RU2233171C2 - ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ L-ЛИЗИН-α-ОКСИДАЗЫ ИЗ ГРИБА РОДА TRICHODERMA И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТОГО ФЕРМЕНТА - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к полифункциональной композиции на основе производного L-лизин-α-оксидазы из гриба Trichoderma и способу получения этого фермента. Сущность изобретения заключается в создании полифункциональной фармацевтической композиции на основе L-лизин-α-оксидазы из гриба Trichoderma, содержащей этот фермент и фармацевтически приемлемый носитель. Композиция дополнительно содержит усилитель биологической активности, выбранный из группы: антиоксидант, витаминный препарат, иммуномодулятор или их сочетание, и фармацевтически приемлемый носитель при соотношении компонентов, указанном в формуле изобретения. Способ очистки фермента позволяет получить высокоактивную лизиноксидазу (ЛО) из гриба рода Trichoderma, обладающую весьма широким спектром действия. 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 11 табл.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к полифункциональной композиции на основе производного L-лизин-α-оксидазы из гриба рода Trichoderma и способу получения этого фермента.

Известен препарат L-лизин-α-оксидазы из гриба рода Trichoderma, обладающий антивирусными и противоопухолевыми свойствами [1].

Известный препарат достаточно хорошо изучен, разработан способ его получения [2], однако он обладает невысокой специфической активностью, спектр его действия не столь широк.

Технической задачей настоящего изобретения является создание полифункциональной фармацевтической композиции на основе нового производного L-лизин-α-оксидазы из гриба рода Trichoderma, обладающего весьма широким спектром биологического действия: антимикробного, антивирусного, включая ВИЧ-инфекцию, иммуномодулирующей и антихламидиозной активностью, а также противоопухолевым, ранозаживляющим и микоплазмостатическим действием.

Другой технической задачей работы является модифицирование способа очистки фермента с целью получения высокоактивной лизиноксидазы (ЛО) из гриба рода Trichoderma.

Поставленная задача решается путем создания фармацевтической композиции на основе лизиноксидазы из гриба рода Trichoderma, содержащая L-лизин-α-оксидазу из этого гриба и фармацевтически приемлемый носитель, при этом композиция содержит L-лизин-α-оксидазу из гриба Trichoderma harzianum Rifai, депонированного в Коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики под №F-180, которая дополнительно содержит усилитель биологической активности (УБА) и фармацевтически приемлемый носитель при следующем соотношении компонентов (на 100 вес.ч.):

L-лизин-α-оксидазы (ЛО) 0,001-0,5

Усилитель биологической активности 0,01-15,0

Носитель Остальное

при этом фармацевтическая композиция обладает одновременно антибактериальной, антивирусной (включая ВИЧ) и иммуномодулирующей активностью, противоопухолевым и ранозаживляющим, а также антихламидиозным и микоплазмостатическим действием.

ЛО нами получена из культуральной жидкости гриба Trichoderma harzianum Rifai, депонированного в Коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики №F180, дополнительно очищенного в градиенте элюции NaCl 0,3-0,8 и на Сефадексе G-100 или G-200, имеющего изоэлектрическую точку в области рН 4,25, молекулярную массу 114,39 кДа (одной субъединицы - 60 кДа), оптимум рН 7,4. Широта спектра и качество биологической активности препарата значительно усилены за счет получения новым способом лизиноксидазы и введения в состав композиции вещества, которое по функциональному действию мы обозначили как усилитель биологической активности.

Усилитель биологической активности представляет собой вещество, выбранное из группы: антиоксидант, витаминный препарат, иммуномодулятор или их сочетание.

В качестве антиоксиданта может быть использовано вещество, относящееся к группе как природных, так и синтетических антиоксидантов.

Природные антиоксиданты делятся на две основные группы: 1) ферментные антиоксиданты и 2) некоторые витамины (эндогенные антиоксиданты).

В состав композиции могут быть включены такие антиоксиданты, как супероксиддисмутаза, глутатион, глутатион-S-трансфераза, церулоплазмин, мочевая кислота, витамины группы А, Е, С и К или их активные компоненты, например α-токоферол, каротиноиды. Из синтетических антиоксидантов весьма эффективны азотокоферол, дибунол (ионол), пробукол и другие.

Витаминные препараты могут быть использованы как жиро-, так и водорастворимые: тиамин, фосфотиамин, рибофлавин, флавинат, витамин РР, пантотеновая кислота, пиридоксин, фолиевая кислота, цианокобаламин, витамин Р, а также ретинол, кальциферол, липоевая кислота, любое сочетание совместимых витаминов, поливитаминные препараты: например, аевит, масло шиповника, облепиховое масло, рыбий жир, а также очищенное соевое, кукурузное и оливковое масло, жир печени трески, акулий жир.

В качестве усилителя биологической активности фармацевтическая композиция может содержать вещество, обладающее иммуномодулирующей активностью как per se, так и в сочетании друг с другом или в комбинации усилителями биологической активности: антиоксидантом, витаминным препаратом.

Предлагается использовать следующие иммуномодуляторы: миелопид, тимоген, тактивин, тималин, натрия нуклеинат, левамизол, полудан, левкадин, продигиозан, лейкомакс, пирогенал, а также различные типы интерферонов и интерлейкинов.

В качестве носителя использованы гелевые и мазевые основы, в том числе и глазные, а также вода для инъекций. В частности: липофильные (вазелин, сплавы углеводородов), силиконовые; гидрофильные - гели высокомолекулярных белков и углеводов (эфиры целлюлозы, крахмала, желатина), гели неорганических веществ (бентонит), гели синтетических высокомолекулярных соединений (полиэтиленоксида, полиакриламида), различные полиэтиленгликоли.

Композиция иллюстрируется следующими примерами (в вес.ч.)

Пример 1 (глазная мазь):

Лизиноксидаза(ЛО) 0,05-0,02

α-токоферол 0,01-0,1

Ретинол 0,1-0,3

Ланолин безводный 5,0-10,0

Вазелин Остальное до 100

Пример 2 (гель для различных поражений кожи, включая трофические и раковые):

ЛО 0,005-0,02

Дибунол 0,05-0,5

Пантотеновая кислота 0,03-0,06

Акулий жир 2,5-5,0

Бентонит Остальное

Пример 3 (глазные капли):

ЛО 0,003-0,01

Витамин РР 0,01-0,02

Вода для инъекций До 100

Пример 4 (мазь преимущественно при опухолевом поражении):

ЛО 0,008-0,01

Леакадин 0,5-1,5

Пантотеновая кислота 0,01-0,3

Глутатион 0,05-0,07

Глицерин 5,0-10,0

Вазелин До 100

Пример 5 (мазь для различных поражений кожи и слизистой оболочки, может быть использована при лечении ожогов, а также в гинекологии и стоматологии):

ЛО 0,005-0,3

Миелопид 0,02-0,03

Азотокоферол 0,01-0,05

Эргокальциферол 0,06-0,13

Ланолин безводный 10,0

Вазелин До 100

Другим аспектом изобретения является способ получения ПЛО, который состоит в следующем.

Для получения ЛО используют культуральную жидкость гриба Trichoderma harzianum Rifai, депонированного в Коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики №F180, выделение препарата проводят высаливанием белковой составляющей насыщенем исходного сырья нарастающими концентрациями (NH₄)₂SO₄. Результаты этапов выделения показаны в таблицах 1-3.

Из таблицы 1 видно, что первое высаливание примесных белков без осаждения фермента необходимо проводить до 15% насыщения (NH₄)₂SO₄. При последующем высаливании до конечной концентрации (NH₄)₂SO₄ 70% насыщения большая часть очищенного фермента выпадает в осадок.

Далее нами было проведено выделение и очистка ПЛО из 55 мл культуральной жидкости. После окончательного высаживания фермента до 70% насыщения (NH₄)₂SO₄ и растворения его в минимальном объеме фосфатного буфера раствор фермента диализовали против 2 смен 20 мМ NaCl фосфатного буфера рН 7,4 и наносили на колонку с ионообменной смолой DEAE-сефацелом, уравновешенную тем же фосфатным буфером. Размер колонки 1,5-20 см. Полученный диализат разделили на две части. Большую часть нанесли на колонку и фермент элюировали с помощью градиента концентрации NaCl от 0 до 0,6 М. В полученных фракциях определяли активность фермента. Оказалось, что конечной концентрации NaCl 0,6 М недостаточно для снятия фермента. Поэтому оставшуюся часть раствора белка после диализа наносили на ионообменную смолу и фермент элюировали с помощью градиента концентрации NaCl от 0 до 0,8 М - элюция фермента начиналась с 0,3 М. Фракции, содержащие фермент, после 1 и 2 колонок объединяли, белок осаждали сульфатом аммония (70% насыщения) и после центрифугирования осадки растворяли в фосфатном буфере. Полученный раствор, содержащий фермент, разделили на две порции. Первую порцию нанесли на колонку с сефадексом G200 с учетом того, что молекулярная масса фермента около 140 кДа. Размер колонки 0,9·90 см. Смола уравновешена 20 мМ фосфатным буфером рН 7,4. В полученных фракциях определяли активность лизиноксидазы и фракции объединяли. Вторую порцию наносили на колонку с сефадексом G200. Результаты выделения и очистки фермента представлены в таблице 2. Как видно из таблицы, удельная активность фермента повысилась от 4 до 200 ед/мг. Также показано, что для очистки можно использовать сефадекс G100.

Содержание лизиноксидазы на каждой стадии очистки контролировали с помощью электрофореза в ПААГ (10%).

Нами также был проведен опыт по выделению и очистке ЛО из 300 мл культуральной среды. Результаты представлены в таблице 3. В результате получен фермент с удельной активностью 292 ед/мг белка. Электрофорез в 10% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия показал, что очищенный фермент обнаруживается в виде преимущественно одной полосы в области 60 кДа.

Нами проведен опыт по лиофилизации фермента после конечной стадии очистки. Лиофильно высушенный препарат содержит то же количество единиц фермента, которое было взято до лиофилизации, и представляет собой белый порошок. Данные представлены в таблице 3.

ЛО, полученная согласно заявленному способу, обладает следующими свойствами:

- субстратная специфичность: подвергает необратимому окислительному дезаминированию аминокислоту L-лизин;

- высокой степенью субстратной специфичности по отношению в лизину; значение константы Михаэлиса (К_м) равно 1,4+0,1·0,01 мМ (субстрат L-лизин);

- рН-оптимум каталитической активности равен 7,4;

- изоэлектрическая точка равна 4,25;

- молекулярная масса по данным гель-фильтрации на сефадексе G-200 и гель-электрофореза равна 114+39 кДа;

- молекула фермента состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 60 кДа каждая;

- при 60°С и рН 7,4 через 2 часа инкубация в плазме крови человека и трис-НСl буфере фермент сохраняет 75% и 68% активности соответственно;

- ингибиторами фермента являются 4-азо-D, L-лейцин и 6-диазо-5-оксинорлейцин;

- в замороженном и лиофилизированном виде препарат может храниться в течение года без снижения специфической активности.

Далее приведены конкретные примеры по испытанию различных биологических активностей заявленной композиции.

Результаты исследования биологической активности ЛО представлены в виде конкретных экспериментальных примеров.

Пример 6

Для изучения цитотоксического и антивирусного действия производного ПЛО, а также ингибирующего действия ЛО на экспрессию антигенов вируса герпеса простого 1 (ВГП 1) типа или репродукцию вирусов, была использована чувствительная к вирусу перевиваемая клеточная линия почек зеленой мартышки Vero.

Данные по цитотоксическому действию ЛО на клетки Vero представлены в таблице 4.

Умеренная токсичность определялась как гибель 7-10% клеток, токсичность - как гибель более 10% клеток. В контрольных культурах количество мертвых клеток не превышало 5%.

В экспериментах по изучению влияния ЛО на репродукцию вируса герпеса клетки Vero культивировали in vitro по стандартной методике (как и в экспериментах по изучению цитотоксического действия) на среде RPMI-1640, содержащей 100 ед/мл ампициллина и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Клетки выращивали в стандартных стеклянных пробирках при температуре 37°С. посевная доза составляла 500000 клеток в 1 мл культуральной среды. После образования сплошного монослоя (контроль под световым микроскопом) клетки заражали ВГП-1 из расчета 1 и 0,1 БОЕ/клетка (бляшкообразующая единица). После инкубирования при 37°С в течении 30 минут вируссодержащую жидкость удаляли, клетки трижды промывали средой и затем добавляли культуральную среду, содержащую ПЛО в различных концентрациях.

Ингибирование репродукции вируса в клетках Vero оценивали по снижению цитопатического действия ВГП-1 на клетку. Результаты представлены в таблице 5.

Как видно из полученных результатов, концентрация лизиноксидазы 0,01 Е/мл (0,3 мкг/мл) вызывает снижение цитопатического действия ВГП-1 на клетки, культивируемые in vitro примерно в 100000 раз.

Ингибирование ЛО экспрессии антигенов ВГП-1 определяли через 24 часа после заражения культивируемых клеток Vero методом иммуноблоттинга. Множественность заражения 1 БОЕ/клетка. В качестве одного контроля - наличие антигенов ВГП-1 в инфицированных клетках Vero, второго контроля - неинфицированные клетки. Исследовались концентрации ЛО 0,7 нг/мл, 0,07 мкг/мл и 0,7 мкг/мл.

Результаты иммуноблоттинга продемонстрировали полное подавление экспрессии вирусных антигенов (оболочечных белков gB, gD, gp80).

Пример 7: Изучение действия ЛО на развитие герпетического заболевания, вызванного ВГП-1 при заражении глаз и кожи кроликов.

Объект исследований: кролики породы шиншилла весом 1000-1100 г.

Исследуемая модель - поврежденная роговица обоих глаз и кожи в области лопаток, зараженные ВГП-1. Для экспериментов использовали штамм Л₂ ВГП-1 музея института вирусологии РАМН им. И.Д. Ивановского, который вносили в дозе 10⁵ тканевых цитопатических единиц, что составляет 50% от летальной дозы.

Эффективность действия препарата при герпетическом заболевании оценивали по следующим параметрам:

- ежедневная оценка макроскопической картины заболевания глаза и кожи;

- иммунологические исследования материала, выделяемого из очагов поражения на 1, 2, 4, 5 и 7 сутки после поражения;

- морфологические данные (препараты роговицы и участков кожи) на 7 сутки после заражения.

Схемы лечения животных препаратом ЛО в виде раствора и геля суммированы в таблице 6.

Лечение герпетической инфекции в области повреждений кожи и роговицы глаз кроликов проводили непосредственно после заражения ВГП-1. Лечебный эффект был заметен уже на 3-4 день после заражения.

В контрольной группе нелеченных животных макроскопически наблюдали отек, слезотечение, выраженную инъецированность сосудов перикорнеальной и конъюнктивальной зон. На гистологических препаратах эпителий роговицы на значительном протяжении отсутствует по всей толщине собственного слоя, выражен отек и клеточная, преимущественно лейкоцитарная, инфильтрация.

В группе животных, получавших препарат в виде глазных капель (пример 3, раствор ЛО), структуры роговицы глаза были восстановлены лишь частично, в зоне изъязвлений отмечали небольшое утолщение эпителиального слоя, четко не прослеживалось и местами отсутствовала передняя пограничная мембрана, на всем остальном протяжении толщина эпителиального слоя роговицы в норме, клеточная инфильтрация в собственном слое выражена слабо, представлена лимфоцитами, эозинофилами. Описанная картина свидетельствовала об остаточных воспалительных изменениях и небольшом гиперпластическом процессе, свойственным ранним этапам заживления.

В группе животных, получавших ЛО в виде геля (пример 2), макроскопическая и гистологическая картины свидетельствуют о выздоровлении с полным восстановлением роговицы глаза, эпителиальный слой с ограниченными и единичными участками утолщения, собственный слой и внутренняя эпителиальная оболочка восстановлены без изменений.

Результаты макроскопических и морфологических наблюдений в основном совпадают с данными иммунологического анализа отделений из глаз животных, не получавших лечения, и глаз леченных животных. Введение препарата при вирусном заражении глаз подавляет синтез вирусных белков, причем лекарственная форма в виде геля по сравнению с раствором более эффективна.

Положительный лечебный эффект препарат также оказывает на герпетические поражения кожи кроликов. В контрольной группе животных макроскопически зона герпетического поражения представлена корочкой и зоной гиперпигментации вокруг зоны. Макроскопически эпидермис отсутствует, слой эпителиальных клеток наползает с краев дефекта. Дно дефекта покрыто некротизированными массами, субэпидермально выражено воспалительная инфильтрация - полиморфноядерные лейкоциты, макрофаги; по краю поражения незначительная инфильтрация клеток базального слоя эпидермиса и гиперкератинизация. Указанные изменения в зоне поражения свидетельствуют о сохраняющейся остроте воспалительного процесса как в поверхностных, так и в более глубоких слоях дермы.

Введение препарата в виде раствора непосредственно после заражения приводит к ускорению процесса заживления и формирования молодой грануляционной ткани в зоне поражения. На гистологических срезах видно, что происходит нормальная эпителизация кожи; весьма ограниченная воспалительная инфильтрация поверхностных слоев дермы, представленная в основном лимфоцитарными скоплениями и фибробластами.

Лечение зараженных участков кожи кроликов препаратом в виде геля (см. пример 2) было наиболее эффективным. Макроскопически в зоне герпетического поражения кожа гладкая, несколько пигментированная, практически имеет нормальную структуру. На гистологических срезах отмечали полное восстановление архитектоники нормальной кожи за исключением ограниченных участков истончения эпидермиса и явлений гиперкератоза. Методом иммуноблоттинга обнаружены значительные различия экспрессии белков ВГП-1, что в целом подтверждало результаты морфологических исследований. При герпетическом поражении кожи наблюдалась значительная экспрессия вирусных белков в течение всего периода заболевания, в то время как при лечении поражений препаратом и в виде раствора, а также в виде геля экспрессия белков ВГП-1 по сравнению с контролем выражена в меньшей степени.

Изложенные выше результаты лечения герпетической инфекции гелевой композицией на основе препарата ЛО доказали принципиальную возможность использования ее как антивирусного препарата, обладающего высокой эффективностью на ранних стадиях заболевания, особенно в виде геля. Однако при заболевании герпесом больные обращаются к врачу как правило на 2-3 сутки после заражения, в момент появления герпетических высыпаний. Следовательно, наиболее приближена к жизненной ситуации схема лечения, при которой применение лекарственных антивирусных препаратов начинают на 2-3 день после заражения.

В связи с этим исследовали эффективность препарата в различных дозах в виде геля на модели офтальмогерпеса и герпетических поражений кожи кроликов, зараженных ВГП-1. Лечение начинали через 24 часа после заражения. Результаты макроскопических и гистологических исследований, а также данные по иммунологическому анализу свидетельствовали, что препарат уже с первых апликаций оказывает значительный заживляющий эффект.

Применение препарата длительное время показало его высокую эффективность при лечении как офтальмогерпеса, так и герпетической инфекции кожи (полное восстановление структуры кожи или роговицы).

Результаты иммунологического анализа совпадали с характером морфологических изменений, выявленных при лечении герпетических поражений глаз и кожи. Эти результаты представлены в таблице 7, из которой следует, что торможение вирусспецифических белков в пораженных ВГП-1 участках кожи несколько слабее по сравнению с офтальмогерпесом, но к шестому дню экспрессия вирусных антигенов в соскобах глаз и кожи лабораторных животных отсутствует. Кроме того, не было зарегистрировано токсического и аллергического действия гелевой формы при втирании в кожу и глаза здоровых животных.

Пример 8: Влияние препарата ЛО на развитие герпетической генитальной инфекции у морских свинок.

В работе использовали вирус герпеса простого 2-го типа (ВГП-2) штамм MS, полученный из национальной коллекции вирусов США (Rockvill, Marylanod USA). Вирус поддерживали в пассажах на чувствительной культуре клеток Vero в среде RPMI-1640, содержащей 500 Е/мл бензилпенициллина.

Вирус, выделенный из мест поражения, определяли титрованием в культуре клеток Vero стандартным методом, результаты выражали в ТЦД₅₀.

В опытах использовали самцов морских свинок весом 300 г. Пред заражением животным давали наркоз внутримышечными (в/м) инъекциями кеталара в дозе 300 мг/мл. На предварительно скарифицированную поверхность слизистой полового члена (пениса) наносили 0,1 мл вирусной суспензии в дозе 10³ БОЕ/мл (ЛД/100) на животное. Клинические проявления острой герпетической генитальной инфекции у морских свинок оценивали по 5-бальной шкале.

Использовали несколько групп животных в эксперименте:

1-я группа (контрольная): животные этой группы не получали препарат;

2-я группа: животные получали ежедневное однократное комбинированное лечение препаратами ЛО путем аппликации 0,5 мл гелевой формы (пример 2) на участках поражения (концентрация 70 мкг/мл) и инъекциями водорастворимой формы препарата (пример 3) в объеме 0,25 мл (концентрация препарата 100 мкг/мл);

3-я группа: животные ежедневно получали однократное лечение препаратами ЛО путем аппликации 0,5 мл геля, в котором концентрация препарата составляла 70 мкг/мл, на участок поверхности слизистой пениса пораженной вирусом герпеса.

В контрольной группе животных типичные местные проявления генитального герпеса развивались через 24-48 часов после заражения. В начале на слизистой полового члена морских свинок появлялись единичные везикулярные высыпания. При прогрессировании заболевания число везикул увеличивалось, возникали сливные очаги с геморрагическим содержимым. К 4-5 дню появлялись симптомы генерализации герпеса: повышение температуры, вялость, парез функции тазовых органов и паралич задних конечностей. При нарастающих явлениях менинго-энцефалита к 7-8 дню наступал летальный исход.

Лечение препаратами ЛО оказывало значительное положительное воздействие на течение заболевания. Наибольший эффект был достигнут при лечении через час после заражения. Местные проявления у всех леченых животных ограничивались проявлением через 24 часа эритемы слизистой, которая полностью исчезала на 4-й день лечения.

При более позднем лечении, а именно через 48 часов после заражения, поражения имели более выраженный характер. Тем не менее, лечебный эффект был значительным и клиническая картина местных поражений в контрольной и опытной группах существенно различалась. В контрольной группе животных средний балл (степень выраженности клинических проявлений) составил 2,8, при этом морфологически очаги герпетических поражений имели тенденцию к слиянию и характеризовались выраженными экссудативными воспалительными изменениями. В опытных группах степень клинических проявлений составляла соответственно 1,8 и 2,2 балла для животных, получавших гель-композицию, и животных, леченых комбинированной композицией (пример 5) методом. Процесс не прогрессировал, слияние очагов не отмечали, фаза экссудации отсутствовала.

Максимальный положительный эффект был зарегистрирован на 5-ый день после заражения в группе животных, получавших композицию (пример 1): с антиоксидантом и ретинолом. Очаги герпетических высыпаний скрывались, происходило быстрое заживление эрозий с эпителизацией слизистой. Местный положительный эффект способствовал предупреждению развития осложнений. В опытных группах число парализованных животных снизилось до 20% и 30%, в то время как в контрольной группе это осложнение отмечалось в 100% случаев.

При дальнейшем наблюдении (на 7 день) летальность в контроле составила 80%, а в опытных группах соответственно 20% и 40%. Другое экспериментальное подтверждение лечебного действия ЛО было получено при анализе содержимого герпетических везикул на биологическую активность ВГП-2. Титр вируса тестировали в культуре клеток Vero после их заражения содержимым генитальных герпетических везикул. В контрольной группе наблюдали нарастание биологической активности вируса. В опытной группе при начале лечения через 48 часов после заражения наблюдали снижение активности вируса, пассированного на культивируемых клетках на 3-4 Ig ТЦД₅₀.

Таким образом, композиции на основе ЛО активно подавляли развитие генитальной герпетической инфекции, при этом действие композиций, содержащих УБО, оказалось наиболее эффективным.

Пример 9: подавление продукции HIV препаратом ЛО

Для изучения ингибирующего действия ПЛО на продукцию HIV (тип HIV-I) были использованы клетки МТ-4 (перевиваемая линия, культивируемых in vitro Т-лимфоцитов человека), чувствительные к цитопатическому действию вируса. Действие ПЛО сопоставляли со стандартным препаратом, широко используемым в настоящее время для лечения больных СПИДом азидотимидином (AZT).

В лунки 24-ячейного планшета стерильно вносили 1,8 мл суспензии клеток МТ-4 в концентрации 5×100000 клеток/мл в культуральной среде RPMI-1640 (100 ед/мл ампицилина), содержащей различные концентрации препаратов.

Препараты ЛО готовили следующим образом: исходный фермент в количестве 100 мкл (уд. Акт. 142 Е/мг) разводили средой RPMI-1640 в соотношении 1:50 (до 5 мл), далее из этого раствора стерильным наконечником отбирали 4,5 мкл и добавляли к 18 мл суспензии клеток. Разливали по 1,8 мл в каждую лунку и доводили объем средой или вируссодержащей жидкостью до 2 мл. Это составило конечную концентрацию ЛО 1:1000 Е/мл культуральной среды. В контроль вместо вируса добавляли 0,2 мл среды на лунку. Дальнейшее уменьшение концентрации фермента 1:10000-1:1000000 достигали стандартными 10-кратными разведениями.

Вирус для испытания препарата получали из культуральной среды клеток МТ-4, который предварительно титровали на цитотоксическую активность. Вирус вносили в дозе 0,0001-0,00001 ЦПД (цитопатическая доза), что составило 0,2 мл, и доводили объем в каждой лунке до 2 мл. Антивирусное действие фермента проводили в сравнении со стандартной дозой AZT (3 мкМ/мл).

Как видно из представленных таблиц 8, 9, AZT вызывает полное подавление вируса в дозе 3 мкМ/мл, ЛО - в дозах 0,0001-0,000001 Е/мл. При более низких концентрациях ЛО уменьшение исходного титра HIV не наблюдалось. Увеличение концентрации ЛО, как видно из таблицы 8, вызывает цитотоксическое действие на клетки.

Таким образом, высокоочищенные препараты ЛО в концентрации 0,0001-0,00001 Е/мл полностью блокируют репродукцию HIV in vitro, не оказывая цитотоксического действия на клетки.

Использование ЛО в качестве ингибитора HIV показывает более высокую специфичность по сравнению с AZT, так как для ингибирования вируса требуется в 1000 раз меньше вещества, чем AZT.

Пример 10: Изучение противомикробного спектра действия ЛО.

В качестве тест-культур использованы штаммы музея культур лаборатории химиотерапии Института антибиотиков и ферментов (г. Санкт-Петербург), имеющие типичные видовые признаки.

Значения минимальных подавляющих концентраций определяли методом двухкратных серийных разведений в мясопептонном бульоне. Оценивали наибольшее разведение препарата, при котором имела место ингибиция роста микроорганизмов (титр).

Как следует из результатов, представленных в таблице А, препарат обладает выраженным ингибирующим действием в отношении кокков. Установлено, что подавляющее действие ферментного препарата на золотистые стафилококки (штаммы 2096, 5340, 0394) имеет место при его разведении 1/160 тыс. - 1/720 тыс. Выявлено подавляющее действие на бета-гемолитические стрептококки (1/640). Энтерококк малочувствителен к воздействию препарата (1/16).

К ферменту чувствительны сарцина (1/25 тыс.), аэробные спорообразующие бациллы (1/320), листерии (1/640).

Кишечная палочка, протей, синегнойная палочка, энтеробактер, клебсиеллы, цитробактер устойчивы к препарату (<1/6).

Дрожжеподобные грибы рода Candida чувствительны к ферменту (1/200-1/400). Грибы Mucos также чувствительны к препарату (1/3200).

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что препарат ЛО, полученный в соответствии с заявленным способом, per se высокоактивен в отношении грамположительных бактерий. Выявлена наибольшая активность для золотистого стафилококка, в том числе устойчивых к таким широко применяемым в медицинской практике антибиотикам, как бензилпенициллин, тетрациклины, левомицетин, эритромицин, олеандомицин.

По спектру антимикробного действия ЛО близок к лизоциму, который нашел применение в оториноларингологии, в офтальмологии при гнойных осложнениях после операций на глазах, в хирургической практике для лечения ран и ожогов, в гинекологии при лечении эрозий, в стоматологии при лечении катаральных и язвенных стоматитов.

Высокая активность в отношении резистентных к антибиотикам штаммов золотистого стафилококка препарата ЛО согласно изобретению открывает перспективы для применения композиций на его основе при гнойной патологии, вызванной чувствительной микрофлорой.

Пример 11: Изучение ранозаживляющего действия ЛО на модели карциномы кожи мышей, индуцированной метилхолантреном.

Опыты проводили на мышах линии С57В1/8 массой 20-25 г. Экспериментальные карциномы получали втиранием в течение 6 месяцев в кожу животных 0,5%-ный раствор метилхолантрена в ацетоне.

За развитием карцином в опытной и контрольной группах следили на протяжении 3-6 недель.

Композицию (см. пример 2) наносили на изъязвленные участки кожи в гелевой форме. Контрольной группе втирали в кожу гель без ЛО и других активных компонентов. Результаты свидетельствуют, что композиция существенно способствует ранозаживлению карцином. Ежедневное, однократное втирание активного геля в течение 3 недель уменьшало размер карцином на 40%. При длительном использовании геля (6 недель) эффект возрастал до 50%.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженном ранозаживляющем действии ЛО даже в случае, когда причиной кожных поражений являются опухоли, индуцированные химическими канцерогенами.

Пример 12: Иммуномодулирующая активность препарата ЛО per se.

Оценку иммуномодулирующей активности ЛО проводили на модели эндогенного колониеобразования, используя мышей линии F/CBA С151В1 по методу, описанному в монографии (Петров, Хаитов. Контроль и регуляция иммунного ответа, 1981, стр. 310). Животным внутривенно двукратно вводили водный раствор ЛО в дозе 0,5 мг. На третий день мышей облучали дозой 600 Р (рентген) на аппарате РУМ 17. После облучения препарат вводили еще три раза в той же дозе. Животные были распределены на 4 группы по 10 мышей в каждой:

1. Облученные, не иммунизированные ЛО

2. Облученные, иммунизированные ЛО.

3. Облучение + введение клеток лимфоузлов родительского генотипа.

4. Облучение + введение клеток лимфоузлов родительского генотипа + введение раствора ЛО.

Доза лимфоцитов мышей, вызывающая 50%-ную инактивацию КОЕ (колониеобразующие клетки), составила 1 млн клеток.

На 9 сутки мышей забивали, удаляли селезенки и после фиксации подсчитывали число колоний на поверхности органа.

Клетки линии МТ-4 (лимфобластоидная клеточная линия человека, культивируемая in vitro) выращивали на среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крови теленка 100 ед/мл ампициллина. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

За скоростью синтеза ДНК следили по включению в кислотонерастворимую фракцию 3-Н-тимидина. Конечная концентрация метки составляла 5 мкКю/мл. После 1 часа инкубации клеток с меченым предшественником к осадку клеток МТ-4 (1 млн клеток) добавляли 5%-ную трихлоруксусную кислоту, охлажденную до 4°С, промывали осадок 3 раза холодной кислотой и затем осадок растворяли в 1 мл 0,1 нормальной NaOH. На фильтры для подсчета радиоактивности наносили 0,1 мл образца. Радиоактивность образцов регистрировали на спектрометре в толуоловом сцинтилляторе (10 мл) в течение 1 мин.

В таблице 10 представлены результаты определения иммуномодулирующей активности. Видно, что введение препарата вызывает достоверную стимуляцию КОЕ более чем на 250% (253,5%), что свидетельствует о наличии выраженных иммуномодулирующих свойств препарата ЛО. Видно также, что иммуномодулирующая активность белка сохраняется и в случае ингибированием процесса эндогенного колониеобразования клетками лимфоузлов родительского генотипа. Разница между опытом и контролем составляет 181%.

Таким образом, результаты демонстрируют высокую иммуномодулирующую активность ЛО in vivo.

Был проведен анализ стимуляции препаратом ЛО репликативного синтеза in vitro лимфобластоидных клеток линии МТ-4. Результаты изучения скорости синтеза ДНК по включению меченого тимидина на разных стадиях роста показали заметное различие в скорости синтеза ДНК между опытными и контрольными культурами на 3 день. К 7-му дню роста в присутствии ПЛО интенсивность биосинтеза ДНК более чем в 2 раза (224%) превышает контрольный уровень. Концентрация ПЛО в культуральной среде МТ-4 в 10 раз ниже се концентрации, оказывающей цитотоксическое воздействие на клетки.

Следовательно, высокая иммуномодулирующая активность ЛО per se подтверждается данными in vitro.

Пример 13. Проводились также испытания препарата по его действию на микоплазмы и хламидии. Культуры представлены Московским научно-исследовательским институтом Микробиологии и Эпидемиологии им. Г.Н. Габричевского. Испытанию подвергались следующие культуры: Chlamydia trochomatis; Chlamydia pneumoniae; Ureaplasma urcaliticum; Mycoplasma hominis; Mycoplasma рnеumоniае.

Препарат ЛО per se показал антихламидиозный и микоплазмостатический эффект.

Таким образом, заявленная композиция, созданная на базе L-лизин-α-оксидазы, обладает широким спектром действия и может быть использована при различных (включая онкологические) поражениях кожи, инфекции глаз, генитальных инфекциях в виде наружных мазей и гелей, а также для внутримышечных, внутривенных и подкожных введений при микробных и вирусных (включая ВИЧ) инфекциях. Действия новых фармацевтических композиций распространяется также на хламидиозные и микоплазматические поражения.

Источники информации

1. Смирнова И.П. и др. Вопросы медицинской химии, 1998, вып.4, стр.384-387.

2. SU 1218676 А, 29.04.1984, кл. C 12 N 9/02.

Claims (7)

1. Полифункциональная фармацевтическая композиция на основе L-лизин-α-оксидазы из гриба Trichoderma, содержащая названный фермент и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что содержит L-лизин-α-оксидазу из гриба Trichoderma harzianum Rifai, депонированного в Коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики под № F-180, дополнительно очищенную в градиенте элюции NaCl 0,3-0,8 М и на Сефадексе G100 или G200, имеющего изоэлектрическую точку в области рН 4,25, молекулярную массу 114,39 кДа (одной субъединицы - 60 кДа), оптимум рН 7,4, при этом композиция дополнительно содержит усилитель биологической активности, выбранный из группы: антиоксидант, витаминный препарат, иммуномодулятор или их сочетание и фармацевтически приемлемый носитель при следующем соотношении компонентов, 100 мас.%:

L-лизин-α-оксидазы 0,001-0,5

Усилитель биологической активности 0,01-15,0

Носитель Остальное

указанная фармацевтическая композиция обладает антибактериальной, антивирусной (включая ВИЧ), антихламидиозной и иммуномодулирующей активностью, а также противоопухолевым и ранозаживляющим, а также микоплазмостатическим действием.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве антиоксиданта содержит вещество, выбранное из группы: супероксиддисмутазы, глутатитон, глутатитон-S-трансфераза, церулоплазмин, мочевая кислота, витамины группы А, Е, С и К или их активные компоненты, например, α-токоферол, каротиноиды, азотокоферол, дибунол (ионол), пробукол.

3. Композиция по пп.1 и 2, отличающаяся тем, что в качестве витаминного препарата содержит вещество, выбранное из группы: тиамин, фосфотиамин, рибофлавин, витамин РР, пантотеновая кислота, пиридоксин, фолиевая кислота, цианокобаламин, витамин Р, а также ретинол, кальциферол, флавинат, липоевая кислота, аевит, масло шиповника, облепиховое масло, рыбий жир, а также очищенное соевое, кукурузное или оливковое масло, жир печени трески, акулий жир.

4. Композиция по пп.1-3, отличающаяся тем, что в качестве иммуномодулятора содержит вещество, выбранное из группы: миелопид, тимоген, тактивин, тималин, натрия нуклеинат, левамизол, полудан, леакадин, продигиозан, лейкомакс, пирогенал, а также интерферон, интерлейкин или их комбинация.

5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве носителя содержит мазевую, гелевую основу или воду для инъекций.

6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что может быть введена peros и парентерально.

7. Способ получения L-лизин-α-оксидазы из гриба рода Trichoderma, включающий осаждение фермента из культуральной жидкости гриба 15-70%-ным сульфатом аммония с последующей очисткой с помощью диализа и ионобменной хроматографии, отличающийся тем, что выделение фермента ведут из гриба Trichoderma harzianum Rifai, депонированного в Коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики под № F-180, элюцию с ионообменной смолы проводят в градиенте NaCl 0,3-0,8 М с последующей доочисткой на Сефадексе G-100 или G-200, уравновешенном 20 мМ фосфатным буфером при рН 7,4, полученный фермент имеет молекулярную массу 114,39 кДа (одной субъединицы - 60 кДа), изоэлектрическую точку 4,25, оптимум рН 7,4.