KR20230099595A

KR20230099595A - 수퍼옥시드 디스뮤타제 및 이의 건성안의 예방 또는 치료용 용도

Info

Publication number: KR20230099595A
Application number: KR1020220047204A
Authority: KR
Inventors: 장인익; 김정현; 반재구; 김의중
Original assignee: 주식회사 바이옴로직; 주식회사 제노포커스
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2022-04-15
Publication date: 2023-07-04

Abstract

본 발명은 수퍼옥시드 디스뮤타제 및 건성안의 예방 또는 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 건성안의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물 및 방법은 눈물 분비량의 증가, 눈물막 파괴 시간의 증가, 안구 표면 손상의 최소화, 결막내 배상세포의 보호, 각막 및 결막내 면역세포 및 염증성 사이토카인 수의 감소, 각막, 결막 및 눈물샘에서의 산화 스트레스의 감소, 및 각막 상피 세포사멸의 감소 중 하나 이상을 가져옴으로써 건성안을 예방하거나 치료하는 데에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

수퍼옥시드 디스뮤타제 및 이의 건성안의 예방 또는 치료용 용도{SUPEROXIDE DISMUTASE AND USES THEREOF FOR PREVENTING OR TREATING DRY EYE SYNDROME}

본 발명은 수퍼옥시드 디스뮤타제 및 건성안의 예방, 개선 또는 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 건성안의 예방, 개선 또는 치료를 위한 수퍼옥시드 디스뮤타제, 조성물 또는 방법에 관한 것이다.

건성안은 우리나라 성인의 약 20%를 차지할 만큼 빈도가 높아지고 있는 주요한 질환이다. 최근 들어 건성안의 개념이 바뀌면서, 건성안은 불편감, 시력장애, 눈물막 불안정 및 안구표면 손상을 일으키며 눈물 삼투압 증가 및 안구표면 염증을 동반하는 눈물막과 안구표면의 다인자 질환으로 정의되고 있다.

건성안 발생의 병리학적 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았지만 눈물의 고오스몰농도(hyperosmolarity)에 의한 안구표면의 염증성 변화와 관련이 있으며, 다양한 염증 인자들이 건성안의 병리학적인 진행과정 뿐만 아니라 안구 불편감에도 기여할 것이라는 여러 연구들이 보고되고 있다. 쇼그렌증후군 환자의 눈물과 결막상피 내 IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ와 같은 염증성 사이토카인과, HLA-DR, ICAM-1과 같은 결막 상피세포내 면역활성 및 유착물질, 그리고 Th-1 또는 Th-17 염증 경로와 관련된 사이토카인의 발현이 증가하며, 그 외에도 건성안에서 매트릭스 메탈로프로테이나아제(matrix metalloproteinase)의 농도와 활성이 증가하고 안구표면상피의 세포자멸이 증가하는 소견을 보여 건성안은 안구표면의 염증과 직접적으로 관련이 있음이 밝혀졌다. 따라서, 건성안의 치료를 위해 눈물의 고오스몰농도에 의한 안구표면의 염증을 억제하는 것이 중요하다.

현재 사용되고 있는 건성안의 치료는 환경조절, 인공누액제, 스테로이드 또는 사이클로스포린 등의 항염증 치료, 눈물 분비 촉진제, 눈물점 폐쇄술, 혈청 안약, 치료용 콘택트렌즈, 수술 등의 방법이 있으며, 질병의 중등도에 따라 선택되어 사용되고 있으나, 아직까지 확실한 치료법은 없는 실정이다. 이 중 인공누액제와 항염증 안약의 혼합투여가 건성안의 치료에 가장 널리 쓰이는 약물 치료방법이다. 인공누액제는 건성안의 증상을 일시적으로 완화시킬 수는 있으나, 안구표면의 염증을 근본적으로 치료할 수 없으며, 항염증 제제 중에서 스테로이드는 녹내장, 백내장 등의 심각한 합병증을 유발할 수 있다는 단점이 있어서 새로운 건성안 치료제제의 개발이 필요하다.

한편, 2006년에 미국 알러간(Allergan)사는 면역조절제인 사이클로스포린(cyclosporine)을 이용한 안구건조증 치료제인 레스타시스(Restasis) 점안액을 개발하였다. 레스타시스 점안액은 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca)과 관련된 면역세포의 생성과 활성화를 억제하고 눈물 분비량을 증가시키는 것으로 보고되었다. 그러나, 상기 제제는 항염증 작용을 통하여 약효를 나타내기 때문에, 만족할 만한 수준의 효능을 얻기 위해서는 수개월간 반복하여 사용해야 하고, 대표적 부작용인 작열감이 약 17% 정도로 높게 발현되는 문제가 있다.

따라서, 점안 투여로 인한 부작용 발현 빈도가 낮아 안전하면서도 단순히 증상만을 완화시키는 대증요법제가 아니라 보다 근본적으로 안구건조증을 예방 또는 치료할 수 있는 제제의 개발이 필요하다.

본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 건성안의 예방, 개선 또는 치료를 위한 수퍼옥시드 디스뮤타제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

본 발명은 건성안의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물 또는 치료 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 건성안의 예방 또는 개선을 위한 식품 또는 사료 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 건성안의 예방, 개선 또는 치료를 위한 수퍼옥시드 디스뮤타제를 포함하는 경구 투여용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 유효성분으로 포함하는 건성안의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따르면, 수퍼옥시드 디스뮤타제를 대상에 투여하는 단계를 포함하는 건성안의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 수퍼옥시드 디스뮤타제를 유효성분으로 포함하는 건성안의 개선 또는 예방을 위한 식품 또는 사료 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 수퍼옥시드 디스뮤타제를 유효성분으로 포함하는 건성안의 개선, 치료 또는 예방을 위한 경구 투여용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 경구 투여되는 경우에도 건성안의 치료, 개선 또는 예방 효과를 나타내는 개선된 수퍼옥시드 디스뮤타제가 제공된다.

본 발명에 의하면, 수퍼옥시드 디스뮤타제, 조성물 및 방법은 눈물 분비량의 증가, 눈물막 파괴 시간의 증가, 안구 표면 손상의 최소화, 결막내 배상세포의 보호, 각막 및/또는 결막내 면역세포 및/또는 염증성 사이토카인 수의 감소, 각막, 결막 및/또는 눈물샘에서의 산화 스트레스의 감소, 및 각막 상피 세포사멸의 감소 중 하나 이상의 효과를 통해 건성안을 예방, 개선 또는 치료하는 데에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 1.1에서 수행된 이중 교차 재조합을 위한 모식도를 나타낸다.
도 2는 발현 숙주 GFBS220과 생산 균주 BSBA310에서 PCR을 이용하여 결손 유전자를 확인한 결과를 나타낸다. W는 야생형 B. subtilis KCTC 3135를 나타내고, 220은 발현 숙주 GFBS220를 나타내고, 310은 SodA2 생산 균주 BSBA310을 나타낸다.
도 3은 SodA(바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 GF423의 배양 상층액에서 N-말단 시퀀싱을 통해 확인된 Mn-SOD)와 본 발명의 수퍼옥시드 디스뮤타제(SodA2)의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 4는 sodA2 유전자의 과발현을 위한 발현 벡터를 나타낸다. 여기서, rrnB T1T2는 전사 종결인자를 나타내고; rep(pBR322)는 E. coli에서 작동하는 pBR322로부터의 레플리콘을 나타내고; rep(pUB110)는 B. subtilis에서 작동하는 pUB110로부터의 레플리콘이고; Kan^R은 카나마이신 내성 유전자(아미노글리코시드 O-뉴클레오티딜트랜스퍼라제)를 나타내고; BJ27 promoter는 B. subtilis에 대한 강력한 프로모터를 나타낸다.
도 5는 생산 균주 BSBA310을 제조하기 위한 전체 절차를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 수행된 눈물 분비량(tear volume) 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 수행된 눈물막 파괴시간(tear film break-up time, TBUT) 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 수행된 각막 형광염색 점수(corneal fluorescent staining score) 측정 결과를 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 실시예에서 수행된 면역세포 수 측정 결과를 나타낸다.
도 10a, 도 10b 및 도 10c는 본 발명의 실시예에서 수행된 활성산소 발생에 대한 결과를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 본 발명의 실시예에서 수행된 결막내 배상세포(goblet cell) 수 측정 결과를 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 실시예에서 수행된 세포사멸 측정 결과를 나타낸다.

후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명을 설명하면서 제시된 용어는 달리 나타내지 않는 한, 일반적으로 그의 통상적인 의미로 이해되어야 하며, 그 용어가 정의된 발명의 태양 또는 구현예뿐만 아니라 본 명세서에 사용된 동일한 용어에 모두 적용된다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD)를 유효성분으로 포함하는 건성안의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물이 제공된다.

용어 "건성안"은 안구건조 또는 안구건조증과 상호 교환적으로 사용되며, 다양한 원인, 예컨대 눈물 부족, 눈물막의 과도한 증발, 눈물 구성성분의 불균형, 눈물 분비 과정에 관여하는 조직들의 염증성 변화로 인한 안구 표면의 손상으로 눈의 불쾌감, 건조감, 이물감, 가려움, 통증, 시력 저하 등의 각종 증상을 나타내는 안질환을 지칭한다. 또한, 본 발명에서 건성안은 쇼그렌증후군과 같은 다른 기저 질환에 의해 야기된 것일 수 있고, 안건염 또는 눈 안의 이물질의 합병증일 수 있다. 또한, 본 발명에서 건성안은 감염의 결과이거나 투약의 부작용일 수 있고, 독소, 화학물질 또는 다른 물질에 대한 노출의 결과일 수 있다. 따라서, 본 발명에서 건성안은 쇼그렌증후군에 의한 건성안 또는 비-쇼그렌 증후군에 의한 건성안을 모두 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 눈물 분비량의 증가, 눈물막 파괴 시간의 증가, 안구 표면 손상의 최소화, 결막내 배상세포의 보호, 각막 및/또는 결막내 면역세포 및/또는 염증성 사이토카인 수의 감소; 각막, 결막 및/또는 눈물샘에서의 산화 스트레스의 감소; 및 각막 상피 세포사멸의 감소로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 가져올 수 있다.

상기 수퍼옥시드 디스뮤타제(Superoxide dismutase; SOD)는 수퍼옥시드 라디칼 (O₂ ^ㆍ-)의 일반 분자 산소(O₂)와 과산화수소(H₂O₂)로의 디스뮤테이션(dismutation)을 번갈아 촉매하는 효소로서, SOD는 활성 산소 종을 제거하여 산화 스트레스를 줄이는 데 중요한 역할을 한다. SOD는 원핵 세포와 진핵 세포에 널리 분포하고 있으며, 다양한 유형의 금속 중심(구리/아연, 니켈, 망간, 및 철)에 따라 4가지 부류로 분류된다. 망간 함유 SOD[Mn-SOD]는 여러 세균, 진핵 세포의 엽록체, 미토콘드리아, 및 세포질에 광범위하게 존재한다.

일 구현예에서, SOD는 망간에 결합하는 것(Mn-SOD)일 수 있다.

일 구현예에서, SOD는 탈아미드화된 Mn-SOD일 수 있다.

일 구현예에서, SOD는 SOD 효소 활성을 갖는 개질된(modified 또는 engineered) 폴리펩티드로서 다양한 측면(생체내, 시험관내 또는 생체외 안정성, 균일성, 및/또는 형태적 변경)에 영향을 미치거나 미치지 않는 하나 이상의 변이, 예컨대, 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 정제, 검출 또는 안정성 증가를 위한 이종성 물질(예컨대, HIS tag, Ha tag, myc tag를 포함한 당업계에 공지된 tag, GFC 및/또는 항체의 Fc 도메인)을 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, SOD는 서열번호 2를 기준으로 73번 및 136번 아미노산 잔기가 Asp로 치환된 것일 수 있다.

일 구현예에서, SOD는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

일 구현예에서, SOD는 천연 또는 재조합 미생물로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, SOD는 박테리아로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, SOD는 약물 또는 식품에 사용하기에 일반적으로 안전한 것으로 간주되는(generally regarded as safe, GRAS) 박테리아로부터 공급될 수 있다. 구체적으로, SOD는 바실러스 종 균주에서 유래될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 SOD는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 SOD는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF423 균주(KCTC 13222 BP)로부터 유래된 것일 수 있다. GF423 균주(KCTC 13222 BP)는 한국생명공학연구원에 2017년 3월 6일자로 기탁된 것이다. 또한, SOD는 도 4에 도시된 발현 벡터를 포함하는 재조합 균주로부터 유래된 것일 수 있다. 또한 상기 SOD는 도 5에 도시된 방법을 포함하는 방법에 의해 제조된 재조합 균주로부터 유래된 것일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 SOD는 건성안의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 경구로 투여되어 눈물 분비량의 증가, 눈물막 파괴 시간의 증가, 안구 표면 손상의 최소화, 결막내 배상세포의 보호, 각막 및/또는 결막내 면역세포 및/또는 염증성 사이토카인 수의 감소; 각막, 결막 및/또는 눈물샘에서의 산화 스트레스의 감소; 및 각막 상피 세포사멸의 감소 중 하나 이상의 효과를 나타내었다.

일 구현예에서, 상기 SOD는 단리 또는 정제된 효소일 수 있다. 이때, 단리되거나 정제된 SOD 또는 그의 생물학적 활성 부분에는 그것이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염 단백질이 실질적으로 없다. 예를 들어, 정제물은 균주 배양물로부터 한외 여과(Ultrafiltration), 황산암모늄 처리, 컬럼 정제, 농축 등을 통해 순수 분리된 것이거나, 한외 여과, 농축 등을 통해 얻어진 배양 농축액일 수 있다. "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 문구는, 단백질이 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 그러한 단백질이 분리된 단백질의 제조물을 포함한다. 일 구현예에서, "세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 문구는 원하지 않는 단백질이 건조 중량을 기준으로 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 5% 미만인 단백질의 제조물을 포함한다.

다른 구현예에서, 상기 SOD는 균주 용해물(lysate), 균주 배양물, 균주 배양 농축액, 균주 배양 추출물, 또는 그의 건조 형태로 포함될 수 있다. 이때, "균주 용해물"은 균주를 배양하여 기계적 또는 화학적으로 파쇄하여 얻은 것을 의미하며 이로부터 추출, 희석, 농축, 정제 등의 추가 공정을 거친 것을 모두 포함할 수 있다. "균주 배양물"은 균주를 배양하여 얻은 배양액 그 자체 또는 그의 상층액을 의미할 수 있다. "균주 배양 농축액"은 균주 배양물로부터 한외 여과, 황산암모늄 처리, 컬럼 정제, 농축 등을 통해 순수 분리된 것이거나, 한외 여과, 농축 등을 통해 얻어진 배양 농축액을 지칭한다. "균주 배양 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액으로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농충액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다. 상기 건조 형태는 동결 건조 형태를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, SOD는 천연 또는 재조합 숙주를 비롯한 다양한 공급원으로부터 단리되거나 정제될 수 있다. 예를 들어, 건성안을 예방하거나 치료하는 활성을 갖는 SOD는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 GF423의 배양 상층액으로부터 추출될 수 있다. 간략하게 말하면, 먼저 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 GF423을 다양한 유형의 배지에서 배양하여 배양액을 얻을 수 있다. 예를 들어, 복합 배지(pH 6.0 내지 7.0)를 사용하여 상기 균주를 25℃내지 42℃에서 1일 내지 4일 동안 성장시킨다. 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 GF423을 배양하기 위한 다른 적합한 배지에는 LB(Luria-Bertani) 배지, ISP(International Streptomyces Project) 배지, NA(nutrient agar) 배지, BHI(brain heart infusion agar) 배지, SDA(sabouraud dextrose agar) 배지, PDA(potato dextrose agar) 배지, NB(nutrient broth) 배지 등이 포함된다. 바람직하게는, LB 배지, ISP 배지, BHI 배지, SDA 배지, 또는 NB 배지가 사용될 수 있다. 또한, SOD는 PubMed 또는 BRENDA(월드 와이드 웹의 brenda-enzymes.org)와 같은 데이터베이스에 제공된 정보를 사용하여 다른 천연 또는 재조합 숙주로부터 공급될 수 있다.

일 구현예에서, SOD는 다음과 같은 정제 방법으로 정제하는 것이 바람직할 수 있지만, 이로 한정되지는 않는다. 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주 GF423을 배양하여 얻은 배양액을 원심분리하여 배양 상층액을 수집한다. 상층액 분획을 고체상 추출로 전처리하고, 이어서 크로마토그래피로 단리하고 정제한다. 이때, SOD는 다양한 방식의 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 바람직하게는, 소수성 상호작용 크로마토그래피가 사용된다.

본 발명의 약학 조성물은 인간을 제외한 동물에 적용되는 경우에 수의학적 조성물이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제는 당업계에 통상적으로 사용되는 것일 수 있다. 담체, 부형제 또는 희석제로는, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 이산화규소 등의 광물유 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

제제화할 경우에는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 첨가제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 제제화를 위한 첨가제는 약제 분야에서 통상 사용하는 것 중에서 적합한 것을 선택할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 사용 방법에 따라 바람직한 형태로 제형화될 수 있으며, 특히 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화될 수 있다. 그러한 제형의 구체적인 예로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제, 주사용액, 경고제(Plasters), 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 에어로졸제, 엑스제(Extracts), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 침제, 크림제, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 패치제 등이 있다.

더 나아가 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최신판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 SOD는 경구 투여될 수 있다. 경구 투여의 경우, 위산으로부터의 보호를 위해 SOD가 쉘락(shellac)으로 코팅될 수 있지만, 코팅제는 이로 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 코팅제의 예에는 쉘락, 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 제인(zein), 유드라짓(Eudragit), 및 이들의 조합이 포함된다. SOD가 코팅되는 경우, SOD는 용액 중에서 코팅될 수 있다. 구체적으로, 정제된 용액과 쉘락 함유 용액이 혼합되고, 이어서 동결 건조된다. 이 동결 건조된 샘플은 분말로 만들어져 사용 시까지 약 4 ℃에서 보관될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 복합 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 유효한 양으로 투여된다. 용어 "약학적으로 유효한 양" 또는 "수의학적으로 유효한 양"은 의학적 또는 수의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자 또는 동물의 체중, 성별, 연령, 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

용어 "치료"는 예방적 및/또는 치료적 처치를 포함한다. 상기 예방적 및/또는 치료적 처치는 당업계에서 인정되는 모든 종류의 처치를 포함하며 대상에 본 발명의 약학 조성물 또는 SOD를 투여하는 것을 포함한다. 만약 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태(예컨대 질병 또는 대상의 다른 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태)의 임상적 징후 전에 투여된다면, 그러한 처치 또는 치료는 예방적 처치 또는 치료이다(예컨대, 대상의 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태가 진행되는 것으로부터 대상을 보호하는 것). 반면에 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태의 임상적 징후 후에 투여된다면, 그러한 처치 또는 치료는 존재하는 원하지 않거나 바람직하지 않은 상태 또는 이의 부작용을 감소, 완화 또는 안정화하는 등의 치료적 처치이다.

용어 "예방"의 의미는 당업계에 잘 알려져 있다. 건성안과 같은 의학적 상태와 관련하여 사용될 때, 본 발명의 약학 조성물 또는 SOD를 투여하여 이를 투여받지 않은 대상과 비교하여 의학적 상태(불편감, 시력장애, 눈물막 불안정, 안구표면 손상, 눈물 삼투압 증가, 안구표면 염증 등)의 빈도를 감소시키거나 발병 및 증상을 지연시키는 것을 의미한다.

본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이러한 양은 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 약학 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 건성안의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다.

또한, 수퍼옥시드 디스뮤타제를 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 건성 안의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다. 상기 SOD, 건성안, 치료 또는 예방에 관한 내용은 약학 조성물에 관하여 상술한 바와 같다.

용어 "투여"는 목적하는 작용을 수행하여 치료를 가능하게 하는 임의의 다양한 투여를 포함한다. 상기 투여는 경구 투여를 포함할 수 있다. 경구 투여에 대해서는, 상기 약학 조성물과 관련하여 설명된 내용을 참조한다.

일 구현예에서, 대상은 임의의 건강하거나 질병에 걸린 동물, 바람직하게는 인간, 개, 고양이, 원숭이 등 유인원, 마우스, 또는 래트를 포함하는 포유 동물이다. 바람직한 구현예에서, 대상은 인간이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 건성안을 치료하거나 예방하기 위한 하나 이상의 추가 제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 추가 제제는 상기 SOD 또는 약학 조성물과 동시에, 순차적으로 또는 역순으로 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 유효성분으로 포함하는 건성안의 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물이 제공된다.

상기 SOD 및 건성안에 관한 상세한 내용은 약학 조성물에 관하여 상술한 바와 같다.

이러한 식품 조성물은 의료용 또는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 식품 조성물을 포함한다.

용어 "의료용 식품" 또는 "뉴트라슈티컬 식품"은 인체에 유익한 기능을 할 가능성이 있는 원료 또는 성분으로 제조된 식품으로서, 정상적인 기능을 유지하거나 인체의 생리적 기능을 활성화함으로써 건강을 유지시키거나 개선시키는 식품을 지칭하고, 식품의약품안전처에 의해 규정되지만 이로 한정되지 않으며, 임의의 통상적인 건강 식품을 그 의미에서 배제하지 않는다.

또한, 상기 식품에는 각종 식품류, 식품 첨가제, 음료(예를 들어, 기능성 음료, 천연 과일 주스 및 야채 음료), 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품, 기타 기능성 식품 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.

상기 식품은 당업계에 알려진 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 의료용 식품, 뉴트라슈티컬 식품 또는 건강기능식품은 건성안을 예방하거나 개선시킬 목적으로 상기 SOD에 더하여 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 추가로 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형화될 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 통상의 기술자는 그 제형에 따라 적절한 성분을 조합하여 제조할 수 있다.

상기 상술한 제형 내 유효성분으로서의 본 발명에 따른 수퍼옥시드 디스뮤타제의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 식품의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 10 내지 1000 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 건강기능식품의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없을 수 있으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 사료 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 식품 조성물은 사료 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 사료 조성물은 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 사료 조성물은 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병 예방제와 같은 첨가제가 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료첨가용 부형제(탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 수퍼옥시드 디스뮤타제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 하기 유전자가 결실된 바실러스 종 균주가 제공된다: AprE, NprE, Bpr, Epr, NprB, Vpr, Mpr, IspA, SrfAC, spoIIAc, EpsE 및 Xpf. 상기 균주의 제조를 위한 상세한 과정은 하기 실시예 1을 참조한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것으로, 어떠한 방식으로든 이의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 제한하려는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 1. 수퍼옥시드 디스뮤타제(SodA2)를 발현하는 재조합 균주의 제조

실시예 1.1. 발현 숙주 GFBS220의 제조

발현 숙주 GFBS220는 Bacillus subtilis KCTC 3135를 이용하여 제조하였다. B. subtilis KCTC 3135는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터 분양받았다. 후공정을 용이하게 하게 위해 B. subtilis KCTC 3135 지놈에서 하기 표 1에 제시된 유전자를 제거하였다.

유전자 명칭	단백질 명칭	기능
AprE	세린 알칼리 프로테아제(서브틸리신 E)	세포외 프로테아제
NprE	세포외 중성 메탈로프로테아제	세포외 프로테아제
Bpr	바실로펩티다제(bacillopeptidase) F	세포외 프로테아제
Epr	세포외 세린 프로테아제	세포외 프로테아제
NprB	세포외 중성 프로테아제 B	세포외 프로테아제
Vpr	세포외 세린 프로테아제	세포외 프로테아제
Mpr	세포외 메탈로프로테아제	세포외 프로테아제
IspA	세포내 세린 프로테아제	세포내 프로테아제
SrfAC	서팩틴 신타제	서팩틴(surfactin) 합성
spoIIAC	RNA 폴리머라제 포자형성-특이적 시그마 인자(시그마-F)	포자형성
EpsE	추정 글리코실트랜스퍼라제	세포외 다당류
Xpf	RNA 폴리머라제 시그마 인자	PBSX 프로파지 유전자의 전사

유전자의 제거는 지놈 상에서 이중 교차 재조합(double cross-over recombination)을 이용하여 수행하였다(도 1). 구체적으로, 온도 민감성 복제 기점을 가지는 벡터 pUCori-ts-cm에 조작 대상 유전자 양 옆의 DNA 염기 서열과 상동성을 갖는 DNA 절편(up frag. 및 down frag.)을 클로닝하였다. 클로닝에 사용된 PCR 조건 및 프라이머는 각각 표 2 및 표 3에 제시되어 있다.

PCR 단계	온도	시간
최초 변성	95℃	30초
30회 주기	95℃50℃ 72℃	30초 30초 1분/kb
최종 신장	72℃	10분
PCR에 사용한 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소(NEB, USA)임.

표적 유전자	상동 쌍		프라이머 서열(5'→3')	서열번호
AprE	단편 1	F	ctacggggtctgacgcagatatcgtaaccgaagaacg	5
		R	tgttgcagacatgttgctgaacgccatc	6
	단편 2	F	caacatgtctgcaacatatcttggaaac	7
		R	gataagctgtcaaaccagagattggataggctatcaag	8
NprE	단편 1	F	ctacggggtctgacgcagggcattactgcaccataatc	9
		R	gaggtacgccttcagcagcctgaacacc	10
	단편 2	F	gctgaaggcgtacctcacgccttcttcc	11
		R	gataagctgtcaaaccagttgtcagatttgcatccttc	12
Bpr	단편 1	F	ctacggggtctgacgcagagcaatttccagcccgcttc	13
		R	gtatgatgaggcatgaacagcaatcccg	14
	단편 2	F	tcatgcctcatcatactcaacaagggtg	15
		R	gataagctgtcaaaccagttcccagccggatgttcaac	16
Epr	단편 1	F	ctacggggtctgacgcaggctttctgccagccgatagg	17
		R	tgtgtcaaagccgttatgcttggctccg	18
	단편 2	F	taacggctttgacacagcacaaactgcc	19
		R	gataagctgtcaaaccaggtctcccatacatgaacgac	20
NprB	단편 1	F	ctacggggtctgacgcagagtaatcttgtaggaggctg	21
		R	tgtgactgtcatattcaccgtcgtgtgg	22
	단편 2	F	tgaatatgacagtcacacagtattccgcc	23
		R	gataagctgtcaaaccagattaggatacggtctggctg	24
Vpr	단편 1	F	ctacggggtctgacgcagatgtacgctgagccgaatag	25
		R	ggaatcacatttgcggagatacggcgtc	26
	단편 2	F	ccgcaaatgtgattccggcacatcaaac	27
		R	gataagctgtcaaaccagaccgttttccgaatctgacc	28
Mpr	단편 1	F	ctacggggtctgacgcagcgttatcccgaatgcccgtg	29
		R	ggctttgttcctttagtgtcaaccaccc	30
	단편 2	F	ctaaaggaacaaagccgattcgctccgc	31
		R	gataagctgtcaaaccagaaattgactgctccacgctg	32
SrfAC	단편 1	F	ctacggggtctgacgcaggatatgtattacctatcgcc	33
		R	gccccttcatccagttcactgcttccttg	34
	단편 2	F	ggaagcagtgaactggatgaaggggcttcgctg	35
		R	gataagctgtcaaaccagaacgcttcgacatcactttc	36
spoIIA	단편 1	F	ctacggggtctgacgcagagcggacgatgggagactgg	37
		R	gccacctcatgcagccgatctggaagag	38
	단편 2	F	ggctgcatgaggtggctgagcggctcgg	39
		R	gataagctgtcaaaccagctcattgttttggtgagctg	40
IspA	단편 1	F	ctacggggtctgacgcagtgctgcttggcattcatttc	41
		R	gccattgaagcaatgcctccgtttgaatc	42
	단편 2	F	acggaggcattgcttcaatggctgcccctcatg	43
		R	gataagctgtcaaaccagtcaatgctctcgtcatattc	44
EpsE	단편 1	F	ctacggggtctgacgcagcaagcaaatgggctgggagg	45
		R	gacaagccatgctttctgccaaagtgcg	46
	단편 2	F	gaaagcatggcttgtcaagcatgaatag	47
		R	gataagctgtcaaaccagtgttgtatacattcagcagc	48
Xpf	단편 1	F	gatcctctacggttcatccatgtccgaac	49
		R	tctatgatcctcctcatttttg	50
	단편 2	F	gaggaggatcatagaaagcttgtcatacgtttgcc	51
		R	gagttttcgttcggatcctccgctttttgtttg	52

이렇게 제조된 벡터를 B. subtilis 세포로 도입한 후, 37℃(비복제온도)에서 클로람페니콜이 함유된 배지를 이용하여 형질전환체(단일 교차 상동 재조합)를 선별하였다. 선별된 형질전환체를 항생제가 없는 LB 배지로 30℃(복제 허용 온도)에서 배양(제2 교차)한 후, 항생제가 없는 LB 한천배지로 39℃에서 배양하였다. 생성된 콜로니를 대상으로 클로람페니콜 감수성을 가지는 균주(plasmid curing)를 선별하였다. 선별된 콜로니를 대상으로 PCR을 수행하여 이중 교차 재조합체(double cross-over recombinant)를 확보하고, 2차 순수 분리를 수행하여 최종 재조합체를 선별하고, GFBS220으로 명명하였다.

GFBS220의 결손 유전자 부위는 표 4에 제시된 프라이머와 PCR을 이용하여 증폭한 후 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 확인하였다. 발현 숙주 GFBS220에서 PCR을 이용하여 결손 유전자를 확인한 결과를 도 2에 나타낸다.

유전자 부위 (locus)	PCR 프라이머(서열번호)	B. subtilis KCTC 3135의 PCR 산물의 크기	GFBSL210 PCR 산물의 크기
AprE	F caaggcttgaaataacgttg (서열 번호 53) R ttcgctgattacaacattgg (서열 번호 54)	3115bp	2116bp
NprE	F ggaacagatgatagctcatc (서열 번호 55) R acactccgagaaggctgaag (서열 번호 56)	3487bp	2145bp
Vpr	F ctgcggcctgcacagccgcc (서열 번호 57) R cgctgaatgacggtggtaag (서열 번호 58)	3733bp	2293bp
NprB	F agtaatcttgtaggaggctg (서열 번호 59) R cgccaatgaagtgaaggagg (서열 번호 60)	2666bp	2153bp
Mpr	F ggttgaggcgattgcgacgg (서열 번호 61) R ccattctgcaaaatcagctc (서열 번호 62)	2734bp	2076bp
spoIIAC	F aagatatgaagaaagccggg (서열 번호 63) R acagccgcttcataagcctg (서열 번호 64)	2628bp	2102bp
ThrC	F tcaagctgtcatgtacggag (서열 번호 65) R tccgatacgaatggctgtcg (서열 번호 66)	376bp	5455bp

실시예 1.2. 발현 벡터 pBE1-sodA2의 제작

바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 GF423의 배양 상층액에서 N-말단 시퀀싱(문헌[Kang et al., 2018])을 통해 Mn-SOD를 확인하였다. 상기 GF423 균주는 한국생명공학연구원에 각각 2017년 3월 6일자로 기탁된 것이다(수탁번호 KCTC 13222 BP). 상기 Mn-SOD의 유전자는 박테리아 SOD에 대한 명명법에 따라 sodA로 명명되었고, 그의 아미노산 서열은 도 3 및 서열번호 2를 참조한다(그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1을 참조함). 효소 제조물의 LC-UV-MS/MS 펩티드 매핑은 100% 아미노산 서열 커버리지를 생성했지만, Asn73 및 Asn136 잔기에서 각각 73% 및 17% 존재비로 탈아미드화가 관찰되었다. 따라서, 정제된 효소의 균질성을 개선하기 위해 두 Asn 잔기를 Asp로 치환하였다. SodA2로 명명된 이러한 변이체 sodA의 아미노산 서열은 도 3 및 서열번호 4(그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3을 참조함)를 참조한다.

4개의 프라이머(표 5)와 주형인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF423 지놈을 사용하는 중복 신장 PCR을 이용하여 sodA2 유전자를 증폭시켰다. Asn의 Asp로의 치환을 위한 뉴클레오티드에는 밑줄이 그어져 있다.

프라이머		서열(5'→3')	서열번호
1	SOD F	GGAGGAATTACAATGGCTTACAA	67
2	D74 R	TGCATGTCCGCCGCCATCGTTGCGGAC	68
3	D74 F	CAGTCCGCAACGATGGCGGCGGACATG	69
4	D137 R	TTCAAGTTTGCCGTCGTTTACAACGAGC	70
5	D137 F	CTCGTTGTAAACGACGGCAAACTTG	71
6	SOD R	CAAAACAGAAGCTTCATTATTTTGCT	72

sodA2 유전자를 포함하는 증폭된 DNA 단편 및 NdeI 및 HindIII 처리에 의해 선형화된 플라스미드 pBE1을 SLIC 방법(문헌[Jeong et al. 2012])으로 시험관내에서 어셈블링하고, 이어서 생성된 작제물을 E. coli C2984H 내로 형질전환시켰다. 제한 효소 매핑으로 정확한 클론을 스크리닝하고, 뉴클레오티드 시퀀싱으로 확인했다. 이렇게 생성된 발현 벡터 pBE1-sodA2는 도 4에 도시되어 있다.

실시예 1.3. 생산 균주 BSBA310의 제조

발현 벡터 pBE1-sodA2를 B. subtilis GFBS220 내로 형질전환시켰다. 형질전환체들로부터 균주를 선택하고, LB2 배지에서 2회의 단일 콜로니 분리 절차에 의해 순수한 클론을 확립하였다. 선택된 균주를 BSBA310으로 명명하고, 글리세롤 스톡법으로 -80℃에서 보관하였다. 이러한 생산 균주 BSBA310에서 PCR을 이용하여 결손 유전자를 확인한 결과를 도 2에 나타낸다. 또한, 생산 균주 BSBA310을 제조하기 위한 전체 절차는 도 5에 요약되어 있다.

실시예 2. 생산 균주 BSBA310으로부터 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SodA2)의 분리 및 정제

실시예 2.1. 생산 균주 BSBA310의 배양

실시예 1에서 얻은 생산 균주 BSBA310의 배양을 위해, LB 한천 배지(LB(Luria-Bertani) 한천; 트립토판 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L, 한천 15 g/L)에서 형성된 단일 콜로니를 LB 배지 30 ml에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이 종배양액(seed culture)을 다시 1 mM 황산망간(MnSO4)이 포함된 LB 배지 3 L에 접종하고, 37℃에서 20시간 동안 배양하였다.

실시예 2.2. SodA2의 분리 및 정제

실시예 2.1에서 얻은 세포 배양액을 4℃, 3,578 x g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취한 후, 초미세여과(Ultrafiltration, 이하 UF, MWCO 10,000)를 이용하여 10배 농축하였다. 농축된 세포 배양액 1L당 390g의 황산암모늄을 넣고 20분간 교반을 하고 원심분리를 하고 상등액을 취하였다. 취한 상등액을 페닐세파로스 HP 컬럼을 사용하여 정제를 하였다. 정제 과정은 2M 황산암모늄 농도의 50mM 인산칼륨 pH 7.0을 사용해서 컬럼을 평형화하였으며, 이후 황산암모늄을 넣고 얻은 상등액을 컬럼에 통과시켰고, 컬럼에 붙은 SodA2를 1.6M 황산암모늄을 포함한 50mM 인산칼륨 pH 7.0을 사용해서 회수하였다. 컬럼을 통해 정제를 한 정제액을 모아서 초미세여과를 통해 정제 과정중에 형성된 고농도 염을 제거하며 농축을 하였다. 농축액을 제균 필터로 여과한 후, 동결건조하였다. SodA2의 활성은 SOD 분석 키트(Cayman Chemical, Michigan, USA)를 이용하여 분석하였다. SOD 활성 1 단위(unit)는 수퍼옥시드 라디칼을 50% 억제하는 효소의 양으로 정의된다. 건조된 SodA2 효소의 활성은 1000 내지 1200 U/mg이었다.

실시예 3. 투여 물질의 제조

쉘락(Shellac)(EXCELACS co., LTD., Bangkok)을 3% 에탄올 농도가 되도록 녹이고 0.2 um 무균 필터를 사용해서 제균하였다. 에탄올로 녹인 쉘락을 PBS로 희석하였다. 동결건조한 SodA2를 20 mg/mL로 녹이고, 쉘락 용액과 SOD 용액을 1:1로 섞은 후, 동결건조시켰다. 동결건조된 쉘락 코팅 SodA2에 덱스트린을 사용해서 1:9 내지 12(쉘락 코팅 SodA2: 덱스트린) 비율로 혼합하여, 동물 시험 시 사용한 물질을 제조하였다. 최종 물질의 SOD 활성은 90 내지 110 U/mg이 되도록 하였다.

실시예 4. 건성안 치료 또는 예방 효과 확인

본 실시예에서는 실험적 건성안(Experimental dry eye, EDE)을 유발한 C57BL/6 쥐 모델에서 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg 농도의 경구용 SodA2가 눈물 분비량, 눈물막 파괴시간, 안구 표면 손상, 결막 배상세포, 안구표면의 염증성 사이토카인, CD4+ T 면역세포, 산화스트레스 및 활성산소종, 각막상피 세포사멸(apoptosis)에 미치는 효과에 대해 분석하고자 하였다.

실시예 4.1. 실험적 건성안(EDE) 동물 모델의 준비

실험적 건성안을 유발시키기 위해, 7주에서 8주령 C57BL/6 쥐(입수처: 다물사이언스)를 1일 18시간 동안 통풍장치에 노출시킨 상태에서 1일 3회 0.5 mg/0.2 Ml의 스코폴라민 하이드로클로라이드로 피하주사하였다. 습도는 30%, 온도는 25℃로 유지시켰다. 투여하는 경구용 약물의 농도에 따라 C57BL/6 쥐를 표 6과 같이 7개 군으로 분류하였다.

군 설정
UT	미처리 대조군(정상), n = 6
EDE	EDE 단독(EDE 대조군), n = 6
비히클	EDE + 비히클(음성 대조군), 1일 1회 투여, n = 6
0.05% CsA	EDE + 0.05% CsA(양성 대조군), 1일 2회 점안 투여, n = 6
2.5 mg/kg 경구용 SodA2	EDE + 경구용 SodA2 2.5 mg/kg, 1일 1회 투여, n = 6
5 mg/kg 경구용 SodA2	EDE + 경구용 SodA2 5 mg/kg, 1일 1회 투여, n = 6
10 mg/kg 경구용 SodA2	EDE + 경구용 SodA2 10 mg/kg, 1일 1회 투여, n = 6
여기서 CsA는 사이클로스포린 A를 지칭한다.

실시예 4.2. 약물 투여 및 시험 절차

실험용 쥐에 실험적 건성안을 유발한 후에 치료군에 실시예 3에서 준비된 약물을 1회당 2 μL로 1일 1회 경구 투여하였다(매일 13시 30분에 투여됨). 모든 쥐의 양안에서 기준선, 5일째 및 10일째에 눈물 분비량, 눈물막 파괴시간을 측정하고 각막 형광색소 염색 점수를 조사하였다. 이어서 쥐를 희생시킨 다음 조직분석을 시행하였다. 각 군에서 동물은 6마리로 하였다.

눈물 분비량(tear volume) 측정

눈물 분비량은 쥐의 외안각쪽 결막낭에 페놀-레드 함침된 코튼 스레드(cotton thread)를 20초간 접촉시켜 그 길이를 SMZ 현미경검사를 이용하여 측정한 다음, 정해진 공식에 대입하여 부피로 변환하였다(문헌[Villareal AL, Farley W, Pflugfelder SC. Effect of topical ophthalmic epinastine and olopatadine on tear volume in mice. Eye Contact Lens. 2006; 32:272-6] 참조).

눈물막 파괴 시간(tear film break-up time) 측정

건성안에 있어 가장 중요한 임상 인자로 알려져 있는 눈물막 안정성(tear film stability)을 평가하기 위해 눈물막 파괴 시간을 측정하였다. 쥐의 아래쪽 결막낭에 1% 형광 염색액(fluorescein) 1 μl을 점안한 후 3회 정도의 눈깜박임을 시킨 후 부드럽게 벌린 다음, 코발트 블루 필터(cobalt blue filter)가 장착된 세극등 현미경(slit lamp)을 통해 염색된 눈물막에 첫 번째 결손이 생길 때까지의 시간(초)을 측정하였다. 이를 3회 반복 시행하여 평균값을 구하였다.

각막 형광 염색 점수(corneal fluorescent staining score) 측정

1% 형광 염색액 1 μl를 점안 후 식염수로 세척한 다음, 쥐의 각막을 세극등 현미경으로 관찰하여 상피손상 정도(형광염색이 묻어나는 정도)를 점수화하였다. 이를 위해 각막을 4개의 구역으로 나눈 다음, 각 등분을 표 7과 같이 0 내지 4점까지 평가한 후 합산하였다(총 0 내지 16점)(문헌[Pauly A, Brignole-Baudouin F,

A, Liang H, Warnet JM, Baudouin C: New tools for the evaluation of toxic ocular surface changes in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007; 48:5473-83] 참조).

0	없음
1	30개 미만 반점의 약한 점상 염색
2	30개 미만 반점의 점상 염색, 그러나 미만성은 아님
3	심한 미만성 염색, 그러나 양성 플라크는 없음
4	양성 플루오레세인 플라크를 동반한 심한 미만성 염색

ELISA를 통한 말론디알데하이드(MDA)의 측정

조직의 분석에 필요한 양안 각 군당 3마리 6안에서 각막, 결막 및 눈물샘을 절제하였다. PBS에서 샘플들을 균질화한 후 용해물을 4℃에서 10분동안 10000 x g에서 원심분리하였다. 그리고 상층액을 취한 후 브래드포드(Bradford) 검사법으로 단백질 총 양을 측정하였다. MDA는 제조상품의 매뉴얼에 따라 캡쳐 및 검출 항체가 포함된 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트(제조사: Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 검출하였다. ELISA를 이용하여 각막, 결막 그리고 눈물샘의 MDA 수치를 각각 측정하고 기록하였다.

루미넥스 멀티플렉스 염색비드 검사(Luminex multiplex immunobead assay)를 통한 염증성 사이토카인의 측정

각 군당 3마리 6안에서 결막 조직을 절제 채취한 후, 이를 프로테아제 억제제를 포함한 용해 완충액에 30분 간 담근 후 원심분리하여 -80℃에 보관하였다. 그 후 루미넥스 멀티플렉스 염색비드 검사를 이용하여 각막 및 결막 내의 IFN-γ, IL-1β, TNF-α의 농도를 분석하였다.

유세포분석(flow cytometry)을 통한 면역세포 수 및 활성산소종(DCF-DA) 측정

각막과 결막, 눈물샘을 절제하여 가위로 쪼갠 후 0.5 mg/ml 콜라게나아제 타입 D(제조사: Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)로 37℃에서 60분간 흔들었다. 조직을 분쇄한 후 셀 스트레이너(cell strainer)에 통과시킨 다음 원심분리를 시행하였다. 플루오레세인-접합 항-CD4 항체와 피코에리트린-접합 항-IFN-γ 항체를 이용하여 유세포분석을 시행하여 CD4+IFN-γ+ T세포를 계산하고, CM-H2DCFDA 키트(제조사: Thermo fisher scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 DCF-DA세포의 수를 계산하였다.

조직학적 분석(histology)

각 군당 1마리, 1안에서 눈과 부속조직을 절제하여 4% 파라포름알데하이드 에 고정하고 파라핀에 포매시킨 다음 조직의 단면 2조각에 대한 PAS 염색을 시행하였다. 각 단면에서 현미경과 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 결막내 배상세포의 밀도를 계산하였다.

면역형광염색(immunofluorescent staining)

각 군당 1마리, 1안에서 눈과 부속조직을 절제하여 4% 파라포름알데하이드 에 고정하고 파라핀에 포매시킨 다음 조직의 단면 2조각에 대한 TUNEL 염색을 시행하였다. 각 단면에서 현미경(Leica TCS SP5 AOBS laser scanning confocal microscope (Zeiss GmbH))과 이미지 분석 소프트웨어(NIS Elements version 4.1; Nikon, Melville, NY, USA)를 이용하여 결막의 세포사멸 정도를 확인하였다.

통계적 분석

SPSS 22.0을 분석에 이용하였고, 연속형 변수의 결과값은 평균 ± S.D. 로 표기하였다. 정규성은 Shapiro-wilk 검정으로 확인하였다. 군 간 비교는 일원 분산 분석(ANOVA) 후 Fishers L.S.D. 사후 검정으로 사후 분석하였다. P-값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 4.3. 결과

눈물 분비량

눈물 분비량은 약물 투여 전 UT군에서 0.046 ± 0.004 μL, EDE군에서 0.023 ± 0.004 μL, 비히클군에서 0.024 ± 0.003 μL, 0.05% CsA(사이클로스포린 A)군에서 0.023 ± 0.003 μL, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 0.024 ± 0.003 μL, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 0.022 ± 0.004 μL, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 0.023 ± 0.004 μL이었다.

투여 5일째에는 UT군에서 0.045 ± 0.006 μL, EDE군에서 0.02 ± 0.003 μL, 비히클군에서 0.021 ± 0.003 μL, 0.05% CsA군에서 0.026 ± 0.004 μL, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 0.026 ± 0.005 μL, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 0.026 ± 0.005 μL, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 0.026 ± 0.005 μL이었다.

투여 10일째에는 UT군에서 0.043 ± 0.005 μL, EDE군에서 0.017 ± 0.003 μL, 비히클군에서 0.018 ± 0.00 3 μL, 0.05% CsA군에서 0.027 ± 0.005 μL, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 0.027 ± 0.005 μL, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 0.03 ± 0.005 μL, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 0.028 ± 0.004 μL이었다.

투여 5일째와 10일째에, 0.05% CsA, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2, 5 mg/kg 경구용 SodA2, 10 mg/kg 경구용 SodA2군 모두에서 EDE 및 비히클군에 비해서 눈물 분비량의 유의한 증가가 있었으며, 특히 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서는 0.05% CsA군보다 더 유의한 증가를 보였다. 이와 같은 눈물 분비량 측정 결과를 도 6에 도시하였다.

눈물막 파괴 시간

눈물막 파괴시간은 약물 투여 전 UT 군에서 2 ± 0.45초, EDE 군에서 1.43 ± 0.19초, 비히클군에서 1.43 ± 0.23초, 0.05% CsA군에서 1.46 ± 0.13초, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 1.44 ± 0.15초, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 1.42 ± 0.16초, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 1.41 ± 0.25초이었다.

투여 5일째에는 UT 군에서 2.21 ± 0.4초, EDE군에서 1.02 ± 0.2초, 비히클군에서 1.06 ± 0.23초, 0.05% CsA군에서 1.3 ± 0.2초, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 1.23 ± 0.2초, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 1.31 ± 0.3초, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 1.28 ± 0.3초이었다.

투여 10일째에는 UT군에서 2.1 ± 0.4초, EDE군에서 0.91 ± 0.2초, 비히클군에서 0.93 ± 0.2초, 0.05% CsA군에서 1.39 ± 0.2초, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 1.21 ± 0.3초, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 1.28 ± 0.3초, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 1.3 ± 0.3초이었다.

투여 5일째와 10일째에, 0.05% CsA, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2, 5 mg/kg 경구용 SodA2, 10 mg/kg 경구용 SodA2군 모두에서 EDE 및 비히클군에 비해서 눈물막 파괴시간의 유의한 증가가 있었으며, 특히 5 mg/kg 경구용 SodA2과 10 mg/kg 경구용 SodA2군은 0.05% CsA군과 유사하게 눈물막 파괴시간을 증가시켰다. 이와 같은 눈물막 파괴시간 측정 결과를 도 7에 도시하였다.

각막 형광염색 점수

각막 형광색소 염색 점수는 약물 투여 전 UT 군에서 1.8 ± 1.1점, EDE군에서 9.5 ± 1.8점, 비히클군에서 9.1 ± 2점, 0.05% CsA군에서 9.1 ± 2점, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 9.2 ± 1.7점, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 9.4 ± 1.7점, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 9.3 ± 1.7점이었다.

투여 5일째에는 UT 군에서 2.9 ± 1.4점, EDE군에서 12.1 ± 2.1점, 비히클군에서 11.7 ± 2.2점, 0.05% CsA군에서 10.4 ± 2.5점, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 10.4 ± 1.9점, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 9.9 ± 2.5점, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 10.1 ± 2.9점이었다.

투여 10일째에는 UT군에서 3.6 ± 1.4점, EDE군에서 14.1 ± 1.8점, 비히클군에서 13.5 ± 1.6점, 0.05% CsA군에서 8.9 ± 2점, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 8.8 ± 2점, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 7.8 ± 1.9점, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 8.2 ± 1.9점이었다.

투여 5일째와 10일째에, 0.05% CsA, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2, 5 mg/kg 경구용 SodA2, 10 mg/kg 경구용 SodA2 군 모두에서 EDE 및 비히클군에 비해서 각막 형광염색 점수의 유의한 감소가 있었으며, 특히 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서는 0.05% CsA 보다 더 유의한 감소를 보였다. 이와 같은 각막 형광염색 점수 측정 결과를 도 8에 도시하였다.

말론디알데하이드(MDA) 농도

각막(cornea), 결막(conjunctiva), 및 눈물샘(lacrimal gland)에서 MDA 농도를 측정한 결과를 표 8에 제시하였다. 단위는 pmol/mL이다.

	각막	결막	눈물샘
UT	12.1 ± 3.16	17.8 ± 12.2	14.6 ± 7.25
EDE	30.9 ± 21.1	28.0 ± 8.92	31.0 ± 13.6
비히클	27.7 ± 27.4	26.1 ± 4.64	37.0 ± 12.6
0.05% CsA	17.7 ± 9.62^* ^†	19.1 ± 7.99^* ^†	22.2 ± 11.4^* ^†
2.5 mg/kg 경구용 SodA2	22.7 ± 13.8^* ^†	21.5 ± 9.26^* ^†	22.6 ± 7.72^* ^†
5 mg/kg 경구용 SodA2	20.2 ± 14.0^* ^†	19.0 ± 7.17^* ^†	18.8 ± 11.6^* ^†
10 mg/kg 경구용 SodA2	18.5 ± 10.6^* ^†	16.3 ± 9.12^* ^†	22.5 ± 11.4^* ^†

상기 표 8에서 확인되는 바와 같이, CsA와 경구용 SodA2 치료군의 각막, 결막, 및 눈물샘 모두에서 EDE 및 비히클군에 비해 MDA의 농도가 감소하였다. 특히 10 mg/kg 경구용 SodA2은 0.05% CsA와 유사하거나(각막, 눈물샘) 우수한 효능을 보였다(결막).

염증성 사이토카인

각막과 결막에서 염증성 사이토카인을 측정한 결과를 표 9에 제시하였다. 단위는 pg/ml이다.

		IFN-γ	IL-1β	TNF-α
각막	UT	9.28 ± 1.28	14.26 ± 6.09	14.6 ± 7.25
	EDE	18.81 ± 18.32	23.12 ± 12.09	31.0 ± 13.6
	비히클	17.90 ± 16.02	22.90 ± 9.91	37.0 ± 12.6
	0.05% CsA	11.95 ± 8.27	19.98 ± 8.14	22.2 ± 11.4
	2.5 mg/kg 경구용 SodA2	10.77 ± 8.30	15.45 ± 8.93	22.6 ± 7.72
	5 mg/kg 경구용 SodA2	9.80 ± 6.11	13.17 ± 2.26	18.8 ± 11.6
	10 mg/kg 경구용 SodA2	7.89 ± 7.90	8.69 ± 4.18	22.5 ± 11.4
결막	UT	12.98 ± 5.14	17.8 ± 12.2	14.6 ± 7.25
	EDE	35.96 ± 25.62	28.0 ± 8.92	31.0 ± 13.6
	비히클	37.42 ± 26.15	26.1 ± 4.64	37.0 ± 12.6
	0.05% CsA	25.33 ± 13.71	19.1 ± 7.99	22.2 ± 11.4
	2.5 mg/kg 경구용 SodA2	21.27 ± 17.49	21.5 ± 9.26	22.6 ± 7.72
	5 mg/kg 경구용 SodA2	18.28 ± 11.75	19.0 ± 7.17	18.8 ± 11.6 ^†
	10 mg/kg 경구용 SodA2	15.53 ± 11.43	16.3 ± 9.12	22.5 ± 11.4

상기 표 9에서 확인되는 바와 같이, CsA와 경구용 SodA2 치료군의 각막과 결막에서 EDE 및 비히클군에 비해서 IFN-γ, IL-1β, TNF-α의 농도가 감소하는 경향을 보였다. 특히 모든 용량의 경구용 SodA2는 CsA보다 염증성 사이토카인을 더 감소시키는 경향을 보였다.

유세포분석을 통한 면역세포(CD4+IFN-γ T 세포)의 수 측정

각막에서 CD4+IFN-γ+ T세포의 비율은 UT군에서 16.53 ± 1.65%, EDE군에서 48.39 ± 1.34%, 비히클군에서 47.02 ± 0.04%, 0.05% CsA 군에서 26.05 ± 0.18% 이었으며, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 21.18 ± 0.15%, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 23.87 ± 0.17%, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 30.24 ± 1.33% 이었다.

한편, 결막에서 CD4+IFN-γ+ T세포의 비율은 UT군에서 17.40 ± 3.43%, EDE군에서 46.63 ± 1.27%, 비히클군에서 43.65 ± 2.68%, 0.05% CsA 군에서 22.67 ± 0.47% 이었으며, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 21.00 ± 0.63%, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 22.87 ± 2.47%, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 25.83 ± 0.27% 이었다.

각막과 결막에서 CsA와 경구용 SodA2 모두에서 EDE 및 비히클 군에 비해 CD4+IFN-γ+ T세포의 비율이 유의하게 감소하였고, 특히 각막에서는 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 0.05% CsA군에 비하여 유의하게 더 낮은 CD4+IFN-γ+ T세포의 비율을 보였다. 이와 같은 각막 및 결막에서 CD4+IFN-γ+ T세포 수를 분석한 결과를 각각 도 9a 및 도 9b에 도시하였다.

활성산소 측정

안구건조에 따른 각막에서 활성산소의 발생은 UT군에서 33.93 ± 24.62%, EDE군에서 87.43 ± 49.83%, 비히클군에서 76.25 ± 49.54%, 0.05% CsA 군에서 50.27 ± 11.27% 이었으며, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 33.57 ± 26.51%, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 54.53 ± 13.53%, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 57.38 ± 23.43%이었다.

결막에서는 UT군에서 42.25 ± 23.23%, EDE군에서 97.69 ± 54.19%, 비히클군에서 95.48 ± 54.54%, 0.05% CsA 군에서 58.16 ± 5.54% 이었으며, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 55.13 ± 7.41%, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 57.63 ± 8.16%, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 53.29 ± 1.19%이었다.

한편, 눈물샘에서는 UT군에서 36.88 ± 26.91%, EDE군에서 100.90 ± 80.95%, 비히클군에서 114.26 ± 65.19%, 0.05% CsA 군에서 58.66 ± 11.11% 이었으며, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 59.05 ± 10.77%, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 56.03 ± 6.37%, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 49.92 ± 4.19% 이었다.

각막, 결막, 및 눈물샘 모두에서 SodA2치료군은 CsA 치료군과 유사하거나 더 나은 활성 감소 효과를 나타냈고, 특히 각막에서 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군은 CsA군에 비하여 더 우수한 활성 산소 발생의 감소 효과를 나타냈다. 이와 같은 각막, 결막, 및 눈물샘에서의 활성 산소 발생에 대한 결과를 각각 도 10a, 도 10b 및 도 10c에 도시하였다.

결막내 배상세포 수 측정

결막내 배상세포의 수는 UT군에서 52.1 ± 9.6 세포/100 μm, EDE군에서 14.1 ± 3.6 세포/100 μm, 비히클군에서 14.6 ± 2.4 세포/100 μm 이었다. 0.05% CsA군에서 25.2 ± 3.4 세포/100 μm, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 27.9 ± 6.9 세포/100 μm, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서 35.8 ± 10.2 세포/100 μm, 10 mg/kg 경구용 SodA2군에서 32.2 ± 3.9 세포/100 μm으로 처리군 모두에서 배상세포 수의 유의적인 증가를 나타냈다. 특히, 5 mg/kg 경구용 SodA2군에서는 0.05% CsA군보다 더 유의하게 배상세포의 수가 증가하였다. 이와 같은 결막내 배상세포 수를 측정한 결과를 도 11a(PAS 염색 이미지) 및 도 11b(배상세포 수)에 도시하였다.

세포사멸 측정

각막 내 괴사세포의 수는 UT군에서 1.6 ± 0.5 cells/100 μm, EDE군에서 14.8 ± 3.3 cells/100 μm, 비히클군에서 12.1 ± 3.0 cells/100 μm으로 안구건조 자극에 의해 크게 증가하였다. 이에 반해 0.05% CsA군은 6.1 ± 2.1 cells/100 μm, 2.5 mg/kg 경구용 SodA2군은 6.2 ± 1.1 cells/100 μm, 5 mg/kg 경구용 SodA2군은 4.0 ± 1.3 cells/100 μm, 10 mg/kg 경구용 SodA2군은 4.6 ± 1.3 cells/100 μm으로 CsA와 경구용 SodA2 처리군 모두에서 EDE 및 비히클군에 비해서 각막 내에서 사멸하는 세포 수가 유의하게 감소하였다. 이와 같은 세포사멸 측정 결과를 도 12a(TUNEL 염색 이미지) 및 도 12b(세포사멸 양성 세포 수)에 도시하였다.

실시예 4.4. 결론

이상의 결과를 요약하면, 건성안을 유발시킨 마우스에서 경구용 SodA2은 안구표면의 눈물분비량, 눈물막파괴시간, 그리고 각막상피 손상을 호전시켰다. 또한 각막 및 결막의 염증성 T 세포와 사이토카인을 감소시키는 경향을 보였다. 그리고 각막, 결막 및 눈물샘의 산화스트레스를 감소시키며, 결막 내 배상세포수를 증가시킬 수 있으며, 각막상피 세포사멸을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 이에 더하여 경구용 SodA2은 각막 형광색소염색 점수, 각막의 염증성 T세포, 결막 내 배상세포 밀도에서 0.05% 사이클로스포린(Cyclosporin) 과 비교하여 비슷하거나 우월한 효능을 보일 수 있다고 판단된다. 새롭게 개발된 경구용 SodA2은 안구표면의 손상을 최소화하고 염증을 감소시킬 수 있어, 향후 건성안 환자의 치료에 있어서 유용하게 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

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2 Met Ala Tyr Lys Leu Pro Glu Leu Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu 1 5 10 15 Pro His Ile Asp Lys Glu Thr Met Thr Ile His His Thr Lys His His 20 25 30 Asn Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Lys Ala Ile Glu Gly Ser Ala Leu 35 40 45 Ala Glu Lys Ser Val Asp Glu Leu Val Ala Asp Leu Asn Ala Val Pro 50 55 60 Glu Asp Ile Arg Thr Ala Val Arg Asn Asn Gly Gly Gly His Ala Asn 65 70 75 80 His Ser Leu Phe Trp Thr Leu Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro 85 90 95 Thr Gly Glu Leu Ala Glu Glu Ile Lys Ser Thr Phe Gly Ser Phe Asp 100 105 110 Gln Phe Lys Glu Lys Phe Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Phe Gly Ser 115 120 125 Gly Trp Ala Trp Leu Val Val Asn Asn Gly Lys Leu Glu Ile Thr Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Glu Gly Lys Thr Pro Val Leu 145 150 155 160 Gly Leu Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Asn Tyr Gln Asn Arg 165 170 175 Arg Pro Asp Tyr Ile Ser Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Asp Glu 180 185 190 Val Ala Arg Leu Tyr Ser Glu Ala Lys 195 200 <210> 3 <211> 609 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 3 atggcttaca aacttccaga attgccttac gcttatgatg ctttagaacc tcatatcgat 60 aaggaaacga tgacgattca ccatacgaag caccataaca catacgtgac aaacctcaac 120 aaagcgatcg aaggatctgc gcttgcagag aaatctgtag atgagcttgt tgctgatttg 180 aacgcagtgc cggaggacat ccgcacggca gtccgcaacg atggcggcgg acatgcaaac 240 cactctttat tctggactct tttatctccg aacggcggag gcgaaccgac tggtgagctt 300 gctgaagaga tcaaaagcac gttcggaagc ttcgatcaat ttaaagaaaa attcgccgca 360 gcagctgcag gccgtttcgg ttcaggctgg gcttggctcg ttgtaaacga cggcaaactt 420 gaaattacaa gcacgccaaa ccaagattca ccgctttcag aaggtaaaac acctgttctc 480 ggtcttgatg tttgggagca tgcgtactac ctgaactacc aaaaccgccg tcctgattac 540 atttcagctt tctggaatgt tgtgaactgg gatgaagttg cccgtcttta cagcgaagca 600 aaataatga 609 <210> 4 <211> 201 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 4 Met Ala Tyr Lys Leu Pro Glu Leu Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu 1 5 10 15 Pro His Ile Asp Lys Glu Thr Met Thr Ile His His Thr Lys His His 20 25 30 Asn Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Lys Ala Ile Glu Gly Ser Ala Leu 35 40 45 Ala Glu Lys Ser Val Asp Glu Leu Val Ala Asp Leu Asn Ala Val Pro 50 55 60 Glu Asp Ile Arg Thr Ala Val Arg Asn Asp Gly Gly Gly His Ala Asn 65 70 75 80 His Ser Leu Phe Trp Thr Leu Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro 85 90 95 Thr Gly Glu Leu Ala Glu Glu Ile Lys Ser Thr Phe Gly Ser Phe Asp 100 105 110 Gln Phe Lys Glu Lys Phe Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Phe Gly Ser 115 120 125 Gly Trp Ala Trp Leu Val Val Asn Asp Gly Lys Leu Glu Ile Thr Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Glu Gly Lys Thr Pro Val Leu 145 150 155 160 Gly Leu Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Asn Tyr Gln Asn Arg 165 170 175 Arg Pro Asp Tyr Ile Ser Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Asp Glu 180 185 190 Val Ala Arg Leu Tyr Ser Glu Ala Lys 195 200 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aprE_frgament 1_forward primer <400> 5 ctacggggtc tgacgcagat atcgtaaccg aagaacg 37 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aprE_frgament 1_reverse primer <400> 6 tgttgcagac atgttgctga acgccatc 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aprE_frgament 2_forward primer <400> 7 caacatgtct gcaacatatc ttggaaac 28 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aprE_frgament 2_reverse <400> 8 gataagctgt caaaccagag attggatagg ctatcaag 38 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nprE_frgament 1_forward primer <400> 9 ctacggggtc tgacgcaggg cattactgca ccataatc 38 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nprE_frgament 1_reverse primer <400> 10 gaggtacgcc ttcagcagcc tgaacacc 28 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nprE_frgament 2_forward primer <400> 11 gctgaaggcg tacctcacgc cttcttcc 28 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nprE_frgament 2_reverse primer <400> 12 gataagctgt caaaccagtt gtcagatttg catccttc 38 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bpr_frgament 1_forward primer <400> 13 ctacggggtc tgacgcagag caatttccag cccgcttc 38 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bpr_frgament 1_reverse primer <400> 14 gtatgatgag gcatgaacag caatcccg 28 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bpr_frgament 2_forward primer <400> 15 tcatgcctca tcatactcaa caagggtg 28 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bpr_frgament 2_reverse primer <400> 16 gataagctgt caaaccagtt cccagccgga tgttcaac 38 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> epr_frgament 1_forward primer <400> 17 ctacggggtc tgacgcaggc tttctgccag ccgatagg 38 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> epr_frgament 1_reverse primer <400> 18 tgtgtcaaag ccgttatgct tggctccg 28 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> epr_frgament 2_forward primer <400> 19 taacggcttt gacacagcac aaactgcc 28 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> epr_frgament 2_reverse primer <400> 20 gataagctgt caaaccaggt ctcccataca tgaacgac 38 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nprB_frgament 1_forward primer <400> 21 ctacggggtc tgacgcagag taatcttgta ggaggctg 38 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nprB_frgament 1_reverse primer <400> 22 tgtgactgtc atattcaccg tcgtgtgg 28 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nprB_frgament 2_forward primer <400> 23 tgaatatgac agtcacacag tattccgcc 29 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nprB_frgament 2_reverse primer <400> 24 gataagctgt caaaccagat taggatacgg tctggctg 38 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vpr_frgament 1_forward primer <400> 25 ctacggggtc tgacgcagat gtacgctgag ccgaatag 38 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vpr_frgament 1_reverse primer <400> 26 ggaatcacat ttgcggagat acggcgtc 28 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vpr_frgament 2_forward primer <400> 27 ccgcaaatgt gattccggca catcaaac 28 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vpr_frgament 2_reverse primer <400> 28 gataagctgt caaaccagac cgttttccga atctgacc 38 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpr_frgament 1_forward primer <400> 29 ctacggggtc tgacgcagcg ttatcccgaa tgcccgtg 38 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpr_frgament 1_reverse primer <400> 30 ggctttgttc ctttagtgtc aaccaccc 28 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpr_frgament 2_forward primer <400> 31 ctaaaggaac aaagccgatt cgctccgc 28 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpr_frgament 2_reverse primer <400> 32 gataagctgt caaaccagaa attgactgct ccacgctg 38 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> srfAC_frgament 1_forward primer <400> 33 ctacggggtc tgacgcagga tatgtattac ctatcgcc 38 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> srfAC_frgament 1_reverse primer <400> 34 gccccttcat ccagttcact gcttccttg 29 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> srfAC_frgament 2_forward primer <400> 35 ggaagcagtg aactggatga aggggcttcg ctg 33 <210> 36 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> srfAC_frgament 2_reverse primer <400> 36 gataagctgt caaaccagaa cgcttcgaca tcactttc 38 <210> 37 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spoIIA_frgament 1_forward primer <400> 37 ctacggggtc tgacgcagag cggacgatgg gagactgg 38 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spoIIA_frgament 1_reverse primer <400> 38 gccacctcat gcagccgatc tggaagag 28 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spoIIA_frgament 2_forward primer <400> 39 ggctgcatga ggtggctgag cggctcgg 28 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spoIIA_frgament 2_reverse primer <400> 40 gataagctgt caaaccagct cattgttttg gtgagctg 38 <210> 41 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA_frgament 1_forward primer <400> 41 ctacggggtc tgacgcagtg ctgcttggca ttcatttc 38 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA_frgament 1_reverse primer <400> 42 gccattgaag caatgcctcc gtttgaatc 29 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA_frgament 2_forward primer <400> 43 acggaggcat tgcttcaatg gctgcccctc atg 33 <210> 44 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA_frgament 2_reverse primer <400> 44 gataagctgt caaaccagtc aatgctctcg tcatattc 38 <210> 45 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> epsE_frgament 1_forward primer <400> 45 ctacggggtc tgacgcagca agcaaatggg ctgggagg 38 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> epsE_frgament 1_reverse primer <400> 46 gacaagccat gctttctgcc aaagtgcg 28 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> epsE_frgament 2_forward primer <400> 47 gaaagcatgg cttgtcaagc atgaatag 28 <210> 48 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> epsE_frgament 2_reverse primer <400> 48 gataagctgt caaaccagtg ttgtatacat tcagcagc 38 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xpf_frgament 1_forward primer <400> 49 gatcctctac ggttcatcca tgtccgaac 29 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xpf_frgament 1_reverse primer <400> 50 tctatgatcc tcctcatttt tg 22 <210> 51 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xpf_frgament 2_forward primer <400> 51 gaggaggatc atagaaagct tgtcatacgt ttgcc 35 <210> 52 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xpf_frgament 2_reverse primer <400> 52 gagttttcgt tcggatcctc cgctttttgt ttg 33 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AprE_PCR primer_forward <400> 53 caaggcttga aataacgttg 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AprE_PCR primer_reverse <400> 54 ttcgctgatt acaacattgg 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NprE_PCR primer_forward <400> 55 ggaacagatg atagctcatc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NprE_PCR primer_reverse <400> 56 acactccgag aaggctgaag 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vpr_PCR primer_forward <400> 57 ctgcggcctg cacagccgcc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vpr_PCR primer_reverse <400> 58 cgctgaatga cggtggtaag 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NprB_PCR primer_forward <400> 59 agtaatcttg taggaggctg 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NprB_PCR primer_reverse <400> 60 cgccaatgaa gtgaaggagg 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpr_PCR primer_forward <400> 61 ggttgaggcg attgcgacgg 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mpr_PCR primer_reverse <400> 62 ccattctgca aaatcagctc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spoIIAC_PCR primer_forward <400> 63 aagatatgaa gaaagccggg 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spoIIAC_PCR primer_reverse <400> 64 acagccgctt cataagcctg 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ThrC_PCR primer_forward <400> 65 tcaagctgtc atgtacggag 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ThrC_PCR primer_reverse <400> 66 tccgatacga atggctgtcg 20 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD_forward primer <400> 67 ggaggaatta caatggctta caa 23 <210> 68 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D74_reverse primer <400> 68 tgcatgtccg ccgccatcgt tgcggac 27 <210> 69 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D74_forward primer <400> 69 cagtccgcaa cgatggcggc ggacatg 27 <210> 70 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D137_reverse primer <400> 70 ttcaagtttg ccgtcgttta caacgagc 28 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D137_forward primer <400> 71 ctcgttgtaa acgacggcaa acttg 25 <210> 72 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD_reverse primer <400> 72 caaaacagaa gcttcattat tttgct 26

Claims

수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 유효성분으로 포함하는
건성안의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 눈물 분비량의 증가, 눈물막 파괴 시간의 증가, 안구 표면 손상의 최소화, 결막내 배상세포의 보호, 각막 또는 결막내 면역세포 또는 염증성 사이토카인 수의 감소, 각막, 결막 또는 눈물샘에서의 산화 스트레스의 감소, 및 각막 상피 세포사멸의 감소 중 하나 이상을 나타내는
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SOD는 단리 또는 정제된 효소인
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SOD는 균주 용해물(lysate), 균주 배양물, 균주 배양 농축액, 균주 배양 추출물 또는 그의 건조 형태로 포함되는
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SOD는 Mn-SOD인
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SOD는 탈아미드화된 Mn-SOD인
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SOD는 바실러스 종 균주로부터 유래된 것인
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SOD는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GF423 균주(KCTC 13222 BP)로부터 유래된 것인
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SOD는 서열번호 2를 기준으로 73번 및 136번 아미노산 잔기가 Asp로 치환된 것인
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SOD는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는,
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 건성안은 쇼그렌증후군 또는 비-쇼그렌증후군 건성안인
약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 경구 투여되는
약학 조성물.
제12항에 있어서,
상기 조성물은 SOD가 코팅제로 코팅된 것인
약학 조성물.
제13항에 있어서,
상기 코팅제는 쉘락(shellac)을 포함하는
약학 조성물.
수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 유효성분으로 포함하는
건성안의 치료 또는 예방을 위한 수의학적 조성물.
수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 유효성분으로 포함하는
건성안의 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물.
수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 유효성분으로 포함하는
건성안의 개선 또는 예방을 위한 사료 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물 또는 수퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)를 대상에 투여하는 단계를 포함하는
건성안을 치료 또는 예방하기 위한 방법.