JP2002326943A - 抗炎症剤 - Google Patents
抗炎症剤Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規な抗炎症剤を提供する。
【解決手段】 インフォームドコンセントに基づいて帝
王切開時に得られた胎盤からＨＡＥＣを公知の方法によ
り分離し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で培養し、Ｈ
ＡＥＣを十分に増殖させた。続いて、ＰＢＳで洗浄後、
０．５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで４８時間培養し、上清を
回収した。角膜中央部表層を熱凝固したマウスに、この
ＨＡＥＣ培養上清を点眼したところ、樹状細胞であるラ
ンゲルハンス細胞の遊走及び炎症性サイトカインが抑制
されることを見い出した。
王切開時に得られた胎盤からＨＡＥＣを公知の方法によ
り分離し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で培養し、Ｈ
ＡＥＣを十分に増殖させた。続いて、ＰＢＳで洗浄後、
０．５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで４８時間培養し、上清を
回収した。角膜中央部表層を熱凝固したマウスに、この
ＨＡＥＣ培養上清を点眼したところ、樹状細胞であるラ
ンゲルハンス細胞の遊走及び炎症性サイトカインが抑制
されることを見い出した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な抗炎症剤に
関する。
関する。
【０００２】
【従来の技術】外傷や感染等の起炎刺激が加えられるこ
とにより異常が起きた生体組織では、ＩＬ−１（インタ
ーロイキン）やＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）等の炎症性
サイトカインが産生される。これらのサイトカインに応
答し、樹状細胞等の抗原提示細胞が異常の起きた組織部
位へと移動（遊走）し、その組織部位における抗原や病
原体を認識する。抗原提示細胞が、この認識情報をリン
パ節へと伝達（提示）し、Ｔ細胞の活性化を促すことに
よって、異常が起きた組織部位を異物として排除する方
向へと処理する。これらの一連の反応が「炎症」であ
り、免疫反応の一部である。
とにより異常が起きた生体組織では、ＩＬ−１（インタ
ーロイキン）やＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）等の炎症性
サイトカインが産生される。これらのサイトカインに応
答し、樹状細胞等の抗原提示細胞が異常の起きた組織部
位へと移動（遊走）し、その組織部位における抗原や病
原体を認識する。抗原提示細胞が、この認識情報をリン
パ節へと伝達（提示）し、Ｔ細胞の活性化を促すことに
よって、異常が起きた組織部位を異物として排除する方
向へと処理する。これらの一連の反応が「炎症」であ
り、免疫反応の一部である。
【０００３】炎症性サイトカインはその発現により強い
抗原提示能を有する樹状細胞を含む炎症性細胞の分化、
増殖、遊走などの炎症反応の誘導に深く関与している。
また、ランゲルハンス細胞は樹状細胞の一種であり、皮
膚、口腔粘膜、鼻腔粘膜等の上皮組織のほか、結膜や角
膜輪部の上皮組織に多数存在している。このランゲルハ
ンス細胞は、例えば角膜に外傷や感染が生じると、直ち
に角膜表面中央に遊走し、角結膜表面の抗原や病原体を
認識して、局所リンパ節にその情報を伝達する。そし
て、この局所リンパ節にて感作リンパ球が増殖し、この
感作リンパ球がリンパ管を通じて角結膜の病変部に到達
し、感染細胞やウイルスの排除を行ったり、移植角膜な
どに対する拒絶反応を引き起こしたりするため、炎症が
起きる。
抗原提示能を有する樹状細胞を含む炎症性細胞の分化、
増殖、遊走などの炎症反応の誘導に深く関与している。
また、ランゲルハンス細胞は樹状細胞の一種であり、皮
膚、口腔粘膜、鼻腔粘膜等の上皮組織のほか、結膜や角
膜輪部の上皮組織に多数存在している。このランゲルハ
ンス細胞は、例えば角膜に外傷や感染が生じると、直ち
に角膜表面中央に遊走し、角結膜表面の抗原や病原体を
認識して、局所リンパ節にその情報を伝達する。そし
て、この局所リンパ節にて感作リンパ球が増殖し、この
感作リンパ球がリンパ管を通じて角結膜の病変部に到達
し、感染細胞やウイルスの排除を行ったり、移植角膜な
どに対する拒絶反応を引き起こしたりするため、炎症が
起きる。
【０００４】このような炎症を抑える手法が種々提案さ
れている。例えば、前述の移植角膜に対する拒絶反応に
よる炎症を抑える手法としては、ＵＶ照射したりステロ
イド剤を与えたりすることが考えられる。
れている。例えば、前述の移植角膜に対する拒絶反応に
よる炎症を抑える手法としては、ＵＶ照射したりステロ
イド剤を与えたりすることが考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の手法とは異なる新たな手法が見い出されるのであれ
ば、選択肢が増加することにより種々の状況に応じて最
適な手法を選び出して対処可能になるため好ましい。例
えば、新規な抗炎症剤が見い出されることにより、ステ
ロイド剤を投与した場合に生じる深刻な副作用を回避す
ることが期待される。このため、そのような手法の開発
やそのような手法の一助となる薬剤の開発が望まれてい
る。
の手法とは異なる新たな手法が見い出されるのであれ
ば、選択肢が増加することにより種々の状況に応じて最
適な手法を選び出して対処可能になるため好ましい。例
えば、新規な抗炎症剤が見い出されることにより、ステ
ロイド剤を投与した場合に生じる深刻な副作用を回避す
ることが期待される。このため、そのような手法の開発
やそのような手法の一助となる薬剤の開発が望まれてい
る。
【０００６】本発明は上記問題点を解決することを課題
とするものであり、新規な抗炎症剤を提供することを目
的とする。
とするものであり、新規な抗炎症剤を提供することを目
的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段、発明の実施の形態及び発
明の効果】本発明者らは、ヒト羊膜上皮細胞（ＨＡＥ
Ｃ，human amniotic epthielial cells）を培養した培
養上清が抗炎症作用を有するかどうかを検討した。樹状
細胞の一種であるランゲルハンス細胞は炎症初期に働
き、遊走して眼表面や皮膚の抗原を認識し、提示するこ
とがよく知られているので、ランゲルハンス細胞の遊走
抑制効果を調べた。また、炎症性サイトカインはその発
現により強い抗原提示能を有する樹状細胞を含む炎症性
細胞の分化、増殖、遊走などの炎症反応の誘導に深く関
与しているため、炎症性サイトカインの発現抑制効果に
ついても調べた。そして、ランゲルハンス細胞の遊走抑
制効果や炎症性サイトカインの発現抑制効果が認められ
れば、抗炎症作用を有していると判定した。
明の効果】本発明者らは、ヒト羊膜上皮細胞（ＨＡＥ
Ｃ，human amniotic epthielial cells）を培養した培
養上清が抗炎症作用を有するかどうかを検討した。樹状
細胞の一種であるランゲルハンス細胞は炎症初期に働
き、遊走して眼表面や皮膚の抗原を認識し、提示するこ
とがよく知られているので、ランゲルハンス細胞の遊走
抑制効果を調べた。また、炎症性サイトカインはその発
現により強い抗原提示能を有する樹状細胞を含む炎症性
細胞の分化、増殖、遊走などの炎症反応の誘導に深く関
与しているため、炎症性サイトカインの発現抑制効果に
ついても調べた。そして、ランゲルハンス細胞の遊走抑
制効果や炎症性サイトカインの発現抑制効果が認められ
れば、抗炎症作用を有していると判定した。
【０００８】まず、ランゲルハンス細胞遊走モデルとし
て、マウスの角膜中央部表層を熱凝固し、２週間後にそ
の角膜を採取し、免疫組織化学的に角膜上皮中のランゲ
ルハンス細胞密度を共焦点顕微鏡下で解析した。具体的
には、熱凝固後に、ＨＡＥＣ培養上清を３回／日の割合
で点眼投与し、対照群には基剤であるウシ胎児血清含有
ダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＦＣＳ含有ＤＭ
ＥＭ）のみを点眼した。そうしたところ、ＨＡＥＣ培養
上清点眼群では、対照群に比較して、有意にランゲルハ
ンス細胞の遊走が抑制されることを見い出した。
て、マウスの角膜中央部表層を熱凝固し、２週間後にそ
の角膜を採取し、免疫組織化学的に角膜上皮中のランゲ
ルハンス細胞密度を共焦点顕微鏡下で解析した。具体的
には、熱凝固後に、ＨＡＥＣ培養上清を３回／日の割合
で点眼投与し、対照群には基剤であるウシ胎児血清含有
ダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＦＣＳ含有ＤＭ
ＥＭ）のみを点眼した。そうしたところ、ＨＡＥＣ培養
上清点眼群では、対照群に比較して、有意にランゲルハ
ンス細胞の遊走が抑制されることを見い出した。
【０００９】また、炎症性サイトカインの発現検討モデ
ルとして、前出のランゲルハンス細胞遊走モデルと同じ
角膜組織を用い、リボヌクレアーゼプロテクションアッ
セイにより解析した。具体的には、熱凝固後に、ＨＡＥ
Ｃ培養上清点眼群にはＨＡＥＣ培養上清を３回／日の割
合で点眼投与し、対照群には基剤であるＦＣＳ含有ＤＭ
ＥＭのみを点眼し、無治療群には何も点眼しなかった。
そして、各群につきリボヌクレアーゼプロテクションア
ッセイにより解析した。そうしたところ、ＨＡＥＣ培養
上清点眼群では、対照群及び無治療群に比較して、有意
に種々の炎症性サイトカインの発現が抑制されることを
見い出した。
ルとして、前出のランゲルハンス細胞遊走モデルと同じ
角膜組織を用い、リボヌクレアーゼプロテクションアッ
セイにより解析した。具体的には、熱凝固後に、ＨＡＥ
Ｃ培養上清点眼群にはＨＡＥＣ培養上清を３回／日の割
合で点眼投与し、対照群には基剤であるＦＣＳ含有ＤＭ
ＥＭのみを点眼し、無治療群には何も点眼しなかった。
そして、各群につきリボヌクレアーゼプロテクションア
ッセイにより解析した。そうしたところ、ＨＡＥＣ培養
上清点眼群では、対照群及び無治療群に比較して、有意
に種々の炎症性サイトカインの発現が抑制されることを
見い出した。
【００１０】即ち、本発明の抗炎症剤は、ＨＡＥＣ培養
上清を含有することを特徴とする抗炎症剤であり、抗原
提示細胞の遊走を抑制する作用を有していてもよく、特
に、抗原提示細胞のうちランゲルハンス細胞、相互連結
性嵌入細胞、末梢非リンパ系組織の間質細胞、輸入リン
パ内のベール細胞、真皮樹状細胞などに代表される樹状
細胞の遊走を抑制する作用を有していてもよい。
上清を含有することを特徴とする抗炎症剤であり、抗原
提示細胞の遊走を抑制する作用を有していてもよく、特
に、抗原提示細胞のうちランゲルハンス細胞、相互連結
性嵌入細胞、末梢非リンパ系組織の間質細胞、輸入リン
パ内のベール細胞、真皮樹状細胞などに代表される樹状
細胞の遊走を抑制する作用を有していてもよい。
【００１１】また、本発明の抗炎症剤は、組織中で発現
する炎症性サイトカインを抑制する作用を有していても
よく、そのような炎症性サイトカインとしては、ＭＩ
Ｆ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＩＬ−１８／ＩＧＩＦ，
ＩＬ−１２ｐ３５，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−１０，Ｉ
Ｌ−６，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５，
ＩＬ−８，ＩＬ−１３，ＩＬ−１６，ＩＬ−１７，ＧＭ
−ＣＳＦ，ＴＮＦ−α，ＴＧＦ−β，ＥＧＦ，ＦＧＦ，
ＰＤＧＦ，ＩＦＮ−α，ＭＣＰ−１及びＲＡＮＴＥＳか
らなる群より選ばれた１以上のサイトカインが挙げられ
る。また、ＨＡＥＣ培養上清を含有する抗炎症剤は、組
織中で発現する抗炎症性サイトカインと同等又は類似の
効果を奏してもよく、そのような抗炎症性サイトカイン
としては、例えば、ＩＬ−１Ｒα，ＩＬ−４，ＩＬ−
６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１３及びＴＧＦ−
βからなる群より選ばれた１以上のサイトカインが挙げ
られる。
する炎症性サイトカインを抑制する作用を有していても
よく、そのような炎症性サイトカインとしては、ＭＩ
Ｆ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＩＬ−１８／ＩＧＩＦ，
ＩＬ−１２ｐ３５，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−１０，Ｉ
Ｌ−６，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５，
ＩＬ−８，ＩＬ−１３，ＩＬ−１６，ＩＬ−１７，ＧＭ
−ＣＳＦ，ＴＮＦ−α，ＴＧＦ−β，ＥＧＦ，ＦＧＦ，
ＰＤＧＦ，ＩＦＮ−α，ＭＣＰ−１及びＲＡＮＴＥＳか
らなる群より選ばれた１以上のサイトカインが挙げられ
る。また、ＨＡＥＣ培養上清を含有する抗炎症剤は、組
織中で発現する抗炎症性サイトカインと同等又は類似の
効果を奏してもよく、そのような抗炎症性サイトカイン
としては、例えば、ＩＬ−１Ｒα，ＩＬ−４，ＩＬ−
６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１３及びＴＧＦ−
βからなる群より選ばれた１以上のサイトカインが挙げ
られる。
【００１２】本発明において用いられるＨＡＥＣは、受
精後約８日で原外肺葉（epiblast）から分離する羊膜芽
細胞（amnioblast）から形成される。このＨＡＥＣは、
ヒト胎盤から得ることができ、従来帝王切開時に廃棄さ
れていたヒト胎盤をインフォームドコンセントを得た上
で使用することで、安定的に確保することができ、ま
た、倫理上の問題も少ない。
精後約８日で原外肺葉（epiblast）から分離する羊膜芽
細胞（amnioblast）から形成される。このＨＡＥＣは、
ヒト胎盤から得ることができ、従来帝王切開時に廃棄さ
れていたヒト胎盤をインフォームドコンセントを得た上
で使用することで、安定的に確保することができ、ま
た、倫理上の問題も少ない。
【００１３】本発明において用いられるＨＡＥＣの培養
上清は、最初にＨＡＥＣを十分に増殖させるために、Ｅ
ＧＦ（上皮増殖因子）やＨＧＦ（肝細胞増殖因子）に代
表されるＨＡＥＣを増殖させる因子を含有する培地によ
りＨＡＥＣを増殖させ、次いでＨＡＥＣの生存を維持で
きる程度であって、不純物の含有量が少ない培地で培養
したものが好ましい。例えば、最初にＨＡＥＣをウシ胎
児血清含有培地で培養し、ＨＡＥＣを増殖させた後、次
いで、その培地のウシ胎児血清含有率よりも低い含有率
を有するウシ胎児血清含有培地又は無血清培地で培養し
たあとの上清であることが好ましい。
上清は、最初にＨＡＥＣを十分に増殖させるために、Ｅ
ＧＦ（上皮増殖因子）やＨＧＦ（肝細胞増殖因子）に代
表されるＨＡＥＣを増殖させる因子を含有する培地によ
りＨＡＥＣを増殖させ、次いでＨＡＥＣの生存を維持で
きる程度であって、不純物の含有量が少ない培地で培養
したものが好ましい。例えば、最初にＨＡＥＣをウシ胎
児血清含有培地で培養し、ＨＡＥＣを増殖させた後、次
いで、その培地のウシ胎児血清含有率よりも低い含有率
を有するウシ胎児血清含有培地又は無血清培地で培養し
たあとの上清であることが好ましい。
【００１４】また、場合によっては、培養したあと濃縮
又は精製したものを抗炎症剤として使用してもよい。な
お、濃縮又は精製の条件は、培養上清中の抗炎症作用を
奏する因子をそのまま維持できる条件とすることが好ま
しい。
又は精製したものを抗炎症剤として使用してもよい。な
お、濃縮又は精製の条件は、培養上清中の抗炎症作用を
奏する因子をそのまま維持できる条件とすることが好ま
しい。
【００１５】本発明の抗炎症剤は、抗原提示細胞である
樹状細胞の働きを抑制する作用や種々の炎症性サイトカ
インの発現を抑制する作用を奏することから、種々の炎
症の治療薬又は予防薬として高い有用性があるものと期
待される。例えば、角膜炎、角膜移植後の拒絶反応によ
る炎症、前眼部（結膜と角膜上皮とで構成される眼表面
と、強角膜実質と、角膜内皮を含む前房とにより構成さ
れる部分）の炎症疾患などに代表される眼免疫疾患のほ
か、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、口内炎、アレル
ギー性鼻炎などに代表される皮膚免疫疾患や、ランゲル
ハンス細胞組織球症（ＬＨＣ）などの治療薬又は予防薬
として期待される。前眼部の炎症疾患としては、例えば
アレルギー性結膜炎、スティーブンスジョンソン症候
群、類天疱瘡、モーレン潰瘍、角膜実質炎、上強膜炎、
強膜炎、前眼部ぶどう膜炎、水晶体起因性眼内炎、ベー
チェット病、交感性眼炎等が挙げられる。
樹状細胞の働きを抑制する作用や種々の炎症性サイトカ
インの発現を抑制する作用を奏することから、種々の炎
症の治療薬又は予防薬として高い有用性があるものと期
待される。例えば、角膜炎、角膜移植後の拒絶反応によ
る炎症、前眼部（結膜と角膜上皮とで構成される眼表面
と、強角膜実質と、角膜内皮を含む前房とにより構成さ
れる部分）の炎症疾患などに代表される眼免疫疾患のほ
か、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、口内炎、アレル
ギー性鼻炎などに代表される皮膚免疫疾患や、ランゲル
ハンス細胞組織球症（ＬＨＣ）などの治療薬又は予防薬
として期待される。前眼部の炎症疾患としては、例えば
アレルギー性結膜炎、スティーブンスジョンソン症候
群、類天疱瘡、モーレン潰瘍、角膜実質炎、上強膜炎、
強膜炎、前眼部ぶどう膜炎、水晶体起因性眼内炎、ベー
チェット病、交感性眼炎等が挙げられる。
【００１６】本発明の抗炎症剤は、ＨＡＥＣ培養上清を
単独で又は適当な希釈剤や他の添加剤と共に各種の製剤
形態（剤形）に調合され、使用される。剤形としては、
一般に非経口的投与に適する剤形が好ましく、例えば、
点眼剤や注射剤などの液剤や、軟膏剤、貼付剤として使
用に供される。各種剤形への調製は、この技術分野で慣
用される通常の手法を用いて行われるが、新たな手法が
開発されたときにはその手法を用いて行われてもよい。
製剤化に使用される製剤担体としては、各種剤形への調
製に慣用される希釈剤や添加剤などが用いられるが、新
たな希釈剤や添加剤などが開発されたときにはそれらを
用いてもよい。
単独で又は適当な希釈剤や他の添加剤と共に各種の製剤
形態（剤形）に調合され、使用される。剤形としては、
一般に非経口的投与に適する剤形が好ましく、例えば、
点眼剤や注射剤などの液剤や、軟膏剤、貼付剤として使
用に供される。各種剤形への調製は、この技術分野で慣
用される通常の手法を用いて行われるが、新たな手法が
開発されたときにはその手法を用いて行われてもよい。
製剤化に使用される製剤担体としては、各種剤形への調
製に慣用される希釈剤や添加剤などが用いられるが、新
たな希釈剤や添加剤などが開発されたときにはそれらを
用いてもよい。
【００１７】
【実施例】［１］抗炎症剤の調製 インフォームドコンセントに基づいて帝王切開時に得ら
れた胎盤からＨＡＥＣを公知の方法（Akle et al., Lan
cet II, 1003-1005, 1981）により分離し、ＨＡＥＣの
生存率を維持しながら十分な量の細胞数まで培養するた
めに、高濃度のＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有培地である
１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で培養し、ＨＡＥＣを十
分に増殖させた。続いて、ＰＢＳ（生理的リン酸緩衝
液）で洗浄後、ＦＣＳ含有率の低い０．５％ＦＣＳ含有
ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル最小必須培地）で４
８時間培養し、上清を回収し、これを抗炎症剤とした。
れた胎盤からＨＡＥＣを公知の方法（Akle et al., Lan
cet II, 1003-1005, 1981）により分離し、ＨＡＥＣの
生存率を維持しながら十分な量の細胞数まで培養するた
めに、高濃度のＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有培地である
１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で培養し、ＨＡＥＣを十
分に増殖させた。続いて、ＰＢＳ（生理的リン酸緩衝
液）で洗浄後、ＦＣＳ含有率の低い０．５％ＦＣＳ含有
ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル最小必須培地）で４
８時間培養し、上清を回収し、これを抗炎症剤とした。
【００１８】［２］ランゲルハンス細胞の遊走惹起 ＢＡＬＢ／ｃマウスに麻酔を施し、手術用顕微鏡の下へ
寝かせた。角膜中央に向かってランゲルハンス細胞を遊
走させるため、熱灼器の先端を用いて角膜の中央部約５
０％に熱傷を与え、角膜中央部表層を熱凝固した。
寝かせた。角膜中央に向かってランゲルハンス細胞を遊
走させるため、熱灼器の先端を用いて角膜の中央部約５
０％に熱傷を与え、角膜中央部表層を熱凝固した。
【００１９】［３］ランゲルハンス細胞の遊走抑制効果 熱凝固したマウス（個体総数１２匹）のうち、４匹に対
しては、ＨＡＥＣ培養上清を３回／日、２週間点眼投与
し、上清点眼群とした。一方、４匹のマウスに対して
は、基剤である０．５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭのみ点眼
し、基剤点眼群とし、残り４匹のマウスに対しては、何
も点眼せず、無治療群とした。これらについて、ランゲ
ルハンス細胞の数を間接的免疫蛍光法によってカウント
した。
しては、ＨＡＥＣ培養上清を３回／日、２週間点眼投与
し、上清点眼群とした。一方、４匹のマウスに対して
は、基剤である０．５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭのみ点眼
し、基剤点眼群とし、残り４匹のマウスに対しては、何
も点眼せず、無治療群とした。これらについて、ランゲ
ルハンス細胞の数を間接的免疫蛍光法によってカウント
した。
【００２０】即ち、各群のマウスにつき、熱凝固してか
ら２週間経過後に眼を取り出し、そこから角膜を切り出
して、この全層角膜をアセトン中で１０分間固定した。
その後、ＰＢＳ中で１０分間の洗浄を２回行った後、フ
ルオレセインイソチアネート（ＦＩＴＣ）標識ラット抗
マウス主要組織適合遺伝子複合体クラスIIｄ（ＭＨＣcl
assII：Ｉ−Ａd）モノクローナル抗体（ファーミンジェ
ン社，希釈率１：１００）で室温にて６０分間インキュ
ベートした。その後、この全層角膜をプロピティウム・
アイオダイド含有の包埋液でスライド上に包埋すること
で、全細胞の核を染色した。共焦点顕微鏡下で観察し、
全層角膜内の上皮層を特定し、角膜上皮層内のランゲル
ハンス細胞数を測定した。結果を表１及び図１に示す。
測定時の顕微鏡倍率を４０倍としたので、観察視野は一
辺が２３０μｍの正方形領域となり、この観察視野内の
Ｉ−Ａd陽性細胞数を測定した。細胞数測定は位置の異
なる３箇所の観察視野で行い、合計した細胞数を表１の
Ｎｏ．１〜４として示した。表１及び図１では、Ｎｏ．
１〜４の平均値となる測定細胞数（ｍｅａｎ）に６．３
を乗じ、１ｍｍ2での細胞数として換算して示した。
ら２週間経過後に眼を取り出し、そこから角膜を切り出
して、この全層角膜をアセトン中で１０分間固定した。
その後、ＰＢＳ中で１０分間の洗浄を２回行った後、フ
ルオレセインイソチアネート（ＦＩＴＣ）標識ラット抗
マウス主要組織適合遺伝子複合体クラスIIｄ（ＭＨＣcl
assII：Ｉ−Ａd）モノクローナル抗体（ファーミンジェ
ン社，希釈率１：１００）で室温にて６０分間インキュ
ベートした。その後、この全層角膜をプロピティウム・
アイオダイド含有の包埋液でスライド上に包埋すること
で、全細胞の核を染色した。共焦点顕微鏡下で観察し、
全層角膜内の上皮層を特定し、角膜上皮層内のランゲル
ハンス細胞数を測定した。結果を表１及び図１に示す。
測定時の顕微鏡倍率を４０倍としたので、観察視野は一
辺が２３０μｍの正方形領域となり、この観察視野内の
Ｉ−Ａd陽性細胞数を測定した。細胞数測定は位置の異
なる３箇所の観察視野で行い、合計した細胞数を表１の
Ｎｏ．１〜４として示した。表１及び図１では、Ｎｏ．
１〜４の平均値となる測定細胞数（ｍｅａｎ）に６．３
を乗じ、１ｍｍ2での細胞数として換算して示した。
【００２１】
【表１】
【００２２】表１及び図１から明らかなように、上清点
眼群では、無治療群及び基剤点眼群に比べて、角膜中央
部及び角膜周辺部のいずれにおいてもランゲルハンス細
胞数が少なかった。つまり、マウスの角膜熱灼におい
て、ＨＡＥＣ培養上清はランゲルハンス細胞の遊走を抑
制することがわかった。このことから、ＨＡＥＣ培養上
清には、樹状細胞であるランゲルハンス細胞の遊走を抑
制する何らかの因子が存在することが示唆される。
眼群では、無治療群及び基剤点眼群に比べて、角膜中央
部及び角膜周辺部のいずれにおいてもランゲルハンス細
胞数が少なかった。つまり、マウスの角膜熱灼におい
て、ＨＡＥＣ培養上清はランゲルハンス細胞の遊走を抑
制することがわかった。このことから、ＨＡＥＣ培養上
清には、樹状細胞であるランゲルハンス細胞の遊走を抑
制する何らかの因子が存在することが示唆される。
【００２３】［４］各種サイトカインの発現抑制効果 各種サイトカインの発現抑制効果の試験は、リボヌクレ
アーゼプロテクションアッセイにより行った。このアッ
セイは、ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）・ファーミ
ンジェン社のBD RiboQuantTM Multi-Probe Ribonucleas
e Protection Assay (RPA) Systemプロトコールに従
い、ＢＤ・ファーミンジェン社のTotal RNAisolation k
it, Mouse Cytokine/Chemokine Template Sets(mCK-2
b), In VitroTranscription Kit, RPA Kitを用いて実
施した。以下、実施手順を詳述する。
アーゼプロテクションアッセイにより行った。このアッ
セイは、ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）・ファーミ
ンジェン社のBD RiboQuantTM Multi-Probe Ribonucleas
e Protection Assay (RPA) Systemプロトコールに従
い、ＢＤ・ファーミンジェン社のTotal RNAisolation k
it, Mouse Cytokine/Chemokine Template Sets(mCK-2
b), In VitroTranscription Kit, RPA Kitを用いて実
施した。以下、実施手順を詳述する。
【００２４】まず、ランゲルハンス細胞の遊走抑制効果
試験と同様にして作製したＨＡＥＣ培養上清点眼群、対
照群、無治療群につき、それぞれの角膜組織のサイズを
一定にして全ＲＮＡ抽出を以下の手順で実施した。即
ち、各角膜組織の細胞を溶液Ｄ（Solution D）／β−メ
ルカプトエタノール溶液で溶解後、０．１倍量の２Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、等量の水飽和フェノー
ル、０．２倍量のクロロホルム：イソアミルアルコール
（４９：１）を順に加え、氷中に１５分静置した。１
２，０００×ｇで４℃、２０分間遠心後、上清に等量の
イソプロパノールを加え沈殿させた。沈殿物であるＲＮ
Ａペレットは、リボヌクレアーゼフリーの水に溶解し、
吸光度測定で濃度を求め、吸光度測定後の残りはエタノ
ールで沈殿させたあと、ハイブリダイゼーション溶液で
溶解した。
試験と同様にして作製したＨＡＥＣ培養上清点眼群、対
照群、無治療群につき、それぞれの角膜組織のサイズを
一定にして全ＲＮＡ抽出を以下の手順で実施した。即
ち、各角膜組織の細胞を溶液Ｄ（Solution D）／β−メ
ルカプトエタノール溶液で溶解後、０．１倍量の２Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、等量の水飽和フェノー
ル、０．２倍量のクロロホルム：イソアミルアルコール
（４９：１）を順に加え、氷中に１５分静置した。１
２，０００×ｇで４℃、２０分間遠心後、上清に等量の
イソプロパノールを加え沈殿させた。沈殿物であるＲＮ
Ａペレットは、リボヌクレアーゼフリーの水に溶解し、
吸光度測定で濃度を求め、吸光度測定後の残りはエタノ
ールで沈殿させたあと、ハイブリダイゼーション溶液で
溶解した。
【００２５】次に、プローブは、ＭＩＦ，ＩＬ−１α，
ＩＬ−１β，ＩＬ−１８／ＩＧＩＦ，ＩＬ−１Ｒａのそ
れぞれの遺伝子について以下の手順で作製した。即ち、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて３７℃で１時間インキ
ュベートを行うことで、それぞれのＤＮＡ（キットに含
まれている）からＲＮＡプローブへと転写させた。その
反応時に［α−32Ｐ］ＵＴＰを取り込ませることで、合
成したＲＮＡのラジオアイソトープ標識を行った。続い
て、デオキシリボヌクレアーゼを添加し、３７℃で３０
分インキュベートすることで、プローブ合成反応を停止
させ、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿
により合成したプローブを精製した。精製したプローブ
はハイブリダイゼーション緩衝液で溶解し、一部をシン
チレーションカウンタで放射線活性を測定してプローブ
合成の確認を行った。
ＩＬ−１β，ＩＬ−１８／ＩＧＩＦ，ＩＬ−１Ｒａのそ
れぞれの遺伝子について以下の手順で作製した。即ち、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて３７℃で１時間インキ
ュベートを行うことで、それぞれのＤＮＡ（キットに含
まれている）からＲＮＡプローブへと転写させた。その
反応時に［α−32Ｐ］ＵＴＰを取り込ませることで、合
成したＲＮＡのラジオアイソトープ標識を行った。続い
て、デオキシリボヌクレアーゼを添加し、３７℃で３０
分インキュベートすることで、プローブ合成反応を停止
させ、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿
により合成したプローブを精製した。精製したプローブ
はハイブリダイゼーション緩衝液で溶解し、一部をシン
チレーションカウンタで放射線活性を測定してプローブ
合成の確認を行った。
【００２６】次に、角膜組織の全ＲＮＡとプローブとの
ハイブリダイゼーションを以下の手順で行った。即ち、
それぞれの角膜組織の全ＲＮＡにプローブを加え、一度
９０℃に加熱したあとに急冷し、５６℃で１２〜１６時
間ハイブリダイゼーションさせた。続いて３０℃で４５
分間リボヌクレアーゼカクテルを加え反応させた。更に
３７℃で１５分間プロテイナーゼＫカクテルを加え反応
させた。フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈
殿により精製後、５μｌの１×泳動用溶液で溶解した。
９０℃で３分間加熱し急冷したあと、これらの試料は５
％アクリルアミドゲルで５０ワットにて泳動した。泳動
後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに感光させて、それ
ぞれのバンドについての放射線活性を測定した。その結
果を図２に示す。
ハイブリダイゼーションを以下の手順で行った。即ち、
それぞれの角膜組織の全ＲＮＡにプローブを加え、一度
９０℃に加熱したあとに急冷し、５６℃で１２〜１６時
間ハイブリダイゼーションさせた。続いて３０℃で４５
分間リボヌクレアーゼカクテルを加え反応させた。更に
３７℃で１５分間プロテイナーゼＫカクテルを加え反応
させた。フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈
殿により精製後、５μｌの１×泳動用溶液で溶解した。
９０℃で３分間加熱し急冷したあと、これらの試料は５
％アクリルアミドゲルで５０ワットにて泳動した。泳動
後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに感光させて、それ
ぞれのバンドについての放射線活性を測定した。その結
果を図２に示す。
【００２７】図２から明らかなように、上清点眼群で
は、無治療群及び基剤点眼群に比べて、炎症性サイトカ
インであるＭＩＦ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＩＬ−１
８／ＩＧＩＦの遺伝子について発現抑制が認められた。
つまり、ＨＡＥＣ培養上清は組織中で発現する炎症性サ
イトカインの発現を抑制することがわかった。また、上
清点眼群では、無治療群及び基剤点眼群に比べて、抗炎
症性サイトカインＩＬ−１Ｒａの遺伝子についても発現
抑制が認められた。このような抗炎症性サイトカインは
通常、炎症時に増加してその炎症を抑制する働きをする
にもかかわらず、今回、上清点眼群でその発現が抑制さ
れたのは、ＨＡＥＣ培養上清自体に抗炎症効果があり、
そのためＩＬ−１Ｒａが増加する必要がなかったものと
考えられる。
は、無治療群及び基剤点眼群に比べて、炎症性サイトカ
インであるＭＩＦ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＩＬ−１
８／ＩＧＩＦの遺伝子について発現抑制が認められた。
つまり、ＨＡＥＣ培養上清は組織中で発現する炎症性サ
イトカインの発現を抑制することがわかった。また、上
清点眼群では、無治療群及び基剤点眼群に比べて、抗炎
症性サイトカインＩＬ−１Ｒａの遺伝子についても発現
抑制が認められた。このような抗炎症性サイトカインは
通常、炎症時に増加してその炎症を抑制する働きをする
にもかかわらず、今回、上清点眼群でその発現が抑制さ
れたのは、ＨＡＥＣ培養上清自体に抗炎症効果があり、
そのためＩＬ−１Ｒａが増加する必要がなかったものと
考えられる。
【００２８】以上のことから、ＨＡＥＣ培養上清は、炎
症性サイトカインや樹状細胞が関わる種々の炎症の治療
薬又は予防薬として高い有用性があるものと期待され
る。例えば、角膜炎、角膜移植後の拒絶反応による炎
症、前眼部の炎症疾患などに代表される眼免疫疾患のほ
か、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、口内炎、アレル
ギー性鼻炎などに代表される皮膚免疫疾患や、ランゲル
ハンス細胞組織球症（ＬＨＣ）などの治療薬又は予防薬
として期待される。前眼部の炎症疾患としては、例えば
アレルギー性結膜炎、スティーブンスジョンソン症候
群、類天疱瘡、モーレン潰瘍、角膜実質炎、上強膜炎、
強膜炎、前眼部ぶどう膜炎、水晶体起因性眼内炎、ベー
チェット病、交感性眼炎等が挙げられる。
症性サイトカインや樹状細胞が関わる種々の炎症の治療
薬又は予防薬として高い有用性があるものと期待され
る。例えば、角膜炎、角膜移植後の拒絶反応による炎
症、前眼部の炎症疾患などに代表される眼免疫疾患のほ
か、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、口内炎、アレル
ギー性鼻炎などに代表される皮膚免疫疾患や、ランゲル
ハンス細胞組織球症（ＬＨＣ）などの治療薬又は予防薬
として期待される。前眼部の炎症疾患としては、例えば
アレルギー性結膜炎、スティーブンスジョンソン症候
群、類天疱瘡、モーレン潰瘍、角膜実質炎、上強膜炎、
強膜炎、前眼部ぶどう膜炎、水晶体起因性眼内炎、ベー
チェット病、交感性眼炎等が挙げられる。
【図１】ＨＡＥＣ培養上清のランゲルハンス細胞遊走抑
制効果を表すグラフである。
制効果を表すグラフである。
【図２】ＨＡＥＣ培養上清の各種サイトカインの発現抑
制効果を表すグラフである。
制効果を表すグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/08 Ａ６１Ｐ 37/08 (72)発明者 内田 彩子 東京都小平市小川町２−1306−44 コート フローラＣ101 (72)発明者 神谷 和孝 東京都世田谷区成城１−29−21−Ｃ Ｆターム(参考） 4C087 AA01 AA02 AA03 BB61 CA04 ZA33 ZA89 ZB08 ZB11 ZB13
Claims (10)
- 【請求項１】 ヒト羊膜上皮細胞を培養した培養上清を
含有することを特徴とする抗炎症剤。 - 【請求項２】 抗原提示細胞の遊走を抑制する作用を奏
する請求項１記載の抗炎症剤。 - 【請求項３】 樹状細胞の遊走を抑制する作用を奏する
請求項１又は２記載の抗炎症剤。 - 【請求項４】 ランゲルハンス細胞の遊走を抑制する作
用を奏する請求項１〜３のいずれかに記載の抗炎症剤。 - 【請求項５】 組織中で発現する炎症性サイトカインを
抑制する作用を有する請求項１〜４のいずれかに記載の
抗炎症剤。 - 【請求項６】 前記炎症性サイトカインが、ＭＩＦ，Ｉ
Ｌ−１α，ＩＬ−１β，ＩＬ−１８／ＩＧＩＦ，ＩＬ−
１２ｐ３５，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−１０，ＩＬ−
６，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ
−８，ＩＬ−１３，ＩＬ−１６，ＩＬ−１７，ＧＭ−Ｃ
ＳＦ，ＴＮＦ−α，ＴＧＦ−β，ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＰＤ
ＧＦ，ＩＦＮ−α，ＭＣＰ−１及びＲＡＮＴＥＳからな
る群より選ばれた１以上のサイトカインである請求項５
記載の抗炎症剤。 - 【請求項７】 組織中で発現する抗炎症性サイトカイン
の効果と同等又は類似の効果を有する請求項１〜６のい
ずれかに記載の抗炎症剤。 - 【請求項８】 前記抗炎症性サイトカインが、ＩＬ−１
Ｒα，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，
ＩＬ−１３及びＴＧＦ−βからなる群より選ばれた１以
上のサイトカインである請求項７記載の抗炎症剤。 - 【請求項９】 前記培養上清は、ヒト羊膜上皮細胞をウ
シ胎児血清含有培地で培養した後、さらに該培地のウシ
胎児血清含有率よりも低い含有率を有するウシ胎児血清
含有培地又は無血清培地で培養した後の上清である請求
項１〜８のいずれかに記載の抗炎症剤。 - 【請求項１０】 眼免疫疾患又は皮膚免疫疾患の治療又
は予防に利用される請求項１〜９のいずれかに記載の抗
炎症剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002021880A JP2002326943A (ja) | 2001-02-28 | 2002-01-30 | 抗炎症剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001054504 | 2001-02-28 | ||
| JP2001-54504 | 2001-02-28 | ||
| JP2002021880A JP2002326943A (ja) | 2001-02-28 | 2002-01-30 | 抗炎症剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002326943A true JP2002326943A (ja) | 2002-11-15 |
Family
ID=26610312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002021880A Pending JP2002326943A (ja) | 2001-02-28 | 2002-01-30 | 抗炎症剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002326943A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003047607A1 (fr) * | 2001-12-06 | 2003-06-12 | Sankyo Company, Limited | Compositions medicales contenant des cellules amniotiques humaines |
| WO2006090849A1 (ja) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Redox Bioscience Inc. | 炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤 |
| JP2010528055A (ja) * | 2007-05-28 | 2010-08-19 | モナッシュ ユニバーシティ | 慢性肺疾患の治療 |
| KR20180057497A (ko) * | 2016-11-21 | 2018-05-30 | 고려대학교 산학협력단 | 중이염 치료를 위한 양막추출물 또는 융모막추출물을 포함하는 조성물 |
| CN110090228A (zh) * | 2018-04-18 | 2019-08-06 | 浙江大学 | 人羊膜上皮细胞在自身免疫性疾病中的治疗用途 |
-
2002
- 2002-01-30 JP JP2002021880A patent/JP2002326943A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003047607A1 (fr) * | 2001-12-06 | 2003-06-12 | Sankyo Company, Limited | Compositions medicales contenant des cellules amniotiques humaines |
| WO2006090849A1 (ja) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Redox Bioscience Inc. | 炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤 |
| JP2012167121A (ja) * | 2005-02-25 | 2012-09-06 | Redox Bioscience Inc | 炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤 |
| JP5043644B2 (ja) * | 2005-02-25 | 2012-10-10 | レドックス・バイオサイエンス株式会社 | 炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤 |
| JP2010528055A (ja) * | 2007-05-28 | 2010-08-19 | モナッシュ ユニバーシティ | 慢性肺疾患の治療 |
| KR20180057497A (ko) * | 2016-11-21 | 2018-05-30 | 고려대학교 산학협력단 | 중이염 치료를 위한 양막추출물 또는 융모막추출물을 포함하는 조성물 |
| KR101891442B1 (ko) | 2016-11-21 | 2018-08-23 | 고려대학교 산학협력단 | 중이염 치료를 위한 양막추출물 또는 융모막추출물을 포함하는 조성물 |
| CN110090228A (zh) * | 2018-04-18 | 2019-08-06 | 浙江大学 | 人羊膜上皮细胞在自身免疫性疾病中的治疗用途 |
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