KR20010098716A - 안구표면질환 치료용 양막 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안구표면질환 치료용 양막 추출물 및 이의 제조방법, 그리고 이러한 양막 추출물을 이용한 점안겔제, 점안액제 또는 점안 연고제에 관한 것이다.

Description

안구표면질환 치료용 양막 추출물{Amnionic extract for ophthalmopathy}

본 발명은 안구표면질환 치료용 양막 추출물 및 이의 제조방법, 그리고 이러한 양막 추출물을 이용한 점안겔제, 점안액제 또는 점안 연고제에 관한 것이다.

안구표면질환으로서 대표되는 난치성 각막염은 각막표면에 만성염증, 혼탁 및 신생혈관 등이 생성되어 실명을 야기하는 것은 물론 각막이식 후 거부반응을 나타내는 심각한 질환이다. 조기에 적절한 치료가 이루어지면 완치가 가능하지만 치료가 늦어지면 심각한 각막조직의 손상으로 인해 시력저하 또는 실명까지 이르게 된다. 난치성 각막염은 병원균 감염, 화학물질 및 과도한 면역반응 등에 의해 유발되는데, 이의 진행과 병인에는 병원균 및 숙주의 단백질분해효소가 중요하게 작용한다는 사실이 밝혀진 바 있다[Fini ME, Girard MT, Matsubara M. Collagenolytic/Gelatinolytic enzymes in corneal wound healing. Acta Ophthalmologica. vol 70. 1992]. 항생물질과 단백질분해효소 억제물질을 동시에 투여하는 방법을 이용하고 있으나, 큰 치료효과를 거두지 못하고 있는 실정이다[Stuart JC. Turgeon P, Kowalski RP. Use of aprotinin in the treatment of pseudomonas corneal ulceration. Trans Pa Acad Ophthalmol Otolaryngol. 41, 1989; Byon DS, Kim JC, Shyn KH. The effect of synthetic inhibitor of metalloproteinase on corneal alkali burn in rabbit. Chung-Ang J Medicine. 20(3), 1995; Wentworth JS, Paterson CA, and Gray RD. Effect of a metalloproteinase inhibitor on established corneal ulcers after an alkali burn. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33, 1992].

현재까지 난치성 각막염을 포함하는 안구표면질환 치료에는 특별한 방법이 개발되지 않은 상태이며, 손상된 각막에 병원균의 감염을 방지하기 위해 항생물질을 투여하는 방법 외에 특별한 방법이 없다.

따라서, 난치성 각막염을 포함하는 안구표면질환 치료법 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명자는 심하게 손상받은 실험적 난치성 각막염 동물 실험을 통하여 표층각막 절제술 후 각막표면에 양막을 이식하게 되면 탁월한 염증억제 효과를 얻을 수 있음을 알게 되었고, 이후 많은 임상 연구를 수행한 결과 다양한 안구표면질환에서 효과가 있음을 확인하였으며, 동물을 이용한 알칼리 모델의 난치성 각막염 모델에서 일시적 양막 이식술 적용으로 대조군보다 좋은 결과를 얻을 수 있었다.

이에, 양막성분 내에는 각막염을 비롯한 안구표면질환 치료에 기여하는 물질이 포함되어 있다는 확신을 갖게 되었고, 실제 임상에서 각종 난치성 각막염 및 안구표면질환에서 양막을 이식하여 각막염의 치료에 효과를 얻을 수 있었다. 그 뿐만 아니라 최근에 많이 시행되고 있는 시력교정 레이저 수술 시에 가장 문제점으로 지적되고 있는 각막혼탁의 예방에서도 우수한 효과를 얻을 수 있음도 알게 되었다.

본 발명은 양막의 구성 성분이 단백질 분해효소에 의한 세포손상 억제와 난치성 각막염에 치유 효과가 있음을 근간으로 하여, 가장 활성이 우수한 조성의 양막 추출물을 수득하게 되었다.

따라서, 본 발명은 양막 추출물을 이용하여 제조된 안구표면질환 치료를 위한 점안제(겔 타입 또는 수용성 안약) 또는 점안 연고제를 제공하는데 그 목적이있다.

도 1은 추출전의 양막과 추출된 양막성분에서의 단백질 전기영동 결과를 비교한 것이다.

도 2는 상피 결손 면적의 각군간 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3은 창상 치유에서의 치유효과를 보여주는 사진으로서, A, B, C는 대조군을, D, E, F는 실험군에 대한 것이고, A, D는 3일째, B, E는 2주째, C, F는 5주째에 찍은 사진이다.

도 4는 각막 부종에 의한 각막 두께의 각군간 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 각막 혼탁도의 차이를 보여주는 사진으로서, A1, A2는 대조군을, B1, B2는 실험군에 대한 것이다.

본 발명은 안구표면질환 치료에 유효한 양막 추출물을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 양막 추출물이 유효성분으로 함유되고, 필요하다면 통상의 항생제가 함께 함유되어 있는 점안제 또는 점안연고제를 또 다른 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 a) 태반으로부터 양막을 박리하는 과정; b) DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 세포배양배지, 글리세롤 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)가 함유된 보관용액에 상기 양막을 담구는 과정; c) 상기 양막 보관용액에 액체 질소를 첨가하고 냉동 건조 상태에서 막자 사발을 이용하여 분쇄하는 과정; d) 상기 분쇄물을 균등기로 균질화하고 원심분리을 수행하여 상층액을 수득하는 과정; 및 e) 상기 추출된 상층액을 한외 여과막 필터(Centrikon)를 이용하여 여과하는 과정이 포함되는 양막 추출물의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 각종 안구표면질환 치료제 및 보조제로서 폭넓게 적용될 수 있는 는 양막 추출물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 양막 추출과정을 그 공정별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

산모의 태반에서 양막을 박리한다. 박리한 양막을 항생제가 섞인 생리 식염수로 세척한 후에, DMEM 세포배양배지, 글리세롤 및 DMSO가 함유되어 있는 보관용액에 담구어 보관한다. 양막이 포함되어 있는 보관용액에 액체 질소를 첨가하여 냉동 건조시키고, 냉동건조된 상태에서 막자 사발을 이용하여 분쇄한다. 분쇄물은 균등기를 이용하여 균질화한 후에 원심분리(3000 ∼ 6000 rpm, 0.5 ∼ 1 시간)하여 상층액을 취한다. 상층액을 한외 여과막 필터(Centrikon)를 이용하여 여과함으로써 본 발명이 목적으로 하는 양막 추출물을 얻는다. 이때, 여과된 양막 추출물을 건조시켜 분말화하는 과정을 추가할 수도 있다.

이상의 추출방법으로 수득한 양막 추출물을 보관 저장함에 있어서는 양막 추출물에 1 : 0.5 ∼ 2 부피비의 메틸 셀룰로오스를 혼합하여 자외선 차단이 가능한 병에 담아 저온 냉장 보관하도록 한다. 또한, 안구표면질환 치료제로서 환자에게 적용할 때는 필요에 따라 항생제, 하이아로론산(Hyaloronic acid) 등을 0.01 ∼ 99.9 중량% 범위로 혼합하여 사용할 수도 있다.

한편, 본 발명은 상기한 양막 추출물을 유효성분으로 함유하는 점안제를 포함한다. 본 발명에 따른 점안제(겔 형태, 수용액 형태 등) 또는 점안연고제 제조시 사용되는 기제 또는 부형제는 안과분야에서 사용되는 통상의 것이다. 또한, 본 발명에 따른 양막 추출물을 유효성분으로 함유하는 점안제는 1일 1 ∼ 5회 점안하도록 하며, 1일 점안량은 1 ∼ 500 mg(유효성분 함량) 범위이나, 점안 횟수 및 점안량은 환자의 상태에 따라 변화될 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 양막 추출물이 유효성분으로 함유되어 있는 점안제 또는 점안연고제는 안구화상, 스티븐-존슨씨 증후군, 헤르페스 각막염을 포함한 각종 난치성 안구표면 질환의 치료제; 각막의 괘양을 포함한 지속성 상피 결손의 치료제; 엑시머 라식 수술 후의 각막 혼탁 억제 및 상피세포의 빠른 치유제; 엑시머 라식 수술 후 합병증 발생 시 치료제;결막 및 각막 수술 후 발생하는 결손 부위 치료 및 상흔 제거제; 안와 재건술 등의 안성형 분야에서의 보조제; 콘텍트렌즈의 잘못된 사용이나 장기간 사용에 의한 안구표면 염증의 안정화제; 항생제 등의 약물 전달 체계; 하이아로론산(Hyalouronic acid) 또는 콘택트 렌즈 등과 병행 사용함으로서 치료 효과 증대; 기존의 임상에서 시행되고 있는 양막이식술의 효과를 극대화하기 위한 보조 치료제; 건성안에서 인공누액에 함유하여 사용할 수 있다.

이와 같은 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

본 발명자의 연구 결과에 따르면, 무균적으로 채취한 양막에는 각막염을 유발하는 병원성 미생물에서 분비되는 단백질 분해 효소 중 세린 프로테아제(serine protease)를 억제하는 α1-안티트립신, 인터-α1-안티트립신, 안티-α2-마크로글로불린, 안티-α2-안티키모트립신, 안티-α2-안티플라스민이 존재하는 것을 밝혀 낼 수 있었다. 또한, TNF(tumor necrosis factor)-α및 LPS(lipopolysaccharide) 처리된 양막에서는 MMP(matrix metalloproteinase)-2, 9 및 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinases)-1, 2의 mRNA 발현이 증가된 반면, 처리전 양막에서는 MMP-2, 9의 발현은 관찰되지 않았으며, TIMP-1, 2의 mRNA와 단백질 발현이 관찰되었다.과산화 수소, 크산틴/크산틴 옥시다제 및 니트릭 옥사이드 단독 투여시 보다 양막 분쇄액을 투여 후에는 DNA 손상이 더 적고 높은 세포 생존율을 보였다. 배양액의 NO(nitric oxide) 양이 감소하였으며 iNOS(inducible nitric oxide synthase) mRNA의 발현 억제가 관찰되었다. TNF-α를 투여한 뒤 증가되는 카스파제-3(Caspase-3) 활성도가 양막 분쇄액을 투여시 감소하였다. 또한, 양막에서는 열충격 단백질(heat shock protein) 27, 47, 70, 90 발현이 관찰되었으며, 양막 추출액에 대한 단백질 전기영동 검사상에서 추출전 양막에서의 특이적 물질이 농축되어 검출되는 것이 확인되었다[도 1 참조]

실시예 2

양막 이식은 임상적으로 염증 및 세포고사 억제효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 많은 유전자들이 이와 관련이 있는 것으로 되어 있다. 또한, 염증시에는 눈물 혹은 전방에 TNF, IL-1이 증가하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자는 시험관 내(in vitro)로 각막세포에 염증성 싸이토킨(cytokine)만을 첨가하였을 때와 양막의 추출물을 함께 첨가하여 배양하였을 때, 염증 및 세포고사 인자(gene)의 발현이 억제 될 수 있는 가를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

태반으로부터 양막을 박리한 후, 항생제가 섞인 생리식염수로 세척하였다. DMEM 세포배양배지, 글리세롤, DMSO가 함유되어 있는 보관용액에 담구어 보관하였다. 양막이 포함되어 있는 보관용액에 액체 질소 을 첨가하여 냉동 건조시키고, 냉동건조된 상태에서 막자 사발을 이용하여 분쇄하였다. 상기 분쇄물은 균등기(homogenizer)를 이용하여 균질화한 후에 원심분리(5000 rpm, 1 시간)하여 상층액을 취하였다. 추출된 상층액을 0.22 마이크로 필터를 이용하여 여과한 후, 원심 한외여과지를 이용하여 100 kDa 이상, 100 ∼ 30 kDa, 30 kDa, 10 kDa, 10 kDa 이하로 각각 분획을 하였다. 모든 과정은 4 ℃에서 이루어졌으며, 분획된 양막 성분은 단백질 정량을 하여 투여량을 결정하였다. 인간각막 섬유아세포에 TNF와 IL-1를 단독으로 첨가한 군과 양막의 추출물을 함께 첨가한 군으로 나누어 배양하였다.

그리고, 세포 생존율 측정(MTT assay), 세포의 형태관찰, cDNA 분석(array)을 이용한 차별적인 유전자 발현(differential gene expression) 관찰, 배양배지에서 NOx 발생량을 HPLC로 확인, 카스파제-3 활성도 측정, 배양배지와 세포 용해질에서 웨스턴 블랏(western blot)과 자이모그래피(zymography)를 시행하여 MMP의 발현과 프로테아제 활성을 측정, RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR) 시행을 통하여 iNOS와 MMP의 mRNA 발현을 측정하였다.

그 결과, 양막성분 투여군에서 세포에 대한 생존율이 높았다. 양막성분 투여군의 배양배지에서 NO 발생량이 감소되었고, iNOS도 RT-PCR 과 cDNA 분석에서 발현이 감소되었다. 양막성분을 투여할 때 투여량에 따라 카스파제-3 활성도가 감소하고, 유전자 발현도 감소하였다. 상층액보다 하층액에서 MMP-1, 2가 많이 측정되었으며, 양막성분 투여 후 배양시 발현이 억제되었다. MMP-2에 대한 RT-PCR에서 TNF 처리한 양막투여군에서는 발현이 억제되었으나, IL-1 처리한 양막투여군에서는 거의 비슷하였다. 또한, cDNA 분석 상에서는 MMP-1, 2, 3, 9가 비슷하거나 약간 증가되었다.

따라서, 양막성분은 세포보호 효과를 가짐을 알 수 있다. 또한, 양막성분은 염증유발 유전자의 발현을 억제하고, 세포고사를 막으며, 세포의 분화를 촉진시키는 것으로 보이며, 이를 통하여 조직손상을 억제하고, 조직손상의 진행과정을 억제함을 알 수 있었다.

실시예 3

알칼리 화상을 입힌 가토의 각막에 대하여 3 일간 일시적 양막이식술을 시행하여 본 결과 다형 백혈구 등의 염증 세포 침윤 방지와 메탈로프로테이나제(Metalloproteinase) 억제 효과를 통하여 보다 신속하게 창상 치유가 이루어짐을 발견할 수 있었다. 따라서 양막을 분쇄하여 안 점안액으로 만들어 사용할 경우 동일한 효과를 기대할 수 있는 지를 다음과 같은 방법으로 알아보았다.

가토안 28안에 직경 6 mm의 원형 여과지를 1 N NaOH 용액에 침적시킨 다음 이를 각막에 30 초간 적용시키고 제거한 뒤 생리식염수로 5 cc로 세척하였다. 양막 분쇄액만을 사용한 군(그룹 1, n=7), 양막 분쇄액과 메틸셀룰로오스 1 : 1 혼합액을 사용한 군(그룹 2, n=7), 대조군으로 메틸셀룰로오스만을 사용한 군(그룹 3, n=7), 2번째 대조군으로 아무 것도 사용하지 않은 군(그룹 4, n=7)으로 각각 분류하였다. 그리고, 각각 1 주일간 대상 물질을 하루 4 회씩 점안하였다. 각막 상피 결손 면적은 35 mm 촬영 슬라이드 필름을 투사하여 비디오 카메라로 스캐닝한 뒤 이를 모니터 상에서 면적 측정 프로그램을 이용하여 측정하였다. 각막 부종의 판정을 위해 각막 두께의 변화를 파키미터(Pachymeter)를 이용해 각막 중심부에서 측정하였다. 실험 5주째까지 매주 동일한 방법의 측정을 시행하였다.

그 결과, 각막 상피 결손은 대조군(그룹 3, 그룹 4)에 비해 양막 분쇄액을 점안한 실험군(그룹 1, 그룹 2)이 모두 P 값 0.05 이하로 회복 속도가 빨랐으나 실험군들 사이의 차이는 통계적으로 의의가 없었다. 각각의 군에서 알칼리 화상 후의 상피결손면적은 3일 째부터 양막 분쇄액을 점안하지 않은 대조군과 양막 분쇄액을 점안한 실험군 사이에서 차이가 났으며 이후 5 주째까지 지속적으로 의미있게 유지되였다. 상피의 재발성 상피 탈락이 일어나는 2 ∼ 3주 째에 실험군에서 비교적 일정하게 상피결손면적이 감소하는데 반하여 대조군에서는 재발성상피결손이 나타났다. 이후 5주 째에는 대조군과 실험군 사이에 뚜렷한 차이를 보였다[도 2 및 도 3 참조].

각막 부종은 1 주일 째에 실험군이 대조군보다 각막 부종이 적은 양상을 보인 후 이후 시간 경과에 따라 실험군과 대조군 사이의 특이한 차이를 보이지는 않았으나, 최종 5 주 째에는 부종이 적어져 실험군이 대조군에 비해 통계학적으로 의의있게 부종이 적었다[도 4 및 도 5 참조].

다음 표 1은 2주째 및 5주째에 측정한 각막의 혼탁도를 나타낸 것으로, 2주째와 5주째에서 실험군이 대조군에 비해 혼탁도가 적었다.

실시예 4 : 점안겔제의 제조

본 발명의 양막 추출물을 함유한 점안겔제의 제조방법은 다음과 같다.

양막 추출물 5 ㎎

카르보폴 934 20 ㎎

트리에탄올아민 적량

파라옥신안식향산메칠 2 ㎎

멸균 정제수 ad. 1 g

멸균 정제수에 파라옥신안식향산메칠을 가하고 가열하여 용해한 후 냉각시키고 양막 추출물을 용해시켰다. 여기에 카르보폴 934를 가하여 고속교반기로 혼합하여 분산시킨 다음 정치하여 공기를 제거하였다. 여기에 트리에탄올아민을 한 방울씩 가하면서 공기가 들어가지 않도록 주의하면서 교반하여 제조하였다

실시예 5 : 점안액제의 제조

본 발명의 양막 추출물을 함유한 점안액제의 제조방법은 다음과 같다.

양막 추출물 5 g

염화벤잘코늄 0.1 g

염화나트륨 5 g

붕산 6.2 g

티록사폴 1.0 g

묽은 염산 적량

멸균 정제수 ad. 1000 ㎖

양막 추출물에 양막 추출물, 염화나트륨, 붕산을 순서대로 투입하여 용해하고, 여기에 소량의 멸균 정제수에 용해시킨 염화벤잘코늄, 티록사폴을 가하여 교반하였다. 묽은 염산을 가하여 pH를 조정하였다. 멸균은 0.45 마이크로필터를 사용하여 실시하였다.

실시예 6 : 점안 연고제의 제조

본 발명의 양막 추출물을 함유한 점안 연고제의 제조방법은 다음과 같다.

양막 추출물 5 ㎎

멸균 정제수 10 ㎎

파라옥시안식향산메칠 2 ㎎

무수 라놀린 100 ㎎

백색 바셀린 ad. 1 g

멸균한 유리제 사발에 양막 추출물과 파라옥시안식향산메칠을 취하고, 양막 추출물을 가하여 녹인 후, 여기에 무수 라놀린을 가하면서 연합하여 균질하게 될 때까지 혼화하여 제조하였다.

실시예 7 : 독성실험

본 발명의 양수 추출물에 대하여 독성시험을 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로 상기 추출물을 암수 토끼 각각(군당 5마리)에 양막 추출물을 복강 및 구강으로 각각 농도별로 투여한 다음 14일 동안 관찰하여 사망률을 측정하였다. 투여 최고 용량인 체중 ㎏당 5 ㎖의 용량에서도 사망예는 전혀 관찰되지 않아 LD₅₀치의 산정은 불가능하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 양막 추출물은 각종 안구표면질환 치료에 유효하므로 점안 치료제 예를 들면 점안액제, 점안겔제, 점안 연고제로 제제화하여 편리하게 사용할 수 있다.

Claims (9)

1. 안구표면질환 치료에 유효한 것임을 특징으로 하는 양막 추출물.
2. 양막 추출물이 유효성분으로 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 점안제.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 양막 추출물에 대하여 항생제 또는 하이아로론산(Hyalouronic acid)이 0.01 ∼ 99.9 중량%로 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 점안제.
4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 점안제가 겔형태 또는 수용액 형태인 것임을 특징으로 하는 점안제.
5. 양막 추출물이 유효성분으로 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 점안 연고제.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 양막 추출물에 대하여 항생제 또는 하이아로론산(Hyalouronic acid)이 0.01 ∼ 99.9 중량%로 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 점안 연고제.
7. a) 태반으로부터 양막을 박리하는 과정,

   b) DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 세포배양배지, 글리세롤 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)가 함유된 보관용액에 상기 양막을 담구는 과정,

   c) 상기 양막 보관용액에 액체 질소를 첨가하고 냉동 건조 상태에서 막자 사발을 이용하여 분쇄하는 과정,

   d) 상기 분쇄물을 균등기 균질화하고 원심분리을 수행하여 상층액을 수득하는 과정, 및

   e) 추출된 상층액을 한외 여과막 필터(Centrikon)를 이용하여 여과하는 과정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 양막 추출물의 제조방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 여과된 양막 추출물을 건조시켜 분말화하는 과정이 추과되는 것을 특징으로 하는 양막 추출물의 제조방법.
9. 제 7 항에 있어서, 상기 양막 추출물은 메틸셀룰로오스와 혼합하여 자외선 차단이 가능한 병에 담아 저온냉장 보관하는 것을 특징으로 하는 양막 추출물의 제조방법.