ES2562707T3 - Métodos de recelularización de un tejido u órgano para una mejor capacidad de trasplante - Google Patents

Abstract

Un método ex vivo de recelularizar una matriz tisular u orgánica, comprendiendo los pasos de: a) Proporcionar una matriz descelularizada de un órgano o tejido vascularizado de mamífero, donde dicha matriz de dicho órgano comprende una cápsula de órgano intacta, donde dicha matriz de dicho órgano o tejido comprende un sistema vascular, donde cuando se introduce fluido por un punto de entrada de dicho sistema vascular de dicha matriz descelularizada, sale por una vía diferente; y b) Reendotelizar la matriz tisular u orgánica por perfusión, en direcciones antégrada y retrógrada, del sistema vascular descelularizado de la matriz tisular u orgánica, con una composición comprendiendo una población sustancialmente pura de células endoteliales o células progenitoras endoteliales.

Description

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DESCRIPCION

Metodos de recelularizacion de un tejido u organo para una mejor capacidad de trasplante Campo tecnico

Esta divulgacion se refiere en general a metodos de recelularizacion de un tejido u organodescelularizado. Antecedentes

Cuando un vaso sangumeo sufre una lesion, o la matriz extracelular queda expuesta, las plaquetas y la fibrina forman un coagulo sangumeo para prevenir la perdida de sangre por la lesion. La trombosis es la formacion del coagulo sangumeo, que es denominado trombo, dentro de un vaso sangumeo. El vaso sangumeo puede ser una vena, una arteria o un capilar. Tfpicamente, un trombo obstruye, en diversos grados, el flujo de la sangre por el sistema circulatorio.In vivo,se utilizan agentes antitromboticos y/o anticoagulantes para reducir la respuesta coagulante, pero no esta demostrada su utilidad para reducir o eliminar la trombosis observada durante el trasplante de un organo, tejido o andamio.

<US2009/202977 divulga metodos para la descelularizacion y la recelularizacion deorganos o tejido>

Resumen

La invencion viene definida por las reivindicaciones.

En un aspecto, se propone un metodoin vitro de recelularizacion de una matriz tisular u organica. Dicho metodo comprende tfpicamente la perfusion de una matriz tisular u organica, ej, una perfusion de matriz tisular u organica, con un tampon fisiologico bajo presion; y la reendotelizacion de la matriz tisular u organica con una composicion fisiologica comprendiendo una poblacion de celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales.Una poblacion tfpica de celulas endoteliales diferenciadas o celulas de musculo liso puede detectarse utilizando tecnicas inmunocitoqmmicas conocidas en la tecnica incluyendo, por ejemplo, inmunofluorescencia de doble etiqueta, y metodos de inmunoperoxidasa que utilizan anticuerpos que detectan las protemas celulares, para distinguir las caractensticas celulares o propiedades fenotfpicas de las celulas endoteliales o celulas de musculo liso. Los marcadores celulares para celulas endoteliales incluyen, por ejemplo, cadherina VE, CD 144, CD 141, CD 106, o CD 142, mientras que los marcadores celulares de oelulas de musculo liso incluyen Flk. La inmunocitoqmmica puede utilizarse tambien para identificar las celulas endoteliales, detectando la expresion de genes de celulas endoteliales, como CD31 y e-NOS. Las poblaciones de celulas endoteliales maduras deben carecer relativamente de celulas hematopoyeticas, tales como poblaciones CD45+. Tambien puede realizarse histoqmmica de hibridacion in situ, utilizando sondas de cDNA o RNA espedficas para el gen endotelial mRNAs. Estas tecnicas pueden combinarse con metodos inmunocitoqmmicos para mejorar la identificacion de fenotipos espedficos. Los anticuerpos y sondas moleculares comentadas mas arriba pueden aplicarse a procedimientos de Western y Northern blot, respectivamente, para ayudar a la identificacion celular. En una realizacion, la poblacion practicamente pura es por lo menos 50%, 60%, 70%> o mas, como 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 100% celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales.La descelularizacion por perfusion es un metodo ex vivo de descelularizar un organo, parte (porcion) de un organo o tejido vascularizado de mairufero, donde una solucion de descelularizacion es perfundida a traves de un organo, parte de un organo o tejido vascularizado para facilitar la descelularizacion manteniendo los conductos vasculares. El organo, matriz, andamio tisular o injerto descelularizado resultante mantiene un sistema vascular, comprendiendo un suministro arterial, espacio intersticial, donde residen los lechos capilares, y una salida venosa, de forma que se pueden introducir lfquidos o celulas a traves de uno o mas puntos de entrada, ej. uno o mas vasos, y que salgan del organo, matriz, tejido o injerto por una vfa distinta. Los organos enteros con una entrada arterial primaria, tendran un retorno venoso de fluido completo. Las porciones aisladas de organos o tejidos tendran una combinacion de retorno venoso y salida de fluidos a traves de la matriz intersticial expuesta, donde el tejido o porcion del organo fue excindido.Si esta presente, la capsula del organo permanece intacta, ej. no facilita el movimiento de lfquido acuoso a traves de la capsula, lo que contrasta con los organos sujetosa descelularizacion por inmersion.

Las celulas endoteliales representativas incluyen, sin limitacion, celulas endoteliales de la sangre, celulas endoteliales de la medula osea, celulas endoteliales circulantes, celulas endoteliales de aorta humana, celulas endoteliales microvasculares cerebrales humanas, celulas endoteliales microvasculares dermicas humanas, celulas endoteliales microvasculares intestinales humanas, celulas endoteliales microvasculares pulmonares humanas, celulas endoteliales microvasculares humanas,celulas endoteliales sinusoidales hepaticas,celulas endoteliales de vena safena humana, celulas endoteliales de vena umbilical humana, celulas endoteliales linfaticas, celulas endoteliales de microvaso,celulas endoteliales microvasculares, celulas endoteliales de arteria pulmonar, celulas endoteliales capilares retinianas, celulas endoteliales microvasculares retinianas, celulas endoteliales vasculares, celulas endoteliales de sangre de cordon umbilical, celulas endoteliales sinusoidales hepaticas,celulas endoteliales unidades formadoras de colonia (CFU-ECs), celulas angiogenicas circulantes (CACs), precursoras endoteliales circulantes (CEPs), celulas formadoras de colonias endoteliales (ECFC), ECFC de bajo potencial proliferativo (LPP-EcFc), ECFC altamente proliferativas (HPP-ECFC), o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, las celulas endoteliales o las celulas progenitoras

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endoteliales derivan de celulas madre embrionicas (ESC) excepto ESC humanas, celulas madre adultas, celulas progenitoras o celulas madre pluripotentes inducidas (iPSCs).

En determinadas realizaciones, la matriz tisular u organica es una matriz tisular u organica biologica.En determinadas realizaciones, la matriz tisular u organica biologica procede de un organo seleccionado de entre el grupo formado por corazon, rinon, tngado, pulmon, pancreas, intestino, musculo, piel, mama, esofago, traquea u omento.En determinadas realizaciones, la matriz tisular u organica biologica es una matriz tisular u organica descelularizada por perfusion. En determinados casos, la matriz tisular u organica biologica y las celulas endoteliales o celulas precursoras endoteliales son xenogenicas. En determinados casos, la matriz tisular u organica biologica y las celulas endoteliales o las celulas precursoras endoteliales son alogenicas.

En algunas realizaciones, este metodo incluye tambien introducir celulas distintas de las endoteliales o progenitoras endoteliales en o sobre la matriz tisular u organica antes de la fase de reendotelizacion. En alguna realizacion, este metodo incluye ademas la introduccion de celulas distintas de las endoteliales, endoteliales derivadas, endoteliales inmaduras o progenitoras endoteliales en o sobre la matriz tisular u organica tras la fase de reendotelizacion.

Sedivulga un metodo de reduccion de la trombogenesis y la inmunogenicidad en un tejido u organo recelularizado, tras su trasplante a un receptor. Tal metodo comprende tfpicamente la perfusion de una matriz tisular u organica con un tampon fisiologico bajo presion; reendotelizar la matriz tisular u organica por perfusion de la matriz tisular u organica con una composicion fisiologica comprendiendo una poblacion de celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales; y trasplantar la matriz tisular u organica reendotelizada al receptor. La trombogenicidad en los tejidos u organos reendotelizados puede ser evaluada mediante tests y ensayos estandar de hemocompatibilidad, incluyendo, pero sin limitacion, la activacion plaquetaria, ruptura oxidativa, hemolisis, fibrinolisis, formacion de fibrina, generacion de trombina, activacion de contacto, ensayo de trombomodulina y/o activacion del complemento. En una realizacion, la matriz tisular u organica reendotelizadaes adecuada para el trasplante, y permanece patente con el trasplante.

Las celulas endoteliales representativas incluyen, sin limitacion, celulas endoteliales de la sangre, celulas endoteliales de la medula osea, celulas endoteliales circulantes, celulas endoteliales de aorta humana, celulas endoteliales microvasculares cerebrales humanas, celulas endoteliales microvasculares dermicas humanas, celulas endoteliales microvasculares intestinales humanas, celulas endoteliales microvasculares pulmonares humanas,celulas endoteliales microvasculares humanas,celulas endoteliales sinusoidales hepaticas,celulas endoteliales de vena safena humana, celulas endoteliales de vena umbilical humana, celulas endoteliales linfaticas, celulas endoteliales de microvaso,celulas endoteliales microvasculares, celulas endoteliales de arteria pulmonar, celulas endoteliales capilares retinianas, celulas endoteliales microvasculares retinianas, celulas endoteliales vasculares, celulas endoteliales de sangre de cordon umbilical, celulas endoteliales sinusoidales hepaticas, celulas endoteliales unidades formadoras de colonias (CFU-ECs), celulas angiogenicas circulantes (CACs), precursoras endoteliales circulantes (CEPs), celulas formadoras de colonias endoteliales (ECFC), ECFC de bajo potencial proliferativo (LPP-ECFC), eCfC altamente proliferativas (HPP-ECFC), o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, las celulas endoteliales o las celulas progenitoras endoteliales se derivan de celulas madre embrionicas (ESC), celulas madre adultas, celulas progenitoras o celulas madre pluripotentes inducidas (iPSCs).

En determinadas realizaciones, la matriz tisular u organica es una matriz tisular u organica biologica. En determinadas realizaciones, la matriz tisular u organica biologica procede de un organo seleccionado de entre el grupo formado por corazon, rinon, hfgado, pulmon, pancreas, intestino, musculo, piel, mama, esofago, traquea u omento. En determinadas realizaciones, la matriz tisular u organica biologica es una matriz tisular u organica descelularizada por perfusion.

En algunas realizaciones, la matriz tisular u organica biologica y las celulas endoteliales o las celulas precursoras endoteliales son xenogenicas. En algunas realizaciones, la matriz tisular u organica biologica y las celulas endoteliales o las celulas precursoras endoteliales son alogenicas. En algunas realizaciones, la matriz tisular u organica biologica es xenogenicarespecto al receptor, y las celulas endoteliales o las celulas progenitoras endoteliales son alogenicas respecto al receptor.

En determinadas realizaciones, tal metodo incluye ademas introducir celulas distintas de las celulas endoteliales o progenitoras endoteliales en o sobre la matriz tisular u organica antes de la fase de reendotelizacion. En determinadas realizaciones, tal metodo incluye ademas introducir celulas distintas de las celulas endoteliales o progenitoras endoteliales en o sobre la matriz tisular u organica tras la fase de reendotelizacion. En determinadas realizaciones, tal metodo incluye ademas introducir celulas distintas de las celulas endoteliales o progenitoras endoteliales en o sobre la matriz tisular u organica tras la fase de trasplante. La composicion fisiologica que incluye celulas distintas de las celulas endoteliales, endoteliales derivadas o celulas endoteliales inmaduras o celulas progenitoras endoteliales, puede ser introducida en la matriz tisular u organica mediante, por ejemplo, perfusion, inyeccion directa, aplicacion topica o combinaciones de todo ello.

A menos que se defina lo contrario, todos lcs terminos tecnicos y cientfficos utilizados aqm tienen el significado habitualmente entendido por alguien con experiencia normal en la tecnica a la que pertenecen los metodos y composiciones de la materia. Si bien pueden utilizarse metodos y materiales similares o equivalentes a los

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descritos aqm en la practica o en la comprobacion de los metodos y composiciones de materia a continuacion se describen metodos y materiales adecuados. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Descripcion de los dibujos

Figura 1. El Panel A es una grafica que muestra la presencia de celulas en las construcciones cardiacas recelularizadas, que fue calculada cuantificando los nucleos positivos DAPI en cuatro localizaciones de ejes cortos distintos, distribuidas desde la base hasta el vertice (N=3 corazones por metodo). Se suministraron celulas endoteliales aorticas de rata (RAECs) en una dosis unica o en dos dosis.El numero total de celulas suministradas se indica entre parentesis para cada metodo. El suministro en dosis unica de celulas implico la perfusion de RAECs en la aorta distal a la tercera rama (Aorta), o vfa la arteria braquiocefalica (BA). En los suministros en dos dosis, la mitad de las celulas fue suministrada a traves de la IVC, seguido por la mitad a traves de la BA (BA+IVC). La distribucion de las RAECs por el conjunto de la matriz cardiaca fue visualizada por marcaje Dil (ROJO) y DiO (VERDE) de las celulas antes del suministro. 40 millones de RAECs marcadas Dil fueron suministrados vfa BA en los Paneles B y C, mientras que se suministraron 20 millones de celulas marcadas DiO vfa IVC, seguidos de 20 millones adicionales de celulas marcadas Dil vfa BA en los Paneles D y E. Las barras de error son el error estandar de la media, y las barras de escala son 5 mm. * indica p>0,05.

La Figura 2 son fotograffas en las que 20 millones de RAECs marcadas DO (VERDE) se suministraron vfa IVC y 20 millones de RAECs Dil (ROJO) fueron suministrados vfa BA y se visualizaron siete dfas despues de la siembra en andamios descelularizados(Paneles A-E). Se observaron RAECs marcadas en distintas distribuciones en las paredes ventriculares (Paneles A-C) y sobre la superficie endocardica (Paneles D-E). Los nucleos positivos DAPi sonAZULES (Paneles A-E). La barra de escala en los Paneles A-E es 50 micrones.

Figura 3. Los Paneles A-D son fotograffas que muestran la evaluacion histologica de ECM de corazon de rata descelularizado resembrado con RAECs vfa BA (40 millones de celulas, Paneles A - B), o BA e IVC (20 millones cada inyeccion, Paneles C - D). Los Paneles A y C son secciones tenidas con hematoxilina y eosina, mientras que los Paneles B y D estan tenidos con Verhoeff-van Gieson. El diametro del vaso fue cuantificado y agrupado de acuerdo con el tamano de la pared del LV y del RV, y los datos se presentan en el Pane E (N=3 por conjunto de datos). La barra de escala es 250 micrones. Las barras de error son una desviacion estandar de la media. * indica una diferencia estadfsticamente significativa entre los metodos de suministro (p<.001) para un diametro de vaso determinado.

La Figura 4 son fotograffas de construcciones de corazon de rata descelularizadas, sembradas el dfa 0 con 40 millones de RAECs por infusion en la BA (Panel A), o 30 millones de RAECs en la IVC (Paneles B y C). El dfa 7, las construcciones cardiacas fueron perfundidas con la tincion vital, CMFDA, vfa aortaa celulas vivas marcadas por fluorescencia (VERDE). Se observaron RAECs CMFDA-positivas en las paredes ventriculares (Paneles A y B) y en la superficie endocardica de la construccion cardiaca (Panel C), con independencia de la vfa de suministro.La muerte celular por apoptosis fue examinada con tincion TUNEL (Paneles D-I). Los Paneles D-F son imagenes de eje corto representativas del ventnculo izquierdo, el septum y el ventnculo derechode construcciones con suministro de celulas vfa BA. Los Paneles G-I son imagenes TUNEL del ventnculo izquierdo, el septum y el ventnculo derecho de construcciones sembradas con celulas vfa BA e IVC. Los nucleos celulares estan tenidos con DAPI (AZUL) y la tincion positiva TUNEL es ROJO. Para seguir cuantificando los cambios en la viabilidad celular a lo largo del tiempo, se tomaron diariamente muestras del medio y se cuantifico la actividad G6PDH (Panel J) (N=6). Las barras de error representan una desviacion estandar de la media. La barra de escala representa 100 micrones en los Paneles A-C, mientras en los Paneles D-I, la barra de escala representa 250 micrones. # designa tincion TUNEL positiva. El Panel J es una representacion grafica de los datos.

La Figura 5 son fotograffas de tincion histoqmmica de RAECs al cabo de siete dfas en andamios cardiacos descelularizados, y muestran que las celulas siguen siendo viables, proliferativas (Panel A, VERDE es CMFDA y ROJO es PCNA), y expresan marcadores de ECs activas funcionalmente (Panel B, ROJO es eNOS, VERDE es CMFDA, AZUL es DAPI; Panel C, ROJOes vWF, VERDEes CMFDA, yAZULes DAPI). Las matrices reendotelizadas segman siendo capaces de reducir la trombogenicidad de los andamios vfa senalizacion de trombomodulina (Panel D, N=6 para controles acelulares, N=8 para BA y BA+IVC). El numero total de RAECs suministradas en cada metodo viene indicado entre parentesis. * indica p < ,05 en comparacion con los controles acelulares. Las barras de error son el error estandar de la media. La barra de escala representa 100 micrones.

La Figura 6 son fotograffas que muestran una comparacion entre explantes de andamiosacelulares (Paneles AD) y explantes de construcciones reendotelizadas (Paneles E-H) siete dfas despues del trasplante heterotropico. El examen macroscopico de la aorta y el ventnculo izquierdo de andamios acelulares (Paneles A y B, respectivamente) y construcciones reendotelizadas (Paneles E y F, respectivamente) revelaron reduccion de la formacion de trombos. La tincion con hematoxilina y eosina de andamios acelulares (Paneles C-D) y construcciones reendotelizadas (Paneles G-H) revelomas sangre suelta en los andamios acelulares, y cantidades comparables de celulas reclutadas en los explantes tanto de andamios acelulares, como de andamios reendotelizados.* indicavasos patentes en las construcciones. Las barras de escala indican: 1 mm

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en los Paneles A, B, E y F, 250 micrones en los Paneles C y G, 50 micrones en el Panel D y 100 micrones en el Panel H.

La Figura 7 son fotograffas de tincion VEGF-R2 (ROJO) de andamios acelulares (Panel A) o construcciones reendotelizadas (Panel B) siete dfas despues del trasplante. Tincion PECAM (ROJO) de un andamio acelular (Panel C) y una construccion reendotelizada (Panel D) 7 dfas despues del trasplante. Los nucleos positivos DAPI son AZULES. La barra de escala representa 100 micrones. * indica autofluorescencia de sangre

Descripcion detallada

La trombosis de matrices tisulares u organicas recelularizadas es un fenomeno observado que ocurre tras el trasplante y reperfusion de tejidos u organos con sangre. Ademas, los tejidos u organos trasplantados son con frecuencia inmunogenicos, y el receptor muestra frecuentemente una respuesta inflamatoria contra el tejido u organo trasplantado. Los metodos de recelularizacion de una matriz tisular u organica que se describen aqm reducen la trombogenicidad cuando la matriz tisular u organicaes posteriormente trasplantada a un huesped y reperfundida con sangre. Los metodos de recelularizacion que se describen aqm producen tambien unos tejidos y organos que, al ser trasplantados y reperfundidos con sangre, presentan una inflamacion limifeda.

En los metodos de recelularizacion de una matriz tisular u organica como se describen aqm, se puede utilizar unamatriz tisular u organica biologica. Las matrices tisulares u organicas biologicas representativas incluyen, por ejemplo, corazon, hfgado, rinon, pulmon, pancreas, bazo, utero, vejiga, esofago, traquea, medula espinal, articulaciones (ej.rodillas, hombros o caderas), piel, mama, musculo, intestino, omento y tejido adiposo.Una matriz biologica puede incluir tambien, por ejemplo, una matriz de colageno que haya sido secretado o remodelado por celulas. La recelularizacion de una matriz biologica, como se describe aqm, requiere tfpicamente que la matriz carezca, o por lo menos carezca sustancialmente, de celulas viables.

Los tejidos y organos biologicos pueden ser descelularizados utilizando diversos metodos conocidos. Por ejemplo, un tejido u organo biologico puede ser descelularizado mediante metodos de perfusion. Vease, por ejemplo, WO 2007/025233 y Ott et al. (2008, Nat. Med., 14:213-21) para descripciones de metodos de descelularizacion basados en la perfusion.Los metodos de descelularizacion por perfusion han demostrado que producen una matrizmuy buena para la recelularizacion. Vease, por ejemplo, WO 2007/025233; Ott et al. (2008, Nat. Med., 14:213-21); Uygun et al., 2010, Nat. Med., 16(7):814-20; Petersen et al., 2010, Science, e- pub June; and Ott et al., 2010, Nat. Med., e-pub July.

Como alternativa a la descelularizacion basada en perfusion, los tejidos u organos biologicos pueden ser descelularizados por inmersion en una solucion de descelularizacion que elimina las celulas. Vease, por ejemplo, la Patente USA N° 6 376 244 y 6 753 181. Ademas, como alternativa a la utilizacion de matrices tisulares y organicas biologicas, en los metodos de recelularizacion que se describen aqm se pueden utilizar matrices tisulares u organicas sinteticas, siempre que tales matrices sinteticas tengan una estructura vascular tipo lecho. Entre las matrices tisulares y organicas sinteticas se incluyen, por ejemplo, hidrogeles, polfmeros (ej., PLGA, PLA biodegradables, o polfmeros durables, como el poliuretano), andamios de colageno, andamios de matriz ECM incluyendo colageno, fibronectina, laminina y combinaciones de ellos.

Los metodos de recelularizacion de una matriz tisular u organica que se describen aqm incluyen la perfusion de una matriz tisular u organica con un tampon fisiologico bajo presion. Esta perfusion de la matriz tisular u organica bajo presion se realiza antes de introducir celulas en la matriz y, de forma similar a la perfusion utilizada en el proceso de descelularizacion descrito en WO 2007/025233, es vfa la vasculatura u otro lumen o estructura de conducto (ej., la traquea en los pulmones, el conducto biliar en el hfgado, la uretra en el rinon, etc.) de la matriz organica o tisular, y generalmente comienza con la canulacion de la vasculatura (ej., arteria;, venas, arteriolas, venulas y capilares),y/o otros lumenes y/o conductos (en lo sucesivo estructuras “tipo vasculatura”)de una matriz organica o tisular (de aproximadamente 1 a aproximadamente 300 Hg). Por tanto, la canulacion incluye la insercion de una canula en un conducto, cavidad o vaso corporal, como la traquea, la vejiga, o un vaso sangmneo, para introducir o extraer un lfquido, una sustancia o un residuo. Como se aplica aqm, la perfusion de una matriz organica o tisular bajo presion, se refiere al suministro de una composicion lfquida (ej., un tampon fisiologico) bajo presion suficiente para que la vasculatura y las estructuras tipo vasculatura de la matriz tisular u organica se mantengan abiertas y expandidas, pero no tan alta como para producir danos o distension de la vasculatura o las estructuras tipo vasculatura de la matriz tisular u organica.Un tampon fisiologico adecuado para la perfusion precelular de una matriz tisular u organica bajo presion, puede ser cualquier tampon que sea compatible con la matriz tisular u organica. Por ejemplo, entre los tampones fisiologicos pueden incluirse nutrientes tales como azucares e hidratos de carbono, y pueden incluir tambien factores proendoteliales (ej., compuestos que tengan un efecto positivo sobre las celulas endoteliales o el endotelio), tales como, por ejemplo, compuestos que induzcan la angiogenesis (ej., VEGF, FGF-1 y/o bFGF). Un tampon fisiologico tiene generalmente pH fisiologico.

En una realizacion, el tampon fisiologico adecuado para la perfusion precelular o la perfusion celular incluye, pero sin limitacion, el tampon fosfato salino (PBS) o soluciones de medio de cultivo adecuadas para el cultivo de celulas endoteliales incluyendo, pero sin limitacion, EGM-2, EGM-2MV, DMEM, PromoCell Endothelial Cell

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Medium, Medium 200, DMEMF/12, tampones junto con suplementos nutricionales, ej., glucosa, que pueden emplearse para la perfusion y/o conservacion de organos, incluyendo el trasplante.Entre ellos se incluye, por ejemplo, para tejidos cardiacos,el tampon Modified Krebs-Henseleit de la siguiente composicion (en mM): 118 NaCl, 4,7 KC1, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCOa, 11 glucosa, 1,75 CaCh, y 2,0 piruvatoy 5 U/L de insulina, otampon Krebs conteniendo (en mM) 118 NaCl, 4,7 KC1, 25 NaHCOa, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2P04, 2 CaCl2 gaseado con 95% O2, 5% CO2; o glucosa (ej., 11 mM) en combinacion con 1 o 1,2 mM palmitato. Para tejidos renales, un medio tfpico es KPS-1 Kidney Perfusion Solution (Solucion de Perfusion Renal). Para tejidos hepaticos, un medio de ejemplo es el tampon Krebs-Henseleit conteniendo 118 mMNaCl, 4,7 mM KC1, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 26 mM NaHCOa, 8 mM glucosa, y 1,25 mM CaChcomplementados con 2% BSA.

Aunque no va vinculado a ningun mecanismo en particular, se cree que esta perfusion precelular bajo presion abre y enjuaga la matriz y, en particular, el lecho vascular de la matriz tisular u organica, exponiendo asf mas parte de la matriz a las celulas durante la reendotelizacion, y permitiendo el establecimiento de un endotelio viable en la vasculatura de la matriz tisular u organica. Los expertos en la materia entenderan que distintas matrices tisulares y organicas (ej., de diferentes fuentes, ej., corazon, hngado, pulmon, rinon, pancreas, etc.) pueden soportar distintos grados de presion. Elnivel de presion que una matriz tisular u organica en particular puede soportar esta relacionado, por lo menos parcialmente, con el lecho vascular de esa matriz tisular u organica concreta.

Los metodos de recelularizacion de una matriz tisular u organica que se describen aqu incluyen tambien la reendotelizacion de la matriz tisular u organica con celulas endoteliales, derivadas endoteliales, celulas endoteliales inmaduras o celulas progenitoras endoteliales. Las fuentes de celulas endoteliales incluyen las obtenidas de una recogida autologa, ej. una biopsia. Las celulas endoteliales autologas pueden ser obtenidas de un paciente vfa la biopsia de una arteria, vena o un tejido espedfico, y colocadas en cultivo celular para elcrecimiento normal de la poblacion. La seleccion de celulas endoteliales se obtiene mediante condiciones de cultivo, donde VEGF o bFGF suprime las poblaciones celulares contaminantes, incluyendo las celulas de musculo liso, o por clasificacion directa FACS u otros metodos de seleccion ex vivo disponibles, como perlas magneticas, microfluidos, lab-on-a-chip, columna de afinidad o dispositivo asociado para la poblacion a seleccionar para una poblacion de celulas endoteliales pura, basado en cualquiera de los siguientes marcadores de superficie de celulas endoteliales aceptados incluyendo, pero sin limitacion, CD31, VEGFR-1, VEGFR-2, CD105, CD144, TEM7, CD146 y/o D2-40.

Las celulas progenitoras endoteliales (EPCs) son celulas endoteliales inmaduras, con capacidad para proliferar, migrar y diferenciarse en celulas endoteliales, pero que no han adquirido todavfa las caractensticas de celulas endoteliales maduras. Las EPCs pueden ser movilizadas de la medula osea a la sangre periferica (EPCs circulantes) en respuesta a determinados estfmulos fisiologicos como, por ejemplo, una lesion tisular.Las EPCs circulantes fueron identificadas en sangre humana de adulto (Asahara et al. (1997) Science 275:964-967),y posteriores estudios han sugerido un papel de las EPCs en el mantenimiento de la integridad y la funcion endotelial, asf como en la neovascularizacion posnatal. Las EPCs pueden ser aisladas de la sangre, la medula osea o la sangre de cordon, y son identificadas en la fraccion celular CD34+ en las celulas mononucleares perifericas humanas adultas.Pueden ser aisladas utilizando celulas CD34+ o celulas CD 133+ solas o en combinacion con KDR+ como una fraccion celular rica en EPC en sangre periferica, vfa clasificacion FACS directa, u otro metodo de seleccion ex vivo disponible, tal como perlas magneticas, microfluidos, lab- ona-chip, columna de afinidad o dispositivo asociado. Las EPCs pueden ser entonces perfundidas directamente en la matriz y cultivadas en condiciones apropiadas para ayudar en la proliferacion y la diferenciacion, o cultivadas in vitro para aumentar las cifras globales de celulas en un medio de cultivo de mantenimiento de EPC, como el cultivo durante siete dfas en medio StemSpan® sin suero (StemCell Technologies, Vancouver, Canada) durante el periodo inicial de expansion, y suplementarlo con 1% penicilina- estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE UU) y ligando Flt3 recombinante humano (rh) (100 ng/ml), factor rh de celulas madre (100 ng/ml), rh IL-3 (20 ng/ml), rh IL-6 (20 ng/ml). Esas celulas pueden ser entonces perfundidas en la matriz como EPCs, o prediferenciadas en ECs y perfundidas en la matriz. La diferenciacion de las EPCs puede conseguirse mediante metodos tales como cultivando aproximadamente 3x 105a aproximadamente 1x106/1,5 ml/9,6 cm2 en medio de cultivo-2 de celulas endoteliales (EGM-2) conteniendo FBS (2%), hidrocortisona, hFGF, VEGF, R3-IGF-1, acido ascorbico, hEGF, gentamicina, anfotericina-B y heparina (Lonza, Basilea, Suiza). Tras tres dfas de cultivo, las celulas pueden ser recogidas y transferidas a placas recubiertas con fibronectina (10 pg/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE UU) a una densidad de aproximadamente 1 x 106 celulas/1,5 ml/9,6 cm2y cultivadas durante tres dfas adicionales en medio EGM-2 fresco.

Se puede utilizar una poblacion de celulas endoteliales o precursoras de celulas endoteliales alogenicas, y prepararlas a partir de tejido que sea alogenico al del receptor, comprobandolo para su uso por los metodos bien conocidos de tipificacion tisular, para que coincida estrictamente con el tipo de histocompatibilidad del receptor. Entre ellos se incluyen, pero sin limitacion, celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs), celulas endoteliales modificadas geneticamente para reducir la inmunogenicidad, celulas endoteliales emparejadas HLA, celulas endoteliales derivadas de sangre de cordon, ECs derivadas de EPCs, progenitoras, celulas iPS o celulas madre embrionicas. La mayona de los metodos alogenicos requeriran el uso de agentes inmunsupresores postrasplante.Estudios recientes han demostrado la naturaleza inmunologica privilegiada de

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las ECs derivadas de EPCs (Cardiovasc Res. 2010 Oct 1 ;88(1): 121-9. Epub 2010 abril 13),donde la supresion inmunologica no requerira postrasplante. Entre los ejemplos de metodos de diferenciacion de EpCs se incluyen: aislar las EPCsde la sangre por centrifugacion de gradiente de densidad con Pancoll rata (PANBiotech), y la realizacion de una reduccion de CD45 utilizando un anticuerpo monoclonal CD45. La fraccion CD45 (-) se cultiva en un medio de diferenciacion endotelial [EBM complementado con 5% FCS, 50 mg/ml gentamicina, 10 ng/ml VEGF rata, 1 ng/ml bFGF bovino, 10 ng/ml IGF-1 murino (ambos R&D Systems), 10 ng/ml EGF murino, y 1 mg/mlhidrocortisona] en placas recubiertas con 20 mg/mlde fibronectina. Las celulas no adherentes fueron eliminadas por cambio de medio cada 4 dfas. Aparecieron grupos de celulas en crecimiento tras aproximadamente de 15 a 22 dfas de cultivo, que son recogidas por tripsinizacion dentro de anillos de clonacion. Las celulas PECAM-1(+) son seleccionadas con separacion MACS utilizando un anticuerpo PECAM-1 eIgGlMicroBeads. La fraccion PECAM-1(+) puede seguir siendo cultivada hasta el paso 25 y perfundida en multiples matrices.

Adicionalmente, una alternativa al empleo de tecnicas de inmunosupresion, metodos de sustitucion obloqueode genes utilizando la recombinacion homologa en celulas madre, propuesta por Smithies et al, 317 Nature 230234 (1985), y ampliada a la sustitucion o bloqueo de genes en lmeas celulares (Zheng et al, 88 Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991)), puede aplicarse a las celulas endoteliales y derivadas endoteliales para la ablacion de genes del complejo de histocompatibilidad (MHC) importantes. Las celulas sin la expresion MHC permiten el injerto de poblaciones celulares endoteliales enriquecidas a traves de barreras de histocompatibilidad alogenica o incluso xenogenica, sin la necesidad de inmunosupresion del receptor. Las revisiones generales y citas sobre el uso de metodos recombinantes para reducir la antigenicidad de las celulas del donante son publicadas tambien por Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992). Metodos tfpicos de la reduccion de la inmunogenicidad de los trasplantes por modificacion de superficie son presentados en la PCT International patent application WO 92/04033 and pCt/US99/24630. Alternativamente, la inmunogenicidad del injerto puede reducirse preparando celulas de un animal transgenico que tenga antfgenos MHC alterados o eliminados.

Los precursores de celulas endoteliales incluyen, pero sin limitacion, celulas endoteliales unidades formadoras de colonias (CFU-ECs), celulas angiogenicas circulantes (CACs), precursoras endoteliales circulantes (CEPs), celulas formadoras de colonias endoteliales (ECFC), ECFC con bajo potencial proliferativo (LPP-ECFC), y ECFC altamente proliferativas (HPP-ECFC).

En una realizacion, las celulas endoteliales y las progenitoras endoteliales son obtenidas mediante cultivo de celulas madre embrionicas (ESCs) o celulas madre pluripotentes inducidas (iPSCs) en condiciones apropiadas para dirigir a las celulas madre por un linaje endotelial. Las celulas progenitoras endoteliales son celulas que han comenzado a diferenciarse en celulas endoteliales (ej., linaje restringido; ej., celulas destinadas a convertirse en celulas endoteliales),pero no son consideradas celulas endoteliales totalmente diferenciadas. Por ejemplo, las celulas progenitoras endoteliales pueden expresar un marcador de progenitoras como el CD 133, y pueden expresar tambien un marcador de celulas endoteliales como, pero sin limitacion, molecula de adhesion celular endotelial y plaquetaria-1 (PECAM1; o CD31), VEGFR-1 (o Flt-1), VEGFR-2 (o Flk-1), protema de union a guanilato-1 (GBP-1), trombomodulina (o CD141), cadherina VE (o CD 144), factor von Willebrand (vWF), y molecula de adhesion intercelular 2 (ICAM-2). Generalmente, las celulas progenitoras endoteliales pueden aceptar tambien el LDL acetilado, y ademas pueden migrar hacia VEGF y/o formar tubos en Matrigel.

Las ESCs o iPSCs, como las ESCs e iPSCs humanas, pueden seguir siendo cultivadas en condiciones que produzcan celulas endoteliales totalmente diferenciadas, ej., VEGF y bFGF. Adicional o alternativamente, pueden obtenerse celulas endoteliales de diversas fuentes, como medula osea, sangre, piel, hfgado, corazon, pulmon, retina y cualquier otro tejido u organo que tenga celulas endoteliales.Por ejemplo, las celulas endoteliales representativas incluyen, sin limitacion, celulas endoteliales de la sangre, celulas endoteliales de medula osea, celulas endoteliales circulantes, celulas endoteliales de aorta humana, celulas endoteliales microvasculares cerebrales humanas, celulas endoteliales microvasculares dermicas humanas, celulas endoteliales microvasculares intestinales humanas celulas endoteliales microvasculares pulmonares humanas, celulas endoteliales microvasculares humanas, celulas endoteliales sinusoidales hepaticas, celulas endoteliales de vena safena humana, celulas endoteliales de vena umbilical humana, celulas endoteliales linfaticas, celulas endoteliales de microvaso, celulas endoteliales microvasculares,celulas endoteliales de arteria pulmonar, celulas endoteliales capilares retinianas, celulas endoteliales microvasculares retinianas, celulas endoteliales vasculares, celulas endoteliales de sangre de cordon umbilical y combinaciones de las anteriores.Como comprenderan los expertos en la tecnica, esto no pretende ser una lista exhaustiva de celulas endoteliales.

Pueden obtenerse EPCs de la sangre periferica aislando celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) por centrifugacion de gradiente de densidad. Se siembran suspensiones de celulas en cualquier receptaculo capaz de mantener celulas, en especial matraces de cultivo, placas de cultivo o botellas rotativas, y muy especialmente en pequenos matraces de cultivo como matraces de cultivo de 25 cm 2 Las celulas cultivadas en suspension pueden ser resuspendidas a aproximadamente de 5x 104a 2 x 105celulas/ml (por ejemplo, aproximadamente 1x105celulas/ml). Las celulas en placas sobre un sustrato fijo pueden ser plaqueadasa

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aproximadamente de 2 a 3x 103celulas/cm2. Opcionalmente, las placas de cultivo se cubren con una matriz proteica, como el colageno.Las celulas pueden colocarse en cualquier medio de cultivo conocido capaz de mantener el crecimiento celular, incluyendo HEM, DMEM, RPMI, F-12, y similares, conteniendo los suplementos requeridos para el metabolismo celular, como son la glutamina y otros aminoacidos, vitaminas, minerales y protemas, como la transferrina y similares. El medio de cultivo puede contener tambien antibioticos para evitar la contaminacion por levaduras, bacterias y hongos, como penicilina, estreptomicina, gentamicina y similares. El medio de cultivo puede contener suero derivado de bovinos, equinos, pollos y similares. Las condiciones de cultivo en general deben ser muy parecidas a las fisiologicas. El pH del medio de cultivo debe ser similar al fisiologico (por ejemplo, entre pH 6-8, entre pH 7a 7.8, o a pH 7.4). Las temperaturas fisiologicas van de 30° Ca 40° C. Las EpCs pueden ser cultivadas a temperaturas de aproximadamente 32° C a 38° C. (por ejemplo, aproximadamente de 35° C a 37° C).

Opcionalmente, el medio de cultivo se suplementa con por lo menos un factor de crecimiento que induzca la proliferacion (“mitogenico”). Un “factor de crecimiento” es una protema, un peptido u otra molecula que tenga un efecto de crecimiento, induzca la proliferacion, induzca la diferenciacion, otenga un efecto trofico sobre las EPCs. Los “Factores de crecimiento que inducen la proliferacion” son factores troficos que permiten la proliferacion de las EPCs, incluyendo cualquier molecula que se una a un receptor sobre la superficie de la celula, para ejercer un efecto trofico o inductor de crecimiento sobre la celula. Entre los factores de crecimiento que inducen la proliferacion se incluyen EGF, anfiregulina, factor de crecimiento fibroblastico acido (aFGF o FGF-1), factor de crecimiento fibroblastico basico (bFGF o FGF-2), factor de crecimiento transformante alfa (TGFa), VEGF y combinaciones de los anteriores.Los factores de crecimiento se anaden habitualmente al medio de cultivo a concentraciones que van de aproximadamente 1 fg/mla 1 mg/ml. Concentraciones de aproximadamente 1 a 100 ng/mlresultan habitualmente suficientes. Se pueden realizar facilmente ensayos de titulacion simples para determinar la concentracion optima de un factor de crecimiento determinado. Los efectos biologicos de los factores de crecimiento y troficos son generalmente mediados por union a los receptores de la superficie celular. Se han identificado los receptores de varios de esos factores, y se dispone de anticuerpos y sondas moleculares para receptores espedficos. Las EPCs pueden ser analizadas respecto a la presencia de factores de crecimiento en todos los estadios de diferenciacion. En muchos casos, la identificacion de un receptor concreto proporciona orientacion respecto a la estrategia a aplicar para una mayor diferenciacion de las celulas por vfas de desarrollo espedficas, con la adicion de factores de crecimiento o troficos exogenos.

En general, tras unos 3-10 dfas/n vitro, el medio de cultivo de las EPCs se repone aspirandolo, y anadiendo medio nuevo al matraz de cultivo. Opcionalmente, el medio aspirado es recogido, filtrado y utilizado como medio de acondicionamiento y posterior paso de EPCs. Por ejemplo, se utiliza el 10%, 20%, 30%, 40% o mas de medio de acondicionamiento. El cultivo de celulas EPC puede ser transferido facilmente para reiniciar la proliferacion.Por ejemplo, despues de 3 a 7 d'las/n vitro, se agitan bien los matraces de cultivo, y se transfieren entonces las EPCs a un tubo de centrifugado de 50 ml, y se centrifugan a baja velocidad.El medio es aspirado, las EPCs son resuspendidas en una pequena cantidad de medio de cultivo, se cuentan entonces las celulas y se resiembran con la densidad deseada para reiniciar la proliferacion. Este procedimiento puede repetirse semanalmente, y tiene como resultado un aumento logantmico en el numero de celulas viables en cada paso. El procedimiento prosigue hasta obtener el numero deseado de EPCs

Las EPCs y la progenie de EPCspueden ser criopreservadas por cualquier metodo conocido en estamateria hasta que son necesarias. (Vease, ej., Pat.USA N° 5.071.741, solicitudes de patente internacional PCT W093/14191, WO95/07611, W096/27287, W096/29862, y WO98/14058, Karlsson et al., 65 Biophysical J. 2524-2536 (1993)). Las EPCs pueden ser suspendidas en una solucion isotonica, de preferencia un medio de cultivo celular, conteniendo un criopreservante determinado.Tales criopreservantes incluyen dimetil sulfuro (DMSO), glicerol y similares.Estos criopreservantes pueden utilizarse a una concentracion del 5-15% (por ejemplo, 8-10%). Las celulas son congeladas gradualmente a una temperatura de -10° C a -150° C (por ejemplo, -20° C a -100° C, o -70° C a -80° C).

Dependiendo de las condiciones del cultivo, las EPCs pueden diferenciarse en celulas endoteliales o celulas de musculo liso. Las EPCs pueden diferenciarse en celulas endoteliales o celulas EPCs de musculo liso Sobre un sustrato fijo, en un medio de cultivo con un factor de crecimiento inductor de diferenciacion. La diferenciacion de las EPCs puede inducirse tambien por cualquier metodo conocido en la materia, que active la cascada de eventos biologicos que conducen al crecimiento, lo que incluye la liberacion de inositol trifosfatoy Ca2+intracelular, liberacion de diacil glicerol y la activacion de proteincinasa C y otras quinasas celulares, y similares. El tratamiento con esteres de forbol, factores de crecimiento inductores de la diferenciacion y otras senales qmmicas pueden inducir la diferenciacion. En lugar de factores del crecimiento inductores de la proliferacion, para la proliferacion de EPCs (ver mas arriba), se pueden anadir factores del crecimiento inductores de la diferenciacion al medio de cultivo para influir en la diferenciacion de las EPCs. Otros factores de crecimiento inductores de la diferenciacion incluyen el factor de crecimiento derivado de plaquetas(PDGF), hormona liberadora de tirotropina (TRH), factor de crecimiento transformante beta (TGF,s), factor de crecimiento tipo insulina (IGF-1) y similares.

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Las celulas endoteliales diferenciadas o las celulas de musculo liso pueden ser detectadas utilizando tecnicas inmunocitoqmmicas conocidas habitualmente. La inmunocitoqmmica (ej. metodos de inmunofluorescencia de etiquetado doble e inmunoperoxidasa) utiliza anticuerpos que detectan las protemas celulares, para distinguir las caractensticas celulares o propiedades fenotfpicas de las celulas endoteliales o las celulas de musculo liso. Entre los marcadores celulares para las celulas endoteliales se incluyen, por ejemplo, cadherina VE, CD144, CD141, CD 106, o CD142, mientras que los marcadores celulares para las celulas de musculo liso incluyen del Flk. Tambien puede utilizarse la inmunoqmmica para identificar las celulas endoteliales, detectando la expresion de genes de celulas endoteliales tales como CD31 y e-NOS.

Puede realizarse tambien histoqmmica de hibridacion in situ, utilizando sondas de cDNA oRNAespedficaspara el gene endotelial mRNAs. Esas tecnicas pueden combinarse con metodos inmunocitoqmmicos, para mejorar la identificacion de fenotipos espedficos. Si es necesario, se pueden aplicar los anticuerpos y las sondas moleculares comentadas mas arriba a procedimientos de Western y Northern blot respectivamente, para ayudar en la identificacion celular.

Se pueden obtener celulas endoteliales, por ejemplo, de uno de losmuchos depositos de material biologico del mundo. Vease, por ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC.orgen internet) ola International Depositary Authority of Canada (IDAC; nml-lnm.gc.ca en internet). Las celulas endoteliales o las celulas progenitoras endoteliales pueden obtenerse tambien del individuo que sera el receptor de la matriz tisular u organica trasplantada. Estas celulas se consideran autologas respecto al receptor.Adicionalmente, en determinadas circunstancias, la relacion entre la matriz tisular u organica y las celulas endoteliales o las celulas progenitoras endoteliales puede ser alogenica (es decir, individuos distintos de la misma especie); en otros casos, la relacion entre la matriz tisular u organica y las celulas endoteliales o las celulas progenitoras endoteliales puede ser xenogenica (es decir, individuos de distintas especies). En determinados casos, la matriz tisular u organica es xenogenica respecto al receptor, y las celulas endoteliales o progenitoras endoteliales son alogenicas respecto al receptor.

Una composicion que incluye celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales, es suministrada tfpicamente a una matriz tisular u organica en una solucion que es compatible con las celulas (ej., en una composicion fisiologica) en condiciones fisiologicas (ej., 37°C). Una composicion fisiologica, como la comentada aqm, puede incluir, sin limitacion, tampones, nutrientes (ej., azucares, hidratos de carbono), enzimas, medio de expansion y/o diferenciacion, citocinas, anticuerpos, represores,factores de crecimiento, soluciones salinas, o protemas derivadas del suero.Como se aplica aqm, una composicion “compuesta esencialmente por celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales, es una composicion que carece basicamente de celulas distintas a las celulas endoteliales o las celulas precursoras endoteliales, pero puede seguir incluyendo cualquiera de los componentes que pueden encontrarse en una composicion fisiologica (ej., tampones, nutrientes, etc.).

Para optimizar la reendotelizacion, las celulas endoteliales o progenitoras endoteliales son introducidas generalmente en una matriz organica o tisular por perfusion. Como con la perfusion precelular, y como se describe en WO 2007/025233, la perfusion se produce vfa la vasculatura o la estructura tipo vasculatura (ej., otros lumenes o conductos) de la matriz organica o tisular. La perfusion para reendotelizar una matriz organica o tisular debe realizarse a una velocidad de flujo que sea suficiente para que circule la composicion fisiologica de celulas por la vasculatura y las estructuras tipo vasculatura; no obstante, la perfusion para reendotelizar una matriz tisular u organica se realiza tfpicamente bajo escasa o ninguna presion (ej., menos presion de la aplicada en la fase de perfusion precelular para expandir y lavar el lecho vascular). La perfusion con las celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales puede ser multidireccional (ej., anterograda o retrograda) para optimizar aun mas la reendotelizacion.

El numero de celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales que se introduce en una matriz tisular u organica para la reendotelizacion depende del organo o tejido (ej., que organo o tejido, el tamano y el peso del organo o tejido, el estadio de desarrollo del organo o tejido, y/o la extension de la vascularizacion del organo o tejido),y el tipo y estadio de desarrollo de las celulas endoteliales, endoteliales derivadas, celulas endoteliales inmaduras, o celulas progenitoras endoteliales.Ademas, se puede perfundir en una matriz organica o tisular mas de un tipo de celulas endoteliales o progenitoras endoteliales (ej., uncoctelde celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales). Distintos tipos de celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales pueden presentar distintas tendencias en cuanto a la densidad de poblacion que alcanzaran esas celulas, y de forma similar, distintas matrices organicas o tisulares pueden ser reendotelizadas a distintas densidades. Simplemente a guisa de ejemplo, por lo menos unas 100 (ej., por lo menos unas 103, 104, 105, 106, 107, 109 o 1010) celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales pueden ser introducidas en una matriz organica o tisular.

Previamente a la implantacion, la matriz o el injerto deben contener una mayona de celulas endoteliales maduras, como se define por la expresion de marcadores celulares para celulas endoteliales incluyendo, por ejemplo, cadherina VE, CD144, CD141, CD 106, o CD142. Tambien puede utilizarse inmunocitoqmmica para identificar las celulas endoteliales, detectando la expresion de genes de celulas endoteliales tales como CD31 y e-NOS. Un metodo no destructivo de aislamiento endotelial sena la perfusion breve de tripsina (0,25% o menos) u otro metodo de separacion celular para permitir la eliminacion de una pequena fraccion <0,01% de

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las celulas endoteliales, que pueden ser ensayadas entonces respecto a la expresion de marcadores de celulas endoteliales incluyendo, pero sin limitacion, CD 105, CD31 y expresion funcional de e-NOS. Una funcion adicional de las celulas endoteliales puede ser evaluada mediante la formacion de tubos endoteliales en ensayos Matrigel. Resumiendo, los pocillos de una placa de 96 pocillos se recubrieron con 50 |iL de Matrigel™ helada, seguido de incubacion a 37°C durante una hora.A continuacion, 100 uL de medio EGM-2, conteniendo aproximadamente de 25.000 a 50.000 celulas endoteliales, se anaden al Matrigel™. La incubacion se lleva a cabo durante 16 horas, en una atmosfera humidificada a 37°C con 5% CO2. La formacion de tubos se evalua con un microscopio invertido y se toman microfotograffas digitales de cada pocillo individual con una ampliacion de cuatro aumentos, y se puede calcular el numero total de tubos, los puntos de ramificacion, la longitud de los tubos y la suma de las longitudes de los tubos para cada pocillo, donde la presencia de tubos endoteliales defima celulas endoteliales funcionales.

Ademas, la medicion de la reendotelizacion puede completarse mediante el uso de tests y ensayos estandar de hemocompatibilidad incluyendo, pero sin limitacion, activacion plaquetaria,ruptura oxidativa, hemolisis, fibrinolisis, formacion de fibrina, generacion de trombina, activacion de contacto y activacion del complemento.Los metodos no destructivos incluyen el uso de un ensayo de proliferacion comoCellTiter Blue,u otros ensayos metabolicos para determinar la densidad de celulas endoteliales presentes en la matriz, que puede ser extrapolada a valores conocidos de tejido nativo, donde el objetivo es tener una densidad de celulas endoteliales >50% de un tejido nativo.

La medicion de la reendotelizacion puede realizarse utilizando tests y ensayos estandar de hemocompatibilidad, incluyendo pero sin limitacion, activacion plaquetaria, ruptura oxidativa, hemolisis, fibrinolisis, formacion de fibrina, generacion de trombina, activacion de contacto y activacion del complemento. Los metodos no destructivos incluyen el uso de un ensayo de proliferacion como CellTiter Blue u otros ensayos metabolicos para determinar la densidad de celulas endoteliales presentes en la matriz, que puede ser extrapolado a valores conocidos de tejido nativo, donde el objetivo es tener una densidad de celulas endoteliales >50% de un tejido nativo.

Las presiones de perfusion para la introduccion de celulas endoteliales corresponden generalmente a las presiones de perfusion nativa de los tejidos u organos de los que se ha derivado la matriz o el andamio, en un rango de +/- 300%, ya que la vasculatura es capaz de resistir presiones >300 mm Hg.

Una matriz tisular u organica reendotelizada como se describe aqm puede ser trasplantadaa un receptor. Esa matriz tisular u organica reendotelizada presenta muy poca trombogenesis y muy poca inmunogenicidad. Esa matriz tisular u organica reendotelizada, una vez trasplantada, puede seguir siendo recelularizada in vivo. Tras el trasplante, esa matriz tisular u organica reendotelizada puede ser recelularizada in vivo (es decir, con celulas nativas del receptor). La recelularizacion in vivo puede incluir mas reendotelizacion y/o recelularizacion con celulas distintas de celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales (ej., celulas espedficas de tejido u organo, tales como hepatocitos, celulas epiteliales de conducto biliar, celulas madre, celulas progenitoras, celulas iPS, celulas mononucleares de medula osea, celulas de musculo liso, cardiomiocitos, fibroblastos cardiacos, fibroblastos, celulas kuffner, celulas de musculo esqueletico, celulas satelite,celulas parietales glomerulares renales, podocitos glomerulares renales, celulas de borde en cepillo tubulares proximales renales, celulas de segmento fino de asa de Henle, celulas de tubulo distal renal, celulas de conducto colector renal, neumocitos tipo I (recubriendo el espacio de airede la celula pulmonar), celulas de conducto pancreatico (celulas centroacinares), celulas beta, celulas islote, cell,celulas intercaladas, celulas de borde de cepillo intestinales (con microvellosidades), celulas de conducto estriado de glandula exocrina, celulas epiteliales de vesfcula biliar, celulas principales epididimarias celulas renales intersticiales y/o celulas basales epididimarias).

Opcionalmente, una matriz tisular u organica puede ser recelularizada in vitro con celulas distintas a las endoteliales o progenitoras endotelialesantes de que la matriz tisular u organica sea reendotelizada, o despues de que la matriz tisular u organica sea reendotelizada. Como se utiliza aqd, las celulas "distintas a las endoteliales, endoteliales derivadas o celulas progenitoras endoteliales”se refiere a todos los otros tipos de celulas que pueblan un tejido u organo concretos. En los metodos que se describen aqd, se pueden utilizar celulas madre, o celulas progenitoras (ej., celulas madre embrionicas (ESC), celulas madre adultas, o madre pluripotentes inducidas (iPS)) para recelularizar el parenquima de un tejido u organo, o se puedenusar celulas espedficas de tejido u organo (es decir, celulas diferenciadas o parcialmente diferenciadas) para recelularizar el parenquima de un tejido u organo. Con celulas espedficas de tejido u organo, el tipo concreto de celulas suministradas depende tfpicamente del tipo de tejido u organo que se produce en ultima instancia Por ejemplo, al recelularizar un corazon se pueden introducir en o sobre la matriz tisular u organica cardiocitos, celulas de musculo liso, fibroblastos cardiacos y/o celulas madre cardiacas; al recelularizar un hfgado se pueden introducir en o sobre la matriz tisular u organica hepatocitos, celulas de conducto biliar, celulas de musculo liso, fibroblastos y/o celulas progenitoras de hepatocitos; al recelularizar un rinon, se pueden introducir en o sobre la matriz tisular u organica podocitos, celulas glomerulares y/o celulas epiteliales; al recelularizar un pulmon se pueden introducir en o sobre la matriz tisular u organica celulas epiteliales, celulas claras, celulas caliciformes celulasalveolares tipo I y/o celulas alveolares tipo II; al recelularizar un pancreas, se pueden introducir en o sobre la matriz tisular u organica celulas beta y/o celulas islote.

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Al igual que con las celulas endoteliales o las celulas progenitoras endoteliales, se pueden suministrar celulas distintas a las endoteliales o progenitoras endoteliales a una matriz tisular u organica en una composicion fisiologica (ej., con tampones, nutrientes, enzimas, medio de crecimiento o diferenciacion), y pueden ser suministradas o introducidas utilizando diversas vfas (ej., inyeccion (ej., en multiples localizaciones), perfusion, infusion y/o aplicacion topica).

En realizaciones en las que se introducen celulas distintas de la endoteliales o progenitoras endoteliales tras la reendotelizacion de la matriz tisular u organica, puede ser beneficioso conceder a las celulas endoteliales o las celulas progenitoras endoteliales algun tiempo para adherirse y establecerse dentro de la vasculatura de la matriz tisular u organica, antes de suministrar otras celulas. Tiempo suficiente para que las celulas endoteliales o las celulas progenitoras endoteliales se adhieran a la matriz tisular u organica es, por ejemplo, de 30 a 180 minutos. No obstante, se puede permitir a las celulas endoteliales o las celulas progenitoras endoteliales adherirse y establecerse en la matriz tisular u organica durante, por ejemplo, hasta 28-30 dfas (ej., aproximadamente 1 mes).

En una realizacion, un injerto o lobulo hepatico descelularizado es reendotelizado con celulas endoteliales sinusoidales arteriales, venosas y/o hepaticas para crear un injerto hepatico trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro hepatico de sangre nativa. El injerto hepatico es recelularizado naturalmente in vivo mediante la migracion de celulas del hngado adyacente.

En otra realizacion, un injerto o lobulo hepatico descelularizado es reendotelizado con celulas endotelialesarteriales, venosas y/o sinusoidales hepaticas, para crear un injerto hepatico trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro hepatico de sangre nativa. Tras el trasplante, otras celulas son perfundidas vfa la vasculatura del paciente, o inyectadas en el intersticio del injerto hepatico, como hepatocitos (autologas, alogenicas, celulas madre derivadas o iPs derivadas).

En otra realizacion, un injerto o lobulo hepatico descelularizado se reendoteliza primero y despues se le inyectan hepatocitos para crear un injerto hepatico trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro hepatico de sangre nativa.

En otra realizacion, un injerto o parche cardiaco descelularizado es reendotelizado para crear un injerto cardiaco trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro cardiaco de sangre nativa. El injerto es anastomosado y colocado sobre una region isquemica del corazon.

En otra realizacion, un injerto o parche cardiaco descelularizado es reendotelizado para crear un injerto cardiaco trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro cardiaco de sangre nativa. Tras el trasplante, otras celulas son perfundidas vfa la vasculatura del paciente, o inyectadas en el intersticio del injerto cardiaco, como cardiomiocitos (autologas, alogenicas, celulas madre derivadas o iPS derivadas).

En otra realizacion, un injerto o parche cardiaco descelularizado es reendotelizado para crear un injerto cardiaco trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro cardiaco de sangre nativa. El tejido isquemico del corazon es eliminado y el injerto reendotelizado es anastomosado e implantado quirurgicamente.

En otra realizacion, un injerto o parche cardiaco descelularizado se reendoteliza primero y luego se le inyectan cardiomiocitos para crear un injerto cardiaco trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro cardiaco de sangre nativa. El tejido isquemico del corazon es eliminado y el injerto contractil es anastomosado e implantado quirurgicamente.

En una realizacion, un injerto o lobulo pulmonar descelularizado es reendotelizado con celulas endoteliales para crear un injerto pulmonar trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado en el suministro hepatico de sangre nativo. El injerto pulmonar es recelularizado naturalmente in vivo mediante la migracion de celulas desde el tejido pulmonar adyacente.

En otra realizacion, un injerto o lobulo pulmonar descelularizado es reendotelizado con celulas endoteliales arteriales, venosas y/o sinusoidales hepaticas, para crear un injerto pulmonar trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro hepatico de sangre nativa. Tras el trasplante, otras celulas son perfundidas vfa la vasculatura del paciente, o inyectadas en el intersticio del injerto en el injerto pulmonar, como son celulas epiteliales pulmonares (autologas, alogenicas, celulas madre derivadas o iPS derivadas).

En una realizacion, un injerto o lobulo renal descelularizado es reendotelizado con celulas endoteliales para crear un injerto renal trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro hepaticode sangre nativa. El injerto pulmonar es recelularizado naturalmente in vivo mediante la migracion de celulas del rinon adyacente.

En otra realizacion, un injerto o lobulo renal descelularizado es reendotelizado con celulas endoteliales, para crear un injerto hepatico trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro renal de sangre nativa. Tras el trasplante, otras celulas son perfundidas vfa la vasculatura de los pacientes, o inyectadas en el intersticio del injerto en el injerto renal, como celulas tubulares renales (autologas, alogenicas, celulas madre derivadas o iPS derivadas).

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En una realizacion, un injerto o lobulo pancreatico descelularizado es reendotelizado con celulas endoteliales, para crear un injerto pancreatico trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro hepatico de sangre nativa. El injerto pulmonar es recelularizado naturalmente in vivo mediante la migracion de celulas desde el pancreas adyacente.

En otra realizacion, un injerto o lobulo pancreatico descelularizado es reendotelizado con celulas endoteliales, para crear un injerto hepatico trasplantable que pueda ser trasplantado y anastomosado al suministro pancreatico de sangre nativa. Tras el trasplante, otras celulas son perfundidas vfa la vasculatura del paciente, o inyectadas en el intersticio del injerto en el injerto pancreatico, como celulas beta (autologas, alogenicas, celulas madre derivadas o iPs derivadas).

En una realizacion, el material inicial es un lobulo hepatico descelularizado por perfusion En otra realizacion, el material inicial es parte de un lobulo hepatico descelularizado por perfusion. En otra realizacion, el material inicial es un injerto cardiaco descelularizado por perfusion, aislado del ventnculo izquierdo. En otra realizacion, el material inicial es un injerto cardiaco descelularizado por perfusion, aislado del ventnculo derecho. En otra realizacion, el material inicial es un injerto pulmonar descelularizado por perfusion aislado de un lobulo pulmonar. En otra realizacion, el material inicial es un lobulo pulmonar descelularizado por perfusion. En otra realizacion, el material inicial es un rinon descelularizado por perfusion. En otra realizacion, el material inicial es un injerto renal descelularizado por perfusion, aislado de una porcion del rinon. En otra realizacion, el material inicial es un pancreas descelularizado por perfusion.En otra realizacion, el material inicial es un injerto pancreatico descelularizado por perfusion aislado de una porcion del pancreas

Como se indica aquf, los metodos de recelularizacion que se describen, y que resultan en una extensa reendotelizacion de la matriz tisular u organica, producen una matriz tisular u organica que, al ser trasplantada a un receptor, presenta muy escasa trombogenicidad. Dicha matriz tisular u organica reendotelizada presenta tambien una muy baja inmunogenicidad, en base a la cantidad de inflamacion observada en el tejido u organo trasplantado y/o la respuesta inflamatoria del receptor tras el trasplante.

De acuerdo con la presente divulgacion, se pueden utilizar tecnicas convencionales de biologfa, microbiologfa y bioqmmica moleculares y de DNA recombinante conocidas por los expertos. Tales tecnicas son ampliamente expuestas en la literatura. La invencion se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de los metodos y composiciones de materia descritos en las reivindicaciones.

EJEMPLOS

Ejemplo 1—Animales

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con laUS Animal Welfare Act, y fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee de la Universidad de Minnesota. Las matrices cardiacas se derivaron de ratas Sprague Dawley (250- 319 g) o Fisher 344 (196-296 g). En estudios de trasplantes se usaron matrices de Fisher 344. Todas las ratas utilizadas en la generacion de andamios cardiacos fueron anestesiadas con 100 mg de etamina por kg de peso corporal (Phoenix Pharmaceutical) and 10 mg de xilacina por kg de peso corporal (Phoenix Pharmaceutical) seguido de heparinizacion sistemica.

Ejemplo 2—Descelularizacion de corazones cadavericos de rata

Corazones cadavericos de rata fueron descelularizados siguiendo metodos publicados previamente (Ott et al., 2008; Nature Med., 14(2):213-21). Resumiendo, las ratas fueron anestesiadas. A continuacion, se realizo una esternotoirna media, seguida de diseccion del pericardio y extraccion del cuerpo graso retroesternal, para dejar expuestos los vasos mediastmicos. Las tres primeras ramas de la aorta toracica ascendente y ambas venas cava superiores se ligaron y seccionaron. La vena cava inferior(IVC) y los vasos pulmonares (venas y arterias) fueron seccionados. El corazon aislado fue entonces extrafdo de la cavidad toracica, colocado en una placa petri conteniendo PBS, fue cateterizado y lavado con PBS. Entonces el corazon fue perfundido por gravedad con l% SDS seguido de lavados con agua desionizada, 1% Triton-X100 (Sigma), y PBS conteniendo antibiotico (100 U/ml penicilina, 100 U/ml estreptomicina; Gibco).

Ejemplo 3—Recelularizacion de andamios de corazon de rata

Se adquirieron celulas endoteliales aorticas de rata(RAECs) de Vec Technologies (Rensselaer, NY). En todos los experimentos fueron utilizadas RAECs entre los pasos 14 y 20. Las RAECs fueron cultivadas en frascos T185 recubiertos con gelatina en MCDB-131 completo (Vec Technologies), y pasadas utilizando TrypLE Express (Invitrogen). Para la recelularizacion vfa la aorta, se llevo a cabo perfusion aortica retrograda de suspensiones celulares en los andamios descelularizados; para las recelularizaciones vfa la arteria braquiocefalica (BA), a construcciones bajo perfusion continua de medio aortica retrograda se infundieron celulas en la BA.A las construccionesrecelularizadas vfa IVC se les coloco un cateter en la IVC, seguido de perfusion de RAECs. En todas las construcciones se infundieron celulas a 10 millones de celulas por ml.A menos que se especifique lo contrario, las construcciones fueron cultivadas con perfusion de mediocontinua vfa la aorta (MCDB-131 completo) durante siete dfas en una incubadora de cultivo tisular El deposito de medio fue inyectado de forma continua con carbogeno(5% CO2y 95% 02) mientras duro el experimento.

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Ejemplo 4—Marcaje celular

En un subgrupo de estudios, las RAECs fueron marcadas con Dil o DiO el dfa de la recelularizacion. Resumiendo, el medio fue eliminado de una placa confluente de RAECs, y sustituido por DPBS conteniendo 5 |jM SP-DilCi8 o SP-DiOCi8 (Invitrogen). Tras 5 minutos de incubacion a 37°C, las placas fueron transferidas a un frigonfico e incubadas durante 15 minutos a 4°C. Las placas fueron lavadas entonces una vez con PBS y se dejo que se recuperaran durante 2 horas a 37°C en medio de cultivo, antes de aislarlas y proceder a la siembra de las construcciones.Al final del experimento, las construccionesfueron extrafdas del biorreactor y visualizadasen un Stereo Discovery V20 Macro Stereo (Carl Zeiss Inc.), diseccionadas, colocadas en Slowfade (Invitrogen) y visualizadas en un microscopio 510 Meta Confocal (Carl Zeiss Inc.).

En otros estudios, las construcciones sembradas conRAECs fueron marcadas con Cell Tracker Green CMFDA (Invitrogen) el ultimo dfa del cultivo (Dfa 7), eliminando el medio de cultivo completo y circulando CMFDA conteniendo DMEM (Cellgro) sin suero durante 45 minutos a 37°C. El medio conteniendo CMFDA fue sustituido entonces por MCDB-131 completo, y las construccionesincubadas durante 45 minutos.Las construcciones marcadas con CMFDA fueron extrafdas entonces del biorreactor, diseccionadas colocadas en Slowfade (Invitrogen) y visualizadas en un microscopio 510 Meta Confocal (Carl Zeiss Inc.).

Ejemplo 5—Histologia y cuantificacion de nucleos celulares/vasos

El ultimo dfa del cultivo, las construccionesfueron extrafdas del biorreactor, seccionadas en cuatro vistas de eje corto distribuidas al azar desde la base al vertice, y luego incrustadas en parafina. Tras inclusion en parafina, seccionamiento y rehidratacion, fueron tenidas con hematoxilina y eosina o Verhoeff van Gieson, siguiendo protocolos estandar. Las platinas fueron visualizadas con un microscopio invertido Nikon Eclipse TE200 (Fryer Co. Inc.). Para la cuantificacion de nucleos, se montaron platinas no tenidas en Vectashield conteniendo dApI (Vectorlabs), y se tomaron al azar 5 imagenes de alta potencia por seccion. Entonces se cuantificaron los nucleos positivos DAPI y se normalizaron con el area tisular.Para la cuantificacion del diametro vascular se tomaron 5 imagenes de alta potencia distribuidas al azar de secciones tenidas con Verhoeff-van Gieson, y se procesaron como se ha descrito anteriormente. El diametro fue calculado midiendo el diametro de eje corto de vaso conteniendo celulas con software ImageJ (NIH). Toda la toma de imagenes fue realizada utilizando un microscopio invertido Nikon Eclipse TE200 (Fryer Co. Inc.).

Ejemplo 6—Tincion inmunofluorescente

Secciones de parafina fueron rehidratadas mediante cambios de xileno y alcoholes graduados.Las platinas fueron hervidas en 10 mM de tampon citrato con 0,05% Tween-20 a pH 6,0 durante 20 min. Se llevo a cabo el bloqueo con 3% BSA en PBS durante una hora.Anticuerpos primarios de PCNA, PECAM-1 (policlonal de conejo, Santa Cruz), vWF, eNOS, Calretinina, Vimentina (policlonal de conejo, Abeam), vWF (policlonal de cabra, Santa Cruz ), FLK-1(monoclonal de raton, BD Bioscience), CD34, CD45, CD1 lb (monoclonal de raton, Santa Cruz), alfaactina de musculo liso (monoclonal de raton, Sigma), y CD8 (monoclonal de conejo Abcam), fueron diluidos a 10 ng / ml en PBS, e incubados durante la noche a 4°C. Las platinas fueron lavadas con tres cambios de PBS con 0,05% Tween-20 entre pasos. Anticuerpos secundarios apropiados conjugados con FTC o Texas Red (Jackson Immunoresearch) fueron diluidos 1:250 e incubados durante una hora. Las platinas fueron montadas con medio de montaje conteniendo DAPI, y visualizadas en un microscopio fluorescente Nikon Eclipse TE200.

Ejemplo 7—Ensayo G6PDH

El medio fuero recogido diariamente del biorreactor y conservado a -20°C. El dfa del ensayo, las muestras fueron descongeladas y, siguiendo las instrucciones del fabricante, se cuantifico la actividad G6PDH utilizando el Vybrant Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen).

Ejemplo 8—TUNEL

Tras siete dfas de cultivo, las construcciones reendotelizadas fueron fijadas con formalina, cortadas en cuatro vistas de eje corto representativas, de la base al vertice, incrustadas en parafina y luego seccionadas. Se utilizo el sistema DeadEnd Colorimetric TUNEL (Promega) para tenir respecto al ADN mellado.Se siguieron las instrucciones del fabricante para muestras en parafina, con las siguientes modificaciones: despues de que las muestras fueran desparafinizadas y rehidratadas con una serie de etanol, fueron sometidas a microondas durante 2 min en una solucion tampon citrato de 10 mM (Trater et al., 1995, Histochem. Cell Biol, 103(2): 15760); y en lugar de utilizar peroxidasa de rabano conjugada a estreptavidina, las muestras fueron tratadas con una estreptavidina conjugada con DyLight 594 (Jackson ImmunoResearch). Las platinas fueron montadas con Vectashield conteniendo DAPI (Vectorlabs) y se visualizaron utilizando un microscopio invertido Nikon Eclipse TE200 (Fryer Co. Inc., Huntley, IL).

Ejemplo 9—Ensayo de trombomodulina in vitro

El ensayo de trombomodulina fue adaptado de trabajos publicados previamente (Calnek& Grinnell, 1998, Experimen. Cell Res., 238(l):294-8; Ibrahim &Ramamurthi, 2008, J. Tissue Eng. Regen. Med., 2(l):22-32). El ultimo dfa del cultivo (dfa siete), las construccionesfueron lavadas tres veces con DMEM/F12 (Invitrogen) sin

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rojo fenol, a una velocidad de flujo de 1 ml/min durante un total de 45 minutos. Cuatro mililitros de DMEM/F12 sin fenol rojo, conteniendo alfa trombina humana (0,1 NIH U/ml; Haematologic Technologies) y protema C humana (12 Mg/ml; Haematologic Technologies) fueron circulados entonces de forma continua por las construcciones cardiacas, vfa la aorta, durante 45 min a 1 ml/min. Por triplicado, 100 plde medio fueron transferidos a una placa de 96 pocillos, se mezclaron con 50 plde caldo de hirudina (12 ATU/ml; American Diagnostica) e incubados durante 5 min a 37°C. A cada pocillo que contema muestra se anadieron 50 uldel sustrato S-2366 (concentracion final 0,75 mM; Chromogenix) y se incubo a temperatura ambiente durante 5 min. Se midio la absorbancia a 410 nm y 490 nm, utilizando un Sprectra MAX 340 (Molecular Devices). La absorbancia relativa final fue calculada restando la absorbancia a 490 nm de 410 nm y luego se normalizo por controles de andamio acelular.

Ejemplo 10—Trasplante heterotopico

Las ratas receptoras, desnudas RNU (213-388 g) o Fisher 344 (278-351 g), fueron anestesiadas con pentobarbital sodico (60 mg/kg de peso corporal, inyeccion intraperitoneal). Se utilizo una incision en la lmea media de la pared abdominal para descubrir la aorta descendente y la vena cava inferior. Se realizo una anastomosis de extremo a lado de la aorta ascendente y la arteria pulmonar izquierda del corazon del donante a la aorta abdominal y la vena cava de la rata receptora, con sutura 9-0 segun Ono & Lindsey (Ono, 1969, J. Thome. Cardiovasc. Surg., 57(2):225-9). Las ratas fueron preheparinizadas antes del trasplante, y los trasplantes de desnudos de solo matriz recibieron terapia anticoagulante continua (heparina sodica a 100 u.i. por kg de peso corporal dos veces el dfa del trasplante, 200 u.i. por kg de peso corporal, subcutaneo durante los 2 dfassiguientes) y Coumadin (0,25 mg/kg de peso corporal/dfa) en el agua de beber.

Ejemplo 11—Perfusion y distribucion de celulas endoteliales aorticas de rata

Se exploraron tres metodos de recelularizacion para determinar la tecnica optima para el suministro de celulas endoteliales: (a) perfusion directa de las RAECs vfa la aorta, (b) perfusion de celulas a traves de la BA con flujo de medio por la aorta, o (c) un suministro combinado de celulas: primero vfa IVC, seguido de una segunda infusion vfa BA como se describe.Tras el suministro, las construcciones fueron cultivadas bajo perfusion aortica retrograda de medio durante una semana, antes de ser analizadas. Para comprobar la localizacion de las celulas y cuantificar la celularidad despues de siete dfas de cultivo, se fijaron las construcciones, se seccionaron en 4 vistas de eje corto distribuidas de la base al vertice, se incrustaron en parafina, se tineron y se cuantificaron los nucleos positivos DAPI (Figure 1A). En cada metodo de suministro, las celulas fueron retenidas dentro de la construccion y forraron el lumen de los vasos. No se observo una diferencia estadfsticamente significativa en el numero de celulas endoteliales en la matriz al suministrar 20 millones de celulas vfa la aorta o la BA (Figura 1A). No obstante, las celulas suministradas vfa la aorta no alcanzaron una distribucion uniforme por el corazon, sino que se localizaron en el vertice, mientras la base del corazon se mantema acelular. Se observo un incremento estadfsticamente significativo en la celularidad cuantificada al duplicar el numero de celulas sembradas. La mayor celularidad se observo con construcciones sembradas porIVC y BA, que resulto estadfsticamente significativo incluso comparado con una infusion por BA unica del mismo numero de celulas.

El marcaje de las RAECs con Dil y DiO antes de la recelularizacion confirmo la distribucion uniforme de las celulas por la matriz cardiaca en las construcciones que fueron sembradas con celulas suministradas vfa BA (Figura 1B-C) o IVC mas BA (Figura 1D-E). De forma similar, tras la perfusion de RAEC IVC,(DiO positivas) se pudieron observar celulas en el corazon desde el vertice a la base. El examen de las construcciones con siembra de celulas marcadas con DiOy Dil revelo que, en la pared del ventnculo, podfan observarse vasos recubiertos con celulas suministradas por una unica vfa (Figura2A y B) (es decir,celulas suministradas por BA o IVC), o conteniendo celulas suministradas por ambas vfas (Figura 2C). La superficie endocardica del ventnculo izquierdo estaba predominantemente recelularizada con celulas suministradas en la BA, mientras que la superficie endocardica del ventnculo derecho estaba recubierta con RAECs suministradas vfa IVC (Figura 2D y E).

La histologfa (tincion de hematoxilina y eosina y Verhoeff- von Gieson) de las construcciones cultivadas durante siete dfas muestra que los vasos de diversos diametros estaban recubiertos (Figura 3A-D), asf como tambien los vasos arteriales elastina positivos, y vasos elastina negativos (Figura 3B y D). Estos resultados indicaron que las RAECs no presentan una preferencia vascular observable durante la recelularizacion y el posterior cultivo in vitro. La cuantificacion del diametro vascular dentro de la pared medioventricular revelo que el suministro combinado de celulas vfa IVC y BA resultaba en un incremento estadfsticamente significativo en el numero de vasos pequenos (11 a 25 micrones de diametro),respecto al suministro de RAECs solo por BA (Figura 3E). Al examinar las secciones apicales no se observo esta dependencia de la vfa de suministro en la distribucion del diametro vascular.

Ejemplo 12—Supervivencia en cultivo de celulas endoteliales aorticas de rata

Para comprobar si la perfusion retrograda era suficiente o no para mantener el fenotipo de las RAECs y evitar la muerte celular en construcciones recelularizadas, se emplearon tres ensayos distintos: (a) marcaje celular CMFDA al final del cultivo in vitro, (b) tincion TUNEL, y (c) cuantificacion de la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) en el perfundido de la construccion durante un periodo de siete dfas. Las

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construcciones fueron recelularizadas vfa BA olVC solo, se cultivaron durante siete dfas como se describe, y luego se marcaron con CMFDA. CMFDA fue utilizado porque solamente puede marcar y ser escindido por celulas viables. Tanto las celulas suministradas vfa BA como las v^a IVC fueron capaces de escindir CMFDA (Figura 4A-C) el dfa siete.Se marcaron las celulas endocardicas que recubnan el ventnculo derecho (Figura 4C), indicando coronarias rudimentarias. El analisis TUNEL demostro que muy pocas RAECs, si ha^a alguna, eran apoptoticas el d^a siete (Figura 4D-I), con independencia de la localizacion celular (LV, RV o tabique). Se cuantifico la actividad G6PDH como indicador de la muerte celular continua. No se observo incremento en el G6PDH mientras duro el experimento, con independencia del metodo de suministro celular (Figura 4J). Estos resultados indican que la perfusion aortica es suficiente para mantener las RAECs en una construccion cardiaca recelularizada, con independencia de como fueron suministradas.

Ejemplo 13—Analisis fenotipico in vitro de construcciones reendotelizadas

Se examino el fenotipo y la funcion de las RAECspor tincion inmunofluorescente de las celulas en las construcciones el dfa siete post recelularizacion. Pudieron observarse celulas PCNA+en las construcciones, sugiriendo que continuaba la proliferacion (Figura 5A). Igualmente, pudieron observarse celulas eNOS+en el arbol vascular, lo que implica que las celulas se mantienen funcionales (Figura 5B). Finalmente, las RAECs expresaron el factor de Von Willebrand (Figura 5C), indicando el potencial de regulacion de la coagulacion. Para determinar si las construcciones reendotelizadas podfan o no inhibir la vfa de coagulacion se realizo un ensayo de trombomodulina in vitro sobre el perfundido circulante por la construccion. Para ello, el dfa siete se hizo circular por las construcciones recelularizadas o los andamios acelulares una solucion conteniendo trombina y protema C. Se observo un incremento estadfsticamente significativo de 6 a 8 veces de la actividad de la protema C mediada por la trombomodulina y la trombina (Figura 5D). La protema C es un regulador negativo de la cascada de la coagulacion; por tanto, estos resultados indican que las construcciones recelularizadas pueden potencialmente inhibir la cascada de la coagulacion, puesto que retienen la capacidad de activar la protema C. Las construcciones recelularizadas BA y BA masIVC se comportaron de forma similar, aunque se observo una tendencia a un mejor comportamiento de las construcciones suministradas con celulas por Ba mas IVC.

Ejemplo 14—Caracterizacion de explantes heterotopicos

Andamios acelulares y construcciones de RAECs reendotelizadas por BA fueron trasplantados heterotopicamente en el abdomen de ratas receptoras. Antes del trasplante, las construcciones reendotelizadas fueron cultivadas durante siete dfas, para permitir la adhesion y el crecimiento de las RAECs. El dfa siete tras el trasplante, las construcciones fueron explantadas y examinadas (Figura 6). Un coagulo formado en el extremo de la aorta fue reducido en las construcciones recelularizadas (Figura 6A y E). El examen de la pared del LV y del ventnculo mostro una mayor trombogenesis en los trasplantes de andamio acelular, comparado con las construcciones reendotelizadas (Figura6B y F). Se observo mas sangre suelta en el parenquima de los andamios acelulares (Figura 6C y G),mientras se observaban vasos patentes llenos de sangre en las construcciones reendotelizadas (Figura 6D e I). La caracterizacion de celulas reclutadas por tincion inmunofluorescente (Tabla 1) mostro que muy pocas (menos del 4%) eran positivas respecto a marcadores de macrofagos (CD1 lb) o linfocitos (CD8). Ademas, marcadores de musculo liso (SMA), mesotelio (calrentinina), progenitoras endoteliales (CD34), endoteliales (vWF) y fibroblastos (vimentina) fueron expresados solamente por un pequeno subconjunto de las celulas reclutadas (Tabla 1). La mayona de las celulas reclutadas expresaron los marcadores celulares PECAM+y VEGFR2+con independencia de que la construccion hubiera sido recelularizada o no (Figura 7). No obstante, los marcadores de celulas progenitoras, CD34 y celulas madre hematopoieticas (CD45), fueron expresados solamente por un pequeno subconjunto de las celulas reclutadas (Tabla 1).

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Tabla 1

Marcador

Celulas positivas por campo de alta potencia % de nucleos positivos DAPI

CD 11b

44,00 3,87

CD45

22,50 2,37

CD8

23,20 0,89

Calretinina

20,00 1,69

CD34

6,00 0,13

vWF

19,00 1,11

Vimentina

17,80 0,39

SMA

3,20 0,09

Debe entenderse que, aunque los metodos y composiciones de materia se han descrito aqm en conjuncion con varios aspectos distintos, la precedente descripcion de los diversos aspectos pretende ilustrar y no limitar el alcance de los metodos y composiciones de materia. Otros aspectos, ventajas y modificaciones quedan dentro del marco de las siguientes reivindicaciones.

Se divulgan metodos y composiciones que pueden ser utilizados para, ser usados conjuntamente con, ser usados en preparacion de, o son productos de los metodos y composiciones divulgados.Esos y otros materiales son divulgados aqm, y se entiende que se divulgan las combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos metodos y composiciones. Es decir, que aunque no se divulga explfcitamente referencia espedfica a cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estas composiciones y metodos, todas son contempladas y descritas espedficamente aqm. Por ejemplo, si se divulga y comenta una composicion de materia determinada, o un metodo espedfico, y son comentados diversos metodos y composiciones, se contemplan espedficamente todas y cada una de las combinaciones y permutaciones de las composiciones y los metodos, a menos que se indique espedficamente lo contrario. De modo similar, todo subconjunto o combinacion de los mismos es tambien espedficamente contemplado y divulgado.

Si bien en la especificacion precedente esta invencion se ha descrito en relacion con determinadas realizaciones preferidas de ella, y se han dado muchos detalles a efectos de ilustracion, resultara aparente para los tecnicos en la materia que la invencion es susceptible de realizaciones adicionales, y que algunos de los detalles descritos aqm pueden variarse considerablemente sin apartarse de los principios basicos de la invencion como vienen definidos por las reivindicaciones.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo ex vivo de recelularizar una matriz tisular u organica, comprendiendo los pasos de:

   a) Proporcionar una matriz descelularizada de un organo o tejido vascularizado de mairnfero, donde dicha matriz de dicho organo comprende una capsula de organo intacta, donde dicha matriz de dicho organo o tejido comprende un sistema vascular, donde cuando se introduce fluido por un punto de entrada de dicho sistema vascular de dicha matriz descelularizada, sale por una via diferente; y

   b) Reendotelizar la matriz tisular u organica por perfusion, en direcciones antegrada y retrograda, del sistema vascular descelularizado de la matriz tisular u organica, con una composicion comprendiendo una poblacion sustancialmente pura de celulas endoteliales o celulas progenitoras endoteliales.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde las celulas endoteliales son seleccionadas del grupo compuesto por celulas endoteliales de la sangre, celulas endoteliales de medula osea, celulas endoteliales circulantes, celulas endoteliales de aorta humana, celulas endoteliales microvasculares de cerebro humano, celulas endoteliales microvasculares dermicas humanas, celulas endoteliales microvasculares intestinales humanas, celulas endoteliales microvasculares pulmonares humanas, celulas endoteliales microvasculares humanas, celulas endoteliales sinusoidales hepaticas, celulas endoteliales de vena safena humana, celulas endoteliales de vena umbilical humana, celulas endoteliales linfaticas, celulas endoteliales de microvaso, celulas endoteliales microvasculares, celulas endoteliales de arteria pulmonar, celulas endoteliales de capilar retiniano, celulas endoteliales microvasculares retinianas, celulas endoteliales vasculares, celulas endoteliales de sangre de cordon umbilical, celulas endoteliales sinusoidales hepaticas, celulas endoteliales unidades formadoras de colonias (CFU-ECs), celulas angiogenicas circulantes (CACs), precursoras endoteliales circulantes (CEPs), celulas formadoras de colonias endoteliales (ECFC), ECFC de bajo potencial proliferativo (LPP-ECFC), EcFC altamente proliferativas (HPP-ECFC), y combinaciones de las mismas.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2,donde las celulas endoteliales o las celulas progenitoras endoteliales son celulas madre embrionicas (ESCs) o celulas madre pluripotentes inducidas (iPSCs), celulas endoteliales derivadas o celulas progenitoras endoteliales.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, donde la matriz tisular u organica se origina a partir de un organo seleccionado entre el grupo compuesto porcorazon, rinon, fngado, pulmon, pancreas, intestino, musculo, piel, mama, esofago, traquea u omento.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, donde la matriz tisular u organica y las celulas endoteliales o las precursoras endoteliales son xenogenicas.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, donde la matriz tisular u organica y las celulas endoteliales o las celulas precursoras endoteliales son alogenicas.
7. 7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas la introduccion de celulas distintas de las celulas endoteliales o progenitoras endoteliales en o sobre la matriz tisular u organica antes del paso b).
8. 8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende ademas la introduccion de celulas distintas de las celulas endoteliales oprogenitoras endoteliales en o sobre la matriz tisular u organica tras el paso b).
9. 9. El metodo de la reivindicacion 7 u 8, donde las celulas distintas de las endoteliales o progenitoras endoteliales son introducidas en la matriz tisular u organica via perfusion, inyeccion directa, aplicacion topica o combinaciones de lo anterior.
10. 10. El metodo de cualquier reivindicacion precedente, donde el paso de proporcionar una matriz descelularizada de un organo o tejido vascularizado de mai^ero comprende descelularizacion por perfusion del organo o tejido vascularizado.