KR20140146220A - 동결된 제대조직으로부터 유래하는 생존가능한 세포 - Google Patents
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Abstract
생존가능한 전구세포는 동결된 제대조직으로부터 추출된다. 구체예에서, 제대조직은 혈관주위 워튼 젤리를 갖는 혈관이고, 추출된 전구세포는 HUCPVCs이다.
Description
본 발명은 제대 (UC; umbilical cord)의 결합 조직으로부터 급속하게 증식하는 인간 세포 군집의 수확; 골원성, 연골형성, 지방생성 또는 근원성 조건에서의 이러한 세포의 배양; 그들의 세포 표면 조직적합성 항원의 부족에 의해 나타나는 바와 같이 면역학적으로 부적격인 이들 군집 내에서의 세포의 높은 비율의 입증; 및 다양한 세포-기본 치료법을 위한 다능전구세포의 공급원으로서 사용될 이들 세포의 능력에 초점이 있다. 더욱 특히, 본 발명은 이러한 생존가능한 전구세포에 대한 공급원으로서의 동결된 조직의 용도에 관한 것이다.
UC는 추후의 장배형성 (3개의 배아 배엽층의 형성)을 구성하는 제1 구조 중 하나이다. 폴딩 (folding)이 시작됨에 따라서, 배아 원반은 다시 제대 혈관를 형성하도록 발생하는 난황 및 요막 혈관을 통해 원시 중간장관 (배아 기원)에 의해 원시 난황난 (외부-배아 기원)에 결합된다 [Haynesworth et al., 1998; Pereda and Motta, 2002; Tuchmann-Duplessis et al., 1972]. 이들 혈관은 워튼 젤리 (WJ; Wharton's Jelly)라 불리는 최초 외부-배아 유도의 원시 중간엽 조직으로 일반적으로 고려되는 것 내에 지지되고, 그에 의해 둘러싸인다 [Weiss, 1983]. 이 초기 단계로부터, UC는 임신 중에 성장하여 출생때 보여지는 30-50 cm 제대가 된다. 따라서, WJ는 섬유모세포-유사, 또는 문헌 (하기 참조)에 기재된 근육-섬유모세포-유사 세포뿐만 아니라 배아 및 태아 발생 동안 제대의 성장을 지지하기 위해 필요한 WJ의 확장 부피의 세포를 유발할 수 있는 전구세포의 군집을 함유한다는 것이 예상될 수 있다.
WJ는 그의 논문 아데노그라피아 [Adenographia in 1656]에 공개한 토마스 워튼 (Thomas Wharton)에 의해 처음 기재되었다. 그 후에, 이것은 히알루론산 [Schoenberg et al., 1960]을 비롯한 프로테오글리칸, 및 다양한 유형의 콜라겐 [Nanaev et al., 1997]으로 이루어진 무정형 기저 물질에 분산된 세포로 구성된 젤라틴성의 느슨한 점액질 결합조직으로서 정의되었다. 매트릭스에 분산된 세포는 붕괴된 제대의 모양에서 방사상이고, 팽창한 제대에서는 길게 늘어나는 "섬유모세포-유사"로서 기재되어 있다 [Parry, 1970]. 평활근 세포는 초기에 매트릭스 내에서 관찰되었지만 [Chacko and Reynolds, 1954], 이는 이들을 외면상으로 평활근 세포를 닮은 다소 "비정상인 섬유모세포"로서 기재한 파리 [Parry, 1970]에 의해 이의가 제기되었다. 그 후에, 타케치 등 [Takechi et al., 1993]이 이들 세포 상에서 면역조직화학 조사를 수행한 1993년까지 이들 세포를 특정화하는 작업은 거의 없었다. 이들은 세포를 "무정형 기저 물질에서의 콜라겐 섬유의 장기간 세포질 프로세스 및 파형 네트워크를 갖는 "방추형 또는 방사형"인 "섬유모세포-유사"로 기재하였다 [Takechi et al., 1993]. 면역조직화학 염색을 위해서, 이들은 어떤 유형의 미오신이 WJ 섬유모세포와 결합하는지를 측정하기 위해 액틴 및 미오신 (세포질 수축성 단백질), 비멘틴 (배아 중간엽 기원의 섬유모세포의 특징) 및 데스민 (근원성 기원의 세포에 특이적임)에 대한 1차 항체를 사용하였다. 이들은 높은 수준의 화학적으로 추출가능한 액토미오신을 관찰하였으며; 비록 섬유모세포는 세포질 액토미오신을 함유하지만, 이들은 액틴 또는 미오신에 대해 염색되지 않은 반면, WJ 섬유모세포는 둘 다에 대해 양성으로 염색되었다. 또한, 비멘틴 및 데스민 둘 다에 대한 양성 염색이 관찰되었으며, 이는 WJ 중의 이들 변형된 섬유모세포가 원시 중간엽 조직으로부터 유도되었다는 결론을 유도하였다 [Takechi et al., 1993]. 그 후의 더 최근 연구 [Nanaev et al. (1997)]는 조산된 제대에서 증식성 중간엽 전구세포 분화의 5 단계를 입증하였다. 이들의 발견은 근섬유모세포가 WJ 매트릭스 내에 존재한다는 제안을 지지하였다. WJ 세포의 면역조직화학적 특징은 골 형태발성에서 골원성 세포의 주요 공급원으로 공지되고, 또한 배양액에서 콜로니 형성 단위-골모세포 (CFU-O) [Aubin, 1998]로서 불리는 골 결절을 형성할 수도 있는 혈관주위세포의 특징과 두드러진 유사성을 나타낸다 [Canfield et al., 2000].
최근 공개문헌에는 UC 혈액보다는 UC로부터 세포를 수확하는 방법이 보고되어 있다. 미첼 등 [Mitchell et al., 2003]은 제대 혈관을 먼저 절단하여 제거하고 잔존 조직을 수확하는 방법을 기술하고 있다. 잔존 WJ (제대 혈관이 WJ 내에 완전히 둘러싸여 있기 때문에, 이들 중 일부는 혈관과 함께 제거된다) 및 양막 상피 둘 다를 포함할 잔존 조직은 이어서 주사위꼴로 절단하여 소조직 단편을 생산하고, 이것을 조직 배양 플레이트에 옮긴다. 이들 조직 단편은 이어서 1차 이식편으로 사용되며, 이것으로부터 세포가 배양 하층 상으로 이동한다.
또 다른 공개문헌에서, 로마노브 등 [Romanov et al., 2003]은 이들이 중간엽 줄기세포-유사 세포를 제대 혈관계로부터 단리하는 데 성공적이었다는 것을 시사하고 있지만, 이들은 또한 그의 배양액이 WJ로부터 유래하는 세포를 함유하지 않았음을 시사하고 있다. 구체적으로는, 이들은 혈관 내피 및 내피하 세포의 혼합 군집을 수득하는 제대 정맥 내로부터의 단일 15 분 콜라게나제 분해 (digestion)를 사용한다. 로마노브 등은 희박한 수의 섬유모세포-유사 세포가 7일 후에 이 세포 수확물로부터 나타난다는 것을 보여주었다.
또한, 미국 특허 제5,919,702호에는 인간 UC의 WJ로부터 "전-연골세포"를 단리하는 방법, 및 연골을 생산하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 특히, 상기 방법은 제대의 1인치 절편을 세로로 슬라이스하여 개방하고, 혈관 및 '케이싱 (casing)' (이들은 후에 제거된다)을 절개하고, WJ를 멸균 용기 내에 수집하고, 여기에서 WJ를 배양을 위해 2-3 ㎣ 절편으로 절단하는 단계를 포함한다. 바람직한 방법에서, 세포는 WJ의 2-3 ㎣ 절편을 페트리 디쉬의 바닥에 있는 유리 슬라이드 상에 놓고, 이것을 또 다른 슬라이드로 덮고, 이것을 '전-연골세포'가 배양 디쉬 표면으로 이동하도록 하기 위해 10-12일 동안 배양함으로써 단리된다.
2005년 7월 7일에 공개된 미국특허출원 제US2005/0148074호에서 데이비스 (Davies) 등은 혈관주위 부분이라 불리는 워튼 젤리의 특유한 부분으로부터 유래하는 독특한 전구세포 군집의 단리를 기술하였다. 이 부분에서 워튼 젤리는 제대 혈관의 외벽 상에 존재하거나, 이 외벽에 결합되며, 이들을 제대로부터 절제하는 경우에 혈관과 결합된 상태로 남는다. 전구세포 군집은 현저하게 짧은 배가시간을 가지며, 다능성이며 지방, 골, 연골, 근육 및 내피를 포함하는 다양한 중간엽 조직을 발생시키는 세포; 자발적으로 골-형성 골모세포로 분화하는 세포; 및 MHC 클래스 I 및 클래스 II 마커가 결여된 세포를 포함하는, 광범한 유용한 특성을 갖는 전구세포를 포함한다.
따라서, 제대조직은 조직공학 및 그 밖의 다른 의료과정에서의 사용을 위한 전구세포 및 그 밖의 다른 세포의 중요한 공급원이 될 수 있다. 현재의 관례는 극저온 상태하에 제대-유도된 세포의 장기간 저장, 및 이들로부터 생존가능한 세포의 회수를 허용한다. 그러나, 제대세포 그 자체와는 완전히 다른 동결 또는 극저온으로 저장된 제대조직으로부터 생존가능한 세포의 회수를 허용하는 기술은 아직 개발되지 않았다. 따라서, 제대조직으로부터 생존가능한 세포의 회수가 필요한 경우에, 원하는 조직을 추출할 수 있고, 원하는 세포를 이들 세포가 여전히 생존가능하면서 단리, 배양 및 동결 저장될 수 있게 하기 위하여 기술자들은 제대조직을 그것이 신선할 동안에, 통상적으로 제대를 추출한 후 24시간 이내에 처리하도록 신속히 행동하는 것이 필요하다.
<발명의 요약>
본 발명에 이르러, 생존가능한 세포가 동결된 제대조직으로부터 회수될 수 있음이 결정되었다. 따라서, 본 발명은 동결된 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 수요에 따라 (on-demand) 추출하기 위한 지속적인 공급원을 제공하기 위한 산후를 기초로 하여 이러한 조직을 극저온 상태에서 "뱅킹 (banking)"하는 방법을 계획한다.
더욱 특히, 이러한 관점 중의 하나에 따르면, 본 발명은 산후에 제대조직을 수득하고, 산후 제대조직을 동결시키는 단계를 포함한다. 바람직한 관점에서, 본 발명은 생존가능한 세포를 포함하는 제대조직을 수득하고, 제대조직을 혈청-함유 세포배양 배지를 포함하는 동결보존용액 (cryopreserving solution)과 조합하고, 조합물을 일차로 동결보존제(cryopreservant)가 조직에 침투하도록 허용하는 온도에서 일정한 기간 동안 액체로서 냉동시키는 동결과정에 이 조합물을 적용시키고, 냉각된 조합물을 동결시킨 다음에 동결된 조합물을 극저온 상태하에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 제대조직 내에 존재하는 세포의 생존력을 보존하기 위해서 적용된다.
이러한 관점들 중의 또 다른 것에 따르면, 본 발명은 제대조직을 동결된 형태로 수득하고, 동결된 조직을 해동시키고, 해동된 조직으로부터 생존가능한 세포를 추출하는 단계를 포함하여, 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 수득하는 방법을 제공한다. 바람직한 관점에서, 본 발명은 특히 본 발명의 방법에 의해서 동결되고, 임의로 극저온 상태로 저장된 제대조직을 수득하고, 동결된 조직을 해동시키고, 해동된 조직을 세척하여 동결보존제를 제거하고, 생성된 조직으로부터 생존가능한 세포를 추출하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 회수하기 위해서 적용된다.
따라서, 이러한 관점들 중의 또 다른 것에서 본 발명은 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 수득하는 방법을 제공하는데, 여기에서 세포는 미리 동결된 제대조직으로부터 추출된다.
추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해서 제조된 경우에는 언제나 생존가능한 상태로 회수될 수 있는 전구세포를 포함하는 동결된 상태, 및 임의로 극저온으로 보존된 상태의 제대조직을 제공한다.
본 발명의 관련된 관점에서는, 각각 상기 동결된 제대조직의 샘플을 포함하는 다수의 용기, 및 각각의 용기의 내용물에 대한 참고용 카탈로그를 포함하는 조직은행의 형태로 제대조직이 제공된다. 특정의 구체예에서, 용기는 극저온 저장에 적합한 용기이다.
추가의 관점에서, 본 발명은 미리 동결된 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 수득하고, 이들 생존가능한 세포들 가운데에서 전구세포인 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정의 관점에서, 전구세포는 HUCPVCs이며, 본 발명은
1) a) 제대조직을 수득하고,
b) 제대조직을 혈청-함유 세포배양 배지 및 DMSO를 포함하는 동결보존용액과 조합하고,
c) 조합물을 DMSO가 조직에 침투하도록 허용하는 온도에서 일정 기간 동안 액체로서 냉동시키는 냉각과정에 적용하고,
d) 냉각된 조합물을 동결시켜 동결된 제대조직을 제공하고, 임의로
e) 동결된 제대조직을 일정 시간 동안 극저온 상태하에 저장하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조된, 임의로 극저온 상태로 저장된 제대조직인 동결된 제대조직을 수득하고 (여기에서, 제대조직은 결합된 혈관주위 워튼 젤리를 가지는 신선하게 단리된 인간 제대 혈관 또는 그의 분절이다);
2) 동결된 제대조직을 해동시키고;
3) 해동된 제대조직을 처리하여 DMSO를 물로 치환시키고;
4) 저장된 혈관과 결합된 워튼 젤리를 분해시켜 생존가능한 HUCPVCs를 방출시키는 단계를 포함하여, 동결된 제대조직으로부터 생존가능한 HUCPVCs를 회수하는 방법을 제공한다.
본 발명의 관점들은 첨부된 도면을 참조하여 이하에 더 상세하게 기술된다:
도 1은 인간 UC에서 나타난 조직의 3개의 개별적 구역을 나타내는 광학 현미경사진이다;
도 2는 콜라게나제 용액에서의 루프형 혈관의 대표적 도해이다;
도 3은 폴리스티렌 조직배양 표면에 부착된 WJ로부터 단리된 세포의 광학 현미경사진이다;
도 4는 CFU-O의 초기 형성을 나타내는 광학 현미경사진이다;
도 5는 성숙 CFU-O를 나타내는 광학 현미경사진이다;
도 6은 35 ㎜ 폴리스티렌 조직 배양 디쉬 상에서 UV 형광 하에 테트라사이클린-표지 CFU-O를 나타낸다;
도 7은 동일한 테트라사이클린-표지 CFU-O의 위상차 광학 현미경사진 및 형광 현미경사진을 나란히 도시한다;
도 8은 조직 배양 폴리스티렌 표면 상의 성숙 CFU-O의 주사 전자 현미경사진이다;
도 9는 기저 매트릭스를 노출시킨 CFU-O의 횡단면의 주사 전자 현미경사진이다;
도 10은 CFU-O의 도드라진 가장자리 상에 위치한 낮게 무기질화된 콜라겐 섬유의 주사 전자 현미경사진이다;
도 11은 골원성 세포를 분화시킴으로써 폴리스티렌 경계면 상에 놓인 비-콜라겐성 매트릭스 (소구체로서 나타남)의 주사 전자 현미경사진이다;
도 12는 성숙 CFU-O의 중심을 포함하는 높게 무기질화된 콜라겐의 주사 전자 현미경사진이다;
도 13은 WJ-유래 세포가 77.4％의 MHC I 및 MHC II 음성인 것을 나타내는 유동 세포측정 데이타를 나타낸다;
도 14는 그 안에 세포가 포착되는 (골세포) 콜라겐의 분포 및 일부가 구성된 세포외 매트릭스에 의해 둘러싸이게 되는 말초 세포의 다층화를 나타내는 골 결절의 마손 (Masson) 트리콤-염색 횡단 절편의 흑백 복원물이다;
도 15는 수임 골전구세포 아군집 및 총 골전구세포 아군집의 팽창과 관련된 유착성 혈관주위 WJ 군집의 잠재적 증식을 나타낸다;
도 16은 0-24 시간의 지체기, 24-72 시간의 대수기, 및 72-120 시간의 고조기를 갖는 정상 성장곡선을 나타내는 0-144 시간의 혈관주위 WJ 세포의 증식을 나타낸다. 배가시간은 전체 배양기간 중에 24 시간인 반면에, 대수기 중에는 16 시간이다;
도 17은 5회 계대배양에 걸쳐 나타난 WJ 세포의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 발현, 동결-해동으로 인한 그의 발현의 변화, 및 재배양으로 인한 후속 발현을 나타낸다;
도 18은 HUCPVCs의 CFU-F 빈도를 나타낸다;
도 19는 P0부터 P9까지의 HUCPVCs의 배가시간을 나타낸다. HUCPVCs는 P2에서 P8까지 20 시간의 비교적 안정하고 빠른 배가시간을 나타낸다;
도 20은 >1014 세포가 배양의 30일 이내에 유도될 수 있음을 설명하는 HUCPVCs의 증식을 나타낸다. 이러한 빠른 팽창에 의해서, 1,000 치료학적 용량 (therapeutic doses; TDs)이 배양의 24 시간 이내에 생성될 수 있다;
도 21은 세포 수확에 대한 콜라게나제 농도 및 분해시간의 영향을 나타낸다;
도 22는 극저온 저장물로부터 회수하고, 5% FBS, 및 페니실린 G (167 단위/㎖), 겐타마이신 (50 ㎍/㎖) 및 암포테리신 B (0.3 ㎍/㎖)를 함유하는 알파-MEM 중의 조직배양물 처리된 표면상에서 배양한 후, 4일 (패널 A) 및 9일 (패널 B) 째에 트립판 배제에 의해 생존가능한 것으로 측정된 세포의 존재를 나타내는 광학 현미경사진을 제공한다. 패널 C는 비교를 위해서, 제대를 사전 냉각이 없이 10% DMSO 중에 액침시킨 후에 동결시킨 경우에 수득된 결과를 나타내는 광학 현미경사진이다.
도 2는 콜라게나제 용액에서의 루프형 혈관의 대표적 도해이다;
도 3은 폴리스티렌 조직배양 표면에 부착된 WJ로부터 단리된 세포의 광학 현미경사진이다;
도 4는 CFU-O의 초기 형성을 나타내는 광학 현미경사진이다;
도 5는 성숙 CFU-O를 나타내는 광학 현미경사진이다;
도 6은 35 ㎜ 폴리스티렌 조직 배양 디쉬 상에서 UV 형광 하에 테트라사이클린-표지 CFU-O를 나타낸다;
도 7은 동일한 테트라사이클린-표지 CFU-O의 위상차 광학 현미경사진 및 형광 현미경사진을 나란히 도시한다;
도 8은 조직 배양 폴리스티렌 표면 상의 성숙 CFU-O의 주사 전자 현미경사진이다;
도 9는 기저 매트릭스를 노출시킨 CFU-O의 횡단면의 주사 전자 현미경사진이다;
도 10은 CFU-O의 도드라진 가장자리 상에 위치한 낮게 무기질화된 콜라겐 섬유의 주사 전자 현미경사진이다;
도 11은 골원성 세포를 분화시킴으로써 폴리스티렌 경계면 상에 놓인 비-콜라겐성 매트릭스 (소구체로서 나타남)의 주사 전자 현미경사진이다;
도 12는 성숙 CFU-O의 중심을 포함하는 높게 무기질화된 콜라겐의 주사 전자 현미경사진이다;
도 13은 WJ-유래 세포가 77.4％의 MHC I 및 MHC II 음성인 것을 나타내는 유동 세포측정 데이타를 나타낸다;
도 14는 그 안에 세포가 포착되는 (골세포) 콜라겐의 분포 및 일부가 구성된 세포외 매트릭스에 의해 둘러싸이게 되는 말초 세포의 다층화를 나타내는 골 결절의 마손 (Masson) 트리콤-염색 횡단 절편의 흑백 복원물이다;
도 15는 수임 골전구세포 아군집 및 총 골전구세포 아군집의 팽창과 관련된 유착성 혈관주위 WJ 군집의 잠재적 증식을 나타낸다;
도 16은 0-24 시간의 지체기, 24-72 시간의 대수기, 및 72-120 시간의 고조기를 갖는 정상 성장곡선을 나타내는 0-144 시간의 혈관주위 WJ 세포의 증식을 나타낸다. 배가시간은 전체 배양기간 중에 24 시간인 반면에, 대수기 중에는 16 시간이다;
도 17은 5회 계대배양에 걸쳐 나타난 WJ 세포의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 발현, 동결-해동으로 인한 그의 발현의 변화, 및 재배양으로 인한 후속 발현을 나타낸다;
도 18은 HUCPVCs의 CFU-F 빈도를 나타낸다;
도 19는 P0부터 P9까지의 HUCPVCs의 배가시간을 나타낸다. HUCPVCs는 P2에서 P8까지 20 시간의 비교적 안정하고 빠른 배가시간을 나타낸다;
도 20은 >1014 세포가 배양의 30일 이내에 유도될 수 있음을 설명하는 HUCPVCs의 증식을 나타낸다. 이러한 빠른 팽창에 의해서, 1,000 치료학적 용량 (therapeutic doses; TDs)이 배양의 24 시간 이내에 생성될 수 있다;
도 21은 세포 수확에 대한 콜라게나제 농도 및 분해시간의 영향을 나타낸다;
도 22는 극저온 저장물로부터 회수하고, 5% FBS, 및 페니실린 G (167 단위/㎖), 겐타마이신 (50 ㎍/㎖) 및 암포테리신 B (0.3 ㎍/㎖)를 함유하는 알파-MEM 중의 조직배양물 처리된 표면상에서 배양한 후, 4일 (패널 A) 및 9일 (패널 B) 째에 트립판 배제에 의해 생존가능한 것으로 측정된 세포의 존재를 나타내는 광학 현미경사진을 제공한다. 패널 C는 비교를 위해서, 제대를 사전 냉각이 없이 10% DMSO 중에 액침시킨 후에 동결시킨 경우에 수득된 결과를 나타내는 광학 현미경사진이다.
본 발명은 한가지 관점에서 제대조직을 저장하는데 유용한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 예를 들어, 세포 또는 조직 복구 또는 재생과 같은 의료적 이유로 미래에 필요한 경우에 그들의 공급 대상체와 조직적합성이 있는 세포의 미래의 이용을 가능하게 한다.
본 발명에서, 제대조직은 산후에 수득하여 동결시키고, 이렇게 하여 동결된 제대조직은 이어서 생존가능한 세포의 미래의 공급원으로 저장된다. 동결된 조직으로부터 생존가능한 세포를 수득하기 위해서는, 조직을 해동시킨 다음에 추출하여, 배양할 때에 생존력을 나타내는 세포를 제공한다.
본 발명의 방법은 혈관벽 및 내피를 포함하는 혈관계, 워튼 젤리, 양막 상피 등과 같은 다양한 제대조직에 적용될 수 있다. 이러한 조직이 수득되는 제대는 어떤 포유동물로부터 유래하는 제대라도 될 수 있으며, 바람직하게는 인간 제대로부터 수득된다. 본 발명의 한가지 구체예에서, 제대조직은 워튼 젤리이다. 바람직한 구체예에서, 조직은 제대 혈관계, 바람직하게는 인간 제대 혈관계의 혈관주위 부분과 결합된 워튼 젤리이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 제대조직은 혈관조직이다. 바람직한 구체예에서, 조직은 그에 결합된 혈관주위 부분과 결합된 워튼 젤리를 갖는 혈관조직이다. 특히 바람직한 구체예에서, 동결되는 제대조직은 혈관계 (즉, 혈관), 및 혈관계를 절제된 제대로부터 제거하는 경우에 그와 결합된 상태로 잔존하는 결합된 워튼 젤리이다. 이러한 제대조직에는 전체 길이의 온전한 혈관계, 개개의 혈관, 그의 종방향으로 절개된 형태 (이것으로부터 혈액은 임의로 완전히 제거된다), 및 이러한 조직의 횡단 절편이 포함된다.
따라서, 본 발명의 모든 관점에서 바람직한 제대조직은 그의 외벽 상에 존재하거나 외벽과 결합된 워튼 젤리, 즉 제대의 혈관주위 부분 내에 위치하는 워튼 젤리를 갖는 인간 제대조직 내의 혈관이다. 이러한 특정 부분 내에 위치하는 워튼 젤리는 상술하고, 이하에 더 상세히 기술하는 전구세포의 풍부한 공급원이다. 이러한 워튼 젤리는 벽으로부터의 그의 단리가 절차상 곤란하도록 혈관벽과 긴밀하게 결합된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 혈관주위 워튼 젤리 그 자체를 결합된 혈관이 없이 회수하는 것은 기술적으로 가능하며, 따라서 본 발명은 추가로, 생존가능한 전구세포의 후속 수확을 위해 동결되고, 임의로 극저온 상태로 저장되는 공급물질로서 유용한 제대조직으로서 이러한 단리된 혈관주위 워튼 젤리의 용도를 포함한다.
제대조직은 바람직하게는 산후 조직으로서 신선하게 수득되며, 상술한 성질의 조직을 제공하도록 임의로 절개한 후, 그 다음에 동결시키기 위해서 준비된다. 바람직하게는, 제대조직은 수확한 지 약 24 시간 이내에 처리되며, 이렇게 추출된 조직은 수확한 지 적어도 약 72 시간 이내에, 더욱 바람직하게는 수확한 지 48 시간 이내에, 특히는 24 시간 이내에 동결시키고, 바람직하게는 극저온으로 저장한다. 신선한 조직은 이 기간 중에 냉각시킬 수 있으며, 바람직하게는 표준방법에 따라서 세척하고, 임의로 멸균하지만, 세포 생존력에 악영향을 미치지 않도록 본 명세서에 언급된 바와 같이 이 기간이 예상되는 중에는 동결되지 않아야 한다.
바람직한 구체예에서, 보존될 제대조직이 결합된 혈관주위 워튼 젤리를 갖는 제대 혈관인 경우에, 혈관은 이하에 더 상세히 기술되고, US2005/0148074에서 데이비스 (Davies) 등에 의해서 기술된 바와 같이 추출할 수 있다. 간략하여, 결합된 워튼 젤리를 갖는 온전한 제대 혈관은 종방향으로 개방된 제대로부터 혈관을 부드럽게 잡아당김으로써 수득되며, 횡으로 절단하여 길이가 1-3 인치, 예를 들어, 약 4 ㎝인 혈관 분절을 수득한다. 이 과정은 제대 내의 워튼 젤리의 벌크를 제공하지만, 추출된 혈관과 결합된 혈관주위 부분 내의 워튼 젤리는 남긴다. 혈관의 말단은 예를 들어, 클램프, 봉합 등을 사용해서 묶어서 혈관 내에 잔류하는 어떤 혈액이라도 방출되는 것을 방지한다. 또한, 또는 대신으로, 혈관 내의 혈액은 식염수 또는 PBS와 같은 완충된 식염수와 같은 적합한 비히클 중에서 반복해서 세정함으로써 제거될 수 있다. 검체 내에 혈액이 부재하는 것은 조혈 기원의 전구세포가 제제 내에 오염물로 존재하지 않는 것을 보장한다. 혈액이 제거된 경우에, 저장에 유용한 제대 혈관 분절은 혈관을 횡방향으로 절단함으로써 생성된 분절뿐만 아니라, 특히 횡절편을 종방향으로 절단하여 다른 식으로 관상인 분절의 스트립인 분절을 생성시킴으로써 생성된 분절도 포함하는 것으로 인식될 수 있다. 혈관주위 워튼 젤리를 갖는 제대 혈관 분절의 모든 형태가 본 발명의 방법에서 유용하다.
생존가능한 세포의 회수를 허용하는 조건 하에서 조직을 보존하기 위해서는, 제대조직을 극저온 저장에 적합한 모든 비히클과 같은 동결과정에 적합한 비히클 내에 배치한다. 임의로, 비히클은 추가로 세포배양에 적합한 보충물을 포함한다. 한가지 구체예에서, 비히클은 디메틸설폭사이드 (DMSO), 예를 들어, 20% DMSO를 비롯한 15-20% DMSO와 같은 10-30% DMSO를 포함한다. 비히클이 세포배양 보충물을 포함하는 또 다른 구체예에서, DMSO는 용적 기준으로 비히클의 1 내지 25%, 예를 들어, 8-15%와 같은 5-20%, 즉 10%로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 보충물은 소 태아 혈청과 같은 혈청-기본 보충물이다. 특정의 구체예에서, 자체가 5-20 용적% (예를 들어, 10% 또는 15%)의 FBS를 포함하는 소 태아 혈청 배지는 용적 기준으로 비히클의 75-99%, 예를 들어, 80-95%, 즉 약 90%로 존재한다. 추가의 특정한 구체예에서, 비히클은 90 용적%의 10% FBS 용액 및 10% DMSO를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 관점에서, 동결 및 임의의 극저온으로 저장을 위한 조직의 제조는 특히 동결보존제가 저장 중에 조직 및 상재하는 세포를 보호하고, 동결시에 조직 및 세포를 손상시킬 수 있는 물을 치환시키는 것 둘 다에 충분하게 조직에 침투할 수 있게 허용하도록 디자인된 점증적 변이 냉각방법 (graduated, transitional cooling process)을 통해서 진행된다. 특히, 바람직한 동결/극저온보존 방법은 상기 언급한 바와 같이, 동결보존제 및 혈청이 보충된 세포배양 배지와 같은 세포 영양 배지를 포함하는 동결보존용액을 사용한다. 동결보존제는 동결 및 얼음 형성의 손상효과로부터 조직 및 상재 세포를 보호하는 어떤 액체 제제, 또는 제제 용액이라도 될 수 있다. 가장 바람직하게는, 동결보존제는 디메틸설폭사이드 (DMSO)이다. 대용물로서, 동결보존제는 글리세롤, 또는 글리세롤과 DMSO의 혼합물이다. 글리세롤은 DMSO와 관련하여 본 명세서에 기술된 것과 동일한 방식 및 동일한 농도로 사용될 수 있다. DMSO의 특성은 이것이 본 발명의 극저온 보존 과정에서 사용하기에 특히 꽤 적합하도록 한다.
동결보존용액에 존재하는 바람직한 혈청-보충된 배양 배지는 소 태아 혈청 (FBS)이다. 대신으로, 배양 배지는 FBS, 인간 혈청 등과 같은 혈청 보충물을 첨가된 DMEM, M 199, RPMI 1640 등과 같은 세포 배양에 적합한 어떤 영양 배지라도 포함할 수 있다. 일반적으로, 그러나 선택된 영양 배지의 유형에 따라서 배양 배지의 혈청 성분은 약 5-30% 혈청, 예를 들어, 10-20% 혈청을 포함할 것이다. 상기 언급한 바와 같이, 바람직한 동결보존용액은 용적 기준으로 약 10%의 DMSO, 및 약 90%의 FBS와 같은 배양 배지를 포함한다.
동결 및 후속 극저온 저장을 위한 조직을 제조하기 위해서, 조직은 동결보존제와 조합하고, 동결보존제가 조직에 침투함으로써 결합된 물을 치환시키는데 효과적인 온도에서 그러한 일정 기간 동안, 액체로서 냉동시킨다. 이러한 목적으로, 조직이 혈관주위 워튼 젤리를 갖는 제대 혈관 분절인 경우에, 조직은 적합하게는 약 4℃에서, 20-40 분과 같은 약 15-60 분의 기간 동안, 바람직하게는 30 분 동안 유지시킨다. DMSO가 이 온도 이하에서 고화하며, 감소된 조직 투과성을 갖는 것을 감안할 때에 더 낮은 온도는 덜 바람직하다. 더 높은 온도가 적합하지만, 취급 중에 제대 내의 대사과정을 느리게 하기 위하여 더 낮은 온도를 사용하는 것이 바람직하다. 냉동의 기간은 변화할 수 있다. 동결보존제가 조직을 침투하는데 충분한 시간을 제공하면서, 제대를 취급하는 시간을 감소시키도록 균형을 이루게 하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 냉동기간은 약 10 분 이상이어야 하며, 60 분 또는 그 이상까지에 가까울 수 있다.
냉동단계 중에, 조직은 표준 방법에 따라서, 예를 들어, 용적 50 ㎖의 원심분리관과 같은 어떤 적합한 용기 내에서라도 배양할 수 있다. 조직이 혈관주위 워튼 젤리를 갖는 제대 혈관인 경우에, 각각의 용기는 약 5-10 개의 혈관 분절을 수용할 수 있다. DMSO 침투가 방해되지 않도록 용기를 꽉 채우지 않는 것이 유용하다.
냉동시킨 후에, 혈관은 동결과정에 적용한다. 이 과정은 바람직하게는, 동결된 조직이 이후에 극저온 저장에 쉽게 전이될 수 있도록 냉동된 조직을 극저온용기에 옮긴 후에 수행된다. 한가지 구체예에서, 용기는 폴리프로필렌 등과 같이 멸균될 수 있는 비-취성 중합체로 만들어지며, 저장 중에 혈관을 갖는 검체를 유지시키고, 그 후에는 그의 방출이 가능하도록 하는 제거가능한 마개를 수용하도록 순응시킨 튜브 또는 그 밖의 다른 저장소의 형태로 제공된다. 가장 바람직하게는, 각각의 극저온용기는 조직이 혈관주위 워튼 젤리를 갖는 제대 혈관인 경우에 하나의 조직 샘플, 예를 들어, 용기당 하나의 혈관 분절을 포함한다. 소위 극저온튜브 (cryotubes)가 폴리에틸렌 백 (bag)과 같이 적합하다. 따라서, 냉동된 혈관을 극저온용기에 옮기고, 바람직하게는 조직을 완전히 액침시키는데 충분한 용적의 신선한 동결보존용액과 조합한다.
그 후, 제조된 조직은 검체를 온도가 조직을 동결시키는데 필요한 낮은 수준으로 조절될 수 있는 동결 유니트에 배치시킴으로써 동결시킨다. 한가지 구체예에서, 조직 및 용액을 포함하는 용기는 동결기 (freezer) 내에 배치하여 적어도 약 6 시간 동안, 예를 들어, 적어도 약 8-12 시간 동안 온도를 약 -70℃, 예를 들어, 약 -40℃ 이하로 감소시킨다. 가장 바람직하게는, 동결은 조절된 속도의 -70℃ 동결기를 사용하여 수행된다.
동결된 조직은 생존가능한 세포를 회수할 수 있는 출발물질로서 직접 사용될 수 있는 것으로 인식될 수 있다. -70℃에서 유지되는 경우에 이러한 동결된 물질은 적어도 일부의 세포 활성을 나타낼 수 있으며, 따라서 이 온도에서 시간이 경과함에 따라 나타날 수 있는 세포사를 피하도록 비교적 신속하게 사용되어야 한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법에 따르면 동결된 조직은 극저온 저장소 내에 배치되며, 즉 세포대사가 정지상태인 온도에서 저장된다.
따라서, 조직을 동결시킨 후에, 동결된 조직을 포함하는 용기는 바람직하게는 유사한 세포 및 조직의 저장을 위해서 이미 개발된 방식으로 극저온 저장소에 옮긴다. 적합하게는, 용기는 액 -180℃ 내지 -200℃에서 액체 질소의 증기상에서 저장된다. 대용으로, 동결된 세포는 액체 이산화탄소 또는 액체 할로카본과 같은 액체 질소 이외의 다른 매질 내에서 극저온 상태하에 저장할 수 있다.
조직 검체는 전구세포의 공급원이 필요할 때까지 복구를 위해서 수일, 수주, 수개월 또는 수년의 장기간 동안 이러한 극저온상태로 유지될 수 있다.
필요한 경우에, 저장된 조직 내에 상재하는 생존가능한 세포는 본 발명에 따르는 회수방법을 사용하여 수득될 수 있다. 더욱 특히, 극저온 상태로 저장된 용기 내의 조직을 우선 수득하고, 해동시켜 동결보존제의 후속 제거를 가능하게 한다. 조직은 예를 들어, 일반적으로 40℃를 초과하지 않는 온도에서 가온된 수욕 중에서 해동시킬 수 있다. 10℃-40℃의 온도가 적합하며, 37℃의 온도가 바람직하다. 37℃에서 약 5-15 분, 예를 들어, 10 분 동안 수행하여 일단 해동되면, 조직을 50 ㎖ 튜브와 같은 용기에 옮길 수 있으며, 조직은 세척하여 DMSO를 희석시키거나 제거한다. 세척은 바람직하게는, 물 또는 완충된 식염수, 예를 들어, PBS와 같은 차가운 (예를 들어, 4℃와 같이 냉동됨) 액체를 사용하여 조직을 차가운 액체에 액침시킴으로써 수행된다. 세포에 대한 쇼크 또는 손상이 최소화되도록 조직을 격렬하게 세척하는 것은 피하는 것이 바람직하다. 액침된 조직은 추가의 희석 및 물에 의한 동결보존제의 치환을 가능하게 하는 추가의 기간 동안 냉동고 내에 유지시킬 수 있으며, 그 후에 추가의 냉각된 액체를 첨가하여 더 희석시킬 수 있다.
그 후, 생성된 복구된 조직은 신선한 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 회수하기 위해서 확립된 것과 동일한 방법을 사용해서 조직 내에 상재하는 생존가능한 세포를 회수하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 방법은 동결되고, 극저온 상태로 저장된 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 회수할 수 있게 한다. 이러한 세포의 생존력은 이러한 목적으로 확립된 어떤 기술을 사용하여서도 확인될 수 있다. 편리하게는, 회수된 세포의 생존력은 간단히 트립판 블루 배제 (염료를 배제할 수 없는 것을 죽은 세포로 정의하는 절차)에 의해서, 또는 더 정교한 방식으로 BrdU의 혼입을 검출함으로써 DNA 합성이 일어나는지를 확인함으로써 확인될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "생존가능한"은 자발적 대사를 나타내며, 추가로 바람직하게는, 유착을 기본으로 하여 배양된 세포의 경우에 배양 기질에 대한 유착 및 후속 확산 및 증식의 특징을 나타내는 세포에 관하여 사용된다. 이러한 생존력의 예는 도 22, 특히 생존가능한 HUCPVCs의 확산 및 증식 현상 특징을 나타내는 패널 A 및 B에 나타내었다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 저장된 제대조직으로부터 회수된 생존가능한 세포는 전구세포이다. 다른 특정의 구체예에서, 생존가능한 전구세포는 본 명세서에 예시된 바와 같이 저장된 제대 혈관 또는 그의 분절과 결합된 혈관주위 워튼 젤리로부터 회수된다.
본 발명의 저장 및 회수방법은 각각이 제대조직 샘플을 포함하는 다수의 용기로 이루어진 저장소 수집물 또는 "뱅크"에서 제대조직의 체계화를 가능하게 하는 것으로 인식될 수 있다. 제대조직 샘플의 이러한 수집물 또는 뱅크는 본 발명의 또 다른 구체예를 구성한다. 조직의 각각의 뱅크는 각각의 샘플에 관해서 예를 들어, 공여체 개체 및 아마도 그의 유전적 또는 의료적 역사에 관한 샘플 기원, 저장일, 샘플을 만든 기관 또는 사람의 신원 등을 표시하는 카탈로그를 동반할 것이다. 이러한 방법에 의해서, 조직 뱅크는 조직 및 그의 고유한 세포의 미래의 사용을 위한 저장소로 작용할 수 있으며, 카탈로그는 특정한 환자에게 사용하기 위한 특정의 조직 및 세포를 선택하거나, 특정의 의료적 상태를 치료하기 위해서 사용될 수 있다.
저장된 조직이 혈관주위 워튼 젤리를 갖는 제대 혈관 또는 혈관 분절인 경우에 생존가능한 전구세포를 회수하기 위해서는 본 발명자의 공동 계류 중인 국제특허출원 WO04/072273호 (2004년 8월 26일에 공개됨) 및 US 2005/0148074에 기술된 방법을 참고로 할 수 있으며, 본 명세서에 참고로 포함된다. 더욱 특히, 신선한 제대조직으로부터 이러한 전구세포의 단리, 및 이들의 특성 및 최종-용도는 이하에 기술된다. 이들 전구세포는 인간 제대 혈관주위 세포 또는 "HUCPVCs"로 칭한다.
언급된 참고문헌들은 인간 제대의 워튼 젤리로부터 세포를 추출하는 과정을 개시하고 있으며, 이 과정은 빠른 증식, 골전구세포 및 어떤 주요 조직적합성 마커도 나타내지 않는 세포 (인간 백혈구 항원 (HLA) 이중 음성)를 포함하는 그 밖의 다른 전구세포의 존재를 특징으로 하는 독특한 세포 군집을 수득한다. 이 세포 군집은 치료 목적으로 그들로부터 골 및 연골, 지방 및 근육을 포함하는 그 밖의 다른 결합조직을 성장시키고, 환자에게 전구세포를 자가 또는 동종이계 전이시키기 위한 전구세포의 유용한 공급원이다.
더욱 특히, 이 과정은 워튼 젤리 추출물을 제공하는데, 여기에서 추출물은 인간 전구세포를 포함하고, 편리하게는 워튼 젤리의 혈관주위 구역이라 불리는 부분에서 인간 제대의 혈관계에 근접한 워튼 젤리의 효소적 분해에 의해서 수득된다. 이러한 혈관주위 구역 내에 있고, 전구세포가 추출되는 조직은 또한 혈관주위 조직으로도 불릴 수 있다. 추출과정은 적합하게는 제대 혈액, UC의 상피세포 또는 내피세포, 및 제대의 혈관구조로부터 유래하는 세포가 본질적으로 존재하지 않는 추출물을 제공하며, 여기에서 혈관구조는 세동맥 또는 정맥 혈관의 내막, 중막 및 외막으로 정의된다. 생성된 추출물은 또한, 혈관구조로부터 분리된 벌크 워튼 젤리 조직으로부터 단리된 다른 워튼 젤리 추출물과는 상이하다.
따라서, 이 과정은 본 발명에 따라 수득된 워튼 젤리 추출물로부터 세포를 단리시키는 단계를 포함하여, 인간 전구세포를 수득하는 방법을 제공한다.
이 과정은 골전구세포의 군집 및 MHC -/- 전구세포를 포함한, 워튼 젤리 추출물 내에 존재하는 세포의 배양에 의해서 수득된 세포 군집을 제공한다.
추출된 전구세포 군집은 유착조건 하에서 추출된 세포를 배양함으로써 수득된 유착세포 군집으로 특정화된다. 또 다른 구체예에서, 추출된 전구세포 군집은 유착조건 하에서 성장한 추출된 세포의 상등액 분획 내에 존재하는 비-유착성 (또는 "유착-후 (post-adherent)") (PA) 세포 군집으로 특정화된다. 이러한 PA 분획은 초기에 평판배양된 HUCPVCs의 상등액을 새로운 T-75 플라스크에 옮겨서 아직 유착되지 않은 세포가 세포 표면에 부착하도록 함으로써 유도된다. 이 방법은 어떤 나머지 PA 세포라도 수확하기 위해서 그의 배지를 또 다른 새로운 T-75 플라스크에 옮겨서 이 새로운 T-75 플라스크를 사용하여 반복한다. 이 PA 세포 군집은 유착조건 하에서 배양하였을 때, 빠르게 증식하고, 골 결절 및 지방세포를 자발적으로 형성하는 전구세포의 아군집을 포함한다. 이 기술은 효소적 분해 세포 군집으로부터 단리된 유착세포의 수율을 증가시키는 수단을 제공한다.
이 과정은 또한, 이러한 분화를 위해서 다른 경우에는 필요한 보충물의 부재 하에서 배양하는 경우에 골 세포로 분화하는 특성을 특징으로 하는 수임된 골전구세포의 군집을 제공한다.
여기에서는 또한, 이들 세포가 원하는 결합조직 표현형으로 분화하는데 도움이 되는 조건에 워튼 젤리 추출물로부터 수득된 세포를 적용시키는 단계를 포함하여, 골조직, 연골조직, 지방조직 및 근육조직을 포함한 결합조직을 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 점에서, 본 발명은 추가로 의료적 상태, 질병 및 장애의 세포 이식-매개된 치료를 포함한 세포-기본 치료법에서의 이러한 세포의 용도를 제공한다.
또한, 여기에서는 본 발명에 따르는 전구세포 또는 그들의 분화된 자손, 및 이러한 세포를 선택된 조직 부위에 송달하는데 적합한 담체를 포함하는 조성물, 및 조직 공학에서 있어서의 그의 용도가 제공된다.
여기에서는 골전구세포를 포함한 인간 전구세포뿐만 아니라 면역-부적격 세포를 포함하는 빠르게 증식하는 세포 군집의 공급원으로서 워튼 젤리 (WJ)의 추출물이 제공된다.
추출된 세포 군집은 인간 제대 혈관주위 (HUCPV) 세포로 불릴 수 있다. HUCPV 세포 군집은 그 안에 함유된 다양한 세포 아군집에 의해서 밝혀지는 바와 같이, 그들의 표현형이 독특한 다능성 전구세포의 풍부한 공급원을 구성한다. 세포가 추출되는 워튼 젤리의 혈관주위 구역은 혈관주위 조직으로 불릴 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "전구세포"는 조절 및/또는 정의된 조건하에 주어진 표현형의 세포로 분화할 세포를 나타낸다. 따라서, 골전구세포는 골모세포 계통으로 수임되어, 이러한 수임 및 분화를 위해 확립된 조건하에 배양하는 경우에 최종적으로 골조직을 형성할 전구세포이다. "면역-부적격" 또는 "비-면역원성"인 전구세포는 클래스 I 및 클래스 II 주요 조직적합성 컴플렉스 (MHC)와 결합된 표면 항원에 대해 음성인 표현형을 갖는 세포이다. 이러한 전구세포는 또한 본 명세서에서 HLA 이중 음성, 또는 MHC -/-로도 나타낸다.
WJ로부터 추출된 HUCPV 세포 군집은 또한 추출된 세포가 성장하는 속도를 전구세포 증식에 대해 표준인 조건하에 다른 공지된 전구세포 군집에 대비하여 나타내는 "빠른 증식"을 특징으로 한다. 본 명세서에 제시된 실험 결과로부터 알 수 있고, 도 16에 나타낸 바와 같이, 전구세포 군집은 적어도 약 25 시간 이내에, 및 7-15 시간 정도로 빠르게 배가되어서 다른 공지된 골전구세포 군집 및 WJ로부터 추출한 다른 전구세포 군집보다 더 빠르게 증식될 수 있다.
이 세포 및 세포 군집은 인간 제대의 WJ로부터의 추출에 의해 수득될 수 있다. 선행 기술과는 달리, 이러한 세포는 제대 혈관계의 외부 벽과 결합된, 즉 그에 인접한 WJ로부터 추출된다. 제대 혈관계의 외부 표면과 결합하거나 그에 매우 인접한 워튼 젤리는 혈관주위 구역이라 불리는 부분 내에 위치하고, 예를 들어 제대로부터 워튼 젤리를 추출하거나, 또는 제대 및 결합된 워튼 젤리로부터 혈관을 추출하기 위해서 수행되는 것과 같이 제대로부터 혈관을 절제하는 경우에 일반적으로 혈관계와 결합된 상태로 남는다. 주목할만하게, 일반적으로 선행 기술 방법에서 제거되는 이 혈관주위 구역 내의 워튼 젤리는 본 명세서에 기술된 특징을 갖는 전구세포의 풍부한 공급원이라는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명은 HUCPVCs라 불리는 유용한 인간 전구세포에 대한 공급원으로서 워튼 젤리의 이러한 혈관주위 구역으로부터 조직을 활용한다.
구체예에서, HUCPV 세포 군집은 기능적 중간엽 (비-조혈성) 표현형, 즉 CD45-, CD34-, SH2+, SH3+, Thy-1+ 및 CD44+를 나타내는 다수의 마커를 갖는 전구세포의 존재를 특징으로 한다. 특히 중요한 것으로, 군집은 일반적으로 혈관주위세포를 나타내는 마커인 3G5 항체에 대해서 양성인 세포를 정착시키는 것으로 특정화된다. 추출된 세포 군집은 일반적으로 알파-액틴, 데스민 및 비멘틴을 발현하며, 그로부터 배양조건의 조작 및 예를 들어, 세포 분류 원리 및 기술을 기본으로 하는 선택을 통해서 목적하는 세포 군집을 수득할 수 있는 매우 유용한 공급원을 제공하는 형태학적으로 균질의 섬유모세포 세포 군집이다.
인간 제대로부터 이러한 혈관주위 세포를 추출하기 위해서, 추출방법 중에 제대 혈액의 세포, UC의 상피세포 또는 내피세포, 및 제대의 혈관 구조로부터 유래하는 세포가 추출되는 것을 피하도록 주의를 하여야 하며, 여기에서 혈관구조는 세동맥 또는 정맥 혈관의 내막, 중막 및 외막으로 정의된다. 이들 원치 않는 세포가 본질적으로 존재하지 않는 추출물을 수득하는 것은 절제하기 전에 제대를 주의해서 플러싱 (flushing) 및 세척하고, 이어서 제대 내부로부터 혈관을 주의해서 절제함으로써 달성될 수 있다. 혈관은 또한, 주위의 제대조직으로부터 주의해서 떼어낼 수 있으며, 이 경우에 혈관주위 조직은 혈관과 함께 절제된다. 이들 원치 않는 세포가 추출되는 것을 피하도록 주의를 기울여도 이들은 여전히 생성된 추출물 내에 작은 정도로 존재할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 이것은 이들이 너무 낮은 빈도로 나타나서 본 명세서에 제시된 관찰된 결과, 즉 중간엽 및 특히 중배엽 기원으로부터 유래하는 세포 콜로니의 관찰, CFU-F, CFU-O 및 CFU-A의 형성의 빈도 및 신속성, 및 배양된 군집에서 관찰된 HLA 표현형의 특정화를 저해하지 않는 한은 허용될 수 있다.
혈관주위 구역 내에 위치하는 조직은 제대 혈관계의 외벽에 인접한 워튼 젤리이며, 일반적으로 혈관의 외벽으로부터 약 3 ㎜까지 연장하는 구역 내에 위치한다. 적합하게는, 표적 추출 구역은 3 개의 혈관 중 어느 하나의 외부 벽으로부터 약 2 ㎜, 예를 들어, 약 1 ㎜ 내에 위치할 수 있다. 이 부분으로부터 WJ의 추출은 실시예에 기개된 기술을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다. 이 기술에서, 혈관은 WJ를 위한 담체로 사용되고, 혈관 그 자체는 그로부터 전구세포가 추출되는 기질로서 사용된다. 따라서, 혈관주위 조직의 얇은 코팅을 갖는 제대 혈관은 철저히 세척하여 실질적으로 모든 제대 혈액 오염물질이 제거된 신선한 제대로부터 외과적으로 또는 수작업으로 절제된다. 근접한 혈관주위 조직을 갖는 혈관, 또는 그의 절편은 그 후에 약 37 ℃에서 원하는 세포가 상재하는 혈관주위 조직의 콜라겐 매트릭스를 분해시키는데 적합한 효소를 함유하는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)와 같은 추출배지 중에서 배양한다. 이러한 목적으로, 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖, 또는 그 이상의 범위, 예를 들어, 0.5 ㎎/㎖의 농도에서 콜라게나제에 의한 분해가 적합하다. 효소 유형, 농도 및 배양 시간은 변화할 수 있으며, 대체 추출조건은 선택된 조건 하에서 세포 표현형 및 군집의 수율을 모니터링함으로써 간단하게 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 4 ㎎/㎖ (예를 들어, 1-4 ㎎/㎖)의 더 높은 콜라게나제 농도가 또한 약 3 시간 (예를 들어, 1-5 시간)의 더 짧은 분해기간에 걸쳐서 적합하다. 추출 중에, 혈관의 말단은 묶거나 클립으로 고정시키고, 혈관 내에 함유된 제제에 의한 오염을 피하기 위해 추출배지 상에서 현탁될 수 있다. 따라서, 워튼 젤리 추출물은 제대 혈액세포, 제대 상피세포, 혈관 내피세포 및 혈관 평활근을 실질적으로 함유하지 않는다는 것을 인식할 수 있을 것이다.
본 발명에 따르면, 이러한 조직은 동결되고, 바람직하게는 극저온으로 저장되며, 저장된 조직으로부터 생존가능한 HUCPV 전구세포의 추출을 허용하는 방식으로 동결되거나 극저온 상태로부터 복구된다.
단리과정에 사용될 수 있는 다른 분해효소는 0.1 내지 10 ㎎/㎖ 히알우로니다제, 0.05 내지 1 ㎎/㎖ 트립신뿐만 아니라 EDTA이다. 최적 콜라게나제 농도는 3 시간의 분해기간 동안 4 ㎎/㎖이지만, 비용이 덜 드는 대체예는 18-24 시간 동안 0.5 ㎎/㎖를 사용하는 것이다. 콜라게나제 농도에 대한 또 다른 대체예는 도 21에 나타내었다. 바람직하게는, 분해는 도 21에 나타난 바와 같이 콜라게나제 농도에 따라 상이한 시점에서 나타나는 혈관이 분해하기 시작할 때, 또는 그 이전에 중지된다.
0.5 ㎎/㎖ 콜라게나제 추출배지에서 약 24 시간, 예를 들어, 18-24 시간과 같은 12-36 시간 후에, 또는 4.0 ㎎/㎖ 콜라게나제 추출배지에서 약 3 시간 후에, 혈관을 제거하여 인간 전구세포를 함유하는 혈관주위 조직 추출물을 남긴다. 이들 세포는 전구세포의 증식에 표준인 조건 하에서 증식된다. 세포는 예를 들어, 폴리스티렌 디쉬 또는 플라스크 내와 같이 유착세포를 선별하기 위한 폴리스티렌 상에서 선별한 후에, 적합한 배양 배지에서 유지시킬 수 있다. 추출된 세포는 문헌 [Baksh et al in WO02/086104]에 기재된 바와 같이 유착성 세포에 대한 예비 선별이 있거나 없이 교반 현탁액의 조건 하에서 증식을 위해 배양될 수 있으며, 상기 문헌의 기술내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
HUCPVCs의 추출된 군집은 유착조건 하에서 배양할 수 있으며, 상등액에 상재하는 비-유착성 세포는 추가의 배양을 위해서 회수된다. 이들 "유착-후" 세포는 골 결절 및 지방세포를 자발적으로 형성하는 경향에 의해서 아군집으로 특정화된다. 따라서, 이 과정은 혈관주위 조직으로부터 추출된 전구세포의 단리된 군집을 제공하며, 여기에서 세포는 골세포, 연골세포, 지방세포 및 근육세포를 포함하는 몇 가지의 분화된 세포 유형 중의 적어도 하나를 형성하는 경향을 가지며, 이러한 전구세포는 유착조건 하에서 배양된 HUCPVCs의 비-유착성 분획을 구성한다. 이러한 세포는 유착조건 하에서 혈관주위 조직-추출된 HUCPVCs를 배양하고, 비-유착성 세포 군집을 선별한 다음에, 비-유착성 세포 군집을 (1) 상기 군집을 증식시키거나, (2) 이들이 원하는 세포 표현형으로 분화하도록 야기하는데 유용한 조건 하에서 배양함으로써 수득된다. 여기에서 유용한 배양조건은 본 명세서에 예시된 바와 같이 이러한 증식 및 분화를 위해서 이미 확립된 것이다.
HUCPV 아군집은 표준 유착성 배양조건 하에서 배양 및 증식될 수 있다. 본 명세서에서 밝혀진 바와 같이, 이러한 유착성 세포 군집은 면역부적격 또는 비-면역원성 전구세포 및 중간엽 전구세포를 포함하는 것으로 알려져 있다.
추출물에 존재하는 세포는 직접 또는 그의 증식 후에, 주어진 표현형의 세포에 대해 풍부한 증식가능한 아군집을 제공하는 확립된 기술을 사용하여 분류될 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 다능성 중간엽 전구세포, 골전구세포에 대해 풍부한 혈관주위 조직 추출된 세포 군집, 면역-부적격 전구세포에 대해 풍부한 세포 군집, 및 면역-부적격인 다능성 및 골전구세포에 대해 풍부한 세포 군집을 추가로 제공한다. 추가로, 세포는 단지 혈관주위세포 마커 3G5에 대해서 양성인 것에 대해서 그에 대한 항체를 사용하여 선별하고, 단지 MHC 클래스 I 및 클래스 II 마커 중의 하나 또는 둘 다에 대해서 음성인 세포에 대해서 선별하도록 풍부하게 될 수 있다. 세포 군집은 또한, 예를 들어, CD45를 갖는 것을 고갈시켜 조혈성 세포를 제거하는 등에 의해서 다른 표면 마커에 대한 선별에 의해서 풍부하게 될 수도 있다.
도 17에서 밝혀진 바와 같이, 전구세포 군집 내의 MHC 마커의 분포가 동결-해동에 의해 변화된다. 신선한 세포를 계대시키면, MHC 이중 음성 세포의 빈도는 비교적 일정하게/근소하게 증가된다. 그러나, 전구세포 군집 내에서 MHC 이중 음성 세포의 빈도는 동결시킨 후에 평판배양된 세포에서 상당히 증가된다. 따라서, 전구세포 군집에서, MHC 이중 음성 표현형의 세포는 동결시킨 후에 빈도가 증가하는 경향에 의해 추가로 특정화된다. 이러한 동결은 먼저 세포 분취물을 제조한 다음에, 원하는 기간 동안 세포 제제를 분류시킴으로써 통상적인 방식으로 수행된다. 이러한 세포는 필요에 따라 수년 동안 분류될 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다.
이 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 혈관주위 조직 추출물 또는 그의 MHC 이중 음성-풍부 분획을 수득하고, 이 추출물 또는 그의 분획을 동결 처리한 다음에, 동결된 세포를 배양함으로써 MHC 이중 음성 전구세포를 생산하는데 유용하다. 언급한 바와 같이 생성된 세포는 조직 형성을 유도하거나, 인간 대상체에서 복구시키는데 잠재적으로 유용하다.
추출물 또는 그의 적합하게 풍부한 분획으로부터 수득된 세포 군집은 직접 또는 그의 증식 후에, 분화된 세포 군집을 제공하는 데 유용하다. 그의 분획화 및 풍부화, 및 그의 증식에 적합한 모든 과정은 선행기술에 확립되어 있다. 증식은 예를 들어, IL-3 및 줄기세포 인자, 및 본 기술분야에서 공지된 유사한 성분과 같은 인자의 존재 하에 수행될 수 있다. 세포 군집, 및 특히 그 안의 골전구세포는 그로부터의 골 조직 성장에 대해 확립된 조건을 사용하여 분화 처리된다. 놀랍게도, 수임된 골전구세포로 불리는, 전구세포 군집의 배양으로부터 발생되는 골전구세포의 아군집은 골원성 보충물의 부재 하에서 분화하는 능력을 나타냈다. 대신으로, 골전구세포는 덱사메타손과 같이 골형성을 자극하는 하나 또는 그 이상의 약제를 보충한 배지에서 배양된다. 또한, 전구세포는 연골, 근육, 힘줄, 지방 등을 포함한 그 밖의 다른 중간엽-유래 결합 조직 [Caplan, 1991]으로의 분화를 자극하는데 적합한 보충물과 함께 배양될 수도 있으며, 이들 모두는 본 기술분야에서의 표준 관례에 따른다.
세포 군집 내의 세포를 시험관내 배양에 대한 실용적인 대안으로서, 세포를 생체내 이식하여 환자에게서 직접적으로 목적하는 조직의 형성을 유도할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이 경로에 의해, 골의 동소 (in situ) 형성은 특히 골 골절 및 골다공증을 포함 다양한 골 상태, 질병 및 장애를 앓고 있는 환자의 이익을 위해 골전구세포를 이식함으로써 제공된다. 이러한 치료법은 또한, 연골, 지방 및 근육과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다른 결합조직의 질병을 약화시키기 위해서 적용될 수도 있다. 세포 군집에 존재하는 면역-부적격 전구세포는 그의 이식 후에 예상될 수 있는 실질적으로 감소된 거부 반응을 고려하여, 이 점에서 특히 유용하다.
이식에서 사용하기 위해서, 세포는 추가로 조작을 위해서 선택된 조직 부위에 그들을 송달하는데 유용한 담체를 포함하는 조성물로서 제공될 수 있다. 세포는 목적하는 효과에 효과적인 용량으로 제공된다. 효과적인 세포 용량은 용량당, 103 내지 107 세포, 예를 들어, 2×105 세포와 같은 104-106 세포의 범위에 있을 것으로 예상된다. 이들 세포를 송달하기 위해서 선택된 담체는 조성물 내에서 생존가능한 세포의 송달을 위해서 확립된 방법에 따라서 변화할 수 있다. 구체예에서, 세포는 골 조직 조작을 목적으로 활용된다. 한가지 구체예에서, 세포는 결함 또는 골절이 있거나, 외과적으로 이식물을 수용하도록 준비된 골 부위에서 이식물로서 세포를 국재화시키는 작용을 하는 스캐폴드 (scaffold) 물질의 형태로 담체와 함께 제공된다. 다양한 물질이 이러한 목적을 위해서 담체로 적합하다. 특정의 구체예에서, 담체는 인산칼슘, PLGA 또는 이들의 혼합물과 같은 흡수성 물질로 형성된다. 등가의 물질은 이들이 세포가 조성물의 형성 및 송달 중에 생존가능한 상태로 유지되도록 허용하고, 다른 식으로는 이식부위에서 생리적으로 상화적인 한은 사용될 수 있다.
전구세포의 송달에 적합한 그 밖의 다른 담체에는 PBS와 같은 비히클 및 히알루론산, 젤라틴 등을 포함하는 겔이 포함될 것이며, 이들 등가물은 세포 생존력에 필요한 pH 및 그 밖의 다른 특성을 갖는 한은 유용하다.
또한, 세포는 원하는 조직 부위에 유전자 발현 생성물을 송달하기 위한 호스트로서 유용한 것으로도 인식될 수 있을 것이다. 즉, 세포는 골조직의 경우에는 유용하게 PTH, BMPs, 칼시토닌 등을 포함할 수 있는 다양한 성장인자와 같이, 발현시키면 조직 복구방법에서 유용한 생성물을 생산하는 유전자를 수용하고 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 세포는 또한, 세포 표현형을 변화시키는 유전자를 도입시켜 세포가 소정의 최종-용도에 더 튼튼하고 더 적합하도록 만드는 것과 같은 다른 목적을 위한 이식유전자로서 개발될 수도 있다.
본 발명의 구체예는 이하의 실시예에서 기술된다.
[실시예]
인간 워튼 젤리로부터 전구세포의 수확
UCs는 캐나다 토론토 소재의 써니브룩 앤드 우먼즈 칼리지 하스피틀 (Sunnybrook & Women's College Hospital)에서 분만된 즉시 정상 임신 기간이 다 찬 제왕절개 영아로부터 수집하였다. UC는 외과의사에 의해 배지 (80% α-MEM, 20% 항생물질)를 함유하는 멸균 용기 내에 옮기고, 즉시 토론토 대학교 생체재료 및 생의학 가공연구소 (the Institute of Biomaterials & Biomedical Engineering, University of Toronto)의 본 발명자들의 실험실로 옮겼다.
이 시점으로부터의 모든 과정은 생물학적 안전 캐비넷 내에서 무균적으로 수행하였다. UC를 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) (-Mg2+, -Ca2+)에서 3회 세척하여 가능한 많은 UC 혈액을 제거하고, 배지를 함유하는 용기 내로 다시 옮겼다. 대략 6 cm 길이의 제대를 멸균 가위로 절단하여 멸균 코르크 절개 보드 상에 두었다. 나머지 제대 (30-45 cm)는 배지-충전 용기 내에 다시 넣고, 37℃의 배양기 내에 두었다. 제대의 6 cm 절편을 그의 나선에 반대로 '꼬고', 양쪽 말단을 핀으로 고정하여 UC 상피의 매끄럽고 곧은 표면이 드러나게 하였다. 미세한 가위를 사용하여, UC를 그의 길이를 따라 대략 1-2 mm 깊이로 절단하여 WJ를 드러나게 하였다. 절단한 상피의 '플랩 (flap)' 각각으로 시작하며, WJ를 외과용 메스 (scalpel)의 무딘 가장자리를 사용하여 그의 내부 표면으로부터 벗겨내고, 벗겨낸 상피 (대략 0.5 ㎜ 두께)를 핀으로 고정하였다. 이 과정으로 WJ를 노출시키고, 그 안에 매립된 그의 3 개의 혈관이 그의 세로 축을 따라서 나선형보다는 말단에서 말단으로 직선으로 뻗게 하였다. 절편은 계속해서 37℃의 PBS에 의해 조심스럽게 침지시켰다. 혈관의 한쪽 끝을 핀셋을 사용하여 분리시키고, 이것을 WJ 매트릭스의 벌크를 함유하지 않을 때까지 WJ로부터 그의 길이에 따라 벗겨내었다. 대신으로, 혈관의 중간을 매트릭스로부터 절개하고, 집게로 잡고, 매트릭스로부터 그의 말단을 향해 각 방향으로 벗겨낼 수도 있었다. 둘 중 하나의 방법에 의해 분리시킨 후에, 혈관을 대략 1-2 ㎜의 세포-보유 WJ 매트릭스로 둘러쌌다. 그 후, 절개된 혈관을 외과용 클램프 또는 모스키토 클립으로 양 말단을 집거나 또는 봉합하여 '루프'를 생성시켜 혈관 내외로 유체의 통과를 막았다. '루프'를 즉시 가위로 PBS (-Mg2+, -Ca2+)와 함께 0.5 ㎎/㎖ 콜라게나제 용액을 함유하는 50 ㎖ 튜브 내에 두고, 37℃의 배양기에 넣었다. 나머지 2 개의 혈관을 유사한 방식으로 절개하고, 루프형으로 만들고, 또한 배양기 내의 콜라게나제 용액 내에 넣었다. 혈관을 제거한 후에, 혈관주위 조직을 구성하는 WJ의 스트립은 쉽게 상피를 절개해내고, 콜라게나제 용액을 함유하는 50 ㎖ 튜브 내에 둘 수 있었다. 그 후, 나머지 상피층은 생물재해 폐기물 용기 내에 폐기시켰다. 동일한 프로토콜을 UC의 나머지 30-45 ㎝에 사용하여 '루프' 또는 혈관주위 조직 스트립을 갖는 15 내지 25 개의 튜브를 제조하였다.
워튼 젤리 전구세포 배양의 개시
18-24 시간 후에, '루프'를 그의 부착된 현수 클램프 또는 봉합사 및 피펫의 도움을 받아서 제거한 다음에, 나머지 현탁액을 PBS에 의해서 2-5 회 희석하고, 1150 rpm으로 5 분 동안 원심분리시켜 튜브/들의 바닥에서 펠릿으로서 세포 분획을 수득하였다. 상등액을 제거한 후에, 어떤 오염성 적혈구라도 용해시키기 위해서 세포를 8 배 용적의 4% NH4Cl에 실온에서 5 분 동안 재현탁시켰다. 그 후, 현탁액을 다시 1150 rpm에서 5 분 동안 원심분리시켜 펠릿으로서 세포 분획을 단리시키고, 상등액은 제거하였다. 혈구계산기를 사용하여 세포를 계수한 후에, 이들을 직접 T-75 ㎠ 조직 배양 폴리스티렌 디쉬 상에 도말하고, 세포가 폴리스티렌 표면에 부착하도록 하기 위해서 24-72 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후, 배지는 매 2일마다 교환하였다.
이하에 상술한 결과는 콜라게나제-기본 분해를 4 ㎎/㎖에서 3 시간 동안, 2 ㎎/㎖에서 6 시간 동안, 및 1 ㎎/㎖에서 12 시간 동안 진행시키는 것을 제외하고는 상술한 과정을 사용하여 재현되었다.
부착된 세포는, 광학 현미경에 의해서 관찰되는 것으로서 80-90％ 합류 (confluency)를 나타내는 시점인 7일 후에 1％ 트립신 용액을 사용하여 계대배양하였으며, 위상 현미경 하에 밝혀지고 광학 특성의 예상된 변화에 의해 나타난 바와 같이, '무기질화된' 응집체 형성의 증거가 있었다. 계대 시에, 세포는 보충된 배지 (SM) (75％ α-MEM 또는 D-MEM, 15％ FBS, 10％ 항생물질) 중의 35 mm 조직 배양 폴리스티렌 디쉬 또는 6 웰 플레이트 내에 4 x 103 세포/㎠로 도말하고, 10-8 M Dex, 5 mM β-GP 및 50 ㎍/㎖ 아스코르브산으로 처리하여 이들 세포의 골원성 능력을 시험하였다. 이들 플레이트는 다른 식으로는 '골 결절' 형성이라 칭하는 CFU-O에 대해 배양 2, 3, 4 및 5일째에 관찰하였다.
이들 세포의 연골발생 능력을 시험하기 위해서, 2×105 세포를 1150 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿으로 수득하였다. 상등액을 제거하자마자, 세포를 10 ng/㎖ 변형성장인자-베타 (TGF-β) (및 임의로 10-7 M 덱사메타손)가 보충된 SM 내에 유지시켰다. 보충된 배지는 매 2일마다 교체하였으며, 3-5 주일 동안 배양을 유지시키고, 이 시점에서 이들은 조직학 (10% 중성 포르말린 완충액 (NFB)으로 고정시킴으로써)을 위해서 수확하고, 파라핀 내에 매립시키고, 6 ㎛ 절편으로 절단하여 콜라겐 II의 존재 (항체 염색) 및 글리코사미노글리칸의 존재 (알시안 블루 염색)에 대해서 염색하였다. 세포의 지방생성 분화능력을 평가하기 위해서, 이들을 처음에는 60% 합류에 도달할 때까지 SM (D-MEM 포함) (이것은 매 2일마다 교체하였다) 중의 6-웰 플레이트 내에서 배양하였다. 그 시점에서 배지를 지방생성 유도 배지 (AIM) (88% D-MEM, 3% FBS, 33 μM 비오틴, 17 μM 판토테네이트, 5 μM PPAR-감마, 100 nM 소인슐린, 1 μM 덱사메타손, 200 μM 이소부틸 메틸크산틴 및 10% 항생물질)로 교체하였다. AIM은 10일 동안 매 2일마다 교체하였으며, 이 시점에서 세포를 10% NFB로 고정시키고, 지방세포의 지질 공포를 적색으로 염색하는 오일 레드 (Oil Red) O로 염색하였다. 마지막으로, 세포의 근원성 능력을 평가하기 위해서, 이들을 처음에는 80-90% 합류에 도달할 때까지 T-75 ㎠ 조직 배양 플라스크 내의 SM (D-MEM 포함) 중에서 배양하였으며, 그 시점에서 배지를 근원성 배지 (MM) (75% D-MEM, 10% FBS, 10% 말 혈청, 50 μM 하이드로코티손 및 10% 항생물질)로 교체하였다. MM은 매 2일마다 교체하였다. 3-5 주일 동안 배양한 후에, 세포를 배양 표면으로부터 분리하고 (이차배양 프로토콜 참조), 용해시켜 그들의 mRNA를 수득하고, MyoG, MyoD1, Myf5, 미오신 중쇄 및 미오게닌 및 데스민을 포함한 몇 가지의 근원성 유전자의 존재에 대하여 rtPCR에 의해서 평가하였다.
하기 프로토콜을 사용하는 혈관주위 조직-유래 전구세포 배양물을 수득하는 또 다른 유용한 접근법이 채택되었다:
1. 제왕절개 환자로부터 멸균 제대 (UC)를 수득하고, 배지 (80％ α-MEM, 20％ 항생물질) 중의 생물학적 안전 캐비넷에 옮긴다.
2. UC를 멸균 37℃ 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 중에서 3회 세척한다.
3. UC를 날카로운 가위로 대략 1-2 인치 절편으로 절단한다.
4. UC의 각 절편을 멸균 37℃ PBS로 2회 세척하여 가능한 많은 잔존 제대 혈액 (UCB)을 제거한다.
5. 건조 멸균 디쉬 상에서 UC 절편 중의 하나를 단리시킨다.
6. 2 세트의 핀셋을 사용하여, 상피를 대략 2 mm 떨어지게 붙잡고, 서로로부터 떼어내어 상피를 찢는다.
7. 상피를 UC 절편의 길이를 따라서 잡고, 상피를 연속으로 찢어서 WJ 하부를 노출시킨다.
8. 단계 6과 유사하게, 상피의 대략 절반 정도가 찢어질 때까지 상피를 계속해서 '스트립'으로 찢는다.
9. 제대 혈관은 WJ를 통해 명확하게 보이게 하여야 하고, 말단을 UC 절편의 절단 가장자리 상에서 느슨하게 한다.
10. 한 세트의 핀셋을 사용하여 상피의 나머지 부분을 잡고, 다른 것으로는 혈관의 말단을 붙잡아서 혈관을 그 주변의 혈관주위 조직 (PVT)을 갖는 벌크 WJ로부터 '잡아당길' 수 있다.
11. 이 과정은 3 개의 혈관 모두가 기저 WJ 매트릭스를 함유하지 않을 때까지 혈관 각각에 대해 반복한다.
12. 방출되자마자, 각각의 혈관은 37℃ PBS 내에 둔다.
13. 모든 혈관이 멸균 37℃ PBS-충전 비이커에서 단리될 때까지 단계 5-12를 UC의 각 절편에 대해서 반복한다.
14. 그 후, 각각의 혈관은 깨끗한 멸균 표면상에 개별적으로 둠으로써 말단을 이중 매듭을 사용하는 봉합사에 의해서 함께 결찰하여 '루프'로 만들 수 있다.
15. 모든 혈관이 루프로 결찰된 후에, 루프를 멸균 50 ㎖ 튜브 내의 0.5 ㎎/㎖ 콜라게나제 용액에 넣는다. 대안으로, 그리고 본 발명에 따라서, 혈관을 동결시키고, 극저온으로 저장한 다음에, 본 발명의 방법을 사용하여 상재하는 전구세포 (HUCPVCs)의 생존력을 유지시키면서 복구시킬 수 있으며, 해동되고 처리된 제대조직 내에 상재하는 생존가능한 전구세포는 단계 15에서 시작하는 방법을 사용하여 회수될 수 있다.
16. 50 ㎖ 튜브를 37℃, 5％ CO2 배양기에서 회전자 (rotator) 내에 밤새 넣어둔다.
17. 다음날, 콜라게나제를 1 ㎖의 소 태아 혈청 (FBS)으로 불활성화시키고, 루프를 현탁액으로부터 제거한다.
18. 나머지 현탁액을 PBS로 희석하고, 1150 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거한다.
19. 그 후, 펠릿을 8 배 용적의 4% NH4Cl에 실온에서 5 분 동안 재현탁시켜 모든 오염성 적혈구를 용해시킨 다음에, 1150 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거한다.
20. 펠릿에 잔존하는 세포를 보충된 배지 (SM) (75％ α-MEM, 15％ FBS, 20％ 항생물질) 내에 재현탁시키고, 분취액을 혈구계산기 상에서 계수한다.
21. 그 후, 세포 현탁액을 T-75 조직-배양 폴리스티렌 플라스크 상에 도말하고, 증식시킨다.
22. 2일 후에, 플라스크로부터의 상등액을 새로운 T-75 플라스크에 옮겨서 "유착-후" (PA) 세포를 수확한다.
23. 2일 후에, 첫 번째 PA 플라스크로부터의 상등액을 새로운 T-75 플라스크에 옮겨서 나머지 PA 세포를 모두 수확한다.
24. 3 개의 T-75 플라스크에서 세포가 합류점전 (sub-confluence)에 도달할 때 (1-2 주일)까지 SM은 매 2일마다 교환하며, 이 시점에서 이들은 이차-배양 (계대배양)한다.
전체 제대 혈관의 극저온 보존
본 발명은 이하에 예시된 과정을 사용하여, 극저온으로 저장된 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 복구시키도록 한다.
동결
개별적인 제대 혈관을 상술한 바와 같이 단리시키고, 말단을 상술한 바와 같이 봉합사로 묶어서 루프를 형성시켰다. 혈관을 각각, 90% 소 태아 혈청 (FBS) 및 10% 디메틸설폭사이드 (DMSO)로 구성된 5 ㎖의 극저온 보존 배지를 함유하는 15 ㎖ 폴리프로필렌 튜브 내에 넣었다. 그 후, 제조된 튜브를 -70℃ 냉동기 내에 밤새 넣어두고, 다음날 더 장기간 저장을 위해서 액체 질소로 옮겼다.
해동
제조된 검체를 함유하는 튜브를 저장한 지 3일 후에 액체 질소로부터 꺼내어 즉시 37℃ 수욕 내에 넣었다. 약 5 분 동안 완전히 해동되면, 검체 루프를 상술한 바와 같은 콜라게나제 분해배지 내에 넣고, 37℃ 배양기 내의 로티세리 (rotisseri) 내에 넣었다. 18-24 시간의 배양 후에, 분해된 혈관을 제거하고, 전구세포는 상술한 바와 같은 과정을 사용하여 단리시켰다. 또한, 상술한 바와 같이 조직 배양 플레이트 상에 도말하고, 5-15% FBS 보충된 배지 내에서 배양한 후에, 생존가능한 세포는 트립판 배제에 의해서 확인되었다.
다음과 같은 개선된 방법이 또한, 개발되었다. 결합된 워튼 젤리를 갖는 혈관을 제대로부터 분리시키고, 상술한 분리기술을 사용하여 약 1-2 인치 또는 약 4 ㎝ 길이의 분절로 절단하였다. 그 후, 분리된 혈관 분절 (밀집되는 것을 피하기 위해서 튜브당, 약 5-10 개의 분절)을 혈관당 1 ㎖로 50 ㎖ 원심분리 튜브 내의 10% DMSO 및 90% FBS (4℃로 냉각됨)에 넣었다. 90% FBS 대신에, 10% 혈청 (FBS 또는 기타) 및 80% DMEM 또는 세포 배양에 적합한 그 밖의 다른 배지와 같은 상이한 혈청-함유 혼합물 또는 블렌드가 사용될 수 있다. 그 후, DMSO/혈청 용액 중에 혈관 분절을 함유하는 튜브를 우선 4℃의 냉동고 내에서 30 분 동안 배양함으로써 과도기적으로 냉각시켰다. 그 후, 튜브를 분리하고, 혈관을 극저온튜브로 공지된 극저온보존 용기에 옮겼다. 하나의 혈관 분절을 각각의 튜브에 첨가하였다. 혈관을 함유하는 극저온튜브에 혈관의 4 ㎝ 절편당, 1 ㎖의 극저온보호용액 (상기한 바와 같이 90% 혈청, 10% DMSO)을 첨가하거나, 혈관을 완전히 침지시키는데 충분하게 첨가하였다.
그 후, 극저온튜브에 넣은 혈관 분절을 밤새 (약 6-12 시간) 조절된 속도의 냉동기 내에 넣고, 온도를 -70℃로 감소시켜 유지시켰다. 그 후에, 튜브를 액체 질소 저장소 (증기상)로 옮기고, 인식표를 붙이고, 약 1 주일 동안 -196℃에서 유지시켰다.
혈관을 해동시키기 위해서, 극저온튜브를 액체 질소 저장소로부터 꺼내었다. 혈관을 극저온튜브로부터 꺼내어 37℃의 수욕 중에서 10 분 동안 해동시켰다. 그 후, 혈관 분절을 50 ㎖ 튜브에 옮기고, 혈관 분절당 약 1 ㎖의 PBS를 사용하여 냉각된 (4℃) PBS 중에서 세척하였다. 그 후, PBS 중에 혈관 분절을 함유하는 튜브를 4℃의 냉동고 내에서 배양하여 DMSO를 제거하였다. 그 후, 각각의 튜브 내의 냉 PBS의 양을 배가시키고, 튜브를 냉동고 내에서 추가로 5 분 동안 배양하였다.
이 과정에 따라서, 혈관 분절은 특히 본 명세서에 더 상세히 기술된 전구세포 추출, 배양 및 분화 기술에 따라서, HUCPVCs를 포함한 생존가능한 전구세포의 공급원으로 제공하도록 준비된다.
생존가능한 세포가 이렇게 보존된 조직으로부터 회수될 수 있음을 확인하기 위해서, 혈관 분절은 상기 언급한 분해과정에 적용하고, 방출된 세포를 도 22와 관련하여 기술된 바와 같이 도말하고, 세포를 트립판 블루 배제를 사용하여 바이셀 (ViCell)-XR 기계에서 계수하였다. 이에 따라서, 생존가능한 것으로 측정된 세포를 본 명세서에서 언급된 바와 같이 표준 배양 배지 내에 평판배양하고, 패널 A 및 B에서 나타낸 바와 같이 콜로니를 형성하고 증식하는 그들의 능력을 입증하였다.
이 방법은 표준 분해과정으로부터 분리된 세포에 대해서 생물학적으로 동등한 세포를 제공하였다.
절제된 조직을 10% DMSO에 액침시킨 다음에, -70℃에서 동결시키고, 이어서 극저온으로 보존하는 것을 포함하는 다른 방법이 시도되었다. 이들 방법은 도 22의 패널 C에 나타낸 바와 같이 매우 적은 생존가능한 세포를 제공하였다.
전구세포 측정시험
세포증식 측정시험
매주의 계대과정 (매 6일마다 발생함) 중에, 3×104 세포의 분취량을 246-웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 도말하였다. 배양 1, 2, 3, 4, 5 및 6일째에, 6-웰 플레이트 중의 4 개를 계대배양하고, 세포를 계수하였다. 이들 세포의 지수적 증식을 제도 (plotting)하고, 이들 배양액 중에서 세포에 대한 평균 배가시간을 계산하였다. 결과는 도 16에 나타내었다. PVWJ 세포 배양에 대한 배가시간은 전체 배양기간에 걸쳐 약 24 시간임을 알 수 있을 것이다. 대수증식기 중에, 배가시간은 놀랍게도 16 시간이다. 이것을 골수 중간엽 세포에 대한 약 33-36 시간 [Conget and Minguell, 1999], 및 지방조직으로부터 유래된 중간엽 줄기 세포에 대한 약 3.2일 [Sen et al., 2001]의 문헌에 보고된 배가시간과 비교한다. 연속적인 계대배양에 의한 증식의 관찰을 위해서, 3×105 세포를 4 개의 T-75 플라스크 (n=4)에 도말하고, SM을 공급하고, 이것은 매 2일마다 교체하였다. 배양 6일 후에, 세포를 이차배양하고 (상기 이차배양 프로토콜 참조), 혈구계산기를 사용하여 계수하였다. 3×105 세포의 분취량을 4 개의 새로운 T-75 플라스크에 접종하고, 6일 동안 배양하여, 계수하는 과정을 반복하였다. 이 과정은 4 개의 제대 샘플에 대해서 Po부터 P9까지 반복하였다.
도 18은 HUCPVCs의 CFU-F 빈도를 나타낸 것이다. 1:300의 빈도는 신생아 BM (1:104) [Caplan, 1991]을 포함한 다른 중간엽 전구세포 공급원, 및 1:2×108의 빈도로 나타나는 제대 혈액-유래하는 "비제한된 체줄기세포" (USSCs) [Kogler et al., 2004]에 대해서 관찰되는 것보다 상당히 더 높다. 도 19는 연속적 계대배양에 의한 HUCPVCs의 증식율을 설명한다. P0에서 60 시간의 초기 배가시간은 P1에서 38 시간으로 떨어지며, 이것은 P2-P8에서 떨어져서 그 자체가 20 시간에서 유지된다. 세포는 그 후에 노년기에 들어가지 시작하며, 그들의 증식율은 빠르게 떨어지기 시작한다. 흥미롭게도, 배양의 처음 30일 동안에 관찰하는 경우에 (도 20), HUCPVCs는 30일 이내에 2×1010 세포를 유도한다. 하나의 치료학적 용량 (TD)은 2×105 세포로 정의되기 때문에 [Horwitz et al., 1999] [Horwitz EM, Prockop DJ, Fitzpatrick LA, Koo WW, Gordon PL, Neel M et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med 1999; 5:309-313], HUCPVCs는 배양의 10일 이내에 1 TD, 및 배양의 24일 이내에 1,000 TDs를 유도할 수 있다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 혈관주위 조직-유래 전구세포는 전구세포의 상이한 하위-군집을 포함한다. 이 군집 내에는, 덱사메타손의 존재 하에서 배양하는 것과 같이 이러한 분화를 유도하는데 통상적으로 필요한 배양 보충물의 부재 하에서, 본 명세서에서 나타내는 바와 같이, 골 결절을 형성하는 능력을 특징으로 하는 소위 "수임된" 골전구세포가 있다. 따라서, 이들 수임된 골전구세포는 자발적으로 분화되어 골 결절을 형성한다. 또한, 전구세포 군집 내에는 덱사메타손, β-글리세로포스페이트 및 아스코르브산과 같은 필요한 인자의 존재 하에서 배양할 때에 골 결절을 형성하도록 유도될 수 있는 골전구세포가 있다. 따라서, 도 15에 그래프로 도시된 "총 골원성" 아군집에는 "수임된 골원성 전구세포" 군집뿐만 아니라 "비수임된 골원성 전구세포" 군집을 포함하고, 골원성 분화 경로를 따라서 분화하도록 유도될 수 있는 세포의 총수를 나타낸다. "수임된" 및 "비수임된" 군집 사이의 실제 비는 대략 1:1이고, 따라서 "총 골원성 전구세포" 군집 및 "수임된 골원성 전구세포" 군집 사이의 비율이 약 2:1이다. 전구세포의 골 형성 특성의 분석은 이하에 언급된 바와 같이 수행되었다.
세포의 연골발생, 지방생성 및 근원성 분화도 또한 관찰되었다. 비록 골원성 및 기회적 지방생성 분화가 자발적으로 관찰되었지만, 다른 표현형은 단지 각각의 표현형에 대한 특이적 유도조건 하에서 배양하는 경우에는 관찰되었다.
계열 희석 및 CFU-F 측정시험
1×105, 5×104, 2.5×104, 1×104, 5×103, 1×103 HUCPVCs의 희석물을 6-웰 배양 플레이트 (Falcon# 353046) 상에 접종하고, 매 2일마다 SM을 공급하였다. >16 세포를 포함하는 콜로니의 수는 배양 10일째에 각 웰에서 계수하였으며, 14일째에 확인하였다. 따라서, 하나의 콜로니를 생산하는데 필요한 세포의 평균 수인 CFU-F 빈도는 1 CFU-F/도말된 300 HUCPVCs인 것으로 측정되었다. 이러한 빈도를 기준으로 하여, 300 HUCPVCs (3 개의 제대 각각으로부터 삼중으로 수행됨)를 제공하는데 필요한 단위 용적을 계산하였으며, HUCPVCs의 8 점증 단위 용적을 6-웰 플레이트 상의 개개 웰에 접종하였다. 다시, >16 세포 (CFU-Fs)를 포함하는 콜로니를 배양 10일째에 계수하여 점증 접종에 의한 CFU-F 빈도를 분석하였다.
CFU-O 측정시험
매주일의 계대배양 중에, 시험 세포 군집의 분취량은 75％ α-MEM, 15％ FBS (StemCell Batch #: S13E40), 페니실린 G (167 단위/㎖), 겐타마이신 (50 ㎍/㎖) 및 암포테리신 B (0.3 ㎍/㎖)를 함유하는 10% 항생물질 저장용액, 및 Dex (10-8 M), β-글리세로포스페이트 (5 mM) 및 L-아스코르브산 (50 ㎍/㎖)을 함유하는 골 형성 배지 내의 조직-배양 폴리스티렌 상에 1×104 세포/㎠의 세포 접종밀도로 직접 도말하였다. 배양액은 12일의 기간 동안 매 2일마다 재공급하였다. 골 결절로서 검출되는 무기질화된 결절 영역이 관찰될 때까지 (일반적으로 3일) 배양을 유지하였으며, 이 시점에서 배양액을 최종 배양물 재공급 시에 테트라사이클린 함유 배지와 함께 재공급한 다음에, 카르노브스키 고정제 (Karnovsky fixative)에서 고정하고, 분석을 위해 준비하였다. 레이츠 아리스토플란 (Leitz Aristoplan) 현미경 (Esselte Leitz GmbH & Co KG, Stuttgart, Germany)을 사용하여 위상차 뿐만 아니라 UV 형광 하에서 테트라사이클린 표지 배양물을 가시화시키고, 15 kV의 가속 전압에서 히타치 (Hitachi) S-2000 주사 전자 현미경을 사용하여 영상을 생성시켜 형태학적으로 식별가능한 골 매트릭스의 존재를 측정하였다.
CFU-C 측정시험
이들 세포의 연골발생 능력을 시험하기 위하여, 2×105 세포를 1150 rpm에서 5 분 동안 원심분리시켜 세포를 펠릿으로 수득하였다. 상등액을 제거하자마자, 세포를 10 ng/㎖ 변형성장인자-베타 (TGF-β) (및 임의로 10-7 M 덱사메타손)가 보충된 SM 내에 유지시켰다. 보충된 배지는 매 2일마다 교체하였으며, 3-5 주일 동안 배양을 유지시키고, 이 시점에서 이들은 조직학 (10% 중성 포르말린 완충액 (NFB)으로 고정시킴으로써)을 위해서 수확하고, 파라핀 내에 매립시키고, 6 ㎛ 절편으로 절단하여 콜라겐 II의 존재 (항체 염색) 및 글리코사미노글리칸의 존재 (알시안 블루 염색)에 대해서 염색하였다. 염색은 유도조건 하에서 연골세포의 형성을 뒷받침하였다.
CFU-A 측정시험
세포의 지방생성 분화능력을 평가하기 위해서, 이들을 처음에는 60% 합류에 도달할 때까지 SM (D-MEM 포함) (이것은 매 2일마다 교체하였다) 중의 6-웰 플레이트 내에서 배양하였다. 그 시점에서 배지를 지방생성 유도 배지 (AIM) (88% D-MEM, 3% FBS, 33 μM 비오틴, 17 μM 판토테네이트, 5 μM PPAR-감마, 100 nM 소인슐린, 1 μM 덱사메타손, 200 μM 이소부틸 메틸크산틴 및 10% 항생물질)로 교체하였다. AIM은 10일 동안 매 2일마다 교체하였으며, 이 시점에서 세포를 10% NFB로 고정시키고, 지방세포의 지질 공포를 적색으로 염색하는 오일 레드 O로 염색하였다. 염색은 유도조건 하에서뿐만 아니라 그들의 부재 하에서의, 즉 자발적인 지방세포의 형성을 뒷받침하였다.
CFU-M 측정시험
세포의 근원성 능력을 평가하기 위해서, 이들을 처음에는 80-90% 합류에 도달할 때까지 T-75 ㎠ 조직 배양 플라스크 내의 SM (D-MEM 포함) 중에서 배양하였으며, 그 시점에서 배지를 근원성 배지 (MM) (75% D-MEM, 10% FBS, 10% 말 혈청, 50 μM 하이드로코티손 및 10% 항생물질)로 교체하였다. MM은 매 2일마다 교체하였다. 3-5 주일 동안 배양한 후에, 세포를 배양 표면으로부터 분리하고 (이차배양 프로토콜 참조), 용해시켜 그들의 mRNA를 수득하고, MyoG, MyoD1, Myf5, 미오신 중쇄 및 미오게닌 및 데스민을 포함한 몇 가지의 근원성 유전자의 존재에 대하여 rtPCR에 의해서 평가하였다. 결과는 이들 유도조건 하에서 근세포의 존재를 뒷받침하였다.
데이타 분석
테트라사이클린 염색
테트라사이클린 (9 ㎍/㎖)은 종결 전에 배양액에 첨가하였다. 종결 시에, 세포를 카르노브스키 고정제에서 밤새 고정시킨 다음에, 결절 영역의 무기질 성분을 표지하는 테트라사이클린에 대한 UV-여기된 형광 영상화에 의해서 검사하였다.
주사 전자 현미경 검사 (SEM)
CFU-O 배양물의 대표적 샘플은 먼저 이들을 70％, 80％, 90％ 및 95％ 에탄올에 1 시간 동안 액침시키고, 이어서 100％ 에탄올에 3 시간 동안 액침시킴으로써 SEM을 위해서 제조되었다. 그 후, 이들은 임계점 건조시켰다. 대략 3 ㎚ 층인 금 층은 폴라론 SC515 SEM 코팅 시스템 (Polaron SC515 SEM Coating System)을 사용하여 검체 상에 스퍼터 코팅 (sputter coating)한 다음에, 이것을 15 kV의 가속 전압으로 히타치 S-2000 주사 전자 현미경의 다양한 배율에서 조사하였다. 생성된 영상을 사용하여 형태학적으로 식별가능한 골 매트릭스의 존재를 입증하였다.
HLA-타이핑 (typing)을 위한 유동 세포측정
>1×105 세포의 시험 세포 군집을 2％ FBS (StemCell Batch #: S13E40)를 함유하는 PBS 중에서 세척하고, 포화 농도 (1:100 희석)의 하기 컨쥬게이트된 마우스 IgG1 HLA-A,B,C-PE 및 HLA-DR,DP,DQ-FITC를 갖는 PBS+2％ FBS 중에 4℃에서 30 분 동안 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 PBS+2％ FBS로 2 회 세척하고, 1 ㎍/㎖ 7-AAD (BD Biosciences)로 염색하고, ExpoADCXL4 소프트웨어 (Beckman-Coulter)를 사용하여 유동 세포측정기 (XL, Beckman-Coulter, Miami, FL) 상에서 분석하기 위해 PBS+2％ FBS 내에 재현탁시켰다. 양성 염색은 부합하는 이소타입 항체 (FITC- 및 PE-컨쥬게이트된 마우스 IgG1,κ 모노클로날 이소타입 표준물, BD Biosciences)로 염색된 대조 군집으로부터 세포의 >99％까지에 의해서 수득된 수준을 초과하는 형광 시그날의 방출로서 정의되었다. 각각의 샘플에 대해서, 적어도 10,000 리스트 모드 현상이 수집되었다. 모든 플롯은 EXPO 32 ADC 분석 소프트웨어에서 작성되었다.
HLA 타이핑 이외에도, HUCPV 세포 군집은 또한 다른 마커에 대해서도 평가되었으며, 그 결과는 다음과 같다:
결과
골 결절 콜로니의 광학 현미경사진
도 3, 4 및 5는 3 및 5일째의 배양액에 존재하는 CFU-O를 나타낸다. 이들은 골-매트릭스를 생성하는 다각세포의 '응집'에 의해서 나타나는 결절 영역을 둘러싸는 "섬유모세포-유사" 세포의 합류층을 나타내었다. 이들 CFU-O는 Dex (+) 및 Dex (-) 배양액 둘 다에서 관찰되었으며, 연속적인 계대배양에서 유사한 형태학을 나타내었다.
CFU-O 배양물의 테트라사이클린 표지
배양물의 테트라사이클린 표지는 골의 생물학적 무기물 상과 결합된 새롭게 형성된 인산칼슘을 표지하기 위해 사용되었다. 배양물의 테트라사이클린 표지는 무기질화된 결절 영역과 일치하며, 이것은 배양물을 UV 광에 노출시킴으로써 가시화되었다. 도 6 및 7은 전구세포의 3일 및 5일째 배양액의 테트라사이클린 표지된 CFU-O 배양물을 도시한 것이다. 이들 영상은 UV-여기된 형광 영상화에 의해서 생성시키고, 사진을 찍었다.
주사 전자 현미경 검사
CFU-O는 무기질화된 콜라겐 매트릭스의 형성에 대해 SEM 하에서 관찰하였으며, 이것은 성숙 CFU-O 내에서 조밀하게 무기질화된 매트릭스를 통한 콜라겐 형성의 초기 단계로부터의 CFU-O의 형성을 나타낸다. 도 8, 9, 10, 11, 12 및 14는 CFU-Os의 주사 전자 현미경사진을 나타낸다.
유동 세포측정 및 HLA-타이핑
주요 조직적합성 컴플렉스 (MHCs) 둘 다를 나타내는 세포-표면 항원을 식별하는 유동 세포측정은 단리된 세포의 군집 중 77.4％를 MHC-/-로 나타내었다. 도 13은 음성 대조군에 관한 유동 세포측정 결과를 나타낸 것이다. 도 17은 전구세포 군집에서 MHC-/- 세포의 빈도에 대한 동결-해동의 영향을 나타낸다. 동결-해동의 영향을 다음과 같이 연구하였다:
>1×105 세포의 시험 세포 군집을 2％ FBS를 함유하는 PBS에서 세척하고, 포화 농도 (1:100 희석)의 하기 컨쥬게이트된 마우스 IgG1 HLA-A,B,C-PE (BD Biosciences #555553, Lot M076246) (MHC I), HLA-DR,DP,DQ-FITC (BD Biosciences #555558, Lot M074842) (MHC II) 및 CD45-Cy-사이크롬 (BD Biosciences #555484, Lot 0000035746)를 갖는 PBS+2％ FBS에 4℃에서 30 분 동안 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 PBS+2％ FBS로 2 회 세척하고, ExpoADCXL4 소프트웨어 (Beckman-Coulter)를 사용하여 유동 세포측정기 (XL, Beckman-Coulter, Miami, FL) 상에서 분석하기 위해 PBS+2％ FBS에 재현탁시켰다. 양성 염색은 부합하는 이소타입 항체 (FITC-, PE-, 및 Cy-사이크롬-컨쥬게이트된 마우스 IgG1,κ 모노클로날 이소타입 표준물, BD Biosciences)로 염색된 대조 군집으로부터 세포의 >99％까지에 의해서 수득된 수준을 초과하는 형광 시그날의 방출로서 정의되었으며, 이것은 인간 BM 샘플의 양성 형광에 의해 확인되었다. 각각의 샘플에 대해서, 적어도 10,000 리스트 모드 현상이 수집되었다. 모든 플롯은 EXPO 32 ADC 분석 소프트웨어에서 작성되었다.
2차 배양 및 세포 접종
부착된 세포는 7일 후에 0.1％ 트립신 용액을 사용하여 2차 배양 (계대배양)하였으며, 이 시점에서 이들은 광학 현미경에 의해 관찰되는 바와 같이 80-90％ 합류를 나타내었다. 계대배양 시에, 세포는 MHC-A,B,C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대해 유동 세포측정에 의해서 관찰하였다. 그 후, 이들을 SM 중에서 4×103 세포/㎠로 T-75 조직 배양 폴리스티렌 플라스크 내에 도말하고, 10-8 M Dex, 5 mM β-GP 및 50 ㎍/㎖ 아스코르브산으로 처리하여 이들 세포의 골원성 능력을 시험하였다. 이들 플라스크를 배양 2, 3, 4, 5 및 6일째에 CFU-O 또는 골 결절 형성에 대해서 관찰하였다. 계대배양 과정으로부터의 임의의 잔존 세포는 또한 추후 사용을 위해서 극저온으로 보존하였다.
세포의 극저온 보존
1×106 PVT 세포의 분취량을 90％ FBS, 10％ 디메틸설폭사이드 (DMSO) (Sigma D-2650, Lot# 11K2320)로 구성된 1 ㎖의 총 용적으로 제조하고, 1 ㎖ 폴리프로필렌 극저온-바이알 내로 피펫으로 옮겼다. 바이알을 -70℃ 냉동고 내에 밤새 넣어두고, 다음날 장기간 저장을 위해서 -150℃ 냉동고로 옮겼다. 극저온 상태에서 보존 1 주일 후에, PVT 세포를 해동시키고, MHC-A,B,C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대해 유동 세포측정으로 관찰하였다. PVT 세포를 극저온 상태로 보존 1주일 후에 해동시키고, 1 주일 동안 재배양하고, 2차 배양한 다음에 MHC-A,B,C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대해 유동 세포측정에 의해서 재분석하는 2차 프로토콜을 사용하였다.
결과는 도 17에 나타내었다. 신선한 세포 군집 내에서 MHC-/-의 빈도가 수회의 계대배양을 통해서 유지된다는 것을 인지할 것이다. 신선한 세포를 계대배양 후에 -150℃에서 1 주일 동안 동결시킨 다음에, 즉시 MHC 표현형에 대해 분석하는 경우에, 이 분석된 군집은 MHC-/- 표현형의 세포의 현저하게 향상된 빈도를 나타낸다. 따라서, MHC-/- 표현형의 세포는 동결에 의해 PVT 세포의 군집으로부터 유용하게 풍부해질 수 있다. 더 더욱 풍부하게 하는 것은 미리 동결시킨 세포의 배양물을 계대배양할 때 실현된다. 특히, 그리고 도 17에 나타낸 바와 같이, 극저온으로 보존된 세포의 일차 계대배양은 MHC -/- 세포의 상대적 군집을 50% 이상으로 증가시키며, 이들 세포의 후속 동결 및 계대배양은 80%, 85%, 90% 및 95% 이상의 MHC -/- 집단을 제공한다. 동결된 PVT 세포 자체는 이들의 비면역원성 성질을 고려하여 인간 치료에서 잠재적으로 매우 유용하다.
유착후 HUCPV 세포 분획의 수확
혈관주위 조직으로부터 회수된 전구세포의 수율은 다음의 방식으로 증진될 수 있다. HUCPVCs의 "유착후" (PA) 분획을 수확하기 위해서, 처음 접종된 HUCPV 수확물의 상등액을 새로운 T-75 플라스크 상에 재도말하고, 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 배양하였다. 그 후, 처음 접종된 HUCPV 플라스크에 신선한 SM을 공급하였다. 2일 후에, 이 상등액을 다시 새로운 T-75 플라스크에 옮기고, 부착된 세포에 신선한 SM을 공급하였다. 마지막으로, 세 번째 접종된 플라스크의 상등액을 흡인하고, 이 플라스크에 신선한 SM을 공급하였다. (따라서, 각각의 제대에 대해 3 개의 플라스크가 제공되었다: 즉 처음 접종된 플라스크, 일차 PA 분획 및 이차 PA 분획.) 이들 세포의 유사 내지 동일한 특징은 처음에 접종된 세포와 비교하여 나타나며, 이것은 더 높은 세포 수율은 이들 PA 분획을 단리시킴으로써 수득된다는 것을 뒷받침한다. 처음 접종된 HUCPVCs와 유사하게, 이들 PA 세포는 빠른 증식율을 가지고, 배양시에 자발적으로 골 결절을 발생시키며, 다른 3 가지 계통, 즉 연골, 지방 및 근육으로 분화하도록 유도될 수 있다.
전구세포를 포함하는 조직공학 조성물
본 실시예에서는, 세포를 골 공학 분야에서 통상적으로 사용되는 CAP/PLGA 형태의 담체와 조합시킨다. CAP/PLGA 스캐폴드를 접종하기 위해서, 이들은 5 ㎜×5 ㎜ 실린더로 절단하였다. 그 후, 2×105 HUCPVCs의 200 ㎕ 현탁액을 멸균 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브 내에 넣고, 스캐폴드를 현탁액 내에 넣었다. 변형된 피펫 팁 (tip) (5 ㎜의 흡인 직경을 가짐)을 사용하여, 세포의 현탁액을 흡인하고, 아래위로 피펫팅 (pipetting)함으로써 스캐폴드를 통해서 수회 세척하였다. 그 후, 스캐폴드를 이 현탁액 내에서 37℃ 및 5% CO2로 4 시간 동안 배양하여 세포가 스캐폴드에 부착하도록 하였다. 4 시간 후에, 스캐폴드를 현탁액으로부터 꺼내어 비-조직 배양물 처리된 24-웰 플레이트의 개개 웰에 배치하고, 1 ㎖의 SM을 공급하고, 37℃, 5% CO2에서 14일 동안 배양하였으며, 이때 SM은 매 2일마다 교체하였다. 그 후, 스캐폴드를 카르노브스키 고정제 내에서 고정시키고, SEM 분석 (상기 참조)을 준비하였다. 배양 14일 후에, HUCPVCs는 스캐폴드를 완전히 덮었다.
언급된 바와 같이, PVT 전구세포 군집은 또한, 이러한 분화에 적절한 조건 하에서 배양함으로써 골 이외의 중간엽 세포 및 조직을 발생시키기 위해서 활용될 수도 있다. 지방세포를 생성하기 위해, 예를 들어, 전구세포를 104 세포/㎠의 농도로 제조하고, 35 ㎜ 조직 배양 디쉬에 도말한다. 세포를 전지방세포 배지 (Preadipocyte Medium; PM) (DMEM/햄스 (Ham's) F-10 (1:1, vol/vol), 10％ 송아지 태아 혈청, 15 mM HEPES, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B) 내에서 3일 동안 유지시킨다. 3일 후에, PM을 제거하고, 세포에 지방생성 배지 (DMEM/ 햄스 F-10 영양육즙, 1:1, v/v; HEPES 완충액 (15 mM); 소 태아 혈청 (3％); 비오틴 (33 μM), 판토테네이트 (17 μM), 인간 인슐린 (100 nM), 덱사메타손 (0.5 μM), PPARγ 아고니스트 (1 μM) 및 항생물질)를 공급하고, 3일 동안 배양한다. 3일 유도 후에, 지방생성 배지를 제거하고 배양물은, 모든 배지가 제거되는 경우에는 지방세포가 떠오를 것이기 때문에 확실하게 배지의 절반만 제거하고, 동일 용적의 AM을 보충하면서 매 3일마다 규칙적으로 공급하는 지방세포 배지 (AM) (DMEM/햄스 F-10 (1:1, vol/vol), 3% 송아지 태아 혈청, 1 μM 덱사메타손, 100 nM 인간 인슐린, 33 μM D-비오틴, 17 μM Na-판토테네이트, 15 mM HEPES, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B) 내에서 유지시킨다. 4 회 공급 (12일) 후에, 세포는 지질 소적에 의해서 둥글게 보인다. 지방세포로의 분화된 중간엽 세포의 양성 확인은 오일 레드 O 및 나일 레드 (Nile Red)로 염색함으로써 확인할 수 있었다.
유사하게, 연골세포는 104 세포/㎠의 농도로 제조된 세포 현탁액을 사용하여 생성시키고, 35 ㎜ 조직 배양 디쉬에 도말할 수 있다. 연골발생을 촉진하기 위해서 상기 세포는 혈청 부재 하에 변형 성장인자-β3과 함께 배양한다. 세포 펠릿은 다층화된 매트릭스-풍부 형태학을 발생시키고, 배양 중에 조직학적으로 증가된 프로테오글리칸-풍부 세포외 매트릭스를 나타낸다.
근모세포를 생성시키기 위해서, 세포 현탁액은 104 세포/㎠의 농도로 제조하여 35 ㎜ 조직 배양 디쉬에 도말하였다. 세포를 15％ 소 태아 혈청 (FBS)을 보충한 MCDB 120 배지에서 1 주일 동안 유지시킨다 (근모세포 증식 배지, MPM). 1 주일째에, 기본 배지 (MPM) 내의 혈청 수준은 2％로 떨어지고 (근모세포 분화 배지, MDM), 배양을 7일 후에 종결하였다. 배양액에 1 주일에 3 회, 적절한 배양 배지를 재공급하였다.
따라서, 본 발명이 골을 포함한 다양한 결합조직의 생산에 유용한 특성을 갖는 생존가능한 인간 전구세포의 유용한 공급원일 수 있는 극저온으로 보존된 제대조직, 및 면역 부적격이고 골 질병 및 장애를 포함한 결합조직 상태를 치료하기 위해서 인간 환자에게 이식하는데 이상적인 전구세포를 제공하는 것을 알 수 있을 것이다. 인간 전구세포는 제대 혈관의 외벽으로부터 인접하게 연장되는, 혈관주위 구역이라 불리는 인간 제대 워튼 젤리의 특정 구역의 추출물로부터 생성된다. 이 구역으로부터 추출된 세포 군집은 빠른 증식, 모든 2차 배양된 플라스크에서 7일 이전에 나타나는 세포 콜로니의 형성 (대략 7-10 배가) 및 배양 배지에 대한 골원성 보충물의 첨가 없이 골 결절 형성의 출현에 의해 입증되는 바와 같은 세포 형태학의 변화뿐만 아니라 MHC 이중 음성 세포의 상대적으로 높은 빈도 (이 빈도는 동결되었던 세포의 배양시에 증가한다)를 비롯한 현저한 특성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "약"은 이 용어로 제한되는 값의 +/-10%인 값을 나타낸다. 따라서, "약 -70℃"는 63℃ 내지 77℃의 범위 내에 있는 온도를 나타낼 수 있다.
하기 참고문헌이 본 명세서에 참고로 포함된다:
<인용된 문헌>
Claims (1)
1) a) 인간으로부터 생존가능한 세포(viable cell)를 포함하는 제대조직을 수득하고,
b) 제대조직을 혈청-함유 세포배양 배지 및 한랭보존제를 포함하는 한랭보존용액과 조합하고,
c) 조합물을 한랭보존제가 조직에 침투하도록 허용하는 온도에서 일정 기간 동안 액체로서 냉동시키는 냉각과정에 적용하고,
d) 냉각된 조합물을 동결시켜 동결된 제대조직을 제공한 다음에, 임의로
e) 동결된 조직을 한랭조건 하에서 저장하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조된, 한랭 저장된 제대조직을 수득하고;
2) 동결된 제대조직을 해동시키고;
3) 해동된 제대조직을 처리하여 한랭보존제를 물로 치환시키고;
4) 이렇게 처리된 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 회수하는 단계를 포함하는,
제대조직으로부터 생존가능한 세포를 회수하는 방법.
b) 제대조직을 혈청-함유 세포배양 배지 및 한랭보존제를 포함하는 한랭보존용액과 조합하고,
c) 조합물을 한랭보존제가 조직에 침투하도록 허용하는 온도에서 일정 기간 동안 액체로서 냉동시키는 냉각과정에 적용하고,
d) 냉각된 조합물을 동결시켜 동결된 제대조직을 제공한 다음에, 임의로
e) 동결된 조직을 한랭조건 하에서 저장하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조된, 한랭 저장된 제대조직을 수득하고;
2) 동결된 제대조직을 해동시키고;
3) 해동된 제대조직을 처리하여 한랭보존제를 물로 치환시키고;
4) 이렇게 처리된 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 회수하는 단계를 포함하는,
제대조직으로부터 생존가능한 세포를 회수하는 방법.
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