KR20110020819A - 안구건조증 및/또는 각막/결막 질환 치료용 약학 조성물 - Google Patents

안구건조증 및/또는 각막/결막 질환 치료용 약학 조성물 Download PDF

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레이코 다부치
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Abstract

본 발명은 안구건조증, 및/또는 각막/결막 장애의 치료용 약학 조성물을 개시한다. 약학 조성물은 활성 성분으로서 인간 혈청 알부민을 포함하고, 인간 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민을 코딩하는 유전자로 효모를 형질전환함으로써 생성되는 재조합 효모를 사용함으로써 제조된다. 또한 본 발명은 안구건조증 및/또는 각막/결막 장애의 치료가 필요한 환자에게, 인간 혈청 알부민을 코딩하는 유전자로 효모를 형질전환함으로써 생성되는 재조합 효모를 사용하여 생성되는 유효량의 인간 혈청 알부민을 투여하는 것을 포함하는 안구건조증 및/또는 각막/결막 장애의 치료 방법을 개시한다.

Description

안구건조증 및/또는 각막/결막 질환 치료용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF DRY EYE AND/OR CORNEAL/CONJUNCTIVAL DISORDERS}
본 발명은 숙주 효모 세포를 유전자 조작함으로써 수득된 재조합 효모 세포에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 안약 용도의 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 안구건조증, 및 각막 및 결막 병변의 치료에 유용하다. 본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 사용하는 각막 및 결막 병변의 치료 방법 및 안구건조증 상태 치료 방법을 제공한다.
각막 및 결막 병변은 각막 상피 표면의 결함에 의해 유발된다. 원인은 안구건조증, 다양한 각막결막염, 알레르기 및 미생물 (예를 들어 바이러스, 박테리아, 곰팡이 등) 의 감염과 같은 병원성 인자, 화학 물질에 의한 세포독성 및 산 및 염기로 인한 부식과 같은 화학적 인자, 안구 표면의 건조, 외부 물질 (예를 들어 콘택트 렌즈 등) 및 뜨거운 물로 인한 손상과 같은 물리적 인자 등을 포함할 수 있다. 안약 조성물에 포함된 방부제 (예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올 등) 및 안약용제 (예를 들어 아미노글리코사이드 항생제, 비-스테로이드성 항염제, IDU, 피마리신 등) 가 각막 상피의 병변을 야기한다는 것이 최근 보고되고 있다. 현재로서는, 각막 및 결막 병변을 치료하기 위하여 콘드로이틴 술페이트, 글루타티온, 히알루론산, 피브로넥틴, EGF 등이 투여되거나, 또한 누액을 보충할 목적으로 인공 누액이 투여되지만, 이러한 치료의 효과는 아직 충분하지 않다.
안구건조증은 눈물 결핍 또는 과다 증발로 인한 눈물막의 장애로 알려져 있으며, 안검 사이 (interpalpebral) 의 눈 표면의 훼손을 야기하는 눈의 불편감의 증상과 관련된다. 최근, 국제 안구건조증 공동연구회의 정의 및 분류 분과위원회 (Definition and Classification Subcommittee) 는 하기와 같이 새로운 안구건조증의 정의를 내렸다: 안구건조증은 불편감, 시력 장애 및 눈물막 불안정성의 증상과 함께 눈 표면에 잠재적인 훼손을 야기하는 눈물 및 눈 표면의 다인자 질병임. 이는 눈물막의 증가된 삼투압 및 눈 표면의 염증을 동반한다. 안구건조증은 하기 두 개의 주요 군으로 분류될 수 있다: 수성 눈물-결핍성 안구건조증 및 증발성 안구건조증. 수성 눈물-결핍성 안구건조증은 눈물샘 눈물 분비의 부족 때문이다. 증발성 안구건조증은 정상적 눈물샘 분비 기능의 존재 하에서의 노출된 눈 표면으로부터의 과다한 수분 상실 때문이다. 이러한 원인은 안검 구조 또는 원동력 (dynamic) 에 영향을 주는 내재적 질병으로 인한 내인성으로서, 또는 일부 외부적 노출로 인해 눈 표면 질병이 발생하는 경우에는 외인성으로서 기재되어 있다 (비특허 문헌 1). 안구건조증을 야기하는 다양한 인자가 있다. 감소된 양의 눈물을 정상으로 회복시키는 적합한 방법은 아직까지 발견되지 않았다. 현재로서는 안구건조증을 치료하기 위해, 눈물을 보충할 목적의 인공 누액, 및 자각 증상을 경감할 목적의 콘드로틴 술페이트, 글루타티온, 히알루론산, 피브로넥틴, 혈청 안약 등이 투여되지만 아직까지 그 효과가 충분하지 않다.
인간 혈청 알부민 (이하 HSA 라 함) 은 인간 혈장 단백질의 주요 성분이다. 이러한 단백질은 간에서 생성되고, 정상 범위 내로 혈액 몰랄삼투압 농도를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 또한, 단백질은 다양한 혈청 분자에 대한 담체로서 기능한다. 현재 HSA 는 외과 수술을 받은 이후의 상태, 충격, 화상 및 저단백혈증과 같은 체액의 상당한 손실과 관련된 상태의 치료에 사용된다. 예를 들어, 충격 또는 화상을 겪는 환자에게 HSA 를 반복적으로 투여하여서 감소된 혈액 부피를 회복하고 손상과 관련된 증상을 개선한다. HSA 는 또한 저단백혈증 및 태아적모구증의 치료에 사용된다.
현재로서는, HSA 는 기증 인간 혈액을 분별함으로써 제조된다. 따라서, 제조된 생성물의 단점은 고비용 및 기증 인간 혈액을 안정적으로 얻는데 있어서의 어려움이다. 또한, 기증 인간 혈액이 간염 바이러스와 같이 불리한 물질로 오염될 가능성이 있다. 따라서, HSA 의 대용이 될 수 있는 물질의 개발이 필요하다.
재조합 DNA 기술의 확립 이후, 다양한 유용한 폴리펩티드가 재조합 미생물에 의해 제조되고 있다. 재조합 HSA 의 대규모 제조는 유전자 조작 기술을 사용함으로써 달성되었고, 고도로 정제된 HSA 생성물이 제조되고 있다. 특허 문헌 1 은 피키아 효모 (Pichia yeast) 를 유전자 조작함으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민 (이후 "rHSA" 라 함) 을 개시하고 있다. 이에 따라 수득된 rHSA 는 현재 일본 후생 노동 복지성의 판매 허가를 받았으며, Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation (Osaka, Japan) 으로부터 상품명 "Medway
Figure pct00001
주사액" 으로 시판된다. HSA 와 유사하게, Medway
Figure pct00002
주사액이 외과 수술 이후의 상태, 충격, 화상 및 저단백혈증을 포함하는, 혈관으로부터의 상당한 체액 손실과 관련된 상태의 치료에 유용하다는 것이 밝혀져 오고있다. 또한, FDA-승인 재조합 인간 알부민 Albagen™ 이 약제용 첨가제로서 New Century Pharmaceuticals, Inc. (AL, US) 로부터 또한 시판된다. Albagen™ 은 또한 재조합 피키아 효모를 사용하여 제조된다. 비특서 문헌 2 는 사카로마이세스 효모 (Saccharomyces yeast) 의 유전자 조작에 의해 수득되는 재조합 인간 혈청 알부민을 개시한다. 상기 rHSA 는 또한 백신과 같은 의료 제품용 안정제로서 Novozymes Inc. 로부터 상품명 Recombumin
Figure pct00003
하에 FDA-승인을 받아 시판되고 있다.
특허 문헌 2 는 인간 혈청 알부민이 안구건조증 및 각막 및 결막 병변을 포함하는 여러 안질환의 치료에 유용하다는 것을 개시한다. 특허 문헌 3 은 0.001 ~ 0.3 ㎎/㎖ 만큼 낮은 농도로 HSA 를 포함하는 안구건조증 치료용 안약 조성물을 개시한다. 특허 문헌 3 에 따르면, 1.0 ㎎/㎖ (0.1 w/v%) 또는 초과의 HSA 를 포함하는 안약 제형은 눈에 대한 자극제이고, 국소적으로 눈에 투여되는 경우 국소 자극과 같은 문제를 야기한다.
특허 문헌 2 및 3 은 일반적으로 HSA 가 통상적인 유전 공학 방법에 의해 수득되는 재조합 인간 알부민으로 대체될 수 있다는 것을 개시한다. 그러나, 숙주 유기체로서의 효모를 유전자 조작함으로써 수득되는 재조합 인간 혈청 알부민의, 안구건조증 또는 각막 및 결막 병변에 있어서의 효과에 대해서는 정보가 없다.
특허 문헌 1: JP-A-6-100592
특허 문헌 2: WO97/039769
특허 문헌 3: JP-A-2000-319194
비특허 문헌 1: The Ocular Surface 2007 Apr, VOL. 5, No. 2: 12-28
비특허 문헌 2: Journal of Clinical Pharmacology 2005;45:57-67
상기 문서들은 본원에서 참조 인용된다.
본 발명의 목적은 신규한 안구건조증 및/또는 각막 및 결막 병변의 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
발명자는 효모 세포를 유전자 조작함으로써 수득되는 재조합 인간 혈청 알부민의 안구건조증 및 각막 및 결막 병변에서의 효과가, 선행기술 문헌에 개시된 기증 인간 혈액을 분별함으로써 수득되는 인간 혈청 알부민의 효과와 상이하다는 것과, 0.001 ~ 0.3 ㎎/㎖ 만큼 낮은 저농도의 재조합 인간 알부민은 안구건조증 또는 각막 및 결막 병변의 치료에 효과적이지 않은 반면, 10 ㎎/㎖ (1.0 w/v%) 또는 초과인 고농도의 재조합 인간 혈청 알부민은 눈 자극을 야기하지 않으면서 안구건조증, 및 각막 및 결막 병변의 치료에 효과적이라는 것을 발견하였으며, 본 발명을 완성하였다.
본 출원은 하기의 발명을 제공한다:
(1) 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 안구건조증 치료용 약학 조성물.
(2) 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 각막 및 결막 병변 치료용 약학 조성물.
(3) (1) 또는 (2) 에 있어서, 재조합 효모가 피키아 속 (genus Pichia) 또는 사카로마이세스 속 (genus Saccharomyces) 의 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 조성물.
(4) (3) 에 있어서, 효모가 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 또는 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 인 조성물.
(5) (1) 또는 (2) 에 있어서, 재조합 인간 혈청 알부민이 하기의 특성을 갖는 조성물:
재조합 인간 혈청 알부민 및, 재조합 인간 혈청 알부민과는 상이한 항원성을 갖는 단백질 및 다당류로 이루어지는 재조합 효모 세포로부터 기원한 오염물의 총량을 기준으로 한 재조합 인간 혈청 알부민의 순도는 99.999% 초과이고,
재조합 인간 혈청 알부민과는 상이한 항원성을 갖는 단백질 및 다당류로 이루어지는 재조합 효모 세포로부터 기원한 오염물의 총량은 효소 면역검정법 (EIA) 의 검출 한계 미만임.
(6) (1) 또는 (2) 에 있어서, 국소 점안용인 조성물.
(7) (1) 에 있어서, 안구건조증이 수성 눈물-결핍성 안구건조증 또는 증발성 안구건조증인 조성물.
(8) (1) 에 있어서, 안구건조증이 무루증, 각막건조증, 쇼그렌 증후군 (Sjogren syndrome), 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군 (Stevens-Johnson syndrome), 눈 유사물집증, 안과 수술 후 안구건조증, 알레르기성 결막염 수반 안구건조증, VDT (영상 단말기 (Visual Display Terminal)) 노동자의 눈물 감소 및 공기 조절장치로 인한 건조한 방에 의해 야기되는 임의의 전신 증상이 없는 눈물 감소를 포함하는 안구건조증 유사 상태로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
(9) (1) 에 있어서, 안구건조증이 증발성 안구건조증인 조성물.
(10) (2) 에 있어서, 각막 및 결막 병변이 안구건조증, 각막결막염, 알레르기 및 바이러스, 박테리아 및 곰팡이를 포함하는 미생물의 감염, 화학 물질에 의한 세포독성, 화학적 인자, 각막건조증, 안약 조성물에 포함된 방부제, 안약 조성물에 포함된 활성 성분, 안과 수술 및 안과 주사로 인한 손상에 의해 야기되는 각막 및 결막 상피의 결함, 각막 및 결막 짓무름 또는 각막 및 결막 종양인 조성물.
(11) 안구건조증 치료용 약학 조성물의 제조를 위한, 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민의 용도.
(12) 각막 및 결막 병변 치료용 약학 조성물의 제조를 위한, 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민의 용도.
(13) 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 안구건조증의 치료 방법.
(14) 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민의 유효량을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 각막 및 결막 병변의 치료 방법.
본 출원에 따르면, 유전적으로 변형된 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민의 안구건조증, 및 각막 및 결막 병변에서의 효과가, 특허 문헌 3 에 개시된 바와 같이 (즉 인간 혈액을 분리함으로써) 수득되는 인간 혈청 알부민과는 상이하다는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 안약 조성물은 효과적으로 안구 건조증 및/또는 각막 및 결막 병변의 치료에 유용하다.
발명을 수행하기 위한 최적 방식
본 발명에서, 유전자 조작에 의해 수득되는 rHSA-생성 재조합 효모는, 이것이 숙주 미생물로서 효모를 사용하여 유전자 조작에 의해 제조되는 한 특별하게 제한되지 않는다. 즉, 문헌에 보고된 것 또는 미래에 개발될 것이 적절하게 사용될 수 있다. 효모의 예는 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 피키아 (Pichia) 속에 속하는 것들을 포함할 수 있고, 특히 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces laactis), 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 가 바람직하게는 사용된다. 클루이베로마이세스 락티스 CBS2360 균주, 사카로마이세스 세레비시에 AH22 균주 (a, his 4, leu 2, can 1) 및 피키아 파스토리스 GTS115 균주 (his 4) 를 숙주 효모로서 사용하는 것이 보다 더 바람직하다. 특히 본 발명에서, 피키아 효모 및 사카로마이세스 효모, 특히 피키아 파스토리스 및 사카로마이세스 세레비시에가 바람직하게 사용된다.
rHSA-생성 재조합 세포의 제조, 재조합 세포의 배양에 의한 rHSA 의 생성, 및 배양균으로부터의 생성된 rHSA 의 분리 및 회수가 약간 변형될 수 있는 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, rHSA-생성 세포 균주의 제조는 하기의 방법을 사용하여 달성될 수 있다: 천연 HSA 유전자가 사용되는 방법 (JP-A-58-56684 (EP-A-73646), JP-A-58-90515 (EP-A-79739) 및 JP-A-58-150517 (EP-A-91527)), 신규한 인간 혈청 알부민 유전자가 사용되는 방법 (JP-A-62-29985 및 JP-A-1-98486 (EP-A-206733)), 합성 신호 서열이 사용되는 방법 (JP-A-1-240191 (EP-A-329127)), 혈청 알부민 신호 서열이 사용되는 방법 (JP-A-2-167095 (EP-A-319641)), 재조합 플라스미드가 염색체 내로 도입되는 방법 (JP-A-3-72889 (EP-A-399455)), 숙주가 융합되는 방법 (JP-A-3-53877 (EP-A-409156)), 돌연변이가 메탄올 함유 배지에서 생성되는 방법, 변종 AOX2 프로모터가 사용되는 방법 (JP-A-3-63598, JP-A-3-63599), HSA 가 고초균 (B.substilis) 에서 발현되는 방법 (JP-A-62-25133 (EP-A-229712)), HSA 가 효모에서 발현되는 방법 (JP-A-60-41487 (EP-A-123544), JP-A-63-39576 (EP-A-248657) 및 JP-A-63-74493 (EP-A-251744)), 및 HSA 가 피키아 효모에서 발현되는 방법 (JP-A-2-104290 (EP-A-3444S9)).
이러한 방법 중에서, 효모의 돌연변이가 메탄올-함유 배지에서 유발되는 방법이 하기의 방식으로 수행된다. 적절한 숙주, 바람직하게는 피키아 효모, 실례로는 GTS115 (NRRL 기탁 제 Y-15851 호) 균주의 전환은, AOX1 프로모터의 조절 하에 HSA 가 발현됨으로써 전사 단위를 함유하는 플라스미드를 숙주의 AOX1 유전자 영역 내로 도입시키는 것에 의한 일반적인 방식으로 수득된다 (비교 JP-A 2-104290). 이러한 형질전환체는 메탄올을 함유하는 배지에서 거의 생장하지 않는다. 결과로서, 이러한 형질전환체는 메탄올-함유 배지에서 배양되어 돌연변이를 발생시키고, 배지에서 생장할 수 있는 균주는 분리된다. 배지 내의 메탄올 농도는, 예를 들어 약 0.0001 내지 약 5 % 의 범위일 수 있다. 배지는 합성적 또는 천연적일 수 있다. 예를 들어, 배양은 약 1 내지 1000 시간 동안 약 15 내지 40 ℃ 의 온도에서 수행될 수 있다.
rHSA-생성 재조합 세포의 배양, 즉 rHSA 의 생성은 상기 특허에 개시된 방법 각각에 의해서나, rHSA-생성 재조합 효모 세포 및 생성물이 유가식 배양 (반-배치식 배양) 에 의해 고농도로 수득되는 방법에 의해서 달성될 수 있다. 유가식 배양은 점차적으로 고농도의 글루코스를 공급하여 재조합 세포에 반하는 기질 저해를 막음으로써 수행된다 (JP-A-1-219561). 재조합 세포의 배양은 배양 배지에 지방산을 첨가함으로써 rHSA 생산성이 개선되는 방법에 의해 또한 달성될 수 있다 (JP-A-4-293495 (EP-A-504823 및 미국 특허 제 5,334,512 호). rHSA 를 분리 및 수확하는 방법은, 예를 들어 열처리에 의한 프로테아제의 비활성화 (JP-A-3-103188), 및 음이온 교환체, 소수성 담체 및 활성탄의 군 중 어느 하나의 사용으로 착색 성분으로부터 rHSA 의 분리함에 의한 rHSA 의 착색의 억제 (JP-A-4-54198) 를 포함할 수 있다.
10 내지 26 개의 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 이의 염으로 보충되는 당업계에서 일반적으로 사용되는 배지는, 재조합 효모의 배양용 배지로서 사용될 수 있고, 재조합 효모의 배양은 공지된 조건 하에서 수행될 수 있다. 배지는 합성적 또는 천연적일 수 있지만, 바람직하게는 액체 배지이다. 예를 들어, 적합한 합성 배지는 하기로 구성될 수 있다: 다양한 당류와 같은 탄소 공급원; 요소, 암모늄염, 질산염과 같은 질소 공급원; 다양한 비타민, 뉴클레오티드와 같은 미량 영양소; 및 Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co 및 Cu 와 같은 무기염. 상기 배지의 실례는 0.7 % 의 효모 질소 기반 (Yeast Nitrogen Base) (Difco) 와 2 % 의 글루코스로 이루어지는 YNB 액체 배지이다. 유용한 천연 배지의 실례는 1% 의 효모 추출물 (Yeast Extract) (Difco), 2 % 의 박토 펩톤 (Bacto Peptone) (Difco) 및 2 % 의 글루코스로 이루어지는 YPD 액체 배지이다. 배지의 pH 는 중성, 약염기성 또는 약산성일 수 있다 메탄올자화 효모 (methylotrophic yeast) 의 경우에서, 배지는 또한 약 0.01 내지 5 % 의 양으로의 메탄올로 보충될 수 있다.
배양 온도는 바람직하게는 15 내지 43 ℃, 특히 20 내지 30 ℃ 의 범위이다. 배양 기간은 약 1 내지 1,000 시간의 범위이다. 배양은 정지 또는 진탕 배양, 또는 교반 (agitation) 하의 배치식, 반-배치식의 배양 또는 연속식 배양에 의해 수행될 수 있다. 본 배양에 앞서서 사전배양은 바람직하게는 배지, 예를 들어 YNB 액체 배지 또는 YPD 액체 배지를 사용하여 수행된다. 사전배양은 약 30 ℃ 에서 10 내지 100 시간 동안 수행될 수 있다.
배양이 완료된 후에, rHSA 는 공지된 분리 방법에 의해 배양 여과물 또는 효모 세포로부터 수확된다.
rHSA 의 정제는 다양한 분별 방법, 흡착 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과, 밀도 구배 원심분리 및 투석과 같은 통상적으로 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 정제 방법의 한 예는 하기 (1) 내지 (7) 의 단계를 포함한다:
(1) 100,000 내지 500,000, 및 1,000 내지 50,000 의 분별 분자량을 갖는 미세여과 막을 사용하여 인간 혈청 알부민-제조 재조합 효모 세포의 배양 상청액을 미세여과하는 단계;
(2) 50 내지 70 ℃ 에서 30 분 내지 5 시간 동안 rHSA 를 함유하는 분획을 가열하는 단계;
(3) pH 3 ~ 5 에서 산과 함께 rHSA 를 함유하는 분획의 pH 를 조절하는 단계;
(4) 이에 따라 처리된 생성물을 100,000 내지 500,000 의 분별 분자량을 갖는 미세여과 막으로 미세여과하는 단계;
(5) pH 3 ~ 5 및 0.01 ~ 0.2 M 의 염농도의 조건 하에서 rHSA 를 함유하는 분획과 양이온 교환체를 접촉시키고; pH 8 ~ 10 및 0.2 ~ 0.5 M 의 염농도의 조건 하에서 생성물을 용출시키는 단계,
(6) pH 6 ~ 8 및 0.01 ~ 0.5 M 의 염농도의 조건 하에서 소수성 크로마토그래피용 담체와 용출액을 접촉시키고 흡착되지 않은 분획을 수집하는 단계; 및
(7) pH 6 ~ 8 및 0.01 ~ 0.1 M 의 염농도의 조건 하에서 흡착되지 않은 분획과 음이온 교환체를 접촉시키고 흡착되지 않은 분획을 수집하는 단계.
상기 언급된 단계는 앞서 언급된 단계 (6) 대신에, pH 6 ~ 8 및 1 ~ 3 M 의 염농도의 조건 하에서 용출액과 소수성 크로마토그래피용 담체를 접촉시킨 후 pH 6 ~ 8 및 0.01 ~ 0.5 M 의 염농도의 조건 하에서 생성물을 용출시키는 단계를 포함할 수 있고; 앞서 언급된 단계 (7) 대신에 pH 6 ~ 8 및 0.001 ~ 0.05 M 의 염농도의 조건 하에서 흡착되지 않은 분획과 음이온 교환체를 접촉시킨 후 pH 6 ~ 8 및 0.05 ~ 1 M 의 염농도의 조건 하에서 생성물을 용출시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 단계는 앞서 언급된 (5) 와 (6) 사이, (6) 와 (7) 사이 또는 (7) 이후에, pH 3 ~ 5 및 0.5 ~ 3 M 의 염농도의 조건 하에서 염석하고 침전 분획을 수집하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
rHSA 의 정제 과정은 바람직하게는 정제 과정의 끝에 탈색 단계를 함유할 수 있다. 탈색 단계는 수득된 미정제 rHSA 와 특정 리간드를 갖는 킬레이트 수지를 접촉시킴으로써 수행된다. 킬레이트 수지의 담체 부분은 스티렌/디비닐벤젠 공중합체 및 아크릴산/메타크릴산 공중합체와 같은 소수성 특성을 갖는 것인 것이 바람직하다. 킬레이트 수지의 리간드 부분의 예는 N-메틸글루카민과 같은 폴리올기, 분자 내에 복소의 이미노기, 아미노기, 에틸렌이미노기 등을 갖는 폴리아민기 (폴리에틸렌 폴리아민과 같은 폴리알킬렌 폴리아민을 포함함), 및 티오우레아기를 포함한다. 하기와 같은 스티렌/디비닐벤젠 공중합체 담체를 갖는 시판되는 것들을 사용하는 것이 편리하다: DIAION CRB02 (리간드: N-메틸글루카민기, Mitsubishi Chemical Corporation 사제), DIAION CR20 (리간드: -NH(CH2CH2NH)nH, Mitsubishi Chemical Corporation 사제), LEWATIT TP (리간드:-NHCSNH2, Bayer Corporation 사제), 및 Amberlite CG4000.
이러한 킬레이트 수지 처리에 적합한 조건은 하기와 같다.
pH: 산성 또는 중성, 바람직하게는 pH 3 내지 9, 더 바람직하게는 pH 4 내지 7.
처리 기간: 1 시간 이상, 바람직하게는 6 시간 이상.
이온 강도: 50 mmho 이하, 바람직하게는 1 내지 10 mmho.
혼합비: 250 ㎎ 의 rHSA 당 0.1 내지 100 g, 바람직하게는 1 내지 10 g (습식 기준) 의 수지.
이에 따라 수득되는 rHSA, 즉 재조합 효모 배양으로부터 수확되고 상기 단계 (1) ~ (7), 염석 단계 및 킬레이트 수지 처리를 수행함으로써 정제된 rHSA 의 착색도는 매우 낮다. rHSA 가 250 ㎎/㎖ 의 rHSA 용액 (25 % 용액) 으로 배합되는 경우, A500 ㎚/A280 ㎚ 비는 약 0.001 ~ 0.005 이다. 킬레이트 수지 처리는 착색도를 1/2 ~ 1/10 로 감소시킬 수 있다. 특히, rHSA 의 500 ㎚ 주변의 흡수 파장에서의 착색도, 즉 적색도는 킬레이트 처리에 의해 1/3 ~ 1/10 로 감소된다.
본 발명에서 사용되는 rHSA 는 약 67,000 의 분자량 및 4.6 ~ 5.0 범위의 등전점을 갖는 균질한 물질이다. 이는 단량체만으로 이루어지고, 실질적으로 이량체, 중합체 또는 분해 생성물이 없다. 특히, 이량체, 중합체 및 분해 생성물을 포함하는 오염물의 총량이 약 0.01 % 미만이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 rHSA 는 실질적으로 재조합 효모로부터 기원하는 rHSA 및 다당류 이외의 단백질을 포함하는 불순물이 없다. rHSA 와 불순물의 총량을 기준으로 rHSA 의 순도는 99.999999% 초과, 바람직하게는 99.9999999% 초과이다. 특히, 1 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 0.1 ng/㎖ 이하의 rHSA 이외의 단백질을 함유하는 25 % 의 rHSA 용액을 제공할 수 있는 정제 rHSA 가 예시된다. 유사하게, 10 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 1 ng/㎖ 이하의 다당류를 함유하는 25 % 의 rHSA 용액을 제공할 수 있는 정제 rHSA 가 또한 예시된다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "rHSA 의 순도" 는 rHSA 를 생성하는 재조합 효모 세포로부터 기원하는 rHSA 및 다당류 이외의 단백질과 같은 오염물을 포함할 수 있는 rHSA 생성물 중의 rHSA 비를 나타낸다. 본 발명의 rHSA 는 하기와 같이 25 % 의 rHSA 용액을 사용하여 측정되는 착색도를 제공할 수 있다: A350/A280 의 비는 약 0.01-0.05 이고, A450/A280 의 비는 약 0.001-0.02 이고, A500/A280 의 비는 약 0.001-0.005 임. 하나의 rHSA 에 부착된 지방산 분자의 수는 1 이하, 바람직하게는 0.1 이하이다.
본 발명에 따르면, rHSA 는 시판되는 제품을 포함하여 유전자 조작으로써 수득되는 재조합 효모로부터 수득되는 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는 Medway
Figure pct00004
주사액 (Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Tokyo, Japan) 이 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "각막 및 결막 병변" 이라는 용어는 안구건조증, 다양한 각막결막염, 알레르기 및 미생물 (예를 들어 바이러스, 박테리아, 곰팡이 등) 의 감염과 같은 병원성 인자, 화학 물질에 의한 세포독성 및 산과 염기로 인한 부식과 같은 화학적 인자, 각막건조증, 외부 물질 (예를 들어 콘택트 렌즈 등) 및 뜨거운 물 등으로 인한 손상, 안약 조성물에 포함된 방부제 (예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올 등) 및 안약 제제 (예를 들어 아미노글리코사이드 항생제, 비스테로이드성 항염제, IDU, 피마리신 등) 과 같은 물리적 인자에 의해 야기되는 각막 및/또는 결막 병변; 외각막 (ectocornea) 의 결함; 각막 짓무름; 각막 종양 등을 포함한다.
또한, 각막 및 결막 병변은 각막이식, 굴절교정 각막절제수술 (refractive keratectomy (RK)), 굴절교정 레이저 각막절제수술 (photo refractive keratectomy (PRK)), 레이저 각막절삭 가공성형술 (laser associated in situ keratomileusis(LASIK)), 각막내 링 삽입수술 (intro coneal ring surgery (ICRS)) 을 포함하는 굴절교정수술, 유수정체 인공 수정체 (phakic IOL) 를 포함하는 전방 인공 수정체 삽입술 (anterior chamber intraocular lens implantation), 군날개 (pterygium) 수술, 백내장내적출수술 (intracapsular cataract extraction (ICCE)), 백내장낭외적출수술 (extracapsular cataract extraction (ECCE)), 후부절낭법 (posterior capsultomy), 안내 렌즈 삽입술 (intraocular lens implantation), 유리체절제술 (vitrectomy), 섬유주절개술 (trabeculotomy), 섬유주절제술 (trabeculectomy), 유리체내 삽입술 (intravitreal implantation), 이물질의 제거 및 다래끼 절제술 (hordeolum excision) 과 같은 수술 이후의 상태, 및 유리체강내 주사 (intraviteral injection) 및 누점 폐쇄 (punctal occlusion) 에 의해 야기되는 손상을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, "안구건조증" 이라는 용어는 수성 눈물-결핍성 안구건조증 및 증발성 안구건조증을 포함할 수 있다. 특히, 무루증, 각막건조증, 쇼그렌 증후군, 건조 각막결막염, 스티븐 존슨 증후군, 눈 유사물집증 및 다래끼와 같은 안구건조증 상태가 예시된다. 또한, "안구건조증" 이라는 용어는 백내장 수술 및 굴절교정술과 같은 전방 안과 수술 (anterior ophthalmic operation) 이후의 안구건조증, 및 알레르기성 결막염뿐만 아니라 VDT (영상 단말기) 노동자의 눈물 감소 및 예를 들어 공기 조절장치에 의한 건조한 방에 의해 야기되는 임의의 전신 증상이 없는 눈물 감소와 같은 안구건조증 유사 상태를 동반하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "치료 (treatment)" 또는 "치료하는 (treating)" 는 상태의 예방, 치유 및 경감을 포함하는 상태 조절의 임의의 방법, 및 상태 전개의 정지 또는 경감을 나타낸다.
본 발명의 약학 조성물은 질정, 알약, 분말, 현탁액, 캡술, 좌약, 주사 제제, 연고, 안약 용액 (점안액) 등과 같은 투약량 형태일 수 있다. 이는 특히 국소 투여가능한 안약 용액 또는 점안액에 바람직하다.
본 발명의 조성물이 안약 용액으로 배합되는 경우에서, 조성물은 약 1 내지1000 ㎎/㎖ (0.1 ~ 100 w/v%), 더 바람직하게는 약 10 내지 1000 ㎎/㎖ (1 ~ 100 w/v%), 특히 약 10 내지 100 ㎎/㎖ (1 ~ 10 w/v%) 의 양으로 rHSA 를 함유할 수 있다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "약학적으로 허용가능한 희석제" 는 당업자에게 공지된 안약 조성물에 사용되는 임의의 희석제, 예를 들어 물, 생리식염수, 인공 누액 등일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 안약 조성물에 일반적으로 사용되는 다양한 성분, 예컨대 안정제, 멸균제, 완충제, 등장성제, 킬레이트제, pH 조절제, 계면활성제 등을 추가로 포함할 수 있다.
조성물이 안약 용액 또는 점안액으로서 배합되는 경우, 조성물의 pH 는 바람직하게는 5 내지 8 로 조절된다. 안약 용액은 한 번 투여시에 약 1 내지 100 ㎕/안구, 바람직하게는 약 10 내지 50 ㎕/안구, 더 바람직하게는 약 30 내지 50 ㎕/안구의 양으로 투여될 수 있다.
또다른 관점에서, 본 발명은 또한 상기 기재된 본 발명의 약학 조성물의 제조를 위한 rHSA 의 용도를 제공한다.
추가적인 관점에서, 본 발명은 각막 및 결막 병변의 치료가 필요한 대상에 대한 유효량의 rHSA 의 투여를 포함하는 각막 및 결막 병변의 치료 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "각막 및 결막 병변의 치료가 필요한 대상" 이라는 용어는 실제로 각막 및 결막 병변에 걸린 환자 및 상기 병변에 걸린 것이 의심되는 환자 모두를 포함한다. 이는 각막 및 결막 병변이 실제로 인식되는 환자뿐만이 아니라 각막 및 결막 병변이 의심되는 환자 및 각막 이식수술 이후의 환자와 같이 상태 발생의 높은 가능성이 예측되는 상태에 있는 환자도 포함한다.
보다 더 추가적인 관점에서, 본 발명은 또한 안구건조증의 치료가 필요한 대상에 대해 유효량의 rHSA 를 투여하는 것을 포함하는 안구건조증의 치료 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "안구건조증의 치료가 필요한 대상" 이라는 용어는 안구건조증 상태를 갖는 환자 및 안구건조증에 걸린 것이 의심되는 환자를 모두 포함한다. 투여 경로는 특정하게 제한되지 않으며, 국소적 안구 투여가 바람직하다.
이러한 본 발명의 방법에서, rHSA 의 "유효량" 은 원하는 치료에 필요한 양이고, 환자의 증상, 나이, 성별, 체중, 규정식, 조합으로 사용되는 기타 약물 및 의료 분야의 당업자에 의해 인식되는 다양한 인자에 따라 선택된 최적량일 수 있다. 또한 이러한 유효량은 rHSA 의 종류 또는 활성도, 또한 상기 인자에 대해 가변적으로 변화할 수 있다. 이러한 본 발명의 방법에서, 약학 조성물은 약 1 내지 100 ㎕/안구, 바람직하게는 약 10 내지 50 ㎕/안구, 더 바람직하게는 약 30 내지 50 ㎕/안구의 양으로, 하루에 약 1 내지 20 회, 더 바람직하게는 하루에 약 1 내지 10 회 투여될 수 있으며, 이는 본 발명의 범위를 제한하지 않도록 의도된다.
본 발명에서 사용되는 약학 조성물은, rHSA 이외의 약학적으로 활성인 화합물과 공동-투여될 수 있다. "공동-투여" 라는 용어는 본 발명의 약학 조성물의 투여 이전, 동시 및 이후에 rHSA 이외의 약학적으로 활성인 성분을 투여하는 것을 포함할 수 있다. rHSA 이외의 약학적으로 활성인 화합물이 본 발명의 조성물과 동시에 투여되는 경우, rHSA 와 기타 활성 성분은 서로 단일 투약량 형태 또는 각각 개별 투약량 형태로 배합될 수 있다. 예를 들어, 하기가 본 발명의 약학 조성물과 공동-투여될 수 있다: 인공 누액, 히알루론산 및 콘드로이틴 술페이트와 같은 다당류 술페이트, 시클로스포린, 글루타티온, 플라빈-아데닌 뉴클레오티드 나트륨, 코르티코스테로이드, 테트라시클린, 비타민 A (레티놀) 및 이의 유도체 (예컨대 레티놀 팔미테이트 및 레티놀 아세테이트를 포함하는 비타민 A 에스테르), 및 간세포 성장 인자 (HGF), 상피 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판-유도 성장 인자 (PDGF), 전환 성장 인자 (TGF-α 및 TGF-β) 및 케라티노사이트 성장 인자 (KGF) 와 같은 세포 성장 인자.
본 발명은 또한 하기에 나타낸 시험예의 관점에서 설명될 것이다. 시험예는 어떠한 의미에서도 본 출원의 범위를 제한하는데 사용되지 않아야 한다.
시험예 1
토끼 강제 안검 개방 안구건조증 모델
시험 방법
Std:JW/CSK 토끼를 사용하였다. 동물을 우레탄 (2 g/㎏, 8㎖/㎏) 을 피하 주사함으로써 마취시켰다. 토끼의 안검을 안과 검경 (eye speculum) 을 사용하여 강제로 개방시키고, 동물을 토끼 홀더 (rabbit holder) 를 사용하여 복와위로 3 시간 동안 유지시켰다. 강제 안검 개방을 마친 후에, 과량의 5 % 펜토바르비탈을 정맥내 투여함으로써 동물을 희생시키고, 안구를 제거하였다. 50 ㎕ 의 1 % 메틸렌 청색 용액을 제거된 안구의 각막 표면에 적하하고, 1 분 동안 유지시켰다. 이후, 안구를 15 ㎖ 의 생리식염수를 포함하는 용기에 넣어 메틸렌 청색을 세척하였다. 각막을 면도칼로 제거하고 아세톤/황산나트륨 용액 (100 % 아세톤: 9% 수성 Na2SO4=7:3) 에 하룻밤 동안 담가서, 각막으로부터 용액 내로 메틸렌 청색을 추출하였다. Multskan
Figure pct00005
Spectrum Thermo 를 사용하여 660 ㎚ 에서의 광학 밀도를 측정함으로써 추출 용액 내 메틸렌 청색의 양을 측정하였다. 평균 흡광도±표준 오차를 하기 표에 나타내었다. 각막 손상을 평균 흡광도 (즉, 메틸렌 청색 흠광도) 에 의해 평가하였다.
각 군의 각막 손상 억제비를 하기와 같은 기준에 따라 평가하였다:
미처리된 군 (I 군) 의 평균 메틸렌 청색 흡광도 = 100% 각막 손상의 억제
강제 안검 개방을 하고 생리식염수를 투여한 군 (II 군) 의 평균 메틸렌 청색 흡광도 = 0 % 각막 손상의 억제.
시험군의 각막 손상 억제비는 하기 식에 따라 계산된다:
Figure pct00006
상기 식에서, (I 군), (II 군) 및 (시험군) 은 각 군의 평균 메틸렌 청색 흡광도를 나타낸다. (시험군) 은 임의의 III-VI 군을 나타낸다.
시험 화합물의 투여
강제 안검 개방 시작 이후 즉시, 동물의 양쪽 눈에 국소적으로 50 ㎕ 의 생리식염수, 1, 3, 또는 5 w/v% 의 rHSA 용액, 또는 0.3 % 나트륨 히알루로네이트 (Hyalein
Figure pct00007
안약 용액 0.3 %, Santen Pharmaceutical Co., Ltd, Osaka, Japan) 을 투여하였다.
1, 3 및 5 % 의 rHSA 용액으로서, 25 % Medway
Figure pct00008
주사액 (25 w/v% 의 rHSA, Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Tokyo, Japan) 을 생리식염수로 희석시켜 원하는 농도를 얻었다.
시험군
군 처리 n
I 0 시간 강제 안검 개방 + 미처리 5 개 (10 개 안구)
II 3 시간 강제 안검 개방 + 생리식염수 10 개 (20 개 안구)
III 3 시간 강제 안검 개방 + 1% rHSA 10 개 (20 개 안구)
IV 3 시간 강제 안검 개방 + 3% rHSA 10 개 (20 개 안구)
V 3 시간 강제 안검 개방 + 5% rHSA 10 개 (20 개 안구)
VI 3 시간 강제 안검 개방 + 0.3 % 나트륨 히알루로네이트 10 개 (20 개 안구)
결과
강제 안검 개방 3 시간 이후, 각막 손상을 나타내는 메틸렌 청색 흡광도가 측정되었다. 결과를 하기 표 2 에 나타냈다:
각막 손상 억제비를 표 2 의 결과를 기준으로 계산하였다.
군 메틸렌 청색 흡광도
(평균 ± 표준 오차)
I 0.051 ± 0.008
II 0.217 ± 0.010
III 0.183 ± 0.012*
IV 0.175 ± 0.011*
V 0.152 ± 0.013**
VI 0.219 ± 0.013
**p, 0.01, *p<0.05 대 II 군 (던넷 시험 (Dunnett's test))
1 %, 3 % 및 5 % 의 rHSA 처리군 (III-V 군) 의 660 ㎚ 에서의 메틸렌 청색 흡광도는 식염수 처리군 (II 군) 에서에 비해 상당히 더 낮았다. 이 결과는 용량 의존적 방식으로, 안구 표면의 건조함에 의해 야기되는 각막 손상으로부터 눈을 보호하기 위한 1%, 3% 및 5% rHSA 의 효과를 입증한다.
1, 3 및 5 % rHSA 처리군의 각막 손상 억제비는 용량 의존 방식으로 증가되었으며, 각각 21 %, 25 % 및 39 % 였다.
시험예 2
토끼 강제 안검 개방 안구건조증 모델
시험 방법
Std:JW/CSK 토끼를 사용하였다. 동물을 우레탄 (2 g/㎏, 8㎖/㎏) 을 피하 주사함으로써 마취시켰다. 토끼의 안검을 안과 검경을 사용하여 강제로 개방시키고, 동물을 토끼 홀더를 사용하여 복와위로 3 시간 동안 유지시켰다. 강제 안검 개방을 마친 후에, 과량의 펜토바르비탈을 정맥내 투여함으로써 동물을 희생시키고, 안구를 제거하였다. 50 ㎕ 의 1 % 메틸렌 청색 용액을 안구의 각막 표면에 적하하고, 1 분 동안 유지시켰다. 이후, 안구를 15 ㎖ 의 생리식염수를 포함하는 용기에 넣어 메틸렌 청색을 세척하였다. 각막을 면도칼로 제거하고 아세톤/황산나트륨 용액 (100 % 아세톤: 9% 수성 Na2SO4=7:3) 에 하룻밤 동안 담가서, 각막으로부터 용액 내로 메틸렌 청색을 추출하였다. Multskan
Figure pct00009
Spectrum Thermo 를 사용하여 660 ㎚ 에서의 광학 밀도 (메틸렌 청색 흡광도) 를 측정함으로써 추출 용액 내 메틸렌 청색의 양을 측정하였다. 평균 흡광도±표준 오차를 하기 표에 나타내었다. 각막 손상을 평균 메틸렌 청색 흡광도를 기준으로 평가하였다.
시험 화합물의 투여
강제 안검 개방 시작 이후 즉시, 국소적으로 동물의 한쪽 눈에는 50 ㎕ 의 생리식염수를 투여하고, 다른 한쪽 눈에는 50 ㎕ 의 비히클, 0.0001 %, 0.03 % 또는 5 % 의 rHSA 용액을 투여하였다.
이 시험예에서, 주사용수 중 0.28% D(+)-글루코스, 0.33% Na2HPO4, 0.55% NaCl, 0.16% KCl, 0.0024% 나트륨 N-아세틸-DL-트립토판 및 0.00135% 나트륨 카프릴레이트를 포함하는 비히클을 사용하였다. 본 실시예에서 사용되는 비히클로 rHSA 저장 용액을 희석시킴으로써 0.0001 % 및 0.03 % rHSA 용액을 제조하였다. JP-A-2000-319194 에 개시된 방법에 따라 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation 에 의해 생산된 28.7 % 의 rHSA 및 0.341 % 의 NaCl 을 포함하는 rHSA 저장 용액을 사용하였다. 5 % rHSA 용액을 시험예 1 과 동일한 방식으로 25% Medway® 주사액 (25w/v% 의 rHSA 함유, Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation) 을 희석시킴으로써 제조하였다.
시험군
시험군 시험성분 안구 n
비히클
 비히클 시험 안구 6
식염수 대조군 안구
0.0001% rHSA
 0.0001% rHSA 시험 안구 6
식염수 대조군 안구
0.03% rHSA
 0.03% rHSA 시험 안구 6
식염수 대조군 안구
5 % rHSA
 5% rHSA 시험 안구 6
식염수 대조군 안구
강제 안검 개방 3 시간 이후, 각막 추출물의 메틸렌 청색 흡광도를 시험 실시예 1 과 동일한 방식으로 측정하였다. 결과를 하기 표 4 에 나타내었다:
각막 손상에 대한 효과
시험군 안구 메틸렌 청색 흡광도
(평균 ± 표준 오차)
비히클
 시험 안구 0.278 ± 0.031
대조군 안구 0.279 ± 0.024
0.0001% rHSA
 시험 안구 0.343 ± 0.024
대조군 안구 0.361 ± 0.041
0.03% rHSA
 시험 안구 0.314 ± 0.044
대조군 안구 0.310 ± 0.046
5% rHSA
 시험 안구 0.209 ± 0.022*
대조군 안구 0.309 ± 0.029
*p<0.01 대 대조군 안구 (대응 스튜던트 t-시험 (Paired Student's t-test))
상기 표에 나타낸 바와 같이, 식염수에 비해 비히클은 메틸렌 청색 흡광도에 영향을 미치지 않았다. 또한, 식염수에 비해 0.0001 % 및 0.03 % rHSA 처리군은 메틸렌 청색 흡광도에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 0.0001 % 또는 0.03 % 의 농도에서 비히클 및 rHSA 는 토끼 안구 표면의 건조함에 의해 야기되는 각막 손상으로부터 눈을 보호하지 못했다.
대조적으로, 시험예 1 에 나타낸 바와 같이 대조군 안구에 비해 5 % rHSA 처리군에서의 메틸렌 청색 흡광도는 상당히 증가하였으며, 토끼 안구 표면의 건조함에 의해 야기되는 각막 병변으로부터의 보호에 대한 rHSA 의 효과를 확인하였다.
시험예 3
rHSA 의 단기 상습 투여에 의해 야기되는 눈점막 자극
시험 방법
Kbl:JW/SPF 토끼를 사용하였다. 50 ㎕/안구의 생리식염수, 3%, 5% 또는 10% rHSA 용액 또는 10 % HSA 용액을 국소적으로 동물의 왼쪽 눈에 30 분 간격으로 총 10 회 반복적으로 투여하였다. 오른쪽 눈은 처리하지 않았다.
25% Medway
Figure pct00010
주사액 (25% 의 rHSA 함유, Mitsubishi Tanabe Pharmaceutical, Inc.) 을 1.03% 염화나트륨 수용액으로 희석시킴으로써 10 % rHSA 용액을 제조하였다. 이에 따라 수득된 10 % rHSA 용액을 생리식염수로 추가 희석시킴으로써 3 % 및 5 % rHSA 용액을 제조하였다. Benesis Corporation 에 의해 생산되는 25% HSA, 켄케츠 알부민 (kenketsu albumin) (기증 인간 혈액을 분별함으로써 수득되는 알부민) 을 함유하는 시판 HSA 제품을, 1.03 % 염화나트륨 수용액으로 희석시킴으로써 10 % HSA 용액을 제조하였다.
시험군
시험군 횟수 간격 지속기간
식염수 10/일 30 분 1 일
3% rHSA 10/일 30 분 1 일
5% rHSA 10/일 30 분 1 일
10% rHSA 10/일 30 분 1 일
10% rHSA 10/일 30 분 1 일
관찰 결과
최종 투여 1 시간 이후, 및 각각 제 1 차 및 최종 투여 24 시간 이후에, 왼쪽 눈의 안구 자극을 관찰하고 Draize 의 기준 (Draize,J.H., Woodard, G. and Calvery, H.O.: Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes., J. Pharmacol. Exptl. Therap., 82, 377-390 (1944)) 에 따라 점수를 기록하여 하기 표에 나타냈다.
Figure pct00011
결과를 표 7 에 나타냈다:
토끼 안구 손상에 대한 평가
투여 이후 시간 (h)
시험군 동물 번호 11) 242) 241)
식염수


 M101 0 0 0
M102 0 0 0
M103 0 0 0
평균 0.0 0.0 0.0
3 % rHSA


 M201 0 0 0
M202 0 0 0
M203 0 0 0
평균 0.0 0.0 0.0
5 % rHSA


 M301 0 0 0
M302 0 0 0
M303 0 0 0
평균 0.0 0.0 0.0
10 % rHSA


 M401 0 0 0
M402 0 0 0
M403 0 0 0
평균 0.0 0.0 0.0
10 % HSA


 M501 0 0 0
M502 2 2 2
M503 2 2 2
평균 1.3 1.3 1.3
1) 최종 투여 이후 시간
2) 1 차 투여 이후 시간
상기 표에 나타낸 바와 같이, 3, 5 및 10 % 의 rHSA 용액은 모든 관찰 시간에서 어떠한 안구 자극도 야기하지 않았다. 대조적으로, 10 % HSA 용액은 1 차 투여 이후 1 및 24 시간일 때 동물의 2/3 에서 결막의 충혈 (점수 1) 을 야기하였다.

Claims (14)

  1. 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 안구건조증 치료용 약학 조성물.
  2. 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 각막 및 결막 병변 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 재조합 효모가 피키아 속 (genus Pichia) 또는 사카로마이세스 속 (genus Saccharomyces) 의 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 효모가 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 또는 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 인 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 재조합 인간 혈청 알부민이 하기의 특성을 갖는 조성물:
    재조합 인간 혈청 알부민 및, 재조합 인간 혈청 알부민과는 상이한 항원성을 갖는 단백질 및 다당류로 이루어지는 재조합 효모 세포로부터 기원한 오염물의 총량을 기준으로 한 재조합 인간 혈청 알부민의 순도가 99.999% 초과이고,
    재조합 인간 혈청 알부민과는 상이한 항원성을 갖는 단백질 및 다당류로 이루어지는 재조합 효모 세포로부터 기원한 오염물의 총량이 효소 면역검정법 (EIA) 의 검출 한계 미만임.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 국소 점안용인 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 안구건조증이 수성 눈물-결핍성 안구건조증 또는 증발성 안구건조증인 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 안구건조증이 무루증, 각막건조증, 쇼그렌 증후군, 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군, 눈 유사물집증, 안과 수술 후 안구건조증, 알레르기성 결막염 수반 안구건조증, VDT (영상 단말기 (Visual Display Terminal)) 노동자의 눈물 감소 및 공기 조절장치로 인한 건조한 방에 의해 야기되는 임의의 전신 증상이 없는 눈물 감소를 포함하는 안구건조증 유사 상태로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 안구건조증이 증발성 안구건조증인 조성물.
  10. 제 2 항에 있어서, 각막 및 결막 병변이 안구건조증, 각막결막염, 알레르기 및 바이러스, 박테리아 및 곰팡이를 포함하는 미생물의 감염, 화학 물질에 의한 세포독성, 화학적 인자, 각막건조증, 안약 조성물에 포함된 방부제, 안약 조성물에 포함된 활성 성분, 안과 수술 및 안과 주사로 인한 손상에 의해 야기되는 각막 및 결막 상피의 결함, 각막 및 결막 짓무름, 또는 각막 및 결막 종양인 조성물.
  11. 안구건조증 치료용 약학 조성물의 제조를 위한, 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민의 용도.
  12. 각막 및 결막 병변 치료용 약학 조성물의 제조를 위한, 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민의 용도.
  13. 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 안구건조증의 치료 방법.
  14. 인간 혈청 알부민에 대한 유전자로 효모를 형질전환시킴으로써 수득되는 재조합 효모에 의해 생성되는 재조합 인간 혈청 알부민의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 각막 및 결막 병변의 치료 방법.
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