TWI689589B - 區別間質幹細胞的方法及測定間質幹細胞的純度的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種區別間質幹細胞(MSCs)與纖維母細胞的方法。本發明亦提供增加細胞培養物中的間質幹細胞(MSCs)群體之純度的方法。上述方法各自包含透過標記物CD146自源自於胎盤相關組織的細胞培養物中分選或分離細胞的步驟。本發明亦提供評估源自於胎盤相關組織的細胞培養物中的間質幹細胞(MSCs)之純度的方法,包含測定該培養物中表現CD146的細胞之百分比。
Description
本發明係關於在源自於胎盤相關組織的細胞培養物中區別間質幹細胞(MSCs)之方法。本發明亦關於在源自於胎盤相關組織的細胞培養物中增加間質幹細胞(MSC)群體之純度的方法。另一方面,本發明係關於評估源自於胎盤相關組織的細胞培養物中的間質幹細胞(MSCs)之純度的方法。
間質幹細胞或基質細胞(Mesenchymal stem or stromal cells,MSCs) 是屬於胚胎中胚層來源之多能性細胞,具有類纖維母細胞的形態。該等細胞視刺激及培養條件可分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神經系細胞及肌細胞與其它細胞類型。雖然人類間質幹細胞(hMSCs)的可塑性及其在組織修復與再生的作用已被廣泛研究,近來得到最多的關注者是其免疫調控性質[1-2]。人類間質幹細胞已自各種組織分離出。最常用之MSCs來源為骨髓(bone marrow, BM)。然而,其分離程序為極具侵入性的。為避免侵入性的分離程序,諸如人類臍帶及胎盤之組織由於通常在生產後被丟棄而被視為良好之候選物。先前研究已證實hMSCs可自臍帶或胎盤有效率的分離[3]。
MSCs為包含在間質組織中的更複雜的基質細胞組成之子群體。由於間質幹細胞之異質性及對其具特異性之已知生物標記物之缺乏,定義MSC表型及特徵是一項具挑戰性的任務[4-6]。負責MSCs功能之分子組份(特別是在細胞膜上者)大多數仍屬未知。此外,特異性細胞表面標記物的缺乏使得細胞培養處於可能為其它細胞類型污染的風險中,特別是諸如纖維母細胞之成熟基質細胞,其相對地大量存在於間質組織中[4-6]。在自胎盤源組織分離MSCs之過程中,非MSCs(包括纖維母細胞、胎盤源上皮細胞及胎盤源網狀細胞)常常在體外培養中與MSCs共存。纖維母細胞尤其是污染的主要來源。
纖維母細胞被視為成熟間質細胞,尤其大量存在於結締組織中。因此,該細胞為許多細胞培養系統中最常存在之污染細胞表型。不僅成功地自培養物去除纖維母細胞之技術困難,在相同培養物中區別MSCs與纖維母細胞亦尤為複雜。纖維母細胞及MSCs具有極相似的形態外觀;二者均可良好地增生並具有許多相同之細胞表面標記物[7-8]。國際細胞治療研討會(International Society of Cellular Therapy, ISCT)目前定義MSC為表現CD73、CD90及CD105之具塑料貼附性之多能性類纖維母細胞之細胞,且不表現造血標記物CD14、CD34及CD45。然而,纖維母細胞亦具有該等性質及標記物。因此,目前由ISCT建議之定義無法區別MSC與一般纖維母細胞。至今,區別MSCs與纖維母細胞之最佳方式係基於此兩種細胞之功能特性之分析;MSCs保留多能性幹細胞性及免疫調控能力,而纖維母細胞在此二功能特性中皆顯得較為受限。
自Friedenstein在辨別MSCs上的開創性成果以來[48],在尋求穩定且明確地區別離體培養擴增之MSC與纖維母細胞方面,培養衍生方法學、形態學及基因表現特徵並無明顯的差異[9-12]。目前,對於分離MSCs與纖維母細胞不存在公認之標準或單一細胞表面標記物。由於纖維母細胞為常見於源自胎盤之MSC培養物中之污染細胞群體之事實,作為生物標記物以區別MSCs與纖維母細胞之新穎表面蛋白對於確保胎盤源MSCs之初代培養之均一性極為重要。
CD146 (黑素瘤細胞黏附分子,melanoma cell adhesion molecule,MCAM)是一種血管內皮細胞的表面標記物,透過促進細胞-細胞相互作用以及血管生成作用而發揮功能。最近的研究揭露,一些間質幹細胞(MSCs)會表現CD146 [13-14、16],而且CD146的表現量與其自我更新能力或分化成脂肪細胞以及成骨能力有關[13、15]。此外,自不同組織分離的間質幹細胞(MSCs)表現出不同的CD146表現量:從骨髓分離之間質幹細胞(MSCs)約有40%表現CD146,且其表現量隨著繼代次數增加而降低[13-15],而從脂肪組織分離之間質幹細胞(MSCs)只有少於10%表現CD146 [14]。
美國第9,470,685號專利公開一種使用在間質幹細胞(MSCs)上表現的標記物EphA2以區別間質幹細胞(MSCs)和纖維母細胞之方法。
在本發明中意外地發現,基於特異性的表面標記物CD146 (黑素瘤細胞黏附分子,melanoma cell adhesion molecule,MCAM)之表現量,可以在源自胎盤相關組織的細胞培養物中區別間質幹細胞(MSCs)。
因此,在一方面,本發明提供一種區別間質幹細胞(mesenchymal stem cells (MSCs)與纖維母細胞的方法,包含使用在MSCs上表現的標記物CD146自纖維母細胞中分離出MSCs,以區別MSCs與纖維母細胞,其中該等MSCs與纖維母細胞係來自於源自胎盤相關組織之細胞培養物。
在本發明之部分具體實施例中,該方法進一步包含以下之初步步驟:自該胎盤相關組織收集MSCs與纖維母細胞;以及在一培養基中培養MSCs與纖維母細胞以製備該細胞培養物。
另一方面,本發明提供一種增加細胞培養物中的間質幹細胞(MSCs)群體之純度的方法,包含使用在MSCs上表現的標記物CD146分離並收集MSCs,其中該等MSCs係來自於源自胎盤相關組織之細胞培養物;以及培養該等MSCs。
根據本發明,該胎盤相關組織可選自於由羊膜、絨毛膜盤、絨毛膜及臍帶所組成之群組。在一較佳具體實施例中,該胎盤相關組織為臍帶。
根據本發明,分選步驟可使用本領域已知或待開發之技術進行,例如一基於抗體或一基於核苷酸之分離方法。
在本發明之部分具體實施例中,該源自胎盤相關組織之細胞係培養於一間質幹細胞用之培養基中。
另一方面,本發明提供一種評估在源自胎盤相關組織之細胞培養物中的間質幹細胞(MSCs)之純度的方法。該方法包含測定在該培養物中表現CD146的細胞之百分比的步驟。
根據本發明,該等MSCs之純度與該表現CD146的細胞之百分比具有正相關性。在本發明之較佳具體實施例中,該表現CD146的細胞之百分比係透過流式細胞法測定。在一具體實施例中,該等MSCs之純度係透過以下之方程計算:Y = SX + I,其中Y為間質幹細胞(MSCs)之純度(%),X為表現CD146的細胞之百分比,S為自1.129至1.283之間的數值,且I為自-28.676至-17.964之間的數值。
應了解先前之一般描述及以下之詳述兩者皆僅為示例性及解釋性且並不限制本發明。
本發明基於意外之發現,亦即透過表面標記物CD146的細胞分選,可以在源自胎盤相關組織的細胞培養物中區別出間質幹細胞(MSCs)。
在一方面,本發明提供了一種區別間質幹細胞(MSCs)與纖維母細胞的方法。該方法包含使用在MSCs上表現的標記物CD146自纖維母細胞中分離出MSCs,以區別MSCs與纖維母細胞,其中該等MSCs與纖維母細胞係來自於源自胎盤相關組織之細胞培養物。
在本發明之部分具體實施例中,該方法進一步包含以下之初步步驟:自該胎盤相關組織收集MSCs與纖維母細胞;以及在一培養基中培養MSCs與纖維母細胞以製備該細胞培養物。
另一方面,本發明提供一種增加細胞培養物中的間質幹細胞(MSCs)群體之純度的方法,包含使用在MSCs上表現的標記物CD146分離並收集MSCs,其中該等MSCs係來自於源自胎盤相關組織之細胞培養物;以及培養該等MSCs。
又一方面,本發明提供了分離間質幹細胞(MSCs)群體的方法,包含使用在MSCs上表現的標記物CD146分離並收集MSCs,其中該等MSCs係來自於源自胎盤相關組織之細胞培養物,且該等MSCs群體具有較高的分化能力、引起較高的抗發炎效果、具有較低的老化程度,及/或分泌較高量的生長因子。
根據本發明,依照本領域已知之實驗操作程序,例如Shen等人之實驗操作程序[21],該等細胞係新鮮地得自、獲得自或收集自胎盤相關組織。在部分較佳具體實施例中,源自胎盤相關組織之細胞接著培養於一MSC用之培養基。MSC用之標準培養基包含α最低必需培養基(具有不同的修改版本)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、L-麩醯胺酸,以及鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)[3,16-20]。
該胎盤相關組織可選自於由羊膜、絨毛膜盤、絨毛膜及臍帶所組成之群組。在本發明之一較佳具體實施例中,該胎盤相關組織為臍帶。
在本發明方法之實行中,使源自胎盤相關組織的細胞培養物接受CD146之細胞分選。該細胞分選可經由本領域已知或待開發之技術進行,例如:一基於抗體或一基於核苷酸之分離方法。較佳地,該細胞分選係藉由一基於抗體之磁性細胞分選進行。例如,MACS法(MACS®
Technology, Miltenyi Biotec)。此外,該細胞分選可以透過流式細胞法進行,如基於抗體或基於核苷酸的流式細胞法。
此外,在本發明中意外地發現,該等MSCs之純度與表現CD146的細胞之百分比具有正相關性。
據此,本發明另一方面提供了一種評估在源自胎盤相關組織之細胞培養物中的間質幹細胞(MSCs)之純度的方法。該方法包含測定在該培養物中表現CD146的細胞之百分比的步驟。
在本發明之較佳具體實施例中,表現CD146的細胞之百分比係透過流式細胞法測定。
在一具體實施例中,該等MSCs之純度係透過以下之方程式計算:Y = SX + I,其中Y為間質幹細胞(MSCs)之純度(%),X為表現CD146的細胞之百分比,S為自1.129至1.283之間的數值,且I為自-28.676至-17.964之間的數值。
根據本發明之部分具體實施例,透過本發明之方法分離的MSCs群體具有較高的分化能力。在一具體實施例中,該等MSCs群體具有較高的脂肪生成能力。
根據本發明之部分具體實施例,透過本發明之方法分離的MSCs群體引起較高的抗發炎效果。在一具體實施例中,該等MSCs群體表現出較高的抑制PBMC增殖的能力。
根據本發明的部分具體實施例,透過本發明的方法分離的MSCs群體具有較低的老化程度。於一些具體實施例中,該等MSCs群體表現出較低量的細胞ROS、粒線體ROS或β-半乳糖苷酶。
根據本發明的部分具體實施例,透過本發明之方法分離的MSCs群體分泌較高量的生長因子。在一具體實施例中,該等MSCs群體分泌較高量的肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)。
應當理解的是,上述一般性描述與以下詳細描述都僅為示例性和解釋性的,而非對本發明之限制。
本發明藉由以下實例進一步說明,其提供作為例示之用而非限制本發明。
實例
實例
1
:
間質幹
細胞
(MSCs)
與纖維母細胞的混合群體之流式細胞儀分析
為證明CD146可作分離源自胎盤之間質幹細胞(MSCs)與纖維母細胞的生物標記物,在微量離心管(Eppendorf)中,將源自於臍帶的MSCs及纖維母細胞以下列比例(MSC:纖維母細胞的細胞數)混合:2x105
:0、1.8x105
:2x104
、1x105
:1x105
、2x104
:1.8x105
,或0:2x105
。接著藉由流式細胞儀分析每一微量離心管中的CD146+
群體。參照圖 1
,結果顯示,經由流式細胞儀,透過抗CD146抗體(抗人類CD146-V450,BD biosciences公司)偵測到的CD146+
群體之百分比相應於增加之纖維母細胞群體而成比例減少。
實例
2
:隨著繼代次數增加
CD146
的表現量依然維持
以不同的繼代數(繼代數:4、6、8、10,以及12)收穫源自於臍帶的MSCs,並透過流式細胞儀分析CD146的表現量。結果顯示經過繼代,CD146的表現量依然維持(圖 2
)。
實例
3
:
MSCs
之純度的評估
在微量離心管中,將源自於臍帶的MSCs與纖維母細胞以下列比例(MSC:纖維母細胞的細胞數)混合:2x105
:0、1.8x105
:2x104
、1x105
:1x105
、2x104
:1.8x105
,或0:2x105
。接著藉由流式細胞儀分析每一微量離心管中的CD146+
群體。隨後,透過簡單線性回歸分析MSCs之純度(%)與表現CD146的細胞的百分比之間的關係,其結果顯示於圖 3
。回歸方程式為Y = 1.206X – 23.32,其中Y為MSCs之純度(%),X為表現CD146的細胞的百分比。結果證實CD146的表現量與MSCs之純度之間存在線性關係。
實例
4
:
CD146
高
的
MSCs
相對
CD146
低
的
MSCs
表現出較高的分化能力
使用流式細胞儀檢查來自不同臍帶的MSCs的CD146的表現。獲得二組MSCs:CD146高
的MSCs與CD146低
的MSCs (圖 4A
)。將2 x 105
細胞/孔的MSCs接種至12孔培養盤中,培養整夜,然後在添加脂肪生成補充物(InvitroGen公司)的脂肪細胞分化基礎培養基(InvitroGen公司)中培養。培養14天後,將該二組MSCs以福馬林固定,以油紅(Oil Red)染色,並在顯微鏡下觀察以計算脂肪細胞的數目。如圖 4B
所示,CD146高
的MSCs展現出較高的脂肪生成能力。
實例
5
:
CD146
高
的
MSCs
相對
CD146
低
的
MSCs
產生較高的抗發炎效果
CD146高
的MSCs及CD146低
的MSCs之獲得如實例4所述。藉由PBMC增殖測定分析間MSCs的免疫調節能力。羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)標記的PBMC由植物凝集素(phytohemagglutinin,PHA)刺激,並且與MSCs共同培養。透過FACS分析增殖之PBMC的百分比。透過評估螢光細胞可滲透染料CFSE之強度的降低來測定PBMC的增殖速率。結果顯示,CD146高
的MSCs較CD146低
的MSCs更有效地抑制PBMC的增殖(圖 5
),表示CD146高
的MSCs產生較高的抗發炎效果。
實例
6
:
CD146
高
的
MSCs
相對
CD146
低
的
MSCs
分泌出較高量的生長因子
CD146高
的MSCs及CD146低
的MSCs之獲得如實例4所述。以ELISA分析來自該二組的條件培養基中的肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor,HGF)的量,並透過BCA方法分析MSC的總蛋白。HGF的量以HGF總量與MSC的總蛋白量的比率來表示。如圖 6
所示,CD146高
的MSCs相對CD146低
的MSCs分泌出顯著較高量的HGF。
實例
7
:
CD146
高
的
MSCs
相對
CD146
低
的
MSCs
具有較低的老化程度
CD146高
的MSCs及CD146低
的MSCs之獲得如實例4所述。較高量的細胞ROS、粒線體ROS及β-半乳糖苷酶被認為與老化有關。在本實驗中,使用市售套組(分別為Sigma公司的DCFDA以及Invitrogen公司的MitoSox)測定細胞ROS量及粒線體ROS量。使用C12FDG (Molecular Probes公司)測定與老化相關的β-半乳糖苷酶的量。結果顯示,在CD146高
的MSCs中的細胞ROS、粒線體ROS及β-半乳糖苷酶的量低於在CD146低
的MSCs中的量(圖 7
),表示CD146高
的MSCs相對CD146低
的MSCs具有較低的老化程度。
熟悉本技術之人士應了解可對上述之實施例進行改變而不背離其廣泛之發明概念。因此,應了解本發明不受限於所揭示之特定實施例,而是意欲涵蓋在如隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神與範疇內之修改。
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無
本發明先前之概述以及以下詳述在配合隨附圖式閱讀時得以更佳地被了解。為說明本發明,在圖式中顯示目前較佳之實施例
在圖式中:
圖 1
顯示間質幹細胞(MSCs)和纖維母細胞的混合群體的流式細胞儀分析的結果。將來自捐獻者之臍帶的MSCs與不同比例的纖維母細胞混合。結果顯示由流式細胞儀偵測到之CD146+
群體的百分比相應於增加之纖維母細胞群體而成比例減少。FB = 纖維母細胞。
圖 2
顯示以流式細胞儀分析不同繼代數的源自臍帶之MSCs的CD146表現量的分析結果。
圖 3
顯示在源自於胎盤相關組織的細胞培養物中MSCs之純度(%)與表現CD146的細胞的百分比之間的線性回歸。
圖 4A
顯示CD146高
的MSCs和CD146低
的MSCs之CD146的表現量。圖 4B
顯示來自CD146高
的MSCs與CD146低
的MSCs的脂肪生成分化之結果。
圖 5
顯示PBMC增殖分析之結果。
圖 6
顯示在CD146高
的MSCs和CD146低
的MSCs的條件培養基中肝細胞生長因子(HGF)的含量。
圖 7
顯示在CD146高
的MSCs和CD146低
的MSCs中細胞ROS、粒線體ROS以及β-半乳糖苷酶(老化標記物)的相對螢光單位(relative fluorescence units, R.F.U)。
無
Claims (2)
- 一種評估臍帶間質幹細胞(MSCs)之純度的方法,包含測定在該培養物中表現CD146的細胞之百分比,其中該等MSCs之純度係透過以下所示之方程計算:Y=1.206X-23.32,其中Y為MSCs之純度(%),X為表現CD146的細胞之百分比。
- 如請求項1之方法,其中該表現CD146的細胞之百分比係透過流式細胞法測定。
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