CN110090228A

CN110090228A - 人羊膜上皮细胞在自身免疫性疾病中的治疗用途

Info

Publication number: CN110090228A
Application number: CN201910310271.XA
Authority: CN
Inventors: 余路阳; 张传宇; 谭冰; 李金英; 袁惟芯; 郭礼和; 邵小燕; 刘佳
Original assignee: Sino-American iCELL (Shanghai) Biotechnology Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Sino-American iCELL (Shanghai) Biotechnology Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2019-08-06
Also published as: CN114470001A

Abstract

本发明涉及人羊膜上皮细胞(hAECs)在治疗自身免疫性疾病中的用途。本发明公开了使用有效剂量的羊膜上皮细胞或含有羊膜上皮细胞的细胞制剂单独或者与其它药物联合使用进行治疗和/或改善自身免疫性疾病的方法，所述的自身免疫性疾病包括桥本甲状腺炎、葡萄膜炎和红斑狼疮等。可以采用局部注射或者静脉注射等方法将羊膜上皮细胞给予患者，每次给予的剂量范围为大约10³‑10⁹细胞，一定程度上弥补了现有方法的不足，产生了良好的治疗的效果，为当前自身免疫性疾病提供了一种新的临床治疗方案。

Description

人羊膜上皮细胞在自身免疫性疾病中的治疗用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人羊膜上皮细胞在自身免疫性疾病中的治疗用途。

背景技术

免疫性疾病是指免疫调节失去平衡影响机体的免疫应答而引起的疾病。广义的免疫性疾病还包括先天或后天性原因导致的免疫系统结构上或功能上的异常。而自身免疫疾病(autoimmune diseases)是指人体对自身抗原产生免疫应答而致使本身组织损害所引发的疾病。其主要特点是病因不明，与遗传、多种环境因素等有关，且病程较长，频频发作，对患者生活造成极大痛苦。常见的自身免疫疾病包括桥本甲状腺炎、葡萄膜炎和红斑狼疮等。

其中，桥本甲状腺炎是人类最常见的内分泌失调疾病及自身免疫性疾病。该疾病是由于相关的性类固醇和X染色体对甲状腺和免疫系统产生的不良影响，女性发病率高于男性，是男性患者的5-10倍以上，其发病率随年龄增加，高峰处于45～65岁之间。

桥本甲状腺炎目前的病因尚不清楚，一般认为由遗传易感个体在环境因素引起的自我耐受破坏导致。桥本甲状腺炎以甲状腺内浸润大量淋巴细胞，产生甲状腺特异性的自身抗体、甲状腺细胞凋亡为主要特征。HT临床表现多种多样，常起病隐匿，进展缓慢，许多患有HT的病人没有明显的症状表象，常患病后1～2年甚至更长时间才发现。病人可伴有四种情况：1、甲状腺功能减退；2、甲状腺机能正常；3、甲状腺机能亢进；4、甲状腺功能减退或甲状腺机能亢进交替出现，患者很难控制激素水平，同时伴有甲状腺纤维化导致的弥漫性甲状腺肿或是甲状腺结节等体征。其他临床特征表现在人体的各个方面，包括消化系统异常，皮肤及附属结构病变，心血管系统出现病灶，并影响呼吸系统、造血系统、生殖系统、神经及精神系统出现相关症状，对患者的生活质量和幸福指数均会造成极大影响。当前对于桥本甲状腺炎相关治疗的方法主要分为：甲状腺激素替代疗法、限碘或补硒疗法、激光疗法和手术切除治疗，但由于以上方法均存在较大样本的并发症以及治疗效果不佳的问题。

此外，眼部的自身免疫性疾病在眼部的各种组织，包括结膜、角膜、巩膜、葡萄膜以及视网膜等均可以发生，严重影响了视力。其中，葡萄膜炎又称色素膜炎，包括虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜、视网膜血管和玻璃体的炎症，是一种眼科常见的易反复发作的致盲性疾病。葡萄膜富含黑色素相关抗原，而且脉络膜血流丰富且缓慢，这些特点使葡萄膜易于受到自身免疫等因素的影响，成为眼科临床上最常见的自身免疫性疾病之一。据有关资料统计，约4％-10％的盲目是由葡萄膜炎所致。葡萄膜炎多发于20-50岁的青壮年，男性多于女性。

葡萄膜炎为针对眼部特定免疫抗原的T细胞介导的自身免疫反应所致，但其具体的发病机制仍未完全明了。为了更好地研究葡萄膜炎，Wacker等成功诱导了实验性自身免疫性葡萄膜(experimental autoimmune uveoretinitis，EAU)动物模型，从而为更好地研究葡萄膜炎搭建了良好的平台。EAU与人类葡萄膜炎有着相似的临床表现以及病程，病理学变化亦与人类有着极大的相似性。EAU是辅助性T细胞(helper T cells，Th)介导的自身免疫反应，以Th1、Th17、Th2以及调节性T细胞(regulatory T cells.Treg)为主的四大类细胞群在EAU发展中发挥重要作用，其中Th1和Th17细胞是主要的效应细胞群，在不同条件下相互影响，分别或同时发挥致病作用。Th2细胞主要起保护作用，抑制免疫应答，保护组织免受炎性因子的破坏。Treg细胞是主要的免疫抑制细胞群，在EAU的恢复过程中发挥重要作用。Th1、Th17、Th2以及Treg细胞之间存在复杂和微妙的调控关系，它们共同参与了EAU的进程，在疾病的各个阶段发挥不同的作用。而且该病具有反复发作的特点，给病人造成了极大的痛苦和负担。目前主要应用激素以及免疫抑制剂对葡萄膜炎进行治疗，但激素及免疫抑制剂具有明显的副作用，在治疗疾病的同时，又给患者带来的严重的并发症。如何更有效、安全地治疗葡萄膜炎，是研究的热点之一。

另外一种常见的自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮(SLE)。SLE是一种多器官、多系统受累的严重危害人类健康的自身免疫性疾病，主要影响生育年龄的女性，其发病率在女性与男性中的比率为9:1。患者体内产生与多种核抗原包括双链DNA，核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)，Sm(small nuclear ribonuclear protein)等结合的自身抗体。这些自身抗体沉积在多个器官包括肾脏、皮肤和关节等，导致炎症的发生。系统性红斑狼疮临床表现多种多样，包括红斑性皮疹、口腔溃疡、关节炎、浆膜炎、血管炎、肾炎、神经系统、肺和心脏异常等。疾病的活动性、感染、狼疮肾炎、神经疾病常常与SLE的高发病率和死亡率相关。

系统性红斑狼疮确切的病因及发病机理至今尚不清楚，其为多基因的复杂疾病，目前已知有30个遗传位点与SLE的发病机理相关。其病因复杂，包括环境因素、性激素、遗传因素及随机事件等。迄今为止，国内外尚无特异的有效治疗手段，该病尚不能治愈。可以用5D疾病这一描述来形容该病给病人、家庭及社会带来的后果，即经济损失(dollar lost)、药物中毒(drug toxicity)、残疾(disability)、痛苦(discomfort)和死亡(death)。

综上，鉴于自身免疫性疾病如甲状腺炎、葡萄膜炎和红斑狼疮等发病机制复杂多样，具体的发病机制仍未完全明了，现有的激素及免疫抑制剂等治疗方法具有明显的副作用或治疗效果不佳，因此找到一种更为安全、有效、经济的治疗方法，对改善患者的生活质量与降低死亡率或伤残率具有重要的意义。

发明内容

为了解决当前对于自身免疫性疾病的治疗方法存在明显的副作用或者治疗效果不佳的技术难题，本发明提供了一种利用羊膜上皮细胞治疗自身免疫性疾病的治疗药物或者方法。

一方面，本发明提供了一种利用人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelialcells，hAECs)在治疗自身免疫性疾病中的用途。

在本发明的另一实施方案中，所述的自身免疫性疾病包括桥本甲状腺炎、葡萄膜炎和红斑狼疮等。

人羊膜上皮细胞来源于新生儿产后废弃物胎盘上的羊膜。胎盘形状为椭圆形或圆形，具有不同直径(15-20厘米)和厚度(2-3厘米)，500-600g，由羊膜、绒毛膜(胎儿部分)和蜕膜(母体部分)构成。其中蜕膜来自于母体的子宫内膜，羊膜和绒毛膜来源于胎儿，其中贴着母体蜕膜一侧为绒毛膜，羊膜位于胎儿绒毛膜的表面，与脐带和婴儿皮肤相连，包裹羊水和胎儿，因此也称作胎膜，是与发育中的胎儿联系紧密的胚胎发育早期产物，是母体与胎儿之间进行物质交流的重要组织。

从发生学上讲，羊膜上皮细胞产生于受精卵起始发育时形成的内细胞团。受精卵发育早期，未植入子宫之前(受精后3-4天)形成桑椹胚，大约由100多个细胞组成。外层的数十个细胞成为滋养层并最终形成绒毛膜，内层的数十个细胞就是内细胞群，未来发育为胚胎和羊膜。受精后大约8天，人类囊胚部分植入到子宫内膜基质。囊胚外层细胞(滋养层)分化成两层埋到基质内，内细胞团也分化成两层：上胚层和下胚层。上胚层是所有三个胚层的来源，最终形成发育的胚胎。同时，羊膜腔在上胚层内出现，相邻细胞滋养层的上胚层细胞被称为羊膜细胞。随着时间的推移羊膜腔扩大，在足月胎儿表面形成了厚约0.02-0.05mm，面积约700-1200cm²的，无血管、神经、肌肉和淋巴管，具有一定韧性和弹性，自内向外分为五层的羊膜。羊膜由羊膜上皮层(epithelium)、基底膜(basement membrane)、致密层(compact layer)、纤维母细胞层(fibroblast layer)、海绵层(spongy layer)五层组成，处于羊膜最里面的一层面向羊膜腔包裹着羊水的细胞为羊膜上皮细胞。

羊膜上皮细胞与胚胎干细胞具有同一发育组织来源，是由受精卵发育至第8天的囊胚内细胞团分化而来，因此保留胚胎干细胞特性，具有多能干性，有较强的分化能力及可塑性。hAECs通常表达多种胚胎干细胞有关的标记，包括阶段特异性胚胎抗原-3(stagespecific embryonic antigen，SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤排斥抗原-60(tumor rejection antigen，TRA1-60)和肿瘤排斥抗原-81(TRA1-81)。与此同时，还表达多潜能干细胞特异性转录因子OCT-4、SOX-2、Nanog、FGF4、REX-1。

在实际应用当中，人羊膜上皮细胞来源于新生儿产后废弃物胎盘上的羊膜，来源广泛，取材容易，价格便宜，没有应用限制，不会对婴儿或母亲产生任何伤害，显然没有胚胎干细胞应用所产生的伦理问题。同时人羊膜上皮细胞具有调节体内和体外免疫反应的能力，研究发现羊膜上皮细胞不表达或低表达HLA-A、B、C基因；有HLA-Ib(HLA-E、HLA-G)的表达；MHCⅡ基因：HLA-DP、DQ、DR则低表达或不表达；不表达β₂微球蛋白；不表达共刺激因子CD80、CD86。由于hAECs在体外培养时能分泌多种免疫调节因子、抗血管生成蛋白或抗炎因子相关蛋白，因此人羊膜上皮细胞可以看作是免疫赦免细胞，无抗原呈递的功能，移植后可减少免疫细胞来源，避免免疫排斥反应的发生。基于以上这些考虑，在各种来源、各种种类的多潜能细胞中，人羊膜上皮细胞是最适合用于临床细胞治疗和再生医学的种子细胞来源与类型。

一方面，本发明公开了由人羊膜上皮细胞或其细胞制剂在制备治疗和/或改善自身免疫性疾病的药物中的用途。使用有效剂量的由人羊膜上皮细胞或其细胞制剂可单独或者与其它药物联合使用进行治疗和/或改善自身免疫性疾病。有效剂量是指足以改善或防止医学疾病的症状或病症的量。对具体受治疗者的有效量可视多种因素而变化，例如待治疗的疾病、患者的整体健康状况、给药的方法途径和剂量及副作用的严重性。有效量可为避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

在本发明另一实施方案中，所述的具有自身免疫性疾病的动物是指哺乳动物。在更为优选的实施方案中，所述的动物为牛、马、羊、猴子、狗、大鼠、小鼠、兔子或人类。在最优选的实施方案中，所述的具有自身免疫性疾病的动物是指人类。

在发明的另一实施方案中，所述的细胞制剂包括人羊膜上皮细胞和药学可接受的载体。本发明所述的药学可接受的载体是指适合用于人和/或动物，无过度的不良副作用(如毒性、刺激性和过敏反应)的具有合适的有益/风险率的物质，例如药学可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂，有利于细胞存活，能递送所配制的细胞到人或动物。载体依合适地计划的给药方式而选择。本发明的载体包括但不限于各种生理缓冲液，如生理盐水、磷酸缓冲液、人工脑脊液或是全血清、脐带血清等。还可包括各种人工支架，包括但不限于明胶海绵、脱钙骨、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及它们的共聚物。

考虑到要治疗的疾病的类型，本领域的技术人员可以适当选择羊膜上皮细胞的合适状态：未经任何处理的收集的细胞(粗提部分)；部分纯化的细胞；纯化的细胞然后经培养扩增。

在本发明的优选实施方案中，所述的自身免疫性疾病包括桥本甲状腺炎、葡萄膜炎和红斑狼疮等。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供了一种用羊膜上皮细胞治疗桥本甲状腺炎的方法。EAT是由Tg诱导的研究人类桥本甲状腺炎的经典模型，与桥本甲状腺炎有许多同样特征。本发明所述的方法可以改善EAT小鼠甲状腺功能，降低血清自身抗体的浓度，减少甲状腺内淋巴细胞浸润，调节免疫系统，是治疗pTg(猪甲状腺球蛋白)引起的自身免疫性甲状腺炎的有效方法。利用这一模型，可将羊膜上皮细胞治疗桥本甲状腺炎的方法推广到人类患者。

在本发明另一优选的实施方案中，本发明提供了一种用羊膜上皮细胞治疗自身免疫性葡萄膜炎的方法。实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmuneuveoretinitis，EAU)与人类葡萄膜炎有着相似的临床表现以及病程，病理学变化亦与人类有着极大的相似。本发明所述的方法可以显著抑制EAU鼠疾病的发生与发展。利用这一模型，可将羊膜上皮细胞治疗葡萄膜炎的方法推广到人类患者。

在本发明另一优选的实施方案中，本发明提供了一种用羊膜上皮细胞治疗红斑狼疮的方法。本发明研究人羊膜上皮细胞在SLE治疗中的潜在能力并挖掘其治疗机理。在小鼠SLE发生后注射hAECs，能明显改善甚至治愈疾病，血清ANA及antidsDNA抗体由阳性转为阴性，显著降低IgG1、IgG2a、IgG3抗体水平。并且发现hAECs能通过调控T细胞亚群比例和细胞因子水平，从而恢复了SLE小鼠的免疫平衡。利用这一模型，可将羊膜上皮细胞治疗红斑狼疮的方法推广到人类患者。

在发明的一个优选实施方案中，提供了一种从羊膜组织中分离羊膜上皮细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；

(2)清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮细胞。

在本发明的另一实施方案中，本发明所述的羊膜上皮细胞来源于人类。可从离体的人胎盘分离羊膜，采用生理缓冲液冲洗除去血细胞，机械剔除残留绒毛膜和血管。分离指的是从组织样品中移出细胞且与另外的非组织干细胞分开。使用任何常规技术或方法将完整的组织分离为单细胞，这些技术或方法包括机械力(切碎力或剪切力)，用一种或组合的蛋白酶例如胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、释放酶(liberase)和胃蛋白酶进行酶消化或机械和酶方法的组合。

在本发明一个优选的实施方案中，人羊膜的获取应经产妇授权同意后，取健康产妇剖腹产后的胎盘组织，通过机械分离得到整张羊膜。

在本发明另一个优选的实施方案中，可对步骤2中获得人羊膜上皮细胞继续培养，优选的培养条件为：以1×10⁶-1×10⁸个细胞/平板的密度将细胞接种于培养皿中，放置于二氧化碳培养箱中培养，待人羊膜上皮细胞贴壁后换培养液，待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存。

本领域技术人员可用已知的其它方法将活性细胞群体浓缩。这些加工后洗涤/浓缩步骤可单独或同时施行。除了上述方法以外，还可在细胞洗涤后或培养后，进一步纯化或富集活性细胞群体，减少杂细胞和死细胞。分离悬浮液中的细胞可通过以下技术来实现：浮力密度沉降离心、有差别的与固相的粘着和从固相上洗脱、免疫磁性珠、荧光激光细胞分选(FACS)或其它技术。这些不同技术以及进行这些技术的装置的实例可参见现有技术和上市商品。

对本发明使用的基础培养基的类型没有限制，只要可用于细胞培养的培养基即可。优选的培养基包括DMEM培养基和NPBM培养基。对上面提到的基础培养基中可能含有的其他组份类型没有限制，优选的成分包括F-12、FCS和神经存活因子等。

在本发明的另一个优选实施方案中，向上面提到的基础培养基中添加bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或EGF(表皮生长因子)。在这种情况下，可以加入一种或者两者都加入。上面提到的bFGF或EGF的举例浓度是1ng/ml至100ng/ml，优选的浓度为10ng/ml。对添加的时间和方法没有限制。优选地，在将上面提到的羊膜上皮细胞在基础培养基中培养时每天加入试剂。

可以采用任意适合的方法将羊膜上皮细胞给予患者，例如患病部位局部注射、视网膜下腔注射、静脉注射或者脊髓腔内注射等。通常这些细胞是包含在药学上可接受的液体培养基中。细胞给予可以重复或连续进行(例如，通过连续灌输注入脑脊液中)。一般而言，多重给药方式通常要间隔至少7-10天分别使用。另外一种方法为将细胞种植在生物可吸收材料如明胶海绵里，采用手术将种有细胞的生物可吸收材料植入所需的部位。上述两种方法可结合应用，可取得更好的疗效。

羊膜上皮细胞的适合用量将根据患者的年龄、性别、体重、健康状况以及其它因素而改变。通常，每次给予的剂量范围为大约10³-10⁹细胞，典型的是大约10⁶-10⁷细胞。

在本发明的一些实施方案中，将羊膜上皮细胞与一种或多种药物一起施用给患者。

本发明首次将人羊膜上皮细胞用于自身免疫性疾病如桥本甲状腺炎、葡萄膜炎和红斑狼疮等疾病的治疗，一定程度上弥补了现有方法的不足，产生了良好的治疗的效果，为当前自身免疫性疾病提供了一种新的临床治疗方案。本发明的技术方案充分发挥了人羊膜上皮细胞的优点，其中人羊膜上皮细胞主要具有以下几个方面的优势：

(1)具有多能干性，有较强的分化能力及可塑性，在体外具有较强的分化能力，可以分化为三个胚层；

(2)具有调节体内和体外免疫反应的能力，在体外培养时能分泌多种免疫调节因子、抗血管生成蛋白或抗炎因子相关蛋白；

(3)有低免疫原性，可以看作是免疫赦免细胞，无抗原呈递的功能，移植后可减少免疫细胞来源，避免免疫排斥反应的发生；

(4)不表达端粒酶逆转录酶，没有致瘤性；

(5)来源广泛，取材容易，没有应用限制，不存在伦理问题。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚地了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下采用本发明的较佳实施案例并配合附图进行详细说明。

附图说明

图1a hAECs表达间充质干细胞标记情况

图1b hAECs表达MHC标记情况

图1c hAECs表达造血干细胞及内皮细胞标记情况

图2a对照组CBA/J小鼠甲状腺滤泡的光镜结构HE染色,甲状腺炎评分0+(×40)(箭头所示为均一的甲状腺滤泡)

图2b EAT组CBA/J小鼠甲状腺滤泡的光镜结构HE染色,甲状腺炎评分1+(×40)(箭头所示为弥漫的淋巴细胞浸润)

图2c EAT组CBA/J小鼠甲状腺滤泡的光镜结构HE染色,甲状腺炎评分2+(×40)(箭头所示为聚集的淋巴细胞，病灶达一个甲状腺滤泡大小)

图2d EAT组CBA/J小鼠甲状腺滤泡的光镜结构HE染色,甲状腺炎评分3+(×40)(箭头所示弥漫的淋巴细胞和聚集的淋巴细胞)

图2e EAT组CBA/J小鼠甲状腺滤泡的光镜结构HE染色，甲状腺炎评分4+(×40)(箭头所示为血管周围聚集的淋巴细胞)

图3建模后不同时间小鼠病理评分

图4 WT与EAT组小鼠血清内TGAb、TMAb的浓度

图5 WT与EAT组小鼠血清内TT3、TT4、TSH的浓度

图6 EAT与EAT+hAECs组小鼠血清TGAb浓度

图7 EAT与EAT+hAECs组小鼠血清TMAb浓度

图8 EAT与EAT+hAECs组小鼠血清TT3浓度

图9 EAT与EAT+hAECs组小鼠血清TT4浓度

图10 EAT与EAT+hAECs组小鼠血清TSH浓度

图11不同治疗时间对EAT小鼠疾病评分的影响

图12甲状腺内浸润的NK细胞和B细胞(B、C箭头所示为浸润的淋巴细胞，F、G所示浸润的NK细胞，J、K所示为浸润的B细胞)

图13不同分组Treg、Th17、Breg细胞比例变化

图14实验整体流程图。D0天预防组在造模同时进行细胞治疗，D6天治疗组在免疫后6天注射hAECs，对照组则在相应时间注射BSS。各组在免疫后第12、18天收集房水、眼球、脾脏淋巴结等样品进行相关检测。

图15各组的裂隙灯观察及炎症评分。(A)D0天预防组和D6天治疗组与相应对照组在免疫后12、18天的裂隙灯眼底图；(B)D0天预防组和D6天治疗组在免疫后12、18天的裂隙灯眼底图与相应对照组的炎症评分统计；(C)D0天预防组裂隙灯炎症评分动态变化图；(D)D6天治疗组裂隙灯炎症评分动态变化图；(E)正常Lewis大鼠眼底图。

(***P<0.0001,**P<0.001,*P<0.05)n＝6，标尺＝1mm.

图16组织病理学观察及评分。(A)D0-hAECs预防组和D6-hAECs治疗组与对照组视网膜结构及炎症细胞侵润情况的HE染色代表性图片；(B)各组组织学评分统计图；(C)免疫后18天各组视网膜和外核层厚度统计图；(D)正常视网膜结构图。(***P<0.0001,**P<0.001,*P<0.05)n＝6,标尺＝100μm.

图17各组巨噬细胞及T细胞的侵润。(A-C)第12天D0-hAECs预防组和D6-hAECs治疗组与相应对照组CD68+(巨噬细胞)CD3+(T细胞)细胞的侵润情况及定量统计；(D-F)第18天D0-hAECs预防组和D6-hAECs治疗组与对照组CD68+(巨噬细胞)CD3+(T细胞)细胞的侵润情况及定量统计。(***P<0.0001,**P<0.001,*P<0.05)n＝6,标尺＝100μm.

图18 hAECs对Th17细胞群和Treg细胞群的影响。(A)流式检测D0-hAECs预防组和D6-hAECs治疗组与对照组IL-17+/CD4+T细胞比例的动态变化图；(B)流式检测D0-hAECs预防组和D6-hAECs治疗组与对照组FoxP3+/CD4+CD25+T细胞比例的动态变化图；(C)各组中Th17细胞群在第12、18天的变化统计图；(D)各组中Tregs细胞群在第12、18天的变化统计图；(E)Tregs/Th17比率在第12、18天的变化统计图。(***P<0.0001,**P<0.001,*P<0.05)n＝6

图19 hAECs对房水和脾脏淋巴结单个核细胞相关免疫因子的影响。(A-D)各组大鼠房水中MCP-1、IFN-γ、IL-17、IL-10表达量的动态变化；(E-F)各组大鼠脾脏淋巴结单个核细胞培养上清液中IL-17、IL-10表达量的动态变化。(***P<0.0001,**P<0.001,*P<0.05)n＝6

图20 hAECs使SLE小鼠血清ANA和抗dsDNA抗体由阳性转为阴性。注射两周后，从Control组、SLE组、SLE+hAECs组中分离血清，免疫荧光法检测小鼠血清ANAs、anti-dsDNAantibodies水平。图片显示以Hep-2细胞为基质检测ANAs，control mice(A)，SLE mice(B)，SLE+hAECs(C)，每只小鼠的平均MFI统计(D)及以Crithidia luciliae kinetoplast为基质检测anti-dsDNA antibodies，control mice(E)，SLE mice(F)，SLE+hAECs(G)，每只小鼠的平均MFI统计(H)。箭头，细胞核(B)、动基体(F)。数据以mean±SD表示，来源于5个独立样本的三次独立实验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，数据分析采用单向方差分析和Tukey多重比较。

图21 hAECs降低SLE小鼠血清IgG Isotypes浓度。MRL-Faslpr(SLE)小鼠对自身细胞核抗原(dsDNA等)发生免疫应答，持续产生对这些核抗原的自身IgG抗体。自身抗体与抗原形成大量的免疫复合物，可以沉积在关节、血管壁及肾小球。为了进一步验证hAECs对SLE的治疗效果，检测了血清内IgG1、IgG2a、IgG3浓度。结果如图所示，SLE组血清内IgG1(p＝0.0065**)、IgG2a(p＝0.0010***)、IgG3(p＝0.0017**)浓度较Control组显著上升，注射hAECs后，血清内IgG1(p＝0.0375*)、IgG2a(p<0.0001***)、IgG3(p＝0.0001***)浓度较SLE组显著下降。说明注射hAECs可以显著降低B淋巴细胞激活，降低SLE小鼠体内循环的IgG同型水平。

图22 hAECs给药后治疗组血清促炎因子水平下降。图22-1为注射hAECs两周后，血清IL-17A浓度显著降低(p＝0.0067**)，这与小鼠脾脏内Th17细胞比例的变化相符合。图22-2表示hAECs在SLE中主要通过降低IFN-γ浓度调节小鼠血清内IFN-γ/IL-4平衡。图22-3表示SLE组小鼠血清IL-10浓度显著高于Control组(p＝0.0307*)，SLE组小鼠血清TGF-β浓度显著低于Control组(p＝0.0231*)，注射hAECs后，血清TGF-β浓度显著升高(p＝0.0101*)。hAECs在SLE中主要通过上调TGF-β浓度起到免疫调节作用，而对IL-10浓度的影响较小。

图23 hAECs改善SLE小鼠脾脏内Th17/Treg细胞平衡。图23-1表示Th17与Tregs平衡影响免疫系统，已知在多种自身免疫疾病中，Th17/Treg细胞平衡受到破坏。对Th17细胞检测结果如图所示，发病后，SLE小鼠脾脏Th17细胞比例显著上升(p＝0.0084**)，在hAECs治疗两周后，Th17细胞显著下降(p＝0.0023**)。图23-2表示治疗后协同的降低Th17细胞比例和提高Tregs细胞比例，hAECs可以通过调节Th17/Treg细胞比例改善SLE小鼠的免疫失衡。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

第一部分人羊膜上皮细胞用于治疗桥本甲状腺炎

实施例1-1构建实验性自身免疫性甲状腺炎模型

1、实验动物的购买和饲养

CBA/J小鼠，SPF级，30-40g，雌性，动物由上海南方模式动物中心提供。分笼饲养，同一组小鼠置于同一笼，每笼6只在浙江大学实验动物中心饲养，空调控制室温23-26摄氏度之间，相对湿度55±10％以内，照明12小时昼夜周期实施，摄食及饮水自由摄取。

2、实验药品

(1)完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant，CFA)美国Sigma公司

(2)不完全弗氏佐剂(incomplete Freund's adjuvant，IFA)美国Sigma公司

(3)猪甲状腺球蛋白(porcine thyroglobulin，pTg)美国Sigma公司

3、实验动物分组

按不同的治疗时间(表2-1)分组，每组至少三次实验重复，一次试验每组9只，分别为模型治疗组3只(EAT+hAECs组)，单纯模型组3只(EAT组)，正常对照组3只(WT组)。

4、初次免疫

选取6-8周的雌性CBA/J小鼠，无菌PBS溶液溶解pTg至终浓度为2mg/ml，CFA与pTg溶液等体积混合，充分乳化。固定好CBA/J小鼠，皮下多点(颈部、上背部等)注射，每只小鼠注射100μl乳化剂，即pTg 100μg。正常对照组小鼠皮下注射同等剂量的无菌PBS溶液。

5、加强免疫

初次免疫后第14天进行加强免疫，将IFA与pTg溶液等体积混合，充分乳化，浓度与初次免疫相同，再次对单纯模型组及模型治疗组小鼠进行下背部皮下多点注射，每只共100μl即100μg的pTg。正常对照组小鼠皮下注射同等剂量的无菌PBS溶液。

实施例1-2人羊膜细胞实验溶液的配制

1、羊膜上皮细胞培液的配制：500ml的DMEM/F12里加入56ml KSR；6mlL-Glutamine；6ml Sodium Pyruvate；6ml MEMNEAA；600μl 2-ME；2000×的EGF与100×的P/S使用前添加；

2、2000×EGF的配制：向EGF包装管中加入1ml无菌ddH2O，静置5-10min使其溶解，再加入4ml稀释液(5％Trehalose PBS)，混匀然后分装至1.5ml EP管中，每管分装100μl；

3、消化终止液配制：DMEM/F12+10％FBS；

4、冻存液配制：40％FBS+50％培液+10％DMSO。

实施例1-3人羊膜上皮细胞的分离

1、人羊膜的来源

经产妇授权同意后，取健康产妇(HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝等血清学反应均显示为阴性)剖腹产后的胎盘组织，十字刀切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。

2、hAECs的分离

用加过双抗(P/S)的无菌PBS溶液清洗羊膜三遍，洗去血液及其他杂质，将羊膜转入50ml离心管。

加入10ml的0.25％胰酶(提前37℃浴化)消化30s，颠倒20次，将羊膜移入另一个50ml离心管中。

向离心管中加入15ml的0.25％胰酶(提前37℃浴化)，37℃水浴消化10min后，将羊膜移入另一个50ml离心管。

向离心管中加入25ml的0.25％胰酶，37℃水浴消化40min，每隔10分钟摇晃10次，结束后用力颠倒10次，加等体积的消化终止液终止消化，转速500g，室温离心10min后收集细胞，用1ml培液重悬。

将羊膜转移至另一个50ml离心管中，加入25ml的0.25％胰酶，37℃消化40min，每隔10分钟混匀10次，结束后用力颠倒10次，加等体积的消化终止液终止消化，转速500g，室温离心10min后收集细胞，用1ml培液重悬。

将两次重悬细胞混合，加入18ml培液(培养液中提前加入双抗及EGF)混匀过200目筛后过400目筛。

实施例1-4人羊膜上皮细胞的接种培养及冻存

细胞计数培养：一个平板接种1×10⁷个细胞。待hAECs贴壁后换培养液，之后三天换一次培养液。

待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存：15cm dish加5ml胰酶，10min后镜下观察，细胞变圆且平面晃动平皿时细胞全变为悬浮状态时加等量消化终止液终止消化。用微量移液器按同一方向将培养皿上的细胞吹下，移入15ml离心管，300g离心3min后收集细胞然后进行细胞计数。在冻存管内加入冻存液，标明冻存日期、批次及细胞数量之后将细胞放入冻存管，然后立刻将冻存管放入冻存盒中并将冻存盒放进-80℃冰箱，12h后取出冻存盒，将细胞移入液氮罐中保存。

实施例1-5流式细胞术鉴定hAECs细胞表面标志

取第1代hAECs，消化后4℃1000rpm离心5min，弃上清，加1mlPBS重悬分装于1.5ml离心管中。4℃1000rpm离心5min后弃上清，加入100μl流式Buffer(PBS+2％FBS)。

每管细胞分别加入1.HLA-DQ-FITC(MHCⅡ类)，CD34-PE(内皮细胞标记)，CD90-APC(间充质干细胞标记)；2.HLA-ABC-FITC(MHCⅠ类)，CD31-APC(内皮细胞标记)；3.CD73-FITC(间充质干细胞标记)，HLA-DR-PE(MHCⅡ类)；4.CD45-FITC(造血干细胞标记)，CD166-PE(间充质干细胞标记)各5μl的抗体混匀；5.空白对照；6.同型对照；7.单标。

4℃避光孵育30min，1000rpm离心5min，弃上清，1ml PBS清洗一次，每管加入500μl含1％多聚甲醛的PBS混匀，4℃避光放置，24小时内用流式细胞仪检测分析。

每份样品采集的细胞数≥10⁴个，用Flow JO软件进行表型分析。同型对照抗体为相应的荧光素标记的小鼠IgG。

实施例1-6小鼠尾静脉注射hAECs

对模型治疗组(EAT+hAECs)小鼠进行尾静脉注射hAECs治疗，每只小鼠每次注射细胞数量为1.5×10⁶个(浓度为1.5×10⁷个/ml细胞悬液，每只注射100μl)。

操作时选择在光线充足的地方，小鼠固定器固定小鼠，准备好l ml胰岛素注射器，每次吸取100μl细胞悬液，防止细胞在注射器内沉积。

夹住鼠尾根部可使血管膨胀，选择明显的一侧静脉，用75％酒精擦拭至肉眼可见血管明显扩张，在鼠尾远端进针，回抽见血表明成功穿刺小鼠静脉，将细胞悬液注入小鼠尾静脉。

正常对照组和EAT模型组小鼠在相同时间尾静脉注射等量的无菌PBS。

实施例1-7小鼠甲状腺功能检测

1、小鼠血清分离

对小鼠进行眼眶静脉丛取血，血液在室温下放置1h后置于4℃放置30min，4℃下3600rpm离心10min，分离血清，分装后于-80℃冷冻保存。收集全部组的血清后采用ELISA方法检测小鼠血清中TSH、TT3、TT4浓度。

2、ELISA检测小鼠血清中TSH、TT3、TT4浓度

标准品的稀释

标准品最高浓度为：TSH(80pg/ml)、TT3(32pmol/L)、TT4(40μg/L)；

2.1加样：每组设有空白孔(不加样品及酶标试剂)、标准样品孔、待测样品孔。在酶标包被板上加标准品、待测样品各50μl(样品用样品稀释液稀释5倍)。将样品加于酶标板孔的底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

2.2温育：使用粘性封板膜(不可交叉使用)封板后置于37℃烘箱30min；

2.3配液：用蒸馏水将30×浓缩洗涤液稀释30倍后备用；

2.4洗涤：倾倒液体，用力甩干，并在无尘纸上拍打，洗涤液加满每孔，等待30秒后弃去，5次，拍干；

2.5加酶：除空白孔外，每孔酶标试剂50μl；

2.6温育：操作同2；

2.7洗涤：操作同4；

2.8显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl。轻轻震荡混匀，以免液体飞溅造成污染，在37℃烘箱内避光显色10min；

2.9终止：每孔加50μl终止液终止反应(此时蓝色立刻变为黄色)，15min以内在450nm波长下测量各孔的吸光度(OD值)；

2.10计算：绘出标准曲线(标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标)，用OD值与标准物的浓度计算出标准曲线的直线回归方程式，通过样品的OD值，计算出检测时的样品浓度，乘以稀释倍数，得样品的实际浓度。

实施例1-8小鼠甲状腺自身抗体水平检测

1、小鼠血清分离

方法同实施例1-7，收集全部组的血清后检测小鼠血清内自身抗体TGAb、TMAb的水平。

2、ELISA检测小鼠血清中甲状腺自身抗体水平

标准品最高浓度为：TGAb(120IU/ml)、TMAb(48pg/ml)，检测方法同实施例1-7。

实施例1-9小鼠甲状腺病理分级

1、分离甲状腺组织

取血完毕的小鼠，酒精消毒后用PBS进行心脏灌注，机械分离两侧甲状腺。将甲状腺组织用PBS清洗后放入4％PFA(体积比1:20)内固定，室温固定8h后，吸掉PFA，PBS清洗后放入70％酒精，可长期保存。

2、溶液配制：

4％PFA：180ml ddH2O加热至65℃，加入20μl 5M NaOH后加入8gPFA(多聚甲醛)持续加热至溶解(用转子搅拌)，冷却至室温后加入10ml的20×PBS，定容至200ml。

盐酸乙醇溶液：7ml HCl(37％)+252ml 70％ethanol。

稀氨水：200ml H2O加8滴氨水，即为0.05％稀氨水。

3、甲状腺组织病理学检查

3.1脱水及透蜡：

将甲状腺组织放入包埋盒中依次通过装有下列溶液的脱水缸：

脱水：装有甲状腺组织的包埋盒依次通过70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇中各15min，然后在两个95％乙醇脱水缸中放置30min，两个100％乙醇脱水缸中放置30min；

透明：依次通过装有50％二甲苯和50％酒精的脱水缸中60min，两个二甲苯脱水缸中60min；

透腊：通过两个装有纯蜡的脱水缸中60min。

3.2包埋：

用镊子将包埋盒取出，与石蜡模子一起置于蜡缸中，用镊子夹取石蜡模子放在滴蜡处，滴一滴蜡后放在4℃处，将组织放在蜡上(切面朝下)，然后将模具放在滴蜡处，盖上包埋盒加石蜡，放在4℃处凝固后再补充石蜡。

3.3切片：

先将蜡块按组织部位修整，切除多余蜡块。调整切片机使刀片与蜡块的距离和角度合适。先将切片厚度调到50μm，切到样品后将切片厚度调到4μm，镜下检查是否切到想要的组织，之后按4μm的厚度切片。小心切取蜡带一定长度后，用刀片按5个样品的距离分割蜡带。

3.4展片、贴片、烘片：

打开展片仪使水温维持在42℃，用小镊子夹取蜡带放在水面上，切片在水中展开。取洁净的载玻片，小心捞起展开的切片，另一端磨面上标记日期与样品编号。将烘片机的温度调到37℃，切片放在烘片机上烘干，使切片贴服在玻璃片上。烘片4h后收起，切片可长期保存。

3.5甲状腺切片HE染色：

将切好的甲状腺病理切片依次经过以下容器：

3.5.1脱蜡：二甲苯10min×3；

3.5.2水化：100％乙醇5min×2—95％乙醇2min；自来水缓慢水流冲洗5min；

3.5.3染细胞核：苏木精(45S至数分钟，根据染色情况决定，细胞核染成蓝色)；自来水缓慢水流冲洗5min；

3.5.4分化：盐酸乙醇溶液2s；自来水缓慢水流冲洗5min；

3.5.5返蓝：放入稀氨水中8次；自来水缓慢水流冲洗6min；95％乙醇4min；

3.5.6染细胞质：伊红(45S，细胞质染成红色)；

3.5.7脱水：95％乙醇2min×2—100％乙醇4min×2；

3.5.8透明：二甲苯5min×3，完成染色之后将切片至于通风厨中风干残留的二甲苯，用中性树脂封片。

3.6甲状腺切片评分：

甲状腺组织病理学评分的基础是甲状腺滤泡被淋巴细胞浸润的百分比。光镜下观察甲状腺组织的炎症细胞(包括淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞)浸润程度，拍照后用Image-Pro Plus图象分析软件计算炎症细胞与甲状腺组织的比值。

参考Tang H[105]的炎症分级标准，1级：炎症细胞在两个或多个甲状腺滤泡间聚集；2级：炎症细胞病灶可达一个甲状腺滤泡大小；3级：10％-40％的甲状腺组织被炎症细胞取代；4级：超过40％的甲状腺组织被炎症细胞取代。

实施例1-10浸润甲状腺内淋巴细胞的表型鉴定

1、溶液配制(所有溶液现配现用)

1.1抗原修复液：A液，0.1M柠檬酸溶液，21.01g柠檬酸加入1L蒸馏水中；B液，0.1M柠檬酸三钠溶液，29.41g柠檬酸三钠加入1L蒸馏水中；柠檬酸修复工作液，9ml A液和41mlB液一起加入450ml蒸馏水中。

1.2封闭血清：5％HBS(马血清稀释20倍)。

1.3 3％H2O2甲醇溶液：市售H2O2浓度为30％，用甲醇稀释10倍。

1.4ABC溶液配制：5ml PBS+2drop A+2drop B(用前30min配制)。

1.5AEC溶液配制(使用过程中注意避光)：5ml蒸馏水+2drop buffer stocksolution+3drop AEC stock solution+2drop Hydrogen peroxide solution。

2、石蜡切片免疫组化(整个过程避免切片干燥)

2.1脱蜡：二甲苯10min×3；

2.2水化：100％乙醇5min×2，95％乙醇2min，自来水冲洗5min；

2.3抗原修复：切片置于95℃-97℃的抗原修复液中10min，整体恢复至室温后，浸入PBS 5min；油性笔将组织圈起(避免边际效应，圈可以适当大些)；

2.4去除内源过氧化物酶活性：3％H2O2甲醇溶液10min；PBS浸洗5min；

2.5孵育一抗：30min后PBS浸洗5min×3；

2.6孵育二抗：30min后PBS浸洗5min×3；

2.7ABC溶液孵育30min；PBS浸洗5min；

2.8AEC试剂孵育显色10-30min，十分钟后镜检确定显色时间；缓慢水流冲洗5min；

2.9苏木精复染细胞核45s-3min；自来水缓慢水流冲洗5min；

2.10水性封片剂封片。

实施例1-11流式细胞术检测小鼠脾脏细胞内Th17、Tregs、Bregs所占比例

1、溶液配制

1.1PMA溶液的配制

贮存液：浓度0.1mg/ml，-80℃避光保存；

工作液：1:10稀释于含10％FBS的RPMI1640中，浓度为10μg/ml；

工作终浓度：25ng/ml，即每500μl培液，加PMA 1.25μl；

1.2Ionomycin溶液的配制

贮存液：浓度1mg/ml，-80℃避光保存；

工作液：1:2稀释于含10％FBS的RPMI1640中，浓度为500μg/ml；

工作终浓度：1μg/ml，即每500μl培液，加Ionomycin 1μl；

1.3Monensin溶液的配制

贮存液：浓度50mg/ml，-80℃避光保存；

工作液：1:50稀释于含10％FBS RPMI1640中，浓度为1000μg/ml；

工作终浓度：1.7μg/ml，即每500μl培液，加Monensin 0.85μl；

1.4淋巴细胞培养液的配制：

RPMI1640(430ml)+10％FBS(50ml)+(1000×)50μMβ巯基乙醇(500μl)+(100×)100mM Sodium Pyruvate丙酮酸钠(5ml)+(50×)1M HEPES(10ml)+(100×)双抗5ml。

1.5红细胞裂解液：

250ml ddH2O中加入1.8675g NH4Cl和0.65g Tris，之后调PH至7.2，0.22mm下过滤除菌。

1.6流式相关buffer配制

1.6.1上机及洗涤Buffer：5ml FBS+245ml PBS(2％FBS)。

1.6.2固定Buffer：30ml Buffer+10ml(4％PFA)(1％PFA)。

1.6.3透膜1×Permeabilization Buffer：5ml(5×Permeabilization Buffer)+45ml dH2O。

1.6.4Foxp3Fixation/Permeabilization working solution：Concentrate(1part)+Diluent(3part)。

2、小鼠脾脏细胞悬液制备方法

无菌取出脾脏，置于含双抗PBS溶液的离心管中，置于冰上。待全部小鼠脾脏取完后，将脾脏置于6孔板中，6孔板事先加入4ml和2ml含双抗的PBS溶液，先用4mlPBS溶液清洗，然后以每孔2ml PBS溶液用玻璃片研磨，得到淋巴悬液。将悬液移入15ml离心管中(组织弃去)，4℃下1400rpm离心5min，用真空泵小心吸去上清。加入2ml红细胞裂解液，充分混匀，室温静置3min，立即加入3倍体积PBS溶液，充分混匀，4℃下1400rpm离心5min，用真空泵小心吸去上清。加入2ml PBS溶液将留下的细胞沉淀吹匀，过滤后取1μl细胞悬液稀释100倍加台盼蓝细胞计数。离心后用淋巴细胞培养液重悬细胞调整浓度为1×107个/ml。

3、流式细胞染色

3.1Th17细胞(胞内细胞因子：IL-17)

实验前5个小时加25ng/ml PMA、1μg/ml离子霉素，2个小时之后加1.7μg/ml莫能霉素。3个小时后细胞收集于1.5ml离心管，1000rpm，4℃离心5min弃上清。用1ml Buffer洗一次，1000rpm，4℃离心5min弃上清。加入100μl Buffer，0.5μl Anti-mouse CD4-FITC抗体，4℃避光孵育30min。1000rpm，4℃离心5min弃上清，加1ml Buffer重悬，1000rpm，室温离心5min弃上清，加入200μL IC Fixation Buffer固定细胞混匀，室温避光作用20min。加入1mL，1×Permeabilization Buffer洗涤细胞两次，1000rpm，室温离心5min，弃上清。加入100μL，1×Permeabilization Buffer重悬，加Anti-mouse/Rat IL-17A-PE抗体0.625μl，室温避光作用20min。加入1mL，1×Permeabilization Buffer洗涤细胞，室温，1000rpm离心5min，弃上清。加入1mL，Buffer洗涤细胞，室温，1000rpm离心5min，弃上清，500μL Buffer重悬细胞上机。

3.2Tregs细胞(核内转录因子：FOXP3)

细胞收集于1.5ml离心管，1000rpm，4℃离心5min弃上清，加入100μl Buffer，0.5μl Anti-mouse CD4-FITC抗体，4℃避光孵育30min。1000rpm，4℃离心5min弃上清，加1mlBuffer重悬，1000rpm，4℃离心5min弃上清。加入200μl Foxp3Fixation/Permeabilizationworking solution混匀，室温避光作用30min。加入1mLBuffer洗涤细胞两次，室温，1000rpm离心5min，弃上清。加入100μl Buffer重悬，加入Anti-mouse/Rat Foxp3-PE抗体2.5μl，室温避光作用30min。加入1mLBuffer洗涤细胞两次，室温，1000rpm离心5min，弃上清，500μLBuffer重悬细胞上机

3.3Bregs细胞

细胞收集于1.5ml离心管，1000rpm，4℃离心5min后弃上清。加入100μl Buffer，0.625μl Anti-mouse CD1d-PE抗体，0.625μl Anti-mouse CD19-APC抗体，1μl Anti-mouseCD5-FITC抗体，4℃避光孵育30min。1000rpm，4℃离心5min弃上清，加1ml Buffer重悬清洗残留的抗体，1000rpm，4℃离心5min弃上清，500μL Buffer重悬细胞上机。

实施例1-12ELISA检测小鼠血清中细胞因子

1、小鼠血清分离

方法同实施例7，检测小鼠血清内细胞因子的水平。

2、ELISA检测小鼠血清内细胞因子水平

标准品的稀释

标准品最高浓度为：IFN-γ(800ng/L)、IL-4(240pg/ml)、IL-10(1000pg/ml)、IL-17(120pg/ml)、TGF-β(240ng/L)；

2.3配液：用蒸馏水将30×浓缩洗涤液稀释30倍后备用；

2.5加酶：除空白孔外，每孔酶标试剂50μl；

2.6温育：操作同2；

2.7洗涤：操作同4；

2.8显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl。轻轻震荡混匀，以免液体飞溅造成污染，在37℃烘箱内避光显色10min(TGF-β应显色15min)；

本实验研究了人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)在实验性自身免疫性甲状腺炎(Experimental Autoimmune Thyroiditis，EAT)治疗中的潜在能力并挖掘其治疗机理。在疾病指标开始上升(21d)与疾病达到严重程度(35d)时注射hAECs，甲状腺内浸润的淋巴细胞显著减少，而其他时间注射hAECs并不能显著降低疾病评分，表明了hAECs对桥本甲状腺炎有显著的治疗效果，但在不同的疾病阶段注射hAECs对EAT治疗产生的效果不同。本实验首次将人羊膜上皮细胞应用于实验性自身免疫性甲状腺炎的治疗中，并且具有良好的效果，为当前自身免疫性疾病提供了一种新的治疗方案。

第二部分人羊膜上皮细胞用于治疗葡萄膜炎

实施例2-1构建实验性自身免疫性葡萄膜炎模型

1、实验动物的购买和饲养

实验动物选用6-8周龄的雄性lewis大鼠，体重160-180g，清洁级，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。在浙江大学实验动物中心饲养，空调控制室温23-26摄氏度之间，相对湿度55±10％以内，照明12小时昼夜周期实施，摄食及饮水自由摄取。

2、主要实验药品

(1)完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant，CFA)美国Sigma公司

(2)光感受器间维生素类结合蛋白(IRBP)上海生物工程公司

(3)水合氯醛美国Sigma公司

3、主要试剂的配制

(1)8％水合氯醛溶液的配制

称取4g水合氯醛粉剂，加入三蒸水10ml，摇晃待其完全溶解后，再加入三蒸水并定容至50ml，即得到8％的水合氯醛溶液，滤膜过滤除菌备用。

(2)4％多聚甲醛固定液的配制

称取多聚甲醛4g，加入0.1mol/L磷酸盐缓冲液80ml，加热至60摄氏度左右，持续搅拌，待使粉末完全溶解后，加少许1mol/LNaOH澄清，冷却后加冰醋酸5ml，丙酮10ml，0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至100ml。

4、实验动物的分组

将动物按序编号，按照分层随机原则，采用随机数字表法将动物先分为EAU组(70只)和正常组(5只)，再将EAU组动物随机分为0天实验组(50只)和6天实验组(20只)，0天实验组再分为对照组(25只)及0天hAECs治疗组(25只)，6天实验组再分为对照组(10只)及6天hAECs治疗组(10只)。

5、实验动物模型的构建

取IRBP粉剂(1mg/支)1支，加入1mlPBS，混匀并待其充分溶解，配成含IRBP浓度为1000μg/ml的PBS溶液，放置备用。2支螺口注射器连接三通阀，依次分别加入含IRBP的PBS溶液0.6ml、PBS 1.4ml、完全弗氏佐剂(CFA)2ml，反复推注并充分乳化，得混合乳剂4ml。自大鼠足垫中部皮下进针，向上潜行至胫骨上端皮下处，缓慢推注混合乳剂0.2ml(每只大鼠最终免疫量为30μg IRBP多肽)，出针并按压进针处，以防乳剂溢出。继续以上皮下注射操作，对20只大鼠进行EAU模型制作。反复进行以上操作4次，共对70只大鼠进行EAU动物模型制作。

实施例2-2原代羊膜上皮细胞分离及培养

1、人羊膜的来源

为了避免产道微生物污染，我们选用了剖腹产胎儿胎盘。由于足月后分娩信号刺激，羊膜会发生凋亡，因此宜用早产胎儿胎盘(38周以前)。经产妇授权同意后，取健康产妇(HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝等血清学反应均显示为阴性)剖腹产后的胎盘组织，十字刀切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。

2、hAECs的分离(全程要求无菌操作)

获取38周以前剖腹产婴儿胎盘，从胎盘内面剥离羊膜，将之浸入含有DMEM/F12(含1％青霉素-链霉素)基础培养基的离心管中。4℃冷链运送至实验室细胞间。

将羊膜取出，并将每张羊膜置于40ml CMF-HBSS(含1％青霉素-链霉素)中清洗去粘液，并用镊子刮去贴近绒毛膜层的间充质层及粘液，重复3次，每次洗涤均换新容器和新HBSS液。

将洗净的羊膜转入新容器，加10ml 0.25％胰酶/EDTA，颠倒30s，弃液。

将羊膜转入新容器，加20ml 0.25％胰酶/EDTA，37℃水浴孵育10min弃液。

羊膜转入新容器，25ml 0.25％胰酶/EDTA 37℃水浴孵育40min，保存消化液。

初次消化后羊膜转入新容器，25ml胰酶/EDTA 37℃水浴孵育40min，保存消化液。

加入等体积消化终止液(F12/DMEM含10％FBS，2mM L-谷氨酸，1mM丙酮酸钠，1％非必须氨基酸)，400g离心10min。弃液，用羊膜完全培养基：F12/DMEM含10％KSR(KnockOutSerum Replacement)，2mM L-谷氨酰胺，1％非必须氨基酸,1mM丙酮酸钠,100U/mL青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin),10ng/ml hEGF重悬沉淀。

过100um筛，计数

以10^5cells/cm2接种至培养皿或置于冻存液(90％FBS,10％DMSO)中液氮冻存备用。

3、hAECs的接种培养及冻存

细胞计数培养：1×10⁷个细胞接种到15cm培养皿。待hAECs贴壁后换培养液，之后三天换一次培养液。

待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存：15cm培养皿加5ml胰酶，10min后镜下观察，细胞变圆且平面晃动平皿时细胞全变为悬浮状态时加等量消化终止液终止消化。用微量移液器按同一方向将培养皿上的细胞吹下，移入15ml离心管，300g离心3min后收集细胞然后进行细胞计数。在冻存管内加入冻存液，标明冻存日期、批次及细胞数量之后将细胞放入冻存管，然后立刻将冻存管放入冻存盒中并将冻存盒放进-80℃冰箱，12h后取出冻存盒，将细胞移入液氮罐中保存。

实施例2-3大鼠眼部裂隙灯下观察及炎症评分

自免疫后第4天开始至免疫后第18天，每日对各组大鼠进行裂隙灯下观察眼部EAU炎症表现，并参照Caspi临床分级进行炎症评分。具体评分标准如下，0分：无炎症反应，眼底红光反射正常；0.5分：虹膜血管轻度扩张、充血；1分：虹膜血管中度充血，瞳孔缩小；2分：房水轻度混浊，眼底红光反射减弱；3分：房水中度混浊，眼底红光反射减弱；4分：前房积脓，瞳孔膜闭，眼底红光反射消失。

结果显示(图15)，与D0-BSS对照组相比，D0-hAECs预防组大鼠眼部炎症在相同时间点症状明显减轻，EAU发病时间推迟，免疫后第12天前房房水中度浑浊，虹膜充血加重，眼底红光减弱；免疫后第18天，炎症减退，房水清，眼底红光反射基本正常。同时，与D6-BSS对照组相比，D6-hAECs治疗组大鼠眼部炎症评分也降低，但没有D0-hAECs预防组差异显著。说明hAECs治疗降低眼部裂隙灯观察的炎症评分。

实施例2-4大鼠眼底hAECs注射

取生长状态良好，融合达90％的hAECs，超净台内倒掉培养液，PBS润洗1次，加入0.25％胰蛋白酶消化液约5ml，显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，0.5ml胎牛血清终止消化，轻轻吹打，将细胞混悬液转移至15ml离心管，1500转/分离心5分钟，去掉上清液，用PBS重悬细胞，并细胞计数。0天hAECs治疗组大鼠于免疫的同时，自其视网膜下腔注射约含1×10⁵个hAECs的细胞悬液2μl。对照组注射相同体积的BSS。6天hAECs治疗组大鼠在免疫后第6天进行眼底hAECs输注治疗，自其视网膜下腔注射约含1×10⁵个hAECs的细胞悬液2μl。对照组注射相同体积的BSS。

实施例2-5病理组织学观察及组织学评分

(1)固定：分别在免疫后第6、9、12、15、20天，采用8％水合氯醛(70μl/10g体重)对各组大鼠进行腹腔内注射，待麻醉完全后，再行0.3％奥比卡因滴眼液点鼠眼以充分表面麻醉，轻轻分开眼睑，摘除眼球。按左右眼分别浸泡于4％多聚甲醛中性缓冲液中固定24小时。

(2)脱水浸蜡：从固定液中取出眼球，用锋利刀片沿视轴方向在眼球两侧各做一矢状剖切，切去两侧部分眼球壁，再小心剥离晶状体，室温脱水，整个眼球依浸入体积分数为55％、65％、75％、85％、95％、100％乙醇中各1h。混合石蜡(硬脂酸与软蜡体积比3：7)2h，混合石蜡(硬脂酸与软蜡体积比2：8)1h，软蜡1.5h，硬蜡1.5h。

(3)包埋切片：浸蜡后的眼球以水平切面朝向包埋盒底，硬蜡包埋。将包埋好的眼球标本，将以平行于视神经矢状轴且以其为平面的视网膜进行连续切片，厚约4μm

(4)切片染色：常规HE染色，封片。显微镜下观察照相。光学显微镜下观察大鼠视网膜组织结构，参照Caspi组织病理学分级进行评分。0分：无炎症，视网膜结构正常；0.5分：炎细胞轻度浸润视网膜，有或无感受器受损；1分：炎细胞轻度浸润视网膜和(或)光感受器外节受损；2分：轻到中度炎细胞浸润和(或)受损部位扩展至外核层；3分：中度到显著炎细胞浸润和(或)受损部位累及到内界膜：4分：重度炎细胞浸润和(或)视网膜全层破坏、受损。

图示(图16)结果显示，对照组大鼠出现明显的炎症细胞浸润和视网膜结构损坏，而在疾病发生第6天时注射hAECs的治疗组大鼠中，炎症细胞的入侵以及视网膜损伤程度均大幅下降，表明hAECs能够抑制炎症发生以及降低视网膜结构紊乱程度。

实施例2-6大鼠眼房水的采集

分别在免疫后第12、18天，采用8％水合氯醛(70μl/10g体重)腹腔内注射，待麻醉满意后，再用0.3％奥比卡因滴眼液点鼠眼以充分表面麻醉，轻轻分开眼睑，显微镜下应用30G针头行鼠眼前房穿刺，留置针头于前房内片刻，抽出针头，置1ml空针，将所得房水收集于无菌EP管中，-80℃超低温冰箱冷冻保存。

实施例2-7流式细胞术测定脾脏淋巴结单个核细胞中Th17、Treg细胞群的比例

1、Th17细胞流式测定步骤

1.1吸取各组大鼠不同时间点100μl脾脏淋巴结单个核细胞悬液加入流式管中。

1.2加入FITC标记的抗大鼠CD4荧光抗体2μl，阴性对照管加入FITC标记的同型对照抗体2μl。单阳管加入CD4荧光抗体或同型对照抗体2μl，震荡混匀。

1.3室温下避光孵育30分钟。

1.4加入破膜固定透化液1ml，室温下避光破膜约40分钟。

1.5 1800转离心5分钟，弃上清。

1.6加入PE标记的抗大鼠IL-17荧光抗体2μl，阴性对照管加入PE标记的同型对照抗体2μl，震荡混匀。单阳管加入IL-17荧光抗体或同型对照抗体2μl，并震荡混匀。

1.7避光孵育30分钟。

1.8加入透化液1ml，振荡后重悬，1800转离心5分钟，重复步骤2次。

1.9每管加入2％多聚甲醛0.5ml固定，4℃避光保存。

1.10流式细胞仪上测定。

2、Treg细胞流式测定步骤

2.1吸取各组大鼠不同时间点100μl脾脏淋巴结单个核细胞悬液加入流式管中。

2.2加入FITC标记的抗大鼠CD4荧光抗体2μl以及PE标记的CD25抗体0.6μl，阴性对照管加入FITC标记的同型对照抗体2μl和PE标记的同型对照抗体0.6μl。单阳管加入CD4荧光抗体或CD25抗体或相对应的同型对照抗体。震荡混匀。

2.3室温下避光孵育30分钟。

2.4加入破膜固定透化液1ml，室温下避光破膜约40分钟。

2.5 1800转离心5分钟，弃上清。

2.6加入APC标记的抗大鼠Foxp3荧光抗体2μl，阴性对照管加入APC标记的同型对照抗体2μl，震荡混匀。单阳管加入Foxp3荧光抗或同型对照抗体2μl，并震荡混匀。

2.7避光孵育30分钟。

2.8加入透化液1ml，振荡后重悬细胞，1800转离心5分钟，重复步骤2次。

2.9每管加入2％多聚甲醛0.5ml固定，4℃避光保存。

2.10流式细胞仪上测定。

实验结果显示(图18)，免疫同时或EAU发病期注射hAECs，均抑制了EAU病程中Th17细胞群的比例，增加了Treg细胞群比例，对EAU起到减缓病情的作用，但免疫同时进行hAECs细胞治疗效果更显著。

实施例2-8免疫细胞因子的ELISA检测

取不同时间点各组分离并计数后的脾脏淋巴结单个核细胞以2x 10^⁶个/well铺到12孔板里，在含有IRBP30ug/ml的培养基中培养72小时后收集上清液，按序分类编号，按照ELISA试剂盒的具体要求进行各因子的ELISA检测。

1、ELISA实验前准备

1.1标准品液配制：使用前加蒸馏水混匀，配成一定比例溶液，设标准8管，根据具体的说明书要求，每管加入一定量的标本稀释液，作对倍稀释，最后一管为空白对照。

1.2 10x标本稀释液：用蒸馏水作1：10倍稀释。

1.3洗涤液：用双蒸水作1：20倍稀释。

2、具体实验步骤

2.1加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.2洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

2.3每孔中加入第一抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

2.4洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

2.5每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板置37℃30分钟。

2.6洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

2.7每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应15分钟。

2.8每孔加入终止液100μl混匀。

2.9 30分钟内用酶标仪在450nm处测定吸光值。

结果显示(图19)，在治疗组大鼠脾脏淋巴结单个核细胞培养上清液中抗炎症因子(IL-10)的水平明显升高，促炎症细胞因子(IL-17)的水平降低，表明hAECs能够降低Th1/Th17细胞分泌的促炎因子并增加Treg细胞分泌的抗炎因子。

实施例2-9眼球切片的免疫荧光

9.1固定：将眼球冰冻切片浸没于丙酮中-20℃固定10min。

9.2用1xPBS溶液清洗切片，洗净残留丙酮。

9.3封闭：

封闭液配制：5ml PBS+0.05BSA粉末+250μl HBS。

封闭：将封闭液滴加在组织上，封闭1h。

9.4一抗孵育：

吸去封闭液并用1xPBS溶液清洗，一抗与封闭液以1:200比例配置，将一抗滴加在组织上，4℃过夜孵育。以下操作尽量避光进行。

9.5二抗孵育:

吸去一抗并用1xPBS溶液清洗，二抗与1xPBS溶液以1:500比例配置，将二抗滴加在组织上，室温孵育1h。

9.6DAPI染细胞核：

吸去二抗并用1xPBS溶液清洗，DAPI与1xPBS溶液以1:1000比例配置，将DAPI滴加在组织上1min后吸去，再用1xPBS溶液清洗。

9.7封片：

用封片液进行封片。

9.8荧光显微镜下观察

结果如图所示(图17)，对照组(D0-BSS和D6-BSS)免疫后第12天可见大量巨噬细胞和T细胞侵润，视网膜组织结构(各核层)紊乱，到第18天，侵润细胞减少，视网膜结构轻度紊乱。D0-hAECs预防组较对照组能够显著减少巨噬细胞及T细胞的侵润，免疫后第12天可见少量巨噬细胞及T细胞的侵润，视网膜结构轻度紊乱，免疫后第18天，视网膜结构基本正常，几乎没有炎性细胞侵润。D6-hAECs治疗组在相同时间点较对照组能够明显减少巨噬细胞及T细胞的侵润，但治疗效果没有D0-hAECs预防组显著。说明hAECs治疗减少巨噬细胞及T细胞的侵润。

本实验研究人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis，EAU)治疗中的潜在能力并挖掘其治疗机理。根据本实验，发明人认为hAECs能够显著抑制促炎症细胞因子的表达并促进抗炎因子的分泌，同时平衡体内免疫调控的微生理环境，从而起到抑制实验性自身免疫性葡萄膜炎发生发展的作用，可以作为疾病治疗的一种新途径。本实验首次将人羊膜上皮细胞应用于实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗中，并且具有良好的效果，为当前自身该类疾病提供了一种新的治疗方案。

第三部分人羊膜上皮细胞用于治疗红斑狼疮

实施例3-1构建实验性自身免疫性红斑狼疮模型

MRL-Faslpr小鼠，SPF级，30-40g，动物由南京大学-南京生物医药研究院提供。分笼饲养，同一组小鼠置于同一笼，每笼6只在浙江大学实验动物中心饲养，空调控制室温23-26℃之间，相对湿度55±10％以内，照明12小时昼夜周期实施，摄食及饮水自由摄取。在MRL-Faslpr小鼠12周后开始检测自身抗体，血清ANA及anti-dsDNA抗体都为阳性时，确定小鼠发病(SLE小鼠)，此时进行hAECs注射(hAECs的制备同第一部分实施例中公开的方法)。随机选取MRL-Faslpr小鼠血清内anti-dsDNA抗体为阴性的小鼠作为Control组。

实施例3-2小鼠尾静脉注射hAECs

对模型治疗组(SLE+hAECs)小鼠进行尾静脉注射hAECs治疗，每只小鼠每次注射细胞数量为1.5×10⁶个(浓度为1.5×10⁷个/ml细胞悬液，每只注射100μl)。

实施例3-3、免疫荧光检测MRL-Fas^lpr小鼠血清ANA和anti-dsDNA抗体

1、小鼠血清分离

对小鼠进行眼眶静脉丛取血，血液在室温下放置1h后置于4℃放置30min，4℃下3600rpm离心10min，分离血清，分装后于-80℃冷冻保存。

1.主要试剂

抗核抗体(ANA)马赛克间接免疫荧光法检测试剂盒，FA 1510-1，欧蒙，

绿蝇短膜虫(nDNA)间接免疫荧光法检测试剂盒，FA 1572，欧蒙，

山羊Anti-小鼠IgG H&L(FITC)，ab6785，Abcam。

2.实验方法

(1)样品、试剂准备

1)通过剪掉鼠尾一毫米，将血液收集到200μl tube中。室温放置1h后，4℃放置30min。4℃3600rpm离心10min分离血清，血清可放置于4℃，14天内检测，但稀释后的血清需当天检测。

2)清洗加样板，检查其是否反应区亲水而周边疏水。

3)检测anti-dsDNA antibody前将样品稀释10倍；检测ANA前将样品稀释40倍。

4)载有生物薄膜的载片室温放置30min后使用。

5)初次使用时，用加样器将二抗，阴性及阳性对照血清混匀。

6)1L蒸馏水加入一包PBS盐后加入2ml吐温20，充分混匀后4℃保存。

(2)、加样：将加样板至于泡沫板上，按检测顺序分别滴加25μl稀释后血清至加样板的每一个反应区上，避免产生气泡。

(3)、孵育：将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始，室温孵育30min。

(4)、冲洗：用烧杯盛PBS吐温缓冲液流水冲洗载玻片，然后立即将其浸入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中浸泡5min(最多洗16张)。

(5)、加样：使用排枪滴加20μl FITC标记的抗鼠球蛋白(荧光二抗)至洁净加样板的反应区，完全加完所有荧光二抗后进行下一步温育。

(6)、温育：从洗杯中取出载片，用吸水纸擦去背面和边缘的水分后(不要擦拭反应区间隙)，立即盖在加样板的凹槽内。确保生物薄片与液滴接触良好，然后继续下一张，室温避光温育30min。

(7)、冲洗：用烧杯盛PBS吐温缓冲液流水冲洗载玻片，然后立即将其浸入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中浸泡5min。

(8)、封片：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽内，滴加封片剂(甘油/PBS)至盖玻片：每一反应区10μl。取出载片，用吸水纸擦去背面和边缘的水分后(不要擦拭反应区间隙)，将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。

(9)、显微镜下观察：激发滤片：488nm，分光滤镜：510nm，阻挡滤镜：520nm，荧光下观察ANA与anti-dsDNA抗体的阳性情况。当小鼠血清ANA呈阳性时，检测其anti-dsDNA抗体，两种抗体都为阳性时，确定MRL-Fas^lpr已呈现SLE的特征，判定其已发病，可以进行小鼠尾静脉注射hAECs治疗。治疗两周后，检测小鼠血清ANA与anti-dsDNA抗体，确定治疗效果。

(10)、使用Image Pro Plus 6.0软件进行平均荧光强度(mean fluorescenceintensity，MFI)测量，≥10cells/sample。

实施例3-4、ELISA检测MRL-Faslpr小鼠血清中IgG Isotypes与细胞因子浓度

1.主要试剂

小鼠IgG1ELISA试剂盒恒远(HY2407)，

小鼠IgG2a ELISA试剂盒恒远(HY2410)，

小鼠IgG3ELISA试剂盒恒远(HY2414)。

2.实验方法

取全血分离血清方法同上，收集全部小鼠的血清后采用ELISA方法检测小鼠血清中IgG1、IgG2a、IgG3、IL-17α、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β浓度。，按以下方法制备标准品溶液。

标准品的稀释

标准品最高浓度为：IgG1(800ng/L)、IgG2a(120ng/L)、IgG3(240ng/L)、IFN-γ(800ng/L)、IL-4(240pg/ml)、IL-10(1000pg/ml)、IL-17α(120pg/ml)、TGF-β(240ng/L)；

2.3配液：用蒸馏水将30×浓缩洗涤液稀释30倍后备用；

2.5加酶：除空白孔外，每孔酶标试剂50μl；

2.6温育：操作同2.2；

2.7洗涤：操作同4；

实施例3-5流式细胞术检测SLE小鼠脾脏内免疫细胞平衡

1.实验材料与主要试剂

实验材料

根据前期实验结果，选择疾病高峰期(35day)治疗，49day取样组的Control，SLE，SLE+hAECs三组小鼠脾脏进行分析。

SLE小鼠血清ANA，anti-dsDNA抗体阳性时，注射hAECs进行治疗。两周后处死小鼠，取脾脏分离脾脏内单核细胞进行流式分析。

主要试剂

Anti-mouse CD4FITC(GK1.5，eBioseienee，USA)，

Anti-mouse/Rat Foxp3PE(FJK-16s，eBiosciene，USA)，

Anti-mouse/Rat IL-17A PE(17B7，eBiosciene，USA)，

Anti-mouse CD1d PE(1B1，eBiosciene，USA)，

Anti-mouse CD5FITC(53-7.3，eBiosciene，USA)，

Anti-mouse CD19APC(1D3，eBiosciene，USA)，

Rat IgG2b kappa Isotype Control PE(eBiosciene，USA)，

Rat IgG2a kappa Isotype Control PE(eBiosciene，USA)，

固定/通透液(eBioscience，USA)，通透buffer(eBiosciene，USA)，乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristate acetate，PMA，联科生物)，离子霉素(ionomycin，联科生物)，莫能菌素(monensin，联科生物)，RPMI 1640(GIBCO)，FBS(GIBCO)，Sodium Pyruvate(GIBCO)，1M HEPES(GIBCO)，NH₄Cl(生工生物)，Tris(生工生物)。

2.实验方法

溶液配制

(1)PMA溶液的配制

贮存液：浓度0.1mg/ml，-80℃避光保存；

工作液：1:10稀释于含10％FBS的RPMI 1640中，浓度为10μg/ml；

工作终浓度：25ng/ml，即每500μl培养液，加PMA 1.25μl；

(2)Ionomycin溶液的配制

贮存液：浓度1mg/ml，-80℃避光保存；

工作液：1:2稀释于含10％FBS的RPMI 1640中，浓度为500μg/ml；

工作终浓度：1μg/ml，即每500μl培养液，加Ionomycin 1μl；

(3)Monensin溶液的配制

贮存液：浓度50mg/ml，-80℃避光保存；

工作液：1:50稀释于含10％FBS的RPMI 1640中，浓度为1000μg/ml；

工作终浓度：1.7μg/ml，即每500μl培养液，加Monensin 0.85μl；

(4)淋巴细胞培养液的配制：RPMI 1640(430ml)+10％FBS(50ml)+(1000×)50μMβ巯基乙醇(500μl)+(100×)100mM Sodium Pyruvate(5ml)+(50×)1M HEPES(10ml)+(100×)双抗(5ml)。

(5)红细胞裂解液的配制：250ml ddH2O中加入1.8675g NH4Cl和0.65g Tris，之后调PH至7.2，0.22mm下过滤除菌。

(6)流式相关buffer配制

1).上机及洗涤Buffer：5ml FBS+245ml PBS(2％FBS)。

2).透膜1×Permeabilization Buffer：5ml的5×Permeabilization Buffer+45ml dH₂O。

3).Foxp3Fixation/Permeabilization working solution：Concentrate(1part)+Diluent(3part)。

3.小鼠脾脏细胞悬液制备方法

无菌取出脾脏，置于6孔板中，用含有P/S的PBS溶液清洗后，用玻璃片研磨脾脏得到淋巴悬液。将悬液移入15ml离心管中(组织弃去)，4℃下1400rpm离心5min，用真空泵吸去上清。加入2ml红细胞裂解液，充分混匀，室温静置3min，立即加入3倍体积PBS溶液，充分混匀，4℃下1400rpm离心5min，用真空泵吸去上清。加入2ml PBS溶液将留下的细胞沉淀吹匀，取1μl细胞悬液台盼蓝检测，之后过滤取1μl细胞悬液稀释100倍细胞计数。离心后用淋巴细胞培养液重悬细胞调整浓度为1×10⁷个/ml，流式细胞染色需要细胞量为1×10^5-6个.

4.流式细胞染色步骤

(1)Th17细胞(胞内细胞因子：IL-17A)

实验前加25ng/ml佛波酯、1μg/ml离子霉素，2个小时之后加1.7μg/ml莫能霉素。继续培养3个小时后细胞收集于1.5ml离心管，1000rpm，4℃离心5min弃上清。用1ml Buffer洗一次，1000rpm，4℃离心5min弃上清。加入100μl Buffer，0.5μl Anti-mouse CD4FITC抗体，4℃避光孵育30min。1000rpm，4℃离心5min弃上清，加1ml Buffer重悬，1000rpm，4℃离心5min弃上清，加入200μL IC Fixation Buffer固定细胞混匀，室温避光作用20min。加入1mL，1×Permeabilization Buffer洗涤细胞两次，1000rpm，室温离心5min，弃上清。加入100μL，1×Permeabilization Buffer重悬，加Anti-mouse/Rat IL-17A PE抗体0.625μl或Isotype，室温避光作用20min。加入1mL，1×Permeabilization Buffer洗涤细胞，室温，1000rpm离心5min，弃上清。加入1mL，Buffer洗涤细胞，室温，1000rpm离心5min，弃上清，500μL Buffer重悬细胞上机。

(2)Treg细胞(核内转录因子：FOXP3)

细胞收集于1.5ml离心管，1000rpm，4℃离心5min弃上清，加入100μl Buffer，0.5μl Anti-mouse CD4FITC抗体，4℃避光孵育30min。1000rpm，4℃离心5min弃上清，加1mlBuffer重悬，1000rpm，4℃离心5min弃上清。加入200μl Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution混匀，室温避光作用30min。加入1mL Buffer洗涤细胞两次，室温，1000rpm离心5min，弃上清。加入100μl Buffer重悬，加入Anti-mouse/RatFoxp3PE抗体2.5μl或Isotype，室温避光作用30min。加入1mL Buffer洗涤细胞两次，室温，1000rpm离心5min，弃上清，500μL Buffer重悬细胞上机。流式细胞检测结果使用KaluzaAnalysis 1.5a软件进行分析。

本实验研究人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)在SLE治疗中的潜在能力并挖掘其治疗机理。在小鼠SLE发生后注射hAECs，能明显改善甚至治愈疾病，血清ANA及antidsDNA抗体由阳性转为阴性，显著降低IgG1、IgG2a、IgG3抗体水平。并且发现hAECs能通过调控T细胞亚群比例和细胞因子水平，从而恢复了SLE小鼠的免疫平衡。本实验首次将人羊膜上皮细胞应用于系统性红斑狼疮的治疗中，并且具有良好的效果，为当前该类自身免疫性疾病提供了一种新的治疗方案。

在此说明书中，本发明已参照特定的实施例作了描述，实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。本发明的说明是说明性的而非限制性的，本领域的技术人员可以在不脱离本发明原理的前提下轻易的做出改进和修饰，但这些改进和修饰也都落入本发明权利要求保护的范围内。

Claims

1.人羊膜上皮细胞或其细胞制剂在制备治疗和/或改善自身免疫性疾病的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：使用有效剂量的人羊膜上皮细胞或其细胞制剂单独或者与其它药物联合使用进行治疗和/或改善自身免疫性疾病。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的自身免疫性疾病包括桥本甲状腺炎、葡萄膜炎和红斑狼疮等。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的具有自身免疫性疾病的动物是指哺乳动物。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的羊膜上皮细胞的合适状态为未经任何处理的收集的细胞、部分纯化的细胞或者纯化的细胞然后经培养扩增。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：可以采用任意适合的方法将羊膜上皮细胞给予患者，包括患病部位局部注射、视网膜下腔注射、静脉注射或者脊髓腔内注射等。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：羊膜上皮细胞每次给予的剂量范围为10³-10⁹细胞。

8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于：所述的羊膜上皮细胞由包括以下步骤的方法制备得到：

(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：对步骤2中获得人羊膜上皮细胞继续培养，优选的培养条件为：以1×10⁶-1×10⁸个细胞/平板的密度将细胞接种于培养皿中，放置于二氧化碳培养箱中培养，待人羊膜上皮细胞贴壁后换培养液，待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：可在基础培养基中添加bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或EGF(表皮生长因子)。