JP5900985B2 - 羊膜調製物及び精製組成物及びその使用方法 - Google Patents
羊膜調製物及び精製組成物及びその使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5900985B2 JP5900985B2 JP2014020763A JP2014020763A JP5900985B2 JP 5900985 B2 JP5900985 B2 JP 5900985B2 JP 2014020763 A JP2014020763 A JP 2014020763A JP 2014020763 A JP2014020763 A JP 2014020763A JP 5900985 B2 JP5900985 B2 JP 5900985B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- human
- extract
- amniotic
- tgf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/738—Cross-linked polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
- A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
- A61K8/982—Reproductive organs; Embryos, Eggs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
- A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
- A61L15/40—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. plant or animal extracts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
- A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
- A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
- A61L15/44—Medicaments
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4718—Cytokine-induced proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
- A61L2300/64—Animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Hematology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
Description
本出願は2005年9月27日出願された米国仮出願第60/720,760号の利益を主張するものであり、同仮出願の全内容は参照によって本明細書に組み入れられるものとする。
本発明は、国立衛生研究所から与えられたグラントNo.RO1 EY06819に基づく米国政府の支援によってなされたもので、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
・架橋した高分子ヒアルロン酸(HA);
・腫瘍壊死因子活性化遺伝子6(TSG−6);
・ペントラキシン(PTX−3);
・トロンボスポンジン(TSP−1)を含む、精製組成物である。
・凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得るステップ;
・該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離するステップ;
・該ヒト羊膜材料を適当なバッファーの中でホモジナイズするステップ、を含む。
・該ヒト羊膜材料を凍結するステップ;
・該凍結羊膜材料を粉砕するステップ、を含む。
・該ホモジネートを凍結乾燥するステップ;又は
・該ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離するステップ、を含む。
・該上清を凍結乾燥して粉末にするステップ、を含む。
・凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得るステップ;
・該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離するステップ;
・該ヒト羊膜材料を適当なバッファーの中でホモジナイズするステップ;
・必要に応じて、該ホモジネートを凍結乾燥して粉末にするステップ;
・該ホモジネート又は該粉末を薬学的に許容される非固体製剤用、又は徐放性固体製剤用担体と混合するステップ、を含む。
・該ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離し、必要に応じてその上清を凍結乾燥して粉末にするステップに置き換える。
・凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得るステップ;
・該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離するステップ;
・該ヒト羊膜材料を適当なバッファーの中でホモジナイズするステップ;
・必要に応じて、該ホモジネートを凍結乾燥して粉末にするステップ;
・該ホモジネート又は該粉末を薬学的に許容される非固体製剤用、又は徐放性固体製剤用担体と混合するステップ、を含む。
・該ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離し、必要に応じてその上清を凍結乾燥して粉末にするステップに置き換える。
・架橋した高分子ヒアルロン酸(HA);
・腫瘍壊死因子活性化遺伝子6(TSG−6);
・ペントラキシン(PTX−3);
・トロンボスポンジン(TSP−1)を含む。
・凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得るステップ;
・該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離するステップ;
・該ヒト羊膜材料を適当なバッファーの中でホモジナイズするステップ;
・必要に応じて、該ホモジネートを凍結乾燥して粉末にするステップ;
・該ホモジネート又は該粉末を薬学的に許容される非固体製剤用、又は徐放性固体製剤用担体と混合するステップ、を含む。
・該ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離し、必要に応じてその上清を凍結乾燥して粉末にするステップに置き換える。
・血管形成に関与する内皮細胞のアポトーシスを引き起こす;
・血管形成に関与する内皮細胞の遊走を抑制する;
・血管形成に関与する内皮細胞の管腔形成を抑制する。
・架橋した高分子ヒアルロン酸(HA);
・腫瘍壊死因子活性化遺伝子6(TSG−6);
・ペントラキシン(PTX−3);
・トロンボスポンジン(TSP−1)を含む。
・凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤を得るステップ;
・該胎盤を解凍し、その解凍した胎盤からヒト羊膜材料を単離するステップ;
・該ヒト羊膜材料を適当なバッファーの中でホモジナイズするステップ;
・必要に応じて、該ホモジネートを凍結乾燥して粉末にするステップ;
・該ホモジネート又は該粉末を薬学的に許容される非固体製剤用、又は徐放性固体製剤用担体と混合するステップ、を含む。
・該ホモジネートを遠心分離し、その遠心分離したホモジネートから上清を分離し、必要に応じてその上清を凍結乾燥して粉末にするステップに置き換える。
・炎症部位におけるマクロファージのアポトーシスを引き起こす;
・炎症部位におけるプロスタグランジンE1に対するプロスタグランジンD2の比を増加させる;
・炎症部位におけるTGF−β1活性を抑制する;又は
・炎症部位におけるインターフェロン−γシグナル伝達を阻害する。
処方、組成物又は成分に関する本明細書において使用される用語「許容される」は、治療される被験者の全般的健康に対して、持続的有害な影響を及ぼさないことを意味する。
本明細書に記載されているのは、哺乳動物細胞及び無処理の哺乳動物組織において、多くの生理学的に有意な効果を発現する精製組成物である。該精製組成物は、少なくとも以下の4つの構成成分を含む。
・架橋した高分子ヒアルロン酸(HA);
・腫瘍壊死因子活性化遺伝子6(TSG−6);
・ペントラキシン(PTX−3);
・トロンボスポンジン(TSP−1)
ある態様では、HA、TSG−6、PTX−3、TSP−1、必要ならばSmad7、の構成成分のうち少なくとも一つは羊膜の調製物から得ることができる。あるいは、HA、TSG−6、PTX−3、TSP−1、必要ならばSmad7、の組み合わせを含む、未精製の羊膜調製物を調製することができる。各種AM調製物の典型的な調製方法は本明細書に記載されている。
ヒト胎盤は、選択的帝王切開分娩の際に採取した(Heiligenhausら、Invest Ophthalmol.Vis Sci.42:1969−1974、2001、Lee and Tseng、Am J Ophthalmol.123:303−312、1997、Prabhasawatら、Ophthalmology 104:974−985、1997、Tsengら、Arch Ophthalmol.116:431−441、1998)。AMは、ニトロセルロース紙(ハイボンド−N+、Amersham、英国)の上に、上皮表面を上にして平らにして乗せた。AMサンプルは、使用するまでDMEM/グリセロール(1:2(v/v))の中で−80℃で保管した。
生のヒト胎盤及び凍結ヒト胎盤はBio−Tissue、Bio−Tissue Inc.(マイアミ、フロリダ州)から入手した。全ヒトAM抽出物(AME)の全調製手順は、次の細胞培養ベースの実験で使用できるように無菌的に行った。AMは、バイオパルベライザー(BioPulverizer)(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,オクラホマ州)の容器に入るように、小片にスライスし、液体窒素で凍結させ、微粉末になるよう粉砕し、秤量した。プロテアーゼ阻害剤(プロテアーゼ阻害剤カクテル、P8340、Sigma及び1mMのPMSFを含む)と、ホスファターゼ阻害剤(50mMのフッ化ナトリウム及び0.2mMのバナジン酸ナトリウム)とを含む1xPBSの冷緩衝液(pH7.4)を得られた粉末に1:1(ml/g)の割合で添加した。混合物は氷上に保持し、Tissue−Tearor(BioSpec Products,Inc.,Dremel,ウィスコンシン州)を用いて、5回、各1分間ずつ(各回が終わるたびに2分間冷却する)ホモジナイズした。これら水溶性抽出物は「全」AM抽出物(AME)と命名した。
凍結ヒト胎盤材料は、Bio−Tissue、Bio−Tissue Inc.(マイアミ、フロリダ州)から入手した。全ヒトAM抽出物(AME)の全調製手順は、次の細胞培養ベースの実験で使用できるように無菌的に行った。AMは、バイオパルベライザー(BioPulverizer)(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,オクラホマ州)の容器に入るように、小片にスライスし、液体窒素で凍結させ、微粉末になるよう粉砕し、秤量した。プロテアーゼ阻害剤(プロテアーゼ阻害剤カクテル、P8340、Sigma、及び1mMのPMSFを含む)及びホスファターゼ阻害剤(50mMのフッ化ナトリウム及び0.2mMのバナジン酸ナトリウム)を含む1xPBSの冷緩衝液(pH7.4)を得られた粉末に1:1(ml/g)の割合で添加した。混合物は氷上に保持し、Tissue−Tearor(BioSpec Products,Inc.,Dremel,ウィスコンシン州)を用いて、5回、各1分間ずつ(各回が終わるたびに2分間冷却する)ホモジナイズした。これら水溶性抽出物は「全」AM抽出物(AME)と命名した。
異なる抽出緩衝液を用いた調製物の試験において、上記より調製した粉末を秤量し、バッファーA(等張性低塩濃度)(100mMのTris−HCl(pH7.6)、150mMのNaCl、4mMのEDTA、1%のTriton X−100)と湿重量(g)のAMと緩衝液(ml)の比が1:1となるように混合し、4℃にて1時間撹拌した。48000xgにて遠心分離し、次に得られたペレットをバッファーB(高塩濃度)(100mMのTris−HCl(pH7.6)、1MのNaCl、4mMのEDTA、1%のTriton X−100)を用い、4℃にて1時間撹拌することにより、抽出した。再び48000xgにて遠心分離し、得られたペレットをバッファーC(4Mの塩酸グアニジン)(100mMの酢酸ナトリウム(pH5.8)、4Mの塩酸グアニジン、4mMのEDTA、1%のTriton X−100)を用い、4℃にて24時間撹拌することにより、最終的に抽出した。上記3種の緩衝液には、全て以下のプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を添加した:1μg/mlのアプロチニン、1μg/mlのロイペプチン、1μg/mlのペプスタチンA、0.5mMのPMSF、50μMのフッ化ナトリウム、0.2μMのバナジン酸ナトリウム。得られた上清はそれぞれ抽出物A、B、Cと命名し、0.5mMのPMSFを含む透析バッファー(50mMのTris−HCl(pH7.5)、0.15MのNaCl)に対して、4℃にて6時間、二回透析バッファーを交換して(それぞれ500x(透析バッファー:サンプル(体積比))を用いて)透析した。透析後、各サンプルの容量を計測し、透析バッファーと同じ容量となるように調整した。簡単にこすり落とすことができた、AM間質に付着した物質であるAMゼリーから抽出物を調製する際にも、同じ方法を用いた。
全可溶性ヒトAM抽出物(T)の全調製手順は、次の細胞培養ベースの実験で使用できるように無菌的に行った。凍結ヒト胎盤は、Bio−Tissue Inc.(マイアミ、フロリダ州)から入手し、そこからAMを回収した。AMは、バイオパルベライザー(BioPulverizer)(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,オクラホマ州)の容器に入るように、小片にスライスし、液体窒素で凍結させ、次いで微粉末になるよう粉砕した。得られた粉末は秤量し、プロテアーゼ阻害剤(プロテアーゼ阻害剤カクテル、P8340、Sigma、1mMのPMSFを含む)及びホスファターゼ阻害剤(50mMのフッ化ナトリウムと0.2mMのバナジン酸ナトリウム)を含む冷PBS緩衝液(10xPBS(cat#70011−044、Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)から蒸留水を加えて1xPBS(pH7.4)に調製した)と1:1(ml/g)の割合で混合した。混合物は氷上に保持し、Tissue−Tearor(BioSpec Products,Inc.,Dremel,ウィスコンシン州)を用いて、5回、各1分間ずつ(各回が終わるたびに2分間冷却する)ホモジナイズした。この水溶性抽出物は「全」(T)と命名した。全水溶性抽出物は4℃にて1時間混合し、次に4℃で30分間48000xgにて遠心分離した。得られた上清はアリコットに分け、−80℃で保管した。
無菌的方法により、Bio−Tissue Inc.(マイアミ、フロリダ州)から入手した凍結ヒトAMは、もとの保存培地を除去するために、HBSSを用いて2〜3回簡単に洗浄した。AM間質はスパチュラでこすり落とし、液体窒素の気相中で凍結させ、バイオパルベライザー(BioPulverizer)(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,オクラホマ州)で微粒子になるように粉砕し、その後、PBS(pH7.4)中で、Tissue−Tearor(BioSpec Products,Inc.,Dremel,ウィスコンシン州)を用いて、氷上にて1分間ホモジナイズした。得られたホモジネートは、1時間回転することにより混合し、その後14,000xgにて30分間4℃で遠心分離した。得られたPBS中の上清を回収し、アリコットに分け、−80℃で保管した。タンパク質濃度は、BCAアッセイにより測定した。この水溶性タンパク質抽出物は羊膜間質抽出物(ASE)と命名し、本明細書に記載の実験に使用した。
タンパク質抽出物の全調製手順は無菌的に行った。Bio−Tissue(マイアミ、フロリダ州)から入手した凍結ヒトAMは、保存培地を除去するために、HBSS(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)を用いて2〜3回簡単に洗浄した。AM間質抽出物を調製するために、AM間質は、AMの間質側からスパチュラでこすり落とした。Baptist Hospital(マイアミ、フロリダ州)から入手したヒト胎盤と絨毛膜は、血液を除去するために、HBSSを用いて3回リンスした。水溶性タンパク質抽出物を調製するために、全AM、こすり落としたAM間質、間質を除去したAM、胎盤と絨毛膜は、それぞれ液体窒素の気相中で凍結させ、次いで、それぞれをバイオパルベライザー(BioPulverizer)(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,オクラホマ州)で微粒子になるように粉砕し、その後、PBS(pH7.4)中で、Tissue−Tearor(Biospec Products,Inc.,Dremel,ウィスコンシン州)を用いて、氷上にて1分間ホモジナイズした。得られた各ホモジネートは、1時間かけて混合し、その後14,000xgにて30分間40℃で遠心分離した。得られた各上清(PBS中)を回収し、アリコット(0.5ml)に分け、−80℃で保管した。BCAアッセイ(Pierce、Rockford、イリノイ州)を用いて、それぞれの抽出物中の全タンパク質を定量した。
ヒトAM抽出物の典型的な調製手順においては、全手順は無菌的に行われる。特に断りのない限り、手順ステップ中においてAM抽出物は室温で取り扱うことができる。まず、生の又は凍結状態のヒトAMを、好ましくはBio−Tissue Inc.(マイアミ、フロリダ州)から入手する。凍結AMは、保存培地を除去するために、HBSS(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)を用いて2〜3回簡単に洗浄する。生のヒト胎盤又は絨毛膜は、血液を除去するために、HBSSを用いて3回リンスする。
AM調製物は、例えば、液剤、滴剤、懸濁剤、ペースト剤、スプレー剤、軟膏剤、油剤、乳剤、エアロゾル剤、被覆包帯、パッチ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、などの組成物を製造するために、配送ビヒクルと組み合わせることにより、非固体製剤として、投与目的で処方することができる。使用する剤形は、特定の適用に応じて決定される。ゲル剤は、導入部での有効成分の保持をより向上させ、有効成分のクリアランス前において有効成分の効果をより長く発現させるので、組成物を投与するのに有用である。あるいは、AM調製物は、徐放性固体製剤(経口製剤を含む)として処方することができる。典型的な薬学的に許容される担体又はビヒクル及び希釈剤の記載は、製剤と同様、本明細書中に提供され、また、当技術分野及びUSP/NFにおける標準書である、Remington’s Pharmaceutical Sciences中にも見つけることができる。
本明細書に記載のAM調製物と精製組成物の製剤は、局所投与に適したものを含む。該製剤は単位剤形として便宜的に提供され、薬学分野でよく知られている任意の方法で調製することができる。単回剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される被験者、特に剤形に応じて決定する。
生物学的に活性な成分の真皮表面への配送率は、真皮配送増強剤によって向上させることができる。適切な真皮配送増強剤としては、例えば、ジメチルスルホキシドやジメチルアセトアミドなどのプロトン受容溶媒が挙げられる。他の適切な真皮配送増強剤としては、例えば、2−ピロリジン、N,N−ジエチル−m−トルアミド、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、N,N−ジメチルホルムアミド、N−メチル−2−ピロリジン、テルペン、界面活性剤、チオグリコール酸カルシウムが挙げられる。
本明細書に記載のAM調製物と精製組成物は、眼への局所配送のあらゆる形態を含む、様々な方法で投与することができる。さらに、本明細書に記載のAM調製物と精製組成物は、経口投与や静脈投与などの全身投与も可能である。本明細書に記載のAM調製物と精製組成物は、眼への局所投与することができ、溶液、懸濁液、ゲル又は軟膏などの様々な局所投与可能な眼科用組成物に処方することができる。従って、「眼への投与」は、これに限定されないが、眼内注射、網膜下注射、硝子体内注射、眼窩周囲投与、結膜下注射、眼球後注射、前房内注射(前眼房又は硝子体眼房への投与を含む)、テノン嚢下注射又は埋め込み、眼科用溶液、眼科用懸濁液、眼軟膏剤、眼内埋め込み、及び眼内挿入、眼内液剤、イオントフォレシスの使用、手術用洗浄液への混和、及び湿布(ほんの一例として、脳弓への飽和させた綿球の挿入)を包含する。
筋肉内注射、皮下注射又は静脈内注射に適した製剤としては、生理学的に許容される無菌の水性又は非水性溶液剤、分散剤、懸濁剤又はエマルションが挙げられ、また無菌の注射可能溶液剤又は分散剤に再構成するための無菌粉末剤が挙げられる。適切な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒又はビヒクルとしては、水、エタノール、ポリオール(プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、クレモホールなど)、それらの適切な混合物、植物油(例えば、オリーブ油など)、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを利用することにより、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより維持することができる。皮下注射に適した製剤は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤などの添加剤を含むことができる。微生物の増殖の防止は、様々な抗菌剤や抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など)により確保することができる。また、糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を含んでいることが好ましい。注射可能な製剤形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの吸収遅延剤を用いることにより、達成することができる。
本明細書に記載の経皮製剤は、当技術分野に記載されている各種装置を用いて投与することができる。例えば、このような装置としては、これに限定されないが、米国特許第3,598,122号、第3,598,123号、第3,710,795号、第3,731,683号、第3,742,951号、第3,814,097号、第3,921,636号、第3,972,995号、第3,993,072号、第3,993,073号、第3,996,934号、第4,031,894号、第4,060,084号、第4,069,307号、第4,077,407号、第4,201,211号、第4,230,105号、第4,292,299号、第4,292,303号、第5,336,168号、第5,665,378号、第5,837,280号、第5,869,090号、第6,923,983号、第6,929,801号、第6,946,144号に記載されているものが挙げられ、その全内容はそれぞれ参照によって本明細書に明確に組み入れられる。
本明細書に記載の固体剤形の製剤は、適合性担体、結合剤、充填剤、懸濁剤、矯味矯臭剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、潤滑剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、保湿剤、可塑剤、安定化剤、浸透増強剤、湿潤剤、消泡剤、抗酸化剤、防腐剤、あるいはこれらの1種以上の組み合わせなどの、薬学的に許容される添加剤を1種以上含むことができる。さらに別の態様では、Remington’s Pharmaceutical Sciences、20th Edition(2000)に記載されているような、標準のコーティング手順が使用される。
鼻腔内用製剤は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第4,476,116号、第5,116,817号、第6,391,452号に記載されており、これらはそれぞれ参照によって本明細書に明確に組み入れられる。製剤はこれらの文献や当技術分野で周知の他の技術に従って調製することができ、ベンジルアルコール又は他の適切な防腐剤、フッ化炭素、及び/又は当技術分野で周知の他の可溶化剤又は分散剤を利用して、生理食塩水溶液として調製される。例えば、Ancel,H.C.ら、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Sixth Ed.(1995)参照。これらの組成物と製剤は、適切な無毒性の薬学的に許容される成分を用いて調製することができる。これらの成分は、鼻腔用剤形の調製に関わる当業者にはよく知られており、それらのうちいくつかは、当技術分野における標準的な参考文献である、REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY,21st edition,2005中に見つけることができる。適切な担体の選択は、目的の鼻腔用剤形(例えば、溶液剤、懸濁剤、軟膏剤、又はゲル剤)の正確な性質によって大きく左右される。鼻腔用剤形は有効成分に加えて大量の水を一般的に含む。少量の他の成分(例えば、pH調整剤、乳化剤、分散剤、防腐剤、界面活性剤、ゲル化剤、又は緩衝化剤、他の安定化剤や可溶化剤など)が含まれてもよい。
また、本明細書に記載のAM調製物と精製組成物は、通常の座薬基剤(例えば、ココアバターや他のグリセリドなど)、合成ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン、PEGなど)などを含む直腸用組成物(例えば、浣腸、直腸ゲル、直腸フォーム、直腸エアロゾル、座薬、ゼリー状座薬、又は停留浣腸など)に処方してもよい。座薬形状の該組成物の場合、低融点ワックス、例えば、これに限定されないが、脂肪酸グリセリドの混合物(任意でココアバターと組み合わせて)が最初に融解する。
組成物は、任意の適切な手法により投与することができる。一般的には、該組成物は、目的の場所(例えば、眼表面、皮膚)に直接投与する。製剤の眼表面への投与は、当技術分野に周知である。AM調製物を皮膚に配送したい場合は、局所投与を利用することができる。注射可能な組成物も想定される。投与は非経口的(例えば、皮下投与)でもよい。他の配送方法としては、例えば、リポソーム配送、該組成物を含浸させた装置からの拡散、マイクロエマルションによる経皮配送(いずれも美容用及び医薬用の適用)が当技術分野に周知である。
本明細書に記載の組成物及び方法は、治療される症状に対する特別な有用性のために選択される他の周知の治療剤と併用することもできる。一般に、本明細書に記載の組成物は、併用療法を使用する実施の形態において、他の薬剤を同じ医薬組成物として投与する必要はなく、物理的、化学的性質の違いにより、異なる経路で投与しなければならないかもしれない。投与の形態や投与の推奨度(可能ならば同一医薬組成物中で)の決定は、十分ベテラン医師の知識の範囲内である。初回投与は、当技術分野に周知の確立されたプロトコルに従って行うことができる。次に、確認された効果に基づいて、用量、投与形態、投与回数について、ベテラン医師によって変更することができる。
本明細書に記載の治療への適用に用いるために、キットと製造品もまた本明細書に記載される。このようなキットは、担体、パッケージ、又は一つ以上の容器(例えば、バイアル、チューブなどであり、それぞれの容器は本明細書に記載の方法に使用される個々の要素の一つを収容する)を受け入れるように区分されている容器を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、テストチューブが挙げられる。その容器はガラスやプラスチックなどの様々な材料から製造することができる。
本明細書に記載のAM調製物と精製組成物は研究適用や臨床適用を含む多くの用途を有する。本明細書に記載の結果に基づいて、生理機能の所望の調節を達成するために、本明細書に記載のAM調製物と精製組成物を組織又は細胞に適用することができる。また、所望の効果(本明細書に記載されているような)を達成するために、本明細書に記載のAM調製物と精製組成物を細胞培養液又は組織培養液に添加することもできる。
本明細書に記載のAM調製物と精製組成物の抗瘢痕作用、抗炎症作用、抗血管新生作用は、本明細書に示されるTGF−β1プロモーター活性の抑制により実証される。凍結羊膜の胎児部分は、生の羊膜よりも著しく高い抗瘢痕作用を有する。凍結羊膜の胎盤部分も、生の羊膜よりも著しく高い抗瘢痕作用を有する(実施例1)。従って、凍結AMの胎盤部分又は胎児部分は、TGF−βに対し、生の羊膜よりも強い抑制作用を示した。凍結AMから得られた全AM抽出物によるこの抑制作用は、0.4〜125μg/mlの範囲にわたって用量依存的であった。さらに、このような抑制作用は、高分子HAのみでは代用できず(AM抽出物の100倍相当量を超えた量)、ヒアルロニダーゼによる消化後にはこの抑制作用は失われた。このことにより、この抑制作用はHA−IαIとの複合体によって媒介されることが示唆された。低速又は高速での遠心分離はこの抑制作用に著しい影響は及ぼさなかった。しかし、次の凍結乾燥及び再構成により、より強い抑制作用が生じた。さらに、AMの全体的な抑制作用はAMゼリーよりも高かった。
本明細書に記載のAM調製物と精製組成物は、組織におけるアポトーシスの予防、減少又は治療に用いることができる。ある態様では、本明細書に記載のAM調製物と精製組成物は、損傷した組織におけるアポトーシスを減少又は予防することができる。この抗アポトーシス作用は、該組成物が、移植前に保管されている臓器の寿命を延ばすために使用できることを実証する。また該組成物は、外科手術中とその後における損傷を治療する又は予防するためにも使用することもできる。実施例3は、眼に損傷を負ったマウスモデルを用いてAM抽出物の抗アポトーシス作用を実証している。マウスの眼を採取し、酵素処理あるいは機械的損傷により損傷を与え、AM抽出物を投与し、核に対するアポトーシス性損傷を測定するアッセイを用いて、細胞の損傷に対する作用を判定した。AM抽出物を用いたインキュベーションにより、アポトーシスのレベルが下がることが分かった。
成人や他の哺乳脊椎動物において、皮膚のような組織の創傷治癒は、胎児性組織や胚性組織の治癒の際に起こると思われる再生プロセッシングとは異なり、一般的に修復プロセッシングである。創傷修復プロセッシングの結果は、内因的パラメータ(例えば、組織酸素化)と外因的パラメータ(例えば、創傷ドレッシング)の両方を含む多くの異なる要素の影響を受ける。しかし、創傷し損傷した組織の治癒と修復の全プロセッシング(必要な細胞間の伝達を含む)は、成人や他の哺乳動物において、創傷環境内に開放され、とりわけ血管新生、白血球走化性、線維芽細胞の増殖、遊走、さらにはコラーゲンや他の細胞外基質分子の創傷部位における沈着を引き起こすと思われる多くの特定の可溶性増殖因子により協調して制御されていることを示す多くの証拠がある。確認され、単離されているこのような増殖因子は、一般的に特殊な可溶性タンパク質やポリペプチドであり、トランスフォーミング増殖因子α(TGF−α)、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、など)、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、インスリン様増殖因子IとII(IGFI及びIGFII)、酸性と塩基性線維芽細胞増殖因子(酸性FGFと塩基性FGF)が挙げられる。
本明細書に記載されるように、凍結保存したAMの無血管間質から調製された可溶性タンパク質抽出物を使用し、本明細書に記載のAM調製物と精製組成物の抗血管新生作用が実証された。AM間質抽出物(ASE)は、増殖を抑制し、アポトーシスを引き起こし、遊走を減少させ、管腔形成を阻害することにより、培養したヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対して強力な抗血管新生作用を有することが分かった。実施例8は、羊膜間質抽出物(ASE)が抗血管新生特性を有することを実証している。ASEは、HUVECの細胞増殖を抑制することが分かった(図34)。また、ASEはHUVEC細胞のアポトーシスを引き起こすことも分かった(図35)。ASEによるVEGF誘発細胞遊走を抑制する作用が、トランスウェルアッセイを用いて実証された(図37)。また、ASEはHUVEC細胞の管腔形成を阻害することも分かった(図38)。
本明細書に記載のAM調製物と精製組成物は、炎症を抑えるために使用することができる。AMは、抗炎症能力を与える/媒介する多くの要素(例えば、インターロイキン−10(IL−10)、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)スーパーファミリーに属する因子、プロテアーゼ阻害剤、IL−1受容体拮抗剤(IL−1RA)など)を含む。IL−10は、炎症誘発性サイトカイン(例えば、IL−6、TNFα、IL−8など)を抑制及び対抗することが知られている。Foutunato,ら、Am.J.Obstet.Gynecol.,175:1057−65(1996);Foutunato,ら、Am.J.Obstet.Gynecol.,177:803−9(1997);Foutunato,ら、Am.J.Obstet.Gynecol.,179:794−9(1998)参照。アクチビンとインヒビン(TGF−βスーパーファミリーに属する因子)は、AMによって産生される。各種用量のアクチビンは、異なる結果をもたらす。アクチビンが低用量の場合、IL−6、IL−8、プロスタグランジンE2(PGE2)の産生が促進され、高用量の場合、産生は阻害される。Petraglia,ら、J.Clin.Endocrinol.Metab.,77:542−8(1993);Riley、ら、Hum.Reprod.15:578−83(2000);Keelan,ら、Placenta,31:38−43(2000)参照。AMは、また、α1抗トリプシンのような、抗炎症作用を発現するプロテアーゼ阻害剤を含む。Na,ら、Trophoblast Res.,13:459−66(1999)参照。IL−1RAは、IL−1も阻害剤であり、従って、IL−1が介在している炎症を抑制する。Romero,ら、Am.J.Obstet.Gynecol.,171:912−21(1994)参照。本発明者らは、AMがIL−1の発現と産生を下方制御し、IL−1RAを上方制御することを実証した。Tseng,ら、Ocular Surface J.,2(3):177−187(2004)参照。
ヒアルロニダーゼによる消化
凍結AMから調製した水溶性AM抽出物(AME)を、上記のプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を添加した反応緩衝液(50mMのHEPES(pH7.5)、0.1MのNaCl、1%のTriton X−100、0.1%のBSA)の中で、10ユニット/mlのヒアルロニダーゼ(Sigma、#H1136)を加えて、あるいは加えずに、2時間37℃で混合した。陽性対照として、ヒト臍帯から精製した高分子HA(cat#H1876、Sigma)を用いた。
100mmのプラスチック製皿上でDMEM/10%FBS中で培養したヒト角膜線維芽細胞が80%コンフルエント(約1.0x106個)に達した時点で、細胞を2回、DMEM/10%FBSで洗浄した。アデノウイルス−TGF−β1プロモーター−ルシフェラーゼ(MOI=37.5)とadeno−CMV−β−gal(MOI=30)を、10mlの新鮮なDMEM/10%FBS及び細胞が入った培養プレートに加え、37℃で4時間培養し、その後、4mlのあらかじめ温めておいたトリプシン/EDTAを用いて5分間トリプシン処理をした。8mlのDMEM/10%FBSを用いてトリプシン/EDTAの活性を中和させた後、細胞を15mlチューブに回収し、1,500rpm(約600xg)で5分間遠心分離した。培地をデカントし、その後、細胞を15mlのDMEM/10%FBSに再懸濁し、細胞生存率をトリパンブルー染色により測定した。3x104個の生細胞をプラスチック製24ウェルに、又はAMインサートの間質表面上に播種した。全部で4ウェルと4つのインサートを準備した。次に、細胞を37℃で48時間、CO2インキュベーターの中で培養した。
図1において、プラスチック対照(PL)と比較して、凍結した羊膜の胎盤部分と胎児部分(それぞれ、FRO/P及びFRO/F)は、両方とも、有意なTGF−β1プロモーター活性の抑制を示した(それぞれ、P<0.01)。生の胎盤については、羊膜の胎盤部分(FRE/P)も、有意なTGF−β1プロモーター活性の抑制を示した(P<0.05)。しかし、生の羊膜の胎児部分(FRE/F)は、なんら抑制作用を示さなかった(P=0.5).これらの結果は、生の羊膜の胎児部分は、凍結した同等物と同等の抗創傷作用を有さないことを示した。凍結した羊膜としては、胎盤部分(FRO/P)による抑制作用は、胎児部分による抑制作用と有意差があるとはいえなかった(P=0.3)。生の羊膜については、胎児部分(FRE/F)による抑制作用は、胎盤部分(FRE/P)と有意差があるとはいえなかった(P=0.1)。胎盤部分については、凍結した羊膜(FRO/P)による抑制作用は、生の羊膜(FRE/P)よりも有意に優れていた(P<0.05)。しかし、胎児部分においては、凍結した羊膜(FRO/F)による抑制作用は、生の羊膜(FRE/F)による抑制作用と有意差があるとはいえなかった(P=0.1)。
凍結AMから調製された全水溶性AM抽出物によるTGF−β1プロモーター活性の抑制は、0.04〜125μg/mlの間において、用量反応曲線に従った(図2)。TGF−β1とTGF−βRIIのプロモーター活性により示されるように、凍結AMから調製された25μg/mlの全水溶性AM抽出物の抑制作用は、ヒアルロニダーゼを用いて前処理すると失われた。これにより、この抑制作用は、HA関連複合体により媒介されていることが示された(図3)。なお、25μg/mlのAM抽出物は、0.78μg/ml未満のHAを含んでいた。
100μg/mlの高分子HA単独では、弱い抑制活性を示したが、その大きさは、25μg/mlのAM抽出物よりも著しく低かった。まとめると、これらのデータは、AM抽出物の抑制作用は、HA結合複合体、すなわち、HA−IαI複合体により媒介されていることを示唆する。
プロモーター活性
PBS対照と比較して、HA、AM(全、低速、高速)、ゼリー(全、低速、高速)は、β−ガラクトシダーゼ活性により正規化すると、TGF−β1プロモーターの活性化の抑制を示した。P値により、対照グループ間において、ばらつきによる統計的な有意性が無いことが示された(データ示さず)。全AMEと二つの条件により遠心分離された可溶性AMEとを比較した結果より、有意差がないことが示された。しかし、遠心分離処理されていないAMEは、低又は高可溶性AMEと比較すると、低い抑制を示した。同様に、ゼリー/Tは、ゼリー/HSと比較して、低いTGF−β抑制活性を示した(図5)。
ヒト角膜線維芽細胞は、対照であるHAのみ、及び低濃度のAME又はゼリー抽出物中では、細胞形態になんら変化を示さなかった(データ示さず)。しかし、高濃度のAMEとL/AMEで処理した後は、早くも播種後18時間には、細胞は著しく変化し、細くかつ小さくなった(図6)。さらに、細胞密度も減少した。上記変化は、AMEとゼリー抽出物それぞれにおいて、凍結乾燥AME又はL/AMEの場合、凍結乾燥しなかった同等物と比べ、より劇的だった(図6)。
次に、天然タイプ1コラーゲンゲルと水溶性AM抽出物の混合物を調製した。この混合物を調製するために、最初に、ラットの尾腱(BD Biosciences,San Jose、カリフォルニア州)から調製した4mg/mlのコラーゲンのストック溶液を0.1N酢酸を用いて希釈し、1/20容量の20xDMEM及び1NのNaOHと混合することにより、コラーゲンゲルを調製した。37℃でインキュベーションすることにより、コラーゲンゲルが形成された。次に、水溶性AM抽出物(本明細書に記載されているように調製された)を、DMEM中に25μg/mlの濃度になるように希釈し、その後上記コラーゲンゲルと混合した。タイプ1コラーゲンゲルと混合したAM抽出物の抑制作用は、BSAのみを添加した対照と比較して、AM抽出物(AME)のみを使用した場合の抑制作用と同様だった(図8、P<0.01)。コラーゲンゲルのみ(Col)も、プラスチックの対照と比べると、同様の抑制活性を示した(図8、P<0.01)。AMEをコラーゲンゲルに添加すると(Col+AME)、より抑制された(図8、P<0.01)。水溶性AM抽出物(AME)をHAゲルと混合すると、TGF−β1のプロモーター活性に対する抑制作用は、AMEのみにより発現される抑制作用と同じように(図9)、HAのみ(対照として、BSAと混合した)と比較して、より保存された(図5、P<0.01)。従って、AM抽出組成物、又はこれのコラーゲンとの併用は、眼組織におけるTGF−β活性を抑制するのに有用である。
材料と方法
各抽出物中のタンパク質の濃度は、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce、Rockford、イリノイ州)により定量した。各抽出物中のヒアルロン酸(HA)の濃度は、HAの段階希釈により作成されたメーカーにより提供された検量線を用いて、ELISAに基づくヒアルロン酸(HA)定量テストキット(Corgenix,Westminster、コロラド州)を用いてアッセイした。
各種抽出物のHAの分子量範囲を、Lee及びCowmanにより記述される方法(Lee,H.G.及びCowman,M.K.An Agarose Gel Electrophoretic Method for Analysis of Hyaluronan Molecular Weight Distribution.Analytical Biochemistry,1994,219,278−287)に従って、アガロースゲル電気泳動により分析した。サンプルを、0.5%アガロースゲル電気泳動にアプライし、次に0.005%のステインズオール(Stains−All)(Sigma、cat#23096−0)を用いて50%のエタノール中で染色した。ゲルの染色は、室温にて光保護カバーで覆い、一晩行った(3〜4時間のこれより短い時間での染色も許容される結果をもたらす)。そのゲルを水に移し、約6時間室内用照明器具に暴露することにより、脱染すると、HAは、青いバンドとして可視化された。分子量スタンダードは、分子量0.9〜5.7x106の範囲にわたるラムダDNA−BstEII消化制限フラグメント(cat#D9793、Sigma)を含んでいた。HAの確実性は、陽性対照としてヒト臍帯から精製した高分子HA(cat#H1876、Sigma)を用い、反応緩衝液(上記プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を加えた、50mMのTris−HCl(pH7.5)、0.1MのNaCl、1%のTriton X−100、0.1%のBSA)の中で、10ユニット/mlのヒアルロニダーゼ(Sigma、#H1136)を加えて、又は加えずに抽出物を2時間37℃でインキュベーションすることにより、さらに実証した。
上記抽出物を4〜15%変性アクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。その後、ウサギ抗ヒトインター−α−トリプシン阻害剤(ウサギポリクローナル抗体(cat#A0301、DAKO、1:1000))、ウサギ抗ヒトTSG−6ポリクローナル抗体(Dr.Tony Day氏により提供された、1:1000希釈)、ラットモノクローナル抗−PTX3抗体(Alexis Biochemicals,ALV−804−464,1μg/ml)、Calibiochemから入手した抗トロンボスポンジン1抗体(cat#BA24)、ヤギ抗ヒトSmad7抗体(AF2029、1:1000、R&D Systems)を用いてイムノブッロトを実施した。免疫反応性タンパクバンドは、Western Lighting TMC化学発光試薬(PerkinElmer)により検出した。
実験により、水溶性AM抽出物が90℃で10分間前処理された場合、観察されたTGF−β1プロモーター活性に対する抑制作用が消滅したことが示された。これにより、関係する成分は、立体構造が重要なタンパク質を含んでいる可能性が高いことが示唆された。
以下の表にまとめた結果は、全てのAMとゼリー抽出物が、HAとタンパク質の両方を含んでいることを示した。一般に、全抽出物中におけるタンパク質とHAとの重量比は、AMを遠心分離した後の上清(例えば、PBSにおけるLとH、かつバッファーAにおけるA)よりも高い。これにより、ほとんどのタンパク質含有物質は、遠心分離により除去されることが示唆された。しかし、この傾向はAMゼリーには認められなかった。これにより、AM抽出物は、ゼリーよりも多くのタンパク質を含んでいることが示唆された(PBSにおけるT及びA/B/CにおけるT参照)。また、タンパク質とHAとの比は、AMとAMゼリーの両方において、抽出物Aから抽出物B及びCへと増加した。このことは、HAはほとんどが可溶性形態で含まれ、反対に、タンパク質は非水溶性成分中に含まれていることを支持する。さらに、HAは、A/B/Cにおいて、遠心分離後、AMゼリーから大部分が除去された。
高分子量(>106Da)のHAは、全抽出物中や抽出物A中に存在していた(図10)。しかし、より大きい分子量のHAが抽出物B中に存在しており、また、抽出物C中には、HAがさらに大きい分子量を持つ細いバンド中に含まれていた(図10)。全てのHA含有成分は、ヒアルロニダーゼ消化後消滅した。これにより、これらの抽出物は実際にHAを含んでいたことが確認された。陽性対照であるSigmaから入手したHA(cat#H1136)と比較して、同じような高分子量(>106Da)のHAが、低速と高速遠心分離後に得られた上清の両方にも含まれていた(図11)。また、これらのHA含有バンドは、ヒアルロニダーゼ消化後消滅した。AMゼリーについても、同様の結果が得られた(図示せず)。
図12は、ヒアルロニダーゼによる消化前には、遊離重鎖が異なる複合体中に存在し、少量の軽鎖(UTI又はビクニン)も存在していることを示した。しかし、全ての抽出物中、すなわち、全抽出物と抽出物A、B、C中において、HAとIαIの重鎖間で共有結合した複合体が存在し、その後者は、ヒアルロニダーゼによる消化後のみ遊離した。同じ結果が、異なる2種の速さの遠心分離処理により得られた抽出物H及びLにおいても得られた(図13)。
図14は、TSG−6(約38kDa)が、全抽出物、抽出物A、抽出物C中に存在していることを示した。抽出物Aには、精製TSG−6(約35kD)のバンドに近い約38kDaの移動バンドが存在した。他の約45kDaと55kDaのバンドの正体は分からなかった。全AM抽出物(遠心分離処理なし)である、「T」は、抽出物A(遠心分離処理後)に含まれていた二本のバンド(両方とも35kDより大きい)及びそれよりさらに大きい一本のバンド(55kD)を示したが、その低いほうのバンド(45kD)は、抽出物Cにも含まれていた。これらの全てのバンドは、サンプルをヒアルロニダーゼ(図14)又はF−グリコシダーゼ(図15)により処理をしても、著しく変化しなかった。しかし、コンドロイチン硫酸ABCリアーゼを用いた消化により、MAB2104抗体(図17)ではなく、RAH−1抗体(図16)を用いることにより、よりはっきりと分かる38kDバンドをもたらした。
図18は、PTX−3もAM抽出物中に存在することができ、水溶性抽出物A中でのみ、HAと複合体を形成することを示した。
図19は、全てのAM抽出物は、TSP−1の高分子量のバンドを有し、一方、全抽出物(T)と抽出物Cもまた、35〜120kDa間にいくつかのバンドも有することを示した。ヒアルロニダーゼによる消化によっても、いくつかのバンドが若干強くなったり弱くなったりした以外は、反応パターンは変わらなかった。
Smad7は、AMのPBS抽出物中及び尿素抽出物中の両方に含まれていた(図20)。
結果
AM抽出物が、損傷した組織におけるアポトーシスを阻止することができることを実証するために、マウスモデルを用いて以下の実験を実施した。全部で22匹のマウスの眼球を摘出し、そのうちの2つを、前処理対照として凍結切片を得るために、直ちにOCTに包埋した。残りの20眼球は、3つのサブグループに分けた。すなわち、1)機械的掻爬(n=8);2)消化処理(酵素的)(n=6);3)無処理の対照(n=6)。各グループにおいて、同じ数の眼球を、処理に先だって、規定の添加剤(Gibco、Carlsbad、カリフォルニア州)を添加した角膜実質細胞無血清培地(KSFM)中において、125μg/mlのAM抽出物が存在する(+)又は存在しない(−)条件下にて4℃で24時間、プレインキュベートした。KSFM+/−AM抽出物(本明細書に記載のように調製)中にてインキュベート開始後最初の24時間の終わりに、サブグループ1の8個の眼球を、手術用刃を用いて機械的に掻爬し、これをさらに二つのグループに分けた(それぞれ、n=4)。その後、KSFM+/−AM抽出物にて37℃でインキュベートした。サブグループ2の6個の眼球に対し、10mg/mlのディスパーゼIIを用いて、KSFM+/−AM抽出物中において、18時間4℃で酵素消化をした(それぞれ、n=3)。各グループからの1個の眼球をOCTに包埋し、凍結切片を得た。各グループの残りの2個の眼球は、分析前に、さらに24時間、KSFM+/−AM抽出物中において、インキュベートした。無処理の対照(n=6)については、3個の眼球をそれぞれ、KSFM+/−AM抽出物中において、37℃で連続的に2日間インキュベートした。1個の眼球は、最初の一日の最後に取り出し、2個の眼球は、2日の最後に取り出した。
材料
ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、アンホテリシンB、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清(FBS)、0.25%のトリプシン/0.53mMのEDTA、ライブアンドデッド細胞生存率アッセイ試薬(Live and Dead cell viability assay reagent)、FITC結合ファロイジンはInvitrogen(Carlsbad,カリフォルニア州)から購入した。ウシ血清アルブミン(BSA)、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤、ホルムアルデヒド、プロテアーゼ阻害剤カクテル、マウス抗デスミン抗体、FITC結合抗マウス、ヤギ、ラットIgG、ヨウ化プロピジウム、ヘキスト−33342色素はSigma(St.Louis,ミズーリ州)から入手した。トランスウェルインサートは、コーニング社(Corning,ニューヨーク州)から入手した。タイプIコラーゲンは、BD Biosciences(Bedford,マサチューセッツ州)から入手した。BCA(登録商標)タンパク質アッセイキットは、Pierce(Rockford,イリノイ州)から入手した。ディスパーゼIIとコラゲーゼはRoche(Penzberg,ドイツ)から入手した。マウス抗αSMAとKi67抗体はDakoCytomation(Carpinteria,カリフォルニア州)から入手した。ウサギ抗ビメンチン抗体はAbcam(Cambridge,マサチューセッツ州)から入手した。マウス抗EDAフィブロネクチン抗体はChemicon(Temecula,カリフォルニア州)から入手した。HRP結合抗マウスIgGは、BioRad(Hercules,カリフォルニア州)から入手した。退色防止封入液はVector Laboratories(Burlingame、カリフォルニア州)から入手した。凍結保存ヒトAMはBio−Tissue(マイアミ,フロリダ州)から入手した。
ヒトの組織は、ヘルシンキ宣言に従って取り扱った。生のヒト胎盤は、Baptist Hospital(マイアミ,フロリダ州)から、IRB承認プロトコルに基づいて、インフォームドコンセントを得てから帝王切開後入手した。ゲンタマイシンとアンホテリシンBを含むPBSにより2回リンスを行った後、AMを絨毛膜から機械的にはがし取り、小片(約30mmの直径)にカットした。その後、10%のFBSを含むDMEM中の10mg/mlのディスパーゼIIを用いて消化処理を37℃にて20分間行った。その後、解剖顕微鏡下で羊膜上皮を外科的ピーリングにより取り除き、残りの間質を、10%のFBSを含むDMEM中の2mg/mlのコラゲナーゼにより、37℃にて14時間さらに消化した。800xgで5分間の遠心分離により細胞を回収し、10%のFBSを含むDMEMに再懸濁し、加湿環境下、空中5%のCO2で37℃にて培養した。培地は2日おきに交換した。酵素消化前のAMも、凍結切片作成のために、OCTに包埋した。ヒト強角膜組織は、Florida Lions Eye Bank(マイアミ,フロリダ州)から入手した。そこから、角膜線維芽細胞(HCF)を採取し、10%のFBSを含むDMEMで培養した。継代2代目(P1)の細胞を全ての実験に使用した。
無菌的方法を用い、凍結保存されたヒトAMを、保存培地を除去するために、HBSSを用いて2〜3回簡単に洗浄した。AM間質はスパチュラでこすり落とし、液体窒素の気相中で凍結させ、バイオパルベライザー(BioPulverizer)(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,オクラホマ州)で微粒子になるように粉砕し、その後、PBS(pH7.4)中で、Tissue−Tearor(BioSpec Products,Inc.,Dremel,ウィスコンシン州)を用いて、氷上にて1分間ホモジナイズした。得られたホモジネートは、1時間回転することにより混合し、その後14,000xgにて30分間4℃で遠心分離した。得られたPBS中の上清を回収し、アリコットに分け、−80℃で保管した。タンパク質濃度は、BCAアッセイを用いて定量した。この水溶性タンパク質抽出物は羊膜間質抽出物(ASE)と命名した。AMインサートの調製については、AMを使用する直前に解凍し、HBSSで3回洗浄し、約2.5x2.5cmの大きさの小片にカットし、間質基質が上を向くようにして、カルチャーインサート上に固定した。
AMのクリオスタット切片(4μm)を、アセトン中で10分間−20℃にて固定し、培養したAMSCとAMSCを含んだAM全マウントを、4%パラホルムアルデヒド中で30分間4℃にて固定した。切片又は培養細胞は、PBSで3回、各5分間ずつリンスし、その後0.2%Triton X−100で10分間インキュベートした。PBSで3回、各5分間ずつリンスし、非特異的染色をブロックするために、2%BSAでプレインキュベーションした。切片又は細胞は、抗αSMA(1:200)抗体、抗デスミン(1:200)抗体及び抗ビメンチン(1:200)抗体を加えて、1時間インキュベートした。PBSで3回15分間洗浄を行い、その後、切片又は細胞は、FITC又はテキサスレッド結合二次抗体を加えて、45分間インキュベートした。F−アクチンで標識するために、細胞は、さらに200ユニット/mlの濃度のFITC結合ファロイジンで15分間染色した。さらにPBSで3回、各15分間ずつ洗浄を行い、その後、核をPI(1:2000)で1分間、又はヘキスト−33342で15分間染色し、次いで、蛍光顕微鏡で分析した。Ki67の免疫組織化学染色のために、内在性のペルオキシダーゼ活性を、0.6%の過酸化水素で10分間処理することによりブロックした。非特異的染色は、1%の通常のヤギ血清で30分間処理することによりブロックした。次に、細胞を抗Ki67抗体(1:50)を加えて1時間インキュベートした。PBSで3回、各15分間ずつ洗浄を行い、その後、細胞は、ビオチン化したウサギ抗マウスIgG(1:100)を加えて30分間インキュベートした。次に、ABC試薬を加えて30分間インキュベートした。反応生成物は、DABで5分間処理して発色させ、光学顕微鏡下で調査した。
プラスチック、コラーゲン、又はAM表面から、培養したAMSC又は筋線維芽細胞を回収し、冷RIPA緩衝液(50mMのTris−Cl(pH7.5)、150mMのNaCl、1%のノニデットP−40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のSDS及びプロテアーゼ阻害剤カクテル)で抽出した。溶解物から抽出した同じ量のタンパク質を4%〜15%のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル(SDS−PAGE)上で分離し、その後、ニトロセルロース膜に電気泳動的に移した。5%の脱脂乳で1時間ブロッキングを行った後、ブロットを、αSMAとED−Aフィブロネクチンに対する一次抗体を加えてインキュベートした。添加対照として、αアクチンを使用した。特定の結合は、抗マウス又は抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体により検出し、化学発光法により増強して可視化した。
上記の実験は、全て3回(各回につき3通り以上)繰り返した。群平均は、適切なバージョンのスチューデント不対t検定を用いて比較した。試験結果は、p<0.05の両側p値を統計的に有意とみなして記載した。要約データは、平均±S.D.として記載する。
AMSCの生体内での表現型
羊膜上皮細胞をディスパーゼIIにより除去した後、AM中のAMSCは、in situで観察することができた。位相差顕微鏡により、それらは樹状形態を示し、薄化ステップにより細胞間接触を維持していた(図21A)。細胞生存率、樹状形態、細胞間接触は、ライブアンドデッド(Live and Dead)アッセイを用いて染色することにより、より良好に可視化された(図21B)。AMの横断面の免疫染色により、AMSCがαSMA(図21C)とデスミン(図21D)を発現しないことが示された。一方、陽性対照としての臍帯間葉系細胞は、αSMAとデスミンの両方に対し、強い染色を示した(それぞれ、図21C、21Dの挿入図参照)。しかし、すべてのAMSCはビメンチンを発現した(図21E)。これらのデータは、ひとまとめにすると、AMSCは、生体内で繊維芽細胞の表原型を有していることを示した。
AMSCのインビトロの分化を調べるために、コラゲナーゼにより単離したAMSCをプラスチック皿上に播種し、10%のFBSを含んだDMEMで、200個/mm2の密度で培養した。4〜5日以内に、細胞は典型的な繊維芽細胞の細胞形状をとり(図22A)、かつαSMA陰性のままであった(図22E)。しかし、ある細胞は、1週間の培養の終わりには、細胞の大きさが増加し始め、形状が変化し始め(図22B)、かつαSMAを発現し始めた(図22F)。別のプラスチック皿で同じ培地を用いて継代培養した後、大部分の細胞は、1週間の継代1代目の終わりには、典型的な筋繊維芽細胞の細胞形状を発現し(図22C)、最終的には全ての細胞が、1週間の継代2代目の終わりには筋繊維芽細胞の形状に変化し、顕著な微小線維を有した(図22D)。従って、αSMA陽性筋繊維芽細胞は、1週間の初代培養における71.9±3.7%から、継代1代目の培養には93.9±4.1%、継代2代目の培養には98.5±1.7%へと劇的に増加した(図22I)。にもかかわらず、デスミンの発現は、継代2代目の培養でもいまだ陰性だった(データ示さず)。ウェスタンブロット分析は、生体内のAMSCは、ED−Aフィブロネクチンを弱く発現していたが、αSMAは発現していなかったことを示した。しかし、αSMAとED−Aフィブロネクチンの発現は初代培養の終わりには劇的に増加し、継代2代目においても維持されていた(図22J)。これらの結果は、AMSCがこの血清含有培地を用いたプラスチック上で迅速に筋繊維芽細胞に分化したことを示した。
我々の過去の研究において、我々は、初代培養からAMの間質基質上でヒト又はマウスの角膜実質細胞を培養すると、AMがヒト又はマウスの角膜実質細胞の筋繊維芽細胞への分化を阻害しうることを示した。AM間質基質が分化した筋繊維芽細胞の表現型も強力に調節するかどうかさらに調べるために、継代2代目におけるAMSCから分化した筋繊維芽細胞をAMの間質基質上で継代培養し、対照としてコラーゲンIで被覆した皿上で継代培養したものと比較した。10%のFBSを含むDMEM中で培養を開始してから7日間後、コラーゲンI上のAMSCは、いまだに筋繊維芽細胞の形状を維持していた(図23A)。これに対し、AM間質基質上に播種した細胞は、円形、紡錘形、細長い形、樹状形が混ざっている形状を呈していた(図23B)。ライブアンドデッド(Live and Dead)アッセイにより、コラーゲンI(図23C)とAM基質(図23D)上の細胞は、両者ともに100%の生存率を維持していることが確認されたが、細胞形状は著しく異なっていることが分かった。ファロイジンに対する免疫染色により、コラーゲンI上に播種された筋繊維芽細胞においては、鮮明なストレスファイバー(図23E)が示され、これはまた強いαSMA発現も含んでいた(図23G)。これに対し、AM間質基質上に播種した細胞においては、ファロイジン染色は弱くかつまばらで(図23F)、αSMA染色はぼんやりしていた(図23H)。ウェスタンブロット分析により、AMSC由来の筋繊維芽細胞は、タイプIコラーゲン上に播種された場合、連続して多量のED−AフィブロネクチンとαSMAを発現することが確認された(図23I)。これに対し、AM間質基質上に播種された場合、ED−Aフィブロネクチンの発現は減少し、αSMAの発現は検出できなくなった(図23I)。これらの結果をまとめると、AMSCから分化した筋繊維芽細胞は、AM間質基質上で継代培養した場合、いまだに繊維芽細胞の表現型に逆行しうることが示された。
AM間質基質による上記の逆行活性が水溶性AM間質抽出物中で保持されるかどうかさらに調べるために、初代AMSC(P0)を、10%のFBSを含むDMEM中で、100μg/mlのASEを加えて、あるいは加えずにプラスチック上で培養した。その結果、AMSCは、ASEの有無に関わらず培養を開始してから4日後において、紡錘状の繊維芽細胞の形状を維持していることが分かった(それぞれ、図24A、24B)。しかし、その時、ASEを添加しなかった場合、αSMAを既に発現しており(図24E)、一方、ASEを添加した場合、αSMAの発現をしないままだった(図24F)。培養を10日間に延長した場合、図2に示すように、AMSCは拡張した形状を示し、活発にファロイジン陽性ストレスファイバーを発現し(図24C)、αSMAの陽性発現を含んでいた(図24G)。印象的だったのは、ASEが存在する場合、AMSCは小核と共に凝集して、様々な大きさの球を形成した(図24D)。球になったこれらの細胞は、ライブアンドデッド(Live and Dead)アッセイにより、生存可能な状態を維持していた(データ示さず)。いくつかの球は、プラスチック皿から離れるが、10%のFBSを含むDMEMに切り替えると、新しいプラスチック皿に再び付着することができ、新たに筋繊維芽細胞の増殖を開始した(データ示さず)。ファロイジン染色により、ストレスファイバーは全く発現せず(図24D)、一方、球におけるαSMAの発現は弱いことが分かった(図24H)。これらの結果により、ASEは実際にAMSCの筋繊維芽細胞への分化を妨げることができることが示された。
上記ASEによるAMSCの筋繊維芽細胞から繊維芽細胞への表現型の逆行が、細胞の増殖に伴って起こるかどうかさらに調べるために、我々は、図2において記述したようにほとんど全ての細胞が筋繊維芽細胞に変化した継代3代目の培養液において、10%のFBSを含むDMEMから無血清のDMEM/ITSに培地を切り替えた。6日間の観察プロセッシングにおいて、対照倍地中の細胞は、細胞質中に顕著なストレスファイバーを有する同じ筋繊維芽細胞形態を維持していた(図26A及び26D)。しかし、ASEを加えた実験培地中の細胞は、徐々にその形状を、0日目(図24E)の大きくかつ扁平な形状から、2日目と4日目(それぞれ、図26F及び26G)には紡錘状かつ細長い形状に変化させ、6日目(図26H)において、最終的には、いくつかの細胞は縮んで小さくなった。ASEの添加により引き起こされたこのような劇的な形態の変化に伴って、αSMAを発現するストレスファイバーも失われた(図26I〜26L)。Ki67染色により、P3の培養液のDMEM/ITS中の筋繊維芽細胞は、ASEの添加の有無に関わらず、細胞増殖を全く発現しなかったことが確認された(それぞれ、図26M、26N)。対照として、P1培養液中のAMSCは、10%のFBSを含むDMEM中のプラスチック上で培養した場合、時々Ki67陽性核を示した(図26O)。一方、10%のFBSを含むDMEM中のプラスチック上で培養したヒトの角膜繊維芽細胞の多くは、Ki67陽性核を示した(図26P)。これらの結果は、ASEは、細胞増殖に影響を及ぼすことなく、AMSCの筋繊維芽細胞への分化を妨げるだけでなく、AMSCから分化した筋繊維芽細胞を繊維芽細胞に逆行させるという概念を強く支持した。
コラゲナーゼにより新たに単離したマウス間質細胞は、10%のFBSを含むDMEM中のプラスチック上で培養すると繊維芽細胞の形態を発現したが、同じ培地を用いてAM間質基質上で培養すると、樹状形態を発現した。免疫染色により、10ng/mlのTGF−β1による暴露後でさえ、ITSを含むDMEM中のAM上で培養した樹状形態の角膜実質細胞におけるSmad4による核排除が示された。これに対し、細胞の増加率は、プラスチック上で培養した場合の13%から、10ng/mlのTGF−β1を添加後3時間及び5日間経過すると、それぞれ67%及び85%に増加した。これらの結果は、AM間質基質は、角膜実質細胞の表現型を維持するのに役立つSmad媒介T−TGF−βシグナル伝達を抑制することを示唆する。
材料及び方法
PBSによる全可溶性ヒトの羊膜抽出物の調製
全可溶性ヒトAM抽出物(T)の調製に関する全手順は、次の細胞培養ベースの実験で使用できるように無菌的に行った。凍結ヒト胎盤は、Bio−Tissue Inc.(マイアミ、フロリダ州)から入手し、そこからAMを回収した。AMは、バイオパルベライザー(BioPulverizer)(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,オクラホマ州)の容器に入るように、小片にスライスし、液体窒素で凍結させ、次いで微粉末になるよう粉砕した。得られた粉末は秤量し、プロテアーゼ阻害剤(プロテアーゼ阻害剤カクテル、P8340、Sigma、1mMのPMSFを含む)とホスファターゼ阻害剤(50mMのフッ化ナトリウムと0.2mMのバナジン酸ナトリウム)を含む冷PBS緩衝液(10xPBS(cat#70011−044、Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)から蒸留水を加えて1xPBS(pH7.4)に調製した)と1:1(ml/g)の割合で混合した。混合物は氷上に保持し、Tissue−Tearor(BioSpec Products,Inc.,Dremel,ウィスコンシン州)を用いて、5回、各1分間ずつ(各回が終わるたびに2分間冷却する)ホモジナイズした。この水溶性抽出物は「全」(T)と命名した。全水溶性抽出物は4℃にて1時間混合し、次に4℃で30分間48000xgにて遠心分離した。得られた上清はアリコットに分け、−80℃で保管した。
ヒトの組織は、ヘルシンキ宣言の原則に従って取り扱った。角膜縁は、ドナーの角膜(Medical Eye Bank of Florida,Orlando,フロリダ州)又は移植後のドナーの角膜(Florida Lions Eye Bank,マイアミ,フロリダ州)のいずれかから入手した。余分な強膜、虹彩、角膜内皮、結膜、テノン嚢は取り除いた。残りの角膜縁は、HEPES緩衝タイプのDMEMと、5%のFBS、0.5%DMSO、2ng/mlのマウスEGF、5μg/mlのインスリン、5μg/mlのトランスフェリン、5ng/mlのセレニウム、0.5μg/mlのヒドロコルチゾン、10nMのコレラ毒、50μg/mlのゲンタマイシン、1.25μg/mlのアンホテリシンBを含むHam F12培地と、の同容量混合物からなるSHEM培地で3回簡単にリンスした。それぞれの角膜縁は、等しく二等分に分割し、各半分にされたものは、さらに6つの外植片に等しく分割し、すなわち、一つの角膜縁につき12の外植片を作成した。年齢、性別、人種によるバラツキを排除するために、同一のドナーの角膜において相当する場所からの外植片を対照グループと実験グループとしてそれぞれ選択した。外植片は、上皮サイドを上に向けて、各6つのウェルの中央に配置し、SHEM又は25μg/mlの上記全AM抽出物を含むSHEMにより培養した。培養液は37℃で95%の湿度及び5%のCO2の下で維持し、培地は一日おきに交換した。外植片の増殖は、倒立位相差顕微鏡(ニコン、日本)を用いて14日間毎日モニターした。増殖した面積は、アドービフォトショップ(Adobe Photoshop)5.5により一日おきにデジタル化し、NIH ImageJ 1.30v(NIH,Bethesda、メリーランド州)により分析した。
MTTアッセイ(細胞増殖キットI、cat#11465007001、Roche Applied Science, Indianapolis、インディアナ州)は、代謝的に活性な細胞により黄色のテトラゾリウム塩であるMTTが切断され紫色のホルマザン結晶へと変化する原理に基づく比色分析アッセイである。SHEM(対照グループ)又は25μg/mlのAMEを含むSHEM(AMEグループ)により14日間培養したヒトの角膜縁の外植片から増殖した細胞をトリプシン/EDTA消化によりばらばらにして回収し、SHEM培地に再懸濁した。細胞数は血球計数器によりカウントし、96ウェルあたり2000個の細胞を100μlの培地を用いて播種した。各グループはさらに3つのサブグループ(対照(添加剤なし)、PBS(2μlのPBSを細胞播種後直ちに添加)、AME(2μlの1250μg/mlのAME(AMEの最終濃度を25μg/mlにした)を細胞播種後直ちに添加))に分けた。各サブグループは、合計16のウェル(繰り返しによって)からなる。細胞は、37℃で95%の湿度、5%のCO2の下、一日おきに培地交換をしながら、10日間培養した。MTTアッセイを実施する際には、10μlのMTT標識試薬(最終濃度:0.5mg/ml)を各96ウェルに加えた。96ウェルプレートは、同じ培養条件下で4時間インキュベートした。その後、100μlの可溶化溶液を各ウェルに加え、次いでプレートをさらに20時間、同じ条件下でインキュベートした。サンプルの分光吸光度はマイクロプレートリーダー(Fusion(登録商標)、Meriden,コネチカット州)を用いて、550nmの波長にて測定し、650nmの参照波長における吸光度も測定し、両測定値の差を求めた。
14日間の培養後、外植片をウェルから取り出し、OCT(Tissue−Tek)に包埋し、液体窒素中で短時間で凍結させ、−80℃で保管した。組織は、スノウコート(snowcoat)X−Tra(登録商標)マイクロスライド(Surgipath,Richmond,イリノイ州)上で、ミクロトームプラス(Microtome Plus,Triangle Biomedical Sciences,Durham,ノースカロライナ州)を用いて、6μmにて切片化した。その後、該切片は、10%ホルマリン中で10分間固定し、ハリス・ヘマトキシリンで5分間染色し、次いで1%エオジンYで1分間25℃にて染色した。組織は、一連の70%、95%、100%アルコールでそれぞれ5分間ずつ脱水し、最後にキシレン(SUB−X(登録商標)、Xylene Substitute,Surgipath)で処理し、カバースリップを載せた。このスライドを倒立顕微鏡(ECLIPSE,TE2000−U,ニコン)の下で観察した。
AM抽出物はヒトの角膜縁の外植片からの上皮の遊走を遅くし、その結果、増殖物中の上皮細胞は減少したが、多くの前駆細胞が含まれていた。
以下に示す表は、AM抽出物を添加した培地において、角膜縁の外植片からの上皮の増殖の開始が遅れ、その結果、上皮の増殖物中にはより少ない細胞が含まれていたことを示す。
図27Aにおいて、SHEM(対照)とSHEM/AME(AME)の両方で培養したヒトの角膜縁の外植片からの増殖物は、同様の上皮層を形成した。しかし、繊維芽細胞様細胞は、対照中にのみいくつか見られたが、AME培養液中には見られなかった。これは、AMEは繊維芽細胞の遊走を抑制するかもしれないことを示す。図27Bにおいて、14日間の培養後、ヒトの角膜縁の外植片を培養ウェルから取り出し、包埋し、切片化し、H&Eで染色した。対照中よりも、AME中に非常に多くの間質細胞が存在していた。これは、おそらくAMEが繊維芽細胞の遊走を抑制したことにより起こったと考えられる。
SHEM(対照)とSHEM/AME(AME)の両方で14日間培養したヒトの角膜縁の外植片からの増殖物を別々に回収し、MTTアッセイで記述したように、96個の各ウェルに、1ウェルあたり2000個の細胞となるように播種した。対照からの細胞は、カラム1〜3(1:対照;2:PBS;3:AME;ここでは1つのプレートにつきn=8と示したが、同様の結果を有する複製としてはn=16)に播種し、AMEからの細胞は、カラム4〜6(1:対照;2:PBS;3:AME)に播種した。10日間の培養後、細胞はMTTアッセイに使用した。繊維芽細胞の増殖について、サブグループ間(対照、PBSとAME)において有意な差はなかったが、SHEMとSHEM/AMEにおける増殖物に由来する細胞間には、繊維芽細胞の増殖について、統計的に有意な差があった(図28A)。繊維芽細胞は上皮細胞よりも非常に早く増殖するので、MTT試薬を加えると、繊維芽細胞を含むウェルも非常に早くピンク色になった。対照とAMEにおける繊維芽細胞の増殖の統計的分析は、AMEが繊維芽細胞の増殖を著しく抑制することを示した(p=0.01)(図28B)。
ヒトの角膜縁の外植片をSHEM(対照)のみかSHEM/AME(100μg/ml)中で培養した。10日間の培養後、増殖した上皮細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、再度細胞数をカウントした。上皮細胞の増殖は、AMEによって著しく抑制された。すなわち、SHEM中で培養した3つの外植片からの細胞の合計は、9x105だったが、SHEM/AME中で培養した3つの外植片からの細胞の合計は、2.3x105であり、対照/AMEの比は3.9である。これらの細胞を、500個又は1000個ずつ、60mmの皿(約18又は36個/cm2)における、SHEM培地中でMMC前処理(4μg/mlで37℃にて2時間)をしたスイス3T3フィーダーレイヤー上に播種した。播種してから4〜5日後、上皮クローンが形成し始めた。SHEM/AMEを用いて前もって培養した細胞由来のクローンは、SHEMのみを用いて前もって培養した細胞由来のクローンよりも数が多くかつサイズも大きかった(p<0.05)。クローンは、10日目まで増殖させ、その後クリスタルバイオレット色素で染色し、クローンの数と大きさが分かるようにした。
SHEM(対照)とSHEM/AME(AME)の両方で14日間培養したヒトの角膜縁の外植片からの増殖物は、同様の上皮層を形成した。しかし、上皮層の縁部が異なっていた:対照の上皮層の縁部はざらざらで、一方、AMEの上皮層の縁部は滑らかだった(図29、対照:左のパネル;AME:右のパネル)。この現象は、MAPKp38阻害剤(SHEM中の10μMのSB203580)による、ヒトの角膜縁の外植片の増殖に対する影響に似ていた(データ示さず)。これは、AMEは、MAPKp38を阻害しうる成分を含んでいるという別の証拠を提供した。
材料と方法
細胞培養とIFNγ刺激
マウスマクロファージ細胞株であるRaw264.7細胞は、ATCCから入手し、10%のウシ胎児血清、50μg/mlのゲンタマイシン、1.25μg/mlのフンギゾンを添加した、フェノールレッドを含まない、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)を用いて、100mmの培養皿中で培養した。細胞が70%〜80%コンフルエントに達したら、培地を除去し、トリプシン/EDTAを用い10分間25℃で処理した。消化後、細胞はまだ皿にしっかり付着していたので、トリプシン/EDTA溶液を除去した。次に、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム(ITS:1000ml中に5mgのインスリン、5mgのヒトトランスフェリン、5μgの亜セレン酸ナトリウムを含む。Sigma,St.Louis,ミズーリ州)を含む5mlのDMEMを皿に加え、細胞をピペッティングにより回収した。500xgで5分間遠心分離した後、培地を除去し、細胞ペレットをDMEM/ITS培地に再懸濁した。次に、細胞数をカウントし、細胞密度を0.5x106/mlに調整した。
培地を除去し、200μlの混合LIVE/DEADアッセイ試薬(Molecular Probes,Eugene、オレゴン州)を各ウェルに加えた。細胞と一緒に15分間室温にてインキュベートし、その後細胞を蛍光顕微鏡の下で観察した。生細胞は、細胞質中において強く均一な緑の蛍光を生成し、死細胞は核中において明るい赤の蛍光を生成する。
培養の終わりに、各ウェルの細胞培養液をそれぞれ回収し、12,000xgで、10分間4℃にて遠心分離した。澄んだ培地を新しいチューブに移し、直接アッセイに供するか、そうでない場合は、後で行われるアッセイの前には−80℃で保管した。NO生成を、Griess試薬を用い、メーカーのプロトコルに従って、それの安定した分解物である亜硝酸塩を測定することにより評価した。簡単に説明すると、50μlの澄んだ培地を100μlのGriess試薬(ICN Biomedicals,Aurora,オハイオ州)と混合し、15分後、Fusion(登録商標)のユニバーサルマイクロプレートアナライザー(Packard、Meriden,コネチカット州)を用いて、550nmで吸光度を測定した。亜硝酸塩の量は、亜硝酸ナトリウム(NaNO2;Sigma、St.Louis,ミズーリ州)の検量線により算出した。
細胞培地の上清を、IFN−γ刺激をして、又はしないで、48時間後回収した。PGD2とPGE2の濃度は、EIAキット(それぞれ、cat#512021及び514010、Cayman Chemical,Ann Arbor,ミシガン州)を用いて、供給者の使用説明書に従ってアッセイを実施して測定した。
TGF−β1プロモーター活性アッセイは、ヒトのTGF−β1プロモーター(−1362〜+11)−ルシフェラーゼ、TGF−β2プロモーター(−1729〜+63,Nomaら、Growth Factors,4:247−255,1991)、TGF−β3プロモーター(−1387〜+110)を含むプラスミドを使用する。TGF−β2プロモーターとTGF−β3プロモーターの両者は、pGL3ベーシックのKpnIとHindIIIに挿入した。ヒトTGF−βRIIプロモーター(−1883〜+50,Baeら、J Biol Chem.,270:29460−29468,1995)は、ヒトの角膜繊維芽細胞のゲノムDNAをテンプレートとして使用し、PCRにより増幅した。その際、フォワードプライマーとしては、5’−GTACGGTACCCATCAAAGAAGTTATGGTTC−3’を使用し、リバースプライマーとしては、5’−GTACAAGCTTACTCAACTTCAACTCAGCGC−3’を使用した。増幅したTGF−βRIIプロモーターフラグメントは、次にKpnIとHindIIIで消化し、ゲル精製(Qiagen,Valencia,カリフォルニア州)を行い、pGL3ベーシックの同じサイトに挿入した。複製欠損アデノウイルスは、既刊の方法(Chenら、J Immunol.167:1297−1305,2001;Heら、Proc Natl Acad Sci USA 95:2509−2514,1998)に従って、ミシガン大学のコア研究室(Core Lab)により、各プロモーター構築物につき作成された。
AMはマクロファージRaw264.7細胞によるNO産生を減少させた。
Raw264.7細胞を、DMEM/ITSの入った24個の各ウェルに2.5x105個ずつ播種した(各グループについてn=3)。細胞を200u/mlのIFN−γを用いて、又は用いないで刺激した後、方法の項目で記述したNOアッセイに供するために、培養液を回収した。IFN−γ刺激が無い場合、マクロファージは、プラスチック上で培養しても無処理羊膜(iAM)の間質表面上で培養しても検出可能なNOをほとんど産生しなかった(図30)。IFN−γ刺激後、マクロファージは、いずれの培地においても、NOを非常に多く産生したが、マクロファージをiAMの間質表面上で培養したときの方が、プラスチック上で培養したときと比べて、NOは著しく少なかった(p=0.048)(図30)。
IFN−γ刺激が無い場合、Raw264.7細胞は、プラスチック上で培養したときは、PGD2をほとんど産生しなかったが、iAM上で培養したときには非常に多く産生した。これは、おそらく、AM上皮細胞から放出されたPGD2のせいだと思われた(図31A)。IFN−γ刺激がある場合、プラスチック上及びiAM上の両方において培養されたRaw264.7細胞中のPGD2の産生は増加した(図31A)。IFN−γ刺激が無い場合、Raw264.7細胞は、プラスチック上で培養したときは、PGE2をほとんど産生しなかったが、iAM上で培養したときには非常に多く産生した。これは、おそらく、AM上皮細胞から放出されたPGE2のせいだと思われた(図31B)。IFN−γ刺激がある場合、プラスチック上で培養されたRaw264.7細胞中のPGE2の産生は劇的に増加したが、iAM上におけるPGE2の産生はほとんど変化しなかった(図31B)。抗炎症作用の指標としてのPGD2/PGE2の比は、IFN−γ刺激の有無に関わらず、Raw264.7細胞をiAM上で培養したときに非常に高かった(図31C)。
IFN−γ刺激が無い場合、Raw264.7細胞におけるTGF−β1プロモーターの活性は、プラスチック上よりもiAM上の方が抑制されたが、統計的に有意ではなかった(p=0.4)(図32)。IFN−γ刺激がある場合、Raw264.7細胞におけるTGF−β1プロモーターの活性は、プラスチック上とiAM上の両方において減少した。しかし、TGF−β1プロモーターの活性の抑制は、プラスチック上で培養した場合と比べて、非常に高くかつ統計的に有意だった(p<0.01)(図32)。
Raw264.7細胞を、10%のウシ胎児血清を含むDMEMの入った24個の各ウェルに2x105個ずつ播種した。1時間後、125μg/mlのAME(PBS中)を培養液に加え、一方、対照には、同容量のPBSを加えた。24時間の培養後、Raw264.7細胞は、対照の場合ではよく付着していたが、AMEを加えた場合は、多くの細胞が浮遊し、死んでいるように見えた(図33)。
インビトロにおけるマクロファージのアポトーシスアッセイを用い、どの程度AMが抗炎症作用を発現するかを、IFN−γにより活性化されたマウスマクロファージ細胞株(Raw264.7細胞)のアポトーシスを促進することに基づいて測定した。細胞死検出ELISAPLUSキットは、Roche Diagnostics (Mannheim,ドイツ)から入手した。104個の細胞と同等の細胞溶解物及び培養後の条件培地を、メーカーの使用説明書に従って、細胞死検出ELISAPLUSアッセイに供した。このELISAは、マウスモノクローナル抗ヒストンと抗DNA抗体を用いるアポトーシス性細胞死により産生された細胞質内ヒストン関連DNAフラグメント(モノ及びオリゴヌクレオソーム)のインビトロでの定性的及かつ定量的測定のための測光的酵素免疫測定法である。陽性及び陰性対照はキットに含まれており、メーカーより提供される。吸光度は、Fusion(登録商標)のユニバーサルマイクロプレートアナライザーを用いて、405nmで測定した。マクロファージは凍結保存した無処理のAMの間質サイド上で培養した。凍結保存された無処理のAMは、ヒトの胎盤を採取し、その胎盤からAMを回収し、ニトロセルロース紙(ハイボンド−N+、Amersham、英国)の上に、上皮表面を上にして平らにして乗せることにより調製し、使用するまで、DMEM/グリセロール(1:2(v/v))の中で、−80℃で保管したものである。AM間質基質上でマクロファージを培養するためには、マクロファージを、無処理の凍結保存したAMの間質サイド上に播種した。
内因的に発生した、又は外因的に適用されたNOは、マクロファージにおけるアポトーシス性細胞死を誘発することが報告されている。NOが、上記のAM間質基質上で培養したマクロファージのアポトーシスの原因であるかどうか明らかにするために、異なる培養時間(24時間〜72時間)の終わりに採取した条件培地中の亜硝酸塩の濃度を測定した。また、TNF−α産生についても検出した。結果は、PL,又はIFN−γ活性化無しのAMで培養したマクロファージは、低レベルのNOとTNF−αを産生していたことを示した。また、NO産生において、培養時間に関わらず、プラスチックとAMとの間で差は無かった(全て、p>0.05)。一方、TNF−αの濃度は、全てのタイムポイントにおいて、プラスチック上よりもAM上の方が高かった(全て、p<0.05)。しかし、IFNγにより活性化されると、プラスチック上で培養されたマクロファージは、24時間〜72時間にわたり、増加したレベルのNOとTNF−αを連続的に産生した。これに対し、AM上で培養したマクロファージは、24時間〜48時間にわたり、NOとTNF−αの産生が増加したが、48時間〜72時間の間は、それらのレベルの増加は見られなかった(p>0.05)。これは、48時間後にNOとTNF−αの産生が終わったことを示す。AM上でのNO濃度はプラスチック上のNO濃度よりも24時間及び48時間において高かった(p<0.01)。一方、AM上でのTNF−αの濃度は、たった24時間においても高かった(p<0.01)。培地においてAMのみで48時間インキュベートした対照は、IFN−γの有無に関わらず、上清中に検出可能なレベルのNOとTNF−αをなんら見出せなかった。これは、AM自身がNOとTNF−αを産生しなかったことを示す。まとめると、これらのデータもまた、AMはIFN−γと相乗的に働いて、より多くのNOを産生し、AM自身は、マクロファージによるTNF−αの産生を弱く誘発することを示した。IFN−γにより促進される亜硝酸塩レベルは、細胞をAM上で培養した場合に、プラスチック上で培養した場合と比べて、48時間の時点でより顕著であった(p<0.01)。この所見は、アポトーシスの所見とよく相関していた。
可溶性及び凍結乾燥形態のAM抽出物(それぞれ、可溶性及び凍結乾燥形態のAM抽出物の調製について本明細書に記載されている方法に従って調製した)の最適濃度を決定するために、及び適切な濃度の各形態のAM抽出物を含む二つの異なるビヒクル間におけるTGF−βプロモーター活性の抑制と、マクロファージのアポトーシスの促進についての相対的な作用強度を比較するために、タイプIコラーゲンゲル又はHAを用いた段階希釈により、これら二つの形態のAM抽出物を比較し、また、それらのタンパク質濃度を適宜にモニターする。タイプIコラーゲンゲルについては、タンパク質濃度は0.05mg/mlから2mg/mlまで異なる。HAゲルにおいては、タンパク質濃度は0.05mg/mlから10mg/mlまで異なる。この二つの形態のAM抽出物を含むこれらの段階希釈溶液又はゲルは、ヒトの角膜繊維芽細胞を播種する前にプラスチック皿にプレコートするか、あるいは細胞は既にプラスチック皿に播種し、10%のFBSを含むDMEMに直接加える。抗瘢痕作用は、TGF−βl、β2、β3及びRIIのプロモーター活性をアッセイし、そのプロモーター活性を陽性対照(AM抽出物(ビヒクル無し)を加えずにプラスチック上に細胞を播種)又は陰性対照(任意の形態のAM抽出物(ビヒクル無し)を加えたプラスチック上に細胞を播種)と比較することにより、測定する。陽性対照(10%FBSを加えたDMEMの入ったプラスチック上に播種した細胞)は、高いプロモーター活性を示した。これに対し、陰性対照(10%FBSを加え、さらに25μg/mlのAM抽出も加えたDMEMの入ったプラスチック上に播種した細胞)は、プロモーター活性の少なくとも50%の削減を示した。これらの対照値に基づき、コラーゲンゲル又はHAに混入させた、異なる濃度のAM抽出物を用いた実験グループについて、測定することができる。
材料と方法
材料
HUVEC及び内皮細胞増殖培地は、PromoCell GmbH(Heidelberg,ドイツ)から入手した。細胞増殖キットI(MTT)は、Roche(Penzberg,ドイツ)から入手した。BCA(登録商標)タンパク質アッセイキットは、Pierce(Rockford,イリノイ州)から入手した。ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、Ham F/12培地、HEPESバッファー、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、リン酸緩衝食塩水(PBS)、アンホテリシンB、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清(FBS)、血管内皮増殖因子(VEGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、0.25%のトリプシン/0.53mMのEDTA、LIVE/DEADアッセイ試薬は、Invitrogen(Carlsbad,カリフォルニア州)から購入した。ヨウ化プロピジウム、ヘキスト−33342色素、triton X−100、ウシ血清アルブミン(BSA)、インスリン、ヒドロコルチゾン、ホルムアルデヒド、クリスタルバイオレット、FITC結合抗マウス、ヤギ、ラットIgGはSigma(St.Louis,ミズーリ州)から入手した。トランスウェルインサートはコーニング社(Corning,ニューヨーク州)から入手した。マトリゲル(Matrigel)はBD Biosciences(Bedford,マサチューセッツ州)から入手した。
2%のウシ胎児血清、0.1ng/mLのEGF、1μg/mLのヒドロコルチゾン、1ng/mLの塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を加えた内皮細胞増殖因子でHUVECを培養した。ヒトの角強膜組織をFlorida Lions Eye Bank(マイアミ,フロリダ州)から入手し、そこから角膜繊維芽細胞(HCF)を回収し、10%FBSを含むDMEMで培養した。継代2代目の細胞を実験に使用した。SV40−不死化ウサギ角膜上皮細胞(RCE)(Dr.Peter Reinach(ニューヨーク州立大学カレッジ・オブ・オプトメトリー(College of Optometry)生物科学科、ニューヨーク州)により提供された)は、10%のFBS、5ng/mLのインスリン及び5ng/mLのEGFを含むDMEM/F12を用いて増殖させた。
無菌的方法を用い、Bio−Tissue Inc.(マイアミ、フロリダ州)から入手した凍結されたヒトAMを、もとの保存培地を除去するために、HBSSを用いて2〜3回簡単に洗浄した。AM間質はスパチュラでこすり落とし、液体窒素の気相中で凍結させ、バイオパルベライザー(BioPulverizer)(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,オクラホマ州)で微粒子になるように粉砕し、その後、PBS(pH7.4)中で、Tissue−Tearor(BioSpec Products,Inc.,Dremel,ウィスコンシン州)を用いて、氷上にて1分間ホモジナイズした。得られたホモジネートは、1時間回転することにより混合し、その後14,000xgにて30分間4℃で遠心分離した。得られたPBS中の上清を回収し、アリコットに分け、−80℃で保管した。タンパク質濃度は、BCAアッセイにより測定した。この水溶性タンパク質抽出物は羊膜間質抽出物(ASE)と命名し、本明細書に記載の実験に使用した。
細胞は、上記のそれぞれの増殖培地が入った96ウェルプレート(n=6)に、1つのウェル(ASEの濃度が増加するようにした)につき2,000個の細胞密度となるように播種し、48時間培養した。細胞の増殖は、MTT(3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)ベースの細胞増殖アッセイ法により、メーカーにより推奨されているプロトコルに従って測定した。
LIVE/DEADアッセイとヘキスト−33342染色を用い、アポトーシス細胞を検出した。簡単に説明すると、48時間の培養後、各増殖培地をそれぞれ培養液から取り除き、200μlの混合LIVE/DEADアッセイ試薬を加え、15分間室温にてインキュベートした。生細胞は、細胞質の緑の蛍光染色により識別され、一方死細胞は、核中において赤の蛍光に染色される。アポトーシスを評価する手段として核の形態を特徴付けるために、ヘキスト−33342色素がそれぞれの増殖培地に、最終濃度が10μg/mlとなるように加えられ、37℃で15分間インキュベートされる。ヘキスト−33342は、生細胞の核を染色し、増加した蛍光と核の断片化又は凝結によりアポトーシス細胞を同定する。
ASEによるVEGF誘導走化性に対する抑制作用を、トランスウェルアッセイを用い、HUVECについて試験した。完全増殖培地を用いて、HUVECを36時間増殖させた。細胞のトリプシン処理と洗浄を行い、その後細胞を、0.5%のFBSを加えた不完全増殖培地に再懸濁し、200μl中に60,000個の細胞となるようにトランスウェルインサート(直径:8mm)(8μmのポアサイズを有するポリカーボネート膜により分離されている)の内側に播種した。この際、200μg/mlのASEを加えたものと加えないものを準備した。1%のFBSと10ng/mlのVEGFを加えた800μl容量の増殖培地を、走化性因子(chemotactant)としてトランスウェルインサートの外側の24ウェルプレートに直接加えた。0.5%のFBSを加えた増殖培地を、陰性対照として24ウェルプレートに直接加えた。37℃で5%CO2と95%湿度にて4.5時間インキュベートした後、遊走しなかった細胞は吸引した。一方、膜はPBSで洗浄し、PBSに溶解した4%ホルムアルデヒド中で固定し、クリスタルバイオレットで染色した。その後、顕微鏡の下で観察を行った。膜の別の面に遊走した細胞の数を数えた。
320μlのマトリゲルを24ウェルプレートの各ウェルに加え、37℃で30分間重合させた。内皮細胞の培養液(10%FBSを含む)に懸濁したHUVEC(50,000個/ウェル)を、異なる濃度のASEが存在するマトリゲルに播種した。対照細胞は、同じ濃度のBSAを含むマトリゲルを用いて培養した。細胞は24時間37℃で培養し、顕微鏡の下で撮影を行った(ニコン、日本)。各ウェルに対し10ランダム、40xフィールド撮影を行い、管の数をカウントし、平均値を算出し、比較した。
上記の実験は、全て3回(各回につき3通り以上)繰り返した。群平均は、適切なバージョンのスチューデント不対t検定を用いて比較した。試験結果は、p<0.05の両側p値を統計的に有意とみなして記載した。要約データは、平均±S.D.として記載する。
ASEはHUVEC細胞の増殖を優先的に阻害した。
我々は、初めに培地に加えられたASEが細胞の増殖を抑制するかどうか試験した。ASEの添加のない対照と比較すると、HUVECの増殖は、50〜200μg/mlのASEにより著しく抑制された(図34A、p<0.001)。しかし、RCEとHCFの増殖は、200μg/mlの濃度のみのASEにより著しく抑制された(図34B、34C、それぞれ、p<0.01)。この結果は、ASEがHUVEC細胞の増殖を優先的に阻害することを示した。
位相差画像は、200μg/mlのASEにより48時間処理された場合、HUVECが紡錘形状から縮んで、小さく丸い形状になり、細胞密度が著しく減少することを示した。これに対し、HCF細胞とRCE細胞の細胞形態と密度は、200μg/mlのASEにより48時間処理されても、変化しなかった(データ示さず)。200μg/mlのASEによるこのようなHUVEC細胞における変化は、細胞死に付随して起こるか明らかにするために、200μg/mlのASEを加えて48時間インキュベートした後、LIVE/DEADアッセイとヘキスト−33342染色を実施した。その結果、HUVEC細胞は、ASEを添加しない対照では生存していたが(図35Aa)、ASE処理後では、顕著な細胞死を示した(図35Ad)。これに対し、HCF細胞とRCE細胞はともに、ASE処理の有る(それぞれ、図35Ae、35Af)無し(それぞれ、図35Ab、35Ac)に関わらず、注目に値する細胞死は何も観察されなかった。ヘキスト−33342染色は、ASEで処理されたHUVECは、61.6±7.7%の凝結と断片化核を有した(図35Bd)ことを示し、この値は、ASE処理をしない対照の値:3.1±1.8%よりも著しく高かった(図35Ba、2Cも参照、p<0.001)。これに対し、HCF、RCEともに、ASE処理の有る(それぞれ、図35Be、35Bf)無し(それぞれ、図35Bb、35Bc)に関わらず、明白なアポトーシスは見られなかった(図36も参照、それぞれ、p=0.84、0.30)。これらの結果は、ASEがアポトーシスを引き起こしてHUVECの増殖を抑制することを示した。
我々は、次にASEが、VEGFにより刺激されたHUVECの遊走を抑制することができるかどうか試験した。走化性因子としてのVEGF無しの対照において、いくつかの細胞は、4.5時間の試験期間中にポリカーボネート膜のポアを通って遊走した(図37A)。走化性因子としてのVEGFで処理した場合、細胞遊走は劇的に増加した(図37B、p<0.001)。しかし、HUVECを200μg/mlのASEで処理した場合、VEGFを用いた陽性対照(p<0.001)又はVEGFを用いない陰性対照(p<0.01)と比較すると、VEGFの影響を受けた細胞遊走の規模は著しく阻害された(図37C)。これらの結果は、ASEはVEGFのケモカイン機能の抑制をするだけでなく、HUVECが本質的に有している遊走の抑制もすることを示した。
ASEの抗血管新生作用をさらに調べるために、我々は、インビトロ管腔形成アッセイを実施した。基底膜タンパク質の固体ゲルであるHUVECをマトリゲル上に播種すると、HUVECは、迅速に整列し、24時間後、中空管様構造物を形成する(図38A)。これに対し、ASEをその培養液に加えると、100μg/ml(図38B)と200μg/ml(図38C)のいずれの濃度においても、HUVECによる管腔形成は、著しく抑制された(両方ともに、p<0.001)。ASEのこれらの二つの用量間の差は、統計的に有意ではなかった(図38D)。まとめると、これらの結果は、ASEは、血管新生プロセッシング中の管腔形成を抑制することにより、抗血管新生作用も発現することを示した。
スキンローションは、以下の方法によって調製される。0.25gのヒドロキシ安息香酸メチルと7.5gのグリセリンを75mlの水に150°Fで溶解する。0.7gのソルビタンモノラウレート、0.7gのポリソルベート20と1.0gのセトステアリルアルコールを150°Fで融解し、上記溶液に混ぜ合わせる。この混合物を混ぜながら冷ます。この混合物の温度が約90°Fより下がったら、混合しながら4mlの本明細書に記載のAM調製物と精製組成物を加える。微量の香料も混ぜながら加える。出来上がったローションを10mlのアリコットに包装し、室温で保管する。
局所用医薬ゲル組成物を調製するために、100mgの凍結粉砕及び凍結乾燥したAM間質基質材料を1.75gのヒドロキシプロピルセルロース、10mlのプロピレングリコール、10mlのイソプロピルミリスチン酸及び100mlの精製アルコールUSPと混合する。次に、得られたゲル混合物を、局所投与に適した容器、例えばチューブに入れる。このゲルを、炎症を起こした皮膚に一日2回適用する。この方法を用いることにより、皮膚の炎症が減少する。
眼科用点眼液は、100mgの粉砕及び凍結乾燥したAM抽出物を0.9gの塩化ナトリウムと100mlの精製水中で混合し、0.2ミクロンのフィルターを用いてろ過することにより調製される。次に、得られた等張液を、眼科的投与に適した眼科用配送ユニット、例えば、点眼液用容器に入れる。一日4回この組成物を2滴、火傷により損傷した眼に適用する。この方法を用いることにより、眼は正常で健康な状態に戻る。
無菌の眼軟膏剤組成物は、90gの白色ワセリン、10gの液体ワセリンと0.5gの凍結乾燥したAM粉末を混ぜ合わせることにより調製される。この混合物を低温殺菌し、個別のチューブ容器に2.0gずつ包装する。
眼に火傷による損傷を有する個人を特定する。DMEM中に1%のAMと0.5%のコラーゲンを含む調製物を調製する。上記の個人にこの組成物を2滴一日に4回処置する。この方法を用いることにより、眼の損傷は、何も処置されなかった火傷により損傷した眼と比較して改善する。
乾癬を有する個人を特定する。1mg/mlの精製したSmad7(市販品由来)を添加した再構成されたAMを5%含む調製物を用いて、この特定した個人を治療する。この処方をローション組成物に溶解する。治療は一日に2回投与する。この方法を用いることにより、乾癬は軽減し、消滅する。
直腸ゲル組成物は、100mgの市販のHAとTSG−6(精製した)を5mlの無菌AM抽出物(実施例1に記載した凍結したAM膜材料から調製した)を混合することにより調製した。この混合物に、2.5gのメチルセルロース(1500mPa)、100mgのメチルパラベン、5gのグリセリン、95mlの精製水を加えた。次に、得られたゲル混合物を、直腸投与に適した直腸配送ユニット、例えばシリンジに入れる。
皮膚炎症を治療するためのOTC用キットを調製する。このキットは、ペースト剤形のAM抽出物の入った1mlの容器、アプリケーター、使用説明書を含むパッケージから構成される。
徐放性固体製剤は、100mgの凍結乾燥及び凍結粉砕したAM間質基質と800mgのメチルセルロースを混合し、次いでカルボキシメチルセルロース膜に入れてマイクロカプセル化することにより調製される。得られたマイクロカプセル化物質は、約15mgをボーラスとして、関節炎患者の炎症を起こした膝関節の皮下に埋め込む。埋め込みステップは一週間に一回繰り返す。この方法を用いることにより、膝の炎症は減少する。
筋肉内投与のための非経口組成物は、各10mgずつの:HA、TSG−6、PTX−3及びTSP−1(それぞれ、市販品から入手)と100mgの本明細書に記載されている化合物の水溶性の塩を混合し、それをDMSOに溶解し、次いで10mlの0.9%無菌生理食塩水と混合することにより調製される。この混合物を注射による投与に適した剤形ユニットに入れる。
幅約2cmの皮下腫瘍を有する患者を特定する。10gの液状AM抽出物と10%のPEG300水溶液を2時間4℃で混合する。この混合物を0.20μmフィルターでろ過し、無菌ガラスバイアル(ゴムストッパーで栓がしてあり、アルミニウムキャップで密閉してあった)に分注した。このバイアルは、使用前に4℃で2週間まで保管される。上記の患者の治療は、この溶液の0.50mlを腫瘍の場所に経皮的に、投与容量を腫瘤の4つの別個の領域に分けて(約125μlを各4つの場所に)直接注射することにより行われる。この組成物を48時間ごとに投与する。腫瘍の大きさを毎週モニターする。この方法を用いることにより、腫瘍の大きさは減少する。
Claims (11)
- a)凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤からの、微粉砕又は粉砕された羊膜材料の粉末であって、インター−α−トリプシン阻害剤(IαI)の重鎖と共有結合することによって架橋され、106Daより大きな分子量を有する高分子ヒアルロン酸(HA)、腫瘍壊死因子活性化遺伝子6(TSG−6)、ペントラキシン(PTX−3)、および、トロンボスポンジン(TSP−1)を含む粉末と、
b)担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、賦形剤及びその組み合わせからなる群から選ばれた化学成分
を含む、被験者における瘢痕形成を抑制させるための医薬組成物。 - 組成物が凍結乾燥されていることを特徴とする請求項1記載の被験者における瘢痕形成を抑制させるための医薬組成物。
- 羊膜材料は、ヒト羊膜、ヒト羊膜ゼリー、ヒト羊膜間質、またはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項1又は2に記載の被験者における瘢痕形成を抑制させるための医薬組成物。
- a)凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤からの、微粉砕又は粉砕された羊膜材料の粉末であって、インター−α−トリプシン阻害剤(IαI)の重鎖と共有結合することによって架橋され、106Daより大きな分子量を有する高分子ヒアルロン酸(HA)、腫瘍壊死因子活性化遺伝子6(TSG−6)、ペントラキシン(PTX−3)、および、トロンボスポンジン(TSP−1)を含む粉末と、
b)担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、賦形剤及びその組み合わせからなる群から選ばれた化学成分
を含む、被験者における血管新生を抑制するために使用される医薬組成物。 - 組成物が凍結乾燥されていることを特徴とする請求項4記載の被験者における血管新生を抑制するために使用される医薬組成物。
- 羊膜材料は、ヒト羊膜、ヒト羊膜ゼリー、ヒト羊膜間質、またはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項4又は5に記載の被験者における血管新生を抑制するために使用される医薬組成物。
- 医薬組成物が、
血管形成に関与する内皮細胞のアポトーシスを引き起こす;
血管形成に関与する内皮細胞の遊走を抑制する;および、
血管形成に関与する内皮細胞の管腔形成を抑制する、
という性質を有することを特徴とする請求項4−6のいずれか一項に記載の被験者における血管新生を抑制するために使用される医薬組成物。 - a)凍結した、又はあらかじめ凍結したヒト胎盤からの、微粉砕又は粉砕された羊膜材料の粉末であって、インター−α−トリプシン阻害剤(IαI)の重鎖と共有結合することによって架橋され、106Daより大きな分子量を有する高分子ヒアルロン酸(HA)、腫瘍壊死因子活性化遺伝子6(TSG−6)、ペントラキシン(PTX−3)、および、トロンボスポンジン(TSP−1)を含む粉末と、
b)担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、賦形剤及びその組み合わせからなる群から選ばれた化学成分
を含む、被験者における炎症を抑制するために使用される医薬組成物であって、
ここで前記炎症は、炎症部位におけるマクロファージのアポトーシスの誘発、炎症部位におけるプロスタグランジンE1に対するプロスタグランジンD2の比の増加、炎症部位におけるTGF−β1活性の抑制、炎症部位におけるインターフェロン−γシグナル伝達の阻害、又はこれらの組み合わせによって抑制せしめるという恩恵を受ける形態であることを特徴とする、被験者における炎症を抑制するために使用される医薬組成物。 - 組成物が凍結乾燥されていることを特徴とする請求項8記載の被験者における炎症を抑制するために使用される医薬組成物。
- 羊膜材料は、ヒト羊膜、ヒト羊膜ゼリー、ヒト羊膜間質、またはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項8又は9に記載の被験者における炎症を抑制するために使用される医薬組成物。
- 医薬組成物が、
炎症部位におけるマクロファージのアポトーシスを引き起こす;
炎症部位におけるプロスタグランジンE1に対するプロスタグランジンD2の比を増加させる;
炎症部位におけるTGF−β1活性を抑制する;
炎症部位におけるインターフェロン−γシグナル伝達を阻害する、
という性質のうち少なくとも二つの性質を有することを特徴とする、請求項8−10のいずれか一項に記載の被験者における炎症を抑制するために使用される医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US72076005P | 2005-09-27 | 2005-09-27 | |
US60/720,760 | 2005-09-27 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008533609A Division JP5505760B2 (ja) | 2005-09-27 | 2006-09-27 | 羊膜調製物及び精製組成物及びその使用方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014098021A JP2014098021A (ja) | 2014-05-29 |
JP5900985B2 true JP5900985B2 (ja) | 2016-04-06 |
Family
ID=37900469
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008533609A Active JP5505760B2 (ja) | 2005-09-27 | 2006-09-27 | 羊膜調製物及び精製組成物及びその使用方法 |
JP2014020763A Expired - Fee Related JP5900985B2 (ja) | 2005-09-27 | 2014-02-05 | 羊膜調製物及び精製組成物及びその使用方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008533609A Active JP5505760B2 (ja) | 2005-09-27 | 2006-09-27 | 羊膜調製物及び精製組成物及びその使用方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (14) | US8153162B2 (ja) |
EP (2) | EP2664337B1 (ja) |
JP (2) | JP5505760B2 (ja) |
CN (2) | CN104873956B (ja) |
AU (1) | AU2006294581B2 (ja) |
CA (3) | CA2999420A1 (ja) |
DK (1) | DK1933852T3 (ja) |
ES (1) | ES2713062T3 (ja) |
HK (1) | HK1213499A1 (ja) |
WO (1) | WO2007038686A2 (ja) |
Families Citing this family (123)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7932365B2 (en) | 2003-11-08 | 2011-04-26 | Pro Thera Biologics, Llc | Preparation and composition of inter-alpha inhibitor proteins from human plasma for therapeutic use |
US8187639B2 (en) | 2005-09-27 | 2012-05-29 | Tissue Tech, Inc. | Amniotic membrane preparations and purified compositions and anti-angiogenesis treatment |
US8153162B2 (en) | 2005-09-27 | 2012-04-10 | Tissuetech, Inc. | Purified amniotic membrane compositions and methods of use |
US8372437B2 (en) | 2006-08-17 | 2013-02-12 | Mimedx Group, Inc. | Placental tissue grafts |
US8071135B2 (en) * | 2006-10-04 | 2011-12-06 | Anthrogenesis Corporation | Placental tissue compositions |
EP3189731B1 (en) | 2007-09-07 | 2020-01-29 | MiMedx Group, Inc. | Placental tissue grafts and improved methods of preparing and using the same |
WO2009111159A2 (en) * | 2008-03-03 | 2009-09-11 | New York University | Biocompatible materials containing stable complexes of tsg-6 and hyaluronan and method of using same |
US9480549B2 (en) | 2008-04-25 | 2016-11-01 | Allosource | Multi-layer tissue patches |
US9358320B2 (en) | 2008-04-25 | 2016-06-07 | Allosource | Multi-layer tissue patches |
ES2673005T3 (es) | 2008-05-28 | 2018-06-19 | Prothera Biologics, Inc | Preparación y composición de proteínas inter-alfa inhibidoras a partir de sangre |
CA2758571A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Tissuetech, Inc. | Compositions containing hc-ha complex and methods of use thereof |
US8859003B2 (en) * | 2009-06-05 | 2014-10-14 | Intercontinental Great Brands Llc | Preparation of an enteric release system |
US20100307542A1 (en) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Kraft Foods Global Brands Llc | Method of Reducing Surface Oil on Encapsulated Material |
US20100310726A1 (en) | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Kraft Foods Global Brands Llc | Novel Preparation of an Enteric Release System |
US9968564B2 (en) | 2009-06-05 | 2018-05-15 | Intercontinental Great Brands Llc | Delivery of functional compounds |
EP3092978A1 (en) * | 2009-07-10 | 2016-11-16 | Kirk Promotion LTD. | Hip joint device |
CN101658491B (zh) * | 2009-09-24 | 2011-04-13 | 哈尔滨医科大学 | 一种治疗角膜碱烧伤的羊膜滴眼液 |
ES2663720T3 (es) * | 2010-02-18 | 2018-04-16 | Osiris Therapeutics, Inc. | Métodos de fabricación de productos terapéuticos que comprenden dispersiones placentarias vitalizadas |
KR101859124B1 (ko) | 2010-05-03 | 2018-05-21 | 더 텍사스 에이 & 엠 유니버시티 시스템 | 눈 손상 및 질환 치료용 성체 줄기 세포/전구 세포 및 줄기 세포 단백질 |
US8883210B1 (en) | 2010-05-14 | 2014-11-11 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
US9352003B1 (en) | 2010-05-14 | 2016-05-31 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
US10130736B1 (en) | 2010-05-14 | 2018-11-20 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
JP6124791B2 (ja) | 2010-09-22 | 2017-05-10 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド,ア ボディー コーポレイトTHE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF COLORADO,a body corporate | Smad7の治療的適用 |
KR102331661B1 (ko) | 2011-02-14 | 2021-11-25 | 미메딕스 그룹 인크. | 마이크로화된 태반 조직 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법 |
KR102118457B1 (ko) | 2011-02-14 | 2020-06-03 | 미메딕스 그룹 인크. | 가교제로 변형된 조직 이식편 및 그것의 제조 및 사용 방법 |
WO2012149486A1 (en) * | 2011-04-28 | 2012-11-01 | Tissuetech, Inc. | Methods of modulating bone remodeling |
ES2822301T3 (es) * | 2011-06-10 | 2021-04-30 | Tissuetech Inc | Métodos de procesamiento de tejidos de soporte fetal |
US9439940B2 (en) * | 2011-07-19 | 2016-09-13 | Neville Pharmaceutical, Inc. | Topical transdermal method for delivering nutrients through the skin for expeditied wound healing and skin rejuvenation |
WO2013032938A1 (en) * | 2011-08-26 | 2013-03-07 | Tissuetech, Inc. | Methods of sterilizing fetal support tissues |
US8932805B1 (en) | 2011-10-31 | 2015-01-13 | BioDlogics, LLC | Birth tissue material and method of preparation |
US9162011B2 (en) | 2011-12-19 | 2015-10-20 | Allosource | Flowable matrix compositions and methods |
EP2793745B1 (en) | 2011-12-22 | 2019-07-31 | MIMEDX Group Inc. | Cross-linked dehydrated placental tissue grafts and methods for making and using the same |
US8961617B2 (en) | 2012-03-08 | 2015-02-24 | Liventa Bioscience, Inc. | Amnion and chorion constructs and uses thereof in abdominal surgery |
US20130236506A1 (en) * | 2012-03-08 | 2013-09-12 | AFcell Medical | Amnion and chorion constructs and uses thereof in ob-gyn surgery |
US9295753B1 (en) | 2012-07-02 | 2016-03-29 | Celso Tello | Amniotic membrane preparation and device for use as a lens or as a dressing for promoting healing |
ES2846789T3 (es) * | 2012-07-11 | 2021-07-29 | Tissuetech Inc | Composiciones que contienen complejos HC-HA/PTX3 y métodos de uso de los mismos |
US8904664B2 (en) | 2012-08-15 | 2014-12-09 | Mimedx Group, Inc. | Dehydration device and methods for drying biological materials |
US9943551B2 (en) | 2012-08-15 | 2018-04-17 | Mimedx Group, Inc. | Tissue grafts composed of micronized placental tissue and methods of making and using the same |
CA2880157C (en) | 2012-08-15 | 2020-07-21 | Mimedx Group, Inc. | Reinforced placental tissue grafts and methods of making and using the same |
US11338063B2 (en) | 2012-08-15 | 2022-05-24 | Mimedx Group, Inc. | Placental tissue grafts modified with a cross-linking agent and methods of making and using the same |
AU2013312215C1 (en) * | 2012-09-09 | 2018-09-06 | Prothera Biologics, Inc. | Treatment of disease using inter-alpha inhibitor proteins |
WO2014040026A2 (en) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | Wake Forest University Health Sciences | Amniotic membrane and its use in wound healing and tissue engineering constructs |
US9180145B2 (en) | 2012-10-12 | 2015-11-10 | Mimedx Group, Inc. | Compositions and methods for recruiting and localizing stem cells |
US9155799B2 (en) | 2012-11-19 | 2015-10-13 | Mimedx Group, Inc. | Cross-linked collagen with at least one bound antimicrobial agent for in vivo release of the agent |
US8946163B2 (en) | 2012-11-19 | 2015-02-03 | Mimedx Group, Inc. | Cross-linked collagen comprising metallic anticancer agents |
US8859005B2 (en) | 2012-12-03 | 2014-10-14 | Intercontinental Great Brands Llc | Enteric delivery of functional ingredients suitable for hot comestible applications |
US10617790B2 (en) * | 2013-01-09 | 2020-04-14 | Ise Professional Testing & Consulting Services, Inc. | Decellularized biomaterial from non-mammalian tissue |
US9655948B1 (en) * | 2013-01-17 | 2017-05-23 | Mimedx Group, Inc. | Non-surgical, localized delivery of compositions for placental growth factors |
US9827293B2 (en) | 2013-01-17 | 2017-11-28 | Mimedx Group, Inc. | Non-surgical, localized delivery of compositions for placental growth factors |
US10517931B2 (en) * | 2013-01-17 | 2019-12-31 | Mimedx Group, Inc. | Non-surgical, localized delivery of compositions for placental growth factors |
US10206977B1 (en) | 2013-01-18 | 2019-02-19 | Mimedx Group, Inc. | Isolated placental stem cell recruiting factors |
US10111910B2 (en) | 2013-01-18 | 2018-10-30 | Mimedx Group, Inc. | Methods for treating cardiac conditions |
US11077229B1 (en) | 2013-03-08 | 2021-08-03 | BioDlogics, LLC | Implant coating composition and method of use |
US9422352B2 (en) | 2013-03-08 | 2016-08-23 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | PTD-SMAD7 therapeutics |
US10016459B1 (en) | 2013-03-13 | 2018-07-10 | BioDlogics, LLC | Platelet-rich plasma derived from human umbilical cord blood |
CA2899246C (en) | 2013-03-13 | 2022-12-06 | Allosource | Fascia fibrous compositions and methods for their use and manufacture |
US10029030B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-07-24 | Mimedx Group, Inc. | Molded placental tissue compositions and methods of making and using the same |
KR102312720B1 (ko) | 2013-03-15 | 2021-10-13 | 알로소스 | 연조직 회복 및 재생을 위한 세포 재배치된 콜라겐 매트릭스 |
WO2014143943A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | NuTech Spine, Inc. | Preparations containing hepatocyte growth factor and hyaluronic acid, and methods of making and using same |
DK2968418T3 (da) | 2013-03-15 | 2024-01-15 | Nutech Medical Inc | Præparater afledt af placentamaterialer til fremstilling og anvendelse deraf |
US10039792B1 (en) | 2013-03-16 | 2018-08-07 | Brahm Holdings, Llc | Methods for the treatment of inflammation and pain using human birth tissue material composition |
US9795639B1 (en) | 2013-03-16 | 2017-10-24 | BioDlogics, LLC | Methods for the treatment of erectile dysfunction by human birth tissue material compostion |
US10555897B1 (en) | 2013-03-16 | 2020-02-11 | Brahm Holdings Llc | Cosmetic composition and methods of treatment |
US9993506B1 (en) | 2013-03-16 | 2018-06-12 | BioDlogics, Inc. | Methods for the treatment of degenerative disc diseases by human birth tissue material composition |
KR20150139569A (ko) * | 2013-04-02 | 2015-12-11 | 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크. | 혈관형성의 유도 및 조절을 위한 조성물 및 방법 및 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 방법 및 분석법 |
US9446142B2 (en) | 2013-05-28 | 2016-09-20 | Mimedx Group, Inc. | Polymer chelator conjugates |
EP3047018A4 (en) * | 2013-09-17 | 2017-02-22 | Singapore Health Services Pte Ltd | Corneal stromal keratocyte culture |
WO2015085232A1 (en) | 2013-12-06 | 2015-06-11 | Allosource | Method of drying sheets of tissue |
WO2015109329A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Mimedx Group, Inc. | Method for inducing angiogenesis |
US10894066B2 (en) | 2014-03-06 | 2021-01-19 | Amnio Technology Llc | Amnion derived therapeutic compositions and methods of use |
US9132156B1 (en) | 2014-06-15 | 2015-09-15 | Amnio Technology Llc | Acellular amnion derived therapeutic compositions |
JP2017520517A (ja) * | 2014-05-08 | 2017-07-27 | ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド | 持続放出性血管新生調節組成物ならびに血管新生を誘導および調節する方法 |
TW201603818A (zh) | 2014-06-03 | 2016-02-01 | 組織科技股份有限公司 | 組成物及方法 |
WO2015189266A1 (en) * | 2014-06-10 | 2015-12-17 | Ludwig Boltzmann Gesellschaft | Biocompatibility assay |
US10363278B2 (en) | 2014-06-15 | 2019-07-30 | Amnio Technology Llc | Frozen therapeutic dose and package |
WO2015195508A1 (en) * | 2014-06-15 | 2015-12-23 | Amnio Technology Llc | Frozen therapeutic dose and package |
EP3185918B1 (en) | 2014-08-28 | 2021-08-18 | MiMedx Group, Inc. | Collagen reinforced tissue grafts |
JP6960333B2 (ja) * | 2014-09-09 | 2021-11-05 | ミメディクス グループ インコーポレイテッド | 任意にシーラントを含む微粒子化胎盤組織の組成物、ならびにその組成物の作製方法および使用方法 |
CA2963273C (en) * | 2014-10-02 | 2023-10-17 | Wake Forest University Health Sciences | Amniotic membrane powder and its use in wound healing and tissue engineering constructs |
JP6873906B2 (ja) | 2014-10-20 | 2021-05-19 | オイスター ポイント ファーマ インコーポレイテッド | 眼の病状の治療方法 |
US10201573B1 (en) | 2014-10-27 | 2019-02-12 | Brahm Holdings, Llc | Human birth tissue material composition and methods for the treatment of damage associated with a cerebral vascular accident |
US10265438B1 (en) | 2014-11-03 | 2019-04-23 | BioDlogics, LLC | Methods and compositions for the repair and replacement of connective tissue |
JP2017533917A (ja) * | 2014-11-05 | 2017-11-16 | ティッシュテック,インク. | 神経成長および再生を促進するための組成物および方法 |
US10765705B2 (en) | 2014-11-24 | 2020-09-08 | Prime Merger Sub, Llc | Visco-supplement compositions, and methods of use thereof |
WO2016109821A1 (en) * | 2014-12-31 | 2016-07-07 | Applied Biologics, Llc | Reconstituted amniotic membrane-amniotic fluid combination tissue graft |
WO2016109824A1 (en) * | 2014-12-31 | 2016-07-07 | Applied Biologics, Llc | Reconstituted amniotic membrane-amniotic fluid combination tissue graft with standardized stem cell component |
US10342830B2 (en) | 2015-01-05 | 2019-07-09 | Gary M. Petrucci | Methods and materials for treating lung disorders |
EP3247381A4 (en) * | 2015-01-23 | 2018-08-01 | Puretein Bioscience, LLC | Methods for treating inflammation with tgf-beta |
WO2016138025A2 (en) | 2015-02-23 | 2016-09-01 | Tissuetech, Inc. | Apparatuses and methods for treating ophthalmic diseases and disorders |
US11077149B1 (en) * | 2015-03-04 | 2021-08-03 | Pensara, Inc | Method for the collection and use of amniotic fluid |
JP2018516869A (ja) | 2015-05-20 | 2018-06-28 | ティッシュテック,インク. | 上皮細胞の増殖および上皮間葉転換を防ぐための組成物および方法 |
WO2016187413A1 (en) | 2015-05-21 | 2016-11-24 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Modified demineralized cortical bone fibers |
US10517903B2 (en) | 2015-09-14 | 2019-12-31 | Amnio Technology Llc | Amnion derived therapeutic composition and process of making same |
CN105356107A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-24 | 上海斐讯数据通信技术有限公司 | 一种终端接口、终端插条、插接组件和多用插接组件 |
TW201733600A (zh) | 2016-01-29 | 2017-10-01 | 帝聖工業公司 | 胎兒扶持組織物及使用方法 |
US10993969B2 (en) | 2016-02-05 | 2021-05-04 | Gary M. Petrucci | Methods and materials for treating nerve injuries and neurological disorders |
CN109069867B (zh) * | 2016-03-14 | 2022-02-01 | 无痛疗法股份有限公司 | 无细胞胎盘制剂 |
JP2018102744A (ja) | 2016-12-27 | 2018-07-05 | オムロン株式会社 | 袋状構造体、カフ及び血圧計 |
US10772986B2 (en) | 2017-01-26 | 2020-09-15 | Allosource | Fascia fibrous compositions and methods for their use and manufacture |
US10960028B2 (en) | 2017-02-01 | 2021-03-30 | Plakous Therapeutics, Inc. | Placental tissue compositions |
JP6373444B1 (ja) * | 2017-05-10 | 2018-08-15 | 株式会社ホルス | 羊膜由来原料の製造方法、化粧品の製造方法及び健康食品の製造方法 |
US10478531B2 (en) | 2017-06-22 | 2019-11-19 | Gary M. Petrucci | Methods and materials for treating blood vessels |
RU176257U1 (ru) * | 2017-09-18 | 2018-01-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Спейсер для реконструктивной пластики века |
US20190083547A1 (en) * | 2017-09-19 | 2019-03-21 | Gary M. Petrucci | Transdermal delivery of amnion tissue preparations |
US10251917B1 (en) | 2017-09-19 | 2019-04-09 | Gary M. Petrucci | Methods and materials for treating tumors |
CN109528772A (zh) * | 2017-09-22 | 2019-03-29 | 中国福利会国际和平妇幼保健院 | 人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的应用 |
CZ307603B6 (cs) | 2017-12-27 | 2019-01-02 | BioHealing k.s. | Způsob přípravy materiálu na bázi amniové membrány a materiál připravitelný tímto způsobem |
US11285177B2 (en) | 2018-01-03 | 2022-03-29 | Globus Medical, Inc. | Allografts containing viable cells and methods thereof |
GB201800909D0 (en) * | 2018-01-19 | 2018-03-07 | Biocel Ltd | Compositions and methods relating to amnion |
JP2021511936A (ja) * | 2018-01-26 | 2021-05-13 | ポラリティー・ティー・イー・インコーポレーテッド | 混成界面接続生体材料促進剤基質 |
US11026980B1 (en) * | 2018-02-26 | 2021-06-08 | Triad Life Sciences, Inc. | Flowable birth tissue composition and related methods |
CN110090228A (zh) * | 2018-04-18 | 2019-08-06 | 浙江大学 | 人羊膜上皮细胞在自身免疫性疾病中的治疗用途 |
CA3097470A1 (en) * | 2018-04-18 | 2019-10-24 | i.com medical GmbH | High molecular weight hyaluronic acid for enhancing epithelial survival and reconstitution of body surfaces |
WO2019220421A1 (en) * | 2018-05-18 | 2019-11-21 | Mimedx Group, Inc. | Placental tissue component compositions for treatment of skin defects and methods using same |
CN109157676A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-01-08 | 谭亚 | 一种重塑复合生物羊膜的制备方法 |
EP3955940A4 (en) * | 2019-04-16 | 2023-01-04 | Lifenet Health | PRODUCTS DERIVED FROM GENITAL TISSUES AND PREPARATION AND USES THEREOF |
AU2021219772A1 (en) * | 2020-02-12 | 2022-09-01 | Tissuetech, Inc. | Methods of killing or inhibiting the growth of cancer cells |
CN112063577B (zh) * | 2020-08-14 | 2023-05-16 | 中国医科大学附属第一医院 | 用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法 |
WO2023044277A1 (en) * | 2021-09-15 | 2023-03-23 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Smad7 polypeptide formulations |
CZ309798B6 (cs) * | 2022-03-15 | 2023-10-18 | Prime Cell Bioscience, a.s | Způsob přípravy biologického léčivého přípravku na bázi perinatální tkáně, práškový materiál a jeho použití |
CN114939190B (zh) * | 2022-06-14 | 2024-01-12 | 健诺维(成都)生物科技有限公司 | 一种用于青光眼治疗的引流管材料及其制备方法 |
WO2023244218A1 (en) * | 2022-06-14 | 2023-12-21 | Verdon Michael | Injectable connective tissue biologic implant |
CN116077530A (zh) * | 2022-11-21 | 2023-05-09 | 中南大学 | 预处理的人羊膜上皮细胞在制备治疗和/或预防炎症疾病药物中的应用 |
Family Cites Families (265)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US1006620A (en) | 1911-10-24 | Gen Electric | Tungsten-furnace. | |
US1023208A (en) | 1908-12-30 | 1912-04-16 | Ludwig Weiss | Process for the production of pyrophorous substances for ignition and illumination. |
US1003979A (en) | 1910-06-13 | 1911-09-26 | Massey Harris Co Ltd | Clutch mechanism. |
US1031468A (en) | 1910-10-04 | 1912-07-02 | Nicholas Power | Perforating-machine. |
US1025865A (en) | 1910-10-13 | 1912-05-07 | Hampden Watch Company | Balance staff and roller for watches. |
US1022005A (en) | 1911-03-02 | 1912-04-02 | Bert Keiser Shrader | Measuring device. |
US1010539A (en) | 1911-03-06 | 1911-12-05 | Frank Vitali | Wheel-tire. |
US1027211A (en) | 1911-03-23 | 1912-05-21 | Robert L Moore | Rail-joint. |
US1026534A (en) | 1911-06-28 | 1912-05-14 | Fletcher H Waddill | Auto cranking device. |
US1025845A (en) | 1911-12-14 | 1912-05-07 | Harry A Thiberge | Trap. |
US3598123A (en) | 1969-04-01 | 1971-08-10 | Alza Corp | Bandage for administering drugs |
US3993073A (en) | 1969-04-01 | 1976-11-23 | Alza Corporation | Novel drug delivery device |
US3598122A (en) | 1969-04-01 | 1971-08-10 | Alza Corp | Bandage for administering drugs |
US3710795A (en) | 1970-09-29 | 1973-01-16 | Alza Corp | Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane |
US4069307A (en) * | 1970-10-01 | 1978-01-17 | Alza Corporation | Drug-delivery device comprising certain polymeric materials for controlled release of drug |
JPS4943153B1 (ja) | 1970-12-05 | 1974-11-19 | ||
US3742051A (en) * | 1971-06-02 | 1973-06-26 | Rohm & Haas | 3,5-dichloro-n-(1,1,dimethyl-2-propynyl)benzimidoyl halides and derivatives |
US3731683A (en) | 1971-06-04 | 1973-05-08 | Alza Corp | Bandage for the controlled metering of topical drugs to the skin |
US3742951A (en) | 1971-08-09 | 1973-07-03 | Alza Corp | Bandage for controlled release of vasodilators |
US3996934A (en) | 1971-08-09 | 1976-12-14 | Alza Corporation | Medical bandage |
BE795384A (fr) | 1972-02-14 | 1973-08-13 | Ici Ltd | Pansements |
JPS4943153A (ja) * | 1972-08-31 | 1974-04-23 | ||
US3921636A (en) | 1973-01-15 | 1975-11-25 | Alza Corp | Novel drug delivery device |
US3909816A (en) | 1974-04-29 | 1975-09-30 | Lloyd L Teeters | Flame and carbon monoxide sensor and alarm circuit |
US3993072A (en) | 1974-08-28 | 1976-11-23 | Alza Corporation | Microporous drug delivery device |
IL47062A (en) | 1975-04-10 | 1979-07-25 | Yeda Res & Dev | Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde |
US3972995A (en) | 1975-04-14 | 1976-08-03 | American Home Products Corporation | Dosage form |
US4405616A (en) | 1975-06-19 | 1983-09-20 | Nelson Research & Development Company | Penetration enhancers for transdermal drug delivery of systemic agents |
JPS5251009A (en) | 1975-10-17 | 1977-04-23 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | Method of producing drug for treating marrow leukemia |
US4077407A (en) | 1975-11-24 | 1978-03-07 | Alza Corporation | Osmotic devices having composite walls |
US4031894A (en) | 1975-12-08 | 1977-06-28 | Alza Corporation | Bandage for transdermally administering scopolamine to prevent nausea |
US4201210A (en) | 1976-06-22 | 1980-05-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Veterinary ocular ring device for sustained drug release |
US4060084A (en) | 1976-09-07 | 1977-11-29 | Alza Corporation | Method and therapeutic system for providing chemotherapy transdermally |
US4201211A (en) | 1977-07-12 | 1980-05-06 | Alza Corporation | Therapeutic system for administering clonidine transdermally |
CA1097233A (en) | 1977-07-20 | 1981-03-10 | George K. E. Gregory | Packages |
JPS5562012A (en) | 1978-11-06 | 1980-05-10 | Teijin Ltd | Slow-releasing preparation |
US4230105A (en) | 1978-11-13 | 1980-10-28 | Merck & Co., Inc. | Transdermal delivery of drugs |
US4291015A (en) | 1979-08-14 | 1981-09-22 | Key Pharmaceuticals, Inc. | Polymeric diffusion matrix containing a vasodilator |
US4361552A (en) | 1980-09-26 | 1982-11-30 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Wound dressing |
US4327725A (en) | 1980-11-25 | 1982-05-04 | Alza Corporation | Osmotic device with hydrogel driving member |
US4347841A (en) | 1981-03-11 | 1982-09-07 | Human Oltoanyagtermelo Es Kutato Intezet | Biological wound covering and method for producing same |
US5116817A (en) | 1982-12-10 | 1992-05-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | LHRH preparations for intranasal administration |
US4476116A (en) * | 1982-12-10 | 1984-10-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Polypeptides/chelating agent nasal compositions having enhanced peptide absorption |
US4599226A (en) | 1983-03-31 | 1986-07-08 | Genetic Laboratories, Inc. | Wound dressing comprising silver sulfadiazine incorporated in animal tissue and method of preparation |
US4599084A (en) | 1983-05-24 | 1986-07-08 | American Hospital Supply Corp. | Method of using biological tissue to promote even bone growth |
US5093487A (en) * | 1986-01-06 | 1992-03-03 | Mobay Corporation | Low viscosity high molecular weight filter sterilizable hyaluronic acid |
US4624848A (en) | 1984-05-10 | 1986-11-25 | Ciba-Geigy Corporation | Active agent containing hydrogel devices wherein the active agent concentration profile contains a sigmoidal concentration gradient for improved constant release, their manufacture and use |
GB8518301D0 (en) * | 1985-07-19 | 1985-08-29 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Hydrodynamically explosive systems |
US4829000A (en) | 1985-08-30 | 1989-05-09 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Reconstituted basement membrane complex with biological activity |
US5436135A (en) | 1985-09-02 | 1995-07-25 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | New preparation of placenta collagen, their extraction method and their applications |
US4983396A (en) | 1985-12-06 | 1991-01-08 | Key Pharmaceuticals, Inc. | Percutaneous penetration enhancer of oleic acid and 2-ethyl-1,3-hexanediol |
ES2056787T3 (es) * | 1985-12-17 | 1994-10-16 | Synergen Inc | Factor angiogenico de placenta humana capaz de estimular la sintesis capilar de proteasa de celulas endoteliales, la sintesis de adn y la migracion. |
EP0230654B1 (en) | 1985-12-28 | 1992-03-18 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Sustained pulsewise release pharmaceutical preparation |
US4886783A (en) | 1986-01-31 | 1989-12-12 | Nelson Research & Development Co. | Penetration enhancers for transdermal delivery of systemic agents |
US4801586A (en) | 1986-04-23 | 1989-01-31 | Nelson Research & Development Co. | Penetration enhancers for transdermal delivery of systemic agents |
US5118845A (en) | 1986-09-29 | 1992-06-02 | Whitby Research, Inc. | Penetration enhancer for transdermal delivery of systemic agents |
US5196410A (en) | 1986-10-31 | 1993-03-23 | Pfizer Inc. | Transdermal flux enhancing compositions |
DE3751254D1 (de) | 1986-10-31 | 1995-05-24 | Nippon Zeon Co | Wundverband. |
US4861764A (en) | 1986-11-17 | 1989-08-29 | Macro Chem. Corp. | Percutaneous absorption enhancers, compositions containing same and method of use |
GB8708009D0 (en) * | 1987-04-03 | 1987-05-07 | Clayton Found Res | Injectable soft tissue augmentation materials |
US5312325A (en) | 1987-05-28 | 1994-05-17 | Drug Delivery Systems Inc | Pulsating transdermal drug delivery system |
US4968509A (en) | 1987-07-27 | 1990-11-06 | Mcneilab, Inc. | Oral sustained release acetaminophen formulation and process |
US5033252A (en) | 1987-12-23 | 1991-07-23 | Entravision, Inc. | Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product |
US5052558A (en) | 1987-12-23 | 1991-10-01 | Entravision, Inc. | Packaged pharmaceutical product |
DE3805459A1 (de) * | 1988-02-22 | 1989-08-31 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur sterilisation von blut, plasma, blut- und plasmaderivaten, zellsuspensionen oder dgl. |
US5135915A (en) | 1988-10-14 | 1992-08-04 | Genentech, Inc. | Method for the treatment of grafts prior to transplantation using TGF-.beta. |
IL92966A (en) | 1989-01-12 | 1995-07-31 | Pfizer | Hydrogel-operated release devices |
US5075104A (en) | 1989-03-31 | 1991-12-24 | Alcon Laboratories, Inc. | Ophthalmic carboxy vinyl polymer gel for dry eye syndrome |
WO1991001720A1 (en) | 1989-08-07 | 1991-02-21 | Herman Wade Schlameus | Composition and method of promoting hard tissue healing |
US5192744A (en) | 1990-01-12 | 1993-03-09 | Northwestern University | Method of inhibiting angiogenesis of tumors |
US5017381A (en) * | 1990-05-02 | 1991-05-21 | Alza Corporation | Multi-unit pulsatile delivery system |
US5633009A (en) | 1990-11-28 | 1997-05-27 | Sano Corporation | Transdermal administration of azapirones |
AU663083B2 (en) | 1991-03-26 | 1995-09-28 | State of Oregon acting by and through The State Board of Higher Education on behalf of The Oregon Health Sciences University, The | Product and method for improving keratinocyte adhesion to the dermis |
AU1537292A (en) | 1991-04-16 | 1992-11-17 | Nippon Shinyaku Co. Ltd. | Method of manufacturing solid dispersion |
US5229135A (en) | 1991-11-22 | 1993-07-20 | Prographarm Laboratories | Sustained release diltiazem formulation |
EP0613373B1 (en) * | 1991-11-22 | 2000-08-02 | THE PROCTER & GAMBLE PHARMACEUTICALS, INC. | Risedronate delayed-release compositions |
CN1072086A (zh) * | 1992-02-22 | 1993-05-19 | 郝振林 | 烧烫伤创面生物覆盖膜的制备方法 |
JP3337488B2 (ja) * | 1992-03-06 | 2002-10-21 | アベンティス ファーマ株式会社 | 切迫流産治療剤 |
US5461140A (en) | 1992-04-30 | 1995-10-24 | Pharmaceutical Delivery Systems | Bioerodible polymers for solid controlled release pharmaceutical compositions |
US5260068A (en) * | 1992-05-04 | 1993-11-09 | Anda Sr Pharmaceuticals Inc. | Multiparticulate pulsatile drug delivery system |
CH684741A5 (de) * | 1992-06-11 | 1994-12-15 | Lucchini Lab Sa | Verfahren zur Herstellung eines Extraktes. |
US5323907A (en) * | 1992-06-23 | 1994-06-28 | Multi-Comp, Inc. | Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications |
US5437287A (en) | 1992-08-17 | 1995-08-01 | Carbomedics, Inc. | Sterilization of tissue implants using iodine |
US5318513A (en) | 1992-09-24 | 1994-06-07 | Leib Martin L | Canalicular balloon fixation stent |
DE69332291T2 (de) | 1992-10-16 | 2003-07-31 | Nippon Shinyaku Co Ltd | Verfahren zur herstellung von wachsmatrizes |
US5260069A (en) | 1992-11-27 | 1993-11-09 | Anda Sr Pharmaceuticals Inc. | Pulsatile particles drug delivery system |
US5686105A (en) * | 1993-10-19 | 1997-11-11 | The Procter & Gamble Company | Pharmaceutical dosage form with multiple enteric polymer coatings for colonic delivery |
IL112580A0 (en) | 1994-02-24 | 1995-05-26 | Res Dev Foundation | Amniotic membrane graft of wrap to prevent adhesions or bleeding of internal organs |
US6203755B1 (en) | 1994-03-04 | 2001-03-20 | St. Jude Medical, Inc. | Electron beam sterilization of biological tissues |
WO1996005851A1 (de) | 1994-08-23 | 1996-02-29 | Dgf Stoess Ag | Verwendung von geschmacksneutralem, hydrolysiertem kollagen und mittel enthaltend dasselbe |
US5665378A (en) | 1994-09-30 | 1997-09-09 | Davis; Roosevelt | Transdermal therapeutic formulation |
US5567441A (en) | 1995-03-24 | 1996-10-22 | Andrx Pharmaceuticals Inc. | Diltiazem controlled release formulation |
JPH11505258A (ja) | 1995-05-17 | 1999-05-18 | セダーシナイ メディカル センター | 小腸における消化および吸収を改善させる脂肪酸を含む組成物 |
US5837284A (en) | 1995-12-04 | 1998-11-17 | Mehta; Atul M. | Delivery of multiple doses of medications |
US7632922B1 (en) | 1995-12-22 | 2009-12-15 | Amgen, Inc. | Osteoprotegerin |
US6923983B2 (en) | 1996-02-19 | 2005-08-02 | Acrux Dds Pty Ltd | Transdermal delivery of hormones |
US6929801B2 (en) | 1996-02-19 | 2005-08-16 | Acrux Dds Pty Ltd | Transdermal delivery of antiparkinson agents |
US6632648B1 (en) | 1996-05-14 | 2003-10-14 | Elan Drug Delivery Limited | Methods of terminal sterilization of fibrinogen |
US5632284A (en) | 1996-05-22 | 1997-05-27 | Graether; John M. | Barrier eye drape and method of using same |
US6152142A (en) * | 1997-02-28 | 2000-11-28 | Tseng; Scheffer C. G. | Grafts made from amniotic membrane; methods of separating, preserving, and using such grafts in surgeries |
US5932545A (en) | 1997-03-17 | 1999-08-03 | Abbott Laboratories | Antiangiogenic drug to treat cancer, arthritis and retinopathy |
US5840329A (en) * | 1997-05-15 | 1998-11-24 | Bioadvances Llc | Pulsatile drug delivery system |
US6391452B1 (en) | 1997-07-18 | 2002-05-21 | Bayer Corporation | Compositions for nasal drug delivery, methods of making same, and methods of removing residual solvent from pharmaceutical preparations |
US5869090A (en) | 1998-01-20 | 1999-02-09 | Rosenbaum; Jerry | Transdermal delivery of dehydroepiandrosterone |
CN1054513C (zh) | 1998-04-14 | 2000-07-19 | 姚炳坤 | 一种制作冻干羊胎素的方法 |
US6946144B1 (en) * | 1998-07-08 | 2005-09-20 | Oryxe | Transdermal delivery system |
CN1203794A (zh) | 1998-07-10 | 1999-01-06 | 聂怀顺 | 羊胎素冻干粉及其生产方法 |
JP4477156B2 (ja) * | 1998-09-22 | 2010-06-09 | 李 鎭彪 | オキシトシン受容体作用物質 |
US6096733A (en) | 1998-12-10 | 2000-08-01 | Virginia Lubkin | Drugs for topical application of sex steroids in the treatment of dry eye syndrome, and methods of preparation and application |
US20030068815A1 (en) | 1999-02-11 | 2003-04-10 | Stone Kevin R. | Sterilized xenograft tissue |
US6395300B1 (en) | 1999-05-27 | 2002-05-28 | Acusphere, Inc. | Porous drug matrices and methods of manufacture thereof |
US6046160A (en) * | 1999-07-22 | 2000-04-04 | Deroyal Industries, Inc. | Composition and method for enhancing wound healing |
US6521179B1 (en) | 1999-08-11 | 2003-02-18 | Biomedical Design, Inc. | Sterilization |
US6573249B2 (en) * | 2000-02-15 | 2003-06-03 | Alphamed Pharmaceutical Corp. | Topical wound therapeutic compositions |
US10281478B2 (en) | 2000-04-06 | 2019-05-07 | Wayne P. Franco | Combination growth factor therapy and cell therapy for treatment of acute and chronic diseases of the organs |
KR20010098716A (ko) | 2000-04-19 | 2001-11-08 | 김재찬 | 안구표면질환 치료용 양막 추출물 |
US6277855B1 (en) | 2000-04-21 | 2001-08-21 | Inspire Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating dry eye disease with nicotinic acetylcholine receptor agonists |
US6465014B1 (en) | 2001-03-21 | 2002-10-15 | Isp Investments Inc. | pH-dependent sustained release, drug-delivery composition |
US20020192272A1 (en) | 2001-03-28 | 2002-12-19 | Popp Karl F. | Metronidazole pledgets |
PT102589A (pt) | 2001-03-30 | 2002-12-31 | Ramos Maria Teresa Furtado | Metodo para a preparacao de membranas amnioticas imunologicamente inertes |
US20030180181A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-09-25 | Teri Greib | Methods for sterilizing tissue |
TWI290055B (en) | 2002-03-14 | 2007-11-21 | Tissuetech Inc | Amniotic membrane covering for a tissue surface and devices facilitating fastening of membranes |
US20030187515A1 (en) | 2002-03-26 | 2003-10-02 | Hariri Robert J. | Collagen biofabric and methods of preparing and using the collagen biofabric |
EP1509236A4 (en) * | 2002-05-13 | 2008-07-30 | Children S Hospital Los Angele | TREATMENT AND PREVENTION OF ABNORMAL SCALING IN KELOIDS AND OTHER SKIN OR INTERNAL WOUNDS OR LESIONS |
WO2004017941A2 (en) | 2002-08-20 | 2004-03-04 | Euro-Celtique, S.A. | Transdermal dosage form comprising an active agent and a salt and free-baseform of an antagonist |
US20040091503A1 (en) | 2002-08-20 | 2004-05-13 | Genitrix, Llc | Lectin compositions and methods for modulating an immune response to an antigen |
US20040057938A1 (en) * | 2002-09-18 | 2004-03-25 | Emiliano Ghinelli | Use of a human amniotic membrane composition for prophylaxis and treatment of diseases and conditions of the eye and skin |
CN1720055A (zh) | 2002-10-04 | 2006-01-11 | 组织技术公司 | 视网膜上皮细胞在羊膜上的培养和移植 |
US7700076B2 (en) | 2002-10-25 | 2010-04-20 | Foamix, Ltd. | Penetrating pharmaceutical foam |
KR100794289B1 (ko) * | 2002-11-08 | 2008-01-11 | 아이진 주식회사 | Bmp-7 폴리펩타이드를 포함하는 흉터 형성 억제제 |
US20190105352A9 (en) | 2003-01-07 | 2019-04-11 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of intervertebral disc degeneration using human umbilical cord tissue-derived cells |
WO2004078225A1 (ja) | 2003-02-26 | 2004-09-16 | Amniotec Inc. | 羊膜由来医用材料、及びその作製方法 |
WO2005001079A2 (en) | 2003-06-27 | 2005-01-06 | Ethicon, Incorporated | Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells |
US20110280838A1 (en) | 2007-12-27 | 2011-11-17 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of intervertebral disc degeneration using human umbilical cord tissue-derived cells |
US7480530B2 (en) | 2003-06-30 | 2009-01-20 | Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. | Device for treatment of barrier membranes |
US8486374B2 (en) | 2003-08-04 | 2013-07-16 | Foamix Ltd. | Hydrophilic, non-aqueous pharmaceutical carriers and compositions and uses |
ITRM20030595A1 (it) * | 2003-12-23 | 2005-06-24 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Uso della ptx3 o di un suo derivato funzionale da sola o in associazione con tsg6 per il trattamento di patologie degenarative dell'osso o della cartilagine e per il trattamento della infertilita' femminile. |
WO2006026325A2 (en) | 2004-08-26 | 2006-03-09 | Pathak Chandrashekhar P | Implantable tissue compositions and method |
WO2006091546A2 (en) | 2005-02-22 | 2006-08-31 | The Johns Hopkins School Of Medicine | Use of amniotic fluid (af) in treating ocular disease and injury |
WO2006094247A2 (en) * | 2005-03-02 | 2006-09-08 | Tissuetech, Inc. | Amniotic membrane extracts, compositions thereof, and methods of use |
WO2007011693A2 (en) | 2005-07-14 | 2007-01-25 | Medistem Laboratories, Inc. | Compositions of placentally-derived stem cells for the treatment of cancer |
GB0514567D0 (en) * | 2005-07-15 | 2005-08-24 | Univ Nottingham | Surgical membrane |
CN1903073A (zh) * | 2005-07-26 | 2007-01-31 | 孙甜甜 | 胎元素保健品的制造方法 |
US8187639B2 (en) | 2005-09-27 | 2012-05-29 | Tissue Tech, Inc. | Amniotic membrane preparations and purified compositions and anti-angiogenesis treatment |
US8153162B2 (en) | 2005-09-27 | 2012-04-10 | Tissuetech, Inc. | Purified amniotic membrane compositions and methods of use |
DK1948259T3 (en) | 2005-10-26 | 2017-04-10 | Genesis Tech Ltd | ACELLULAR BIOabsorbable Tissue Regeneration Matrices Produced by Incubation of ACELLULAR BLOOD PRODUCTS |
SG10201401805YA (en) | 2005-12-22 | 2014-08-28 | Jane Ennis | Viable cells from frozen umbilical cord tissue |
US9944900B2 (en) | 2006-01-18 | 2018-04-17 | Hemacell Perfusion | Pulsatile perfusion extraction method for non-embryonic pluripotent stem cells |
US20180008649A1 (en) | 2006-03-23 | 2018-01-11 | Pluristem Ltd. | Adherent stromal cells derived from placentas of multiple donors and uses thereof |
US20080050814A1 (en) | 2006-06-05 | 2008-02-28 | Cryo-Cell International, Inc. | Procurement, isolation and cryopreservation of fetal placental cells |
US20070299386A1 (en) | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Minu, L.L.C. | Delivery of an ocular agent using iontophoresis |
US8980630B2 (en) | 2006-06-28 | 2015-03-17 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Obtaining multipotent amnion-derived stem cell (ADSC) from amniotic membrane tissue without enzymatic digestion |
US8105634B2 (en) | 2006-08-15 | 2012-01-31 | Anthrogenesis Corporation | Umbilical cord biomaterial for medical use |
US8372437B2 (en) | 2006-08-17 | 2013-02-12 | Mimedx Group, Inc. | Placental tissue grafts |
WO2008042441A1 (en) | 2006-10-03 | 2008-04-10 | Anthrogenesis Corporation | Use of umbilical cord biomaterial for ocular surgery |
US8071135B2 (en) | 2006-10-04 | 2011-12-06 | Anthrogenesis Corporation | Placental tissue compositions |
EP2664341A3 (en) | 2006-10-06 | 2014-01-08 | Anthrogenesis Corporation | Native (telopeptide) placental collagen compositions |
US20080102135A1 (en) | 2006-10-28 | 2008-05-01 | Franck Jean Ollivier | Use of equine amniotic membrane in ophthalmic surgeries in veterinary medicine |
US20080241211A1 (en) | 2007-03-27 | 2008-10-02 | University Of Southern California | Device which enhances the biological activity of locally applied growth factors with particular emphasis on those used for bone repair |
DK3473260T3 (da) | 2007-07-10 | 2020-12-21 | Lifecell Corp | Acellulære vævsmatrixs-sammensætninger til vævsreparation |
EP3189731B1 (en) | 2007-09-07 | 2020-01-29 | MiMedx Group, Inc. | Placental tissue grafts and improved methods of preparing and using the same |
KR20140107677A (ko) | 2007-09-19 | 2014-09-04 | 플루리스템 리미티드 | 지방 또는 태반 조직 유래의 부착 세포 및 이의 치료 용도 |
WO2009111159A2 (en) | 2008-03-03 | 2009-09-11 | New York University | Biocompatible materials containing stable complexes of tsg-6 and hyaluronan and method of using same |
US9125735B2 (en) | 2008-04-04 | 2015-09-08 | Forsight Labs, Llc | Method of correcting vision using corneal onlays |
US8728805B2 (en) | 2008-08-22 | 2014-05-20 | Anthrogenesis Corporation | Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations |
BRPI0923177A2 (pt) | 2008-12-19 | 2020-08-25 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | usos de composições para tratar dor neuropática e espacidade, as referidas composições, e kit |
US20190054125A1 (en) | 2008-12-19 | 2019-02-21 | DePuy Synthes Products, Inc. | hUTC MODULATION OF PRO-INFLAMMATORY MEDIATORS OF LUNG AND PULMONARY DISEASES AND DISORDERS |
CA2758571A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Tissuetech, Inc. | Compositions containing hc-ha complex and methods of use thereof |
EP4108216A1 (en) | 2009-06-03 | 2022-12-28 | Forsight Vision5, Inc. | Anterior segment drug delivery |
EP2470231B1 (en) | 2009-08-25 | 2019-10-09 | Tissue Tech, Inc. | Umbilical cord amniotic membrane products |
ES2663720T3 (es) | 2010-02-18 | 2018-04-16 | Osiris Therapeutics, Inc. | Métodos de fabricación de productos terapéuticos que comprenden dispersiones placentarias vitalizadas |
WO2011127113A1 (en) | 2010-04-08 | 2011-10-13 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of sarcoidosis using placental stem cells |
US9352003B1 (en) | 2010-05-14 | 2016-05-31 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
SG185811A1 (en) | 2010-06-01 | 2013-01-30 | Auxocell Lab Inc | Native wharton's jelly stem cells and their purification |
US8939948B2 (en) | 2010-06-01 | 2015-01-27 | Forsight Vision5, Inc. | Ocular insert apparatus and methods |
US8840665B2 (en) | 2010-06-11 | 2014-09-23 | Liventa Bioscience, Inc. | Method of tendon repair with amnion and chorion constructs |
US20130156863A1 (en) | 2010-06-30 | 2013-06-20 | Tissuetech, Inc. | Methods of preparing chorion tissue and products derived therefrom |
US20120003296A1 (en) | 2010-07-01 | 2012-01-05 | Shantha Totada R | New methods of treating dry eye syndrome |
US20120010727A1 (en) | 2010-07-06 | 2012-01-12 | AFcell Medical | Amnion and chorion constructs and uses thereof in sport injury surgeries |
US20120010708A1 (en) | 2010-07-08 | 2012-01-12 | AFcell Medical | Amnion and chorion replacement cover and uses thereof in surgical repair of muscles |
US20120020933A1 (en) | 2010-07-22 | 2012-01-26 | AFcell Medical | Method of nerve repair with amnion and chorion constructs |
US20120035743A1 (en) | 2010-08-03 | 2012-02-09 | AFcell Medical | Amnion and chorion constructs and uses thereof in minimally invasive surgeries |
US20120035744A1 (en) | 2010-08-04 | 2012-02-09 | AFcell Medical | Amnion and chorion constructs and uses thereof in joint repair |
MX344727B (es) | 2010-11-11 | 2017-01-05 | Abbvie Biotechnology Ltd | Formulaciones liquidas de anticuerpos anti-tnf-alfa de alta concentracion mejoradas. |
KR102331661B1 (ko) | 2011-02-14 | 2021-11-25 | 미메딕스 그룹 인크. | 마이크로화된 태반 조직 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법 |
KR102118457B1 (ko) | 2011-02-14 | 2020-06-03 | 미메딕스 그룹 인크. | 가교제로 변형된 조직 이식편 및 그것의 제조 및 사용 방법 |
WO2012112441A1 (en) | 2011-02-14 | 2012-08-23 | Mimedx Group Inc. | Laminated tissue grafts composed of wharton's jelly and methods of making and using the same |
WO2012149486A1 (en) | 2011-04-28 | 2012-11-01 | Tissuetech, Inc. | Methods of modulating bone remodeling |
AU2012262273B2 (en) | 2011-06-01 | 2017-09-14 | Celularity Inc. | Treatment of pain using placental stem cells |
ES2822301T3 (es) | 2011-06-10 | 2021-04-30 | Tissuetech Inc | Métodos de procesamiento de tejidos de soporte fetal |
WO2013032938A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-03-07 | Tissuetech, Inc. | Methods of sterilizing fetal support tissues |
US8932805B1 (en) | 2011-10-31 | 2015-01-13 | BioDlogics, LLC | Birth tissue material and method of preparation |
CA2858161C (en) | 2011-12-05 | 2020-03-10 | Incept, Llc | Medical organogel processes and compositions |
US9162011B2 (en) | 2011-12-19 | 2015-10-20 | Allosource | Flowable matrix compositions and methods |
DK3321355T3 (da) | 2011-12-30 | 2021-11-08 | Amit Patel | Fremgangsmåder og sammensætninger til klinisk afledning af en allogen celle og terapeutiske anvendelser |
US9510972B2 (en) | 2012-01-04 | 2016-12-06 | Sight Sciences, Inc. | Dry eye treatment systems |
US20130211504A1 (en) | 2012-02-14 | 2013-08-15 | AFcell Medical | Method of using amnion allograft in heart valve repair surgery |
US9416410B2 (en) | 2012-02-14 | 2016-08-16 | Genetics Development Corporation | Cutoff point delta Ct. method for HER2 PCR testing in breast cancer |
US8961617B2 (en) | 2012-03-08 | 2015-02-24 | Liventa Bioscience, Inc. | Amnion and chorion constructs and uses thereof in abdominal surgery |
US20130236506A1 (en) | 2012-03-08 | 2013-09-12 | AFcell Medical | Amnion and chorion constructs and uses thereof in ob-gyn surgery |
US20130289724A1 (en) | 2012-04-25 | 2013-10-31 | AFcell Medical | Amnion and chorion wound dressing and uses thereof |
US9295753B1 (en) | 2012-07-02 | 2016-03-29 | Celso Tello | Amniotic membrane preparation and device for use as a lens or as a dressing for promoting healing |
ES2846789T3 (es) | 2012-07-11 | 2021-07-29 | Tissuetech Inc | Composiciones que contienen complejos HC-HA/PTX3 y métodos de uso de los mismos |
WO2014025792A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-13 | Baylor College Of Medicine | Therapeutics dispensing device and methods of making same |
CA2880157C (en) | 2012-08-15 | 2020-07-21 | Mimedx Group, Inc. | Reinforced placental tissue grafts and methods of making and using the same |
US11338063B2 (en) | 2012-08-15 | 2022-05-24 | Mimedx Group, Inc. | Placental tissue grafts modified with a cross-linking agent and methods of making and using the same |
US9943551B2 (en) | 2012-08-15 | 2018-04-17 | Mimedx Group, Inc. | Tissue grafts composed of micronized placental tissue and methods of making and using the same |
US8904664B2 (en) | 2012-08-15 | 2014-12-09 | Mimedx Group, Inc. | Dehydration device and methods for drying biological materials |
US20140186461A1 (en) | 2012-09-10 | 2014-07-03 | Alpha Tissue, Inc. | Human Amniotic Membrane Lyophilized Grafts |
US20140106447A1 (en) | 2012-10-12 | 2014-04-17 | Mimedx Group, Inc. | Compositions and methods for recruiting stem cells |
US9180145B2 (en) | 2012-10-12 | 2015-11-10 | Mimedx Group, Inc. | Compositions and methods for recruiting and localizing stem cells |
PT2911623T (pt) | 2012-10-26 | 2019-11-21 | Forsight Vision5 Inc | Sistema oftálmico para libertação prolongada de fármaco no olho |
US10517931B2 (en) | 2013-01-17 | 2019-12-31 | Mimedx Group, Inc. | Non-surgical, localized delivery of compositions for placental growth factors |
US9827293B2 (en) | 2013-01-17 | 2017-11-28 | Mimedx Group, Inc. | Non-surgical, localized delivery of compositions for placental growth factors |
US9655948B1 (en) | 2013-01-17 | 2017-05-23 | Mimedx Group, Inc. | Non-surgical, localized delivery of compositions for placental growth factors |
US10111910B2 (en) | 2013-01-18 | 2018-10-30 | Mimedx Group, Inc. | Methods for treating cardiac conditions |
US9498327B1 (en) | 2013-03-05 | 2016-11-22 | Biodlogics Llc | Repair of tympanic membrane using human birth tissue material |
DK2968418T3 (da) | 2013-03-15 | 2024-01-15 | Nutech Medical Inc | Præparater afledt af placentamaterialer til fremstilling og anvendelse deraf |
US9795639B1 (en) | 2013-03-16 | 2017-10-24 | BioDlogics, LLC | Methods for the treatment of erectile dysfunction by human birth tissue material compostion |
US20160022695A1 (en) | 2013-03-27 | 2016-01-28 | Forsight Vision5, Inc. | Bimatoprost Ocular Silicone Inserts and Methods of Use Thereof |
KR20150139569A (ko) | 2013-04-02 | 2015-12-11 | 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크. | 혈관형성의 유도 및 조절을 위한 조성물 및 방법 및 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 방법 및 분석법 |
WO2015038477A1 (en) | 2013-09-10 | 2015-03-19 | Mimedx Group, Inc. | Cosmetic uses of molded placental compositions |
ES2870567T3 (es) | 2014-01-08 | 2021-10-27 | Samsung Life Public Welfare Foundation | Células madre procedentes de una capa trofoblástica coriónica pura y terapia celular que comprende las mismas |
WO2015109329A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Mimedx Group, Inc. | Method for inducing angiogenesis |
US9814746B2 (en) | 2014-06-15 | 2017-11-14 | Amnio Technology Llc | Method of treatment utilizing an acellular amnion derived therapeutic composition |
US9132156B1 (en) | 2014-06-15 | 2015-09-15 | Amnio Technology Llc | Acellular amnion derived therapeutic compositions |
US11083758B2 (en) | 2014-05-14 | 2021-08-10 | Prime Merger Sub, Llc | Placental membrane preparations and methods of making and using same for regenerating cartilage and spinal intervertebral discs |
US20150335686A1 (en) | 2014-05-21 | 2015-11-26 | Mimedx Group, Inc. | Micronized wharton's jelly |
TW201603818A (zh) | 2014-06-03 | 2016-02-01 | 組織科技股份有限公司 | 組成物及方法 |
JP6640826B2 (ja) | 2014-07-08 | 2020-02-05 | ミメディクス グループ インコーポレイテッド | 微粒子化ワルトン膠質 |
TW201625229A (zh) | 2014-07-14 | 2016-07-16 | 組織科技股份有限公司 | 用於治療玫瑰斑之組成物及方法 |
CN107002035A (zh) | 2014-08-14 | 2017-08-01 | 阿威他国际有限公司 | 干细胞组合物和生产用于治疗应用的干细胞的方法 |
JP6960333B2 (ja) | 2014-09-09 | 2021-11-05 | ミメディクス グループ インコーポレイテッド | 任意にシーラントを含む微粒子化胎盤組織の組成物、ならびにその組成物の作製方法および使用方法 |
US9913466B2 (en) | 2014-09-10 | 2018-03-13 | Healthbanks Biotech Co. Ltd. | Cryopreservation of umbilical cord tissue strips for cord tissue-derived stem cells |
JP2017533917A (ja) | 2014-11-05 | 2017-11-16 | ティッシュテック,インク. | 神経成長および再生を促進するための組成物および方法 |
US9395557B2 (en) | 2014-11-12 | 2016-07-19 | Vance M. Thompson | Partial corneal conjunctival contact lens |
GB2532499A (en) | 2014-11-21 | 2016-05-25 | Virgin Health Bank Qstp-Llc | Improvements in tissue processing |
US9694109B1 (en) | 2015-01-06 | 2017-07-04 | Brahm Holdings, Llc | Nanoparticle-containing placental constructs and methods of use |
WO2016138025A2 (en) | 2015-02-23 | 2016-09-01 | Tissuetech, Inc. | Apparatuses and methods for treating ophthalmic diseases and disorders |
JP2018516869A (ja) | 2015-05-20 | 2018-06-28 | ティッシュテック,インク. | 上皮細胞の増殖および上皮間葉転換を防ぐための組成物および方法 |
KR20160140492A (ko) | 2015-05-28 | 2016-12-07 | (주)차바이오텍 | 향상된 산후 부착형 세포 및 그의 제조 방법 |
WO2017096616A1 (zh) | 2015-12-11 | 2017-06-15 | 郭镭 | 一种无血清培养基及其制备方法和用途 |
WO2017096617A1 (zh) | 2015-12-11 | 2017-06-15 | 郭镭 | 一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒及采用所述试剂盒获得的hUC-MSC |
US20180362923A1 (en) | 2015-12-11 | 2018-12-20 | Lei Guo | Method for separating and extracting huc-msc from wharton's jelly tissue of umbilical cord |
TW201733600A (zh) | 2016-01-29 | 2017-10-01 | 帝聖工業公司 | 胎兒扶持組織物及使用方法 |
US10993969B2 (en) | 2016-02-05 | 2021-05-04 | Gary M. Petrucci | Methods and materials for treating nerve injuries and neurological disorders |
US20170354692A1 (en) | 2016-06-13 | 2017-12-14 | MAM Holdings of West Florida, L.L.C. | Amniotic fluid formulation for treatment of lung disorders |
US11318168B2 (en) | 2016-06-24 | 2022-05-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human tissue derived compositions and uses thereof |
US20180110900A1 (en) | 2016-08-21 | 2018-04-26 | Michael S. Korenfeld | Therapeutic Applications of Honey and Amniotic Membrane for the Treatment of Disease |
WO2018039294A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | Arthrex, Inc. | Tissue use for repair of injury |
TWI689589B (zh) | 2016-08-31 | 2020-04-01 | 宣捷細胞生物製藥股份有限公司 | 區別間質幹細胞的方法及測定間質幹細胞的純度的方法 |
WO2018067071A1 (en) | 2016-10-05 | 2018-04-12 | Cellresearch Corporation Pte. Ltd. | A method of isolating mesenchymal stem cells from umbilical cord amniotic membrane using a cell culture medium |
US10745664B2 (en) | 2016-10-28 | 2020-08-18 | Reelabs Private Limited, a Company Incorporated Under Provisions of The Companies Act 1956 | Method of progenitor cell isolation from different organs by natural destruction of extracellular matrix |
US20180126036A1 (en) | 2016-11-07 | 2018-05-10 | Ise Professional Testing & Consulting Services, Inc. | Decellularized biomaterial from mammalian tissue |
US20180163177A1 (en) | 2016-12-11 | 2018-06-14 | Healthbanks Biotech Co. Ltd. | Serum-free culture medium and method for expanding hematopoietic stem cells |
JP6557717B2 (ja) | 2016-12-23 | 2019-08-07 | インスコビー・インコーポレイテッドInscobee,Inc. | 生体植立用インプラント及びその製造方法 |
US20180177989A1 (en) | 2016-12-28 | 2018-06-28 | Regen Medical Inc. | Vaginal rejuvenation methods and devices |
US10668111B2 (en) | 2017-01-18 | 2020-06-02 | National Yang Ming University | Use of umbilical mesenchymal stem cells for treating pulmonary fibrosis |
US20180264049A1 (en) | 2017-03-20 | 2018-09-20 | Batu Biologics, Inc. | Immunotherapy of Aberrant Ocular Angiogenesis by Placental Vaccination |
US20180271914A1 (en) | 2017-03-21 | 2018-09-27 | Noveome Biotherapeutics, Inc. | Methods for Reducing the Extent of Light-induced Tissue Inflammation and Injury |
US20180311408A1 (en) | 2017-05-01 | 2018-11-01 | Trojan Medical Solutions, LLC | Amnion based conduit tissue |
US20180346874A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Janssen Biotech, Inc. | Methods of obtaining cells from human postpartum umbilical cord arterial tissue |
US20180344777A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method of modulating müller glia cells |
WO2019087130A2 (en) | 2017-11-03 | 2019-05-09 | Janssen Biotech, Inc. | Method of inhibiting angiogenesis |
WO2019099503A1 (en) | 2017-11-14 | 2019-05-23 | Cook Biotech Incorporated | Preserved tissue products and related methods |
-
2006
- 2006-09-27 US US11/528,980 patent/US8153162B2/en active Active
- 2006-09-27 ES ES06804232T patent/ES2713062T3/es active Active
- 2006-09-27 WO PCT/US2006/037906 patent/WO2007038686A2/en active Application Filing
- 2006-09-27 US US11/529,658 patent/US8182841B2/en active Active
- 2006-09-27 CN CN201510209392.7A patent/CN104873956B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-27 CA CA2999420A patent/CA2999420A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-27 AU AU2006294581A patent/AU2006294581B2/en not_active Ceased
- 2006-09-27 CA CA2623940A patent/CA2623940C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-27 US US11/528,902 patent/US8182840B2/en active Active
- 2006-09-27 EP EP13163155.8A patent/EP2664337B1/en not_active Not-in-force
- 2006-09-27 DK DK06804232.4T patent/DK1933852T3/en active
- 2006-09-27 CA CA2949643A patent/CA2949643C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-27 JP JP2008533609A patent/JP5505760B2/ja active Active
- 2006-09-27 EP EP06804232.4A patent/EP1933852B1/en active Active
- 2006-09-27 CN CN200680044389.3A patent/CN101316602B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-04-03 US US13/438,759 patent/US8460714B2/en active Active
- 2012-04-23 US US13/453,771 patent/US8455009B2/en active Active
- 2012-04-23 US US13/453,765 patent/US8440235B2/en active Active
-
2013
- 2013-03-13 US US13/802,264 patent/US9198939B2/en active Active
- 2013-03-13 US US13/802,359 patent/US9161955B2/en active Active
- 2013-03-13 US US13/802,447 patent/US9161956B2/en active Active
-
2014
- 2014-02-05 JP JP2014020763A patent/JP5900985B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-09-08 US US14/848,143 patent/US9956252B2/en active Active
- 2015-09-08 US US14/848,148 patent/US9724370B2/en active Active
- 2015-09-08 US US14/848,153 patent/US9750771B2/en active Active
-
2016
- 2016-02-16 HK HK16101655.6A patent/HK1213499A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2017
- 2017-06-28 US US15/636,227 patent/US10272119B2/en active Active
-
2018
- 2018-01-24 US US15/879,042 patent/US10632155B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5900985B2 (ja) | 羊膜調製物及び精製組成物及びその使用方法 | |
US9750772B2 (en) | Amniotic membrane preparations and purified compositions and anti-angiogenesis treatment |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150212 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150507 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150710 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150717 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151109 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160205 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160224 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160303 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5900985 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |