JPH07504398A - 真皮に対する表皮ケラチン細胞の接着を改善する生成物および方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 真皮に対する表皮ケラチン細胞の接着を改善する生成物および方法 発明の背景 １、発明の分野 本発明は真皮に表皮ケラチン細胞を接着させる際に有用な基底膜タンパク質に関 するものである。特に本発明はこのタンパク質を使用して皮膚移植の成功を向上 させる方法に関するものである。

Ｚ発明の全体的背景 生命を脅かす火傷をした患者を治療するために培養した表皮移植片（表皮ケラチ ン細胞移植片）を使用することはオコナー（０’　Ｃｏｎｎｅｒ）等（＋９８１ ）　ｒザ・ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）Ｊ　１　：　７５〜４８によって最初に 報告されている。火傷患者から生検した小さい皮膚試料をインビトロ培養し、培 養した自家移植片を火傷患者の腕における全厚の傷（ｆｕｌｌ　ｔｈｉｃｋｎｅ ｓｓ　ｗｏｕｎｄｓ）の上に置く。

培養した表皮ケラチン細胞はうまく成長して６週間で皮膚を覆う。次に、この方 法を改良して血清を含有していない培地で表皮ケラチン細胞を成長させることに より、この方法を改善する方法か試みられた。他の文献には死体の複合皮膚同種 移植片を使用して自己由来の培養表皮ケラチン細胞で表面を再生する方法か示唆 されている。また、培養した細胞に対して異なる裏材を使用すること、または表 皮ケラチン細胞の培養方法を変えることも試みられている。しかし、培養表皮ケ ラチン細胞を移植しても期待はずれに終わることが多かった。表皮ケラチン細胞 移植片の最も有用な適用例の一つは、損傷が人体の半分以上に及んでいる火傷患 者においてである。このような患者は、外科的切除後に火傷区域の表面を再生す るのに十分な薄くはがした皮膚厚さの移植片を提供するには不十分な提供部位を 有する。

不幸なことには、このような環境において表皮ケラチン細胞を自己移植した結果 は変動か大きくかつ期待はずれであった。培養した表皮移植片は正常な皮膚より 有意に脆（、かつ水ぶくれを生じ易いことが分かった。ウッドルイ（Ｗｏｏｄｌ ｅｙ）等（１９８Ｂ）ｒＪＡＭＡＪ　２５９　：　２５６６〜２５７１参照。数 人の研究者は、１種または２種以上の結合組織成分における異常性によって、臨 床的に観察された表皮−真皮間の接着性の変化を説明できるかもしれないと示唆 している。しかし、この成分の正体は不明瞭なままである。

本発明の目的は、表皮と真皮とを接着させる治療に有用な形態の結合組織成分を 明らかにしかつ提供することにある。

本発明の他の目的は１、二のような治療に有用な物質を使用して、移植した培養 表皮ケラチン細胞の下側基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、例えば哺乳動物またはヒ トの真皮に対にする接着を向上させることにある。

本発明のこれらおよび他の目的は以下の詳細な説明によって一層明瞭に理解され る。

発明の概説 上述の目的は、ヒトの表皮下の皮膚、気管、食道、角膜および羊膜の基底膜のア ンカリング（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）・フィラメント中に存在し、精製された新規 なタンパク質を明らかにし、かっこのタンパク質を生産することによって達成さ れる。その発見者等によってカリニンと名付けられたこの新規なタンパク質はヒ トの表皮と真皮との間を接着することか見い出された。カリニンは４００〜４４ ０ｋＤａの分子量を有し、そのジスルフィド結合を還元した後に、ウェスターン プロット法で１６５ｋＤａ。

１５５ｋＤａ、１４０ｋＤａおよび１０５ｋＤａのフラグメントに分けられる。

モノクローナル抗体ＢＭ１６５の抗原決定基は、前記プロットを８Ｍ１６５によ って調べると、１６５ｋＤａフラグメントにおいて確認される。このタンパク質 の回転シャドウ画像化によって、第１端に２個の小球体を有し、かつ反対端に１ 個の小球体を有する長さ１７０ｎｍの非対称棒状物質であることが明らかにされ ている。カリニンは、表皮が下側の真皮から剥離する接合部表皮水胞症にかかつ ているヒトの真皮−表皮接合部に存在していないことが分かった。

また、本発明は移植した表皮ケラチン細胞の下側基質に対する接着を、前記表皮 ケラチン細胞と前記基質との間に、表皮ケラチン細胞によって自然に生成される 量より多量のカリニンを提供することにより、改善する方法を包含する。この増 加したカリニン量は、移植部位上に集密的表皮ケラチン細胞培養物を載置する前 に、前記基質または表皮ケラチン細胞の基底表面に外因性の精製カリニンを適用 することによって、供給することができる。あるいはまた、培養した表皮ケラチ ン細胞は、サイトカインのような成長促進剤を使用することによって、前記表皮 ケラチン細胞のカリニン生産の基本的レベルを起生理学的レベルまで上昇させる ことかできる。あるいはまた、培養した表皮ケラチン細胞が活発にカリニンを生 産しているかどうかを知るために前記表皮ケラチン細胞をモニターし、この表皮 ケラチン細胞を、活発なカリニン生産が有意に減衰する前に、基質に移植する。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、ヒト包皮における８Ｍ１６５抗原の間接免疫蛍光法による局在状態（ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｉｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示す顕微 鏡写真である。

図ＩＢは、凍結部分が未融合（ｕｎｆｕｓｅｄ）　骨髄腫からの媒質で染色され ている、図ＩＡと同様な顕微鏡写真である。

図２Ａは、ヒト皮膚における真皮−表皮接合部領域の超微細構造を、長さＩｏｏ ｎｍを示すバーと共に示す顕微鏡写真である。

図２Ｂは、真皮−表皮基底膜のアンカリング・フィラメントに対するＢＭ１６５ モノクローナル抗体の局在状態を示す、図２Ａと同様な顕微鏡写真である。

図２Ｃは、無傷の皮膚の連続する広がりに沿った８Ｍ１６５標識を、長さ２００ ｎｍを示すバーと共にを示す、低倍率における図２Ｂと同様な顕微鏡写真である 。

図２Ｄは、抗体が表皮剥離を生じさせた領域における基底膜に沿った８Ｍ１６５ 標識を示す、図２０と同様な顕微鏡写真である。

図３Ａは、ＢＭＩ６５で染色した集密的表皮ケラチン細胞培養物を、長さ２０ｎ ｍを示す小形バーと共に示す顕微鏡写真である。

図３Ｂは、集密的表皮ケラチン細胞培養物が対照媒質で染色されている、図３Ａ と同様な顕微鏡写真である。

図３０は、細胞層を培養基質に平行にして透過電子顕微鏡で撮影した状態を、長 さ２０ｎｍを示す黒いバーと共に示す、図３Ａと同様な顕微鏡写真である。

図３Ｄは、８Ｍ１６５による染色前に細胞がＥＤＴＡによって除去されている状 態を示す、図３Ａ〜３Ｃと同様な顕微鏡写真である。

図４Ａは、集密に近い状態まで成長させ、次いでＰＢＳで洗浄し、ＢＭ１６５モ ノクローナル抗体に次いで５ｎｍ粒子と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　した二次 抗体と共に培養した表皮ケラチン細胞培養物中の連続する亜細胞マトリックスを 示す顕微鏡写真である。

Ｑ４Ｂは、表皮ケラチン細胞が集密に近い状態まで成長し、ＢＭ１６５染色を行 うことなく直ちに固定されている、図４Ａと同様な顕微鏡写真である。

図４０は、図４Ａにおけると同様にして調製した細胞の走査顕微鏡写真である。

図４Ｄは、図４Ｂにおけると同様にして調製した集密的培養物の走査顕微鏡写真 である。

図５Ａは、７５〜８０％の集密状態まで成長させ、次いで洗浄し、ＰＢＳで処理 した表皮ケラチン細胞を処理の１０分後に撮影した状態を、２０μｍを示すバー と共に示す顕微鏡写真である。

図５Ｂは、細胞をＰＢＳ処理の６０分後に撮影した状態を示す、図５八と同様な 顕微鏡写真である。

図５Ｃは、細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μｇ／ｍＡ’のＢＭＩ６５で処理し、１ ０分後に撮影した状態を示す、図５Ａと同様な顕微鏡写真である。

図５Ｄは、ＢＭＩ　６５ｍＡｂに曝してから６０分後に撮影した状態を示す、図 ５Ｃと同様な顕微鏡写真である。

図５Ｅは、細胞をＰＢＳで洗浄し、ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡで処理し、処理の１０分 後に撮影した状態を示す、図５Ａと同様な顕微鏡写真である。

図５Ｆは、ＥＤＴＡ処理の６０分後に撮影した状態を示す、図５Ｅと同様な顕微 鏡写真である。

図６Ａは、培養した表皮ケラチン細胞を６時間後にＢＭ１６５抗体に曝した状態 を、長さ５０　Ｈ，ｍを示すバーと共に示す顕微鏡写真である。

図６Ｂは、２４時間培養後に、培養した表皮ケラチン細胞をＢＭ１６５抗体に曝 した状態を示す、図６Ａと同様な顕微鏡写真である。

図６０は、４８時間培養後に、培養した表皮ケラチン細胞を８Ｍ１６５に曝した 状態を示す、図６Ａと同様な顕微鏡写真である。

図６Ｄは、移動する表皮ケラチン細胞の通路に沿った基質標識を示す、図６Ｂと 同様な顕微鏡写真である。

図６Ｅは、図６Ｄと同様な顕微鏡写真である。

図７は、表皮ケラチン細胞培地から単離した８Ｍ１６５抗原の電気泳動分析結果 を示すウェスターンプロットである。

図８Ａは、アフィニティー精製に続＜８Ｍ１６５抗原の回転シャドウ分析の結果 を、長さ１１００ｎを示すバーと共に示す写真である。

図８Ｂは、図８への回転シャドウ分析の結果を示す一層高倍率の写真である。

図８Ｃは、図８Ａの回転シャドウ分析の結果を示す他の高倍率の写真である。

図９は、ヒト皮膚の真皮−表皮接合部における基底膜領域の超構造を示す路線図 である。

図ＩＯは、図示した培養時間の間に、放射能で標識した表皮ケラチン細胞から抗 体ＢＭ１６５と共に免疫沈降したカリニン量を示すグラフである。

好適例の詳説 真皮−表皮接合部における基底膜の超構造は図９に示す通りであり、図９は基底 の表皮ケラチン細胞１０の下部を示し、表皮ケラチン細胞ｌＯは形質膜１２を有 し、形質膜１２は基底膜の低電子密度層（ｌａｍｉｎａ　１ｕｃｉｄａ）　１４ 上に位置し、その下側に隣接して基底膜の高電子密度層１６および真皮１８があ る。ヘミデスモソーム２０を形質膜Ｉ２の上に表皮ケラチン細胞１０の基底部分 （ｂａｓａｌ　ｐｏｒｔｉｏｎ）に示す。張原フィラメント２２はへミデスモソ ーム２０中に入り込み、細胞質中に延在する。ヘミデスモソーム２０の接着班板 の下の形質膜からはアンカリング・フィラメント２４が出ている。フィラメント ２４は低電子密度層１４を横切って基底形質膜１２と高電子密度層１６とを連結 し、ヘミデスモソーム２０の領域で最も多数存在する。これに対し、アンカリン グ・フィブリル２６は短い湾曲構造を有し、その中央部には間隔の不規則な横断 する帯状のものを有し、両端部分では散開している。フィブリル２６の末端部分 は高電子密度層１６中に入り込んでいるが、近位部分は毛管状真皮中で終端して いるかあるいはループを形成して高電子密度層１６と合体している。本発明はア ンカリング・フィラメント２４と組み合わされたタンパク質に関するもので、こ のタンパク質は真皮を表皮に接着させる際に重要な作用を行う。

アンカリング・フィブリルの網状組織の超構造は、この網状組織が基底膜を下側 の真皮に固定していることを示唆している（Ｓｕｓｉ等、　１９６７；　ｒＪ、 　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　Ｊ　２４＋６８６−６９０．　にａｗａｎａｍｉ。

等、　１９７８；　ｒＡｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、Ｊ　９２：３８９−４１０ ．この仮定は、退行性（ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ）の栄養障害性表皮水痘症にかかっ ている個々のヒトがアンカリング・フィブリに欠けており（Ｂｒｉｇｇａｍａｎ 等。

１９７５ｂ；　ｒＪ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、」６５：２０３− ２１１．　Ｌｅｉｇｈ等、　１９８８；ｒＪ、［ｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏ ｌ、Ｊ　９０：６１２−６３９．　Ｂｒｕｃｋｎｅｒ−Ｔｕｄｅｒｍａｎ等。

１９８９；　ｒＪ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、Ｊ　９３：３−９） 、表皮基底膜がその下側に隣接する支質から自然に分離しているという観察結果 によって支持される。

真皮−表皮接合部における分子の不均質は、この区域に局在するいくつかの種類 の糖タンパク質の存在に反映している。例えば、ヘミデスモソームは１６５．０ ００〜２４０．０００のＭｒ値を有するいくつかの種類のタンパク質を含有して いる（Ｍｕｔａｓｉｍ等。

１９８９；　ｒＪ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、」９２：２２５−２ ３０．　Ｗｅｓｔｇａｔｅ等。

１９８５；　ｒＪ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、」８１：１４９−１ ５３．　Ｒｅｇｎｉｅｒ　等。

１９８５；　ｒＪ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、」８５：１８７−１ ９０．　Ｊｏｎｅｓ等、　１９８６；ｒｃｅｌｌ　Ｍｏｔｉｆ、　Ｃｙｔｏｓｋ ｅｌ、　Ｊ　６：５６０−５６９．５ｔａｎｌｅｙ等、１９８４；ｒＪ、　Ｉｎ ｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｒｎａｔｏｌ、Ｊ　８２−１０８−１１１．　Ｌａｂｉｂ等 、１９８６；ｒＪ、夏ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｊ　１３６：１２３１−１２３５． 　Ｍｕｅｌｌｅｒ等、１９８９；ｒＪ、Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、Ｊ 　９２：３３−３８）　６　また、インテグリン（ｉ（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）　ａ 　６β４は、最近になって５ｔｅｐ等、　１９９０；　ｒＰｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、（ＵＳＡ）」８７：８９７０−８９７４によって、ヘミデス モソームの外部領域に局在するとされている。アンカリング・フィブリル自体は 、５ａｋａｉ等、　１９８６ａ；　ｒＪ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　Ｊ　１０３ ：１５７７−１５８６およびｔ、ｕｎｓｔｒｕｎ等、　１９８７；　ｒＪ、Ｂｉ ｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　Ｊ　２６２：　１３７０６−１３７１２によって説明 されている■型コラーゲンの横方向にずれていない（ｌａｔｅｒａｌ　ｕｎｓｔ ａｇｇｅｒｅｄ）集合体を含有する。

このような既知のタンパク質のほかに、真皮−表皮接合部に特異な抗原を認識す るいくつかの種類の抗体が見い出された。

その−例はハッカネズミのモノクローナル抗体１９−ＤＥＪ−■であって、これ は表皮水痘症患者からの皮膚の基底膜には存在しない未知の抗原を認識する（Ｆ ｉｎ、　１９８８；　ｒＡｒｃｈ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、Ｊ１２４ニア１３−７ １７）。ｌ　９−ＤＥＪ−１によって検知される抗原は知られておらず、部分的 に特性が示されているにすぎない。

ヘミデスモソームのタンパク質と、基底膜構成成分と、アンカリング・フィブリ ル中の■型コラーゲンとの間の構造上の関係は、従来明瞭に説明されていなかっ た。若干の研究者等は超構造解析に基いてアンカリング・フィブリルとへミデス モソームとの間の関連を示唆しており、この超構造解析においてへミデスモソー ムはアンカリング・フィブリルの全体にわたって裸にされた基底膜に沿った部位 のみにおいて再生されることが分かった（Ｇｉｐｓｏｎ、　１９８３；　ｒＪ、 ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、」９７：８４９−８５７．５ｕｓｉ等。

１９６７；　ｒＪ、ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、」３４：６８６−６９０．　Ｅｌｌｉ ｓｏｎ等、　１９８４；　ｒＪ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、」７２：１６３−１７２）　。また、ヘミデスモソームお よびアンカリング・フィブリルは、胎児の発育中および傷の治癒中に同等に出現 することが観察されている（Ｇｉｐｓｏｎ等、　１９８８；ｒＤｅｖ、　Ｂｉｏ ｌ、Ｊ　１２６：２５３−２６２．　Ｓｍ７ｔｈ等、　１９８８；　ｒＪ、Ｉｎ ｖｅｓｔ。

Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　Ｊ　９０：４８０−４８５）　ｏアンカリング・フィブリ ルの構造の公表されているモデルからは、■型コラーゲンとへミデスモソームと の直接触接はありそうもないことが予知される。その理由は、■型コラーゲンの ＮＣ−１領域は直径が５０ｎｍであるにすぎず、５０ｎｍより幅の広い基底膜全 体に広がるのに十分な大きさでないからである。従って、他のタンパク質が■型 コラーゲンをヘミデスモソームのタンパク質に結合させているように思われる（ Ｌｕｎｓｔｒｕｍ等、　１９８７；　ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ　２６ ２：１３７０６−１３７１２．　Ｋｅｅｎｅ等、１９８７；　ｒＪ、　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、Ｊ　１０４：６１１−６２１゜Ｂａｃｈｉｎｇｅｒ　等、　１９９ ０；　ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｏ＋、Ｊ　２６５二１００９５−１０１０１ ）。

本発明者等はアンカリング・フィラメントと組み合わされたタンパク質を説明し た。このタンパク質はさらに超構造の配置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）および組織分布 を特徴としている。このタンパク質は精製されており、その繊維状立体構造はシ ャドウ画像化法によってめられる。最後に、この新たに精製されたタンパク質は 、表皮ケラチン細胞のプラスチックまたはガラスの基板に対するインビトロ付着 、または基底膜に対するインビボ付着に免疫原の供給源 モノクローナル抗体ＢＭ１６５を使用してカリニンを局在させる。ＢＭ１６５免 疫源はヒト羊膜の抽出物から得られ、次のようにして製造される。ヒト羊膜から の■型コラーゲンのＮＣ−１小球状領域のコラゲナーゼによる抽出・精製は既に 文献に記載されている（Ｂａｃｈｉ　ｎｇｅｒ等、　１９９０；　ｒＪ、Ｂｉｏ ｌ、　ＣｈｅＩｇ、　Ｊ　２６５：１００９５−１０１０１）。この精製の一工 程中に、抽出物をＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ　５２．　ワットマン社）と共に 低濃度の塩緩衝液（２Ｍ尿素、２５ｍＭＮａｃｉ、５ｍＭＥＤＴＡおよび５０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８）中で培養する。この未結合部分を、ＮＣ−１領 域をさらに精製するのに使用する。同容量の０゜２ＭＮａＣ／を含有する緩衝液 でＤＥＡＥを洗浄し、溶出物質を遠心分離（１７，０００ｘ　ｇ　、　６０分） 後に分離する。この試料を、硫酸アンモニラ沈殿法（５０％飽和）によって１０ 倍に濃縮し、ＰＢＳ中で透析によって平衡させる。生成する複雑なタンパク質混 合物はハイブリドーマを調製する際に免疫原として使用される。

表皮ケラチン細胞の培養 ヒト包皮の表皮ケラチン細胞を公知の方法（Ｂｏｙｃｅ等、　１９８５；ｒＪ、 　Ｔｉ５ｓ、　Ｃｕ１ｔ、　Ｍｅｔｈ、Ｊ　９：８３−９３）によって調製した 。この文献を参考としてここに加入する。これらの細胞を、Ｏ，１５ｍＭＣａ　 Ｃ！！２を含有する表皮ケラチン細胞成長培地中で成長させ、製造者の指示（ク ロネティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ））に従って継代培養した。大部分の免疫細 胞化学実験のために、第１または第２の継代細胞をガラスまたはプラスチックの チャンバースライド（ｃｈａｍｂｅｒ　５ｌｉｄｅＸラブ・チク（Ｌａｂ−Ｔｅ ｋＪ社製）中、またはガラスカバースリップ上で約８０％の集密度まで成長させ た。大規模に集めるために使用済みの培地細胞を１５０　ｃｍ”の組織培養皿内 で成長させ、これに１週間に３回１５ｍ１の新鮮な培地を供給した。

８Ｍ１６５抗原のアフィニティー精製 成長しつつある表皮ケラチン細胞から集めた培地を遠心分離（２，０００Ｘｇ、 Ｉ　０分）によって清澄にし、内因性プロテアーゼ活性を、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ およびＮ−エチルマレイミドをそれぞれ５ｍＭ、５０μＭおよび５０μＭの最終 濃度まで添加することにより、最小にした。この培地を濾過によって滅菌し、直 ちに処理するかあるいは使用時まで一２０℃で冷凍貯蔵した、ＢＭＩ　６５ｍＡ ｂをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（商品名）（ファルマチ力・エル・ケー・ ビー社製）に、製造者が記載しているように、樹脂１ｍｆ当り抗体１５ｍｊ７の 割合で結合させた。表皮ケラチン細胞培地（１〜２リツトル）を１５ｍＡの抗体 カラムに通し、このカラムをＰＢＳで洗浄した。抗原を１Ｍ酢酸によって溶離さ せ、得られた分画を２８０ｎｍにおける吸光度でモニターした。−緒にした分画 をジイソプロピルフルオロフォスフェート（５μｇ／ｍｌ）で処理し、適当な緩 衝液中で透析してさらに分析を行った。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行うために、試料を還元前には３〜 ５９６グラジエンドゲルで、また還元後には５％ゲルでメルカプトエタノールに よって分離した。

高分子量の予め染色した標準物質（バイオラッド社製）のほかに、ジスルフィド 結合を有するＶｌｌ型コラーゲンのＮＣ−１領域（Ｍ　ｒ　４５０．０００）、 還元したＮ　Ｃ−１（Ｍ　ｒ　１５０．０００）および還元したフィブリリン（ ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）　（Ｍｒ　３５０，０００；サカイ等、１９８６ｂ）をＭ ｒスケールの測定に使用した。

組織の調製 既にキープ（Ｋｅｅｎｅ）等（１９８７；　ｒＪ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、Ｊ 　１０４．６１１−６２１）が発表している方法に若干の修正を加えた方法によ って、抗原のひとまとめにした免疫局在化（ｉＩＩｌｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａ ｔｉｏｎ）を行った。ヒト新生児包皮を環状切除の直後に集め、上皮を含むすべ てを０．５Ｘ１ｍｍの切片に切断し、４℃においてｐＨ７゜４のリン酸緩衝溶液 （ＰＢＳ）中で２時間洗浄し、ＰＢＳを数回変えて洗浄し、次いでｌｎｍ金粒子 結合二次抗体（米国ニューシャーシー州　ビスキャラタウエイ所在のＪａｎｓｓ ｅｎ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ社の製品）を１＝３の比で１．　０％ＢＳＡ を含有するＰＢＳ中に希釈した。溶液中で４℃において一夜培養した。洗浄後に 、氷冷した銀増強溶液（米国ニューシャーシー州ビスキャッタウエイ所在のＪａ ｎｓｓｅｎ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ社の製品）中に１５分間沈め、次いで 室温まで迅速に加温した。銀をｌｎｍ金粒子上に室温において７分間沈殿させた 後に、組織を水に次いでｐＨ７，４の０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｃａｃｏｄｙ ｌａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）で１５分間にわたって数回洗浄した。最後に、組織を ｐＨ７，４の０゜１Ｍカコジル酸緩衝１．５９６／１．５９６グルタルアルデヒ ド／バラホルムアルデヒド液中で固定し、一連の段階的エタノール希釈液中で脱 水し、プロピレンオキシドに曝し、スバルス・エポキシ（Ｓｐｕｒｒｓ　ｅｐｏ ｘｙ）中に埋め込んだ。対照抗体としては認識（ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ）　エ ラスチン（リン・サカイ（Ｌｙｎｎ　５ａｋａｉ）博士によって製造および提供 された）、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｓａｋａｉ等、１９８２　：　ｒ　Ａｍ、　Ｊ 、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｊ１０８：３１０−３１８）およびＶＩ型コラーゲン（ Ｋｅｅｎｅ等、１９８８　；　Ｊ、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、Ｊ　１０７：１９５ ５−２００６）を使用した。１個の皮膚試料を水冷アセトン中で３０分間固定し 、緩衝液中で洗浄し、さらに３％／３％アルデヒドおよび１％Ｏｓ　Ｏａの溶液 中で固定し、次いでスパルス・エポキシ中に埋め込む前にアセトン中で脱水して アンカリング・フィラメントの存在を明らかにした（図２Ａ）。

電子顕微鏡検査 抗体処理に先立って正常細胞の超構造を検査するために、ヒトの表皮ケラチン細 胞培養物をガラス・カバースリップ上で成長させ、０．１Ｍカコジル酸緩衝１． ５％／１．５％グルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド、１％０８Ｏ４溶液 中て固定し、一連の段階的エタノール希釈液中で固定し、次いで透過電子顕微鏡 （ＴＥＭ）用にスバルス・エポキシ中に埋め込むか、あるいは既述（Ｋｅｅｎｅ 等、　１９８８；Ｊ、　Ｃｅｌ１．Ｂｉｏｌ、Ｊ　１０７：１９５５−２００６ ）のように、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）用に臨界点乾燥し、スパッタコーティン グした。８個のくぼみ付培養スラスコで成長させた表皮ケラチン細胞についてＴ ＥＭ免疫電子顕微鏡検査を行った。この際、−次抗体における培養時間を室温に おいて４時間とし、二次抗体を５ｎｍ金粒子に結合させ、ＢＳＡ緩衝液（２０ｍ Ｍトリス−ＨＣＩ　、２０　ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｎ２　）中で１：３に希釈し、銀増 強処理を行わなかった点を除いて、組織用に先に説明したと同じプロトコールを 使用した。ガラス・カバースリップ上で成長させ、ＳＥＭによって観察し、次い で抗体に曝した表皮ケラチン細胞を、液体ＣＯ２で臨界点乾燥し、次いでエタノ ール中で脱水した点を除いて、同様に処理した。　通常のＴＥＭ検査のために、 厚さ６０〜９０ｎｍの切片をダイヤモンドナイフによって、ライヘルド（Ｒｅｉ ｃｈｅｒｔ）・超ミクロトームを使用して切り取り、フィリップス（Ｐｈｉｌｉ ９ｓ）　４１０　Ｌ　Ｓ　（商品名）を６０ｋＶで操作して使用し、酢酸ウラニ ルおよびレイノルズ（Ｒｅｙｎｏｉｄｓ）クエン酸船中でコントラストをつけて 検査した（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、１９６３；ｒ　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、Ｊ　 １７：２０８−２１５）。通常のＳＥＭ検査用に、試料を最少量の金−パラジウ ムでスパッターコーティングし、１ＯｋＶで操作したＳＥＭ　（ＤＳ　１３０型 ：米国カリフォルニア州　ミルビタス所在のインターナショナルサイエンティフ ィック　インスツルメンツ　社製）の上側ステージにおいて、３〜ｌ　Ｏｍｎの スポットサイズを使用して観察した。

他の技術 ウェスターン　ブロッティング法、回転シャドウ解析および長さの測定を包含す る方法は文献（Ｍｏｒｒｉｓ等、１９８６；　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、Ｊ　２６１：５６３８−５６４４．　Ｌｕｎｓｔｒｕｍ等、１９８６ ；　ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ２６１：　９０４２−９０４８．　Ｂａ ｃｈｉｎｇｅｒ等、　１９９０；　ｒ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ　２６ ：　１００９５−１０１０１）に詳述されている。

分子の回転シャドウィングは、既に５ｈｏｔｔｏｎ等、　１９７９．　ｒ　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｊ　１３１：　３０３−３２９．ならびにＴｙｌｅｒおよ びＢｒａｎｔｏｎ。

１９８０；　ｒｊ、　Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ、Ｒｅｓ、Ｊ　７１：９５−１０ ２に記載されている標準技術を修正することによって達成される。ｐ　Ｈ７，４ の０．１５Ｍ炭酸塩緩衝液中の試料をグリセリンで最終濃度７０％まで希釈した 。次いで、１００μｍの溶液をエアブラシによって新たに襞間した６ｍｍマイ力 円板上に鋭角に吹きつけた。小液滴の寸法は直径５０〜２００μｍであった。試 料を蒸発器内でｌ〇−ｍｍＨｇ　（１０−”トル）で乾燥した。白金線を炭素電 極に巻き付け、試料を前記ステージ上に載置し、１１００ｒｐで回転させた。高 電圧において、白金はマイカ表面から６°の角度で蒸発を完了した。次いで前記 ステージを炭素源に対して９０°傾斜させ、室内を排気し、５０人の炭素をマイ カ表面上に蒸着させた。直ちに炭素レプリカを２回蒸留した蒸留水のなかでマイ カから浮かせて除去し、４００メツシユ格子上に取り付けた。

透過電子顕微鏡において、対物レンズの有効口径を３０μｍとし、８０ｋＶにお いて試料を検査した。

ハイブリドーマの調製 既に５ａｋａｉ等、　１９８６；　ｒＪ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　Ｊ　１０３ 　：　１５７７−１５８６に記載されているようにしてハイブリドーマを調製し 、間接免疫蛍光法によって選別した。ＢＭＩ　６５ｍＡｂ、Ｉ　ｇＣｚを文献（ Ｋｅｅｎｅ等、　１９９０；　ＣｏｌｌＣｏ１１ａ　ＸＬ　ａｎｄ　ＸＸ　１ｏ ｃａｌｉｚｅ　ｔ。

ｔｈｅ　５ｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ｂａｎｄｅｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｆｉｂｅｒ ｓ、　ｒＪ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　Ｊ（印刷中）に記載されているようにし て細胞培養物の上澄液から精製した。数種類のｍＡｂがザ・う・ジョン・カンサ ー・リサーチ”７ｙウンデ−ジョン（ｔｈｅ　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）のエバ　イングバル（Ｅｖａ　Ｅｎ ｇｖａｌｌ）博士によって提供され、これらのｍＡｂとしてはｍ　Ａ　ｂ　１１ 　Ｄ　５　（Ｅｎｇｖａｌｌ等。

１９９０；　ｒｃｅｌｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｊ　１ニア３ｌ−７４０）、 ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）Ａ鎖に特異的な４　Ｃ７（Ｅｎｇｖａｌｌ等、　１ ９８６；　ｒＪ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｏｉｌ、　Ｊ１０３：２４５７−２４６５）、 およびラミニンＢ鎖に特異的な４　Ｅ　ｌ　Ｏ（Ｗｅｗｅｒ等、　１９８３；　 ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、」２５８：１２６５４−１２６６０）がある。

マウスのラミニンに対するウサギのポリクロナール抗血清は、米国ミズーリ州セ ントルイス所在のシグマ・ケミカル・カンパニーから入手した。

■型コラーゲンのＮＣ−１領域の単離に関してＢａｃｈｉｎｇｅｒ。

１９９０；　ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、」２６５：１００９５−１０１０ １　に記載されているように、モノクロナール抗体を、コラゲナーゼ消化によっ て、初めにヒト羊膜から抽出した部分精製タンパク質混合物にした。

生成したハイブリドーマを、ヒト胎児の包皮の脈管基底腰囲に対してではなく真 皮−表皮に対して局在させるために間接免疫蛍光法によって選別した。選定した ハイブリドーマを、既知の基底膜成分を含有する免疫原およびタンパク質抽出物 をウェスターン・プロッティング法によって再度選別した。既知の基底膜成分を 認識しなかったハイブリドーマはさらに検討するために保存した。これらの選別 の一方によって同じ独特なタンパク質を認識すると思われる２種のハイブリドー マが得られた。８Ｍ１６５と名付けられたこれらのタンパク質の一方を使用して ここに報告する検討を行った。８Ｍ１６５は皮膚の真皮−表皮接合部の基底腰囲 を特異的に識別するが、脈管構造の基底膜または周囲神経の基底膜に対しては反 応性を示さない（図１）。

８Ｍ１６５の反応性の組織分布を表１に示す。皮膚、気管、食道、角膜および羊 膜の表皮下領域のすべてが、はっきりとした輝いている連続する線形の蛍光を示 した。組織分布は、腸管の平滑筋の随時の弱い染色を除けば、ヘミデスモソーム およびアンカリング・フィラメントの存在と直接に平行している。８Ｍ１６５の 反応性はヒトの腎臓、血管、神経および軟骨から採取した組織には観察されなか った。

表　１ ｒｎＡｂ　８Ｍ１６５によって認識された抗原の組織分布を間接免疫蛍光法によ って測定した結果 組織　結果 皮膚の表皮下領域　十 気管の表皮下領域　十 食道の表皮下領域　士 角膜の表皮下領域　十 羊膜の表皮下領域　十 腸管の平滑筋　＋／− 腎臓　− 次いで、ＢＭ１６５抗体を使用してヒト包皮の真皮−表皮基底膜内の抗原を局在 化した。銀を増強することによって見えるようにしたｌｎｍ金粒子に結合した二 次抗体を使用して一次抗体を局在化した。Ｉｎｍ金粒子の使用は、Ｓｎｍ金粒子 に結合した二次抗体による基底膜への侵入が限定されるため必要であった。この 方法は、ヘミデスモソームの基底膜緻密板の丁度下て、＋６５抗原をアンカリン グ・フィラメントに対して局在化させる。アンカリング・フィラメントの標識は 、無関係な特異性を有する抗体（「材料および方法」を参照）を−次抗体（デー タは示されていない）として使用した場合には、認められなかった。ある追加の 標識か高電子密度層に沿って認められる（図２Ｃ）か、標識の大部分はへミデス モソームの下に位置する。また、少量の全堆積物が高電子密度層の真皮側の下に 認められる。

これらの実験の全体を通じて、広範囲で、完全であることの多いデ・エビシライ ゼイション（ｄｅ−ｅｐｉｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）が、−次抗体と共に培養し ている間に観察されるのが普通である。これは■型−および■型コラーゲンを使 用した場合の本発明者等の多くの経験とは全く異なることである。図２Ｂおよび 図２０に示す剥かれていない（ｕｎｓｐｌｉｔ）基底膜の領域は、組織端縁から 比較的離れた領域である。組織端縁の近くでは、抗体濃度か最高であり、表皮は 基底膜から分離しており、極めて強い標識が高電子密度層に沿って細胞界面であ った位置において均一に認められた（図２Ｄ）。若干の標識はなおヘミデスモソ ームの細胞外表面に付着しているのが認められたが、これは比較的まれなことで あった（図示せず）。

抗原の局在化 ＢＭ１６５抗体を使用して表皮ケラチン細胞培養物に対する抗原を見えるように した。図３Ａに示すように、集密的細胞層の頂面に適用した場合には、抗体は培 養細胞間のプラスチック基板の表面に局在する（細胞層を培養基質に平行にして 撮影した図３０と比較すること）。分子内蛍光は観察されない。この普通でない 局在化は、■型コラーゲンに対する抗体（Ｓａｋａｉ等。

１９８２；　ｒＡｍ、　Ｊ、　ＰａｔｈｏｌｏｇｙＪ　１０８：３１０−３１８ ）、ラミニンに対する抗体（「材料および方法」を参照）またはＶＩＩ型コラー ゲンに対する抗体（Ｓａｋａｉ等、　１９８６；　ｒＪ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、Ｊ　１０３：１５７７−１５８６）については、繰り返されなかった（図示 せず）。この局在状聾は、免疫学的に同じ並順型であるか無関係な特異性を有す る抗体を使用した場合には、認められなかった（図示せず）。

１０ｍＭ　ＥＴＤＡを使用して細胞を除去した後におけるプラスチック基板全体 の強い蛍光によって示されるように、抗原は細胞の下の基質上に存在する（図３ Ｄ）。

ＢＭ］６５抗原が表皮ケラチン細胞培養物中の連続する亜細胞マトリックスに沿 って免疫局在している（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚｅ）状態を図４に示す。表 皮ケラチン細胞は、集密に近い状態まで成長させて直ちに固定する（図４Ｂ、図 ４Ｄ）か、あるいはＰＢＳで洗浄し、ＢＭＩ　６５ｍＡｂ　（５０ｕｍ　ｇ／ｌ ）に次いてＳｎｍ金粒子と結合した二次抗体と共に培養し、その後に固定した（ 図４Ａ、図４Ｃ）。表皮ケラチン細胞培養物を電子顕微鏡によって見えるように すると、免疫金詰合物（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）か電子密 度の高い微細フェルト状構造の上の基質を均一に横断して直線状に堆積している のか認められる（図４Ａ）。

このフェルト状構造は細胞の下に続いているが、無標識のことか多かった。場合 によっては、他の研究者（Ｃｏｍｐｔｏｎ）等、１９８９；ｒＬａｂ、Ｉｎｖｅ ｓｔ、」６０二６００−６１２）によって観察された構造に類似している未成熟 へミデスモソームに似た表皮ケラチン細胞プラズマ膜に沿って厚くなった部分を 認めることができた（図４Ｂ）。

表皮ケラチン細胞培養物中の８Ｍ１６５の超構造的免疫局在化の研究は、濃厚な りＭ］６５抗体と共に長期間培養する間に、表皮ケラチン細胞の丸味つけ（ｒｏ ｕｎｄ　ｉｎｇ）および分離によって複雑になった。８Ｍ１６５培養細胞の変化 した形感を未処理表皮ケラチン細胞の形感と比較して示す走査顕微鏡写真を、そ れぞれ図４Ｃおよび図４Ｄに示す。図４０における処理された表皮ケラチン細胞 は８Ｍ１６５と共に培養した間に丸味がつき、分離した。分離した表皮ケラチン 細胞は容易にプラスチック基板上を再びおおい、未処理細胞と比較して等しい活 発さで成長した。これは、丸味のついた分離した細胞が抗体処理によって物質代 謝上傷付けられなかったことを示す。

これらの観察結果を追求するために、亜集密状態の表皮ケラチン細胞培養物を精 製ＢＭ１６５抗体と共に１０分間および６０分間培養し、各時点で培養物を撮影 した（図５Ａ〜図５Ｆ）。

ＰＢＳ中の精製抗体、ＰＢＳ単独、又は１０ｍＭＥＤＴＡを表皮ケラチン細胞と 共に平行に培養した。また平行培養物をＰＢＳ中の抗■型モノクローナルＩｇＧ と共に同じ時間的経過にわたって培養した。ＢＭ１６５抗体（図５Ｃおよび図５ Ｄ）およびＥＤＴＡ　（図５Ｅおよび図５Ｆ）により６０分間に表皮ケラチン細 胞に広範囲な丸み付けおよび分離か生じた。このような丸み付けおよび分離はＰ ＢＳ　（図５Ａおよび図５Ｂ）、抗■型コラーゲン又は抗ラミニン（図示せず） を用いた場合には認められなかった。真皮の繊維芽細胞を８Ｍ１６５ではなくＥ ＤＴＡにより丸み付けし、分離した（図示せず）。従って、ＢＭＩ６５抗原決定 基は表皮ケラチン細胞の付着には必要であるが、真皮繊維芽細胞の基質への付着 には必要でない。図３Ａの顕微鏡写真は、集密状態の表皮ケラチン細胞培養物か 細胞内蛍光を示さないことを示す。平板培養時間に対して生じる抗原の基質への 堆積を評価するために、表皮ケラチン細胞を低密度で平板培養し、蛍光の発現を 増大する細胞密度の関数として観察した。

これらの研究に関する顕微鏡写真の結果は図６Ａ〜図６Ｅに示されており、８Ｍ １６５抗原の合成が成長および移動する細胞と相関していることを示す。平板培 養後６時間で、細胞内蛍光のみが観察される（図６Ａ）。２４時間までに、個々 の細胞および細胞クラスターが核周囲の細胞内蛍光および細胞に直接隣接する基 質の蛍光染色の両方を示すことを認めることができた（図６Ｂ、図６Ｄおよび図 ６Ｅ）。若干の場合には、細胞か移動し、基質に付着した蛍光染色の後方に位置 するのが分かった（図６Ｄおよび図６Ｅ）。細胞クラスターが大きくなるので（ 図６０）、周囲細胞のみか細胞内蛍光を示し、これはクラスター内部で細胞がも はやこの抗原を合成していないことを示す。

これらの結果は、細胞の成長および移動が表皮ケラチン細胞コロニーの周囲で生 じ、内部細胞が不活発であるという以前の観察と一致する（バラントン等、　１ ９８７；　ｒｃｅｌｌＪ　５０：１１３１−１１３７頁）。また、パラントン等 は、ＢＭ１６５抗原が主として細胞の成長および移動によって生産されることを 示唆している。集密状態培養物の内部細胞は抗原を合成しない。

抗原を更に特徴付けるために、免疫原を、ＢＭ１６５抗体を　６用いるイムノア フィニティー・クロマトグラフィーにより表皮ケラチン細胞培地から分画し、ポ リアクリルアミドゲル電気泳動により分析した（図７）。前述のアフィニティー 精製の部分で述へたように、抗原を使用済みの表皮ケラチン細胞培地からアフィ ニティー精製した。ジスルフィド還元前にドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した場合に、２種の種 がコンマシー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）ブルーを用いた染色により観察された（レ ーン１）。両分子種はイムノプロット陽性であった（レーン２）。推定Ｍｒ約４ ０．０００の優勢な種は移動した。Ｍ　ｒ　４４０．０００の劣勢な種は認めら れないことが多かった。

メルカプトエタノールを用いてジスルフィド結合の還元を行った後にＭ　ｒ　１ ６５，０００．１５５，０００．１４０．０００および１０５．０００の４種の 主要な電気泳動種が分離された（レーン３．矢印）。これらのバンドは、ＥＭＳ ラミニン（シグマ社製）へのポリクローナル抗血清との免疫反応性、又はヒトＡ ＳＢｌ又はＢ２鎖（エングバール（Ｅｎｇｖａｌｌ）へのモノクローナル抗体と の免疫反応性を示さなかった（テークを示さず）。Ｍ　ｒ　ｆ６５．０００の種 のみ（および化学的に染色されたバンドのいずれにも対応せずかつ減成生産物で あると推定される免疫反応性のより小さい種）が、ｍＡｂ　ＢＭ１６５で調べた 場合にウェスタンプロットによって示されるように、８Ｍ１６５抗原決定基を含 む（レーン４）。ジスルフィド結合を有する４、００１ｃＤａの種をゲルから別 個に取り出し、２−メルカプトエタノールで還元し、還元生成物を電気泳動によ り分離した。４００　ｋＤａ種は１６５ｋＤａ、１５５ｋＤａおよび１４０ｋＤ ａの鎖を含む（レーン５）ほかに、コンマシー染色によりかすかに認められる少 量の２００ｋＤａ種（レーン３）を含む。また、この２００　ｋＤａ種は８Ｍ１ ６５抗原決定基を含む。４００ｋＤａ種は１６５ｋＤａ、１４０ｋＤａおよび１ ０５ｋＤａの鎖を含む（レーン７）。これらの結果は、３種の非同−鎖を有する 分子の同定と一致する。

非還元種の電気泳動による移動における差異は、タンパク質の加水分解による１ ５５ｋＤａから１０５　ｋＤａへの転化によって説明できる。また、これらの結 果は、１６５ｋＤａ鎖が２００ｋＤａ鎖に関連していることを示す。２００ｋＤ ａ鎖と１６５ｋＤａ鎖との間の前駆物質生産物の関係は、生合成パルス−チェイ ス実験により確認されている。これらのタンパク質の加水分解が生理学的なもの であるか否かは明らかでない。

精製した抗原の回転シャドウ画像化は１１０７ｎの中央棒状部を有する線状分子 を示す（図８）。分子は２種の形で存在することが認められる。最も普通の画像 は棒状部の核末端に１個の小球状の節を有する広がったダンベルのように見える （図８Ｂ）。一方の節か他方の節より小さく見えることか多い。最も少ない形は 非対照で、一端に大きい小球体を有し、他端に２個のより小さい小球体を有する ものである（図８０．３個の一連の画像のうち第２および第３の画像について） 。これらの画像は本発明者等が以前から知っているいずれのものにも似てし１な い。比較的多いのは上述の２個の画像であり、より大きし１種における追加の節 は４４０ｋＤａ分子によるより大きい画像と一致する。

培養した表皮ケラチン細胞の移植 表皮ケラチン細胞を移植する方法は既に文献に開示されており、これらの方法は いずれも、本発明を実施する際に使用できるように変更を加えるのに適している 。この技術分野に習熟した者てあれば、こうした移植をいかにして実施するかを 知っている。しかし、例示の意味で、適当な移植方法のいくつかの例を開示する 。

実施例１ 表皮ケラチン細胞を移植する方法の一つは、オコーナー（０’　Ｃｏｎｎｏｒ） 等によって１９８１年に「ザ・ランセ・ノド（ＴｈｅＬａｎｃｃｔ）　Ｊ　ｌ　 ：　７５−７８に開示されている。患者から２個の２ｃｍ”皮膚試料を局部麻酔 下に採取した。この細胞を培地中に置き、培養および移植片調製のための実験室 に移した。できるだけ多くの皮下組織および表皮をこの組織から除去し、次いで この組織を切り刻み、トリプシン処理した。これらの細胞を、異なる密度て接種 した（４Ｘ１０’個の致死放射された３Ｔ３細胞を入れた１個のｓｏｍｍ皿に対 して１０’〜１０’個の密度で）。これらの培養物に、２０％胎児ウシ血清、ヒ ドロコルチゾン０．４μｇ７ｍｌ、およびコレラゲン０．１　ｎモル／ｌを補給 した強化イーグル培地を供給した。これらの培養物を、１０９６のＣ０２を含む 大気中で、３０°Ｃで培養した。また、３日後に、表皮生成因子（ＥＧＦ、１０ 層ｇ／ｍ１）をこの培地に加えた。これらの培養物が集密状態になるか（１４日 〜２１日で）、あるいは継代培養されるまで、培地を週に２回変えた。若干の亜 集密状態の培養物を生存凍結し、その後に継代培養した。このようにして、二次 および三次継代培養物を移植片として後で使用するために調製することができた 。

この集密状態の上皮を、酵素ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）によって、５０ｍ ｍ組織培養皿の表面から無傷のまま分離した。分離後に、弾性のある上皮は２〜 ２．５ｃｍの直径まで収縮した。次いで、これを無血清培地で洗浄し、２ｃｍ円 の形に切り取った２層の無菌ワセリンガーゼの上に基底側を上にして置いた。露 出した基底面を覆うのに丁度充分な無血清培地を加えた。次いで、移植片の入っ ている幾つかの皿を、ガラスジャー内に入れた。この気相を１０％ＣＯｔで洗浄 し、シールされたジャーをベッドのそばに運んだ。

この上皮移植片をワセリンガーゼの覆いと共に、準備された部位上に置き、この 基底細胞層を、移植を受ける人のベッドに向けた。縫合は不要であった。それは 、この移植片が目の細かい非含浸ガーゼの単層によって所定位置に保持され、こ の単層が毎日取り替えられる目の粗いガーゼの緩い層によって覆われているから である。この目の細かいガーゼおよびワセリンガーゼを、６日目と１００日目の 間に除去し、この領域をワセリンガーゼの単相および目の粗いガーゼの緩い層で 再び包帯した。

移植時から３〜４週間の間、これらの包帯を毎日取り替えた。

その後に、移植片を露出したままにしておいたが、ラノリン軟膏の薄層によって 毎日１回処理した。

この上皮移植片を、初期肉芽組織（７日未満経過）、慢性肉芽組織および最近筋 膜まで下方に切開された領域という３種の異なるタイプの移植を受ける人のベッ トの上に置いた。

本発明に従い、集密状態の上皮のその下に横たわる組織への接着は、外因性カリ ニンの薄層を、表皮ケラチン細胞培養物の基底面の上、又は移植片が配置されて いる組織の露出面の上皮の上に拡げることによって、改善される。このような外 因性カリニンは優れた接着をもたらす。それは、細胞培養物内の集密状態の表皮 ケラチン細胞が、カリニン生産を停止させるかあるいは有意に減少させ、培養細 胞の基底面上に存在するカリニンがディスバーゼ処理によって破壊され、カリニ ンが真皮−表皮接合部の安定化に必要になるからである。

実施例２ また、自己由来の培養ヒト上皮を移植する方法が、ガリコ（Ｇａ１１ｉｃｏ）等 、１９８４年、ｒＮＥＪＭ」３１１：４４８−４５１に開示されている。患者は ２人の子供であり、その体の９５％より広い部分に火傷を負っていたが、その体 表面の半分以上を自己由来の培養表皮移植によって成功裡に被覆することができ た。承諾の下に、皮膚の２ｃｍ”全厚上皮試料を各患者の腋から切り取った。こ の皮膚を切り刻み、トリプシン処理して、単細胞懸濁液を製造した。２ＸｌＯ” 個の細胞の部分標本した。このコロニーが集密状態になった時に、この培養物を トリプシン処理し、３Ｘ１０’個の細胞を接種して、移植用の二次又は三次の培 養物を作った。移植片を調製するために、この培養細胞からなるシートをデイス パーゼによってフラスコから離し、培地で洗浄し、４．５Ｘ６ｃｍの切断したワ セリンガーゼでつかんだ。火傷部分は、顔の三度の火傷部分を除いて、筋膜まで 切開し、死んだ組織を除去するのに充分な深さにまで接線方向に切開し、た。こ れらの培養された移植片をそのガーゼ裏材と共に、準備した傷の表面上に置き、 所定位置で縫合し、乾燥ガーゼで包んだ。７〜１０日後にワセリンガーゼを除去 した。

この手−順を、なお同定の必要のあるサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）で、釈 放された表面ケラチン細胞を処理することによって、カリニンの形質発現を増幅 することにより、本発明に従って変更した。カリニン生産は細胞増殖に関係して いるので、成長ホルモンが候補にすることができた。また、他の供給スケジュー ルも有効であった。

実施例３ 自己由来の培養ヒト上皮の移植は、上述の実施例１および２におけるように実施 することができる。しかし、この方法を、表皮ケラチン細胞の相当数がなおりリ ニンを活発に生産している間に、表皮ケラチン細胞を移植することにより、変更 した。

この場合には、豆果密状態の表皮ケラチン細胞が、１０ｍＭＥＤＴＡで処理する ことによって、培養基質から釈放された。懸濁しているこれら細胞を成長培地で 洗浄し、「ヴイトロゲン」（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）（米国カリフォルニア州バロア ルト所在のコラーゲン・コーポレーション製）中に懸濁させ、テフロン成形品内 のガーゼ層の上に注ぎ、単一の表皮ケラチン細胞からなる薄い安定化層を作った 。この「ヴイトロゲン」は３７℃で短時間培養することによりゲル化し、生成し たゲルを上記テフロン成形品から引き上げ、傷ベッドに付着させた。移植された 細胞は、実施例１および２におけると同様にして保護した。

実施例４ 標準インビトロ付着試験を実施して、精製されたカリニンカ（、表皮ケラチン細 胞のプラスチック基板に対する付着を容易にする程度を測定した。これらの試験 では、外因性精製カリニン又は対照タンパク質を、この基板と共に一夜培養し、 次１Ｎでこれらの平板を洗浄した。付着していない細胞を洗浄除去し、残った付 着細胞を、オーメイリー（Ａｕｍａｉｌｌｅｙ）等（１９８９）　ｒＥｘｐ。

Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、Ｊ　１８１　：　４６３〜４７４に記載されているようにし て、定量した。

実施例５ また、表皮ケラチン細胞の基質への付着を強めるカリニンの役割を、傷ベットへ の移植細胞シートを作る際に行われように、細胞シートをディスパーゼで処理し てプラスチ・ツク又はガラスの基板から釈放させることによって、明らかにした 。この細胞シートを、カリニン又は対照タンパク質のいずれかによって被覆され た一連のプラスチック基板に移した。この細胞シートの接着性を形態的に評価し て、この細胞シートがカリニン被覆基板に対する優れた付着性を有することを明 らかにした。この細胞シートの接着性を、ＢＭ１６５抗体を使用する間接免疫蛍 光法によって評価した。しつかり付着した細胞シートは、集密状態の表皮ケラチ ン細胞培養物の研究によって示されるように、抗体の基板表面への侵入を許さな かった。これによりしつかり付着していないソートの場合には、細胞の下方で蛍 光が観察された。

実施例に の実施例では、培養された表皮ケラチン細胞によってカリニンが合成されている 間における、細胞培養物の相を明らかにした。単一の表皮ケラチン細胞を培養開 始後の種々の時間で平板培養し、カリニンを、細胞の間又は基板の上に免疫化学 的に局在させた。細胞内カリニンは表皮ケラチン細胞の単細胞内又は小クラスタ ー内にのみ存在していた。カリニンは、大きなコロニーの中央領域内の表皮ケラ チン細胞内では細胞内に観察することができず、細胞がなお分割および移動を続 けているコロニー周縁の表皮ケラチン細胞内でのみ細胞内に観察することができ た。

種々の時間において、平板培養後の選択した時点で、培養物を放射性同位元素で 標識したタンパク質前駆体と共に１２時間の間培養した。次いで、カリニンを全 培養時間の関数として定量的に免疫沈降させた。この実験の予備的な結果が示す ところでは、細胞当たりのベースで測定した場合に、カリニンの合成は培養時間 と共に低下したく図１０）。この情報により、表皮ケラチン細胞によるカリニン 生産および堆積を最大にできるように、細胞培養の最適時間を規定することがで きた。

本発明は、ヒトおよび動物源の両方からのカリニンを含む。

カリニンはウシ胎児、ヒト羊膜及び羊水のような、多用な供給また、将来におい ては、技術進歩により、表皮ケラチン細胞に接着性をもたらすカリニンの個々の 領域の同定、単離および精製か可能になる。これらの領域を同定するには、単離 したカリニンを断片化して個々の領域を生産し、表皮ケラチン細胞接着因子とし て作用する各領域の能力を個々に試験する。あるいは、細胞の接着を阻止する領 域特異的モノクローナル抗体を生産し、これを１個または２個以上の活性領域を 同定するのに使用できる。これらの進歩が達成されると、単離された接着領域を 精製し、かつ本発明で使用することができる。

また、さらに進歩すると、カリニン、カリニンのサブチェーン（ｓｕｂ−ｃｈａ ｉｎ）　、または表皮ケラチン細胞を接着する関連タンパク質の分子クローニン グが可能になる。これらのクローン化した鎖は確認された構造領域についての構 造上の情報を提供する。そこで、これらのクローン化領域をインビトロ発現させ ることができる。細胞付着領域が単一カリニン鎖内に含まれている場合には、機 能的にフラグメントをインビトロ生産することが可能である。組換えタンパク質 フラグメントは、クリ−グラ−等ｒＧｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　Ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ」、米国ニューヨーク州、ストックトンプレス社（Ｓｔｏｃｋ ｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、　１９９０年に記載されているようなＳＶ４０ウィルス ベクターを用いてＣＶ−１細胞にトランスフェクションすることかできる。

むすび 本発明者等は、インビトロにおけるプラスチックに対する細胞の付着およびイン ビボにおける基底膜に対する細胞の付着に必要となるタンパク質をヒト表皮ケラ チン細胞培養物から単離した。確認された１６５ｋＤａ、１５５ｋＤａおよび１ ４０ｋＤａの鎖は明らかに単分子を形成し、この単分子は一端に２個の小球体を 有する特徴ある棒状形態を有することが、回転シャドウィングによって分かった 。１６５ｋＤａ、１４０ｋＤａおよび１０５　ｋＤａのフラグメントを含む第２ 分子は一端において第２小球体を有していないことが、主要な回転シャドウィン グ画像によって示されている。これらの２種の分子は１５５ｋＤａ鎖か１０５ｋ Ｄａに分裂しているために相違する。この時点では、このタンパク質加水分解の 結果が生理学的なものであるかどうかは確かでない。本発明者等は、この新規な 精製したタンパク質をカリニンと命名したが、これは小帯またはひもを意味する ギリシャ語ξαλＣυδσから導いた単語である。

ヒト皮膚に対するカリニンの免疫局在は、この抗原がアンカリング・フィラメン トとして記載されている超構造要素であることを示す。また抗原の回転シャドウ ィングにより明らかにされた棒状の形および長さは上述のことと一致する。大部 分のカリニンが高電子密度層に次いで抗体によって生ずる真皮−表皮接合の破壊 部に局在するという知見は、ＢＭ１６５抗体の抗原決定基がヘミデスモソームへ の結合の原因となる抗原領域の近くに存在することを示唆する。抗原の反対端は 高電子密度層中に埋め込まれているように思われる。密度の大きい基底板の下　 −のコロイド状金粒子の観察された直線状堆積は、これがへミデスモソームとの 相互作用の部位であることを示す。ヘミデスモソームとアンカリング・フィラメ ントとの間の接触が抗体の結合により破壊された場合には、基底膜に沿って認め られる金粒子は比較的不均一に分布される。

本発明者等は理論および化学的知識の限界により拘束されるのを望まないが、通 常の顕微鏡法によって認められる基底膜領域の分子状元素の配向は全く人工的な ものであることがある。

迅速−凍結および凍結および凍結−再生（ｆｒｅｅｚｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉ ｏｎ）により調製されたラットの門歯、舌および歯肉の電子顕微鏡検査は、低電 子密度層を完全に欠いている均一な厚さ２５〜１１００ｎの高電子密度基底膜を 明らかにした（ゴールドベルブ等。

１９８６；　ｒＥｕｒ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、Ｊ　４２；３６５−３６ ８）　、同じ結果が本発明者の一人によってヒト皮膚の真皮−表皮接合部を用い た場合に得られている。従って、低電子密度層が、基底膜から細胞が減少する結 果として得られる人工産物であり、かつ高電子密度層が完全な基底膜の残部であ る、ことが可能である。その通りである場合にはカリニンは全く基底膜内に存在 し、一端のみがへミデスモソームと基底層との接触部位に集中していると思われ る。そこでアンカリング・フィラメントは基底層内のこれらの種を反映する。こ れらの種はへミデスモソームに強く結合し、かつ細胞が減少するにつれて基底膜 から引き寄せられるために緊張して直線状態になる。

また、これらのデータは、発育中または再生中の上皮において、最初カリニンが 移動基質上に均一に分布しており、付着複合体の熟成部上で細胞内縁部に再構成 された状態になることを７示す。これはプラスチックまたはガラスの上で培養さ れた表皮ケラチン細胞が、培養中に未成熟へミデスモソームであると考えられる ものの下だけでな（基板上に均一にカリニンを堆積するという観察結果により支 持される。表皮ケラチン細胞の培養物が集密状態になり、かつ患者に移植するの に十分な表面を有するようになると、集密的培養物はカリニンを基質上に堆積す るのを停止する。これは、皮膚移植部位の真皮、筋肉または皮下組織に対する培 養表皮ケラチン細胞の接着性が小さいためであると考えられる。

カリニンが分裂する表皮ケラチン細胞によって合成されるというこの観察結果を 考慮すると、集密状態の細胞を、火傷部における上皮再形成を成功させるために 用いることを考えるのが重要である。またこれらの結果は、カリニンが、接合部 の表皮水痘症（Ｅａｄｙ、　１９８７；　ｒｃｌｉｎ、　Ｅｘｐ、　Ｄｅｒｍａ ｔｏｌ、Ｊ　１２：１６１−１７０）または妊娠ヘルペス（にａｔｚ等、　１９ ８７；　Ｉｌｎ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　１ｎＧｅｎｅｒａｌ　Ｍｅｄｉｃｉ ｎｅ　Ｅｄｓ、　Ｊ第５８６−５８８頁、米国ニューヨーク州所在のマグロ−ヒ ル社）のような水ぶくれ状態を有する個々のヒトにおいて、不足または変化して いることを示唆する。従って、カリニンの局所適用もまたこのような状態を処置 するのに有用である場合がある。

カリニンの回転シャドウィングはこれが不斉分子であることを示す。この確認結 果は、カリニン分子の１個の部位が表皮ケラチン細胞表面上の受容体と相互作用 することができ、他の部分が高電子密度層内に埋め込まれていて、細胞−基質接 着を提供することができる分子構造と一致する。この考えは、培養細胞を抗体と 共に温室した際に観察される細胞−基質接触の破壊およびＢＭ１６５抗体により 生じる矛盾のない劇的なデ・エビシライゼイションによって支持される。

いくつかの好適例において本発明の技術的思想を例示および説明したが、当業者 にとって、本発明をこのような技術的思想から逸脱することなく配列および詳細 を変更できるのは明らかである。本発明者等は次の請求項の技術的思想および範 囲内に入るすへての変更例を請求するものである。

口Ｇ、ｌＡ 口Ｇ、ＩＢ 日Ｇ、２Ａ　日０．２８ ０Ｇ、２Ｃ 日Ｇ、２Ｄ 口Ｇ、　３Ａ　ＦＩＧ、　３Ｂ ｍ、３０　日α３Ｄ 日Ｇ、　４Ａ　ＦＩＧ、　４Ｂ 日Ｇ、　５Ａ　ＦＩＧ、　５８ ＦＩＧ、　５０　口Ｇ、　５Ｄ 口Ｇ、　５Ｅ　ＦＩＧ、　５Ｆ 口Ｇ、６Ａ　口０．６８ ０Ｇ、６０ ＦＩＧ、　６Ｄ　ＦＩＧ、　６Ｅ ロ　− 口Ｇ、８Ａ 日Ｇ、８Ｂ　日０．８０　ＦＩＧ、８ＤＦＩＧ、９ 国際調査報告 フロントベージの続き （７２）発明者　ランストラム　グレゴリ−ポールアメリカ合衆国　オレゴン州 　９７２２５　ポートランド　ニスダブリュー　エイティーナインス　ストリー ト２３５ （７２）発明者　ルセレ　バトリシア フランス国　６９００９　リョン　リュ　デュドクテユール　ラフアン　１９ （７２）発明者　キーン　ダグラス　アールアメリカ合衆国　オレゴン州　９７ ２２１　ボートランド　ニスダブリュー　フィフティセカンド　ストリート　１ ００２９ （７２）発明者　マリンコヴイッチ　エム　ピータ−アメリカ合衆国　オレゴン 州　９７００５　ビーバートン　センター　ストリート　４

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．精製カリニン。
2. ２．免疫アフィニティークロマトグラフィーによって他の基底膜タンパク質から 精製されたものであることを特徴とする請求項１記載の精製カリニン。
3. ３．モノクローナル抗体ＢＭ１６５に曝された際に、ヒトの上皮下の皮膚、気管 、食道、角膜および羊膜の基底膜のヘミデスモソームに局在していることを特徴 とする精製タンパク質カリニン。
4. ４．ヒトの真皮と表皮との間を接着させることを特徴とする請求項１記載のタン パク質。
5. ５．前記タンパク質は４００〜４４０ＫＤａの分子量を有し、そのジスルフィド 結合を還元した場合にウエスタンプロットにおいて１６５ＫＤａ，１５５ＫＤａ および１４０ＫＤａのフラグメントに分離することを特徴とする請求項１記載の タンパク質。
6. ６．前記タンパク質は４００〜４４０ＫＤａの分子量を有し、これを還元した場 合にウエスタンプロットにおいて１６５ｋＤａ，１４０ＫＤａおよび１０５ＫＤ ａのフラグメントに分離することを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
7. ７．前記１６５Ｄａフラグメントにモノクロナール抗体ＢＭ１６５が結合するこ とを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
8. ８．回転シャドウ画像は第１端部に２個の小球体を有する長さ１７０ｎｍの非対 称棒状物を示すことを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
9. ９．回転シャドウ画像はさらに第１端とは反対の棒状物端部に１個の小球体を有 することを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
10. １０．回転シャドウ画像化において、図８に示すような長さ１０７ｎｍの非対称 棒状物であることを示すことを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
11. １１．前記タンパク質は接合部表皮水疱症にかかっているヒトの真皮−表皮接合 部には存在していないかあるいは減少していることを特徴とする請求項１記載の タンパク質。
12. １２．モノクローナル抗体ＢＭ１６５に曝された際に、ヒトの上皮下の皮膚、気 管、食道、角膜および羊膜の基底膜のアンカリング・フィラメントに局在し、ヒ トの真皮と表皮との間を接着させるタンパク質であって、該タンパク質は４００ 〜４４０ＫＤａの分子量を有し、そのジスルフィド結合を還元した場合にウエス タンプロットにおいて１６５ＫＤａ、１５５ＫＤａ，１４０ＫＤａおよび１０５ ＫＤａのフラグメントに分離され、抗原決定基またはＢＭ１６５が１６５ＫＤａ フラグメントに存在し、かつ前記タンパク質は図８に示す回転シャドウ画像を有 することを特徴とする精製タンパク質カリニン。
13. １３．移植した表皮ケラチン細胞の下側基質に対する接着を改善するに当り、 前記表皮ケラチン細胞と前記基質との間に、前記表皮ケラチン細胞によって本来 生産される量より多量のカリニンを供給することを特徴とする表皮ケラチン細胞 の下側基質に対する接着を改善する方法。
14. １４．カリニンとして、外因性カリニンを使用することを特徴とする請求項１３ 記載の方法。
15. １５．カリンシ供給工程において、表皮ヶラチン細胞によるカリニン生産量を、 表皮ケラチン細胞によって本来生産される基本レベルより多い量まで増加させる ことを特徴とする請求項１３記載の方法。
16. １６．移植した表皮ケラチン細胞の下側基質に対する接着を改善するに当り、 表皮ケラチン細胞の細胞培養物におけるカリニン生産をモニターし、 表皮ケラチン細胞が活発にカリニンを生産している間に表皮ケラチン細胞を移植 する ことを特徴とする表皮ケラチン細胞の下側基質に対する接着を改善する方法。
17. １７．基質が火傷表面であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
18. １８．基質が火傷表面であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
19. １９．基質がヒトの真皮または皮下組織であることを特徴とする請求項１７記載 の方法。