KR101168224B1 - 항-ｔｍ4ｓｆ1 항체를 이용한 중간엽줄기세포 동정방법 및 그 조성물 - Google Patents

항-ｔｍ4ｓｆ1 항체를 이용한 중간엽줄기세포 동정방법 및 그 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중간엽줄기세포에서 특이적으로 발현되는 TM4SF1 단백질을 이용하여 중간엽줄기세포를 동정 또는 분리하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 항-TM4SF1 항체를 포함하는 중간엽줄기세포 동정 또는 분리용 조성물을 제공하고, 항-TM4SF1 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽줄기세포 동정용 키트 및 단백질칩을 제공한다. 또한 본 발명은 항-TM4SF1 항체를 이용하여 중간엽줄기세포를 동정하는 방법 및 분리 정제하는 방법을 제공한다.
중간엽줄기세포, TM4SF1, 섬유아세포, 마커, 동정

Description

항-ＴＭ4ＳＦ1 항체를 이용한 중간엽줄기세포 동정방법 및 그 조성물{Method for identification of mesenchymal stem cells using anti-TM4SF1 antibody and composition for it}
본 발명은 인체의 여러 조직, 특히 섬유아세포나 혈액세포가 섞여 있는 조직으로부터 중간엽줄기세포를 효과적으로 동정 및 분리하기 위한 신규한 표면 단백질 마커로서의 TM4SF1의 기능에 관한 것이다.
중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells 또는 mesenchymal stromal cells, MSCs)는 결합조직(connective tissue)들의 재생을 위한 세포 저장고일 뿐만 아니라(Pittenger et al, 1999), 혈액 생성의 조절을 위한 영양의 제공(Dazzi et al, 2006) 및 면역반응(Uceelli et al, 2006)에 관여한다. 이러한 다양한 기능 때문에 인체 MSCs는 다양한 치료제로서의 가능성을 인정받고 있으나, MSC 배양물이 다른 타입의 혈액 및 조직 세포들과 섞이는 문제 때문에 임상적 적용에 제한을 받고 있다. 특히, 피부 섬유아세포(fibroblast)들은 체내에 가장 풍부하게 산재해 있고, 형질 및 기능에 있어 MSCs와 공통되는 면이 많아 가장 주된 오염원으로 꼽히고 있다(Lysy et al, 2007). 이들로 오염될 경우 MSC는 체외 팽창(ex vivo expansion) 동안 이들과 구별되지 않고 일체로 남아있게 된다.
지난 수십 년간, 하이브리도마(hybridoma) 기술의 진보는 일련의 MSC-활성 모노클론(monoclonal) 항체 시리즈들, 즉 SH-2, SH-3, SB-10, HOP-26, 및 Stro-1의 개발을 촉진시켰고, 이것은 후에 CD105, CD73, CD166 및 CD63을 포함하는 MSCs 상의 여러 다른 표면 단백질들을 인식하는 것으로 밝혀졌다. 또한 최근에 3개의 막관통 단백질(transmembrane proteins), NGF-R (Quirici et al, 2002), CD200 (Delorme et al, 2008) 및 FAPα (Bae et al, 2008) 뿐만 아니라 3개의 당지질(glycolipid), SSEA-1 (Anjos-Afonso & Dominique, 2007), SSEA-4 (Gang et al, 2007) 및 GD2(Martinez et al, 2007) 역시 MSC-특이적 표면 마커들로 밝혀졌고 골수(BM)로부터 MSCs의 분리 및 동정에 효과적임이 입증되었다. 하지만, 상기 분자들이 골수 외의 다른 조직에서도 똑같이 효과적인 MSC-특이적 마커들로 작용할 수 있는지 또는 형질이 같은 세포들, 즉 섬유아세포들로부터 신뢰할만한 수준으로 MSCs를 구별해 낼 수 있는지는 아직 불분명한 상태이다.
이에 본 발명자들은 혈액세포들 및 섬유아세포들로부터 동시에 MSCs를 구별할 수 있는 신규한 표면 단백질 마커들을 찾기 위해 기존에 얻었던 차별적 전사체 데이터(differential transcriptome data) (Jeong et al, 2007a; Bae et al, 2009) 및 MSCs의 막 단백질체 데이터(Jeong et al, 2007b)의 조합 분석을 수행하였고, 상기 분석으로 얻은 표면 마커들이 다양한 세포들, 특히 섬유아세포가 많은 결합조직 들로부터 MSCs를 용이하게 식별 및 분리시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 인체 내 여러 조직, 특히 섬유아세포가 풍부한 결합조직 등에서 중간엽줄기세포를 분리 동정하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 중간엽줄기세포를 특이적으로 분리 동정할 수 있는 조성물 또는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항-TM4SF1(anti-transmembrane 4 L6 family member 1) 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽줄기세포 분리 또는 동정용 조성물을 제공한다. 상기 항체의 종류에는 제한이 없으며, 모노클론 (monoclonal) 항체 또는 폴리클론 (polyclonal) 항체, 단쇄 항체 또는 재조합 항체가 될 수 있다. 상기 항체는 이들의 분리 및 동정을 위해 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 상기 표지물에는 리간드, 비드(bead), 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광물질(fluorescer), 화학발광물질, 자성 입자, 합텐 및 염료 등이 포함될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 리간드에는 바이오틴, 아비딘 및 스트렙토아비딘 등이 포함되고, 상기 효소에는 루시퍼라아제, 퍼옥시다아제 및 베타 갈락토시다아제 등이 포함되며, 상기 형광물질에는 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 피코에리트린 및 설포로다민산 클로라이드 (텍사스 레드: Texas red) 등이 포함된다. 이러한 검출 가능한 표지물로 공지의 표지물 대부분이 사용될 수 있고, 당업자라면 발명의 목적에 맞게 적절 한 표지물을 선택할 수 있을 것이다.
다른 측면으로 본 발명은 항-TM4SF1 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽줄기세포 동정용 키트를 제공한다. 추가로 상기 키트는 중간엽줄기세포와 항-TM4SF1 항체의 복합체를 분리하는데 사용되는 시약 및 고형의 지지체; 및 필요한 시약을 담는 용기를 포함할 수 있다. 상기 항체는 이들의 분리 및 동정을 위해 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있고, 이를 위해 형광물질, 효소 및 리간드를 포함한 상기 표지물이 모두 사용될 수 있다.
또다른 측면에서 본 발명은 항-TM4SF1 항체가 기판에 부착된 중간엽줄기세포 동정용 단백질 칩을 제공한다. 상기 기판의 종류에는 제한이 없으며, 예를 들어 폴리스틸렌 (Polystylene), 폴리염화비닐 (Polyvinylchloride), 폴리프로필렌 (Polypropylene) 등을 사용할 수 있으며, 통상의 유리판 위에 아비딘(Abidin)을 이용하여 상기 항체를 부착시킬 수도 있다.
또다른 측면으로 본 발명은 (a) 시료 세포를 항-TM4SF1 항체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항-TM4SF1 항체와 상기 세포의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 중간엽줄기세포 동정 방법을 제공한다. 상기 세포와 항-TM4SF1 항체 복합체의 형성을 확인하는 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 라디오면역측정법(RIA), 효소 면역측정법(ELISA), 면역형광법 또는 화학발광물질결합법 등이 있 다.
본 발명은 또한, (a) 중간엽줄기세포가 포함된 배지를 항-TM4SF1 항체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 중간엽줄기세포 및 항-TM4SF1 항체의 복합체를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽줄기세포 분리방법을 제공한다. 상기 복합체를 회수하는 단계는, 이에 제한되는 것은 아니나, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 리간드 또는 자기 비드와 자기 장치 등을 이용할 수 있다.
본 발명이 표적으로 하는 TM4SF1 단백질은 인체내 여러 조직으로부터 중간엽줄기세포를 분리 동정하기 위한 표면 단백질 마커로서 매우 유용하다. 표지된 항-TM4SF1 항체를 이용하면 TM4SF1을 가진 중간엽줄기세포를 특이적으로 신속하게 분리할 수 있다. 또한 기존의 중간엽줄기세포 특이적 마커와 달리 혈액세포들 및 섬유아세포들로부터 동시에 MSCs를 구별할 수 있는 장점이 있다.
사람 중간엽줄기세포는 골, 연골, 근육 및 지방세포 등의 중배엽 관련 조직세포로 분화할 수 있을 뿐 아니라, 조혈모세포에 의한 조혈작용을 보조하거나 면역기능을 조절하는 능력을 가지고 있기 때문에 그 응용 영역이 가장 광범위한 세포의 하나로 인식되고 있다. 이 줄기세포는 다른 줄기세포에 비해 윤리 및 법적 문제점이 적고, 탁월한 자가증식 능력을 보유하고 있으며, 줄기세포의 특성에 영향을 주지 않고 장기간 냉동보관이 가능하며, 전분화능 (Pluripotency)에 가까운 분화능력 을 보유하고 있으며, 유전자 조작 후 높은 세포 안정성을 보이기 때문에 유망한 세포치료제로 각광을 받고 있다. 따라서 중간엽줄기세포의 특이 마커인 TM4SF1는 사람의 골수, 말초혈액, 탯줄혈액 및 지방세포로부터 중간엽줄기세포를 간편하게 동정하고 분리시킴으로 앞으로 진행될 중간엽줄기세포 기반 세포치료제 개발에 적극 사용될 것이기 때문에, 산업상 이용 가능성이 아주 높을 뿐 아니라, 중간엽줄기세포에 대한 세포생물학적, 분자생물학적 기초 연구에도 사용되어, 자가증식과 분화 연구에 관련된 주요 세포신호전달기전을 규명하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 전망된다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제 1의 태양은 항-TM4SF1 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽줄기세포 분리 또는 동정용 조성물에 관한 것이다.
상기 "TM4SF1(anti-transmembrane 4 L6 family member 1)"은 테트라스패닌 패밀리(tetraspanin family)로도 알려진 막 관통 4 슈퍼패밀리(transmembrane 4 superfamily)의 한 멤버에 속하는 단백질이다. 여기에 속하는 대부분의 단백질들은 특이적으로 4개의 소수성 도메인을 갖는 세포 표면 단백질들이다. 이 단백질들은 세포 발달, 성장, 이동 및 활성화의 조절에 관여하는 신호전달을 매개하는 것으로 알려져 있다. 사람(Homo sapiens) TM4SF1의 서열은 NCBI accession CAG33234로 검색가능하다(서열번호 1).
본 발명에서 말하는 "항체"는 통상적으로 생체 내에 존재하는 형태의 항체 이외에, 항체의 H쇄 또는 L쇄의 가변 영역 또는 그의 조합으로 형성되는 항원 결합 부위를 적어도 1개 갖는 분자를 포함한다. 예를 들면, H쇄의 가변 영역만 포함하는 펩티드, 1조의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 Fab, 2조의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 (Fab')2, H쇄 단편과 L쇄 단편이 동일 펩티드 상에 직렬로 결합된 단쇄 항체 "ScFv" 등도 포함된다. 상기 항체는 모노클론 항체이거나, 폴리 클론 항체 또는 단쇄 항체 또는 재조합 항체 일 수 있다. 상기 항체와 중간엽줄기세포 특이적인 TM4SF1과의 결합의 확인을 용이하게 하기 위하여 상기 항체에 리간드, 자기 비드, 효소 등을 결합시킬 수 있다. 상기 리간드는 이에 한정되는 것은 아니나, 바이오틴, 아비딘 또는 스트렙토아비딘 일 수 있고, 상기 효소는 이에 한정되는 것은 아니나, 루시퍼라아제, 퍼옥시다아제 또는 베타 갈락토시다아제 일 수 있다. 당업자는 항체의 확인을 위하여 적절한 리간드, 비드 및 효소를 선정하여 사용할 수 있다.
본 발명의 제 2의 태양은 항-TM4SF1 항체를 이용한 중간엽줄기세포 분리 장치 및 동정 키트에 관한 것이다. 본 발명의 항-TM4SF1 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽줄기세포 분리 장치로는 상기 항-TM4SF1 항체와 TM4SF1의 복합체 를 분리하기 위하여 형광물질이 결합된 항체 및 세포 분리기를 이용하여 분리할 수 있고, 자기 비드가 연결된 항체와 자기 장치를 이용하여 분리할 수 있으며, 특정 리간드 결합과 이를 분리하기 위한 컬럼을 이용하여 분리할 수 있다.
본 발명의 항-TM4SF1 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽줄기세포 동정 키트로는 상기 항-TM4SF1 항체와 TM4SF1의 복합체를 확인하기 위하여 형광물질이 결합된 항체 및 형광분석장치를 이용하여 확인할 수 있고, 자기 비드가 연결된 항체와 자기 장치를 이용하여 확인할 수 있으며, 특정 효소와 기질 반응을 통하여 확인할 수 있다. 상기 동정 키트는 구체적으로 항-TM4SF1 항체를 포함하는 중간엽줄기세포 동정용 단백질 칩일 수 있다.
본 발명에 사용되는 용기 형상으로는 수불용성 담체를 충전한 칼럼, 수불용성 담체를 충전한 플라스크형 또는 플라스크형 케이스가 예시된다. 이러한 용기 형상과 항체를 직접 또는 간접적으로 고정화시킨 불용성 담체를 조합함으로써 TM4SF1 양성 세포 분리 장치를 제작할 수 있다. 또한, 이들 장치는 세포 현탁액, 생리식염수 등을 흘려보내는 펌프와 조합함으로써 세포 분리 시스템으로서 이용성을 높일 수 있다.
항체를 수불용성 담체에 고정화시킬 때, 항체와 수불용성 담체 사이에 스페이서를 개재하여 결합시키는 것도 유용하다. 또한, 필요에 따라 수불용성 담체와 화합물을 임의의 길이의 분자 (스페이서)를 통해 서로 결합시킬 수도 있다. 스페이 서에 관한 상세한 내용은 예를 들면, 문헌["Affinity Chromatography" K. Kasai등, Tokyo Kagaku Dojin Publishing (1991) p.105-108]를 참조할 수 있다. 스페이서의 예로서는 폴리메틸렌 사슬과 폴리에틸렌글리콜 사슬 등을 들 수 있다. 스페이서의 길이는 500Å 이하인 것이 바람직하고, 200Å 이하인 것이 더 바람직하다. 화합물을 스페이서를 통해 수불용성 담체에 결합시키는 방법으로서는 예를 들면 수불용성 담체로서 아가로스를 사용하는 경우, 아가로스의 히드록실기와 스페이서로서 사용하는 헥사메틸렌 디이소시아네이트의 한쪽 이소시아네이트기를 반응시켜 결합시키고, 남은 이소시아네이트기와 항체의 아미노기, 히드록실기 또는 카르복실기 등을 반응시켜 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 말하는 수불용성 담체는 실온의 수용액 중에서 고형 상태인 것을 말하며 어떠한 형상이어도 좋다. 형상의 예로는 구형, 입방형, 평면형, 칩형, 섬유형, 평막형, 스폰지형, 중공사형 등을 들 수 있다. 이들 중에서 세밀한 충전이 쉽고, 항체를 표면에 비교적 균질하게 유지시킬 수 있고, 실유효 면적을 비교적 많이 확보할 수 있으며 세포 현탁액의 유동성의 면에서 구형, 입자형 및 섬유형의 것이 바람직하다.
수불용성 담체의 재질은 표면에 항체를 유지할 수 있으면 무기 화합물이거나 유기 화합물이거나 상관없지만, 세포 현탁액과 접촉시 용출물이 적고, 형상 제어가 보다 쉽다는 점에서 유기 고분자 화합물이 바람직하다. 그 예로는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트 에스테르, 폴리아크릴레이트 에스테르, 폴리아크릴산, 폴리비닐알코올 등의 비닐계 화합물 또는 그의 유도체의 중합체 및 공중합 체; 나일론 6 또는 나일론 66 등의 폴리아미드계 화합물; 폴리에틸렌 테레프탈레이트 등의 폴리에스테르계 화합물; 셀룰로오스 등의 식물 유래 다당류계 화합물 등을 들 수 있다. 또한, 이들과 자석을 조합함으로써 이들 수불용성 담체를 쉽게 회수할 수도 있다.
수불용성 담체를 수식하고 표면에 친수성을 부여하는 것도 본 발명에서 바람직하게 이용된다. 알부민, 글로브린 등의 생체 유래 단백질을 고정화시키고, 합성 관능기를 도입함으로써 수불용성 담체 표면에 친수성을 부여할 수 있다. 친수성을 부여하는 합성 관능기의 예로는 반복 단위 2 내지 1500의 폴리에틸렌글리콜 사슬, 히드록실기, 아미드기, 에테르기 및 에스테르기를 포함한다. 단, 폴리에틸렌글리콜 사슬과 히드록실기는 서로 결합할 수 있거나 별도로 존재할 수 있다. 친수성을 부여하는 폴리에틸렌글리콜 사슬을 갖는 단량체의 예로는 메톡시디에틸렌글리콜 메타크릴레이트, 메톡시트리에틸렌글리콜 메타크릴레이트 등의 말단 메톡시메타크릴레이트; 메톡시디에틸렌글리콜 아크릴레이트, 메톡시트리에틸렌글리콜 아크릴레이트 등의 말단 메톡시아크릴레이트; 및 메틸기 대신 수소 원자가 결합된 말단 히드록실기를 갖는 메타크릴레이트 및 아크릴레이트; 또는 말단에 중합성 관능기를 1개 이상 갖는 반복 단위 2 내지 1500의 폴리에틸렌글리콜 사슬을 갖는 단량체 전반을 들 수 있다. 또한, 담체에 직접 결합시키는 경우, 반복 단위 2 내지 1500의 폴리에틸렌글리콜 유도체도 포함된다. 친수성을 부여하는 그 밖의 다른 치환기를 갖는 단량체의 예로는 비닐피롤리돈 등을 들 수 있지만 이것으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 중합성 관능기가 1개 이상 존재할 수도 있다. 중합성 관능기는 단독 또는 2개 이상의 관능기에 의해 중합할 수 있는 관능기를 나타내며, 그 예로는 비닐기, 아세틸렌기, 디엔기 등의 탄소-탄소 다중 결합과 에폭시기, 옥세탄기 등의 환 구조 등을 들 수 있지만 이것으로 한정되는 것은 아니다.
또한, 비이온성 관능기가 상기 관능기와 함께 존재할 수도 있으며, 그 예로는 비이온성 관능기, 특히 친수성 향상을 목적으로 한 디메틸아미드기, 디에틸아미드기, 디이소프로필아미드기 등의 아미드기; 폴리에틸렌 테레프탈레이트 사슬, 폴리부틸렌 테레프탈레이트 사슬 등의 방향족 폴리에스테르 사슬 및 지방족 폴리에스테르 사슬 등의 폴리에스테르 사슬; 메틸렌글리콜 사슬 및 프로필렌글리콜 사슬과 같은 폴리에테르 사슬; 폴리카르보네이트 사슬 등의 비이온성 친수성 관능기, 또는 소수성 부여를 목적으로 한 알킬 사슬, 불화알킬 사슬, 알릴 사슬 등의 비이온성 관능기 전반을 포함한다. 이상의 임의의 관능기가 공존할 수도 있지만, 바람직하게는 비이온성 친수성 관능기를 갖는 경우가 우수한 결과를 제공한다.
수불용성 담체를 수식하고 그 표면에 친수성을 부여하는 방법으로는 공유 결합, 이온 결합, 방사선 또는 플라즈마에 의한 그래프트법; 물리 흡착; 임베딩 (embedding); 또는 기재 표면으로의 침전물의 불용화 등 모든 공지된 방법을 사용할 수 있다. 따라서, 방사선 또는 플라즈마 등을 사용하여 고분자 화합물 또는 그 단량체를 그래프트 중합시키거나 또는 공유 결합을 형성하는 등의 공지된 방법에 의해 표면 개질 (일본 특허 공개(평)1-249063호 공보, 일본 특허 공개(평)3-502094호 공보)을 수행하는 방법이 본 발명에 바람직하게 이용된다.
수불용성 담체의 표면에 항체를 고정화시키는 방법으로는 수불용성 담체 표 면에 항체를 화학적 수단이나 방사선 또는 전자선을 이용한 그래프트법에 의해 공유 결합시키는 방법, 또는 화학적 수단에 의해 수불용성 담체의 표면 상의 관능기를 통해 공유 결합시키는 방법 등이 있다. 이 중에서 관능기를 통한 공유 결합 방법이 사용시 항체 용출의 위험이 없어 바람직하다. 수불용성 담체가 피복층을 갖는 경우, 항체를 피복층 표면 상에 불용화시킬 수도 있다.
수불용성 담체 또는 그의 피복층의 표면에 항체 고정화를 위한 활성기를 얻는 방법의 일례로서 할로겐화 시안법, 에피클로로히드린법, 비스에폭시드법, 브로모아세틸브로마이드법, 할로겐화 아세트아미드법 등이 있다. 구체적으로는 아미노기, 카르복실기, 히드록실기, 티올기, 산무수화물, 숙시닐아미드기, 치환성 할로겐기, 알데히드기, 에폭시기, 트리실기 등을 들 수 있다. 항체 고정화의 용이성의 면에서 브로모시안법, N-히드로숙신이미드기법, 할로겐화 아세트아미드법이 특히 바람직하다.
활성기에 사용되는 할로아세트아미노메틸화제로서는 N-히드록시메틸클로로아세트아미드, N-히드록시메틸플루오로아세트아미드, N-히드록시메틸브로모아세트아미드, N-히드록시메틸요오도아세트아미드 등을 유리하게 사용할 수 있다. 이 중에서도 경제성과 안정성의 면에서 바람직하게는 N-히드록시메틸브로모아세트아미드, N-히드록시메틸요오도아세트아미드 등을 유리하게 사용할 수 있다. 수불용성 담체에 도입된 플루오로기 또는 클로로기는 활성기를 도입시킨 후, 요오드화칼륨 또는 브롬화칼륨 용액으로 처리함으로써 쉽게 요오드기 또는 브롬기로 전환시킬 수 있다. 이들 활성기를 도입시킨 수불용성 담체의 제조에 사용되는 산 촉매로는 강산 특히 프로톤산이면 어떤 것도 좋지만, 비제한적인 예로는 트리플루오로메탄, 메탄, 벤젠, 톨루엔 등의 술폰산 유도체; 및 황산, 염화아연, 염화알루미늄, 사염화주석 등의 프리델-크래프츠(Friedel-Crafts) 촉매 등을 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 제 3의 태양은 항-TM4SF1 항체를 이용한 중간엽줄기세포 분리 동정 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 항-TM4SF1 항체를 시료 세포와 접촉시키는 단계; 상기 시료 세포의 TM4SF1와 상기 항-TM4SF1 항체의 항원-항체 복합체 형성을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽줄기세포를 동정 방법을 제공한다.
상기 항원-항체 복합체 형성을 확인하는 방법은 항원항체반응을 이용한 면역학적 측정법(이뮤노어세이(immunoassay))이 있다. 이뮤노어세이 중, 가장 일반적인 측정방법은, 효소 면역측정법(ELISA)이다. 상기 ELISA법으로서는, 라디오이뮤노어세이(radioimmunoassay)(RIA), 형광 이뮤노어세이(FIA), 엔자임 이뮤노어세이(enzyme immunoassay)(EIA, ELISA), 색체입자결합법 및 화학발광물질결합법 등이 알려져 있다.
또한 본 발명은 중간엽줄기세포가 들어 있는 액체 생물학적 배지를 항-TM4SF1 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 항원-항체 복합체를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽줄기세포를 분리 정제하는 방법을 제공한다. 상기 항원-항체 복합체 회수하는 단계는 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 리간드를 이용하여 회수할 수도 있고, 자기 비드와 자기 장치를 이용하여 회수할 수도 있다.
항체를 이용하여 중간엽줄기세포만을 특이적으로 분리시키는 방법으로는 형광 항체로 표식하여 세포 분리기(cell sorter)로 분리하는 방법, 수불용성 담체 상에 중간엽줄기세포에 특이적인 TM4SF1에 친화성이 있는 항-TM4SF1 항체를 고정화시키고 여기에 중간엽줄기세포를 직접 또는 간접적으로 결합시키는 방법, 면역 흡착 칼럼에 의한 분리방법 및 면역 자기 비드를 이용하는 분리방법 등이 있다.
형광 항체로 표식한 세포의 분리법은 먼저 세포 혼합액을 표적 세포 상에 발현되는 막 항원을 인식하는 형광 표식된 모노클론 항체와 함께 배양한 후 처리된 세포에 세포 분리기(cell sorter) 등으로 레이저광을 조사하여, 항체가 결합된 세포만 발광하는 것을 이용하여 형광 항체가 결합된 세포를 분리하는 방법이다.
수불용성 담체 상에 단일클론 항체를 고정화시키는 방법은 담체 또는 장치에 고정화시킨 모노클론 항체에 대해 상기 항원 양성 세포가 직접 또는 간접적으로 결합하여 수행되는 세포 분리 방법이다.
국제 특허공개공보 W0 87-04628호에는 표적 세포의 막 표면에 존재하는 항원에 대한 모노클론 항체를 분리 장치의 표면에 직접 고정화시켜 이용하는 방법과, 먼저 세포 혼합액을 표적 세포 상의 막 항원에 결합하는 모노클론 항체와 함께 배 양한 후, 세포 표면상의 항체에 결합하는 항-면역글로불린 항체와 같은 리간드를 고정화시킨 세포 분리 장치에서 처리하는 방법이 기재되어 있다. 이들 방법에서는 항체를 고정화시킨 플라스틱 샬레 상에서 분리가 일어나며, 세포 혼합액을 최초 항체를 고정화시킨 플라스틱 샬레 상에 붓고, 항체를 표적 세포 상의 막 항원과 결합시키기 위해 배양시킨다. 배양 후, 플라스틱 샬레를 세정하여 결합하지 않은 세포를 제거하여 분리시킨다.
면역흡착 칼럼법은 표적 세포 상의 막 항원에 대한 항체 등의 리간드를 비드 표면에 고정화시키고, 이것을 칼럼에 충전시켜 여기에서 세포 분리를 수행하는 것이다.
국제 특허 공개 공보 제W0 91-16116호에는 표적 세포 상의 막 항원에 대해 바이오틴 표식한 항체를 세포 혼합액 중에 첨가하여 배양함으로써 세포-항체-바이오틴 결합을 형성한 후, 다공질 아크릴아미드 겔에 아비딘을 고정화시킨 비드를 충전시킨 칼럼을 통해 통과시킴으로써, 바이오틴-아비딘의 강한 결합을 이용하여 표적 세포를 칼럼 내에 결합시켜 분리하는 방법이 기재되어 있다.
면역 자기 비드법에서는 먼저 세포 혼합액을 항체가 결합된 자기 비드와 함께 배양하여 표적 세포를 자기 비드로 표식시킨다. 표식시킨 후, 자기 장치를 이용하여 표식되지 않은 세포로부터 표식된 세포를 분리한다.
예를 들면, 바이오틴 또는 자기 비드를 미리 세포에 고정화시킬 항체에 결합 시킨 후, 바이오틴 또는 자기 비드에 결합하기 쉬운 물질, 예를 들면 아비딘 또는 자석에 결합하거나 이를 포함하는 수불용성 담체를 반응시킴으로써 세포가 결합된 수불용성 담체를 쉽게 회수할 수 있다. 또한, 표적 조혈 미분화 세포에 TM4SF1 항체를 반응시킨 후, 항-면역글로불린 항체가 결합된 수불용성 담체와 반응시키고 수불용성 담체를 세정하거나 회수함으로써, 표적 세포만을 선택적으로 분리할 수 있다. 수불용성 담체인 자기 비드에 고정화시킨 항체를 이용하면, 자석 등에 의해 보다 효율적으로 분리할 수도 있다. 본 발명에 사용되는 용기 형상으로는 수불용성 담체를 충전한 칼럼, 수불용성 담체를 충전한 플라스크형 또는 플라스크형 케이스가 예시된다. 이러한 용기 형상과 항체를 직접 또는 간접적으로 고정화시킨 불용성 담체를 조합함으로써 조혈 미분화 세포 분리 장치를 제작할 수 있다. 또한, 이들 장치는 세포 현탁액, 생리식염수 등을 흘려보내는 펌프와 조합함으로써 세포 분리 시스템으로서 이용성을 높일 수 있다.
< 실험예 1> TM4SF1 단백질을 이용한 중간엽줄기세포(MSCs)의 분리 및 동정
1. 실험재료 및 방법
(1) 세포준비
냉동보존된 인체 골수(BM)-유래 단핵세포들(MNCs), 골수(BM)-유래 MSCs, 및 지방 조직(adipose tissue, AT)-유래 MSCs를 Lonza Inc.(Allendale, NJ)에서 구입하였다. 제대혈(umbilical cord blood, UCB)-유래 MNCs 및 MSCs 뿐만 아니라, 냉동보존된 AT-유래 SVF(stromal vascular fraction)시료들을 지역 회사들로부터 입수 하였다. 항-TM4SF1 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma) 세포주(L6-20-4)는 스티브 R. 로플러 교수(National Taiwan University Hospital, Taipei, Taiwan)로부터 얻었다.
(2) 유세포 분석
모든 분석은 이전에 만들어진 MSC 마커들에 대한 마우스 모노클론(monoclonal) 항체(표 3) 및 Alexa488-결합 염소 항-마우스 IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 가지고 Guava PCA-96 유세포분석기(flow cytometer) (Guava Technologies, Hayward, CA)로 수행하였다. 모든 측정들은 Guava Express 소프트웨어 및 De novo 소프트웨어 (Thornhill, ON, Canada)로 분석하였다.
(3) 역전사-PCR (reverse transcriptase-PCR, RT-PCR) 분석
인체 복합조직 cDNA (MTC) 패널(panel)들을 Clontech Laboratories Inc.(Mountain View, CA)로부터 구했다. 트리졸(Trizol) 시약을 이용하여 다른 세포 시료들로부터 총 RNA를 추출한 후 역전사시켜 cDNA를 만들었다. 사용한 프라이머는 표 1에 기재되어 있다.
RT-PCR 분석에 사용된 프라이머 및 반응조건
유전자 서열 생성물 크기(bp) 어닐링 온도(℃)
TM4SF1 F5'-CCTAGCAGACCACCA-3' (서열번호 2)
R5'-GTCCTGGGTTGGTTCT-3' (서열번호 3)		 640 57
BSP F5'-GCACGCCTACTTCTATCCTC-3' (서열번호 4)
R5'-CGGCCTCGGAGTCTT-3' (서열번호 5)		 185 59
RUNX2 F5'-ACTGGGCCCTTTTTCAGA-3' (서열번호 6)
R5'-GCGGAAGCATTCTGGAA-3' (서열번호 7)		 317 54
aP2 F5'-GGCCAAACCCAACCTGA-3' (서열번호 8)
R5'-GGGCGCCTCCATCTAAG-3' (서열번호 9)		 167 57
PPAR -γ2 F5'-GCTGTTATGGGTGAAACTCTG-3' (서열번호 10)
R5'-ATAAGGTGGAGATGCAGGTTC-3' (서열번호 11)		 350 62
COLX F5'-GCCCAAGAGGTGCCCCTGGAATAC-3'(서열번호 12)
R5'-CCTGAGAAAGAGGAGTGGACATAC-3'(서열번호 13)		 703 57
SOX9 F5'-AGACAGCCCCCTATCGACTTC-3' (서열번호 14)
R5'-TGCTGCTTGGACATCCACAC-3' (서열번호 15)		 230 63
ACTB F5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3' (서열번호 16)
R5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3' (서열번호 17)		 435 57
BSP , bone sialoprotein ; RUNX2 , runt - related transcription factor 2; aP2 , adipocyte fatty acid binding protein ; PPAR -γ2, peroxisome proliferator -activated receptor γ2; COLX , collagen X; SOX9 , Sry - box 9; ACTB , β- actin .
(4) 오믹스(Omics) 데이터 처리
191개의 엑토도메인-포함(ectodomain-containing) 막 결합 단백질들로 구성된 MSCs의 막 단백질체(membrane proteome) 데이터(Jeong et al, 2007b)를 MSCs의 두 개의 차별적 전사체 데이터세트(differential transcriptome dataset) (Jeong et al, 2007a; Bae et al, 2009)에 통합시킨 후, 두 전사체 데이터세트 중 어느 하나에서 유전자 발현 값이 존재하지 않는 단백질들을 제거함으로써 148개의 서로 다른 단백질들로 감축시켰다(표 2).
Figure 112009069929378-pat00001
Figure 112009069929378-pat00002
Figure 112009069929378-pat00003
Figure 112009069929378-pat00004
(5) 면역선택(Immunoselection)
하이브리도마(hybridoma) 배양액의 상층액으로부터 정제한 약 0.5㎍의 L6-20-4 모노클론(monoclonal) 항체들을 25㎖ (1 × 107)의 Dynabeads Pan mouse IgG (Dynal Biotech, Oslo, Norway)와 함께 30분간 배양시켰다. 과량의 항체를 제거한 뒤, 코팅된 비드(bead)들을 2.5 × 107의 녹인 BM-유래 MNCs 와 섞고, 4℃에서 20분간 배양하였다. 세포들은 Cell Stalker (Biterials Co., Korea) 로 오버나잇(overnight) 배양하였다.
(6) 시험관내 분화(differentiation) 측정
TM4SF1+ 세포들을 시험관 내에서 2nd passage 까지 팽창시키고 mesenchymal differentiation media(Lonza Inc.)에서 배양하였다. 상기 세포들이 조골세포(osteoblast), 연골모세포(chondroblast) 및 지방아세포(adipoblast) 리니지로 분화되는 것을 각각 von Kossa, Oil Red O, 및 Alcian Blue 염색으로 측정하였다.
(7) 생체내 조골세포생성 분화 측정
0.4 ㎛의 pore size를 갖는 트랜스웰 인서트(transwell insert) (Corning Inc, Corning, MA)에 약 1 × 104 의 세포들을 뿌려준 후, 파라필름(parafilm)으로 봉하고, 누드마우스에서 3주간 피하이식하였다. 상기 인서트를 수집한 뒤, 그것의 막을 분리하고 von Kossa 법으로 염색하였다.
2. 결과
본 발명자는 우선 MSCs 와 섬유아세포(fibroblast) 사이에서 기 설정된 MSC 마커들의 발현 패턴을 비교하였다(표 3).
Figure 112009069929378-pat00005
유세포분석(flow cytometry analysis)은 MSCs가 CD105, CD73, CD166, CD63, SSEA-4, GD2 및 FAPα 에 대해 강하게 양성이며, CD49a 및 CD146(도 1A)에 대해서는 약하게 양성이라는 것을 보여주었다. 이에 따라, 상기 마커들을 개별적으로 또는 조합하여 MSCs의 양성 검출을 위한 표면 마커들로 사용할 수 있음이 확인되었다. 하지만, 상기 마커들 대부분은 피부 섬유아세포에서도 발현됨을 관찰하였고, 대개는 MSCs 상에 있는 것과 비교할만한 수준으로 피부 섬유아세포에서도 발현되었다. 이것은 상기 마커들이 MSCs와 섬유아세포들을 명확하게 구별하지 못한다는 것을 나타낸다. 예외적으로 GD2는 섬유아세포와 비교하여 MSCs에서 선택적으로 발현되는 것으로 보이나, MSCs 상의 분산되고 균일하지 않은 패턴(Martinez et al, 2007)으로 인해 기초 및 임상 연구에서 그 이용에 한계가 있다.
따라서, 다른 혈액 세포들 뿐만 아니라 섬유아세포로부터 신뢰할 수 있는 수준으로 MSCs를 구별해 낼 수 있는 신규한 표면 마커들이 MSCs의 안전하고 효과적인 임상 적용에 실질적인 가치를 갖는다. 상기와 같이 이중 식별 표면 마커들을 찾기 위하여, 본 발명자들은 조합된 오믹스(omics) 접근을 생각하였다. 이에 따라, MSCs의 막 단백질체(membrane proteome) 데이터(Jeong et al, 2007b)를 MSCs의 두 구별되는 전사체(transcriptome) 데이터 세트, 즉 하나는 BM-유래 MNCs에 대한 것이고(Jeong et al, 2007a) 다른 하나는 섬유아세포에 대한(Bae et al, 2009) 것, 에 통합시키고, MNCs 및 섬유아세포들에 대한 MSCs에서의 유전자 발현 강도 비율을 지도화할 수 있는 일련의 막 단백질들로 감축시켰다(표 2). 상기 조합된 데이터의 2D 스캐터 플롯 분석(scatter plot analysis)에 따르면, TM4SF1, H-L6, L6, M3S1 또는 TAAL6으로 널리 알려진 테트라스패닌(tetraspanin)-패밀리 단백질 유전자 발현이 MNCs 및 섬유아세포들에 비하여 MSC에서 특이적으로 10배 이상의 수준으로 상향조절되는 것으로 관찰되었기 때문에, 상기 단백질은 MSCs를 MNCs 및 섬유아세포로부터 동시에 구별할 수 있는 선도적인 표면 마커 후보로 볼 수 있다(도 1B).
이러한 결과들을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 유전자 및 단백질 수준 모두에서 골수(BM) 유래 MSCs, MNCs 및 섬유아세포 사이에서 TM4SF1의 발현을 비교하였다. RT-PCR에 이은 유세포분석을 통해 TM4SF1이 MSCs에서는 많이 발현되지만, MNCs 나 섬유아세포에서는 그렇지 않음을 보였고(도 1C 및 1D), 이는 TM4SF1 발현이 BM 조직 내에서, 심지어 섬유아세포가 혼합된 조건에서도, MSCs에서만 일어날 수 있다는 것을 나타낸다. 마찬가지로, MSCs의 두 가지 다른 중요한 소스인 제대혈(UCB) 및 지방조직(AT)에서도 TM4SF1이 MSC 타입에서만 특이적으로 발현되는 것으로 보인다. 왜냐하면 UCB 및 AT로부터 유래된 MSCs 내에서는 TM4SF1 발현이 높은 수준으로 나타났지만, 상기 조직에서 본래 그렇지는 않기 때문이다(도 1E). 그 후 사람 MTC(multiple tissue cDNA) 패널의 PCR 스크리닝을 통해 주요 신체 조직들에서의 TM4SF1 발현을 조사하였다. 그 결과 TM4SF1이 주변 혈액 분획(도 2F) 및 주요 조직들(도 2G) 모두에서 유의한 수준으로 발현되지 않았다. 이러한 결과들은, 일부 암세포에서 종종 상향조절되기는 하지만(Marken et al, 2002), TM4SF1 발현이 대부분의 정상 조직들에서는 매우 낮은 수준으로 억제된다는 것을 보여주며, 이는 이전의 연구결과와 일치한다(Marken et al, 2004). 따라서, TM4SF1은 섬유아세포가 많은 결합조직을 포함하여 대부분의 조직들로부터 MSCs를 특이적으로 식별할 수 있는 표면 단백질 마커로 사용될 수 있을 것이다.
다음으로 본 발명자들은 TM4SF1을 표적으로 하는 항체로 한 면역선택(immunoselection)이 잠재적으로 섬유아세포가 풍부한 소스 중 하나인 SVF 시료로부터 MSCs를 분리하는데 이용될 수 있는지 여부를 조사하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 종래 개발되었던 항-TM4SF1 모노클론(monoclonal) 항체인 L6-20-4 항체를 사용하였다(Marken et al, 2004). 이것은 본 발명자들이 TM4SF1+ MSCs 및 TM4SF1- 섬유아세포의 세포 혼합물에 대해 앞서 수행한 실험에서 TM4SF1의 엑토도메인(ectodomain)에 대해 높은 특이성 및 친화성을 갖는 것으로 입증됐다(도 3). SVF 시료 상에서 TM4SF1 면역선택을 수행한 결과, 부착성(adherent) TM4SF1+ 세포들은 약 SVF 세포당 1개의 빈도로 분리되었다. 상기 분리된 TM4SF1+ 세포들은 빠르게 성장하였고, 균일한 섬유아세포 형태를 보였다(도 2A). TM4SF1- 쪽 역시 부착성 세포군집을 함유하였지만, 형태는 불균일하게 보였다(도 2B). 놀랍게도 TM4SF1+ 및 TM4SF1- 세포들 모두 CD63, CD73, CD90, CD105 및 CD166에 대해 유사한 표면 발현 패턴을 보였다(도 2C).
TM4SF1+ 및 TM4SF1- 세포들의 특성을 더 알아보기 위하여, 본 발명자들은 그것들을 중간엽줄기세포 분화 조건에서 독립적으로 배양하였다. 세포화학적 염색(cytochemical staining) 및 RT-PCR 분석을 통해 TM4SF1+ 세포들은 조골세포(osteoblast), 지방아세포(adipoblast) 및 연골모세포(chondroblast)로 쉽게 분화할 수 있으나, TM4SF1- 세포들은 그렇지 않다는 것을 보였다(도 2D-2I). 추가로, 생체내 이소성 골형성(in vivo ectopic bone formation) 어세이 역시 TM4SF1+ 세포들이 조골형성 리니지(osteogenic lineage)를 따라 분화가 유도될 수 있다는 것을 보여준다(도 2J). 상기 두 세포 군집들간 분화잠재력의 명백한 차이는 MSCs 및 섬유아세포 사이에서 관찰된 것을 연상케하며(Bae et al, 2009), 이는 TM4SF1+ 세포들이 균일한 MSC 군집을 대표하는 반면, TM4SF1- 세포들은 섬유아세포를 포함한 불균일 세포 군집들로 구성되었을 것이라는 점을 시사한다. 따라서 TM4SF1을 이용하여 전형적인 세포 소스들뿐 아니라 섬유아세포가 풍부한 결합조직으로부터도 MSCs의 동정 및 분리를 용이하게 할 수 있다.
도 1은 신규한 MSC 특이적 표면 마커인 TM4SF1의 동정을 나타낸다. (A) 기 설정된 MSC 마커들에 대한 MSCs(shaded profiles) 및 섬유아세포(open profiles) 사이의 표면 형질의 비교. 양 세포 군집들 모두 5th passage로 확장되었고, 상기 마커들에 대한 마우스 모노클론 항체들 및 Alexa488-연결 2차 항체와 함께 배양하였다. 대조군은 2차 항체로만 염색된 세포들로부터 얻었다. GD2를 제외한, 모든 MSC 마커들이 섬유아세포에 대해서도 활성이 있음을 주목할 필요가 있다. (B) 막 단백질체가 두 개의 차별적(differential) MSCs 전사체, 즉 MNCs에 대한 것과 섬유아세포에 대한 것, 에 통합된 조합된 오믹스(omics) 데이터의 2D 스캐터 플롯 분석. 각각의 검은 점은 섬유아세포 및 MNCs에 대한 MSC에서의 유전자 발현율이 각각 x 및 y축에 로그 단위로 표시된 막관통 단백질을 나타낸다. 양쪽 모두에서 좌표값이 10 이상인 단백질이 하나(TM4SF1)뿐이라는 것을 주목할 필요가 있다. (C) 골수 유래 MNCs 및 섬유아세포에 대한 MSCs에서의 TM4SF1의 선택적 발현을 보여주는 RT-PCR 분석결과. (D) TM4SF1이 BM 유래 MSCs에서 강하게 발현되지만(진한 음영부분), MNCs(약한 음영부분) 및 섬유아세포(열린 부분)에서는 그렇지 않다는 것을 보여주는 상대적 유세포분석. (E) UCB 및AT 유래 MSCs가 BM 유래 MSCs 와 유사한 수준으로 TM4SF1 을 발현할 수 있다는 것을 보여주는 RT-PCR 분석. (F-G) 사람 혈액 및 주요 장기 내에서의 TM4SF1의 비발현(또는 무시할만한 수준의 발현)을 보여주는 MTC 패널 스크리닝. 폐 및 이자 조직들에서는, 항체-기반 단백질체 프로파일링 데 이터(www.proteinatlas.org)와 일치하게, 검출될만한 수준으로 TM4SF1의 발현이 관찰되나, MSCs에서와 비교하면 매우 낮은 수준이다.
도 2는 AT 유래 SVF 세포들로부터 면역선택된 TM4SF1+ 및 TM4SF1- 세포들 사이의 형태(morphology), 면역형질(immunophenotype) 및 세포분화능(mesengenic differentiation potential)의 상대적 분석을 보여준다. (A) TM4SF1+ 부착 세포들의 현미경 사진(배율 40X). (B) TM4SF1- 부착 세포들의 이미지들. (C) TM4SF1+ (close)및 TM4SF1- (open) 사이의 면역형질적 유사성을 보여주는 유세포분석. 2차 항체로만 염색된 세포들을 음성 대조군으로 사용하였다. (D-I) 시험관내 분화세포들의 상대적 세포화학적 염색 및 RT-PCR 분석. TM4SF1+ 및 TM4SF1- 는 각각 분리시켜 배양하였고, 각각 (D,E) 조골세포, (F, G) 지방아세포 및 (H, I) 연골모세포 분화조건에서 배양시켰으며, 각각 (E) 뼈 관련 BSP 및 RUNX2 유전자들, (G) 지방 관련 aP2 및 PPAR-γ2 유전자들, 및 (I) 연골 관련 COLX 및 SOX9 유전자들의 RT-PCR 분석뿐 아니라, (D) 본 코사(Von Kossa), (F) 오일 레드 O 및 (H) 알리자린(Alizarin) 레드 염색으로 분화능을 측정하였다. (G) 생체 내 조골세포 분화 측정. 세포들을 트랜스웰 인서트(transwell inserts)에 로딩하고 봉한 후, 누드마우스에 피하이식하였다. 3주 후에, 인서트의 막들을 본 코사법으로 염색하였다.
도 3은 형광표지된 MSCs 및 미표지된 섬유아세포의 세포혼합물로부터 MSCs의 면역선택을 위한 항-TM4SF1 항체 L6-20-4의 이용가능성을 시험한 것이다. 형광 세포 표지를 위해, MSCs를 0.2㎎/㎖ 의 Cell StalkerTM (Biterials Co., Korea)를 포함하는 배지에서 오버나잇(overnight) 배양하였다. 형광-표지된 MSCs(A)를 세척 및 트립시나이제이션(trypsinization)시키고, 같은 수의 표지되지 않은 섬유아세포(B)와 혼합하였다. Dynalbeads Pan 마우스 IgG 및 L6-20-4 항체들로 각각 배양한 후에, 자성분류(magnet sorting)를 이용해 상기 세포 혼합물을 TM4SF1+ 및 TM4SF1- 로 분리하였다. 유세포분석은 TM4SF1+ 부분(C)이 대부분의 형광 MSCs를 포함하는 반면, TM4SF1- 부분(D)은 주로 표지되지 않은 섬유아세포로 이루어졌다는 것을 보여주었다. 이것은 TM4SF1+ MSCs를 TM4SF1- 섬유아세포로부터 면역선택하는데 있어 L6-20-4 항체가 충분히 이용가능성을 갖고 있다는 것을 보여준다.
<110> Genexel-Sein Inc. <120> Method for identification of mesenchymal stem cells using anti-TM4SF1 antibody and composition for it. <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 202 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Cys Tyr Gly Lys Cys Ala Arg Cys Ile Gly His Ser Leu Val Gly 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Cys Ile Ala Ala Asn Ile Leu Leu Tyr Phe Pro Asn 20 25 30 Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Ser Glu Asn His Leu Ser Arg Phe Val Trp 35 40 45 Phe Phe Ser Gly Ile Val Gly Gly Gly Leu Leu Met Leu Leu Pro Ala 50 55 60 Phe Val Phe Ile Gly Leu Glu Gln Asp Asp Cys Cys Gly Cys Cys Gly 65 70 75 80 His Glu Asn Cys Gly Lys Arg Cys Ala Met Leu Ser Ser Val Leu Ala 85 90 95 Ala Leu Ile Gly Ile Ala Gly Ser Gly Tyr Cys Val Ile Val Ala Ala 100 105 110 Leu Gly Leu Ala Glu Gly Pro Leu Cys Leu Asp Ser Leu Gly Gln Trp 115 120 125 Asn Tyr Thr Phe Ala Ser Thr Glu Gly Gln Tyr Leu Leu Asp Thr Ser 130 135 140 Thr Trp Ser Glu Cys Thr Glu Pro Lys His Ile Val Glu Trp Asn Val 145 150 155 160 Ser Leu Phe Ser Ile Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ile Glu Phe Ile Leu 165 170 175 Cys Leu Ile Gln Val Ile Asn Gly Val Leu Gly Gly Ile Cys Gly Phe 180 185 190 Cys Cys Ser His Gln Gln Gln Tyr Asp Cys 195 200 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM4SF1 F <400> 2 cctagcagac cacca 15 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM4SF1 R <400> 3 gtcctgggtt ggttct 16 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP F <400> 4 gcacgcctac ttctatcctc 20 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP R <400> 5 cggcctcgga gtctt 15 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RUNX2 F <400> 6 actgggccct ttttcaga 18 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RUNX2 R <400> 7 gcggaagcat tctggaa 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2 F <400> 8 ggccaaaccc aacctga 17 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2 R <400> 9 gggcgcctcc atctaag 17 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR F <400> 10 gctgttatgg gtgaaactct g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR R <400> 11 ataaggtgga gatgcaggtt c 21 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COLX F <400> 12 gcccaagagg tgcccctgga atac 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COLX R <400> 13 cctgagaaag aggagtggac atac 24 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 F <400> 14 agacagcccc ctatcgactt c 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 R <400> 15 tgctgcttgg acatccacac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB F <400> 16 agaaaatctg gcaccacacc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB <400> 17 ccatctcttg ctcgaagtcc 20

Claims (7)

  1. 골수세포, 말초혈액, 탯줄혈액, 지방세포로부터 중간엽줄기세포를 분리 또는 동정하기 위한 항-TM4SF1 항체를 포함하는 중간엽줄기세포 분리 또는 동정용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 섬유아세포로부터 중간엽줄기세포 분리 또는 동정할 수 있는 것을 특징으로 하는 중간엽줄기세포 분리 또는 동정용 조성물.
  3. 골수세포, 말초혈액, 탯줄혈액 및 지방세포로부터 중간엽줄기세포를 분리 또는 동정하는 것을 특징으로 하는 표지된 항-TM4SF1 항체를 포함하는 키트.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 항체가 섬유아세포로부터 중간엽줄기세포를 분리 또는 동정하는 것을 특징으로 하는 표지된 항-TM4SF1 항체를 포함하는 키트.
  5. (a) 시료 세포를 항-TM4SF1 항체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항-TM4SF1 항체와 상기 세포의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 골수세포, 말초혈액, 탯줄혈액 및 지방세포로부터 중간엽줄기세포 동정 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 항-TM4SF1 항체와 세포의 결합 여부를 확인하는 단계는 이뮤노어세이(immunoassay)를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. (a) 중간엽줄기세포가 포함된 배지를 항-TM4SF1 항체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 중간엽줄기세포 및 항-TM4SF1 항체의 복합체를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 골수세포, 말초혈액, 탯줄혈액 및 지방세포로부터 중간엽줄기세포 분리방법.
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