JP2023171287A - 乾燥細胞シート及び乾燥細胞シートの作製方法 - Google Patents
乾燥細胞シート及び乾燥細胞シートの作製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023171287A JP2023171287A JP2023077772A JP2023077772A JP2023171287A JP 2023171287 A JP2023171287 A JP 2023171287A JP 2023077772 A JP2023077772 A JP 2023077772A JP 2023077772 A JP2023077772 A JP 2023077772A JP 2023171287 A JP2023171287 A JP 2023171287A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell sheet
- sheet
- cell
- dried
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 94
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 87
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 42
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 38
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 576
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 117
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 62
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 28
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 9
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000002271 resection Methods 0.000 claims description 6
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 claims description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 abstract description 30
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 48
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 47
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 46
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 46
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 43
- 101001025337 Homo sapiens High mobility group protein B1 Proteins 0.000 description 43
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 42
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 42
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 42
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 37
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 36
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 35
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 25
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 24
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 23
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 22
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 17
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 17
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 17
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 17
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 16
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 16
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 13
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 13
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 13
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 12
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 12
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 10
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 10
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 10
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 10
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 10
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 10
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 10
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 10
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 10
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 10
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 10
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 9
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 9
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 7
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 7
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 7
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 6
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 5
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 238000011814 C57BL/6N mouse Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 4
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 4
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 4
- 230000006711 vascular endothelial growth factor production Effects 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 3
- VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].COC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- 208000000575 Arteriosclerosis Obliterans Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 2
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 2
- 208000027932 Collagen disease Diseases 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 206010016717 Fistula Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 231100000416 LDH assay Toxicity 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AMFGWXWBFGVCKG-UHFFFAOYSA-N Panavia opaque Chemical compound C1=CC(OCC(O)COC(=O)C(=C)C)=CC=C1C(C)(C)C1=CC=C(OCC(O)COC(=O)C(C)=C)C=C1 AMFGWXWBFGVCKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 2
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 2
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000295 expanded polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 230000003890 fistula Effects 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 238000002843 lactate dehydrogenase assay Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 2
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 2
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 208000005422 Foreign-Body reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002177 Icodextrin Polymers 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 206010048858 Ischaemic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 description 1
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 101001052030 Mus musculus Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043540 Thromboangiitis obliterans Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 210000005022 abdominal esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000004618 arterial endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003459 common hepatic duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 102000043827 human Smooth muscle Human genes 0.000 description 1
- 108700038605 human Smooth muscle Proteins 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940016836 icodextrin Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003780 keratinization Effects 0.000 description 1
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033667 organ regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920013716 polyethylene resin Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012779 reinforcing material Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229920002050 silicone resin Polymers 0.000 description 1
- 210000004683 skeletal myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 1
- 201000002282 venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 230000010388 wound contraction Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】本発明の課題は、細胞シート、特に同種異系（他家）細胞を用いた細胞シートの移植治療の利便性を向上させるため、再生医療に応用可能、かつ長期保存が可能である細胞シート及びその作製方法を提供することにある。さらに、創傷若しくは手術部位の組織を被覆若しくは補強するために使用できる細胞シート及びその作製方法を提供することにある。【解決手段】生体から採取されたＦＧＦ－２発現細胞を培養基材上で培養して細胞シートを得る工程（ａ）；及び前記工程（ａ）で得られた細胞シートを構成する細胞の増殖能が失われるまで前記細胞シートを乾燥処理する工程（ｂ）；によって作製された乾燥細胞シートを作製する。【選択図】図９Ｄ
Description
本発明は乾燥細胞シート及び乾燥細胞シートの作製方法に関する。
近年、移植細胞の組織生着性を向上させる方法として“細胞シート技術”が開発され、虚血性心筋症、肺術後気漏、内視鏡的食道粘膜下層剥離術後の狭窄などの様々な疾患や術後合併症予防に対する細胞シート移植治療の研究が実施されている。この技術は難治性皮膚潰瘍にも応用できると考えられる。難治性皮膚潰瘍の原因には、静脈不全、閉塞性動脈硬化症、血管炎などの血流障害、褥瘡、糖尿病、膠原病、外傷などがある。本発明者らはこれまでの研究において、末梢血単核球と線維芽細胞を共培養することで機能性を高めた混合細胞シートを開示した(特許文献１、非特許文献１、２参照)。細胞シートの治療効果のメカニズムの一つは、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor：VEGF）や肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor：HGF）などの生理活性物質の産生によるパラクライン効果である。上記混合細胞シートはマウスとウサギの皮膚潰瘍モデルにおいて治療効果を認めた。また、本発明者らは、積層線維芽細胞シートの簡便な製造方法を開発し、マウス皮膚潰瘍モデルにおける自家積層混合細胞シートの有用性を開示した（特許文献２、非特許文献３参照）。
細胞シートの作製においては自家細胞を用いることもあるが、自家細胞を用いることによる組織採取の侵襲性、細胞培養に要する使用までのタイムラグ、そして高額な費用という課題が残った。さらに、「難治性皮膚潰瘍に対する培養ヒト自己細胞混合シートを用いた移植治療に関する臨床試験（第Ｉ相試験）」(UMIN-CTR: UMIN000031645)を実施し、患者毎にヒト口腔内組織由来線維芽細胞の増殖能やＶＥＧＦの分泌能に差がみられたため、細胞シート移植に至らない症例も6例中3例と高率に経験した（非特許文献４参照)。上記の問題を改善するためには、同種異系（他家）細胞を用いた細胞シートを開発する必要がある。マウス皮膚潰瘍モデルにおいて、他家マウスから作製した線維芽細胞単独の細胞シートの治療効果を検証し、他家細胞シートの創傷治療効果は自家細胞と遜色なく、多少の局所免疫は生じたが、創傷治癒の効果に不利な影響を与えるほどではなかった（非特許文献５参照）。他家細胞シートの治療効果は確認できており、次は細胞シート移植療法の迅速な安定供給のために、レディメイドな細胞シートの保存法の開発が求められていた。
そこで、細胞シートの保存において、細胞シートを凍結させる技術の研究が進んでいる。凍結保存法は、高い細胞生存率を確保できる有用な保存法である。しかし、凍結保存法では超低温の冷凍庫での保管が必要であり、さらには凍結及び融解（解凍）操作による細胞損傷が避けられない。また凍結及び保存にかかるコスト、設備、輸送の問題もある。
また、細胞シート移植療法では、凍結融解操作による脱細胞化を生じさせ、細胞外マトリックスのみを保持した細胞外マトリックスシートについての研究も行われている（非特許文献６参照）。細胞外マトリックスシートは細胞シートを移植する際の細胞の足場としての効果を持つことが知られている（非特許文献６、７参照）。細胞外マトリックスシートは保存可能であり、脱細胞化により移植時の免疫拒絶反応を誘発しにくいという利点がある。しかし、細胞外マトリックスシートは、凍結融解によって引き起こされる細胞の損傷のため、生理活性物質をほとんど保持していない。
さらに、不活化したフィーダー細胞と共に皮膚由来の表皮角化細胞（ケラチノサイト）をシート状に培養した表皮細胞シート（培養表皮）を、送風乾燥、加温乾燥、自然乾燥及び化学乾燥のうちの１以上で前記細胞が死滅するまで乾燥させる工程を含む、移植材料の製造方法が開示されている（特許文献３、非特許文献８参照）。しかしながら、上記培養表皮として、同種異系（他家）の皮膚由来の表皮角化細胞をシート状に培養した培養表皮を皮膚の創部に貼付けた場合には、創部の上皮化に伴いその培養表皮は体表から脱落してしまうことが知られていた。
Ueno, K. et al. Sci Rep. 6, 28538 (2016).
Takeuchi, Y. et al. Am J Transl Res. 9, 2340-2351 (2017).
Mizoguchi, T. et al. Cell Physiol Biochem. 47, 201-211 (2018).
Mizoguchi, T. et al. Am. J. Transl. Res. 13, 9495-9504 (2021).
Nagase, T. et al. Am J Transl Res. 12, 2652-2663 (2020).
Xing, Q. et al. Tissue Eng Part C Methods. 21, 77-87 (2015).
Hodde, J. et al. J Mater Sci Mater Med. 18, 537-543 (2007).
Sakamoto, M et al. Sci Rep. 12, 3184 (2022).
本発明の課題は、細胞シート、特に同種異系（他家）細胞を用いた細胞シートの移植治療の利便性を向上させるため、再生医療に応用可能、かつ長期保存が可能である細胞シート及びその作製方法を提供することにある。さらに、創傷若しくは手術部位の組織を被覆若しくは補強するために使用できる細胞シート及びその作製方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、細胞の乾燥保存法に注目した。線維芽細胞又は間葉系幹細胞由来の細胞シートを乾燥させた場合に、得られた乾燥細胞シートを溶液に浸漬させると血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）や肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）だけでなく、線維芽細胞増殖因子－２（ＦＧＦ－２）や高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）も溶液へ溶出することを見出した。さらに、得られた乾燥細胞シートを皮膚の創部に貼付けた場合に、創部の上皮化の際、乾燥細胞シートを覆って再生上皮が形成され、乾燥細胞シートは脱落せずに表皮の下側に残り、その後分解、吸収されることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕生体から採取されたＦＧＦ－２発現細胞を培養基材上で培養して細胞シートを得る工程（ａ）；及び
前記工程（ａ）で得られた細胞シートを構成する細胞の増殖能が失われるまで前記細胞シートを乾燥処理する工程（ｂ）；
によって作製された乾燥細胞シートであって、
前記工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液における総タンパク質１μｇあたりのＦＧＦ－２の量が、５ｐｇ/μｇ以上であることを特徴とする、前記乾燥細胞シート。
〔２〕工程（ａ）で培養する細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１又は２種以上の細胞であることを特徴とする、上記〔１〕に記載の乾燥細胞シート。
〔３〕工程（ａ）で培養する細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１種のみの細胞であることを特徴とする、上記〔１〕に記載の乾燥細胞シート。
〔４〕乾燥処理後の厚さが１５μｍ以上の積層化乾燥細胞シートであることを特徴とする、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の乾燥細胞シート。
〔５〕工程（ａ）において、培養基材上で培養して得られた細胞シートを、前記培養基材から剥離した後に、細胞の増殖能が失われるまで乾燥させることを特徴とする、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の乾燥細胞シート。
〔６〕創傷の被覆若しくは手術部位の組織の補強に使用される、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の乾燥細胞シート。
〔７〕生体内の創傷の被覆若しくは生体内の手術部位の組織の補強に使用される、上記〔６〕に記載の乾燥細胞シート。
〔８〕生体内の手術によって生じた肺切除時の気管支断端、消化管吻合時の吻合部、肝若しくは膵切離時の断端の補強に使用される、上記〔７〕に記載の乾燥細胞シート。
〔９〕生体から採取されたＦＧＦ－２発現細胞を培養基材上で培養して細胞シートを得る工程（ａ）；及び
前記工程（ａ）で得られた細胞シートを構成する細胞の増殖能が失われるまで前記細胞シートを乾燥処理する工程（ｂ）；
を備えた乾燥細胞シートの作製方法であって、
前記工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液における総タンパク質１μｇあたりのＦＧＦ－２の量が、５ｐｇ/μｇ以上であることを特徴とする、前記方法。
〔１０〕工程（ａ）で培養する細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１又は２種以上の細胞であることを特徴とする、上記〔９〕に記載の乾燥細胞シートの作製方法。
〔１〕生体から採取されたＦＧＦ－２発現細胞を培養基材上で培養して細胞シートを得る工程（ａ）；及び
前記工程（ａ）で得られた細胞シートを構成する細胞の増殖能が失われるまで前記細胞シートを乾燥処理する工程（ｂ）；
によって作製された乾燥細胞シートであって、
前記工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液における総タンパク質１μｇあたりのＦＧＦ－２の量が、５ｐｇ/μｇ以上であることを特徴とする、前記乾燥細胞シート。
〔２〕工程（ａ）で培養する細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１又は２種以上の細胞であることを特徴とする、上記〔１〕に記載の乾燥細胞シート。
〔３〕工程（ａ）で培養する細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１種のみの細胞であることを特徴とする、上記〔１〕に記載の乾燥細胞シート。
〔４〕乾燥処理後の厚さが１５μｍ以上の積層化乾燥細胞シートであることを特徴とする、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の乾燥細胞シート。
〔５〕工程（ａ）において、培養基材上で培養して得られた細胞シートを、前記培養基材から剥離した後に、細胞の増殖能が失われるまで乾燥させることを特徴とする、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の乾燥細胞シート。
〔６〕創傷の被覆若しくは手術部位の組織の補強に使用される、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の乾燥細胞シート。
〔７〕生体内の創傷の被覆若しくは生体内の手術部位の組織の補強に使用される、上記〔６〕に記載の乾燥細胞シート。
〔８〕生体内の手術によって生じた肺切除時の気管支断端、消化管吻合時の吻合部、肝若しくは膵切離時の断端の補強に使用される、上記〔７〕に記載の乾燥細胞シート。
〔９〕生体から採取されたＦＧＦ－２発現細胞を培養基材上で培養して細胞シートを得る工程（ａ）；及び
前記工程（ａ）で得られた細胞シートを構成する細胞の増殖能が失われるまで前記細胞シートを乾燥処理する工程（ｂ）；
を備えた乾燥細胞シートの作製方法であって、
前記工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液における総タンパク質１μｇあたりのＦＧＦ－２の量が、５ｐｇ/μｇ以上であることを特徴とする、前記方法。
〔１０〕工程（ａ）で培養する細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１又は２種以上の細胞であることを特徴とする、上記〔９〕に記載の乾燥細胞シートの作製方法。
本発明の乾燥細胞シートは、長期保存及び安定供給が可能となる。また、当該乾燥細胞シートは、ＦＧＦ－２やＨＭＧＢ１などが溶出しやすく、高い創傷治癒効果を有する。さらに、本発明の乾燥細胞シートは、創傷若しくは手術部位の組織を被覆若しくは補強することができる。
（細胞及び細胞シート）
本発明において、「細胞シート」とは、細胞同士がシート状に結合した細胞の培養物を意味し、「積層化細胞シート」とは、平均２以上の細胞、好ましくは平均３以上の細胞、より好ましくは平均４以上の細胞からなる縦層が観察される細胞シートを意味する。なお、上記「細胞同士がシート状に結合」とは、細胞同士が直接又は細胞由来の細胞外マトリックスを介してシート状に結合している状態や、細胞同士の全部又は一部がハイドロゲル粒子等の人工的な細胞培養支持体を介して結合している状態を挙げることができる。
本発明において、「細胞シート」とは、細胞同士がシート状に結合した細胞の培養物を意味し、「積層化細胞シート」とは、平均２以上の細胞、好ましくは平均３以上の細胞、より好ましくは平均４以上の細胞からなる縦層が観察される細胞シートを意味する。なお、上記「細胞同士がシート状に結合」とは、細胞同士が直接又は細胞由来の細胞外マトリックスを介してシート状に結合している状態や、細胞同士の全部又は一部がハイドロゲル粒子等の人工的な細胞培養支持体を介して結合している状態を挙げることができる。
工程（ａ）で培養する細胞としては、ＦＧＦ－２発現細胞、すなわちＦＧＦ－２を発現する細胞であれば特に制限されないが、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、臍帯静脈内皮細胞、動脈内皮細胞等の血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１又は２種以上の細胞を挙げることができ、ＦＧＦ－２の発現量の観点からは線維芽細胞、間葉系幹細胞又は、多能性幹細胞を好適に挙げることができる。上記細胞の由来としては、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、サルを挙げることができ、ヒト由来の細胞であることが好ましい。ここで、ＦＧＦ－２発現細胞としては、たとえば、次の方法で細胞内のＦＧＦ－２の含有量を測定し、所定量のＦＧＦ－２を含有する細胞であることが好ましい。まず、５×１０５細胞を０．２ｍＬのＤＭＥＭに懸濁し、凍結融解を２回繰り返して細胞膜を破壊し、細胞内容物を溶出させる。遠心分離後に上清を回収し、上清中のＦＧＦ－２の含有量をＥＬＩＳＡ法によって測定する。上清中のＦＧＦ－２含有量が２０００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは４０００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１００００ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１８０００ｐｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは２００００ｐｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。また、工程（ａ）で培養する細胞としては、ＦＧＦ－２発現量が低い表皮角化細胞（ケラチノサイト）以外であることが好ましい。
工程（ａ）で培養する細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、臍帯静脈内皮細胞、動脈内皮細胞等の血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１腫のみの細胞とすることもできる。ここで、「１種のみの細胞」とは、乾燥細胞シートを構成する細胞が、実質的に所定の１種類の細胞のみであることを意味する。したがって、工程（ａ）で培養する細胞が、所定の１種類の細胞のみであってもよいが、所定の１種類の細胞と共に、他の細胞をわずかに用いてもよく、具体的には所定の１種類の細胞に対して播種する細胞数で３０分の１以下、１００分の１以下、５００分の１以下、又は１０００分の１以下の他の細胞を含んでいてもよい。この場合、所定の１種類の細胞としては線維芽細胞又は間葉系幹細胞であることが好ましい。
なお、乾燥細胞シートを表皮に貼付けた場合の創傷部位において新生される表皮角化細胞には細胞外マトリックス等の適切な足場が必要であるため、表皮角化細胞の上には新生した表皮が作られにくいと考えられる。この観点からも、工程（ａ）で培養する細胞としては、表皮角化細胞を含まないことが好ましい。
上記「線維芽細胞」とは、結合組織を構成する当該組織固有の細胞である。この線維芽細胞は、正常組織においては特に顕著な機能を有しないが、損傷が加わると損傷部に遊走し、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等を分泌することで、細胞外マトリックスの産生を開始し、細胞外マトリックスを更新する機能を有する。このほか、創の収縮を誘起する等、創傷治癒過程の中で重要な働きを果たしている。線維芽細胞の単離法については、例えば、本明細書の後述する実施例欄に記載の方法や上記特許文献１に記載の方法を挙げることができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において線維芽細胞画分として通常調製される条件により取得した細胞群であればよい。
線維芽細胞としては、口腔内組織、皮膚、歯肉、肺、心臓、大動脈外膜、子宮、絨毛胎盤組織、肝、肝管、胆嚢、前立腺、膀胱などの結合組織由来の線維芽細胞を挙げることができる。
上記「間葉系幹細胞」とは、間葉系組織に属する細胞に分化する能力を有する幹細胞である。具体的には、脂肪組織由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞（歯髄幹細胞）などを挙げることができる。
上記「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞である。
上記「筋芽細胞」とは、後に筋線維になる原始筋細胞である。また、上記「多能性幹細胞」としては、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、核移植胚性幹細胞、胚性腫瘍細胞、又は胚性生殖細胞を挙げることができる。
上記「末梢血単核球」とは、末梢血管より採取される血液中に含まれるリンパ球及び単球等からなる白血球の総称名である。
工程（ａ）において、２以上の異なる種類の細胞を培養して細胞シートを作製する場合には、各細胞を一緒に培養して作製する方法の他、１種類の細胞シートを作製して、その上に他の細胞を播種して培養して作製する方法も挙げることができる。
また、工程（ａ）で培養する細胞は、いかなる動物個体から取得してもよい。また、治療を施す対象である、治療対象の疾患を患う患者又は個体から取得してもよく、治療対象の疾患を患う患者又は個体以外から取得してもよい。
上記工程（ａ）において、培養基材上へ細胞を培養する際の細胞の播種密度については、１．０×１０５～２．５×１０６個／ｃｍ２であればよく、好ましくは、１．５×１０５～１．０×１０6個／ｃｍ２、より好ましくは、２．０×１０５～８．０×１０５個／ｃｍ２である。上記播種密度が１．０×１０５未満であれば細胞シートが薄く、細胞シートを乾燥させた場合に強度が弱くなる。一方、上記播種密度が２．５×１０6個／ｃｍ２より高いとを細胞シートの作製に培地交換が必要となるなど、手間がかかる。
上記工程（ａ）において、培養基材上へ細胞を培養する際の細胞の播種については、上記播種密度の細胞を一度に播種しても、複数回に分けて播種してもよい。複数回に分けて播種する場合における、１回当たりの播種する細胞数は目的とする播種密度に応じて適宜調整可能である。また、複数回に分けて播種する場合における、播種する間隔は２０時間以上をあけることが好ましく、２４時間～４８時間間隔をあけて播種してもよい。
なお、上記工程（ａ）において、細胞を培養基材上で培養する際にはフィーダー細胞、特に不活化フィーダー細胞を含まないことが好ましい。フィーダー細胞を含むと、得られた細胞シートに表面、裏面が生じて細胞シートの貼付けの際に手間がかかるほか、フィーダー細胞層と培養した細胞の層との層間剥離が生じることがある。なお、フィーダー細胞は、増殖や分化を生じさせる目的の細胞に必要な環境を整えるために補助的に用いられる細胞である。また、不活化フィーダー細胞は、予め細胞増殖しないように処理されたフィーダー細胞である。
上記乾燥細胞シートは、積層化乾燥細胞シートであることが望ましい。前記積層化乾燥細胞シートの厚さとしては、工程（ｂ）で乾燥処理後の厚さとして、１５μｍ以上、２０μｍ以上、３０～１００μｍ、４０～８０μｍ、又は５０～７０μｍであってもよい。また上記乾燥細胞シートの積層数、すなわち乾燥細胞シートの縦層を構成する細胞数としては、４層以上、好ましくは４～１０層、より好ましくは５～７層を挙げることができる。
（細胞の培養）
上記工程（ａ）の細胞の培養時間としては、所望の細胞シートが形成されるために必要な時間であれば特に限定されるものではないが、状態の良好な細胞シートを製造する為には、細胞播種時にほぼコンフルエントな状態であることが好ましい。例えば、０．５～１２日、好ましくは、１～７日、より好ましくは、２～５日、さらに好ましくは３～５日である。
上記工程（ａ）の細胞の培養時間としては、所望の細胞シートが形成されるために必要な時間であれば特に限定されるものではないが、状態の良好な細胞シートを製造する為には、細胞播種時にほぼコンフルエントな状態であることが好ましい。例えば、０．５～１２日、好ましくは、１～７日、より好ましくは、２～５日、さらに好ましくは３～５日である。
上記工程（ａ）の細胞の培養温度としては、細胞シートの形成が可能であれば、いかなる方法を用いてもよく、培養する細胞に適した、当該技術分野において通常実施される条件等で行うことができる。例えば、３０～４０℃、好ましくは３６～３８℃である。
上記工程（ａ）の培養のＣＯ２濃度としては、細胞シートの形成が可能であれば、いかなる方法を用いてもよく、培養する細胞に適した、当該技術分野において通常実施される条件等で行うことができる。例えば、０～１０％、好ましくは４～６％である。
上記工程（ａ）の培養の酸素（Ｏ２）濃度の条件としては、細胞シートの形成が可能であれば、いかなる濃度を用いてもよく、培養するに適した、当該技術分野において通常実施される条件等で行うことができる。例えば、大気酸素濃度（通常(normal)酸素濃度：およそ２０％）である。なお、大気酸素濃度で培養後、低酸素（hypoxia）濃度（２％）で培養してもよく、かかる低酸素濃度による培養によりＶＥＧＦ等の成長因子の分泌量を増加させることが可能となる。
（培養基材）
本明細書における「培養基材」とは細胞がその表面上で細胞シートを作製可能なものであればいかなるものであってもよい。具体的には、細胞が接着し得るような平坦な部分を具備し、典型的には、マルチウエルプレート、デッシュ、ペトリデッシュ、マルチデッシュ、フラスコ、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルを挙げることができる。市販される２４－ウェルプレートなどの培養用マルチウエルプレートなどが使用可能である。培養基材の材料としては特に制限されないが、培養中に意図せずに作製した細胞シートが培養基材から剥離しないもの、すなわち酵素処理などの剥離処理を行うまでは細胞シートが培養基材から剥離しないものであることが好ましい。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート等のプラスチック、ガラス、シリコン樹脂、アクリル樹脂等の樹脂を挙げることができる。
本明細書における「培養基材」とは細胞がその表面上で細胞シートを作製可能なものであればいかなるものであってもよい。具体的には、細胞が接着し得るような平坦な部分を具備し、典型的には、マルチウエルプレート、デッシュ、ペトリデッシュ、マルチデッシュ、フラスコ、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルを挙げることができる。市販される２４－ウェルプレートなどの培養用マルチウエルプレートなどが使用可能である。培養基材の材料としては特に制限されないが、培養中に意図せずに作製した細胞シートが培養基材から剥離しないもの、すなわち酵素処理などの剥離処理を行うまでは細胞シートが培養基材から剥離しないものであることが好ましい。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート等のプラスチック、ガラス、シリコン樹脂、アクリル樹脂等の樹脂を挙げることができる。
また、「培養基材」には、温度応答性材料が被覆されていても被覆されていなくてもよいが、細胞シートの剥離を酵素処理によって任意のタイミングで行うためには、細胞が接着する面に当該温度応答性材料が被覆されていないものであることが好ましい。
さらに、「培養基材」の培養表面上には、細胞接着性成分／又は細胞接着阻害性成分が存在していてもよい。細胞接着性成分としては、細胞培養技術において、培養表面に細胞を接着させるために通常使用される成分であればいかなるものでもよく、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、カドヘリン、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、ポリＬリジン、ヒアルロン酸、多血小板血漿、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。細胞接着阻害性成分も、細胞培養技術において、培養表面への細胞の接着を阻害させるために通常使用される成分であればいかなるものでもよく、例えば、アルブミンやグロブリンなどが挙げられる。これらの成分で細胞培養基材の培養表面上を被覆する場合、各成分によって、培養表面を被覆するために使用する溶液の濃度が異なるため、予備的な実験等、当業者であれば容易に検討できる方法によって、各成分の被覆のために適当な溶液濃度を決定することができる。
（培地）
工程（ａ）において細胞を培養して細胞シートを得る工程に用いられる培地は、培養する細胞の由来や培養条件に適した培地を適宜選択して使用することができる。例えば、一般的に使用可能な培地として、ヒト正常線維芽細胞増殖用合成培地（ＨＦＤＭ－１）、ＣＴＳTMＡＩＭ－Ｖ（登録商標）、最小必須培地（ＭＥＭ）、最小必須培地アルファ（ＭＥＭ－Ａｌｐｈａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、ヒト平滑筋細胞増殖培地（ｈＳＭＳ－ＧＭ）等を挙げることができ、ＨＦＤＭ－１、ＣＴＳTMＡＩＭ－Ｖ（登録商標）あるいはＨＦＤＭ－１とＣＴＳTMＡＩＭ－Ｖ（登録商標）の混合培地を好ましく挙げることができる。これらの培地は市販のものを購入して使用してもよい。また、これらの培地は単独で用いても、また、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
工程（ａ）において細胞を培養して細胞シートを得る工程に用いられる培地は、培養する細胞の由来や培養条件に適した培地を適宜選択して使用することができる。例えば、一般的に使用可能な培地として、ヒト正常線維芽細胞増殖用合成培地（ＨＦＤＭ－１）、ＣＴＳTMＡＩＭ－Ｖ（登録商標）、最小必須培地（ＭＥＭ）、最小必須培地アルファ（ＭＥＭ－Ａｌｐｈａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、ヒト平滑筋細胞増殖培地（ｈＳＭＳ－ＧＭ）等を挙げることができ、ＨＦＤＭ－１、ＣＴＳTMＡＩＭ－Ｖ（登録商標）あるいはＨＦＤＭ－１とＣＴＳTMＡＩＭ－Ｖ（登録商標）の混合培地を好ましく挙げることができる。これらの培地は市販のものを購入して使用してもよい。また、これらの培地は単独で用いても、また、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
さらに、培地に対し、必要に応じて適当な添加物を加えて使用してもよい。添加物としては、例えば、Ｌ型アミノ酸類（例えば、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－トリオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシンなど）、ビタミン類（例えば、葉酸、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸など）、Ｄ－グルコース、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウマ血清などの動物血清などを含んでもよい。また、緩衝剤（例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＨＡＮＫ’Ｓなど）を適宜培地に加えてもよい。さらに、培養する細胞の由来や目的等に応じて、適宜、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－β１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）－ＢＢ、塩基性線維芽細胞増殖因子／線維芽細胞増殖因子２（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）／ＦＧＦ－２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等の成長因子などを添加してもよい。特に、細胞シートを積層化する観点からは、ＥＧＦ又はｂＦＧＦ等の増殖因子及びアスコルビン酸を含むことが好ましい。ヒト由来の細胞、例えば線維芽細胞又は間葉系幹細胞を培養する場合においては、当該細胞を採取した被験者より血液を採血し、当該血液から血清を調製し、これを含有させてもよい。
たとえば、工程（ａ）において、線維芽細胞を培養して細胞シートに用いる培地としては、線維芽細胞用培地であるＨＦＤＭ－１（＋）に血清を加えた血清含有ＨＦＤＭ培地や、ＨＦＤＭ－１（＋）とＣＴＳTMＡＩＭ－Ｖ培地に血清を加えた血清含有ＡＩＭ／ＨＦＤＭ培地を挙げることができる。なお、ＣＴＳTMＡＩＭ－Ｖ培地には、ゲンタマイシン１０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ及びＬ－グルタミンを含んでいる。
また、培地に血清を含有する場合には、その含有量を０．５～１２％、好ましくは１～１０％とすることができる。
（乾燥）
工程（ｂ）において、細胞シートを構成する細胞の増殖能が失われるまで細胞シートを乾燥処理するとは、乾燥細胞シートを構成する細胞が、再播種しても細胞が増殖できなくなるまで細胞シートを乾燥させることを意味する。再播種しても細胞が増殖できなくなるか否かは、後述する本明細書の実施例に記載のように、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性を調べる方法や、乾燥後の細胞シートを培養して位相差光学顕微鏡で細胞シートの辺縁を観察する方法を挙げることができる。
工程（ｂ）において、細胞シートを構成する細胞の増殖能が失われるまで細胞シートを乾燥処理するとは、乾燥細胞シートを構成する細胞が、再播種しても細胞が増殖できなくなるまで細胞シートを乾燥させることを意味する。再播種しても細胞が増殖できなくなるか否かは、後述する本明細書の実施例に記載のように、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性を調べる方法や、乾燥後の細胞シートを培養して位相差光学顕微鏡で細胞シートの辺縁を観察する方法を挙げることができる。
乾燥の方法としては、細胞シート中の水分が減少する方法であれば特に制限されないが、風乾（送風乾燥）、加温送風乾燥、化学乾燥、真空乾燥、凍結乾燥（真空凍結乾燥）、を挙げることができる。
風乾の場合においては、温度、湿度、風速、時間を総合的に考慮して調整して乾燥させることが可能である。温度としては、例えば４～５０℃とすることができ、下限としては２２℃、２４℃、２６℃とすることもでき、上限としては４５℃、４０℃、３２℃とすることもできる。湿度としては、例えば１５～５５％とすることができ、下限としては２６％、２８％、３０％とすることもでき、上限としては５３％、５１％、５０％とすることもできる。風速としては０．０５～４ｍ／ｓを挙げることができ、下限としては０．０８ｍ／ｓ、０．１ｍ／ｓ、０．２ｍ／ｓとすることもでき、上限としては２．０ｍ／ｓ、１．５ｍ／ｓ、１．０ｍ／ｓとすることもできる。また、乾燥はクリーンベンチ内で行うことが、細胞シートのコンタミネーションを防ぐ観点から好ましい。
加温送風乾燥の場合は、例えばプレートヒーター等で３０～５０℃、好ましくは３５～４５℃に加温したプレートに細胞シートを静置し、送風１～５ｍ／ｓ、好ましくは２～４ｍ／ｓで送風乾燥させる方法を挙げることができる。
化学乾燥の場合は、例えば細胞シートに２－プロパノール、エタノール、アセトンなどの有機溶媒を滴下し、自然乾燥、風乾させる方法を挙げることができる。
真空乾燥の場合は、例えば真空乾燥機を用いて、庫内の温度を２５～４０℃、好ましくは２８～３２℃に設定し、真空ポンプで庫内の圧力を６００ｍＴｏｒｒ以下、好ましくは１００ｍＴｏｒｒ以下に減圧して４時間程度乾燥させる方法を挙げることができる。
凍結乾燥の場合は、例えば真空凍結乾燥機を用いて、庫内の温度を－４０℃に冷却し、一次乾燥として真空ポンプで庫内の圧力を６００ｍＴｏｒｒ以下、好ましくは１００ｍＴｏｒｒ以下に減圧して４時間程度乾燥させ、その後二次乾燥として庫内の圧力を維持したまま、庫内の温度を－４０℃から２０℃までゆっくり復温させる方法を挙げることができる。
上記乾燥によって、細胞シートの平衡含水率が５％以下、好ましくは０．５～４％、より好ましくは１．５～３．５％を挙げることができる。なお、平衡含水率の測定方法は特に制限されないが、例えばカールフィッシャー法によって測定可能である。
（細胞シート又は乾燥細胞シートの剥離）
本発明の乾燥細胞シートの作製方法においては、工程（ｂ）において培養基材上で培養して得られた細胞シートを、細胞の増殖能が失われるまで乾燥させてもよいし、培養基材上で培養して得られた細胞シートをそのまま乾燥させて、乾燥後に乾燥細胞シートを剥離させてもよい。上記乾燥は、その培養基材から剥離した後に乾燥させても、培養基材上にある状態で乾燥させてもよい。
本発明の乾燥細胞シートの作製方法においては、工程（ｂ）において培養基材上で培養して得られた細胞シートを、細胞の増殖能が失われるまで乾燥させてもよいし、培養基材上で培養して得られた細胞シートをそのまま乾燥させて、乾燥後に乾燥細胞シートを剥離させてもよい。上記乾燥は、その培養基材から剥離した後に乾燥させても、培養基材上にある状態で乾燥させてもよい。
工程（ｂ）において培養基材上で培養して得られた細胞シートを、その培養基材から剥離した後に、細胞の増殖能が失われるまで乾燥する場合においては、細胞シートの培養基材からの剥離は、シート状の構造が破損されないような方法で実施することができる。例えば、細胞シート又は培養基材を直接ピンセットなどによって摘み、培養基材表面と細胞シートを剥離させる、あるいは、ピペッティングにより細胞シートを培養基材表面から剥離する等、物理的な手法を用いてもよい。さらには、細胞シート上面に、ＰＶＤＦ膜、ニトロセルロース膜、ＣｅｌｌＳｈｉｆｔｅｒのような、細胞に親和性を有する細胞シート回収用支持体を被せて、細胞シートを膜に移し取ることによって細胞シートを剥離、回収することもできる。このほか、ディスパーゼ、トリプシン、コラゲナーゼなどの酵素処理によって細胞シートを培養基材表面から剥離する方法でもよい。ディスパーゼ処理を行う場合には、ディスパーゼをＰＢＳ等で希釈して１～１２ＰＵ／ｍＬとなるように加えることが好ましい。
上記細胞シート回収用支持体としては特に制限されず、例えば市販のＣｅｌｌ ｓｈｉｆｔｅｒTMやＡＴＴＲＡＮ（登録商標）を用いることができる。なお、細胞シートを細胞シート回収用支持体に貼付したまま乾燥させた場合には、水分を付加しても細胞シート回収用支持体からの離脱が困難である。そのため、乾燥時は細胞シート回収用支持体から細胞シートを剥離して細胞シート単体で行うことが好ましい。細胞シートを置く細胞シート台としては特に制限されず、細胞シート台の材質としてはシリコン、テフロン（登録商標）、プラスチック、ポリエチレン系合成樹脂などを挙げることができ、上記ポリエチレン系合成樹脂としては、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＥＦＥ）を挙げることができる。上記支持体の形状としては容器、シートなどを挙げることができる。
一方、培養基材上で培養して得られた細胞シートをそのまま乾燥させて、乾燥後に培養基材表面と乾燥細胞シートを剥離させる場合においては、乾燥細胞シート状の構造が破損されないような方法で実施することができる。例えば、乾燥細胞シート又は培養基材を直接ピンセットなどによって摘み、培養基材表面と細胞シートを剥離させる方法を用いることができる。なお、培養基材上で培養して得られた細胞シートをそのまま乾燥させて、乾燥後に乾燥細胞シートを剥離させる場合には、培養基材としてシリコンなどの剥離しやすい材質を含む培養基材を用いることが好ましく、この方法により酵素処理が不要となり、剥離作業の工程が簡略化できる。
（乾燥細胞シートの保存）
作製した乾燥細胞シートの保存方法としては冷蔵（４℃）、室温で保存する方法や、凍結保存する方法を挙げることができる。凍結保存する場合は、例えば特開２０２２－８２６９号公報に記載の方法を挙げることができる。冷蔵で保存する場合には、冷蔵保存の状態にもよるが、保存期間は１２ヶ月以下、好ましくは６ヶ月以下、より好ましくは３ヶ月以下、さらに好ましくは１ヶ月以下を挙げることができる。室温で保存する場合は、室温や必要とする成長因子、サイトカインの種類によって適宜調整可能であるが、６ヶ月以下、より好ましくは３ヶ月以下、さらに好ましくは２ヶ月以下、最も好ましくは１ヶ月以下を挙げることができる。
作製した乾燥細胞シートの保存方法としては冷蔵（４℃）、室温で保存する方法や、凍結保存する方法を挙げることができる。凍結保存する場合は、例えば特開２０２２－８２６９号公報に記載の方法を挙げることができる。冷蔵で保存する場合には、冷蔵保存の状態にもよるが、保存期間は１２ヶ月以下、好ましくは６ヶ月以下、より好ましくは３ヶ月以下、さらに好ましくは１ヶ月以下を挙げることができる。室温で保存する場合は、室温や必要とする成長因子、サイトカインの種類によって適宜調整可能であるが、６ヶ月以下、より好ましくは３ヶ月以下、さらに好ましくは２ヶ月以下、最も好ましくは１ヶ月以下を挙げることができる。
（成長因子又はサイトカインの溶出）
本発明の乾燥細胞シートにおいては、工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液へのＦＧＦ－２の溶出量が、工程（ｂ）の乾燥処理前の細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液へのＦＧＦ－２の溶出量に対して５倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上、よりさらに好ましくは５００倍以上、最も好ましくは１０００倍以上を挙げることができる。同様に、本発明の乾燥細胞シートにおいては、工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液へのＨＭＧＢ１の溶出量が、工程（ｂ）の乾燥処理前の細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液へのＨＭＧＢ１の溶出量に対して２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは７倍以上を挙げることができる。
本発明の乾燥細胞シートにおいては、工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液へのＦＧＦ－２の溶出量が、工程（ｂ）の乾燥処理前の細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液へのＦＧＦ－２の溶出量に対して５倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上、よりさらに好ましくは５００倍以上、最も好ましくは１０００倍以上を挙げることができる。同様に、本発明の乾燥細胞シートにおいては、工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液へのＨＭＧＢ１の溶出量が、工程（ｂ）の乾燥処理前の細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液へのＨＭＧＢ１の溶出量に対して２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは７倍以上を挙げることができる。
また、工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液における総タンパク質１μｇあたりのＦＧＦ－２の量が、５ｐｇ/μｇ以上、好ましくは７ｐｇ/μｇ以上、より好ましくは１０ｐｇ/μｇ以上、さらに好ましくは１５ｐｇ/μｇ以上、特に好ましくは２０ｐｇ/μｇ以上を挙げることができる。用いる乾燥細胞シートとしては、冷蔵（４℃）で0．5～24時間、1～12時間、又は2～3時間保存した細胞シートを挙げることができる。
上記溶出に用いられる溶液としては通常細胞の保存、洗浄若しくは培養に用いられる溶液であれば特に制限されないが、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、緩衝液のほか、ＤＭＥＭや１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＣＴＳTM ＡＩＭ－Ｖ（登録商標）等の上記「工程（ａ）において細胞を培養して細胞シートを得る工程に用いられる培地」に記載の培地などの通常細胞の培養に用いられる培地を挙げることができる。溶液での２４時間の浸漬からＦＧＦ－２又はＨＭＧＢ１の溶出量の算出までの流れとしては、例えば、次の方法が挙げられる。まず、測定対象の乾燥細胞シート（工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シート及び工程（ｂ）の乾燥処理前の細胞シートそれぞれ）をＤＭＥＭ若しくは１０％ＦＢＳ含有ＣＴＳTM ＡＩＭ－Ｖ（登録商標）培地などの溶液を用いて、大気酸素状態（３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２）で２４時間浸漬する。次に遠心分離（４℃、５０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清を溶出液として採取する。採取された上清中のＦＧＦ－２又はＨＭＧＢ１をＥＬＩＳＡ法で測定することで溶液へのＦＧＦ－２又はＨＭＧＢ１の溶出量を算出する。
また、本発明の乾燥細胞シートは、上記方法によって算出した乾燥細胞シートあたりのＦＧＦ－２溶出量が３５０ｐｇ／ｃｍ２以上、好ましくは７００ｐｇ／ｃｍ２以上、より好ましくは１１００ｐｇ／ｃｍ２以上、さらに好ましくは３０００ｐｇ／ｃｍ２以上、特に好ましくは５０００ｐｇ／ｃｍ２以上を挙げることができる。
（乾燥細胞シートの用途）
本発明の乾燥細胞シートは、様々な動物の創傷若しくは手術部位の組織の被覆若しくは補強に使用することができる。上記創傷の要因としては特に制限されないが、例えば外傷、火傷などの外的要因や、糖尿病、膠原病、下肢静脈瘤、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、ＳＬＥなどの内的要因が含まれる。また、上記創傷の種類としては、熱傷皮膚潰瘍、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、静脈性皮膚潰瘍、難治性皮膚潰瘍などの皮膚疾患を挙げることができる。また、手術部位の組織としては、手術によって生じた肺切除時の気管支断端、消化管吻合時の吻合部、肝若しくは膵切離時の断端を挙げることができる。つまり、上記乾燥細胞シートは、外科手術時の縫合不全あるいは断端瘻（ろう）の予防のための補強材として使用し、乾燥細胞シートの移植によって、手術部位における創傷治癒の促進と結合組織の形成を促して、手術で修復された部位を強化し、構造的に弱くなっている部位からの漏れを予防することができる。ここで「動物」とは、特に限定されないが、具体的には、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことであり、好ましくはヒトである。
本発明の乾燥細胞シートは、様々な動物の創傷若しくは手術部位の組織の被覆若しくは補強に使用することができる。上記創傷の要因としては特に制限されないが、例えば外傷、火傷などの外的要因や、糖尿病、膠原病、下肢静脈瘤、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、ＳＬＥなどの内的要因が含まれる。また、上記創傷の種類としては、熱傷皮膚潰瘍、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、静脈性皮膚潰瘍、難治性皮膚潰瘍などの皮膚疾患を挙げることができる。また、手術部位の組織としては、手術によって生じた肺切除時の気管支断端、消化管吻合時の吻合部、肝若しくは膵切離時の断端を挙げることができる。つまり、上記乾燥細胞シートは、外科手術時の縫合不全あるいは断端瘻（ろう）の予防のための補強材として使用し、乾燥細胞シートの移植によって、手術部位における創傷治癒の促進と結合組織の形成を促して、手術で修復された部位を強化し、構造的に弱くなっている部位からの漏れを予防することができる。ここで「動物」とは、特に限定されないが、具体的には、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことであり、好ましくはヒトである。
乾燥細胞シートの使用態様としては、創傷若しくは手術部位に乾燥細胞シートを構成する乾燥細胞が直接あるいは生理食塩水などの溶液を介して創傷部位や手術部位の組織に接触すればよい。しかしながら、創傷部位や手術部位の組織に凹凸があるなど、平らな形状ではない部位において、その部位へ直接又は間接的に乾燥細胞シートが接するように、乾燥細胞シートを細かく切断、裁断、若しくは粉末化して用いてもよい。この場合は、切断、裁断、若しくは粉末化した乾燥細胞シートを、生理食塩水や徐放性ゲル等の溶液を介して創傷部位や手術部位の組織に接触させることができる。
なお、本発明の上記乾燥細胞シートは、細胞を培養基材上に播種して培養し、さらに乾燥して得られる。一方、得られた本発明の乾燥細胞シートは、その構造又は特性が極めて複雑であり、その構造又は特性により直接特定するには著しく過大な経済的支出や時間を要する。そのため、本発明の乾燥細胞シートの説明において、「生体から採取されたＦＧＦ－２発現細胞を培養基材上で培養して細胞シートを得る工程（ａ）；及び前記工程（ａ）で得られた細胞シートを構成する細胞の増殖能が失われるまで前記細胞シートを乾燥処理する工程（ｂ）；によって作製された乾燥細胞シート」と記載することには、いわゆる「不可能・非実際的事情」が存在する。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例の統計解析において特に明記しない限り、結果は平均±標準偏差とした。２つのグループ間の比較にはスチューデントのt検定を行い、３つ以上のグループ間の比較にはTukey-Kramer法で検定を行った。
例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例の統計解析において特に明記しない限り、結果は平均±標準偏差とした。２つのグループ間の比較にはスチューデントのt検定を行い、３つ以上のグループ間の比較にはTukey-Kramer法で検定を行った。
［実施例１］
＜マウス線維芽細胞による乾燥細胞シートの作製＞
まずはマウスの線維芽細胞を培養して細胞シートを作製し、得られた細胞シートを培養基材から剥離後に風乾して乾燥細胞シート（Dry sheet）を作製した。
＜マウス線維芽細胞による乾燥細胞シートの作製＞
まずはマウスの線維芽細胞を培養して細胞シートを作製し、得られた細胞シートを培養基材から剥離後に風乾して乾燥細胞シート（Dry sheet）を作製した。
マウスは雄のC57BL / 6N（6週齢：日本SLC社）を用いた。マウスの飼育においては、温度、湿度、及び消灯時間（12時間）を制御し、食物と水は自由に摂取可能とした。すべての動物実験は、国立大学法人山口大学の動物実験委員会によって承認され、動物実験に関連するガイドラインに準拠した。
まずは線維芽細胞から細胞シートを次の方法で作製した。コラゲナーゼ（富士フイルム和光純薬社）を使用し、上記C57BL / 6Nマウスの尾から線維芽細胞を単離し、10％ウシ胎児血清（FBS）含有CTSTM AIM-V（登録商標）培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で培養した。次に、5％FBSを含有するCTSTM AIM-V（登録商標）培地とHFDM-1（+）の等量混合培地（FBS含有AIM-V+HFDM-1培地：total 2ml/well: Cell Science＆Technology Institute社）を使用して、初代線維芽細胞をポリスチレン製の24 well plate（1.88cm2/well：AGCテクノグラス社）で4.2×105/wellとなるように播種した。次に大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2(normal)）で2日間培養した後、低酸素状態（33℃、5％CO2、2％O2）で１日培養して積層線維芽細胞シートを作製した。得られた積層線維芽細胞シートは、培養容器に接着していた。培養後、積層線維芽細胞シートを2ml / wellのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、500μl（10 PU / mL）のディスパーゼ（合同酒精社）を加えて大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で30分間インキュベートした。続いて、2ml / well のPBSで2回洗浄した。以上の過程で24 well plateから剥離された積層線維芽細胞シートは、乾燥前で生細胞のシートであり、本明細書において「Living sheet」ともいう。Living sheetは、引き続き、後述のクリーンベンチ内での風乾法、又は凍結融解処理を行った。
風乾法では、バイオクリーンベンチ内に置いたシリコン製の細胞シート台上に、広口の1,000μLのピペット用チップを付けたピペットを用いて上記で作製したliving sheetを移動させた。以下、この細胞シートの移動方法を単に「ピペット法」ともいう。次に、Living sheetを細胞シート台上に静置したまま、バイオクリーンベンチ内の清浄な環境の下でバーナーの種火を作動させた状態において平均温度３０．７℃（２７．６～３１．４℃）、平均湿度３９．６％（３１．１～４９．６％）、風速０．１～０．４ｍ／ｓの条件下で３０分ほどLiving sheetを乾燥させて乾燥細胞シートを作製した。本明細書において、上記作製した乾燥細胞シートを「Dry sheet」ともいう。バイオクリーンベンチ内の湿度及び温度はHYGROPALM-HP32（ロトロニック社）を使用し測定し、風速はINFURIDERハンディ風速計（AOPUTTRIVER社）を使用して測定した。Dry sheetはピンセットでシリコン製の細胞シート台から容易に剥がすことが可能であった。得られたDry sheetは1.5mlのチューブ容器に移し、乾燥剤とともに冷蔵庫（4℃）又は室温（23℃）で保存した。
また、後の実験に用いるために凍結融解細胞シートを作製した。なお、凍結融解細胞シートは細胞内の物質を除去した比較対象である。凍結融解操作において、24 well plate内で剥離された上記Living sheetを、2ml / well のPBS含有24 well plateと共に密封可能なビニール袋内に移し、-80℃で凍結した（60分）。その後、インキュベーター（37℃、90分）で融解した。この凍結－融解サイクルを3回繰り返して作製した細胞シートを凍結融解細胞シートとした。本明細書において、上記作製した凍結融解細胞シートを「FT sheet」ともいう。
Living sheet、Dry sheet及びFT sheet作製の流れを図１Ａに示す。なお、図１Ａ中、Dry sheet及びFT sheetの写真は、24 well plateから剥離後に乾燥若しくは凍結融解操作を行ったシートを、培養に用いた24 well plate内に静置して撮影したものである。得られたDry sheetは平面形状を維持しており、かつ、ピンセットなどで扱っても細胞シートの形状を維持できる強度を有しておりハンドリングも容易であった。また、フィーダー細胞を用いずに単一の細胞を培養して得られた細胞シートであるため、細胞シートとして表裏の区別もなく、かつ層間剥離もなかった。
＜各細胞シートの組織学的所見＞
Living sheet、Dry sheet及びFT sheetの各細胞シートの切片標本を作製し、ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色又はアザン(Azan)染色し、顕微鏡で観察した。切片標本は、次のとおりである。まず、CellShifterTM（CellSeed社）に載せた各細胞シートを10％ホルマリン中性緩衝液で固定し、パラフィンに包埋した。次に、切片（厚さ3μm）を切り取り、スライドガラスにマウントし、キシレンで脱パラフィンし、段階的にエタノールで再水和した。結果を図１Ｂに示す。さらに、各細胞シートの厚さ（μｍ）、積層数、及び各細胞シート100μｍ長あたりの核の数を図１Ｃに示す。図１Ｂ上段及び中段に示すように、すべての細胞シートは積層構造で形成され、細胞の角化は見られず、表皮角化細胞（ケラチノサイト）は含まれていない状態であった。また、図１Ｂ上段及び中段、図１Ｃの左又は中央のグラフより、Dry sheetはLiving sheetより少し薄くなり、厚さは21±4.2μm、5～7層構造であった。図１Ｂ下段及び図１Ｃ右のグラフより、核の形態変化はDry sheetではわずかであり、細胞核は膨潤してサイズがより不均一であった。FT sheetでは変化が大きく、核とクロマチンの数が大幅に減少していた。また、図１Ｂ下段に示すように、アザン染色においてコラーゲンを示す青色の領域と、蛍光免疫染色で細胞外マトリックスI型コラーゲンを示す赤色の領域に関して、すべての細胞シートに認められ、Living sheet、Dry sheet、FT sheetの順で多かった。このことから、乾燥によって細胞が死んだ場合、及び凍結融解によって細胞の中身を溶出させた場合のいずれもコラーゲンなどの膠原繊維が残っており、マトリックスとしての作用、すなわち細胞の足場としての作用は残っていることが明らかとなった。
Living sheet、Dry sheet及びFT sheetの各細胞シートの切片標本を作製し、ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色又はアザン(Azan)染色し、顕微鏡で観察した。切片標本は、次のとおりである。まず、CellShifterTM（CellSeed社）に載せた各細胞シートを10％ホルマリン中性緩衝液で固定し、パラフィンに包埋した。次に、切片（厚さ3μm）を切り取り、スライドガラスにマウントし、キシレンで脱パラフィンし、段階的にエタノールで再水和した。結果を図１Ｂに示す。さらに、各細胞シートの厚さ（μｍ）、積層数、及び各細胞シート100μｍ長あたりの核の数を図１Ｃに示す。図１Ｂ上段及び中段に示すように、すべての細胞シートは積層構造で形成され、細胞の角化は見られず、表皮角化細胞（ケラチノサイト）は含まれていない状態であった。また、図１Ｂ上段及び中段、図１Ｃの左又は中央のグラフより、Dry sheetはLiving sheetより少し薄くなり、厚さは21±4.2μm、5～7層構造であった。図１Ｂ下段及び図１Ｃ右のグラフより、核の形態変化はDry sheetではわずかであり、細胞核は膨潤してサイズがより不均一であった。FT sheetでは変化が大きく、核とクロマチンの数が大幅に減少していた。また、図１Ｂ下段に示すように、アザン染色においてコラーゲンを示す青色の領域と、蛍光免疫染色で細胞外マトリックスI型コラーゲンを示す赤色の領域に関して、すべての細胞シートに認められ、Living sheet、Dry sheet、FT sheetの順で多かった。このことから、乾燥によって細胞が死んだ場合、及び凍結融解によって細胞の中身を溶出させた場合のいずれもコラーゲンなどの膠原繊維が残っており、マトリックスとしての作用、すなわち細胞の足場としての作用は残っていることが明らかとなった。
［実施例２］
＜乾燥速度及び乾燥細胞シートの重量及び平衡含水率＞
実施例１と同様の方法でマウスの線維芽細胞を培養することにより作製したLiving sheetを平均温度30.7℃（27.6-31.4℃）、平均湿度39.6％（31.1-49.6％）、風速0.1-0.4 m / sの条件で60分ほど風乾により乾燥させた。
＜乾燥速度及び乾燥細胞シートの重量及び平衡含水率＞
実施例１と同様の方法でマウスの線維芽細胞を培養することにより作製したLiving sheetを平均温度30.7℃（27.6-31.4℃）、平均湿度39.6％（31.1-49.6％）、風速0.1-0.4 m / sの条件で60分ほど風乾により乾燥させた。
Living sheetからDry sheetへ乾燥する過程における細胞シートの重量（ｇ）変化は、プラスチックプレート上に8枚のLiving sheetを上記ピペット法で移動させ、バイオクリーンベンチ内に設置されたBalance XS104 (Mettler Toledo社)で１分毎に測定した。また、細胞シートの重量変化に基づいて乾燥速度を算出した。さらに、Dry sheetの含水量は、Japan Testing Laboratories社に委託し、カールフィッシャー法で測定した。カールフィッシャー法での含水量の測定には、50枚のDry sheetを2 mlのメタノールに浸漬し、メタノール中の水分量を測定することによって行った。
風乾20分までの乾燥処理時間と細胞シートの重量との関係の結果を図２Ａに示す。Living sheetの平均重量は6.9mg / sheetであり、乾燥時間とともに、重量は減少し、平均13.7分（9分,12分,20分の3回の測定の平均）で重量の平衡状態に達していた。20分乾燥処理後の乾燥細胞シートの重量は0.31mg / sheet、面積は0.31cm2 / sheet、カールフィッシャー法で測定した平衡含水率は3.2％、乾燥前と比較しておよそ1/22の重量であり、乾燥速度は7.9mg / min / cm2であった。従って、上記乾燥条件では、乾燥時間は14分で十分であるといえる。
＜乾燥細胞シートの生命活動＞
乾燥した細胞シートの生命活動を次の方法で調べた。実施例１と同様の方法で作製した、24 well plateから剥離していない積層線維芽細胞シート（Attached cell sheet）、Living sheet、30分間乾燥したDry sheet、及び、陽性コントロールとしてのメタノールに浸漬したLiving sheetを4 ',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で核を染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
乾燥した細胞シートの生命活動を次の方法で調べた。実施例１と同様の方法で作製した、24 well plateから剥離していない積層線維芽細胞シート（Attached cell sheet）、Living sheet、30分間乾燥したDry sheet、及び、陽性コントロールとしてのメタノールに浸漬したLiving sheetを4 ',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で核を染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
結果を図２Ｂに示す。24 well plateから剥離していない積層線維芽細胞シート（Attached cell sheet）はDAPIで染色された核がほとんど認められず、Living sheetは複数のDAPIで染色された核が認められた。乾燥時間30分のDry sheetでは、ほとんどすべての核がDAPIで染色されていた。この結果から、乾燥によりDry sheetを構成する細胞の細胞膜が傷害され、細胞死に至ったと考えられた。
＜ＬＤＨの放出＞
乳酸脱水素酵素（LDH）細胞毒性アッセイキットにより、乾燥時間と死細胞率との関係を検討した。
乳酸脱水素酵素（LDH）細胞毒性アッセイキットにより、乾燥時間と死細胞率との関係を検討した。
24 well plateからAttached cell sheet、Living sheet、そして5、10、15、30、45、60分間の乾燥によって得られたDry sheetを500μl PBSに室温（23℃）で30分間浸漬した。各細胞シートの上清中のLDHを、Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST（同人化学社）を使用して測定した。陰性コントロールをPBSとし、陽性コントロールはAttached cell sheetを、上記Cytotoxicity LDH Assay Kitキットに付属のLysis BufferをPBSで希釈し、終濃度20％になるように調整した溶液500μlに浸漬し、その上清を用いた。
結果を図２Ｃに示す。陽性コントロールに含まれるLDHの量を100％として、Living sheetではLDHの放出率は21％であった。Dry sheet においては、LDHの放出率は乾燥時間の経過とともに増加し、10分で88％、15分で92％、30分後に98％以上となった。したがって、乾燥時間の経過と共に死細胞率が上昇すること、上記乾燥条件であれば10分、あるいは15分でほぼ細胞が死ぬことが確認された。
＜再播種試験と再播種後の細胞シートの代謝活性＞
乾燥時間に伴い細胞増殖能が喪失することを、再播種試験によって検討した。Living sheetと30分間風乾したDry sheetを2 mlの10%FBS含有CTSTM AIM-V（登録商標）培地に移し（12 well plate）、大気酸素条件で24時間培養した後、位相差光学顕微鏡で観察した。
乾燥時間に伴い細胞増殖能が喪失することを、再播種試験によって検討した。Living sheetと30分間風乾したDry sheetを2 mlの10%FBS含有CTSTM AIM-V（登録商標）培地に移し（12 well plate）、大気酸素条件で24時間培養した後、位相差光学顕微鏡で観察した。
結果を図２Ｄに示す。Living sheet（図２Ｄ左側）では培養皿の底面にLiving sheetが付着し、Living sheetの辺縁から線維芽細胞の増殖が認められた。一方、Dry sheet（図２Ｄ右側）では、線維芽細胞の増殖は確認できず、細胞の増殖能を失っていることが確認された。
さらに、再播種から24時間後のLiving sheetとDry sheetから培養上清を除去後、1mLの溶液（10%FBS含有CTSTM AIM-V（登録商標）培地にWST-8試薬（Cell Count Reagent SF、ナカライテスク社）を終濃度10%となるように添加した培養液）を添加した。3時間インキュベートした後、上清の450nmの吸光度を測定することにより代謝活性を調べた。結果を図２Ｅに示す。Dry sheetの吸光度は培地の吸光度と同等であり、Dry sheetは代謝活性を失っていることが確認された。
上記図２Ａ～Ｅの結果から、乾燥細胞シートの細胞膜は30分以上の乾燥により脆弱化し、不可逆的に生命活動を停止していることが確認された。また、これらの結果に基づいて後述の実施例においては、個別に記載がない限り、風乾法により30分以上乾燥させ、1～12時間冷蔵（4℃）又は常温（23℃）で2～3日保存した乾燥細胞シートをDry sheetとして使用した。
［実施例３］
＜Dry sheetに保持される成長因子及びサイトカインの細胞外への放出＞
細胞溶解液を使用して細胞シートを溶解した。その溶解液の上清を使用し、Dry sheetに保持されている生理活性物質を評価するために、VEGF、HGF、FGF-2、及びHMGB1を酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA法）で測定した。なお、VEGFは血管を新しく作るために必要となる成長因子であり、HGFは器官再生促進作用を有する成長因子である。さらに、FGF-2（図中、単にFGF2と記載することもある）は細胞膜、細胞質若しくは核に局在し、細胞が生きているときには細胞外に分泌されず、細胞が障害を受けて初めて細胞外に溶出される成長因子である（Rifkin, D.B., Moscatelli, D. Recent Developments in the Cell Biology of Basic Fibroblast Growth Factor. Cell Biol. 190, 1-6 (1989).）。また、HMGB1はalarminの一種であり、生体防御因子としての作用が知られており、主に核に局在し、間葉系幹細胞の動員にも関わり、創傷治癒を促進する可能性が示唆されているサイトカインである（Tamai, K. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6609-6614 (2011)., Iinuma, S. J Immunol. 194, 1996-2003 (2015)., Aikawa, E. Fujita, R., Kikuchi, Y., Kaneda, Y., Tamai, K. Sci Rep. 5, 11008 (2015).）。
＜Dry sheetに保持される成長因子及びサイトカインの細胞外への放出＞
細胞溶解液を使用して細胞シートを溶解した。その溶解液の上清を使用し、Dry sheetに保持されている生理活性物質を評価するために、VEGF、HGF、FGF-2、及びHMGB1を酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA法）で測定した。なお、VEGFは血管を新しく作るために必要となる成長因子であり、HGFは器官再生促進作用を有する成長因子である。さらに、FGF-2（図中、単にFGF2と記載することもある）は細胞膜、細胞質若しくは核に局在し、細胞が生きているときには細胞外に分泌されず、細胞が障害を受けて初めて細胞外に溶出される成長因子である（Rifkin, D.B., Moscatelli, D. Recent Developments in the Cell Biology of Basic Fibroblast Growth Factor. Cell Biol. 190, 1-6 (1989).）。また、HMGB1はalarminの一種であり、生体防御因子としての作用が知られており、主に核に局在し、間葉系幹細胞の動員にも関わり、創傷治癒を促進する可能性が示唆されているサイトカインである（Tamai, K. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6609-6614 (2011)., Iinuma, S. J Immunol. 194, 1996-2003 (2015)., Aikawa, E. Fujita, R., Kikuchi, Y., Kaneda, Y., Tamai, K. Sci Rep. 5, 11008 (2015).）。
実施例１と同様の方法でマウスの線維芽細胞を培養することにより作製したLiving sheet、Dry sheet及びFT sheetの各細胞シートを200μlのcell lysis buffer 2（R＆D社）に室温で30分間浸漬して細胞シートを溶解し、遠心分離（4℃、5000rpm、5分）した後の上清を細胞溶解液（lysate）として採取し、VEGF、HGF、FGF-2、及びHMGB1をELISA法で測定した（n=3）。ELISA法として、VEGF、HGF、FGF-2の測定においては、Quantikine Immunoassay Kits (R&D Systems社)を用い、HMGB1の測定においてはHMGB1 ELISA Kit Exp (SHINO-TEST社)を用いた。結果を図３Ａに示す。
次に、これらの成長因子やサイトカインが細胞溶解液を用いなくてもDry sheetから培養溶液中に分泌又は溶出されるかどうかを検討した。Living sheet、Dry sheet及びFT sheetの各細胞シートを200μlの10％FBS 含有CTSTM AIM-V（登録商標）培地を用いて、大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で24時間浸漬した。次に遠心分離（4℃、5000rpm、5分）を行い、それぞれの上清を溶出液（Eluate）として採取した。採取した上清は測定までは-30℃で保存した。上清中のVEGF、HGF、FGF-2及びHMGB1を上記ELISA法で測定した（n=3）。結果を図３Ｂに示す。
図３Ａから明らかなように、Dry sheetの溶解液ではLiving sheetの溶解液とほぼ同程度の各成長因子又はサイトカインが検出されていた。したがって、Dry sheetではLiving sheetと同程度の各成長因子又はサイトカインが保持されていることが明らかとなった。一方、FT sheetはほとんどの成長因子又はサイトカインを保持していなかった。また、図３Ｂから明らかなように、VEGFとHGFはLiving sheetの溶出液とDry sheetの溶出液の両方で検出されたが、FGF-2又はHMGB1はDry sheetの溶出液で検出されたものの、Living sheetの溶出液ではほとんど検出されなかった。さらに、VEGF及びHGFに関して、Living sheetと比較してDry sheetの溶出液ではそれぞれ約50％、約95％も維持していた。なお、マウスのFGF-2及びHMGB1は分泌シグナル配列がないため、生細胞ではほとんど細胞外(上清中)に分泌されないタンパク質であり、VEGF及びHGFは分泌シグナル配列を有しているため、生細胞でも細胞外（上清中）に分泌されるタンパク質である。これらの結果から、Dry sheetは乾燥による細胞膜の傷害によって、Living sheetでは放出されないFGF-2及びHMGB1が細胞外に放出できることが明らかとなった。また、Dry sheetを貼付することで、細胞シートから成長因子やサイトカインなどの生理活性物質が漏出し、創傷又は手術部位の組織周囲の線維芽細胞や間葉系幹細胞を刺激し、血管新生や創傷治癒、もしくは手術部位の組織修復を促進すると考えられる。
さらに、免疫蛍光染色により、各細胞シートにおけるFGF-2及びHMGB1の局在を観察した。切片標本は、次のとおりである。まず、CellShifterTM（CellSeed社）に載せた各細胞シートを10％ホルマリン中性緩衝液で固定し、パラフィンに包埋した。次に、切片（厚さ3μm）を切り取り、スライドガラスにマウントし、キシレンで脱パラフィンし、段階的にエタノールで再水和した。Target Retrieval Solution（S1699; DAKO Cytomation A/S社）で100℃、30分間、熱誘導抗原回復を行い、ブロッキングバッファー（X0909：DAKO社）を用いて室温で20分間インキュベートした。使用した各抗体は以下に示す。Rabbit anti-FGF-2 antibody (ab208687; Abcam社)、rabbit anti-HMGB-1 antibody (ab79823; Abcam社), goat anti-rabbit IgG H&L secondary antibody (ab96884; Abcam社)。すべての組織像は、BZ-X710顕微鏡（キーエンス社）を使用して撮像し、BZ-Xアナライザー（キーエンス社）を使用して分析した。FGF-2の局在を顕微鏡で観察した結果を図３Ｃに、ＨＭＧＢ１の局在を顕微鏡で観察した結果を図３Ｄに示す。
図３Ｃから明らかなように、FGF-2は、Living sheetとDry sheetの細胞質に局在していたが、FT sheetではほとんど認められなかった。また、図３Ｄから明らかなように、HMGB1は、Living sheetとDry sheetの細胞核に局在していたが、FT sheetではほとんど認められなかった。
上記図３Ａ－Ｄの結果から、Dry sheetの細胞内に保持されるFGF-2及び主に核内に保持されるHMGB1は、乾燥によって細胞膜及び核膜が脆弱化し、溶出液に浸漬することで細胞外に容易に放出されることが明らかとなった。
［実施例４］
＜細胞シート溶出液による線維芽細胞の細胞増殖及びVEGF/HGF産生解析＞
Dry sheetの溶出液による線維芽細胞の細胞増殖、VEGF及びHGF産生の増強を調べた。
＜細胞シート溶出液による線維芽細胞の細胞増殖及びVEGF/HGF産生解析＞
Dry sheetの溶出液による線維芽細胞の細胞増殖、VEGF及びHGF産生の増強を調べた。
実施例１と同様の方法でマウスの線維芽細胞から作製したLiving sheet、Dry sheet及びFT sheetの各細胞シートを200μLのDMEM（FBS不含有）に24時間浸漬し、遠心分離（5000 rpm、4℃、3分）を行って上清を回収して、上記各細胞シートの溶出液試料とした。
マウスの線維芽細胞を、10% FBSを含むDMEM100μL中で細胞濃度8×103細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、続いて、Living sheet、Dry sheet及びFT sheetの各細胞シートから調製した溶出液試料又はコントロールとしてDMEMを100μL添加した。次に、大気酸素条件下で48時間（37℃、5％CO2、20%O2）インキュベート後、培養上清を採取し、WST-8試薬（Cell Count Regent SF、ナカライテスク社）を用いた細胞増殖アッセイを行った。コントロールのDMEM添加で培養したマウスの線維芽細胞の細胞増殖率を１とした場合の相対比で細胞増殖率を算出した。結果を図４Ａに示す（数値は平均値±標準偏差、*: P <0.05、**: P<0.01、n.s.:有意差なし）。図４Ａ中、LivingはLiving sheetから調製した溶出液試料を添加した場合、DryはDry sheetから調製した溶出液試料を添加した場合、FTはFT sheetから調製した溶出液試料を添加した場合、ControlはDMEMを添加した場合である（図４Ｂ－図４Ｄも同じ）。
また、Living sheet、Dry sheet及びFT sheetの各細胞シートから調製した溶出液試料で培養したマウスの線維芽細胞、及びコントロールのDMEM添加で培養したマウスの線維芽細胞におけるVEGF産生及びHGF産生をELISAで測定し、コントロールのDMEM添加で培養した線維芽細胞におけるVEGF産生及びHGF産生量を１とした場合の相対比を算出した。結果を図４Ｂ、図４Ｃに示す（数値は平均値±標準偏差、*: P <0.05、**: P<0.01、n.s.:有意差なし）。
図４Ａから明らかなように、線維芽細胞の細胞増殖アッセイでは、Living sheet、Dry sheet、FT sheetから調製した溶出液試料を用いた場合は、DMEM（コントロール）に比べて細胞増殖率がそれぞれ順に1.14、1.75、1.03倍高値であった。したがって、Dry sheetの溶出液は、Living sheet、FT sheetに比べ有意な細胞増殖能を示した。また、図４Ｂ、図４Ｃから明らかなように、 Dry sheetから調製した溶出液試料を用いた場合は、コントロールに比べ1.53倍有意に高いVEGFの産生を誘導し、コントロールに比べ4.64倍有意に高いHGFの産生を誘導した。
さらに、上記実施例３において、Dry sheetの溶出液にはFGF-2が多量に含まれていたため、FGF-2は生物活性に影響を及ぼす可能性がある。このFGF-2は強力な増殖因子である。そこで、FGF-2に対する中和抗体又は組換えFGF-2蛋白質(rFGF-2)を用いて、溶出液中のFGF-2が線維芽細胞の増殖に直接影響するか否かを調べた。
Dry sheetの溶出液試料、あるいは0若しくは5ng/mLのrFGF-2（FUJIFILM Wako Pure Chemical社）を含むDMEM（FBS不含有）を、抗FGF-2抗体（bFM-1：Merck Millipore社）又はコントロール抗体（マウスIgG1アイソタイプコントロール clone 11711：R&D Systems社）と37℃で60分間インキュベートして、上記いずれかの抗体で中和処理した溶出液を調製した。マウスの線維芽細胞を1% FBSを含むDMEM100μL中の細胞濃度8×103細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、その後、上記で調製した上記いずれかの抗体を含むDry sheetの溶出液サンプル100μL、上記いずれかの抗体及び0若しくは5ng/mLのrFGF-2を含むDMEM100μLを添加した。それぞれ大気酸素条件下で48時間インキュベートした後、培養上清を吸引し、続いて細胞増殖アッセイを行った。コントロール抗体を用い、かつrFGF-2添加なしのDMEMで培養した線維芽細胞の細胞増殖率を１とした場合の相対比でそれぞれの細胞増殖率を算出した。数値は平均値±標準偏差で表した（**: P<0.01）。結果を図４Ｄに示す。
図４Ｄから明らかなように、Dry sheetの溶出液又はrFGF-2のいずれにおいてもコントロール抗体の処理群では線維芽細胞の細胞増殖率を高めるが、FGF-2中和抗体処理群では線維芽細胞の増殖を妨げていた。したがって、Dry sheetの生物活性が主にFGF-2の効果であることが明らかとなった。
［実施例５］
＜糖尿病マウスの皮膚全層欠損モデルにおける創傷治癒効果－マウス線維芽細胞＞
糖尿病マウスの皮膚全層欠損モデルを用い、マウスの線維芽細胞から作製した乾燥細胞シートが創傷治癒効果を有するかどうかを調べた。
＜糖尿病マウスの皮膚全層欠損モデルにおける創傷治癒効果－マウス線維芽細胞＞
糖尿病マウスの皮膚全層欠損モデルを用い、マウスの線維芽細胞から作製した乾燥細胞シートが創傷治癒効果を有するかどうかを調べた。
雄のC57BL / 6Nマウス（6週齢：Japan SLC社）に、ストレプトゾトシン（STZ）55 mg / kgを24時間ごとに5日間連続して腹腔内投与した。STZ投与後9日目及び10日目に血糖値測定を行い、血糖値が連続で300mg / dl以上のマウスを糖尿病マウスとした。次に、STZの最終投与から14日後に、上記糖尿病マウスを2％イソフルランで吸入麻酔し、6mm生検パンチを使用して背側に全層皮膚欠損を作製した（n=6）。
Living sheet、Dry sheet、FT sheetの各細胞シートは、雄のC57BL / 6Nマウス（自家）と雄のC3H / Heマウス（他家／同種異系）から線維芽細胞を単離し、実施例１と同様の方法で作製した。各細胞シート作製から２～３日ほど室温（23℃）で保存した後、Living sheetとFT sheetは上記ピペット法で移動して皮膚欠損部に貼付した。Dry sheetはピンセットで容易に把持して貼付可能であり、ピンセットを用いて貼付した（図示なし）。各細胞シート貼付日（Day 0）に、ADAPTIC（＃2012; Acelity社）及びDerma-aid（登録商標）（ALCARE社）で創傷部を保護し、Silkytex（＃11893; ALCARE社）で固定した。Day 1以降は、隔日にAirwall Fuwari（＃MA-E050-FT; 共和社）で創傷部を保護し、Silkytex（＃11893; ALCARE社）で固定した。Day 0、1、3、5、7、9、11、及び13にデジタルカメラで直径10.5 mmの定規とともに創傷部を撮影した。自家の線維芽細胞から作製した細胞シートを用いた場合の結果を図５Ａ、他家／同種異系の線維芽細胞から作製した細胞シートを用いた場合の結果を図５Ｃに示す。また、ImageJソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所）を用いて創傷面積を測定した。創傷の閉鎖率は以下の式で求めた。[ day X ]（％）= {1-（創傷部 [ day X ] / 創傷部 [ day 0 ]）}×100。Dry sheetは室温で保存され、作製後１週間以内のものを使用した。結果を図５Ｂ、Ｄに示す。
図５Ａ－Ｄから明らかなように、創傷の閉鎖率は、無治療群（Control）よりも自家及び他家のDry sheet群で有意に高かった。具体的には、５日目[自家Dry sheet群 and 他家Dry sheet群 vs 無治療群：74.2±5.0％（P <0.05）and 80.0± 4.9％（P < 0.01）vs 51.0±7.2％]、7日目[自家Dry sheet群 and 他家Dry sheet群 vs. 無治療群：95.8±2.1％（P < 0.01）and 90.0±4.0％（P < 0.05） vs. 72.4±5.7％]、9日目[自家Dry sheet群 vs. 無治療群：99.4±0.5％（P < 0.01） vs 91.0±2.4％]であった。したがって、Dry sheetは難治性皮膚潰瘍の治療効果があることや、５日目、７日目という早い段階から治癒効果があることが明らかとなった。
また、他家細胞のDry sheetで治療した組織をHE染色及びAzan染色した結果を図５Ｅに示す。Dry sheet は、Azan染色で局在を確認可能であった。Dry sheetは表皮組織から脱落することなく、day 3以降は、形成された痂皮又は表皮組織の直下に存在していた。さらに、Dry sheetは9日目の切片では認められなかった。したがって、他家細胞のDry sheetは皮膚の創傷部に貼付け後、創傷部の上皮化の過程で脱落せずに表皮の下側に残り、9日目までに白血球などにより分解、吸収されたと考えられる。また、他家細胞のDry sheetは皮膚の創傷部に貼付け後、表皮から排除されないことは、貼付け後の乾燥細胞シートによる創傷部のバリア機能を発揮しているといえる。
［実施例６］
＜細胞シート貼付後30日目の創部組織像＞
実施例５で用いた各細胞シート貼付後30日目の創部組織像を調べた。結果を図６に示す。図６中、左が自家移植（自家の線維芽細胞から作製した細胞シートを用いた場合）、左が他家移植（他家／同種異系の線維芽細胞から作製した細胞シートを用いた場合）である。自家移植、他家移植ともにすべての細胞シート移植群において、無治療群と比較し、創傷治癒後の皮膚組織に異常所見は認められなかった。したがってDry sheetを貼付しても、創傷治癒後の皮膚組織に異常をきたすことはないことが確認された。
＜細胞シート貼付後30日目の創部組織像＞
実施例５で用いた各細胞シート貼付後30日目の創部組織像を調べた。結果を図６に示す。図６中、左が自家移植（自家の線維芽細胞から作製した細胞シートを用いた場合）、左が他家移植（他家／同種異系の線維芽細胞から作製した細胞シートを用いた場合）である。自家移植、他家移植ともにすべての細胞シート移植群において、無治療群と比較し、創傷治癒後の皮膚組織に異常所見は認められなかった。したがってDry sheetを貼付しても、創傷治癒後の皮膚組織に異常をきたすことはないことが確認された。
［実施例７］
＜Dry sheetに保持される成長因子又はサイトカインの保存安定性＞
実施例１と同様の方法で同日に作製したマウス線維芽細胞を用いた乾燥細胞シート（Dry sheet）を使用して、温度及び保存期間によるDry sheetに保持される成長因子又はサイトカインの安定性を検討した。Dry sheetを冷蔵（4℃）又は室温（23℃）で1日、1、2、4週間保存した後、10％FBS 含有CTSTM AIM-V（登録商標）培地に24時間浸漬し、その溶出液を-30℃で保存した。溶出液を融解後、実施例３と同様の方法でVEGF、HGF、FGF-2、及びHMGB1をELISA法で測定した（n=4）。結果を図７に示す。
＜Dry sheetに保持される成長因子又はサイトカインの保存安定性＞
実施例１と同様の方法で同日に作製したマウス線維芽細胞を用いた乾燥細胞シート（Dry sheet）を使用して、温度及び保存期間によるDry sheetに保持される成長因子又はサイトカインの安定性を検討した。Dry sheetを冷蔵（4℃）又は室温（23℃）で1日、1、2、4週間保存した後、10％FBS 含有CTSTM AIM-V（登録商標）培地に24時間浸漬し、その溶出液を-30℃で保存した。溶出液を融解後、実施例３と同様の方法でVEGF、HGF、FGF-2、及びHMGB1をELISA法で測定した（n=4）。結果を図７に示す。
図７から明らかなように、VEGF、HGFは温度や保存期間による有意な変動をほとんど示さなかった。また、FGF-2、HMGB1においては、4週間4℃保存した場合にほとんど変動は示さず、4週間の室温保存では徐々に溶出量は減少したものの、FGF-2に関しては４週間で１日と比較して50％程度、HMGB-1に関しては2週間で１日と比較して60％程度、4週間で25％程度も維持していた。
これらの結果から、冷蔵保存であれば少なくとも成長因子やサイトカインは4週間安定しており、室温保存であってもVEGF、HGF及びFGF-2は4週間安定、HMGB-1は2週間ほど安定であることが明らかとなった。また、乾燥細胞シートは細胞の生命活動が停止しており、成長因子やサイトカインの持続的な分泌はされない。しかしながら、上記結果より所定の条件で所定期間保存後も乾燥細胞シートに保持された成長因子やサイトカインを安定的に放出されることが明らかとなった。
＜糖尿病マウスの皮膚全層欠損モデルにおける創傷治癒効果＞
糖尿病マウスの皮膚全層欠損モデルを用い、上記冷蔵（４℃）で保存した乾燥細胞シートが創傷治癒効果を有するかどうかを調べた。
糖尿病マウスの皮膚全層欠損モデルを用い、上記冷蔵（４℃）で保存した乾燥細胞シートが創傷治癒効果を有するかどうかを調べた。
実施例５と同様の方法により糖尿病マウスを作製し、生検パンチを使用して背側に全層皮膚欠損を作製した。
マウスC3H / Heマウス（他家／同種異系）から単離した線維芽細胞を用いた乾燥細胞シート（Dry sheet）を上記と同様に４℃で１日（D1）又は４週（２８日：D28）保存した。１日ほど保存した乾燥細胞シート（D1 sheet）又は４週ほど保存した乾燥細胞シート（D28 sheet）はピンセットを用いて皮膚欠損部に貼付した。各細胞シート貼付日（Day 0）に、ADAPTIC（＃2012; Acelity社）及びDerma-aid（登録商標）（ALCARE社）で創傷部を保護し、Silkytex（＃11893; ALCARE社）で固定した。Day 1以降は、隔日にAirwall Fuwari（＃MA-E050-FT;共和社）で創傷部を保護し、Silkytex（＃11893; ALCARE社）で固定した。Day 0、1、3、及び5にデジタルカメラで直径10.5 mmの定規とともに創傷部を撮影した。結果を図８Ａに示す。また、ImageJソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所）を用いて創傷面積を測定した。創傷の閉鎖率は以下の式で求めた。
[ day X ]（％）= {1-（創傷部 [ day X ]/ 創傷部 [ day 0 ]）}×100
結果を図８Ｂ示す。
[ day X ]（％）= {1-（創傷部 [ day X ]/ 創傷部 [ day 0 ]）}×100
結果を図８Ｂ示す。
図８Ａ、Ｂから明らかなように、創傷の閉鎖率は、Day 3において無治療群（Control：乾燥細胞シートによる創傷部の保護なし）よりもD1 sheet及びD28 sheetでそれぞれ10.2%、15％上昇し、Day 5において無治療群（Control）よりもD1 sheet及びD28 sheetでそれぞれ19．4%、27.1％上昇した。したがって、4℃で4週間も保存した乾燥細胞シートであっても、難治性皮膚潰瘍の治療効果があることや、３日目、５日目という早い段階から治癒効果があることが明らかとなった。
［実施例９］
＜ヒトの細胞を用いた乾燥細胞シートの作製＞
上記まではマウスの線維芽細胞を培養して作製した細胞シート、乾燥細胞シート、凍結融解細胞シートを用いて解析を行ったが、ヒトの細胞についても解析を行った。
１）ヒト口腔内組織由来線維芽細胞の培養
凍結保存されている健常人（Ａ）から採取されたヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ａ株）を融解後、10% FBS含有CTSTM AIM-V（登録商標）培地を用いて大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で培養した。3日ごとに細胞継代を行い、細胞シートの作製に用いた。
２）ヒト間葉系幹細胞MSCの培養
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hBM-MSC）はLONZA社より購入し、添付文書に従って培養を行った。培地はMSCGM Bullet kit（LONZA社）を用いて大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で培養し、3日毎に培地交換した。６～７日間培養後、細胞継代を行った。５継代目まで継代を重ねて、細胞数を増やし、細胞シートの作製に用いた。
３）積層細胞シートの作製（線維芽細胞・間葉系幹細胞ともに共通）
積層細胞シートは、5％FBSを含有する等量のCTSTM AIM-V（登録商標）培地＋HFDM-1（+）（Cell Science＆Technology Institute社）混合培地を使用して、細胞を24 well plate（5.0×105/well）で播種し、大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で３日間インキュベートして作製した。インキュベート後、積層細胞シートを2ml / wellのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、500μl（10 PU / mL）のディスパーゼを使用して、大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で30分間インキュベートした。続いて、2ml / well のPBSで2回洗浄してliving sheetを得た。
＜ヒトの細胞を用いた乾燥細胞シートの作製＞
上記まではマウスの線維芽細胞を培養して作製した細胞シート、乾燥細胞シート、凍結融解細胞シートを用いて解析を行ったが、ヒトの細胞についても解析を行った。
１）ヒト口腔内組織由来線維芽細胞の培養
凍結保存されている健常人（Ａ）から採取されたヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ａ株）を融解後、10% FBS含有CTSTM AIM-V（登録商標）培地を用いて大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で培養した。3日ごとに細胞継代を行い、細胞シートの作製に用いた。
２）ヒト間葉系幹細胞MSCの培養
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hBM-MSC）はLONZA社より購入し、添付文書に従って培養を行った。培地はMSCGM Bullet kit（LONZA社）を用いて大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で培養し、3日毎に培地交換した。６～７日間培養後、細胞継代を行った。５継代目まで継代を重ねて、細胞数を増やし、細胞シートの作製に用いた。
３）積層細胞シートの作製（線維芽細胞・間葉系幹細胞ともに共通）
積層細胞シートは、5％FBSを含有する等量のCTSTM AIM-V（登録商標）培地＋HFDM-1（+）（Cell Science＆Technology Institute社）混合培地を使用して、細胞を24 well plate（5.0×105/well）で播種し、大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で３日間インキュベートして作製した。インキュベート後、積層細胞シートを2ml / wellのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、500μl（10 PU / mL）のディスパーゼを使用して、大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で30分間インキュベートした。続いて、2ml / well のPBSで2回洗浄してliving sheetを得た。
以上の過程で24 well plateから剥離されたLiving sheetを用いて、引き続き実施例１と同様の方法でDry sheet及びFT sheetを作製した。Dry sheetはピンセットでシリコン製の細胞シート台から容易に剥がすことが可能であった。Dry sheetは1.5mlのチューブ容器に移し、乾燥剤とともに冷蔵（4℃）又は室温（23℃）で保存した。ヒト口腔内組織由来線維芽細胞を用いた乾燥細胞シートの形態の写真及びＨＥ染色の結果を図９Ａに、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を用いた乾燥細胞シートの形態の写真及びHE染色の結果を図９Ｂに示す。図９Ａ及び図９Ｂから明らかなように、ヒトの細胞においてもマウスの細胞と同様に乾燥細胞シートを作製できることが確認された。なお、ヒト口腔内組織由来線維芽細胞を用いた乾燥細胞シート及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞を用いた乾燥細胞シートのいずれもピンセットで扱っても細胞シートの形状を維持できる強度を有しており、ハンドリングも容易であった。
＜ヒト由来細胞を用いた乾燥細胞シートから溶出する生理活性物質の測定＞
上記で作製したヒト口腔内組織由来線維芽細胞を用いた乾燥細胞シート及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞を用いた乾燥細胞シート（いずれもシート作製後１２時間室温で保存後の乾燥細胞シート）を200μlのDMEM培地を用いて、大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で24時間浸漬した。次に遠心分離（4℃、5000 rpm、5分）を行い、それぞれの上清を採取した。採取した上清は測定までは-30℃で保存した。上清中のVEGF、HGF、FGF-2及びHMGB1をELISA法で測定した。結果を図９Ｃに示す。さらに、上記健常人（Ａ）とは別の健常人（Ｂ）から採取されたヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ｂ株）を用いた乾燥細胞シートを上記と同じ方法で作製した。そして、その乾燥細胞シートを上記と同じ方法で浸漬、遠心分離、上清採取し、その上清中のVEGF、HGF、FGF-2及びHMGB1をELISA法で測定した。結果を図９Ｄに示す。なお、ヒトのFGF-2及びHMGB1は分泌シグナル配列がないため、生細胞ではほとんど細胞外(上清中)に分泌されないタンパク質であり、VEGF及びHGFは分泌シグナル配列を有しているため、生細胞でも細胞外（上清中）に分泌されるタンパク質である。
上記で作製したヒト口腔内組織由来線維芽細胞を用いた乾燥細胞シート及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞を用いた乾燥細胞シート（いずれもシート作製後１２時間室温で保存後の乾燥細胞シート）を200μlのDMEM培地を用いて、大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で24時間浸漬した。次に遠心分離（4℃、5000 rpm、5分）を行い、それぞれの上清を採取した。採取した上清は測定までは-30℃で保存した。上清中のVEGF、HGF、FGF-2及びHMGB1をELISA法で測定した。結果を図９Ｃに示す。さらに、上記健常人（Ａ）とは別の健常人（Ｂ）から採取されたヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ｂ株）を用いた乾燥細胞シートを上記と同じ方法で作製した。そして、その乾燥細胞シートを上記と同じ方法で浸漬、遠心分離、上清採取し、その上清中のVEGF、HGF、FGF-2及びHMGB1をELISA法で測定した。結果を図９Ｄに示す。なお、ヒトのFGF-2及びHMGB1は分泌シグナル配列がないため、生細胞ではほとんど細胞外(上清中)に分泌されないタンパク質であり、VEGF及びHGFは分泌シグナル配列を有しているため、生細胞でも細胞外（上清中）に分泌されるタンパク質である。
図９Ｃから明らかなように、FGF-2はヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ａ株）を用いた乾燥細胞シートの場合におよそ８０００pg/mL、骨髄由来間葉系幹細胞を用いた乾燥細胞シートの場合におよそ１８００pg/mLも検出された。一方、Living sheetやFT sheetではほとんど検出されなかった。また、HGFにおいて、ヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ａ株）を用いた乾燥細胞シートの場合は培養上清又はLiving cellの２倍程度検出されていた。なお、上記上清中のFGF-2は、乾燥細胞シート0.31cm2を0.2mLの上清に溶解して測定していることから、乾燥細胞シートあたりのFGF-2溶出量としては、ヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ａ株）を用いた乾燥細胞シートの場合はおよそ5200pg/cm2、骨髄由来間葉系幹細胞を用いた乾燥細胞シートの場合にはおよそ1200pg/cm2となる。
また、図９Ｄから明らかなように、FGF-2はヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ｂ株）を用いた乾燥細胞シートの場合におよそ１４５００pg/mLも検出された。一方、Living sheetやFT sheetではほとんど検出されなかった。また、HGFにおいて、ヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ｂ株）を用いた乾燥細胞シートの場合は培養上清又はLiving cellの２．５倍程度検出されていた。なお、上記上清中のFGF-2は、乾燥細胞シート0.31cm2を0.2mLの上清に溶解して測定していることから、乾燥細胞シートあたりのFGF-2溶出量としては、およそ9400pg/cm2となる。
図９Ｃ、Ｄの結果より、ヒトの線維芽細胞や間葉系幹細胞から作製した乾燥細胞シートにおいても、培地に浸すと細胞膜が壊れ、細胞内に貯蔵されているFGF-2及びHMGB1が放出されることが確認された。
［実施例１０］
＜ヒトの細胞を用いた乾燥細胞シートからの溶出液の生理活性＞
上記実施例９で作製した、健常人（Ｂ）から採取されたヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ｂ株）を用いた乾燥細胞シートを200μlのDMEM培地を用いて、大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で24時間浸漬した。次に遠心分離（4℃、5000 rpm、5分）を行い、それぞれの上清を採取した。次に、上記採取した上清（溶出液）とDMEM培地の混合液(1:4)100μLをヒト皮膚由来線維芽細胞又はヒト血管内皮細胞の懸濁液(2×104 cell/mL,100μL)にそれぞれ添加して37℃で48時間培養後、細胞増殖比を測定した。コントロールとして上記混合液の代わりにDMEM100μLを用いた。結果を図１０Ａに示す。図１０Ａの左はヒト皮膚由来線維芽細胞に添加した場合、右は血管内皮細胞に添加した場合である。縦軸はDMEMを用いた場合を１とした場合の相対比である。
＜ヒトの細胞を用いた乾燥細胞シートからの溶出液の生理活性＞
上記実施例９で作製した、健常人（Ｂ）から採取されたヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ｂ株）を用いた乾燥細胞シートを200μlのDMEM培地を用いて、大気酸素状態（37℃、5％CO2、20％O2）で24時間浸漬した。次に遠心分離（4℃、5000 rpm、5分）を行い、それぞれの上清を採取した。次に、上記採取した上清（溶出液）とDMEM培地の混合液(1:4)100μLをヒト皮膚由来線維芽細胞又はヒト血管内皮細胞の懸濁液(2×104 cell/mL,100μL)にそれぞれ添加して37℃で48時間培養後、細胞増殖比を測定した。コントロールとして上記混合液の代わりにDMEM100μLを用いた。結果を図１０Ａに示す。図１０Ａの左はヒト皮膚由来線維芽細胞に添加した場合、右は血管内皮細胞に添加した場合である。縦軸はDMEMを用いた場合を１とした場合の相対比である。
さらに、上記溶出液とDMEM培地の混合液(1:4)に抗FGF-2抗体を加えて、中和処理した溶出液を調製した。そして、上記の溶出液(100μL)、コントロール抗体で中和処理した溶出液(100μL)をそれぞれヒト血管内皮細胞の懸濁液(2×104cell/mL,100μL)に添加し、48時間培養後の細胞増殖比を測定した。コントロールとして上記混合液の代わりにDMEM100μLを用いた。抗体添加なし、かつrFGF-2添加なしのDMEMで培養した血管内皮細胞の細胞増殖率を１とした場合の相対比でそれぞれの細胞増殖率を算出した。数値は平均値±標準偏差で表した（**: P<0.01）。用いたrFGF-2、抗FGF-2抗体、及びコントロール抗体は実施例４に記載と同じ方法で行った。結果を図１０Ｂに示す。
図１０Ａの結果より、ヒト皮膚由来線維芽細胞、ヒト血管内皮細胞ともにヒト口腔内組織由来線維芽細胞を用いた乾燥細胞シートからの溶出液を添加した場合には、添加しなかった場合（DMEM）と比較して有意に細胞増殖が認められた。また、図１０Ｂの結果より、抗FGF-2抗体による中和処理により細胞増殖が有意に阻害され、血管内皮細胞の増殖には乾燥細胞シートからのFGF-2が作用していることが確認された。
［実施例１１］
＜Dry sheetに保持される成長因子又はサイトカインの保存安定性＞
実施例９で作製したヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ｂ株）を用いた乾燥細胞シート（Dry sheet）を使用して、温度及び保存期間によるDry sheetに保持される成長因子又はサイトカインの安定性を検討した。Dry sheetを冷蔵（4℃）又は室温（23℃）で３ヶ月保存した後、DMEM培地200μLに37℃で24時間浸漬し、遠心分離（5000 rpm、4℃、3分）を行って上清を回収して、上記乾燥細胞シートの溶出液とし、-80℃で保存した。溶出液を融解後、実施例９と同様の方法でVEGF、HGF、FGF-2、及びHMGB1をELISA法で測定した（n=6）。結果を図１１に示す。
［実施例１１］
＜Dry sheetに保持される成長因子又はサイトカインの保存安定性＞
実施例９で作製したヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ｂ株）を用いた乾燥細胞シート（Dry sheet）を使用して、温度及び保存期間によるDry sheetに保持される成長因子又はサイトカインの安定性を検討した。Dry sheetを冷蔵（4℃）又は室温（23℃）で３ヶ月保存した後、DMEM培地200μLに37℃で24時間浸漬し、遠心分離（5000 rpm、4℃、3分）を行って上清を回収して、上記乾燥細胞シートの溶出液とし、-80℃で保存した。溶出液を融解後、実施例９と同様の方法でVEGF、HGF、FGF-2、及びHMGB1をELISA法で測定した（n=6）。結果を図１１に示す。
図１１から明らかなように、ヒト口腔内組織由来線維芽細胞（Ｂ株）を用いた乾燥細胞シートにも、VEGFは温度や保存期間による有意な変動を示さず、HGFは4℃では有意な変動を示さず、23℃でもコントロールと比較して減少率が36．3％であった。また、FGF-2、HMGB1のいずれも、3ヶ月もの長期間4℃保存した場合には有意な変動は示さず、23℃で保存した場合には溶出量は減少したものの、FGF-2ではコントロールと比較して減少率が9.8%、HMGB-1では29．8％程度にとどまっていた。
これらの結果から、冷蔵保存であれば少なくとも成長因子やサイトカインは3ヶ月安定しており、23℃保存であってもVEGFは3ヶ月安定であり、HGF、FGF-2、及びHMGB-1も少なくとも60％程度は維持していることが明らかとなった。上記結果よりヒトの細胞から得られた乾燥細胞シートは3ヶ月もの長期間保存後も乾燥細胞シートに保持された成長因子やサイトカインを安定的に放出されることが明らかとなった。
［実施例１２］
＜乾燥条件の検討＞
実施例１では風乾で行ったが、乾燥について他の様々な方法で検討を行った。乾燥方法としては、風乾（送風乾燥）、加温送風乾燥、真空乾燥、凍結乾燥、化学乾燥を行った。
＜乾燥条件の検討＞
実施例１では風乾で行ったが、乾燥について他の様々な方法で検討を行った。乾燥方法としては、風乾（送風乾燥）、加温送風乾燥、真空乾燥、凍結乾燥、化学乾燥を行った。
実施例１と同様の方法で作製したLiving sheetをピペット法でシリコンシート上に移し、可能な限りPBSを除去した後にそれぞれの乾燥方法を実施した。
１．加温送風乾燥
プレートヒーターで45℃に加温し、送風3m/sの条件下で30分ほど乾燥させた。
２．真空乾燥（AVO-310NS(ETTAS社)
庫内の温度を30℃に設定し、真空ポンプで庫内の圧力を500mTorr以下に減圧した。真空ポンプを4時間作動させて乾燥させた。乾燥処理後にゆっくり加圧して真空を解除した。
３．凍結乾燥（Freeze dry:FD GENESIS 25XL-3(VirTis社）
凍結（3時間）：庫内の温度を室温から-40℃に冷却した。
一次乾燥（４時間）：真空ポンプで庫内の圧力を500mTorr以下に減圧した。
二次乾燥（O/N 16時間）：庫内の圧力を維持したまま、庫内の温度を-40℃から-20℃までゆっくり復温させた。
真空解除（1時間）：ゆっくり加圧して真空を解除した。
４．化学乾燥
細胞シートに2-プロパノールを滴下し、自然乾燥させた。
１．加温送風乾燥
プレートヒーターで45℃に加温し、送風3m/sの条件下で30分ほど乾燥させた。
２．真空乾燥（AVO-310NS(ETTAS社)
庫内の温度を30℃に設定し、真空ポンプで庫内の圧力を500mTorr以下に減圧した。真空ポンプを4時間作動させて乾燥させた。乾燥処理後にゆっくり加圧して真空を解除した。
３．凍結乾燥（Freeze dry:FD GENESIS 25XL-3(VirTis社）
凍結（3時間）：庫内の温度を室温から-40℃に冷却した。
一次乾燥（４時間）：真空ポンプで庫内の圧力を500mTorr以下に減圧した。
二次乾燥（O/N 16時間）：庫内の圧力を維持したまま、庫内の温度を-40℃から-20℃までゆっくり復温させた。
真空解除（1時間）：ゆっくり加圧して真空を解除した。
４．化学乾燥
細胞シートに2-プロパノールを滴下し、自然乾燥させた。
乾燥処理後の各細胞シートを24 well plateに置いた状態の写真、及びHE染色を行い、その断面を顕微鏡観察した結果を図１２Ａに示す。いずれの乾燥方法においても風乾と同様に乾燥細胞シートが形成されることが確認された。
また、風乾（送風乾燥）、加温送風乾燥、真空乾燥、凍結乾燥、化学乾燥した乾燥細胞シートを10％FBS 含有CTSTM AIM-V（登録商標）培地に24時間浸漬し、その溶出液中のVEGF、HGF、FGF-2及びHMGB1の濃度を、実施例３と同様の方法で調べた結果を図１２Ｂに示す。図１２Ｂから明らかなように、乾燥方法によるVEGF、HGF、FGF-2及びHMGB1の溶出の差はほとんどみられず、乾燥方法は風乾に限らず、他の方法によってもVEGF、HGF、FGF-2及びHMGB1が溶出することが確認された。
［実施例１３］
上記実施例により、本発明の乾燥細胞シートはFGF-2を溶出しやすいことが明らかとなった。そこで、細胞によるFGF-2の含有量の違いを調べた。
上記実施例により、本発明の乾燥細胞シートはFGF-2を溶出しやすいことが明らかとなった。そこで、細胞によるFGF-2の含有量の違いを調べた。
ヒトの口腔組織由来の線維芽細胞（Human Oral Fibroblasts:HOF）、ヒトの皮膚由来の線維芽細胞（Human Dermal Fibroblasts:HDF）、ヒトの歯髄幹細胞（Human Dental Pulp Stem cells:DPSC）、ヒトの骨髄由来の間葉系幹細胞（Human Mesenchymal Stem Cells:MSC）、ヒトの臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells:HUVEC）、ヒトの骨格筋芽細胞（Human Skeltal Muscle Myoblast Cells:SkMM）、ヒト表皮ケラチノサイト（Human Epidermal Keratinocytes:HEK）、のそれぞれ５×１０５細胞を200μLのDMEMに懸濁し、凍結融解を2回繰り返して細胞膜を破壊し、細胞内容物を溶出させた。遠心分離後に上清を回収し、FGF-2、HGF及びVEGFの含有量をELISA法によって測定した。総タンパク質濃度はウシアルブミンをスタンダードとして、Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit (23200; Thermo Fisher Scientific社)で測定した。そして、乾燥細胞シートから溶出されたFGF-2量、HGF量及びVEGF量（pg）は、総タンパク質１μgあたりで算出した（pg/μg）。結果を図１３に示す。
図１３から明らかなように、FGF-2は口腔組織由来の線維芽細胞、皮膚由来の線維芽細胞、歯髄幹細胞及び骨髄由来の間葉系幹細胞、において多く含まれ、次いで臍帯静脈内皮細胞や骨格筋芽細胞で多く含まれ、表皮ケラチノサイトにはほとんど含まれていないことが確認された。また、HGFは間葉系幹細胞や口腔組織由来の線維芽細胞に多く含まれていることが確認された。さらに、VEGFは間葉系幹細胞に多く含まれ、次いで歯髄幹細胞、表皮ケラチノサイトに含まれていることが確認された。したがって本発明の乾燥細胞シートを作製するにあたって、線維芽細胞、歯髄幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、骨格筋芽細胞、特に線維芽細胞、歯髄幹細胞、間葉系幹細胞が好ましいこと、表皮ケラチノサイトを用いてもFGF-2の溶出がほとんど期待できないことが明らかとなった。
［実施例１４］
＜乾燥細胞シートから溶出されるFGF-2量＞
ヒトの口腔組織由来の線維芽細胞（Human Oral Fibroblasts:HOF）、ヒト歯髄幹細胞（Human Dental Pulp Stem cells:DPSC）、ヒトの骨髄由来の間葉系幹細胞（Human Mesenchymal Stem Cells:MSC）それぞれの細胞を用いて、実施例９に記載の方法で乾燥細胞シートを作製した。その乾燥細胞シートを200μLのDMEMに浸し、24時間インキュベート（37℃、5％CO2、20％O2）した。遠心分離後に上清を回収し、FGF-2、HGF及びVEGFの濃度をELISA法で測定した。総タンパク質濃度は実施例１３に記載の方法で算出した（pg/μg）。結果を図１４に示す。
＜乾燥細胞シートから溶出されるFGF-2量＞
ヒトの口腔組織由来の線維芽細胞（Human Oral Fibroblasts:HOF）、ヒト歯髄幹細胞（Human Dental Pulp Stem cells:DPSC）、ヒトの骨髄由来の間葉系幹細胞（Human Mesenchymal Stem Cells:MSC）それぞれの細胞を用いて、実施例９に記載の方法で乾燥細胞シートを作製した。その乾燥細胞シートを200μLのDMEMに浸し、24時間インキュベート（37℃、5％CO2、20％O2）した。遠心分離後に上清を回収し、FGF-2、HGF及びVEGFの濃度をELISA法で測定した。総タンパク質濃度は実施例１３に記載の方法で算出した（pg/μg）。結果を図１４に示す。
いずれのヒトの細胞においても、FGF-2が乾燥細胞シートから溶出されていることが確認された。さらに、HGFやVEGFも乾燥細胞シートから溶出されていることが確認された。通常FGF-2は細胞が生きた状態では細胞外へ分泌することも溶出することもないが、本発明の乾燥細胞シートとすることで効率よくFGF-2を細胞外へ溶出でき、細胞シートにおける創傷治癒効果を向上していることが示された。
［実施例１５］
＜細胞シート溶出液による線維芽細胞の細胞増殖＞
実施例４ではマウスの線維芽細胞から作製した乾燥細胞シートの溶出液による線維芽細胞の増殖を調べたが、上記実施例１４で使用したヒトの細胞（HOF、DPSC、MSC）から作製した乾燥細胞シートの溶出液の生理活性を、血管内皮細胞の増殖で評価した。
＜細胞シート溶出液による線維芽細胞の細胞増殖＞
実施例４ではマウスの線維芽細胞から作製した乾燥細胞シートの溶出液による線維芽細胞の増殖を調べたが、上記実施例１４で使用したヒトの細胞（HOF、DPSC、MSC）から作製した乾燥細胞シートの溶出液の生理活性を、血管内皮細胞の増殖で評価した。
内皮細胞増殖培地（EGM）2（C-22011：PromoCell社）で血管内皮細胞の懸濁液(2×104 cells/mL)を調製し、100uLずつ播種した。次に実施例１４で調製した、HOF、DPSC、及びMSC各乾燥細胞シートの溶出液（20%）を100uLずつ添加した（溶出液の終濃度は10%）。コントロールにはDMEM 100uLを添加した。そして、48時間培養後に、生細胞数アッセイ（WST-8試薬）を用いて細胞増殖を比較した。結果を図１５に示す。
HOF、DPSC、及びMSCで作製した乾燥細胞シートの溶出液はコントロール（DMEM）に比べ有意な細胞増殖が確認された。すなわち、HOF、DPSC、MSCで作製した乾燥細胞シートの溶出液は生理活性を有することが示された。
［実施例１６］
＜乾燥細胞シートによる生体内の手術部位の組織の補強＞
食道縫合部に対して乾燥細胞シートを移植することで創傷治癒の促進及び組織の補強効果が得られるのかを検証した。
＜乾燥細胞シートによる生体内の手術部位の組織の補強＞
食道縫合部に対して乾燥細胞シートを移植することで創傷治癒の促進及び組織の補強効果が得られるのかを検証した。
実施例１においてマウスの線維芽細胞を用いた代わりにラット(Wister/ST、10週齢、オス)の口腔組織由来の線維芽細胞を用い、単離した線維芽細胞を10%FBS含有DMEM培地で培養した。細胞シート作製時の１日目は10%FBS含有DMEM培地で培養し、翌日に上記FBS含有AIM-V+HFDM-1培地に入れ替えた以外は同様の方法で乾燥細胞シートを作製した。
・食道縫合モデルの作製
以下の方法で食道縫合モデルを作製した。
（１）イソフルランによる吸入麻酔下にラット(Wister/ST、10週齢、オス)を仰臥位とし、頸部を伸展させて台に固定した。
（２）頸部を剃毛し、頸部に2cmの縦切開を行った。気管と食道を周囲の組織から剥離し、気管と食道を分離させた。食道を気管の前方に引き出し、クリップで固定した。食道の幅は約3mmであった。
（３）縫合は顕微鏡下で行った。食道を第9～10気管軟骨レベルで切離し、7-0非吸収糸を用いて4針で縫合した。まず側壁に1針ずつ、次に前壁に1針、最後に食道を反転させて1針の計4針で縫合した。縫合は等間隔となるようにした。また、内腔が狭窄していないことを確認した。
（４）食道を気管の後方に戻し、筋肉、皮下組織及び皮膚をそれぞれ縫合した。
以下の方法で食道縫合モデルを作製した。
（１）イソフルランによる吸入麻酔下にラット(Wister/ST、10週齢、オス)を仰臥位とし、頸部を伸展させて台に固定した。
（２）頸部を剃毛し、頸部に2cmの縦切開を行った。気管と食道を周囲の組織から剥離し、気管と食道を分離させた。食道を気管の前方に引き出し、クリップで固定した。食道の幅は約3mmであった。
（３）縫合は顕微鏡下で行った。食道を第9～10気管軟骨レベルで切離し、7-0非吸収糸を用いて4針で縫合した。まず側壁に1針ずつ、次に前壁に1針、最後に食道を反転させて1針の計4針で縫合した。縫合は等間隔となるようにした。また、内腔が狭窄していないことを確認した。
（４）食道を気管の後方に戻し、筋肉、皮下組織及び皮膚をそれぞれ縫合した。
・食道縫合部への乾燥線維芽細胞シートの移植
上記食道縫合モデルの作製の(３)の後に、自家の口腔粘膜由来の線維芽細胞から作製した乾燥細胞シートを縫合部の後壁、前壁の順に合計2枚移植した。この時、側壁にも乾燥細胞シートを被せ、縫合部の全周が覆われるようにした。乾燥細胞シートは鑷子を用いて移植した。食道を反転させる際や気管の後方へ戻す際に乾燥細胞シートが縫合部から移動することが危惧されたため、開創器を用いて移植した乾燥細胞シートが周囲組織へ接着することを防止した。また、乾燥細胞シート移植後に5分間待つことで細胞シートが十分に接着するようにした。移植後は上記食道縫合モデルの作製の(４)と同様の操作を行った。コントロール群(食道の切離・縫合のみ)と乾燥細胞シート群(食道の切離・縫合に加えて乾燥細胞シートを2枚移植)の2群に分けて検討した。それぞれを術後3日目と5日目に犠牲死させた。食道縫合モデル及び乾燥細胞シートの移植のイメージを図１６Ａに示す。
上記食道縫合モデルの作製の(３)の後に、自家の口腔粘膜由来の線維芽細胞から作製した乾燥細胞シートを縫合部の後壁、前壁の順に合計2枚移植した。この時、側壁にも乾燥細胞シートを被せ、縫合部の全周が覆われるようにした。乾燥細胞シートは鑷子を用いて移植した。食道を反転させる際や気管の後方へ戻す際に乾燥細胞シートが縫合部から移動することが危惧されたため、開創器を用いて移植した乾燥細胞シートが周囲組織へ接着することを防止した。また、乾燥細胞シート移植後に5分間待つことで細胞シートが十分に接着するようにした。移植後は上記食道縫合モデルの作製の(４)と同様の操作を行った。コントロール群(食道の切離・縫合のみ)と乾燥細胞シート群(食道の切離・縫合に加えて乾燥細胞シートを2枚移植)の2群に分けて検討した。それぞれを術後3日目と5日目に犠牲死させた。食道縫合モデル及び乾燥細胞シートの移植のイメージを図１６Ａに示す。
・縫合不全の発生率
術後３日目（Day3）及び５日目（Day5）における縫合不全又は死亡の発生を調べた。結果を図１６Ｂに示す。術後３日目、５日目共に、乾燥細胞シート群（Dry）ではコントロール（Control）と比較して縫合不全の発生率が極めて低いことが確認された。
術後３日目（Day3）及び５日目（Day5）における縫合不全又は死亡の発生を調べた。結果を図１６Ｂに示す。術後３日目、５日目共に、乾燥細胞シート群（Dry）ではコントロール（Control）と比較して縫合不全の発生率が極めて低いことが確認された。
・縫合部付近の膿瘍
さらに、縫合部付近の膿瘍の程度を以下の表１に示すAbscess score（Verco, S. J. S. et al. Development of a novel glucose polymer solution (icodextrin) for adhesion prevention: Pre-clinical studies. Hum. Reprod. 15, 1764-1772 (2000).）に基づいて評価した。結果を図１６Ｃに示す。
さらに、縫合部付近の膿瘍の程度を以下の表１に示すAbscess score（Verco, S. J. S. et al. Development of a novel glucose polymer solution (icodextrin) for adhesion prevention: Pre-clinical studies. Hum. Reprod. 15, 1764-1772 (2000).）に基づいて評価した。結果を図１６Ｃに示す。
図１６Ｃより、乾燥細胞シート群では、膿瘍の程度が軽いことが確認された。
・縫合部の耐圧能
術後3日目と5日目に犠牲死させ、食道を気管及び周囲組織と一括に採取した。耐圧能を評価するために、腹部食道から24Gサーフローを挿入し、食道の肛門側及び口側を4-0ナイロン糸で結紮した。24Gサーフローにアネロイド式圧力計を接続し、10mLシリンジを使用して加圧した。耐圧能にはBurst pressureを採用した。Burst pressureは食道を生理食塩水中に沈め、縫合部から空気が漏れ出た時の圧と定義した。結果を図１６Ｄに示す。
術後3日目と5日目に犠牲死させ、食道を気管及び周囲組織と一括に採取した。耐圧能を評価するために、腹部食道から24Gサーフローを挿入し、食道の肛門側及び口側を4-0ナイロン糸で結紮した。24Gサーフローにアネロイド式圧力計を接続し、10mLシリンジを使用して加圧した。耐圧能にはBurst pressureを採用した。Burst pressureは食道を生理食塩水中に沈め、縫合部から空気が漏れ出た時の圧と定義した。結果を図１６Ｄに示す。
図１６Ｄより、縫合後５日目にはコントール群のBurst pressureは164.6mmHgだったのに対して、乾燥細胞シート群のBurst pressureは221.7mmHgであった。したがって、乾燥細胞シートを移植することによって、縫合部が補強されていることが確認された。
・縫合部の組織学的評価
術後3日目と5日目に採取した食道をAzan染色で評価した。Azan染色の標本において、縫合部を中心にして3000μm（前後1500μmずつ）の範囲でImageJソフトを用いてRGBに分離してBlueの領域（Azan染色陽性：膠原繊維）の面積を求めた。Azan染色の写真を図１６Ｅに、Azan染色陽性の面積を図１６Ｆに示す。図１６Ｅ中、矢印は縫合した部位を示し、図の上側が粘膜側（内腔側）である。
術後3日目と5日目に採取した食道をAzan染色で評価した。Azan染色の標本において、縫合部を中心にして3000μm（前後1500μmずつ）の範囲でImageJソフトを用いてRGBに分離してBlueの領域（Azan染色陽性：膠原繊維）の面積を求めた。Azan染色の写真を図１６Ｅに、Azan染色陽性の面積を図１６Ｆに示す。図１６Ｅ中、矢印は縫合した部位を示し、図の上側が粘膜側（内腔側）である。
図１６Ｅ、Ｆより、コントロールと比較して、乾燥細胞シート群(Dry)のDay5には膠原線維が縫合部に多くあり、膠原線維によって縫合部の組織を補強していることが確認された。
・縫合部の遺伝子発現解析
術後3日目と5日目に採取した食道の縫合部において発現している遺伝子を評価した。縫合部を中心に食道を3mm切り出し、組織からRNase Miniキット（Qiagen社）を用いてtotal RNA抽出し、nanodrop（Thermo Fisher Scientific社）を用いて定量した後、PrimeScript Reverse Transcriptase（タカラバイオ社）でcDNAを合成し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行った。PCRは、SYBRTM Select Master Mix（Thermo Fisher Scientific社）及びStepOnePlusTM（Thermo Fisher Scientific社）を用いて実施した。PCRは50℃ 2分、95℃ 2分、95℃ 3秒、60℃ 30秒の40サイクルで行った。すべての反応は10μLの反応容量で三重測定により行った。mRNA発現量は2-ΔCT法で測定した。測定項目は、コラーゲンタイプI(COL1)、コラーゲンタイプIII(COL3)、VEGFとした。内在性コントロールとしてβ-アクチンを用いて補正した。結果を図１６Ｇに示し、用いたプライ-マーを表２に示す。
術後3日目と5日目に採取した食道の縫合部において発現している遺伝子を評価した。縫合部を中心に食道を3mm切り出し、組織からRNase Miniキット（Qiagen社）を用いてtotal RNA抽出し、nanodrop（Thermo Fisher Scientific社）を用いて定量した後、PrimeScript Reverse Transcriptase（タカラバイオ社）でcDNAを合成し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行った。PCRは、SYBRTM Select Master Mix（Thermo Fisher Scientific社）及びStepOnePlusTM（Thermo Fisher Scientific社）を用いて実施した。PCRは50℃ 2分、95℃ 2分、95℃ 3秒、60℃ 30秒の40サイクルで行った。すべての反応は10μLの反応容量で三重測定により行った。mRNA発現量は2-ΔCT法で測定した。測定項目は、コラーゲンタイプI(COL1)、コラーゲンタイプIII(COL3)、VEGFとした。内在性コントロールとしてβ-アクチンを用いて補正した。結果を図１６Ｇに示し、用いたプライ-マーを表２に示す。
図１６Ｇより、乾燥細胞シート群ではDay3、Day5共にコントロールと比較してコラーゲンI及びIIIの発現が高い傾向があった。また、VEGFの発現も特にDay3で発現が高い傾向があった。したがって、乾燥細胞シート群は縫合部の創傷治癒を促進していることが確認された。
上記図１６Ａ～１６Ｇにおける組織学的及び機能学的評価により、上記乾燥細胞シートは創傷治癒の促進及び膠原繊維の増生を促して縫合部の組織を補強し、縫合不全の発生を予防することが明らかになった。
［実施例１７］
生体内に乾燥細胞シートを用いるには、乾燥細胞シート自体の安全性を検討する必要がある。また、乾燥細胞シートは細胞膜が損傷した死細胞であるため、成長因子以外にも、ダメージ関連分子パターン（DAMPs）を代表するHMGB1を放出する。ここで、HMGB1は自然免疫系を介して炎症を促進するため、強い炎症を引き起こし、遷延する可能性が懸念される。そこで、生体組織の物理的補強を目的として広く外科手術において使用される不織布シートと共に、マウスの皮下組織下への乾燥細胞シートを移植した場合の炎症反応や組織学的評価を行った。
［実施例１７］
生体内に乾燥細胞シートを用いるには、乾燥細胞シート自体の安全性を検討する必要がある。また、乾燥細胞シートは細胞膜が損傷した死細胞であるため、成長因子以外にも、ダメージ関連分子パターン（DAMPs）を代表するHMGB1を放出する。ここで、HMGB1は自然免疫系を介して炎症を促進するため、強い炎症を引き起こし、遷延する可能性が懸念される。そこで、生体組織の物理的補強を目的として広く外科手術において使用される不織布シートと共に、マウスの皮下組織下への乾燥細胞シートを移植した場合の炎症反応や組織学的評価を行った。
＜生体内での炎症反応＞
乾燥細胞シート群（n=3）としては、実施例５で作製した他家（雄のC3H / Heマウス（他家／同種異系）から単離した線維芽細胞による乾燥細胞シートを用いた。また、不織布シート群（n=3）としては、ポリグリコール酸(PGA)不織布シート（商品名「ネオベール ナノ（登録商標）Ｄ５タイプ」：グンゼ社）を用いた。それぞれのシートをC57BL/6マウス皮下組織下（皮筋と骨格筋の間）に移植した。コントロール群（n=3）としてはシートの移植はなく、一旦皮下組織を剥離後、再びそのまま戻す施術を行った。
乾燥細胞シート群（n=3）としては、実施例５で作製した他家（雄のC3H / Heマウス（他家／同種異系）から単離した線維芽細胞による乾燥細胞シートを用いた。また、不織布シート群（n=3）としては、ポリグリコール酸(PGA)不織布シート（商品名「ネオベール ナノ（登録商標）Ｄ５タイプ」：グンゼ社）を用いた。それぞれのシートをC57BL/6マウス皮下組織下（皮筋と骨格筋の間）に移植した。コントロール群（n=3）としてはシートの移植はなく、一旦皮下組織を剥離後、再びそのまま戻す施術を行った。
次に、移植後12、24、48、72時間にMPO活性検出試薬（IVISbrite MPO 425:PerkinElmer社）を腹腔内投与し、IVIS SpectrumBL（PerkinElmer社）で、投与5分後から5分間露光させ、MPO活性による発光を検出した。さらに、Living Image 4.7.3 Softwareでデータを解析し、シート移植部位のMPO活性を比較した。in vivoイメージング解析の結果を図１７Ａに、MPO活性を調べた結果を図１７Ｂに示す。
図１７Ａ、図１７Ｂより、他家の乾燥細胞シート（Dry）に対する炎症反応は弱く、炎症が早期に消退した。一方、ＰＧＡ不織布シート（PGA）に対する炎症反応は強く、48時間後には低下したが、弱い炎症反応が持続していた。
＜シート移植後の組織学的評価＞
乾燥細胞シート（C3H/He）移植群（Dry）、PGAシート移植群（PGA）、Control群の3群に分けて、C57BL/6マウスの皮下にシートを移植した。移植後1、3、7、14、21日後に組織を採取し、組織標本とした。各標本のHE染色および免疫染色(MPO：活性化好中球、F4/80：成熟マクロファージ)で比較検討した。各標本のHE染色及び免疫染色の結果を図１７Ｃに示す。
乾燥細胞シート（C3H/He）移植群（Dry）、PGAシート移植群（PGA）、Control群の3群に分けて、C57BL/6マウスの皮下にシートを移植した。移植後1、3、7、14、21日後に組織を採取し、組織標本とした。各標本のHE染色および免疫染色(MPO：活性化好中球、F4/80：成熟マクロファージ)で比較検討した。各標本のHE染色及び免疫染色の結果を図１７Ｃに示す。
図１７Ｃより、乾燥細胞シートを移植した場合の移植直後の好中球性炎症は弱く、マクロファージによって緩やかに分解を受けることが組織学的に示唆された。そのため、生体内に乾燥細胞シートを移植しても有害な副作用はないと考えられる。なお、ＰＧＡシートを用いた場合には１２時間後に強い炎症反応が見られ、さらに３日目以降にはマクロファージやマクロファージが融合して形成される異物巨細胞がみられ、乾燥細胞シートを用いた場合と比較して生体内での異物反応が強いことが確認された。
本発明は、細胞シートが適用される創傷治癒、手術部位の組織の補強や、移植分野、生体移植医療分野に利用可能である。
Claims (10)
- 生体から採取されたＦＧＦ－２発現細胞を培養基材上で培養して細胞シートを得る工程（ａ）；及び
前記工程（ａ）で得られた細胞シートを構成する細胞の増殖能が失われるまで前記細胞シートを乾燥処理する工程（ｂ）；
によって作製された乾燥細胞シートであって、
前記工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液における総タンパク質１μｇあたりのＦＧＦ－２の量が、５ｐｇ/μｇ以上であることを特徴とする、前記乾燥細胞シート。 - 工程（ａ）で培養する細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１又は２種以上の細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の乾燥細胞シート。
- 工程（ａ）で培養する細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１種のみの細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の乾燥細胞シート。
- 乾燥処理後の厚さが１５μｍ以上の積層化乾燥細胞シートであることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の乾燥細胞シート。
- 工程（ａ）において、培養基材上で培養して得られた細胞シートを、前記培養基材から剥離した後に、細胞の増殖能が失われるまで乾燥させることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の乾燥細胞シート。
- 創傷の被覆若しくは手術部位の組織の補強に使用される、請求項１～３のいずれかに記載の乾燥細胞シート。
- 生体内の創傷の被覆若しくは生体内の手術部位の組織の補強に使用される、請求項６に記載の乾燥細胞シート。
- 生体内の手術によって生じた肺切除時の気管支断端、消化管吻合時の吻合部、肝若しくは膵切離時の断端の補強に使用される、請求項７に記載の乾燥細胞シート。
- 生体から採取されたＦＧＦ－２発現細胞を培養基材上で培養して細胞シートを得る工程（ａ）；及び
前記工程（ａ）で得られた細胞シートを構成する細胞の増殖能が失われるまで前記細胞シートを乾燥処理する工程（ｂ）；
を備えた乾燥細胞シートの作製方法であって、
前記工程（ｂ）の乾燥処理によって得られた乾燥細胞シートを溶液に２４時間浸漬させた場合の前記溶液における総タンパク質１μｇあたりのＦＧＦ－２の量が、５ｐｇ/μｇ以上であることを特徴とする、前記方法。 - 工程（ａ）で培養する細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、筋芽細胞、末梢血単核球、角膜上皮細胞、網膜細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、膵細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞及び滑膜細胞から選択される１又は２種以上の細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の乾燥細胞シートの作製方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022083228 | 2022-05-20 | ||
| JP2022083228 | 2022-05-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023171287A true JP2023171287A (ja) | 2023-12-01 |
Family
ID=88928335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023077772A Pending JP2023171287A (ja) | 2022-05-20 | 2023-05-10 | 乾燥細胞シート及び乾燥細胞シートの作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2023171287A (ja) |
-
2023
- 2023-05-10 JP JP2023077772A patent/JP2023171287A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Cell sheet technology: a promising strategy in regenerative medicine | |
| EP2266499B1 (en) | Three-dimensional tissue structure | |
| ES2562707T3 (es) | Métodos de recelularización de un tejido u órgano para una mejor capacidad de trasplante | |
| JP2002530069A (ja) | 生物工学的組織構築物およびそれを生成および使用する方法 | |
| US20060234375A1 (en) | Use of human stem cells and/or factors they produce to promote adult mammalian cardiac repair through cardiomyocyte cell division | |
| Trevisan et al. | Generation of a functioning and self-renewing diaphragmatic muscle construct | |
| CN107635592A (zh) | 充气的去细胞化胞外基质 | |
| US20070072294A1 (en) | Use of human stem cells and/or factors they produce to promote adult mammalian cardiac repair through cardiomyocyte cell division | |
| Kirby et al. | Cell sheets in cell therapies | |
| JP2014221417A (ja) | 即時使用のための乾燥され、放射線照射された皮膚同等物 | |
| CN111031792A (zh) | 低温保存 | |
| TW202122573A (zh) | 治療血管疾病之組成物及方法 | |
| Bolte et al. | Molecular, cellular, and bioengineering approaches to stimulate lung regeneration after injury | |
| US20200390937A1 (en) | Sheet-shaped cell culture for regeneration of digestive tract | |
| Noori et al. | Decellularized lung extracellular matrix scaffold promotes human embryonic stem cell differentiation towards alveolar progenitors | |
| Hollweck et al. | Mesenchymal stem cells from umbilical cord tissue as potential therapeutics for cardiomyodegenerative diseases–a review | |
| JP6670040B2 (ja) | シート状細胞培養物の製造方法 | |
| JP2023171287A (ja) | 乾燥細胞シート及び乾燥細胞シートの作製方法 | |
| Hong et al. | Enhanced intramyocardial vascular cell delivery promotes post-myocardial infarction healing by polarizing pro-regenerative neutrophils | |
| US20230348851A1 (en) | Biocompatible scaffolds for culturing post natal progenitor cells | |
| Sabetkish et al. | Lung Extracellular Matrix as a Platform for Lung Organ Bioengineering: Design and Development of Tissue Engineered Lung | |
| Hodges et al. | Tissue-Engineered Organs | |
| Wonski | Development of Biologically-Engineered Blood Vessels Towards Clinical Translation | |
| Sjöqvist | Oral mucosa keratinocytes and their exosomes for epithelial tissue regeneration | |
| WO2020067442A1 (ja) | 細胞の凍結保存方法 |