JP2004505746A - 血管化組織移植片 - Google Patents

Abstract

チャンバー中に閉じ込められ供与体に移植された血管柄を利用して血管化組織を製造する方法が提供される。具体的には、（ａ）供与体における血管柄に機能性の循環を創出する工程、（ｂ）該血管柄の一部又は全部を作成されたチャンバー内に閉じ込める工程、（ｃ）該チャンバーに単離された細胞又は組織片を接種する工程、（ｄ）そのような解剖学的構築物を創出できる供与体の部位に該血管柄を含むチャンバーを移植する工程、及び（ｅ）血管化された新たな組織を成長させるのに十分な期間の間その移植部位に該チャンバーを放置する工程を含む、血管化組織の移植処置を必要とする受容体動物に移植するのに適した供与体の血管化組織を製造する方法が提供される。移植に適した血管化組織移植片も提供される。本発明は血管化組織移植片を用いて組織欠損を修復する方法をも包含する。

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は組織工学と移植の分野に関し、さらに詳しくは血管化組織の生成に関する。
【０００２】
発明の背景
同種出発材料を利用する組織工学は、欠損したり機能しなくなったりした身体部分を新たに作成した生きている組織で置換することへの展望を開くものである。その技術は、異種移植で必要な長期免疫抑制を行わなくても、従来の再建手術で起こる供与者部位の組織損失や随伴する疼痛を抑制したり、供与者部位が存在しない特化組織を再生させるという可能性を秘めている。
【０００３】
その技術は、損傷組織や先天的欠損組織に代わる新しい血管化組織を作成するために、組織培養、生体適合性材料の作成、及び血管形成操作の技術を組み合わせたものである。
【０００４】
組織工学が直面する大きな課題の一つに、適当なサイズと形状の分化組織を作成することがある。機能する血管系を付けないで作成された組織は、酸素拡散が限られることにより、サイズが厳しく制約される。組織が大きすぎると、宿主が新しい血管部分を作るより先に組織が壊死状態に陥る。即ち、機能する血管系を含んだ新しい組織を作成することができれば、多くの利点がある。また、その新しい組織は、欠損部分から遠隔の身体部位で、免疫抑制キャリヤー動物の体内で、又はイン・ビトロで体外循環を伴って製造される必要があるので、組織を無傷に保ったまま再建部位へ送達できるように新しい組織への血液供給源を確保しなければならない。
【０００５】
皮膚と皮下脂肪から成る生きた複合体である皮膚皮弁の作成は、再建手術において組織欠損を修復するために使われる普通の技術である。これらの皮弁が移植後も生存し続けるためには、血液供給源を保持しなければならないので、皮弁の起源は、解剖学的に認識される血管ソースが存在する区域に限定される。この制約を打破するために、短い血管セグメントを所望部位に移植し、その結果生ずる血管形成を利用して所望のサイズと組成の皮弁を血管化させることによって、皮膚皮弁を「プレハブ化」することができる。次いで、顕微手術によりこの血管化皮弁を目的の領域に移すことができる。しかしながら、この技術は供与者組織の入手可能性と供与者部位に生じる傷跡による制約を受ける。
【０００６】
エロールとスピラ［Ｅｒｏｌ ａｎｄ Ｓｐｉｒａ （１９８０）］はこの技術を発展させ、皮膚移植片の下に吻合動静脈（ＡＶ）ループを作成すると、血管化皮膚「皮弁」を製造することができることを明らかにした。
【０００７】
しかしながら、ＡＶループを用いて血管化皮膚を生成させることができることが明らかにされてはいるものの、移植に適した他の血管化組織の製造は手探りの状態である。例えば再建手術では血管化脂肪組織が必要な場合が多いが、供与者の成熟脂肪組織は非常に壊れやすく、機能する血液供給源に直ちに再結合させないと、たちまち壊死してしまう。さらに、従来の自家移植法を用いると、「甲から奪って乙に与える」ことになり、供与者部位に傷跡を生じてしまう。確保された血管系を用いた新しい組織の製造が可能になれば、この難題が克服されるであろう。
【０００８】
クホウリら［Ｋｈｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３）］及びタナカら［Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ． （１９９６）］は、動静脈ループを身体から持ち上げ、コラーゲン性マトリクスのシートに挟み、プラスチック製チャンバー内で周辺組織から隔離しておくと、新しい血管化組織を自然に生成しうることを明らかにした。クホウリら（Ｋｈｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ．）が記載したモデルでは、新しい組織を生成させるために、血小板由来成長因子の組換え体ＢＢホモダイマー（ＢＢ−ＰＤＧＦ）を添加していたが、この添加があっても組織は不安定で、１５日目に体積がピークに達し、３０日目までには縮小していた。同様に、チャンバーにβ線維芽細胞成長因子（β−ＦＧＦ又はＦＧＦ−２）を添加するタナカ（Ｔａｎａｋａ）のモデルにおける組織成長は、体積が増加し続け、２週目にピークに達したが、４週後には無添加対照チャンバーの水準に戻ってしまった。このＡＶループモデルは組織工学の分野では一般に知られていない。
【０００９】
成熟組織は幹細胞を含んでいないという古典的概念は、近年、大きく様変わりしてきた。かつては、多くの成熟組織はほとんど自己更新性を持たないとみなされていたが、今では、幹細胞集団を保持していると考えられている。これらの幹細胞は環境に応じて自らの表現型を変化させることができるので、自己補充性幹細胞集団を提供できる可能性がある［プロッコップ（Ｐｒｏｃｋｏｐ）、１９９７］。例えば幹細胞の分裂と分化の開始及び／又は幹細胞静止期の維持における幹細胞の挙動を決定する上で微小環境刺激が重要な役目を果たしていると考えられる。これらの過程に関与する刺激と機序は、十分に理解されているとは言いがたい。しかしながら、幹細胞を動員し、刺激し、増殖させ、分化させることが、組織工学の難題であることは明白である。幹細胞の挙動はほとんどはイン・ビトロで研究されてきたが、少数のイン・ビボ研究では、幹細胞を成熟臓器の被膜下又は全身に注射した場合の挙動が検討されている。これらの研究は、組織工学への幹細胞の使用に関する知見を深める上でいくつかの制約を受ける。とりわけ、成熟臓器に注射する場合、幹細胞は、確立された微小環境と相互作用を示し、宿主臓器から新生血管系を誘導する際に制約を受けねばならない。幹細胞は、全身に注射されると、広範囲に分散してしまう。幹細胞が臓器を形成するためには、デノボの組織形成の誘導、維持のための増殖可能な血管供給源が必要であることが予想される。幹細胞の増殖、発育、及び分化の誘導を助けるために、不活性支持体及び／又は細胞外マトリクスから成る増殖可能な微小環境が必要であることも予想される。本発明者らは、これらの要件を満たし幹細胞の研究に非常に有望なモデルを開発した。それを組織工学に応用すれば、当該分野における技術の大いなる発展につながる。
【００１０】
本明細書ではいくつかの先行技術文献を引用しているが、この引例は、これらの文献のいずれかがオーストラリア又はその他の国において当該分野の公知一般的知見の一部をなすことを容認するものでないことは当然である。
【００１１】
本発明者らは、移植や再建手術に有用であって、有用モデル系をも提供する血管化移植片組織製造系を開発した。
【００１２】
発明の概要
第一の側面として、本発明は、血管化組織移植治療を必要としているレシピエント動物の体内への移植に適した供与者血管化組織を製造する方法であって、
ａ）機能する循環を供与者主体の体内の血管柄上に作成する工程、
ｂ）その血管柄の一部又は全体をあらかじめ作成しておいたチャンバーに閉じ込める工程、
ｃ）そのチャンバーに単離細胞又は組織片を接種する工程、
ｄ）その血管柄を含むチャンバーを、宿主動物体内の上記解剖学的構築物を作成することができる任意の部位に移植する工程、及び
ｅ）血管化新組織を成長させるのに十分な期間の間その移植部位にそのチャンバーを留置する工程、
を含む方法を提供する。
【００１３】
一つの好ましい態様においては、本方法は、工程（ａ）の後で細胞外マトリクス及び／又は機械的支持体を添加して血管柄を囲む工程を含む。もう一つの好ましい態様においては、本方法は、工程（ｂ）の後で成長因子、薬物、抗体、阻害剤、又はその他の化学物質を該チャンバーに添加する工程を含む。
【００１４】
工程（ｅ）では、チャンバーを少なくとも４週間、より好ましくは少なくとも６週間にわたり移植部位に留置することが好ましい。
【００１５】
血管化組織はイン・ビボ又はイン・ビトロで成長させてもよいし、宿主体内でイン・シテュの状態であってもよい。
【００１６】
該チャンバーを供与者体内の皮膚下に移植することがより好ましいが、皮下挿入に限定されない。組織／臓器成長時にチャンバーを露出させておくことが理論的に可能であるが、感染のリスクが高いので、この方法はまれに代替的に使用されるにすぎない。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「供与者主体」という用語は、供与者血管化組織がその体内で作成される動物、とりわけ哺乳類、最もとりわけヒトを意味するものとする。本明細書で使用する場合、「レシピエント動物」という用語は、供与者血管化組織移植片を受容する動物、とりわけ哺乳類、最も具体的にはヒトを意味するものとする。新しい血管系の形成即ち血管新生は全ての温血動物で実質的に同じ生理学的及び病理学的過程が関与しているので、当業者は、本明細書に開示する方法は全ての温血動物に直接適用しうるものと理解する。哺乳類が供与者主体であることが好ましく、ヒト又はヒト以外の動物であってよい。好ましい哺乳類としては、げっ歯類、ネコ類、イヌ類、ウマ、ウシ、ヒツジ、及びヤギなどの有蹄哺乳類、ブタ類、及び霊長類が挙げられる。とくに好ましい態様においては、ヒトが供与者主体であり且つレシピエントである。
【００１８】
当業者にとっては、「血管柄」とは血管又は血管置換物の人工又は天然の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）であって、構築物の部位への血液を取る動脈と、その血液を運び去る静脈とから成る構成であることが明白である。血管柄は動静脈（ＡＶ）のループ又は分路（ｓｈｕｎｔ）から成ることが好ましい。ＡＶのループ又は分路においては、動脈は静脈と直接連結されるか、同程度の直径の移植片を介して連結されるので、血流障害が生じない（例えば図１に示す状態）。もう一つの構成では、動脈と静脈の両者を結合し、血流は両者間の微小接続部分を経て行なわれる（例えば図３に示す状態）。さらに別の構成では、動脈と静脈は、血管が半閉鎖チャンバーの一端から入って反対側の端から出る「流通性」構造を取る（例えば図４に示す状態）。
【００１９】
当業者にとっては、本明細書で使用する「機能する循環」という用語は以下の特性のうち少なくとも一つを備えた循環を指すものと解される。即ち、循環を構成している血管が開存していること、それらの血管がそれらを通って流れる血液又は血液代替物を維持できること、それらの血管が付近の組織に栄養分及び／又は酸素を供給できること、及びそれらの血管が発芽によって新しい血管を形成できることである。
【００２０】
任意選択的に、チャンバーは添加された細胞外マトリクス、例えばイン・シテュで細胞を沈着させたマトリクス、Ｍａｔｒｉｇｅｌ （商標） やラミニン（マウス由来）などの再構成基底膜調製品、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤を添加したか添加していない Ａｍｇｅｌ （商標）、Ｈｕｍａｔｒｉｘ （商標）、又はラミニン（全てヒト由来）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸変異体（ＰＬＧＡ）、繊維素溶解阻害剤を添加したか添加していないフィブリン接着剤又は血漿接着剤（自家又は他家）、又はコラゲナーゼ阻害剤を添加したか添加していない天然のコラーゲン（自家又は他家）を供給されてもよい。
【００２１】
好ましい態様においては、細胞外マトリクス様ポリ乳酸−ポリグリコール酸スポンジ、Ｄｅｘｏｎ（商標）スポンジ、又は海生スポンジがチャンバーに添加される。フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、低分子量ヒアルロナン、及びビトロネクチンなど他の一つ以上のマトリクス形成成分で被覆したＰＬＧＡスポンジなどのマトリクスを組み合わせたものも好ましい他の選択肢である。筋肉などの組織や肝臓などの臓器の凍結乾燥セグメントをマトリクスや成長因子の供給源として使用してよい。組織や臓器のセグメントは供与者主体と同じ種から採取されることが好ましく、供与者個体から採取されることが最も好ましい。
【００２２】
本発明のとくに好ましい態様においては、供与者主体はレシピエント動物と同一の個体である、即ち、移植片は自家である。他に、供与者主体は胸腺を除去されたマウスやブタなどの免疫低下動物であってよく、レシピエントは異なる個体であってもよい、即ち、移植片は他家である。上記以外のこれらの操作の順列や組合せとしては、元の供与者又は異なるレシピエント個体のいずれかに移植し戻された自家又は免疫低下の血管、細胞、組織セグメント、又は成長因子のいずれかの使用が挙げられる。移植片の「成熟」が他家移植片に免疫保護をもたらすかどうかは日常的技術を用いて判定できる別の一変形である。
【００２３】
チャンバー内で使用される組織又は細胞は、循環から幹細胞を引き寄せる「ホーミング」因子、α線維芽細胞成長因子（αＦＧＦ又はαＦＧＦ−１）、β線維芽細胞成長因子（βＦＧＦ−１又はβＦＧＦ−２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＥ）、アンジオポエチン−１及び−２、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２及び−７）、トランスフォーミング成長因子−α及び−β（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヒト成長因子（ＨＧＨ）、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ），顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの外因性成長因子、及び３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、インスリン、インドメタシン、デキサメサゾン、ヒアルロナン六糖、ＰＰＡＲ−γリガンド・トログリタゾン、一酸化窒素、プロスタグランジンＥ１、トランスフェリン、セレン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）などその他の因子から成る群より選ばれた成長因子がさらに添加されてもよく、これらの成長因子の多くは血管新生又は血管形成の促進物質である。これらの成長因子又は化学メディエーター阻害剤の一部に対する抗体、アゴニスト、又はアンタゴニストも、形成させる組織のタイプや形成速度を変える目的で使用することもできる。当業者であれば、どの成長因子（単数又は複数）、抗成長因子抗体、阻害剤、又はそれらの組み合わせが特定の状況に最適であるかを容易に判定することができる。
【００２４】
チャンバーは、骨格筋表現型の形成を促進するためにＭｙｏ−Ｄでトランスフェクトされた筋芽細胞、適当な分化因子を有する幹細胞、顔頚部再建用の薄い皮膚構築物を製造するために接種された角化細胞などの自家又は他家細胞と併用してよい。任意選択的に、チャンバーは、筋芽細胞、線維芽細胞、前脂肪細胞並びに脂肪細胞、心筋細胞、角化細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、外膜細胞、骨髄由来間質前駆体細胞、胚、間葉、又は造血幹細胞、シュワン細胞ならびにその他の末梢及び中枢神経系の細胞、嗅覚細胞、肝細胞ならびにその他の肝臓細胞、メサンギウム細胞ならびにその他の腎臓細胞、膵島β細胞ならびに膵管細胞、甲状腺細胞ならびにその他の内分泌器官の細胞から成る群より選ばれた同種移植細胞又は自家細胞を含んでもよい。
【００２５】
他に、チャンバーは、骨格筋又は心筋、膵臓、肝臓、精巣上体脂肪ならびにその他の皮下脂肪、神経（末梢、血管関連など）、腎臓、膀胱、卵巣、子宮、精巣、嗅覚組織又は内分泌器官由来腺組織の自家又は同種移植部分と併用してよい。本明細書で使用する場合、「組織片」という用語は、動物から直接採取されたか、組織培養における細胞の操作の結果として製造されたか、両者を組み合わせた、細胞外マトリクスなどの細胞外材料を添加した又は添加していない細胞の任意の集合体を包含するものとする。他の変形においては、上記組織セグメントは、組織発育に影響を及ぼす可能性のある生存幹細胞及びその他の細胞に刺激又はシグナルを与える目的で、虚血、細胞不足、又は壊死の状態にしてもよい。
【００２６】
血管化組織は、細胞に添加される物質の性質に応じて分化することができる。とくに好ましい態様においては、血管化され分化された組織又は臓器を製造する目的で、幹細胞を適当な細胞外マトリクスならびに成長因子添加物と共にチャンバーに添加する。この目的に適した多能性幹細胞は以下のものから得ることができる。
ａ）血液、
ｂ）骨髄、
ｃ）間葉幹細胞を含む特定の臓器又は組織、
ｄ）トランスフェクト又は分化させてもよい培養細胞、又は
ｅ）胎盤幹細胞バンク。
【００２７】
これまで、本発明者らは、骨髄、虚血骨格筋、及び皮下脂肪組織などの供給源を用いてきた。他に多能性幹細胞の供給源として使える可能性のあるものとしては、血液、とりわけ胎児又は新生児由来ならびに成人由来の血液、及びヒト胎盤が挙げられる。骨髄バンクや臍帯血バンクなどいくつかの幹細胞バンクがすでに設立されている。ヒト胚は幹細胞の潜在的な臨床供給源であるが、一部の国では、今のところ法律上及び倫理上の問題から使用が禁止されている。
【００２８】
製造される分化細胞のタイプは、幹細胞の起源、局所環境、組織特異的成長因子又は分化因子の存在、及びその他の因子によって決まる。例えば、本発明者らは、予想外にも、ＡＶループ付きのチャンバー内に置いた虚血骨格筋が４〜６週間後には主に脂肪組織に分化することを観察した。本発明者らは、如何なる提唱された機序にも制約されることを望まないが、この場合、筋肉内の間質幹細胞が酸性虚血代謝物の刺激と併せてこの分化を引き起こした可能性があると考えている。幹細胞を使用することの主な利点は、増殖能力が極めて大きいが故に、ＡＶループ付きチャンバーに接種するための大きなコロニーの形成に必要な細胞が比較的少数でよいことである。
【００２９】
ＡＶループなどの血管柄は、静脈移植片に連結された動脈であって、その移植片がさらに静脈に連結された動脈を含むことが好ましい。他に、ＡＶループは静脈に直接連結された動脈を含み、又はＡＶループは静脈移植片、動脈移植片、及び静脈に順に連結された動脈を含む。顕微手術による血管吻合が技術的に困難又は不可能な場合に有用なもう一つの変形においては、動脈と静脈（例えば大腿静脈）の断端を結合させてチャンバー内に並列して置かれたものを含む血管柄を血管供給源として使用することができる。本発明のもう一つの好ましい態様においては、ＡＶループ血管は同じ端からチャンバーに流入、流出する。もう一つの変形においては、動脈と静脈は分割させたり分路状に形成されたりせずに、チャンバーの一方の側から入り、反対側から出る（例えば図４参照）。ごく小さい血管に適した第三の変形においては、動脈と静脈は分割されてチャンバー内に並列され、両方の血管が同じ端から入る。これについては図３で説明する。
【００３０】
ＡＶループの移植片部分は宿主から得られたものでもよいし、別の供与者から得られたものでもよい。低温保存された血管又は予め作成された血管を使用してもよい。
【００３１】
本発明の一つの好ましい態様においては、チャンバー内の組織が刺激を受けるように神経断端幹を組み込むさらに別の工程を含む。例えば骨格筋は、その維持と成熟のために神経に近接している必要がある。そうでないと、骨格筋は萎縮してしまう。
【００３２】
血管柄を含むチャンバーは定められた内部寸法を有することが好ましい。製造しようとする新しい組織の容積と形状を変えるために、内部寸法、容積、及び形状を変えてよい。例えば、
ａ）チャンバーの内部容積は、壁をより薄くすることによって、チャンバーの外部サイズを変化させることなく増大させてもよい、
ｂ）チャンバーの形状は、耳、鼻、乳房、膵臓、肝臓、腎臓、指又はその他の関節などの標的臓器又は身体部分の形状に似せて構築してよい、
ｃ）チャンバーの壁の透過度は変更してもよく、例えばチャンバーは、分子をチャンバーの内に若しくは外に選択的に潅流させる半透膜部材を含んでいてもよく、細胞の生存、成長、及び分化に影響を及ぼす代謝物ならびに代謝副産物、成長因子、及びその他の因子の、チャンバーの内側と外側の間での通過流を増大させるための複数の穿孔をチャンバーの壁に設けてもよい。この穿孔のサイズ、形状、及び数は、供与者血管化組織のサイズ及びチャンバー内容物を移植部位と直接接触させずに保持する必要性に応じて選んでよい。他に、
ｄ）「フィーダー」細胞を免疫反応から隔離するために、半透性部材をチャンバー内に設置してよい。
【００３３】
後者の一例として、線維芽細胞又はその他の細胞の集団をトランスフェクトさせた後で、それをチャンバー内でトランスフェクト化遺伝子産物（単数又は複数）の供給源として使用することができる。この構築物を、宿主の免疫系と接触しない半透性ポケット内に置く。薬物送達を利用して、トランスフェクト化遺伝子のスイッチを入れたり切ったりする。これらの細胞は、適切な栄養分の供給を受けている限り、拡散によって生存するが、最終的には死滅する。
【００３４】
組織とチャンバー壁の間の相互作用を変化させるため、分化の刺激を提供するため、化学的又は生物学的薬剤の徐放に関与して勾配を生じさせるアルギネートなどのゲルを取り込ませるかゲルによって被覆させるために、チャンバー壁の表面化学的性質を変化させてよい。
【００３５】
チャンバー内の内部支持の程度は例えば以下のように変えてもよい。
ａ）支持体なし、
ｂ）新しい組織の成長を刺激、促進、若しくは阻害するか、新しい組織を排除するか、又は新しい組織に取り込まれる固体支持体、
ｃ）再吸収性物質から形成される一時的支持体、
ｄ）細胞と血管の内部成長を支え、且つ、例えば膨張ＰＴＦＥ材や様々な組成と多孔性を持つＰＬＧＡスポンジなどのスポンジ様物質といったその上で新しい組織を形成できる骨格を提供できる、多孔質支持材、
ｅ）ヒドロキシアパタイトや脱ミネラル化粒状化骨など組織分化を刺激する材料から形成された支持体。
【００３６】
チャンバーの外部表面は、チャンバーを身体の所望領域に付着及び／又は固定することができる手段を有することが好ましい。
【００３７】
第二の側面として、本発明は、分化組織又は成熟血管供給源を有する臓器を含む血管化組織移植片即ちチャンバーの内容物を提供する。
【００３８】
この移植片は、脂肪組織、軟骨、骨、骨格筋、心筋、疎性結合組織、靱帯、腱、腎臓、肝臓、神経組織、膀胱、内分泌組織、及び腺組織から成る群より選ばれる組織を主に含むことが好ましい。該移植片は、脂肪組織、骨格筋、軟骨又は骨組織、又は膵島及び／若しくは膵管細胞、腎臓細胞、若しくは肝臓細胞を含む組織の血管化させたものを主に含むことがより好ましい。
【００３９】
第三の側面として、本発明は、組織チャンバーを移植する治療を必要としている患者の体内に本発明の組織チャンバーを移植する工程を含む組織欠損修復方法であって、以下の特徴を有する方法を提供する。
ａ）組織又は「臓器」移植片が本発明の方法によって形成されるものである、
ｂ）成熟即ち所望のサイズ、血管化度、及び分化度に達するのに十分な時間にわたり保持されるものである、及び
ｃ）所望のレシピエント部位に移植されるものである、及び
ｄ）移植片の血管が顕微手術により局所の動脈及び静脈に吻合されるものである。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「組織欠損」という用語は、レシピエント体内の組織の正常な容積、構造、又は機能の不足を含むものと解される。上記組織は、皮膚及び／又は皮下脂肪、筋肉、軟骨、骨又はその他の身体構造要素又は支持要素、又は臓器の全体又は一部分などの表層組織から選んでよいが、これらに限定されない。豊胸術など他の点では正常な組織を美容目的で増大させることも本発明によって提供される。当業者にとっては、上記組織欠損が外傷、外科手術、又はその他の治療介入の結果であってもよく、先天的に存在するものであってもよいことは容易に認識される。
【００４１】
第四の側面として、本発明は、被験体に遺伝子産物を提供する方法であって、
ａ）そのような治療を必要としている患者から血管化組織を作成するため、本発明の組織チャンバーを構築する工程、
ｂ）血管化組織を付けたままのチャンバーを取り出し、チャンバーアセンブリーをイン・ビトロで培養する工程、
ｃ）チャンバー内の組織の細胞を所望の遺伝子で形質転換させる工程、
ｄ）チャンバー又はチャンバーを除いた内容物を患者の体内に移植する工程、
を含む方法を提供する。
【００４２】
組織生産性細胞の遺伝子形質転換のタイミングは状況に応じて変えることができ、例えば上記細胞はチャンバー構築物の作成時点、インキュベーションの途中、又は移植直前に形質転換させてもよい。
【００４３】
遺伝子産物の提供はいくつかの形を取ることができる。一例として、Ｍｙｏ−Ｄ遺伝子を持つ筋芽細胞でトランスフェクトさせて、正常な骨格筋表現型を有する組織を作成することが挙げられる。次いで、このトランスフェクト細胞を所望のチャンバー、マトリクス、及びＡＶループ中に接種して、血管化骨格筋を形成させる。このことは、筋ジストロフィー及びその他の遺伝性筋疾患を治療する可能性を示唆するものである。第二の例として、「健全な」表現型を有する膵島細胞をトランスフェクトし、それらをチャンバー内に接種することが挙げられる。このアプローチは糖尿病患者の治療に有用かもしれない。第三の例では、細胞を、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、又はＶＥＧＦなどの成長因子遺伝子又は血管新生促進遺伝子でトランスフェクトした後、それをＡＶループと特定のマトリクスとを併せ持つチャンバーに接種する。成長因子のこの連続的生産は、新しい組織／臓器の発育の速度、及び新しい組織／臓器内の新しい血管形成の速度を速めるために計画されたものである。
【００４４】
第五の側面として、本発明は、本発明の血管柄及び任意選択的に細胞外マトリクスを含む組織チャンバーを含む血管化組織のモデル系であって、体外循環装置と腎臓透析フィルターに機能しうるように接続されている系を提供する。体外循環装置と腎臓透析フィルターは適当な従来型のものであればよい。チャンバー内で組織を形成する細胞は、異種遺伝子を発現させる目的で任意に形質転換される。このモデル系は、イン・ビトロ又はイン・ビボのいずれかにおいて、幹細胞又は前駆細胞含有組織を培養、動員、成長させたり、それらの挙動を研究したりする目的に使用してもよい。成長因子、分化因子、及び化学因子を添加することでチャンバーの環境を変えることが可能であるので、このプロセスにより多様な組織及び臓器を製造することができる。
【００４５】
動静脈ループ又は適当な血管柄を作成することができる体内のどの解剖学的部位でも一定の組成の自家血管化組織を生成することができるので、他にも多くの用途がある。その局在化された部位におけるチャンバー内の組織は、例えば以下のように操作してよい。
ａ）遺伝子トランスフェクション、
ｂ）薬剤又はその他の「因子」の局所投与、又は
ｃ）循環幹細胞の帰巣部位の作成。
【００４６】
さらに、組織の成長や発育の過程をモニターするために、チャンバー内の組織及び滲出物を容易に集めることができる。とりわけ、本発明が他の発明と違う点は、新しく血管化し分化した組織又は類器官を成長させ移植することができることである
【００４７】
本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含むが、これらに限定されない」ことを意味し、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は対応する意味を有するものと解される。
【００４８】
発明の詳細な説明
以下、本発明を実施例ならびに図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明はこれら実施例ならびに図面に限定されない。
【００４９】
実験操作法
組織チャンバーの調製
特注のポリカーボネート製チャンバーを調製した。このものは上半部と下半部を有し、この２つの部分を閉じ合わせると、内部容積は０．４５〜０．５０ｍｌになる。チャンバーの全体構成を図１に示す。
【００５０】
ラット用の基本チャンバーはポリカーボネート製である。一つの変形では、該チャンバーはポリ乳酸製又はＰＬＧＡ製である。該チャンバーは、直径１４ｍｍ、高さ４ｍｍの外部寸法を有する円筒形状のもので、一端には切れ込みがあって、血管の出入り口になる開口部を構成している。別の変形では、チャンバーの両側に開口部が切られていて、血管が一方の側から入って反対側から出るようになっている。チャンバーは基底部分と取り外し可能な蓋を有する。基底部分には、チャンバーを皮下組織に固定することができる穴があいている。内部容積は約０．４５〜０．５０ｍｌである。この基本チャンバーの内部容積は、食品保存用の標準的なプラスチック製フィルムと同程度に薄くてよい薄壁を用いることによって、同じ外部容積を維持しながら、変化させることができる。これに代わるデザインとしては、図２に示したようなより丸みを帯びた端を有する「ドーム」形状が挙げられる。他の変形としては、図３に示したような、鼠径部の皮下空間に容易にフィットする縦長に平たくしたタバコ形状が挙げられる。特定の移植片を取得するために、例えばヒト指関節又は拇指、ヒト耳、ヒト鼻、ヒト乳房など身体の特定部分の形状又は輪郭に似せたチャンバー形状を設計してもよい。
【００５１】
このチャンバーのサイズは宿主のサイズに合わせて増減することができる。即ち、マウス用のチャンバーの内部容積は約０．１〜０．２ｍｌ、ウサギ用では１０〜１２ｍｌであってよいが、ヒト用としては約１００〜２００ｍｌまで可能である。
【００５２】
チャンバーは任意選択的に封鎖してもよい。標準的なものでは、開口部が、周囲組織との接触を制限しつつ、血液供給源との全面的かつ無制限の接触を可能にする。封鎖された変形においては、該開口部は、血管を壊すことなく、入る動脈と出る静脈にちょうど十分な空間を与えるように工作される。発育しつつある移植片が周囲組織と接触するのを防止するため、血管出入口は例えばフィブリン接着剤で封鎖される。
【００５３】
ポリカーボネート製チャンバーの表面はその自然の疎水性状態のままとすることができ、又はポリ乳酸を使用したり、ポリカーボネートをポリＬリジンの薄膜で前処理したりすることにより親水性を高めることもできる。一つの有用な構成においては、チャンバーの表面は、周囲組織内の成長因子との接触面積を増大させる複数の穿孔を含む。該穿孔のサイズと形状は、細胞の通過を抑制又は防止しながら、所望の因子の通過を最適化するように改変してもよい。
【００５４】
チャンバーがガラス又はパイレックス（登録商標）製である場合には、それをシリコンで被覆することができる。
【００５５】
チャンバーのデザインはレシピエント部位に快適にフィットするのが理想的であり、丸い形状であって、傷口の破れを防止するのに十分に小さいサイズのものでなければならない。
【００５６】
チャンバーの内容物は、薬物、成長因子、抗体、阻害剤、又はその他の化学物質を制御された速度で送達するための浸透圧ポンプ［例えばＡｌｚｅｔ（商標）浸透圧ミニポンプ］を収容するのに十分な大きさのものである。上記以外の一つの薬物／因子送達方法においては、該浸透圧ポンプは、例えばＡＶループの中心のチャンバー内部に置いたポンプからプラスチック製チューブが来ている状態でチャンバーの外側に皮下的に設置してよい。
【００５７】
組織チャンバー内の動静脈（ＡＶ）分路ループの作成
基本モデルはタナカら（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）に記載されている。簡単に説明すると、雄性スプラーグドーレー系ラット（２２５〜２８５ｇ）をフェノバルビトンの腹腔内注射（５０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｍｌ溶液２．５ｍｌ）により麻酔した。無菌条件下で右鼠径部に下方ベース皮弁を作成して、鼠径部靱帯から表層心窩部分岐までの大腿血管を露出させた。左鼠径部に縦切開を行い、鼠径部靱帯から表層心窩部分岐までの左大腿静脈を採取した。この静脈移植片（長さ約１．５〜３ｃｍ、通常は２ｃｍ）を、１０−０縫合糸を用いる顕微手技により、表層心窩部動脈レベルでレシピエントの右大腿静脈と動脈の間に間置した。この分路をチャンバーに入れ、蓋を閉じ、チャンバーの基底に設けた小穴を利用して構築物を鼠径部筋組織に縫合した。脂肪層をチャンバーに載せ、創傷を４−０絹縫合糸で閉鎖した。
ＡＶ分路を入れた成長チャンバーを移植後２、４、又は１２週目に採取した。
【００５８】
血管化と組織作成の評価
所定の検討時点でチャンバーを開き、その血管をクリーニングし、開存の有無を調べた。チャンバーの入り口で該血管を５−０絹縫合糸で結紮閉鎖し、皮弁を採取した。各群５匹のラット中２匹では、採取前に大動脈を介して墨汁で皮弁を潅流した（詳細は以下参照）。皮弁は、容積と重量を評価し、組織学的検査のため緩衝１０％ホルマール食塩水（ＢＦＳ）に浸漬した。検査終了時に、動物をペンタバルビトンナトリウムの心臓内注射（２５０ｍｇ／ｍｌ溶液〜３ｍｌ）により屠殺した。
【００５９】
組織の質量と容積
チャンバー内の組織を取り出し、その湿潤重量と容積を記録した。組織の容積は標準的な水置換法で評価した。組織は、あらかじめデジタル秤でゼロ調整しておいた容器入り生理食塩水に５−０絹縫合糸で懸垂した。標本を入れた容器に触れないよう注意した。記録された重量を組織標本（生理食塩水の密度１．００ｇ／ｍｌに等しい密度を有する）の容積とした。組織を容器のベースに乗った状態にし、重量を記録することで、同時に同じデジタル秤を用いて標本の質量を評価した。
【００６０】
墨汁潅流
皮弁を墨汁で潅流するために、正中切開による開腹を行った。腸を静かに周辺側に後退させ、大動脈周囲脂肪をストリッピング除去した。近位大動脈と下大静脈を結紮した。大動脈に、血管カテーテルと大動脈の周りに遠位縫合で固定された２２ゲージ血管カテーテルを挿入した。下大静脈に静脈切除を行った。大動脈に１０ｍｌのヘパリン化食塩水を潅流して残留血液を追い出し、動物をペンタバルビトンナトリウムの心臓内注射（２５０ｍｇ／ｍｌ溶液３ｍｌ）により屠殺し、大動脈に３ｍｌの緩衝１０％ホルマール食塩水（ＢＦＳ）を注入し、次いで５ｍｌの墨汁１０％ゼラチン液を注入した。次いで、皮弁血管を結紮閉鎖した。チャンバーから組織を取り出し、ＢＦＳ中で固定し、シーダーウッド油中で洗い、透過光画像解析法［Ｖｉｄｅｏ Ｐｒｏ（商標）撮像］を用いて血管のパターンを顕微鏡下で可視化した。
【００６１】
組織学的検査
標本を緩衝ホルマール食塩水中で固定し、パラフィンに包埋した。切片（５μｍ）を切り出し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）か又はマソンのトリクロームで染色した。
【００６２】
実施例１：ＡＶループ付きチャンバーにおける血管化組織の作成
各群５匹から成る３群のラットを使用した。各群には上記と同じ操作を施し、移植後２、４、又は１２週目にＡＶ分路付き成長チャンバーを採取した。
【００６３】
挿入前のＡＶ分路血管の平均質量は０．０２０ｇ（放血後）及び０．０３９ｇ（血液充満時）であった。挿入後２週目では、周囲組織を含めたＡＶ分路の重量は０．１８±０．０３ｇであった。質量は次第に増加し、４週目には０．２４±０．０４ｇ、１２週目には０．２８±０．０４ｇになった。新しい組織の容積は重量と蜜に平行していた。２週目から１２週目の間の重量増加（容積増加ではない）は統計的に有意であった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ／ダネットの検定）。
【００６４】
移植後２週目には、ＡＶループは様々な量の凝血塊を含んだ凝固滲出物の塊に囲まれていた。４週目には、ループ周囲の組織塊が大きく強固になっており、とりわけ中心部で顕著であった。１２週目までには、ループを取り囲む新生組織がさらに容積を増大させており、チャンバーの約３分の２を占めていた。表面凝固物はもはや見えず、塊全体が均一に強固な強度を持っていた。
【００６５】
インキュベーション開始後２週目には、ＡＶ分路は、分路に対してほぼ垂直に配列した線維芽細胞、薄いコラーゲン線維、及び血管発芽から成る新生結合組織の構造体に囲まれていた。新生組織の外側と周囲の凝血炎症滲出物塊には、かなりの数の好中球とマクロファージの両者の炎症細胞が存在していた。ＡＶ分路の静脈内腔から出ている新生血管の分岐が認められる切片もあった。
【００６６】
４週間インキュベーション群では、新生組織はより成熟度が高かった。ＡＶＳに最も近接するゾーンは、成熟コラーゲン内腔に埋入された新性血管の高密度の束を含んでいた。この層の外側には、２週目の標本における新生組織と似た成熟度の低いゾーンがあった。ほとんどの周囲凝血物はもはや見えず、少数の炎症細胞が新生組織中に存在しているだけであった。２週目には、ＡＶ分路と新生血管の間の連絡が認められる切片もあった。
【００６７】
インキュベーション開始後１２週目では、新生組織はさらに成熟が進んでおり、線維芽細胞がＡＶ分路の外縁部に対して平行に並んだ高密度コラーゲン性結合組織で構成されていた。血管化度の明白な低下はなく、新生血管は結合組織全体に高密度の束を形成していた。炎症細胞はほとんど認められなかった。
【００６８】
３つのいずれの時点においても、墨汁注入標本は新生血管系の範囲と密度のより明確な図を示した。ほとんどの標本では、ほぼ全ての血管が内腔に炭素を含んでいたことから、ＡＶ分路と連絡していることが示された。
【００６９】
新生組織は安定で、形状を保持しうるものでなければならないのが理想的である。ＡＶループの周りに形成された組織はこれら２つの特性を併せ持っている。２週目には、チャンバー内の塊は軟らかくて変形しやすい。４週目までには、塊はより強固でより頑丈になり、１２週目には成熟した結合組織の物理的特性を示す。驚くべきことに、移植後少なくとも１２週間にわたり成長が続き、成熟が進んでも新生組織の再吸収や退行の徴候は認められない。
【００７０】
実施例２：ラット真皮線維芽細胞を有するチャンバー
ラット真皮線維芽細胞の培養
近交系スプラーグドーレー系ラット（Ｍｏｎａｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｃｌａｙｔｏｎ， Ｖｉｃｔｏｒｉａ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の鼠径部から６ｃｍ×４ｃｍの楕円形のラット皮膚を採取した。この近交系は、少なくとも２０世代の兄妹交配から生じた動物から成るものであった。
【００７１】
表皮をトリミング除去した。真皮のセグメントを２ｍｍ四方の四角形に切り、１０個を無菌ペトリ皿に置いて、ラット血漿「接着剤」を用いて基底に付着させた。この接着剤は、スプラーグドーレー系ラットから調製した２ｍｌのラット血漿を０．３ｍｌの２％塩化カルシウムに添加することによって作成した。接着剤を３７℃で１０分間硬化させた。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ胎児血清、ペニシリンならびにストレプトマイシン、及びグルタミンを含む完全培養培地を培養皿に添加した。皮膚セグメントを７日間放置した後で、培地を交換した。１０日目までに線維芽細胞の顕著な外部成長が起きて、その時点で皮膚セグメントを取り出した。各回それぞれ７５ｃｍ^２と１７５ｃｍ^２の培養フラスコ中で線維芽細胞を１週間間隔で２回継代培養した。
【００７２】
線維芽細胞を２つの蛍光標識、即ちビスベンズアミド（ＢＢ）とカルボキシフルオレセイン二酢酸（ＣＦＤＡ）で標識した。ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶かした０．１％トリプシン３ｍｌを、コンフルーエントの線維芽細胞を含む１７５ｃｍ^２細胞培養フラスコに３７℃で５分間添加した。１７ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地の添加によりトリプシンを失活させた。この細胞懸濁液を２０００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを３ｍｌの培地に再懸濁し、この懸濁液を１ｍｌづつに分けて３本のエッペンドルフチューブに移した。各エッペンドルフチューブに１３．５μｌの１０％ＣＦＤＡ溶液と２０μｌのＢＢを添加した。このチューブを３７℃で１時間インキュベートし、１５分ごとに静かに振盪した。次いで、細胞を１７５ｃｍ^２フラスコに移し、再培養した。ＣＦＤＡは培養細胞の細胞質内にとどまり、細胞分裂で娘細胞ができてからも残る。ＣＦＤＡは５１３ｎｍで最大蛍光を発し、ＢＢは＞４３０ｎｍで最大蛍光を発する。最大蛍光を維持するために、標識細胞を遮光した。
【００７３】
細胞計数
細胞をチャンバーに添加する前に、線維芽細胞培養フラスコをトリプシン処理し、トリプシンを失活させた。ヘモサイトメーターと１対１０比の０．０５％エバンスブルー染色液を用いて、１０μｌの懸濁細胞を計数した。この溶液を遠心分離し、得られた細胞ペレットを適当量のウシコラーゲン溶液に懸濁して、１００万個／ｍｌの細胞濃度を得た。
【００７４】
ラット尾部腱コラーゲン（ＲＴＴＣ）
６匹のラットの尾部から腱を採取し、２×２×２ｍｍの立方体状に切断した（収量約１０ｇ）。４００ｍｌの冷却０．５Ｍ酢酸を添加し、混合物をホモジナイズし、４℃で２４時間攪拌した。ホモジネートを遠心分離し（３０００ｒｐｍ×２０分間）、上清を採取した。３００ｍｌの冷却０．５Ｍ酢酸をさらに添加してこの抽出操作を２回繰り返した。プールした抽出物に、４℃でマグネチックスターラーで攪拌しながら、最終塩濃度が約０．７Ｍになるまで５ＭのＮａＣｌ溶液をゆっくりと添加した（抽出物６００ｍｌに対して１００ｍｌの５Ｍ　ＮａＣｌを添加）。溶液を１時間放置してネイティブコラーゲンを完全に沈殿させた。沈殿物を遠心分離（４℃で３０００ｒｐｍ×２０分間）で集め、２００ｍｌの０．５Ｍ酢酸に再溶解し、２ｌの冷却０．５Ｍ酢酸に対して２４時間透析を２回繰り返し、さらに無菌冷却蒸留水に対して２回透析し、最終透析液の表面に数滴のクロロホルムを落とした。その結果、タイプＩコラーゲン標準品を用いるブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）で調べた濃度では約３ｍｇ／ｍｌのＲＴＴＣ無菌貯蔵原液が得られた。
【００７５】
チャンバーの調製
全ての操作は、無菌法を用いて細胞培養フード内で行った。２００μｌの２．５ｍｇ／ｍｌＲＴＴＣ溶液（ｐＨ７．４）を各チャンバー半部に添加することで、チャンバー内部をＲＴＴＣで被覆した。チャンバーを３７℃で１時間インキュベートしてゲルを形成させ、２４時間乾燥した。ＰＢＳで濯いで残留塩結晶を除いた後、１５０μｌの完全ＤＭＥＭに懸濁した０．２５×１０^６個の蛍光標識線維芽細胞を各チャンバー半部に添加した。１時間にわたり細胞を付着させた後、チャンバーを完全ＤＭＥＭに浸漬し、３７℃で空気中５％ＣＯ_２存在下で２４時間インキュベートした。１０倍の対物レンズを用いて、各チャンバー半部の７つの無作為的に選んだ視野における細胞数を計数することにより、標識細胞の密度を求めた。
【００７６】
チャンバーの挿入
１群あたり６匹から成る体重２３０ないし２８０ｇの近交系雄性スプラーグドーレー系ラットの２群を使用した。２個のチャンバーを各ラットの鼠径部に挿入し、右側にはＡＶ分路（上記要領で調製）を含むチャンバーを、左側には分路を含まないチャンバーを挿入した。６匹のラットでは、移植後２日目にチャンバーを取り出した。残りの６個のチャンバーは移植後７日目に取り出した。
【００７７】
取り出し後のチャンバーの検査
チャンバーを取り出し、ＡＶ分路の開存度を調べ、皮弁を取り出した。１０μｌの０．０５％エバンスブルー染色液を各チャンバー半部に添加し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、１０倍接眼レンズを用いて各チャンバー半部の基底を調べて、７つの無作為的に選んだ顕微鏡視野におけるエバンスブルー染色蛍光細胞の数を求めた。次いで、ＡＶ分路の表面上の７つの無作為視野における標識細胞の数を求めた。
【００７８】
挿入後２日目には、該分路及び周囲組織はチャンバー表面の約２０％を覆っており、７日目までには、この割合は約３０％まで増加していた。これに基づき、ＡＶ分路を入れたチャンバー内の細胞の全体密度は、チャンバー表面の細胞密度と、ＡＶ分路表面上の標識細胞の２０％（２日目）又は３０％（７日目）を加算することにより計算した。
【００７９】
対応のあるｔ検定を用い、対照チャンバー及び実験チャンバー内のグリッド当たりの細胞数と手術前のグリッド当たりの細胞数を Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ （商標） とＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて比較した。
【００８０】
計数後、該分路及び周囲組織を１０％ホルモール食塩水中に固定し、メタクリレートに包埋し、薄切片を調製し、ヘマトキシリン・エオジンか又はマソンのトリクロームで染色した。
【００８１】
ビスベンズアミド（ＢＢ）による標識とカルボキシフルオレセイン二酢酸塩（ＣＦＤＡ）による標識の比較
イン・ビトロ培養されたチャンバーとイン・ビボにおけるチャンバーのどちらの場合も、２つの検討波長（ＢＢは４３０ｎｍ、ＣＦＤＡは５７３ｎｍ）における標識細胞の数と分布は同じであった。どちらか一方の蛍光染色剤のみで標識されたと判定された細胞はなかった。従って、以下の結果において、「蛍光細胞」とはＢＢとＣＦＤＡの両方によって標識された細胞をいう。
【００８２】
肉眼的所見
どのチャンバーにおいても、ＡＶループは開存していた。
挿入後２日目には、ＡＶ分路がチャンバー表面の約２０％を被覆していた。７日目までには、ＡＶ分路とそれから発生した新しい組織で被覆されている面積は約３０％まで増大していた。
【００８３】
２日目の分路平均重量は０．１２±０．０１７ｇであり、平均容積は０．１２±０．０１４ｍｌであった。７日目までには、平均重量は０．２３±０．０１８ｇまで増加し、平均容積は０．２１±０．０１５ｍｌまで増加していた。
【００８４】
標識細胞の密度
空のチャンバーとＡＶ分路含有チャンバーにおける標識細胞の密度を表１に示す。
【００８５】
【表１】

【００８６】
全てのチャンバーにおいて移植後早期段階で細胞密度が低下し、全ての２日目チャンバーの値は挿入前の密度よりも低かったことが見てとれる。挿入後２日目には、空のチャンバーとＡＶ分路含有チャンバーの細胞密度に有意差はなかった。
【００８７】
７日目には、空のチャンバー内の細胞密度は挿入後２日目の密度と有意差がなかった。対照的に、ＡＶ分路含有チャンバーにおける細胞密度は２日目の値のほぼ３倍まで上昇し、グリッド内の細胞密度と（分路を取り囲む組織内の標識細胞の数を考慮した後の）密度はどちらも空のチャンバー内の密度より有意に高かった（ｐ＝０．０１３）。
【００８８】
エバンスブルー染色で、全ての検討チャンバーにおいて全ての標識線維芽細胞が生存しており、細胞の１％未満しかエバンスブルー染色剤を取り込まないことが示された。
【００８９】
組織学的所見
２日間のインキュベーションの後では、ＡＶ分路の血管は血餅と凝固炎症滲出物で囲まれた。少数の線維芽細胞が血管外膜から凝固物の中まで遊走しているのが認められた。
【００９０】
７日目までには、さらに多くの線維芽細胞が凝固物の中に存在しており、ＡＶ分路の外側から早期血管発芽が出ているのが認められた。
【００９１】
２日目と７日目のいずれにおいても、蛍光試験で、ＡＶ分路を取り囲む凝固物の表面上に標識線維芽細胞が認められたが、その物質の内部には標識細胞は認められなかった。挿入後７日目に取り出したＡＶ分路含有チャンバーの内部の様相を図５に示す。
【００９２】
実施例３：移植した組織チャンバー内での幹細胞の分化
４匹の近交系スプラーグドーレー系ラットから骨格筋、膵臓、脂肪、肝臓、及び腎臓を無菌的に摘出した。これらを１ｍｍ大の立方体に切断し、これを１〜２ｍｌの完全無血清ＤＭＥＭを入れた組織培養用ペトリ皿に置いた（培養表面積７ｃｍ^２あたり１５〜２０個）。次いで、最短２４時間から最長３日間までインキュベートした。適当な時点で、４〜６個の組織片を血漿血餅で包んで実施例２で説明したタイプのチャンバーの各側に付着させた。次いで、このチャンバーにＡＶループを接種し、閉鎖した。大腿神経の近位端を、骨格筋外部移植片を入れたチャンバーの片半部に入れた。４〜６週後、ラットを犠牲にし、チャンバーを調べた。
【００９３】
４〜６週間後、組織外部移植片入りのチャンバーの内容物は、組織外部移植片を入れていないチャンバーの内容物と違い、新しい異なる細胞表現型を含んでいた。いずれの場合も、大部分の壊死組織外部移植片は新しい細胞の塊で置換されていた。
【００９４】
これらのうち最も劇的であった実験では、骨格筋外部移植片を接種した１１個のチャンバー中８個は、成熟しよく血管化した脂肪組織と成熟した骨格筋線維とが薄い被膜で囲まれたものを含んでおり、容積の３分の２を占めていた。新しい組織の成熟部分は最大９０％の血管化脂肪組織を含んでいた。残りのチャンバーも、割合は低いが成熟した脂肪組織と骨格筋線維を有していた。
【００９５】
膵臓組織の一部を接種されたチャンバーは、境界明瞭な大型の卵形好酸球と多くの巨細胞とその他の比較的小型の細胞から成る大集団を有していた。
【００９６】
本発明者らは、提唱される如何なる機序にも拘束されることを望まないが、「幹細胞」集団が、壊死組織外部移植片によって循環幹細胞供給源からチャンバー内へ引き寄せられたか、組織外部移植片内に含まれていて、新しい組織を生じたと考えている。いずれの場合も、幹細胞の単離に大量に必要であったのことと比べてごく少量の外部移植片組織が使用されたので、本発明者らの結果は、本発明の方法が新規かつ効率的な幹細胞取得方法であることを示しているといえる。得られた幹細胞は特定の組織タイプとの関与の度合いが異なっていた結果、そうでなければ、異なる外部移植片に特有の微小環境によって発現された刺激に反応した結果、観察された異なる細胞タイプへと増殖及び分化したのかもしれない。
【００９７】
本発明者らの知る限り、ここで説明する被膜化脂肪組織の形成は、そのような新生臓器がそれ自体の動静脈上で新たに成長した最初の例である。
【００９８】
チャンバー内の空間的時間的ならびに動的変化及びこれらの事象が新生臓器を形成する機序に関する詳細な研究は、イン・ビボでの幹細胞の利用と挙動を定めに場合に応用できる可能性もある。このチャンバーモデルは、チャンバーの内容物と環境及び幹細胞供給源を様々に操作することができるので、これまで入手可能であった他のどのイン・ビボのモデルよりも優れている。さらに、このチャンバーモデルは、確立されている組織における幹細胞の成長の場合と異なり、他の近くの組織の影響を受けることなく単純な環境における幹細胞の研究が可能である。
【００９９】
筋肉の外部移植片がほぼ全く成熟脂肪組織から成る新生臓器の形成を生じうるという知見から、以下のことが明らかである。
ａ）幹細胞集団をうまくチャンバーに接種できること、
ｂ）該チャンバーモデルが幹細胞の可塑性を支えること、
ｃ）十分で適当で適正な血管新生が上記組織構築物とともに発育し、その組織構築物を統合し、支えること、
ｄ）その構築物は線維芽細胞内部成長によって不活性化されないこと、及び
ｅ）その構築物は炎症細胞によって不活性化されないこと。
【０１００】
これらの結果から、該チャンバーモデルの組織工学への応用が可能であって、「組織工学」の技術における重要な進歩になることがわかる。
【０１０１】
実施例４：マトリゲルの効果
ＡＶループと接触している２０分間におけるマトリゲルの初期損失の有無を判定するためのパイロット試験を計画した。そのパイロット試験の結果に基づき、２、４、及び８週間という期間を選んだ。４週目の時点で、成長因子低減マトリゲルとの比較を行った。１群あたり６匹の体重２２０ないし２８０ｇの雄性スプラーグドーレー系ラットを用いた。「実験操作法」の項で述べた要領で動静脈ループ操作を行った。
【０１０２】
マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ， ＵＳＡ）を、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含むＤＭＥＭ中の概略濃度が１２ｍｇ／ｍｌになるように、１０ｍｌづつに無菌的に分注した。このマトリゲルを−２０℃で保存し、使用前に４℃で一夜融解させた。調製工程中はマトリゲルを氷上に置き、あらかじめ冷却しておいたピペットを用いて操作した。成長因子低減（ＧＦＲ）マトリゲルは、ビキセビックら（Ｖｉｋｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９２）により記載されたと実質的に同様のやり方でマトリゲルから調製した。このために、さらに硫酸アンモニウム分画工程を入れた。生じたＧＦＲマトリゲルのタンパク質濃度は、ブラッドフォードタンパク質アッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブルー染色により、通常の成長因子完全含有マトリゲルのタンパク質濃度と同じであることが確認された。
【０１０３】
無菌条件下で、０．５ｍｌのマトリゲルを室温で各無菌チャンバーに添加したところ、たちまちゲル化した（１５秒以内）。次いで、マトリゲル入りチャンバーをラット右鼠径部の所定位置に置いた。マトリゲルは室温でゼラチン質なので、ループを浸漬しておくことができる。パイロット試験では、ＡＶループを作成し、移植前の２０分間マトリゲルに浸漬しておくことで、マトリクスの液化によるチャンバーからのマトリゲルの初期損失の有無を調べた。
【０１０４】
経時的変化を調べるために、新しい組織皮弁を２、４、及び８週目に採取した。皮弁は上記時点で採取し、重量、容積、及び組織学的所見を評価した。２、４、及び８週群を互いの群及びＡＶループ単独群と比較する統計解析を行った（実施例１参照）。さらに４週目のマトリゲルとＧＦＲマトリゲルとＡＶループ単独の比較も４週目に行った。
【０１０５】
パイロット試験で、マトリゲルはイン・ビトロで操作しやすいことが判明した。ＡＶループと２０分間接触させた後のマトリゲルは、損失がほとんどなかった。
【０１０６】
ＡＶループ単独では（マトリクスの添加なし）、４週間後に形成された新しい組織皮弁の平均重量は０．２４±０．０４ｇ、平均容積は０．２３±０．０３ｍｌであった。これらの結果を、本実験及び実施例５の対照とした。
【０１０７】
２週目では、マトリゲルを添加したチャンバー内の皮弁の平均重量は０．３２±０．０３ｇ、容積は０．３０±０．０３ｍｌであった。これは、４週目ループ単独皮弁の場合より有意に大きかった（ｐ＝０．０５）。４週目では、皮弁は２週目皮弁よりやや重く、平均重量は０．３５±０．０３ｇ、容積は０．３３±０．０３ｍｌであった。これら２群を比較したところ、統計的有意差は認められなかった。重量（ｐ＝０．０１）と容積（ｐ＝０．０１）はいずれも、ループ単独で製造した対照皮弁よりも有意に大きかった。
【０１０８】
８週目では、皮弁は退行しており、平均重量は０．１８ｇ±０．０２ｇ、容積は０．１６ｍｌ±０．０２ｍｌであった。統計解析を行うと、これは、２週目皮弁と４週目皮弁の重量（ｐ＝０．０００５）及び容積（Ｐ＝０．０００３）の両者と比べて、重量（ｐ＝０．００２）と容積（ｐ＝０．００１）に高度の有意性があることがわかる。この経過時間の長い群については、感染や披裂を見込んで、８匹のラットを処理した。そのような問題は生じなかったので、８匹全てを解析に含めた。
【０１０９】
ＧＦＲマトリゲル皮弁は４週目の正常マトリゲル皮弁よりも小さく、重量は平均０．２７±０．０２ｇであった。重量を比較したところ、統計的有意性は認められなかった。容積は０．２４±０．０１ｍｌで、これは正常マトリゲルよりも有意に少なかった（ｐ＝０．０４）。同じ期間でＧＦＲ皮弁はまだループ単独よりも大きかった（統計的に有意でない）。チャンバーの１つが感染し、除去せざるを得なかった。その結果、この群では５匹の動物を調べた。
【０１１０】
２週目と４週目では、０日目のループ単独入りチャンバーと比べて有意な組織皮弁が形成されていた。チャンバー内にはマトリゲルが残留しており、皮弁の端からマトリゲルまで走行する微小血管の束が肉眼的に認められた。ミクロフィル（Ｍｉｃｒｏｆｉｌ）を注射したところ、前進する微小血管を含めた皮弁血管の充満が良好であることが明らかになった。皮弁がより小さく、より規則的な平滑表面を有していた８週目では、このような外観は認められなかった。８週目には、チャンバー内に残留液だけがあって、粘性マトリゲルは認められなかった。
【０１１１】
組織学的検査で、２週目には、多くの未成熟血管が皮弁端まで伸び、末梢組織内に出血があることが示された。皮弁内の中心部と取り込まれていないマトリゲル部分には早期コラーゲン形成が認められた。
【０１１２】
４週目では、血管は細動脈や細静脈へと成熟しており、太い分岐血管がループから発生し、細い分岐が周辺部に認められた。依然として取り込まれていないマトリゲルと少量の出血があった。取り込まれていないマトリゲルは粗な線維芽細胞と不定血管を含んでいた。全体的印象としては、成熟しつつあるがまだ成長途中で、血管形成の良好な皮弁であった。
【０１１３】
８週目には、皮弁組織はより成熟が進んだ外観を示し、ループに近いほどコラーゲン密度が高く、血管が大きかった。皮弁組織は細胞が少なく、血管も少なくなっていた。生成した組織の周りには被膜形成が始まっており、皮弁内にはマトリゲルが残留していた。
【０１１４】
ＧＦＲマトリゲル皮弁はさらに成熟が進んだ外観を示し、中心部には大きめの血管が、周辺部には活性度が低めの血管形成が認められた。早期被膜形成の所見が認められ、一部の標本には炎症度が高めの細胞が存在していた。
【０１１５】
全ての経過時点で、ループと皮弁血管の間の血管接続が良好であることがミクロフィル注射により明らかになった。
【０１１６】
実施例５：ポリ−Ｌ−乳酸ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）の効果
（ａ）塩浸出法により調製されたＰＬＧＡ
組織チャンバーに対するＰＬＧＡ挿入物はパトリックら（１９９９） により記載された微粒子浸出法を用いて構築された。要点を述べれば、ＰＬＧＡをクロロホルムに溶解しＮａＣｌと混合する。クロロホルムを蒸発させた後得られる残留物を所望の形状に機械加工する。次いで、その塩をそれから浸出させて相互に連結している孔を生じさせる。この孔のサイズは使用した塩粒子のサイズを反映する。この実験では、３００〜４００μｍの孔及び８４％の孔隙率が作られた。このＰＬＧＡをポリカーボネートチャンバーの内部にフィットするように二つの部分に加工された。底部の部分はループのための溝を含む基底平板を含み、上部の部分はループ及び基底平板を覆うように平らな円盤を含んでいた。このＰＬＧＡ円盤は直径が１．４ｍｍで厚さが２．５ｍｍであった。このＰＬＧＡを滅菌し、機械的攪拌機の上で１００％アルコール中に３０分間浸漬することにより予備加湿し、次いでそれを機械攪拌機の上で滅菌食塩水洗浄で３０分３回の洗浄を行なった。
【０１１７】
動静脈ループを上記のように調製し、チャンバー内のＰＬＧＡ座席の基底平板中に置いた。上皿を表面に置き、チャンバーを閉鎖した。各ラットが２２０〜２８０グラムの間の体重の６匹の雄性スプラーグドーレー系ラットを含むラットの各群を用意した。このチャンバーを２又は４週間のいずれかに収穫した。両期間について、重量、容積及び組織学を評価した。α−アクチンの皮弁部分の免疫組織化学的染色を行って筋繊維芽細胞を検出した。各群にはチャンバーが排出されたもの、感染したもの及びその他裂開したものなどがあり、残ったのは各群５匹のラットであった。
【０１１８】
２週で血管は該構築物をほとんど全体的に血管化し、先端には単純なＰＬＧＡが一部残った。皮膜は入口付近の近位に形成し始めた。４週で該構築物は全体的に皮膜に包まれ、縮小し、収縮し、チャンバーの側から引っ込んだ。ミクロ−フィル注射により血管浸透の程度を明らかにした。
【０１１９】
２週の皮弁の重量は０．４３±０．０５ｇであり、容積は０．３８±０．０４ｍｌであった。４週の皮弁の重量は０．３３ｇ±０．０４ｇであり、その容積は０．２９ｍｌ±０．０４ｍｌであった。２週と４週の群の比較から、２週と４週の間の皮弁のサイズの減少が明らかになった。この結果は統計的に有意ではなかった。他の実験とのさらなる比較は、結果を歪める皮弁内に残ったＰＬＧＡの存在のために不可能であった。
【０１２０】
２週及び４週共に広範な血管の成長があり、ＰＬＧＡの端にまで分枝した血管が見られた。細動脈が形成し、健康に分枝する脈管形成が該ループから生ずるのが見られた。細胞の浸潤がマトリクス上及び該構造物の表面上にあった。皮膜は僅か２週で該皮弁の近位部分に生じた。α−アクチン染色によりこの皮膜が筋繊維芽細胞を含むことが明らかにされた。４週で、この皮膜は近位がより多くの筋繊維芽細胞によりより肥厚化し、そして皮弁全体を覆うように伸長した。
【０１２１】
（ｂ）繊維紡ぎ法により調製されたＰＬＧＡ
実施例１で説明した血管ループモデルをこの実験で使用した。ＡＶループを、土台としてのＰＬＧＡディスク（７５％ポリＬ−乳酸／２５％ポリグリコール酸）で充填した丸いポリカーボネートチャンバー（０．５ｍｌ容積）内に置いた。このＰＬＧＡ土台を上記の塩浸出法か又は繊維紡ぎ法のいずれかにより製造した。各群には５匹の動物を含めた。４週のインキュベーションの後及び収穫の直前に、ヘパリン化した墨汁を５分間静注で注入した。このチャンバーから組織を摘出し、緩衝化１０％ホルマリンで固定しパラフィンに包埋し、５μｍの切片に切断しそしてヘマトキシリンとエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色して評価した。
【０１２２】
塩浸出されたＰＬＧＡは、硬い密度の高い堅さの繊維紡ぎＰＬＧＡよりも密度が低かった。このことは組織学的評価のために組織／ＰＬＧＡブロックのその後の切断により明らかになった。塩浸出ＰＬＧＡは堅いがもろく、砕ける傾向があった。繊維紡ぎＰＬＧＡはそれが固形状を持ったまま容易に切片化でき、砕けることはなかった。
【０１２３】
組織学的検査は、それらのそれぞれのグループにおける全ての標品について一様なパターンを示した。塩浸出ＰＬＧＡグループでは、ＰＬＧＡ中への微小血管系によるかなりの侵入及び新たな組織が全体にわたって見出され、無数の墨汁の詰まった微小血管が明らかであった。繊維紡ぎＰＬＧＡは性格が異なっていた。血管新生及び新組織の形成が二次元平面において優勢に展開した。初めは、ＰＬＧＡを侵す代わりに、組織がＰＬＧＡディスクを優先的に取り囲み、チャンバーの端に向かって移動した。組織は遙かに遅い速度でマトリクスに侵入した。ディスクの端に到達すると新組織のさらなる肥厚がディスクの周りに成長したが、４週後にそれを完全に食うことはなかった。
【０１２４】
孔サイズを増加させたり密度（従って、堅さ）を減少させたりするなどの繊維紡ぎＰＬＧＡのさらなる改変は、この技法を塩浸出ＰＬＧＡ調製に対する意味のある代替法としうる。
【０１２５】
実施例６−血管化組織のためのモデル系
本発明の組織チャンバー及び移植系は、その形成の間イン・ビトロで発育する組織を維持するための体外循環機の使用により、血管化組織の挙動を研究するためのモデルとして使用しうる。該チャンバーの内容物は実施例１で具体化したように設定される。宿主の血液又は適当な輸血（少なくとも９０ｍｌ）を採り、ヘパリン化（５０ユニット／ｍｌまで）する。血管の末端はシリコンチューブに連結し、血液を腎透析フィルターを経て酸素化される。酸素化された血液は、この目的に適応された通常の集中治療病棟の装置を用いポンプで組織を通過させ、組織／臓器が成熟するまでこのようにしてイン・ビトロで維持する。この相の間、血液試料は絶えずモニターして凝血の程度及びホメオスタシスの維持を評価する。イン・ビボ研究と同様にして、該組織形成細胞の遺伝的改変をこのモデルに適用することができる。最後に、形成された該組織／臓器を微小外科手術により宿主の適当な部位移植する。この方法の主要な利点は注文通りの、又は規格通りの部品及び臓器を製造する能力である。
【０１２６】
本発明のモデルを試験する次の段階は、幹細胞をこの系に添加し、組織が新たに形成されるか否かを検討することである。「幹細胞」の単離、増殖及びチャンバーへの接種はそれ自体大きな研究領域であり、未だにその揺籃期にある。種々の理由から、本発明者らは幹細胞及び環境刺激を添加するというオーソドックスでない方法を採って、予想外の結果を得た。本発明者らは該チャンバー内でイン・ビボで置かれた障害を受けた／壊死した組織外植片の挙動を研究し、筋肉の脂肪への変換を証明した（実施例３を参照）。
【０１２７】
このような実験で試験される仮説は、これらの小さな組織の外植片が少なくとも数個の幹細胞を収容し、これらの幹細胞がそれらの親の臓器の損傷を知覚し、それに応答して組織再生を開始するというものである。本発明者らは、脂肪、肝臓及び腎臓を含む幾つかの組織をも試験し、そして近いうちに神経、子宮、卵巣、甲状腺及び腺組織を研究するであろう。その結果は、試験した組織は全て未知の機序により該チャンバー内に通常存在しない表現型の細胞の形成を「駆動した」ので、極めて有望であった。機序的には、それらはチャンバー内の細胞／血管形成の応答を、大部分繊維芽細胞から構成される組織の新たな形成を含む「炎症及び傷痕形成」に類似するものから、認識可能な三次元構造及び表現型を持つ血管化組織の形成を含む、胎児における「傷痕なき」組織修復としても知られる「組織の新生及び形成」に類似のものへと変換させた。この形成された新たな組織には繊維芽細胞の内部増殖も炎症性細胞も存在しないことが重要である。
【０１２８】
実施例７−組織増殖チャンバー内での低酸素性の評価
該チャンバー内の細胞の低酸素性の研究のため、ＡＶ分路ループを先に実施例１で記述したように麻酔をかけた雄性ラット中に作成した。標準的なサイズのチャンバー（０．５ｍｌ容積）を用いた。実施例５で述べたようにチャンバーをマトリゲルで充填し、ついで不死のラットＬ６筋芽細胞（１×１０^６ 細胞／０．５ｍｌマトリゲル）を全表面積に分布するように接種した。次に、チャンバーをラットの鼠蹊部中に設置した。
【０１２９】
チャンバーを３日、７日に収穫し、そして２週及び４週のインキュベーションを行なった。検査の時には、フェノバルビトンナトリウム（３０ｍｇ／ｍｌ）で動物に再び麻酔をかけ、チャンバー収穫の２時間前にニトロイミダゾール（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の注射により無酸素性の評価を行なった。該チャンバーを収穫した後、ラットを致死量のペントバルビトンナトリウム（３２５ｍｇ／ｍｌ溶液の３ｍｌ）を用いて犠牲にした。このチャンバー内の試料を組織学及びニトロイミダゾール抗体での免疫染色をするために処理した。これらの状況下で、標識される細胞のみが低酸素性（＜１０ｍｍＨｇ）のものであり、増殖しているものである。
【０１３０】
３日及び７日における組織の酸素化の程度の評価により、両時点での血管化ループの直近では増殖性の低酸素性の細胞が観察された。２週後には、新生組織の増殖体の周辺では標識された細胞のみであった。４週までに、ニトロイミダゾールで標識される細胞はいなくなった。
【０１３１】
この研究の結果は、低酸素性の活発な生合成の状態が血管ループの近辺の細胞で存在することを示す。これは、低酸素性が、とりわけ第１週で、ポリカーボネートチャンバー中での血管形成の駆動力であることを強く示唆する。該ＡＶループから離れた細胞は疑いもなく低酸素性であるが増殖していなかった。２週の間では、低酸素性の増殖している細胞は新たな組織の成長先端に位置していたが、４週の終わりには、チャンバーは全体にわたって十分に酸素化され、新たな組織の形成がかなり遅くなった。このような研究は、如何にして低酸素が該チャンバー内の新たな組織の成長に影響を与え得るかを研究者が研究することを可能とする。
【０１３２】
実施例８−チャンバーに添加された細胞のラットＡＶループモデル内で隔離され培養された細胞
（ａ）チャンバーへの筋芽細胞の添加
身体の種々の部分（例えば、腓腹筋、大腿直筋、広背筋など）からの骨格筋を離乳して５日後の新生ラットから収穫した。筋芽細胞はこの収穫した組織からコラゲナーゼ消化及びハムのＦ１０培養培地（２０％ウシ胎児血清を２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと共に含む）中で培養することにより調製した。筋芽細胞はデスミン免疫染色により同定した。繊維芽細胞は、それが半時間以内にプラスチックに付着するが筋芽細胞はこの時間の後にしか付着しないという事実を利用して、連続継代培養により除去した。濃縮された筋芽細胞（２〜４×１０^６ 細胞）を（１）マトリゲルのみ（ほぼ０．５ｍｌ）又は（２）容量の均衡をとるためのＰＬＧＡを含むマトリゲル（ほぼ０．１５ｍｌ）のいずれかに挿入した。これらのマトリクスを、先に記載したように標準的０．５ｍｌチャンバー内のＡＶループの周りに配置した。これらの構築物を２、４、６、１２又は１６週のいずれかの間、皮下でインキュベーションした。検査の時に、ラットを全身麻酔の下に置き、チャンバー内で形成された組織（「皮弁」としても知られる）を取り出した。この組織のほぼ半分をイソペンタン中で凍結し、他の半分をホルマリン中で固定し、そして形態学的、組織学的及び免疫組織化学的染色の前に切片とした。
【０１３３】
１．マトリゲル単独のグループ
グループＡ−２週（ｎ＝６）
６匹のラットからのチャンバーを２週で検査した。これらのうちの４個に大量の筋肉があった。そのうち３個は筋管の形成の証拠である同定可能なデスミン−陽性の筋芽細胞を含んでいた。他の２個はデスミン−陽性の組織を含んでいなかった。
グループＢ−６週（ｎ＝９）
このグループの９匹のラットのうち、２個の構築物は筋肉及び筋管を含み、４個の皮弁は同定可能な筋肉を含んでおらず、そして３匹のラットは成熟前に死んだ。
グループＣ−１２週（ｎ＝１１）
このグループの１１匹のラットのうち、筋肉を含む構築物は皆無であり、５個の皮弁は筋肉を含まないが何らかの（未同定の）組織を含んでおり、２個のチャンバーは皮弁を含まず（おそらくチャンバーから滑り出たためと思われる）、そして３匹のラットは未成熟で死んだ。
【０１３４】
２．ＰＬＧＡ／マトリゲルグループ
グループＡ−２週（ｎ＝３）
このグループについての結果はない。
グループＢ−６週（ｎ＝６）
このグループの６匹のラットのうちで、２個の構築物は筋肉及び筋管を含んでおり、そして４個の皮弁は筋肉を含んでいなかった。チャンバーに接種される前に筋芽細胞がＣＦＤＡで蛍光標識された一つのチャンバーでは、イン・ビボでの４週のインキュベーションの後になお筋芽細胞が生存しているという証拠があった。
グループＣ−１２週（ｎ＝７）
このグループの７匹のラットのうちで、２個の構築物はデスミン−染色された筋芽細胞を含んでおり、５個の皮弁は未同定の組織を含んでいたが筋肉は含まず、そして１匹のラットは未成熟で死んだ。
グループＤ−１６週（ｎ＝５）
このグループについては結果はない。
【０１３５】
２週インキュベーション後の皮弁のＨ＆Ｅ染色切片では、筋芽細胞は幾つかの組織試料で明らかであり、それらの存在はデスミンの免疫染色により確認された。２週以内に、筋芽細胞の核の群は整列しジストロフィンについて陽性に染色される筋管を形成し、そして成熟した縞模様の骨格筋を形成した。６週までに、筋管及び成熟筋が一部の試料中に存在したが、他の試料では結合組織が形成した。２、４及び６週で、おそらく、マトリゲルの使用による単核白血球浸潤が存在した。これはマウス細胞に由来するものである。しかしながら、１２週までに、多くの皮弁組織は再吸収された。「より純粋でない」筋芽細胞を接種した初期の実験の一部では、マトリゲル単独実験の２週及び４週後に類骨（骨組織）及び脂肪組織（脂肪）の孤立したポケットも観察されたことは興味深い。
【０１３６】
予備的実験では、遠位で切断された大腿部神経がマトリゲルマトリクス内でループの近くに組み込まれ、そして接種された筋芽細胞で取り囲まれた（ｎ＝６、２週インキュベーション）。デスミン−陽性筋細胞は（神経の無い対照、グループ１Ａと比べ）減少する傾向であるように見えたが、新たに形成された組織の大部分で、シュワン細胞マーカーであるＳ１００についての陽性の免疫染色があった。
【０１３７】
本発明者らは先の研究から、このモデルが良好な血管新生の刺激を与えることを知っており、そして本発明者らは今回このモデルが筋芽細胞の生存、拡大及び分化を維持できることを示した。この血管化チャンバーはこの細胞系統をも支持できそして選択された細胞が正常な且つ予想される様式で分化できる最適環境をも提供できる。組織学的証拠により、接種された筋芽細胞は両者とも生存し分化して筋管を形成し、２週程の短い期間にわたって今度はそれが合体してこのモデルで成熟骨格筋を形成する。
【０１３８】
（ｂ）幹細胞添加
同じＡＶループモデルを用いて、本発明者らは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識した及び標識しないラット骨髄由来の幹細胞のこれらのチャンバーにおける運命を研究した。
【０１３９】
骨髄由来の間質細胞を正常食塩水でそれらを洗い出すことによりラットの大腿骨から収穫した。これらの細胞を次に標識化しＦＡＣＳ装置により分類した。この間質細胞の部分集合を、２０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地中で培養することにより拡大させた。拡大した細胞を本発明者らの皮弁内で追跡できるように緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びネオマイシンプラスミドでレトロウイルスを用いてトランスフェクトした。十分な細胞が利用可能であった場合、本発明者らはそれらを２×１０^６ ／０．５ｍｌマトリゲルの濃度で本発明者らのＡＶループチャンバーモデル中に配置した。
【０１４０】
これらの幹細胞を含むチャンバー中の９個のＡＶループを、マトリゲル単独（ｎ＝８）か又はマトリゲル／ＰＬＧＡ（ｎ＝１）のいずれか及びに該マトリクスを用いて構築した。２週（ｎ＝４）又は４週（ｎ＝４）にラットを検査した。凍結切片では、これらの標品で一部蛍光が見られるが、これが真正のＧＦＰ蛍光であるか又は自己蛍光であるかは明らかでない。続く実験で、本発明者らのＧＦＰ−標識化皮弁から得られた組織をネオマイシンの豊富な培地の存在下で培養した。チャンバー内で２週及び４週の後に残存するＧＦＰ標識化細胞をこのような条件の下で検出し、他方、ＧＦＰで標識しない細胞はこれらの条件下では生存できなかった。しかしながら、今日まで、本発明者らはこれらの接種された細胞から生じた新たな組織中に特異的な組織表現型又は特異的なクローン形成の証拠を見出せなかった。
【０１４１】
実施例９−移植可能な膵臓様のものを形成するためラットＡＶループモデル中のチャンバーに添加した膵臓細胞
全ての実験は同系のスプラーグドーレー系ラットを用いて行なった。使用した、右鼠蹊部に静脈移植片で作成された動静脈（ＡＶ）のフィステル（導管）を０．５ｍｌの内容積のポリカーボネートチャンバー内に設置した実験モデルは、全ての実験グループにわたって同様であった。
【０１４２】
先の実施例で述べたように手術前にペントバルビトンでラットに麻酔をかけた。移植のための膵臓組織を種々の方法により調製した。
（ａ）「フィコール島」：供与体成熟ラットを用い、単離した膵臓をイン・ビトロでコラゲナーゼＰ（ベーリンガー・マンハイム、ドイツ）で消化し、次いでフィコール密度勾配上で遠心分離により島を精製した。
（ｂ）「ヒストパーク島」：供与体成熟ラットを用い、膵臓の血管系にイン・ビボで７ｍｌのコラゲナーゼ（ワーシントン・バイオケミカルズ，ＵＳＡ）（１．３Ｕ／ｍｌ）を灌流した。得られた島を単離し、ヒストパーク（リュー及びシァピロ，１９９５） を用いて精製した。
（ｃ）「消化膵臓」：供与体成熟ラットを用い、単離された膵臓をイン・ビトロでコラゲナーゼＰ（ベーリンガー・マンハイム、ドイツ）で消化したが、この調製物はさらなる精製工程には付さなかった。
（ｄ）「濾過膵臓」：供与体成熟ラットを用い、単離された膵臓を酵素による消化には付さず、単にホモジナイズし、この粗抽出物を異なるサイズ範囲のフィルターを通して篩にかけた。４５０μｍフィルターを通過したが１００μｍフィルターにより保持された画分をさらなる実験に使用した。
【０１４３】
上記の島調製物を接種するための支持体として使用された細胞外マトリクスは以下の構造のものの一つに使用された。
（ｉ）チャンバーをマトリゲルで充填し、島はその全体に分散させた。
（ｉｉ） チャンバーをマトリゲルで充填し、そして島／膵臓組織をチャンバー／ＡＶループの中央に置いた。
（ｉｉｉ）島／膵臓組織を含む１５０μＬのマトリゲルをＡＶループの直ぐ近くのチャンバーの中央に置いた。
（ｉｖ） 島／膵臓組織を含む１５０μＬのラット血漿凝固物をＡＶループの直ぐ近くのチャンバーの中央に置いた。
【０１４４】
実験グループは次のように考案した。
グループ１．老齢（４００〜５００グラム）同系スプラーグドーレー系ラットを使用した。「フィコール島」をマトリゲル中に置いた。受容体ラットは３匹であった。供与体：受容体の比を２．５：１とし、１０〜１７日インキュベートした。
グループ２．老齢（４００〜５００グラム）同系ラットを用いた。「消化膵臓」をマトリゲルの中に置いた。受容体ラットは３匹であった。供与体：受容体の比を１：１とし、１１日インキュベートした。
グループ３．成熟（２３０〜２６０ｇ）同系ラットを使用した。「消化膵臓」をマトリゲル内に置いた。受容体ラットは６匹であった。供与体：受容体の比を１：１とし、７〜１４日インキュベートした。
グループ４．成熟（２３０〜２６０ｇ）同系ラットを使用した。「ヒストパーク島」をマトリゲル内に置いた。受容体ラットは８匹であった。供与体：受容体の比を１：１及び４：１とし、６〜２１日インキュベートした。
グループ５．成熟（２３０〜２６０ｇ）同系ラットを使用した。「濾過膵臓」を血漿凝固物内に置いた。受容体ラットは８匹であった。供与体：受容体の比を１：２とし、８〜２４日インキュベートした。
【０１４５】
イン・ビトロ実験
培養中の島の長寿命を試験するため、上記のイン・ビボ実験と平行して、ＤＭＥＭ培地を週に２回交換しながら、島をマトリゲル中で培養し続けた。１か月及び２か月でインスリン免疫染色をその様な培養物の数個について実施し、陽性染色の結果を得た。
【０１４６】
血清インスリンレベルの測定
チャンバー収穫の時に、該ループの動脈及び静脈及び全身血液循環から血液試料（１００μｌ）を採取し、ラット・イソ型についてのラジオイムノアッセイによりインスリンレベルの測定を行なった。
【０１４７】
チャンバー収穫及び皮弁操作
上記の時点でチャンバーを収穫し、組織を緩衝化正規食塩水中に保存し、通常の組織学的標本、次いでパラフィン包埋を実施した。組織学的切片を通常の（Ｈ＆Ｅ）染色及び（インスリン及びグルカゴンについて）免疫染色を行なった。
【０１４８】
イン・ビトロ培養
培養で４及び８週までの島の生存が証明された。Ｈ＆Ｅ染色及びインスリン染色により、これらの時点での機能の生存が明らかにされた。島の塊は、４及び８週の間に個々の細胞及び細胞の塊に解離しはじめた。
【０１４９】
血清インスリンレベル
血清インスリンレベルは上記の実験グループ３及び４で試験した。ほとんどの動物において静脈（流出）血は、動脈（流入）血清のそれよりも血清インスリンレベルが３０〜５０％低かった。２匹の動物では、このレベルは静脈系でのそれよりも４０％及び１００％高かった。
【０１５０】
チャンバーの解析
チャンバー中の組織を４個の部分に分け、一連の切片を作成した。元のモデルと同様に、大量の血管形成及びコラーゲン沈着が確認された。Ｈ＆Ｅ染色により全てのグループで時おり島の持続が証明されたが、全ての皮弁ではそうでなかった。多くの皮弁に炎症性浸潤が存在し、それは主にリンパ球からなるものであった。グループ５の「濾過膵臓」チャンバーで管の要素が観察されたが、確認のための免疫組織化学的検査は行なわなかった。インスリン及びグルカゴンの免疫組織化学的検査により、時おり陽性の染色が、とりわけグルカゴンについて、証明された。
【０１５１】
これらの実験は、ＡＶループチャンバーモデルが相当の数の該構築物中で２４日までの期間にわたる島の生存を支えるのに適当な環境を創り出すことを証明する。この同じ期間の間に、組織の組織学的切片の免疫染色によりインスリン及びグルカゴンの生産が同定された。しかしながら、この新たな「臓器様組織（ｏｒｇａｎｏｉｄ） 」の長期生存性及びその継続的インスリン生産はさらに評価されねばならない。
【０１５２】
実施例１０−より大きなチャンバーの使用によるラットモデル内の組織の量の増大
（ａ）ラットの実験
標準的チャンバーモデル（約０．３ｍｌ）を用いてラット中で生産される組織の量は該動物の身体のサイズと比べ全く妥当であり、その身体内の小さな「乳房」又は小さな「臓器」に相当する。ヒトでこの知見を再現できるようにするためには、組織生産の限界を試験することが必須である。これは、より大きな容積のチャンバーを使用することにより、まずラットで実施することができる。従って、この研究の狙いはより大量の組織が、より大きなチャンバー内でより長い期間（４〜８週）にわたって成長できるであろうか否かを評価することであった。この方式で、この方法は、必要であればそれ自身の血管皮弁を同じ個体の別の部分に移植することができるであろう新たな組織の臨床的に有用な量を生産するために使用できるということが提唱される。
【０１５３】
閉じ込められた成長チャンバー内の動静脈（ＡＶ）分路ループの基本モデルは実施例１に詳細に記述した。このＡＶ分路はドーム型のチャンバー（図２）内に置かれた。このチャンバーはポリカーボネート製であり、柄を通すための近位開口部を有しており、そして基底平板と蓋から成る。それは１７ｍｍの基底直径、１．３ｍｍの基底中央からドーム頂上までの距離、及び１．９ｍｌの内容積を持っていた。対照的に、先の研究（例えば、実施例１及び２）で説明した標準的チャンバーは０．５ｍｌの容積を持っていた。ＡＶ分路は、このチャンバーを充填するためのマトリクスとして使用された特注製のＰＬＧＡディスク２枚の間に挟んだ。このＰＬＧＡはパトリックら（１９９９） により記載された塩浸食法により調製された。３００〜４２０ｎｍの孔サイズ及び８０〜９０％の孔隙率が得られた。このディスクを１００％エタノール中で３０分間４サイクルの機械攪拌により滅菌し、次いで使用前に無菌リン酸緩衝化食塩水で３回洗浄した。
【０１５４】
チャンバー内に該ループを配置した後、チャンバーの蓋を閉じ、このチャンバーを鼠蹊部の皮膚の下に埋め込み、３本の６−０プロレン保持縫合糸で固定した。その傷は４−０絹縫合糸で閉じた。さらに分析するため（グループ当たりｎ＝６）、２、４、６、及び８週インキュベーション時に、全身麻酔の下でラットからチャンバーを収穫した。この動物を心臓内注射によるレトバルブの過剰用量（３ｍｌ）により最後に殺した。
【０１５５】
試料の全量を緩衝化正規食塩水（ＢＦＳ）中で固定し、１ｍｍ切片に切断した。これらの切片の半分を交互の順番でパラフィン中に包埋し、新たに形成した組織及びその血管系の成熟度を組織学的に比較するため、Ｈ＆Ｅで染色した。これらの切片の他の半分は１００％エタノール中で貯蔵し、新たに形成された組織、残っているＰＬＧＡ、及び該試料中のＡＶループのパーセンテージを評価するためグリッド上のポイント計数に使用した。１００ポイントの５番目毎の視野を各組織切片の前及び後について計数した。この目的のために、該切片は計数の前にヘマトキシリン中に簡単に浸漬した。これにより、新たに形成された組織はＰＬＧＡから容易に識別することが可能となった。グリッド上のポイント計数の結果は、新たに形成された組織、残っているＰＬＧＡ及びＡＶループのパーセンテージの計算、及び２、４、６、及び８週におけるこれらの数値の比較を可能にした。新たに形成された組織の重量とＰＬＧＡの重量との間の経時的な統計的相違は、スチューデントのｔ−テストを用いて計算され、ｐ＜０．０５が統計的に有意である。
【０１５６】
重量及び容積測定：チャンバーから収穫された全ての試料を容積及び重量について評価した。流体置換法により測定した該試料の容積は、測定された重量とは統計的に有意に異ならなかった。該試料の総平均重量（容積と等価である）は時間経過と共に減少した。試料の各群の総平均重量±標準偏差（ＳＤ）は２、４、６、及び８週において、それぞれ１．０７±０．０６、１．０３±０．０６、０．９６±０．０６、及び０．８１±０．１８グラムであった。この結果は４週又はそれ以上長い時間間隔では試料重量の減少は統計的に有意であり、これはＰＬＧＡマトリクスの経時的に進行するゆるやかな再吸収によるものであろう。
【０１５７】
該試料中のＰＬＧＡ及び組織の量を、試料の重量の一貫した減少にそれらが関与しているか否かを評価するために研究した。ＰＬＧＡ及び組織が占める試料中のパーセンテージを決定するため、全ての試料をグリッドの助けを借りて顕微鏡によりポイント計数を行なった。試料の湿重量の減少はＰＬＧＡの再吸収に帰せられた。２、４、６、及び８週におけるＰＬＧＡ±ＳＤの総平均重量は、それぞれ０．８９±０．０７、０．５６±０．１４、０．３４±０．０７、及び０．２０±０．０９グラムであった。他方、試料中の新たに形成された組織成分は経時的に重量の漸進的増加を示した。２、４、６、及び８週における組織±ＳＤの総平均重量は、それぞれ０．１３±０．０４、０．４２±０．０９、０．５７±０．０６、及び０．５８±０．１０グラムであった。組織重量の増加は、６週と８週の間の期間を除き、全ての連続時間にわたって統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。この６〜８週の期間では、組織の成長はプラトーに達したが、組織はＰＬＧＡで充填したより小さなサイズのチャンバーでの先の実験（実施例５）で指摘されたような減少を示さなかった。
【０１５８】
顕微鏡による所見：墨汁注射後に、新血管形成は該組織の処理中でも容易に同定できるであろう。新血管系は如何なる時点でもＰＬＧＡ土台の外端に到達しなかった。しかしながら、一つの思いがけない発見において、チャンバーを不注意にも１０か月間ラット中でインキュベートさせたまま放置した。収穫したとき、このチャンバーは柔らかい結合組織で全体が充満しており、この結合組織は十分に血管化されており、該組織「皮弁」へ栄養物を供給する開存した血管を有していた。
【０１５９】
（ｂ）ウサギでのパイロット実験
ラットの実験から得られた予備的結果は、より大きなチャンバーが、標準的チャンバーよりもより多くの組織をより長期間成長させることができたことを示す。大きなチャンバーの壁が無数の孔で穿孔された場合、新たな組織の成長速度、生産された組織の量、及び該チャンバーの端までの成長におけるさらなる改良が見られた（タナカ，Ｙ，２０００、未発表の所見） 。これらの後者の条件は、このモデルにおける組織成長のための最適条件に近づく。このパイロット研究の主要な目的は、組織生産がラットのサイズの８〜１０倍の動物で規模拡大ができるであろうか否か、及び該組織がそのサイズ及び形状を維持するであろうか否かを評価することであった。
【０１６０】
使用した実験モデルは、実験動物はニュージーランド白ウサギであったものの、閉じ込められた成長チャンバー内の基本的ＡＶ分路ループであった。
【０１６１】
カルプロフェン（１．５ｍｇ／ｋｇ、皮下）の形で手術前の痛覚脱失を与えた。ニュージーランド白ウサギ（２．０〜２．８ｋｇ）をペントバルビトン（３０ｍｇ／ｋｇ）の静注で麻酔にかけ、ハロタン及び酸素（２．０Ｌ／分）を顔面マスクの下で維持した。無菌条件下でそれぞれ４〜６ｃｍの移植片（ウサギ）を左大腿部静脈から採取し、分割した右大腿部動脈の近位末端と静脈の間にＡＶ分路を作成するために使用した。このＡＶ分路を、この場合、ポリウレタン製で、３．０ｃｍの直径、２．０ｃｍの高さの大体の大きさを持ち、血管の入口と出口のための開口部を持つ（図２）ドーム型チャンバー内に配置した。ある場合には、ウサギの解剖によりＡＶループではなくＡＶ柄の使用が可能になった。何故なら、該柄を取り巻く組織内の小さな結合血管がそれを天然に生ずる流通ループとしたからである。この後者の例では、ＡＶ血流の効果は匹敵したが、手術時間及び術後の苦痛は少なかった。通常の構造では、このチャンバーはチャンバー壁内に複数の小さな穿孔を有していた。鼠蹊部の皮下脂肪を脂肪細胞及び脂肪原前駆体細胞の供給源として使用した（ズクら，２００１） 。この脂肪組織を１８ゲージ針を通して注射することにより粗スラリーを形成させた。これらの細胞は同じウサギにより供与されそして同じウサギに移植された。
【０１６２】
ＡＶ分路ループ又はＡＶ分路柄を、チャンバーに適合するように機械加工されたＰＬＧＡ、マトリゲル、１型ブタ皮膚コラーゲン又は類似の適当な組成物、及び前脂肪細胞濃縮脂肪組織スラリーの組み合わせからなる３次元マトリクスを充填されたチャンバー内に配置した。ついで、該マトリゲルをゲル化とした。蓋を閉じ、チャンバーを鼠蹊部皮膚の下に埋め込んだ。傷は４−０ナイロン縫合糸で縫合した。
【０１６３】
約６〜８週の後、該動物を再び全身麻酔の下で、チャンバーをその関連する血管と共に鼠蹊部及びチャンバーから取り出した。二つの皮弁は今日までに分析した。
【０１６４】
チャンバー中の組織を取り出し、その湿重量を記録した。該組織を細かい綿縫合糸で吊るし、秤上の水を入れたビーカー中にその全体を浸漬した。密度を１．００ｇ／ｍｌとすれば、その質量はその組織の容積である。試料を緩衝化正規食塩水（ＢＦＳ）中で固定し、パラフィンに包埋し、そしてＨ＆Ｅ又はマッソンズトリクローム（結合組織染色）のいずれかにより染色した。
【０１６５】
８週の成長の後、形成された新たな組織の容積は（１２ｍｌと見積もられたチャンバーの総容積と比べて）１０〜１１ｍｌであった。該皮弁の組成は脂肪及び他の結合組織の混合物であると判断された。その形状は同じ雄性ウサギの乳頭の下に移植された場合には保存され、そしてその容積はこの動物に中程度のサイズの乳房の構築を可能にするのに十分であった（図６参照）。
【０１６６】
本発明者らはラット及びウサギで臨床的に有用な量の組織の生産を達成した。こうして生産された組織は乳房再構築及び同様な適用に潜在的に適するサイズ及び形状のものであった。その関連する開存した血管を持つこのような皮弁は再構築用として身体の別の部分に移植される能力を有する。
【０１６７】
実施例１１−マウスにおける血管化組織工学の新しいモデル
組織工学の基本的プロセスを研究するためには、以下の理由から、マウスにおける適当な組織工学モデルを開発することが望ましい。
【０１６８】
遺伝子技法：トランスジェニック技法及び遺伝子ノックアウト技法はマウスで大きく前進し、成長促進因子や成長阻害剤などの組織工学に関与する幾つかの因子の影響を探査することを可能にした。
【０１６９】
幹細胞生物学：幹細胞はあらゆる組織を生ずる多能性の細胞であり、幹細胞は極めて丈夫であり、従ってチャンバーの最初は具合の悪い虚血性の環境に理論的には耐えることができる。これは幹細胞をチャンバーに接種するための魅力的な細胞とする。幹細胞生物学者は、特定の組織型を形成しようと試みるため、該マウスモデルに接種できるマウス中の多様な幹細胞下位型をクローニングした。
【０１７０】
費用：マウスを使用する場合には費用面でのかなりの利点もある。マウスの購入、容器及び飼育はより大きな動物の場合よりも低廉である。また、成長因子などの高価な実験室消費物の使用が減少する。
【０１７１】
本発明者らは、マウスを使用するための最良の技法を決定するため、先の研究で血管形成性であることが示された二つの異なる型の血管構造を研究した。第１は大腿部の動脈と静脈の結紮動静脈柄（ＡＶＰ）（クホウリら，１９９３、図３）であり、そして第２は「流通ループ」柄（ＦＴＬＰ）構造（モリソンら，１９９０、図４）であった。
【０１７２】
ポリカーボネートチャンバーは、ラットモデルで使用する場合、高速流の微小外科的動静脈ループの開存率に悪影響を与えなかった。これらの動物はそれにも十分耐えた。しかしながら、この材料は固くそして鋭い端を持っており、マウスにおいて提唱された血管構造及びより小さな直径の血管のより低い流速のため、該動物における開存率に悪影響を与えるかも知れないと感じられた。従って、該チャンバーの構築において使用するために最も適当な材料を決定するため、ポリカーボネートチャンバーとより柔らかいシリコンチャンバーとを比較した。本発明者らは、どれが血管形成及び組織成長に関して最良であるかを判断するため、マウスにおいてラットモデルで使用した二つの主な細胞外マトリクス（マトリゲル及びＰＬＧＡ）をも比較した。全部で８８匹のＣ５７ＢＬ／６野性型マウス（雄性及び雌性、１８〜２４ｇ体重）を用いてこの一連の実験を行なった。
【０１７３】
まず、二つの血管構造を、特別に構築したポリカーボネートチャンバーを用いて検討した。第１のものは、ラットでクホウリら（１９９３） により記述されたようなマウス大腿動静脈の結紮ＡＶＰであった（図３）。第２はモリソンら（１９９０） により記述されたようなポリカーボネートチャンバーの改良版内に閉じ込められた表面の心窩部血管を含むＦＴＬ柄であった（図４）。両方の血管構造に対して６匹の動物からなる３群を用いた。各構造を、２、４、及び６週で検討した。この実験は、細胞外マトリクスとして、Ｍａｔｒｉｇｅｌ （登録商標） とＰＬＧＡの両者を用いて行なった（ｎ＝２×２×３×６＝７２）。
【０１７４】
全ての手術は全身麻酔の下で行なった（抱水クロラール、４ｍｇ／ｇ体重、腹腔内）。右側鼠蹊部及び前脚の毛を、クリッピング及び除毛クリームを組み合わせて用いて除去した。その皮膚の汚れをアルコール標品を用いて落とした。結紮柄法は鼠蹊部の縦溝から皮膚を通して見える伏在静脈からの丁度枝分かれの膝まで伸びる垂直の切開を必要とする。伏在静脈血管は膝の位置で結紮し、ついで鼠蹊部靱帯で大腿動脈の起源にもどるそれらの随伴する神経から切り離す。この流通モデルは鼠蹊部脂肪パッドの丁度上に位置する横断的鼠蹊部切開を用いて行なった。表面の心窩部（ＳＥ）血管を、約１ｃｍの距離で、大腿血管のその元から鼠蹊部脂肪パッドへの入口までを周囲の組織から切り離す。ここで、該血管はそれらの周りの脂肪組織及び腺組織に栄養物の支流を送る脂肪パッドの中を進む。次いで、それらは鼠蹊部靱帯の側面で腹壁に入る腸骨鼠蹊部血管（腎臓下の動脈の直接の支流）と直接吻合して側面から脂肪パッド中に入る。脂肪パッド全体は皮膚及び下層にある筋肉から自由に動くことができ、こうしてチャンバーが導入されうる空間を創る。従って、ＳＥ血管は両側からの動脈の入口と静脈の出口を持ち、それがこのモデルにおける長期間の開存率を増強するであろうと本発明者らは感じた。本発明者らの知る限りでは、これは、この血管配置がマウスで記述された最初である。ＳＥ血管（脂肪パッドを含まない））の最初の１ｃｍを次に分かれている改良されたポリカーボネートチャンバーの下側に閉じ込め、適当な細胞外マトリクス（マトリゲル又はＰＬＧＡ）を該チャンバー内に挿入する。次いで、このチャンバーを溶融骨ワックス（Ｅｔｈｉｃｏｎ ｂｏｎｅ ｗａｘ （商標））を用いて近位末端及び側面割れ目に沿って密閉する。このとき、加熱したワックスが直接血管に適用されないように注意する。この密閉は側面割れ目のいずれかを２本の１０／０ナイロン微小縫合することにより増強され、チャンバー全体は柄が術後の移動の間に追い出されるのを防止するためＳＥ血管の元の位置の近くの下層筋肉に固定される。該血管が脂肪パッド中に入るときその周りの脂肪組織の少量が該チャンバーの遠位の末端を「塞ぐ」ことが可能である。この栓は次にワックス密閉で強化され、そして構築物全体をそれが大腿部血管の横で切開された空間の中に位置するように、注意深く鼠蹊部に配置される。その傷は、これらの動物がその傷の場所を噛み切る傾向があるので、埋め込まれた断続的な水平のマットレス縫合及び走行縫合（両者とも６／０絹）の組み合わせを用いて閉じる。
【０１７５】
各グループの結果の初期の解析の後、結紮ＡＶＰグループの実験を中止した。これは、血栓症の割合が許容できない程高く（１１／１４動物）、この線での研究の遂行は無駄であり、動物の浪費であると思われたからである。この観察はラットでのクホウリの研究及び結紮ＡＶＰが大部分のケースで開存の状態を維持したラット及びウサギでの本発明者ら自身の経験とは対照的である。本発明者らの研究における血栓症の高率に対する最も可能性の高い理由はマウスの血管が極めて小さく（内径が約０．２ｍｍ）且つ切開に対して極めて感受性であることである。このサイズの血管における流速も極めて遅い。ＦＴＬＰグループにおける血栓症の割合はより良好（３／１１）であったが、なお極端に高いように思われた。
【０１７６】
本発明者らは使用していたポリカーボネート材料がマウスのデリケートな血管には堅過ぎそして鋭ど過ぎであったと仮定した。本発明者らの実験計画は医学グレードのシリコンから作成されたチャンバーを一群の動物に含めるように改良した（この改良についてはアニマル・エシックス・コミティーの承認を得た）。流通血管構造のみを用いるこの改良された実験のために各４動物からなる３群のうちの２群（１はＰＬＧＡで、１は Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標） で） を用いた（ｎ＝２×３×４＝２４）。この試料の容積及び重量の正確な評価は不可能であることが分かった。該チャンバーの容積は約８０〜１００μｌである。これはチャンバーの入口点を浸食する脂肪又はワックスの量などの幾つかの理由により変動する。また、各チャンバーで使用される細胞外マトリクスの正確な容積を測定することは困難である。マトリゲルは通常液体として添加され、イン・ビボでゲル化させられる。注入の間又はチャンバーの操作の間に幾らかこぼれるかも知れない。本発明者らは、マトリゲルの容積が最初の２週の間に少なくとも５０％まで減少し、取り出された試料が挿入されたものよりも実際に少なかったことに注目した。
【０１７７】
各チャンバーに使用されたＰＬＧＡの重量は正確に測定できるであろうが、その容積は確認することが困難であった。何故なら、その構造は多孔性であり、小さなチャンバーにそれを容易に適合させるために粒子に砕かねばならなかったからである。これらの不確実さを考慮して、本発明者らはチャンバー組織を定量的に評価することを試みず、本装置のより定性的な側面、例えば新たに形成された組織の形態などに注目した。該血管の開存度は微小外科的検査によりそして墨汁灌流研究により測定した。血管がチャンバー内で広く血栓を生じた場合は、顕微鏡の操作下で通常これを見ることが可能であった。しかしながら、確定的開存度を確認することは常に可能であるとは限らなかった。従って、墨汁灌流研究は犠牲前に各動物に全身麻酔をかけて実施した。顕微鏡操作下で鼠蹊部切開部を再度開き、該柄を損傷しないように気を付けながらチャンバーを露出させた。次いで開腹手術を行い、腹部大動脈を大静脈から切り離し、微細な（３０Ｇ）中空シリコン管を用いてその直ぐ下の腎臓管中にカニューレ挿入した。次いで、該カニューレを正確な位置に確実に配置するため、ヘパリン化食塩水でこれをフラッシュした。次に、ｍｌ当たり１０国際単位のヘパリンを含む市販の純粋な墨汁を、動物の肝臓が完全に黒くなるまで拍動方式で温和な手動圧により注入した。先の記述はこの溶液におけるゼラチンの使用を記したが、本発明者らのこの技法の予備的試行では、本発明者らは該ゼラチンが微細な中空の管を遮断する塊を形成し、この方法を失敗に導く（これは該ゼラチンが注入の前に体温まで加温された場合でさえ起こった）ことを見出した。墨汁が血管柄に沿ってチャンバー中に入るのを明確に追跡できたので、開存度は透明のチャンバーの直接観察により確認できた。この後で、フェノバルビトンの致死量の過剰投与により該動物を犠牲にし、そしてチャンバーを、該装置への入口での該柄の出水をカットしながら注意深く除去した。
【０１７８】
この試料をホルマリンで固定し、無水アルコールまで勾配を付けたアルコールを通した。次いで、該試料をサリチル酸メチル中に浸漬し、７２時間以上かけて綺麗にした。これは墨汁を灌流させた樹状血管を直接見ることができた。全ての試料を次にマイクロケーターの下で全搭載試料として検討し、血管の計数を行なった。この後、該試料を組織学的検査のために処理し、ワックス中に包埋した。次いで、このワックスの塊を５μｍで切片とし、ヘマトキシリン及びエオジンを用い標準的手法で染色した。血管面積の密度は、これらの小さな組織標本の深さの全体を可視化させるマイクロケーターを用いて綺麗にした標本全てについて評価した。３個の視野を５００μｍの３深さ間隔で無作為に選択し、血管密度を体積測定用のグリッドを用いて評価した。この処理の完了後に、該標本を組織学的処理に委ねた。染色した切片を血管形成及び新たに形成された組織の細胞学的特徴の観点から形態学的に評価した。スチューデントｔ−テストを用いて開存率及び血管密度の単変数解析を行なった。開存率は、２血管構造について及びチャンバーの材料として用いられた異なる材料について評価した。
【０１７９】
結紮した動静脈柄の開存率は、流通柄の８８％に対して２１％であった。ポリカーボネートチャンバーにおけるこの開存率（結紮ＡＶ柄グループを除く）は、シリコンチャンバーの９７％に対して８８％であった。結紮ＡＶＰグループにおける新たな血管は、チャンバーの外から生じ血栓の生じた柄に沿って成長するのが見られた。流通チャンバーにおける血管密度は２、４、及び６週で類似であった。同様に、ＰＬＧＡとマトリゲルの間には血管密度の差はなかった。形態学的には、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）及びＰＬＧＡでの良好な血管形成があったが、定性的には Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の方がより良好であった。新たな血管は Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で数もより多くそして構築物の全体に生じた。ＰＬＧＡでの血管形成は該構築物の周辺部でより多く、中央付近では血管数はより少なかった。これはおそらくこのＥＣＭの固体の性質によるものであろう。
【０１８０】
細胞形態学的な側面では、ＰＬＧＡはほとんどが繊維状である外来物体型の反応を促進するようであった。繊維芽細胞はマトリクスがチャンバー壁に相対している周辺部及び該マトリクスの物質内である中央部の両方で見られた主要な細胞である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ （登録商標） グループはＥＣＭとチャンバーの境界において繊維芽細胞の応答をも示した。他方、Ｍａｔｒｉｇｅｌ （登録商標） の中央部はチャンバー内の脂肪の存在を示し、この脂肪は明らかにこのマトリクスを通って移動し、そして生存していた。おそらく新たに形成された樹状血管により栄養補給を受けていたのであろう。この現象は、成長因子及び前脂肪細胞を用いて、マウスで、閉じ込められていないＭａｔｒｉｇｅｌ （登録商標） で前に報告された。チャンバー中の成熟した生存脂肪の存在から、このモデルが脂肪細胞及びそれらの前駆体の移動、成熟及びおそらく再生を支持できることが示唆される。雌性動物では、この脂肪パッドは、この組織が遠位の裂け目を密閉するための「栓」として使用されるチャンバーの遠位の部分で時折見出される一部の乳房組織及び関連する管を含んでいる。マトリゲルグループでは、本発明者らは、これらの動物の一部で、乳房の管／腺房の組織がマトリゲル中に成長していくように思われ、他の動物では、新たに形成されつつある管／腺房組織の明瞭な形態学的証拠があることを観察した。これは、該チャンバーが脂肪と同様に腺組織の発生を支持できることを示唆する。本発明者らの知る限りでは、これは以前には報告されなかったことである。
【０１８１】
本発明者らはＣ５７インモルトマウスから培養されたマウスの間充織幹細胞のクローン及びマウス乳房腫瘍細胞系統をもチャンバーに接種した。両者とも蛍光マーカー（ＧＦＰ又はＣＦＤＡ）で標識した。そして本発明者らは移植した細胞が４８時間、４日、２週、４週及び８週で生存していたことを証明することができた。この乳房腫瘍系統を４週で組織学的に見て、該チャンバーが細胞系統をより長期間支持できることを証明した。本発明者らは免疫不全ＳＣＩＤマウスの胎児の膵臓、肝臓、心臓、腸、及び四肢の芽状突起（皮膚、骨、軟骨、筋肉、血管及び神経の複合体）をも首尾良く成長させた。これと同様に、本発明者らは野性型マウス（Ｃ５７ＢＬ６）で、２及び１０週生存しホルモンを生産する成熟膵臓島を培養することに成功した。これは本発明者らが他の膵臓移植モデルで達成されなかったこれらの動物での機能性の島の同種移植を成長させるのに成功したことを効果的に示す。これは、該チャンバーが、その中で成長する細胞にある種の免疫特権状態を付与しうることを意味する。これは、真正糖尿病の治療として局部的免疫抑制又はセルトリ細胞の共培養をしたり又はせずに、該チャンバー中で不適合な同種移植又は異種移植でさえも行なうことが可能になるという点で治療上の意味も有する。
【０１８２】
本発明が、明確性及び理解のために、かなり詳細に記述されたが、ここに記述したこれらの実施態様及び方法の種々の修正や変更が本明細書に開示された本発明の概念の範囲を逸脱することなくなされうるであろうことは当業者には明らかである。
【０１８３】
本明細書に引用された参考文献は以下のぺージに列挙されており、参照により本明細書にインコーポレートされる。
【０１８４】
参照文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、大腿動静脈を同程度の直径を有する静脈移植片に顕微手術によって吻合してループ（分路）を形成する方法を示している。図示したようにしてＡＶループをプラスチック製チャンバー（ポリカーボネート又はポリＬ乳酸などでできている）内に置き、蓋を閉め、任意にチャンバーに細胞又は成長因子を添加していてもしていなくてもよい細胞外マトリクスを充填する。このチャンバーは、外部の孔を通る支持縫合により周辺組織に対して適当な位置に固定する。
【図２】図２は、傷口の破れを抑えるためにチャンバーの蓋がドーム状になっていて、チャンバーの両端がより丸みを帯びている点を除いて、図１と同様の構成を示す。
【図３】図３は、上記血管柄モデルに使用される薄壁チャンバーの具体例を示す。この場合、動静脈は遠位に結合され、互いに隣接する状態に置かれる。顕微手術により動静脈間を接続し、図１と図２と同様にしてＡＶループを形成する。
【図４】図４は、チャンバーの一端に血管出口孔が設けられている点を除いて、図３のものと同様のモデルチャンバーを示す。これにより、並列され、一部の変形においては細胞外マトリクスで囲まれている、一定の長さで切り出されて分割されていない血管に新しい組織を形成させる。
【図５】図５は、挿入後７日目のＡＶループ含有チャンバーの内側を示す。倍率１６０倍の蛍光顕微鏡は、標識線維芽細胞がチャンバー表面に均一に分布していることを示す（実施例２参照）。
【図６】図６は、同一ウサギの遠隔部位（鼠径部）に作成した血管化させた組織工作脂肪及び結合組織皮弁を用いて構築した雄性ウサギの再建「乳房」を示す（実施例１０参照）。

Claims (27)

1. 血管化組織の移植処置を必要とする受容体動物に移植するのに適した供与体の血管化組織を製造する方法であって、
   （ａ）供与体における血管柄に機能性の循環を創出する工程、
   （ｂ）該血管柄の一部又は全部を作成されたチャンバー内に閉じ込める工程、
   （ｃ）該チャンバーに単離された細胞又は組織片を接種する工程、
   （ｄ）そのような解剖学的構築物を創出できる供与体の部位に該血管柄を含むチャンバーを移植する工程、及び
   （ｅ）血管化された新たな組織を成長させるのに十分な期間の間その移植部位に該チャンバーを放置する工程、
   を含む方法。
2. 工程（ａ）の後に、細胞外マトリクス及び／又は機械的支持体を添加して血管柄を取り囲む工程を含む、請求項１記載の方法。
3. 工程（ｂ）の後に、成長因子、薬物、抗体、阻害剤、又は他の化学物質をチャンバーに添加する工程を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
4. 血管柄が動−静脈（ＡＶ）ループ又は分路を含むものである、請求項１記載の方法。
5. 血管柄が連結された動脈及び静脈を含むものである、請求項１記載の方法。
6. 工程（ｅ）のチャンバーが移植部位に少なくとも４週間放置されるものである、請求項１記載の方法。
7. 工程（ｅ）のチャンバーが移植部位に少なくとも６週間放置されるものである、請求項１記載の方法。
8. チャンバー内に含まれる該創出される血管柄が体外循環装置に連結されるものである、請求項１記載の方法。
9. 工程（ａ）の供与体が哺乳動物である、請求項１記載の方法。
10. 該哺乳動物がヒトである、請求項９記載の方法。
11. 該血管化された新たな組織を同一個体の受容体に移植する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
12. 該血管化された新たな組織を異種の受容体に移植する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
13. 添加される細胞外マトリクスが再構成された基底膜調製物、ポリ乳酸−ポリグリコール酸変異型（ＰＬＧＡ）、フィブリン又は血漿の糊、及び天然のコラーゲンから成る群より選択されるものである、請求項２記載の方法。
14. 該ＰＬＧＡがＰＬＧＡスポンジを含むものである、請求項１３記載の方法。
15. チャンバーに添加される付加的な成長因子、薬物、抗体、阻害剤、又は他の化学物質が、成長因子、循環から幹細胞を引き寄せる帰巣因子、外因性成長因子及び血管新生又は血管形成の促進剤から成る群より選択されるものである、請求項３記載の方法。
16. 工程（ｃ）の単離された細胞又は組織片が宿主にとって自己由来のものである、請求項１記載の方法。
17. 工程（ｃ）の単離された細胞又は組織片が宿主にとって異種由来のものである、請求項１記載の方法。
18. 工程（ｃ）の単離された細胞又は組織片が幹細胞、虚血状態になった骨格筋組織、ミオ−Ｄでトランスフェクトされた筋芽細胞、ケラチン生成細胞、筋芽細胞、繊維芽細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、心筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、周囲細胞、ストロマ前駆体細胞に由来する骨髄、シュワン細胞、及び末梢神経系や中枢神経系の他の細胞、嗅覚細胞、肝細胞及び肝臓の他の細胞、糸状体間質細胞及び腎臓の他の細胞、膵臓の島β細胞及び管細胞、甲状腺細胞、他の内分泌器官の細胞、骨格筋及び心筋の一部、膵臓、肝臓、精巣及び他の皮下脂肪、神経、腎臓、腸、卵巣、子宮、睾丸、及び内分泌器官由来の腺組織から成る群より選択されるものである、請求項１記載の方法。
19. 工程（ａ）の血管柄についての機能性の循環が動脈と静脈を含むものである、請求項１記載の方法。
20. 工程（ａ）の血管柄についての機能性の循環が動脈、静脈移植片、及び静脈を含むものである、請求項１記載の方法。
21. 工程（ａ）の血管柄についての機能性の循環が動脈、静脈移植片、動脈移植片、及び静脈を含むものである、請求項１記載の方法。
22. 工程（ａ）の血管柄についての機能性の循環が平行して置かれた動脈と静脈の連結された切株末端を含むものである、請求項１記載の方法。
23. 請求項１に記載の方法により製造される血管化組織移植片。
24. 下記の工程、即ち
    （ａ）請求項２３に記載の血管化組織移植片を創り出す工程、
    （ｂ）所望の、サイズ、血管系、及び分化程度を持つ組織を生産するのに十分な期間だけ移植片を供与体中に保持する工程、
    （ｃ）所望の受容体部位に移植片を移植する工程、及び
    （ｄ）移植片の血管を動脈及び静脈の局部に吻合する工程、
    を含む、組織欠損を修復する方法。
25. 下記の工程、即ち
    （ａ）請求項２３記載の血管化組織移植片を創り出す工程、
    （ｂ）所望の、サイズ、血管系、及び分化程度を持つ組織を生産するのに十分な期間だけ移植片を供与体中に保持する工程、
    （ｃ）所望の受容体部位に移植片を移植する工程、及び
    （ｄ）移植片の血管を局部の動脈及び静脈に吻合する工程、
    を含む、組織を増大させる方法。
26. 下記の工程、即ち
    （ａ）請求項１の方法により組織チャンバー中で血管化組織を創り出す工程、
    （ｂ）その血管化組織を持つ該チャンバーを取り出し、イン・ビトロでそのチャンバー集合体を培養する工程、
    （ｃ）チャンバー中の組織の細胞を所望の遺伝子で形質転換する工程、及び
    （ｄ）チャンバーと共に又はチャンバーを除いて血管化組織をこのような処置を必要とする患者に移植する工程、
    を含む患者に遺伝子生産物を送達する方法。
27. 請求項１に記載の方法により生産される単離された血管柄を含む組織チャンバーを含む血管化組織のためのモデル系であって、組織チャンバーが体外循環装置にそして腎臓透析フィルターへ機能しうるように連結されているものであるモデル系。

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