KR102534195B1 - 암 모델링 플랫폼 및 그를 사용하는 방법 - Google Patents

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KR102534195B1
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알렉산더 스카달
콘스탄티노스 보타노폴로스
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웨이크 포리스트 유니버시티 헬스 사이언시즈
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Abstract

종양 모델로서 유용한 인 비트로 세포 구조체(또는 "오가노이드(organoid)")로서, 상기 구조체는 개체로부터 유래된 살아있는 종양 세포를 포함하는 것인 인 비트로 세포 구조체가 본 명세서에 개시된다. 일부 구체예에서, (a) 살아있는 종양 세포로 이루어진(comprised of) 코어(core); 및 (b) 상기 코어를 둘러싸는(예를 들면, 캡슐화하는) 쉘(shell)로서, 상기 쉘은 살아있는 양성 세포(live benign cell)(예를 들면, 조직 세포, 양성 또는 분화된 종양 세포, 등)로 이루어진 것인 쉘을 포함하는, 인 비트로 세포 구조체가 제공된다. 또한, 그러한 구조체를 제조하고 사용하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 또한, (a) 챔버, 및 상기 챔버와 유체 소통(fluid communication)하는 채널을 갖는 미세유체 장치(microfluidic device); (b) 상기 챔버 중의 살아있는 종양 세포 구조체(예를 들면, 오가노이드); (c) 상기 챔버 및 상기 채널 중의 증식 배지; (d) 상기 챔버 및 채널과 작동가능하게 결합되고(operatively associated), 상기 챔버로부터 상기 채널을 통해 순환하여 상기 챔버로 되돌아오게 배지를 순환시키도록 구성된 펌프; (e) 상기 채널에 존재하고, 상기 배지가 관통해서 흐를 수 있도록 배치된 미세다공성 막(예를 들면, TRANSWELL® 미세다공성 막)을 포함하는, 인 비트로에서 종양 세포를 평가하기 위해 유용한 장치가 제공된다.

Description

암 모델링 플랫폼 및 그를 사용하는 방법
관련 출원 정보
본 출원은, 참조에 의해 각각의 개시가 전체로 본 명세서에 포함된, 2016년 8월 3일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/370,320호 및 2017년 6월 20일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/522,313호의 이익을 주장한다.
정부 지원의 기술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 교부 번호(grant number) 1U54TR001362-01 및 5UL1TR001420-03 하의 정부 지원으로 이루어졌다.
본 출원은 종양 모델(tumor model)로 사용될 수 있는 인 비트로 세포 구조체(또는 "오가노이드(organoid)") 및 그를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
정밀 의료(precision medicine)는 암 환자에서 치료를 개선시키는 것에 대한 놀라운 가망을 보여준다. 현재, 주요 돌연변이에 근거하여 약물 선택의 범위를 좁히기 위해 종양 생검물에 대한 유전자 프로파일링(genetic profiling)이 수행될 수 있으나, 특정 환자에 대한 절대적인 최선 약물을 선택하는 것은 어려운 것으로 남아 있다. 환자 자신의 세포로 제조된 종양 모델을 이용하여 약물 선택을 스크리닝하는 것이 가장 우수한 효능의 약물을 결정하기 위한 유전적 스크리닝(genetic screening)을 보완할 수 있다. 이러한 환자 특이적 암 모델은 종양의 증식 및 전이 능력에 대한 약물의 효과에 대한 맞춤화된, 예측 데이터를 제공할 것이다.
발명의 요약
본 발명의 제 1 양태는 (a) 살아있는 종양 세포로 구성된(comprised of) 코어(core); 및 (b) 상기 코어를 둘러싸는(또는 캡슐화하는) 쉘(shell)로서, 상기 쉘은 살아있는 양성(benign) 세포(예를 들면, 조직 세포, 양성 또는 분화된 종양 세포, 등)로 구성되는 것인 쉘을 포함하는, 종양 모델로서 유용한 인 비트로 세포 구조체(cell construct)(또는 "오가노이드")이다. 살아있는 종양 세포 및/또는 살아있는 양성 세포는 개체, 예를 들면, 상기 개체로부터 채취된 생검물(biopsy)(예를 들면, 종양 생검물 및/또는 조직 생검물)로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 제 2 양태는 개체로부터 유래된 살아있는 종양 세포를 포함하는, 종양 모델로서 유용한 인 비트로 세포 구조체(또는 "오가노이드")이다. 일부 구체예에서, 상기 살아있는 종양 세포는 상기 개체로부터 채취된 생검물(예를 들면, 종양 생검물)로부터 유래된다.
본 발명의 추가적인 양태는 인 비트로에서 종양 세포를 평가하기에 유용한(예를 들면, 인 비트로에서 종양 세포의 전이를 평가하기에 유용하고, 인 비트로에서 종양 세포 이동(migration) 및/또는 침습(invasion)을 평가하기에 유용하고, 인 비트로에서 종양 세포를 포함하는 구조체의 증식을 평가하기에 유용하고, 및/또는 목적 화합물(compound of interest), 예를 들면, 약물 또는 전구 약물(prodrug)에 대한 반응을 평가하기에 유용한) 장치로서: (a) 챔버, 및 상기 챔버와 유체 소통(fluid communication)되는 채널을 갖는 미세유체 장치; (b) 상기 챔버 중의 살아있는 종양 세포 구조체(예를 들면, 오가노이드); (c) 상기 챔버 및 상기 채널 중의 증식 배지(grwoth media); (d) 상기 챔버 및 채널과 작동가능하게 결합되고, 상기 배지를 상기 챔버로부터 상기 채널을 통해서 상기 챔버로 되돌아오게 순환시키도록 구성된(configured) 펌프; 및 (e) 상기 채널 내에 상기 배지가 관통해 흐를 수 있도록 배치된 미세다공성 막(예를 들면, TRANSWELL® 미세다공성 막)을 포함하는 것인 장치이다.
본 발명의 또 다른 양태는 인 비트로에서 종양 세포를 평가하기에 유용한(예를 들면, 인 비트로에서 종양 세포의 전이를 평가하기에 유용하고, 인 비트로에서 종양 세포 이동 및/또는 침습을 평가하기에 유용하고, 인 비트로에서 종양 세포를 포함하는 구조체의 증식을 평가하기에 유용하고, 및/또는 목적 화합물, 예를 들면, 약물 또는 전구 약물에 대한 반응을 평가하기에 유용한) 장치로서, 상기 장치는 각 챔버에 하나 이상의 오가노이드를 갖는, 2개 이상의 챔버를 포함하는 것인 장치이다. 상기 장치에 존재하는 하나 이상의 오가노이드는 단일 개체로부터 수득된 세포로부터 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 장치는 제 1 챔버(first chamber) 중 살아있는 종양 세포 오가노이드 및 제 2 챔버 중 간 오가노이드를 포함한다. 상기 살아있는 종양 세포 오가노이드 및 간 오가노이드는 동일한 개체로부터 수득된 세포로부터 형성될 수 있고, 이는 맞춤화된 분석(personalized analysis)을 제공할 수 있다.
본 발명의 전술된 목적 및 양태와 기타 목적 및 양태가 하기에서 보다 상세하게 설명된다. 본 발명은 상이한 형태로 구현될 수 있는 것으로 이해되어야 하고 본 명세서에 기재된 구체예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 이러한 구체예는 본 개시가 완벽하고 완전하게 하며, 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달하기 위해 제공된다.
본 발명은 본 발명의 구체예가 도시된, 첨부된 도면을 참조하여 하기에서 보다 완전하게 기술된다. 그러나, 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있고 본 명세서에 기재된 구체예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다; 오히려, 이러한 구체예는 본 개시가 완벽하고 완전하며, 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달하기 위해 제공된다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정한 구체예를 기술하기 위한 목적만을 가지며, 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용된, 단수 형태 "하나(a, an)" 및 "그(the)"는, 문맥상 명확하게 달리 표시되지 않으면, 복수 형태도 포함하도록 의도된다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 명시된 특징, 정수, 단계, 작업(operation), 요소, 성분 및/또는 이들의 그룹 또는 조합의 존재를 특정하나, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 작업, 요소, 성분 및/또는 이들의 그룹 또는 조합의 존재 또는 첨가를 배제하지 않는 것으로 또한 이해될 것이다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 용어(기술 및 과학 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에서 정의된 것과 같은 용어들은 명세서 및 청구항의 문맥에서 그들의 의미와 일관된 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고 본 명세서에서 명시적으로 정의되지 않은 경우, 이상화된 또는 과도하게 형식적인(formal) 방식으로 해석되어서는 안 되는 것으로 이해될 것이다. 잘 알려진 기능이나 구성(construction)은 간결성 및/또는 명확성을 위해 상세하게 기재되지 않을 수 있다. 본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허출원, 특허, 및 기타 참조문헌은 그 전체로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 용어에 있어서 상충이 있는 경우, 본 명세서가 지배한다.
또한, 본 명세서에서 사용된, "및/또는(and/or)"은 관련하여 열거된 하나 이상의 항목들의 모든 가능한 조합, 및 대안적으로("또는") 해석되는 경우, 조합의 부재를 포함한다.
문맥이 달리 표시하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 본 발명의 다양한 특징은 임의의 조합으로 이용될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 특징 또는 특징의 조합이 배제되거나 또는 생략될 수 있다는 것을 고려한다. 예시하면, 복합체가 성분 A, B, 및 C를 포함하는 것으로 명세서가 기재하는 경우, A, B, 또는 C, 또는 이들의 조합은 생략되고 부인될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다.
본 명세서에서 사용된, 전환 구(transitional phrase) "필수적으로 구성된(consisting essentially of)" (및 문법적 변형)은 청구된 발명의 기재된 물질 또는 단계, "및 기본적 및 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들(and those that do not materially affect the basic and novel characteristic(s))"을 포괄하는 것을 해석된다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 용어 "필수적으로 구성된"은 "포함하는(comprising)"과 균등한 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에서 측정 가능한 값, 예를 들면, 양 또는 농도 등을 언급할 때 사용된, 용어 "약(about)"은 특정된 값, 및 특정된 값의 최대 ± 20%의 증감, 예를 들면, 특정된 값의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%이나 이에 한정되지 않는 증감(variation)을 의미하도록 의도된다. 예를 들면, X는 측정 가능한 값인 "약 X(about X)"는 X 및 X의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1% 증감을 포함하도록 의도된다. 측정 가능한 값에 대해 본 명세서에 제공된 범위는 본 명세서에 기재된 기타 범위 및/또는 개별적인 값을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "세포(cell)"는 일반적으로, 동물 세포, 특히, 포유동물 세포 및 영장류 세포이고, 그의 예는 인간, 개, 고양이, 토끼, 원숭이, 침팬지, 소, 돼지, 또는 염소를 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 세포는 바람직하게는 적어도 부분적으로 특정 세포 또는 조직 유형, 예를 들면, 간, 장(intestine), 췌장, 림프절, 평활근, 골격근, 중추 신경, 말초 신경, 피부, 면역계 등으로 분화된다. 일부 세포는 하기에서 추가로 검토되는 바와 같이, 암세포일 수 있고, 이 경우, 이들은 선택적으로, 그러나, 바람직하게는 또한 하기에서 검토되는 바와 같은, 검출가능한 화합물을 (자연적으로, 또는 재조합 기법에 의해) 발현한다.
본 발명의 양태가 다른 동물 개체, 특히, 수의학 목적을 위해 포유동물 개체(예를 들면, 개, 고양이, 말, 염소, 양)를 이용하여 구현될 수 있으나, 본 명세서에서 사용된 "개체(subject)"는 일반적으로 인간 개체이다. 개체는 남성 또는 여성일 수 있고, 유아, 청소년, 청년, 성인, 및 노인을 포함한 임의의 연령일 수 있다.
"오가노이드(organoid)"는 본 명세서에서 "세포 구조체(cell construct)" 및 "3차원 조직 구조체(three dimensional tissue construct)"와 호환적으로 사용되고, 일반적으로, (단일층 대비) 3차원 또는 다층 구조(multi-layered configuration)로 배열된, 담체 매질(carrier media) 중 살아있는 세포의 조성물을 의미한다. 적합한 담체 매질은 히드로겔, 예를 들면, 하기에 기술된 가교 히드로겔을 포함한다. 추가적인 예시적 히드로겔은 그 내용이 전체로 참조에 의해 본 명세서에 포함된, PCT/US2015/055699에 기재된 것들을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 오가노이드는 모델링되거나 모방 대상인(emulated) 특정한 조직 또는 기관에 따라, 하나의 분화된 세포 종류, 또는 2종 이상의 분화된 세포 종류를 포함할 수 있다. 일부 오가노이드는 하기에서 더 검토되는 바와 같이, 암세포를 포함할 수 있다. 오가노이드가 암세포를 포함하는 경우, 이들은 조직 세포를 포함할 수 있고, 및/또는 무세포 조직 모방체(tissue mimic without cells), 예를 들면, 세포외 매트릭스(또는 그로부터 유래된 단백질 또는 폴리머), 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 이들의 조합 등을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 세포는 세포외 매트릭스, 또는 가교 매트릭스와 혼합되어 오가노이드 또는 구조체를 형성하고, 반면에, 다른 구체예에서 스페로이드(spheroid) 또는 오가노이드와 같은 세포 응집체(cell aggregate)가 전-형성되고(pre-form), 그 후, 세포외 매트릭스와 합쳐질 수 있다. 일부 구체예에서, 오가노이드는 신생물성 오가노이드(neoplastic organoid) 및/또는 비-신생물성(non-neoplastic) 오가노이드이다.
일부 구체예에서, 오가노이드는 인간-유래 세포인 세포를 포함하고, 일부 구체예에서, 오가노이드는 인간-유래 세포로 구성된 세포를 포함한다. 본 발명의 오가노이드는 인 비보에서 세포에 의해 생성되는 바이오마커와 동일한 하나 이상의 바이오마커(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 그 이상)를 발현하고 및/또는 생성할 수 있다. 예를 들면, 간 세포는 인 비보에서 알부민을 생성하고, 간 세포를 포함하는 본 발명의 오가노이드는 알부민을 발현할 수 있다. 일부 구체예에서, 오가노이드는 인 비보에서 해당하는(corresponding) 세포에 의해 생성되고 및/또는 발현되는 평균량과 동일한 양 또는 평균량의 ±20%, ±10%, 또는 ±5%인 양으로 바이오마커를 발현할 수 있다. 바이오마커의 예는 알부민, 우레아, 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(Glutathione S-transferase)(GST)(예를 들면, α-GST), 케모카인(예를 들면, IL-8, IL-1β, 등), 프로스타사이클린(prostacyclin), SB100B, NSE(neuron-specific enolase), MBP(myelin basic protein), 호르몬(예를 들면, 테스토스테론, 에스트라디올, 프로게스테론, 등), 인히빈(inhibin) A/B, 락테이트 데히드로게나아제(LDH), 및/또는 TNF(tumor necrosis factor)를 포함하나, 그에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 오가노이드는 직경이 약 200 ㎛ 내지 약 350 ㎛, 예를 들면, 약 200, 250, 300, 또는 350 ㎛이다. 오가노이드는 총 약 1,500개 또는 2,000개 내지 약 3,000개 또는 3,500개의 세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 오가노이드는 적절한 형태, 예를 들면, 임의의 3차원 형태 또는 다층형 형태일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 오가노이드는 스페로이드의 형태이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 오가노이드는 현탁액 또는 매질(media)(예를 들면, 가교 히드로겔)에서 자가-조직화(self-organize)될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "증식 배지(growth media)"는 본 발명의 실시에서 사용되는 세포를 유지하는 천연 또는 인공 증식 배지(일반적으로 수성 액체)일 수 있다. 예는 필수 배지(essential media) 또는 최소 필수 배지(MEM), 또는 그의 변형, 예를 들면, EMEM(Eagle's minimal essential medium) 및 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), 및 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 그들의 합성 모방물(synthetic mimics) 등을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 증식 배지는 pH 발색 지시약(pH color indicator)(예를 들면, 페놀 레드)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된, "후보 화합물(candidate compound)" 또는 "목적 화합물"은 원발 부위(primary site)로부터 이차 부위(second site)로의 암세포의 확산(spreading)을 억제하는 활성이 결정되거나, 또는 암세포 생존력 저하 및/또는 항-종양 활성이 결정될 화합물일 수 있다. 예시적 목적을 위해, 마리마스타트(Marimastat)(N-[2,2-디메틸-1-(메틸카르바모일)프로필]-2-[히드록시-(히드록시카르바모일)메틸]-4-메틸-펜탄아미드)가 테스트 화합물로 사용된다. 그러나, 임의의 화합물이 사용될 수 있고, 일반적으로, 유기 화합물, 예를 들면, 단백질, 펩티드, 핵산, 및 소형 유기 화합물(지방족, 방향족, 및 혼합 지방족/방향족(mixed alipathic/aromatic) 화합물)이 사용될 수 있다. 후보 화합물은 조합 기법(combinatorial technique)에 의한 랜덤 생성, 및/또는 특정 표적에 기반하여 합리적으로 설계된 것을 포함한, 적합한 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, A.M. Stock et al., Targets for anti-metastatic drug development, Curr. Pharm. Des. 19(28): 5127-34 (2013)을 참조한다. 일부 구체예에서, 후보 화합물은 테스트 및/또는 본 발명의 방법 동안 활성 약물로 전환될 수 있는, 전구 약물(prodrug)이다. 일부 구체예에서, 전구 약물은 간 오가노이드에 의해 활성 약물로 전환된다.
본 명세서에서 사용된, "검출가능한 화합물(detectable compound)"은 형광 단백질(예를 들면, 적색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 등), 효소, 형광 그룹, 또는 방사성(radioactive) 그룹, 또는 기타 표지(label)에 결합된 항체에 특이적으로 결합할 항원성(antigenic) 단백질, 또는 펩티드, 또는 기타 적합한 검출가능한 화합물일 수 있다. 검출가능한 화합물은 암세포에서 자연적으로 발생하는 것(예를 들면, 비-암세포보다 암세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 세포 마커 단백질), 또는 유전 공학 및/또는 재조합 DNA 기법에 의해 암세포에 삽입된 것(즉, 이종기원성(heterologous))일 수 있다.
본 발명을 실시하기 위해 사용되는 세포는 바람직하게는 동물 세포(예를 들면, 조류, 파충류, 양서류, 등)이고, 일부 구체예에서, 바람직하게는 포유동물 세포(예를 들면, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 원숭이, 유인원, 인간)이다. 세포는 분화된 세포 또는 미분화(undifferentiated) 세포일 수 있으나, 일부 구체예에서, 조직 세포(예를 들면, 간세포(hepatocyte)와 같은 간 세포, 췌장 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 등)이다.
세포의 선택은 생성될 특정 오가노이드에 의존적일 것이다. 예를 들면, 간 오가노이드의 경우, 간 실질세포(liver hepatocyte)가 사용될 수 있다. 말초 또는 중추 신경 오가노이드의 경우, 말초 신경 세포, 중추 신경 세포, 아교 세포(glia cell), 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 골 오가노이드(bone organoid)의 경우, 골의 조골세포(osteoblast), 골의 파골세포(osteoclast), 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 폐 오가노이드의 경우, 폐 기도 상피 세포(lung airway epithelial cell)가 사용될 수 있다. 림프절 오가노이드의 경우, 소포성 수지상 림프 세포(follicular dendritic lymph cell), 섬유 세망 림프 세포(fibroblastic reticular lymph cell), 백혈구, B 세포, T 세포, 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 평활근 오가노이드 또는 골격근 오가노이드의 경우, 평활근 세포, 골격근 세포, 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 피부 오가노이드의 경우, 피부 각질형성세포(skin keratinocyte), 피부 멜라닌 형성 세포(skin melanocyte), 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 조성물로의 최초 혼합(incorporation) 시 분화될 수 있거나, 또는 뒤이어 분화되는 미분화 세포가 사용될 수 있다. 추가적인 세포가 전술된 조성물에 첨가될 수 있고, 하기에 기술되는 바와 같은 암세포가 하기에 기술된, 일차(primary) 또는 "제 1(first)" 오가노이드에 첨가될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 암세포는 흑색종 세포, 암종(carcinoma) 세포, 육종 세포, 모세포종(blastoma) 세포, 신경교종(glioma) 세포, 및 성상세포종(astrocytoma) 세포, 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 종류의 암세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 암세포는 본 명세서에 교시된 방법에서 N-카데린(N-cadherin)을 발현하고, 및/또는 상피의 간엽으로의 전이(epithelial to mesenchymal transition)을 보인다. 암세포는 장(소장, 대장, 결장) 암세포, 폐암 세포, 유방암 세포, 전립선암 세포, 피부암 세포, 골암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 자궁암 세포, 경부암 세포, 정소암 세포, 및 난소암 세포 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 임의의 기원의 조직으로부터 유래된 암세포일 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 개체, 예를 들면, 암의 치료를 받고 있고 및/또는 암을 갖는 개체 또는 환자, 및/또는 약화된 면역계를 갖는 개체로부터 수득될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 종양 세포, 예를 들면, 생검물-유래 종양 세포이고, 그러한 세포로부터 제조된 오가노이드가 잠재적으로 효과적인 약물 및/또는 치료를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 생검물-유래 종양 오가노이드의 예는 중피종, 결장암, 충수암, 폐암, 흑색종 및 육종 오가노이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 세포는 조직 생검물로부터 수득된 양성 세포를 포함한다. 세포는 적어도 부분적으로 특정 세포 또는 조직 종류, 예를 들면, 뇌, 간, 장, 췌장, 림프절, 평활근, 골격근, 중추 신경, 말초 신경, 피부, 면역계, 등으로 분화될 수 있다. 생검물-유래 세포(예를 들면, 종양 및/또는 양성)가 본 발명의 오가노이드를 형성 및/또는 제조하기 위해 사용될 수 있고, 결과적으로 수득된 오가노이드는 생검 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8일 내에 본 발명의 방법 및/또는 장치에서 제조 및/또는 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 형광 화합물(예를 들면, 염료, 단백질, 등)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 검출가능한 화합물로 표지될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 오가노이드는 불멸화 세포주(immortalized cell line)로부터 유래된 세포로부터 제조되지 않고 및/또는 그러한 세포를 포함하지 않는다. 본 발명의 오가노이드는 일차 세포 및/또는 줄기 세포, 예를 들면, 유도된 다능성 줄기 세포 및/또는 분화된 iPS-유래 세포와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 고 기능성(high functioning) 세포를 포함하고 및/또는 이를 이용하여 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 양태 및 특징은 공지된 재료, 방법, 및 기법, 또는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명할 이들의 변형에 따라 구현될 수 있다. 예를 들면, Skardal A, Devarasetty M, et al. A reductionist metastasis-on-a-chip platform for in vitro tumor progression modeling and drug screening. Biotechnology and Bioengineering 113(9), 2020-32 (2016); Skardal A, Devarasetty M, et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomaterialia 25, 24-34 (2015); Bhise N, Manoharan V, et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication 8(1); 014010 (2016)을 참조한다.
전술된 바와 같이, 본 발명은 (a) 살아있는 종양 세포로 구성된 코어; 및 (b) 상기 코어를 둘러싸는(예를 들면, 캡슐화하는) 쉘로서, 상기 쉘은 살아있는 양성 세포(예를 들면, 조직 세포, 양성 또는 분화된 종양 세포, 등)로 구성되는 것인 쉘을 포함하는, 종양 모델로서 유용한 인 비트로 구조체(또는 "오가노이드")를 제공한다.
일부 구체예에서, 살아있는 종양 세포는 악성(malignant) 세포를 포함한다.
일부 구체예에서, 살아있는 종양 세포는 결장암 세포(예를 들면, HCT116 세포, HT29 세포, SW480 세포, Caco2 세포, 등)를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
일부 구체예에서, 종양 세포 및 양성 세포는 포유동물 세포(예를 들면, 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 등)를 포함한다.
일부 구체예에서, 살아있는 양성 세포는 상피 세포를 포함한다.
일부 구체예에서, 살아있는 양성 세포는 Caco-2 세포를 포함한다.
일부 구체예에서, 종양 세포는 검출가능한 화합물(예를 들면, 형광 화합물)을 포함한다.
일부 구체예에서, 코어 및/또는 쉘은 히드로겔을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 구조체는 1 또는 2일, 또는 1 내지 2주, 또는 그 이상의 시간 동안 배양으로 증식된다.
일부 구체예에 따라, 개체로부터 유래된 살아있는 종양 세포를 포함하는, 종양 모델로서 유용한 인 비트로 세포 구조체(또는 "오가노이드")가 제공된다. 일부 구체예에서, 살아있는 종양 세포는 개체, 예를 들면, 개체의 종양으로부터 수득되고 및/또는 유래된다. 살아있는 종양 세포는 종양 생검물로부터 수득 및/또는 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, 살아있는 종양 세포는 오가노이드의 코어를 형성하고, 오가노이드는 살아있는 양성 세포의 쉘을 포함한다.
일부 구체예에서, 개체로부터 유래된 살아있는 양성 세포를 포함하는 오가노이드가 제공된다. 양성 세포는 개체, 예를 들면, 개체 중 조직으로부터 수득되고 및/또는 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, 살아있는 양성 세포는 조직 생검물로부터 수득 및/또는 유래될 수 있고 및/또는 조직 특이적일 수 있다. 살아있는 양성 세포를 포함하는 오가노이드는 살아있는 종양 세포를 포함하는 오가노이드와 별개일(예를 들면, 장치의 상이한 챔버에 존재하고 및/또는 별개로 형성됨) 수 있다. 일부 구체예에서, 2종 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8종 또는 그 이상)의 상이한 오가노이드가 단일 개체로부터 (상기 개체로부터의 하나 이상의 생검물을 이용하여) 수득 및/또는 유래된 세포로 형성되고, 하나 이상의 오가노이드는 상기 개체로부터의 종양 생검물로부터 유래된 살아있는 종양 세포를 포함하고, 하나 이상의 별개의 오가노이드는 상기 개체로부 유래된 살아있는 간 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 2개 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 그 이상)의 오가노이드가 단일 개체로부터 수득되고 및/또는 유래된 세포로 (예를 들면, 개체로부터의 하나 이상의 생검물을 이용하여) 형성되고, 하나 이상의 오가노이드는 상기 개체로부터의 종양 생검물로부터 유래된 살아있는 종양 세포를 포함하고, 하나 이상의 별개의 오가노이드는 상기 살아있는 종양 세포와 동일한 조직 유형인 상기 개체로부터의 살아있는 양성 세포를 포함한다.
본 발명의 오가노이드는 환자-특이적 모델 시스템을 제공할 수 있고, 이는 환자를 위한 치료를 결정하기 위해 이용될 수 있고, 선택적으로 치료제 및/또는 치료의 개시 전에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 목적 화합물은 항-종양 활성에 대해 스크리닝될 수 있고, 선택적으로, 추가적인 스크리닝 방법, 예를 들면, 유전적 바이오마커 평가 및/또는 유전자 프로파일링에 더해 항-종양 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 오가노이드 및/또는 방법은 세포 바이오마커 인식(cellular biomarker recognition), 바이오마커 발현 정량, 및/또는 화학요법 약물 효능의 실시간 테스트를 가능하게 하고 및/또는 제공할 수 있다.
인 비트로에서 항-종양 활성에 대한 목적 화합물(compound of interest)을 스크리닝하는 방법이 (a) 본 명세서에 기재된 살아있는 종양 세포를 포함하는 하나 이상의 구조체를 제공하는 단계; (b) 인 비트로에서 상기 화합물을 상기 구조체와 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 살아있는 종양 세포의 증식을 (예를 들면, 상기 화합물과 접촉되지 않은 하나 이상의 동일한(like) 구조체의 종양 세포와 비교하여, 및/또는 상기 구조체 주위의 쉘에 존재하고 및/또는 별개의 오가노이드에 존재하는 살아있는 양성 세포와 비교하여) 결정하는 단계로서, 상기 살아있는 종양 세포의 증식의 감소(예를 들면, 상기 종양 세포의 증식의 부재, 상기 종양 세포의 사망, 상기 종양 세포에 의한 상기 쉘의 침습의 감소, 등)는 상기 목적 화합물의 항-종양 활성을 나타내는 것인 단계에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 세포는 종양을 가진 환자로부터 수집된다. 일부 구체예에서, 목적 화합물은 전구 약물이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 화합물이 인 비트로에서 종양 세포의 증식을 감소시키는 것으로 결정되는 경우, 상기 환자에게 상기 화합물을 치료-유효량(treatment-effective amount)으로 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 개체(예를 들면, 환자)로부터 종양 생검물을 수득하는 단계, 및 세포를 이용하여 본 발명의 오가노이드를 제조하는 단계를 포함한다. 종양 생검물은 돌연변이를 식별하기 위해 부분적으로 또는 완전하게 유전자 서열결정될 수 있고, 식별된 돌연변이는 개체에 대한 치료적 목적(예를 들면, 항-종양 활성)을 위한 하나 이상의 목적 화합물을 나타내고 및/또는 제안할 수 있다. 상기 방법은 유전자 서열결정에서 식별된 하나 이상의 화합물을 스크리닝하는 단계 및 상기 하나 이상의 목적 화합물 각각, 및/또는 이들의 조합을 종양 생검물로부터 유래된 세포를 이용하여 제조된 오가노이드와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 하나 이상의 화합물이 인 비트로에서 종양 세포의 증식을 감소시키는 것으로 결정되는 경우 종양 생검출이 채취된 개체에 하나 이상의 상기 화합물을 치료-유효량으로 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 개체로부터의 종양 생검물로부터 수득된 살아있는 종양 세포로부터 종양 세포 오가노이드를 제조하는 단계 및 동일한 개체 또는 상이한 출처(source)로부터 수득된 살아있는 간 세포로부터 간 오가노이드를 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 살아있는 종양 세포 및 살아있는 간 세포는 동일한 개체로부터 수득된다. 살아있는 종양 세포 오가노이드 및 간 오가노이드는 상호 간에 유체소통되도록 (예를 들면, 장치, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 장치에서) 제공될 수 있고, 목적 화합물을 살아있는 종양 세포 오가노이드 및/또는 간 오가노이드와 접촉시킬 수 있다. 또한, 살아있는 종양 세포 오가노이드 중 살아있는 종양 세포의 증식이 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 목적 화합물은 전구 약물이고, 이는 간 오가노이드가 대사하여 활성 약물을 제공할 수 있고, 활성 약물의 활성이 결정될 수 있다(예를 들면, 살아있는 종양 세포 및/또는 간세포의 증식이 전구 약물 및/또는 활성 약물에 의해 영향받는지 여부가 결정될 수 있다). 하나 이상의 추가적인 오가노이드가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가적인 오가노이드는 동일한 개체로부터 유래될 수 있고 상기 개체 중 동일한 조직 또는 상이한 조직으로부터 유래될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및/또는 장치는 2종 이상(예를 들면, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 또는 그 이상)의 목적 화합물의 병렬 스크리닝(parallel screening)을 제공할 수 있고 및/또는 가능하게 할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 2종 이상의 목적 화합물 중 하나 이상은 전구 약물이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및/또는 장치는 상기 방법 및/또는 장치에서 사용된 본 발명의 오가노이드를 제조하기 위해 사용되었던 세포가 수득된 개체로부터의 생검(예를 들면, 종양 생검) 후 약 1 또는 2주 내(예를 들면, 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 또는 10일 이내)에 결과(예를 들면, 약물 스크리닝 결과 및/또는 치료효과(therapeutic) 분석)을 제공하고 및/또는 수득될 수 있게 한다.
또한, 본 명세서에, (a) 챔버, 및 상기 챔버와 유체 소통(fluid communication)되는 채널을 갖는 미세유체 장치; (b) 상기 챔버 중의 살아있는 종양 세포 구조체(예를 들면, 오가노이드); (c) 상기 챔버 및 상기 채널 중의 증식 배지; (d) 상기 챔버 및 채널과 작동가능하게 결합되고, 상기 배지를 상기 챔버로부터 상기 채널을 통해서 상기 챔버로 되돌아오게 순환시키도록 구성된 펌프; 및 (e) 상기 채널 내에, 상기 배지가 관통해 흐를 수 있도록 배치된 미세다공성 막(예를 들면, TRANSWELL® 미세다공성 막)을 포함하는, 인 비트로에서 종양 세포를 평가하기에 유용한 장치가 기재된다. 일부 구체예에서, 상기 장치는 인 비트로에서 종양 세포의 전이를 평가하기에 유용하고, 인 비트로에서 종양 세포 이동 및/또는 침습을 평가하기에 유용하고, 인 비트로에서 종양 세포를 포함하는 구조체의 증식을 평가하기에 유용하고, 및/또는 목적 화합물에 대한 반응을 평가하기에 유용하다. 일부 구체예에서, 상기 장치는 인 비트로에서 구조체 크기, 인 비트로에서 종양 세포의 개수 및/또는 인 비트로에서 종양 세포 사망을 평가하는데 유용할 수 있다.
일부 구체예에서, 인 비트로에서 종양 세포를 평가하는데 유용한 장치는 2개 이상의 챔버를 포함하고, 각 챔버는 하나 이상의 오가노이드를 포함하고, 상호 간에 유체소통된다. 상기 장치는 인 비트로에서 종양 세포의 전이를 평가하고, 인 비트로에서 종양 세포 이동 및/또는 침습을 평가하며, 인 비트로에서 종양 세포를 포함하는 구조체의 증식을 평가하고, 및/또는 목적 화합물에 대한 반응을 평가하는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 장치는 인 비트로에서 구조체 크기, 인 비트로에서 종양 세포의 개수, 및/또는 인 비트로에서 종양 세포 사망을 평가하는데 유용할 수 있다. 상기 장치에 존재하는 하나 이상의 오가노이드는 단일 개체로부터 수득된 세포로부터 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 장치는 제 1 챔버 중 살아있는 종양 세포 오가노이드 및 제 2 챔버 중 간 오가노이드를 포함한다. 상기 살아있는 종양 세포 오가노이드 및 간 오가노이드는 동일한 개체로부터 수득된 세포로부터 형성될 수 있고, 이는 맞춤화 분석을 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 장치는: 살아있는 종양 세포 오가노이드를 포함하는 일차 챔버; 상이한 오가노이드를 포함하는 하나 이상의 이차 챔버; 상기 일차 챔버와 이차 챔버를 연결하고 그들 간에 유체 소통(예를 들면, 증식 배지의 흐름)을 제공하는 하나 이상의 일차 도관(conduit); 및 선택적으로 상기 일차 챔버, 각각의 이차 챔버, 및 상기 일차 도관 중 증식 배지를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 2개 이상(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 그 이상)의 이차 챔버가 제공되고, 각각 상호 간에 상이한 세포를 포함하는 오가노이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 이차 챔버는 간 오가노이드를 포함하고, 선택적으로, 상기 살아있는 종양 세포 오가노이드 및 간 오가노이드는 동일한 개체로부터 수득된 세포로 제조된다. 추가적인 예시적 장치는 그 내용이 전체로 본 명세서에 포함된, PCT/US2016/054611에 기재된 것을 포함하나, 그에 한정되지 않는다.
2개의 챔버를 포함하는 예시적 장치가 도 15에 도시된다. 5개의 챔버를 갖는 또 다른 예시적 장치가, 상이한 단계에서 배지가 장치의 챔버들을 통해 흐를 수 있는 방법과 함께 도 16에 도시된다. 도 17은 본 발명의 양태에 따라 검출가능한 화합물로 표지된 세포(예를 들면, 종양 세포)를 추적하기 위해 사용될 수 있는, 장치 구조(device configuration)의 개략도이다.
일부 구체예에서, 종양 세포 구조체는 히드로겔을 포함한다.
일부 구체예에서, 종양 세포 구조체는 단일 세포 종류로 구성된다.
일부 구체예에서, 종양 세포 구조체는 결장암 세포(예를 들면, HCT116 세포, HT29 세포, SW480 세포, Caco2 세포, 등)를 포함하거나 또는 그로 구성된다.
일부 구체예에서, 미세유체 장치의 적어도 일부분은 투명하고, 상기 장치는 미세다공성 막과 작동가능하게 결합되고 상기 미세다공성 막 상의 종양 세포를 검출(예를 들면, 이미징)하도록 구성된 검출기(예를 들면, 카메라)를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 장치는 생리적 또는 고생리적 체액 대 조직 부피 비(physiological or hyperphysiological fluid to tissue volume ratio)를 제공하도록 구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 장치의 하나 이상의 챔버는 약 2 ㎕ 내지 약 10 ㎕ 범위의 평균 부피를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 장치의 하나 이상의 챔버는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 ㎕의 평균 부피를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 장치(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 그 이상의 챔버를 포함하는 장치)는 약 100 ㎕ 미만, 예를 들면, 약 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 ㎕ 또는 그 미만의 양의 액체를 사용하고 및/또는 부피를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 상기 장치의 부피는 상기 장치의 챔버(들) 및 채널(들)을 채우기 위한 부피를 의미한다. 일부 구체예에서, 상기 장치는 약 50 ㎕ 미만의 양의 액체를 사용하고 및/또는 약 50 ㎕ 미만의 부피를 가질 수 있다.
본 발명의 오가노이드는 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상 동안 생존가능할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 장치 중 오가노이드 및/또는 본 발명의 방법에서 사용되는 오가노이드는 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상 동안 생존가능할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 오가노이드는 생존 가능할 수 있고, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상의 주에 오가노이드에 존재하는 세포의 평균 개수 기준 적어도 약 75% 또는 그 이상(예를 들면, 약 80%, 85%, 90%, 95% or more)의 살아있는 세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 세포 및/또는 세포 시료가 본 발명의 오가노이드를 형성하기 위해 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 생존 가능한 오가노이드를 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 적어도 50% 또는 그 이상, 예를 들면, 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 그 이상의 수율(take rate)을 달성할 수 있다. 예를 들면, 90% 수율은 시도의 90%에서 본 발명의 방법에 의해 생존 가능한 오가노이드 또는 복수의 오가노이드(예를 들면, 오가노이드 세트(organoid set))가 달성되고 및/또는 제공된다는 것을 의미한다. 즉, 90% 수율의 경우, 10개의 세포 시료(예를 들면, 종양 세포 시료) 중 9개가 본 발명의 방법에 따라 제조시, 생존 가능한 오가노이드 또는 복수 개의 오가노이드를 생성한다. 오가노이드 또는 복수 개의 오가노이드가 본 발명의 또 다른 방법 및/또는 진단에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 또는 세포 시료는 종양, 예를 들면, 중피종 생체시료(biospecimen) 및/또는 GI 종양 생체시료로부터 유래될 수 있다.
인 비트로에서 전이 활성에 대해 종양 세포를 스크리닝하는 방법이: (a) 전술된 장치를 제공하는 단계; (b) 상기 장치에서 배지를 순환시키는 단계; 및 (c) 미세다공성 막에 포획된 종양 세포를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 단계로서, (예를 들면, 동일한 조건 하에서 다른 종양 세포, 및/또는 동일한 조건 하에서 비-전이성 세포 대비) 더 많은 수의 포획된 종양 세포는 상기 종양 세포의 더 큰 전이 활성을 나타내는 것인 단계에 의해 수행될 수 있다.
인 비트로에서 전이 활성에 대해 종양 세포를 스크리닝하는 방법이: (a) 전술된 장치(예를 들면, 살아있는 종양 세포 오가노이드를 포함하는 일차 챔버 및 하나 이상의 이차 챔버를 포함하는 장치)를 제공하는 단계; (b) 상기 장치에서 배지를 순환시키는 단계; 및 (c) 하나 이상의 상기 이차 챔버에(예를 들면, 선택적으로 이차 챔버에 존재하는 오가노이드 상에 및/또는 내에) 존재하는 종양 세포를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 단계로서, (예를 들면, 동일한 조건 하에서 다른 종양 세포, 및/또는 동일한 조건 하에서 비-전이성 세포 대비) 상기 하나 이상의 이차 챔버에 존재하는 더 많은 수의 종양 세포는 상기 종양 세포의 더 큰 전이 활성을 나타내는 것인 단계에 의해 수행될 수 있다.
인 비트로에서 항-전이 활성 및/또는 항-종양 활성에 대해 목적 화합물을 스크리닝하는 방법이: (a) 전술된 장치를 제공하는 단계; (b) 상기 장치에서 배지를 순환시키는 단계; (c) 상기 화합물을 상기 종양 세포에 (예를 들면, 상기 화합물을 상기 배지에 첨가하는 것에 의해) 투여하는 단계; 및 (d) 상기 미세다공성 막에 포획된 종양 세포를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 단계로서, (예를 들면, 동일하나, 상기 목적 화합물의 투여가 없는 조건 하에서 다른 종양 세포 대비) 더 적은 수의 포획된 종양 세포는 상기 목적 화합물의 더 높은 항-전이 활성을 나타내는 것인 단계에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 세포는 종양을 가진 환자로부터 수집된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 화합물이 인 비트로에서 상기 종양 세포의 전이를 감소시키고, 인 비트로에서 구조체 크기를 감소시키고, 인 비트로에서 종양 세포의 개수를 감소시키고, 및/또는 인 비트로에서 종양 세포 사망을 유도하는 것으로 결정되는 경우, 상기 환자에게 상기 화합물을 치료-유효량으로 투여하는 단계를 더 포함한다.
인 비트로에서 항-전이 활성 및/또는 항-종양 활성에 대해 목적 화합물을 스크리닝하는 방법은: (a) 전술된 장치를 제공하는 단계; (b) 상기 장치에서 배지를 순환시키는 단계; (c) 상기 화합물을 상기 종양 세포에 (예를 들면, 상기 화합물을 상기 배지에 첨가하는 것에 의해) 투여하는 단계; 및 (d) 일차 챔버 및/또는 이차 챔버에 존재하는 종양 세포를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 단계로서, (예를 들면, 동일하나, 상기 목적 화합물의 투여가 없는 조건에 있는 다른 종양 세포 대비) 상기 챔버에 존재하는 더 적은 수의 종양 세포는 상기 목적 화합물의 더 높은 항-전이 활성 및/또는 항-종양 활성을 나타내는 것인 단계에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 세포는 종양을 가진 환자로부터 수집된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 화합물이 인 비트로에서 상기 종양 세포의 전이를 감소시키고, 인 비트로에서 구조체 크기를 감소시키고, 인 비트로에서 종양 세포의 개수를 감소시키고, 및/또는 인 비트로에서 종양 세포 사망을 유도하는 것으로 결정되는 경우, 상기 환자에게 상기 화합물을 치료-유효량으로 투여하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 인 비트로에서 항-전이 활성 및/또는 항-종양 활성에 대해 목적 화합물을 스크리닝하는 것을 포함할 수 있고, 상기 방법은: (a) 본 명세서에 기재된 장치를 제공하는 단계; (b) 증식 배지를 간 오가노이드를 포함하는 제 1 챔버로부터 살아있는 종양 세포 오가노이드를 포함하는 제 2 챔버까지 순환시키는 단계; (c) 상기 간 오가노이드 및/또는 살아있는 종양 세포 오가노이드에 (예를 들면, 상기 화합물을 상기 증식 배지에 첨가하는 것에 의해) 목적 화합물을 투여하는 단계; 및 (d) 테스트 화합물이 투여되지 않은 경우 상기 살아있는 종양 세포 오가노이드에 존재하는 종양 세포의 개수 대비, 상기 제 2 챔버에서 종양 세포의 존재의 감소(예를 들면, 개수 또는 농도의 변화)를 결정하는 단계를 포함한다. 선택적으로 양성 및/또는 종양 세포를 포함하는, 뇌 오가노이드, 결장 오가노이드, 폐 오가노이드, 내피 오가노이드, 심장 오가노이드, 상피 오가노이드 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가적인 오가노이드가 상기 장치의 하나 이상의 추가적인 챔버에 존재할 수 있고, 상기 챔버들은 상호 간에 유체 소통된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 인 비트로에서 항-전이 활성 및/또는 항-종양 활성에 대해 목적 화합물을 스크리닝하는 것을 포함할 수 있고, 상기 방법은: (a) 본 명세서에 기재된 장치(예를 들면, 살아있는 종양 세포 오가노이드를 포함하는 일차 챔버 및 상이한 오가노이드(예를 들면, 양성 세포를 포함하는 오가노이드)를 포함하는 하나 이상의 이차 챔버를 포함하는 장치)를 제공하는 단계; (b) 상기 장치에서 배지를 순환시키는 단계; (c) 상기 종양 세포에 (예를 들면, 상기 화합물을 상기 배지에 첨가하는 것에 의해) 상기 화합물을 투여하는 단계; 및 (d) 테스트 화합물이 화합물이 투여되지 않은 경우, 상기 살아있는 종양 세포 오가노이드 및/또는 이차 챔버에 존재하는 종양 세포의 개수 대비, 일차 챔버(예를 들면, 살아있는 종양 세포 오가노이드와 연관된 챔버) 및/또는 이차 챔버 중 종양 세포의 존재의 감소(예를 들면, 개수 또는 농도의 변화)를 결정하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 이차 챔버 중 상이한 오가노이드의 예는 양성 세포 및/또는 종양 세포를 포함할 수 있고, 뇌 오가노이드, 결장 오가노이드, 폐 오가노이드, 내피 오가노이드, 심장 오가노이드, 상피 오가노이드, 간 오가노이드, 등을 포함할 수 있으나, 그에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법은 형광 화합물(예를 들면, 염료, 단백질, 등)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 검출 가능한 화합물로 세포(예를 들면, 종양 세포)를 표지하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 전술된 양태 및 기타 양태가 하기의 실시예에서 더 설명된다.
도 1은 개별 환자 기준(patient-by-patient basis)으로 정밀 의료 치료 처방(precision medicine treatment regimen)을 더 잘 파악하기 위해 공학적(engineered) 3D 인 비트로 모델을 사용하는 것의 개념을 보여준다. 실선 화살표(solid arrow): 환자의 종양 유전자 프로파일에 근거하여 환자에 대한 치료법이 확인되는 것인, 종래 정밀 의료 파이프라인. 그러나, 실제로, 주요 돌연변이의 확인 후에도, 종양학자들은 종종 수개의 잠재적인 약물 옵션을 갖게되어, 최적의 치료법에 대한 최선의 추측(best guess) 또는 추정을 초래한다. 파선 화살표(dashed arrow): 환자 세포를 이용하여 생성된 오가노이드의 구현은 생검된 종양 세포의 유전자 스크린(genetic screen)을 보완하여, 궁극적으로 환자에 대한 최적의 치료법을 예측할 수 있다.
도 2는 패널 A) 상단부터 하단까지: 도관(tubing), 유체 유입구(inlet) 및 유출구(outlet)를 갖는 폴리스티렌(PS) 슬라이드, 오가노이드를 위한 챔버 및 상응하는 유체 유입구 및 유출구를 갖는 접착 필름(adhesive film), 유리 슬라이드, 및 포토마스크(photomask) 층인 미세유체 장치 층의 조립의 모식도; 패널 B) 인 시투 패터닝 기법(In situ patterning technique): 미세유체 챔버(i)에 HA 히드로겔, 광개시제, 및 종양 세포를 포함하는 히드로겔 혼합물(ii)을 채우고 포토마스크(iii)를 통해 UV 조사에 노출시킨다. 노출시킨 히드로겔을 가교시키고(iv), 깨끗한 완충액을 이용하여 비-가교 겔(v)을 플러싱(flush)한다. 플러싱 완충액을 최종적으로 인큐배이션을 위해 배지(vi)로 교체한다; 패널 C) 컴퓨터-조절 정량 펌프(computer-controlled peristaltic pump)에 의해 촉진되는, 각 오가노이드를 위한 저-용량, 폐쇄 유체 회로(low-volume, closed loop fluidic circuit)를 특징으로 하는, 전체 측정 셋-업(total measurement set-up); 및 패널 D) 각각 93.9% 및 86.4%의 퍼센트 생존력을 보여주는, 탑재(onboard) 7일차 및 14일차의 LIVE/DEAD 분석 후 종양 구조체의 최대 투사 공초점 이미지(maximum projection confocal image) 및 세분화 이미지(segmented image)를 보여준다.
도 3은 LIVE/DEAD 분석 후 종양 구조체의 최대 투사 공초점 이미지인 패널 a-f(i), 및 Imaris 소프트웨어를 이용한 세분화 이미지인 패널 a-f(ii)를 보여준다. 중간 회색(medium grey)은 죽은 세포를 나타내고, 연한 회색(light grey)은 살아있는 세포를 나타낸다. 패널 a)는 >90% 생존력을 갖는 1주차 대조군(control) 이미지이고, 패널 b)는 2주차 대조군이며, 패널 c & d)는 7일 동안 카르보플라틴 및 페메트렉세드(premetrexed) 약물의 영향 하의 구조체를 보여주고; 패널 e & f)는 7일 동안 시스플라틴 및 페메트렉세드 약물의 영향 하의 구조체를 보여준다. 패널 g)는 대조군 및 약물 처리 오가노이드에 대한 세분화 이미지로부터 유래된 생존력(살아있는 세포/죽은 세포) 측정값의 그래프를 보여준다. 약물 노출은 7일 차에 개시했다. 유의성: * p<0.1, ** p<0.05, *** p<0.01.
도 4는 환자-유래 종양 구조체에서 바이오마커-기반(biomarker-driven) 치료제 스크리닝을 보여준다. 패널 A) 종양 생검 시료의 유전자 분석은 두 개의 돌연변이, PBRM1 및 BAP1을 확인했다. BAP1 돌연변이는 EZH2 억제제 DZNep에 의해 표적화될 수 있는 것으로 확인되었다. 패널 B) MTS 미토콘드리아 대사 분석은 감소된 세포 개수에 비례하여, 감소된 미토콘드리아 대사를 초래한 DZNep 약물 처리에 비해, 대조군 오가노이드가 가장 증식적이라는 것을 보여준다. 반대로, HCT116 오가노이드는 DZNep에 부정적으로(negatively) 반응하는 것을 보이지 않는다. 패널 C-D) 추가적으로, Annexin V 및 Ki67 바이오마커 이미지를 이용하여, 모든 약물 처리는 Ki67에 대한 Annexin V의 더 높은 비율을 가져서, 더 많은 양의 아폽토시스 세포를 나타낸다는 것을 보여주는 분석을 수행했다. Annexin V 및 Ki67 형광 바이오마커의 대표적 이미지가 DZNep 처리에 대해 도시된다. 적색 염색(red stain) (흑백 이미지의 중간 회색) - annexin V; 녹색 염색 (흑백 이미지의 연한 회색) - Ki67. 스케일 바(scale bar)는 100㎛를 나타낸다. 패널 E-F) 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin)이 염색된 오가노이드 절편(section)은, DZNep 농도가 중피종 오가노이드에서 증가되면서, 정상 형태의 상실 및 무핵 유령세포(ghost cell with no nuclei)의 출현을 보여준다. 반대로, HCT116 세포는 이러한 용량 의존적 변화를 보이지 않아서, DZNep가 HCT116 오가노이드보다 중피종 오가노이드에서 보다 효과적으로 세포 사망을 유도한다는 것을 시사한다.
도 5는 배양이 어려운 것으로부터 유래된 살아있는 오가노이드를 보여준다. 패널 A) 저등급 충수(LGA) 및 패널 B) 고-분화(well-differentiated) 복막 유두상 중피종(peritoneal papillary mesothelioma). 패널 C) LGA 오가노이드는 임상에서 이미 의심되던 바와 같이, 치료에 반응하지 않고, 고등급 충수 종양 오가노이드(high grade appendiceal tumor organoid)는 반응한다. 패널 D) 희귀 육종(rare sarcoma)으로부터 생존 가능한 종양 오가노이드의 구축.
도 6은 2D Drug Study Protocol의 예시(illustration)를 보여준다. 패널 (A). 2차원 미세환경(two-dimensional microenvrionment)에서 다양한 농도의 항암 약물로 처리된 후, HCT116, HT29, CACO2, 및 SW480 결장암 세포의 퍼센트 상대적 세포 생존력 값. 패널 (B) A = 레고라페닙(Regorafenib)(μM), B = 소라페닙(Sorafenib)(μM), C = 트라메티닙(Trametinib)(nM), D = 5-FU (mM), E= 드라브라페닙(Drabrafenib)(μM).
도 7은 3D Drug Study Protocol의 예시를 보여준다. 패널 (A). 3차원 미세환경(two-dimensional microenvrionment)에서 다양한 농도의 항암 약물로 처리된 후, HCT116, HT29, CACO2, 및 SW480 결장암 세포의 퍼센트 상대적 세포 생존력 값. 패널 (B) A = 레고라페닙 (μM), B = 소라페닙 (μM), C = 트라메페닙 (nM), D = 5-FU (mM), E = 드라브라페닙(μM).
도 8은 HCT116 및 CACO2 결장암 세포주에 대한 레고라페닙, 소라페닙, 및 F-FU를 이용한 2D 및 3D 약물 스크리닝의 결과를 비교하는 그래프를 보여준다. p-값에 의해 결정된 유의성 있는 차이도 표지됨 (< 0.10 = *; < 0.05 = **; < 0.01 = ***).
도 9는 Ringed Organoid Drug Study Protocol의 예시를 보여준다. 패널 (A). 레고라페닙에 의한 HTC116의 표적화 세포 사망 및 5-FU에 의한 HCT116 및 CACO2의 공통 세포 사망(universal cell death)을 보여주는 현미경 이미지. 패널 (B) 녹색(흑백 이미지에서 연한 회색) 형광 염료(Calcein AM)는 살아있는 세포를 나타내고, 적색(흑백 이미지에서 중간 회색) 형광 염료(Ethidium Homodimer-1)는 죽은 세포를 나타낸다(스케일 바　=　200 ㎛). 패널 (C)는 레고라페닙 및 5-FU의 농도 각각에 대한 비율 및 대조군, 미처리 대비 비율의 그래프를 보여준다.
도 10은 미세유체 장치의 내부 구성요소 및 배지를 장치를 통해 순환시키는 외부 구성요소를 도시하는 도면이다.
도 11은 LIVE/DEAD 결과의 이미지를 보여주고, 상기 이미지는 카페시타빈을 그의 활성 5-FU 형태로 대사하여, 심장 오가노이드 및 폐 오가노이드에서 증가된 세포 사망을 유도하기 위해 간 오가노이드가 요구된다는 것을 보여준다.
도 12는 소형화(miniaturized) 시스템에서 LIVE/DEAD 결과의 이미지를 보여주고, 간이 존재하는 경우, 카페시타빈이 독성 약물인 5-FU로 대사되어, 심장 및 폐 독성을 유발한다는 것을 보여준다. 간이 없는 경우, 이 대사는 일어나지 않고, 심장 및 폐 오가노이드 생존력은 감소되지 않는다.
도 13은 표준 크기 시스템(standard size system) 및 소형화 시스템에서 초기 바이오마커 분석의 그래프를 보여준다.
도 14는 테이프 유체소자(tape fluidics) 및 접착 필름 및/또는 양면 테이프(DST), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 및 폴리디메틸실록산(PDMS) 구성요소를 결합(incorporate)하는 하이브리드 마이크로반응기 제조(hybrid microreactor fabrication) 전략의 예시를 보여준다.
도 15는 본 발명의 양태에 따른 2개의 챔버를 갖는 예시적 장치의 상이한 구성요소 및/또는 도면(view)(패널 A-D)을 보여준다.
도 16은 본 발명의 양태에 따른 6개의 챔버를 갖는 장치의 예를 보여준다.
도 17은 본 발명의 양태에 따른 장치 구성(device configuration)의 개략도이다.
실시예 1
본 프로젝트의 제 1 목적은 정상 숙주 세포에 의해 둘러싸인 결장암 종양의 3D 모델을 평가하는 것이었다. 공학적 동심원 구조체(engineered concentric ring construct)는 환원적이나, 생리학적으로 적합한 환경(reductionist, yet physiologically relevant environment)에서 종양을 모델링하기 위해, 결장 종양 코어 및 결장 상피 외부 링(colon epithelial outer ring)으로 구성된다. 이 구조체는 종양 코어의 증식, 종양 세포의 상피층으로의 관찰된 침습, 및 약물의 효능을 측정하기 위해 사용하였다. 히알루론산 및 젤라틴-기반 히드로겔에 현탁된 세포를 갖는 구조체를 생성했다. 4종의 직장암 세포 유형 중 하나를 이용하여 종양 코어를 제조하여, 4개 수준의 악성(malignancy)의 모델을 제공하였다. HCT116 세포가 가장 악성이었고, HT29, SW480, 및 Caco2 세포로 이어졌다. Caco2 세포는 건강한 상피 세포를 가장 잘 모사하기 때문에, 외부 링에서도 사용되었다. 종양 코어를 형광으로 표지하고, 형광 이미징을 이용하여 7-14일의 과정 동안 종양 코어를 모니터링하였다. 이 길이의 시간 후에, 침습은 거의 보이지 않았으나, 종양 코어는 더 치밀해진(denser) 것으로 나타났다. Caco2 외부 링 및 SW480 코어로 제조된 링 구조체도 화학요법제인 레고라페닙으로 처리했다. MTS 분석은 처리 후 생존가능한 세포의 양의 감소를 확인했고 LIVE/DEAD 염색은 레고라페닙이 종양원성(tumorigenic)이 더 약한 Caco2 세포보다, 구조체의 내부 링을 선택적으로 표적화했다는 것을 보여주었다.
제 2 목적은 3D 결장암 종양 구조체로부터 전이하는 세포의 개수를 정량화하는 시스템을 개발하는 것이었다. 장치의 채널 내에 밀봉된 Transwell 막 상에 순환하는 전이성 세포를 포획하도록 미세유체 관류 장치(microfluidic perfusion device)를 설계했다. 폴리디메틸실록산(PDMS)의 소프트 리소그래피(soft lithography)를 이용하여 장치를 제조했다. 히드로겔 중에 현탁된 단일 종양 세포 유형으로 구성된 종양 구조체를 적절한 챔버에 배치하고, 장치를 밀봉하고, 클램프로 고정시켰다(clamp). 상기 장치를 통해 배지를 순환시키고, 약 2주 동안 2 내지 3일마다 이미지를 수득했다. 2주 후에, Transwell 막 상에서 세포가 관찰되어, 상기 장치가 종양 구조체로부터 순환으로 진입된 종양 세포의 정량화를 지원할 수 있다는 것을 나타냈다. 상이한 악성 수준의 종양 세포가 상이한 정량적 이동 개수(migratino number)를 보이는지 여부를 확인하기 위하여 추가 연구를 수행할 것이다.
요약하면, 이 2개의 모델 -3D 동심 링 종양 모델(3D concentric ring tumor model) 및 미세유체 순환 종양 세포 정량 장치(microfluidic circulating tumor cell quantification device)-은 종양 세포의 증식, 약물의 종양 세포 반응에 대한 영향, 및 순환 세포의 정량을 연구하는 새로운 접근법을 제공한다.
실시예 2
치료의 개시 전에 치료 최적화가 수행될 수 있는 환자-특이적 모델 시스템을 제공하기 위해 3D 종양 오가노이드를 신선한 종양 생검물로부터 직접 미세조작하였다(microengineer). 여기에서, 이 플랫폼의 초기 구현이 환자로부터 채취된 중피종 종양 생체시료를 이용하여 설명된다. 종양-온-어-칩 미세유체 장치(tumor-on-a-chip microfluidic device) 내에 생존 가능한 3D 종양 구조체를 생체제조(biofabricate)하고 유지할 수 있는 능력이 확인된다. 둘째로, 온-칩 화학요법제 스크리닝(on-chip chemotherapy screening)이 약물 시스플라틴 및 페메트렉세드에 대한 환자 반응을 모사한다는 것이 설명된다. 최종적으로, 유전적 바이오마커 평가를 통해 확인된 후보 화합물의 효과가 인 비트로에서 입증된다.
방법
박막 미세유체 장치 제조(Thin film microfluidic device fabrication)
미세유체 장치 제조 방식은 다른 데서 보고된 방법에 기초한다. 커팅 플로터(cutting floater)(GraphTec-CE6000-40)를 이용하여 양면 접착 필름에 채널을 형성하고, 패터닝된 층(patterend layer)의 하부 표면(bottom surface)을 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 부착시켰다. 상부 표면에 채널로의 유체 전달을 위한 유입구 및 유출구로 작용하도록 드릴 프레스(drill press)에 의해 형성된 구멍을 갖는 폴리스티렌 슬라이드(Tedpella.Inc)를 부착시켰다. 장치 조립 후에, PTFE 도관(tubing)을 각 포트에 연결시키고 UV 경화 폴리에스테르 수지(UV cure polyester resin)를 이용하여 고정시켰다.
환자 병력(Patient clinical history)
환자는 쇠약성 악액질(debilitating cachexia), ECOG 2 기능 상태, 및 복부 팽만(abdominal distention)을 가진 50세 남성이다. 조직 진단을 위해 진단용 복강경 검사를 수행하여 상피모양 악성 복막 중피종(pithelioid malignant peritoneal mesothelioma)의 진단을 확립했다. 그의 종양의 정밀 의료 분석은 입수 가능한 표적화 약물 또는 임상 시험이 없는, 두 개의 유전체 변형(BAP1 스플라이싱 부위(splice site) 1729+1G>A 및 PBRM1 N258fs*6)을 밝혔다. iv 조영제(iv contrast)를 이용한 CT(computerized tomography)는 복막강 외부에 질병의 증거 없이 다량의 악성 복수(voluminous malignant ascite)를 보여주었다. HIPEC(heated intraperitoneal chemotherapy)을 이용하여 CRS(cytoreductive surgery)에 대해 평가했다. 질병의 과다한 부피 때문에, 그 시점에 완전한 CRS가 달성될 수 없을 것 같았다. 따라서, 그를 질병 부피 병기하강(disease volume downstaging)을 위한 선행 전신 화학요법(upfront systemic chemotherapy)을 위해 의뢰했다. 그를 시스플라틴 연관 이독성(ototoxicity)의 우려 때문에, 시스플라틴-겜시타빈의 6회 사이클 후, 카르보플라틴-겜시타빈의 단일 사이클로 치료했다. 그는 시스플라틴 기반 화학요법에 대한 탁월한 임상적 반응을 보여서, 반복 병기판정(staging) CT 및 그의 카르보플라틴 기반 화학요법 전에 수행된 임상 검사 모두에서 그의 악성 복수의 거의 완전한 소실(resolution)을 보였다. 뒤이어, 그를 수술실로 데려가서, CRS/시스플라틴 기반 HIPEC를 받게 하고, 평범한(unremarkable) 수술후 경과를 보였다. 외과 검사(surgical exploration) 동안 및 HIPEC 전에, 그의 망 질환(omental disease)의 부분(segment)을 가위로 절제하고 얼음 위에 배치하고, 종양 오가노이드 개발을 위해 신선한 상태로 랩으로 옮겼다.
종양 생체시료 확보 및 세포 가공(Tumor biospecimen procurement and cell processing)
세포 가공을 위해 종양을 제거 후 1 시간 내에 랩으로 전달했다. 받은 후에, 종양을 2% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 PBS(Phosphate Buffer Solution)로 3회의 5분 사이클로 세척하고, 2% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 2회의 5분 사이클로 세척했다. 종양을 개별적으로 갈고(mince) 37C에서 진탕기 플레이트(shaker plate) 상에서 18시간 동안 2% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 콜라게나아제/히알루로니다아제를 포함하는 DMEM 중에 배치했다(10X Collagenase/Hyaluronidase in DMEM, STEMCELL Technologies, Seattle, WA). 처리된(digested) 종양을 100 ㎛ 세포 필터를 통해 여과시키고 원심분리하여 펠렛(pellet)을 생성했다 혈장 및 비-세포 물질(non-cell material)을 제거하고 펠렛을 9 mL 탈이온수를 이용하여 1mL BD PharmLyse에 5분 동안 재현탁시켰다(BD PharmLyse, San Diego, CA). 코니칼 튜브(conical)를 탈이온수로 50mL까지 채우고 원심분리하고 용해된 세포와 용해 완충액을 흡인하여 제거하고 사용을 위해 세포 펠렛을 계수했다.
세포외 매트릭스 히드로겔 제조 및 기본 오가노이드 (basic organoid ) 형성
전술된 바와 같이, ECM-모사(mimicking) HA/젤라틴-기반 히드로겔(HyStem-HP, ESI-BIO, Alameda, CA)을 제조했다.15,18,27 요약하면, 티올화(thiolated) HA 성분(Glycosil) 및 티올화 젤라틴 성분(Gelin-S)을 0.05% w/v 광개시제 2-히드록시-4′-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(Sigma, St. Louis, MO)을 함유한 멸균수에 용해시켜 1% w/v 용액을 제조했다. 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA) 가교제(Extralink, ESI-BIO)를 광개시제 용액에 용해시켜 2% w/v 용액을 제조했다. Glycosil, Gelin-S, 및 Extralink를 각각 부피 기준 2:2:1의 비율로 혼합했다. 종양 구조체 형성을 위해, 결과적으로 수득된 용액을 볼텍싱(vortexing)에 의해 완전히 혼합하고, 이를 사용하여 세포를 재현탁시키고(2천만개 세포/mL), 그 후, 1초 동안 UV 광 노출(365 nm, 18 W cm-2)이 가교 및 오가노이드 형성을 개시했다.
종양-온-어-칩 생체제조(Tumor-on-a-chip biofabrication )
본 발명자들의 이전 연구에 유사한 포토패터닝(photopatterning) 기법을 이용하여 미세유체 장치에서 종양 구조체를 생체제조하였다.15 이 때, 채널 정의를 위해 사용된 동일한 커팅 플로터 기법으로 알루미늄 호일에서 1-3 mm 개구부(aperture)를 갖는 포토마스크를 제조하고 매칭 패턴 접착 필름(matching patterned adhesive film)을 갖는 미세유체 장치의 하부 표면에 부착시켰다. 그 후, 히드로겔 전구체 용액을 환자 중피종 생검물로부터 유래된 세포와 2천만개 세포/mL의 농도로 혼합시켰다. 수득된 혼합물을 유입구 포트를 통해 장치 채널의 각각에 도입하고 부착된 포토마스크를 통한 1초 UV 광 노출(365 nm, 18 W cm-2)에 의해 오가노이드 구조체를 정의시켰다. 이 노출은 신속한 티올렌 단계적 중합 반응(thiolene stepwise crosslinking)을 개시시켜 3D 컬럼에 세포를 캡슐화시켰다. 최종적으로, 미노출(unexposed) 전구체/세포 혼합물을 PBS(phosphate buffered saline)로 장치로부터 플러싱시켜, 각 채널 내에 3D 환자-유래 중피종 구조체를 남겼다. 세포 구조체를 갖는 장치의 각 채널을 DMEM을 포함하는 별개의 저장소(reservior)에 연결시켰다. 배지를 MP2 Precison 미세-정량(micro-peristaltic) 펌프(Elemental Scientific, Inc., Omaha, NE)에 연결된 실라스틱(silastic) 도관에 의해 저장소로부터 채널을 통해 흘려주었다. 흐름을 개시하고 10 ㎕/분으로 유지시켰다.
조직학적 평가
5 ㎛ 두께의 오가노이드 설편을 파라핀-포매 구조체(paraffim-embedded construct)로부터 제조하고, 염색을 위해 탈파라핀시켰다. IHC를 이용하여 바이오마커 사이토케라틴(cytokeratin) 5/6 (CK5/6), 칼레티닌(calretinin), 및 트롬보모듈린(thrombomodulin)을 시각화시켰다. Dako Protein Block 하에 15분 동안 인큐베이션시켜 블록킹(blocking)을 수행했다. 일차 항체 CK5/6 (Abcam, ab17133, 마우스에서 생성됨) 및 칼레티닌(Abcam, ab702, 토끼에서 생성됨) 또는 CK5/6 및 트롬보모듈린(Abcam, ab109189, 토끼에서 생성됨)을 Dako Antibody Diluent 중 1:200 희석 비율로 슬라이드 상의 절편에 적용하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 각각 적합한 종에 의한 이차 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 594 항체를 Dako Antibody Diluent 중 1:200으로 모든 시료에 적용하고, 실온에서 1시간 동안 방치했다(항-마우스　Alexa Fluor 488 및 항-토끼 Alexa Fluor 594, Life Technologies, Carlsbad, CA, A-11070). 그 후, 커버 슬립을 덮기(coverslipping) 전에, 절편을 5분 동안 Dapi와 인큐베이션시켰다. 후속 바이오마커-기반 실험에서 Annexin V 및 Ki67 염색(Abcam, Cambridge, MA, 각각 ab14196 및 ab16667)을 위해, 동일한 프로토콜을 이용했다. Leica DM400B Compound Microscope을 이용하여 형광 이미지를 촬영하고 분석을 위해 중첩시켰다(overlaid).
시스플라틴 , 카르보플라틴 , 및 페메트렉세드 약물 연구
1주차의 종료시, 하기에 기재된 바와 같이, 약물의 첨가 전에 세포가 살아있다는 것을 확인하기 위해 2개의 구조체에서 LIVE/DEAD 염색을 수행했다. 이 암 모델에서 테스트하기 위해, DMEM 중 혼합된 0.1 μM 및 10 μM의 2개의 상이한 농도로 2개의 약물 조합, 시스플라틴+페메트렉세드(Cisplatin+Pemetrexed) 및 카르보플라틴+페메트렉세드(Carboplatin+Pemetrexed)를 고려했다. DMEM 저장소를 이 약물 혼합물의 2 mL 부피로 교체했다.
약물 노출 기간의 종료 시 7일 차에 LIVE/DEAD 염색(포유동물용 LIVE/DEAD 생존력/세포독성(Viability/Cytotoxicity) 키트, Life Technologies, Grand Island, NY)을 수행했다. 먼저 깨끗한 PBS를 이용하여 순환 배지를 장치 채널로부터 플러싱시키고, 2　μM 칼세인-AM 및 2　μM 에티디움 호모다이머(ethidium homodimer)-1을 포함하는 DMEM(1:1)과 PBS의 1mL 혼합물을 도입했다. 구조체를 60분 동안 인큐베이션시키고, 그 후, 채널을 다시 깨끗한 PBS로 플러싱시켰다. Olympus FluoView® FV1000 공초점 현미경을 이용하여 인 시투 이미징을 수행했다. 적색 및 녹색 형광을 위해 적합한 필터를 이용하여 각각의 구조체에 대해 5 ㎛ z-스택(stack)을 수득하고 중첩시켰다.
Imaris MeasurementPro (Bitplane, Concord, MA)를 이용하여 공초점 이미지(confocal image)를 가공했다. 소프트웨어를 통해, 각 컬러 채널의 이미지를 세포 크기, 형태, 및 형광 강도에 대해 분석하고, 세포 위치를 표시했다. 정합성(consistency)을 위해, 각 이미지의 450 ㎛ x 900 ㎛ 영역을 고려했다. 적색 채널 중 총 개수(DEAD) 대비 녹색 채널 중 확인된 세포의 총 개수(LIVE)의 정량을 통해 세포 생존력(cell viability)을 산출했다.
바이오마커 -기반 실험 약물 연구( Biomarker -driven experimental drug study)
종양 생체시료가 유래된 환자를 웨이크 포리스트 밥티스트 메디칼 센터(Wake Forest Baptist Medical Center)의 종합 암 센터(Comprehensive Cancer Center)에서 Precision Medicine Program에 입력시켜, 종양 중 잠재적인 작동가능한(actionable) 돌연변이의 식별을 위해 생검물의 일부를 보냈다. 식별정보가 제거된(deidentified) 데이터는 BAP1 유전자 중 양성 돌연변이(positive mutation)를 보여, 실험적, 표적화 치료로 EZH2(enhancer of zeste homolog 2) 억제제를 테스트할 기회를 나타냈다.
종양 구조체를 다시 한번 생체제조하고, 그 후, 이들을 약물 스크리닝 전에 3일 동안 유지시켰다. 그 후, 환자 오가노이드를 96 시간의 인큐베이션 기간 동안 세포 배양 배지에서 0.1 μM, 1 μM, 및 10 μM 농도로 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 EZH2 억제제인 약물 DZNep(3-deazaneplanocin A)에 적용시켰다. EZH2 억제에 반응하는 것으로 확인된 결장암 세포주인 HCT116 세포를 이용하여 생체제조된 오가노이드를 양성 대조군으로서 병렬로 테스트했다. MTS 분석 및 면역조직화학에 의해 약물 효과를 정량했다. MTS 분석(CellTiter 96 One Solution Reagent Promega, Madison, WI)은 미토콘드리아 대사를 정량하는 것에 의해 상대적 세포 개수를 결정했다. Molecular Devices SpectrumMax M5 (Molecular Devices) 조정가능한(tunable) 플레이트 판독기 시스템에서 490 nm의 파장에서 흡광도 값을 결정했다.
5㎛ 두께의 오가노이드 절편 상에서 바이오마커 Annexin V 및 Ki67을 이용하여 면역조직화학 염색을 수행했다. 파라핀에 포매되고, 절단되고, IHC 염색을 위해 탈파라핀되었던, 이전에 염색되지 않았던 오가노이드로부터 절편을 제조했다. Dako Antibody Diluent 중 1:200 농도로 슬라이드에 일차 항체 Annexin V를 적용하고 실온에서 60분 동안 방치했다(Annexin V, Abcam, Cambridge, MA, ab14196). 별개의 시료에 대해 병렬로, 일차 항체 Ki67을 Dako Antibody Diluent 중 1:200 농도로 적용했다(Ki67, Abcam, ab16667). 이차 Alexa 488 항체를 모든 시료에 Dako Antibody Diluent 중 1:200으로 적용하고 실온에서 1시간 동안 방치했다(Alexa 488, Life Technologies, Carlsbad, CA, A-11070). Leica DM400B Compound Microscope을 이용하여 형광 이미지를 촬영하고, Annexin V 및 Ki67에 대해 GFP에서 서로 나란히 배치된 절편들로부터 이미지를 촬영했고; Annexin V 이미지는 적색(흑백 이미지에서 중간 회색)으로 착색되었고; Ki67 이미지는 녹색(흑백 이미지에서 연한 회색)으로 착색되었다.
결과
정밀 의료 기반 종양 오가노이드 전략(Precision medicine driven tumor organoid strategy)
본 발명자들의 목표는 항암 약물을 효능에 대해 테스트하고, 그 후, 치료 최적화를 알릴 수 있는 것인 환자-특이적 종양으로 구성된 플랫폼을 개발하는 것이었다. 맞춤화 정밀 의료의 개념은 하기와 같이 작용한다. 환자로부터 종양 생검물이 채취된 경우, 약물로 개발될 수 있는 표적(drugable target)을 나타낼 수 있는 돌연변이를 확인하기 위해 생체시료의 일부 또는 전부를 부분적으로 또는 완전하게 유전자 서열결정한다. 뒤이어, 이 바이오마커들 중 하나를 표적화하는 FDA-승인 약물이 이용가능하거나 또는 임상 시험이 진행 중인 경우, 주어진 환자에 대한 치료를 그에 따라 조정할 수 있다(도 1 - 실선 화살표). 최적 조건 하에, 이 전략은 표준 화학요법에서 더 효과적인 치료제를 가져온다. 그러나, 실제로, 종종 복수의 돌연변이가 확인되어, 명확한 최상 치료제 없이, 잠재적인 약물 옵션의 패널(panel)을 초래하여, 이러한 약물 및 잠재적인 실험 약물을 테스트할 추가적인 도구를 필요로 한다. 본 발명자들의 접근방식은 유전자 프로파일링(genetic profiling)을 위해 보낸 것과 동일한 생체시료 물질을 이용하여 형성된, 환자-유래 종양 오가노이드를 통합하는 것이다. 이 방법(도 1 - 파선 화살표)에서, 생체시료의 일부를 이용하여 세포 지지 세포외 매트릭스 히드로겔 생체 물질을 이용한 다수의 마이크로-규모 3D 종양 오가노이드를 생체제조한다. 이 오가노이드를 유전자 스크린(genetic screen)에서 식별된 작용제를 테스트하도록 설계된 약물 스크린에서 이용하여, 어느 작용제가 그 환자에게 가장 효과적인지를 결정한다.
환자-특이적 종양-온-어-칩 생체제조
도 2 패널 A-C는 박막 미세유체 장치를 제조하는 방법, 인 시투 종양 오가노이드 통합, 및 일반적인 장치 작동(operation)을 도시한다. 6개의 독립적인 종양 오가노이드를 수용할 수 있는 장치는 유체 채널 및 오가노이드 챔버가 재단(cut)되고, 유입구 포트 및 유출구 포트를 갖는 폴리스티렌 슬라이드와 부착된 포토마스크를 갖는 유리 슬라이드 사이에 샌드위치된 접착 필름으로 이루어진다(comprised of)(도 2, 패널 A). 환자 종양-유래 세포를 포함하는 히드로겔 전구체 용액을 이용하여 종양 오가노이드를 패터닝하고, 6개의 채널 각각에 도입하고, 포토마스크 개구부(photomask aperture)를 통해 오가노이드로 광중합시켰다(도 2, 패널 B). 오가노이드 생체제조 후, 장치를 마이크로-정량 펌프 및 배지 저장소에 도관(tubing)을 통해 연결시키고, 그 후, 오가노이드 배양을 위해 흐름을 개시시켰다(도 2, 패널 C).
먼저, 각각의 종양 구조체를 7일 또는 14일 동안 순환 DMEM 하에 방치했다. 플랫폼이 생존 가능한 환자-유래 종양 모델을 유지하는 능력을 검증하기 위해, 본 발명자들은 7일차 및 14일차에 오가노이드 상에서 LIVE/DEAD 분석을 수행했다(도 2, 패널 D). 결과는 높은 세포 생존력, 7일차에 90%보다 높은 생존력 및 14일차에 85%보다 높은 생존력을 나타내어, 본 발명자들의 장치 아키텍쳐 및 지지 히드로겔 매트릭스(supporting hydrogel matrix)가 연장된 실험을 위해 환자-유래 세포를 지지할 수 있다는 것을 입증했다.
종양-온-어-칩은 생존 가능한 환자-유래 모델을 지원하고 화학요법 약물 연구는 환자 약물 반응과 상관관계를 갖는다
7일차에, 종양 구조체의 서브세트를 화학요법제 혼합물인 카르보플라틴/프레메트렉세드 및 시스플라틴/프레메트렉세드 각각의 두 개의 상이한 용량 중 하나, 또는 무 약물(no drug)에 노출시켰다. 7일 처리 후에, 모든 오가노이드에 대해 LIVE/DEAD 분석을 수행했다(도 3, 패널 a(i)-f(i) 및 a(ii)-f(ii)). 대조군(무 약물) 조건 하에서, 종양 구조체가 높은 생존력을 유지하여, 장치에서 총 14일 후에 87%까지 통계적으로 유의성 없는 감소를 보이는 것으로 관찰되었다. 그러나, 약물 혼합물에 노출된 오가노이드는 살아있는 세포 비율의 상당한 감소를 보였다. 카르보플라틴/프레메트렉세드로 처리된 시료에 대해, 본 발명자들은 생존력이 0.1 μM의 순환 농도에서 52.1%까지 감소되고 10 μM의 농도에서 39.8%까지 감소된 것으로 확인했다. 고용량이 저용량보다 100배(two orders of magnitude) 더 높았으나, 생존력의 관찰된 변화는 단지 낮은 유의성(p<0.1)을 가져서, 약물에 대한 잠재적으로 중간 정도의(moderate) 효과를 나타냈다. 대조적으로, 시스플라틴/프레메트렉세드로 처리된 오가노이드는 0.1 μM 농도에서 39.0%까지 생존력의 감소를 가져왔고, 10 μM에서 11.8%까지 생존력을 감소를 가져왔다. 이는 상호간(p<0.05) 및 대조군 측정값(각각 p<0.05 및 p<0.001) 모두에 대해 유의성 있는 감소를 나타냈다. 결과적으로, 본 발명자의 장치에서 시스플라틴/프레메트렉세드가 카르보플라틴/프레메트렉세드보다 유의성 있게 더 효과적이었다. 이러한 결과가 도 3, 패널 g에 요약된다.
이러한 데이터는 2개의 중요한 결과를 갖는다. 먼저, 그들은 환자 종양 생검물로부터 유래된 세포가 심층 연구를 위해 바이오공학에 의한 오가노이드 시스템(bioengineered organoid system)에서 장기간 지속될 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명자들이 알기로는, 이것은 이러한 능력에 대한 최초의 보고이다. 둘째로, 그들은 그러한 오가노이드의 인 비트로 약물 스크리닝이 실현가능하여, 세포 생존력의 약물-의존적 감소를 가져온다는 것을 보여준다. 약물 효능이 원칙적으로 치료제의 투여 전에 환자-특이적 방식으로 확립될 수 있기 때문에, 이는 치료제 설계에 대한 잠재적 자산을 나타낸다. 예를 들면, 이러한 측정에서, 본 발명자들의 결과는 카르보플라틴/프레메트렉세드보다 시스플라틴/프레메트렉세드가 탁월한 치료 옵션이라는 것을 제안한다. 맞춤화 의료의 속성은 환자에서 2개의 작용제의 효과의 체계적 비교를 막는다. 그러나, 중요하게, 환자는 시스플라틴/프레메트렉세드로 치료되어 탁월한 반응을 보였다. 이는 환자-특이적 약물 효과(effectiveness)가 본 발명자들의 인 비트로 시스템에서 정확하게 재현(recapitulate)될 수 있다는 것을 시사한다.
유전적 바이오마커 확인에 기반한 실험적 약물 스크리닝
정밀 의학 테스트는 종양 생체시료에서 2개의 공지된 돌연변이: BAP1 스플라이싱 부위 1729+1G>A 및 PBRM1 N258fs*6을 확인했다. BAP1 (BRCA1 associated protein-1)은 탈유비퀴틴화(deubiquinating) 효소이고28 PBRM1는 여러 종양과 연관된 종양 억제자(tumor suppressor) 유전자이다.29 중피종 또는 기타 종양 유형에서 FDA-허가 치료제를 이용한 테스트 당시에 어느 돌연변이도 연관되어 있지 않았다.
그러나, 추가적인 조사 후에, 본 발명자들은 BAP1의 돌연변이가 동물 모델 및 인 비트로 연구에서 DNA 메틸화 및 전사 억제에 참여하는 효소, EZH230의 억제에 의해 성공적으로 표적화되었다는 것을 확인했다(도 4, 패널 A). 그러나, 본 발명자들은 EZH2 억제제 DZNep를 이용한 약물 스크리닝 실험을 수행했다. 대조군 집단으로서, 널리 연구된 결장암 세포주 HCT116을 이용하여 오가노이드를 생성했다. 중요하게, HCT116 세포가 DZNep31 처리시, 반드시 유의성 있는 수준의 세포 사망은 아니나, 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 진행하는 것으로 확인되었고, 따라서, 본 발명자들은 이들을 본 연구를 위한 적합한 대조군으로 간주했다.
본 발명자들의 결과는 약물 처리 후, HCT116 증식에서는 유의성 있는 감소가 없으나, 중피종 증식은 유의성 있는 감소가 있었다는 것을 보여준다(도 4, 패널 B). HCT116 및 중피종에 대한 대조군은 유사했으나, DZNep 처리 중피종은 약물 농도의 증가에 따라 대조군 대비 증식의 감소를 보였다. DZNep 농도가 증가되면, 세포 증식은 감소했다. 추가적으로, HCT116와 중피종의 비교는 모든 처리 농도에 대해 유의성 있게 더 낮은 중피종 세포 증식을 보여준다. Annexin V 및 Ki67 면역조직화학을 모든 조건에 대해 두 세포 종류 모두에 대해 수행했다. Annexin V는 DZNep 농도의 증가에 따라 중피종에서 증가를 보여, 아폽토시스 세포(apoptotic cell)의 증가를 나타낸다(도 4, 패널 C). 그러나, 증식의 최소 변화(minimal change)가 모든 HCT116 조건에서 관찰되어, DZNep가 증식에 크게 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다(도 4, 패널 D). 헤마톡실린 및 에오신 염색을 오가노이드 각각에 대해 수행하였고, 중피종의 대표적 이미지는 DZNep 처리시 유령 세포 및 무핵 유령 세포를 보여준다(도 4, 패널 E). 이 반응은 중피종 또는 HCT116 대조군에서는 관찰되지 않고, HCT116 처리군 어디에도 존재하지 않는다(도 4, 패널 F). 중피종만의 반응은 또한 DZNep가 환자 시료의 증식을 측정가능하게 감소시켰고 HCT116이 반응 없이 적절한 양성 대조군으로 작용했다는 것을 나타낸다.
검토
작용가능한 유전자 돌연변이를 식별하기 위해 종양 DNA가 서열결정되는 것인 정밀 종양학(precision oncology)이 암 치료의 치료 결정 과정을 위한 표준 임상이 되고 있다. 그러나, 현재, 유전적 변형과 잠재적 약물 간의 보고된 상관관계가 치료의 개시 전에 검증될 수 없고, 정밀 의료로 테스트된 환자의 11%만이 정밀 의료 기반 치료(precision medicine guided treatment)를 따를 것이다. 또한, 질환의 조직학적 타입(histologic type), 등급 및 부피에 기반한 암의 생물학적 거동에 큰 다양성이 존재한다. 　
연구 내에서, 환자 유래 이종이식편(patient derived xenograft)(PDX)이 환자 종양 진행 및 약물 처리 반응을 연구하기 위해 이용되고 있다. 이러한 모델은 생검물 또는 종양 시료를 배치하여 마우스로부터의 세포로 침윤될 수 있게 하는 면역결핍 마우스(immunodeficient mouse)를 요구한다는 점에서 부족하다. 세포도 그들의 새로운 환경에 적응하고 최초 시료로부터 유전적 부동(genetic drift)을 보여 그들을 덜 이상적이게 만들었다. PDX 기술의 광범위한 채택에서 하나의 추가적인 제한 인자는 면역 결핍 마우스에 도입되는 경우, 종양 생체시료의 가장 악성만이 성공적으로 "수용(take)"된다는 사실이다. 일반적으로 25 내지 33 퍼센트 성공률 범위로 인정되는, 이러한 열등한 수율(take rate)이 PDX 기술의 적용성 및 대다수의 암 환자에 대한 그의 예측적 적용(predictive application)을 제한한다. 본 명세서에 기재된 연구의 시작 및 병행 진행 연구에서, 본 발명자들의 연구의 주요한 평가기준(critique)은 본 발명자들이 PDX의 수율 퍼센트를 개선할 수 있는지 여부였다. 현저하게, 이는 본 발명자들의 플랫폼에서 놀랍게도 명확했다. 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 배양의 7일차 및 14일차에 높은 세포 생존력을 본다. 또한, 본 발명자들이 다른 중피종 생체시료 및 기타 GI 종양 생체시료를 이용한 유사한 연구를 수행하면서, 본 발명자들은 90%보다 높은 수율을 관찰했다. 10% 비수용율(non-take rate)은 가능하게는 저등급 점액성 충수 환자(low grade mucinous appendiceal patient)로부터 수득된 무세포(acellular) 시료를 반영한다는 것을 언급하는 것이 중요하다. 전술은 오늘날 모든 고등급 시료는 오가노이드로 성장했다는 관찰로부터 기인한다. 이는 중요하고, 본 발명자들에게 3D, ECM 미세환경-지지 오가노이드 기술의 이용이 PDX 기술이 할 수 있는 것보다 더 많은 수의 환자들을 위해 활용할 수 있는(deployable) 모델을 생성할 수 있다는 것을 나타낸다. 매우 유망하나, 이러한 수율 효율성(take rate efficiency)의 추가적인 증거는 유의성 있는 추가적인 연구가 확인하는 것을 요구할 것이다.
이러한 실험의 집합에서, 수율 및 생존력 평가를 넘어서, 본 발명자들은 두 개의 추가적인 개념 증명(proof-of-concept) 시나리오의 타당성을 보여준다: 1) 환자 대 종양 오가노이드 상관관계; 및 2) 실험 약물의 바이오마커-기반 테스트. 첫째로, 본 발명자들은 이러한 유형의 암을 위해 임상적으로 사용된 공통의 화학요법 처방 중 2가지를 스크리닝하기 위해 중피종 오가노이드 플랫폼을 이용했다. 구체적으로, 본 발명자들은 카르보플라틴과 페메트렉세드 대비 시스플라틴과 페메트렉세드의 조합에 대한 오가노이드 반응을 테스트했다(도 3). 미세유체 시스템을 통한 순환 배지로의 주입을 통한 7일 동안의 약물로의 노출은 시스플라틴-페메트렉세드 처리가 더 효과적이라는 것을 나타내는 명확한 결과를 가져왔다. 생존 가능한 세포에 대한 죽은 세포의 비율이 10 μM 시스플라틴과 페메트렉세드의 치료에서 카르보플라틴과 페메트렉세드의 동일한 농도에 비해 더 높았다. 독립적으로, 이 결과는 본 발명자들이 플랫폼을 이용하여 성공적으로 약물 스크리닝 연구를 수행할 수 있다는 점에서 본 발명자들의 플랫폼을 검증한다. 그러나, 보다 중요하게, 이러한 오가노이드가 유래된 환자는 또한 시스플라틴 기반 화학요법의 종료시 수행된 CT 이미징에서 그의 다량의 복수의 거의 완전한 소실에 의해 확인되 바와 같이, 시스플라틴-기반 화학요법에 대해 획기적으로 반응했다. 실제로, 이 환자는 그의 질환이 시스플라틴 기반 치료에 반응하지 않았다면, 유효한(operative) 후보가 아니었을 것이다. 이는 중요하고, 환자와 본 발명자들의 오가노이드 기술의 이러한 종류의 상관관계 결과는 임상 채택(clinical adoption)을 위해 이 방법을 검증하도록 지속적으로 증가하는 것이 중요할 데이터세트이다.
둘째로, 본 발명자들은 환자의 종양 생체시료의 일부를 이용한 유전자 테스트 결과를 알게 되었다. 이 보고는 이 종양에 특이적인 두 개의 돌연변이, BAP1 스플라이싱 부위 1729+1G>A 및 PBRM1 N258fs*6가 확인되었다는 것을 나타냈다. 전술된 바와 같이, BAP1은 탈유비퀴틴화 효소28이고, PBRM1은 여러 암과 연관된 종양 억제자 유전자이다.29 이러한 연구의 시점에, 중피종 또는 다른 종양 유형에서 FDA-허가 치료와 연관된 돌연변이는 없었고, 관련된 임상 시험도 진행되는 것이 없었다. 그러나, 본 발명자들은 BAP1의 돌연변이가 EZH2 억제에 의한 인 비트로 연구 및 동물 모델에서 표적화되었다는 것을 알았다.30 따라서, 본 발명자들은 유전적 분석에서 나타난 이러한 바이오마커가 실제로 작용가능한 표적으로 이용될 수 있는지 여부를 파악하기 위하여 테스트 시나리오로 EZH2 억제제 DZNep를 사용하여 약물 스크리닝 실험을 수행했다(도 4). 실제로, 이 화합물에 의한 처리시, 본 발명자들은 일반적으로 세포 개수에 비례하는 측정지표(metric)인 미토콘드리아 대사(mitochondrial metabolism)의 감소를 관찰했다. 추가적으로, 본 발명자들은 아폽토시스를 나타내는 annexin V 발현에서 증가 경향, 및 세포 증식을 확인하는, Ki67 발현의 감소 경향을 관찰했다. 또한, H&E 염색은 세포 형태 및 온전한 세포 핵이 이 화합물을 이용하여 용량 의존적 방식으로 영향을 받는다(suffer)는 것을 보여준다. 널리 이용되는 HCT116 결장암 세포주로부터 동일한 방식으로 생성된 오가노이드는 동일한 방식으로 반응하지 않았다. 오히려, DZNep는 농도와 상관 없이, 거의 효과를 갖지 않는 것으로 보였다.
순환계(circulatory system)를 갖는 병렬화 미세유체 플랫폼(parallelized microfluidic platform)에서 이러한 3D 종양 모델을 구현하는 것에 의해, 본 발명자들은 단일 장치에서 복수의 약물 유형 및 용량을 평가하는 능력을 가졌을 뿐 아니라, 본 발명자들은 또한 종양 진행, 이동, 및 원위(distant site)로의 전이 전에 일어나는, 순환으로의 혈관내침입(intravasation)의 동역학(kinetics)을 시각화하고 추적할 수 있는 기회를 얻는다.
실시예 3
환자 종양-유래 오가노이드의 복수의 세트를 인 비트로에서 90% 보다 높은 수율(take rate)(2D 세포 배양에서의 10% 미만 대비)로 생성했고, 이는 가장 공격적인 생체시료만 성공하는 환자-유래 이종이식편(PDX) 모델에서 보고된 25 내지 33% 수율에 대해 유리하게 비교된다. 이러한 열등한 수율은 대부분의 암 환자에 대한 예측적 진단에 대한 PDX 기술의 적용을 제한한다. 본 발명자들의 종양 오가노이드 시스템은 뒤이어, 환자처럼, 그들의 종양 오가노이드가 상이한 약물에 대한 선택적 반응을 유지한다는 것을 입증하기 위해 약물 스크린에서 이용되었다. 현재까지, 일련의 환자-특이적 오가노이드가 결장임, 고등급 및 저등급 충수 전이 부위부터 장막(omentum), 난소, 및 간, 복막 중피종, 및 말단 육종(extremity sarcoma)을 포함한 원발성 부위 및 그들의 전이성 부위의 다양한 그룹으로부터 생성되었다. 본 명세서에 1) 종양 오가노이드 약물 반응과 오가노이드가 유래된 환자의 약물 반응 간 상관관계, 2) 환자의 종양 중 약물의 표적이 될 수 있는(druggable) 돌연변이의 식별에 근거한 치료의 효능을 테스트하는 능력, 및 3) 배양하기 어려운 종양 집단으로부터 생존 가능한 오가노이드를 수립하는 것을 보여주는, 여러 실시예가 기재된다.
본 발명자들은 분리하고 배양하는 것이 어려운 종양 유형으로부터 생존 가능한 종양 오가노이드 모델을 생성하는 능력을 입증했다. 예를 들면, 본 발명자들은 저등급 충수(LGA) 종양(도 5, 패널 A) 및 고분화 유두상 중피종(도 5, 패널 B) - 전통적으로 "양성(benign)" 중피종으로 지칭됨-으로부터 생존 가능한 환자-특이적 종양 오가노이드를 생성했고, 이들 모두는 느린 증식 패턴 및 예측 불가능한 형질전환(transformation) 가능성을 갖는다. 현재까지 낮은 증식 지표(proliferation index)를 갖는 원발성 종양(primaries)으로부터 세포 배양물을 구축하는 것은 본질적으로 불가능했다. 중요하게, 본 발명자들의 LGA 오가노이드는 치료에 반응하지 않는 고등급 오가노이드 및 2D 배양물에 비해 화학치료제에 반응하지 않는다(도 5, 패널 C). 이 데이터는 LGA가 실제로 화학내성(chemoresistant) 종양이고 따라서 화학요법에 의한 LGA 환자의 치료가 유용하지 않아서, 그들에게 불필요한 독성을 피하게 한다는 최초의 입수가능한 구체적인 증거일 수 있다. 또한, 본 발명자들은 최근에 말단 육종을 가공하여 본 발명자들의 플랫폼에서 높은 생존력을 발현하는 일련의 환자 특이적 육종 오가노이드를 생성했다(도 5, 패널 D). 이러한 육종 오가노이드가 현재 약물 스크리닝 연구에서 이용되고 있다.
실시예 4
정상 세포 유형의 악성 종양 세포로의 한정(restriction)이 세포-대-세포 상호작용에 대한 변형 및 물리적 장벽(physical barrier)에 의해 유지된다(Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al., 2000). 항암 약물은 순환계를 통해 종양으로 이동하고 기관 내에 존재하는 암세포를 성공적으로 표적화하기 위해 혈관외(extravascular) 조직을 침투해야 한다(Tannock et al., 2002). 환상-오가노이드(ringed-organoid) 모델은 상이한 세포 유형에 의해 둘러싸인 침습성 암 유형을 포함하는 단순한 3D 미세-기관, 또는 오가노이드를 생성하고, 그 후, 내부, 침습성 세포주를 표적화하기 위해 특정한 항암 약물을 사용하는 것에 의해 항암 약물 전달의 인 비보 과정을 재현하고자 시도한다. 또한, 항암 약물이, 양자 모두가 인 비보에서 발견되는 것과 유사한 3D 미세 환경에 있을 때, 외부 세포 유형 대비, 내부의 보다 침습적 세포 유형(이전의 3D 약물 스크린으로부터 결정된 효과)을 성공적으로 표적화하는지 여부를 결정하기 위해 본 명세서에 기재된 실험을 수행했다.
항암 약물의 효능에 대한 세포외 미세환경의 영향을 조사하기 위해, 4개의 결장암 세포주(HCT116, HT29, SW480, 및 CACO2)에 다양한 농도의 항암 약물(레고라페닙, 소라페닙, 트라메티닙, 5-플루오로우라실, 및 다브라페닙)을 투여했고, 이들을 히알루로난-기반 히드로겔 내에 내장(embed)시키거나 웰-플레이트(well-plate)의 웰에 직접적으로 접종하였다. 히알루로난-기반 히드로겔 내에 내장된 결장암 세포는 인 비트로 삼차원 미세환경 중 암세포를 모사했고 웰 내에 직접 접종된 세포들은 전통적인 이차원 미세환경에서 증식된 암세포를 나타냈다.
2D 종양 구조체 약물 스크린
인 비보에서 악성 종양에서 일반적으로 발견된 세포-대-ECM 상호작용이 결핍된 통상적인 약물 스크린 실행에서 항암 약물 효능을 결정하기 위해 단일층 배양물에 존재하는 결장암 세포주를 이용한 2D 약물 스크린을 수행했다.
웰에 직접적으로 접종된 암세포가 4-5 시간 동안 웰의 하부(bottom)에 재부착하게 하였다. 그 시간 후에, 항암 약물 용액을 배지 대신에 투여하고(도 6, 패널 A) 세포 생존력을 결정하기 위해 2일 뒤에 MTS 분석을 수행했다. 항암 약물에 대한 MTS 흡광도 결과가 대조군인 무 약물 MTS 값 대비 표시된다(도 6, 패널 B). 레고라페닙 및 소라페닙의 100 μM 농도 및 5-FU의 100 mM 농도에서, 세포 생존력은 이용된 결장암 세포주 4종 모두에 대해 대조군의 생존력의 20% 미만으로 남았다. 그러나, 다브라페닙 및 트라메페닙을 이용한 스크리닝은 보다 높은 농도에서 나머지 3종의 항암 약물로부터 상이한(diverging) 결과를 생성했다. 다프라페닙의 100 μM 농도는 HCT116 세포에 대한 약 36% 내지 SW480 세포에 대한 약 93%에 이르는 범위의 상대적 생존력을 초래했고, 트라메티닙의 100 nM 농도는 CACO2 세포에 대한 약 39% 내지 SW480 세포에 대한 약 58% 범위의 상대적 세포 생존력을 가져왔다. 5-FU의 1 mM 농도로 처리된 경우, 상대적 세포 생존력은 SW480 세포에 대해 약 39%였고, HCT116, HT29, 및 CACO2 세포에 대해 10%-22%였다. 이러한 값들은 나머지 항암 약물의 최저 농도에 대한 상대적 세포 생존력 값보다 훨씬 더 낮았다.
3D 종양 구조체 약물 스크린
히알루론산의 존재 하에 세포-대-ECM 상호작용이 항암 약물의 효능에 어떻게 영향을 미칠 수 있는 지를 관찰하기 위해 히알루로난-기반 히드로겔 구조체 내에 내장(embed)된 결장암 세포 상에서 3D 약물 스크린을 수행했다.
폴리디메틸실록산 또는 PDMS를 웰의 바닥을 코팅하기 위해 사용했다. 세포를 히알루로난-기반 히드로겔 내에 내장시키고, 그들의 3차원 환경에 순응하도록 5일을 부여하고 5일차에 상이한 항암 약물 용액을 투여했다(도 7, 패널 A). 7일차에 MTS 분석을 수행하고, 대조군 값 대비 결과를 표시했다 (도 7, 패널 B). 레고라페닙 및 소라페닙의 100 μM 농도에서, 세포 생존력은 사용된 4종의 결장암 세포주 모두에 대해 대조군의 생존력의 25% 미만이었다. 이에 대한 유일한 예외는 100 μM 레고라페닙이 CACO2 세포에 투여된 경우이고, 퍼센트 상대적 세포 생존력은 약 48%까지 상승했다. 100 mM 5-FU를 이용한 스크리닝은 SW480 세포에 사용된 경우의 48% 내지 HCT116 세포에 투여된 경우의 81%의 상대적 세포 생존력을 가져왔다. 그러나, 5-FU의 10 mM 농도만 4종의 세포주 모두에 대해 SW480 세포에 대한 9% 내지 HT29 세포에 대한 50% 범위의 세포 생존력 값을 가져왔다. 100 μM 농도에서, 다브라페닙은 HCT116 및 SW480 세포주를 표적화한 경우 더 높은 효능을 가졌고, 이들은 93% 및 75%의 더 높은 세포 생존력 값을 갖는 HT29 및 CACO2 세포주 대비, 38% 및 43%의 상대적 세포 생존력 값을 가졌다. 트라메티닙의 100 μM 농도는 4종의 결장암 세포주에 대해 좁은 범위 내에 속하는 상대적 세포 생존력 값을 초래했고, 그 값은 SW480 세포에 대해 54%이고, HT29 세포에 대해 74%였다.
2D 및 3D 약물 스크린 비교
결장암 세포가 각 환경에 있을 때 항암 약물에 상이하게 반응했는지 여부를 확립하기 위해 2D 및 3D 약물 스크린에서 유의성 차이 통계 분석(significant difference statistics)을 수행했다. 이러한 약물 스크린에서 약물에 대한 세포 반응의 유의성 있는 차이는 세포와 히알루론산 간의 세포-대-ECM 상호작용에 의한 것이라는 것을 시사할 것이다. 레고라페닙, 소라페닙, 및 5-플루오로우라실에 대한 HCT116 및 CACO2 반응은 이들 세포 유형들 간의 형태학적 차이 및 유사성 때문이다. 이러한 세포들 및 약물들이 본 연구의 이후 섹션에서 사용될 것이다.
동일한 세포주에 항암 약물 용액의 동일한 농도가 제공되었으나, 2차원 인 비트로 미세환경 대비 3차원 인 비트로 미세환경 내에 배치된 경우 세포들이 약물 처리에 상이하게 반응했다는 것이 명백하다. HCT116 및 CACO2 상에서 레고라페닙, 소라페닙, 및 5-플루오로우라실을 이용한 2차원 약물 스크린 및 3차원 약물 스크린의 결과 간에 세포 생존력의 유의성 있는 차이가 관찰되었다(도 8). HCT116 세포의 경우, 두 결과는 레고라페닙을 이용한 2D 스크린과 3D 스크린 간에 유의성 있게 상이했고 (양자 모두(both) <0.05), 소라페닙에 대해 1개는 유의성 있게 상이했고(<0.10), 5-FU에 대해 2개가 유의성 있게 상이했다(양자 모두 <0.01). CACO2 세포의 경우, 두 결과는 레고라페닙을 이용한 2D 스크린과 3D 스크린 간에 유의성 있게 상이했고(양자 모두 <0.01), 소라페닙에 대해 3개가 유의성 있게 상이했으며(2개 <0.01 및 1개 <0.05), 5-FU에 대해 3개가 유의성 있게 상이했다(2개 <0.01 및 1개 <0.10).
HCT116 세포의 경우, 소라페닙의 10 μM 용액 및 5-FU의 10 mM 용액을 제외하고, 3D 약물 스크린은 2D 약물 스크린보다 더 높은 상대적 세포 생존력을 초래했다. CACO2 세포의 경우, 레고라페닙 및 소라페닙의 10 μM 용액 및 5-FU의 10 mM 용액을 제외하고, 3D 약물 스크린도 2D 약물 스크린보다 더 높은 상대적 세포 생존력을 초래했다. 2D 약물 스크린과 3D 약물 스크린의 비교 결과(도 8)는 레고라페닙이 CACO2 세포에서보다 HCT116 세포에서 세포 생존력 변화에 대해 더 유의성 있는 영향을 가졌고, 소라페닙은 HCT116 세포보다 CACO2 세포의 세포 생존력의 변화에 더 유의성 있는 효과를 가졌으며 (두 스크린 모두에서 HCT116은 이미 크게 영향을 받았으나), 5-FU는 HCT116 세포와 CACO2 세포 모두의 세포 생존력을 유의성 있게 변화시켰다는 것을 나타낸다. 3D 약물 스크린 동안, 레고라페닙과 소라페닙의 100 μM 농도에서, HCT116 세포는 21% 대 48% 및 15% 대 25%로 CACO2 세포보다 더 낮은 퍼센트 상대적 세포 생존력을 가졌다. 5-FU의 100 mM 농도가 10 mM 5-FU 약물 스크린 동안 생존력 값보다 훨씬 더 높은 생존력 값을 생성했기 때문에, 3D 미세환경에서 HCT116 세포 및 CACO2 세포 모두에 대한 10 mM 5-FU 농도 결과를 볼때, 그들의 상대적 세포 생존력은 18% 및 22%로 상당이 유사한 값까지 낮아졌다는 것이 명확하다.
환상 오가노이드 약물 스크리닝
환상-오가노이드(ringed-organoid) 연구는 3D 약물 스크린에서 이전에 관찰된 바와 같이, 3D 히알루로난-기반 히드로겔 미세환경 내에서 상이한 세포 유형 간 세포-대-ECM 상호작용 또는 세포-대-세포 상호작용이 특정한 암세포를 표적화하는데 있어서 항암 약물의 효능 및 특이성에 영향을 미쳤는지 여부를 테스트했다.
폴리디메틸실록산, 또는 PDMS를 다시 웰의 바닥을 코팅하기 위해 사용했다. HCT116 세포를 히알루로난 히드로겔 내에 내장시키고 PDMS 표면 상에 구조체를 생성시켰다. 히알루로난 겔 내에 내장된 CACO2 세포를 사용하여 HCT116 내부-링 구조체(inner-ring construct) 주위에 외부 링을 생성했다(도 9, 패널 A). HCT116 세포가 100 μM 농도의 레고라페닙이 투여되었을 때, 3D 미세환경에서 CACO2 세포 대비더 낮은 상대적 세포 생존력을 보였고(21% 대 48%), 5-FU가 3D 미세환경에서 상대적 세포 생존력의 감소에 대해 유사한 효과를 보였기 때문에, 비교를 위해 이러한 약물들의 2개의 세포주에 대한 효능을 관찰하고 정량하기 위해, 동일한 농도 (1 μM, 10 μM, 및 100 μM)로 환상-구조체에 투여했다.
7일차에 환상-구조체에 live-dead 염색을 수행하고 Axiovert 현미경 하에서 이미지를 수득했다(도 9, 패널 B). 이미징 소프트웨어, MATLAB를 사용하여 환상-구조체에 대한 % 사망(dead): % 생존(live) 비 (또는 % 적색(흑백 이미지에서 중간 회색): % 녹색(흑백 이미지에서 연한 회색))를 생성했다. 그 후, 값들을 그래프로 도시하여, 레고라페닙 및 5-FU의 각각의 농도에 대한 비율 및 대조군, 미처리 비율 대비 나타냈다(도 9, 패널 C). 100 μM에서, 레고라페닙 및 5-FU 모두 0.98의 % dead: % live 비율을 보였다. 이는 HCT116 및 CACO2 세포의 약 절반이 살아있고, 절반이 항암 약물에 의해 표적화되었다는 것을 의미한다. 레고라페닙 및 5-FU의 1 μM 및 10 μM 농도가 투여되었을 때 상대적 세포 생존력을 분석한 경우, % dead: % live 비율은 레고라페닙 용액에 대한 것보다 5-FU 용액에 대한 것이 훨씬 더 높았다. 1 μM에서, % dead: % live 비는 5-FU에 대해 0.95이고, 레고라페닙에 대해 0.48이었으며, 10 μM에서, % dead: % live 비는 5-FU에 대해 0.78이고, 레고라페닙에 대해 0.08이었다. 레고라페닙 및 5-FU의 3개의 농도에 대한 % dead: % live 비는 실질적으로 대조군 % dead: % live 비의 값 0.03보다 실질적으로 더 높았다.
패널 B 중 live-dead 이미지를 볼때, 적색(흑백 이미지에서 중간 회색) 세포의 대다수가 내부 링 내에 나타나고(이미지의 우측), 외부 링에는 나타나지 않기 때문에(이미지의 좌측), 내부 HCT116 세포가 CACO2 세포보다 더 큰 정도까지 레고라페닙에 비해 영향을 받았던 것으로 보인다. 대조적으로, 적색(흑백 이미지에서 중간 회색), Ethidium Homodimer-1 염료로 염색된 죽은 세포가 내부 링(HCT116) 및 외부 링(CACO2)에 모두 나타나기 때문에, 5-FU는 두 세포 유형 모두를 유사한 정도까지 표적화하는 것으로 보인다. 또한, 항암 약물 농도를 10배(by a factor of 10) 증가시키면 해당 약물에 의한 표적화된 세포 사망의 관찰가능한 증가를 초래한다.
전이(metastasis) 정량을 위한 미세유체 장치
암세포를 3D 히알루로난-기반 구조체 내에 내장시키고 단순화된 순환계에서 흐르는 항암 약물 용액의 투여시 암세포 전이율의 변화를 결정하기 위해 PDMS-기반 미세유체 장치(도 10)를 개발했다. 또한, 미세유체 장치는 항암 약물이 "일차(primary)" 종양 구조체 내 및 트랜스웰(transwell) 막 상에 포획된 "이차(secondary)" 암세포에서 암세포 생존력에 어떻게 영향을 미치는지를 결정하고자 하였다.
장치가 배지 순환(media circulation) 내로 들어간 세포를 트랜스웰 막 상에 포획하는 가능성을 관찰하기 위해 7일 가동(running)의 의도로 2개의 미세유체 장치를 설정했다. 내장된 HCT116 세포를 갖는 3D 구조체를 2개의 장치의 "구조체 챔버(construct chamber)" 내에 이식했다. 미처리 배지를 장치 중 하나(대조군)의 유체 저장소(fluid reservooir)에 첨가하고, 소라페닙의 10 μM 용액을 나머지 장치의 유체 저장소에 첨가했다. 대조군 장치의 구조체 및 트랜스웰 막의 이미지를 1일차 및 7일차에 Zeiss Axiovert 200M 487-1 현미경을 이용하여 수득했다. 대조군 장치의 트랜스웰 막 상에서 포획된 세포의 증가가 DiO, 녹색 막 염료에 의해 표시된 바와 같이 1일차와 7일차 사이에 관찰되었다. 장치의 분해(disassembly) 후에, 7일차에 트랜스웰 막을 공초점 현미경에서 이미징하고, 장치가 성공적으로 3D 구조체로부터 이동하여 순환으로 들어간 세포를 포획한 것으로 확인했다. 장치의 유속은 0.20 mL/분으로 기록되었다.
10 μM 소라페닙의 약물-배지 용액을 순환시키는 장치는 3일차에 내부 진균 감염(internal fungal infection)의 징후를 보였고, 따라서 이 관찰 후에, 장치를 분해하고 버렸다. 결과적으로, 이 장치로부터 수집될 수 있었던 데이터를 소실했다. 장치의 유출구로부터 미량의 누출(minor leakage)이 오염의 원인인 것으로 파악되었다.
검토
이러한 연구는 3D 세포외 미세환경이 항암 약물의 효능의 결정에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 확립했다. 4종의 결장암 세포주는 히알루로난-기반 히드로겔에 내장(embedding) 및 캡슐화 및 5종의 항암 약물의 투여 후 세포 생존력에서 유의성 있는 차이를 보였다. 환상 오가노이드는 3D 히드로겔 환경에 내장된 상이한 암세포를 표적화하는 약물의 정량적 비교를 가능하게 하고 환상 오가노이드가 세포 이동을 측정하는 방법을 제공할 수 있다는 것을 시사한다. 개발된 미세유체 장치는 전이성 암세포를 포획하는 능력을 보여주고, 3D 구조체 및 포획된 세포의 지속적인 현미경 관찰을 가능하게 하고, 맞춤화된 화학요법 약물 스크리닝을 위한 모델 및 플랫폼으로서의 용도를 시사한다.
재료 및 방법:
암세포주 출처(Cancer Cell Line Origin)
사용된 HCT-116, HT-29, SW-480, 및 CACO-2 결장암 세포주는 웨이크 포레스크 대학교 의과대학의 세포 및 바이러스 벡터 코어 랩(the Cell and Viral Vector Core Laboratory of the Wake Forest University School of Medicine)에서 유래되었다. 세포를 15 cm 세포 배양 플레이트에서 배양하고, DMEM High Glucose 용액(HyClone, Utah, USA), 10% 우태혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 1% L-글루타민을 포함하는 표준 DMEM-10 (Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 세포 증식 배지로 사용했다.
2D 약물 스크리닝
멸균 및 세포 계대배양(Cell Passaging): 세포 배양 플레이트로부터 배지를 흡인하고, 각각의 플레이트에 10 mL의 PBS (25℃)를 피펫으로 첨가했다. PBS가 플레이트 내에서 모든 세포를 뒤덮도록 세포 배양 플레이트를 조작하고, 그 후, 플레이트로부터 PBS를 흡인했다. 5 mL의 0.05% Trypsin (37℃)을 세포 배양 플레이트의 각각에 피펫으로 첨가했다. 그 후, 세포 배양 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 ~8분 동안 배치했다. 이 시간 후에, 각각의 플레이트에 5 mL의 DMEM-10 배지를 첨가했다. 그 후, 10 mL의 세포 및 배지 성분을 4개의 깨끗한 15 mL 원심분리 튜브에 넣었다.
세포 계수 및 혈색소계로의 적재(Cell Counting and Loading onto Hemocytometer): 세포를 1000 ㎕ 단일-채널 피펫을 이용하여 15 mL 원심분리 튜브에 재현탁시키고, 각각의 세포주 튜브로부터 100 ㎕를 새로운 15 mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 그 후, 400 ㎕의 DMEM-10 배지 및 500 ㎕의 Gibco Trypan Blue Stain (0.4%) (Thermo-Fischer Scientific, Massachusetts, USA) 염료를 이들 각각에 피펫으로 첨가했다. 제2 원심분리 튜브를 세포 계수를 촉진하기 위해 1:10 희석액으로 사용하고, Trypan Blue Stain의 첨가는 죽은 세포가 세포 계수(cell count)에 포함되는 것을 배제하기 위한 것이었다. 10 ㎕의 1:10 희석 시료를 2-20 ㎕ 단일 채널 피펫을 이용하여 취하고 미리 세척된 혈색소계(previously sanitized hemocytometer)의 계수 챔버에 적재했다. 살아있는 세포(live cell)를 계수하고, 각각의 암세포주의 총 개수를 결정하기 위해 계산을 수행했다.
세포 접종: 10 mL의 DMEM-10, 세포, 및 트립신을 담은 최초의 15 mL 원심분리 튜브를 원심분리기에 넣었다. 원심분리 설정은 1500 RPM 및 최대 가속(maximal acceleration)에서 5분 동안이었다. 그 시간 후에, 배지와 트립신 혼합물을 튜브로부터 흡인에 의해 제거하여, 세포 펠렛을 온전하게 남겼다. 그 후, 5 mL의 DMEM-10을 각각의 튜브에 피펫을 이용하여 첨가하고, 그 과정에서 세포를 재현탁시켰다. 폴리스티렌 투명-바닥 96-웰 플레이트의 각 웰에 직접적으로 4종의 결장암 세포주 각각의 25,000개 세포가 접종되도록 하기 위해 5mL 세포-배지 용액의 계산된 부피를 결정했다. 그 후, 100 ㎕의 DMEM-10 배지를 웰에 직접 피펫으로 첨가했다. 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션시켜서, 배지를 흡인에 의해 제거하고 항암 약물 용액을 첨가할 때까지 세포가 웰의 바닥에 재부착될 수 있게 했다.
스크리닝을 위한 항암 약물의 첨가: 이 스크리닝에서 사용된 항결장암 약물은 5-FU, 레고라페닙, 소라페닙, 트라메티닙, 및 다브라페닙을 포함했다(Sigma-Aldrich, Missouri, USA)). DMSO를 이용하여 고농도 약물 스톡 용액을 제조했다. 항암 약물 스톡을 DMEM-10 배지와 혼합하는 것에 의해, 더 낮은 농도의 약물 용액을 생성했다. 5-FU에 대해 1 mM, 10 mM, 및 100 mM 약물 용액을 생성했고; 레고라페닙, 소라페닙, 및 다브라페닙에 대해 1 μM, 10 μM, 및 100 μM 약물 용액을 생성했으며; 및 트라메티닙에 대해 1 nM, 10 nM, 및 100 nM 약물 용액을 생성했다. 배지를 웰로부터 조심스럽게 흡인하고, 세포를 포함하는 웰에 200 ㎕의 다양한 약물-배지 용액을 넣었다. 상이한 세포 유형 각각으로 각각의 항암 약물 농도에 대해 3개의 재현물(duplicate)을 생성하여, 생성된 데이터에 대한 평균을 산출하고 통계분석을 수행했다. 그 후, 웰 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
세포 생존력 분석: 항암 약물 용액으로의 노출 후 48시간에 세포 생존력을 결정했다. CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation (MTS) 분석(Promega, Wisconsin, USA)에 의해 세포 생존력을 조사했다. 웰로부터 항암 약물-배지 용액을 흡인하고, 웰에 조심스럽게 200 ㎕의 MTS 시약을 피펫을 이용하여 첨가했다. 세포와 MTS 시약의 인큐베이션 시간은 약 45분이었다. 또 다른 96-웰 프레이트에서 세포 생존력 분석을 수행하고 EnVision Multilabel Plate Reader (PerkinElmer, California, USA)에 의해 흡광도를 정량했다.
약물 스크리닝을 위한 3D 암 오가노이드
PDMS에 의한 웰 코팅 및 세포 분리: 폴리디메틸실록산, 또는 PDMS, (DOW Corning, North Carolina, USA)를 1:10 경화제 비율로 사용하여 96-웰 플레이트의 바닥을 코팅하고 그 후, 플레이트를 80℃ 오븐에 1시간 이상 동안 배치했다. 4종의 결장암 세포 유형 모두에 대해, 각각 100,000 개 세포를 포함하는 10 ㎕ 3D 히알루로난-기반 히드로겔 구조체(10,000,000개/㎕)를 96-웰 플레이트의 웰에 배치하기 위해 전술된(A) 것과 동일한 방법으로 세포를 계대시켰다. 세포 계수에 따라, 원하는 개수의 세포를 세포-배지 용액으로서 15 mL 원심분리 튜브에 분리하고 원심분리를 수행했다.
단일-세포 유형 구조체(single-cell type construct)의 히드로겔 성분: 3가지 성분: Heprasil, Gelin-S, 및 Extralink PEGDA 2-ARM Acrylate 가교제의 혼합물을 사용하여, 히알루론산-기반 히드로겔(ESI BIO, California, USA)을 생성했다. 이 성분들을 부피 기준 2:2:1 비로 혼합했다. 혼합 전에 3개의 성분들 각각에 0.1% Irgacure 광개시제(Sigma-Aldrich, Missouri, USA)를 첨가하고, 상기 3개의 성분들을 가용화시키기 위해 37℃ 인큐베이터에 ~30분 동안 배치했다.
오가노이드 구조 형성: 가용화되면, 배지를 (원심분리-후) 15 mL 원심분리 튜브로부터 흡인해서 제거하고 세포를 펠렛으로 분리했다. 히드로겔 성분을 직접 세포를 담은 원심분리 튜브에 첨가하고 세포를 조심스럽게 혼합물에 재현탁시켰다. 10 ㎕의 겔-세포 용액을 PDMS 코팅 위에 웰의 중심에 배치했다. 세포를 포함하는 모든 웰에 대해 이를 지속하고, 각각의 세포 유형에 대해 반복했다. 이 시점 후에, 겔을 BlueWave 200 스팟 광(spot light)(Dymax, Connecticut, USA)으로부터의 UV 광에 노출시켜 히드로겔을 고화시키거나 또는 겔이 자체적으로 형성되도록 ~30분 기다릴 수 있다. 그 후, DMEM-10 배지를 웰에 첨가하고 구조체를 5일 동안 인큐베이션시켰다.
항암 약물 스크리닝 및 세포 생존력: 동일한 5종의 항암 약물을 5일차에 첨가하고 생존력 분석은 7일차에 수행했다.
상대적 항암 약물 효과를 위한 환상 오가노이드(Ringed Organoid)
환상 오가노이드 구조체의 히드로겔 성분: 환상 오가노이드의 제조에서 사용된 히알루론산-기반 히드로겔은 4개 성분의 혼합물이었다: Heprasil, Gelin-S, 및 PEGDA 2-ARM Acrylate 가교제(Extralink), 및 Alkyne-PEG-Alkyne 2-ARM 가교제(ESI BIO, California, USA). 이 성분들을 부피 기준 4:4:1:1 비로 혼합했다. 혼합 전에 4개 성분 각각에 0.1% Irgacure 광개시제를 첨가하고 가용화시키기 위해 이 성분들을 37℃ 인큐베이터에 ~30분 동안 배치했다. 전술된 계대배양 방법에서 HCT116 및 CACO2 세포를 분리하고, PDMS를 사용하여 96-웰 플레이트의 바닥을 코팅했다.
환상-오가노이드 구조체 형성: 히드로겔의 4개 성분을 HCT116 세포 펠렛을 포함하는 15 mL 원심분리 튜브에 첨가하고 혼합물 내에 세포를 재현탁시켰다. HCT116 함유 히드로겔 10 ㎕를 웰의 중심에 배치하고 96-웰 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 ~35분 동안 그대로(untouched) 방치했다. 이 시간 동안, PEGDA 2-ARM Acrylate가 겔을 가교시키고, UV-감수성 2-ARM Alkyne-PEG-Alkyne은 비가교 상태로 남을 것이다.
PEGDA가 가교되는 것을 기다리면서, 4개의 히드로겔 성분을 분리된 CACO2 세포를 담은 15 mL 원심분리 튜브에 첨가하고 겔 내에 세포를 재현탁시킨다. 96-웰 플레이트 위의 알루미늄 호일 포장(wrapping)을 제거하고 고화되었는지 여부를 확인하기 위해 구조체를 조사한다. 고화된 경우, 25 ㎕의 CACO2-내장-히드로겔을 채취하고 HCT116 구조체 주위의 영역에 조심스럽게 배치한다. 피펫 팁을 이용하여 모든 슬라이드 위의 구조체 주위로 CACO2 겔을 물리적으로 이동시킨다. BlueWave 200 spot light으로부터 UV 광을 이용하여 두 겔을 함께 가교시켜, 융합된, 환상-구조체를 형성시킨다. DMEM-10 배지를 첨가하여 웰을 채운다.
항암 약물 스크리닝: 5일차에, 1 μM, 10 μM, 및 100 μM 5-FU 약물 용액을 환상 구조체에 첨가하고, 1 μM, 10 μM, 및 100 μM 레고라페닙 약물 용액을 별개의 환상 구조체에 첨가했다. 각각의 약물 농도에 대해 3개의 재현물을 생성하고 무-약물(no-drug) 대조군도 유지시켰다.
Live-Dead 염색 및 현미경 관찰: 7일차에, 환상 구조체에 Live-Dead 염색을 수행하고 Axiovert 200M 487-1 현미경(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)에서 이미징했다. 환상 구조체를 Calcein AM 및 Ethidium Homodimer-1 염색(Thermo-Fischer Scientific, Massachusetts, USA)을 1.0 ㎕/mL의 동일한 농도로 포함하는 배지에 노출시켰다. Live-Dead 염색 용액으로의 노출 전 및 후에 구조체를 PBS로 2회 세척했다. 레고라페닙 및 5-FU의 존재 시, HCT116-CACO2 환상 구조체에 대한 약물의 효능을 결정하기 위해, 소프트웨어 MATLAB (MathWorks, Massachusetts, USA)를 이용하여 퍼센트 적색 대 퍼센트 녹색 비를 계산했다. % 적색: % 녹색 비가 % 죽은 세포: % 살아있는 세포 비(% dead/% live ratio)를 나타낸다.
미세유체 장치
조립(Assembly): Graphtec Studio 소프트웨어를 이용하여 신규한 미세유체 장치를 위한 몰드(mold)를 구축했다. 장치 몰드를 양면 테이프에 식각(etch)시키고 Graphtec ce6000-60 Plotter (Graphtec, Tokyo, Japan)를 이용하여 일면에 알루미늄 호일을 부착시키고 그 후, 몰드를 물리적으로 세포 배양 플레이트에 부착시켰다. 20 mL의 PDMS (1:10 경화제 비)를 플레이트에 넣고 PDMS를 밤새 80℃ 오븐에 넣어 밤새 고화시켰다. 다음 날 PDMS 몰드를 플레이트로부터 절단했다.
8.0 ㎛ Isopore Transwell Membrane Filter(Merck Millipore, Massachusetts, USA)를 세포 포획을 위한 트랜스웰 막을 포함하는 장치 구획(compartment)의 크기에 구체적으로 맞추기 위해 재단했다. 트랜스웰 막을Plasma Cleaner PDC-32G (Harrick Plasma Inc., New York, USA)을 이용하여 PDMS 층을 플라즈마 본딩(plasma bonding)시켜 두 개의 PDMS 층 사이에 끼웠다(trap). 사용 전에 실험실 후드에서 70% 에탄올 용액을 이용하여 장치 PDMS 층을 멸균시켰다.
가동(Running): HCT116 세포를 계대시키고 세포를 5 ㎕/mL DMEM-10 배지로 DiO 막 염료(Thermo-Fischer Scientific, Massachusetts, USA)로 ~20분 동안 처리했다. 100,000개 HCT116 세포(10,000,000/㎕)를 포함하는 10 ㎕ 히알루로난-기반 히드로겔 구조체를 오가노이드 챔버 내에 배치했다. PDMS 층을 함께 누르고 플라스틱 클램프를 장치의 양면에 사용하여 PDMS층을 4개의 스크류(screw)로 제 자리에 고정시켰다. 3 mL의 미처리 배지를 유체 저장소에 첨가했다. 구조체 및 트랜스웰 막의 이미징을 Axiovert 200M 487-1 현미경에서 수행하고 7일차에 공초점 현미경(Leica Camera, Wetzlar, Germany) 이미징을 트랜스웰 막에 대해 수행했다.
실시예 5 - 5 오가노이드 통합 약물 스크리닝
실험의 목표: 다중 오가노이드 독성의 간 오가노이드 대사 기능에 대한 의존성을 평가하는 것이다. 일예로, 간의 대사 활성은 일부 약물의 결과(outcome) 및 효능에 크게 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 일반적인 1차 암 약물(1st line cancer drug)인 5-FU는 종양만이 아니라, 신체 내의 다수의 세포에 세포독성이다. 따라서, 이는 일반적으로 전구약물인 카페시타빈의 형태로 주어지고, 카페시타빈은 간을 통과하여 그의 활성 형태로 대사될 때까지 본질적으로 비활성이다.
실험의 설계 및 결과: 간 오가노이드, 심장 오가노이드, 폐 오가노이드, 정소 오가노이드 및 뇌 오가노이드를 포함하는 5개의 조직 플랫폼을 개시시키고 약물 연구의 시작 전 7일 동안 유지시켰다. 이 시점에, 플랫폼의 절반으로부터 간 모듈을 제거했다. 카페시타빈(20 μM)을 모든 플랫폼에 투여하고, 그 후, 7일 노출 후 live/dead 염색 또는 심장 박동 거동(cardiac beating behavior)을 통해 생존력을 측정했다(총 14일의 연구).
결과는 간의 존재 하에, 카페시타빈은 독성 약물인 5-FU로 대사되어, 심장 및 폐 독성을 유발했다는 것을 보여준다(도 11). 간의 부재시, 이 대사는 일어나지 않고, 심장 및 폐 오가노이드 생존력은 감소되지 않는다. 놀랍게도, 뇌 오가노이드는 두 그룹 모두에서 영향을 받았다(suffer)(도 11). LIVE/DEAD 결과는 카페시타빈을 활성 5-FU로 대사하여, 심장 및 폐 오가노이드에서 증가된 세포 사망을 유도하기 위해 간 오가노이드가 요구된다는 것을 보여준다.
우레아, 알부민, α-GST, IL-8, 및 IL-1β를 포함한 가용성(soluble) 바이오마커를 1일차, 3일차, 5일차, 7일차, 9일차, 11일차, 13일차, 및 15일차에 배지 분량(aliquot)으로부터 정량했다(도 13). 카페시타빈의 5-FU로의 대사를 검증하기 위해 배지 분량을 질량 스펙트럼 분석을 위해 보냈다.
실시예 6 - 소형화 미세유체 플랫폼 중 5 오가노이드 통합 약물 스크리닝
소형화 족문(footprint) 및 유체 부피를 갖는 미세유체 플랫폼을 제조하고 동일한 복합 약물 연구(complex drug study)가 이 플랫폼에서 가능한지 여부를 평가했다. 유체 부피를 최소화하는 것은 시스템 순환에서 관련 바이오마커의 신호 대 잡음 비의 증가를 가져올 수 있다.
실험의 설계 및 결과: 접착 필름-기반 미세유체 플랫폼을 하기에 기재된 바와 같이 제조했다. 실시예 4에 기재된 실물 크기(full-scale) 플랫폼에서와 같이, 간 오가노이드, 심장 오가노이드, 폐 오가노이드, 정소 오가노이드 및 뇌 오가노이드를 포함하는 5개의 조직 구조체를 개시시키고 약물 연구의 시작 전 7일 동안 유지시켰다. 이 시점에, 플랫폼의 절반으로부터 간 모듈을 제거했다. 카페시타빈(20 μM)을 모든 플랫폼에 투여하고, 그 후, 7일 노출 후 live/dead 염색 또는 심장 박동 거동(cardiac beating behavior)을 통해 생존력을 측정했다(총 14일의 연구).
소형화 시스템에서, 간의 존재 하에, 카페시타빈은 독성 약물인 5-FU로 대사되어, 심장 및 폐 독성을 유발한다(도 12). 간의 부재시, 이 대사는 일어나지 않고, 심장 및 폐 오가노이드 생존력은 감소되지 않는다. 중요하게, 이 플랫폼에서 뇌 오가노이드 생존력은 높다(도 1 2). LIVE/DEAD 결과는 카페시타빈을 그의 활성 5-FU 형태로 대사하여, 심장 및 폐 오가노이드에서 증가된 세포 사망을 유도하기 위해 간 오가노이드가 요구된다는 것을 보여준다. 또한, 뇌 오가노이드는 생존 가능하여, 특정 이론에 한정되기를 원치 않으면서, 시스템의 축소된 부피가 뇌 오가노이드 생존력을 지지하는 보다 우수한 조건화 배지(conditioned media)를 초래할 수 있다는 것을 시사한다. 이는 뇌 오가노이드가 다른 오가노이드 유형과 함께 이 시스템에서 유지될 수 있다는 것을 입증한다.
우레아, 알부민, α-GST, IL-8, 및 IL-1β를 포함한 가용성 바이오마커를 7일차 및 15일차에 배지 분량으로부터 정량했다(도 1 3). 카페시타빈의 5-FU로의 대사를 검증하기 위해 배지 분량을 질량 스펙트럼 분석을 위해 보냈다.
소형화 시스템 설계(miniaturized system design):
이 시스템은 다른 시스템, 예를 들면, 표준 크기 시스템에 비해 배지에 노출된 PDMS의 표면적을 감소시키거나 제거하여, 약물 화합물, 독소, 가용성 단백질, 및 분비된 화합물의 장치 벽 위 또는 그 내부로의 흡착 또는 흡수의 가능성을 감소시킨다. 장치 제조 전략은 테이프 미세유체(tape microfluidics), 레이저 절단 PMMA, 및 일부 PDMS 몰딩(molding)에 근거하고, 그에 의해 장치의 배지와 접촉하는 PDMS의 표면적의 양을 유의성 있게 최소화한다. 도 1 4는 이 제조(fabrication) 방법의 개요를 제공한다.
전술은 본 발명을 예시하나, 그를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 본 발명은 하기의 청구항에 의해 정의되며, 청구항의 균등물은 그에 속한다. 본 명세서에서 인용된 모든 공개문헌, 특허출원, 특허, 특허 공개, GenBank 및/또는 SNP 수탁번호(accession number)에 의해 식별된 서열, 및 기타 참조문헌은 해당 참조문헌이 제시된 문장 및/또는 단락과 관련된 교시에 대해 그 전체로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

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  33. 하기를 포함하는, 인 비트로에서 종양 세포를 평가하기에 유용한 장치:
    살아있는 종양 세포 구조체를 포함하는 챔버;
    상기 챔버와 유체 소통(fluid communication)되는 채널;
    상기 챔버 및 상기 채널 중의 증식 배지;
    상기 채널 내에, 상기 증식 배지가 상기 챔버로부터 관통해 흐를 수 있도록 배치된 미세다공성 막; 및
    상기 챔버 및 채널과 결합된 유체 회로(circuit)로서, 상기 유체 회로는 작동 시에 상기 챔버, 채널 및 미세다공성 막을 통과한 다음 다시 상기 챔버로 돌아오는 유체 흐름을 제공하는 폐쇄 유체 시스템인 유체 회로.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 종양 세포 구조체는 히드로겔을 포함하는 것인 장치.
  35. 청구항 33에 있어서, 상기 종양 세포 구조체는 단일 세포 종류로 구성되는 것인 장치.
  36. 청구항 33에 있어서, 상기 종양 세포 구조체는 결장암 세포, 중피종암 세포, 충수암 세포, 및/또는 육종암 세포를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 것인 장치.
  37. 청구항 33에 있어서, 상기 챔버 및 상기 채널은 미세유체 장치 내에 위치하고, 상기 미세유체 장치의 적어도 일부는 투명하고, 상기 장치는 상기 미세다공성 막과 작동가능하게 결합되고 상기 미세다공성 막 상의 종양 세포를 검출하도록 구성된 검출기를 더 포함하는 것인 장치.
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  39. 하기 단계를 포함하는, 인 비트로에서 전이 활성에 대해 종양 세포를 스크리닝하는 방법:
    (a) 청구항 33의 장치를 제공하는 단계;
    (b) 상기 장치에서 상기 배지를 순환시키는 단계; 및
    (c) 상기 미세다공성 막 상에 포획된 종양 세포를 검출하는 단계로서, 더 많은 수의 포획된 종양 세포는 상기 종양 세포의 더 큰 전이 활성을 나타내는 것인 단계.
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  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 하기 단계를 포함하는, 인 비트로에서 항-전이 및/또는 항-종양 활성에 대해 목적 화합물을 스크리닝하는 방법:
    (a) 청구항 33의 장치를 제공하는 단계;
    (b) 상기 장치에서 상기 배지를 순환시키는 단계;
    (c) 상기 화합물을 상기 종양 세포에 투여하는 단계; 및
    (d) 상기 미세다공성 막에 포획된 종양 세포를 검출하는 단계로서, 더 적은 수의 포획된 종양 세포는 상기 목적 화합물의 더 높은 항-전이 및/또는 항-종양 활성을 나타내는 것인 단계.
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 청구항 43에 있어서, 상기 화합물이 인 비트로에서 상기 종양 세포의 전이를 감소시키고, 인 비트로에서 구조체 크기를 감소시키고, 인 비트로에서 종양 세포의 개수를 감소시키고, 및/또는 인 비트로에서 종양 세포 사망을 유도하는 것으로 결정되는 경우, 환자에게 상기 화합물을 치료-유효량으로 투여하는 단계를 더 포함하고, 상기 환자는 인간을 제외한 개체인 것인 방법.
  51. 삭제
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