CN110694114A - 一种负载prp的胰腺脱细胞支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种负载PRP的胰腺脱细胞支架及其制备方法，属于胰腺组织工程技术领域；胰腺脱细胞支架的脉管中组装富含多种促血管化生长因子的PRP并种植人脐静脉内皮细胞，负载的PRP被胰腺脱细胞支架的胶原纤维缓慢激活，在局部持续缓释大量的生长因子，为人脐静脉内皮细胞围绕支架内固有血管网络的粘附和增殖提供了理想环境；所述负载PRP的胰腺脱细胞支架仍然保留胰腺组织的天然结构、生物学特性及低免疫原性，其体内移植后局部持续缓释大量的生长因子能够起到明显的促血管化作用，操作方便、可控性好，有利于促进支架内新生血管的生成。
Description
技术领域
本发明属于胰腺组织工程技术领域，具体是涉及一种负载PRP的胰腺脱细胞支架及其制备方法。
背景技术
作为全球疾病，每年有将近340万人死于糖尿病及其并发症。目前治疗1型糖尿病的有效方法是植入胰岛细胞，然而，胰岛的长期存活并不令人满意，移植到糖尿病动物中的胰岛细胞没有良好的定植环境，易于被身体清除，这降低了长期疗效。因此，目前关于胰腺组织工程支架的研究集中于重建胰岛的存活环境，最近提出的胰腺脱细胞支架(pancreatic decellularized scaffold，PDS)，它除去细胞成分，包括DNA和表面抗原，但保留细胞附着点、结构完整性和血管通道。胰腺脱细胞支架具有最适合于天然细胞生长的细胞外基质组分，提供了与移植细胞原有的生存环境类似的微环境。由于在移植后缺少足够的血供，脱细胞支架的使用依然受到了很大的限制。一个功能完善的人造组织工程器官必须具有完整的功能血管网络，基于细胞成分来构建新的血管是目前可行的血管化手段，胰腺脱细胞支架因具有完整的脉管网络及细胞外基质，成为了一个再造胰岛素分泌器官的可行性选择。
目前为解决脱细胞支架血管化的问题，研究人员通过偶联抗内皮细胞抗体来重建脱细胞支架内的血管网络(In Kap Ko等2014年)，或者通过明胶水凝胶修饰构建了再内皮化的脱细胞支架(Fanwei Meng等2018年)，但以上方法操作较为复杂，长期效果并不理想。
胰腺脱细胞支架采用专利号为ZL201410590216.8的方法制备。研究表明，脱细胞过程显著减少了肝素结合生长因子的数量，而这些肝素结合生长因子是组织工程血管化所必需的。因此，在胰腺脱细胞支架上补充促血管生成的生长因子对增强支架的血管化具有重要意义。富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)是通过离心全血获得的血小板浓缩物，其在被活化后可释放大量生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子β1和β2(TGFβ1，β2)、血小板衍生生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子(IGF)，这些生长因子的浓度约为体内正常浓度的3～8倍。单独或联合应用这些生长因子均可刺激细胞增殖和分化，VEGF可促进新生血管的形成并抑制缺血组织中内皮细胞的凋亡，由于血管形成的复杂性，它还需要FGF、EGF、PDGF等的参与，并且自体PRP具有最佳的生长因子比例，可以最大化相互协同发挥作用，这反映了PRP促进血管生长的优势。
发明内容
本发明主要是解决上述现有技术所存在的问题，提供一种负载PRP的胰腺脱细胞支架及其制备方法。
本发明主要是通过下述技术方案解决现有技术所存在的问题：一种负载PRP的胰腺脱细胞支架，包括胰腺脱细胞支架，所述胰腺脱细胞支架来源于大鼠，所述胰腺脱细胞支架的脉管中组装富含多种促血管化生长因子的PRP，并种植人脐静脉内皮细胞，所述PRP与人脐静脉内皮细胞在胰腺脱细胞支架内形成负载PRP的胰腺脱细胞支架。
一种负载PRP的胰腺脱细胞支架的制备方法，其步骤为：
步骤1、PRP的制备：从大鼠心脏中将8ml全血收集到10ml无菌注射器中，然后放入装有3.2％柠檬酸钠作为抗凝剂的采血管中,通过变速离心机的初始离心以215g进行10min，将发白薄膜层上方的血浆置于第二个离心管中，然后再通过变速离心机以863g离心10min，弃去上清液，剩余的1ml带有血小板沉淀的部分为PRP；
步骤2、负载PRP于胰腺脱细胞支架：用DMEM培养基分别溶解2.5ml、5ml、7.5ml、10ml PRP，配置成50ml相应浓度为5％、10％、15％、20％的PRP灌注液，将稀释后的PRP运用三维动态循环灌注装置经脾动脉于37℃、1ml/min循环灌注24小时，负载PRP于胰腺脱细胞支架脉管中；
步骤3、最适PRP负载浓度的筛选：将负载不同浓度PRP的胰腺脱细胞支架修剪成直径1cm，厚度5mm的薄片组织，将这些薄片组织置于每孔含250μl基质胶的24孔培养板中，后将2×104个人脐静脉内皮细胞添加到每个孔中，培养箱中孵育6小时，通过观察负载不同浓度PRP的胰腺脱细胞支架促进人脐静脉内皮细胞形成管腔能力，从而筛选出最适的PRP负载浓度值为10％。
步骤4、内皮细胞种植于胰腺脱细胞支架：将5×107个人脐静脉内皮细胞，加入1mlDMEM培养基，充分混匀，经脾动脉注射进负载PRP的胰腺脱细胞支架，静置2小时，通过三维动态循环灌注装置1ml/min循环灌注3天后，将支架植入大鼠背部。
本发明具有的有益效果：
1、本发明以胰腺脱细胞支架为基础，通过循环灌注将PRP组装到胰腺脱细胞支架内部，负载PRP的胰腺脱细胞支架通过持续缓释大量生因子，促进了内皮细胞围绕支架内固有血管网络的粘附和增殖。体外培养一段时间后，将支架植入大鼠体内，实现血液在组织工程胰腺内部的持续灌注，为支架持续提供氧气和营养物质，并排出代谢产物。
2、采用本发明方法，使负载的PRP被胰腺脱细胞支架的胶原纤维缓慢激活，在局部持续缓释大量的生长因子，为内皮细胞围绕支架内固有血管网络的粘附和增殖提供了理想环境。同时，本发明所述负载PRP的胰腺脱细胞支架在植入体内后继续缓释生长因子，促进了周围宿主血管渗透长入支架内部与支架内新生血管吻合，使血液灌注进入组织工程胰腺内部，加速血管化的进程。以PRP作为内源性生长因子，人脐静脉内皮细胞作为种子细胞负载胰腺脱细胞支架，符合胰腺组织工程生长因子+种子细胞+生物支架的经典模式，其可构建理想的组织工程胰腺移植物。本发明所述方法对于其他复杂器官如肝脏、肾脏等脱细胞支架的血管化也同样具有积极指导意义。
3、本发明所述负载PRP的胰腺脱细胞支架的优势在于：所述方法制备的负载PRP的胰腺脱细胞支架除具备胰腺脱细胞支架的基本特性外，通过循环灌注PRP实现内源性生长因子的负载；本发明所述负载PRP的胰腺脱细胞支架通过持续缓释大量生长因子，促进了人脐静脉内皮细胞围绕支架内固有血管网络的粘附和增殖。为种子细胞存活提供理想环境。
4、本发明所述负载PRP的胰腺脱细胞支架仍然保留胰腺组织的天然结构、生物学特性及低免疫原性，其体内移植后局部持续缓释大量的生长因子能够起到明显的促血管化作用，操作方便、可控性好。
附图说明
图1是本发明制备方法的一种流程示意图；
图2是本发明的一种CD62P/Collagen I免疫荧光检测PRP负载胰腺脱细胞支架前后超微结构变化示意图(胰腺脱细胞支架PDS，负载PRP的胰腺脱细胞支架PDS+PRP)；
图3是本发明的一种扫描电镜(SEM)检测PRP负载胰腺脱细胞支架前后超微结构变化示意图；
图4是本发明一种负载不同浓度PRP的胰腺脱细胞支架促进人脐静脉内皮细胞形成管腔的示意图(未负载PRP的胰腺脱细胞支架PDS，负载5％PRP的胰腺脱细胞支架PDS+5％PRP，负载10％PRP的胰腺脱细胞支架PDS+10％PRP，负载15％PRP的胰腺脱细胞支架PDS+15％PRP，负载20％PRP的胰腺脱细胞支架PDS+20％PRP)；
图5是本发明的一种统计分析人脐静脉内皮细胞形成管腔的数目和长度的示意图(*P＜0.05，**P＜0.01)；
图6是本发明的一种分别种植人脐静脉内皮细胞于胰腺脱细胞支架和负载PRP的胰腺脱细胞支架，培养3天，HE染色、SEM、Ki-67免疫组化检测内皮细胞的粘附和增值情况的示意图(胰腺脱细胞支架种植人脐静脉内皮细胞PDS+HUVEC，负载PRP的胰腺脱细胞支架种植人脐静脉内皮细胞PDS+PRP+HUVEC)；
图7是本发明的一种统计分析体外种植人脐静脉内皮细胞的管腔覆盖率和增值情况示意图(*P＜0.05，**P＜0.01)；
图8是本发明一种负载PRP的胰腺脱细胞支架植入体内的HE染色示意图(箭头指示新生血管，字母I代表植入支架，字母S代表周围组织，W代表时间单位周)；
图9是本发明一种负载PRP的胰腺脱细胞支架体内移植1周、2周、3周后血管密度的统计学分析示意图(*P＜0.05，**P＜0.01)。
具体实施方式
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
实施例：一种负载PRP的胰腺脱细胞支架，如图1-图9所示，包括胰腺脱细胞支架，其特征在于所述胰腺脱细胞支架来源于大鼠，所述胰腺脱细胞支架的脉管中组装富含多种促血管化生长因子的PRP，并种植人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcell，HUVEC)，所述PRP与人脐静脉内皮细胞在胰腺脱细胞支架内形成负载PRP的胰腺脱细胞支架。
一种负载PRP的胰腺脱细胞支架的制备方法，其步骤为：
步骤1、PRP的制备：从大鼠心脏中将8ml全血收集到10ml无菌注射器中，然后放入装有3.2％柠檬酸钠作为抗凝剂的采血管中,通过变速离心机的初始离心以215g进行10min，将发白薄膜层上方的血浆置于第二个离心管中，然后再通过变速离心机以863g离心10min，弃去上清液，剩余的1ml带有血小板沉淀的部分为PRP；
步骤2、负载PRP于胰腺脱细胞支架：用DMEM培养基分别溶解2.5ml、5ml、7.5ml、10ml PRP，配置成50ml相应浓度为5％、10％、15％、20％的PRP灌注液，将稀释后的PRP运用三维动态循环灌注装置经脾动脉于37℃、1ml/min循环灌注24小时，负载PRP于胰腺脱细胞支架脉管中；
步骤3、最适PRP负载浓度的筛选：将负载不同浓度PRP的胰腺脱细胞支架修剪成直径1cm，厚度5mm的薄片组织，将这些薄片组织置于每孔含250μl基质胶的24孔培养板中，后将2×104个人脐静脉内皮细胞添加到每个孔中，培养箱中孵育6小时，通过观察负载不同浓度PRP的胰腺脱细胞支架促进人脐静脉内皮细胞形成管腔能力，从而筛选出最适的PRP负载浓度值为10％。
步骤4、内皮细胞种植于胰腺脱细胞支架：将5×107个人脐静脉内皮细胞，加入1mlDMEM培养基，充分混匀，经脾动脉注射进负载PRP的胰腺脱细胞支架，静置2小时，通过三维动态循环灌注装置1ml/min循环灌注3天后，将支架植入大鼠背部。
所述脱细胞支架来源于鼠或猪胰腺，本实施例采用大鼠胰腺，人脐静脉内皮细胞(Chi Scientific公司)，DMEM细胞培养基(Sigma公司)，胎牛血清(Gibco公司)，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；
主要仪器设备：三维动态循环灌注装置(Equl公司)、蠕动泵、细胞培养箱(Thermo公司)、变速离心机(eppendorf公司)。
实施制备负载PRP的胰腺脱细胞支架过程：
1)PRP的制备：从大鼠心脏中将8ml全血收集到10ml无菌注射器中，然后放入装有3.2％柠檬酸钠作为抗凝剂的采血管中；通过变速离心机的初始离心以215g进行10min，将发白薄膜层上方的血浆置于第二个离心管中，然后再通过变速离心机以863g离心10min，弃去上清液，剩余的1ml带有血小板沉淀的部分为PRP；
2)负载PRP于胰腺脱细胞支架：用DMEM培养基分别溶解2.5ml、5ml、7.5ml、10mlPRP，配置成50ml相应浓度为5％、10％、15％、20％的PRP灌注液，将稀释后的PRP运用三维动态循环灌注装置经脾动脉于37℃、1ml/min循环灌注24小时，负载PRP于胰腺脱细胞支架脉管中；
3)最适PRP负载浓度的筛选：将负载不同浓度PRP的胰腺脱细胞支架修剪成直径1cm，厚度5mm的薄片组织，将这些薄片组织置于每孔含250μl基质胶的24孔培养板中，后将2×104个人脐静脉内皮细胞添加到每个孔中，培养箱中孵育6小时，通过观察负载不同浓度PRP的胰腺脱细胞支架促进人脐静脉内皮细胞形成管腔能力，从而筛选出最适的PRP负载浓度值为10％。
4)内皮细胞种植于胰腺脱细胞支架：将5×107个人脐静脉内皮细胞，加入1mlDMEM培养基，充分混匀，经脾动脉注射进负载PRP的胰腺脱细胞支架，静置2小时，通过三维动态循环灌注装置1ml/min循环灌注3天后，将支架植入大鼠背部。
从图1-图9的结果可以得出：负载PRP的胰腺脱细胞支架通过持续缓释大量生长因子，促进了人脐静脉内皮细胞围绕支架内固有血管网络的粘附增殖并显著提高了支架在体内微血管的形成，可为后续进一步构建具有胰岛素分泌功能的组织工程胰腺提供理想的支架来源。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明不限于上述实施例，还可以有许多变形。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均应认为属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种负载PRP的胰腺脱细胞支架，包括胰腺脱细胞支架，其特征在于所述胰腺脱细胞支架来源于大鼠，所述胰腺脱细胞支架的脉管中组装富含多种促血管化生长因子的PRP，并种植人脐静脉内皮细胞，所述PRP与人脐静脉内皮细胞在胰腺脱细胞支架内形成负载PRP的胰腺脱细胞支架。
2.根据权利要求1所述的一种负载PRP的胰腺脱细胞支架的制备方法，其特征在于所述制备方法的步骤为：
步骤1、PRP的制备：从大鼠心脏中将8ml全血收集到10ml无菌注射器中，然后放入装有3.2％柠檬酸钠作为抗凝剂的采血管中,通过变速离心机的初始离心以215g进行10min，将发白薄膜层上方的血浆置于第二个离心管中，然后再通过变速离心机以863g离心10min，弃去上清液，剩余的1ml带有血小板沉淀的部分为PRP；
步骤2、负载PRP于胰腺脱细胞支架：用DMEM培养基分别溶解2.5ml、5ml、7.5ml、10mlPRP，配置成50ml相应浓度为5％、10％、15％、20％的PRP灌注液，将稀释后的PRP运用三维动态循环灌注装置经脾动脉于37℃、1ml/min循环灌注24小时，负载PRP于胰腺脱细胞支架脉管中；
步骤3、最适PRP负载浓度的筛选：将负载不同浓度PRP的胰腺脱细胞支架修剪成直径1cm，厚度5mm的薄片组织，将这些薄片组织置于每孔含250μl基质胶的24孔培养板中，后将2×104个人脐静脉内皮细胞添加到每个孔中，培养箱中孵育6小时，通过观察负载不同浓度PRP的胰腺脱细胞支架促进人脐静脉内皮细胞形成管腔能力，从而筛选出最适的PRP负载浓度值为10％。
步骤4、内皮细胞种植于胰腺脱细胞支架：将5×107个人脐静脉内皮细胞，加入1ml DMEM培养基，充分混匀，经脾动脉注射进负载PRP的胰腺脱细胞支架，静置2小时，通过三维动态循环灌注装置1ml/min循环灌注3天后，将支架植入大鼠背部。
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