CN101316602B - 羊膜制品和纯化的组合物及其使用方法 - Google Patents

羊膜制品和纯化的组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

已经发现含有特异性生物成分组合的组合物在哺乳动物细胞中具有许多有用的作用，包括调节哺乳动物细胞的TGF-β信号传导，细胞凋亡和增殖以及减轻小鼠炎症。这些成分可以商购获得，或可以由生物组织，诸如胎盘组织制备。本文所述的胎盘羊膜(AM)制品包括AM片，AM提取物，AM胶冻，AM基质，和这些组合物与另外成分的混合物。这些组合物可以用于治疗各种疾病，诸如伤口愈合，炎症和与血管发生-相关疾病。

Description

羊膜制品和纯化的组合物及其使用方法
交叉参考
本申请要求2005年9月27日提交的美国临时申请号60/720,760的利益，将该文献完整地引入本文作为参考。
有关联邦政府资助研究的声明
本发明得到了美国政府在National Institutes of Health颁发的资助金号RO1 EY06819下的支持。美国政府可以在本发明中拥有一定的权利。
发明领域
本发明一般涉及生物学和药学领域。更具体地说，本发明涉及使用可以在羊膜制品中存在的化合物的组合调节细胞生理和病理过程的组合物和方法。
发明背景
胎盘为妊娠过程中包裹胎儿的暂时器官。胎盘能够转运气体和营养物，并且还提供其它代谢和内分泌功能。胎盘由几种类型组织组成。脐带将胎盘与胎儿连接并且将氧输送给胎儿。脐带具有两条动脉和一条静脉。Wharton胶冻(jelly)，即专用凝胶状结缔组织材料包围脐带以防止其在胎儿活动和发育过程中受到损害。胎盘的外″壳″称作“绒毛膜”。胎盘的绝大部分由绒毛膜绒毛组成，它们为绒毛膜绒毛树的延伸。通过这些结构，发生胎儿营养交换。羊膜(AM)为充满羊水的无血管膜囊。该膜为包裹羊膜腔中的胎儿的最内层膜。这种组织由上皮层和其下相邻的无血管基质层组成。
发明概述
本说明书描述了纯化的组合物和羊膜制品(即由羊膜材料制备的组合物，该羊膜材料包括羊膜，羊膜基质和羊膜胶冻)。在某些实施方案中，纯化组合物中的至少一种成分获自羊膜制品。本文还描述了纯化的组合物，其中纯化组合物中的至少一种成分获自人胎盘和绒毛膜。本文还描述了制备上述纯化组合物和制品中的任一种的方法。本文还描述了储藏和保存上述纯化纯化组合物和制品中的任一种的方法。本文还描述了使用上述纯化组合物和制品中的任一种的方法，包括保存方法，细胞培养方法，组织培养方法，治疗方法，预防方法和美容方法。
在一个方面中为纯化的组合物，其包含：
●交联高分子量乙酰透明质酸(HA)；
●肿瘤坏死因子-刺激基因6(TSG-6)；
●五聚环蛋白(PTX-3)；和
●血小板反应蛋白(TSP-1)。
在另一个实施方案中，纯化组合物中的至少部分成分由选自人羊膜，人羊膜胶冻，人羊膜基质或其组合(combination)的人羊膜材料制备。在另一个实施方案中，该纯化的组合物还包含Smad7。在纯化的组合物的另一个或可选择的实施方案中，HA的交联包含与间-α-胰蛋白酶抑制剂的重链的共价键。在纯化的组合物的另一个或可选择的实施方案中，蛋白质与HA之比小于约100。
在纯化的组合物的另一个或可选择的实施方案中，纯化的组合物的制备方法包括：
●获得冷冻或预先冷冻的人胎盘；
●融化胎盘并且从融化的胎盘中分离人羊膜材料；和
●在合适的缓冲液中匀浆人羊膜材料。
在另一个或可选择的实施方案中，所述的制备方法还包括：
●冷冻人羊膜材料；和
●研磨冷冻的羊膜材料。
在另一个或可选择的实施方案中，所述的制备方法还包括：
●冻干匀浆物；或
●离心匀浆物并且从离心的匀浆物中分离上清液。
在另一个或可选择的实施方案中，所述的制备方法还包括：
●将上清液冻干成粉末。
在另一个或可选择的实施方案中，纯化的组合物还包含用于非固体剂型或延长释放的固体剂型的药学上可接受的载体。
本文所述的另一个方面为抑制受治疗者瘢痕形成的方法，包括对有抑制瘢痕形成需要的受治疗者提供有效量的抑制瘢痕形成组合物的步骤；其中该抑制瘢痕形成组合物包含由选自从羊膜提取的人羊膜，人羊膜胶冻，人羊膜基质或其组合的人羊膜材料制备的至少一种成分。
在这类方法的另一个或可选择的实施方案中，至少一种成分由人羊膜材料提取。在这类方法的另一个或可选择的实施方案中人羊膜材料为人羊膜基质。
在这类方法的另一个或可选择的实施方案中，提取方法包含：
●获得冷冻或预先冷冻的人胎盘；
●融化胎盘并且从融化的胎盘中分离人羊膜材料；
●在合适的缓冲液中匀浆人羊膜材料；
●任选将匀浆物冻干成粉末；和
●将匀浆物或粉末与用于非固体剂型或延长释放的固体剂型的药学上可接受的载体混合。
在另一个或可选择的实施方案中，制备方法中使用如下步骤取代了冻干匀浆物的步骤：
●离心匀浆物，从离心的匀浆物中分离上清液，并且任选将上清液冻干成粉末。
在另一个方面中为逆转受治疗者瘢痕形成的方法，包括对形成瘢痕的受治疗者提供有效量的逆转瘢痕组合物的步骤；其中该逆转瘢痕组合物包含由选自从羊膜提取的人羊膜，人羊膜胶冻，人羊膜基质或其组合的人羊膜材料制备的至少一种成分。在这些方法的另一个实施方案中，至少一种成分由人羊膜材料提取。在这些方法的另一个的实施方案中，人羊膜材料为人羊膜基质。
在这些方法的另一个的实施方案中，提取方法包括：
●获得冷冻或预先冷冻的人胎盘；
●融化胎盘并且从融化的胎盘中分离人羊膜材料；
●在合适的缓冲液中匀浆人羊膜材料；
●任选将匀浆物冻干成粉末；和
●将匀浆物或粉末与用于非固体剂型或延长释放的固体剂型的药学上可接受的载体混合。
在另一个的实施方案中，所述的制备方法使用如下步骤取代了冻干匀浆物的步骤：
●离心匀浆物，从离心的匀浆物中分离上清液，并且任选将上清液冻干成粉末。
在另一方面为抑制受治疗者血管发生的方法，包括对有抑制血管发生需要的受治疗者提供有效量的抑制血管发生组合物的步骤；其中该抑制血管发生组合物包含由选自从羊膜提取的人羊膜，人羊膜胶冻，人羊膜基质或其组合的人羊膜材料制备的至少一种成分。
在这些方法的另一个实施方案中，至少一种成分由人羊膜材料提取。在这些方法的另一个实施方案中，人羊膜材料为人羊膜基质。
在这些方法的另一个的实施方案中，所述的组合物包含：
●交联高分子量乙酰透明质酸(HA)；
●肿瘤坏死因子-刺激基因6(TSG-6)；
●五聚环蛋白(PTX-3)；和
●血小板反应蛋白(TSP-1).
在这些方法的另一个的实施方案中，提取方法包括：
●获得冷冻或预先冷冻的人胎盘；
●融化胎盘并且从融化的胎盘中分离人羊膜材料；
●在合适的缓冲液中匀浆人羊膜材料；
●任选将匀浆物冻干成粉末；和
●将匀浆物或粉末与用于非固体剂型或延长释放的固体剂型的药学上可接受的载体混合。
在这些方法的另一个的实施方案中，制备方法中使用如下步骤取代了冻干匀浆物的步骤：
●离心匀浆物，从离心的匀浆物中分离上清液，并且任选将上清液冻干成粉末。
在这些方法的另一个的实施方案中，需要的受治疗者为患有癌症的人。在这些方法的另一个的实施方案中，需要的受治疗者为患有与年龄相关的黄斑变性的人。
在这些方法的另一个的实施方案中，提供了非固体剂型或延长释放的固体剂型形式的抑制血管发生组合物。
在这些方法的另一个的实施方案中，该抑制血管发生组合物具有如下特性：
●诱导涉及血管形成的内皮细胞凋亡；
●防止涉及血管形成的内皮细胞迁移；和
●防止涉及血管形成的内皮细胞管形成。
减轻或预防受治疗者炎症的方法，包括对需要炎症抑制或预防的受治疗者提供有效量的炎症抑制组合物的步骤；其中该炎症抑制组合物包含由选自从羊膜提取的人羊膜，人羊膜胶冻，人羊膜基质或其组合的人羊膜材料制备的至少一种成分。
在这些方法的另一个的实施方案中，至少一种成分由人羊膜材料提取。在这些方法的另一个的实施方案中，人羊膜材料为人羊膜。
在这些方法的另一个的实施方案中，所述的组合物包含：
●交联高分子量乙酰透明质酸(HA)；
●肿瘤坏死因子-刺激基因6(TSG-6)；
●五聚环蛋白(PTX-3)；和
●血小板反应蛋白(TSP-1)。
在这些方法的另一个的实施方案中，提取方法包括：
●获得冷冻或预先冷冻的人胎盘；
●融化胎盘并且从融化的胎盘中分离人羊膜材料；
●在合适的缓冲液中匀浆人羊膜材料；
●任选将匀浆物冻干成粉末；和
●将匀浆物或粉末与用于非固体剂型或延长释放的固体剂型的药学上可接受的载体混合。
在这些方法的另一个的实施方案中，所述的制备方法中使用如下步骤取代了冻干匀浆物的步骤：
●离心匀浆物，从离心的匀浆物中分离上清液，并且如任选上清液冻干成粉末。
在这些方法的另一个的实施方案中，所述的人患有关节炎。在这些方法的另一个的实施方案中，所述的人在至少一只眼中患有炎症。在这些方法的另一个的实施方案中，将炎症抑制组合物以非固体剂型或延长释放的固体剂型提供。
在这些方法的另一个的实施方案中，该炎症抑制组合物具有如下特性中的至少两种：
●诱导炎症部位上巨噬细胞凋亡；
●增加炎症部位上前列腺素D2与前列腺素E1之比；
●抑制炎症部位上的TGF-β1活性；或
●抑制炎症部位上的干扰素-γ信号传导。
各种AM制品在哺乳动物细胞和完整哺乳动物组织中发挥大量生理学显著作用。这类作用包括抑制TGF-β信号传导，增加巨噬细胞凋亡，减少血管内皮细胞增殖，减少其细胞迁移并且增加其细胞凋亡，防止角膜和缘上皮细胞和角膜细胞因储藏或分散酶处理诱导的细胞凋亡和减轻组织中的炎症。除完整AM片外，本文所述的其它制品包括AM基质片，加工的(例如研磨或粉碎的)AM或AM基质和完整AM和AM基质的各种提取物。AM提取物可以为液体或冻干粉末形式。
所述组合物还包括可以通过混合AM提取物与增稠剂，诸如一种或多种另外的细胞基质成分(ECM)制备的AM提取物的增稠或凝胶形式。已知大量ECM成分，诸如胶原蛋白，透明质酸(HA)和血纤蛋白。
尽管与本文所述类似或等效的制品，材料和方法可以用于实施或测试本发明，但是本文描述了合适的制品，方法和材料。将本文提及的所有公开文献完整地引入作为参考。如果出现矛盾的情况，那么本说明书，包括定义可以限制。此外，如下讨论的具体实施方案仅为例证性的并不用来起限定作用。
某些定义
在本文所用的制剂，组合物或组分方面术语的“可接受的”意指不会对所治疗的受治疗者一般健康产生持久的有害作用。
“抗氧化剂”包括，例如丁羟甲苯(BHT)，抗坏血酸钠，抗坏血酸，偏亚硫酸氢钠和生育酚。在某些实施方案中，如果需要，抗氧化剂增强化学稳定性。
“粘合剂”具有(impart)粘性并且包括，例如藻酸及其盐；纤维素衍生物，诸如羧甲基纤维素，甲基纤维素(例如)，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素(例如)，乙基纤维素(例如)和微晶纤维素(例如)；微晶右旋糖；直链淀粉；硅酸镁铝；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；交聚维酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶，糊精，糖，诸如蔗糖(例如)，葡萄糖(glucose)，右旋糖(dextrose)，糖蜜，甘露醇，山梨醇，木糖醇(例如)和乳糖；天然或合成树胶，诸如阿拉伯树，黄蓍胶，印度胶，车前子壳黏液，聚乙烯吡咯烷酮(例如CL，CL，XL-10)，落叶松阿拉伯半乳聚糖，聚乙二醇，蜡，藻酸钠等。
本文所用的术语“载体”意指有利于将化合物掺入细胞或组织的相对无毒性的化学化合物或试剂。
“载体物质”包括药学中任何常用的赋形剂并且应基于与本文公开的化合物的相容性和所需剂型的释放分布特性进行选择。典型载体物质包括，例如粘合剂，助悬剂，崩解剂，填充剂，表面活性剂，增溶剂，稳定剂，润滑剂，湿润剂，稀释剂等。“药学上相容性载体物质”可以包括，但不限于阿拉伯胶，明胶，胶体二氧化硅，甘油磷酸钙，乳酸钙，麦芽糖糊精，甘油，硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，胆固醇，胆固醇酯类，酪蛋白酸钠，大豆卵磷脂，牛磺胆酸，磷脂酰胆碱，氯化钠，磷酸三钙，磷酸氢二钾，纤维素和纤维素轭合物，硬脂酰乳酸钠糖类(sugars sodium stearoyl lactylate)，角叉菜胶，单酸甘油酯，二酸甘油酯，预胶化淀粉等。例如，参见Remington：TheScience和Practice of Pharmacy，Nineteenth Ed(Easton，Pa.：Mack PublishingCompany，1995)；Hoover，John E.，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.，Eds.，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；和Pharmaceutical Dosage Forms和Drug Delivery Systems，SeventhEd-(Lippincott Williams&Wilkins 1999)。
本文所用的术语“共同给药”等意指包括对单一患者给予选择的各种药物治疗并且意指包括治疗方案，其中通过相同或不同给药途径或在相同或不同时间给予药物。
本文所用的术语“延长释放(delayed release)”意指递送药物，使得处于比那些如果没有延长释放所能达到的位置更远的一些可预测的位置上释放。
“分散剂”和/或“粘度调节剂”包括通过液体介质或制粒方法或掺合方法控制扩散和均匀性的物质。在某些实施方案中，这些试剂还有利于包衣或可蚀性基质的有效性。典型的扩散促进剂/分散剂包括，例如亲水性聚合物，电解质，60或80，PEG，聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商业上称作)和基于碳水化合物的分散剂，诸如，例如羟丙基纤维素(例如HPC，HPC-SL和HPC-L)，羟丙基甲基纤维素(例如HPMC K100，HPMC K4M，HPMC K15M和HPMC K100M)，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素，乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)，非晶纤维素，硅酸镁铝，三乙醇胺，聚乙烯醇(PVA)，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，4-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯酚与环氧乙烷和甲醛的聚合物(也称作泰洛沙泊)，泊洛沙姆(例如Pluronics和其为环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；和poloxamines(例如Tetronic也称作Poloxamine其为衍生自环氧丙烷和环氧乙烷依次加成到乙二胺上的四官能嵌段共聚物(BASF Corporation，Parsippany，N.J.))，聚乙烯吡咯烷酮K12，聚乙烯吡咯烷酮K17，聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)，聚乙二醇，例如聚乙二醇可以具有约300-约6000或约3350-约4000或约7000-约5400的分子量，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，聚山梨醇酯-80，藻酸钠，树胶，诸如，例如黄蓍树胶和阿拉伯树胶，瓜尔胶，黄原胶(xanthans)，包括黄原胶(xanthan gum)，糖类，纤维素，诸如，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，聚山梨醇酯-80，藻酸钠，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚维酮，卡波姆，聚乙烯醇(PVA)，藻酸盐，脱乙酰壳多糖及其组合。增塑剂，诸如纤维素或三乙基纤维素也可以用作分散剂。特别用于脂质体分散体和自乳化分散体的分散剂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，来自蛋类的天然磷酯酰胆碱，来自蛋类的天然磷脂酰甘油，胆固醇和肉豆蔻酸异丙酯。
本文所用的术语“稀释剂”意指在递送前用于稀释所关注的化合物的化学化合物。稀释剂还可以用于稳定化合物，因为它们可以提供更稳定的环境。溶于缓冲溶液的盐(也可以提供pH控制或维持)用作本领域中的稀释剂，包括，但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些实施方案中，稀释剂增加组合物的体积以便有利于压制或生成用于胶囊填充的均匀性掺合物的足够体积。这类化合物包括，例如乳糖，淀粉，甘露糖醇，山梨醇，葡萄糖，微晶纤维素，诸如磷酸氢钙，磷酸二钙二水合物；磷酸三钙，磷酸钙；无水乳糖，喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉，可压缩糖，诸如(Amstar)；甘露糖醇，羟丙基甲基纤维素，乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素，基于蔗糖的稀释剂，特细精糖粉；硫酸氢钙一水合物，硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物；葡聚糖结合剂；水解谷类固体，直链淀粉；粉状纤维素，碳酸钙；甘氨酸，高岭土；甘露糖醇，氯化钠；肌醇，膨润土等。
“肠溶衣”为在胃中基本上保持完整，但在小肠或结肠中溶出和释放药物的物质。一般而言，肠溶衣包含在胃的低pH环境下防止释放，而在较高pH，一般在pH 6-7下离子化且由此在小肠或结肠中充分溶出以便在其中释放活性剂的聚合物材料。
“填充剂”包括化合物，诸如乳糖，碳酸钙，磷酸钙，磷酸氢钙，硫酸钙，微晶纤维素，纤维素粉，葡萄糖，葡聚糖结合剂，葡聚糖，淀粉，预胶化淀粉，蔗糖，木糖醇，拉克替醇，甘露糖醇，山梨醇，氯化钠，聚乙二醇等。
本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”意指将所治疗的疾病或疾患的一种或多种症状缓解至一定程度而给予的药物或化合物的足够量。结果可以为疾病体征，症状或或原因的减轻和/或缓解或生物系统的任何其它所需改变。例如，治疗应用的“有效量”为在无过度不良副作用的情况下在临床上对疾病症状显著减轻而所需的包括如本文公开的化合物的组合物用量。可以使用技术，诸如剂量按比例上升研究测定在任何个体情况中合适的“有效量”。本文所用的术语“治疗有效量”包括，例如预防有效量。本文披露的化合物的“有效量”为在无过度不良副作用的情况下有效实现所需药理学作用或治疗改善的用量。应理解“有效量”或“治疗有效量”可以因受治疗者与受治疗者的不同，组合物代谢的变化，受治疗者年龄，体重，一般健康状况，所治疗的疾患，所治疗的疾患的严重性和开据处方的临床医师的判断的不同而改变。
本文所用的术语“增强”或“强化”意指增加或延长所需作用的功效或时间。因此，就强化治疗剂的作用而言，本文所用的术语“强化”意指在功效或时间上增加或延长其它治疗剂对系统的作用的能力。本文所用的“强化有效量”意指促进另一种治疗剂在所需系统中的作用的用量。
本文所用的术语“试剂盒”和“制品”作为同义词使用。
本文所用的术语“调节”意指直接或间接与靶标相互作用，以改变靶标的活性，包括仅作为实例的促进靶标的活性，抑制靶标的活性，限制靶标的活性或延长靶标的活性。
本文所用的术语“调节剂”意指改变分子活性的化合物。例如调节剂可以导致分子某些活性的大小比在没有该调节剂存在下的活性大小增加或下降。在某些实施方案中，调节剂为降低分子的一种或多种活性大小的抑制剂。在某些实施方案中，抑制剂完全阻止分子的一种或多种活性。在某些实施方案中，调节剂为增加分子的至少一种活性大小的活化剂。在某些实施方案中，调节剂的存在产生在没有该调节剂存在下不会产生的活性。
本文所用的术语“非水溶性稀释剂”表示一般用于药物制剂中的化合物，诸如磷酸钙，硫酸钙，淀粉，改性淀粉和微晶纤维素和微纤维素(microcellulose)(例如具有约0.45g/cm3的密度，例如Avicel的粉状纤维素)和滑石粉。
本文中对于诸如载体或稀释剂，使用的“药学上可接受的”意指不会消除化合物的生物活性或特性并且为相对无毒性的材料，即该材料可以对个体给予，但不会产生不需要的生物作用或以有害方式与它所包含在其中的组合物中的任何成分相互作用。
本文所用的术语“药物组合”意指由混合或组合一种以上活性组分得到的产品并且包括活性组分的固定和不固定组合。本文所用的术语“固定组合”意指将活性组分，例如本文所述的AM制品和纯化的组合物和活性助剂以单一实体或剂量的形式同时给予患者。本文所用的术语“不固定的组合”意指将活性组分，例如本文所述的AM制品和纯化的组合物和联用药物(co-agent)以单独的实体同时，共同或依次，但没有具体介入时间限制的情况下给予患者，其中这类给药在患者体内提供了两种化合物的有效水平。后者还应用于鸡尾酒疗法，例如给予三种或三种以上活性组分。
“增塑剂”为用于软化微囊材料或薄膜包衣以使它们减少脆化的化合物。合适的增塑剂包括，例如聚乙二醇类，诸如PEG 300，PEG 400，PEG 600，PEG 1450，PEG 3350和PEG 800，硬脂酸，丙二醇，油酸，三乙基纤维素和三醋精。在某些实施方案中，增塑剂还可以起分散剂或湿润剂的作用。
本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”可以为全长多肽或多肽片段或区段，并且可以包括全长多肽中至少约8个氨基酸，一般为至少10个氨基酸，更一般为至少20个氨基酸，通常为至少30个氨基酸，更通常为至少50个氨基酸或50个氨基酸以上的氨基酸残基的一段序列。
“增溶剂”包括化合物，诸如三醋精，柠檬酸三乙酯，油酸乙酯，辛酸乙酯，十二烷基硫酸钠，多库酯钠(sodium doccusate)，维生素E TPGS，二甲基乙酰胺，N-甲基吡咯烷酮，N-羟乙基吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素，羟丙基环糊精，乙醇，正-丁醇，异丙醇，胆固醇，胆汁酸盐，聚乙二醇200-600，糖原质(glycofurol)，二乙二醇单乙醚(transcutol)，丙二醇和二甲基异山梨醇等。
“稳定剂”包括化合物，诸如任何抗氧化剂，缓冲剂，酸，防腐剂等。
“基本上纯”或“纯化的”在用于上下文中的生物材料，羊膜材料和/或蛋白质时一般意指分离自其它污染蛋白质，核酸和其它来源于原始来源生物体的生物制品的材料。可以通过标准方法测定纯度或“分离度”，并且一般至少约10％纯度，更一般地至少约20％纯度，一般至少约30％纯度且更一般至少约40％纯度；在其它实施方案中，至少约50％纯或更通常至少约60％纯度；在其它实施方案中，至少约95％纯度。
“悬浮剂”包括化合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮K12，聚乙烯吡咯烷酮K17，聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，聚乙二醇，例如聚乙二醇可以具有约300-约6000或约3350-约4000或约7000-约5400的分子量，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，乙酸硬脂酸羟甲基纤维素，聚山梨醇酯-80，羟乙基纤维素，藻酸钠，树胶，诸如，例如黄蓍树胶和阿拉伯树胶，瓜尔胶，黄原胶(xanthans)，包括黄原胶(xanthan gum)，糖类，纤维素，诸如，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素，聚山梨醇酯-80，藻酸钠，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚维酮等。
“表面活性剂”包括化合物，诸如十二烷基硫酸钠，多库酯钠，Tween 60或80，三醋精，维生素E TPGS，脱水山梨糖醇单油酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯，聚山梨醇酯类，伯洛沙姆类，胆汁酸盐，单硬脂酸甘油酯，环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，例如(BASF)等。某些其它表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯类和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚类和烷基苯基醚类，例如辛苯聚醇10，辛苯聚醇40。在某些实施方案中，可以包括表面活性剂以便增强物理稳定性或其它目的。
本文所用的术语“受治疗者”用于指动物，优选哺乳动物，包括人或非-人。术语患者和受治疗者可以互换使用。
本文所用的术语“治疗(treat)”，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括缓解，消除或改善疾病或疾患症状，预防另外的症状，改善或预防症状的潜在代谢原因，抑制疾病或疾患，例如阻止疾病或疾患发展，缓解疾病或疾患，导致疾病或疾患退化，缓解因疾病或疾患导致的情况或预防性和/或治疗性地终止疾病或疾患症状。
“湿润剂”包括化合物，诸如油酸，单硬脂酸甘油酯，脱水山梨糖醇单油酸酯，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯，多库酯钠，油酸钠，十二烷基硫酸钠，多库酯钠(sodium doccusate)，三醋精，Tween 80，维生素E TPGS，铵盐等。
将本说明书中提及的所有公开文献和专利申请引入本文作为参考，其引用程度与如同将每篇公开文献或专利申请各自特别和分别引入作为参考相同。
附图简述
本发明的新特征具体列在待批权利要求中。通过参照如下列出例证性实施方案的详细描述会更好地理解本发明的特征和优点，其中使用了本发明的原理，并且在附图中：
图1A为表示各种AM提取物抑制TGF-β1启动子活性的柱形图的非限制性实例。PL：塑料对照。FRO/P：冷冻羊膜，胎盘部分。FRO/F：冷冻羊膜，胎部分。FRE/P：新鲜羊膜，胎盘部分。FRE/F：新鲜羊膜，胎部分。图1B为比较各种胎盘制品P值的表。
图2为表示TGF-β1启动子活性抑制的剂量响应曲线的柱形图的非限制性实例。RLU：相对荧光素酶单位。
图3为表示各种AM提取物制品对TGF-β1启动子活性抑制的作用的柱形图的非限制性实例。
图4为表示各种AM提取物制品对TGF-βRII启动子活性抑制的作用的柱形图的非限制性实例。
图5为表示离心后衍生的可溶性AME和胶冻提取物不改变对TGF-β启动子活性的抑制作用的柱形图的非限制性实例。HA，AM(总(T)，低速(LS)，高速(HS))和胶冻(总(T)，低速(LS)，高速(HS))在使用β-半乳糖苷酶(galatosidase)活性标准化时与PBS对照物相比显示出对TGF-β1启动子活化的抑制。
图6为表示使用各种化合物处理后18或48小时细胞形态改变的人角膜成纤维细胞的一组显微镜影像的非限制性实例。PBS：PBS对照物；HA：透明质酸；AME：羊膜提取物；L/AME：冻干的羊膜提取物；AMJ：羊膜胶冻；L/AMJ：冻干的羊膜胶冻。
图7为表示使用或不使用冻干的(L)AME(在25或125μg/ml下)对抑制TGFβ1活性的作用的柱形图的非限制性实例。以相对荧光素酶单位(RLU)测定活性。
图8为表示添加胶原蛋白凝胶(Col)，AM提取物AME或混合了AM提取物的胶原蛋白凝胶(Col+AME)对抑制TGF-β启动子活性的作用的柱形图的非限制性实例。将BSA用作对照物。
图9为与单独使用BSA的对照组测定相比，使用AME，HA或HA+AME处理对抑制TGFβ1活性的作用比较的柱形图的非限制性实例。将启动子活性表示为相对荧光素酶单位(RLU)。
图10为通过琼脂糖凝胶电泳分离的各种AM提取物中的AM提取物中的乙酰透明质酸MW范围分析的非限制性实例。使用或不使用透明质酸酶处理用缓冲液A，B，C提取的羊膜提取物并且通过电泳方式用0.5％琼脂糖凝胶分离。
图11为通过琼脂糖凝胶电泳分离的各种AM提取物中的AM提取物中的乙酰透明质酸MW范围分析的非限制性实例。使用或不使用透明质酸酶(在Tris-HCl中10个单位/ml，pH 7.5，150mM NaCl)将用缓冲液PBS提取的羊膜在37℃下处理2小时并且通过0.5％琼脂糖凝胶。HA：透明质酸阳性对照；L：低速离心后的AM提取物；H：高速离心后的AM提取物。
图12为表示间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)存在于AM提取物中的蛋白质印迹照片的非限制性实例。IαI存在于AM提取物A和C中，不过，bikunin的信号极弱(～39kDa)。在转至蛋白质印迹前，用4-15％变性丙烯酰胺凝胶分离提取物。
图13为表示即使在低速(LS)或高速(HS)离心后间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)也存在于AM提取物中的免疫印迹的非限制性实例。
图14为使用(+)或不使用(-)透明质酸酶处理的TSG-6(肿瘤坏死因子-刺激基因6)的免疫印迹的非限制性实例。样品包括不进行离心的总AM提取物(T)，在等渗的低盐缓冲液(缓冲液A)提取后的AM提取物；高盐缓冲液(B)提取后的AM提取物；或4M胍HCl(C)中提取后的AM提取物，如实施例2中详述。TSG-6存在于总提取物，缓冲液A提取物和缓冲液C提取物中。添加透明质酸酶不会改变提取物中的TSG-6水平。
图15为TSG-6在AM中去糖基化的免疫印迹分析的非限制性实例。在37℃下使用(+)或不使用(-)20个单位/ml的PNGase F将AM提取物A，B和C处理3小时。然后通过蛋白质印迹分析TSG-6在AM中的糖基化。将人角膜成纤维细胞(HCF)的细胞裂解物用作阳性对照。
图16为通过用硫酸软骨素ABC裂解酶消化对可能的TSG-6复合物在AM中的免疫印迹分析的非限制性实例。在37℃下使用(+)或不使用(-)1个单位/ml的ABC裂解酶将AM提取物A，B和C处理2小时。然后通过蛋白质印迹，使用抗-TSG-6抗体RAH-1∶1∶1000分析TSG-6复合物的可能破坏。
图17为通过用硫酸软骨素ABC裂解酶消化对可能的TSG-6复合物在AM中的免疫印迹分析的非限制性实例。它与如图16中所示的实验相同，但使用不同的TSG-6抗体。此处，抗-TSG-6抗体获自R&D Systems(cat#MAB2104)。
图18为表示使用获自Alexis Biochemicals的大鼠单克隆抗-PTX3抗体在AM中存在五聚环蛋白(PTX3)的免疫印迹的非限制性实例。HCF：人角膜成纤维细胞，T，A，B，C：分别为总，A，B，C的AM提取物；HAse，透明质酸酶。
图19为表示AM中存在TSP-1的免疫印迹的非限制性实例。表明单体TSP-1(180kDa)和推定的三聚体TSP-1(540kDa)。阳性对照TSP-1自人血小板纯化(Calbiochem，Cat#605225)和并且加载至100ng/泳道。
图20为表示AM中存在Smad 7的免疫印迹的非限制性实例。使用PBS或尿素(2M尿素在50mM Tris-HCl中，pH 7.5)提取AM。对每种提取物而言使20μg总蛋白质上样。使用山羊抗-人Smad 7(AF2029，1∶1000，R&DSystems)检测Smad 7。Smad 7以～51kDa带迁移。
图21为羊膜基质细胞(AMSC)在AM中的显微镜影像的非限制性实例。A：AMSCs显示树突形态并且在原位维持胞间接触。B：使用活与死测定法为测定细胞存活(viability)进行染色。通过该方法显示树突形态和胞间接触更好。C：AMSCs不表达α-SMA。D：AMSCs不表达结蛋白。相反，作为阳性对照，脐带间充质细胞显示出对α-SMA和结蛋白的强染色(分别为C和D的插入片段(insert))。E：所有AMSCs均表达波形蛋白。虚线表示AM上皮与AM基质层之间分离。分别用DAPI(C，D)和PI(E)进行核对比染色。条代表50μm。
图22为体外AMSCs成肌纤维细胞快速分化的非限制性实例。P0＝初级AMSC细胞。P1＝第1代；P2＝第2代。P0，P1，P2分别指第0，1和2代。A和E：P0(4天)；B和F：P0(7天)；C和G：P1；D和H：P2。用小鼠抗-αSMA单克隆抗体对E，F，G，H中的细胞进行免疫染色；A：在含有10％FBS的DMEM中的塑料上培养的AMSCs显示出典型成纤维细胞形状。条代表100μm。
图22I为线性图的非限制性实例，该线形图表示α-SMA-阳性成肌纤维细胞显著地从1周初级培养物的71.9±3.7％增加至第1代的93.9±4.1％和第2代的98.5±1.7％。
图22J为显示α-SMA和ED-A纤连蛋白(Fn)的蛋白质表达增加的免疫印迹分析的非限制性实例。P0和P2分别指的是第0代和第2代。将β-肌动蛋白用作对照物。
图23A-23H为表示在AM基质上反向培养时分化的成肌纤维细胞从AMSCs逆转至成纤维细胞的显微镜影像的非限制性实例。在含有10％FBS的DMEM中的I型胶原蛋白(A，C，E，G)或AM基质(B，D，F，H)上将来源于P2的AMSCs的成肌纤维细胞传代培养7天。条代表100μm。活与死测定显示在胶原蛋白(C)和AM基质(D)上的细胞保持100％的存活率，并且显示不同的细胞形状。鬼笔环肽和α-SMA双染色在胶原蛋白培养物上的成肌纤维细胞中显示鲜明的应力纤维(E)和强α-SMA表达(G)。相反，鬼笔环肽染色变得较弱和有斑点(F)且α-SMA在AM基质(H)上传代培养的细胞中变得模糊。I：免疫印迹分析显示ED-A纤连蛋白(Fn)表达减少，并且与接种在I型胶原蛋白上的那些相比在AM基质上接种的AMSCs的α-SMA的表达不能检测到。
图24A-24H为表示AM基质提取物(ASE)预防的AMSCs的成肌纤维细胞分化的显微镜影像的非限制性实例。进行鬼笔环肽染色(上组)和α-SMA染色(下组)。A和E：不使用ASE培养4天的细胞；B和F：使用ASE培养4天的细胞；C和G：不使用ASE培养10天的细胞；D和H：使用ASE培养10天的细胞。用FITC缀合的鬼笔环肽染色A，B，C和D中的细胞，而用小鼠抗-α-SMA单克隆抗体染色E，F，G和H中的细胞。在不使用(A)或使用(B)ASE的DMEM/10％FBS中的塑料上培养4天后，AMSCs维持了纺锤状的成纤维细胞形状。然而，此时，不使用ASE(E)的细胞已经开始表达α-SMA，而在添加ASE时(F)不表达α-SMA。当培养延长10天时，细胞变扩展并且在不使用ASE下显示出突出的应力纤维(C)和强α-SMA表达(G)。相反，在添加ASE时AMSCs聚集成不同大小的球体。这些球体不表示应力纤维(D)，而表示弱的α-SMA染色(H)。条代表100μm。
图25A和25B为表示羊膜基质提取物(ASE)反向分化的成肌纤维细胞的显微镜影像的非限制性实例。通过添加ASE将在DMEM/10％FBS中的塑料上从第2代AMSCs分化的成肌纤维细胞培养1周。A：从扁平形状恢复至长或纺锤形状的细胞。B：α-SMA染色显著减少。C：显示ED-A纤连蛋白和α-SMA水平比不使用ASE的对照组下降的免疫印迹分析。条表示100μm。
图26A-26L为表示ASE逆转成肌纤维细胞与细胞增殖无关的显微镜影像的非限制性实例。如所示的不使用(A，B，C，D)或使用ASE(E，F，G，H)在DMEM/ITS中将AMSCs(第2代)培养0，2，4或6天。在添加ASE(I，J，K，L)后第0天到第6天表达α-SMA的应力纤维逐步下降并且与形态改变相关(E-H)。
图27A-27D为显微镜影像的非限制性实例，该影像表示AM提取物抑制成纤维细胞从人缘外植块(explant)迁移并且导致向外生长的成纤维细胞较少。A，B：从在SHEM(Ctrl)和SHEM/AME(AME)中培养的人缘外植块中向外生长。C，D：在培养物中14天后，从培养孔中取出人缘外植块，包埋，切片并且用苏木精和伊红染色。
图28A为表示AME抑制成纤维细胞向外生长的48孔测定平板的照片的非限制性实例。A.分别收集在SHEM(Ctrl(对照))和含有25μg/mlAME(AME)的SHEM中生长14天后从人缘外植块向外生长物并且以2000个细胞/孔接种在96孔中。将来自Ctrl的细胞接种在第1-3列(1：Ctrl；2：PBS；3：AME；并且将来自AME的那些接种在第4-6列(1：Ctrl；2：PBS；3：AME。在10天培养后进行MTT测定。
图28B为表示AME对成纤维细胞向外生长的相对抑制的测定和统计学分析的柱形图的非限制性实例。
图29A和29B为从在SHEM对照组(图29A)和含有AME的SHEM(图29B)中培养14天的人缘外植块向外生长的显微镜影像的非限制性实例。
图30为在使用或不使用IFN-γ刺激的塑料或完整羊膜上培养的细胞中相对NO产生的柱形图的非限制性实例。将Raw264.7细胞以2.5×105接种在DMEM/ITS中的24孔中的每一个中(每组n＝3)。使用或不使用200μ/mlIFN-γ刺激细胞并且收集培养基用于NO测定。P1：塑料。iAM：完整羊膜。
图31为对在使用或不使用IFN-γ刺激的塑料或iAM上培养的raw264.7细胞中测定前列腺素D2(PGD2)和前列腺素E2(PGE2)水平的一组柱形图的非限制性实例。A：PGD2合成。B：PGE2合成。C：在塑料和iAM上培养的Raw264.6中的PGD2/PGE2之比。
图32为表示在使用或不使用IFN-γ刺激的塑料或iAM上培养的Raw264.7细胞中TGF-β1启动子活性的柱形图的非限制性实例。
图33为表示AME诱导的巨噬细胞死亡的显微镜影像的非限制性实例。将Raw264.7细胞以2×105接种在24孔中每个孔的DMEM/10％胎牛血清中。1小时后，向培养基中加入125μg/ml PBS(对照组-图33A)或在PBS中的125μg/ml AME(AME-图33B)。
图34A-34C为表示ASE优选抑制HUVEC细胞的柱形图的非限制性实例。A：存活HUVEC细胞的测定。B：存活HCF细胞的测定。C：存活RCE细胞的测定。
图35为HUVEC细胞的显微镜影像的非限制性实例。结果证实HUVEC细胞在不添加ASE的对照组中存活(图35Aa)，而在ASE处理后显示明显的细胞死亡(图35Ad)。相反，HCF和RCE细胞在不使用(分别为图35Ab和35Ac)或使用(分别为35Ae和35Af)ASE处理的培养物中未显示出任何明显的细胞死亡。Hoechst-33342染色显示ASE-处理的HUVECs具有61.6±7.7％凝集和碎片化的核(图35Bd)，这一结果明显高于不使用ASE处理的对照组的3.1±1.8％(图35Ba，另外参见2C，p＜0.001)。相反，在不使用(分别为图35Ab和35Ac)或使用(分别为35Ae和35Af)ASE处理的HCFs或RCEs中未见明显的细胞凋亡。
图36为添加ASE增加HUVEC细胞凋亡数量的柱形图的非限制性实例。
图37为表示ASE对VEGF刺激的抑制HUVEC迁移的作用的非限制性实例。A：对照组(无VEGF或ASE)。B：添加VEGF增加细胞迁移。C：添加VEGF和200μg/ml ASE。添加ASE阻滞VEGF-诱导的迁移。图37D为对在图37A，37B和37C中出现的测定细胞迁移的柱形图。
图38为显示添加ASE抑制管形成的一组显微镜影像(A-C)和柱形图(D)的非限制性实例。为了进行体外管形成测定，将HUVEC细胞接种在基质胶上。A：在对照组培养物中形成管类物质。B：将100μg/mLASE添加到培养物中抑制管形成。C：将200μg/mL ASE添加到培养物中抑制管形成。D：测定来自A，β和C的每个视野中形成的管数量的柱形图。
发明详述
组合物
本文描述了在哺乳动物细胞和完整哺乳动物组织中具有许多生理学显著作用的纯化的组合物。该纯化的组合物包含至少4种成分：
交联高分子量乙酰透明质酸(hyaluronan，HA)；
肿瘤坏死因子-刺激基因6(TSG-6)；
五聚环蛋白(PTX-3)；和
血小板反应蛋白(TSP-1)。
具有这4种成分的纯化的组合物至还可以包括另外的成分，包括Smad7。
本文所述的纯化的组合物中的任何或所有成分均可以由人羊膜材料制备，所述人羊膜材料包括人羊膜胶冻制品和提取物(如本文所述)，人羊膜制品和提取物(如本文所述)和人羊膜基质制品和提取物(如本文所述)。
这4种成分(含有或不含有Smad7)可以共同抑制TGF-β启动子活性；增加巨噬细胞的凋亡；减少增殖；减少迁移和增加人血管内皮细胞的凋亡；降低人成纤维细胞活力；减轻炎症；和防止接触储藏和损伤的上皮细胞的凋亡。
透明质酸(HA)为在滑膜关节液，眼玻璃体液，软骨，血管，胞外基质，皮肤和脐带中存在的天然糖。HA的交联可以通过共价键与另一种分子，诸如蛋白质结合。例如，HA可以与间-α-胰蛋白酶抑制剂的重链共价结合。本文所述的AM制品和纯化的组合物中蛋白质与HA之比可以小于约200∶1，小于约100∶1，小于约50∶1或小于约10∶1。
TSG-6为在胞外基质重塑，细胞增殖和白细胞迁移中起作用的乙酰透明质酸结合蛋白。TSG-6可以与丝氨酸蛋白酶抑制剂间-α-抑制形成复合物。PTX-3(五聚坏蛋白)为具有五聚盘形结构并且存在于血浆中的Ca2+依赖性配体结合蛋白。TSP-1(血小板反应蛋白I)为具有有效的抗生成血管和其它生物活性的同三聚糖蛋白。TSP-1由各种细胞类型分泌入胞外基质。
这些成分可以获自任何合适的来源。例如，这些成分中的至少一种可以获自人组织，诸如羊膜，羊膜胶冻，羊膜基质或其组合。这些成分中的至少一种可以获自商业来源。这些成分中的至少一种可以分离自转基因生物体。蛋白质序列可以与人蛋白质序列具有至少90％，93％，95％，97％，99％或99.5％的相似性。这些成分可以纯化，基本上纯化，部分纯化，或还可以存在于粗提取物中。还可以由哺乳动物羊膜组织制备这些成分，因为这4种成分种的每一种均存在于羊膜组织中。
在其它方面中，蛋白质Smad7也存在于组合物中。Smad7可以获自任何合适的来源，诸如获自羊膜，获自商业来源，分离自转基因生物体。Smad7蛋白质可以纯化，基本上纯化，部分纯化，或可以存在于粗提取物中。
来源于胎盘材料的AM制品
在某些方面中，成分HA，TSG-6，PTX-3，TSP-1，任选的Smad7中的至少一种可以获自羊膜制品。可选择地，可以制备包含HA，TSG-6，PTX-3，TSP-1和任选的Smad7的粗羊膜制品。制备各种AM制品的典型方法如本文所述。
可以获得人胎盘材料，例如来自诸如Bio-Tissue，Inc.(Miami，FL)和Baptist Hospital(Miami，FL)(得到IRB批准)的这类来源。一般以新鲜或冷冻状态获得该组织。可以洗涤该组织以便除去过量的储藏缓冲液，血液或污染物。例如，可以使用简单的离心步骤或通过其它方式除去过量的液体。例如，可以使用液氮或其它冷却方式冷冻组织，以便有利于随后的匀浆。AM组织来源可以为人。然而，可以使用AM组织的其它来源，诸如牛或猪AM组织。
AM可以用于制备组合物。AM制品可以包括纯化自或提取自完整AM，AM基质，HA，AM胶冻和间-α胰蛋白酶抑制剂(HA-ITI))的成分或部分。如果需要，可以在加工过程中的任何时间从制品中分离AM制品的某些成分。例如，可以从制品中分离富集了特异性蛋白质或AM蛋白质的提取物。在匀浆组织后，可以分离出较大颗粒或可以使它们保留在制品中。如果需要，可以干燥制品。典型制备方法如实施例1中所述。
所述的成分还可以自AM胶冻获得。AM胶冻可以自新鲜AM组织获得或可以在冷冻加工之前或之后获得。可以冷冻AM胶冻并且可以在如本文所述对AM制品处理后冷冻磨碎。可以离心胶冻并且还可以冻干。
在另外的实施方案中，制备基本上由基质层制备的组合物。为了制备该组合物，从新鲜，冷冻，融化或其他处理的AM膜的层中分离基质层。例如，可以通过酶法，机械方法或通过其它方法取出基质。基质层材料可以为新鲜的或冷冻的。可以在如本文所述对AM制品处理后磨碎或冷冻磨碎基质材料。如果需要，可以离心基质材料并且还可以冷冻。
在研磨过程前冷冻组织。可以通过任何合适的冷却方法进行冷冻步骤。例如，使用液氮速冻组织。可选择地，将该材料置于异丙醇/干冰浴中或可以在其它冷却剂中速冻。可以使用工业上通用的速冻法。另外，可以将材料置于冷藏箱中并且使其更缓慢地平衡至储藏温度，而不是速冻。将组织储存在任何所需温度下。例如，可以将-20℃或-80℃或其它温度用于储存。
在冷冻的同时磨碎组织，而不是在冷冻前研磨组织是制备组织的一种可选择方法。另一方面，可以在研磨步骤中使用新鲜，部分融化或融化的组织。然后可以使用合适的装置，诸如解剖刀将组织(新鲜，冷冻或融化的)切成所需大小的片，随后使用BioPulverizer(Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK)或其它合适的装置研磨成细颗粒，并且使用匀浆装置，诸如TissueTearor(Biospec Products，Inc.，Dremel，WI)在合适的溶液中匀浆。典型溶液包括，但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)，DMEM，NaCl溶液和水。可以根据需要调整溶液的pH。在某些实施方案中，pH范围在约5.5或6.0-约8.5。在某些实施方案中，在具有约6.3，约6.6或约7.0-约7.4，约7.6或约7.8pH的溶液中研磨冷冻组织。
任何合适的缓冲液或液体均可以用于制备制剂。实施例2检验了各种提取缓冲液(高盐，低盐，PBS等)对在制品中总蛋白质含量和HA的用途(表X)。实施例2还使用几种提取法检验了特异性蛋白质TSG-6(图14)，PTX-3(图18)，TSP-1(图19)和Smad7(图20)的水平。
然后以任何合适的速度，温度或其它参数混合匀浆物。混合可以在例如约1℃，或3℃，至约6℃，10℃，15℃，或20℃的温度下进行。在某些实施方案中，混合在约4℃下进行。例如，可以将匀浆物混合少于约1分钟，10分钟，或20分钟-约1，2，3小时或3小时以上。
如果需要，然后可以离心匀浆物以便除去任何遗留的大颗粒。可以根据需要使用任何合适范围的时间，温度，蛋白质浓度，缓冲液和速度进行离心。例如，离心可以以约1,000，5,000或10,000xg-约20,000xg进行。在某些实施方案中，离心以约15,000xg进行。离心可以进行少于1分钟，5分钟，10分钟，20分钟，至约40分钟，60分钟，1.5小时或1.5小时以上。然后可以收集上清液并且将以等分部分储存在-80℃下。如果需要，可以使用合适的工业蛋白质分析试剂盒，诸如BCA测定法(Pierce，Rockford，IL)对总蛋白质进行测定。实施例2，表X和图13描述了低速或高速离心后AM制品的分析。
为了生化表征和纯化，可以使用蛋白酶抑制剂补充上述溶液。蛋白酶抑制剂的典型混合物如下：1μg/ml抑肽酶，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胃酶抑素A和1mM PMSF。然而，一般而言，如果将制剂加入到活细胞或组织中，则不向制品中添加蛋白酶抑制剂。
可以测试制剂以便证实存在特异性成分或蛋白质。例如，可以测试制剂中存在的分子，包括，但不限于HA，TSG-6，PTX-3，TSP-1，Smad7等。还可以测试制剂以便证实在制备过程中的任何点上均不存在病原体。
AM制品可以为液体，混悬液或冻干粉(例如研磨或磨碎的)或其它形式。可以加入抗微生物剂，诸如抗生素或抗-真菌药。可以将其它物质加入到组合物中以便稳定和/或保护组合物。可以在使用前将材料包装和储存，例如，在室温或例如在-20℃或-80℃下储存。
在某些实施方案中，将制品以干粉制剂存在。可以将干粉制剂以小体积储存，并且可能无需相同的低温储存要求就可防止制剂随时间降解。可以储存干粉制剂并且在使用前再溶解(reconstitute)。例如，可以通过如本文所述制备冷冻研磨的AM组织，然后除去组合物中的至少部分水制备干粉制剂。可以通过任何合适的方式从制品中除去过量的水。除去水的典型方法通过使用商购冻干器或冻干机冻干来进行。可以找到合适的设备，例如通过Virtis，Gardiner，NY；FTS Systems，Stone Ridge，NY；和SpeedVac(Savant InstrumentsInc.，Farmingdale，NY)进行。除去的水量可以在约5％，10％，20％，30％-约60，70，80，90，95或99％或99％以上。在某些实施方案中，基本上除去了所有过量的水。然后可以储存冻干的粉末。储存温度可以在低于约-196℃-80℃，-50℃或-20℃-约23℃以上之间改变。如果需要，可以在储存前表征粉末(重量，蛋白质含量等)。
可以在使用前在合适的溶液或缓冲液中再溶解冻干粉。典型的溶液包括，但不限于PBS，DMEM和BSS。可以根据需要调整溶液的pH。可以根据需要改变AM的浓度。在某些制备过程中，更浓的制品是有用的，而在其它制备过程中，具有低浓度AM的溶液是有用的。可以将另外的化合物加入到组合物中。可以加入到再溶解制剂中的典型化合物包括，但不限于pH调节剂，缓冲剂，胶原蛋白，HA，抗生素，表面活性剂，稳定剂，蛋白质等。还可以将冻干的AM粉末加入到制备的霜剂，软膏剂或洗剂中以便产生所需浓度。
可以根据需要将另外的成分加入到组合物中。在某些实施方案中，可以将水溶性或粉末AM制品与ECM成分，如胶原蛋白，血纤蛋白或HA混合。
胶原蛋白为在体内存在的主要结构蛋白。它提供对骨的组织，结缔组织的支撑并且提供身体结构。当身体处于愈合过程中时，胶原蛋白在帮助构成细胞结构方面起作用。透明质酸为在滑膜关节液，眼玻璃体液，软骨，血管，胞外基质，皮肤和脐带中存在的天然糖。血纤蛋白为涉及血凝固的蛋白质。
可以将水溶性AM制品与胶原蛋白，血纤蛋白或HA混合。类似地，可以将冻干粉末AM制品与胶原蛋白，血纤蛋白或HA混合。胶原蛋白，血纤蛋白和HA可以为合适的递送赋形剂(vehicle)，因为证实混合了胶原蛋白或HA的AM制品可对TGF-β启动子活性产生抑制作用。尽管在本文所述的实验中将AM制品与胶原蛋白凝胶和HA凝胶混合，但是可以使用胶原蛋白和HA或其它ECM成分(例如血纤蛋白)的任何可溶性形式(例如液体)。胶原蛋白，血纤蛋白或HA可以来源于任何合适来源的生物体。当加入胶原蛋白，血纤蛋白或HA时，这些化合物与AM之比可以根据需要改变。例如，可以使用的AM与胶原蛋白(或血纤蛋白或HA)之比小于约0.001∶1，0.01∶1，0.05∶1或0.1∶1，至约1∶1，1.5∶1，2∶1，5∶1，10∶1，100∶1或1000∶1或更高。
例如，如实施例1中所述，可以通过用0.1N乙酸稀释储备溶液(4mg/ml)并且通过将其与适当体积比的20X DMEM或合适的缓冲液和1N NaOH混合制备胶原蛋白凝胶。例如，制品中存在的胶原蛋白在小于约2mg/ml到大于约4mg/ml的范围。
例如，可以通过在DMEM或合适的缓冲液中稀释工业制备的HA(HealonTM(10mg HA/ml)(Pharmacia，LaJolla，CA)制备高MW HA的各种稀释液。可以在溶液，诸如PBS，DMEM或其它溶液中将AM制品的冻干粉和水溶性形式稀释成所需胶原蛋白浓度。例如，HA在制品中的存在范围在小于约2μg/ml到高于约129μg/ml。
下列方法代表了制备本文所述和使用的羊膜制品和纯化的组合物的例证方法。
保存的人AM的制备：
在选择的剖腹生产术时采集人胎盘(Heiligenhaus等，Invest OphthalmolVis Sci.42：1969-1974，2001，Lee和Tseng，Am J Ophthalmol.123：303-312，1997，Prabhasawat等，Ophthalmology，104：974-985，1997，Tseng等，ArchOphthalmol.116：431-441，1998)。将AM在硝化纤维纸(Hybond N+，Amersham，England)上平展，使上皮表面向上。将AM样品储存在-80℃下的DMEM/甘油1∶2(v/v)中，直到使用为止。
羊膜提取物制备
新鲜和冷冻人胎盘获自io-Tissue，Bio-Tissue，Inc.(Miami，FL)。制备总人AM提取物(AME)的完整方法在无菌下进行，以便用于随后基于细胞培养的实验。将AM切成适合于BioPulverizer(Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK)的桶的小切片，冷冻在液氮中，粉碎成细粉并且称重。将包含蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物，P8340，Sigma，并且补充了1mMPMSF)和磷酸酶抑制剂(50mM氟化钠和0.2mM钒酸钠)的pH 7.4的冷1XPBS缓冲液以1∶1(ml/g)加入到粉末中。将该混合物保持在冰上并且使用Tissue Tearor(Biospec Products，Inc.，Dremel，WI)匀浆5次，每次1分钟，其中有2分钟的冷却间隔。将这些水溶性提取物称为“总”AM提取物(AME)。
将总AM提取物分入两个50ml圆锥形离心管中。在4℃下以高速(HS，48,000xg)离心一个并且以低速(LS，15,000Xg)离心另一个。将HS和LS上清液的等分部分转入无菌1.5ml埃彭道夫管中并且分别称为AM/HS，AM/LS。将所需的AM/H样品冷冻在-20℃下1小时，此后冻干。然后将样品放入在盖上带有孔的FreeZone室(Labconco，Kansas City，MO)中。在-50℃下和0.85mBar真空中将样品冻干5小时。在使用前，使用无菌蒸馏H2O将样品再溶解成相同体积。同样的方法还用于由易于从AM基质上粘附的物质上刮取的AM胶冻制备提取物。
总可溶性人羊膜和羊膜胶冻提取物制备
冷冻人胎盘材料获自Bio-Tissue，Bio-Tissue，Inc.(Miami，FL)。制备总人AM提取物(AME)的完整方法在无菌下进行，以便用于随后基于细胞培养的实验。将AM切成适合于BioPulverizer(Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK)的桶的小切片，冷冻在液氮中，粉碎成细粉并且称重。将包含蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物，P8340，Sigma，并且补充了1mM PMSF)和磷酸酶抑制剂(50mM氟化钠和0.2mM钒酸钠)的pH 7.4的冷1X PBS缓冲液以1∶1(ml/g)加入到粉末中。将该混合物保持在冰上并且使用TissueTearor(Biospec Products，Inc.，Dremel，WI)匀浆5次，每次1分钟，其中有2分钟的冷却间隔。将这些水溶性提取物称为“总”AM提取物(AME)。
将总水溶性提取物在4℃下混合1小时，随后通过在4℃下两种不同速度的离心30分钟，即15000xg和48000xg，进行分级分离，且将所得上清液分别称为L和H。将每种上清液分成等分部分并且储存在-80℃下。该方法还用于由易于从AM基质上粘附的物质上刮取的AM胶冻制备提取物。
使用不同缓冲液和分级分离方法的总可溶性人羊膜和羊膜胶冻提取物
在检验不同提取缓冲液中的制品中，称重由上述制备的粉末并且通过在4℃下搅拌1小时与缓冲液A(等渗低盐)：100mM Tris-HCl，pH 7.6，150mMNaCl，4mM EDTA，1％Triton X-100以AM与缓冲液(ml)1∶1的湿重(g)比混合。在以48000xg离心后，随之通过在4℃下搅拌1小时用缓冲液B(高盐)：100mM Tris-HCl，pH 7.6，1M NaCl，4mM EDTA，1％Triton X-100提取所得沉淀。再以48000xg离心后，最终通过在4℃下搅拌24小时用缓冲液C(4M胍盐酸盐)：100mM乙酸钠，pH 5.8，4M胍盐酸盐，4mMEDTA，1％Triton X-100提取沉淀。使用下列蛋白酶和磷酸酶抑制剂补充所有上述三种缓冲液：1μg/ml抑肽酶，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胃酶抑素A，0.5mM PMSF，50μM氟化钠和0.2μM正钒酸钠。在4℃下将分别称为提取物A，B和C的所得上清液对补充了0.5mM PMSF的透析缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCl)透析6小时并且改变两次透析缓冲液，每次使用500x(体积比-透析缓冲液：样品)。在透析后，测定每种样品的体积并且使用透析缓冲液调整至相同体积。同样的方法也用于由为易于刮取的AM基质上粘附的物质的AM胶冻制备提取物。
在PBS中的总可溶性人羊膜提取物的制备
制备总可溶性人AM提取物(T)的完整方法在无菌下进行，以便用于随后基于细胞培养的实验。冷冻人胎盘获自Bio-Tissue，Inc.(Miami，FL)，从其中取出AM。将AM切成适合于BioPulverizer(Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK)的桶的小切片，冷冻在液氮中，粉碎成细粉。称重粉末并且与包含蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物，P8340，Sigma，并且补充了1mM PMSF)和磷酸酶抑制剂(50mM氟化钠和0.2mM钒酸钠)的冷1X PBS缓冲液(通过将蒸馏H2O加入到1x PBS中制备，pH7.4，来自10x PBS，cat#70011-044，Invitrogen，Carlsbad，CA)以1∶1(ml/g)混合。将该混合物保持在冰上并且使用Tissue Tearor(Biospec Products，Inc.，Dremel，WI)匀浆5次，每次1分钟，其中有2分钟的冷却间隔。将该水溶性提取物称为“总”(T)。将总水溶性提取物在4℃下混合1小时，在4℃下以48000xg离心30分钟。将上清液分成等分部分并且储存在-80℃下。
水溶性AM基质提取物的制备
使用无菌技术，用HBSS简单将获自Bio-Tissue，Inc.(Miami，FL)的冷冻人AM洗涤2-3次以便除去原始的保存介质。用药刀刮取AM基质，冷冻在液氮的气相中并且用BioPulverizer(Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK)研磨成细颗粒，随后使用Tissue Tearor(Biospec Products，Inc.，Dremel，WI)在冰上的pH 7.4的PBS中匀浆1分钟。通过旋转1小时混合匀浆物并且在4℃下以14,000xg离心30分钟。然后收集在PBS中的上清液并且以等分部分储存在-80℃下。通过BCA测定法测定蛋白质浓度。称为羊膜基质提取物(ASE)的该羊膜水溶性蛋白质提取物用于本文所述的实验。
AM基质提取物制备
以无菌方式实施制备蛋白质提取物的完整方法。使用HBSS(Invitrogen，Carlsbad，CA)简单将获自Bio-Tissue，Inc.(Miami，FL)的冷冻人AM洗涤2-3次以便除去保存介质。用药刀从AM基质侧上刮取AM基质以便进行基质提取物制备。用HBSS将获自Baptist Hospital(Miami，FL)的人胎盘以及绒毛膜冲洗3次以便除去血液。为了制备水溶性蛋白质提取物，将总AM，刮取的AM基质，除去基质的AM，胎盘和绒毛膜各自冷冻在液氮的气相中并且用BioPulverizer(Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK)各自研磨成细颗粒，随后使用Tissue Tearor(Biospec Products，Inc.，Dremel，WI)在冰上的PBS(pH7.4)中匀浆1分钟。混合各匀浆物1小时并且在4℃下以14,000xg离心30分钟。然后收集各上清液(在PBS中)并且以等分部分(0.5ml)储存在-80℃下。将BCA测定法(Pierce，Rockford，IL)用于测定不同提取物中的总蛋白质。
制备人AM提取物的水溶性和冻干粉形式
在制备人AM提取物的典型方法中，以无菌方式实施完整方法。除非另作陈述，可以在方法的步骤中在室温下处理AM提取物。首先，优选从Bio-Tissue，Inc.(Miami，FL)获得新鲜或冷冻人AM。用HBSS(Invitrogen，Carlsbad，CA)将冷冻AM简单洗涤2-3次以便除去保存的介质。用HBSS将新鲜人胎盘或绒毛膜冲洗3次以便除去血液。
为了制备AM提取物的水溶性形式，将AM(例如AM基质，除去基质的AM，胎盘，绒毛膜)转入无菌50ml离心管并且在4℃下以5000xg离心5分钟以便除去过量流体。称重AM，转至100mm或150mm无菌培养皿中并且冷冻在液氮容器的气相中20分钟以便有利于随后的匀浆。使用一次性解剖刀将冷冻AM切成小片或使用BioPulverizer(Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK)或其它合适的装置研磨成细颗粒且在中性pH下用TissueTearor(Biospec Products，Inc.，Dremel，WI)或其它合适的装置在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或不含酚红的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中匀浆。为了进行生化表征和纯化，使用下列蛋白酶抑制剂补充上述溶液：1μg/ml抑肽酶，l μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胃酶抑素A和1mM PMSF。然而，如果将提取物直接加入到细胞培养物中，那么不加入蛋白酶抑制剂。在4℃下将匀浆物混合30分钟并且以15,000xg离心30分钟。收集上清液(即AM提取物)并且以等分部分(0.5ml)储存在-80℃下。将BCA测定法(Pierce，Rockford，IL)用于测定各AM提取物中的总蛋白质。
为了制备AM提取物的冻干粉末形式，使用BioPulverizer(BiospecProducts，Inc.，Bartlesville，OK)或其它合适的装置将冷冻AM研磨成细颗粒并且如本文所述进一步匀浆。在4℃下用SpeedVac(Savant InstrumentsInc.，Farmingdale，NY)将约0.5ml的等分部分冻干4小时以便使重量从280mg减至32mg(减少～89％)。称重冻干粉末并且储存在-80℃下。在使用前，用合适的缓冲液将冻干粉再溶解。
为了制备AM基质提取物，从完整的总AM的基质表面上刮取AM基质，从而得到完整基膜和羊膜上皮，并且使用如本文所述BioPulverizer研磨冷冻AM基质。在中性pH和4℃下用PBS(例如1.4mg/ml)将基质提取30分钟并且以15,000xg离心30分钟。收集上清液并且以等分部分(0.5ml)储存在-80℃下。将BCA测定法(Pierce，Rockford，IL)用于测定AM基质提取物中的总蛋白质。
涉及普通分子生物学技术的方法在本文中描述。这类技术一般为本领域中公知的并且详细描述在方法学专题论文中，诸如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rd ed.，vol.1-3，ed.Sambrook等，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001；和Current Protocols inMolecular Biology，ed.Ausubel等，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，2003(最新期刊)。用于培养动物细胞的各种技术为本领域中公知的并且描述在Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，4th ed.，R.Ian Freshney，Wiley-Liss，Hoboken，NJ，2000和Animal Cell CultureTechniques(Springer Lab Manual)，M.Clynos，Springer-Verlag，New York，NY，1998中。涉及蛋白质分析和纯化的方法也为本领域中公知的并且描述在Protein Analysis and Purification：Benchtop Techniques，2nd ed.，Ian M.Rosenberg，Birkhauser，New York，NY，2004中。
药物组合物
为给药目的可以将AM制品配制成非固体剂型，例如，通过与递送赋形剂混合而产生组合物，诸如溶液，滴剂，混悬液，糊剂，喷雾剂，软膏剂，油，乳剂，气溶胶，涂敷绷带，贴剂，霜剂，洗剂，凝胶等。所用的制剂取决于具体应用。凝胶用于给予组合物，因为它们能够更好地使活性组分保留在导入部位，从而使活性组分将其作用较长时间，此后将活性组分清除。可选择地，将AM制品可配制成延长释放固体剂型(包括口服剂型)。本文提供了典型的药学上可接受的载体或赋形剂和稀释剂以及药物制剂的描述，并且还可以在本领域中的标准教科书Remington′s Pharmaceutical Sciences和USP/NF中找到。
可以使用一种或多种生理学上可接受的载体，按照通用方法配制药物组合物，所述的生理学可接受的载体包括有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。适当的制剂取决于选择的给药途径。任何众所周知的技术，载体和赋形剂可以合适的和为本领域中理解的使用。例如，可以在如下文献中找到本文所述的药物组合物的概述：Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，Nineteenth Ed(Easton，Pa.：Mack PublishingCompany，1995)；Hoover，John E.，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.，Eds.，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，SeventhEd.(Lippincott Williams&Wilkins；1999)，将这些文献完整地引入本文作为参考。
在某些实施方案中，所述组合物包括药学上可接受的稀释剂，赋形剂或载体。此外，可以将本文所述的AM制品和纯化的组合物以药物组合物形式给药，其中将本文所述的AM制品和纯化的组合物与作为组合疗法中的其它活性组分混合。在某些实施方案中，药物组合物可以包括其它药用或药物活性剂，载体，佐剂，诸如防腐剂，稳定剂，湿润剂或乳化剂，溶解促进剂，用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，药物组合物还可以包含其它治疗上有价值的物质。
本文所用的药物组合物意指本文所述的AM制品和纯化的组合物与其它化学成分，诸如载体，稳定剂，稀释剂，分散剂，悬浮剂，增稠剂和/或赋形剂的混合物。药物组合物有利于将化合物给予生物体。在实施本文提供的治疗或使用方法中，以药物组合物的形式将治疗有效量的本文所述的AM制品和纯化的组合物给予患有所要治疗的疾病，病症或疾患的哺乳动物。在某些实施方案中，所述的哺乳动物为人。治疗有效量可以根据疾病的严重性，受治疗者的年龄和相对健康状况，所用的化合物的功效和其它因素的不同而广泛改变。可以单独或与作为混合物中成分的一种或多种治疗剂组合使用所述的化合物。
局部用制剂
本文所述的AM制品和纯化的组合物的制剂包括那些适合于局部给药的制剂。可以将这些制剂便利地制成单位剂型并且可以通过制药领域众所周知的任何方法制备。可以与载体物质混合以便得到单一剂型的活性组分的量取决于所治疗的宿主，特定给药方式。
混悬液可以包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇类，聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯类，微晶纤维素，偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)，膨润土，琼脂和黄蓍胶及其混合物。
本文所述的局部用组合物包括各种物理形式。它们包括，但不限于溶液，洗剂，霜剂，油，凝胶，棒状物，喷雾剂，软膏剂，香膏，洗发剂和糊剂。一般而言，可以将这类载体系统描述为溶液，乳剂，凝胶，固体和气溶胶。可以将组合物直接施用于皮肤或可以施用透皮递送装置形式，诸如本领域中公知的显微操作针，贴剂，绷带或纱布垫。
软膏剂，糊剂，霜剂和凝胶除包含本文所述的AM制品和纯化的组合物外还可以包含赋形剂，诸如动物和植物脂肪，油，蜡，石蜡，淀粉，黄蓍胶，纤维素衍生物，聚乙二醇类，硅氧烷，膨润土，硅酸，滑石粉和氧化锌或其混合物。
粉末和喷雾剂除包含本文所述的AM制品和纯化的组合物外还可以包含赋形剂，诸如乳糖，滑石粉，硅酸，氢氧化铝，磷酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂还可以包含常用的抛射剂，诸如氯氟烃类和挥发性未被取代的烃类，诸如丁烷和丙烷。
溶剂一般用于制备合适的局部用组合物。这类溶剂可以为基于水或有机物的。溶剂必须能够使活性组分分散于或溶于其中，而不会对所治疗的动物产生刺激。水构成所有含水溶剂的基础，而合适的有机溶剂包括丙二醇，丁二醇，聚乙二醇，聚丙二醇，甘油，1，2，4-丁三醇，山梨醇酯类，1，2，6-己三醇，乙醇，异丙醇，丁二醇及其混合物。在整个组合物中可以包括的溶剂量在0.1％-99％且优选2.0％-75％。在某些实施方案中，生产包含软化剂(emollient)的组合物形式的组合物。各种合适的软化剂为公知的并且可以在本文使用。
在某些实施方案中，将组合物配制成包含约0.01％-10％本文所述的AM制品和纯化的组合物的洗剂。在其它实施方案中，用溶液载体系统将组合物配制成霜剂。霜剂组合物可以优选包含约0.1％-15％且优选1％-5％的本文所述的AM制品和纯化的组合物。将洗剂和霜剂配制成乳剂和溶液。还可以以液体形式给予组合物，包括悬浮于液体中的脂质体形式，如这种工业领域中可利用的不同喷雾剂类型。
在其它实施方案中，将活性组分配制成软膏剂。合适的软膏剂可以包含动物或植物油或半固体烃类(油脂性的)单一基质。合适的软膏剂还可以包含吸收水而形成乳剂的吸收软膏基质。软膏剂载体还可以为水溶性的。软膏剂可以包含1％-99％的软化剂和约0.1％-99％的增稠剂。
所述组合物中本文所述的AM制品和纯化的组合物的比例可以在约0.01wt.％-约100wt.％，更优选约0.1wt.％-约99.9wt.％且尤其是约1.0wt.％-约99.0wt.％之间改变。
“载体”或“赋形剂”优选意指适合于局部给药的载体物质并且包括本领域中公知的任何这类物质，诸如任何液体，凝胶溶剂，液体稀释剂，增溶剂等，其为无毒性的并且不以有害方式与组合物中的其它成分发生相互作用。本文使用的合适的载体的实例包括水，硅氧烷，液体糖类，蜡，油，石油胶冻和各种其它物质。
在某些实施方案中，载体或赋形剂包括一种或多种溶剂，油，表面活性剂，保湿剂，增稠剂，抗氧化剂，螯合剂，缓冲剂和防腐剂。
溶剂的实例包括C2-C10醇类，诸如己醇，环己醇，苄醇，1，2-丁二醇，甘油，和戊醇；C5-C10烃类，诸如正-己烷，环己烷和乙基苯；C4-C10醛类和酮类，诸如庚醛，环己酮和苯甲醛；C4-C10酯类，诸如乙酸戊酯和丙酸苄酯；芳香油，诸如桉树油，芸香油，小茴香子油，柠檬烯，麝香草酚和1-蒎烯；具有2-8个碳原子的卤代烃类，诸如1-氯己烷，1-溴己烷和氯环己烷。
油的实例包含脂肪和油，诸如橄榄油和氢化油；蜡，诸如蜂蜡和羊毛脂；烃类，诸如液体石蜡，地蜡和角鲨烷；脂肪酸，诸如硬脂酸和油酸；醇类，诸如鯨蜡醇，十八烷醇，羊毛脂醇和十六醇；和酯类，诸如肉豆蔻酸异丙酯，棕榈酸异丙酯和硬脂酸丁酯。
表面活性剂的实例包括阴离子型表面活性剂，诸如硬脂酸钠，十六烷基硫酸钠，聚氧乙烯月桂基醚磷酸酯，N-乙酰基谷氨酸钠；阳离子型表面活性剂，诸如硬脂酰二甲基苄基氯化铵和硬脂酰三甲基氯化铵；两性表面活性剂，诸如烷氨基乙基甘氨酸盐酸盐溶液和卵磷脂；和非离子型表面活性剂，诸如单硬脂酸甘油酯，失水山梨糖醇单硬脂酸酯，蔗糖脂肪酸酯类，丙二醇单硬脂酸酯，聚氧乙烯油基醚，聚乙二醇单硬脂酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇单棕榈酸酯，聚氧乙烯椰子油脂肪酸一乙醇酰胺，聚亚丙基二醇(例如在商标“Pluronic”下销售的物质)，聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯羊毛脂。
保湿剂的实例包括甘油，1，3-丁二醇和丙二醇；增稠剂的实例包括黄原胶，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚乙二醇和羧甲基纤维素钠；抗氧化剂的实例包括丁羟甲苯，丁羟茴香醚，桔酸丙酯，柠檬酸和乙氧(三甲)喹啉；螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸二钠和二磷酸羟乙酯(ethanehydroxyldiphosphate)；缓冲剂的实例包含柠檬酸，柠檬酸钠，硼酸，硼砂和磷酸氢二钠；且防腐剂的实例为对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，甲基乙酰吡喃二酮，水杨酸和苯甲酸。
在某些实施方案中，载体/赋形剂由上述物质构成以便实现对皮肤的受控封闭，由此在最低的皮肤刺激下导致生物活性部分通过皮肤渗透的最佳强化。在某些实施方案中，载体/赋形剂可以包括有助于维持分散于连续相中的活性组分的颗粒相的分散剂。在其它实施方案中，非-离子赋形剂，诸如月桂醇，丙二醇一月桂酸酯，乳酸肉豆蔻酯，乳酸月桂酯等有利于分散。
可以用透皮递送促进剂增加通过表皮表面的生物活性部分的比例。合适的透皮递送促进剂包括接受质子的溶剂，诸如二甲亚砜和二甲基乙酰胺。其它合适的透皮递送促进剂包括2-吡咯烷，N，N-二乙基-间-甲苯甲酰胺，1-十二烷基氮杂环庚-2-酮，N，N-二甲基甲酰胺，N-甲基-2-吡咯烷，萜类，表面活性剂和巯基乙酸钙。
合适的皮肤渗透促进剂包括对-氨基苯甲酸的1-5个碳的脂肪酸酯类，棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇，异丁醇，异丁醇，十八烷醇，甘油，2-吡咯烷酮，尿素，丙二醇，油酸，棕榈酸，二甲亚砜，N，N-二甲基乙酰胺，N，N-二甲基甲酰胺，2-吡咯烷酮，1-甲基-2-吡咯烷酮，5-甲基-2-吡咯烷酮，1，5-二甲基-2-吡咯烷酮，1-乙基-2-吡咯烷酮，2-吡咯烷酮-5-甲酸，N，N-二甲基-间-甲苯甲酰胺，尿素，乙酸乙酯，1-十二烷基氮杂环庚-2-酮，油酸，咪唑啉，丁基脲和吡咯烷酮羧酸酯类。
湿润剂，乳化剂，表面活性剂和润滑剂，诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，释放剂，包衣剂，甜味剂，矫味剂和香味剂，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于所述组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸，盐酸半胱氨酸，硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯，丁羟茴香醚(BHA)，丁羟甲苯(BHT)，卵磷脂，桔酸丙酯，α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨醇，酒石酸，磷酸等。
作为局部应用的合适的组合物，可以列举所有常用于局部给予治疗剂的组合物，例如霜剂，胶冻剂，敷料，洗发剂，酊剂，糊剂，软膏剂，油膏，粉剂，液体或半液体制剂等。所述组合物的使用可以通过气溶胶进行，例如含有抛射剂，诸如氮，二氧化碳，氟利昂或不含抛射剂的气溶胶，诸如泵式喷雾剂，滴剂，洗剂或半固体，诸如可以用拭子涂布的增稠的组合物。在具体的组合物中，便利地使用半固体组合物，诸如油膏，霜剂，糊剂，胶冻剂，软膏剂等。
眼用制剂
可以以各种方式给予本文所述的AM制品和纯化的组合物，包括局部递送至眼部的所有剂型。另外，可以通过全身，诸如口服或静脉内给予本文所述的AM制品和纯化的组合物。可以通过将本文所述的AM制品和纯化的组合物局部施用于眼部并且可以将其配制成各种可局部给药的眼用组合物，诸如溶液，混悬液，凝胶或软膏剂。因此，“眼部给药”包括，但不限于眼内注射，视网膜下注射，玻璃体内注射，眼周给药，结膜下(subconjuctival)注射，眼球后注射，房内注射(包括进入前房或玻璃体房)，sub-Tenon注射或植入物，眼用溶液，眼用混悬液，眼用软膏剂，眼用植入物和眼用嵌入剂，眼内溶液，应用离子透入，掺入手术灌洗液和药包(仅作为实例，插入穹窿的浸透的穹窿)。
包含本文所述的AM制品和纯化的组合物的组合物作为例证采用液体形式，其中活性剂以溶液，混悬液或它们两者的形式存在。一般而言，当将组合物作为溶液或混悬液给药时，活性剂的第一部分以溶液的形式存在，而活性剂的第二部分以颗粒形式，在液体基质中的混悬液形式存在。在某些实施方案中，液体组合物可以包括凝胶制剂。在其它实施方案中，液体组合物为含水的。可选择地，组合物可采用软膏剂形式。
有用的组合物可以为水溶液，混悬液或溶液/混悬液，可以将它们制成滴眼剂形式。可以通过已知的许多滴剂将所需剂量给药于眼。例如，就25μl体积的滴眼剂而言，给予1-6滴递送25-150μl的组合物。含水组合物一般包含约0.01％-约50％，更一般地约0.1％-约20％，更一般地约0.2％-约10％且最一般地约0.5％-约5％重量/体积的本文所述的AM制品和纯化的组合物。
一般而言，含水组合物具有眼科可接受的pH和同渗质量摩尔浓度。就制剂，组合或组分而言的“眼科可接受的”一般意指对治疗的眼或其功能或对受治疗者一般健康状况没有持久的有害作用。暂时的作用，诸如最小的刺激或“螫刺”感在使用活性剂的局部眼部给药是常见的并且与所述制剂，组合物或组分一致性是“眼科可接受的”。
有用的含水混悬液还可以包含一种或多种聚合物作为悬浮剂。有用的聚合物包括水溶性聚合物，诸如纤维素聚合物，例如羟丙基甲基纤维素，和水不溶性聚合物，诸如含交联羧基的聚合物。有用的组合物还可以包含眼科可接受的粘膜粘着性聚合物，例如，选自羧甲基纤维素，卡波姆(丙烯酸聚合物)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚丙烯酰胺，聚卡波菲，丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物，藻酸钠和葡聚糖。
有用的组合物还可以包括眼科可接受的增溶剂以便有助于本文所述的AM制品和纯化的组合物中的成分的溶解性。本文所用的术语“增溶剂”一般包括导致活性剂的胶束溶液或真溶液形成的试剂。某些眼科可接受的非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯80可以用作增溶剂，因为它们可以为眼科可接受的二醇类，聚乙二醇，例如聚乙二醇400和乙二醇醚类。
有用的组合物还可以包括一种或多种眼科可接受的pH调节剂或缓冲剂，包括酸，诸如乙酸，硼酸，柠檬酸，乳酸，磷酸和盐酸；碱，诸如氢氧化钠，磷酸钠，硼酸钠，柠檬酸钠，乙酸钠，乳酸钠和三-羟甲基氨基甲烷；和缓冲剂，诸如柠檬酸盐/葡萄糖，碳酸氢钠和氯化铵。以将组合物的pH维持在眼部可接受范围所需的量包括这类酸，碱和缓冲液。
有用的组合物还可以包括一种或多种眼科可接受的盐，其用量使组合物的同渗质量摩尔浓度达到眼科可接受的范围所需要的。这类盐包括具有钠，钾或铵阳离子和氯根，柠檬酸根，抗坏血酸根，硼酸根，磷酸根，碳酸氢根，硫酸根，硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠，氯化钾，硫代硫酸钠，亚硫酸氢钠和硫酸铵。
其它有用的组合物还可以包括一种或多种眼科可接受的防腐剂以便抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞的物质，诸如硼酸苯汞和硫柳汞；稳定的二氧化氯；和季铵化合物，诸如苯扎氯铵，溴化十六烷基三甲铵和氯化十六烷基吡啶鎓。
其它有用的组合物可以包括一种或多种眼科可接受的表面活性剂以便增强物理稳定性或用于其它目的。合适的非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯类和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚类和烷基苯基醚类，例如辛苯昔醇10，辛苯昔醇40。
如果需要，其它有用的组合物可以包括一种或多种抗氧化剂以便增强化学稳定性。仅作为实例，合适的抗氧化剂包括抗坏血酸和焦亚硫酸钠。
可以将含水混悬液组合物包装在单剂量的不能再封闭的容器中。另一方面，可以使用多剂量可再封闭的容器，其中典型的是在组合物中包括防腐剂。
眼用组合物还可以采用可以插入在眼与眼睑之间或结膜囊中的固体制品，其中它释放本文所述的AM制品和纯化的组合物。释放至冲洗角膜表面的泪液或直接释放至角膜，在其中一般与固体制品紧密接触。适合于以这类方式植入眼的固体制品一般主要由聚合物组成并且可以为生物可降解的或不能生物降解的。
注射制剂
适合于肌内，皮下或静脉内注射的制剂可以包括生理学可接受的无菌水或非水溶液，分散液，混悬液或乳液和再溶解成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的含水和非水载体，稀释剂，溶剂或赋形剂的实例包括水，乙醇，多元醇类(丙二醇，聚乙二醇，甘油，克列莫佛等)，其合适的混合物，植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯类，诸如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣材料，诸如卵磷脂，就分散液而言通过维持所需颗粒大小并且通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。适合于皮下注射的制剂还可以包含添加剂，诸如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。可以用各种抗菌和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯类，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等确保防止微生物生长。还需要包括等渗剂，诸如糖类，氯化钠等。可以通过使用延缓吸收的试剂，诸如单硬脂酸二羟基铝和明胶使注射药物剂型延长吸收。
就静脉内注射剂而言，可以将本文所述的AM制品和纯化的组合物配制成在生理学相容性缓冲液中的水溶液，所述的生理学相容性缓冲液诸如Hank溶液，林格液，生理盐水缓冲液或其它合适的溶液。就跨粘膜给药而言，将适合于透过屏障的渗透剂用于制剂中。这类渗透剂一般为本领域中公知的。就其他非肠道注射剂而言，合适的制剂可以包括水或非水溶液，优选含有生理学相容性缓冲液或赋形剂。这类赋形剂一般为本领域中公知的。
非肠道注射可以包括快速浓注或连续输注。可以将用于注射的制制成单位剂型，，例如在添加了防腐剂的安瓿或多剂量容器中。本文所述的药物组合物可以为适合于非肠道注射的形式，如在含油或含水赋形剂中的无菌混悬液，溶液或乳剂并且可以包含配制试剂，诸如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。用于非肠道给药的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可以将活性化合物的混悬液制备成合适的含油注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或赋形剂包括脂肪油，诸如芝麻油或合成脂肪酸酯类，诸如油酸乙酯或甘油三酯类或脂质体。含水注射混悬液可以包含增加混悬液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠，山梨醇或葡聚糖。该混悬液还可以任选包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂以便能够制备高浓缩溶液。可选择地，活性组分可以为在使用前用合适的赋形剂，例如无菌无热原水溶解(constitution)的粉末形式。
透皮制剂
可以使用本领域中已经描述的各种装置给予本文所述的透皮制剂。例如，这类装置包括，但不限于：美国专利US3,598,122，3,598,123，3,710,795，3,731,683，3,742,951，3,814,097，3,921,636，3,972,995，3,993,072，3,993,073，3,996,934，4,031,894，4,060,084，4,069,307，4,077,407，4,201,211，4,230,105，4,292,299，4,292,303，5,336,168，5,665,378，5,837,280，5,869,090，6,923,983，6,929,801和6,946,144，特别将这些文献各自完整地引入作为参考。
本文所述的透皮剂型可以掺入某些本领域中常用的药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，本文所述的透皮制剂包括至少三种成分：(1)如本文所述制剂；(2)透皮促进剂；和(3)含水佐剂。此外，透皮制剂可以包括另外的成分，诸如，但不限于胶凝剂，霜剂和软膏剂基质等。在某些实施方案中，透皮制剂可以还包括针织或针织裱背材料以便促进吸收并且防止透皮制剂从皮肤上除去。在其它实施方案中，本文所述的透皮制剂可以维持促进扩散入皮肤的饱和或过饱和状态。
适合于本文所述的AM制品和纯化的组合物的透皮给药的制剂可以使用透皮递送装置和透皮递送贴剂，并且可以为溶于和/或分散于聚合物或粘合剂中的亲脂性乳剂或缓冲的水溶液。可以构成这类贴剂用于连续，搏动或根据需要递送药物活性剂。此外，本文所述的AM制品和纯化的组合物的透皮递送可以通过离子透入贴剂等进行。另外，透皮贴剂可以提供组合物的受控递送。可以通过使用控制速率的膜或通过将化合物截留在聚合物基质或凝胶内减缓吸收速率。相反，吸收促进剂可以用于增加吸收。吸收促进剂或载体可以包括可吸收的药学上可接受的溶剂以便有助于通过皮肤。例如，透皮装置为绷带形式，其包含裱背部分，包含化合物与任选载体的储器，任选的速率控制屏障以便以受控和预定速率在延长时间期限内将化合物递送至宿主皮肤和将装置与皮肤固定的用具。
固体口服剂型
本文所述的药物固体剂型可以包括一种或多种药学上可接受的添加剂，诸如相容性载体，粘合剂，填充剂，悬浮剂，矫味剂，甜味剂，崩解剂，分散剂，表面活性剂，润滑剂，着色剂，稀释剂，增溶剂，湿润剂，增塑剂，稳定剂，渗透促进剂，湿润剂，消泡剂，抗氧化剂，防腐剂，或其一种或多种的组合。在其它方面中，使用标准包衣方法，诸如描述在Remington′sPharmaceutical Sciences，20th Edition(2000)中的那些。
压制片为通过压制本文所述制剂的疏松掺合物制备的固体剂型。在各种实施方案中，为在口腔中溶解设计的压制片包括一种或多种矫味剂。在其它实施方案中，压制片包括包围在最终压制片周围的薄膜。在某些实施方案中，薄膜包衣可以提供组合物从制剂中的延缓释放。在其它实施方案中，薄膜包衣有助于患者的配合性(例如Opadry包衣或糖衣)。包括Opadry的薄膜包衣一般占片重的约1％-约3％。在其它实施方案中，压制片包括一种或多种赋形剂。
例如，通过将本文所述的组合物制剂的疏松掺合物放入胶囊内制备胶囊。在某些实施方案中，将制剂(非水混悬液和溶液)放入软胶囊。在其它实施方案中，将制剂放入标准胶囊或非胶囊中，诸如包含HPMC的胶囊。在其它实施方案中，将制剂放入撒布胶囊(sprinkle capsule)，其中胶囊可以为完整可吞咽的，或可以为开放的并且在食用前将内含物撒布于食物上。在某些实施方案中，将治疗剂量分入多(例如2，3或4)胶囊中。在某些实施方案中，以胶囊形式递送制剂的完整剂量。
在各种实施方案中，将组合物的颗粒和一种或多种赋形剂干燥掺合并且压制成团，诸如片剂，它们具有足以提供药物组合物的硬度，这些药物组合物基本上在在口服给药后少于约30分钟，少于约35分钟，少于约40分钟，少于约45分钟，少于约50分钟，少于约55分钟或少于约60分钟内崩解，由此将制剂释放入胃肠液。
在另一个方面中，剂型可以包括微囊化制剂。在某些实施方案中，一种或多种其它相容性物质存在于微囊化材料中。典型的物质包括，但不限于pH调节剂，蚀解促进剂，消泡剂，抗氧化剂，矫味剂和载体物质，诸如粘合剂，悬浮剂，崩解剂，填充剂，表面活性剂，增溶剂，稳定剂，润滑剂，湿润剂和稀释剂。
可以进一步配制包括本文所述的AM制品和纯化的组合物的药物固体剂型以便提供组合物的控释。控释意指组合物从剂型中释放，其中根据在延长时间期限内的所需特性掺入它。控释特性包括，例如，缓释，延长释放，脉冲式释放和延缓释放特性。与即刻释放组合物相反，控释组合物能够按照预定特性在延长时间期限内将活性剂递送至受治疗者。这类释放速率可以将活性剂的治疗有效水平提供延长的时间期限且由此提供较长期限的药理学反应，同时与常规速释剂型相比将副作用减少到最低限度。这类较长的反应期限提供了许多固有的有益性，而这些有益性无法使用相应的短效即刻释放制剂实现。
在某些实施方案中，可以将本文所述的固体剂型配制成肠溶衣延缓释放口服剂型，即，如本文所述使用肠溶衣影响胃肠道的小肠中的释放的药物组合物的口服剂型。肠溶衣剂型可以为压制或模制或挤压片/塑模(包衣或未包衣的)，它们包含活性组分和/或其它组合物成分的粒剂，粉末，丸粒，珠或颗粒，其自身为包衣或未包衣的。肠溶衣口服剂型还可以为胶囊(包衣或未包衣的)，它们包含固体载体或组合物的丸粒，珠或颗粒，其自身为包衣或未包衣的。
在其它实施方案中，使用搏动剂型递送本文所述的组合物。搏动剂型能够在受控的延滞时间后或在具体部位上提供一种或多种即刻释放脉冲。可以使用本领域中公知的各种搏动制剂给予搏动剂型。例如，这类制剂包括，但不限于美国专利US 5,011,692，5,017,381，5,229,135和5,840,329中所述的那些，特别将这些文献各自引入作为参考。适用于本发明制剂的其它搏动释放剂型包括，但不限于，例如，美国专利US 4,871,549，5,260,068，5,260,069，5,508,040，5,567,441和5,837,284，特别将所有这些文献引入作为参考。
控释系统的许多其它类型为本领域技术人员公知的并且适用于本文所述的制剂。这类递送系统的实例包括，例如基于聚合物的系统，诸如聚乳酸和聚乙醇酸，聚酸酐类和聚已内酯；多孔基质，为脂质的基于非聚合物的系统，包括固醇类，诸如胆固醇，胆固醇酯类和脂肪酸或中性脂肪，诸如甘油一酯类，甘油二酯类和甘油三酯类；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包衣材料，生物蚀解的剂型，使用常用粘合剂的压制片等。例如，参见Liberman等，Pharmaceutical Dosage Forms，2 Ed.，Vol.1，pp.209-214(1990)；Singh等，Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，2nd Ed.，pp.751-753(2002)；美国专利US 4,327,725，4,624,848，4,968,509，5,461,140，5,456,923，5,516,527，5,622,721，5,686,105，5,700,410，5,977,175，6,465,014和6,932,983，特别将这些文献各自引入作为参考。
在某些实施方案中，提供了药物制剂，它们包括本文所述的组合物颗粒和用于对受治疗者给药的至少一种分散剂或悬浮剂。这些制剂可以为用于混悬和在与水混合时获得基本上均匀混悬液的粉末和/或颗粒。
本文所述的含水混悬液和分散液可以保持如The USP Pharmacists′Pharmacopeia(2005 edition，chapter 905)中定义的均匀状态至少4小时。这种均匀性应通过与有关测定组合物整体均匀性一致的试验方法测定。在一个实施方案中，可以通过持续物理搅拌少于1分钟将含水混悬液重新悬浮成均匀混悬液中。在另一个实施方案中，可以通过持续物理搅拌少于45秒将含水缓冲液重新悬浮成均匀混悬液。在另一个实施方案中，可以通过持续物理搅拌少于30秒将含水缓冲液重新悬浮成均匀混悬液。在另一个实施方案中，不需要搅拌就可以维持均匀含水混悬液。
用于本文所述的含水混悬液或分散液的合适的粘度促进剂包括，但不限于甲基纤维素，黄原胶，羧甲基纤维，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，PlasdonS-630，卡波姆，聚乙烯醇，藻酸盐，阿拉伯胶，脱乙酰壳多糖及其组合。粘度促进剂的浓度取决于选择的试剂和所需的粘度。
除上述添加剂外，液体制剂还可以包括本领域中常用的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂。典型的乳化剂为乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苄醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1，3-丁二醇，二甲基甲酰胺，十二烷基硫酸钠，多库酯钠(sodium doccusate)，胆固醇，胆固醇酯类，牛磺胆酸，磷脂酰胆碱(phosphotidylcholine)，油，诸如棉子油，落花生油，玉米胚油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油，甘油，四氢化糠醇，聚乙二醇类，脱水山梨糖醇脂肪酸酯类或这些物质的混合物等。
可以理解在用于本文所述的含水分散液或混悬液的上述添加剂之间存在重叠，因为指定添加剂通常由本领域不同技术人员不同的分类或常用于任何几种不同功能。因此，应将上述添加剂仅视为包括在本文所述的制剂中的添加剂类型中的典型，而非限制性的。这类添加剂的用量易于由本领域技术人员根据所需的具体特性确定。
鼻内用制剂
鼻内用制剂为本领域中公知的并且描述在，例如，美国专利US4,476,116，5,116,817和6,391,452中，特别将这些文献各自引入作为参考。可以将按照这些和其它本领域众所周知的技术制备制剂，制成在盐水中的溶液，其中使用本领域中公知的苄醇或其它合适的防腐剂，氟烃类和/或其它增溶剂或分散剂。例如，参见Ansel，H.C.等，Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems，Sixth Ed.(1995)。可以使用合适的无毒性药学上可接受的组分制备这些组合物和制剂。这些组分为制备鼻用剂型技术人员公知的并且它们中的某些可以在本领域中的普通教科书REMINGTON：THESCIENCE和PRACTICE OF PHARMACY，21st edition，2005中找到。对合适的载体的选择高度依赖于所需鼻用剂型的确切性质，例如溶液，混悬液，软膏剂或凝胶。鼻用剂型一般包含大量水与活性组分。还可以存在少量其它组分，诸如pH调节剂，乳化剂或分散剂，防腐剂，表面活性剂，胶凝剂或缓冲剂和其它稳定剂和增溶剂。
为了通过吸入给药，本文所述的组合物可以为气溶胶，烟雾剂或粉末的形式。便利地以使用合适的抛射剂的气雾剂形式从加压药包或喷雾器中递送本文所述的药物组合物，所述的抛射剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。就加压气雾剂而言，可以通过安装递送计量量的阀测定剂量单位。可以配制包含本文所述的AM制品和纯化的组合物和合适的粉末基质，诸如乳糖或淀粉的粉末混合物的用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒，诸如，仅作为实施例。
其它制剂
还可以将本文所述的AM制品和纯化的组合物配制成直肠用组合物，诸如灌肠剂，直肠凝胶，直肠泡沫，直肠气溶胶，栓剂，胶冻栓剂或保留灌肠剂，它们包含常用栓剂基质，诸如可可脂或其它甘油酯类以及合成聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮，PEG等。在组合物的栓剂剂型中，首先熔化低熔点蜡，诸如，但不限于脂肪酸甘油酯类，任选与可可脂的组合的混合物。
给药方法和治疗方案
可以通过任何合适的技术给予组合物。一般而言，将组合物直接给药至靶点(例如眼表面，皮肤)。将制剂给药至眼表面为本领域众所周知的。如果需要将AM制品递送至皮肤，那么可以使用局部给药。还关注可注射组合物。给药还可以为非肠道的(例如皮下)。在化妆品和药物应用中的其它递送方法，例如脂质体递送，从浸渍了组合物的装置中扩散和基于微乳剂的透皮递送为本领域中公知的。
可以为预防和/或治疗给药包含本文所述的AM制品和纯化的组合物的组合物。在治疗应用中，将组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病或疾患症状的用量给予已经患病或疾患的患者。用于这一应用的有效量依赖于疾病或疾患的严重性和病程，在先的疗法，患者的健康状况，体重和对药物的反应以及治疗的临床医师的判断。在本领域技术人员范围内可以充分考虑到通过常规实验(包括，但不限于剂量按比例上升临床试验)测定这类治疗有效量。
在预防应用中，将包含本文所述的AM制品和纯化的组合物的组合物给予易感，或者处于特定疾病，病症或疾患风险中的患者。将这类用量定义为“预防有效量或剂量”。在这种应用中确切量也依赖于患者的健康状况，体重等。在本领域技术人员范围内可以充分考虑到通过常规实验(包括，但不限于剂量按比例上升临床试验)测定这类预防有效量。当用于患者时，这一应用的有效量依赖于疾病，病症或疾患的严重性和过程，在先的疗法，患者的健康状况，体重和对药物的反应以及治疗的临床医师的判断。
就患者疾患未改善的情况而言，在医生判定时，可以长期给予所述化合物，即延长时间期限，包括在患者整个生命期过程中，以便改善，或者控制或限制患者疾病或疾患的症状。
就患者疾患确实改善的情况而言，在医生判定时，可以连续给予所述化合物；可选择地，可以暂时减少给药剂量或暂停一定时间期限(即“休药期”)。休药期的长度可以在2天-1年之间改变，包括2天，3天，4天，5天，6天，7天，10天，12天，15天，20天，28天，35天，50天，70天，100天，120天，150天，180天，200天，250天，280天，300天，320天，350天或365天，仅作为实例。在休药期过程中的剂量减少可以为10％-100％，包括10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％，仅作为实例。
一旦患者的病情已经发生改善，如果必要，就给予维持剂量。随后可以将作为症状函数的给药剂量或频率或它们两者降至保持疾病，步骤或疾患改善的水平。然而，患者可能需要在任何症状复发时基于长期的间歇疗法。
相当于这类用量的指定活性剂的用量根据如下因素的而改变：诸如特定的化合物，疾病或疾患及其严重性，需要治疗的受治疗者或宿主的鉴定(例如体重)，然而可以通过本领域中公知的常规方式，按照围绕该情况的特定环境确定，包括，例如给予的具体活性剂，给药途径，所治疗疾病，和所治疗的受治疗者或宿主。然而，一般而言，用于成年人治疗的剂量一般在0.02-5000mg/天，优选1-1500mg/天。可以将所需剂量便利地制成单剂量或作为同时给予的分次剂量(或在短期内)或在适当间隔，例如作为2，3，4或4次以上亚-剂量/天。
本文所述的药物组合物可以为适合于确切剂量单一给药的单位剂型。在单位剂型中，将制剂分成包含适量的一种或多种化合物的单位剂量。该单位剂量可以为包含单一量制剂的包装形式。非限制性实例为在小瓶或安瓿中包装的片剂或胶囊和粉末。可以将含水悬浮液组合物包装在单剂量不能再封闭的容器中。可选择地，可以使用多剂量可再封闭的容器，在这种情况中，一般在组合物中包括防腐剂。仅作为实例，可以将用于非肠道注射的制剂制成单位剂型，包括，但不限于添加了防腐剂的安瓿或在多剂量容器中。
适合于本文所述的AM制品和纯化的组合物的每日剂量为约0.01-2.5mg/kg/体重。较大哺乳动物，包括，但不限于人的所示每目剂量为约0.5mg-约100mg，便利地以分次剂量给予，包括，但不限于最多每天4次或以延长释放剂型给予。用于口服给药的合适的单位剂型包括约1-50mg活性组分。上述范围仅为推荐性的，因为有关个体治疗方案方面的变量数很大并且非常远离这些推荐值并非不常用。可以根据许多变量的不同改变这类剂量，但不限于所用化合物的活性，所治疗的疾病或疾患，给药方式，个体受治疗者的需要，所治疗疾病或疾患的严重性和从业医师的判断。
可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物方法测定这类治疗方案的毒性和治疗功效，包括，但不限于LD50(致50％群体死亡的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)的测定。毒性与治疗作用之间的剂量比为治疗指数并且可以将其表示为LD50与ED50之比。优选显示高治疗指数的化合物。获自细胞培养测定和动物研究的数据可以用于确定用于人的剂量范围。这类化合物的剂量优选在包括具有最低毒性的ED50的循环浓度范围。该剂量可以根据所用剂型和所用给药途径的不同在这一范围内改变。
联合疗法
本文所述的组合物和方法还可以与针对所治疗的疾患选择的特别有用的其它众所周知的治疗试联用。一般而言，本文所述的组合物，且在使用联合疗法的实施方案中，不必将其它活性剂在同一药物组合物中给予，并且因为不同的物理和化学特性而必须通过不同途经给予。如果可能，给药方式和在同一药物组合物中给药的合理性的确定完全在有经验的临床医师的知识范围内。最初的给药可以根据本领域中公知的确定方案进行，且然后基于观察到的作用，有经验的临床医师可以改变给药剂量，方式和次数。
所用化合物的具体选择依赖于主治医师的诊断及其病情的判断和适当的治疗方案。可以同时(例如同时，基本上同时或在相同治疗方案内)或依次给予所述化合物，这取决于疾病，病症或疾患的性质，患者的病情和所用化合物的实际选择。在治疗方案中每种治疗剂的给药顺序和给药的重复次数的确定完全在有经验的临床医师在评价所治疗的疾病和患者病情后的知识范围内。
本领域技术人员已知治疗有效剂量可以在将药物用于联合治疗时改变。以实验方式测定用于联合治疗方案的药物和其它活性剂的治疗有效剂量的方法描述在文献中。例如，文献中已经广泛描述了节拍器给药的应用，即提供更频繁的较低剂量，以便将毒性副作用降至最低限度。联合疗法还包括在不同时间开始和终止的定期治疗以便有助于对患者的临床控制。
就本文所述的联合疗法而言，共同给予的化合物的剂量当然根据共同使用的药物类型，所用的具体药物，所治疗的疾病或疾患的等的不同而改变。此外，当与一种或多种生物活性剂共同给药时，可以与该生物活性剂同时或依次给予本文提供的化合物。如果依次给药，那么主治医师会决定按照适当的顺序给予蛋白质与生物活性剂。
在任何情况下，可以以任何顺序乃至同时给予多种治疗剂。如果同时进行，那么可以将多种治疗剂以同一标准剂型或多种剂型(仅作为实例，如单一丸剂或两种单独的丸剂)给药。可以以多剂量给予治疗剂之一或可以将两者均以多剂量给药。如果不同时进行，那么多剂量之间的时限可以在大于0周到小于4周以内之间改变。此外，联合方法，组合物和制剂并不限于仅应用两种活性剂；还关注多种治疗组合的应用。
应理解治疗，预防或改善寻找缓解的疾患的剂量方案可以根据各种因素的不同而改变。这些因素包括受治疗者患有的病症以及受治疗者的年龄，体重，性别，膳食和医疗条件。因此，实际所用的剂量方案可以广泛改变且由此可以从本文列出的剂量方案中得到。
构成本文披露的联合疗法的药物活性剂可以为指定用于基本上同时给药的组合剂型或单独剂型。还可以通过称作两步给药方案将构成联合疗法的药物活性剂与给予的化合物中依次给予。两步给药方案要求依次给予活性剂或间隔给予单独的活性剂。多种给药步骤之间的时间期限可以在几分钟到几小时，这取决于每种药物活性剂的特性，诸如药物活性剂的功效，溶解度，生物利用度，血浆半衰期和动力学特性。靶分子浓度的生理节律变化也可以决定最佳剂量间隔。
此外，本文所述的AM制品和纯化的组合物还可以与可以对患者提供另外或协同有益性的方法组合。仅作为实例，预计患者发现本文所述方法中的治疗和/或预防有益性，其中将本文披露的化合物的药物组合物和/或与其它治疗剂的组合药物与遗传测试联用以便确定个体是否为已知与某些疾病或疾患相关的突变基因携带者。
可以在疾病或疾患发生前，过程中或之后给予本文所述的AM制品和纯化的组合物和进行联合疗法，并且包含化合物的组合物的定时给药可以改变。因此，例如，可以将化合物用作预防剂并且可以对具有发生疾患或疾病倾向的受治疗者连续给药，以便预防疾病或疾患的发生。可以在症状发作过程中或之后尽可能快速地给予化合物和组合物。可以在症状发作最初48小时内，优选在症状发作最初48小时内，更优选在症状发作最初6小时内，且最优选在症状发作最初3小时内开始给予化合物。最初给药可以通过任何途径实施，诸如，例如，静脉内注射，快速浓柱，在5分钟-约5小时内输注，丸剂，胶囊，透皮贴剂，口含递送等，或其组合。优选一旦检测到或怀疑疾病或疾患后就实施给药并且持续治疗疾病所必需的时间期限，诸如，例如，约1个月-约3个月。治疗期限可以针对每一受治疗者而改变并且可以使用公知标准确定期限。例如，可以将化合物或包含化合物的制剂给予至少2周，优选约1个月-约5年，且更优选约1个月-约3年。
试剂盒/制品
为了用于本文所述的治疗应用，本文还描述了试剂盒和制品。这类试剂盒可以包括载体，包装或分隔以便容纳一个或多个诸如小瓶、管等的容器的贮存器，容器各自包含用于本文所述方法的各成分之一。合适的容器包括，例如，瓶，小瓶，注射器和试管。容器可以由各种材料，诸如玻璃或塑料构成。
这里提供的制品包含包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员众所周知的。例如，参见美国专利US 5,323,907，5,052,558和5,033,252。药物包装材料的实例包括，但不限于泡罩包，瓶，管，吸入器，泵，袋，小瓶，容器，注射器，瓶和适合于选择的制剂和指定给药和治疗方式的任何包装材料。关注作为治疗任何疾病，病症或疾患的各种治疗方法的这里提供的化合物和组合物的各类制剂。
例如，容器可以包括本文所述的一种或多种AM制品和纯化的组合物，任选在组合物中或与如本文披露的与另一种活性剂组合药物中。容器任选具有无菌入口(例如，容器可以为静脉内溶液袋或带有皮下注射针头可插入的塞的小瓶)。这类试剂盒任选包含化合物与鉴定说明书或标记或涉及在本文所述方法中的应用的说明书。
试剂盒一般可以包括一种或多种另外的容器，它们各自具有从本文所述的AM制品和纯化的组合物的商品和使用者观点来看需要的各种物质中的一种或多种(诸如试剂，任选浓缩形式，和/或装置)。这类物质的非限制性实例包括，但不限于缓冲剂，稀释剂，过滤剂，针头，注射器；载体，包装，容器，小瓶和/或管，列出内含物和/或使用说明书的标签和具有使用说明的包装插页。一般还包括一组说明书。
标签可以位于容器上或贴在其上。标签可以位于容器上，此时构成标签的字母，数字或其它符号贴在，模塑在或蚀刻在容器自身上；标签可以贴在容器上，此时它存在于也容纳容器的贮存器或载体内，例如为包装插页。标签可以用于指示用于具体治疗应用的内含物。标签还可以指示内含物在诸如本文所述方法中的使用指导原则。
在某些实施方案中，可以将药物组合物制成药包或配药器，它们可以包含一种或多种包含本文提供的化合物的单位剂型。例如，药包可以包含金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或配药器中可以附带有给药说明书。药包或配药器中还可以附带有贴在容器上的由管理部门开据形式的注意事项，它涉及药物的生产，使用或销售，该注意事项反映出用于人或兽给药的药物形式得到管理部门批准。例如，这类注意事项可以为美国食品与药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准的有关处方药的标签或批准的产品插页。还可以制备包含在相容性药用载体中配制的本文提供的化合物的组合物，将其放入适当的容器并且标记用于治疗所示的疾患。
治疗方法
本文所述的AM制品和纯化的组合物具有许多用途，包括研究和临床应用。基于本文所述的结果，可以将本文所述的AM制品和纯化的组合物施用于组织或细胞，以便获得所需的生理学调节。可以将本文所述的AM制品和纯化的组合物进一步加入到细胞培养物或组织培养物中以便获得所需作用(如本文所述)。
本文所述的AM制品和纯化的组合物抑制TGF启动子活性
本文所述的AM制品和纯化的组合物的抗瘢痕形成，抗炎和抗血管形成活性通过如本文所述抑制TGF-β1启动子活性得以证实。冷冻羊膜的胎部分具有显著高于新鲜羊膜的抗瘢痕形成作用；冷冻羊膜的胎盘部分也具有显著高于新鲜羊膜的抗瘢痕形成作用(实施例1)。因此，冷冻AM，无论是胎盘还是胎部分均显示比新鲜AM更有效的在TGF-β中的抑制作用。获自冷冻AM的总AM提取物介导的这种抑制作用在0.4-125μg/ml范围内为剂量依赖性的。此外，这类抑制作用不能被单独的高MW HA取代(超过100X等量AM提取物)并且在用透明质酸酶消化后消失，认为它由HA-IαI的复合物介导。以低速或高速离心不会显著影响这一抑制作用。然而，随后的冻干和再溶解产生了更有效的抑制作用。另外，对AM的总抑制作用比AM胶冻更有效。
TGF-β为涉及组织炎症以及伤口愈合和瘢痕形成的原型细胞因子。参见Border等，J.Clin.Invest.，90：1-7(1992)；Grande，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，214：27-40(1997)；Jester等，Prog.Retin.Eye Res.，18(3)：311-356(1999)；和Marek等，Med.Sci.Monit.，8(7)：RA145-151(2002)。哺乳动物细胞表达三种不同的TGF-βs：TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。TGF-β为最有效的促进成肌纤维细胞分化的细胞因子，通过增量调节许多细胞类型，包括成纤维细胞中α-SMA，整联蛋白α5β1和包含EDA结构域的纤连蛋白(Fn)的表达来进行。参见Tseng等，Ocular Surface J.，2(3)：177-187(2004)；Ronnov-Jessen等，Lab.Invest.，68：696-707(1993)；Verbeek等，Am.J.Pathol.，144：372-82(1994)；Hales等，Curr.Eye Res.，13：885-90(1994)；Jester等，Cornea，15：505-16(1996)；Serini等，J.Cell.Biol.，142：873-81(1998)；Grande，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，214(1)：27-40(1997)；和Jester等，Prog.Retin.Eye.Res.，18：311-56(1999)。TGF-β也增量调节诸如胶原蛋白和蛋白聚糖类这类基质成分的表达，减量调节蛋白酶和基质金属蛋白酶并且增量调节其抑制剂。这些作用共同导致细胞-基质相互作用和粘着性增加以及瘢痕组织沉积和形成。参见Tseng等，OcularSurface J.，2(3)：177-187(2004)；Grande，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，214(1)：27-40(1997)；Jester等，Prog.Retin.Eye.Res.，18：311-56(1999)；和Lawrence，Eur.Cytokine Netw.，7：363-74(1996)。
TGF-βs通过结合细胞膜上的TGF-β受体(TGF-βRs)发挥其作用。在人细胞中，存在三种TGF-βRs，即TGF-βR I型(TGF-βRI)，II型(TGF-βRII)和III型(TGF-βRIII)。用作配体的TGF-βs结合丝氨酸，TGF-βRI和TGF-βRII构成的苏氨酸激酶受体复合物；这类结合得到非丝氨酸，苏氨酸激酶受体的TGF-βRIII促进。参见Tseng等，Ocular Surface J.，2(3)：177-187(2004)；和Massague等，Genes和Development.，14：627-44(2000)。结合TGF-βRII活化了TGF-βRI，导致称作Smads的效应物家族直接磷酸化，所述的效应物调节许多参与瘢痕形成的靶基因转录，包括本文所述的那些。参见Tseng等，Ocular Surface J.，2(3)：177-187(2004)；Massague等，Genes and Development.，14：627-44(2000)；和Derynck等，Biochem.Biophys.Acta.，1333：F105-F150(1997)。
可以通过中和针对TGF-β的抗体和调解TGF-β介导的信号传导的试剂，诸如核心蛋白聚糖来抑制TGF-β。参见Shahi等，Lancet，339：213-214(1992)；Petroll等，Curr.Eye Res.，1739：736-747(1998)；Yamaguchi等，Nature，346(6281)：281-284(1990)；和Logan等，Exp.Neurol.，159：504-510(1999)。大部分文献已经证实抑制TGF-β在调节TGF-β活化，结合其受体或其信号转导水平上得以实现。已经证实羊膜可以在转录水平上实现这类抑制，即切断TGF-β基因转录。特别地，已经证实羊膜抑制人角膜和缘成纤维细胞和人结膜和翼状胬肉体成纤维细胞中的TGF-β信号传导。参见Tseng等，J CellPhysiol.，179：325-335(1999)；和Lee等，Curr.Eye Res.，20(4)：325-334(2000)。
本文所述的AM制品和纯化的组合物的应用可以用于降低TGF-β产生或活性。如实施例1中详细描述的制备几种类型的AM组合物，诸如AME(总人AM提取物)，离心后的AME上清液，AM胶冻和AM基质。检验了各种缓冲液，诸如PBS，低盐缓冲液，高盐缓冲液和胍HCl对TGF-β活性的作用。另外，检验了各种冷冻-研磨方法对TGF-β活性的作用。
透明质酸酶消化后失去了对TGF-β活性的抑制，从而表明这种抑制作用可以由HA-相关复合物介导(图3)。通过添加HA无法恢复这种抑制作用。离心步骤无法改变对TGF-β活性的抑制，无论是在AME还是在AM胶冻提取物中(图5)。冻干增强了AME和胶冻提取物对TGF-β活性的抑制(图6)。图8和图9表明胶原蛋白和HA在加入到AME中时可以增强对TGF-β活性的抑制。因此，将胶原蛋白和HA添加到基于AM的组合物中可以用于治疗涉及TGF-β的各种疾病。
正如本文说明的，用披露的组合物减量调节TGF-β。因此，本文所述的组合物可以用于治疗涉及TGF-β减量调节的各种疾病，诸如血管发生，伤口愈合和组织炎症。
本文所述的AM制品和纯化的组合物可以预防细胞凋亡
本文所述的AM制品和纯化的组合物可以用于预防，减少或治疗组织中的细胞凋亡。在某些实施方案中，本文所述的AM制品和纯化的组合物可以减少或预防已经受损组织中的细胞凋亡。这种抗-细胞凋亡作用表明这些组合物可以用于延长植入前保存的器官寿命。这些组合物还可以用于治疗或预防外科手术过程中和之后的损害。实施例3使用眼损害的鼠模型证实了AM提取物的抗-细胞凋亡作用。采集小鼠眼并且通过酶处理或机械损伤造成损害，给予AM提取物并且使用测量对核的细胞凋亡损害的测定法测定对细胞损害的作用。发现与AM提取物培养可降低细胞凋亡水平。
由于AM制品发挥抗-细胞凋亡作用，所以预计AM制品和组合物用于保护植入前的组织(例如角膜)。将AM制品添加到保存的组织中可以有助于减轻因保存过程产生的细胞损害。例如，本文所述的AM制品和纯化的组合物可以用于降低植入或外科手术前保存的组织中发生的降解量。可以将本文所述的AM制品和纯化的组合物与或不与胶原蛋白和/或HA加入到保存介质中。保存的组织，诸如眼，器官，皮肤等可以得益于加入AM组合物时发生的细胞凋亡减少。
一旦采集到了供体组织，一般就将其保存在储藏介质中，直到植入时为止。可以将所述组合物加入到保存介质中以防止细胞凋亡。例如，可以将组合物加入到保存介质中以保护缘上皮干细胞。类似地，可以将包含AM制品的组合物加入到细胞培养基或消化培养基中以防止细胞(例如角膜细胞)凋亡。因为本文所述的研究证实在分散酶消化过程中培养AM制品(分别模拟手术和病理学损伤的处理，诸如在PRK和复发性角膜糜烂中的受激子消融)显著减少了上皮细胞和角膜细胞凋亡，还可以将这些组合物给予接受机械刮术或准分子激光光挥发术的眼，以尝试减少角膜细胞凋亡和由此减轻角膜混浊。作为另一个实例，还可以将包含AM制品的组合物用于手术疾患或疾病，诸如复发性角膜糜烂或基膜溶解的圆锥形角膜，以便减少角膜细胞凋亡。
本文所述的AM制品和纯化的组合物可以预防或逆转瘢痕形成和可以用于辅助伤口愈合
在成年人和其它哺乳脊椎动物中，组织，诸如皮肤中的伤口愈合一般为修补性过程，与在胎和胚胎组织愈合中发生的再生过程相反。伤口修复过程的结果似乎受许多不同因素的影响，包括内在参数，例如组织氧合；和外在参数，例如伤口敷料。然而，存在大量证据证实在成年人和其它哺乳动物中，伤口损害组织的愈合和修复的总过程，包括必须的细胞通讯以协调的方式受到大量特异性可溶性生长因子调节，它们在伤口环境内释放并且其中似乎诱导新生血管形成，白细胞趋化性，成纤维细胞增殖，迁移和胶原蛋白和其它胞外基质分子在伤口内沉积。这类已经得到鉴定和分离的生长因子一般为专用可溶性蛋白或多肽类，并且包括转化生长因子α(TGF-α)，转化生长因子β(TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3等)，血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，胰岛素样生长因子I和II(IGFI和IGFII)和酸性和碱性成纤维细胞生长因子(酸性FGF和碱性FGF)。
成肌纤维细胞为平滑肌细胞与成纤维细胞之间的表型中间体。成肌纤维细胞在大部分器官和组织中的形态发生和癌发生，炎症，伤口愈合和纤维化中起重要作用。在正常伤口愈合过程中，成纤维细胞迁移至伤口区域并且在生长因子，诸如TGF-β1影响和在指定组织中发生的机械应力下分化成成肌纤维细胞。一般而言，成肌纤维细胞因消退期中细胞凋亡而逐步消失。然而，在某些病理学情况下，成肌纤维细胞持续和连续重塑胞外基质，从而导致瘢痕形成。因此，控制成肌纤维细胞分化的能力可以用于预防伤口愈合过程中的各种组织的瘢痕形成。本文所述的AM制品和纯化的组合物能够预防和逆转瘢痕形成并且由此可以用于治疗可能发生瘢痕形成的任何疾病。
在某些实施方案中，本文所述的AM制品和纯化的组合物可以减少或预防瘢痕组织形成。这种作用在实施例4中得以证实。在塑料，胶原蛋白或AM组织表面材料上培养AMSCs。在塑料上培养的AMSC在体外快速分化成成肌纤维细胞。然而，这些分化的成肌纤维细胞在AM基质上传代培养时可以逆转为AMSCs(图23)。在将羊膜基质提取物加入到分化的成肌纤维细胞中时也可以观察到成肌纤维细胞分化的逆转(图25)。此外，还发现AM基质提取物预防AMSCs的成肌纤维细胞分化(图26)。
因此，本文所述的AM制品和纯化的组合物可以用于预防或逆转由任何方式导致的瘢痕形成。可以给予这些组合物以便治疗皱纹，牵张痕，手术疤痕，伤口疤痕，因烧伤或机械损伤产生的疤痕等。
本文所述的AM制品和纯化的组合物可以用于治疗或预防因伤口导致的瘢痕形成。伤口为因诸如机械这类物理方式，化学，病毒，细菌，真菌和其它病原生物体或热方式导致的体内和体外损伤或损害，它们可破坏组织结构的正常连续性。伤口可以因意外伤害，手术，致病生物体或外科手术导致。
另外，本文所述的AM制品和纯化的组合物可以抑制成纤维细胞迁移。正如实施例5和图27-29中所示，发现AME抑制成纤维细胞迁移。在补充了AME的SHEM或SHEM中培养人缘外植块(HLE)以便研究AME的生物活性。AME(在25μg/ml下)延缓了上皮从缘外植块向外生长发作。AME抑制了外植块成纤维细胞从基质迁移，导致具有少得多的成纤维细胞的上皮层向外生长。此外，在包含AME的SHEM中扩充的上皮层具有平滑的边缘，这是在含有10μM SB203580-MAPK p38抑制剂的SHEM中培养HLE时类似的现象。在向外生长后剩余的外植块的组织切片显示如果不使用AME，那么基质的溶解就会显著增加。因此，AME能够通过防止基质裂解而抑制成纤维细胞迁移。这些发现表明AME可以用于研发新产品，以便以定向的人角膜干细胞扩充和抗炎症，瘢痕形成和血管发生的方式促进伤口愈合。
本文所述的AM制品和纯化的组合物可以在手术过程中或之后使用，以便改善愈合并且减少因对组织的机械损伤导致的组织损害数量。本文所述的组合物和方法的适当应用是广泛的并且包括，但不限于所有类型的手术，诸如整形，脊髓或剖腹产术；疾病，诸如癌症，充血性心力衰竭和肾疾病；和作为烧伤，痤疮或其它损伤结果的疾患。临床医师可以在重建或整形手术中使用本文所述的方法。本文所述的AM制品和纯化的组合物还可以局部施用于身体表面或组织以便获得短期和长期治疗作用。
本文所述的AM制品和纯化的组合物可以用于治疗或预防因眼病导致的损害。可以通过给予本文所述的AM制品和纯化的组合物治疗的疾病类型包括，但不限于干眼，角膜损伤，角膜溃疡，斯耶格伦综合征，因隐形眼镜导致的损害，真菌感染，病毒感染或细菌感染，机械损伤，手术损伤，烧伤损害，结膜炎，眼类天疱疮，斯-约综合征，化学损伤等。
本文所述的AM制品和纯化的组合物还可以用于治疗表皮疾病。可以通过给予本文所述的AM制品和纯化的组合物治疗的表皮疾病类型包括，但不限于真菌病，病毒病，细菌病，疹，湿疹，牛皮癣，鱼鳞癣，表皮角化过度等。
血管发生-相关疾病的治疗和预防
如本文所述，使用由超低温保存的AM的无血管基质制备的可溶性蛋白质提取物证实本文所述的AM制品和纯化的组合物的抗生成血管活性。发现AM基质提取物(ASE)通过抑制增殖，诱导细胞凋亡，减弱迁移和抑制管形成对培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)具有有效的抗生成血管作用。实施例8证实羊膜基质提取物(ASE)具有抗生成血管特性。发现ASE抑制HUVEC细胞增殖(图34)。还发现ASE诱导HUVEC细胞中的细胞凋亡(图35)。使用跨孔试验证实ASE对VEGF-诱导的细胞迁移的抑制作用(图37)。进一步发现ASE抑制HUVEC细胞的管形成(图38)。
这些结果共同证实本文所述的AM制品和纯化的组合物可以用于治疗血管发生-相关疾病。可以治疗的典型的血管发生-相关疾病包括，但不限于肿瘤生长，癌症和眼科疾患，诸如角膜移植排斥，眼新生血管形成，视网膜新生血管形成，包括损伤或感染后新生血管形成，糖尿病性视网膜病，黄斑变性，晶状体后的纤维增生症，新生血管性青光眼，视网膜缺血，玻璃体出血等。
可以使用本文所述的AM制品和纯化的组合物治疗的典型癌症类型包括，但不限于急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞性白血病，肾上腺皮质癌，AIDS-相关癌，AIDS-相关淋巴瘤，直肠癌，星形细胞瘤，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，膀胱癌，骨癌，脑干神经胶质瘤，脑瘤，乳腺癌，支气管腺瘤，伯基特淋巴瘤，类癌肿瘤，癌，中枢神经系统淋巴瘤，小脑星形细胞瘤，宫颈癌，慢性淋巴细胞性白血病，慢性髓性白血病，慢性骨髓增生病，结肠癌，结肠直肠癌，皮肤T-细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤，食管癌，性腺外生殖细胞瘤，眼癌，眼内黑素瘤，眼癌，视网膜母细胞瘤，胆囊癌，胃肠类癌瘤，胃肠基质瘤(GIST)，胚细胞瘤(颅外)，胚细胞瘤(性腺外)，胚细胞瘤(卵巢)，妊娠滋养层肿瘤，神经胶质瘤，多毛细胞白血病，头颈癌，肝细胞(肝)癌，何杰金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视路神经胶质瘤，眼内黑素瘤，胰岛细胞癌(内分泌胰腺)，卡波西肉瘤，肾(肾细胞)癌，喉癌，白血病(急性淋巴细胞性)，白血病(急性髓细胞性)，白血病(慢性淋巴细胞性)，白血病(慢性髓性)，唇和口腔癌，肝癌，肺癌(非小细胞)，肺癌(小细胞)，淋巴瘤，(皮肤T-细胞)，淋巴瘤(非-何杰金)，骨的恶化纤维组织细胞瘤/骨肉瘤，髓母细胞瘤，黑素瘤，默克尔细胞癌，间皮瘤，具有初级隐藏的转移性鳞状颈癌，多内分泌性腺瘤形成综合征，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，蕈样真菌病，骨髓增生异常综合征，脊髓发育不良/骨髓增生疾病，髓细胞性白血病，髓样白血病，骨髓增生病症，鼻腔和鼻旁窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤/骨的骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞瘤，卵巢低度潜在恶性肿瘤，胰腺癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚瘤，垂体瘤，浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤，胸膜肺母细胞瘤，前列腺癌，直肠癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，涎腺癌，肉瘤(卡波西)，肉瘤(子宫)，塞泽里综合征，皮肤癌(非-黑素瘤)，皮肤癌(黑素瘤)，皮肤癌(默克尔细胞)，小肠癌，软组织肉瘤，鳞状细胞癌，胃(Gastric)癌，T-细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤，甲状腺癌，滋养细胞瘤，Gestational，尿道癌，子宫癌，子宫内膜，子宫肉瘤，阴道癌，视路和下丘脑神经胶质瘤，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，维尔姆斯瘤等。
炎症的治疗
本文所述的AM制品和纯化的组合物可以用于减轻炎症。AM包含许多可以有助于/介导其抗炎能力的因子，诸如白细胞介素-10(IL-10)，转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员，蛋白酶抑制剂和IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)。已知IL-10抑制和抵抗促炎细胞因子，诸如IL-6，TNFα和IL-8。参见Foutunato等，Am.J.Obstet.Gynecol.，175：1057-65(1996)；Foutunato等，Am.J.Obstet.Gynecol.，177：803-9(1997)；和Foutunato等，Am.J.Obstet.Gynecol.，179：794-9(1998)。为TGF-β超家族成员的活化素和抑制素由AM产生。不同剂量的活化素产生不同效果。在低剂量活化素下，刺激IL-6，IL-8和前列腺素E2(PGE2)产生，而在高剂量下，它抑制产生。参见Petraglia等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，77：542-8(1993)；Riley等，Hum.Reprod.15：578-83(2000)；和Keelan等，Placenta，31：38-43(2000)。AM还包含可以起抗炎作用的蛋白酶抑制剂，诸如α1抗-胰蛋白酶。参见Na等，Trophoblast Res.，13：459-66(1999)。IL-1RA为IL-1的抑制剂且由此抑制IL-1介导的炎症。参见Romero等，Am.J.Obstet.Gynecol.，171：912-21(1994)。本发明者已经证实AM减量调节IL-1表达和产生并且增量调节IL-1RA。参见Tseng等，Ocular Surface J.，2(3)：177-187(2004)。
活化的巨噬细胞在启动，维持和分辨宿主炎症反应中起重要作用。除杀伤病毒，细菌和寄生虫并且起清除细胞作用外，巨噬细胞还通过产生过量自由基，裂解酶和炎性细胞因子，共同恶化组织损害并且导致与急性和慢性炎症相关的全身症状中的许多对宿主起有害作用。
本文所述的AM制品和纯化的组合物可以抑制产生炎性作用的巨噬细胞，如实施例6和如图30-33中所示。将小鼠巨噬细胞细胞系Raw 264.7用作测试在活化或不活化IFNγ下的抗炎作用的模型。超低温保存的羊膜(AM)抑制Raw264.7细胞，尤其是在刺激IFNγ下产生NO。此外，与在塑料上培养细胞相比，在AM上培养细胞时，PGD2产生比PGE2更有利。抗炎作用指数PGD2与PGE2之比在AM上培养的细胞中显著高于在塑料上培养的细胞中。
上述抗炎作用与抑制TGF-β信号传导相关，因为抑制Raw264.7中的TGF-β1启动子活性在AM上培养时显著高于在塑料上培养时。此外，添加125μg/ml AME诱导Raw264.7细胞的细胞死亡。这些结果共同表明本文所述的AM制品和纯化的组合物可以抑制巨噬细胞，从而产生抗炎作用。
因此，本文所述的AM制品和纯化的组合物可以用于治疗与组织炎症相关的疾病。炎性病症的特征一般在于疼痛(痛，来自有毒物质生成和神经刺激)，热(灼热，来自血管扩张)，发红(红，来自血管扩张和血流增加)，肿胀(肿块，来自流体过度流入或受限的流出)和功能缺失(功能丧失，可以为部分或完全的，暂时或永久的)体征中的一种或多种。炎症有许多形式并且包括，但不限于如下一种或多种的炎症：急性，粘连，萎缩，卡他性，慢性，硬变，弥散，播散，渗出性，含纤维的，纤维的，病灶性，肉芽肿的，增生的，肥大的，间质性，转移性，坏死性，闭塞性，实质性的，整形的，产生性的，增殖性的，假膜的，化脓性，致硬化的，浆液纤维蛋白性的，浆液的，单纯的，特异性的，亚急性的，化脓性的，中毒的，创伤性的，溃疡性的等。
可以用本文所述的AM制品和纯化的组合物治疗的典型炎性病症包括，但不限于关节炎(包括类风湿性关节炎，脊椎关节病(spondyloarthopathies)，通风性关节炎，变性关节病(即骨关节炎)，系统性红斑狼疮，斯耶格伦综合征，强直性脊柱炎，分化不良型的脊柱炎，贝切特病，溶血性自身免疫性贫血，多发性硬化，肌萎缩性侧索硬化，淀粉样变性，急性痛性肩，牛皮癣和青少年关节炎)，哮喘，动脉粥样硬化，骨质疏松症，支气管炎，腱炎，滑囊炎，皮肤炎性病症(即牛皮癣，湿疹，烧伤，皮炎)，遗尿症，嗜曙红细胞病，胃肠道病症(包括炎症性肠病，消化性溃疡，区域性肠炎，憩室炎，胃肠道出血，克罗恩病，胃炎，腹泻，肠易激综合征和溃疡性结肠炎)，胃食管反流病，嗜酸性急性食管炎，胃轻瘫，诸如糖尿病性胃轻瘫；食物耐受不良和食物过敏和其它功能性肠病，诸如非-溃疡性消化不良，非心源性胸痛等，
本文所述的AM制品和纯化的组合物还可以用于治疗，例如，与如下疾病相关的炎症：血管疾病，偏头痛，紧张性头痛，结节性多动脉炎，甲状腺炎，再生障碍性贫血，何杰金病，scierodoma，风湿热，I型糖尿病，重症肌无力，结节病，肾病综合征，贝切特综合征，多肌炎，牙龈炎，超敏反应，结膜炎，多发性硬化和局部缺血(例如心肌缺血)等。所述的化合物可以用于治疗与脑病症(例如帕金森病和阿尔茨海默病)相关的肾炎和与颅放射性损伤相关的慢性炎症。这些化合物可以用于治疗急性炎症疾患(诸如因感染导致的疾患)和慢性炎症疾患(诸如因哮喘，关节炎和炎症性肠病导致的疾患)。这些化合物还可以用于治疗与创伤和非炎性肌痛相关的炎症。
在下列实施例中进一步详细提供本文所述的组合物和方法。提供这些实施例作为例证，但无论如何不用来限定本发明。
实施例
实施例1：各种羊膜制品的抑制活性
透明质酸酶消化
将由冷冻AM制备的AM总水溶性提取物(AME)与或不与10个单位/ml透明质酸酶(Sigma#H1136)混合在反应缓冲液中(补充了上述蛋白酶和磷酸酶抑制剂的50mM HEPES，pH7.5，0.1M NaCl，1％Triton X-100，0.1％BSA)在37℃下2小时，使用纯化自人脐带的高MW HA作为阳性对照(cat#H1876，Sigma)。
细胞培养和TGF-β1启动子抑制
当在100mm塑料平皿中的DMEM/10％FBS中培养的人角膜成纤维细胞达到80％汇合率(～1.0×106个细胞)时，用DMEM/10％FBS将细胞洗涤两次。将腺病毒-TGF-β1启动子-荧光素酶(MOI＝37.5)和腺-CMV-β-gal(MOI＝30)加入到含有10ml新鲜DMEM/10％FBS的培养平板中并且将细胞在37℃下孵育4小时且使用4ml预热的胰蛋白酶/EDTA进行胰蛋白酶消化5分钟。在使用8ml DMEM/10％FBS中和胰蛋白酶/EDTA活性后，将细胞收集入15ml试管并且以1,500rpm(～600xg)离心5分钟。在滗析培养基后，将细胞重新悬浮于15ml DMEM/10％FBS中并且通过锥虫蓝染色测定细胞存活率。将存活的3×104个细胞接种在塑料24孔或AM插入片段(inserts)的基质表面上。总计准备4个孔或插入片段。然后将细胞在37℃下和CO2培养箱内孵育48小时。
在从各孔中谨慎除去生长培养基后，用0.5ml PBS将细胞冲洗至少两次，当心不要移出附着细胞。在尽可能多地除去孔中的PBS后，加入100μl1x裂解缓冲液以便覆盖细胞并且以机械刮取细胞并转入微量离心管，置于冰上。通过在室温下涡旋10-15秒并且以12,000xg离心15秒收集细胞裂解物。将称作细胞裂解物的上清液储存在-80℃下，此后测定荧光素酶活性。
用不同AM提取物抑制TGF-β1启动子活性
在图1中，与塑料对照组(PL)相比，冷冻羊膜的胎盘部分和胎部分(分别为FRO/P和FRO/F)均显示对TGF-β1启动子活性的显著抑制(各P＜0.01)。就新鲜胎盘而言，羊膜的胎盘部分(FRE/P)还显示对TGF-β1启动子活性的显著抑制(P＜0.05)。然而，新鲜羊膜的胎部分(FRE/F)未显示任何抑制作用(P＝0.5)。这些结果表明新鲜羊膜的胎部分不具有与冷冻羊膜的胎部分相同的抗瘢痕形成作用。就冷冻羊膜而言，胎盘部分(FRO/P)的抑制作用与胎部分没有显著性差异(P＝0.3)。就新鲜羊膜而言，胎部分(FRE/F)的抑制作用与胎盘部分(FRE/P)没有显著差异(P＝0.1)。就胎盘部分而言，冷冻羊膜(FRO/P)的抑制作用明显优于新鲜羊膜(FRE/P)(P＜0.05)。然而，在胎部分中，冷冻羊膜(FRO/F)的抑制作用与新鲜羊膜(FRE/F)的抑制作用无显著差异(P＝0.1)。
TGF-β1启动子活性的抑制为剂量依赖性的并且在使用透明质酸酶消化后消失
由冷冻AM制备的总水溶性AM提取物对TGF-β1启动子活性的抑制满足0.04-125μg/ml的剂量响应曲线(图2)。正如TGF-β1和TGF-βRII的启动子活性所示，在用透明质酸酶预处理时，由冷冻AM制备的25μg/ml总水溶性AM提取物的抑制作用消失，表明这类抑制作用由HA-相关复合物介导(图3)。应注意25μg/ml的AM提取物包含低于0.78μg/ml的HA。
因透明质酸酶失去的抑制作用不能通过添加HA而恢复
尽管单独的100μg/ml高MW HA显示适度的抑制活性，但其大小仍然显著低于25μg/ml的AM提取物。这些数据共同表示AM提取物的抑制作用由HA-相关复合物，即HA-IαI复合物介导。
离心后得到的可溶性AME和胶冻提取物不改变对TGF-β1启动子活性的抑制作用
与PBS对照组相比，HA，AM(总，低速，高速)和胶冻(总，低速，高速)在使用β-半乳糖苷酶(galatosidase)活性校准(normalized)时显示对TGF-β1启动子活化的抑制。P值显示因对照组中的变化而没有统计学显著性(数据未显示)。通过比较总AME和两种条件的离心可溶性AME，结果表示不存在显著性差异。然而，未离心的AME显示比低或高可溶性AME低的抑制作用。同样，胶冻/T显示比胶冻/HS低的TGF-β抑制活性(图5)。
冻干增强了AME和胶冻提取物的抑制作用
人角膜成纤维细胞在对照组，单独的HA和低浓度AME或胶冻提取物中未显示细胞形态改变(数据未显示)。然而，在使用高浓度的AME和L/AME处理后，早至接种后18小时，细胞显示显著改变成细长和小细胞(图6)。此外，细胞密度也下降。上述改变甚至在冻干的AME或L/AME中也分别比其在AME或胶冻提取物中的非-冻干相应物中显著(图6)。
为了检验TGF-β启动子在AME处理过程中是否得到抑制，进行荧光素酶测定。将β-半乳糖苷酶用作转染对照物。结果表明AME-125，L-AME-25，L-AME-125，L-胶冻-125在抑制TGF-β1启动子活性方面显示显著性差异，抑制百分比分别为86％(P＜0.01)，55％(P＜0.1)，95％(P＜0.01)和46％(P＜0.1)(图7)。数据显示AME或胶冻(Jelly)在125μg/ml高浓度下的冻干形式比未-冻干AME形式更为有效。尽管最低浓度的商品HA(4μg/ml)与HA在AME/125中的浓度(3.8μg/ml)接近，但在AME/125中的有效抑制远比HA更有效(数据未显示)。此外，AME形式完全解释了TGF-β优于胶冻形式的抑制作用。
混合了胶原蛋白凝胶或HA的AM提取物对TGF-β1启动子活性的抑制
随后制备天然1型胶原蛋白凝胶和水溶性AM提取物的混合物。为了制备该混合物，首先通过用0.1N乙酸稀释由大鼠尾腱制备的4mg/ml胶原蛋白储备溶液(BD Biosciences，San Jose，CA)并且将其与1/20体积比的20XDMEM和1N的NaOH混合制备胶原蛋白凝胶。胶原蛋白凝胶在37℃下孵育后形成。接下来，用DMEM将水溶性AM提取物(如本文所述制备)稀释至25μg/ml浓度且然后与胶原蛋白凝胶混合。在与添加单独的BSA的对照物比较时，1型胶原蛋白凝胶中混合的AM提取物的抑制作用与单独使用的AM提取物(AME)的抑制作用类似(图8，p＜0.01)。尽管单独的胶原蛋白凝胶(Col)在与塑料对照物相比时也显示类似的抑制活性(图8，p＜0.01)，但是在胶原蛋白凝胶中添加AME(Col+AME)导致进一步抑制(图8，p＜0.01)。当将水溶性AM提取物(AME)混合在HA凝胶中时，对TGF-β1启动子活性的抑制作用与单独HA相比更明显(与BSA混合作为对照物)(图5，p＜0.01)，与单独AME相似(图9)。因此，AM提取物组合物或其与胶原蛋白组合可以用于抑制眼组织中的TGF-β活性。
实施例2：羊膜成分的表征
材料和方法
用BCA蛋白质测定试剂盒对每种提取物中的蛋白质浓度进行测定(Pierce，Rockford，IL)。使用基于ELISA的透明质酸(HA)定量测试试剂盒(Corgenix，Westminster，CO)，应用HA的系列稀释液制备的制造商提供的标准曲线测定每种提取物中透明质酸(HA)的浓度。
通过透明质酸酶消化的HA分子量范围分析
通过琼脂糖凝胶电泳，按照Lee和Cowman所述的方法分析提取物的HA分子量范围(Lee H.G.和Cowman，M.K.An Agarose Gel ElectrophoreticMethod for Analysis of Hyaluronan Molecular Weight Distribution.AnalyticalBiochemistry，1994，219，278-287)。对样品进行0.5％琼脂糖凝胶电泳，随后使用在50％乙醇中的0.005％Stains-All(Sigma，cat#23096-0)染色。在室温下避光覆盖下将凝胶染色过夜(3-4小时的较短染色时间也可以产生可接受的结果)。在通过将凝胶转至H2O上脱色并且使其接触室内光约6小时后HA显示为蓝色带。分子量标准物包括MW范围在0.9-5.7×106的λDNA-BstE II消化的限制片段(cat#D9793，Sigma)。通过在37℃下将提取物与或不与约10个单位/ml透明质酸酶(Sigma#H1136)在反应缓冲液(补充了上述蛋白酶和磷酸酶抑制剂的50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1M NaCl，1％Triton X-100，0.1％BSA)中培养2小时进一步验证HA的可靠性，使用纯化自人脐带的高MWHA(cat#H1876，Sigma)作为阳性对照。
蛋白质印迹分析
将上述提取物在4-15％变性丙烯酰胺凝胶上电泳并且转入硝化纤维膜且然后使用家兔抗-人间-α-胰蛋白酶抑制剂(家兔多克隆抗体(cat#A0301，DAKO于1∶1000)，家兔抗-人TSG-6多克隆抗体(由Dr.Tony Day提供，以1∶1000稀释)，大鼠单克隆抗-PTX3抗体(Alexis Biochemicals，ALX-804-464，1μg/ml)，获自Calbiochem(Cat#BA24)的抗-血小板反应蛋白-1抗体和山羊抗-人Smad 7抗体(AF2029，1∶1000，R&D Systems)进行免疫印迹分析。用Western LightingTMChemiluminesence Reagent(PerkinElmer)检测免疫反应蛋白带。
结果
实验证实当在90℃下将水溶性AM提取物预加热10分钟时，对TGF-β1启动子活性观察到的抑制作用消除，表示起作用的成分很可能包含蛋白质，其中构象是重要的。
AM提取物中HA和蛋白质的定量测定
下表中概括的结果表明所有的AM和胶冻提取物均包含HA和蛋白质。一般而言，在离心AM后蛋白质与HA的重量比在总提取物中高于上清液(例如PBS为L和H且缓冲液A为A)，表示大部分包含蛋白质的物质被离心去除。然而，这种趋势在AM胶冻中并不显著，表示与胶冻相比AM提取物包含较多的蛋白质(参见PBS中的T和A/B/C中的T)。就AM和AM胶冻而言，蛋白质与HA之比从提取物A增加至提取物B和C，进一步支持了HA主要存在于可溶性形式中并且反之亦然，在水不溶性成分中发现了更多的蛋白质。此外，在A/B/C中离心后从AM胶冻中除去了大部分HA。
[注]：T：总，L：低速离心总提取物后的上清液，H：低速离心总提取物，A，B，C后的上清液：提取物，参见正文。
不同AM提取物中的HA具有高于1百万道尔顿的分子量
高分子量(＞106道尔顿)的HA存在于总提取物和提取物A中(图10)。然而，甚至更高MW的HA存在于提取物B中，而在提取物C的窄带中发现了具有甚至更高MW的HA(图10)。所有包含HA的成分在透明质酸酶消化后均消失，证实它们实际上包含HA。与获自Sigma(cat#H1136)的HA的阳性对照相比，在低速和高速离心后获得的上清液中也均发现了类似高分子量(＞106道尔顿)的HA(图11)。再次，这些包含HA的带在透明质酸酶消化后消失。对AM胶冻获得了类似的结果(未显示)。
间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)存在于不同AM提取物中且其重链(HCs)与HA共价连接
图12表示使用透明质酸酶消化前，游离重链存在于不同复合物中并且还存在少量轻链(UTI或bikunin)。然而，在所有提取物，即总提取物和提取物A，B和C中，也存在HA与IαI重链共价连接复合物，因为后者仅在透明质酸酶消化后释放。在通过两种不同速度离心获得的提取物H和L中获得了相同的结果(图13)。
肿瘤坏死因子-刺激基因6(TSG-6)也存在于AM提取物中
图14显示TSG-6(～38kDa)存在于总提取物，提取物A和提取物C中。在提取物A中，存在迁移至接近纯化TSG-6(35kD)的～38kDa带。～45和55kDa其它带的鉴定是未知的。总AM提取物(不进行离心)“T”显示存在两个带(均高于35kD)，较高的带(55kD)在提取物A(离心后)中，而在提取物C中存在一个较低的带(45kD)。在用透明质酸酶(图14)或用F-糖苷酶(图15)处理样品时，所有这些带均未显著改变。然而，使用抗体RAH-1(图16)，用硫酸软骨素ABC裂解酶消化产生更明显的38kD带，而使用抗体MAB2104不产生这种情况(图17)。
五聚环蛋白(PTX-3)仅存在于水溶性AM提取物中并且与HA形成复合物
图18表示PTX3还可以存在于AM提取物中并且仅与水溶性提取物A中的HA复合。
血小板反应蛋白(TSP-1)存在于不同AM提取物中
图19显示所有AM提取物均具有TSP-1的高分子量带，而总提取物(T)和提取物C也具有35-120kDa的某些带。透明质酸酶消化不会改变反应模式，只是某些带稍变强或弱。
Smad7大部分存在于水不溶性AM提取物中
在AM的PBS提取物和尿素提取物中存在Smad 7(图20)。
实施例3：水溶性AM提取物预防储存和机械和酶方式导致的损伤诱导角膜上皮细胞(基底细胞和角膜细胞)的细胞死亡
结果
为了证实AM提取物可以预防受损组织中的细胞凋亡，使用鼠模型进行下列实验。摘出总计22只小鼠眼球，将其中的2个即刻包埋在OCT中用于冷冻切片，作为预处理的对照物。将剩余的20只眼球再分成3个亚组，即1)机械刮取(n＝8)；2)处理消化(酶促)(n＝6)和；3)不进行处理的对照(n＝6)。就每个组而言，在4℃下将等数量的眼球在有(+)或没有(-)125μg/ml AM提取物存在下的含有确定补充(Gibco，Carlsbad，CA)的不含角膜细胞血清的培养基(KSFM)中预孵育24小时，此后进行处理。在KSFM+/-AM提取物(如本文所述制备的)中的前24小时培养结束时，用手术刀片对第1亚组中的8只眼球进行机械刮取并且进一步分成2个组(每个组n＝4)且在37℃下的KSFM+/-AM提取物中孵育。在4℃下用10mg/ml分散酶II在KSFM+/-AM提取物中对第2亚组中的6只眼球进行酶消化(每组n＝3)18小时。将来自每个组的1只眼球包埋在OCT用于冷冻切片。将来自每个组的剩余2只眼球在KSFM+/-AM提取物中再孵育24小时，此后进行分析。就未处理的对照组而言(n＝6)，将3只眼球在37℃下的KSFM+/-AM提取物中连续培养2天；在第一天结束时取出1只眼球，而在2天结束时取出2只眼球。
将来自这些眼球的冷冻切片进行TUNEL染色。简言之，使用获自Promega(Madison，WI)的DeadEndTM荧光TUNEL系统，按照制造商的说明进行末端脱氧核苷酰基转移酶-介导的FITC连接的dUTP切下的末端DNA标记(TUNEL)测定。在室温下将切片固定在4％甲醛中20分钟并且用1％Triton X-100渗透处理。然后在37℃下将样品与外源性TdT和荧光素-缀合的dUTP一起孵育60分钟以便修复切下的3′-羟基DNA末端。用作为阳性对照的DNase I处理细胞，同时将阴性对照与缺乏rTdT酶的缓冲液一起孵育。用绿色荧光标记细胞凋亡核并且用DAPI将核复染为红色荧光。
通过制备水溶性AM提取物的方法制备AM提取物的水溶性形式。BCA测定法(Pierce，Rockford，IL)用于对AM提取物中的总蛋白质定量测定。
正常小鼠眼球仅在KSFM中孵育前显示在未损伤的对照组角膜上皮浅层中最少量的细胞凋亡；在基质角膜细胞中未发现细胞凋亡。然而，在4℃下KSFM中孵育24小时后，在浅层基质角膜细胞中存在适度的细胞凋亡增加。用AM提取物抑制这类角膜细胞凋亡增加。
还证实AM提取物减少对细胞机械损害后的细胞凋亡。在机械刮取后，小鼠眼球显示角膜细胞凋亡的显著增加。然而，在使用机械刮取后与AM提取物孵育导致角膜细胞凋亡减少。
还以酶促方式处理小鼠眼球以便损害细胞。在4℃下KSFM中进行分散酶消化18小时不仅在角膜细胞中，而且在上皮细胞中导致大量细胞凋亡；就后者而言，发现细胞凋亡不仅存在于浅表上皮细胞中，而且存在于基底上皮细胞中。上皮细胞和角膜细胞凋亡程度远高于在机械刮取后注意到的细胞凋亡程度。在分散酶消化过程中AM提取物孵育显著减少了上皮细胞和角膜细胞凋亡。这是显著的，因为分散酶处理模拟了可以定向于基底膜的手术(例如PRK中受激子消融)和病理学结果(例如复发性角膜糜烂)。本实验结果证实将AM提取物施用于具有受损细胞的组织可以用于减轻或预防细胞损害。
实施例4：羊膜基质提取物使成肌纤维细胞去分化
材料
Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)，Hank平衡盐溶液(HBSS)，两性霉素B，庆大霉素，胎牛血清(FBS)，0.25％胰蛋白酶/0.53mM EDTA，活与死细胞存活率测定试剂和FITC缀合的鬼笔环肽购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。牛血清清蛋白(BSA)，胰岛素-运铁蛋白-亚硒酸钠培养基补充剂，甲醛，蛋白酶抑制剂混合物，小鼠抗-结蛋白抗体，FITC缀合的抗-小鼠，山羊和大鼠IgG，碘化丙锭和Hoechst-33342染料来自Sigma(St.Louis，MO)。跨孔插入片段来自Corning Incorporated(Corning，NY)。I型胶原蛋白来自BDBiosciences(Bedford，MA)。BCATM蛋白质测定试剂盒来自Pierce(Rockford，IL)。分散酶II和胶原酶来自Roche(Penzberg，Germany)。小鼠抗-αSMA和Ki67抗体来自DakoCytomation(Carpinteria，CA)。家兔抗-波形蛋白抗体来自Abcam(Cambridge，MA)。小鼠抗-EDA纤连蛋白抗体来自Chemicon(Temecula，CA)。HRP缀合的抗-小鼠IgG来自BioRad(Hercules，CA)。抗-褪色固定溶液来自Vector Laboratories(Burlingame，CA)。超低温保存的人AM获自Bio-Tissue(Miami，FL)。
细胞培养
按照赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)处理人组织。新鲜人胎盘获自在IRB-批准方案下得到通知许可后的剖宫产术之后的BaptistHospital(Miami，FL)。用包括庆大霉素和两性霉素B的PBS冲洗2次后，从绒毛膜中以机械方式剥取AM，切成片(～30mm直径)并且在37℃下用在含有10％FBS的DMEM中的10mg/mL分散酶II消化20分钟。此后，通过在解剖显微镜下手术剥离取出羊膜上皮并且用在37℃下在含有10％FBS的DMEM中的2mg/mL胶原酶将剩余的基质进一步消化14小时。通过以800xg离心5分钟收集细胞并且重新悬浮且在37℃下的5％CO2加湿气体下在含有10％FBS的DMEM中，并在其中培养，每2天更换一次培养基。在酶消化前再将AM包埋在O.C.T中用于冰冻切片术。人角巩膜组织获自Florida Lions Eye Bank(Miami，FL)，从其中收集角膜成纤维细胞(HCFs)并且在包含10％FBS的DMEM中培养，将二次传代(P1)细胞用于所有实验。
水溶性AM基质提取物和AM插入片段的制备
使用无菌技术，用HBSS将超低温保存的人AM简单洗涤2-3次以便除去储存介质。用药刀刮出AM基质，冷冻在液氮的气相中并且用BioPulverizer(Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK)研磨成细颗粒，随后在冰上用Tissue Tearor(Biospec Products，Inc.，Dremel，WI)在pH 7.4的PBS中匀浆1分钟。通过旋转使匀浆物混合1小时并且在4℃下以14,000×g离心30分钟。然后收集在PBS中的上清液并且以等分部分储存在-80℃下。将BCA测定法用于定量测定蛋白质浓度。将这种水溶性蛋白质提取物称为羊膜基质提取物(ASE)。为了制备AM插入片段，在使用前即刻融化AM，用HBSS洗涤3次，切成约2.5×2.5cm大小的片并且固定在具有基质侧向上的培养物插入片段上。
免疫染色
在-20℃下将AM的冷冻切片(4-μm)固定在丙酮中10分钟；培养的AMSCs和用AMSCs整装的AM在4℃下固定在4％低聚甲醛中30分钟。用PBS将切片或培养的细胞各自冲洗3次，每次5分钟，且然后在0.2％TritonX-100中孵育10分钟。在用PBS洗涤3次，每次5分钟，并且与2％BSA预孵育以阻断非特异性染色后，将切片或细胞与抗-αSMA(1∶200)，抗-结蛋白(1∶200)和抗-波形蛋白(1∶200)抗体一起孵育1小时。在用PBS洗涤3次各15分钟后，将它们与FITC或德克萨斯红(Texas Red)缀合的二次抗体一起孵育45分钟。为了标记F-肌动蛋白，用FITC缀合的鬼笔环肽以200个单位/mL的浓度将细胞进一步染色15分钟。再进行3次各15分钟的PBS洗涤后，用PI(1∶2000)将核染色1分钟或用Hoechst-33342染色15分钟，然后用荧光显微镜分析。为了对Ki67进行免疫组织化学染色，用0.6％过氧化氢将内源性过氧化物酶活性抑制(block)10分钟。用1％正常山羊血清将非特异性染色阻断30分钟。然后将细胞与抗-Ki67抗体(1∶50)孵育1小时。在用PBS洗涤3次各15分钟后，将细胞与生物素化家兔抗-小鼠IgG(1∶100)一起培养30分钟，随后与ABC试剂一起孵育30分钟。用DAB将反应产物展开5分钟并且在光学显微镜下检验。
蛋白质印迹分析
收集来自塑料，胶原蛋白或AM表面的培养的AMSCs或成肌纤维细胞并且在冷的RIPA缓冲液[50mM Tris·Cl，pH 7.5，150mM NaCl，1％NonidetP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS和蛋白酶抑制剂混合物]中提取。在4％-15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上分离提取自裂解物的等量蛋白质且然后以电泳方式转至硝化纤维素膜。在5％脱脂奶中阻断1小时后，将印迹与αSMA和ED-A纤连蛋白的初级抗体一起培养，使用α-肌动蛋白作为加载对照。用抗-小鼠或抗-家兔辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗体检测特异性结合并且通过增强化学发光法显示。
统计学分析
将上述所有实验重复3次，每次一式三份或更多。使用适当版本的斯氏不配对t-试验比较组平均值。将试验结果报导为双-尾p值，其中将p＜0.05视为具有统计学显著性。将概括数据报导为平均值±S.D。
结果
AMSCs的体内表型
在用分散酶II除去羊膜上皮细胞后，可以在原位观察到AM中的AMSCs。通过相差显微镜，它们显示出树突形态并且通过细突起(thinprocesses)维持胞间接触(图21A)。通过用活与死测定法染色更好地显示了细胞存活率，树突形态和胞间接触(图21B)。AM横切片的免疫染色显示AMSCs不表达α-SMA(图21C)和结蛋白(图21D)。相反，作为阳性对照，脐带间充质细胞显示对α-SMA和结蛋白的强染色(分别参见图21C和21D的插图)。然而，所有AMSCs均表达波形蛋白(图21E)。这些数据共同表明AMSCs在体内具有成纤维细胞表型。
体外AMSCs的快速成肌纤维细胞分化
为了研究AMSCs的体外分化，将胶原酶-分离的AMSCs置于塑料平皿上并且在含有10％FBS的DMEM中以200个细胞/mm2的密度孵育。在4-5天内，细胞呈现典型的成纤维细胞的细胞形状(图22A)并且保持α-SMA阴性(图22E)。然而，某些细胞在1周培养结束时开始增加细胞大小，改变形状(图22B)和表达α-SMA(图22F)。在相同培养基中传代培养至另一塑料平皿后，大部分细胞在第1代1周结束时显示典型的成肌纤维细胞的细胞形状(图22C)并且最终几乎所有细胞均变成成肌纤维细胞形状且在第2代1周结束时具有显著的微丝(图22D)。因此，α-SMA-阳性成肌纤维细胞在1周初级培养时从71.9±3.7％显著增加至第1代培养时的93.9±4.1％和第2代培养时的98.5±1.7％(图22I)。然而，结蛋白的表达在第2代培养时仍然为阴性(数据未显示)。蛋白质印迹分析揭示出AMSCs在体内弱表达ED-A纤连蛋白，但不表达α-SMA。然而，α-SMA和ED-A纤连蛋白表达在初级培养结束时显著增加并且在的第2代时维持(图22J)。这些结果表明AMSCs在这种包含血清的培养基中在塑料上快速分化成成肌纤维细胞。
如果在AM基质上传代培养，那么从AMSCs分化的成肌纤维细胞可以被逆转
在我们的上述研究中，我们已经证实，当在来自初级培养物的AM基质上培养时，AM可以抑制人或小鼠角膜细胞的成肌纤维细胞分化。为了进一步研究AM基质是否还在调节分化的成肌纤维细胞的表型中有效，使从第2代AMSCs分化的成肌纤维细胞在AM基质上传代培养并且与作为对照组的胶原蛋白I-包被的平皿上传代培养的那些比较。在含有10％FBS的DMEM中培养7天后，胶原蛋白I上的AMSCs仍然维持成肌纤维细胞形状(图23A)。相反，接种在AM基质上的细胞显示出圆，纺锤，长和树突形状的混合形状(图23B)。活与死测定证实在胶原蛋白I(图23C)和AM基质(图23D)上的细胞保持100％存活率，但在细胞形状上表现出显著性差异。对鬼笔环肽的免疫染色显示了有强的应力纤维(图23E)，它还在接种在胶原蛋白I上的成肌纤维细胞中包含强α-SMA表达(图23G)。相反，鬼笔环肽染色变弱和有斑点(图23F)且α-SMA染色变模糊，同时将细胞接种在AM基质上(图23H)。蛋白质印迹分析证实在接种在I型胶原蛋白上时，来源于AMSCs的成肌纤维细胞连续表达大量ED-A纤连蛋白和α-SMA(图23I)。相反，在接种在AM基质上时，ED-A纤连蛋白的表达减少并且α-SMA的表达变得无法检测到(图23I)。这些结果共同表明从AMSCs分化的成肌纤维细胞在AM基质上传代培养时仍然可以逆转成成纤维细胞表型。
羊膜基质提取物防止AMSCs的成肌纤维细胞分化和逆转分化的成肌纤维细胞
为了进一步研究上述AM基质的逆转活性是否在水溶性AM基质提取物中得以保持，在包含10％FBS含或不含100μg/ml ASE的DMEM中在塑料上培养初级AMSCs(P0)。结果表明AMSCs在含有或不含有ASE情况下培养4天后维持纺锤成肌纤维细胞形状(分别为图24A和24B)。然而，此时，细胞已经在不含有ASE情况下表达α-SMA(图24E)，而在加入ASE时保持无α-SMA表达(图24F)。当如图2中所示将培养延长至10天时，AMSCs显示伸长的细胞形状并且显著表达包含α-SMA阳性表达(图24G)的鬼笔环肽-阳性应力纤维(图24C)。引人注目的是，AMSCs在有ASE存在下聚集成具有较小核的不同大小的球体(图24D)。基于活与死测定法，这些球形细胞保持存活(数据未显示)。使某些球体从塑料平皿上脱离，但它们在返回DMEM/10％FBS时可以附着新的塑料平皿而产生新的成肌纤维细胞生长(数据未显示)。鬼笔环肽染色未显示出任何应力纤维(图24D)，而在球体中的α-SMA表达较弱(图24H)。这些结果表明ASE确实可以预防AMSCs的成肌纤维细胞分化。
为了检验上述AM基质的逆转活性是否保持在ASE中，我们向包含具有10％FBS的DMEM培养基中的塑料上的第2代AMSCs培养物上添加了100μg/ml ASE 1周。如上所述(图22)，到此时，接近所有的细胞变成具有鳞状形态，应力纤维明显和α-SMA强表达的成肌纤维细胞。添加ASE使细胞恢复至伸长或纺锤形状(图25A)，其中α-SMA表达显著减少(图25B)。蛋白质印迹分析进一步证实EDA纤连蛋白和α-SMA表达在添加ASE后减少(图25C)。这些结果表明AM基质包含可以抑制AMSCs的成肌纤维细胞分化的可溶性因子(如果在先添加的话)，并且可以将分化的成肌纤维细胞逆转成成纤维细胞(如果随后添加的话)。
成肌纤维细胞逆转与细胞增殖无关
为了进一步测定用ASE将上述AMSCs表型从成肌纤维细胞逆转成成纤维细胞是否伴随细胞增殖，我们将培养基从DMEM+10％FBS转换成不含血清的在第3代培养物中的DMEM/ITS，其中如图2中所示，接近所有的细胞变成成肌纤维细胞。在6天观察过程中，对照组培养物中的细胞维持与胞质中明显应力纤维相同的成肌纤维细胞形态(图26A-26D)。然而，在添加了ASE的实验培养物中的细胞从第0天时的较大和扁平形状(图24E)逐步改变成第2天和第4天时的纺锤和伸长形状(分别为图26F和26G)，且最终某些细胞皱缩成第6天时的较小的大小(图26H)。这类因添加ASE导致的显著形态改变伴随表达α-SMA的应力纤维缺失(图26I-26L)。Ki67染色证实P3培养物中DMEM/ITS中的成肌纤维细胞未显示任何细胞增殖，无论是否添加ASE(分别为图26M和26N)。作为对照，P1培养物中的AMSCs在DMEM/10％FBS中的塑料上培养时显示偶然的Ki67-阳性核(图26O)，而在DMEM/10％FBS中的塑料上培养的许多人角膜成纤维细胞显示Ki67-阳性核(图26P)。这些结果强烈支持了如下见解：ASE不仅预防AMSCs的成肌纤维细胞分化，而且将AMSCs的分化的成肌纤维细胞逆转成成纤维细胞，但不影响其细胞增殖。
形态和Smad信号传导的差异和AM基质对TGF-β启动子活性的抑制
用胶原酶新鲜分离的小鼠基质细胞在包含10％FBS的DMEM中的塑料上培养时显示出成肌纤维细胞形态，而在相同培养基中在AM基质上培养时显示出树突形态。免疫染色显示甚至在使用10ng/ml TGF-β1攻击后在含有ITS的DMEM中的AM上培养的树突角膜细胞Smad4的核排斥。相反，细胞百分比从在塑料上培养的13％增加至添加10ng/ml TGF-β1分别3小时和5天后的67％和85％。这些结果表示AM基质抑制Smad-介导的T-TGF-β信号传导，这有助于维持角膜细胞表型。
将在塑料和完整超低温保存的AM(如本文为制备超低温保存的完整AM所述制备的)上培养的小鼠角膜成纤维细胞与TGF-β2启动子-荧光素酶+CMV-β-半乳糖苷酶或TGF-βRII启动子-荧光素酶+CMV-β-半乳糖苷酶共转染48小时。检测细胞提取物的荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。TGF-β2和TGF-βRII的启动子活性的相对荧光素酶单位在AM上培养的细胞中得到抑制。
实施例5：AM提取物抑制来自人缘外植块的成纤维细胞迁移
材料和方法
总可溶性人羊膜提取物在PBS中的制备
以无菌方式进行制备总可溶性人AM提取物(T)的完整方法以便用于随后基于细胞培养物的实验。冷冻人胎盘获自Bio-Tissue，Inc.(Miami，FL)，从其中回收AM。将AM切成适合于BioPulverizer(Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK)的桶的小片，在液氮中冷冻且然后粉碎成细粉末。称重该粉末并且与冷PBS缓冲液(通过将蒸馏H2O添加至来自pH7.4的10x PBS的1x PBS制备，cat#70011-044，Invitrogen，Carlsbad，CA)与1∶1(ml/g)的蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合物，P8340，Sigma并且补充了1mM的PMSF)和磷酸酶抑制剂(50mM氟化钠和0.2mM钒酸钠)混合。将该混合物保持在冰中并且用Tissue Tearor(Biospec Products，Inc.，Dremel，WI)匀浆5次，每次1分钟，有2分钟间隔冷却。将该水溶性提取物称为“总”(T)。将该总水溶性提取物在4℃下混合1小时，在4℃下以48000xg离心30分钟。将上清液分成等分部分并且储存在-80℃下。
人角膜缘外植块培养物
按照赫尔辛基宣言的信条处理人组织。边缘(Limbal rims)获自供体角膜(Medical Eye Bank of Florida，Orlando，FL)或植入后的供体角膜(FloridaLions Eye Bank，Miami，FL)。除去过多的巩膜，虹膜，角膜内皮，结膜和特农囊并且将剩余的边缘用SHEM介质简单冲洗3次，该介质由等体积的HEPES-缓冲的DMEM和Ham’s F12构成，补充了5％FBS，0.5％DMSO，2ng/ml小鼠EGF，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，5ng/ml硒，0.5μg/ml氢化可的松，10nM霍乱毒素，50μg/ml庆大霉素，1.25μg/ml两性霉素B。将每一边缘等分成两半并且将每半再等分成6个外植块，即每个边缘制成12个外植块。为了消除年龄，性别和种族的差异，选择来自相同供体角膜的相应位置的外植块分别用于对照组和实验组。将外植块放在上皮侧向上的各6个孔的中心并且在SHEM或SHEM中与上述25μg/ml的总AM提取物一起培养。将培养物维持在37℃下和95％湿度和5％CO2中，每隔天改变一次培养基并且使用倒置相差显微镜(Nikon，Japan)每天检测其向外生长，持续14天。每隔天用Adobe Photoshop 5.5将向外生长的面积数字化处理并且用NIH ImageJ 1.30v(NIH，Bethesda，MD)分析。
MTT测定
MTT测定(Cell Proliferation Kit I，cat#11465007001，Roche AppliedScience，Indianapolis，IN)为基于黄色四唑鎓盐MTT被代谢活性细胞裂解成紫色甲晶体的比色测定。通过胰蛋白酶/EDTA消化分别收集从在SHEM(Ctrl组)或含有25μg/ml AME的SHEM(AME组)中培养14天的人缘外植块中向外生长的细胞并且重新悬浮入SHEM培养基中。用血细胞计数器对细胞计数并且以2000个细胞/孔接种在96孔中，每个孔中含有100μl培养基。将每个组再分成3个亚组(Ctrl，PBS，AME)，其中在细胞接种后不即刻添加补充液2μl PBS或2μl 1250μg/ml AME(制成25μg/ml AME终浓度)。每个亚组具有总计16个孔(来自复本)。将细胞在37℃下和95％湿度和5％CO2中培养10天，其中每隔天更换一次培养基。当进行MTT测定时，将10μl MTT标记试剂(终浓度0.5mg/ml)加入到96孔的每个孔中。将96孔平板在相同培养条件下孵育4小时。然后向每个孔中加入100μl增溶溶液并且将该平板在相同条件下再孵育20小时。使用微量培养板读出器(FusionTM，Meriden，CT)测定在550nm波长样品的分光光度测定吸收度，减去650nm参比波长的吸收度。
苏木精和伊红(H&E)染色
在培养14天后，从孔中取出外植块并且用OCT(Tissue-Tek)包埋，简单冷冻在液氮中并储存在-80℃下。用Microtome Plus(Triangle BiomedicalSciences，Durham，NC)在snowcoat X-TraTM显微镜载玻片(Surgipath，Richmond，IL)上将组织切成6μm片，固定在10％福尔马林中10分钟且在25℃下依次用Harris苏木精染色5分钟，1％伊红淡黄染色1分钟。用一系列70％，95％和100％的醇使组织脱水，各自至少5分钟且最终用二甲苯(SUB-XTM Xylene Substitute，Surgipath)处理，并且用盖玻片固定。在倒置显微镜(ECLIPSE，TE 2000-U，Nikon)下观察载玻片。
结果
AM提取物减缓上皮细胞从人缘外植块中迁移并且导致向外生长的上皮细胞较少，而祖细胞较多
如下所示的表说明上皮细胞从缘外植块中开始向外生长减缓并且产生的上皮细胞向外生长包含在添加了AM提取物的培养物中的较少细胞。
表：外植块向外生长
 向外生长   外植块(6)SHEM/PL   外植块(6)SHEM/AME/PL25μg/ml
 第3天   2   0
 第4天   6   1
 第5天   6   6
 第14天(来自4个外植块的细胞)   7.35×106(3.6)   2.05×106(1.0)
AM提取物抑制成纤维细胞从人缘外植块中迁移并且导致向外生长的成纤维细胞较少
在图27A中，从在SHEM(Ctrl)和SHEM/AME(AME)中培养的人缘外植块中向外生长形成类似的上皮层。然而，某些成纤维细胞-样细胞仅出现在Ctrl中，而未出现在AME培养物中，表明AME可以抑制成纤维细胞迁移。在图27B中，在14天培养后，从培养孔中取出人缘外植块，包埋，切片并且用H&E染色。在AME中存在远多于Ctrl中的基质细胞。这可能是因AME抑制成纤维细胞迁移所致。
AME抑制成纤维细胞向外生长
分别收集来自在SHEM(Ctrl)和SHEM/AME(AME)培养14天的人缘外植块的向外生长物并且如MTT测定中所述以2000个细胞/孔接种在96孔的每个孔中。将来自Ctrl的细胞接种在第1-3列(1：Ctrl；2：PBS；3：AME；n＝8，就本文所示的1个平板而言，而就具有类似结果的复本而言，n＝16)并且将来自AME的那些接种在第4-6列(1：Ctrl；2：PBS；3：AME)。在培养10天后，将细胞用于MTT测定。在亚组中成纤维细胞生长无显著性差异(Ctrl，PBS和AME)，而在来源于SHEM和SHEM/AME中的向外生长产生的细胞之间的成纤维细胞生长存在统计学显著性差异(图28A)。因为成纤维细胞远比上皮细胞生长快得多，所以这类孔在添加包含成纤维细胞的MTT试剂后变成粉红色。对Ctrl和AME中成纤维细胞生长的统计学分析显示AME显著抑制成纤维细胞生长(p＝0.01)(图28B)。
来自在SHEM/AME中培养的向外生长的上皮细胞的克隆生长多于仅用SHEM培养的向外生长的上皮细胞的克隆生长
仅在SHEM(Ctrl)或在SHEM/AME(100μg/ml)中培养人缘外植块。在培养10天后，用胰蛋白酶/EDTA收集向外生长的上皮细胞并且再次计数，上皮细胞生长得到AME的显著抑制。即，在来自SHEM中培养的3个外植物的细胞总计为9×105，而来自在SHEM/AME中培养的3个外植块的细胞总计为2.3×105，Ctrl/AME之比＝3.9。此时将这些细胞以500或1000个细胞接种在每个60mm平皿(～18或36个细胞/cm2)的SHEM培养基中的用MMC预处理的swiss 3T3滋养层上(4μg/ml，2小时，在37℃下)。在接种4-5天后，上皮克隆开始形成。来自上述用SHEM/AME培养的细胞的克隆比预先仅用SHEM培养的的细胞克隆更多和更大(P＜0.05)。使克隆生长至第10天且然后用结晶紫染料染色克隆以便显示克隆的数量和大小。
AME抑制MAPKp38的向外生长
来自在SHEM(Ctrl)和SHEM/AME(AME)中培养14天的人缘外植块的向外生长物形成类似的上皮层。然而，上皮层的边缘不同：Ctrl上皮层的边缘显得粗糙，而AME的边缘平滑(图29，Ctrl-左侧组；AME-右侧组)。这种现象类似于MAPK p38抑制剂(在SHEM中10μM SB203580)对人缘外植块的作用(数据未显示)。它提供了AME包含可以抑制MAPK p38的成分的另一个证据。
实施例6：羊膜制品抑制巨噬细胞功能
材料和方法
细胞培养和IFN-γ刺激
Raw 264.7细胞，即小鼠巨噬细胞细胞株获自ATCC并且将其在100mm培养皿中不含酚红的补充了10％胎牛血清，50μg/ml庆大霉素和1.25μg/ml两性霉素B的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)中培养。当细胞变成70％-80％汇合率时，除去培养基并且在25℃下将细胞用胰蛋白酶/EDTA处理10分钟。在消化后，细胞仍然牢固地粘附在培养皿上，由此除去胰蛋白酶/EDTA溶液。然后向培养皿中加入含有胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的5mlDMEM(ITS；在1000ml中包括5mg胰岛素，5mg人转铁蛋白和5μg亚硒酸钠.Sigma，St.Louis，MO)，并且通过吸移收集细胞。在以500xg离心5分钟后，除去培养基，将细胞沉淀重新悬浮于DMEM/ITS培养基中，进行细胞计数并且将细胞密度调整至0.5×106/ml。
为了接种细胞，将0.5ml(0.25×106)的细胞混悬液加入到24孔的每个孔中。在1小时保持细胞贴壁后，将5ul的IFN-γ(2×104U)加入到各孔中以便达到IFN-γ终浓度：200U/ml。48小时后，收集细胞培养基用于NO和PGD2/PGE2测定。将细胞用于活与死测定或收集用于蛋白质印迹。
活与死测定
除去培养基并且向每个孔中加入200μl合并的LIVE/DEAD测定试剂(Molecular Probes，Eugene，OR)。在室温下将细胞孵育15分钟后，在荧光显微镜下观察细胞。活细胞在胞质中产生强烈的均匀绿色荧光，而死细胞在核中产生亮红色荧光。
NO测定
在培养结束时，分别采集每个孔中的细胞培养基并且在4℃下以12,000xg离心10分钟。将澄清的培养基转入新管并且进行直接测定或储存在-80℃下，此后进行测定。通过使用Griess试剂，按照制造商的方案测定稳定降解产物亚硝酸盐评价NO产生。简言之，将50μl澄清培养基与100μl Griess试剂(ICN Biomedicals，Aurora，Ohio)混合，15分钟后，在550nm处使用FusionTM通用微量培养板分析仪(Packard，Meriden，CT)测量吸收度。根据亚硝酸钠标准曲线计算亚硝酸盐的量(NaNO2；Sigma，St.Louis，MO)。
前列腺素D2(PGD2)和前列腺素E2(PGE2)测定
在使用或不使用IFN-γ刺激后48小时收集细胞培养物上清液。使用EIA试剂盒(分别为cat#512021和514010，Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)测定PGD2和PGE2浓度，其中按照供应商的说明进行测定。
TGF-β1启动子测定
TGF-β启动子活性测定涉及包含人TGF-β1启动子(-1362至+11)-荧光素酶，TGF-β2启动子(-1729至+63，Noma等，生长因子，4：247-255，1991)和TGF-β3启动子(-1387至+110)的质粒。将TGF-β2启动子和TGF-β3启动子插入pGL3-基的Kpn I和Hind III中。通过使用人角膜成纤维细胞的基因组DNA作为模版，正向引物5′-GTACGGTACCCATCAAAGAAGTTATGGTTC -3′和反向引物5′-GTACAAGCTTACTCAACTTCAACTCAGCGC -3′的PCR扩增人TGF-βRII启动子(-1883至+50，Bae等，J Biol Chem.，270：29460-29468，1995)。然后用Kpn I和Hind III消化扩增的TGF-β RII启动子片段，进行凝胶-纯化(Qiagen，Valencia，CA)并且插入PGL3-基的相同位点。由Core Lab ofUniversity of Michigan按照在先公布的方法(Chen等，J Immunol.167：1297-1305，2001；He等，Proc Natl Acad Sci USA 95：2509-2514，1998)生产用于各启动子构建体的复制缺陷腺病毒。
在2×100mm塑料平皿中，在DMEM/10％FB中培养人角膜成纤维细胞(第1-4代)。当细胞达到～80％的汇合率(～8×105个细胞/平皿)时，除去培养基并且用相应培养基将细胞洗涤2次。将包括含有各自连接荧光素酶的TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3或TGF-βRII启动子的复制缺陷腺病毒(感染复数(MOI)各自为100)和包含CMV-β-半乳糖苷酶的对照腺病毒(MOI为30)的新鲜培养基与细胞培养4小时。然后除去包含腺病毒的培养基并且在室温下与预热的胰蛋白酶/EDTA进行胰蛋白酶消化5分钟。将细胞收集入15ml无菌管并且以1000rpm(～600xg)离心5分钟。谨慎除去培养基并且用相应的培养基将细胞洗涤一次。将细胞沉淀以所需密度重新悬浮入培养基中。将具有或不具有不同量(例如25μg/ml)水溶性AM提取物(通过本文为制备水溶性AM提取物所述的方法制备)或其它试剂的100μl细胞混悬液总体积(5000个细胞)转入96-孔平板的每个孔中。
将细胞进一步培养44小时(腺病毒转导总计48小时)。此后，除去培养基并且用PBS将细胞冲洗一次。在50μl细胞培养裂解试剂(Promega.Madison，WI)中裂解来自96孔的每个孔的细胞。将细胞裂解物涡旋15秒并且通过在4℃下以12,000xg离心2分钟清除。将上清液转入澄清管。将20μl上清液用于荧光素酶测定或β-半乳糖苷酶测定。为了进行荧光素酶测定，将100μl荧光素酶测定试剂(Promega，Madison，WI)分配入每个孔并且加入20μl细胞裂解物，且通过吸移3次混合。按照荧光素酶分析仪(FusionTM，Packard Instrument Company，Boston，MA)的程序设计进行10-秒测定。就高灵敏度β-半乳糖苷酶测定(Stratagene，LaJolla，CA)而言，将20μl细胞裂解物与130μl氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)底物在每个孔中混合并且在37℃下孵育30分钟-2小时，直到样品变成红色为止。终止反应并且在570nm处读取每一样品的吸光度。计算每一样品的β-半乳糖苷酶活性并且用于将荧光素酶活性校准为相对荧光素酶活性。
结果
AM减少了由巨噬细胞Raw264.7细胞产生的NO
将Raw264.7细胞以在DMEM/ITS中2.5×105接种在24孔的每个孔中(每组n＝3)。在用或不用200u/mlIFN-γ刺激细胞后，收集培养基用于如方法中所述的NO测定。不使用IFN-γ刺激，巨噬细胞在塑料或完整羊膜(iAM)基质表面上培养时几乎不产生可检测到的NO(图30)。在IFN-γ刺激后，巨噬细胞在两种培养物中均产生大量NO，而在iAM的基质表面上培养巨噬细胞时显著低于在塑料上培养巨噬细胞时(p＝0.048)(图30)。
AM有利于PGD2合成而减量调节PGE2产生
不使用IFN-γ刺激，Raw264.7细胞在塑料上培养时几乎不产生PGD2，而在iAM上培养时产生很多，推断是因PGD2从AM上皮细胞中释放所致(图31A)。使用IFN-γ刺激，在塑料和iAM上培养的Raw264.7细胞中的PGD2产生增加(图31A)。不使用IFN-γ刺激，Raw264.7细胞在塑料上培养时几乎不产生PGE2，而在iAM上培养时产生很多，推断是因PGE2从AM上皮细胞中释放所致(图31B)。使用IFN-γ刺激，在塑料上培养的Raw264.7细胞中的PGE2产生显著增加，而在iAM上培养的PGE2产生几乎没有改变(图31B)。作为抗炎指数的PGD2/PGE2之比在使用或不使用IFN-γ刺激的iAM上培养时远高于在Rraw264.7中的(图31C)。
AM抑制巨噬细胞中的TGF-β1启动子活化
不使用IFN-γ刺激，Raw264.7细胞中的TGF-β1启动子活性在iAM上比在塑料上受到抑制，但不具有统计学显著性(p＝0.4)(图32)。使用IFN-γ刺激，Raw264.7细胞中的TGF-β1启动子活性在塑料和iAM上均下降。然而在与在塑料上培养的相比时TGF-β1启动子活性的乙酯大的多，且具有统计学显著性(p＜0.01)(图32)。
AME诱导巨噬细胞死亡
将Raw264.7细胞以2×105接种在24孔的每个孔中的DMEM/10％胎牛血清中。在1小时后，将125μg/ml AME(在PBS中)加入到培养基中，同时将相同体积的PBS加入到Ctrl.中。在24小时培养后，在Ctrl中Raw264.7细胞充分粘壁，而在加入AME时大量细胞漂浮且出现死亡(图33)。
测定巨噬细胞凋亡的体外测定
体外巨噬细胞凋亡测定用于测定AM如何发挥基于有利于IFN-γ-活化的小鼠巨噬细胞细胞株(Raw 264.7细胞)的细胞凋亡的抗炎作用。细胞死亡检测ELISAPLUS试剂盒获自Roche Diagnostics(Mannheim，Germany)。按照制造商的说明对培养后相当于104个细胞的细胞裂解物和条件培养基进行细胞死亡检测ELISAPLUS测定。这种ELISA为光度酶联免疫测定，其用于使用小鼠单克隆抗-组蛋白和抗-DNA抗体进行的细胞凋亡细胞死亡产生的胞质组蛋白-连接的-DNA-片段(单-和寡核小体)的定性和定量体外测定。包括如制造商提供的阳性对照和阴性对照，并且使用FusionTM通用微量培养板分析仪在405nm处测定吸收度。在超低温保存的完整AM的基质侧上培养巨噬细胞，所述的超低温保存的完整AM通过下列步骤制备：采集人胎盘，从胎盘中收集AM，将AM平展在具有上皮侧向上的硝化纤维纸(Hybond N+，Amersham，England)上并且将AM储存在-80℃下的DMEM/甘油(1∶2v/v)中至使用为止。为了在AM基质上培养巨噬细胞，将巨噬细胞接种在完整超低温保存的AM的基质侧面上。
结果表明在DMEM+ITS中48小时后在塑料培养物中检测到了少量细胞凋亡，而在用IFN-γ活化巨噬细胞时，细胞凋亡下降。在超低温保存的完整AM上培养的巨噬细胞也显示一定的细胞凋亡，但在AM与塑料之间无显著性差异。相反，由IFN-γ活化的巨噬细胞在AM上培养时显示显著的细胞凋亡增加。这一测定结果与通过如本文所述的LIVE/DEAD测定染色(MolecularProbes，Carlsbad，CA)，Hoechst-33342核染色和DeadEndTM荧光末端脱氧核苷酰基转移酶-介导的dUTP-地高辛配基切口末端(TUNEL)标记法(Promega，Madison，WI)相关。
在均匀分布的塑料(PL)上培养的巨噬细胞大部分为卵形，但在用200U/ml IFN-γ(PL/IFN-γ)活化后，细胞变大和纺锤形。相反，在AM基质上培养的巨噬细胞聚集成簇并且保持圆形且在IFN-γ活化(AM/IFN-γ)时，细胞皱缩并且变性成碎片。这些由AM导致的明显形态改变与使用或不使用IFN-γ活化48小时的细胞死亡检测ELISA测定的巨噬细胞凋亡显著加速相关(图1，PL与AM相比，p＞0.05，PL与PL/IFN-γ相比和AM与AM/IFN-γ相比，p＜0.05，PL/IFN-与AM/IFN-γ相比，p＜0.01)。这一结果表明在AM基质上培养的巨噬细胞改变了其形态，表示用IFN-γ活化后细胞死亡。
为了测定上述在AM培养物上的形态改变确实代表了细胞死亡，对平行实验的细胞进行LIVE/DEAD测定。在使用或不使用IFN-γ活化的塑料上培养的细胞和在不使用IFN-γ活化的在AM上培养48小时的细胞主要为存活的(即产生绿色荧光)。相反，在IFN-γ活化，AM上的大量细胞死亡(即产生红色荧光)。
为了测定上述细胞是否由细胞凋亡介导，对平行实验的细胞进行Hoechst-33342染色。发现在AM/IFN-γ中具有强Hoechst染色的碎片核多于不使用IFN-γ的AM及其塑料对照组。Hoechst-33342-阳性细胞凋亡核的百分比为12.4±2.7％(PL)，16.5±3.1％(PL/IFN-γ)，14.7±1.1％(AM)和63.8±7.9％(AM/IFN-γ)。在PL与PL/IFN-γ之间和PL与AM之间无统计学差异(均为p＞0.05)，而在AM与AM/IFN-γ之间和PL/IFN-γ与AM/IFN-γ之间存在统计学差异(均为p＜0.001)。此外，Hoechst-33342染色还发现在用IFN-γ活化时的塑料培养物中的多核巨细胞。相反，在AM/IFN-γ培养物中不存在这类巨细胞。
为了验证这类碎片核确实由DNA裂解导致，对平行实验的细胞进行TUNEL测定染色。TUNEL-阳性碎片核在PL，PL/IFN-γ和无IFN-γ的AM培养物中是散在的，但在AM/IFN-γ培养物中显著增加。这一结果与通过Hoechst-33342染色显示的结果一致。
AM通过打断NF-κB和Akt介导的存活途径诱导体外IFN-γ活化的巨噬细胞凋亡
已经报导了内源性产生的或外源性施用的NO可以诱导巨噬细胞的凋亡性细胞死亡。为了确定NO是否导致在AM基质上培养的巨噬细胞的上述细胞凋亡，在24小时到72小时不同培养期结束时收集的条件培养基中测定亚硝酸盐浓度，同时还检测TNF-α产生。结果证实在不使用IFN-γ活化的PL或AM上培养的巨噬细胞产生低水平的NO和TNF-α并且在整个培养期中塑料与AM之间的NO产生无差异(均为p＞0.05)，而在AM上的TNF-α浓度在所有时间点时均高于在塑料上(均为p＜0.05)。然而，当使用IFNγ活化时，在塑料上培养的巨噬细胞从24小时到72小时连续产生增加水平的NO和TNF-α。相反，尽管在AM上培养的巨噬细胞从24小时到48小时也增加了NO和TNF-α产生，但是在48小时到72小时之间其水平没有增加(p＞0.05)，表明NO和TNF-α的产生在48小时后停止。NO浓度在24小时和48小时在AM上高于在塑料上(p＜0.01)，而TNF-α浓度仅在24小时在AM上较高(p＜0.01)。在使用或不使用IFN-γ的培养基中单独孵育AM 48小时的对照组在上清液中未显示出任何可检测到水平的NO或TNF-α，表明AM自身不会产生NO和TNF-α。这些数据共同表明AM与IFN-γ以协同作用方式起作用产生更多的NO，而AM自身诱导巨噬细胞TNF-α产生的能力较弱。在48小时，在AM上培养细胞时IFN-γ促进的亚硝酸盐水平明显高于塑料(p＜0.01)，这是完全与细胞凋亡有关的发现。
为了确定高水平的NO和细胞凋亡相关原因，通过添加为NO合酶抑制剂的NG-一甲基-L-精氨酸乙酸盐(L-NMMA)或L-N6-(1-亚氨基乙基)赖氨酸盐酸盐(L-NIL)阻断NO产生。结果证实500μM的L-NMMA或L-NIL显著减弱了高于在AM上培养细胞50％的IFN-γ诱导的亚硝酸盐水平，即，就L-NMMA和L-NIL而言，分别从基线46.2±4.3μM到19.8±4.9μM和14.0±9.8μM(均为p＜0.01)。然而，通过Hoechst 33342染色测定的巨噬细胞凋亡程度并非因此而明显减弱。这些结果共同表明在IFN-γ活化下，AM上的巨噬细胞凋亡并非因NO过度产生而介导。
为了进一步研究AM上巨噬细胞凋亡的机制，研究了两种主要的细胞存活信号传导途径，即NF-κB和Akt-FKHR信号传导途径。通过测定来自使用或不使用IFN-γ的塑料或AM上培养24小时的巨噬细胞的NF-κB，Akt，磷酸基-Akt(Ser473)和phospho-FKHR(Thr24)/FKHRL1(Thr32)的总IKK-α，IKK-β，p65(RelA)亚单位的表达来研究这些途径，此时对细胞凋亡的定量ELISA并不明显。蛋白质印迹分析显示NF-κB和总Akt的p65(RelA)亚单位在使用IFN-γ活化的塑料上培养的巨噬细胞中得到轻微地增量调节。IKK-α，IKK-β总Akt和phosphor-Akt(Ser473)水平在使用IFN-γ活化的AM上培养的巨噬细胞中仅得到减量调节，而NF-κB和phospho-FKHR(Thr24)/FKHRLl(Thr32)的p65(RelA)亚单位在不使用IFN-γ活化的AM上培养的巨噬细胞中得到减量调节并且在使用IFN-γ活化时进一步得到减量调节。这些结果表明这两种信号传导途径均涉及在AM上培养的巨噬细胞凋亡。
实施例7：使用胶原蛋白或HA作为载体递送两种不同AM提取物的相对功效比较
为了测定AM提取物的水溶性和冻干形式(通过本文分别为制备AM提取物的水溶性和冻干形式所述的方法制备)的最佳浓度并且比较包含适当浓度的每种AM提取物的两种不同载体之间分别在抑制TGF-β启动子活性和促进巨噬细胞凋亡中的相对功效，通过在I型胶原蛋白凝胶或HA中系列稀释液比较这两种AM提取物形式并且由此监测其蛋白质浓度。就I型胶原蛋白凝胶而言，蛋白质浓度在0.05-2mg/ml之间改变；就HA凝胶而言，该浓度在0.05-10mg/ml之间改变。将这两种形式的AM提取物的这些系列稀释溶液或凝胶预包被在塑料平皿上，此后接种人角膜成纤维细胞或将细胞接种在塑料上的同时将其直接加入到含有10％FBS的DMEM中。通过下列步骤测定抗-瘢痕形成作用：测定TGF-β1，β2，β3和RII的启动子活性，并且比较启动子活性与阳性对照或阴性对照，其中将细胞分别接种在含有或不含指定形式的AM提取物(无载体)的塑料上。细胞接种在含有DMEM+10％FBS的塑料上的阳性对照显示了高的启动子活性。相反，细胞接种在含有DMEM+10％FBS，但添加了25μg/ml AM提取物的塑料上的阴性对照显示启动子活性至少下降了50％。基于这些对照数值，可以测定使用不同浓度的混合了胶原蛋白凝胶或HA的AM提取物的实验组。
一旦测定了这两种形式的AM提取物在胶原蛋白或HA中的最有效浓度，就通过重复在不含血清的DMEM中的实验验证结果，所述的DMEM中包含添加了10pg/ml-5ng/ml TGF-β1的ITS。抗-瘢痕形成作用进一步与通过Smads 2，3和4和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，即成肌纤维细胞标记的免疫细胞定位抑制Smad-介导的信号传导相关(Gabbiani G.，J Pathol.200：500-503，2003；Jester和Petroll，Prog Retin Eye Res.18：311-356，1999)。另一种阳性对照通过将10μg/ml中和抗体加入到TGF-β的所有三种同工型中获得。通过下列步骤在使用或不使用200U/ml IFN-γ活化的含有ITS的DMEM中的鼠巨噬细胞中类似地测试抗炎作用：使用细胞死亡检测ELISAPLUS试剂盒(Roche，Mannheim，Germany)测定细胞凋亡程度并且将数据与通过如近来报导的(Li等，Exp Eye Res.2005，In Press)细胞形态LIVE/DEAD测定(Molecular Probes，Carlsbad，CA)，Hoechst-33342核染色和TUNEL测定(Promega，Madison，WI)获得的那些数据建立相关性。
实施例8：羊膜基质提取物具有抗-生成血管特性
材料和方法
材料
HUVECs和内皮细胞生长培养基来自PromoCell GmbH(Heidelberg，Germany)。细胞增殖试剂盒I(MTT)来自Roche(Penzberg，Germany)。BCATM蛋白质测定试剂盒来自Pierce(Rockford，IL)。Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)，Ham’s/F12培养基，HEPES缓冲液，Hank平衡盐溶液(HBSS)，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，两性霉素B，庆大霉素，胎牛血清(FBS)，血管内皮生长因子(VEGF)，表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，0.25％胰蛋白酶/0.53mM EDTA，LIVE/DEAD测定试剂购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。碘化丙锭，Hoechst-33342染料，triton X-100，牛血清清蛋白(BSA)，胰岛素，氢化可的松，甲醛，结晶紫，FITC缀合的抗-小鼠，山羊和大鼠IgG来自Sigma(St.Louis，MO)。跨孔插入片段来自CorningIncorporated(Corning，NY)。基质胶来自BD Biosciences(Bedford，MA)。
细胞培养
在补充了2％胎牛血清，0.1ng/mL EGF，1μg/mL氢化可的松和1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的内皮细胞生长培养基中培养HUVECs。人角巩膜组织获自Florida Lions Eye Bank(Miami，FL)，从其中收集角膜成纤维细胞(HCFs)并且在包含10％FBS的DMEM中培养。将第2代细胞用于实验。使Peter Reinach博士(Department of Biological Science，College ofOptometry，State University of New York，New York)友情提供的SV40-无限增殖化家兔角膜上皮细胞(RCEs)生长在包含10％FBS，5ng/mL胰岛素和5ng/mL EGF的DMEM/F12中。
水溶性AM基质提取物的制备
使用无菌技术，用HBSS简单将获自Bio-Tissue，Inc.(Miami，FL)的冷冻人AM洗涤2-3次以便除去原始的保存介质。用药刀刮取AM基质，冷冻在液氮的气相中并且用BioPulverizer(Biospec Products，Inc.，Bartlesville，OK)研磨成细颗粒，随后使用Tissue Tearor(Biospec Products，Inc.，Dremel，WI)的pH 7.4的PBS中在冰上匀浆1分钟。通过旋转1小时混合匀浆物并且在4℃下以14,000xg离心30分钟。然后收集在PBS中的上清液并且以等分部分储存在-80℃下。通过BCA测定法测定蛋白质浓度。称为羊膜基质提取物(ASE)的该水溶性蛋白质提取物用于本文所述的实验。
细胞增殖测定
将细胞以2,000个细胞/孔的密度与增加浓度的ASE一起接种在96-孔平板中的上述相应生长培养基中(n＝6)并且培养48小时。通过基于MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(dephenyl tetrazolium bromide))的细胞增殖测定，按照制造商提供的方案测定细胞生长。
细胞凋亡测定
将LIVE/DEAD测定和Hoechst-33342染色用于检测凋亡细胞。简言之，在培养48小时后，从培养物中除去各相应的生长培养基，添加200μl合并的LIVE/DEAD测定试剂并且在室温下培养15分钟。活细胞通过细胞质的绿色荧光染色区分，而死细胞在核中染色为红色荧光。为了表征核形态作为评价细胞凋亡的方式，将Hoechst-33342染料以10μg/mL的终浓度加入到各相应的生长培养基中并且在37℃下孵育15分钟。Hoechst-33342染色了活细胞核并且通过荧光增加和核裂解或浓缩确定凋亡细胞。
迁移测定
使用跨孔测定对HUVECs测试ASE对VEGF-诱导的趋化性的抑制作用。使HUVECs生长在完全生长培养基中36小时。在胰蛋白酶消化，洗涤并且在补充了0.5％FBS的不完全生长培养基中重新悬浮细胞后，将200μL中的60,000个细胞接种在被8μm孔径的聚碳酸酯膜分隔的含有或不含200μg/mLASE的跨孔插入片段的(8mm直径)内侧。将在补充了1％FBS和10ng/mLVEGF的800μL体积中的生长培养基作为化学引诱剂(chemotactant)直接加入到跨孔插入片段外部的24-孔平板中。将补充了0.5％FBS的生长培养基直接加入到24-孔中作为阴性对照。在37℃与5％CO2和95％湿度下孵育4.5小时后，抽吸未迁移的细胞，同时用PBS洗涤膜，固定在PBS中的4％甲醛中，用结晶紫染色并且在显微镜下观察。计数迁移至膜另一侧的细胞。
内皮管形成测定
将基质胶以320μL加入到24-孔平板的每个孔中并且使其在37℃下聚合30分钟。将在含有10％FBS的内皮细胞培养基中的HUVECs(50,000个细胞/孔)接种在有不同浓度ASE存在下的基质胶上。将对照组细胞与相同浓度的BSA一起培养。将细胞在37℃下培养24小时并且在显微镜(Nikon，Japan)下照相。对每个孔的10个随机40×视野进行拍照，并且计管数，取平均值并且比较。
统计学分析
将上述所有实验重复3次，每次一式三份或更多。使用适当版本的斯氏不配对t-检验比较组平均值。将检验结果报导为双-尾p值，其中将p＜0.05视为具有统计学显著性。将概括数据报导为平均值±S.D。
结果
ASE优选抑制HUVEC细胞增殖
我们首先测试了ASE加入到培养基中是否可以抑制细胞增殖。与不添加ASE的对照组相比，HUVECs增殖明显受到50-200μg/mLASE的抑制(图34A，p＜0.001)。然而，RCEs和HCFs增殖受到仅在200μg/mL浓度下的ASE的显著抑制(分别为图34B和34C，各自p＜0.01)。结果表明ASE优选抑制HUVECs增殖。
ASE诱导HUVEC细胞中的细胞凋亡
相差影像显示HUVEC细胞从纺锤形皱缩至小和圆形的形状并且细胞密度在使用200μg/mLASE处理48小时时显著下降。相反，在使用200μg/mLASE处理48小时时，HCF和RCE细胞形态和密度均未改变(数据未显示)。为了测定200μg/mLASE导致的HUVEC细胞中这类改变是否伴随细胞死亡，在用200μg/mL ASE孵育48小时后进行LIVE/DEAD测定和Hoechst-33342染色。结果表明HUVEC细胞在不添加ASE的对照组中存活(图35Aa)，而在ASE处理后显示显著细胞死亡(图35Ad)。相反，HCF和RCE细胞在不使用(分别为图35Ab和35Ac)或使用(分别为35Ae和35Af)ASE处理的培养物中未显示出任何显著的细胞死亡。Hoechst-33342染色显示ASE-处理的HUVECs具有61.6±7.7％的浓缩和裂解的核(图35Bd)，明显高于不使用ASE处理的对照组的3.1±1.8％(图35Ba，也参见2C，p＜0.001)。相反，在不使用(分别为图35Bb和35Bc)或使用(分别为图35Be和35Bf)ASE处理的HCFs或RCEs中无明显的细胞凋亡(也参见图36，分别为p＝0.84和0.30)。这些数据表明ASE通过诱导细胞凋亡抑制HUVECs增殖。
ASE在使用或不使用VEGF刺激下抑制HUVEC细胞迁移
我们随后测试了ASE是否可以抑制VEGF刺激的HUVEC迁移。在4.5小时的测试期中，某些细胞在不含VEGF作为化学引诱剂的对照组中通过聚碳酸酯膜的孔迁移(图37A)。在用作为化学引诱剂的VEGF处理时，细胞迁移显著增加(图37B，p＜0.001)。然而，当用200μg/mL ASE处理HUVECs时，在VEGF影响下的细胞迁移数量与使用VEGF的阳性对照(p＜0.001)或不使用VEGF的阴性对照(p＜0.01)相比时明显受阻(图37C)。这些结果表明ASE不仅消除了VEGF的趋化因子功能，而且抑制了实质上存在于HUVECs中的迁移。
ASE抑制HUVEC细胞的管形成
为了进一步研究ASE的抗-生成血管作用，我们进行了体外管形成测定。当将HUVECs接种在基质胶，即基底膜蛋白的固体凝胶上时，它们快速排列并且在24小时后形成空心管样结构(图38A)。相反，当将ASE加入到培养物中时，在100μg/mL(图38B)或200μg/mL(图38C)(均为p＜0.001)浓度下HUVECs的管形成明显受到抑制。这两种ASE剂量之间的差异不具有统计学意义(图38D)。这些结果共同表明ASE也通过抑制生成血管过程中的管形成起其抗-生成血管作用。
实施例9：包含AM提取物的皮肤洗剂组合物
通过下列方法制备皮肤洗剂。在150℉下将0.25g羟基苯甲酸甲酯和7.5g甘油(gycerin)溶于75ml水中。在150℉下熔化0.7g脱水山梨糖醇单月桂酸酯，0.7g聚山梨醇酯20和1.0g十八醇十六醇混合物且然后混合成溶液。在混合的同时冷却该混合物。当该混合物达到低于约90℉的温度下时，在混合的同时加入4ml本文所述的AM制品和纯化的组合物。另外在混合的同时加入痕量的香料。将该洗剂包装成10ml的等分部分并且储存在室温下。
实施例10：局部用AM基质凝胶组合物和皮肤炎症的治疗
为了制备局部用凝胶药物组合物，将100mg冷冻-研磨的冻干的AM基质材料与1.75g羟丙基纤维素，10mL丙二醇，10mL肉豆蔻酸异丙酯和100mL纯化的乙醇(USP)混合。然后将所得凝胶混合物加入适合于局部给药的容器，诸如管中。将该凝胶施用于发炎的皮肤，每天2次。通过使用该方法，皮肤炎症减轻。
实施例11：眼用溶液组合物和眼病的治疗
通过将100mg研磨的冻干的AM提取物与0.9g NaCl在100mL纯水中混合制备滴眼液并且使用0.2微米过滤器过滤。然后将所得等渗溶液加入适合于眼科给药的眼用递送装置，诸如滴眼液容器。将2滴该组合物施用于烧灼损害的眼，每天4次。通过使用该方法，眼恢复到正常的健康状况。
实施例12：眼用软膏组合物使用该组合物治疗眼病
通过将90克白凡士林，10克液体石蜡和0.5克冻干的AM粉末混合制备无菌眼用软膏组合物。将该混合物进行巴氏灭菌并且包装入每个2.0g管容器中。
为了使用该组合物治疗眼病，将约0.1g的等分部分缓慢直接从管中涂布于底部眼睑的内部边缘。将该软膏每天涂布4次。眼科专家隔周一次监测患者进展。通过使用该方法，眼病改善。
实施例13：使用AM制品治疗人眼病
鉴定具有眼烧灼损害的个体。制备1％AM，0.5％胶原蛋白在DMEM中的制品。用2滴该组合物每天4X治疗个体。通过使用该方法，眼损害比未治疗的烧灼损害的眼改善。
实施例14：使用AM制品治疗人皮肤病
鉴定具有牛皮癣的个体。用补充了来源于商品源的1mg/ml纯化的Smad7的5％再溶解(reconstituted)的AM制品治疗个体。将该制剂溶于洗剂组合物。每天给予2次治疗。通过使用该方法，牛皮癣得到缓解或消失。
实施例15：包含AM提取物的直肠凝胶组合物
通过混合100mg商购HA和TSG-6(纯化的)与如实施例1所述由冷冻AM膜材料制备的5ml无菌AM提取物制备直肠凝胶组合物。向该混合物中加入2.5g甲基纤维素(1500mPa)，100mg对羟基苯甲酸甲酯(methylparapen)，5g甘油和95mL纯水。然后将所得凝胶混合物加入适合于直肠给药的直肠递送装置，诸如注射器。
实施例16：治疗皮肤炎症的试剂盒
制备治疗皮肤炎症的非处方药试剂盒。该试剂盒由下述包裹构成，所述的包裹包含糊剂中的AM提取物的1ml容器，涂药器和说明书插页。
实施例17：延长释放的固体剂型和在减轻关节炎炎症中的应用
通过混合100mg冻干的，冷冻-研磨的AM基质与800mg甲基纤维素制备延长释放的剂型且然后用羧甲基纤维素包衣材料微囊化。将约15mg的微囊化材料作为弹丸植入关节炎患者的发炎的膝关节皮下。每周一次重复植入过程。通过使用该方法，膝盖炎症减轻。
实施例18：非胃肠组合物
通过混合HA，TSG-6，PTX-3和TSP-1A各10mg制备用于肌内给药的非肠道组合物，其中所述的各成分获自商业来源，其中将100mg本文所述的化合物的水溶性盐溶于DMSO且然后与10mL 0.9％无菌盐水混合。将该混合物加入适合于注射给药的单位剂型中。
实施例19：通过直接注射AM非肠道制剂治疗人肿瘤
鉴定具有约2cm宽皮下肿瘤的患者。在4℃下将10克液体AM提取物与10％PEG 300水溶液混合2小时。将该混合物通过0.20μm过滤器过滤并且等分入用橡皮塞封闭并且用铝帽密封的无菌玻璃小瓶。使用前将小瓶储存在4℃下达2周。通过将0.50ml溶液直接通过皮肤注入肿瘤部位治疗患者，其中将给药体积分成用于肿瘤块的4个单独的区(对4个位点各自约125μl)。将该组合物每隔48小时给药一次。然后每周监测肿瘤大小。通过使用该方法，肿瘤体积减小。
尽管本文已经说明和描述了优选的实施方案，但是本领域技术人员可以在不脱离本发明的情况下进行大量变化，改变和替代。应理解对本文所述的本发明实施方案的各种可选择方案均可以用于实施本发明。指定下列权利要求限定本发明的范围且由此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。

Claims (7)

1.纯化的组合物，包含：
●交联高分子量乙酰透明质酸(HA)；
●肿瘤坏死因子-刺激基因6(TSG-6)；
●五聚环蛋白(PTX-3)；和
●血小板反应蛋白(TSP-1)；
其中由选自人羊膜、人羊膜胶冻、人羊膜基质或其组合的人羊膜材料制备至少部分所述的成分，所述制备方法包括：
●获得冷冻或预先冷冻的人胎盘；
●融化胎盘并且从融化的胎盘中分离人羊膜材料；
●冷冻人羊膜材料；
●磨碎冷冻的羊膜材料；和
●在合适的缓冲液中匀化人羊膜材料。
2.权利要求1所述的组合物，还包含分子量大于106道尔顿的HA。
3.权利要求1所述的纯化的组合物，其中HA交联包含与间-α-胰蛋白酶抑制剂重链的共价键。
4.权利要求1-3之一所述的纯化的组合物在制备用于抑制受治疗者瘢痕形成的药物中的应用。
5.权利要求1-3之一所述的纯化的组合物在制备用于逆转受治疗者瘢痕形成的药物中的应用。
6.权利要求1-3之一所述的纯化的组合物在制备抑制受治疗者血管发生的药物中的应用。
7.权利要求1-3之一所述的纯化的组合物在制备用于减轻或预防受治疗者炎症的药物中的应用。
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