한 설명은 논의를 용이하게 하기 위해서 사용될 뿐이며, 실시형태의 용도를 제한하려는 의도는 아니다.
정의
유기체에서 원발성 부위에서 이차성 위치까지 세포 이주의 과정을 재구성하도록 설계된 장치에서 진핵세포를 시험관내 배양하는 세포 배양 조립체가 여기 제공된다. 상기 언급된 대로, 재구성된 전이 모델인 세포 배양 조립체는 때로 "rMet" 모델 또는 시스템 또는 세포 배양 장치 또는 플랫폼으로 언급된다. rMet 모델은 원발성 조직 부위, 예를 들어 유선에서 이차성 부위, 예를 들어 골수까지 종래의 배양 방법을 사용하여 가능한 것보다 생체내 전파를 더욱 근접하게 닮은 방식으로 종양 세포를 전파시킬 수 있다. rMet 모델은 치료제 개발, 항암 약물 시험, 치료에 대한 반응의 평가, 및 개별 종양의 전이 능력의 예측에서 사용될 수 있도록 원발성 종양, 침습성, 및 전이성 세포를 분리하기 위한 개선된 기회를 제공한다.
rMet 모델을 설명하기 위해 사용된 용어들이 아래 제공된다.
세포 배양 조립체는 조직 배양 용기 또는 세포 배양 용기를 이용할 수 있다. 실시형태를 설명하려는 목적에서, 문구 "조직 배양 용기" 및 "세포 배양 용기"는 상호 교환이 가능하며, 상업적으로 이용가능하거나 해당 목적을 위해 주문 제작된 임의의 용기/컨테이너를 포함하여, 진핵세포의 성장에 적합한 임의의 용기/컨테이너를 말한다. 일부 실시형태에서, 문구 "조직 배양 삽입물", "세포 배양 삽입물", "삽입물 용기", 또는 "트랜스웰"은 다수의 격리된 챔버를 생성할 목적으로 조직 배양 용기에 위치되도록 설계된 장치를 말한다. 조직 배양 용기 또는 배양 삽입물은, 제한은 아니지만 폴리스티렌, 폴리머, 유리, 플라스틱 등을 포함하는 재료로 구성될 수 있으며, 세포 부착에 적합한 표면으로 처리/코팅/구성될 수 있다. 삽입물은 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리카보네이트, 또는 임의의 다른 적합한 재료와 같은 재료로 구성된 다공질 막을 가질 수 있다. 조직 배양 용기 및/또는 삽입물의 표면은 친수성, 소수성, 음으로 하전, 양으로 하전, 비-이온성일 수 있거나, 또는 하나 이상의 표면 영역을 증가시키도록 질감이 변경될 수 있다. 이에 더하여, 조직 배양 용기는 가스 투과성일 수 있고 및/또는 가스 투과성인 캡/뚜껑/마개를 포함할 수 있다. 구체예에 따른 조직 배양 용기는, 제한은 아니지만 플라스크, 단일 웰 플레이트, 다중-웰 플레이트, 마이크로타이터 플레이트, 보틀, 페트리 접시, 챔버 슬라이드, 및 다른 컨테이너들을 포함한다.
여기 사용된 용어 "척추동물로부터 유래된 유체"는, 제한은 아니지만 혈장, 또는 혈액이나 골수로부터의 혈청, 복막 유체, 복수 유체, 뇌척수 유체, 전혈, 림프 및/또는 활막 유체, 눈물, 소변, 침 또는 임의의 척추동물(제한은 아니지만 사람, 비-사람 영장류, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 개 및 기타를 포함한다)로부터의 임의의 다른 위장 유체를 포함할 수 있다. 척추동물은 건강할 수 있거나, 암을 가질 수 있거나, 또는 전악성 증후군을 가질 수 있다. 척추동물이 암을 갖지 않고 건강한 한 실시형태에서, 동일한 출처나 상이한 출처로부터의 종양 세포가 시스템에 첨가될 수 있다. 척추동물이 암을 가진 실시형태에서, 이 유체는, 제한은 아니지만 고상 종양, 뼈, 연조직, 근육, 피부 및/또는 혈액의 암을 포함하는 임의의 암의 형태를 가진 임의의 척추동물(제한은 아니지만 사람, 비-사람 영장류, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 개 및 기타를 포함한다)로부터의 혈장, 혈청, 복막 유체, 복수 유체, 뇌척수 유체, 혈액, 림프 및/또는 활막 유체를 포함할 수 있다. 실시형태를 설명하려는 목적에서, 문구 "건강한 척추동물", "정상 척추동물" 또는 "질환이 없는 척추동물"은 상호 교환하여 사용되며, 임의의 질환 상태나 병증이 없는 척추동물을 설명한다.
일부 실시형태에서, 제1 성분은 또한 장기와 같은 건강한 조직이나 원발성 종양 성장 부위를 의태하도록 의도된 "원발성 부위 성장 바탕질"을 포함할 수 있다. 원발성 종양 부위는 방광, 뼈, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장, 식도, 신장, 간, 폐, 피부, 난소, 췌장, 전립선, 위, 자궁, 고환, 갑상선 등을 포함하는 여러 가지 부위로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 바탕질은 L-글루타민(또는 다른 성장 배지)과 약 1% 말 혈청과 함께 RPMI-1640를 포함하는 세포 배양 배지를 포함한다. 이 바탕질은 또한 항미생물, 항생물질, 및/또는 항진균 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 여기 예시된 일부 실시형태에서, 성장 배지는 L-글루타민, 20% 태아 소 혈청(FBS), 6.2x10-4M CaCl2, 1x10-6M 나트륨 석시네이트, 및 1x10-6M 하이드로코르티손 및 1% 페니실린/스트렙토마이신과 함께 RPMI-1640를 포함한다.
원발성 부위 성장 바탕질을 위한 추가 성분은 원발성 종양 부위에 기초하여 선택될 수 있다. 추가 성분은 기저막(BM), 콜라겐(콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V에 대해 CI-V로서 아래 정의된다), 피브로넥틴(FN), 라미닌(LN), 히알루론산(HA), 엘라스틴, 렉티칸 등을 포함할 수 있다.
예시적인 원발성 부위 성장 바탕질이 아래 표 1에 제시된다. 또한, 대표적 농도와 적절한 농도 범위가 제공된다.
원발성 부위 성장 바탕질
원발성 종양 부위
- 장기 		바탕질 바탕질
농도		 농도 범위
방광 LN; FN; CI; CIII;
엘라스틴		 1:2:4:1:1 (1-2):(1-2):(2-6):(0-1):(0-1)
뇌 HA; 렉티칸 5:1 (2-10):1
유방 Matrigel# 1 n/a
자궁경부 HA; CI; CIII 5:1:1 (2-10):(1-5):(0-1)
결장 Matrigel; FN 2:1 (2-4):(1-3)
식도 LN; FN; CI; CIII;
엘라스틴		 1:2:4:1:1 (1-2):(1-2):(2-6):(0-1):(0-1)
신장 FN; CI; CIII 2:3:1 (1-2):(1-5):(0-1)
간 Matrigel; FN; HA (BM) 4:2.5:1 (2-6):(2-3):(1-3)
　 CI; CIII; CV 5:1:1 (5-10):1:1
폐 Matrigel (BM) 1 n/a
Matrigel; FN 2:1 (2-4):(1-3)
흑색종 Matrigel 1 n/a
난소 LN; FN; HA; CI; CIII 1:2:3:2:1 (1-2):(1-2):(1-4):(1-4):(0-1)
췌장 콜라겐 I 1 n/a
전립선 Matrigel 1 n/a
육종 Matrigel; FN; HA; CI1/CI2/ CIII3 4:2:2:2 (3-6):(1-3):(1-4):(1-2)
위 Matrigel; FN; HA 4:2.5:1 (2-6):(2-3):(1-3)
고환 Matrigel 1 n/a
갑상선 Matrigel; FN 2:1 (2-4):(1-3)
# Matrigel: LN; CIV (주요 성분)
1 골육종; 2 근육종; 3 연골육종
실시형태를 설명하려는 목적에서, 문구 "생물학적 바탕질 의태물", "재구성된 장기 바탕질", "장기-특이적 바탕질", 또는 "세포외 바탕질"은, 예를 들어 세포외 바탕질, 세포내 바탕질, 기저막, 및/또는 결합조직의 구조와 같은 하나 이상의 생물학적 바탕질을 시험관내 의태하거나 모사하기 위해 설계, 제조, 또는 사용된 Matrigel®과 같은 상업적으로 이용가능한 제품을 포함하는 임의의 물질, 용액, 혼합물을 말한다. 이 바탕질은 전이 부위나 이차성 부위를 의태한다. 바탕질은 이차성 부위 또는 전이 부위에 기초하여 선택될 수 있다. 추가 성분은 기저막(BM), 콜라겐(콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V에 대해 CI-V로서 아래 정의된다), 피브로넥틴(FN), 라미닌(LN), 히알루론산(HA) 또는 관련된 히알루로난, 엘라스틴, 렉티칸, Matrigel® 또는 다른 글리코사미노글리칸, 콘드로이틴, 더마탄, 또는 관련된 세포외 바탕질 또는 당질피질 성분 또는 이들의 조합 등을 포함할 수 있다. 대표적 바탕질 및 농도가 아래 표 2에 제시된다.
생물학적 바탕질 의태물
장기 바탕질 바탕질 농도 농도 범위
부신 Matrigel; FN; CI 4:2.5:1 (3-6):(2-4):1
뼈 FN, CI (골내막) 1:1 (7.5-3.5):1
　 Matrigel; FN; CI, HA 4:2.5:1:1 (3-6):(2-3):1:1
뇌 HA; 렉티칸 5:1 (2-10):1
간 Matrigel; FN;
HA(BM) 		4:2.5:1 (2-6):(2-3):(1-3)
　 CI; CIII; CV 5:1:1 (5-10):1:1
폐 Matrigel (BM) 1 n/a
　 Matrigel; FN 2:1 (2-4):(1-3)
림프절 Matrigel; FN; CI; CIII 4:2.5:1:1 (3-6):(2-4):(1-5):(0-1)
난소 Matrigel 1 n/a
복막 Matrigel; CI; FN 4:2.5:1 (3-6):(2-4):1
피부 Matrigel; FN (BM) 2:1 (2-4):(1-3)
　 CI; CIII 3:1 (1-6):(0:3)
비장 Matrigel; HA (BM) 4:1 (2-6):(1-10)
　 FN; CI 2:1 (2-4):1
실시형태를 설명하려는 목적에서, 문구 "이차성 부위 성장 배지"는 L-글루타민 또는 적합한 성장 배지, 골수 기질 세포의 배양물로부터의 유체, 또는 6.2x10-4M CaCl2, 1x10-6M 나트륨 석시네이트, 및 1x10-6M 하이드로코르티손으로 보충된 척추동물로부터의 유체와 함께 RPMI-1640을 포함하는 세포 배양 배지를 말한다. 성장 배지는 또한 항미생물/항생물질/항진균 물질을 포함할 수 있다. 말 혈청 또는 골수 기질 세포의 배양물로부터의 유체는 건강한 척추동물이나 암을 가진 척추동물로부터의 유체를 대신할 수 있다. 성장 배지에서 각 성분의 몰 농도 및/또는 몰랄 농도는 실시형태에 따라 변할 수 있다. "골수 기질 세포의 배양물로부터의 유체"는, 제한은 아니지만 임의의 척추동물(제한은 아니지만 사람, 비-사람 영장류, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 개 및 기타)로부터의 골수 기질 셀라인 또는 일차 골수 세포를 포함할 수 있는 골수 기질 세포의 배양물로부터 수집된 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 문구 "골수 기질 세포의 배양물"은 세포 배양 배지로 덮인 조직 배양 용기에서 일차 골수 세포 또는 골수 셀라인이 성장된 시스템을 말한다.
유체 및 선택적으로 원발성 부위 성장 바탕질은 종양 세포가 기원된 원발성 종양 부위를 모사한다. 전이 동안 원발성 종양 세포는, 본 기술의 제2 성분에서 생물학적 바탕질 의태물이 모사하는 다른 부위로 침투하여 이주할 필요가 있다. 생체내 침입 및 이주는 순환계에 의해서 매개된다. 본 기술에서, 동적 유체 성분은 순환계를 모사하고, 이차성 부위 성장 배지 내부는 순환하는 혈액이나 림프를 모사한다.
이와 관련하여, 본 발명 시스템의 모사 효능은, 이차성 부위 성장 배지가 유체보다 높은 혈청 함량을 함유할 때 증진된다는 것이 발견된다. 예를 들어, 이차성 부위 성장 배지는 8%-35%, 또는 더욱 구체적으로는 10%-30%의 범위의 혈청 농도를 가질 수 있다. 반면, 제1 성분의 유체에서 혈청 함량은 1% 내지 5%, 또는 더욱 일반적으로는 0.5% 내지 6%일 수 있다.
본 분야에 잘 알려진 대로, 혈청은 혈액 세포와 응고 인자가 제거된 후의 혈액 성분이며, 피브리노겐을 포함하지 않는 혈액 혈장이다. 혈청은 혈액 응고에 사용되지 않는 모든 단백질과 모든 전해질, 항체, 항원, 호르몬, 및 임의의 외인성 물질을 포함한다. 천연 혈장은 건강하거나 암을 가진 척추동물의 혈액으로부터 분리될 수 있다.
합성, 대용 또는 대체 혈청(종합적으로 "대용 혈청"이라고 한다)이 또한 제조될 수 있으며 상업적으로 이용가능하다. 대용 혈청은 전형적으로 척추동물에서 발견된 대부분의 또는 모든 주요 혈청 단백질을 포함한다.
주요 혈청 단백질은, 예를 들어 알부민, 글로불린, 및 조절성 단백질을 포함한다. 더욱 구체적인 예들은, 제한은 아니지만 프레알부민, 알파 1 안티트립신, 알파 1 산 당단백질, 알파 1 태아단백질, 알파 2-마크로글로불린, 감마 글로불린, 베타-2-마크로글로불린, 헵토글로빈, 세룰로플라즈민, 보체 성분 3, 보체 성분 4, C-반응성 단백질(CRP), 지방단백질(유미지립, VLDL, LDL, HDL), 트랜스페린, 만난-결합 렉틴, 및 만노오스-결합 단백질을 포함한다.
일부 양태에서, 이차성 부위 성장 배지에서 혈청 또는 대용 혈청 농도는 적어도 8%, 9% 10%, 12%, 15%, 18%, 20% 또는 25%이다. 일부 양태에서, 제1 성분의 유체에서 혈청 또는 대용 혈청 농도는 6%, 5.5%, 5%, 4.5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1.5% 미만이다. 일부 양태에서, 이차성 부위 성장 배지에서 혈청 또는 대용 혈청 농도는 적어도 50% 초과, 80% 초과이거나, 또는 제1 성분의 유체에서의 혈청 또는 대용 혈청 농도의 2배, 3배, 4배 또는 5배이다.
추가의 구성요소, 예를 들어 인큐베이터, 현미경, 펌프 등이 세포 배양 조립체에 결합될 수 있다. 용어 "결합된" 및 "연결된"은 이들의 파생어와 함께 사용될 수 있다. 이들 용어는 서로 동의어는 아닌 것으로 이해되어야 한다. 오히려 특정 실시형태에서 "연결된"은 둘 이상의 요소가 서로 직접적으로 물리적 또는 전기적 접촉하고 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있다. "결합된"은 둘 이상의 요소가 직접적인 물리적 또는 전기적 접촉 상태에 있음을 의미할 수 있다. 그러나, "결합된"은 또한 둘 이상의 요소가 서로 직접 접촉하고 있지는 않지만 서로 협력하거나 상호작용하고 있음을 의미할 수 있다.
실시형태를 설명하려는 목적에서, 문구 "인큐베이터"는 30-45℃의 온도 및 1-10 CO2에서 세포 배양물을 유지하기 위한 제어된 이산화탄소(CO2) 환경을 가진 온도 제어, 가습 챔버이다.
여기 사용된 문구 "고상 종양"은 비-조혈 기원의 임의의 암을 말하고, "항암 치료제"는 암세포의 성장이나 이주를 방지하고, 암세포에서 세포 사멸을 유도하고, 및/또는 암세포 집단의 생존과 확장에 해로운 임의의 화합물, 화학물질, 물질 또는 이러한 화합물, 화학물질, 물질, 나노입자의 조합, 또는 다른 약물 송달 부형제를 말한다.
실시형태를 설명하려는 목적에서, 문구 "종양", "암", "악성물" 및 "신생물"은 상호 교환하여 사용된다.
세포 배양 조립체 및 그것의 성분
종양형성의 상이한 단계에서 세포(예컨대 원발성 종양, 침습성, 및 전이성 세포, 뿐만 아니라 재발성/회귀성 암으로부터의 세포)를 분리하기 위해 종양 세포 집단의 격리를 위한 플랫폼을 제공하는 독특한 시스템이 여기 제공된다.
항암 약물의 90% 이상은 임상 개발 동안 실패하기 때문에 시중에 나오지 못한다. 전임상 개발 동안 동물 모델에서 높은 효능을 증명하여도 신규 치료제의 최고 감소 비율이 효능 단계인 II상 및 III상 임상 시험에서 나타난다. 이것은 전임상 개발에 사용된 실험적 전이의 생체내 설치류 모델이 사람 조직의 미소환경을 충실히 설명하지 않는다는 것을 시사한다. 따라서, 포괄적인 3-차원(3-D) 시험관내 재구성 전이(rMet) 모델이 개발되었으며, 여기서는 원발성 부위와 이차성 부위의 분리된 조직-특이적 사람 미소환경이 정착-독립 단계를 포함하여 전이의 주요 단계들(원발성 부위에서 벗어나는 것과 먼 장기의 콜로니화)을 설명하기 위해 단일 분석에 통합된다. rMet 시스템의 모듈형 디자인은 장기-특이적 미소환경의 설치를 허용하며, 원발성 및 이차성 부위뿐만 아니라 사람 조직의 순환계 환경을 재구성한다. 특이적 세포외 바탕질 성분의 존재는 사람 종양 및 비-악성 세포의 성공적인 확장을 가능하게 하며, 생체내와 유사한 세포-세포 상호작용을 유지한다.
rMet 모델은 전이성 및 침습성 세포 집단의 분리를 가능하게 할 뿐만 아니라, 암과 그것의 전파에 대한 기초적 생물학을 연구하기 위한 포괄적 시스템을 제공한다. rMet 모델은 원발성 종양, 침습성 및 전이성 집단을 표적화하는 신규 치료제를 설계 및 평가하고, 치료 섭생을 개인화하여 개별 환자에서 효능이 있을 것으로 보이는 약물을 확인하고, 개별 종양의 전이 능력을 예측하기 위한 유용한 도구이다. 이들 실시형태는 아래 더 충분히 설명된다. 더욱이, 이 모델은 특이적 세포 구획을 표적화하는 잠재성을 가진 약물의 고-처리량 분석에도 적합하다.
여러 가지 원발성 종양 부위 및 전이성 종양 부위가 여기 설명된 방법 및 시스템을 사용하여 조사될 수 있다. 예를 들어, 원발성 종양 부위는, 제한은 아니지만 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 장, 신장, 간, 폐, 구강, 근육, 난소, 피부, 췌장, 전립선, 피부, 위, 고환, 갑상선, 자궁, 뿐만 아니라 혈관 구조(예를 들어, 내피세포, 평활근세포, 혈관주위세포, 흉터, 섬유화 조직, 수술 유착 조직 또는 과증식성 뼈 병소)를 포함하는 임의의 과증식성 조직 등을 포함한다.
여러 가지 전이성 부위가 여기 설명된 시스템을 사용하여 또한 조사될 수 있다. 이들 부위는, 제한은 아니지만 부신, 뼈, 뇌, 신장, 간, 폐, 림프절, 난소, 복막, 피부, 비장 등을 포함한다. 한 실시형태에서, 세포 배양 조립체는 유선의 원발성 부위와 골수의 전이성 부위의 조합을 포함하지 않는다.
한 실시형태에서, 세포 배양 조립체는 척추동물로부터 유래된 유체 및 선택적으로 원발성 부위 성장 바탕질, 생물학적 바탕질 의태물을 포함하는 제2 성분, 및 이차성 부위 성장 배지를 포함하는 동적 유체 성분을 포함하며, 여기서 유체 성분은 제1 및 제2 성분과 유체 접촉한다.
여러 가지 세포가 여기 설명된 세포 조립체에서 배양될 수 있다. 특정 실시형태에서, 배양된 세포는 상피 세포, 조혈 세포, 기질 세포, 및/또는 임의의 다른 진핵세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태는 암세포를 배양하는 것에 관한 것이지만, 본 개시에 의해서, 제한은 아니지만 아구, 다형핵 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 전-PMN 세포, 전골수세포, 골수세포, 메타골수세포, 림프구, B 및/또는 T 세포, 유핵 적혈구, 전적아구, 호염기성 적아구, 다염성 적아구, 정색성 적아구, 대식세포, 섬유아세포, 근상피세포, 간엽성 줄기세포, 망상 세포, 파골세포, 골아세포, 연골세포, 상피세포, 간엽세포, 신경세포 등을 포함하는 임의의 세포 타입을 배양하기 위한 조립체, 장치 및 방법도 또한 포함된다.
실시형태에서, 제1 성분은 척추동물로부터 유래된 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유체는 암을 가진 척추동물로부터 유래된다. 이 성분은 원발성 종양 부위를 의태한다. 일부 실시형태는 건강한 척추동물이나 암을 가진 척추동물로부터 유래된 유체를 생물학적 바탕질 의태물의 표면 위에 가하는 것을 더 포함하지만, 다른 실시형태는 세포 배양 유체 및/또는 희석제를 생물학적 바탕질 의태물의 표면 위에 가하는 것을 더 포함한다. 일부 실시형태는 척추동물로부터의 조혈 성분이나 기질 성분을 가진 유체를 포함한다. 하나 이상의 세포 유착 인자, 또는 제한은 아니지만 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인을 포함하는 다른 인자가 또한 생물학적 바탕질 의태물 및/또는 유체에 첨가될 수 있다.
제2 성분은 생물학적 바탕질 의태물을 포함한다. 이 성분은 전이성 부위를 의태한다. 한 실시형태에서, 바탕질 의태물은 장기 특이적이다. 한 실시형태에서, 장기 특이적-바탕질은 부신, 골수, 뇌, 간 또는 폐 조직, 림프절, 난소, 복막, 피부, 피장, 결합조직, 뼈, 혈관 구조, 또는 관절 등을 모사한다.
Matrigel®이 일부 실시형태에서는 생물학적 바탕질 의태물이지만, 다른 실시형태에서는 다른 생물학적 바탕질 의태물 및/또는 Matrigel®의 하나 이상의 성분이 생물학적 바탕질 의태물로서 치횐될 수 있다.
상기로 돌아가면, 원발성 부위 성장 바탕질, 이차성 부위 배지, 및 생물학적 바탕질 의태물은 모두 세포 유착 안지를 포함할 수 있다. 세포 유착 인자는 본 분야에 잘 알려져 있으며, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴, 테나스신, 히알루론산, 렉티칸, 양으로 하전된 분자(예컨대 폴리-1-리신, 키토산, 폴리(에틸렌이민), 중합된 아크릴 등), 세포 표면 탄수화물-결합 단백질/당단백질, 인테그린, 캐드헤린, 세포 유착 분자의 단편/하위단위, 세포 유착 분자의 합성 유사체, 젤라틴, 폴리-1-오르니틴 등을 포함한다. 실시형태는 각 혼합물의 성분으로서 이들 인자들 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상을 포함할 수 있고, 및/또는 건강한 척추동물 또는 암을 가진 척추동물로부터 유래된 유체에 첨가제로서 하나 이상을 포함할 수 있다. 이에 더하여, 이들 인자의 비율 및/또는 농도는 실시형태에 따라 변할 수 있다.
추가로, 하나 이상의 희석제 및/또는 세포 배양 배지가 혼합물 중 어느 것에 및/또는 척추동물로부터의 유체에 첨가될 수 있다. 희석제/배지는 물, 인산염-완충 식염수(PBS), RPMI-1640 성장배지, 최소 필수 배지(MEM), 이글 기본 배지(BME), 듈베코 변형 이글스 배지(DMEM), 행크 균형 염 영액(HBSS), 및 이들의 변형물 등을 포함할 수 있다. 세포 배양 배지는 새로 제조되거나 또는 척추동물 세포의 배양물로부터 수집될 수 있다.
제1 및 제2 성분은 정지된 또는 동적 유체 성분과 유체 접촉한다. 동적 유체 성분은 순환계를 의태한다. 이 성분은 전체적으로 설명된 이차성 부위 성장 배지를 포함한다. 유체는 조립체를 교반하거나 휘저어서 동적으로 제조될 수 있다. 선택적으로, 조립체는 시스템을 이동시킬 수 있는 기계 장치와 결합될 수 있다. 한 실시형태에서, 조립체는 교반 장치나 심지어 펌프와 결합되거나 연결될 수 있다. 이것은 아래 더 충분히 설명된다.
제1 및 제2 성분은 정지된 또는 동적 유체층과 유체 접촉한다. 한 실시형태에서, 제1 성분 및 제2 성분은, 성분들의 내용물이 제1 성분에서 동적 유체 성분을 통해 제2 성분으로 이동하도록 허용하는 막 또는 다른 다공질 성분을 포함한다.
세포 배양 조립체의 제조 및 사용 방법
세포 배양 조립체는 도 1a에 도시된 대로 수직일 수 있거나, 또는 도 2에 도시된 대로 수평일 수 있다.
도 1a는 rMet 모델의 기본 성분 및 조립체를 나타내는 도해이다. 이 실시형태에서, Matrigel이 사람 암세포와 조합되었고, 이 혼합물이 8μm 기공을 가진 세포 배양 삽입물에 첨가되었으며, 다음에 이것이 rBM 바탕질을 함유하는 조직 배양 플레이트의 웰에 삽입되었다. 당업자에 의해 적합한 기공 크기가 쉽게 결정될 수 있다고 생각된다. 대표적 삽입물은 약 4μm 내지 약 10μm의 기공 크기를 가진다. 세포 배양 삽입물에서 원발성 종양 부위 설치를 완료하기 위해 세포/Matrigel 혼합물이 성장 배지로 덮였다. 전이성 부위의 미소환경을 조립하기 위해 골수 배양 배지(BMCM)가 rBM-함유 조직 배양 웰에 첨가되었다. 전체 조립체는 바탕질 위에서 배지들을 교반하기 위해 축회전 믹서에 위치되었다. 이 축회전 혼합물은 유체 성분의 움직임을 제공하기 위한 유일한 선택사항이다. 이 도면은 골수 배양 배지를 언급하고 있지만, 제한은 아니지만 성장 배지, 건강한 척추동물 또는 암을 가진 척추동물로부터의 유체 등을 포함하여 여러 가지 배지가 이용될 수 있다.
도 1b는 극저온-스캔 전자 현미경법에 의해서 시각화된 중합된 Matrigel의 구조를 도시한다(축척: 5μm). 도 1c는 극저온-스캔 전자 현미경법에 의해서 시각화된 중합된 rBM의 구조를 도시한다(축척: 5μm). 도 1d는 삽입물의 Matrigel 내에 포착된 구체들로 구성된 종양-유사 분획에 rMet 배양물에서 14일 후 세포의 분포를 도시한다. 침습성 분획은 Matrigel에 침투하여 삽입물의 막 표면에 단층을 형성한 세포들로 이루어졌다. 마지막으로, 전이성 집단이 Matrigel에 침투해서 정착-독립 조건하에 BMCM에서 생존하여 rBM 바탕질을 콜로니화했다.
일부 실시형태에서, rMet 모델은 생리학적으로 관련된 방식으로 고상 종양 전이를 연구하기 위해 장기-특이적 세포외 바탕질 성분을 통합한다. 특정 실시형태에서, rMet 모델은 세포 배양 배지 윗층과 함께 겔을 형성한 생물학적 바탕질 의태물을 통합한 조직 배양 삽입물을 포함하며, 이것은 이어서 제1 혼합물, 제1 혼합물 위에 겔을 형성한 생물학적 바탕질 의태물을 포함하는 제2 혼합물, 및 제2 혼합물을 덮은 세포 배양 배지로 코팅된 조직 배양 용기에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 사람의 암세포가 원발성 부위를 재구성하도록 설계된 삽입물 내부의 겔에 매립된다. 이 삽입물은 이어서 겔과 배지가 설치된 조직 배양 용기 내에 위치된다. 실시형태에 따라서 rMet 세포 배양물을 형성하는 방법이 여기 더 설명된다.
일부 실시형태에서, rMet 모델을 형성하는 방법은 원발성 종양 부위를 의태하기 위해 다공질 막을 가진 조직 배양 삽입물에 생물학적 바탕질 의태물의 배치를 포함하며, 세포 배양 배지로 혼합물을 덮고, 조직을 의태하기 위해 겔을 형성한 혼합물로 덮이고, 세포 배양 배지로 덮인, 관심의 조직의 기저막을 의태하기 위해 이 삽입물을 생물학적 바탕질 의태물로 코팅된 조직 배양 용기에 삽입한다. 연동식 또는 임의의 다른 펌프로부터 선택된 교반 장치, 축회전 믹서, 또는 삽입물 아래의 세포 배양 배지를 교반할 수 있는 임의의 다른 장치가 시스템에 부착된다. 다음에, 전체 조립체가 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 진핵세포가 코팅과 겔 사이에 배치될 수 있으며, 다른 실시형태에서는 진핵세포가 하나 또는 두 챔버의 겔에 매립되거나 하나 또는 두 챔버에서 상기 배지에 위치될 수 있다. 다른 실시형태는 원발성 및 이차성 조직 부위를 위한 별도의 조직 배양 용기를 포함한다.
더욱 구체적으로는, rMet 모델을 형성하는 방법은 1) 다공질 막을 가진 조직 배양 삽입물에 진핵세포와 생물학적 바탕질 의태물을 위치시키며, 여기서 혼합물은 겔을 형성하고, 진핵세포는 겔에 매립되며, 제2 혼합물의 표면 위에 제2 혼합물을 첨가하고, 제2 혼합물은 척추동물 대상으로부터의 유체를 포함하는 단계; 2) 조직 배양 용기의 내부 표면의 일부를 조직의 기저막에 특이적인 세포외 바탕질 단백질을 포함하는 제1 혼합물로 코팅하며, 조직 배양 용기의 내부 표면의 일부 위에 제2 혼합물을 첨가하고, 제2 혼합물은 생물학적 바탕질 의태물을 포함하며, 여기서 제2 혼합물을 겔을 형성하고, 제2 혼합물의 표면 위에 제3 혼합물을 첨가하며, 제3 혼합물은 척추동물 대상으로부터의 유체를 포함하는 단계; 3) (1)을 (2)에 삽입하고, (2)의 유체가 약 30-45℃, 예를 들어 약 37℃ 및 1-10% CO2, 예를 들어 약 5% CO2에서 움직이는 조건하에 조립체를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, rMet 모델을 위한 방법은 1) 다공질 막을 가진 조직 배양 삽입물에 생물학적 바탕질 의태물을 위치시키며, 여기서 혼합물은 겔을 형성하고, 진핵세포는 겔에 매립되며, 제2 혼합물의 표면 위에 제2 혼합물을 첨가하고, 제2 혼합물은 진핵세포와 척추동물 대상으로부터의 유체를 포함하는 단계; 2) 조직 배양 용기의 내부 표면의 일부를 조직의 기저막에 특이적인 세포외 바탕질 단백질을 포함하는 제1 혼합물로 코팅하며, 조직 배양 용기의 내부 표면의 일부 위에 제2 혼합물을 첨가하고, 제2 혼합물은 생물학적 바탕질 의태물을 포함하며, 여기서 제2 혼합물을 겔을 형성하고, 제2 혼합물의 표면 위에 제3 혼합물을 첨가하며, 제3 혼합물은 척추동물 대상으로부터의 유체를 포함하는 단계; 3) (1)을 (2)에 삽입하고, (2)의 유체가 약 30-45℃, 예를 들어 약 37℃ 및 1-10% CO2, 예를 들어 약 5% CO2에서 움직이는 조건하에 조립체를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, rMet 모델을 위한 방법은 1) 다공질 막을 가진 조직 배양 삽입물에 진핵세포와 생물학적 바탕질 의태물을 위치시키며, 여기서 혼합물은 겔을 형성하고, 진핵세포는 겔에 매립되며, 제2 혼합물의 표면 위에 제2 혼합물을 첨가하고, 제2 혼합물은 척추동물 대상으로부터의 유체를 포함하는 단계; 2) 조직 배양 용기의 내부 표면의 일부를 조직의 기저막에 특이적인 세포외 바탕질 단백질을 포함하는 제1 혼합물로 코팅하며, 조직 배양 용기의 내부 표면의 일부 위에 진핵세포와 제2 혼합물을 첨가하고, 제2 혼합물은 생물학적 바탕질 의태물을 포함하며, 여기서 제2 혼합물을 겔을 형성하고, 제2 혼합물의 표면 위에 제3 혼합물을 첨가하며, 제3 혼합물은 척추동물 대상으로부터의 유체를 포함하는 단계; 3) (1)을 (2)에 삽입하고, (2)의 유체가 약 30-45℃, 예를 들어 약 37℃ 및 1-10% CO2, 예를 들어 약 5% CO2에서 움직이는 조건하에 조립체를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, rMet 모델을 위한 방법은 1) 조직 배양 용기에 진핵세포와 생물학적 바탕질 의태물을 위치시키며, 여기서 혼합물은 겔을 형성하고, 진핵세포는 겔에 매립되며, 제2 혼합물의 표면 위에 제2 혼합물을 첨가하고, 제2 혼합물은 척추동물 대상으로부터의 유체를 포함하는 단계; 2) 제2 조직 배양 용기의 내부 표면의 일부를 조직의 기저막에 특이적인 세포외 바탕질 단백질을 포함하는 제1 혼합물로 코팅하며, 조직 배양 용기의 내부 표면의 일부 위에 진핵세포와 제2 혼합물을 첨가하고, 제2 혼합물은 생물학적 바탕질 의태물을 포함하며, 여기서 제2 혼합물을 겔을 형성하고, 제2 혼합물의 표면 위에 제3 혼합물을 첨가하며, 제3 혼합물은 척추동물 대상으로부터의 유체를 포함하는 단계; 3) 암을 가진 척추동물로부터의 유체가 각 조직 배양 용기에서 생물학적 바탕질 의태물을 통해 이동하는 방식으로 조직 배양 용기 (1)과 (2)를 연결하고, (2)의 유체가 약 30-45℃, 예를 들어 약 37℃ 및 1-10% CO2, 예를 들어 약 5% CO2에서 움직이는 조건하에 조립체를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
상기 설명된 예시적인 실시형태에서, 다중-웰 조직 배양 플레이트에서 진핵세포의 성장을 위한 배양 장치를 제조하는 방법은 24웰 조직 배양 플레이트의 1개의 웰을 포함할 수 있다(다른 배양 접시에 대해서는 알맞게 부피를 조정한다). 당업자는 이들 예시적인 방법이 원하는 결과를 생성하도록 변형될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 바탕질 혼합물은 웰에 처음에 첨가되었을 때는 세포를 결여하지만, 다른 실시형태에서는 바탕질 혼합물이 세포를 포함한다. 표지된 세포, 정상 세포, 암세포 및 다른 세포 타입들이 바탕질 혼합물에 단독으로 또는 조합하여 첨가될 수 있다. 추가로, 성장 배지가 일부 및/또는 전체 혼합물에 첨가될 수 있다.
당업자는 또한 재현탁된 후 개별 혼합물에 첨가된 세포의 최적 밀도가 각 개별 세포 타입에 대해 특정하다는 것을 인정할 것이다. 따라서, 상기 단계에서 열거된 밀도는 여러 가지 밀도에 의한 규칙적인 실험을 통해서 변화될 수 있다. 실시형태는 rMet 배양 장치 및 방법에 포함시키기 위한 세포의 여러 가지 밀도를 고려한다. 실시형태는 또한, 제한은 아니지만 항암 화합물, 항바이러스 화합물, 항박테리아 화합물, 항진균 화합물, 또는 배지 보충물을 포함하는 첨가제의 선택적 첨가를 고려하며, 이들은 모두 관심의 세포의 성장을 장려하고, 세포, 바이러스, 또는 관심 대상이 아닌 유기물의 성장은 방해한다.
상기 언급된 대로, 세포 배양 조립체는 또한 수평일 수 있다. 도 2는 rMet 배양의 또 다른 설치를 예시하며, 여기서 도 1a의 세포 배양 삽입물에서 도시되었던 원발성 부위의 미소환경은, 도 1a에서 조립체의 하부에 도시된 별도의 용기에서 설장된 이차성 부위의 미소환경으로부터 별도의 조직 배양 용기에서 설치된다. 두 용기의 튜브 연결은 도 1a의 "이차성 부위 배지"에 의해서 묘사된 순환 미소환경을 나타낸다. 용기들 간에 유체가 이동하도록 펌프가 설치되며, 이것은 도 1a의 축회전 믹서와 같은 것이다. 종양-유사 세포 집단이 원발성 부위의 조직 배양 용기에서 구체를 형성하고, 침습성 분획이 원발성 부위에서 바탕질을 통해 이주한 세포에 의해서 형성되지만, 조직 배양 용기 내의 막에 부착된 채로 유지된다. 전이성 분획은 하나의 조직 배양 용기에서 다른 용기로 이동한 세포에 의해서 형성된다.
실시형태는 원발성 종양, 침습성, 및 전이성 세포 집단의 시험관내 확장을 지원하는 장치를 더 제공하며, 추가의 분석을 위한 암 줄기세포에 대한 접근을 제공한다. 실시형태에 따른 장치는 rMet의 세포 구획, 암세포, 및/또는 종양에 대한 약물 및/또는 다른 치료법의 영향을 시험하기 위한 전임상 모델을 제공한다. 실시형태는 정상 및 악성 조직에서 사이토카인/케모카인 및 성장 인자 네트워크와 정상 조직 항상성 및 질환 상태 조직 항상성에서 세포 신호화를 연구하기 위한 장치를 제공한다. 추가의 실시형태는, 제한은 아니지만 개별 세포, 정상 세포, 암세포, 및 고체상 종양에 대한 화학치료 효과의 특성화를 포함하여, 다양한 세포 구획을 표적화하는 잠재성을 가진 치료법의 고-처리량 및/또는 고-함량 분석을 위한 장치를 제공한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 진핵세포가 rMet 모델의 생물학적 바탕질 의태 겔층 내에 매립될 수 있으며, 다른 실시형태에서는 진행세포가 생물학적 바탕질 의태물 위의 유체에 배치된다. 실시형태에서, 제1 타입의 세포가 중간 겔층 내에 매립될 수 있고, 다른 타입의 세포가 하부층과 중간층 사이에 배치될 수 있다. rMet 조직 배양 조립체는 상기 rMet 배양 방법에 대해 설명된 대로 더 변형될 수 있다.
항암/항-과증식 치료법에 대한 시험 방법
실시형태는 전체 미소환경 내에서 악성 세포 확장이 관찰되는 전-임상 시험의 아래 조사된 양태에 유용한 배양 방법 및 장치를 개시한다. 종양 미소환경의 rMet 재구성은 전체 악성 계층에 대한 치료 전략 및 신규 약물의 치료 잠재성을 평가하기 위한 필수 도구를 제공한다.
예시적인 실시형태에서, 항암 치료법을 시험하기 위한 rMet 모델은 원발성 및 이차성 부위의 미소환경을 재구성하며, 정상 세포 및/또는 암세포에 치료법이 적용될 수 있도록 하고, 이후 세포는 세포에 대한 치료법의 효과 및 잠재적 독성 및 표적을 벗어난 효과를 결정하기 위해 시험될 수 있다. 한 실시형태에서, a) 여기 설명된 세포 배양 조립체에 잠재적 치료제를 포함하는 용액을 가하는 단계로서, 여기서 세포 배양 조립체의 제2 성분은 원발성 종양, 침습성, 전이성, 암 줄기세포 또는 HPP 세포의 검출가능한 양을 포함하는 단계, b) 잠재적 치료제를 가하기 전후에 세포 배양 조립체에 존재하는 암세포의 양을 검출하는 단계, 및 c) 잠재적 항암 또는 항-HPP 치료제를 확인하는 단계를 포함하는 항암(또는 항-과증식(항-HPP)) 치료제를 확인하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 세포 배양 조립체는 조립체에 결합된 전이성 세포의 콜로니화를 검출하기 위한 시스템을 더 포함한다. 한 실시형태에서, 조립체는 조립체에 결합된 디지털 현미경을 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포 배양 조립체는 조립체에 결합된 유세포계수기를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 장치는 rMet 조직 배양 조립체의 크기/부피를 감소시키고 및/또는 96웰, 384웰, 1536웰, 3456웰 또는 임의의 다른 숫자의 웰을 가진 마이크로타이터 플레이트를 사용함으로써 고-처리량 스크리닝/분석에 맞게 개조된다.
배양물은 개체, 컴퓨터, 자동화된 기계, 로봇, 또는 다른 방법에 의해서 시험될 수 있다. rMet 조직 배양 조립체 장치는 또한 고-함량 스크리닝에 맞게 개조될 수 있으며, 자동화된 이미지 리더, 디지털 현미경/이미지 리더, 및/또는 유세포계수기를 포함할 수 있다. 다양한 구체예에 따른 디지털 현미경은 형광 현미경, 자동화된 현미경, 공초점 현미경, 광시야 현미경 등일 수 있다. 추가로, 암 치료법을 시험하기 위한 장치의 실시형태는 이미지 분석을 위한 소프트웨어를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료법은 rMet 조립체에서 임의의 구획, 튜빙, 유체, 및/또는 바탕질 의태물에 위치된다.
이 실시형태는, 제한은 아니지만 rMet 조립체에서 임의의 세포에 대한 세포독성, 세포증식억제, 항-증식, 항-이주 및/또는 어떤 다른 효과를 포함하여, 세포에 대한 치료제의 효과를 측정하기 위한 방법을 제공한다.
항암 치료제의 효능을 확인하는 방법
예시적인 실시형태에서, 항암 치료법의 효능을 확인하기 위한 rMet 장치는 원발성 및 이차성 부위의 미소환경을 재구성하며, 정상 세포 및/또는 암세포에 치료법이 적용될 수 있도록 하고, 이후 세포는 세포에 대한 치료법의 효과를 결정하기 위해 시험될 수 있다. 이 실시형태는, 제한은 아니지만 rMet 조립체에서 임의의 세포에 대한 세포독성, 세포증식억제, 항-증식 및/또는 어떤 다른 효과를 포함하여, 세포에 대한 치료제의 효과를 측정하기 위한 방법을 제공한다. 배양물은 개체, 컴퓨터, 자동화된 기계, 로봇, 또는 다른 방법에 의해서 시험될 수 있다. rMet 조직 배양 조립체 장치는 또한 고-함량 스크리닝에 맞게 개조될 수 있으며, 자동화된 이미지 리더, 디지털 현미경/이미지 리더, 및/또는 유세포계수기를 포함할 수 있다. 다양한 구체예에 따른 디지털 현미경은 형광 현미경, 자동화된 현미경, 공초점 현미경, 광시야 현미경 등일 수 있다. 추가로, 암 치료법을 시험하기 위한 장치의 실시형태는 이미지 분석을 위한 소프트웨어를 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, a) 여기 설명된 세포 배양 조립체의 제1 성분에 잠재적 항암 치료제를 포함하는 용액을 가하는 단계로서, 여기서 세포 배양 조립체의 제2 성분은 전이성 암세포의 검출가능한 양을 함유하는 단계; b) 잠재적 항암 치료제를 가하기 전후에 제2 성분에 존재하는 전이성 암세포의 양을 검출하는 단계, 및 c) 항암 치료제의 효능을 확인하는 단계를 포함하는 환자의 종양에 대한 항암 치료제의 효능을 확인하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 세포 배양 조립체는 조립체에 결합된 전이성 세포의 콜로니화를 검출하기 위한 시스템을 더 포함한다. 한 실시형태에서, 조립체는 조립체에 결합된 디지털 현미경을 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포 배양 조립체는 조립체에 결합된 유세포계수기를 더 포함한다.
이 실시형태에서, 암을 가진 개별 척추동물로부터의 종양 세포가 rMet에서 배양되고, rMet 조립체에 치료법을 적용하며, 세포독성, 세포증식억제, 항-증식 및/또는 어떤 다른 효과를 측정한다. rMet의 임의의 구획에서 암세포를 제거할 수 있는 치료법을 확인하기 위해 개별 치료법 및/또는 조합이 암을 가진 단일 척추동물의 rMet 배양물에 적용된다. 이 과정은 암을 가진 다수의 개별 척추동물에 맞게 조정될 수 있다.
종양의 전이 능력을 예측하는 방법
예시적인 실시형태에서, rMet 장치는 개별 종양의 전이 잠재성을 예측하기 위해 원발성 및 이차성 부위의 미소환경을 재구성한다. 이 실시형태는 전이를 형성할 확률을 가진 개별 종양을 확인하기 위해 종양 세포의 이주 및 전파 능력을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 배양물은 개체, 컴퓨터, 자동화된 기계, 로봇, 또는 다른 방법에 의해서 시험될 수 있다. rMet 조직 배양 조립체 장치는 또한 고-함량 스크리닝에 맞게 개조될 수 있으며, 자동화된 이미지 리더, 디지털 현미경/이미지 리더, 및/또는 유세포계수기를 포함할 수 있다. 다양한 구체예에 따른 디지털 현미경은 형광 현미경, 자동화된 현미경, 공초점 현미경, 광시야 현미경 등일 수 있다. 추가로, 암 치료법을 시험하기 위한 장치의 실시형태는 이미지 분석을 위한 소프트웨어를 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, a) 여기 설명된 세포 배양 조립체의 제1 성분에 환자로부터 획득된 암세포를 포함하는 용액을 가하는 단계로서, 여기서 세포 배양 조립체의 제2 성분은 환자로부터의 검출가능한 양의 암세포를 포함하는 단계, 및 b) 충분한 시간 기간 후 세포 배양 조립체의 제2 성분에서 전이성 암세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 환자에서 암의 전이성 전파를 예측 및/또는 확인하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 세포 배양 조립체는 조립체에 결합된 전이성 세포의 콜로니화를 검출하기 위한 시스템을 더 포함한다. 한 실시형태에서, 조립체는 조립체에 결합된 디지털 현미경을 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포 배양 조립체는 조립체에 결합된 유세포계수기를 더 포함한다.
이 실시형태에서, 암을 가진 척추동물로부터의 종양 세포가 rMet 조립체에서 배양되며, 검출된 전이성 세포는 전이할 수 있는 개별 종양의 능력을 반영한다. 이 과정은 암을 가진 다수의 개별 척추동물에 맞게 조정될 수 있다.
여기 개시된 시스템 및 방법은 또한 표적 스크리닝과 발견 및 후보 치료제의 독성 및 표적을 벗어난 효과를 평가하는데 유용하다. 예를 들어, 시스템은 마이크로어레이, 차세대 시퀀싱, 항체 어레이, 질량분광법, 및 여기 설명된 시스템을 생체외 이용하는 비-악성 세포 및 조직에 대한 치료제, 조합, 또는 치료 일정/섭생을 스크리닝하기 위한 다수의 다른 기술들과 결합될 수 있다.
예를 들어, 약물 발견은 비-악성, 전-악성, 비-전이성, 침습성 및 전이성 세포들 간의 유전자, 단백질, 지질, 대사물질, 및 임의의 다른 세포성 또는 세포외 성분, 및 암 줄기세포 및 상기의 임의의 조합의 차등적 발현/생성에 기초할 수 있다. 치료제의 표적을 벗어난 효과가 기질 세포(섬유아세포, 근상피 세포, 지방세포, 골아세포, 파골세포 등), 혈액 세포(T 세포, B 세포, 혈장 세포, 골수 세포 등), 상피, 및 임의의 다른 비-암성 조직과 같은 rMet에 통합된 비-악성 세포 집단의 약물 치료에 대한 반응에 기초하여 평가될 수 있다.
한 실시형태에서, 여기 개시된 시스템은 단일 제제 또는 조합 치료에 대하여 개별 환자에 의한 치료에 대한 반응을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, rMet에서 성장된 종양 세포가 잠재적 치료 양식에 노출되고, 치료에 대한 세포 반응 및 표적을 벗어난 독성에 기초하여 최적의 치료가 선택될 수 있다.
실시예
실시예 1
유선 또는 전립선 원발성 부위 및 골수 이차성 부위와 함께 사용하기 위한 예시적인 rMet 시스템
원발성 부위가 유선 또는 전립선이고 이차성 부위가 골수인 rMet 시스템에서 바탕질 혼합물을 다음과 같이 설치한다. 래트-꼬리 콜라겐 타입 I(BD Biosciences)의 2mg/ml 스톡 용액을 중화 버퍼(2x 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 100mM HEPES(Sigma)), pH 7.2-7.4에 희석한다. 고상 뼈와 골수 사이의 계면에 있는 세포외 바탕질 층인 재구성된 골내막(rEnd)은 CaCl2 및 MgCl2(Sigma)가 없는 1x PBS, 1mg/ml 사람 혈장 피브로넥틴(Millipore) 및 2mg/ml 콜라겐 I의 63:5.3:1 v/v 혼합물이었다. 재구성된 골수(rBM) 바탕질은 Matrigel(BD biosciences), 1mg/ml 피브로넥틴, 2mg/ml 콜라겐 I 및 2mg/ml 히알루론산의 4:2.5:1:1 v/v 혼합물로서 설치되었다.
rMet 시스템은 다음과 같이 조립된다. 재구성된 골수(rBM)를 24-웰 조직 배양 용기에 설치하는데, rEnd 바탕질을 130μl/웰로 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하며, 과잉 액체를 제거하고, 75μl/웰로 rBM 바탕질을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. rBM의 조립은 고화된 rBM 바탕질의 상부에 가온된 골수 기질 세포 컨디셔닝 배지(BMCM) 1ml를 덮는 것으로서 완료된다. BMCM은 골수 기질 세포의 3일차 배양물로부터 컨디셔닝 배지를 수집함으로써 획득했다(성장 배지: 6.2x10-4M CaCl2, 1x10-6M 나트륨 석시네이트, 1x10-6M 하이드로코르티손, 20% FBS, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640). 유선/전립선 미소환경을 Matrigel(23μl)과 유방암 또는 전립선암 세포와 2.5x104 세포/7μl PBS/삽입물로 혼합하고, 세포 배양 삽입물에 Matrigel/세포 혼합물을 피펫팅하고, 바탕질/세포 혼합물을 30분 동안 37℃에서 겔이 되도록 하고, 각 삽입물을 rBM 바탕질이 미리 설치된 24웰 조직 배양 용기의 웰에 배치하고, 삽입물 내의 세포/바탕질 혼합물을 0.5ml의 가온된 성장 배지(1% 말 혈청(Sigma) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640)로 덮어서 8μm 기공을 가진 조직배양 삽입물(Corning)에 설치한다. 전체 조립체를 축회전 믹서에 위치시켜 배지를 교반하고, 37℃, 5% CO2 조직 배양 인큐베이터에 배치한다.
중합된 바탕질을 시각화하기 위해 극저온-스캔 전자 현미경법을 사용한다. 극저온-스캔 전자 현미경법을 위해, 소량의 Matrigel 또는 rBM 바탕질이 극저온 홀더의 슬릿 삽입물에 위치시키고, 이것을 이어서 액체 질소 슬러시로 차단했다. 진공을 유입하고, 샘플을 Gatan Alto 2500 프레-챔버(-170℃로 냉각된)로 옮겼다. 냉각된 메스로 샘플을 잘라서 자유롭게 부서진 표면을 생성한 후, 샘플을 10분 동안 -90℃에서 승화시키고, 이어서 120초 동안 백금으로 스퍼터 코팅했다. 다음에, 샘플을 현미경 극저온대(-130℃)로 옮겨 이미지화했다.
표 1 및 2의 정보에 기초하면, 이 시스템은 다수의 상이한 원발성 부위와 이차성 부위에 대해 개조될 수 있다.
실시예 2
rMet 시스템에서 다양한 전이성 암세포의 재콜로니화
도 3 및 4에 도시된 실시형태에서, 다양한 셀라인을 실시예 1에 설명된 것과 유사한 방식으로 rMet 시스템에서 시험했다. 다음의 셀라인이 시험되었다: 유방암(MCF10A, MCF10AneoT, MCF10CA1h, MCF10CA1a, MDA-MB-231, MDA-MB-231BO, MCF7), 전립선암(PC-3 및 LNCap), 폐암(A549), 위암(AGS), 췌장암(Panc-1), 결장암(LoVo), 난소암(SK-OV-3), 흑색종(A375), 고환암(NTERA-2) 셀라인이 rMet 배양에서 성장되었다. 셀라인은 ATCC 및 Barbara Ann Karmanos Cancer Institute에서 획득했다. 침습성 및 전이성 암을 가진 환자로부터 분리된 유방암세포도 rMet 모델에서 시험되었다. 이용된 다양한 바탕질을 포함해서, 조립체의 제조에 대한 더 상세한 내용이 아래 제공된다.
중합된 콜라겐 I 겔의 제조
1) 중화 버퍼의 제조: 2x PBS 중의 100mM HEPES. 이 용액의 pH는 약 7.0이었다.
2) 2mg/ml 콜라겐 I 용액을 중화 버퍼에 10.21mg/ml 래트 꼬리 콜라겐 I를 희석하여 제조했다. 이 용액을 저속으로 교반하거나 피펫을 사용하여 잘 혼합했다.
3) 단계 2에서 제조된 용액을 플레이트 웰에 첨가하고 37℃에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하여 잘 중합되어 겔을 형성하도록 했다. 첨가되는 부피는 겔의 원하는 두께에 따라서 결정했다.
재구성된 골내막(rEnd)의 제조
1) 5ml rEnd를 제조하기 위해 384.6μl 피브로넥틴(1mg/ml 스톡), 72.3μl 콜라겐 I(2mg/ml 스톡), 및 4.543ml 1x PBS를 혼합한 후 얼음 위에 두었다.
재구성된 골수 바탕질( rBM )의 제조
1) rBM을 제조하기 위해 104μl Matrigel, 68μl 피브로넥틴(1mg/ml 스톡), 28μl 콜라겐 I(2mg/ml 스톡), 및 28μl 히알루론산(2mg/ml)을 혼합한 후 얼음 위에 두었다.
골수 성장 배지( BMGM )의 제조
1) BMGM을 제조하기 위해 500μl 염화칼슘(0.62M 스톡), 500μl 나트륨 석시네이트(1x10-3M 스톡), 500μl 하이드로코르티손(1x10-3M 스톡), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 394mL RPMI-1640에 10% FBS에 첨가했다.
유선 상피 성장 배지( MEGM )
1) MEGM을 제조하기 위해 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 말 혈청을 490ml RPMI-1640에 첨가했다.
재구성된 전이의 설치( rMet 모델)
1) Matrigel을 4℃에서 하룻밤 해동했다.
2) rEnd, rBM, MEGM 및 BMGM을 상기 설명된 대로 제조했다.
3) 130μl rEnd를 24웰 플레이트의 웰마다 첨가했다.
4) 이것을 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다.
5) rEnd와 함께 1시간 인큐베이션한 후 용액을 웰에서 제거하고, 75μl rBM을 각 웰의 가운데에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다.
6) 7μl PBS 중의 25000 세포를 24웰 플레이트의 각 웰마다 23μl Matrigel과 함께 혼합했다.
7) 단계 6으로부터의 혼합물을 삽입물의 막에 가만히 첨가하고 균일하게 퍼트렸다.
8) 세포/Matrigel 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션했다.
9) 일단 조직 배양 플레이트 및 삽입물의 바탕질이 고화되면, 각 삽입물을 이미 설치된 바탕질을 가진 24웰 플레이트의 웰에 배치했다.
10) 1ml BMGM을 조직 배양 플레이트의 각 웰에 첨가했다.
11) 400 마이크로리터의 MEGM을 삽입물에 첨가했다.
12) 전체 조립체를 축회전 믹서에 배치하고, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이터에 배치했다.
명시야 현미경법을 위해서 세포를 12-14일 동안 rMet 모델에서 배양하고, Axiovision 소프트웨어 4.7.3가 장착된 Zeiss AxioObserver 반전 현미경(Zeiss)을 사용하여 상부의 침습성 및 전이성 분획의 명시야 이미지를 취득했다. Zeiss Axiovert 40C 반전 현미경을 사용하여 rMet를 통한 세포 이주를 관찰했다.
도 3에 제시된 패널은 사람 유방암 셀라인(도 3a), 원발성 사람 유방암세포(도 3b), 전립선암(도 3c), 폐암(도 3d(a)), 위암(도 3d(b)), 췌장암(도 3d(c)), 결장암(도 3d(d)), 난소암(도 3d(e)), 흑색종(도 3d(f)), 및 고환암 셀라인(도 3d(g))이 rMet 모델에서 14일 동안 배양되어 이미지화된 것을 도시한다. 모든 종양 타입은 원발성 종양-유사 분획, 세포 배양 삽입물의 막 상에 성장중인 세포들로 구성된 침습성 분획(검은 스폿: 막의 기공), 및 전이성 분획을 생성했다.
도 4는 rMet 모델에서 전이하는 세포의 경향이 생체내에서 전이하는 세포의 경향과 거의 일치함을 도시한다. 매우 전이성인 세포, 예를 들어 MCF10CA1a, MDA-MB-231, MDA-MB-231BO, PC-3, A549, 및 AGS는 rMet에서 14일 후 조직 배양 용기의 >90%를 점유한 rMet의 전이성 분획을 견고히 형성했다. 중간 전이성인 세포, 예를 들어 Panc-1, LoVo, 및 SK-OV-3은 조직 배양 용기의 50-75%를 점유한 전이성 분획을 형성했다. 약한 전이성인 세포, 예를 들어 MCF10AneoT, MCF10CA1h, A375, 및 NTERA-2는 전이성 분획을 드문드문 형성했고, 비-전이성 세포, 예를 들어 MCF10A, MCF7, 및 LNCaP는 rMet에서 전이성 층을 형성하지 않았다.
표 3은 여기 설명된 시스템에서 사용된 다양한 셀라인의 이주성 특징을 제공한다.
다양한 암 계통의 전이성 및 rMet 이주성 특징
셀라인 장기 전이성( rMet ) 전이성( 생체내 )
MCF10A 유방 - 없음****
MCF10AneoT 유방 ++ 약함***
MCF10CA1h 유방 ++ 약함***
MCF10CA1a 유방 +++ 강함*
MDA-MB-231 유방 +++ 강함*
MDA-MB-231BO 유방 +++ 강함*
MCF7 유방 - 없음****
PC-3 전립선 +++ 강함*
LNCaP 전립선 - 없음****
A549 폐 +++ 강함*
AGS 위 +++ 강함*
Panc-1 췌장 ++ 중간**
LoVo 결장 ++ 중간**
SK-OV-3 난소 ++ 중간**
A375 흑색종 ++ 약함***
NTERA-2 고환 + 약함***
*강한 전이: 동물의 >85%에서 전이성 병소가 발생한다
**중간 전이: 동물의 50-85%에서 전이성 병소가 발생한다
***약한 전이: 동물의 <50%에서 전이성 병소가 발생한다
****비-전이: 전이성 병소가 검출되지 않음
도 5는 rMet에서 세포의 전이 능력을 유지하는데 대한 바탕질 성분의 효과를 도시한다. rMet 배양의 하부 챔버(조직 배양 용기)에 다양한 바탕질 성분이나 이들의 혼합물(Matrigel/피브로넥틴, 콜라겐 I(CI), 피브로넥틴(FN), 히알루론산(HA) 또는 rBM(Matrigel, 콜라겐 I, 피브로넥틴, 히알루론산의 혼합물)을 설치하고, 전이성 분획의 형성을 rMet 배양 14일 후에 시각화했다. rBM은 전이성 세포의 가장 많은 수를 지속할 수 있었지만, Matrigel/피브로넥틴 혼합물 또는 개별 성분은 비슷한 수준으로 전이성 분획의 형성을 지속할 수 없었다(p-값=0.0056).
실시예 3
rMet 시스템에서 세포의 생육성
도 6에 도시된 실시형태에서, rMet 세포 배양을 수행했고, 이어서 각 분획의 세포 생육성을 측정했다. 세포 조립체는 실시예 1에 따라서 제조했다. 다음의 셀라인이 시험되었다: 유방암(MDA-MB-231, MDA-MB-231BO, MCF7), 전립선암(PC-3 및 LNCap), 폐암(A549), 위암(AGS), 췌장암(Panc-1), 결장암(LoVo), 난소암(SK-OV-3), 흑색종(A375), 고환암(NTERA-2). rMet 모델에서 배양 12-14일 후 세포 생육성을 측정하기 위해 종양-유사, 침습성 및 전이성 분획을 제조자의 지시에 따라 LIVE/DEAD 생육성/세포독성 키트(Life Technologies)를 사용하여 염색했다. 간단히 말하면, 세포를 1μM의 칼세인 AM 및 에티듐 호모다이머-1과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 칼세인 및 에티듐-발생 형광을 각각 493nm 및 528nm 필터 세트를 사용하여 Zeiss AxioObserver 현미경 상에서 염색 1시간 이내에 이미지화했다. 이미지의 밝기, 대비 또는 크기를 편집했으며, ImageJ 소프트웨어(버전 1.46r; NIH)를 사용하여 축척을 부가했다.
도 6은 rMet 모델에서 14일 동안 각 셀라인을 배양한 후 전이성 세포의 대부분(>95%)이 rMet에서 생육성임을 도시한다(녹색: 칼세인 AM 양성, 살아 있는 세포; 적색: 에티듐 호모다이머-1 양성, 죽은 세포).
실시예 4
rMet 시스템과 이종이식편 모델의 비교
도 7에 도시된 실시형태에서, rMet로부터의 전이성 분획의 전이 능력을 검증하기 위해 이종이식편 모델을 설치했다.
rMet 모델로부터의 세포의 전이 잠재성을 평가하기 위해 종양-유사 및 전이성 분획을 제조자의 지시에 따라 다음의 변형을 반영해서 세포 회수 용액(CRS)(BD biosciences)을 사용하여 14일차 rMet 배양물로부터 분리했다. 배지를 rMet 시스템의 상부 및 하부 챔버로부터 제거하고, 얼음 냉각된 CRS 565μl 및 1585μl를 세포 배양 삽입물과 플레이트에 남은 바탕질 층에 각각 첨가했다. CRS/세포/바탕질 혼합물을 마이크로원심분리 튜브로 옮겨서 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 세포를 10분 동안 1800rpm에서 원심분리하여 CRS를 제거하고 PBS로 2x 세척했다. 세포 펠릿을 주사를 위해 1x PBS에 재현탁했다. 원발성 종양-유사 또는 전이성 세포 100 마이크로리터를 27 1/2-게이지 니들을 사용하여 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스(Jackson Labs)의 좌심실에 주사했다. 마우스를 이소플루란(2.0-2.5%, 3.0L/min O2 중에; VetEquip 테이블-탑 증발기)을 사용하여 마취했다. 모든 동물 실험은 동물관리사용 위원회의 승인 후 수행했다. 동물이 허약, 운동성 상실, 체중감소 또는 >1cm3의 감지가능한 종양의 출현을 나타냈을 때 CO2 질식/경부 탈구를 사용하여 동물을 죽였다. 검시 동안 장기 수반 및 전이성 병소의 이미지를 Canon Powershot A650 IS 디지털 카메라를 사용하여 취득했다.
도 7a는 원발성 종양-유사 집단과 비교하여 rMet로부터 유래된 전이성 집단이 높은 빈도와 100% 민감성으로 전이성 병소를 생성한 것을 도시한다(즉, 전이성 분획이 주사된 모든 동물에서 먼 부위 전이가 발생한다).
도 7b는 뼈, 폐, 난소, 간 및 신장과 같은 이차성 부위에서의 전이성 병소의 예를 제공한다.
실시예 5
이종이식편으로부터 수거된 종양 세포를 유세포계수기에 의해서 사람 백혈구 항원(HLA)의 존재에 대해 평가했다.
종양 단편을 작은 조각으로 자르고 37℃에서 30분 동안 0.5-1mg/ml 콜라게나아제(Sigma) 또는 리베라아제(Roche)에서 700rpm로 흔들면서 인큐베이션했다. 성장 배지를 첨가하여 효소를 비활성화하고, 해리된 세포를 40μm 세포 여과기를 통과시키고, 10분 동안 3000rpm에서 원심분리하고, 1x PBS로 한 번 세척하고, 다시 원심분리했다. 세포를 27 1/2-게이지 니들을 가진 10ml 주사기를 사용하여 1x PBS 30-40ml로 대퇴골과 경골의 BM으로부터 플러싱했다. 플러싱된 세포를 위아래로 피펫으로 섞어서 어떤 덩어리를 파괴하고, 40μm 세포 여과기를 통과시키고, 10분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 세포 펠릿을 1분 동안 증류수에 재현탁해서 적혈구 세포를 용해시켰다. 이어서 1x PBS를 수 부피 첨가하고 세포를 10분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 해리된 세포를 10% 중성 완충 포르말린(NBF)로 15분 동안 실온에서 고정하고, 10분 동안 3000rpm에서 원심분리하고, PBS로 한 번 세척하고, 4℃에서 PBS 중에 저장했다. 제조자의 지시에 따라 래트 항-마우스 CD16/32 Fc 차단 시약(BD Pharmingen) 및 M.O.M 키트(Vector laboratories)를 사용하여 비-특이적 결합을 차단했다. 세포를 1시간 동안 마우스 항-HLA-A-C-PE-Cy5 또는 마우스 IgG1κ-PE-Cy5 이소타입 대조군(BD Pharmingen)과 함께 인큐베이션하고, Beckman Coulter FC500 유세포계수기에서 분석했다. 데이터 분석은 FlowJo 소프트웨어(버전 10.0.6)를 사용하여 행했다.
전이성 병소로부터 분리된 세포는 사람 백혈구 항원(HLA)에 대해 양성이었으며, 이것은 각 병소가 주사된 사람 세포로부터 유래되었음을 증명한다. 페어드 t-테스트 분석에 기초하면, 전이성 분획이 주사된 마우스의 전이성 병소에서는 HLA 양성 세포에서 통계적 유의성 증가가 있었지만(p-값=0.021), rMet의 종양-유사 분획이 주사된 마우스에서는 이소타입 대조군의 수준을 넘는 HLA-양성 염색에 증가가 없었다(p-값>0.05).
실시예 6
인시튜 지모그라피를 사용하여 바탕질 메탈로프로테이나아제(MMP) 활성을 검출했다. 세포를 상기 설명된 대로 rMet 모델에서 배양했으며, 이때 제조자의 지시에 따라 DQ-FITC 콜라겐 I 또는 IV(Life Technologies)가 Matrigel 및 rBM 바탕질에 50μg/ml로 포함되었다. MMP 분비를 Zeiss AxioObserver 반전 현미경을 사용하여 형광 현미경으로 14일에 걸쳐서 모니터했다. 각 시간 지점에서 495nm의 여기 파장에 동일한 시간 노출하여 이미지를 취득했다. 이미지를 ImageJ(버전 1.46r; NIH) 또는 Adobe Photoshop CS6 확장형(버전 13.0)를 사용하여 밝기, 대비 및 크기를 편집했다.
실시예 7
rMet의 전임상 능력을 증명하기 위해 종래 모델 및 rMet 전임상 모델을 이용하여 5개 치료제의 효능을 평가했다. 화합물 #1, 3, 및 5는 rMet 시스템에서 평가되었을 때 최소 저항을 나타냈고, 생체내 및 임상 활성을 증명했다. 화합물 #2는 II상 임상 시험에 실패했고, 화합물 #4는 포기되었다; 둘 다 rMet에서 불량한 활성을 나타냈다(rMet 곡선이 실패 역치 위에 유지된다). 따라서, 이 실시예는 rMet 시스템으로부터의 시험 결과와 임상 시험 결과의 높은 상관성을 증명한다. 따라서, 이러한 상관성은 후보 암 치료제의 임상 성능을 예측하는데 있어서 rMet 시스템의 가치를 강조한다.
통계적 분석을 위해 적어도 3개의 독립적인 생물학적 복제물에 대해 각 실험을 수행했다. rBM에서 콜로니화를 개시하기까지 전이성 또는 비-전이성 세포에 의해서 걸린 시간을 카이-스퀘이 테스트를 사용하여 비교했다. BM에서 HLA 양성 세포의 생존 시간 및 존재에 대한 통계적 유의성을 로그-랭크 테스트 및 페어드 t-테스트를 각각 사용하여 결정했다. 데이터는 평균±SD으로 표시되었다. 모든 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(Mac의 경우에 버전 5.0a for Mac; San Diego, CA; www.graphpad.com)를 사용하여 행했고, p<0.05 값이 유의한 것으로 고려되었다.
일부 실시형태는 rMet 조직 배양 조립체와 인큐베이터만을 포함할 수 있지만, 다른 실시형태는 자동화된 이미지 리더, 디지털 현미경, 및/또는 유세포계수기를 더 포함할 수 있다. rMet 조직 배양 장치의 일부 실시형태에서, 자동화된 이미지 리더가 디지털 현미경 및/또는 유세포계수기에 결합될 수 있고, 및/또는 디지털 현미경이 유세포계수기에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 구성요소의 전부 또는 어느 것이 컴퓨터 및/또는 사용자 인터페이스에 결합되고 및/또는 이들을 통해서 제어될 수 있다. 고-처리량 및/또는 고-함량 스크리닝에 적합한 일부 실시형태에서, 일부 또는 모든 구성요소의 제어가 자동화될 수 있다.
바람직한 실시형태를 설명할 목적에서 특정 실시형태들이 여기 예시되고 설명되었지만, 동일한 목적으로 달성하도록 계산된 광범위한 대용 및/또는 동등한 실시형태 또는 실시가 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 제시되고 설명된 실시형태를 대신할 수 있음이 당업자에게 인정될 것이다. 당업자는 본 발명에 따른 실시형태들이 매우 광범위한 방식으로 실시될 수 있음을 쉽게 인정할 것이다. 본 출원은 여기 논의된 실시형태의 임의의 개조 또는 변형을 포괄하도록 의도된다. 따라서, 본 발명에 따른 실시형태는 청구항 및 그것의 등가물에 의해서반 제한되어야 한다는 것이 명백하다.

Claims (24)

  1. a) 척추동물로부터 유래된 유체 및 선택적으로 원발성 부위 성장 바탕질을 포함하는 제1 성분,
    b) 생물학적 바탕질 의태물을 포함하는 제2 성분, 및
    c) 제1 성분 및 제2 성분과 유체 접촉하는, 이차성 부위 성장 배지를 포함하는 동적 유체 성분
    을 포함하는 세포 배양 조립체로서, 상기 이차성 부위 성장 배지가 유체보다 높은 혈청 농도를 갖는 세포 배양 조립체.
  2. 제 1 항에 있어서, 이차성 부위 성장 배지가 적어도 8% 혈청 또는 혈청 대용물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  3. 제 1 항에 있어서, 이차성 부위 성장 배지가 적어도 15% 혈청 또는 혈청 대용물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  4. 제 2 항에 있어서, 유체는 5% 미만의 혈청 또는 혈청 대용물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  5. 제 2 항에 있어서, 이차성 부위 성장 배지가 유체보다 적어도 두 배인 혈청 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  6. 제 1 항에 있어서, 제1 성분 및 제2 성분은 별도의 조직 배양 용기 내에 함유된 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  7. 제 1 항에 있어서, 제1 성분은 삽입물 용기 내에 적어도 부분적으로 함유된 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분에 결합된 펌프 또는 교반 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분에서 유체는 건강한 척추동물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분에서 유체는 암을 가진 척추동물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 유체 성분은 암을 가진 척추동물로부터 획득된 유체를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 유체 성분은 골수 기질 세포의 배양물로부터 획득된 유체를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 바탕질 의태물은 장기-특이적 바탕질을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  14. 제 13 항에 있어서, 장기-특이적 바탕질은 부신, 골수, 뇌, 간, 폐 조직, 림프절, 난소, 복막, 피부, 비장, 결합조직, 뼈, 혈관 구조, 또는 관절을 모사하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 바탕질 의태물은 콜라겐 1-14 또는 그것의 단편, 엘라스틴, 라미닌, 피브로넥틴, 히알루론산 또는 관련된 히알루로난, 렉티칸, Matrigel® 또는 다른 글리코사미노글리칸, 콘드로이틴, 더마탄, 또는 관련된 세포외 바탕질 또는 당질피질 성분 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분은 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 신장, 간, 폐, 피부, 난소, 췌장, 전립선, 위, 고환, 갑상선, 또는 자궁의 고상 종양, 내피세포, 평활근세포, 혈관주변세포, 흉터, 섬유화 조직, 수술 유착 조직 또는 과증식성 뼈 병소를 의태하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분은 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 엘라스틴, 라미닌, 피브로넥틴, 히알루론산, 렉티칸, Matrigel® 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템은 약 30℃ 내지 약 45℃의 온도에서 유지되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 조립체.
  19. a) 잠재적 항암/항-HPP 치료제를 포함하는 용액을 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 세포 배양 조립체에 가하는 단계로서, 세포 배양 조립체의 제2 성분이 전이성 암세포, 또는 HPP 세포의 검출가능한 양을 포함하는 단계,
    b) 잠재적 항암/항-HPP 치료제를 가하기 전후에 세포 배양 조립체에 존재하는 원발성 종양, 침습성, 또는 전이성 암세포 또는 HPP 세포의 양을 검출하는 단계, 및
    c) 잠재적 항암/항-HPP 치료제를 확인하는 단계
    를 포함하는, 항암 또는 항-과증식성(항-HPP) 치료제를 확인하는 방법.
  20. a) 잠재적 항암/항-HPP 치료제 또는 조합 또는 치료 일정을 포함하는 용액을 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 세포 배양 조립체의 제1 또는 제2 성분에 가하는 단계로서, 세포 배양 조립체의 제2 성분이 전이성 암세포 또는 HPP 세포의 검출가능한 양을 함유하는 단계,
    b) 잠재적 항암/항-HPP 치료제, 조합, 또는 치료 일정을 가하기 전후에 제2 성분에 존재하는 전이성 암세포 또는 HPP 세포의 양을 검출하는 단계, 및
    d) 항암/항-HPP 치료제, 조합 또는 치료 일정의 효능을 확인하는 단계
    를 포함하는, 환자에 대한 항암/항-HPP 치료제 또는 조합 또는 치료 일정의 효능을 확인하는 방법.
  21. a) 환자로부터 획득된 암세포 또는 HPP 세포를 포함하는 용액을 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 세포 배양 조립체의 제1 성분에 가하는 단계로서, 세포 배양 조립체의 제2 성분이 환자로부터의 암세포 또는 HPP 세포의 검출가능한 양을 포함하는 단계, 및
    b) 충분한 시간 기간 후에 세포 배양 조립체의 제2 성분에서 전이성 암세포 또는 HPP 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
    를 포함하는, 환자에서 암의 전이성 전파 또는 병리학적 HPP 성장의 진행을 예측 및/또는 확인하는 방법.
  22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 조립체는 조립체에 결합된 전이성 세포의 콜로니화를 검출하기 위한 시스템을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 조립체는 조립체에 결합된 전이성 암세포 또는 HPP 세포의 콜로니화 또는 성장을 검출하기 위한 디지털 현미경 또는 시스템을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 조립체는 조립체에 결합된 유세포계수기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020167021002A 2014-01-22 2015-01-21 치료제를 평가하고 전이 능력을 예측하기 위해 침습성 및 전이성 세포를 분리하기 위한 방법 및 장치 KR20160106108A (ko)

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