JP7454379B2 - 接着性幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物 - Google Patents
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Description
(1) 接着性幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
前記細胞集団において、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上である細胞集団を取得することを含む、製造方法。
(2) 接着性幹細胞を含む細胞集団であって、
前記細胞集団において、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上である、細胞集団。
(3) 前記細胞集団が、SDHA遺伝子の発現量に対するKCNAB1遺伝子の相対発現量が0.05以上である、(2)に記載の細胞集団。
(4) 前記細胞集団が、SDHA遺伝子の発現量に対するSULT1E1遺伝子の相対発現量が0.1以上である、(2)又は(3)に記載の細胞集団。
(5) 前記細胞集団が、SDHA遺伝子の発現量に対するMN1遺伝子の相対発現量が0.7以上である、(2)から(4)の何れか一に記載の細胞集団。
(6) 前記細胞集団が、SDHA遺伝子の発現量に対するRARRES2遺伝子の相対発現量が0.4以下である、(2)から(5)の何れか一に記載の細胞集団。
(7) 前記接着性幹細胞が、胎児付属物に由来するものである、(2)から(6)の何れか一に記載の細胞集団。
(9) (2)から(7)の何れか一に記載の細胞集団と、投与可能な他の細胞とを含む、医薬組成物。
(10) ヒトへの接着性幹細胞の1回の用量が1012個/kg体重以下である、(8)又は(9)に記載の医薬組成物。
(11) 前記医薬組成物が、注射用製剤である、(8)から(10)の何れか一に記載の医薬組成物。
(12) 前記医薬組成物が、移植用製剤である、(8)から(10)の何れか一に記載の医薬組成物。
(13) 前記移植用製剤が細胞塊又はシート状構造である、(12)に記載の医薬組成物。
(14) 免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び/又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤である、(8)から(13)の何れか一に記載の医薬組成物。
KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるKCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上であることを指標として接着性幹細胞の核型異常をモニタリングする方法。
(16) ドナーから接着性幹細胞を含む細胞集団を採取し、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるKCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上であることを指標として評価する、ドナー及び/又はドナーから採取した生体試料の評価方法。
(17) ドナーから採取した生体試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるKCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上であることを指標として評価する、前記生体試料の酵素処理条件を判断及び/又は予測する方法。
(22) ヒトへの接着性幹細胞の1回の用量が1×1012個/kg体重以下である、(21)に記載の方法。
(23) 注射用製剤である、(21)又は(22)に記載の方法。
(24) 移植用製剤である、(21)又は(22)に記載の方法。
(25) 前記移植用製剤が細胞塊又はシート状構造である、(24)に記載の医薬組成物。
(26) 疾患が、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び/又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患である、(21)から(25)の何れか一に記載の方法。
(32) 前記医薬組成物が、ヒトへの接着性幹細胞の1回の用量が1×1012個/kg体重以下である医薬組成物である、(31)に記載の使用。
(33) 前記医薬組成物が、注射用製剤である、(31)又は(32)に記載の使用。
(34) 前記医薬組成物が、移植用製剤である、(31)又は(32)に記載の使用。
(35) 前記移植用製剤が細胞塊又はシート状構造である、(34)に記載の医薬組成物。
(36) 前記医薬組成物が、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び/又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤である、(31)から(35)の何れか一に記載の使用。
(42) ヒトへの接着性幹細胞の1回の用量が1×1012個/kg体重以下である、(41)に記載の細胞集団。
(43) 注射用製剤である、(41)又は(42)に記載の細胞集団。
(44) 移植用製剤である、(41)又は(42)に記載の細胞集団。
(45) 前記移植用製剤が細胞塊又はシート状構造である、(44)に記載の医薬組成物。
(46) 疾患が、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び/又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患である、(41)から(45)の何れか一に細胞集団。
本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層(上皮細胞層ともよばれる)は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層(細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する)は接着性幹細胞を含む。
i)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
ii)表面抗原CD73、CD90が陽性であり、CD326が陰性。
本明細書における「正常核型」とは、上述した核型異常が認められないか、又は正常に近い核型を意味する。
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、前記細胞集団において、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上であることを特徴とする。
また、本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団が、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上であるという条件を満たすと、正常核型を維持している接着性幹細胞を含む細胞集団を形成する。そのため、本発明においては、前記条件を、正常核型を維持している接着性幹細胞を含む細胞集団形成の指標とすることができる。また、前記指標を経時的に測定することで、接着性幹細胞の核型異常の変化を迅速かつ簡便に把握し、予測することができる。さらに本発明によれば、前記の指標を利用することによって、ドナー自体及び/又はドナーから採取した生体試料の品質を評価することができる。さらに本発明によれば、前記指標を使用することによって、ドナーから採取した生体試料を酵素処理する際の酵素処理方法が、最適かどうかを判断及び/又は予測することができる。また、前記指標に加え、KCNAB1遺伝子、SULT1E1遺伝子、MN1遺伝子、RARRES2遺伝子の相対発現量が特定の数値範囲を示すことも、正常核型を維持している接着性幹細胞を含む細胞集団形成の指標とすることができる。
CD105は、分化クラスター105を意味し、Endoglinとしても知られているタンパク質である。
CD73は、分化クラスター73を意味し、5-Nucleotidase、或いはEcto-5’-nucleotidaseとしても知られているタンパク質である。
CD90は、分化クラスター90を意味し、Thy-1としても知られているタンパク質である。
細胞集団においてCD73が陽性を呈する接着性幹細胞の比率は、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、又は100%でもよい。
細胞集団においてCD90が陽性を呈する接着性幹細胞の比率は、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、又は100%でもよい。
CD166は、分化クラスター166を意味し、Activaed leukocyte cell adhesion molecule(ALCAM)としても知られているタンパク質である。
CD45は、分化クラスター45を意味し、PTPRC(Protein tyrosine phosphatase,receptor type,C)、或いはLCA(Leukocyte common antigen)としても知られているタンパク質である。
CD34は、分化クラスター34を意味し、Hematopoietic progenitor cell antigen CD34としても知られているタンパク質である。
CD326は、分化クラスター326を意味し、EPCAM遺伝子によってコードされるEpithelial cell adhesion moleculeとしても知られているタンパク質である。
細胞集団においてCD34が陰性を呈する接着性幹細胞の比率は、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、又は100%でもよい。
細胞集団においてCD326が陰性を呈する接着性幹細胞の比率は、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、又は100%でもよい。
(1)凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収する。回収した細胞集団をリン酸バッファー(PBS)にて洗浄し、遠心分離により回収する。
(2)4%パラホルムアルデヒドに、終濃度0.1%となるようポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(Triton-X)を加えた溶液を用いて細胞を固定・膜透過処理した後、リン酸バッファー(PBS)にて細胞を洗浄し、0.5%BSA/PBSにて2.0×106個/mLとなるように細胞懸濁液を調製する。前記細胞懸濁液を100μLずつ分注する。
(3)分注した細胞懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットに0.5%BSA/PBSを100μLずつ添加する。次いで、各抗原マーカーに対応する抗体、又はそのアイソタイプコントロール用抗体を添加する。各反応液をVoltexした後、4℃にて20分間静置する。
(4)0.5%BSA/PBSを添加し、遠心分離により細胞を洗浄した後、0.5%BSA/PBSにて細胞を懸濁し、セルストレーナー(35μmナイロンメッシュフィルター)(コーニング社/品番:352235)にてフィルターろ過する。
(5)フィルターろ過により得られた細胞懸濁液を、BD AccuriTM C6 Flow Cytometer(ベクトン・ディッキンソン社)を用いて解析する(ALL Event 10000)。
(6)測定結果を、縦軸にSSC(側方散乱光)、横軸をFSC(前方散乱光)としたドットプロットで展開する。
(7)ドットプロット展開図において、アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が0.5%以下となる全ての領域(ゲート)を選択する。
(8)抗原マーカーに対応する抗体で測定した総細胞のうち、(7)で選択したゲート内に含まれる細胞の割合を算出する。
陰性率(%)=100-陽性率
SDHA遺伝子の発現量に対するKCNAB1遺伝子の相対発現量は、0.75以上、0.1以上、0.15以上、0.2以上、0.25以上、0.3以上、0.35以上、0.4以上でもよい。SDHA遺伝子の発現量に対するKCNAB1遺伝子の相対発現量の上限は特に限定されないが、例えば、5以下、4以下、3以下、2以下、1以下、0.9以下、0.8以下、0.7以下、0.6以下でもよい。
SDHA遺伝子の発現量に対するSULT1E1遺伝子の相対発現量は、0.13以上、0.15以上、0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、又は0.6以上でもよい。SDHA遺伝子の発現量に対するSULT1E1遺伝子の相対発現量の上限は特に限定されないが、例えば、5以下、4以下、3以下、2以下、1以下、0.9以下、0.8以下、0.7以下、0.6以下、又は0.5以下でもよい。
SDHA遺伝子の発現量に対するMN1遺伝子の相対発現量は、0.8以上、0.9以上、1以上、1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.4以上、1.5以上、1.6以上、又は1.7以上でもよい。SDHA遺伝子の発現量に対するMN1遺伝子の相対発現量の上限は特に限定されないが、例えば、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下でもよい。
SDHA遺伝子の発現量に対するRARRES2遺伝子の相対発現量は、0.3以下、0.2以下、0.1以下、0.05以下、0.04以下、0.03以下、0.02以下、0.01以下、0.009以下、0.008以下、0.007以下、0.006以下、0.005以下、0.004以下、又は0.003以下でもよい。SDHA遺伝子の発現量に対するRARRES2遺伝子の相対発現量の下限は特に限定されないが、例えば、0.001以上、又は0.002以上でもよい。
(1)凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収する。回収した細胞集団をリン酸バッファー(PBS)にて洗浄し、遠心分離により細胞を回収する。
(2)RNA抽出キット(RNeasy Plus Miniキット(QIAGEN社製))を用いてトータルRNAを抽出、精製する。
(3)精製したトータルRNAを鋳型として用いて逆転写反応によりcDNAを合成し、さらに合成されたcDNAからin vitro transcriptionによりcRNAに転写してビオチン標識を行う。
(4)ビオチン標識cRNAをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Human GeneGenome U133A 2.0 Array(Affymetrix社製)上で16時間のハイブリダイゼーションを行う。GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix社製)にて洗浄し、フィコエリスリン染色後、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix社製)にてスキャンを行い、AGCC(Affymetrix GeneChip Command Console Software)(Affymetrix社製)にて画像解析し、Affymetrix Expression Console(Affymetrix社製)を用いて数値化する。
(5)数値データファイルを、解析ソフトGeneSpring GX(アジレント・テクノロジー社製)を用いて比較解析する。各細胞におけるSDHA遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対発現量を算出する。
SDHA遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対発現量の測定方法としては、定量PCRを使用することができる。定量PCRは、具体的には、以下の手順(1)~(5)にて行なうことができる。
(1)凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収する。回収した細胞集団をリン酸バッファー(PBS)にて洗浄し、遠心分離により細胞を回収する。
(2)RNA抽出キット(RNeasy Plus Miniキット(QIAGEN社製))を用いてトータルRNAを抽出、精製する。
(3)精製したトータルRNAを鋳型として用いて逆転写反応によりcDNAを合成し、さらに合成したcDNAとTaqman Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems社製)とプライマー(Taqman Gene Expression Assay、Thermo Fisher社製)を混合して96穴プレートに注入し、定量PCRを行う。
(4)各サンプルのSDHAに対するΔCt値をStepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems社製)にて解析し、各細胞におけるSDHA遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対発現量(2^(-ΔCt))を算出する。
SULT1E1(sulfotransferase family 1E member 1)遺伝子の配列は、National Center for Biotechnology Infomationの遺伝子データベースにID:6783として登録されている。SULT1E1は、配列番号5に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号6に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
MN1(meningioma (disrupted in balanced translocation) 1)遺伝子の配列は、National Center for Biotechnology Infomationの遺伝子データベースにID:4330として登録されている。MN1は、配列番号7に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号8に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
RARRES2(retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 2)遺伝子の配列は、National Center for Biotechnology Infomationの遺伝子データベースにID:5919として登録されている。RARRES2は、配列番号9に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号10に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、胎児付属物などの生体組織又は器官から採取した細胞を含む細胞集団において、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上である細胞集団を取得することを含む、製造方法である。また、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、胎児付属物などの生体組織又は器官から採取した細胞を含む細胞集団を、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上に維持する条件下において培養する工程を含む方法である。前記条件は、正常核型を維持している接着性幹細胞を含む細胞集団形成の指標であり、本発明の培養方法は、前記指標を満たせば特に制限されない。
本発明においては、接着性幹細胞を含む細胞集団におけるKCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上であることを指標として測定することによって(好ましくは経時的に測定することによって)、接着性幹細胞の核型異常をモニタリングすることができる。前記モニタリングが必要な工程としては、例えば、培養する工程、凍結保存する工程及び/又は製剤化する工程である。
本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物が提供される。本発明によればさらに、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団と、投与可能な他の細胞とを含む、医薬組成物が提供される。
本発明の医薬組成物は、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び/又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤として使用することができる。本発明の医薬組成物を治療部位に効果が計測できる量投与することで、上記疾患を治療することができる。
本発明によれば、細胞治療剤のために使用される、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤の製造のための、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
また、上記液剤は細胞の懸濁液でもよく、細胞が液剤中に分散した液体調製物でもよい。さらに前記液剤に含まれる細胞の形態は特に限定されないが、例えばシングルセルでもよいし、細胞凝集塊でもよい。
また、シート状構造の移植用製剤としては、例えば、国際公開WO2006/080434号公報、特開2016-52272号公報などにおいて、温度応答性培養皿(例えば、UpCell(登録商標)(セルシード社製))を用いて培養することにより得られる細胞シートや、シート状細胞培養物とフィブリンゲルとの積層体、細胞懸濁液をシート状の基材に塗布した細胞塗布シートなどが知られている。本発明の医薬組成物も、例えば上記文献に記載されている方法を用いることにより、各種のシート状構造の移植用製剤とすることができる。
以下に示す比較例1及び実施例1では、核型安定性の高い接着性幹細胞を含む細胞集団を取得するための指標を検討した。
(工程1-1:羊膜の採取)
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液(Ca・Mg不含有)にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
上皮細胞層と接着性幹細胞層とを含む羊膜を240PU/mLコラゲナーゼ及び200PU/mLディスパーゼIを含有するハンクス平衡塩溶液(Ca・Mg含有)に浸し、37℃にて90分間、50rpmの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き95μmのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、羊膜接着性幹細胞を含む細胞懸濁液を回収した。
上述の「羊膜の酵素処理及び羊膜接着性幹細胞の回収」で得られた、羊膜接着性幹細胞を含む細胞集団を6,000cells/cm2の密度で培養容器のCellSTACK(登録商標)(コーニング社製)に播種し、終濃度にして10%のウシ胎児血清(FBS)及び10ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むαMEM(Alpha Modification of Minimum Essential Medium Eagle)にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、TrypLE Selectを用いて0継代目の細胞を剥離し、1/5量の細胞を先の培養と同じスケールのCellSTACK(登録商標)に播種することにより、継代培養を行った。培地交換は2~4日に1回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でTrypLE Selectを用いて1継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が2×107cells/mLになるようRPMI1640を添加した。これに等量のCP-1(登録商標)溶液(CP-1(登録商標):25%ヒト血清アルブミン=34:16の比で混合した溶液)を加え、1mLずつクライオバイアルに移して-80℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で1日凍結保存した。その後、解凍して約15,000~18,000cells/cm2の密度で2継代目の細胞をCellSTACK(登録商標)に播種し、終濃度にして10%のウシ胎児血清(FBS)及び10ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むαMEM(Alpha Modification of Minimum Essential Medium Eagle)にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、TrypLE Selectを用いて2継代目の細胞を剥離し、1/5量の細胞を先の培養と同じスケールのCellSTACK(登録商標)に播種することにより、継代培養を行った。培地交換は2~4日に1回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でTrypLE Selectを用いて3継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が4×106cells/mLになるようRPMI1640を添加した。これに等量のCP-1(登録商標)溶液(CP-1(登録商標):25%ヒト血清アルブミン=34:16の比で混合した溶液)を加え、1mLずつクライオバイアルに移して-80℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で1日凍結保存した。その後、解凍して約6,000cells/cm2の密度で4継代目の細胞をCellSTACK(登録商標)に播種し、終濃度にして10%のウシ胎児血清(FBS)及び10ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むαMEM(Alpha Modification of Minimum Essential Medium Eagle)にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、TrypLE Selectを用いて4継代目の細胞を剥離し、1/5量の細胞を先の培養と同じスケールのCellSTACK(登録商標)に播種することにより、継代培養を行った。培地交換は2~4日に1回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でTrypLE Selectを用いて5継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が4×106cells/mLになるようRPMI1640を添加した。これに等量のCP-1(登録商標)溶液(CP-1(登録商標):25%ヒト血清アルブミン=34:16の比で混合した溶液)を加え、1mLずつクライオバイアルに移して-80℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
上記の培養方法で培養した5継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原(MSCマーカーとして知られているCD73の陽性率、CD90の陽性率、CD105の陽性率、CD166の陽性率、CD45の陰性率、CD34の陰性率、CD326の陰性率)を解析した。その結果、CD73、CD90、CD105の陽性率はいずれも90%以上であった(具体的にはCD73:100%、CD90:97%、CD105:100%)、CD166の陽性率はいずれも30%以上であった(具体的にはCD166:98%)。CD45、CD34、CD326の陰性率はいずれも95%以上であった(具体的にはCD45:100%、CD34:100%、CD326:100%)。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞が接着性幹細胞であることが確認された。
また、上記の培養方法で培養した3、5継代目の羊膜接着性幹細胞に関して固定及び膜透過処理を行い、フローサイトメーターを用いてKCNAB1抗原に対して陽性となる細胞の比率を解析した。その結果、いずれの継代数においても85%未満であった(3継代目:78%、5継代目:81%)。
(1)測定結果を、縦軸に側方散乱光(SSC)、横軸をFSC(前方散乱光)としたドットプロットで展開した。
(2)ドットプロット展開図において、アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が0.5%以下となる全ての領域(ゲート)を選択した。
(3)抗原マーカーに対応する抗体で測定した総細胞のうち、(2)で選択したゲート内に含まれる細胞の割合を算出した。
上記の培養方法で培養した5継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、マイクロアレイによる遺伝子(KCNAB1遺伝子、SULT1E1遺伝子、MN1遺伝子、RARRES2遺伝子)発現解析を株式会社理研ジェネシスに委託した。
以下の手順(1)~(4)によりマイクロアレイ解析を実施した。なお、以下の手順(2)~(4)は、株式会社理研ジェネシスが実施した。
(1)凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団をリン酸バッファー(PBS)にて洗浄し、遠心分離により細胞を回収した。その後、RNeasy Plus Miniキット(QIAGEN社製)を用いてトータルRNAを抽出、精製した。
(2)100ngのトータルRNAから逆転写反応によりcDNAを合成し、cDNAからin vitro transcriptionによりcRNAに転写してビオチン標識を行った(3’IVT PLUS Reagent Kitを使用)。
(3)10.0μgの標識cRNAをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Human GeneGenome U133A 2.0 Array(Affymetrix社製)上で16時間のハイブリダイゼーションを行った。GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix社製)にて洗浄、フィコエリスリン染色後、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix社製)にてスキャンを行い、AGCC(Affymetrix GeneChip Command Console Software)(Affymetrix社製)にて画像解析し、Affymetrix Expression Console(Affymetrix社製)を用いて数値化した。
(4)数値データファイルを、解析ソフトGeneSpring GX(アジレント・テクノロジー社製)を用いて解析した。
各遺伝子の発現レベルを、SDHA遺伝子の発現レベルに対する相対発現量として求めた。その結果、KCNAB1遺伝子:0.03、SULT1E1遺伝子:0.05、MN1遺伝子:0.69、RARRES2遺伝子:0.41であった。
上記の培養方法で培養した3、5継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、Gバンド法による核型解析を株式会社日本遺伝子研究所に委託した。3、5継代目に凍結した細胞を解凍し、約8,000cells/cm2の密度でT25フラスコ各2枚に播種し、終濃度にして10%のウシ胎児血清(FBS)及び10ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むαMEMを5mL添加し、24時間培養した。その後、T25フラスコを終濃度にして10%のウシ胎児血清(FBS)及び10ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むαMEMで満たし、室温で株式会社日本遺伝子研究所(宮城県仙台市)に輸送した。株式会社日本遺伝子研究所において任意の20個の細胞を回収し、そこから染色体を取り出し、分染法で検出される染色体に特徴的なバンドパターンをもとに各染色体を同定し、異数性や転座などの核型異常の有無を解析した。その結果、3、5継代目のいずれの細胞においても核型異常が認められた。具体的には、3継代目においては、20個中1個の細胞で核型異常が認められ、2番染色体長腕の同腕染色体が増加(+i(2)(q10))していた。5継代目においては、20個中5個の細胞で核型異常が認められ、5個の全てにおいて2番染色体のトリソミーが認められた。
(工程2-1:羊膜の採取)
比較例1と同じ手法にて羊膜を取得した。
比較例1と同じ手法にて羊膜接着性幹細胞を含む細胞集団を取得した。
上述の「羊膜の酵素処理及び羊膜接着性幹細胞の回収」で得られた、羊膜接着性幹細胞を含む細胞集団を6,000cells/cm2の密度でCellSTACK(登録商標)に播種し、終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)及を含むαMEMにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、TrypLE Selectを用いて0継代目の細胞を剥離し、1/5量の細胞を先の培養と同じスケールのCellSTACK(登録商標)に播種することにより、継代培養を行った。培地交換は2~4日に1回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でTrypLE Selectを用いて1継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が2×107cells/mLになるようRPMI1640を添加した。これに等量のCP-1(登録商標)溶液(CP-1(登録商標):25%ヒト血清アルブミン=34:16の比で混合した溶液)を加え、1mLずつクライオバイアルに移して-80℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で1日凍結保存した。その後、解凍して約15,000~18,000cells/cm2の密度で2継代目の細胞をCellSTACK(登録商標)に播種し、終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)を含むαMEMにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、TrypLE Selectを用いて2継代目の細胞を剥離し、1/5量の細胞を先の培養と同じスケールのCellSTACK(登録商標)に播種することにより、継代培養を行った。培地交換は2~4日に1回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でTrypLE Selectを用いて3継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が4×106cells/mLになるようRPMI1640を添加した。これに等量のCP-1溶液(登録商標)(CP-1(登録商標):25%ヒト血清アルブミン=34:16の比で混合した溶液)を加え、1mLずつクライオバイアルに移して-80℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で1日凍結保存した。その後、解凍して約6,000cells/cm2の密度で4継代目の細胞をCellSTACK(登録商標)に播種し、終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)を含むαMEMにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、TrypLE Selectを用いて4継代目の細胞を剥離し、1/5量の細胞を先の培養と同じスケールのCellSTACK(登録商標)に播種することにより、継代培養を行った。培地交換は2~4日に1回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でTrypLE Selectを用いて5継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が4×106cells/mLになるようRPMI1640を添加した。これに等量のCP-1(登録商標)溶液(CP-1(登録商標):25%ヒト血清アルブミン=34:16の比で混合した溶液)を加え、1mLずつクライオバイアルに移して-80℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。6継代目以降は全て約6,000cells/cm2の密度で細胞をCellSTACK(登録商標)に播種し、終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)を含むαMEMにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、TrypLE Selectを用いて剥離し、継代培養を9継代目まで繰り返した。
上記の培養方法で培養した5継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原(CD73の陽性率、CD90の陽性率、CD105の陽性率、CD166の陽性率、CD45の陰性率、CD34の陰性率、CD326の陰性率)を解析した。その結果、CD73、CD90、CD105の陽性率はいずれも50%以上であった(具体的にはCD73:99%、CD90:100%、CD105:100%)。CD166の陽性率はいずれも30%以上であった(具体的にはCD166:100%)。CD45、CD34、CD326の陰性率はいずれも95%以上であった(具体的にはCD45:100%、CD34:100%、CD326:100%)。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞が接着性幹細胞であることが確認された。
また、上記の培養方法で培養した3、5継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、フローサイトメーターを用いてKCNAB1抗原に対して陽性となる細胞の比率を解析した。その結果、いずれの継代数においても85%以上であった(3継代目:91%、5継代目:90%)。よって、実施例1の5継代目の羊膜接着性幹細胞は、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上である、という条件を満たすことがわかった。
なお、本測定の方法、試薬は比較例1と同じである。
上記の培養方法で培養した5継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、マイクロアレイによる遺伝子(KCNAB1遺伝子、SULT1E1遺伝子、MN1遺伝子、RARRES2遺伝子)発現解析を株式会社理研ジェネシスに委託した。
比較例1と同様にしてマイクロアレイ解析を実施した。各遺伝子の発現レベルを、SDHA遺伝子の発現レベルに対する相対発現量として求めた。その結果、KCNAB1遺伝子:0.44、SULT1E1遺伝子:0.68、MN1遺伝子:1.77、RARRES2遺伝子:0.003であった。
上記の培養方法で培養した3、5継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、Gバンド法による核型解析を株式会社日本遺伝子研究所に委託した。3、5継代目に凍結した細胞を解凍し、約8,000cells/cm2の密度でT25フラスコ各2枚に播種し、終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)を含むαMEMを5mL添加し、24時間培養した。その後、T25フラスコを終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)を含むαMEMで満たし、室温で株式会社日本遺伝子研究所(宮城県仙台市)に輸送した。株式会社日本遺伝子研究所において任意の20個の細胞を回収し、そこから染色体を取り出し、分染法で検出される染色体に特徴的なバンドパターンをもとに各染色体を同定し、異数性や転座などの核型異常の有無を解析した。その結果、3、5継代目の全ての細胞が正常核型を維持していた。
さらに本発明によれば、接着性幹細胞を含む細胞集団において、KCNAB1の陽性率が85%以上であることを指標とすることで、生体試料の核型安定性(接着性幹細胞の核型異常の有無)の経時的モニタリングについても簡便かつ短時間で実施することができる。これにより、生体試料の品質評価に必要なコストの低下と品質評価に必要となる期間の短縮が可能となり、細胞製剤の製造コスト削減につなげることができる。
比較例1及び実施例1におけるドナーとは異なるドナー2名(#1、#2)のインフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取し、それぞれの胎児付属物を「工程1-1:羊膜の採取」、「工程1-2:羊膜の酵素処理及び羊膜接着性幹細胞の回収」に沿って処理し、羊膜接着性幹細胞を取得した。
#1、#2のドナーから取得した羊膜接着性幹細胞を含む細胞集団を「実施例1:羊膜接着性幹細胞の培養」の方法で培養し、5継代目の細胞集団を取得した。
表2に実施例2におけるKCNAB1の陽性率と核型解析の結果についてまとめる。
以下に示す実施例3では、比較例1、実施例1、実施例2と比較してドナーや酵素処理条件、培養条件が異なる羊膜接着性幹細胞を取得した。
比較例1、実施例1、及び実施例2におけるドナーとは異なるドナー3名(#3~#5)のインフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。
比較例1と同じ手法にて羊膜を取得した。
上皮細胞層と接着性幹細胞層とを含む羊膜を480PU/mLコラゲナーゼ及び400PU/mLディスパーゼIを含有するハンクス平衡塩溶液(Ca・Mg含有)に浸し、37℃にて90分間、50rpmの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き95μmのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、羊膜接着性幹細胞を含む細胞懸濁液を回収した。
上述の「羊膜の酵素処理及び羊膜接着性幹細胞の回収」で得られた、羊膜接着性幹細胞を含む細胞集団を1,000cells/cm2の密度でCellSTACK(登録商標)に播種し、終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)及を含むαMEMにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培地交換は3~5日に1回の頻度で実施した。その後、TrypLE Selectを用いて0継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が2×107cells/mLになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のCP-1(登録商標)溶液(CP-1(登録商標):25%ヒト血清アルブミン=34:16の比で混合した溶液)を加え、1mLずつクライオバイアルに移して-80℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で1日凍結保存した。その後、解凍して約1,000cells/cm2の密度で1継代目の細胞をCellSTACK(登録商標)に播種し、終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)を含むαMEMにてサブコンフルエントになるまで5日間接着培養した。その後、TrypLE Selectを用いて1継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が2×107cells/mLになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のCP-1(登録商標)溶液(CP-1(登録商標):25%ヒト血清アルブミン=34:16の比で混合した溶液)を加え、1mLずつクライオバイアルに移して-80℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で1日凍結保存した。その後、解凍して約1,000cells/cm2の密度で2継代目の細胞をCellSTACK(登録商標)に播種し、終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)を含むαMEMにてサブコンフルエントになるまで5日間接着培養した。その後、TrypLE Selectを用いて2継代目の細胞を剥離し、細胞濃度が4×106cells/mLになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のCP-1溶液(登録商標)(CP-1(登録商標):25%ヒト血清アルブミン=34:16の比で混合した溶液)を加え、1mLずつクライオバイアルに移して-80℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
上記の培養方法で培養した2継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原(CD73の陽性率、CD90の陽性率、CD105の陽性率、CD166の陽性率、CD45の陰性率、CD34の陰性率、CD326の陰性率)を解析した。その結果、CD73、CD90、CD105の陽性率はいずれも50%以上であった(具体的には#3~#5ともに全て100%)。CD166の陽性率はいずれも30%以上であった(具体的には#3:99%、#4:100%、#5:99%)。CD45、CD34、CD326の陰性率はいずれも95%以上であった(具体的には#3:99%、#4:100%、#5:100%)。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞が接着性幹細胞であることを確認した。
また、上記の培養方法で培養した2継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、フローサイトメーターを用いてKCNAB1抗原に対して陽性となる細胞の比率を解析した。その結果、いずれのドナーにおいても85%以上であった(#3:98.2%、#4:99.9%、#5:99.7%)。よって、実施例3の2継代目の羊膜接着性幹細胞は、#3~#5の全てのドナーについて、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上である、という条件を満たすことがわかった。なお、本測定の方法、試薬は比較例1と同じである。
上記の培養方法で培養した2継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、マイクロアレイによる遺伝子(KCNAB1遺伝子、SULT1E1遺伝子、MN1遺伝子、RARRES2遺伝子)発現解析を株式会社理研ジェネシスに委託した。
比較例1と同様にしてマイクロアレイ解析を実施した。各遺伝子の発現レベルを、SDHA遺伝子の発現レベルに対する相対発現量として求めた。その結果、#3はKCNAB1遺伝子:0.15、SULT1E1遺伝子:0.36、MN1遺伝子:0.81、RARRES2遺伝子:0.01であった。#4はKCNAB1遺伝子:0.07、SULT1E1遺伝子:0.16、MN1遺伝子:0.75、RARRES2遺伝子:0.001であった。#5はKCNAB1遺伝子:0.11、SULT1E1遺伝子:0.27、MN1遺伝子:1.38、RARRES2遺伝子:0.001であった。
(1)凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団をリン酸バッファー(PBS)にて洗浄し、遠心分離により細胞を回収した。その後、RNeasy Plus Miniキット(QIAGEN社製)を用いてトータルRNAを抽出、精製した。
(2)精製したトータルRNAにReverTra Ace qPCR RT Master Mix(東洋紡社製)を添加し、トータルRNAを鋳型として用いて逆転写反応によりcDNAを合成した。
(3)合成したcDNAとTaqman Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems社製)、及びプライマー(Taqman Gene Expression Assay、Thermo Fisher社製、SDHAのプライマーのAssay ID:Hs00188166_m1、KCNAB1のプライマーのAssay ID:Hs00185764_m1、SULT1E1のプライマーのAssay ID:Hs00960938_m1、MN1のプライマーのAssay ID:Hs00159202_m1、RARRES2のプライマーのAssay ID:Hs00414615_m1)を混合して96穴プレートに注入し、定量PCRを行った。
(4)各サンプルのSDHAに対するΔCt値をStepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems社製)にて解析し、各細胞におけるSDHA遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対発現量(2^(-ΔCt))を算出した。その結果、#3はKCNAB1遺伝子:0.77、SULT1E1遺伝子:0.37、MN1遺伝子:1.1、RARRES2遺伝子:0.0026であった。#4はKCNAB1遺伝子:0.72、SULT1E1遺伝子:0.13、MN1遺伝子:1.8、RARRES2遺伝子:0.0029であった。#5はKCNAB1遺伝子:4.4、SULT1E1遺伝子:0.50、MN1遺伝子:5.9、RARRES2遺伝子:0.0033であった。
上記の培養方法で培養した2継代目の羊膜接着性幹細胞に関し、Gバンド法による核型解析を株式会社日本遺伝子研究所に委託した。2継代目に凍結した細胞を解凍し、約8,000cells/cm2の密度でT25フラスコ各2枚に播種し、終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)を含むαMEMを5mL添加し、24時間培養した。その後、T25フラスコを終濃度にして5%のヒト血小板溶解物(hPL)を含むαMEMで満たし、室温で株式会社日本遺伝子研究所(宮城県仙台市)に輸送した。株式会社日本遺伝子研究所において任意の20個の細胞を回収し、そこから染色体を取り出し、分染法で検出される染色体に特徴的なバンドパターンをもとに各染色体を同定し、異数性や転座などの核型異常の有無を解析した。その結果、2継代目の全ての細胞が正常核型を維持していた。
上記の実施例1で得られた羊膜接着性幹細胞の一部を医薬組成物の調製に供する。羊膜接着性幹細胞2.0×108個、6.8mLのCP-1溶液(登録商標)、3.2mLの25%ヒト血清アルブミン溶液、及び10mLのRPMI1640培地を含有する医薬組成物(細胞製剤)を調製する。当該医薬組成物を凍結用バッグに封入し、凍結状態で保存する。尚、使用時に医薬組成物を解凍し、患者に供することができる。
(工程4-1:骨髄由来間葉系幹細胞の培養)
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC間葉系幹細胞、Lonza社製)3ドナー分(#6~#8)を購入し、それぞれ解凍して6,000cells/cm2の密度でφ15cmのディッシュに播種し、Lonza社製の専用培地でサブコンフルエントになるまで接着培養した。培地交換は3~5日に1回の頻度で実施した。その後、TrypLE Selectを用いて細胞を剥離し、細胞濃度が2×106cells/mLになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のCP-1(登録商標)溶液(CP-1(登録商標):25%ヒト血清アルブミン=34:16の比で混合した溶液)を加え、1mLずつクライオバイアルに移して-80℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
上記の培養方法で培養した骨髄由来間葉系幹細胞に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原(CD73の陽性率、CD90の陽性率、CD105の陽性率、CD166の陽性率、CD45の陰性率、CD34の陰性率、CD326の陰性率)を解析した。その結果、CD73、CD90、CD105の陽性率はいずれも50%以上であった。CD166の陽性率はいずれも30%以上であった。CD45、CD34、CD326はいずれも5%未満であった。
また、フローサイトメーターを用いてKCNAB1抗原に対して陽性となる細胞の比率を解析した。その結果、いずれのドナーにおいても85%未満であった(#6:66%、#7:71%、#8:57%)。なお、本測定の方法、試薬は比較例1と同じである。
上記の培養方法で培養した骨髄由来間葉系幹細胞に関し、定量PCRによる遺伝子(KCNAB1遺伝子、SULT1E1遺伝子、MN1遺伝子、RARRES2遺伝子)発現解析を行った。その結果、#6はKCNAB1遺伝子:0.0015、SULT1E1遺伝子:発現量が低すぎるので検出不可、MN1遺伝子:0.54、RARRES2遺伝子:0.0026であった。#7はKCNAB1遺伝子:0.0020、SULT1E1遺伝子:発現量が低すぎるので検出不可、MN1遺伝子:0.90、RARRES2遺伝子:0.0029であった。#8はKCNAB1遺伝子:0.0033、SULT1E1遺伝子:発現量が低すぎるので検出不可、MN1遺伝子:0.52、RARRES2遺伝子:0.0033であった。なお、本測定の方法、試薬は実施例3と同じである。
表3に実施例3及び参考例における定量PCR遺伝子発現解析の結果についてまとめる。
Claims (5)
- 羊膜由来幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
a)ドナーから採取した羊膜を酵素処理して、接着性幹細胞を含む細胞集団を取得すること;
b)前記細胞集団を培養すること;及び
c)前記細胞集団において、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上である細胞集団を取得することを含み、
前記c)が、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるKCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上であることを指標として、条件を満たす細胞集団を選抜することを含む、
方法。 - 前記b)の培養が、ヒト血小板溶解物を含む培地を使用することを含む、請求項1に記載の方法。
- 接着性幹細胞を含む細胞集団において、
KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるKCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上であることを指標として接着性幹細胞の核型異常をモニタリングする方法。 - ドナーから接着性幹細胞を含む細胞集団を採取し、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるKCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上であることを指標として評価する、ドナー及び/又はドナーから採取した生体試料の評価方法。
- ドナーから採取した生体試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、KCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率を測定し、前記細胞集団におけるKCNAB1が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が85%以上であることを指標として評価する、前記生体試料の最適な酵素処理条件を判断及び/又は予測する方法。
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