WO2021052503A1

WO2021052503A1 - 一种多能干细胞、药物组合物及其制备方法与用途

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Publication number: WO2021052503A1
Application number: PCT/CN2020/116626
Authority: WO
Inventors: 周琪; 胡宝洋; 郝捷; 李伟; 吴骏; 王柳; 郭保杰; 李仲文; 高婷婷; 陈燕霞; 王红梅
Original assignee: 北京干细胞与再生医学研究院; 中国科学院动物研究所
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2021-03-25
Also published as: CN112538456B; EP4047083A4; CN112538456A; US20220348879A1; JP2022548997A; EP4047083A1; KR20220094194A

Abstract

涉及细胞治疗领域。具体而言，涉及一种产生间充质干细胞群的方法，由所述方法产生的间充质干细胞群及其培养上清，以及包含此类细胞或其培养上清的药物组合物。还涉及所述间充质干细胞群及其培养上清，用于预防和治疗疾病的用途。

Description

一种多能干细胞、药物组合物及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及细胞治疗领域。具体而言，本发明涉及一种产生间充质干细胞群的方法，由所述方法产生的间充质干细胞群及其培养上清，以及包含此类细胞或其培养上清的药物组合物。本发明还涉及所述间充质干细胞群及其培养上清，以及包含此类细胞或其培养上清，用于预防和/或治疗疾病的用途。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，其来源广泛，几乎可以从任何结缔组织都能分离得到，如脑、脾、肝、肾、肺、骨髓等。在过去的几十年中，研究人员把MSCs作为干细胞治疗研究的焦点。MSCs很容易从不同结缔组织中获得，并且能够大量扩增，可以获得大量细胞。胚胎干细胞(ESCs)/诱导多能干细胞(iPSCs)因其有潜在成瘤性和伦理问题，制约了它的临床应用。间充质干细胞具有多向分化能力、免疫调节功能以及低免疫原性，且仍未发现它有成瘤性，因而成为干细胞治疗颇具临床应用价值的种子细胞。

目前为止，大多数的治疗性应用是以成体骨髓或者脐带来源的为研究对象，尽管能从骨髓和脐带中较易分离获得，但是存在来源有限，并随着体外培养时间的增加会降低其增殖能力和分化潜能。因而细胞数量和质量不稳定的问题影响了骨髓来源的临床应用。

要解决MSC的来源问题，可通过寻求新的MSC来源。胚胎干细胞具有无限增殖能力，具有向中胚层、内胚层、外胚层各种不同细胞和组织分化的潜能，因而可以作为MSC新的来源。近年来，许多研究已报道从人胚胎干细胞诱导成间质样细胞的方法，然而依然存在诱导效率不高、诱导过程复杂、诱导时间长等缺点，并且大部分方法中均需使用血清等异源物质，无法应用于临床。

总之，鉴于目前获得间充质干细胞的方法都受限于一些缺陷，寻找一种纯度高、产量高、耗时短的产生间充质干细胞的方法，从而用于临床治疗和预防各种疾病，是十分必要的。

发明内容

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，获得了一种从干细胞(例如全能干细胞或多能干细胞)在体外产生间充质干细胞的方法，由该方法获得的间充质干细胞具备显著提高的细胞因子分泌量，并由此完成了本发明。在本文中，本发明的细胞或通过本发明的方法获得的细胞可称为M细胞。

间充质干细胞群

因此，在第一方面，本发明提供了一种间充质干细胞群，其中，所述间充质干细胞群的平均MMP1表达水平(例如，在未经遗传修饰的情况下)是原代间充质干细胞的至少约10倍(例如，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约60倍，至少约70倍，至少约80倍，至少约90倍，至少约100倍，至少约150倍，至少约200倍，至少约300倍，至少约400倍，至少约500倍，至少约1000倍，至少约2000倍，至少约3000倍，至少约5000倍，至少约8000倍，至少约10000倍，或至少约12000倍)；和/或，所述间充质干细胞群的平均PGE2表达水平(例如，在未经遗传修饰的情况下)是原代间充质干细胞的至少约10倍(例如，至少约20倍，至少约30倍，至少约50倍，至少约60倍，或至少约80倍)。

在本文中，术语“原代间充质干细胞”是指，直接从机体取出的组织(例如脂肪组织、脐带、骨髓或脐血)中分离获得的间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群的MMP1表达水平是同等数量的原代间充质干细胞的至少约10倍(例如，至少约50倍，至少约100倍，至少约200倍，至少约300倍，至少约400倍，至少约500倍，至少约1000倍，至少约2000倍，至少约3000倍，至少约5000倍，至少约8000倍，至少约10000倍，或至少约12000倍)。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群的PGE2表达水平是同等数量的原代间充质干细胞的至少约10倍(例如，至少约20倍，至少约30倍，至少约50倍，至少约60倍，或至少约80倍)。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群的PGE2表达水平是同等数量的原代间充质干细胞的约80倍。

在某些实施方案中，经IFN-γ(例如25-100ng/ml)刺激后，所述间充质干细胞群的平均PD-L1表达水平(例如，在未经遗传修饰的情况下)高于原代间充质干细胞。在某些实施方案中，经IFN-γ(例如25-100ng/ml)刺激后，所述间充质干细胞群的平均PD-L1表达水平是原代间充质干细胞的至少约2倍(例如，至少约3倍)。在某些实施方案中，经50-100ng/ml的IFN-γ刺激后，所述间充质干细胞群的平均PD-L1表达水平是原代间充质干细胞的约3倍。在某些实施方案中，经IFN-γ(例如25-100ng/ml)刺激后，所述间充质干细胞群的PD-L1表达水平是同等数量的原代间充质干细胞的至少约2倍(例如，至少约3倍)。在某些实施方案中，经50-100ng/ml的IFN-γ刺激后，所述间充质干细胞群的PD-L1表达水平是同等数量的原代间充质干细胞的约3倍。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群的平均IDO表达水平(例如，在未经遗传修饰的情况下)高于原代间充质干细胞。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群的平均IDO表达水平是原代间充质干细胞的至少约10倍(例如，至少约20倍，至少约30倍，至少约50倍，至少约60倍，至少约80倍，至少约100倍，或至少约110倍)。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群的平均IDO表达水平是原代间充质干细胞的约110倍。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群的IDO表达水平是同等数量的原代间充质干细胞的至少约10倍(例如，至少约20倍，至少约30倍，至少约50倍，至少约60倍，至少约80倍，至少约100倍，或至少约110倍)。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群的IDO表达水平是同等数量的原代间充质干细胞的约110倍。

在本文中，所述表达可通过测量基因的全长mRNA、mRNA片段、全长蛋白质或蛋白质片段的水平来监测。因此，在某些实施方案中，所述表达水平是mRNA水平或蛋白水平。

在一些实施方案中，所述表达通过分析所述基因的mRNA转录物的表达来评估。例如，通过RT-PCR测定IDO、MMP1、PDL1或PGE2的mRNA在所述细胞群中的存在或含量从而确定上述基因在该细胞群中的表达情况。

在另一些实施方案中，所述表达通过分析所述基因的蛋白产物的表达来评估。例如，通过免疫学检测测定IDO、MMP1、PDL1或PGE2的蛋白在所述细胞群的培养上清的存在或含量从而确定上述基因在该细胞群中的表达情况。因此，在某些实施方案中，所述基因(例如，IDO、MMP1、PDL1或PGE2)的表达水平通过分泌在培养上清中的相应蛋白的水平来评价。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群是在未经遗传修饰的情况下具备以上所述的一种或多种基因表达特征，术语“未经遗传修饰”指未经历过将DNA或RNA形式的外源遗传物质添加至细胞的总遗传物质中的过程，此处术语“外源遗传物质”可以指人为引入的核苷酸序列，其相对于未经遗传修饰的细胞而言是外来的。容易理解，上述“未经遗传修饰”仅用于描述本发明的间充质干细胞群具备以上一种或多种基因表达特征的条件，并非用于限定本发明的间充质干细胞群不能包含遗传修饰。因此，在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群完全可以包含一种或多种遗传修饰。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群从干细胞产生。在某些实施方案中，所述干细胞是全能干细胞或多能干细胞。在某些实施方案中，所述多能干细胞选自胚胎干细胞、单倍体干细胞、诱导多能干细胞、或成体干细胞。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群从胚胎干细胞或诱导多能干细胞产生。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群在体外产生。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群还具有以下特征：

(1)包含≥80％(例如≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的细胞表达CD105、CD73、CD90、CD13、CD29、CD44、CD166和HLA-ABC中的一种或多种；

(2)包含≤2％(例如≤1％、≤0.5％、≤0.2％、≤0.1％或≤0.01％)的细胞表达CXCL1、CD34、CD45、CD133、FGFR2、CD271、Stro-1和CXCR4中的一种或多种。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群还具有以下特征中的一项或多项：

(3)存在表达CD274的细胞；

(4)存在表达CD24的细胞；

(5)存在表达CD31的细胞。

在某些实施方案中，所述CD274+细胞的比例不低于80％，例如为80％-95％，例如约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、或约95％。

在某些实施方案中，所述CD24+细胞的比例不低于50％，例如为50％-70％，例如约50％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％或约70％。

在某些实施方案中，所述CD31+细胞的比例不低于5％，例如为5％-20％，例如约5％、约10％、约12％、约15％、约18％、或约20％。

本发明的间充质干细胞群可以作为药物组合物被配制和施用。这样的药物组合物可以是医学领域已知的任何形式，优选为注射剂(包括注射液、冻干粉剂)。在某些实施方案中，该药物组合物包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。关于该药物组合物的配制的一般原则可参考由G.Morstyn和W.Sheridan编著的《细胞疗法：干细胞移植，基因疗法和细胞免疫疗法(Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and Cellular Immunotherapy)》，剑桥大学出版社，1996；和《造血干细胞疗法(Hematopoietic Stem Cell Therapy)》,E.D.Ball,J.Lister&P.Law,Churchill Livingstone,2000。

间充质干细胞群的制备方法

在第二方面，本发明提供了一种产生间充质干细胞群的方法，或者产生第一方面所述的间充质干细胞群的方法，其包括以下步骤：

(1)使用第一培养基培养干细胞以形成胚状体；其中，所述第一培养基是添加以下物质的基础培养基：一种或多种血清替代物、一种或多种非必需氨基酸、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、以及bFGF；

(2)使用第二培养基培养所述胚状体以诱导其分化为间充质干细胞；其中，所述第二培养基是添加以下物质的基础培养基：一种或多种血清替代物、一种或多种非必需氨基酸、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、以及一种或多种生长因子。

在某些实施方案中，步骤(2)包括：使所述胚状体附着于培养容器并使用第二培养基进行培养。

在本文中，术语“基础培养基”是指能够支持细胞生长的任何培养基，通常包含无机盐、维生素、葡萄糖、缓冲体系和必需氨基酸，并且通常具有约280-330mOsmol的渗透压。

在某些实施方案中，步骤(1)中所述的干细胞是全能干细胞或多能干细胞。在某些实施方案中，所述多能干细胞选自胚胎干细胞、单倍体干细胞、诱导多能干细胞、或成体干细胞。

在某些实施方案中，所述第一培养基具备以下特征中的一项或多项：

(i)所述一种或多种血清替代物的总含量为3-30％(v/v)，例如约3％(v/v)、约5％(v/v)、约8％(v/v)、约10％(v/v)、约12％(v/v)、约15％(v/v)、约18％(v/v)、约20％(v/v)、约22％(v/v)、约25％(v/v)、约28％(v/v)或约30％(v/v)；

(ii)所述一种或多种非必需氨基酸各自的含量分别为0.1-0.5mM，例如约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM或约0.5mM；

(iii)谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽的含量为1-5mM，例如约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、或约5mM；

(iv)bFGF的含量为1-100ng/mL，例如2-100ng/mL，2-50ng/mL，5-100ng/mL，5-50ng/mL，或5-20ng/mL；例如约1ng/mL，约2ng/mL，约3ng/mL，约5ng/mL，约8ng/mL，约10ng/mL，约15ng/mL，约20ng/mL，约25ng/mL，约30ng/mL，约35ng/mL，约40ng/mL，约45ng/mL，约50ng/mL，约55ng/mL，约60ng/mL，约65ng/mL，约70ng/mL，约75ng/mL，约80ng/mL、约85ng/mL，约90ng/mL，约95ng/mL，或约100ng/mL。

(a)所述血清替代物选自KOSR、MSC无血清添加剂、Ultroser ^TM G及其任意组合；优选地，所述血清替代物是KnockOut ^TM SR(例如，Thermo：货号10828028)(以下简称为KOSR)；

(b)所述非必需氨基酸选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸及其组合；

(c)所述基础培养基选自KnockOut ^TM DMEM(例如，Gibco：货号10829018)(以下简称为KO-DMEM)、KnockOut ^TM DMEM/F-12(例如，Gibco：货号12660-012)(以下简称为KO-DMEM/F12)、DMEM、α-MEM、F-12、MEM、BME、RPMI 1640、G-MEM及其任意组合；优选地，所述基础培养基选自KO-DMEM、KO-DMEM/F12、DMEM、DMEM/F12；优选地，所述基础培养基是KO-DMEM。

在某些实施方案中，所述第一培养基包括：KO-DMEM、KOSR、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、和bFGF。在某些实施方案中，所述第一培养基包含：3-30％(v/v)的KOSR、1-5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、1-100ng/mL的bFGF、以及浓度各自为0.1-0.5mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第一培养基进一步包含β-巯基乙醇。在某些实施方案中，β-巯基乙醇的含量为0.1-0.5％(v/v)，例如约0.1％(v/v)、约0.2％(v/v)、约0.3％(v/v)、约0.4％(v/v)或约0.5％(v/v)。

在某些实施方案中，所述第一培养基基本由以下成分组成：KO-DMEM、KOSR、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、bFGF和β-巯基乙醇。

在某些实施方案中，所述第一培养基包含：3-30％(v/v)的KOSR、1-5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、1-100ng/mL的bFGF、0.1-0.5％(v/v)的β-巯基乙醇、以及浓度各自为0.1-0.5mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第一培养基包含：约15％(v/v)的KOSR、约1mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约8ng/mL的bFGF、约0.1％(v/v)的β-巯基乙醇、以及浓度各自为约0.1mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第一培养基包含：约18％(v/v)的KOSR、约1mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约12ng/mL的bFGF、约0.1％(v/v)的β-巯基乙醇、以及浓度各自为约0.1mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第一培养基包含：约20％(v/v)的KOSR、约2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约10ng/mL的bFGF、约0.1％(v/v)的β-巯基乙醇、以及浓度各自为约0.1mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第一培养基包含：约22％(v/v)的KOSR、约2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约12ng/mL的bFGF、约0.2％(v/v)的β-巯基乙醇、以及浓度各自为约0.1mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第一培养基包含：约22％(v/v)的KOSR、约2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约12ng/mL的bFGF、约0.1％(v/v)的β-巯基乙醇、以及浓度各自为约0.2mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些示例性实施方案中，所述第一培养基基本由以下成分组成：KO-DMEM(Gibco：货号10829018)、KOSR(Thermo：货号10828028)、NEAA(Gibco：货号11140050)、GlutaMAX(Gibco：货号A1286001)、bFGF和β-巯基乙醇。

在某些示例性实施方案中，所述第一培养基包含：18-22％(v/v)的KOSR、0.5-1.5％(v/v)的GlutaMAX、1-100ng/mL的bFGF、0.1-0.5％(v/v)的β-巯基乙醇、以及1-2％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第一培养基包含：约15％(v/v)的KOSR、约0.5％(v/v)的GlutaMAX、约8ng/mL的bFGF、约0.1％(v/v)的β-巯基乙醇、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第一培养基包含：约18％(v/v)的KOSR、约0.5％(v/v)的GlutaMAX、约12ng/mL的bFGF、约0.1％(v/v)的β-巯基乙醇、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第一培养基包含：约20％(v/v)的KOSR、约1％(v/v)的GlutaMAX、约10ng/mL的bFGF、约0.1％(v/v)的β-巯基乙醇、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第一培养基包含：约22％(v/v)的KOSR、约1％(v/v)的GlutaMAX、约12ng/mL的bFGF、约0.2％(v/v)的β-巯基乙醇、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第一培养基包含：约22％(v/v)的KOSR、约1％(v/v)的GlutaMAX、约12ng/mL的bFGF、约0.1％(v/v)的β-巯基乙醇、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些实施方案中，所述第二培养基具备以下特征中的一项或多项：

(i)所述一种或多种血清替代物的总含量为1-40％(v/v)，例如，1-35％(v/v)，1-30％(v/v)，2-30％(v/v)，5-30％(v/v)，1-20％(v/v)，2-20％(v/v)，5-20％(v/v)，1-10％(v/v)，2-10％(v/v)，或5-10％(v/v)；例如约1％(v/v)、约2％(v/v)、约3％(v/v)、约5％(v/v)、约8％(v/v)、约10％(v/v)、约12％(v/v)、约15％(v/v)、约18％(v/v)、约20％(v/v)、约22％(v/v)、约25％(v/v)、约28％(v/v)、或约30％(v/v)；

(ii)所述一种或多种非必需氨基酸各自的含量分别为0.1-0.5mM，例如0.1-0.2mM，例如约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM或约0.5mM；

(iii)谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽的含量为1-5mM，例如1-3mM，例如约1mM、约2mM、约3mM、约4mM或约5mM；

(iv)所述一种或多种生长因子各自的含量为1-100ng/mL，例如约1ng/mL，约2ng/mL，约3ng/mL，约5ng/mL，约8ng/mL，约10ng/mL，约15ng/mL，约20ng/mL，约25ng/mL，约30ng/mL，约35ng/mL，约40ng/mL，约45ng/mL，约50ng/mL，约55ng/mL，约60ng/mL，约65ng/mL，约70ng/mL，约75ng/mL，约80ng/mL、约85ng/mL，约90ng/mL，约95ng/mL，或约100ng/mL。

(a)所述血清替代物选自KOSR、MSC无血清添加剂、Ultroser ^TM G及其任意组合；

(b)所述非必需氨基酸选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、 L-脯氨酸、L-丝氨酸及其组合；

(c)所述基础培养基选自KO-DMEM、KO-DMEM/F12、α-MEM、DMEM、F12、MEM、BME、RPMI 1640、G-MEM及其任意组合；优选地，所述基础培养基选自KO-DMEM、KO-DMEM/F12、α-MEM、DMEM、DMEM/F12。

在某些实施方案中，所述血清替代物是KOSR、以及选自MSC无血清添加剂(例如，TBD：货号SC2013-G-B)和Ultroser ^TM G(例如，PALL：货号15950-017)(以下简称为Ultroser G)中的一种。在某些实施方案中，KOSR与MSC无血清添加剂或Ultroser G的体积比为2：1～150：1，例如约2：1、约3：1、约4：1、约5：1、约6：1、约7：1、约8：1、约9：1、约10：1、约20：1、约50：1、约80：1、约100：1、约120：1、或约150：1。在某些实施方案中，KOSR与MSC无血清添加剂或Ultroser G的体积比为10：1～1：2，例如约10：1、约9：1、约8：1、约7：1、约6：1、约5：1、约4：1、约3：1、约2：1、约1：1或约1：2。

在某些实施方案中，KOSR的含量为约1-30％(v/v)，约1-20％(v/v)，约1-10％(v/v)，约2-10％(v/v)，或约5-10％(v/v)。在某些实施方案中，MSC无血清添加剂或Ultroser G的含量为约1-10％(v/v)，或约1-5％(v/v)。

在某些实施方案中，所述第二培养基包含：KO-DMEM/F12、α-MEM、MSC无血清添加剂或Ultroser G、KOSR、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)。在某些实施方案中，所述第二培养基包含：1-10％(v/v)的Ultroser G、1-20％(v/v)的KOSR、1-5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、浓度各自为1-100ng/mL的的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)，以及浓度各自为0.1-0.5mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第二培养基进一步包含抗坏血酸。在某些实施方案中，抗坏血酸的含量为1-100μg/mL，例如1-100μg/mL，1-50μg/mL，1-20μg/mL或5-20μg/mL；例如约1μg/mL、约10μg/mL、约100μg/mL、约500μg/mL或约1000μg/mL。

在某些实施方案中，所述第二培养基基本由以下成分组成：KO-DMEM/F12、α-MEM、MSC无血清添加剂或Ultroser G、KOSR、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、 L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、抗坏血酸、以及一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)。

在某些实施方案中，所述第二培养基包含：1-5％(v/v)(例如约1％(v/v)、约2％(v/v)、约3％(v/v)、约4％(v/v)或约5％(v/v))的Ultroser G、2-20％(v/v)(例如约2％(v/v)、约4％(v/v)、约6％(v/v)、约8％(v/v)、约10％(v/v)、约12％(v/v)、约14％(v/v)、约16％(v/v)、约18％(v/v)或约20％(v/v))的KOSR、1-5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、1-1000μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为1-100ng/mL的的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及浓度各自为0.1-0.5mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第二培养基包含：约1％(v/v)的Ultroser G、约4％(v/v)的KOSR、约2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-100ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及浓度各自为约0.1mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第二培养基包含：约1％(v/v)的Ultroser G、约6％(v/v)的KOSR、约2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-100ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及浓度各自为约0.1mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第二培养基包含：约1％(v/v)的Ultroser G、约8％(v/v)的KOSR、约2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-100ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及浓度各自为约0.1mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第二培养基包含：约2％(v/v)的Ultroser G、约4％(v/v)的KOSR、约1mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-100ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及浓度各自为约0.1mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第二培养基包含：约2％(v/v)的Ultroser G、约6％(v/v)的KOSR、约1mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-100ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及浓度各自为约0.1mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些实施方案中，所述第二培养基包含：约2％(v/v)的Ultroser G、约8％(v/v)的KOSR、约1mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-100ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及浓度各自为约0.1mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

在某些示例性实施方案中，所述第二培养基基本由以下成分组成：KO-DMEM/F12(Gibco：货号12660-012)、α-MEM(HyClone：货号SH30265.01B)、Ultroser G(PALL：货号15950-017)、KOSR(Thermo：货号10828028)、NEAA(Gibco：货号11140050)、GlutaMAX(Gibco：货号A1286001)、抗坏血酸、一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)。

在某些示例性实施方案中，所述第二培养基包含：1-2％(v/v)的Ultroser G、4-6％(v/v)的KOSR、0.5-1.5％(v/v)的GlutaMAX、1-1000μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-100ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及1-2％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第二培养基包含：约1％(v/v)的Ultroser G、约4％(v/v)的KOSR、约1％(v/v)的GlutaMAX、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-10ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第二培养基包含：约1％(v/v)的Ultroser G、约6％(v/v)的KOSR、约1％(v/v)的GlutaMAX、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-10ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第二培养基包含：约1％(v/v)的Ultroser G、约8％(v/v)的KOSR、约1％(v/v)的GlutaMAX、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-10ng/mL 的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第二培养基包含：约2％(v/v)的Ultroser G、约4％(v/v)的KOSR、约0.5％(v/v)的GlutaMAX、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-10ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第二培养基包含：约2％(v/v)的Ultroser G、约6％(v/v)的KOSR、约0.5％(v/v)的GlutaMAX、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-10ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些示例性实施方案中，所述第二培养基包含：约2％(v/v)的Ultroser G、约8％(v/v)的KOSR、约0.5％(v/v)的GlutaMAX、约100μg/mL的抗坏血酸、浓度各自为约1-10ng/mL的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)、以及约1％(v/v)的NEAA。

在某些实施方案中，所述第一培养基及第二培养基所包含的组分均为细胞治疗级(CTS级)。在某些实施方案中，所述第一培养基及第二培养基所包含的基础培养基(如KO-DMEM)、血清替代物(如KOSR)、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽均为细胞治疗级(CTS级)。

在某些实施方案中，所述步骤(1)包括在低吸附细胞培养皿中培养所述多能干细胞。

在本文中，术语“低吸附细胞培养皿”是指，表面具有涂层的培养皿，该涂层可以阻止蛋白质在培养皿表面吸附，从而尽可能减少了单层细胞与培养容器的粘附。此类细胞培养皿是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，Corning的低贴附培养皿(货号3262)。

在某些实施方案中，所述步骤(1)中培养的持续时间是3-14天，例如约3天、约4天、约5天、约7天、约10天、或约14天。

在某些实施方案中，所述步骤(1)中培养的持续时间是4-7天，例如约5天。

在某些实施方案中，所述步骤(2)包括以约1个胚状体/cm ²的密度将步骤(1)的胚状体接种于所述培养容器。

在某些实施方案中，所述步骤(2)包括在包被有明胶、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、玻连蛋白、纤维黏连蛋白或多聚赖氨酸的培养皿中培养所述胚状体。

在某些实施方案中，所述步骤(2)包括在包被有玻连蛋白的培养皿中培养所述胚状体。

在某些实施方案中，所述步骤(2)中培养的持续时间是10-21天，例如约10天、约14天、或约21天。

在某些实施方案中，所述步骤(2)中培养的持续时间是10-14天，例如约14天。

在某些实施方案中，所述步骤(2)包括每天或每隔1-7天(例如，每隔1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天)更换新鲜的第二培养基。在某些实施方案中，所述步骤(2)包括每天或每隔1-7天(例如，每隔1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天)弃去消耗的培养基(the spent media)并更换新鲜的第二培养基。

在某些实施方案中，在步骤(1)-(2)中，所述培养条件为37℃、5％CO ₂。在某些实施方案中，在步骤(1)-(2)中，在37℃、5％CO ₂的培养箱中进行培养。

在某些实施方案中，所述步骤(2)中附着于培养容器的细胞即为P0代的间充质干细胞。在某些实施方案中，当步骤(2)中所述的附着于培养容器的细胞的汇合度不低于约80％(例如不低于约85％，不低于约90％，或不低于约95％)时，可以将该细胞与培养容器分离，从而获得P0代的间充质干细胞。

因此，在某些实施方案中，所述方法还包括：(3)分离步骤(2)中附着于培养容器的细胞，从而获得间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述方法还包括对步骤(3)的间充质干细胞进行传代。

在某些实施方案中，当细胞汇合度大于或等于约80％(例如，大于或等于约85％，大于或等于约90％，或大于或等于约95％)时，对所述细胞进行传代。

在某些实施方案中，对所述间充质干细胞传代1代、2代、3代、4代或5代。

对细胞进行传代的方法是本领域技术人员熟知的。例如，该方法可以包括：将细胞与培养容器分离并将细胞均匀分散于培养基中，然后接种于培养容器中。加入适量培养基，根据细胞生长状态每隔一段时间(例如每1～5天)更换适量新鲜的培养基，待细胞长至70～100％汇合时，重复传代操作。细胞每次进行传代操作，代数增加1。

在某些实施方案中，所述传代包括以约5×10 ³-5×10 ⁴/cm ²(例如，约5×10 ³/cm ²、约1×10 ⁴/cm ²、约2×10 ⁴/cm ²、约3×10 ⁴/cm ²、约4×10 ⁴/cm ²、或约5×10 ⁴/cm ²)的细胞密度进行传代。

在某些实施方案中，所述传代包括将细胞接种于所述第二培养基进行培养。

在某些实施方案中，所述分离包括通过以下方法破坏所述间充质干细胞与该培养容器的附着：(i)使培养物与选自下列的一种或多种酶接触：胰蛋白酶或其类似物、胶原酶、分散酶、木瓜蛋白酶、胶原酶与分散酶的混合物、以及胶原酶与胰蛋白酶或其类似物的混合物；(ii)使用细胞刮等进行机械分离；或，(iii)使该培养物与EDTA或EGTA相接触。

在某些实施方案中，所述分离包括通过酶消化破坏所述间充质干细胞与该培养容器的附着。

在某些实施方案中，所述酶为胰蛋白酶(例如，Gibco：货号25200072)。

任选地，在培养获得脐带间充质干细胞之后，可以通过MTT法、WST法、DNA含量检测法、ATP检测法等测定细胞生长曲线，以评估脐带间充质干细胞的生长活性。另外，可通过流式细胞术检测细胞表面标志物、三向分化测定以及PCR法检测细胞表达基因来鉴定所分离培养的脐带间充质干细胞。

在步骤(1)之前，可以使用本领域已知的任何培养方法来繁殖和维持干细胞(例如全能干细胞或多能干细胞，例如胚胎干细胞、单倍体干细胞、诱导多能干细胞、或成体干细胞)。例如，胚胎干细胞可以在饲养细胞如鼠细胞(例如，鼠胚胎成纤维细胞(MEF))、人饲养细胞(例如，成人皮肤细胞、新生儿真皮成纤维细胞(HNDF)等)存在下进行培养。例如，胚胎干细胞可以在无异源物质的培养物中，和/或在无饲养条件下进行培养。参见克利曼斯基(Klimanskaya)等人，柳叶刀(Lancet.)，2005年5月7-13；365(9471):1636-41；理查德(Richards)等人，干细胞学杂志(Stem Cells.)2003；21(5):546-56；美国专利号7,410,798；伊利克(Ilic)等人，干细胞发育(Stem Cells Dev.)，2009年11月；18(9):1343-5；徐(Xu)等人，自然生物技术(Nat Biotechnol.)2001年10月；19(10):971-4，每个参考文献通过引用以其全部内容结合在此。例如，胚胎干细胞可以在一种基质上培养，该基质可以选自：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VIII、硫酸乙酰肝素、Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)、CellStart、人基底膜提取物、以及其任何组合。

在第三方面，本发明还涉及由第二方面所述的方法产生的间充质干细胞群。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群如第一方面定义。

试剂盒

在第四方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含分开提供的第一培养基和第二培养基，其中，

所述第一培养基是添加以下物质的基础培养基：一种或多种血清替代物、一种或多种非必需氨基酸、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、和bFGF；

所述第二培养基是添加以下物质的基础培养基：一种或多种血清替代物、一种或多种非必需氨基酸、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、以及一种或多种生长因子。

在某些实施方案中，所述第一培养基和第二培养基如第二方面的任一实施方案中定义。

培养物及培养上清

在第五方面，本发明提供了一种培养物，其包含第一方面或第三方面所述的间充质干细胞群，以及培养基。

所述培养基是可用于干细胞培养的任何培养基，例如KO-DMEM、KO-DMEM/F12(KO-DMEM与F-12的等量混合液)、α-MEM、DMEM/F-12(DMEM与F-12的等量混合液)、DMEM、IMDM、F-12、RPMI1640，以及上述任一项组合形成的混合培养基。上述培养基任选地进一步包含补充物质，例如血清(例如，胎牛血清、人血清、羊血清等)、血清替代物(例如，KOSR等)、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、维生素、矿物质。

在某些实施方案中，所述培养基是第二方面任一实施方案中所定义的第二培养基。

本发明的培养物可以作为药物组合物被配制和施用。这样的药物组合物可以是医学领域已知的任何形式，优选为注射剂(包括注射液、冻干粉剂)。在某些优选的实施方案中，该药物组合物包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。关于该药物组合物的配制的一般原则可参考由G.Morstyn和W.Sheridan编著的《细胞疗法：干细胞移植，基因疗法和细胞免疫疗法(Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and Cellular Immunotherapy)》，剑桥大学出版社，1996；和《造血干细胞疗法(Hematopoietic Stem Cell Therapy)》,E.D.Ball,J.Lister&P.Law,Churchill Livingstone,2000。

在第六方面，本发明提供了一种培养上清，其为第五方面所述的培养物的上清液；或者，为在培养基中培养第一方面或第三方面所述的间充质干细胞群所产生的培养上清。

在某些实施方案中，所述培养上清不含所述间充质干细胞群。

本发明的培养上清可以作为药物组合物被配制和施用。这样的药物组合物可以是医学领域已知的任何形式，例如片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。

在第七方面，本发明还涉及制备如本文所述的培养上清的方法，其包括以下步骤：

(1)对第一方面或第三方面所述的间充质干细胞群进行培养；和

(2)回收步骤(1)获得的培养物的上清液(即，培养上清)。

在某些实施方案中，所述方法还包括：(3)对步骤(2)获得的上清液进行处理，所述处理选自离心、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、保存，及其任意组合。

在本发明中，可以使用本领域已知的任何可用于干细胞培养的培养基以及培养条件对本发明的间充质干细胞群进行培养。在某些实施方案中，在步骤(1)中使用第二方面任一实施方案中定义的第二培养基对所述间充质干细胞群进行培养。

在某些实施方案中，本发明的培养上清不含血清，以提高安全性。因此，在某些示例性实施方案中，在步骤(1)中，可以使用不含血清的培养基(例如，基础培养基或无血清培养基)对所述间充质干细胞群进行培养，从而获得不含血清的培养上清。在此类实施方案中，可以在整个培养过程中、或在最后或最后几次的传代培养中使用所述不含血清的培养基进行培养。在某些示例性实施方案中，可以对步骤(2)获得的培养上清进行透析或溶剂置换，从而去除血清，由此也可得到不含血清的培养上清。

微载体和冻存方法

在第八方面，本发明还涉及培养第一方面或第三方面所述的间充质干细胞群的方法，其包括使用微载体。在某些实施方案中，所述的微载体包括载体片(如TableTrix)、载体球(如CultiSpher,Coring,Cytodex1、2、3,Solohill,Cytopore,Cytoline)等，亦或是液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。

在某些实施方案中，本发明所述的微载体能够提高所述间充质干细胞群冻存后的存活率。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和/或培养于微载体上间充质干细胞群在冻存至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、1个月、2个月、3个月、半年、一年后，能够在37℃±3℃、37℃±2℃、或37℃±1℃范围内恢复至少50％、60％、70％、80％、90％的存活率。

在某些实施方案中，所述微载体包含选自下列的物质、由选自下列的物质组成、或基本上由选自下列的物质组成：蛋白质、纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、玻璃、葡聚糖、二乙氨基乙醇(DEAE)-葡聚糖、胶原、胶原-gylcose-氨基聚糖、明胶、丙烯酰胺(例如聚丙烯酰胺)、及其任意组合。

在某些实施方案中，所述微载体不具有基质涂层。在某些实施方案中，所述微载体的表面涂覆有基质。

在某些实施方案中，所述基质包括细胞外基质。在某些实施方案中，所述基质包括Matrigel ^TM(BD Biosciences)、透明质酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素中的一种或多种。

在某些实施方案中，所述微载体是无孔微载体。在某些实施方案中，所述微载体是多孔微载体。

在某些实施方案中，所述微载体培养在静态培养条件下进行。

在某些实施方案中，所述微载体培养在动态培养条件下进行。

在某些实施方案中，所述培养方法包括：在培养基中对所述间充质干细胞群进行微载体培养，所述生长培养基是包含以下物质的基础培养基：一种或多种血清替代物、一种或多种非必需氨基酸、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、以及一种或多种生长因子。在某些实施方案中，所述生长培养基如第二方面任一实施方案中所述的第二培养基定义。

药物组合物

在第九方面，本发明提供了一种药物组合物，其至少包含选自下列中的一种或几种：第一方面或第三方面所述的间充质干细胞群、第五方面所述的培养物、第六方面所述的培养上清。在某些实施方案中，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂、或其它可能需要的辅料。

在本文中，术语“辅料”是指药物制剂在制备或调配过程中所必需的、除主药以外的物质。一般要求这些物质无生理活性，不影响药物制剂中药物疗效、含量测定和稳定性。加入辅料的主要目的是方便制剂的制备和临床应用。优选地，用于本发明的药物组合物中的辅料是药用的并且还与活性成分兼容。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的所述间充质干细胞群和/或培养物和/或治疗有效量的如本文所述的培养上清。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的生物材料，包括但不限于胶原(例如胶原凝胶、胶原支架、明胶微载体)、明胶(例如明胶凝胶、明胶电纺丝、明胶支架、明胶微载体等)、氨基化明胶(例如氨基化明胶凝胶、氨基化明胶电纺丝、氨基化明胶支架、氨基化明胶微载体等)、壳聚糖(例如壳聚糖凝胶、壳聚糖支架等)、脱细胞支架(例如子宫脱细胞支架、心脏脱细胞支架等)、皮肤修复膜、骨修复膜、口腔修复膜、纤维素、纤维蛋白、聚乳酸、纤维素聚乳酸、聚氨酯、弹性蛋白原、透明质酸、海藻酸钠、聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚乳酸羟基乙酸、聚ε-己内酯、硅酸盐、硅橡胶、细胞外基质或其任何组合等。在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物为注射剂(包括注射液、冻干粉剂)或气雾剂。

在某些实施方案中，所述药物组合为喷射剂，能用于皮肤表面修复或移植等。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以以悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物的形式进行移植。

关于包含本发明的间充质干细胞群的药物组合物的配制的一般原则可参考由G.Morstyn和W.Sheridan编著的《细胞疗法：干细胞移植，基因疗法和细胞免疫疗法(Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and Cellular Immunotherapy)》，剑桥大学出版社，1996；和《造血干细胞疗法(Hematopoietic Stem Cell Therapy)》,E.D.Ball,J.Lister&P.Law,Churchill Livingstone,2000。在某些实施方案中，所述药物组合物包含注射液(包括生理盐水、乳酸钠林格液、复方电解质注射液、5％葡萄糖注射液、20％HSA注射液、琥珀酰明胶注射液、琥珀酰明胶MIX注射液、MZJ注射液1、MZJ注射液2、MZJ注射液3、人血清蛋白注射液、勃脉力A、氯化钾注射液、硫酸镁注射液、碳酸氢钠注射液、葡萄糖氯化钠注射液、复方氯化钠注射液(林格氏液)、右旋糖酐20葡萄糖注射液(小分子)、氨基酸注射液、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、注射用低分子量肝素钙、肝素钠注射液、注射用辅酶A、三磷酸胞苷二钠、注射用盐酸赖氨酸、维生素C注射液、胞磷胆碱氯化钠、注射用脂溶性维生素Ⅱ、注射用还原型谷胱甘肽、注射用脑蛋白水解物、脱氧核苷酸钠注射液、多种微量元素注射液Ⅱ、甘露醇注射液、盐酸精氨酸注射液、氯化钾注射液、注射用三磷酸胞苷二钠、注射用门冬氨酸鸟氨酸等)，以及包含如下材料中的一种或多种混合物：丙二醇、碳酸氢钠、胆固醇、肝素、FBS、培养基、二甲基亚砜、甘油磷酸钠溶液、羟乙基淀粉、甘露醇溶液、乙二醇、聚乙烯醇、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、人脐带间充质干细胞来源的外泌体溶液、人脐带间充质干细胞来源的短肽或多肽类化合物溶液、乳酸钠、甘露醇、右旋糖酐、氯化钾、氯化钙、氮酮、低分子右旋糖酐。在某些实施方案中，所述药物组合的注射液非冻存或冻存后细胞能够在14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天内，在4℃左右保持所述药物组合物至少50％、60％、70％、80％、90％的存活率。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的生物材料(例如但不限于胶原支架、皮肤修复膜、氨基化明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纤维素聚乳酸、弹性蛋白原、透明质酸。)

在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。

在某些实施方案中，所述药物组合物为注射剂，例如溶液型注射剂。

在某些实施方案中，所述注射剂中含有一种或多种注射剂附加剂，例如选自增溶剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、助悬剂、螯合剂、抗氧剂、抑菌剂、局麻剂、等渗调节剂、填充剂、保护剂及其任意组合。

在某些实施方案中，所述注射剂中含有等渗或高渗溶液；优选地，所述溶液选自NaCl注射液(例如0.9％～2.7％NaCl注射液)、葡萄糖注射液(例如4％～5％葡萄糖注射液)、乳酸钠林格注射液、复方电解质注射液、HSA注射液(例如10％～20％HSA注射液)、琥珀酰明胶注射液(例如4％～5％琥珀酰明胶注射液)及其任意组合。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞的给药剂量不少于1×10 ⁴个/mL(例如不少于1×10 ⁴个/ml，不少于3×10 ⁴个/ml，不少于5×10 ⁴个/ml，不少于7×10 ⁴个/ml，不少于1×10 ⁵个/ml，不少于3×10 ⁵个/ml，不少于5×10 ⁵个/ml，不少于7×10 ⁵个/ml，不少于1×10 ⁶个/ml，不少于3×10 ⁶个/ml，不少于5×10 ⁶个/ml，不少于7×10 ⁶个/ml，不少于1×10 ⁷个/ml，不少于3×10 ⁷个/ml，不少于5×10 ⁷个/ml，不少于7×10 ⁷个/ml，不少于1×10 ⁸ 个/ml，不少于3×10 ⁸个/ml，不少于5×10 ⁸个/ml，不少于7×10 ⁸个/ml，不少于1×10 ⁹个/ml，不少于3×10 ⁹个/ml，不少于5×10 ⁹个/ml，不少于7×10 ⁹个/ml，不少于1×10 ¹⁰个/ml，不少于3×10 ¹⁰个/ml，不少于5×10 ¹⁰个/ml或不少于7×10 ¹⁰个/ml，又例如1×10 ⁵-1×10 ⁸、7×10 ⁵-7×10 ⁶、1×10 ⁶-5×10 ⁶个，优选1×10 ⁶、3×10 ⁶、5×10 ⁶个/mL，更优选3×10 ⁶个/mL)。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞的给药剂量不少于1×10 ³个/kg(例如不少于1×10 ³个/kg，不少于3×10 ³个/kg，不少于5×10 ³个/kg，不少于7×10 ³个/kg，不少于1×10 ⁴个/kg，不少于3×10 ⁴个/kg，不少于5×10 ⁴个/kg，不少于7×10 ⁴个/kg，不少于1×10 ⁵个/kg，不少于3×10 ⁵个/kg，不少于5×10 ⁵个/kg，不少于7×10 ⁵个/kg，不少于1×10 ⁶个/kg，不少于3×10 ⁶个/kg，不少于5×10 ⁶个/kg，不少于7×10 ⁶个/kg，不少于1×10 ⁷个/kg，不少于3×10 ⁷个/kg，不少于5×10 ⁷个/kg，不少于7×10 ⁷个/kg，不少于1×10 ⁸个/kg，不少于3×10 ⁸个/kg，不少于5×10 ⁸个/kg，不少于7×10 ⁸个/kg，不少于1×10 ⁹个/kg，不少于3×10 ⁹个/kg，不少于5×10 ⁹个/kg，不少于7×10 ⁹个/kg，不少于1×10 ¹⁰个/kg，不少于3×10 ¹⁰个/kg，不少于5×10 ¹⁰个/kg或不少于7×10 ¹⁰个/kg，又例如1×10 ⁵-1×10 ⁸、7×10 ⁵-7×10 ⁶、1×10 ⁶-5×10 ⁶个，优选1×10 ⁶、3×10 ⁶、5×10 ⁶个/kg，更优选3×10 ⁶个/kg)。

在某些实施方案中，给药剂量为不少于1×10 ⁴个/次(例如不少于1×10 ⁴个/次，不少于3×10 ⁴个/次，不少于5×10 ⁴个/次，不少于7×10 ⁴个/次，不少于1×10 ⁵个/次，不少于3×10 ⁵个/次，不少于5×10 ⁵个/次，不少于7×10 ⁵个/次，不少于1×10 ⁶个/次，不少于3×10 ⁶个/次，不少于5×10 ⁶个/次，不少于7×10 ⁶个/次，不少于1×10 ⁷个/次，不少于3×10 ⁷个/次，不少于5×10 ⁷个/次，不少于7×10 ⁷个/次，不少于1×10 ⁸个/次，不少于3×10 ⁸个/次，不少于5×10 ⁸个/次，不少于7×10 ⁸个/次，不少于1×10 ⁹个/次，不少于3×10 ⁹个/次，不少于5×10 ⁹个/次，不少于7×10 ⁹个/次，不少于1×10 ¹⁰个/次，不少于3×10 ¹⁰个/次，不少于5×10 ¹⁰个/次或不少于7×10 ¹⁰个/次)，优选为3～6×10 ⁶个/次。

在某些实施方案中，所述注射剂中还含有下述功能性成分：

(1)维持所述间充质干细胞活性的成分；

(2)促进所述间充质干细胞增殖的成分；和/或，

(3)促进所述间充质干细胞分化的成分。

在某些实施方案中，所述功能性成分选自血清替代物、非必需氨基酸、谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、生长因子及其任意组合。

在某些实施方案中，所述功能性成分选自KOSR、MSC无血清添加剂、Ultroser ^TM G、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF及其任意组合。

生物支架

在一个方面，本发明提供一种制品，其包含间充质干细胞群和生物支架，所述间充质干细胞群的平均MMP1表达水平是原代间充质干细胞的至少约10倍；和/或，所述间充质干细胞群的平均PGE2表达水平是原代间充质干细胞的至少约10倍。

在另一个方面，本发明提供一种制品，其包含间充质干细胞群和生物支架，所述间充质干细胞群的平均MMP1表达水平是原代间充质干细胞的至少约10倍；任选地，所述间充质干细胞群的平均PGE2表达水平是原代间充质干细胞的至少约10倍。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群是在体外产生的。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群如前面所定义或描述。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群部分或全部负载于所述生物支架上。

在某些实施方案中，用于制备所述生物支架的材料是可降解的或不可降解的。

在某些实施方案中，用于制备所述生物支架的材料是天然存在的，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。

在某些实施方案中，所述天然存在的材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、丝蛋白、纤维素、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠)、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、琼脂糖、明胶、葡聚糖、细胞外基质、硅酸盐或其任何组合。

在某些实施方案中，所述人工合成的材料选自聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚赖氨酸)，聚氨酯，聚环氧乙烷，聚乙二醇，聚乳酸羟基乙酸，硅橡胶，脱细胞支架或者其任何组合。

在某些实施方案中，所述经过改性的材料选自经过改性的海藻酸盐、经过改性的明胶或其组合，优选地，所述经过改性的海藻酸盐为氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)，优选地，所述经过改性的明胶为氨基化明胶。

在某些实施方案中，用于制备所述生物支架的材料选自胶原蛋白、氨基化明胶、壳聚糖或其任何组合。

在某些实施方案中，所述生物支架为固体或半固体(如凝胶)。

在某些实施方案中，所述生物支架具有层状结构(例如，单层、双层或多层，例如生物膜、皮肤修复膜)，或片状结构(例如长方形，正方形，圆形，椭圆形，六角形或不规则形状的片状结构)，或中空管状结构，或中空环状(例如圆环状)，或中空三维结构(例如中空立方体，中空球体，中空的矩形棱柱体，中空圆柱体，或中空的不规则形状的三维结构)，或实心三维结构(例如实心立方体，实心球体，实心矩形棱柱体，实心圆柱体，或实心不规则形状的三维结构)，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述生物支架模拟天然组织或器官的形状。

在某些实施方案中，所述生物支架具有片状结构、层状结构或中空环状(如圆环状)结构。

在某些实施方案中，所述生物支架选自胶原蛋白支架、皮肤修复膜、明胶支架、氨基化明胶支架、壳聚糖支架。

在某些实施方案中，所述生物支架负载有不少于1×10 ⁴个/ml(例如不少于1×10 ⁴个/ml，不少于3×10 ⁴个/ml，不少于5×10 ⁴个/ml，不少于7×10 ⁴个/ml，不少于1×10 ⁵个/ml，不少于3×10 ⁵个/ml，不少于5×10 ⁵个/ml，不少于7×10 ⁵个/ml，不少于1×10 ⁶个/ml，不少于3×10 ⁶个/ml，不少于5×10 ⁶个/ml，不少于7×10 ⁶个/ml，不少于1×10 ⁷个/ml，不少于3×10 ⁷个/ml，不少于5×10 ⁷个/ml，不少于7×10 ⁷个/ml，不少于1×10 ⁸个/ml，不少于3×10 ⁸个/ml，不少于5×10 ⁸个/ml，不少于7×10 ⁸个/ml，不少于1×10 ⁹个/ml，不少于3×10 ⁹个/ml，不少于5×10 ⁹个/ml，不少于7×10 ⁹个/ml，不少于1×10 ¹⁰个/ml，不少于3×10 ¹⁰个/ml，不少于5×10 ¹⁰个/ml或不少于7×10 ¹⁰个/ml)所述间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述制品还包含其他活性成分。

在某些实施方案中，所述其他活性成分部分或全部负载于所述生物支架上。

在某些实施方案中，所述其他活性成分选自治疗骨关节病(如半月板损伤、骨损伤)的药物、治疗心脏疾病(如心肌梗死)的药物、治疗神经系统疾病(如脊髓损伤)的药物、治疗皮肤疾病(如皮肤损伤、烧伤、烫伤)的药物、治疗眼部疾病(如角膜碱烧伤)的药物或其任何组合。

在某些实施方案中，所述治疗骨关节病的药物选自硫酸氨基葡萄糖胶囊、硫酸氨基软骨素、玻璃酸钠注射液、抗骨增生片、骨肽片、恒古骨伤愈合剂、根痛平颗粒、非甾体类消炎药(如洛索洛芬钠片、双氯芬酸钠缓释片、塞来昔布、美洛昔康、吲哚美辛片、扶他林软膏)或其任何组合。

在某些实施方案中，所述治疗心脏疾病的药物选自阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛、ACEl、ARB类、β-受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、硝酸盐类血管扩张剂、盐酸曲美他嗪、尼可地尔、利多卡因、胺碘酮、奎尼丁或其任何组合。

在某些实施方案中，所述治疗神经系统疾病的药物选自卡马西平、苯巴比妥、苯妥英钠、丙戊酸钠、氯硝西泮、拉莫三嗪、奥卡西平、多奈哌齐、美金刚、维生素B1、甲钴胺、牛痘疫苗接种家兔炎症皮肤提取物、阿替普酶、阿司匹林、氯吡格雷、低分子肝素、依达拉奉、尤瑞克林、丁苯酞、注射用丙种球蛋白、溴吡斯的明、糖皮质激素或其任何组合。

在某些实施方案中，所述治疗皮肤疾病的药物选自依巴斯汀片、氯雷他定片、西替利嗪片、糠酸莫米松软膏、卤米松软膏、莫匹罗星软膏、夫西地酸软膏、头孢克肟片、罗红霉素片、奈替芬酮康唑软膏、舍他康唑软膏、伊曲康唑片、特比萘芬片、阿昔洛韦片，伐昔洛韦片、喷昔洛韦软膏、干扰素凝胶或其任何组合。

在某些实施方案中，所述治疗眼部疾病的药物如抗菌消炎药物。

在某些实施方案中，所述制品还包含培养/分化细胞的成分。

在某些实施方案中，所述培养/分化细胞的成分选自血清替代物、非必需氨基酸、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、生长因子，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述血清替代物选自KOSR、MSC无血清添加剂、Ultroser ^TM G或其任何组合。

在某些实施方案中，所述非必需氨基酸选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸或其任何组合。

在某些实施方案中，所述生长因子选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF或其任何组合。

在另一个方面，本发明提供前述制品在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中治疗和/或预防骨关节病(如半月板损伤、骨损伤)、心脏疾病(如心肌梗死)、神经系统疾病(如脊髓损伤)、皮肤疾病(如皮肤损伤、烧伤、烫伤)、眼部疾病(如角膜碱烧伤)或其任何组合。

在某些实施方案中，所述药物用于在受试者中治疗和/或预防脊髓损伤、皮肤损伤、角膜碱烧伤或其任何组合。

在另一个方面，本发明提供一种在受试者中治疗和/或预防疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用(如植入或粘贴，优选植入)前述的制品，所述疾病选自骨关节病(如半月板损伤、骨损伤)、心脏疾病(如心肌梗死)、神经系统疾病(如脊髓损伤)、皮肤疾病(如皮肤损伤、烧伤、烫伤)、眼部疾病(如角膜碱烧伤)或其任何组合。

在某些实施方案中，所述疾病选自脊髓损伤、皮肤损伤、角膜碱烧伤或其任何组合。

用于预防和/或治疗疾病的用途

在第十方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗疾病中的用途，或者在制备用于在受试者中预防和/或治疗疾病的药物中的用途，以及一种在受试者中预防和/或治疗疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用本发明的间充质干细胞群、培养物、培养上清、或本发明的药物组合物。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述疾病选自骨关节病(例如，半月板损伤、骨关节炎、或骨损伤等)、生殖系统疾病(例如，卵巢衰老、卵巢功能不全、子宫内膜损伤、子宫创伤、宫腔粘连、或薄型子宫等)、心脏疾病(例如，心肌梗死等)、肺部疾病(例如，特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫症、尘肺、或肺炎等)、皮肤疾病(例如，银屑病、皮肤损伤、褥疮、压疮、或烧伤等)、眼部疾病(例如，角膜损伤等)、神经系统疾病(例如，脊髓损伤、脑瘫、脑中风、阿尔茨海默症、老年痴呆、或神经性疼痛等)、消化系统疾病(例如，炎症性肠炎、结肠炎、克罗恩病、或肠激综合征等)、肾脏疾病(例如，抗肾小球基底膜病、糖尿病肾病、狼疮性肾炎、或急性肾炎等)、肝脏疾病(肝损伤、肝纤维化、肝炎、肝硬化、或肝功能衰竭等)、自身免疫性疾病(例如，硬皮病、红斑狼疮、或多发性硬化等)、移植排斥(例如，移植物抗宿主病等)、代谢性疾病(例如，糖尿病等)。

在本发明中可以通过各种合适的方式，向受试者施用如本文所述的间充质干细胞群或培养物，或包含所述间充质干细胞群或培养物的药物组合物。在某些实施方案中，通过局部注射移植(例如，立体定向脑内注射移植或脊髓局部注射移植)、血液循环途径移植(例如，静脉内注射移植或动脉内注射移植)或经脑脊液途径移植(例如，腰椎穿刺蛛网膜下腔注射移植)等途径向受试者施用如本文所述的间充质干细胞群或药物组合物。本领域技术人员已知如何根据病灶的位置和性质等选择合适的细胞移植途径。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的如本文所述的培养上清。可以将本发明的培养上清，作为药物进行配制和施用。这样的药物组合物可包含治疗有效量的所述培养上清。

在本发明中可以通过各种合适的方式，向受试者施用本发明的培养上清，或包含所述培养上清的药物组合物。在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的培养上清，或包含所述培养上清的药物组合物。

女性生殖系统疾病

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻女性生殖系统疾病；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻女性生殖系统疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，所述女性生殖系统疾病包括：(1)妇科炎症，例如外阴炎、阴道炎、宫颈炎、子宫内膜炎、宫体炎，还有盆腔炎、附件炎；(2)妇科肿瘤，例如良性肿瘤和恶性肿瘤；(3)月经失调，例如痛经、月经量增多、月经量减少；(4)不孕不育，例如排卵功能障碍引起的不孕、输卵管阻塞引起的不孕、免疫性不孕。在某些实施方案中，所述女性生殖系统疾病选自卵巢衰老、卵巢功能不全、子宫内膜损伤、子宫创伤、宫腔粘连、薄型子宫。

在某些实施方案中，子宫内膜损伤主要为内膜基底层的损伤，表现为月经周期不规律，或者是整个的月经出血量少，月经出血时间缩短。一般来说，子宫内膜受到损伤多数出现在流产之后，包括人工流产或者是药物流产。而且相关的宫腔内操作，也可能会导致子宫内膜受到损伤。

在某些实施方案中，子宫内膜炎是子宫内膜的炎症。按照病程的长短，可以分为急性子宫内膜炎和慢性子宫内膜炎两种。

在某些实施方案中，“宫腔粘连”是属于女性生殖系统疾病中一类子宫疾病，是指因各种原因引起的子宫内膜损伤，包括妊娠和非妊娠子宫的创伤，导致子宫内膜基底层受损，使宫腔和(或)宫颈管部分或全部闭塞，子宫壁相互粘连，从而导致月经异常、不孕或反复流产等，多无典型症状。其本质是内膜纤维化。如：子宫内膜病变、宫腔异物、子宫内膜良性病变、子宫畸形、子宫内膜恶性病变等。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群与另外的活性成分组合施用，因此所述药物还可以包含另外的活性成分。在某些实施方案中，所述间充质干细胞与另外的治疗剂同时、分开或相继施用。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。

在某些实施方案中，所述另外的活性成分选自雌激素、抗雌激素或选择性雌激素受体调节剂、雄激素、抗雄激素或孕激素。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，并且所述单位剂量的药物中含有不少于1×10 ⁴个/ml(例如不少于1×10 ⁴个/ml，不少于3×10 ⁴个/ml，不少于5×10 ⁴个/ml，不少于7×10 ⁴个/ml，不少于1×10 ⁵个/ml，不少于3×10 ⁵个/ml，不少于5×10 ⁵个/ml，不少于7×10 ⁵个/ml，不少于1×10 ⁶个/ml，不少于3×10 ⁶个/ml，不少于5×10 ⁶个/ml，不少于7×10 ⁶个/ml，不少于1×10 ⁷个/ml，不少于3×10 ⁷个/ml，不少于5×10 ⁷个/ml，不少于7×10 ⁷个/ml，不少于1×10 ⁸个/ml，不少于3×10 ⁸个/ml，不少于5×10 ⁸个/ml，不少于7×10 ⁸个/ml，不少于1×10 ⁹个/ml，不少于3×10 ⁹个/ml，不少于5×10 ⁹个/ml，不少于7×10 ⁹个/ml，不少于1×10 ¹⁰个/ml，不少于3×10 ¹⁰个/ml，不少于5×10 ¹⁰个/ml或不少于7×10 ¹⁰个/ml)所述间充质干细胞。在某些实施方案中，所述单位剂量的药物中含有1×10 ⁴～1×10 ¹⁰个(例如1×10 ⁶～1×10 ⁸个，1×10 ⁶～1×10 ⁷个，或1×10 ⁶～5×10 ⁶个)所述间充质干细胞。

在另一方面，本发明还提供了用于一种预防、治疗、延缓和/或减轻女性生殖系统疾病的产品，其含有本发明的间充质干细胞群。在某些实施方案中，所述产品中还含有另外的活性成分，所述另外的活性成分如上文中定义。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。在某些实施方案中，所述产品为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂或胶囊剂，优选为注射剂。在某些实施方案中，所述产品为植入物。

宫腔粘连

宫腔粘连(包含由于子宫内膜损伤导致子宫内膜纤维化，宫腔部分或全部闭塞，继而引起月经过少、闭经、不孕或反复流产等)。近年来由于频繁的宫腔操作及宫腔镜手术的普及，宫腔粘连的发病率和检出率逐渐上升，而且发病年龄呈年轻化趋势，已成为女性继发不孕的第二大病因。尽管临床医生不断寻求新的治疗方案，的治愈率和妊娠率仍无明显改善，且复发率较高(轻度患者治疗后复发率为，重度患者治疗后复发率更是高达，由此引起的不孕以及反复流产、早产、前置胎盘、胎盘粘连或植入等产科并发症严重威胁着女性的生殖健康。其高发病率及其所导致的女性生育功能损害已成为临床上亟待解决的问题。目前临床上针对的治疗旨在恢复宫腔形态，防止粘连复发，促进损伤子宫内膜修复再生，恢复正常生育功能。治疗的步骤是宫腔镜下宫腔粘连分离术、术中放置宫内节育器以及术后应用雌孕激素，但存在着治疗周期长、治愈率低下、粘连易复发、妊娠率低、大剂量雌激素应用增加患者乳腺和子宫内膜肿瘤风险等问题而且严重的肌性或结缔组织性中子宫内膜基底层已被破坏，对雌孕激素反应较差。

迄今为止，国内外学者对的发病机制进行了大量研究，一致认为子宫内膜修复障碍可能是形成的主要机制。如流产后刮宫或其它宫腔操作后，由于一些病理因素，使子宫内膜修复发生障碍，结果导致瘢痕形成、粘连发生。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻宫腔粘连；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻宫腔粘连的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群能够增厚子宫内膜、增加血管、腺体和细胞、改善宫腔黏连、恢复宫腔形态和/或减少子宫积液。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群能够预防或治疗子宫黏连的症状，如降低子宫内积液增多。

在某些实施方案中，所述宫腔粘连包括不孕不育者子宫黏连或人流导致的子宫黏连等。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群能够改善子宫形态、抑制宫腔黏连。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群可以促进子宫内膜修复再生，例如损伤子宫内膜的修复再生，达到增强繁殖子代的能力。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群可以使子宫瘢痕处恢复，以预防或治疗宫腔粘连。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，通过局部注射移植(例如，立体定向脑内注射移植或脊髓局部注射移植)、血液循环途径移植(例如，静脉内注射移植或动脉内注射移植)或经脑脊液途径移植(例如，腰椎穿刺蛛网膜下腔注射移植)等途径向受试者施用如本文所述的间充质干细胞群或药物组合物。本领域技术人员已知如何根据病灶的位置和性质等选择合适的细胞移植途径。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的间充质干细胞群。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以是医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在某些实施方案中，所述药物组合物为注射剂(包括注射液、冻干粉剂)。在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。关于该药物组合物的配制的一般原则可参考由G.Morstyn和W.Sheridan编著的《细胞疗法：干细胞移植，基因疗法和细胞免疫疗法(Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and Cellular Immunotherapy)》，剑桥大学出版社，1996；和《造血干细胞疗法(Hematopoietic Stem Cell Therapy)》,E.D.Ball,J.Lister&P.Law,Churchill Livingstone,2000。

在某些实施方案中，所述药物包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的生物材料，包括但不限于胶原支架、皮肤修复膜、氨基化明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纤维素聚乳酸、弹性蛋白原、透明质酸等。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群可以以悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物的形式进行移植。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，并且所述单位剂量的药物中含有不少于1×10 ⁴个/ml(例如不少于1×10 ⁴个/ml，不少于3×10 ⁴个/ml，不少于5×10 ⁴个/ml，不少于7×10 ⁴个/ml，不少于1×10 ⁵个/ml，不少于3×10 ⁵个/ml，不少于5×10 ⁵个/ml，不少于7×10 ⁵个/ml，不少于1×10 ⁶个/ml，不少于3×10 ⁶个/ml，不少于5×10 ⁶个/ml，不少于7×10 ⁶个/ml，不少于1×10 ⁷个/ml，不少于3×10 ⁷个/ml，不少于5×10 ⁷个/ml，不少于7×10 ⁷个/ml，不少于1×10 ⁸个/ml，不少于3×10 ⁸个/ml，不少于5×10 ⁸个/ml，不少于7×10 ⁸个/ml，不少于1×10 ⁹个/ml，不少于3×10 ⁹个/ml，不少于5×10 ⁹个/ml，不少于7×10 ⁹个/ml，不少于1×10 ¹⁰个/ml，不少于3×10 ¹⁰个/ml，不少于5×10 ¹⁰个/ml或不少于7×10 ¹⁰个/ml)所述间充质干细胞。在某些实施方案中，所述单位剂量的药物中含有1×10 ^＝4～1×10 ¹⁰个(例如1×10 ⁶～1×10 ⁸个，1×10 ⁶～1×10 ⁷个，或1×10 ⁶～5×10 ⁶个)所述间充质干细胞。

原发性卵巢功能不全

原发性卵巢功能不全(Primary ovarian insufficiency，POI)是指女性40岁之前卵巢功能丧失。2015年ESHER指南中其定义为：(1)闭经/月经稀发至少4个月；(2)2次血FSH>25U/L(监测时间至少隔开4周)。其特点为月经紊乱(闭经或者月经稀发)、促性腺激素升高、低雌激素(潮热多汗、面部潮红、性欲低下等)。POI发病率约1％，不同种族发病率略不相同。原发性闭经患者中POI发病率为10％～28％，继发性闭经患者中POI发病率为4％～18％。

POI的病因包括遗传、免疫、医源性(放化疗、免疫抑制剂和手术治疗等)等，但大部分POI原因不明。POI可能与多种内分泌疾病有关，包括甲状旁腺功能减退和肾上腺素功能减退。骨盆手术也可能导致卵巢功能受损。大约4％POI的患者存在肾上腺或卵巢抗体，说明这种疾病存在自身免疫性。在许多病例中，其机制尚不清楚。POI可致女性生育能力丧失，增加骨质疏松、脂代谢紊乱和心血管疾病的风险。生育期提早闭经，丧失生育能力，会增加女性心理负担，降低婚姻生活质量，从而产生一系列严重的心理和社会问题。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻卵巢功能不全(例如原发性卵巢功能不全)；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻卵巢功能不全(例如原发性卵巢功能不全)的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群可以改善血液性激素(如FSH和E2)水平，增加卵泡数量，改善体重和卵巢重，恢复排卵水平，和/或改善生育力水平。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的间充质干细胞群。在某些实施方案中，通过腹部或静脉注射给药。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的生物材料，包括但不限于胶原支架、Matrigel、皮肤修复膜、氨基化明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纤维素聚乳酸、弹性蛋白原、透明质酸等。

男性生殖系统疾病

男性生殖系统疾病包括与泌尿外科疾病有关的有排尿异常、脓尿、尿道异常分泌物、疼痛、肿块、性功能障碍及男性不育症等。主要有泌尿系统炎症，如膀胱炎、尿道炎、尿失禁、尿潴留等；生殖系统炎症，如睾丸附睾炎、精囊炎、前列腺炎等；生殖道结核，如睾丸附睾结核、精囊结核等；生殖道损伤，如睾丸挫伤、阴茎折断伤、尿道断裂等；男性不孕不育疾病，如精索静脉曲张、弱精子症、先天性输精管梗阻、输精管缺如等；男性性功能障碍性疾病，如男性勃起功能障碍、早泄、性欲减退、不射精、延迟射精等。在本文中，术语“男性不孕”是指由于男性因素引起的不育一般把婚后同居2年以上未采取任何避孕措施而女方未怀孕，男性不孕包括睾丸萎缩、睾丸发育不全、少精子症、精子生成障碍、无精子症、阻塞性无精子症、弱精子症、克氏综合征、XYY综合征、Kallmann氏综合征、选择性LH缺陷症和FSH缺陷症、肾上腺皮质增生症、高泌乳素血症、精索静脉曲张、精子畸形症等。在本文中，术语“少精子症”是指精液中精子的数量低于正常健康有生育能力的男子，包括由内分泌功能障碍、生殖系统感染、精索静脉曲张、抗精子抗体、隐睾、鞒膜积液、营养不良、化学治疗、放射治疗、肥胖等导致的少精子症。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻男性生殖系统疾病；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻男性生殖系统疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，所述男性生殖系统疾病是无精子症或少精子。在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群能在无精子症中用于提高精子浓度，提高精子活力，恢复睾丸和/或恢复储精囊功能。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物组合物。在某些实施方案中，通过睾丸内或曲细精管内或静脉注射给药。

在某些实施方案中，所述另外的活性成分选自雌激素、抗雌激素或选择性雌激素受体调节剂、雄激素、抗雄激素。

在另一方面，本发明还提供了用于一种预防、治疗、延缓和/或减轻男性生殖系统疾病的产品，其含有本发明的间充质干细胞群。在某些实施方案中，所述产品中还含有另外的活性成分，所述另外的活性成分如上文中定义。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。在某些实施方案中，所述产品为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂或胶囊剂。在某些实施方案中，所述产品为植入物。

消化系统疾病

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗消化系统疾病；或者，本发明提供预防和/或治疗消化系统疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，所述消化系统疾病选自食管疾病、胃部疾病、肠道疾病、肝脏疾病、胆囊疾病、胰腺疾病或其任何组合。

肠道疾病选自十二指肠溃疡、功能性结肠病、肠息肉、结肠癌、直肠癌、炎性肠病(IBD)、结肠炎、直肠炎、肠激综合征、消化不良、功能性便秘、胃食管返流性疾病、食管炎、腹膜炎、自身免疫性肝病、胃炎、结核性肠病或其任何组合。

在某些实施方案中，肠道疾病为肠道炎性疾病。

在某些实施方案中，肠道炎性疾病选自炎性肠病(IBD)、结肠炎、直肠炎或其任何组合。

在某些实施方案中，肠道炎性疾病为炎性肠病(IBD)。

胃肠道疾病(胃部疾病、肠道疾病)主要指一般炎症性胃肠道疾病(急、慢性胃炎，急、慢性阑尾炎等)、消化性溃疡、胃癌、食道癌、大肠癌及肠易激综合征等。炎性肠病是胃肠道疾病中的一种疾病。

肝脏疾病是发生在肝脏的所有疾病的总称。根据肝功能损害的病因不同，分为病毒性肝病，包括甲肝，乙肝，丙肝，戊肝等等，还有新陈代谢异常性肝病、酒精性肝病、药物或毒物性肝病、非酒精性脂肪性肝病，自身免疫性肝病等。根据发病快慢，分为慢性肝病和急性肝病。

肝脏疾病选自肝损伤、肝纤维化、肝炎(如甲型病毒性肝炎、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎)、肝硬化、肝功能衰竭、肝脓肿、肝囊肿、肝内血管瘤、肝癌、肝内胆管结石、肝吸虫病、肝包虫病、酒精性的肝病、非酒精性的脂肪性肝病或其任何组合。

肝脏疾病包括脂肪肝，本文中，术语“脂肪肝”是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，是一种常见的肝脏病理改变，而非一种独立的疾病。脂肪肝一般分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝两大类。

肝脏疾病包括脂肪肝炎，本文中，术语“脂肪性肝炎”属于脂肪肝的一种。轻微的脂肪肝一般没有明显的肝脏损伤，没有明显的自觉症状。中重度脂肪肝一般都会伴有肝细胞损伤，称为脂肪性肝炎，表现有相应地临床症状。

肝脏疾病包括非酒精性脂肪性肝病，本文中，术语“非酒精性脂肪性肝病”是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化。

肝脏疾病包括非酒精性脂肪肝炎，本文中，术语“非酒精性脂肪性肝炎”是非酒精性脂肪性肝病的炎症亚型，伴有肝脂肪变性以及肝细胞损伤(气球样变)和炎症的证据，伴或不伴肝纤维化。随着时间的推移，非酒精性脂肪性肝炎可能进展为肝纤维化、肝硬化、终末期肝病或需要肝移植。

肝脏疾病包括肝脏脂肪变性，本文中，术语“肝脂肪变性”是指肝细胞胞浆内出现脂肪滴。肝脏发生脂肪变性时，轻者，眼观无明显异常，严重时，可见肝脏肿大，质地较软，色泽淡黄至土黄，切面结构模糊，有油腻感。镜下可见在变性的肝细胞浆内出现大小不一的空泡，严重时可融合为一大空泡，形似脂肪细胞。

肝脏疾病包括肝损伤。肝损伤选自急性肝损伤、慢性肝损伤、化学性肝损伤、物理性肝损伤或其任何组合。在本文中，术语“肝损伤”是由各种肝脏疾病所产生的病变结果。各种有害因素导致的肝损伤主要有病毒性肝损伤、酒精性肝损伤和药源性肝损伤等类型。在某些实施方案中，肝损伤为急性肝损伤。

在某些实施方案中，所述药物还包含载体或赋形剂。

在某些实施方案中，所述载体选自明胶、壳聚糖、海藻酸钠、胶原、丝蛋白、纤维素、纤维蛋白、聚乳酸、聚氨酯、聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚乳酸羟基乙酸、聚ε-己内酯、硅酸盐、硅橡胶、细胞外基质、脱细胞支架或其任何组合。

在某些实施方案中，所述载体选自明胶、胶原或其任何组合。

在某些实施方案中，所述药物还包含第二活性成分。

在某些实施方案中，所述第二活性成分选自维丙胺、氯化胆碱、肌醇、去氢胆酸、硫酸镁、多烯磷脂酰胆碱(易善复)、葡萄糖醛酸内酯(肝泰乐)、谷胱甘肽(古拉定、阿拓莫兰)、硫普罗宁(凯西莱)、甘草甜素制剂、腺甘蛋氨酸(思美泰)、促肝细胞生长素、五味子(联苯双酯)、水飞蓟素(水林佳、利肝隆、保肝宁)、齐墩果酸(肝舒片)、菌栀黄制剂、茵陈或其任何组合。

在某些实施方案中，所述第二活性成分选自氨基水杨酸类药物、皮质类固醇类药物、免疫抑制剂、生物制剂或其任何组合。在某些实施方案中，所述氨基水杨酸类药物为5-氨基水杨酸。在某些实施方案中，所述皮质类固醇类药物为糖皮质激素。在某些实施方案中，所述免疫抑制剂选自咪唑硫嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、环孢素A、他克莫司或其任何组合。在某些实施方案中，所述生物制剂为TNF拮抗剂。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，所述单位剂量的药物含有不少于1×10 ⁴个/ml(例如不少于1×10 ⁴个/ml，不少于3×10 ⁴个/ml，不少于5×10 ⁴个/ml，不少于7×10 ⁴个/ml，不少于1×10 ⁵个/ml，不少于3×10 ⁵个/ml，不少于5×10 ⁵个/ml，不少于7×10 ⁵个/ml，不少于1×10 ⁶个/ml，不少于3×10 ⁶个/ml，不少于5×10 ⁶个/ml，不少于7×10 ⁶个/ml，不少于1×10 ⁷个/ml，不少于3×10 ⁷个/ml，不少于5×10 ⁷个/ml，不少于7×10 ⁷个/ml，不少于1×10 ⁸个/ml，不少于3×10 ⁸个/ml，不少于5×10 ⁸个/ml，不少于7×10 ⁸个/ml，不少于1×10 ⁹个/ml，不少于3×10 ⁹个/ml，不少于5×10 ⁹个/ml，不少于7×10 ⁹ 个/ml，不少于1×10 ¹⁰个/ml，不少于3×10 ¹⁰个/ml，不少于5×10 ¹⁰个/ml或不少于7×10 ¹⁰个/ml)所述间充质干细胞。在某些实施方案中，所述单位剂量的药物中含有1×10 ⁴～1×10 ¹⁰个(例如1×10 ⁶～1×10 ⁸个，1×10 ⁶～1×10 ⁷个，或1×10 ⁶～5×10 ⁶个)所述间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞的给药途径选自注射给药、涂抹给药、粘贴给药、灌肠给药、灌注给药、直肠给药、口服给药。

在某些实施方案中，所述方法还包括向有此需要的受试者施用第二活性成分，所述第二活性成分如前面所描述或定义。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在另一个方面，本发明提供一种治疗消化系统疾病的产品，其包含第一活性成分间充质干细胞群。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群如前面所描述或定义。

在某些实施方案中，所述消化系统疾病如前面所描述或定义。

在某些实施方案中，所述产品还包含第二活性成分。

在某些实施方案中，所述第二活性成分如前面所描述或定义。

在某些实施方案中，所述第一活性成分和所述第二活性成分是单独存在的或者联合存在的。

在某些实施方案中，所述第一活性成分与选自前面所描述的第二活性成分联合用药。

在某些实施方案中，所述产品为植入物，优选地，所述植入物用于改善微环境，抑制免疫排斥反应。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

急性肝损伤

在本文中，术语“急性肝损伤”是指短时间内肝细胞出现急性损伤或坏死，出现肝功能的异常，部分患者甚至出现肝脏衰竭。所述急性肝损伤的原因主要有病毒感染、服用药物不当、食物添加剂、乙醇摄入过量、误服有毒食物、放射线损伤等。急性肝损伤包括病毒性、化学性、药物性肝损伤等。

在本文中，术语“化学性急性肝损伤”是指由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤。这些化学物质包括酒精、环境中的化学有毒物质(比如四氯化碳)及某些药物。

肝脏具有强大的防御和修复能力，当各种原因造成肝脏损伤时可以依靠肝细胞再生重建肝结构，恢复肝功能。急性肝损伤是由病毒、药物、酒精、自身免疫异常等因素引起的以短时间内肝功能不全为特征的一类疾病，主要病理改变是肝细胞广泛坏死和凋亡，使得肝脏无法发挥正常合成和代谢功能。病情进展短时间内未得到干预可迅速恶化发生凝血功能障碍、黄疸、腹水和肝性脑病等进而导致多器官功能衰竭。进展至肝衰竭时，由于发展迅速，治疗困难导致总体预后极差。自体肝移植是治疗严重肝损伤的最有效手段，但存在肝脏供者缺乏、手术费用高、移植术后并发症和免疫排斥反应等各种风险，因而肝移植的应用受到限制。鉴于急性肝损伤的高死亡率和肝移植的局限性，干细胞疗法在急性和慢性肝脏疾病治疗中显示出极大的潜能和优势。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗急性肝损伤中的用途，或者在制备用于在受试者中预防和/或治疗急性肝损伤的药物中的用途。上述用途可以保护肝脏、维持和/或延续和/或改善肝脏功能。

更具体的，在某实施方案中，所述药物组合物能够抑制或降低急性肝损伤者体重的下降速率，降低急性肝损患者死亡率。

在某实施方案中，所述药物组合物能够降低血清中转氨酶和/或碱性磷酸酶的含量。

在某实施方案中，所述药物组合物能够防止炎症细胞浸润。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述药物包含治疗有效量的间充质干细胞群和/或培养物和/或治疗有效量的如本文所述的培养上清。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的培养上清，或包含所述培养上清的药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含前述生物支架，或者药学上可接受的生物材料，包括但不限于胶原支架、皮肤修复膜、氨基化明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纤维素聚乳酸、弹性蛋白原、透明质酸等。

在某些实施方案中，所述药物可以以悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物的形式进行移植。

非酒精性脂肪性肝炎

非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)又称代谢性脂肪性肝炎，是非酒精性脂肪肝疾病的进行形式，定义为存在5％或以上的肝脂肪变性伴发炎和肝细胞损伤(例如，气球样变)，伴或不伴纤维化。NASH容易发展为肝硬化、肝癌等疾病。全球有3％-5％NASH患者。中国肝硬化患者约为109万，2030年，将增加到232万。NASH发展与遗传(PNPLA3的多态性)、生活习惯(宿主的饮食习惯、进食次数、睡眠觉醒周期等)、肥胖、代谢综合征等息息相关。NASH常见症状有食欲缺乏、乏力、腹胀、恶心呕吐、肝区隐痛和肝肿大、等表现。环境、代谢、遗传这些因素导致游离脂肪酸在肝脏堆积，继而对细胞产生一系列损伤。目前，针对NASH治疗有非临床治疗和临床治疗。前者包括改变生活习惯来改善病程，后者包括肝移植、手术和正在处于研究中的药物来治疗疾病。制定健康的生活方式的治疗策略更适辅助治疗。肝移植费用昂贵、供体稀缺；手术治疗需要患者符合入组条件，具有局限性；现在没有被FDA批准的可用于NASH的治疗药物。所以对于NASH的治疗，仍处于一个急缺的状态。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎的用途，或者在制备用于在受试者中预防非酒精性脂肪性肝炎，或者延缓、或减少非酒精性脂肪性肝炎、或阻止减轻非酒精性脂肪性肝炎。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以降低肝脏的重量，抑制脂肪在肝脏中的积累，和/或降低肝脏的脂肪变性。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以降低转氨酶含量，改善肝功能。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以抑制纤维化，和/或抑制炎症。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，可以通过静脉给药。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含前述生物支架，或者药学上可接受的生物材料，包括但不限于胶原支架、Matrigel、皮肤修复膜、氨基化明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纤维素聚乳酸、弹性蛋白原、透明质酸等。

炎性肠病

炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种典型的与粘膜免疫系统和共生生态系统失调相关的慢性复发疾病，体现了宿主遗传学，宿主免疫学，微生物组和环境暴露之间的相互作用。

IBD表现为两个主要临床实体：克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)。UC影响结肠，CD可能影响胃肠道的任何区域，但主要发生在小肠的末端回肠。

IBD的肠道并发症包括脓肿，肠梗阻，肠穿孔，大肠癌，肛裂，瘘管，经期症状恶化和中毒性巨结肠。IBD(克罗恩病和溃疡性结肠炎)的某些并发症可能危及生命，需要及时治疗以预防更严重的疾病。

脓肿：在克罗恩病中比在溃疡性结肠炎中更常见的脓肿是感染部位脓液的积聚。它可能发生在看不见的体内，例如在肠壁内部、肠壁外部、皮肤等。内部脓肿可通过抗生素治疗解决，但如果不能解决，则需要将其排干。这可以通过将导管穿过皮肤插入脓肿部位来完成。导管可以以其他方式插入，例如穿过胃壁。在某些情况下，需要进行手术以排脓。

肠梗阻：肠梗阻是指小肠或大肠的一部分被部分或完全阻塞，阻止身体废物的排出。阻塞通常伴随着剧烈的疼痛，呕吐和便秘。在某些情况下，鼻胃管可以帮助缓解症状，但可能需要手术清除阻塞物。

肠穿孔：肠道出现穿孔(洞)的风险很少，但这是IBD的潜在致命并发症。在溃疡性结肠炎的首次发作期间以及由于严重疾病而肠壁变得很薄的人中，穿孔最常见。穿孔最常通过外科手术进行治疗，以修复孔甚至去除一部分肠。

大肠癌：IBD患者罹患大肠癌的风险增加，尤其是患有全结肠溃疡性结肠炎8至10年的人。克罗恩病患者也处于危险之中，尽管关于危险程度的信息很少。对于患有IBD的任何人，特别是对于那些风险最高的人，必须通过结肠镜检查仔细监测结肠直肠癌。

肛裂：肛裂是肛门管的痛苦撕裂，可引起出血。大多数裂痕无需手术即可痊愈，可以使用局部乳霜等治疗方法，并确保排便通畅而不会紧张。无法愈合并成为慢性的裂痕可能需要手术。

瘘管：瘘管是两个体腔之间或体腔与皮肤之间的异常状连接。在克罗恩病中，瘘管比在溃疡性结肠炎中更常见，事实上，约有25％的克罗恩病患者在疾病过程中的某个时候可能会形成瘘管。某些瘘管可以用药物治疗，但是它们越严重或范围越广，就越有可能需要手术。

经前综合症：一些患有IBD的妇女注意到其症状在月经期恶化。在月经来潮之前和期间，腹泻和疼痛可能会增加。这些症状的原因可能是月经周期中激素的增加。

中毒性巨结肠：中毒性巨结肠很罕见，但这是威胁生命的疾病。如果不加以治疗，有毒的巨结肠可能会导致休克，穿孔或腹部或血液感染。在某些情况下，可以进行医学治疗，但严重的情况下可能需要手术。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清和/或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗炎性肠病的用途，或者在制备用于在受试者中预防和/或治疗炎性肠病的药物中的用途。

上述用途能够起到防治炎性细胞的浸润、保护结肠、降低炎症因子(例如IFN-γ、IL-6、TNF-α、iNOS等)、增加或上调抑炎因子(例如IL10等)、抑制炎症发生、分泌营养因子(例如VEGF、HGF、SDF-1a等)，促进结肠组织修复等作用，以在炎性肠病的预防和/或治疗中达到抑制炎症、促进组织修复等功能，从而保护结肠组织、保护肠道、提高组织修复能力。

在某些实施方案中，所述药物组合物能用于治疗克罗恩病(Crohn’s disease,CD)CD)和/或溃疡性结肠炎((Ulcerative colitis,UC)。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的培养上清，或包含所述培养上清的药物组合物。在某些优选方案中，所述药物组合物通过静脉注射或腹腔注射方式进行给药。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含前述生物支架或者药学上可接受的生物材料，包括但不限于胶原支架、皮肤修复膜、氨基化明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纤维素聚乳酸、弹性蛋白原、透明质酸等。

在某些实施方案中，所述药物组合物也包含其他药物组合，包括但不限于5-氨基水杨酸、NF-κB和激活蛋白1((Activator protein-1,AP1)、免疫抑制剂类的药物(咪唑硫嘌呤(Azathioprine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、和环孢素A(Cyclosporin A)、他克莫司(Tacrolimus)),、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)、拮抗剂等。

神经系统疾病

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗神经系统疾病；或者，本发明提供预防和/或治疗神经系统疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

神经系统疾病是以神经系统功能障碍为主要表现的疾病，症状主要有精神行为异常，健忘、失眠、情感的变化、智力的改变等。包括脑血管疾病、神经系统变性疾病、中枢神经系统感染性疾病、中枢神经系统脱髓鞘疾病、运动障碍性疾病、癫痫、脊髓疾病、神经系统遗传性疾病、神经系统发育异常性疾病、中枢神经系统中毒性疾病、中枢神经系统肿瘤性疾病、中枢神经系统免疫性疾病等。例如包括脑血管疾病、周期性麻痹、进行性肌营养不良、强直性肌营养不良、共济失调、失眠症、神经衰弱、癫痫、三叉神经痛、神经退行性疾病、神经性头痛(例如，偏头痛等)和神经性病变等。

神经性病变

神经性病变是中枢神经系统、周围神经系统、植物神经系统的感觉、运动、意识、植物神经功能障碍为临床表现的疾病。

神经退行性疾病

神经退行性疾病是指神经元结构或功能逐渐丧失甚至死亡而导致功能障的一类疾病，包括肌萎缩侧索硬化症、帕金森、阿尔茨海默病、癫痫、亨廷顿氏病以及脊髓性肌萎缩症、脑损伤、不同类型脊髓小脑共济失调、齿状核红核苍白球丘脑下核萎縮、传染性海绵状脑病、原发性侧索硬化、多发性硬化症、心脑血管性痴呆、神经性疼痛、青光眼、外伤性脊髓损伤、多系统萎缩等。

(1)萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)：

肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)，俗称“渐冻人”，是一种自发性的、致命的神经退行性疾病，影响大脑运动皮层的上运动神经元和脑干、脊髓的下运动神经元。大量运动神经元的丢失会导致肌肉萎缩和自发性收缩和痉挛。ALS分为两类：家族性ALS(Familial ALS,FALS)和散发性ALS(Sporadic ALS,SALS)，前者占比10％，后者占比90％。ALS患者通常发病年龄是在40岁以后，47–52岁和58–63岁分别是FALS和SALS高发阶段，80岁以后发病率减少，男性比女性更倾向于患病；自发病开始，患者一般存活年限为3-5年。各种因素与ALS发病息息相关，譬如：遗传、职业、生活方式、年龄等。ALS发病一方面是星形胶质细胞未能及时恢复堆积在突触的谷氨酸，产生谷氨酸兴奋性毒性；另一方面突变的基因包括SOD1、UBQLN2、OPTN、VCP、TDP43、FUS、C9ORF72导致产生错误的蛋白构象聚合物产生毒性以及产生有毒的RNA种类加重运动神将元损伤，致使突触回缩，不能与突触后膜受体相结合，无法完成电信号的传递，最后出现临床表征。针对ALS的治疗，有药物治疗，目前，只有两种美国食品药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)和欧洲药品管理局(European Medicines Agency,EMA)批准的神经保护药物可以延长一些患者几个月的寿命：利鲁唑，它可以阻止过量的谷氨酰胺神经传递；依达拉奉，它可以防止氧化应激损伤；手术治疗：如果患者吞咽或咀嚼有困难，可进行鼻饲或胃造口术。如果呼吸肌瘫痪，应尽快行气管切开术，并通过通气维持呼吸；还有辅助治疗：康复训练。临床上，对应具体表征，有具体的处理方式。上述的治疗方式也只能延缓患者数月生存时间，但对于病人的生活品质并没有明显帮助。所以，仍然急需更加有效的治疗。除了上述治疗方式，目前临床前研究比较热点的还有基因编辑，譬如通过CRISPR/Cas9基因编辑系统直接编SOD1，在体外及转基因小鼠中治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症。但是，基因编辑的治疗方式仍存在很多的不确定性。

在一些实施方案中，本发明所述药物除前述给药形式外，还可通过静脉注射或大脑组织注射方式给药。

在某实施方案中，所述药物能够延迟发病。

在某实施方案中，所述药物能够增强肢体协调能力、运动能力、反应能力，例如抓握力等。

在某实施方案中，所述药物能够在肌萎缩侧索硬化症中改善的肌肉力量，减轻运动神经元损伤。

在某实施方案中，所述药物能够在肌萎缩侧索硬化症中运动神经元，减少小胶质细胞和星形胶质细胞，减轻疾病进程。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的培养上清，或包含所述培养上清的药物组合物。在某些优选方案中，药物组合是通过静脉注射或大脑组织注射方式。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以是医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在某些实施方案中，所述药物组合物为注射剂(包括注射液、冻干粉剂)。在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。关于该药物组合物的配制的一般原则可参考由G.Morstyn和W.Sheridan编著的《细胞疗法：干细胞移植，基因疗法和细胞免疫疗法(Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and Cellular Immunotherapy)》，剑桥大学出版社，1996；和《造血干细胞疗法(Hematopoietic Stem Cell Therapy)》,E.D.Ball,J.Lister&P.Law, Churchill Livingstone,2000。

(2)癫痫

癫痫是指由多种病因引起、以脑神经元过度放电导致突然、反复和短暂的中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病。包括特发性癫痫综合征、症状性癫痫综合征、可能的症状性癫痫综合征或隐源性癫痫、反射性癫痫综合征、良性癫痫综合征、癫痫性脑病。

癫痫是一种表现为反复癫痫发作的慢性脑部疾病，会突然间毫无缘由的发作，是脑卒中后第二常见的神经系统疾病。脑部神经元的“异常放电”引起癫痫发作，具有反复性和短暂性的特点。癫痫影响全球7000多万人，中国人群的发病率在5-7‰之间，全国有650-910万患者。一些脑血管并发症、头外伤、中枢神经系统感染等会导致继发性癫痫；睡眠、年龄、遗传与特发性癫痫发作息息相关。针对于癫痫治疗，应用最多的是抗癫痫药物。然而，尽管目前已有30种不同分子靶点的抗癫痫药物(Antiepileptic drugs,AEDs)，但在癫痫的药物治疗中仍存在许多挑战，如耐药、副作用、伴随着频繁依赖毒性和记忆缺陷等。此外，脑外科手术是最重要的替代治疗；然而，手术必须考虑是否可以入组以及风险和费用。目前，临床试验主要是药物治疗，有200多项处于Ⅲ期。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗癫痫，延缓或减轻癫痫发作，或者阻止癫痫发作的药物中的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗癫痫，延缓或减轻癫痫发作，或者阻止癫痫发作的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

本发明所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物可预防癫痫，或者延缓、或减轻癫痫发作或者阻止癫痫发作。

在某些优选方案中，通过大脑或静脉注射给药。

在某些实施方案中，所述药物组合能增加脑内GABA能神经元数量或激活GABA能神经元或减少小胶质细胞数量或重塑和修复模型中GABA能神经元缺陷的神经回路或促进内源干细胞向GABA能谱系的分化能力或抑制炎症反应。

在某些实施方案中，所述药物组合能改善模型动物记忆和学习能力。

在某些实施方案中，所述药物组合能提供脑内营养分子(如GDNF)分泌水平，保护神经功能。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的培养上清，或包含所述培养上清的药物组合物。在某些优选方案中，可以通过大脑或静脉注射给药。

(3)阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年痴呆最普遍的形式，也是老年期最常见的慢性病之一，约占老年痴呆的50-70％。全世界有3500多万人受其影响。AD临床表现为进行性记忆丧失和认知功能障碍。阿尔茨海默病与两种致病特征有关，即细胞外淀粉样蛋白(Amyloid beta,Aβ)沉积和细胞内神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NTFs)，伴随神经炎症和广泛的神经元和突触丢失，导致进行性记忆丧失和认知功能障碍。目前还没有特效药能治愈阿尔兹海默病或者有效逆转疾病进程，联合使用药物治疗、非药物治疗和细心护理等能够减轻和延缓病情发生。因此，研发可以治愈AD或者逆反AD的有效治疗策略是很重要的。目前，已经上临床试验的主要是药物研究，临床Ⅲ期有200多项。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)临床试验有10项，处于临床Ⅰ期、Ⅱ期。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病或脑血管疾病，延缓或减轻阿尔茨海默病或脑血管疾病，或者阻止减轻阿尔茨海默病或脑血管疾病的药物中的用途；或者，涉及预防和/或治疗阿尔茨海默病或脑血管疾病，延缓或减轻阿尔茨海默病或脑血管疾病，或者阻止减轻阿尔茨海默病或脑血管疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物可以改善学习记忆能力，改善记忆与认知的缺陷。

在某些实施方案中，所述药物可以降低脑内淀粉沉淀的累积，降低淀粉沉淀对神经的不利影响。

在某些实施方案中，所述药物可以抑制小胶质细胞向促炎形式转化，防止小胶质细胞过渡激活及功能紊乱。

在某些实施方案中，所述药物可以提高小胶质细胞吞噬能力，清除淀粉样沉淀与凋亡的细胞碎片，抑制AD大脑炎症环境中A1星型胶质细胞的产生，抑制过渡激活的免疫。

在某些实施方案中，所述药物可以提高神经的存活，改善认知与记忆。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在一些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，并且所述单位剂量的药物中含有1×10 ⁴ 个/ml(例如不少于1×10 ⁴个/ml，不少于3×10 ⁴个/ml，不少于5×10 ⁴个/ml，不少于7×10 ⁴个/ml，不少于1×10 ⁵个/ml，不少于3×10 ⁵个/ml，不少于5×10 ⁵个/ml，不少于7×10 ⁵个/ml，不少于1×10 ⁶个/ml，不少于3×10 ⁶个/ml，不少于5×10 ⁶个/ml，不少于7×10 ⁶个/ml，不少于1×10 ⁷个/ml，不少于3×10 ⁷个/ml，不少于5×10 ⁷个/ml，不少于7×10 ⁷个/ml，不少于1×10 ⁸个/ml，不少于3×10 ⁸个/ml，不少于5×10 ⁸个/ml，不少于7×10 ⁸个/ml，不少于1×10 ⁹个/ml，不少于3×10 ⁹个/ml，不少于5×10 ⁹个/ml，不少于7×10 ⁹个/ml，不少于1×10 ¹⁰个/ml，不少于3×10 ¹⁰个/ml，不少于5×10 ¹⁰个/ml或不少于7×10 ¹⁰个/ml，优选为3～6×10 ⁶个)的所述间充质干细胞。

在一些实施方案中，所述药物中还含有药学上可接受的载体或赋形剂；优选地，所述载体选自明胶、壳聚糖、海藻酸钠、胶原、丝蛋白、纤维素、纤维蛋白、聚乳酸、聚氨酯、聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚乳酸羟基乙酸、聚ε-己内酯、硅酸盐、硅橡胶、细胞外基质、脱细胞支架及其任意组合；优选地，所述载体选自明胶、胶原及其任意组合；优选地，所述药物为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂或胶囊剂，优选为注射剂；优选地，所述药物中进一步含有药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液。

在一些实施方案中，所述药物中还含有其它活性成分，所述其它活性成分例如选自β分泌酶抑制剂(例如OM99-2)、γ分泌酶抑制剂(例如R-氟比洛芬)、胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐、盐酸多奈哌齐、利凡斯的明、石杉碱甲、他克林、加兰他敏或氢溴酸加兰他敏)、M胆碱受体激动剂或拮抗剂(例如M1胆碱受体激动剂包括占诺美林、沙可美林、萘必西坦、AF-102B和SR-46559A；M2胆碱受体拮抗剂包括BIBN-99和AF-DX 11；或N胆碱受体激动剂包括烟碱和ABT-418)、谷氨酸受体拮抗剂(例如美金刚、盐酸美金刚或利鲁唑)、钙离子拮抗剂(例如尼莫地平或氟桂嗪)、抗氧化剂(例如维生素E、炔苯丙胺、美拉托宁、褪黑素、去铁敏、艾地苯醌或甲磺酸替拉扎特)、抑制Aβ生成药(例如雌激素、氯喹、刚果红或氨苯乙酸苯)、多巴胺替代物(例如左旋多巴)、外周脱羧酶抑制剂(例如卡比多巴或苄丝肼)、多巴胺D受体激动剂(例如溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡、普拉克索或罗匹尼罗)、神经营养剂(例如哌拉西坦、阿尼西坦、奥拉西坦、普拉西坦或奈非西坦)、抗胆碱药(例如盐酸苯海索、丙环定、比哌立登或苯扎托品)、抗抑郁药(例如阿米替林、苯乙肼、反苯环丙胺、异卡波肼或伊曲茶碱)、5-羟色胺及冬季(例如沙立佐坦或布地品)、MAO-B抑制剂(例如司来克兰或雷沙克兰)、多巴胺β-羟基化酶抑制剂(例如镰孢菌酸)、 COMT抑制剂(例如恩卡他朋或托卡朋)、免疫抑制剂(例如咪唑硫嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、环孢素A或他克莫司)及其任意组合；优选地，所述间充质干细胞群和所述其它活性成分单独或联合存在。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，通过大脑或静脉注射给药。

在某些实施方案中，给药剂量为不少于1×10 ⁴个/次(例如不少于1×10 ⁴个/次，不少于3×10 ⁴个/次，不少于5×10 ⁴个/次，不少于7×10 ⁴个/次，不少于1*10 ⁵个/次，不少于3*10 ⁵个/次，不少于5*10 ⁵个/次，不少于7*10 ⁵个/次，不少于1×10 ⁶个/次，不少于3×10 ⁶个/次，不少于5×10 ⁶个/次，不少于7×10 ⁶个/次，不少于1×10 ⁷个/次，不少于3×10 ⁷ 个/次，不少于5×10 ⁷个/次，不少于7×10 ⁷个/次，不少于1×10 ⁸个/次，不少于3×10 ⁸个/次，不少于5×10 ⁸个/次，不少于7×10 ⁸个/次，不少于1×10 ⁹个/次，不少于3×10 ⁹个/次，不少于5×10 ⁹个/次，不少于7×10 ⁹个/次，不少于1×10 ¹⁰个/次，不少于3×10 ¹⁰个/次，不少于5×10 ¹⁰个/次或不少于7×10 ¹⁰个/次)。

在某些实施方案中，通过下述途径向受试者施用预防和/或治疗有效量的间充质干细胞群：注射给药、粘膜给药、腔道给药、口服给药、呼吸道给药或皮肤给药。

在某些实施方案中，所述方法还包括同时、相继或交替向受试者施用预防和/或治疗有效量的其它活性成分，所述其它活性成分例如选自β分泌酶抑制剂(例如OM99-2)、γ分泌酶抑制剂(例如R-氟比洛芬)、胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐、盐酸多奈哌齐、利凡斯的明、石杉碱甲、他克林、加兰他敏或氢溴酸加兰他敏)、M胆碱受体激动剂或拮抗剂(例如M1胆碱受体激动剂包括占诺美林、沙可美林、萘必西坦、AF-102B和SR-46559A；M2胆碱受体拮抗剂包括BIBN-99和AF-DX 11；或N胆碱受体激动剂包括烟碱和ABT-418)、谷氨酸受体拮抗剂(例如美金刚、盐酸美金刚或利鲁唑)、钙离子拮抗剂(例如尼莫地平或氟桂嗪)、抗氧化剂(例如维生素E、炔苯丙胺、美拉托宁、褪黑素、去铁敏、艾地苯醌或甲磺酸替拉扎特)、抑制Aβ生成药(例如雌激素、氯喹、刚果红或氨苯乙酸苯)、多巴胺替代物(例如左旋多巴)、外周脱羧酶抑制剂(例如卡比多巴或苄丝肼)、多巴胺D受体激动剂(例如溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡、普拉克索或罗匹尼罗)、神经营养剂(例如哌拉西坦、阿尼西坦、奥拉西坦、普拉西坦或奈非西坦)、抗胆碱药(例如盐酸苯海索、丙环定、比哌立登或苯扎托品)、抗抑郁药(例如阿米替林、苯乙肼、反苯环丙胺、异卡波肼或伊曲茶碱)、5-羟色胺及冬季(例如沙立佐坦或布地品)、MAO-B抑制剂(例如司来克兰或雷沙克兰)、多巴胺β-羟基化酶抑制剂(例如镰孢菌酸)、COMT抑制剂(例如恩卡他朋或托卡朋)、免疫抑制剂(例如咪唑硫嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、环孢素A或他克莫司)及其任意组合。

(4)锥体外束和运动疾患

锥体外束和运动疾患，包括帕金森症、继发性帕金森综合征、分类于他处的疾病引起的帕金森综合征、基底节的其他变性性疾病、肌张力障碍、其他锥体外束和运动疾患、分类于他处的疾病引起的锥体外束和运动疾患。

运动障碍疾病(movement disorders)又称锥体外系疾病(extrapyramidal diseases)，主要表现随意运动调节功能障碍，肌力、感觉及小脑功能不受影响。本组疾病源于基底核功能紊乱，通常分为肌张力增高-运动减少和肌张力降低-运动过多两大类，前者以运动贫乏为特征，后者主要表现异常不自主运动。

帕金森病(Parkinson's Disease,PD)是一种运动障碍疾病，是一种影响中枢神经系统的慢性神经退化疾病，主要影响运动神经系统。它的症状通常随时间缓慢出现，早期最明显的症状为颤抖、肢体僵硬、运动功能减退和步态异常，也可能有认知和行为问题；痴呆症在病情严重的患者中相当常见，超过三分之一的病例也会发生重性抑郁障碍和焦虑症。其它可能伴随的症状包括知觉、睡眠、情绪问题。帕金森病带来的主要运动症状合称为帕金森综合征。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备预防和/或治疗帕金森病，延缓或减轻帕金森病，或者阻止减轻帕金森病的药物中的用途；或者，涉及预防和/或治疗帕金森病，延缓或减轻帕金森病，或者阻止减轻帕金森病的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物可以减轻多巴胺能去神经，或/和改善帕金森疾病进程。

在某些实施方案中，所述药物可以改善肢体的僵硬程度，或/和增强运动能力。

在某些实施方案中，所述药物可以保护神经元，减少神经元损伤和死亡，对神经元有营养和促突触再生作用，减少脑内炎症发生，或/和改善脑内微环境。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，通过静脉或脑部注射给药。

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)

“脊髓损伤”是指各种致病因素(外伤、炎症、肿瘤等)引起的脊髓结构、功能的横贯性损伤，造成损伤节段平面以下的脊髓神经功能(运动、感觉、括约肌及自主神经功能)障碍，分为原发性脊髓损伤与继发性脊髓损伤，前者包括创伤性脊髓损伤，后者包括脊柱结核、脊柱化脓性感染、横贯性脊髓炎、脊柱退化性疾病、先天性脊柱侧弯、脊髓栓系综合征。

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是由外伤诱发的一种脊柱外科创伤性疾病，表现为在损伤节段以下出现感觉、运动和自主神经功能障碍。国外流行病学调查显示，每年全球有13万新发脊髓损伤患者，且有超过250万患者正饱受着不同程度的脊髓损伤后遗症困扰，而这些SCI患者每年的医疗支出将超过60亿美元，给家庭及社会造成沉重负担。

原发性脊髓损伤的常见结果主要有两种：脊髓挫伤和脊髓压迫(外源力或内源力)。继发性损伤是指由于外力造成的脊髓水肿、椎管内小血管出血形成血肿、压缩性骨折以及破碎的椎间盘组织等形成脊髓压迫所造成的脊髓的继发性损害。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群或其培养上清或药物组合物用于制备预防和/或治疗脊髓损伤，延缓或减轻脊髓损伤，或者阻止减轻脊髓损伤的药物中的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗脊髓损伤，延缓或减轻脊髓损伤，或者阻止减轻脊髓损伤的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物可以提高运动能力。

在某些实施方案中，所述药物可以降低膀胱出口阻力和逼尿肌过度活动，改善排尿功能。

在某些实施方案中，所述药物可以促进细胞存活并增强轴突再生，抑制胶质细胞活化，抗纤维化，降低损伤部位的炎症反应。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，可以通过静脉注射给药。

在某些实施方案中，所述药物可以以悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物的形式进行移植

在某些实施方案中，所述药物除了包括上述药物，也包括前列环素、内皮素-1受体拮抗剂或/和5型磷酸二酯酶抑制剂等药物。

脑血管疾病

“脑血管疾病”是指发生在脑部血管、因颅内血液循环障碍而造成的脑组织损害及脑功能障碍的一组疾病，包括脑卒中、脑瘫、脑动脉粥样硬化、脑动脉炎、脑动脉损伤、脑动脉瘤、颅内血管畸形、脑动静脉瘘、脑血管意外、脑血管痉挛等。

(1)脑卒中

脑卒中是指是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性两大类。缺血性脑卒中包括脑血栓、脑栓塞、脑梗死；出血性脑卒中包括蛛网膜下腔出血、高血压脑出血等。

脑卒中是一种大脑血管狭窄、堵塞或破裂导致大脑组织缺血或出血致使大脑细胞和组织坏死的一类脑血管疾病。分为缺血性脑卒中(又称脑梗死)和出血性脑卒中(包括脑实质出血、脑室出血以及蛛网膜下腔出血)。缺血性脑卒中男性和女性发病率为212/10万和170/10万；出血性脑卒中：12-15/10万。然而，生活方式譬如吸烟、不良饮食、不运动等和患有并发症包括高血压、糖尿病、高血脂症、肥胖等的人往往容易发生脑卒中。目前，对于卒中的治疗，临床上应用最多的仍是溶栓药物组织纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t-PA)。应用t-PA治疗，需要患者符合入选条件，因此t-PA是针对特定脑卒中患者，而且，治疗时间窗短，局限于4.5小时。除此之外，血管内治疗也是一大治疗策略。但也存在弊端，血管内支架也只适用于解决大血管血流不通的问题。虽然，使用预防措施包括药物和健康生活方式以及有氧运动等使得脑卒中的发病率有所下降，但高的复发率着实让人头疼。所以，对脑卒中的治疗仍然是一大难题。现有的临床试验主要研究了帮助卒中患者恢复的一些电子科技产品或软件系统，对卒中患者恢复进行的行为方式和生活方式改善以及药物治疗和细胞治疗。临床试验中，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)基本都是处于Ⅰ期和Ⅱ期。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗脑卒，延缓或减轻脑卒，或者阻止脑卒的药物中的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗脑卒，延缓或减轻脑卒，或者阻止脑卒的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物可以降低大脑组织梗死程度，降低大脑组织梗死面积，降低脑组织含水量，提高侧前肢使用率，提高运动时间，减弱中风引起的神经细胞损伤程度。

在某些实施方案中，所述药物可以促进神经元再生，减少神经元损伤和死亡，为神经元提供营养和促突触再生。

在某些实施方案中，所述药物可以减弱脑内炎症反应，改善脑内微环境。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，通过静脉注射或大脑组织注射给药。

神经性疼痛

神经性疼痛是指由影响躯体外周神经、神经系统、感觉神经等的原发病变或功能障碍等疾病引发或引起的疼痛，其特征是自发性疼痛、异常性疼痛及痛觉过敏。本病可由外伤和(或)疾病致末梢神经、脊髓后根、脊髓及其以上中枢神经某些部位损伤而引发。如面肌痉挛、糖尿病神经病变所致的疼痛、筋膜病、中枢神经痛、周围神经性疼痛、神经根性疼痛、背部手术后综合征、慢性区域疼痛综合征和外周神经损伤)、局部缺血性疼痛(如周围血管性疾病和咽峡炎)、癫痫发作、帕金森综合征相关的运动障碍(如震颤、瘫痪、强直和运动障碍)、脊髓损伤相关神经性疼痛、椎间盘源性疼痛、枕大神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、脑血管疾病、癫痫、脑水肿、脑积水、癌性神经痛、脑炎、脑膜炎、神经性皮炎、神经性头疼等神经性疼痛。

神经病理性疼痛是由神经系统损伤或异常引起的一种难以治疗的疼痛状态，是发生在神经组织的疼痛，比如神经炎。这种疼痛主要以神经的病变为主，神经疼痛的特点，有一定的阵发性。有时候感觉到局部有疼痛，但是按压的时候并没有疼痛感。这就是神经性疼痛的特点。一般治疗神经疼痛，主要是使用营养神经的药物和配合止痛的药物治疗，最好是在医生指导下使用。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗神经性疼痛带来的损伤或相关神经性疼痛，或者用于预防神经性疼痛，或者延缓、或减少神经性疼痛、或阻止减轻神经性疼痛的药物中的用途；或者，本发明涉及一种预防和/或治疗神经性疼痛带来的损伤或相关神经性疼痛，或者预防神经性疼痛，或者延缓、或减少神经性疼痛、或阻止减轻神经性疼痛的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以提高受试者对于疼痛的耐受程度，对于异常性冷痛的耐受程度，促进运动协调能力。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以降低促炎因子(IL-1β、IL-6及IL-17)，抑制炎症反应。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，可以通过静脉注射给药。

脱髓鞘疾病

脱髓鞘疾病是一类病因不相同、临床表现各异、但有类同特征的获得性疾患，其特征的病理变化是神经纤维的髓鞘脱失而神经细胞相对保持完整。髓鞘的作用是保护神经元并使神经冲动在神经元上得到很快的传递，所以，髓鞘的脱失会使神经冲动的传送受到影响。

中枢神经系统的脱髓鞘疾病，包括多发性硬化、其他急性播散性脱髓鞘、中枢神经系统的其他脱髓鞘疾病。

多发性硬化症

多发性硬化症：(Multiple sclerosis,MS)是一种脱髓鞘性神经病变，患者脑或脊髓中的神经细胞表面的绝缘物质(即髓鞘)受到破坏，神经系统的讯息传递受损，导致一系列可能发生的症状，影响患者的活动、心智、甚至精神状态。这些症状可能包括复视、单侧视力受损、肌肉无力、感觉迟钝，或协调障碍。多发性硬化症的病情多变，患者的症状可能反覆发作，也可能持续加剧。在每次发作之间，症状有可能完全消失，但永久性的神经损伤仍然存在，这在病情严重的患者特别明显。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗多发性硬化症，或者用于预防多发性硬化症，或者延缓、或减少多发性硬化症、或阻止减轻多发性硬化症的药物中的用途；或者，本发明涉及一种预防和/或治疗多发性硬化症，或者预防多发性硬化症，或者延缓、或减少多发性硬化症、或阻止减轻多发性硬化症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物可以减轻脊髓脱髓鞘化。

在某些实施方案中，所述药物可以抑制脊髓部位的炎症，减少星型胶质细胞的数量，保护少突胶质细胞,或/如缓解脊髓节段的炎症。

在某些实施方案中，所述药物可以降低促炎因子(如IFN-γ、IL-17、TNF-α、IL-2)的含量、提高抑炎因子(如IL-10)、抑制炎症。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

神经炎症

神经炎症是由创伤性脑损伤、脑卒中、脑出血及各种神经退行性疾病引起的周围神经炎性及变性疾病。在正常情况下，神经炎症维持体内平衡并促进组织修复。然而，不受控制的神经炎症可能对大脑有害。因此，控制有害的炎症反应是一种很有前途的神经系统疾病的治疗方法。

“神经炎症”是神经或者神经群由于各种原因发生衰退或变质引起的炎症，包括由中毒、感染、营养代谢障碍、免疫异常、衰老、遗传变异等引起的中枢神经炎症和周围神经炎症。

“中枢神经系统感染”是指各种生物性病原体(包括病毒、细菌、立克次体、螺旋体、寄生虫、朊蛋白等)侵犯中枢神经系统实质、被膜及血管等引起的急性或慢性炎症性(或非炎症性)疾病，包括病毒性、细菌性、真菌性、寄生虫性等感染引起的大脑炎、小脑炎、间脑炎、脑干炎、脑脊髓炎、脑膜脑炎等。

在本文中，术语“细菌性脑膜脑炎”是指由细菌感染引起的软脑膜及脑实质的炎症，包括由链球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、双球菌、多杀性巴氏杆菌、化脓杆菌、坏死杆菌、变形杆菌、化脓性棒状杆菌、单核细胞增生李斯特杆菌等引起的脑膜炎、脑炎或脑膜脑炎，以及由硬脑膜下腔开放的颅脑创伤、中耳炎症、鼻-喉部炎症、头部其他局部炎性、以及感染灶破裂后栓子经淋巴或血液转移等引起细菌性脑膜炎、脑炎、或脑膜脑炎。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗神经性炎症，延缓或减少神经性炎症，或者阻止减轻神经性炎症的药物中的用途；或者，涉及预防和/或治疗神经性炎症，延缓或减少神经性炎症，或者阻止减轻神经性炎症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物可以减少促炎因子(如IL-1β、IL-6)，增加抑炎因子(如IL-10)，减轻炎症。

在某些实施方案中，所述药物可以促进神经元再生，减少神经元损伤和死亡，降低神经炎症反应，对神经元具有提供营养和促突触再生作用。

在某些实施方案中，所述药物可以减弱炎症反应，改善神经系统微环境。

在某些实施方案中，所述药物可以改善场景记忆能力。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

精神障碍

精神障碍指的是大脑机能活动发生紊乱，导致认知、情感、行为和意志等精神活动不同程度障碍的总称。常见的有情感性精神障碍、脑器质性精神障碍等。致病因素有多方面：先天遗传、个性特征及体质因素、器质因素、社会性环境因素等。精神障碍包括精神分裂症、躁狂抑郁性精神障碍、狂想障碍症(妄想、幻觉)、恐惧症(恐怖症、焦虑症)、行为意志障碍症(强迫症)、产后精神障碍症(产后精神病、产后忧郁症、产妇忧郁症)、更年期精神障碍、偏执性精神障碍和各种器质性病变伴发的精神障碍(谵妄症、遗忘综合症、痴呆、神经性贪/厌食症、创伤后应激症)。

(1)心境障碍

心境障碍也称情感性精神障碍，是指由各种原因引起的以显著而持久的情感或心境改变为主要特征的一组疾病。临床上主要表现为情感高涨或低落，伴有相应的认知和行为改变和有幻觉尧妄想等精神病性症状。心境障碍包括抑郁症、躁狂症、双相障碍症、持续性心境障碍和恶劣心境症。

(2)抑郁症

抑郁症又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。

临床主要表现为心境低落、思维迟缓、意志活动减退、认知功能损害和睡眠障碍等躯体症状。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗抑郁症，或者延缓、或减少抑郁症或者阻止减轻抑郁症的药物中的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗抑郁症，或者延缓、或减少抑郁症或者阻止减轻抑郁症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物可以促进神经生长和发育。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，静脉或脑部注射给药。

在另一方面，本发明还提供了用于一种预防、治疗、延缓和/或减轻神经系统疾病的产品，其含有本发明的间充质干细胞群。在某些实施方案中，所述产品中还含有另外的活性成分，所述另外的活性成分如上文中定义。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。在某些实施方案中，所述产品为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂或胶囊剂。在某些实施方案中，所述产品为植入物。

皮肤疾病

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗皮肤疾病；或者，本发明提供预防和/或治疗皮肤疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

皮肤是人体表面积最大的器官。它是保护内部组织免受机械损伤，微生物感染，紫外线辐射和极端温度影响的关键结构。

皮肤系统疾病包括病毒性皮肤病、细菌性皮肤病、真菌性皮肤病、动物性皮肤病、物理性皮肤病、皮炎、湿疹、药疹、荨麻疹类皮肤病、瘙痒性皮肤病、红斑鳞屑性皮肤病、结缔组织病、大疱性皮肤病、血管炎性皮肤病、皮肤附属器官疾病、色素障碍性皮肤病、遗传性皮肤病、皮肤肿瘤、性传播疾病。

鳞屑性皮肤病选自银屑病、副银屑病、多形性红斑、环状红斑、单纯糠疹、玫瑰糠疹、连圈状糠秕疹、石棉状糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、念珠状红苔藓、硬化萎缩性苔藓、线状苔藓、剥脱性皮炎，或其任何组合。

银屑病是红斑鳞屑性皮肤病的一种。

皮炎是一种皮肤炎症性疾病。

皮炎具有明显的皮肤损害，多发生在颈后部或其两侧、肘窝、腘窝、前臂、大腿、小腿及腰骶部等，常成片出现，呈三角形或多角形的平顶丘疹，皮肤增厚，皮脊突起，皮沟加深，形似苔藓，常呈淡红或淡褐色。表现为皮肤出现脱皮、剥落、变厚、变色、及碰触时会发痒等现象。包括：

神经性皮炎：中青年多见，先有剧烈瘙痒，后有皮损；皮疹为扁平丘疹，苔藓样变，无渗出；皮疹多发于颈部、四肢伸侧、腰氐部、腘窝、外阴；病程慢性，常反复发作。

特应性皮炎：最初病损多为面颊部，初起时为散发或群集的小红丘疹或红斑，逐渐增多，并可见小水疱、黄白色鳞屑痂皮，可有渗出、糜烂及继发感染。瘙痒剧烈。慢性表现为干性、较大、较隆起的棕红色丘疹和粗糙而带皮屑的棕褐色苔癣样变，可融合成片。经过搔抓，常有少许渗液、表皮剥脱及抓痕。

夏季皮炎：初起时皮损为针尖大小红斑、丘疹，因瘙痒搔抓后可出现抓痕、血痂、皮肤肥厚及色素沉着，无糜烂及渗液，好发于成年人的四肢伸侧。当气温下降时病情明显好转，并可自愈，病情与气候明显有关。

脂溢性皮炎：皮疹初起为毛囊口周红色小丘疹，渐发展融合成黄红色斑片，上覆有油腻性鳞屑或痂皮。由于病变发生的部位不同，临床表现略有差别。

婴儿脂溢性皮炎常于出生后1～3个月发病，前头顶或整个头皮可覆满厚薄不等油腻性灰黄色或黄褐色痂屑，可累及眉区、鼻唇沟、耳后等处，微痒。一般在3～4周内痊愈，若持续不愈，常并发感染或异位性皮炎。

日光性皮炎：是由日光诱发的一种迟发性光变态反应性皮肤病。临床表现为多形性皮疹可有红斑、丘疹、水疱、糜烂、鳞屑、苔藓样变，常以某种皮疹为主。

念球菌性皮炎多发于皮肤皱褶部如腹股沟，肛周臀裂部，腋窝，女性乳房下皮肤，也可发于龟头包皮内和大小阴唇，指甲沟和口角等处。皮疹多呈局部皮肤潮红，轻度肿胀，表面可糜烂，分泌物有异臭味。有时也可呈干燥，脱屑。小儿念珠菌性皮炎还常累及躯干，颈部皮肤，呈广泛密集红色斑丘疹，外观似热痱。可同时侵犯口腔或外阴粘膜，常有乳酪样分泌物呈假膜状。

蚊虫叮咬型皮炎：是被虫类叮咬，接触其毒液或虫体的粉毛而引起的皮炎。较为常见的害虫有跳蚤、虱类、蠓、刺毛虫、飞蛾、蚊、臭虫、蜂等。会出现红斑、丘疹、风团等症状，严重的可出现水疱或大疱，在蜇咬部位可见到瘀点或水疱。

激素依赖性皮炎是因长期反复不当的外用激素引起的皮炎。同一部位外用高效皮质类固醇激素3周以上，皮肤出现红斑、丘疹、干燥脱屑、萎缩、萎缩纹、毛细血管扩张、紫癜、痤疮、色素沉着异常、酒渣鼻样皮炎、口周皮炎、光过敏、多毛、不易辩认的癣，鱼鳞病样变化等继发症状等，局部有明显自觉瘙痒或灼热感。

在某些实施方案中，所述药物还包含载体或赋形剂。

在某些实施方案中，所述药物还包含第二活性成分。

在某些实施方案中，所述第二活性成分选自依巴斯汀片、氯雷他定片、西替利嗪片、糠酸莫米松软膏、卤米松软膏、莫匹罗星软膏、夫西地酸软膏、头孢克肟片、罗红霉素片、奈替芬酮康唑软膏、舍他康唑软膏、伊曲康唑片、特比萘芬片、阿昔洛韦片，伐昔洛韦片、喷昔洛韦软膏、干扰素凝胶或其任何组合。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，所述单位剂量的药物含有不少于1×10 ⁴个(例如不少于1×10 ⁴个，不少于3×10 ⁴个，不少于5×10 ⁴个，不少于7×10 ⁴个，不少于1×10 ⁵个，不少于3×10 ⁵个，不少于5×10 ⁵个，不少于7×10 ⁵个，不少于1×10 ⁶个，不少于3×10 ⁶个，不少于5×10 ⁶个，不少于7×10 ⁶个，不少于1×10 ⁷个，不少于3×10 ⁷个，不少于5×10 ⁷个，不少于7×10 ⁷个，不少于1×10 ⁸个，不少于3×10 ⁸个，不少于5×10 ⁸个，不少于7×10 ⁸个，不少于1×10 ⁹个，不少于3×10 ⁹个，不少于5×10 ⁹个，不少于7×10 ⁹个，不少于1×10 ¹⁰个，不少于3×10 ¹⁰个，不少于5×10 ¹⁰个或不少于7×10 ¹⁰个，优选1*10 ⁶、3*10 ⁶、5*10 ⁶个，更优选3*10 ⁶个)所述间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞的给药剂量不少于1*10 ⁴个/mL((例如不少于1×10 ⁴，不少于3×10 ⁴，不少于5×10 ⁴，不少于7×10 ⁴，不少于1×10 ⁵，不少于3×10 ⁵，不少于5×10 ⁵，不少于7×10 ⁵，不少于1×10 ⁶，不少于3×10 ⁶，不少于5×10 ⁶，不少于7×10 ⁶，不少于1×10 ⁷，不少于3×10 ⁷，不少于5×10 ⁷，不少于7×10 ⁷，不少于1×10 ⁸，不少于3×10 ⁸，不少于5×10 ⁸，不少于7×10 ⁸，不少于1×10 ⁹，不少于3×10 ⁹，不少于5×10 ⁹，不少于7×10 ⁹，不少于1×10 ¹⁰，不少于3×10 ¹⁰，不少于5×10 ¹⁰或不少于7×10 ¹⁰，优选1*10 ⁶、3*10 ⁶、5*10 ⁶个/mL，更优选3*10 ⁶个/mL)。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在另一个方面，本发明提供一种治疗皮肤疾病的产品，其包含第一活性成分间充质干细胞群。

在某些实施方案中，所述皮肤疾病如前面所描述或定义。

在某些实施方案中，所述产品还包含第二活性成分。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

特应性皮炎(Atopic dermatitis,AD)

特应性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是一种慢性、复发性、瘙痒性及炎症性皮肤病。AD已经成为一个重要的公共卫生问题，其儿童患病率高达20％，成年人患病率3-10％。AD的发病机制是复杂的，涉及遗传、免疫及环境等多方面因素，而其中免疫功能的异常，特别是免疫细胞发挥免疫应答效应在AD发病中占有重要地位。

目前，AD的治疗通常涉及局部和(或)全身使用糖皮质激素及免疫抑制剂，但是局部使用糖皮质激素对于中、重度AD患者来说作用有限，而系统使用免疫制剂存在骨髓抑制及增加感染机会等风险；新的生物制剂如抗白细胞介素(IL)-4R单克隆抗体杜匹鲁单抗(Dupilum-ab)及抗免疫球蛋白IgE单克隆抗体奥马珠单抗(Omalizumab)等研究结果有限，并且存在差异性，因此发展新型及安全有效的治疗AD的方法十分必要。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗特应性皮炎的用途，或者在制备用于在受试者中预防特应性皮炎，或者延缓、或减少特应性皮炎或者阻止减轻特应性皮炎。

本发明提供M细胞对特应性皮炎的治疗，M细胞治疗可以改善小鼠皮肤的微环境，抑制炎症情况，皮肤附属器官比OVA组也要多，说明M细胞可以保护皮肤的附属器官，对特应性皮炎起到很好的治疗效果。

在某些实施方案中，所述药物组合可以缓解皮疹红斑，减轻特应性皮炎表型，减轻AD样皮损，减少脂肪层厚度或/和减少角质层厚度。

在某些实施方案中，所述药物组合可以降低瘙痒程度，保护皮肤的附属器官，降低肥大细胞增生，调解Th1/Th2细胞失衡，降低CD19阳性细胞IgE表达强度，改善过敏性疾病，和/或抑制炎症反应。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，皮下注射或皮下点注射给药。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含前述生物载体或者药学上可接受的生物材料，包括但不限于胶原支架、Matrigel、皮肤修复膜、氨基化明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纤维素聚乳酸、弹性蛋白原、透明质酸等。

在某些实施方案中，所述药物组合也包含生物抗体(例如但不限于杜匹鲁单抗、奥马珠单抗)。

烧伤或烫伤

烧伤：一般指热力，包括热液(水、汤、油等)、蒸气、高温气体、火焰、炽热金属液体或固体(如钢水、钢锭)等所引起的组织损害，主要指皮肤和/或黏膜，严重者也可伤及皮下或/和黏膜下组织，如肌肉、骨、关节甚至内脏。烫伤是由热液、蒸气等所引起的组织损伤，是热力烧伤的一种。

烫伤：是由无火焰的高温液体(沸水、热油、钢水)、高温固体(烧热的金属等)或高温蒸气等所致的组织损伤。常见低热烫伤，低热烫伤又可称为低温烫伤。是因为皮肤长时间接触高于体温的低热物体而造成的烫伤。

烧伤常常造成大面积的皮肤损伤，造成皮肤屏障功能丧失及内环境平衡紊乱，且创面愈合时间长，临床治疗上常常需要大面积的皮肤移植，但是烧伤病人皮肤有限，且取皮存在二次伤害，创面感染导致创面难以愈合及感染性休克等多种并发症，感染坏死创面的进行性加深，创面愈合后的瘢痕愈合造成挛缩畸形，造成外观上不美观及功能上的障碍。病人预后差，功能恢复不良，后期康复治疗增加了病人的心理负担及经济负担，所以寻找一种可以更快的促进创面愈合，更好地恢复皮肤的外观和功能的方法，成了烧伤界需要解决的问题。

迄今为止，皮肤损伤虽然通过自体皮肤移植或者人工皮肤移植进行治疗，但在大面积烧伤烫伤中，任然捉襟见肘，间充质干细胞的出现为皮肤损伤带来了一些希望，结合材料联合治疗。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗烧伤或烫伤中的用途，或者在制备用于在受试者中预防和/或治疗烧伤或烫伤的药物中的用途。

在某些实施方案中，所述药物组合物能用于解决皮肤损伤后无功能性恢复、皮肤移植来源有限、自体皮肤有限等问题。

在某实施方案中，所述药物组合物能够起到在皮肤损伤后让附属器官重建、加速伤口愈合、减少纤维化等作用，从而恢复皮肤功能、减小伤口面积、治疗皮肤损伤、保护皮肤。

在某实施方案中，所述药物组合物可以减轻烫伤后，伤口部位的炎症情况，抑制炎症。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以促进皮肤伤口的血管再生。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以促进毛囊再生，调高β-Catenin、CD133、Ki67等因子。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以减少胶原蛋白的沉积，治疗皮肤损伤。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的培养上清，或包含所述培养上清的药物组合物。在某些优选方案中，通过表面敷药、药物组合是通过表面移植或注射或表面喷射方式。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含前述生物支架或者药学上可接受的生物材料，包括但不限于胶原支架、Matrigel、皮肤修复膜、氨基化明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纤维素聚乳酸、弹性蛋白原、透明质酸等。

难治式皮肤损伤

难治性皮肤破损是多种疾病或损伤导致的皮肤破损现象，表现为皮肤易反复破溃、部分皮肤功能丧失、易产生瘢痕等皮肤增生组织等。常见导致皮肤难治性破损的因素有烧烫伤、糖尿病(导致糖尿病足)、红斑狼疮、银屑病等。

糖尿病足：糖尿病足病的主要症状是下肢疼痛及皮肤溃疡。糖尿病足溃疡与坏疽是导致临床非创伤性截肢的主要原因，同时也严重危害着糖尿病患者的劳动能力和生活质量。糖足通常由下肢神经病变、血管病变和感染共同作用的结果。

糖尿病并发症

1.糖尿病肾病

是糖尿病患者最重要的合并症之一。我国的发病率亦呈上升趋势，目前已成为终末期肾脏病的第二位原因，仅次于各种肾小球肾炎。由于其存在复杂的代谢紊乱，一旦发展到终末期肾脏病，往往比其他肾脏疾病的治疗更加棘手。但积极适当的干预措施能明显减少和延缓糖尿病肾病的发生，尤其在病程早期干预治疗效果甚佳。

2.糖尿病眼部并发症

(1)糖尿病性视网膜病变是糖尿病性微血管病变中最重要的表现，是一种具有特异性改变的眼底病变，是糖尿病的严重并发症之一。临床上根据是否出现视网膜新生血管为标志，将没有视网膜新生血管形成的糖尿病性视网膜病变称为非增殖性糖尿病性视网膜病变(或称单纯型或背景型)，而将有视网膜新生血管形成的糖尿病性视网膜病变称为增殖性糖尿病性视网膜病变。

(2)与糖尿病相关的葡萄膜炎大致上有以下4种情况：①与糖尿病本身相关的葡萄膜炎；②感染性葡萄膜炎，糖尿病患者发生内源性感染性眼内炎的机会较正常人明显增加；③伴有一些特定的葡萄膜炎类型，但二者是偶然的巧合，抑或是有内在的联系；④内眼手术后的感染性眼内炎或无菌性眼内炎。多发生于中年人和老年人糖尿病患者。

(3)糖尿病性白内障发生在血糖没有很好控制的青少年糖尿病患者。多为双眼发病，发展迅速，甚至可于数天、数周或数月内发展为完全混浊。

3.糖尿病足

足部是糖尿病这个多系统疾病的一个复杂的靶器官。糖尿病患者因周围神经病变与外周血管疾病合并过高的机械压力，可引起足部软组织及骨关节系统的破坏与畸形形成，进而引发一系列足部问题，从轻度的神经症状到严重的溃疡、感染、血管疾病、Charcot关节病和神经病变性骨折。实际上类似的病理改变也可以发生在上肢、面部和躯干上，不过糖尿病足的发生率明显高于其他部位。

4.糖尿病心血管并发症

包括心脏和大血管上的微血管病变、心肌病变、心脏自主神经病变，引起糖尿病患者死亡的首要病因。冠心病是糖尿病的主要大血管并发症，研究显示，糖尿病患者冠心病的死亡风险比非糖尿患者群高3～5倍。其病理机制是动脉粥样硬化，高血糖、高收缩压、高胆固醇、低密度脂蛋白增高、高密度脂蛋白下降、年龄、性别、吸烟、家族史均是其发病的危险因素。

5.糖尿病性脑血管病

是指由糖尿病所引起的颅内大血管和微血管病变，据统计，2型糖尿病患者有20％～40％会发生脑血管病，主要表现为脑动脉硬化、缺血性脑血管病、脑出血、脑萎缩等，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。

6.糖尿病神经病变

糖尿病神经病变最常见的类型是慢性远端对称性感觉运动性多发神经病变，即糖尿病周围神经病变，发病率很高，部分患者在新诊断为糖尿病时就已经存在周围神经病变了，遗憾的是在治疗上，尤其是在根治糖尿病神经病变方面相当困难，所以其重点还在于预防其发生和控制发展。

难治性皮肤破损并不是一种疾病，而是多种疾病或损伤导致的皮肤破损现象，表现为皮肤易反复破溃、部分皮肤功能丧失、易产生瘢痕等皮肤增生组织等。常见导致皮肤难治性破损的因素有烧烫伤、糖尿病、红斑狼疮、银屑病等。目前，对于这些问题尚无万全的解决方案，因为这种破损往往伴随有复杂的免疫紊乱和组织再生障碍，单一的治疗方案无法针对所有问题进行解决。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗难治性皮肤的用途，或者在制备用于在受试者中预防难治性皮肤，或者延缓、或减轻硬皮病或者阻止硬皮病，或缓解难治性皮肤的症状。在某些案例中，所述难治性皮肤源自于这些因素(例如但不限于烧烫伤、糖尿病、红斑狼疮、银屑病等)

在某些优选方案中，可以通过皮下注射给药。

在某些实施方案中，所述药物组合能在治疗难治性皮肤中提高伤口的愈合速度，减少伤口面积，促进皮肤伤口的血管再生，使皮肤损伤后再生。

在某些实施方案中，所述药物组合能在治疗难治性皮肤中降低CD3、F4/80、MPO基因或蛋白的表达，抑制炎症。

在某些实施方案中，所述药物组合能在治疗难治性皮肤中提高β-Catenin、CD133、Ki67、CD31基因或蛋白的表达。

在某些实施方案中，所述药物组合能促进毛囊再生。

在某些实施方案中，所述药物组合能够在糖尿病肾病中使促炎因子IL-1β，IL-6和TNFα的表达降低，可以减少肾小球膜增厚和巨噬细胞浸润，降低糖尿病引起的肾小球病变，增加大鼠的肾脏重量，肾脏与体重指数，因此对糖尿病肾病可以起到很好的治疗效果。

在某些实施方案中，所述药物组合能够在糖尿病足中，加速糖尿病足的愈合，减轻皮肤伤口的炎症情况，促进血管、毛囊的再生，减少胶原蛋白的沉积，抑制纤维化发生，因此可以有效治疗皮肤损伤。

在某些实施方案中，所述药物组合能够在糖尿病眼部并发症中，可以起到降血糖和调节炎症反应的作用，显著降低空腹血糖和HbA1c水平，对视功能以及黄斑水肿具有一定的改善趋势，因此可以很好的治疗糖尿病眼部并发症。

在某些实施方案中，所述药物组合能够在糖尿病并发的血管钙化中，可以抑制血管钙化，从而对并发症中血管钙化的疾病起到很好的治疗效果。

在某些实施方案中，所述药物组合能够在糖尿病神经病变中，可以增强星形胶质细胞抗氧化应激的能力，增强其清除脑内谷氨酸及维持脑内K+平衡的能力，从而促进神经元功能、脑内平衡和突触形成，改善糖尿病引起的认知障碍。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，可以通过皮下注射给药。

银屑病

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，具有顽固性和复发性的特点。病因未明，目前认为，是遗传因素与环境因素等多方面因素相互作用引起的疾病。

临床分为寻常型、脓包型、关节型、红皮病型四种常见类型。其皮损特征是起初出现红斑丘疹，表面覆盖一层层银白鳞屑，皮肤干枯，脱屑结痂，有的皮肤症状连成一片，状如地图，有的瘙痒，流脓流水，血迹斑斑，目不忍睹。

寻常型银屑病，表现十分明显，是因为皮炎而引起的红色丘疹。如绿豆般大小，然后会慢慢增大，形成银白色干燥的鳞屑。如果情况严重一些，大片的白鳞会覆盖全身，看起来特别吓人。甚至会伴随着出血现象，令人无法接受。

脓疱型：出现十分密集的水脓疱，大小不均等。随着病情的加重，脓疱也会不断增大，最后形成了红斑。这种症状属于急症，突然间爆发出来。患上此类型银屑病，患者会发热，会感到关节疼痛与肿胀。

红皮病型银屑病：表现为全身皮肤弥漫性潮红、浸润肿胀，并伴有大量糠状鳞屑，期间可有片状正常皮肤，可伴有全身症状如发热，表浅淋巴结肿大等，病程较长，易复发。

关节型银屑病：除皮损外可出现关节病变，任何关节都有可能受累，包括肘、膝大关节，指、趾小关节，脊椎及骶髂关节。可表现为关节的肿胀和疼痛，活动受限，严重时出现关节畸形，呈进行性发展，但类风湿因子检查常呈阴性。

银屑病(俗称牛皮癣)是一种大众熟知的皮肤病，一旦发病，皮肤上可出现红色丘疹或斑块，且覆有多层银白色鳞屑，好发于四肢、头背部，甚至累及全身，部分病例几乎终生不愈。目前尚无特效疗法。该病发病以青壮年为主，对患者的身体健康和精神状况影响较大，给社会经济造成了巨大的负担。流行病学调查显示，目前我国约有650万名银屑病患者，发病率为0.47％。

目前，银屑病被认为是由树突状细胞(Dendritic cell,DC)和T淋巴细胞主导、固有免疫及适应性免疫共同参与、遗传背景与环境因素相互作用所导致的自身免疫性皮肤疾病。由炎症情况导致角质细胞的过度增殖，等银屑病的特征性病变。针对银屑病发病机制中关键细胞因子(TNF-α、IL-12、IL-23、IL-17)的靶向拮抗生物制剂在临床治疗中极为有效，但长期维持治疗所需的高额费用以及潜在的严重不良反应，限制了该类生物制剂的广泛应用。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗银屑病的用途，或者在制备用于在受试者中预防银屑病，或者延缓、或减轻银屑病或者阻止减轻银屑病。

在某些实施方案中，所述药物组合可以缓解皮疹红斑，缓解鳞屑，缓解浸润程度，减轻银屑病样皮炎表型，减轻银屑病样皮损，减少表皮棘层或减少角质层厚度。

在某些实施方案中，所述药物组合可以降低ROS水平，减少脾脏中性粒细胞和树突状细胞的募集，减少炎性浸润细胞，或/和调节免疫功能。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，通过背部或静脉注射给药。

自身免疫性疾病

免疫系统疾病是指免疫系统受到损伤所引起的病理反应。主要包括：感染性疾病、超敏反应性疾病、自身免疫病、免疫增殖病、免疫缺陷病和免疫相关疾病等。本文中，术语“自身免疫性疾病”是指机体免疫系统功能异常导致机体攻击自身组织的疾病。常见的自身免疫病往往累及多个系统、器官(如皮肤、骨骼、肌肉、内脏等等)，从而形成系统性的自身免疫病。包括系统性红斑狼疮、强制性脊柱炎、类风湿性关节炎、银屑病、红皮病、肾小球肾炎、安卡相关性血管炎、硬皮病、原发性系统性淀粉样变、自身免疫性肝炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性胃炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、结节性红斑、桥本氏甲状腺炎、斑秃、湿疹一型糖尿病。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻自身免疫性疾病；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻自身免疫性疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自硬皮病、红斑狼疮(例如系统性红斑狼疮)、银屑病、类风湿性关节炎、皮肌炎、多发性硬化、重症肌无力、多发性肌炎、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD))、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、血管炎(例如系统性血管炎)、成人Still病或其任意组合。

在某些实施方案中，所述另外的活性成分选自抗炎药物或免疫抑制剂。在某些实施方案中，所述另外的活性成分选自非甾体抗炎药(如布洛芬、双氯芬酸、萘普生、吲哚美辛、吡罗昔康、美洛昔康、萘丁美酮或尼美舒利)、甾体抗炎药(如强的松、地塞米松或氢化考的松)、致炎性细胞因子的抗体或拮抗剂(例如，TNFα、IL-1、IL-6、IL-8、GM-CSF或PAF的抗体或受体拮抗剂)、抗炎细胞因子(如IL-10、IL-4、IL-11、IL-13或TGFβ)、抗增殖/抗代谢类药物(如环磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、莱氟米特)、钙调磷酸酶抑制剂(如环孢素、他克莫司)或其任意组合。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，并且所述单位剂量的药物中含有不少于1×10 ⁴个(例如不少于1×10 ⁴个，不少于3×10 ⁴个，不少于5×10 ⁴个，不少于7×10 ⁴个，不少于1×10 ⁵个，不少于3×10 ⁵个，不少于5×10 ⁵个，不少于7×10 ⁵个，不少于1×10 ⁶个，不少于3×10 ⁶个，不少于5×10 ⁶个，不少于7×10 ⁶个，不少于1×10 ⁷个，不少于3×10 ⁷个，不少于5×10 ⁷个，不少于7×10 ⁷个，不少于1×10 ⁸个，不少于3×10 ⁸个，不少于5×10 ⁸个，不少于7×10 ⁸个，不少于1×10 ⁹个，不少于3×10 ⁹个，不少于5×10 ⁹个，不少于7×10 ⁹个，不少于1×10 ¹⁰个，不少于3×10 ¹⁰个，不少于5×10 ¹⁰个或不少于7×10 ¹⁰个)所述间充质干细胞。在某些实施方案中，所述单位剂量的药物中含有1×10 ⁵～1×10 ⁸个(例如1×10 ⁶～1×10 ⁸个，1×10 ⁶～1×10 ⁷个，或1×10 ⁶～5×10 ⁶个)所述间充质干细胞。

在另一方面，本发明还提供了用于一种预防、治疗、延缓和/或减轻自身免疫性疾病的产品，其含有本发明的间充质干细胞群。在某些实施方案中，所述产品中还含有另外的活性成分，所述另外的活性成分如上文中定义。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。在某些实施方案中，所述产品为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂或胶囊剂。在某些实施方案中，所述产品为植入物。

红斑狼疮

红斑狼疮是一种典型的自身免疫性结缔组织病，多见于15～40岁女性。红斑狼疮是一种疾病谱性疾病，可分为盘状红斑狼疮(DLE)、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)、系统性红斑狼疮(SLE)、深在性红斑狼疮(LEP)、新生儿红斑狼疮(NLE)、药物性红斑狼疮(DIL)等亚型。术语“系统性红斑狼疮”是指是一种自身免疫性疾病，发病缓慢，隐袭发生，临床表现多样、变化多端一种涉及许多系统和脏器的自身免疫性疾病，由于细胞和体液免疫功能障碍，产生多种自身抗体。可累及皮肤、浆膜、关节、肾及中枢神经系统等，并以自身免疫为特征，患者体内存在多种自身抗体，不仅影响体液免疫，亦影响细胞免疫，补体系统亦有变化。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻红斑狼疮(例如系统性红斑狼疮)；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻红斑狼疮(例如系统性红斑狼疮)的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群能够通过降低抗双链DNA抗体，减缓系统发病过程。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群能够通过避免或防止或抑制脾脏及项部淋巴肿大，减缓红斑狼疮的发病过程。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群能够促进肾小球的形成。

在某些实施方案中，在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群能够抑制促炎因子。

在某些实施方案中，在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群能够降低脾脏中T细胞群体数量(例如CD3 ⁺T细胞、CD4 ⁺T细胞和CD4 ⁺T细胞)。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的间充质干细胞群。在某些优选方案中，可以通过静脉注射给药。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，并且所述单位剂量的药物中含有不少于1×10 ⁴个(例如不少于1×10 ⁴个，不少于3×10 ⁴个，不少于5×10 ⁴个，不少于7×10 ⁴个，不少于1×10 ⁵个，不少于3×10 ⁵个，不少于5×10 ⁵个，不少于7×10 ⁵个，不少于1×10 ⁶个，不少于3×10 ⁶个，不少于5×10 ⁶个，不少于7×10 ⁶个，不少于1×10 ⁷个，不少于3×10 ⁷个，不少于5×10 ⁷个，不少于7×10 ⁷个，不少于1×10 ⁸个，不少于3×10 ⁸个，不少于5×10 ⁸个，不少于7×10 ⁸个，不少于1×10 ⁹个，不少于3×10 ⁹个，不少于5×10 ⁹个，不少于7×10 ⁹个，不少于1×10 ¹⁰个，不少于3×10 ¹⁰个，不少于5×10 ¹⁰个或不少于7×10 ¹⁰个)所述间充质干细胞。在某些实施方案中，所述单位剂量的药物中含有1×10 ⁴～1×10 ¹⁰个(例如1×10 ⁶～1×10 ⁸个，1×10 ⁶～1×10 ⁷个，或1×10 ⁶～5×10 ⁶个)所述间充质干细胞。

硬皮病

皮肤是人体表面积最大的器官。它是保护内部组织免受机械损伤，微生物感染，紫外线辐射和极端温度影响的关键结构。皮肤系统疾病包括病毒性皮肤病、细菌性皮肤病、真菌性皮肤病、动物性皮肤病、物理性皮肤病、皮炎、湿疹、药疹、荨麻疹类皮肤病、瘙痒性皮肤病、红斑鳞屑性皮肤病、结缔组织病、大疱性皮肤病、血管炎性皮肤病、皮肤附属器官疾病、色素障碍性皮肤病、遗传性皮肤病、皮肤肿瘤、性传播疾病。

硬皮病是皮肤结缔组织病的一种。硬皮病或全身性硬化症(SSC)是一种进行性、衰弱性自身免疫病，其特征在于皮肤成纤维细胞将过量蛋白沉积于胞外基质中，也称作皮肤纤维化。典型的皮肤损害依次经历肿胀期、浸润期、萎缩期三个阶段，病变呈对称性性，病变多由手指逐渐向近端扩展，并累及心、肺、肾、消化道等内脏器官的结缔组织病。

硬皮病是一种以皮肤增厚和局限或弥漫性纤维化为特点的自身免疫性疾病，可累及肺、肾、肝、心脏等器官，发病机制未明。目前研究发现，疾病主要涉及小血管病变、细胞外基质过量积聚所致的纤维化和免疫异常等三方面。炎性细胞浸润为硬皮病早期阶段的主要特征，以T淋巴细胞浸润为主，研究显示，T淋巴细胞可以释放多种细胞因子，引起炎症及血管病变，激活成纤维细胞及促进胶原纤维的合成。目前，对于硬皮病主要以免疫抑制剂和对症治疗为主，但治疗效果并不理想，而且不良反应较多，需要寻找更为有效的治疗方法。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻硬皮病；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻硬皮病的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群能在硬皮病中使皮肤真皮层明显变薄，减少胶原纤维积聚。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群能在硬皮病中可以减少皮肤硬化变厚的发生，对硬皮病起到有效的治疗作用。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群能在硬皮病中增加毛囊数量，减少真皮层厚度。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群能在硬皮病中防止脂肪层明显变薄，防止皮肤附属器官减少。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群能在硬皮病中抑制炎性因子(如IL-17、IL-6、TNF)，抑制炎性因子表达水平，或/和提高抑炎因子表达水平(如IL10)，提高MMP1蛋白表达水平，降低或抑制平滑肌肌动蛋白(a-SMA)表达。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的间充质干细胞群。在某些优选方案中，可以通过皮下注射给药。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，并且所述单位剂量的药物中含有不少于1×10 ⁵个(例如不少于1×10 ⁵个，不少于5×10 ⁵个，不少于1×10 ⁶个，不少于2×10 ⁶个，不少于3×10 ⁶个，不少于4×10 ⁶个，不少于5×10 ⁶个，不少于6×10 ⁶个，不少于7×10 ⁶个，不少于8×10 ⁶个，不少于9×10 ⁶个，不少于1×10 ⁷个，不少于3×10 ⁷个，不少于5×10 ⁷个，不少于7×10 ⁷个，不少于1×10 ⁸个，不少于3×10 ⁸个，不少于5×10 ⁸个或不少于7×10 ⁸个)所述间充质干细胞。在某些实施方案中，所述单位剂量的药物中含有1×10 ⁵～1×10 ⁸个(例如1×10 ⁶～1×10 ⁸个，1×10 ⁶～1×10 ⁷个，或1×10 ⁶～5×10 ⁶个)所述间充质干细胞。

呼吸系统疾病

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗呼吸系统疾病；或者，本发明提供预防和/或治疗呼吸系统疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

呼吸系统(Respiratory System)是人体与外界空气进行气体交换的一系列器官的总称，包括鼻、咽、喉、气管、支气管及由大量的肺泡、血管、淋巴管、神经构成的肺，以及胸膜等组织。临床上常将鼻、咽、喉称为上呼吸道，气管以下的气体通道(包括肺内各级支气管)部分称为下呼吸道。

肺部疾病是指肺脏本身的疾病或全身性疾病的肺部表现。主要包括感染性肺部疾病、与大气污染和吸烟有关的肺部疾病、与职业有关的肺部疾病、与免疫有关的肺部疾病、与遗传有关的肺部疾病以及原因不明的肺部疾病。在一些实施方案中，所述肺部疾病选自肺部血管疾病、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫症、尘肺和肺炎。在一些实施方案中，所述肺部血管疾病选自肺高血压、肺心病、肺栓塞、肺血管炎、慢性阻塞性肺疾病和肺间质病。在一些实施方案中，所述肺部疾病为肺动脉高压肺动脉高压(PAH)。

与职业有关的肺部疾病：

是指从事某些职业时，吸入有害的粉尘、烟雾或毒物引起肺部损害引起的肺部疾病，例如尘肺。有害的粉尘包括二氧化硅(即石英)、硅酸盐、煤、铁、锡。烟雾包括二氧化硫、二氧化氮、铵、盐酸、氯、光气等有害气体和强酸烟雾。有毒物质包括铀、镍、铬酸盐、石棉、二氯甲醚等。

尘肺：

尘肺是由于在职业活动中长期吸入生产性粉尘(灰尘)，并在肺内潴留而引起的以肺组织弥漫性纤维化(疤痕)为主的全身性疾病。尘肺按其吸入粉尘的种类不同，可分为无机尘肺和有机尘肺。在生产劳动中吸入无机粉尘所致的尘肺，称为无机尘肺。尘肺大部分为无机尘肺。吸入有机粉尘所致的尘肺称为有机尘肺，如棉尘肺、农民肺等。

尘肺是一种进行性慢性疾病，它不像急性传染病或其他慢性病(如肺结核、高血压、糖尿病等)那样能在短期内看到比较明显的治疗效果，一般需要持续几年的长期治疗才能获得较明显的疗效。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗尘肺，或者延缓、或减少尘肺、或阻止减轻尘肺的药物中的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗尘肺，或者延缓、或减少尘肺、或阻止减轻尘肺的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，本发明所述药物能够降低血清中炎症因子水平，提高肺功能，降低肺部致密部面积，和/或减少纤维化形成。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

肺炎：

肺炎是指肺泡、远端气道和肺间质的感染性炎症，可由细菌、病毒和其他病原体等因素感染引起，其中以细菌性和病毒性肺炎最为常见。广义上，肺炎可由病原微生物、理化因素、免疫损伤、过敏及药物所致。患者常有发烧、咳嗽、呼吸困难等典型症状。

肺气肿：

肺气肿是指终末细支气管远端的气道弹性减退，过度膨胀、充气和肺容积增大或同时伴有气道壁破坏的病理状态。按其发病原因肺气肿有如下几种类型：老年性肺气肿、代偿性肺气肿、间质性肺气肿、灶性肺气肿、旁间隔性肺气肿、阻塞性肺气肿。

支气管炎：

支气管炎是指气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症。支气管炎主要原因为病毒和细菌的反复感染形成了支气管的慢性非特异性炎症。主要包括急性支气管炎和慢性支气管炎。

慢性支气管炎：

慢性支气管炎是气管、支气管黏膜及周围组织的慢性非特异性炎症。主要症状为咳嗽、咳痰，或伴有喘息。

慢性阻塞性肺疾病:

慢性阻塞性肺疾病是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。与有害气体及有害颗粒的异常炎症反应有关，致残率和病死率很高。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗慢性肺阻，或者延缓、或减少慢性肺阻、或阻止减轻慢性肺阻的药物中的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗慢性肺阻，或者延缓、或减少慢性肺阻、或阻止减轻慢性肺阻的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施案例中，所述药物可以减少肺部致密部面积，改善肺功能，包括肺活量、改善最大通气量，缩小气道阻力，降低肺泡平均截距，维持肺部结构完整性，或/和提高动脉血的氧分压。

在某些实施案例中，所述药物可以降低促炎症因子水平，提高抑炎症因子水平，抑制炎症。

在某些实施案例中，所述药物可以降低肺部Collagen I和α-SMA蛋白的表达量，可以抑制纤维化的发生。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

免疫相关的肺部疾病：

免疫相关的肺部疾病是指当肺部受外界致敏原侵袭时，肺内可产生保护性的免疫和过敏反应。主要表现为急性、亚急性或慢性间质性肺炎。

感染性肺部疾病：

感染性肺部是指由病原微生物感染肺部所引发的疾病。主要分为细菌性肺炎、病毒性肺炎、支原体肺炎、真菌性肺炎和肺结核。细菌性肺炎是由细菌感染引起的肺炎，包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性杆菌等感染引起的肺炎。病毒性肺炎是由上呼吸道病毒感染引起的肺炎，主要包括流行性感冒病毒、副流感病毒、巨细胞病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒(SARS病毒、MERS病毒和新型冠状病毒)和某些肠道病毒等引起的流行性感冒、咽炎、非典型肺炎(SARS)、中东呼吸综合症(MERS)和新冠肺炎(COVID-19)等。支原体肺炎是由肺炎支原体引起的肺炎。真菌性肺炎包括由曲霉菌等真菌引起的肺炎。肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的肺疾病。

急性呼吸衰竭：

急性呼吸衰竭是由于呼吸系统疾病，如严重呼吸系统感染、急性呼吸道阻塞性疾病、重度或危重哮喘、各种原因引起的急性肺水肿、肺血管疾病、胸廓外伤或手术损伤、自发性气胸和急剧增加的胸腔积液导致肺通气和或换气功能障碍，急性颅内感染、颅脑外伤、脑血管病变等直接或间接抑制呼吸中枢，脊髓灰质炎、重症肌无力、有机磷中毒及颈椎外伤等损伤神经肌肉传导系统，引起通气不足而导致急性呼吸衰竭。

呼吸窘迫综合征(ARDS):

是急性呼吸衰竭的一个类型，由于各种原因引起肺脏内血管组织因液体交换功能紊乱致肺含水量增加、肺顺应性减低、肺泡萎陷和通气血流比例失调。以严重低氧血症和呼吸极度困难窘迫为典型症状。主要是由重感染、创伤、休克等肺内外因素导致。呼吸窘迫综合征包括急性呼吸窘迫综合征和新生儿呼吸窘迫综合征。

新型冠状病“SARS-CoV-2”感染导致的肺炎“COVID-19”潜伏期长，传染性强，危害性大。截止目前，COVID-19尚无有效治疗药物，但重型、危重型患者COVID-19患者的预后差，病死率高，其临床救治需求尤其迫切。

根据最新的流行病学数据，COVID-19中部分患者出现呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS),导致呼吸衰竭，进而累及其它脏器官功能，甚至导致死亡。ARDS表现为快速进展的呼吸困难、低氧血症、弥漫性肺浸润直至呼吸衰竭的临床综合症。ARDS目前的治疗方案仅局限于基础医疗护理和支持性通气策略等对症治疗，尚无法逆转疾病进程、提高患者生活质量及降低病死率。机械通气是急性呼吸窘迫综合征患者的主要治疗手段。在机械通气过程中，常出现呼吸机相关性肺炎、呼吸机相关肺损伤、深静脉血栓形成、机械通气脱机困难、肺间质纤维化等并发症。药物治疗手段包括：皮质类固醇、他汀类药物、阿司匹林、β-2受体激动剂、表面活性剂和吸入NO等，都没有显示出明显疗效。上述两种治疗手段，连同血液净化治疗、营养干预、液体控制等辅助性手段，都不能满足COVID-19所致ARDS的治疗。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗呼吸窘迫综合征，或者延缓、或减少呼吸窘迫综合征、或阻止减轻呼吸窘迫综合征的药物中的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗呼吸窘迫综合征，或者延缓、或减少呼吸窘迫综合征、或阻止减轻呼吸窘迫综合征的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物可以减轻憋喘，促进病灶部位吸收好转、抑制炎症，和/或恢复肺部功能。

在某些实施方案中，所述药物可以降低低促炎细胞因子(如IL-1α、IL-1β、IL-5、IL-8、IL-25和CXCL10/IP-10)，提高抑炎细胞因子(如IL-1RA、RANTES)水平。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。优选通过静脉注射给药。

特发性间质性肺炎:

特发性间质性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia,IIP)又名特发性肺间质纤维化，特发性意指原因未明，为一组原因不明的进行性下呼吸道疾病，病理过程一般为进展缓慢的弥漫性肺泡炎和/或肺泡结构紊乱，最终导致肺泡结构破坏，形成肺泡腔内完全型纤维化和囊泡状的蜂窝肺。IIPs分为主要的IIPs、罕见的IIPs和不能分类的IIPs。主要的IIPs 有6种类型，包括特发性肺纤维化(IPF)、特发性非特异性间质性肺炎(iNSIP)、呼吸性细支气管炎伴间质性肺疾病(RB-ILD)、脱屑性间质性肺炎(DIP)、隐原性机化性肺炎(COP)、急性间质性肺炎(AIP)。少见的IIPs有2种类型，包括特发性淋巴细胞性间质性肺炎(iLIP)、特发性胸膜肺实质弹力纤维增生症(iPPFE)。

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF):

特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性进展性的以肺间质纤维化为主要特征的肺部疾病，其病因目前仍不明确，是主要的特发性间质性肺炎中最为常见的一种类型。该病多见于老年人，近年来发病率呈上升趋势。但IPF的诊断目前仍是临床难题，IPF起病隐匿，早期常无明显临床表现，且影像学及肺功能表现不典型，因此IPF患者常在疾病的发展至出现多种并发症后才得以确诊。然而，IPF目前尚无有效治疗方案，患者的肺功能随疾病进展不断恶化，中位生存期仅为2-3年。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗特发性肺纤维化，或者延缓、或减少特发性肺纤维化、或阻止减轻特发性肺纤维化的药物中的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗特发性肺纤维化，或者延缓、或减少特发性肺纤维化、或阻止减轻特发性肺纤维化的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以使肺部病灶部位吸收好转，减少肺部纤维化。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

肺血管病：

肺血管病是先天的、遗传的或获得的肺循环结构和/或功能改变，包括肺动脉、肺静脉及肺微血管病变。主要症状是肺动脉高压的原发或继发病变，以及肺静脉阻塞性疾病。其主要原因与遗传易感性和环境因素的相互作用有关。继发性肺动脉高压与肺静脉高压，慢性缺氧，血栓或栓塞性疾病有关，也可直接累及肺血管病变。

肺动脉高压(Pulmonary hypertension,PH)：

肺动脉高压指肺动脉压力升高超过一定界值的一种血流动力学和病理生理状态，可导致右心衰竭，可以是一种独立的疾病，也可以是并发症，还可以是综合征。患者伴有体乏无力和呼吸困难等主要症状,不经治疗病程发展较快,往往发展为右心衰竭进而导致死亡。其特征包括肺血管重构,血管阻塞引起肺血管阻力(Pulmonary vascular resistance,PVR)、肺动脉压力增高和右心室肥厚。

依据病理表现、血流动力学特征以及临床诊治策略将肺动脉高压分为五大类：①动脉性肺动脉高压；②左心疾病所致肺动脉高压；③缺氧和/或肺部疾病引起的肺动脉高压；④慢性血栓栓塞性肺动脉高压；⑤多种机制和/或不明机制引起的肺动脉高压。

目前最有效的治疗方法是药物治疗,包括前列环素、内皮素-1受体拮抗剂、5型磷酸二酯酶抑制剂等3大类药物。这些药物虽然可以改善病情,但没有从根本上改善肺血管重构, 且总体而言价格较高,不能满足长期治疗的需要。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗肺动脉高压，延缓或减轻肺动脉高压的药物中的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗肺动脉高压，延缓或减轻肺动脉高压的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物可以在治疗肺动脉高压中降低右心室收缩压。

在某些实施方案中，所述药物可以在治疗肺动脉高压中抑制肺动脉高压的形成，提高肺动脉血流加速时间、降低右室与左室直径比值、降低肺动脉平均压，降低肺动脉高压大鼠的肺细小动脉中膜厚度和肺细小动脉管壁面积。

在某些实施方案中，所述药物能抑制炎症，调高抑炎症因子水平，降低促炎症因子水平。

在一些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，并且所述单位剂量的药物中含有不少于1×10 ⁴个(例如不少于1×10 ⁴个，不少于3×10 ⁴个，不少于5×10 ⁴个，不少于7×10 ⁴个，不少于1×10 ⁵个，不少于3×10 ⁵个，不少于5×10 ⁵个，不少于7×10 ⁵个，不少于1×10 ⁶个，不少于3×10 ⁶个，不少于5×10 ⁶个，不少于7×10 ⁶个，不少于1×10 ⁷个，不少于3×10 ⁷个，不少于5×10 ⁷个，不少于7×10 ⁷个，不少于1×10 ⁸个，不少于3×10 ⁸个，不少于5×10 ⁸个，不少于7×10 ⁸个，不少于1×10 ⁹个，不少于3×10 ⁹个，不少于5×10 ⁹个，不少于7×10 ⁹个，不少于1×10 ¹⁰个，不少于3×10 ¹⁰个，不少于5×10 ¹⁰个或不少于7×10 ¹⁰个，优选为3～6×10 ⁶个)的所述间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述药物中还含有其它活性成分，所述其它活性成分例如选自前列环素类似物、内皮素受体拮抗剂和磷酸二酯酶抑制剂；优选地，所述前列环素类似物选自贝前列素钠、伊洛前列素、依前列醇、曲前列尼尔及其任意组合；优选地，所述内皮素受体拮抗剂选自波生坦、安立生坦、马昔滕坦及其任意组合；优选地，所述磷酸二酯酶抑制剂选自西地那非、他达拉非、伐地那非、利奥西呱及其任意组合。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，给药剂量为不少于不少于1×10 ⁴个/次(例如不少于1×10 ⁴个/次，不少于3×10 ⁴个/次，不少于5×10 ⁴个/次，不少于7×10 ⁴个/次，不少于1*10 ⁵个/次，不少于3*10 ⁵个/次，不少于5*10 ⁵个/次，不少于7*10 ⁵个/次，不少于1×10 ⁶个/次，不少于3×10 ⁶个/次，不少于5×10 ⁶个/次，不少于7×10 ⁶个/次，不少于1×10 ⁷个/次，不少于3×10 ⁷个/次，不少于5×10 ⁷个/次，不少于7×10 ⁷个/次，不少于1×10 ⁸个/次，不少于3×10 ⁸个/次，不少于5×10 ⁸个/次，不少于7×10 ⁸个/次，不少于1×10 ⁹个/次，不少于3×10 ⁹个/次，不少于5×10 ⁹个/次，不少于7×10 ⁹个/次，不少于1×10 ¹⁰个/次，不少于3×10 ¹⁰个/次，不少于5×10 ¹⁰个/次或不少于7×10 ¹⁰个/次)，优选为3～6×10 ⁶个/天。

在某些实施方案中，所述方法还包括同时、相继或交替向受试者施用预防和/或治疗有效量的其它活性成分，所述其它活性成分例如选自前列环素类似物、内皮素受体拮抗剂和磷酸二酯酶抑制剂；优选地，所述前列环素类似物选自贝前列素钠、伊洛前列素、依前列醇、曲前列尼尔及其任意组合；优选地，所述内皮素受体拮抗剂选自波生坦、安立生坦、马昔滕坦及其任意组合；优选地，所述磷酸二酯酶抑制剂选自西地那非、他达拉非、伐地那非、利奥西呱及其任意组合。

在另一方面，本发明还提供了用于一种预防、治疗、延缓和/或减轻呼吸系统疾病的产品，其含有本发明的间充质干细胞群。在某些实施方案中，所述产品中还含有另外的活性成分，所述另外的活性成分如上文中定义。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。在某些实施方案中，所述产品为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂或胶囊剂。在某些实施方案中，所述产品为植入物。

眼部疾病

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗眼部疾病；或者，本发明提供预防和/或治疗眼部疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

眼部疾病选自眼表损伤(如角膜损伤)、干眼、睑板腺功能障碍(MGD)、青光眼、白内障、眼结膜炎、角膜炎、眼睑炎、撒粒肿、麦粒肿、视网膜病变、视网膜脱垂、眼底静脉血管病变或其任何组合。

在某些实施方案中，所述药物还包含载体或赋形剂。

在某些实施方案中，所述药物还包含第二活性成分。

在某些实施方案中，所述第二活性成分例如为抗菌消炎药物。

在某些实施方案中，所述第二活性成分选自盐酸四环素滴眼液、醋酸泼尼松眼膏、醋酸氢化可的松滴眼液、醋酸氢化可的松眼膏、地塞米松滴眼液、多粘菌素B滴眼液、谷胱甘肽滴眼液、红霉素眼膏、黄氧化汞眼膏、金霉素眼膏、硫酸阿托品眼膏、硼酸眼膏或其任何组合。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，所述单位剂量的药物含有不少于1×10 ⁴(例如不少于1×10 ⁴，不少于3×10 ⁴，不少于5×10 ⁴，不少于7×10 ⁴，不少于1×10 ⁵，不少于3×10 ⁵，不少于5×10 ⁵，不少于7×10 ⁵，不少于1×10 ⁶，不少于3×10 ⁶，不少于5×10 ⁶，不少于7×10 ⁶，不少于1×10 ⁷，不少于3×10 ⁷，不少于5×10 ⁷，不少于7×10 ⁷，不少于1×10 ⁸，不少于3×10 ⁸，不少于5×10 ⁸，不少于7×10 ⁸，不少于1×10 ⁹，不少于3×10 ⁹，不少于5×10 ⁹，不少于7×10 ⁹，不少于1×10 ¹⁰，不少于3×10 ¹⁰，不少于5×10 ¹⁰或不少于7×10 ¹⁰，优选1*10 ⁶、3*10 ⁶、5*10 ⁶个，更优选3*10 ⁶个)所述间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞的给药剂量不少于1*10 ⁴个/mL(例如不少于1×10 ⁴，不少于3×10 ⁴，不少于5×10 ⁴，不少于7×10 ⁴，不少于1×10 ⁵，不少于3×10 ⁵，不少于5×10 ⁵，不少于7×10 ⁵，不少于1×10 ⁶，不少于3×10 ⁶，不少于5×10 ⁶，不少于7×10 ⁶，不少于1×10 ⁷，不少于3×10 ⁷，不少于5×10 ⁷，不少于7×10 ⁷，不少于1×10 ⁸，不少于3×10 ⁸，不少于5×10 ⁸，不少于7×10 ⁸，不少于1×10 ⁹，不少于3×10 ⁹，不少于5×10 ⁹，不少于7×10 ⁹，不少于1×10 ¹⁰，不少于3×10 ¹⁰，不少于5×10 ¹⁰或不少于7×10 ¹⁰，优选1*10 ⁶、3*10 ⁶、5*10 ⁶个/mL，更优选3*10 ⁶个/mL)。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在另一个方面，本发明提供一种治疗眼部疾病的产品，其包含第一活性成分间充质干细胞群。

在某些实施方案中，所述眼部疾病如前面所描述或定义。

在某些实施方案中，所述产品还包含第二活性成分。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

眼表损伤

眼表损伤选自眼(如角膜)化学性烧伤(如碱、酸烧伤)、眼(如角膜)热烧伤、角膜损伤或其任何组合。

眼表损伤是全世界范围内致盲的主要原因之一，其中，最常见的原因是眼化学性烧伤(如碱、酸烧伤)和热烧伤，这类损伤对眼表的损伤重，治疗困难，预后较差，常导致伤眼失明，甚至丧失眼球。角膜碱烧伤在化学性烧伤中最严重，碱性物质会导致角膜组织液化坏死，造成角膜缘干细胞的严重破坏。角膜缘干细胞的严重缺失会导致持续的炎症反应，角膜结膜上皮化生，新生血管的长入及角膜基质的瘢痕化。后续引起的免疫炎症反应比较容易向深层发展，并造成角膜溃疡和穿孔、继发性青光眼及并发性白内障，严重破坏眼的解剖结构和视功能。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗眼表损伤的用途，或者在制备用于在受试者中预防眼表损伤，或者延缓、或减轻脑卒或者阻止减轻眼表损伤。

角膜碱烧伤是眼表损伤的一种。

在某些实施方案中，所述药物组合可以治疗角膜碱，减轻角膜碱烧伤，促进角膜碱损伤的恢复，减轻炎症，降低眼角膜的髓过氧化物酶(MPO)浓度，减少新生血管数量，降低MMP-9的水平，或/和减少促炎细胞因子(IL-6和IL-1抑制因子)和趋化因子(CXCL1/cinc1和CCL2/MCP-1)水平。

角膜：眼球壁前端吴血管的透明纤维膜，呈圆形，占外层面积的六分之一，主要由无血管的结缔组织构成；组织学上由前向后分五层：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。角膜高度透明，表面光滑，前凸后凹，形如凸凹透镜，像球面一样弯曲，有折光作用。

角膜碱烧伤：碱性物质的溶液、粉尘或气体接触角膜后，导致脂肪和蛋白质溶解，组织破坏，促使碱性物质继续扩散并渗透到深层组织，使角膜组织细胞分解、坏死，多发生在化工厂、实验室或施工场所。

角膜炎：角膜炎是角膜防御能力减弱时，外源性或内源性致病因素侵袭角膜组织引起的炎症。患者以眼痛、畏光、流泪、眼睑痉挛等眼部刺激症状为主要表现。角膜炎早期一般只局限于角膜的部分层次，得不到有效治疗时可逐步进展，晚期可造成不可逆的视力损害。感染性角膜炎多发生于角膜中央区，而免疫性角膜病易发生于角膜周边部。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，通过角膜注射给药。

运动系统疾病及骨骼相关疾病

运动系统疾病是指发生于骨、关节、肌肉、韧带等部位的疾病，临床常见。可表现为局部疾病也可表现为全身性疾病。局部者如外伤、骨折、脱位、畸形等。全身性疾病如类风湿性关节炎，可发生于手、腕、膝与髋等部位。骨关节结核常发生于脊柱、髋关节等部位。许多运动系统局部病变在矫形外科诊治。运动系统全身性疾病有的在内科诊治，如类风湿性关节炎，有的仍在矫形外科诊治，如骨关节结核。可按病因或发病部位分类。一般教科书中有时将运动疾病分为创伤与骨疾病两大类。创伤又分为骨折、脱位及软组织损伤等。骨病则按病因或解剖部分分类。

骨骼相关疾病包括所有与骨骼、关节、韧带、软骨及支持四肢、颈部及背部的结构相关的疾病。相关疾病选自软骨的扭伤、拉伤及撕裂伤、关节炎、滑囊炎、急性和慢性背痛、骨质疏松症、扳机指、成骨不全症以及其合并症等。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻运动系统疾病或骨骼相关疾病；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻运动系统疾病或骨骼相关疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案，所述运动系统疾病包括，例如创伤(例如骨折、脱位、软组织损伤等)，或骨疾病。在某些实施方案中，所述骨骼相关疾病选自软骨的扭伤、拉伤及撕裂伤、关节炎、滑囊炎、急性和慢性背痛、骨质疏松症、扳机指、成骨不全症以及其合并症。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，并且所述单位剂量的药物中含有不少于1×10 ⁴(例如不少于1×10 ⁴，不少于3×10 ⁴，不少于5×10 ⁴，不少于7×10 ⁴，不少于1×10 ⁵，不少于3×10 ⁵，不少于5×10 ⁵，不少于7×10 ⁵，不少于1×10 ⁶，不少于3×10 ⁶，不少于5×10 ⁶，不少于7×10 ⁶，不少于1×10 ⁷，不少于3×10 ⁷，不少于5×10 ⁷，不少于7×10 ⁷，不少于1×10 ⁸，不少于3×10 ⁸，不少于5×10 ⁸，不少于7×10 ⁸，不少于1×10 ⁹，不少于3×10 ⁹，不少于5×10 ⁹，不少于7×10 ⁹，不少于1×10 ¹⁰，不少于3×10 ¹⁰，不少于5×10 ¹⁰或不少于7×10 ¹⁰)所述间充质干细胞。在某些实施方案中，所述单位剂量的药物中含有1×10 ⁴～1×10 ¹⁰个(例如1×10 ⁶～1×10 ⁸个，1×10 ⁶～1×10 ⁷个，或1×10 ⁶～5×10 ⁶个)所述间充质干细胞。

在另一方面，本发明还提供了用于一种预防、治疗、延缓和/或减轻运动系统疾病或骨骼相关疾病的产品，其含有本发明的间充质干细胞群。在某些实施方案中，所述产品中还含有另外的活性成分，所述另外的活性成分如上文中定义。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。在某些实施方案中，所述产品为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂或胶囊剂。在某些实施方案中，所述产品为植入物。

关节炎或关节损伤

关节炎是指指任何会影响关节的疾病，症状常包括关节疼痛和僵硬，其他可能的症状包括发红、发热、肿胀、患病关节活动度缩小。某些关节炎，除了关节外，也会影响其他器官。发病可能是渐进式，或是突然急性发作。关节炎有超过100多种，最常见的是骨关节炎(退化性关节病)和类风湿性关节炎。

在本文中，术语“骨关节炎”是指以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。大多数骨关节炎病例的原因不明，并被称为“原发性骨关节炎”。当骨关节炎的原因已知时，其被称为“继发性骨关节炎”。继发性骨关节炎由其它疾病或情形引起。可导致继发性骨关节炎的情形包括关节结构的反复性损伤或手术、出生时关节异常(先天性异常)、痛风、糖尿病和其它激素紊乱。其它形式的关节炎包括系统性疾病，例如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻关节炎或关节损伤；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻关节炎或关节损伤的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，所述关节炎选自骨关节炎、创伤性关节炎和自身免疫性关节炎。在某些实施方案中，所述关节损伤是半月板损伤。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群用于在受试者中预防、治疗、延缓和/或减轻骨关节炎(OA)。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群可以改善运动活性，抑制神经产生的疼痛，治疗组织损伤或/和缓解关节炎的症状。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的所述间充质干细胞群。在某些优选方案中，通过关节腔内注射给药。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含由所述间充质干细胞群形成的细胞球。在某些实施方案中，所述药物组合物包含所述细胞球和生物材料的混合物。

在某些实施方案中，所述所述间充质干细胞群可以以悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物的形式进行移植。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群与另外的活性成分组合施用，因此所述药物还可以包含另外的活性成分(例如另外的治疗骨关节炎的治疗剂)。在某些实施方案中，所述间充质干细胞与另外的治疗剂同时、分开或相继施用。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。

半月板损伤

半月板是构成膝关节的重要结构之一，是两个半月状纤维软骨，位于股骨髁与胫骨平台之间，其外侧缘较厚，内侧缘较薄，内侧半月板呈"c"形，外侧半月板近似呈"o"形。半月板的功能即在于稳定膝关节，传布膝关节负荷力，促进关节内营养。半月板损伤(meniscusinjury)指旋转力、挤压、半月板自身疾病等因素导致半月板破裂，表现为膝关节剧痛，不能伸直，肿胀等，是膝部最常见的损伤之一。膝关节半月板损伤表现为膝关节局限性疼痛，部分患者有打软腿或膝关节交锁现象。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻半月板损伤；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻半月板损伤的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群可以降低膝关节疼痛，减轻局部水肿，缓解跛行、缓解交锁、或/和缓解疼痛。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的间充质干细胞群。在某些优选方案中，可以通过静脉给药。

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群与另外的活性成分组合施用，因此所述药物还可以包含另外的活性成分(例如另外的治疗半月板损伤的治疗剂)。在某些实施方案中，所述间充质干细胞与另外的治疗剂同时、分开或相继施用。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。

骨损伤

骨损伤是一种运动系统疾病，指由先天性因素或后天因素导致的骨缺损或缺损修复，以及骨结构的连续性完全或部分断裂。如骨折，常包含多发性骨折、骨盆骨折、股骨骨折、锁骨骨折、股骨颈骨折、髋骨骨折、胸腰椎骨折、骨质疏松导致的压缩性骨折、尺骨骨折、跟骨骨折、桡骨远端骨折、胫骨干骨折、胫骨平台骨折、股骨转子间骨折、踝关节骨折、下肢骨折、长骨骨干骨折、脊柱骨折及严重的开放性骨折等。骨缺损是因创伤或手术或外伤所致的骨质短缺，如创伤、炎症、骨病等因素所造成粉碎骨折、开放骨折大块骨组织缺损，炎症所致的骨坏死脱落分离，骨梗死或骨缺血性坏死所致大片骨坏死所造成的缺损等，这些都属于疾病所造成的骨缺损。而手术所造成的骨缺损及外伤时骨折块穿出肢体或发生于开放性骨折清创时失活骨被清除，也属于骨缺损。骨损伤根据损伤的部位不同，症状也不同。主要表现为疼痛，肿胀和活动受限。如半月板损伤时，病人自感觉为撕裂感和脆响感，膝关节局部疼痛，有压痛，不能完全伸膝，活动时膝关节有响声。慢性期时，关节疼痛症状减轻，但可出现膝关节打软，上下楼时疼痛加重，休息后可好转。久之可伴创伤性关节炎，肱四头肌萎缩。有的病人也可出现膝关节交锁症状。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻骨损伤；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻骨损伤的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群可以加速骨损伤的愈合，抑制神经产生的疼痛，治疗组织损伤或/和缓解关节炎的症状。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的间充质干细胞群。在某些优选方案中，通过肌肉注射给药。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群可以以悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物的形式进行移植

在某些实施方案中，本发明的间充质干细胞群与另外的活性成分组合施用，因此所述药物还可以包含另外的活性成分(例如另外的用于治疗骨损伤的治疗剂)。在某些实施方案中，所述间充质干细胞与另外的治疗剂同时、分开或相继施用。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，并且所述单位剂量的药物中含有不少于不少于1×10 ⁴个(例如不少于1×10 ⁴个，不少于3×10 ⁴个，不少于5×10 ⁴个，不少于7×10 ⁴个，不少于1×10 ⁵个，不少于3×10 ⁵个，不少于5×10 ⁵个，不少于7×10 ⁵个，不少于1×10 ⁶个，不少于3×10 ⁶个，不少于5×10 ⁶个，不少于7×10 ⁶个，不少于1×10 ⁷个，不少于3×10 ⁷个，不少于5×10 ⁷个，不少于7×10 ⁷个，不少于1×10 ⁸个，不少于3×10 ⁸个，不少于5×10 ⁸个，不少于7×10 ⁸个，不少于1×10 ⁹个，不少于3×10 ⁹个，不少于5×10 ⁹个，不少于7×10 ⁹个，不少于1×10 ¹⁰个，不少于3×10 ¹⁰个，不少于5×10 ¹⁰个或不少于7×10 ¹⁰个)所述间充质干细胞。在某些实施方案中，所述单位剂量的药物中含有1×10 ⁴～1×10 ¹⁰个(例如 1×10 ⁶～1×10 ⁸个，1×10 ⁶～1×10 ⁷个，或1×10 ⁶～5×10 ⁶个)所述间充质干细胞。

黏膜免疫系统

粘膜免疫系统(Mucosal immune system,MIS)是指广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道粘膜下及一些外分泌腺体处的淋巴组织，是执行局部特异性免疫功能的主要场所。粘膜免疫系统由肠粘膜相关淋巴组织(GALT)、支气管粘膜相关淋巴组织(BALT)、眼结膜相关淋巴组织(CALT)和泌尿生殖道粘膜相关淋巴组织(UALT)四部分构成，它们在抗病毒免疫反应中起着非常重要的作用。所谓粘膜结合淋巴组织，即沿着呼吸道、消化道、泌尿生殖道粘膜上皮及某些外分泌腺(哈德氏腺、胰腺、乳腺、泪道、唾液腺分泌管等)分布并广泛存在于上皮下的淋巴组织，是粘膜接触并摄取抗原和最初免疫应答产生的部位。其相关疾病包括胃肠道黏膜损伤(胃肠道感染、胃炎、肠炎等)、尿道生殖道相关疾病(尿道感染、尿道黏膜炎症、生殖道感染及相关炎症等)、口腔黏膜疾病(口腔黏膜感染性疾病、口腔黏膜变态反应性疾病、口腔黏膜溃疡类疾病、口腔黏膜大疱类疾病、口腔黏膜斑纹类疾病、口腔黏膜肉芽肿疾病、唇舌疾病、性传播疾病、口腔黏膜色素异常等)、中耳黏膜炎症(中耳炎等)、鼻腔粘膜病变(鼻窦炎、嗅觉障碍、变应性鼻炎等)、呼吸道黏膜疾病(慢性阻塞性肺疾病、哮喘、细菌或病毒感染的呼吸道疾病)等。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗粘膜免疫系统疾病；或者，本发明提供预防和/或治疗粘膜免疫系统疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

鼻部疾病

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗鼻部疾病；或者，本发明提供预防和/或治疗鼻部疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

“鼻部疾病(diseases of nose)”，包括外鼻、鼻前庭、鼻腔和鼻窦的疾病。可分为感染、出血、变态反应、肿瘤、外伤、异物、先天性畸形和结构异常等。鼻经常受到外界不良因素的影响，容易发生各种疾病。微生物的感染可致鼻疖、鼻前庭炎、鼻腔粘膜和鼻窦的炎症；鼻腔是变应原进入机体的门户，又是发生变态反应疾病的部位，所以花粉症和变应性鼻炎是常见病；某些口腔疾病如牙根感染可引起牙源性上颌窦炎。外鼻位于面部正中，易受外伤，外鼻又是维持容貌端正的重要标志，因此，对先天和后天性鼻畸形的手术要求较高。鼻腔和鼻窦是恶性肿瘤的好发部位，以上颌窦癌最多见，其次是鼻腔癌和筛窦癌。鼻在解剖上与颅腔、眼眶和口腔毗邻，鼻前庭、鼻腔和鼻窦的疾病可导致严重并发症，如脑膜炎、眼眶蜂窝织炎等；通过血行可致海绵窦感染，严重者可失明，甚至危及生命

术语“鼻部粘膜”是指覆盖于鼻腔表面的粘膜，其下方为软骨、骨或骨骼肌。常见的鼻腔粘膜病变包括鼻窦炎(鼻窦的黏膜与呼吸部黏膜相连续，因此鼻炎及感冒易引起鼻窦炎)、嗅觉障碍(炎症感染或有局部占位病变时，黏膜肿胀过分充血及分泌物过多，一方面，引起鼻阻塞，使携带嗅素的气流受阻，达不到嗅区)、变应性鼻炎(称过敏性鼻炎，是机体接触变应原后主要由IgE介导的鼻黏膜非感染性炎性疾病)等。

鼻部疾病选自鼻炎、鼻窦炎、鼻前庭炎、鼻部粘膜疾病或其任何组合。

鼻炎

术语“鼻炎”是指鼻腔炎性疾病，是病毒、细菌、变应原、各种理化因子以及某些全身性疾病引起的鼻腔黏膜的炎症。鼻炎主要分为以下四种类型慢性鼻炎、急性鼻炎、药物性鼻炎、萎缩性鼻炎。其包括：慢性单纯性鼻炎、慢性肥厚性鼻炎、慢性干燥性鼻炎、过敏性鼻炎(季节性鼻炎、常年性鼻炎)、干燥性鼻炎、血管运动性鼻炎、嗜酸细胞增多性非变态反应性鼻炎、过强反射性鼻炎、特发性鼻炎、结构性鼻炎、局部变应性鼻炎。除局部和环境因素外，长期慢性疾病，如内分泌失调，心血管疾病等，维生素缺乏，烟酒过多，长期使用血液药物，会引起鼻腔血管舒张并产生鼻炎等症状。慢性疾病包括血、结核、糖尿病、风湿病、急性传染病后及慢性心、肝、肾疾病等，均可引起鼻黏膜长期淤血或反射性充血；鼻腔及鼻窦的慢性炎症，或临近感染灶的影响，促使发生慢性鼻炎。

过敏性鼻炎(Allergic rhinitis,AR),又称变应性鼻炎,是常见的耳鼻咽喉科疾病,也是常见的呼吸道变应性疾病。该病是发生于鼻粘膜的变应性疾病,以鼻痒、喷嚏、鼻溢清涕、鼻粘膜肿胀为主要特点。过敏性鼻炎的患病率在10％-40％,其中花粉过敏症多见于欧洲和北美,常年性的过敏性鼻炎多见于亚洲。虽然过敏性鼻炎并不致死,但由于患者的鼻子和全身不适感很明显,影响患者的学习和工作。如果得不到正确的治疗,约30％的患者会发展为支气管哮喘,甚至肺心病等严重影响患者身体健康和生活质量的疾病。皮质类固醇和抗组胺药是目前治疗过敏性鼻炎的一线药物。过敏性鼻炎是在体外环境因素作用由IgE介导的,以鼻腔黏膜的免疫反应为主的变应性炎症反应。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗鼻炎(如过敏性鼻炎)的用途，或者在制备用于在受试者中预防鼻炎，或者延缓、或减少鼻炎或者阻止减轻鼻炎。

在某些实施方案中，所述药物组合可以减少鼻炎引起的打喷嚏，减少受试者挠鼻子的次数。

在某些实施方案中，所述药物组合可以降低血清抗原特异性抗体应答水平，降低炎症介质表达。

在某些实施方案中，所述药物组合可以促进炎症部位血管生成，促进上皮细胞生成，降低炎性细胞浸润。

在某些实施方案中，所述药物组合可以恢复鼻粘膜上皮表面，使纤毛恢复正常，使成纤维细胞恢复正常，使胞浆胞质恢复正常。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，通过静脉注射给药。

在某些实施方案中，所述药物还包含载体或赋形剂。

在某些实施方案中，所述药物还包含第二活性成分。

在某些实施方案中，所述第二活性成分选自糖皮质激素、鼻用减充血剂、抗组胺药(如氮卓斯汀)、白三烯受体拮抗药(如孟鲁斯特纳)、抗胆碱类药(如异丙托溴铵)、抗过敏药(如色苷酸钠)、黏液溶解药(如桃金娘油)、抗菌药或其任何组合。

在某些实施方案中，糖皮质激素选自丙酸倍氯米松、布地奈德、丙酸氟替卡松、糠酸莫米松或其任何组合。

在某些实施方案中，抗菌药选自阿莫西林、头孢泊肟酯、头孢呋辛酯、头孢地尼、甲氧苄啶、磺胺甲基异噁唑、多西环素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、加替沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、头孢曲松或其任何组合。

在某些实施方案中，所述药物为单位剂量形式，所述单位剂量的药物含有不少于1×10 ⁴个(例如不少于1×10 ⁴，不少于3×10 ⁴，不少于5×10 ⁴，不少于7×10 ⁴，不少于1×10 ⁵，不少于3×10 ⁵，不少于5×10 ⁵，不少于7×10 ⁵，不少于1×10 ⁶，不少于3×10 ⁶，不少于5×10 ⁶，不少于7×10 ⁶，不少于1×10 ⁷，不少于3×10 ⁷，不少于5×10 ⁷，不少于7×10 ⁷，不少于1×10 ⁸，不少于3×10 ⁸，不少于5×10 ⁸，不少于7×10 ⁸，不少于1×10 ⁹，不少于3×10 ⁹，不少于5×10 ⁹，不少于7×10 ⁹，不少于1×10 ¹⁰，不少于3×10 ¹⁰，不少于5×10 ¹⁰或不少于7×10 ¹⁰，又例如1*10 ⁵-1*10 ⁸、7*10 ⁵-7*10 ⁶、1*10 ⁶-5*10 ⁶个，优选1*10 ⁶、3*10 ⁶、5*10 ⁶个，更优选3*10 ⁶个)所述间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞的给药剂量不少于1×10 ⁴(例如不少于1×10 ⁴，不少于3×10 ⁴，不少于5×10 ⁴，不少于7×10 ⁴，不少于1×10 ⁵，不少于3×10 ⁵，不少于5×10 ⁵，不少于7×10 ⁵，不少于1×10 ⁶，不少于3×10 ⁶，不少于5×10 ⁶，不少于7×10 ⁶，不少于1×10 ⁷，不少于3×10 ⁷，不少于5×10 ⁷，不少于7×10 ⁷，不少于1×10 ⁸，不少于3×10 ⁸，不少于5×10 ⁸，不少于7×10 ⁸，不少于1×10 ⁹，不少于3×10 ⁹，不少于5×10 ⁹，不少于7×10 ⁹，不少于1×10 ¹⁰，不少于3×10 ¹⁰，不少于5×10 ¹⁰或不少于7×10 ¹⁰，又例如1*10 ⁵-1*10 ⁸、7*10 ⁵-7*10 ⁶、1*10 ⁶-5*10 ⁶个，优选1*10 ⁶、3*10 ⁶、5*10 ⁶个/mL，更优选3*10 ⁶个/mL)。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在另一个方面，本发明提供一种治疗鼻部疾病的产品，其包含第一活性成分间充质干细胞群。

在某些实施方案中，所述鼻部疾病如前面所描述或定义。

在某些实施方案中，所述产品还包含第二活性成分。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

肾脏疾病

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗肾脏疾病；或者，本发明提供预防和/或治疗肾脏疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

肾脏疾病是各种原因导致的肾脏损伤或肾功能下降疾病。肾脏病是一种严重危害人类健康常见病的统称。肾脏疾病主要包括不同类型的肾炎、急性肾衰竭、肾结石、肾囊肿、慢性肾脏病等等。肾脏疾病的主要临床表现有蛋白尿、血尿、水肿、高血压、肾功能不全等。

“肾脏疾病”为肾脏相关疾病，主要包括：原发性肾小球疾病、继发性肾小球肾炎、遗传性肾脏病、泌尿系统感染性肾脏病、肾小管疾病、间质性肾炎、肾结石和梗阻性肾病、囊肿性肾脏病和肾脏肿瘤、肾血管疾病、肾脏与高血压、妊娠与肾脏疾病、老年肾脏病、药(食物)源性肾损害、肾功能衰竭。

肾脏疾病包括肾损伤疾病。肾损伤的主要表现为水肿、高血压、呕吐和肾功能不全。

肾脏疾病包括肾功能不全。肾功能不全(renal insufficiency)是由多种原因引起的，肾小球严重破坏，使身体在排泄代谢废物和调节水电解质、酸碱平衡等方面出现紊乱的临床综合症后群。分为急性肾功能不全和慢性肾功能不全。预后严重，是威胁生命的主要病症之一。引起肾功能不全的原因可概括如下：a.肾脏疾病：如急性、慢性肾小球肾炎，肾盂肾炎，肾结核，化学毒物和生物性毒物引起的急性肾小管变性、坏死，肾脏肿瘤和先天性肾脏疾病等。b.肾外疾病：如全身性血液循环障碍(休克、心力衰竭、高血压病)，全身代谢障碍(如糖尿病)以及尿路疾患(尿路结石、肿瘤压迫)等。

肾脏疾病包括肾切除。肾切除是一种治疗肾脏疾病的外科手术。其适应症包括肾恶性肿瘤、肾结核、严重的肾盂积水或肾结石等、严重的肾损伤和一侧脓肾。

肾脏疾病包括肾脏纤维化。

肾脏疾病包括肾炎。

“肾炎”是指两侧肾脏非化脓性的炎性病变，是因肾小体受到损害出现浮肿、高血压、蛋白尿等肾炎现象，是肾脏疾病中最常见的一种。根据病因，肾炎可分为继发性和原发性肾小球肾炎。继发性肾小球肾炎是由其他疾病(如糖尿病、高血压病、系统性红斑狼疮、过敏性紫癜、血管炎等)引起，是全身性疾病的肾脏受累及。根据临床分类，肾炎可分为急性、慢性和急进性肾炎综合征、隐匿性肾炎(无症状血尿和/或蛋白尿)。慢性肾炎包括系膜增生性肾小球肾炎、局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病、系膜毛细血管肾小球肾炎、硬化性肾炎。急进性肾炎病理改变特征为肾小球内新月体形成，又称为新月体性肾炎。

肾脏疾病包括药源性肾脏疾病。

“药源性肾脏疾病”是指在疾病治疗过程中使用抗感染药物、非甾体类抗炎药、降尿酸药、抗肿瘤化疗药、免疫抑制剂、中草药等对肾脏产生的药源性损伤。

在某些实施方案中，所述药物还包含载体或赋形剂。

在某些实施方案中，所述药物还包含第二活性成分。

在某些实施方案中，所述第二活性成分选自糖皮质激素(强的松、强的松龙)、其他免疫抑制剂(环磷酰胺、氮芥、瘤可宁)、血管紧张素转换酶抑制剂、钙通道阻滞剂、利尿药、胃肠道吸附剂、酸碱平衡调节剂或其任何组合。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞的给药剂量不少于1×10 ⁴个/ml(例如不少于1×10 ⁴，不少于3×10 ⁴，不少于5×10 ⁴，不少于7×10 ⁴，不少于1×10 ⁵，不少于3×10 ⁵，不少于5×10 ⁵，不少于7×10 ⁵，不少于1×10 ⁶，不少于3×10 ⁶，不少于5×10 ⁶，不少于7×10 ⁶，不少于1×10 ⁷，不少于3×10 ⁷，不少于5×10 ⁷，不少于7×10 ⁷，不少于1×10 ⁸，不少于3×10 ⁸，不少于5×10 ⁸，不少于7×10 ⁸，不少于1×10 ⁹，不少于3×10 ⁹，不少于5×10 ⁹，不少于7×10 ⁹，不少于1×10 ¹⁰，不少于3×10 ¹⁰，不少于5×10 ¹⁰或不少于7×10 ¹⁰，优选1*10 ⁶、3*10 ⁶、5*10 ⁶个/mL，更优选3*10 ⁶个/mL)。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在另一个方面，本发明提供一种治疗肾脏疾病的产品，其包含第一活性成分间充质干细胞群。

在某些实施方案中，所述肾脏疾病如前面所描述或定义。

在某些实施方案中，所述产品还包含第二活性成分。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以恢复体重。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以降低尿酸、尿素和尿酐。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以对肾损伤举得保护作用，改善肾功能。

新月体肾炎

“新月体性肾炎”又称为急进性肾炎。新月体肾炎是一组病情发展急骤，以血尿、蛋白尿、浮肿、高血压为主要临床表现，并迅速发展为少尿、无尿和肾功能衰竭的预后恶劣的肾小球肾炎的总称。按照病因，可分为原发性和继发性两大类。其中原发性新月体肾炎可分为抗肾小球基底膜抗体型、免疫复合物型、发病机理不明。继发性新月体肾炎可能是由于原发性肾小球疾病引起，如膜增生性肾炎，膜性肾病，IgA肾病(较少见)等；继发于感染性疾病：如感染性心内膜炎、链球菌感染后肾炎、隐匿性脏器细菌性病灶、乙型肝炎及流行性感冒等；继发于其它系统疾病：如系统性红斑狼疮、全身性血管炎，肺出血一肾炎综合征，过敏性紫癜、自发性冷球蛋白血症、恶性肿瘤及复发性多发性软骨炎等。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗新月体肾炎的用途，或者在制备用于在受试者中预防新月体肾炎，或者延缓、或减少多新月体肾炎、或阻止减轻新月体肾炎。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以降低尿蛋白和血肌酐，恢复肾脏的功能，或/和抑制新月体的形成。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以下调脾脏、肾脏中Th1、Th2、Th17因子，减少表达IL-1β、CD8、ED1基因的细胞，增加Treg细胞，制肾脏的炎症情况。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以降低促炎因子的表达(如IFN-γ、IL-6、TNF-α、iNOS等)，提高抑炎因子IL-10的表达，抑制受试者的炎症情况。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

肾纤维化

“肾脏纤维化”是指肾脏的一种病理生理改变，是各种进展性慢性肾脏病，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程。肾脏由于受到创伤、感染、炎症、血循环障碍，以及免疫反应等多种致病因素刺激，其固有细胞受损，发展到后期出现大量胶原沉积和积聚，造成肾实质逐渐硬化，形成瘢痕，直至肾脏完全丧失脏器功能。肾脏内固有细胞纤维化、硬化的过程也就是肾脏纤维化的过程。肾脏纤维化是以细胞外基质(ECM)的异常沉积为特征的。如：急性肾损伤、急性肾损伤、肾小球疾病、肾小球疾病、糖尿病肾病、可逆性后部脑病综合征、慢性肾功能衰竭、急性肾衰竭等。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗肾纤维化的用途，或者在制备用于在受试者中预防肾纤维化，或者延缓、或减少肾纤维化或者阻止减轻肾纤维化。

在某些实施方案中，所述药物组合可以恢复受试者体重，降低尿微量白蛋白(如尿酐,尿素,尿酸)。

在某些实施方案中，所述药物组合改善肾脏结构，减少胶原沉积，延缓肾纤维化进展

在某些实施方案中，所述药物组合能够抑制肾间质中TGF-β1等促纤维化因子的表达，并且能够逆转间质转换，从而起到保护肾脏的作用。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

肾切除带来的损伤或相关肾脏疾病

肾切除，是一种治疗肾脏疾病的外科手术。其适应症包括肾恶性肿瘤、肾结核、严重的肾盂积水或肾结石等、严重的肾损伤和一侧脓肾。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物用于在受试者中预防和/或治疗肾切除带来的损伤或相关肾脏疾病的用途，或者在制备用于在受试者中预防肾切除带来的损伤或相关肾脏疾病，或者延缓、或减少肾切除带来的损伤或相关肾脏疾病、或阻止减轻肾切除带来的损伤或相关肾脏疾病。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以恢复体重。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以对修复肾脏、抑制肾脏损伤相关疾病，如肾纤维化、肾衰竭。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)

移植物抗宿主病(GVHD)是指由于供受体间次要组织相容性抗原的差异，导致的移植组织与宿主受体之间发生的病理反应。移植物抗宿主疾病(GVHD)易于攻击上皮组织，尤其是皮肤、肝脏和胃肠道黏膜。其主要分为急性GVHD(可能引起皮肤、胃肠道和肝脏损伤等不良反应)和慢性GVHD(可能引起除了皮肤、胃肠道、肝脏外，更多部位包括肺部和眼睛等感染)。目前GVHD常见于造血干细胞和实体器官移植后。此外，GVHD也可见于同种T淋巴细胞移植至免疫功能不健全的患者体内时，可能发生的一种潜在的可致死性临床并发症。实施例显示M细胞对于hPBMC移植引起的GVHD具有明显的治疗效果，提高了嵌合体小鼠生存率、降低了细胞嵌合率。提高了由于GVHD引起的肠、肾、肝、肺中的抑炎症因子的表达。

移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)主要是由于移植后异体供者移植中的T淋巴细胞，经过受者体内相关细胞因子的影响，增强了对受者抗原的免疫反应，以受者靶细胞为目标发动的细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标，而GVHD的发生主要有以下3点:(1)移植物中含有免疫活性细胞；(2)供体和受体的组织相容性抗原不同；(3)供体免疫活性细胞因不被排斥而存活，并识别不同组织相容性抗原而分裂增殖。一般认为参与GVHD的免疫活性细胞是混入的成熟T细胞，而且它混入率越高，发生 GVHD的几率越大。

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、延缓和/或减轻移植物抗宿主病；或者，本发明提供预防、治疗、延缓和/或减轻移植物抗宿主病的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群可以提高受试者的体重。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群可以提高受试者生存率。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群可以降低减轻外源细胞在骨髓的浸润，和/或可以降低炎症反应和组织损伤。

在某些实施方案中，所述间充质干细胞群可以抑制炎症，降低促炎症因子水平，提高抑炎症因子水平。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的间充质干细胞群。在某些优选方案中，通过静脉注射给药。

在另一方面，本发明还提供了用于一种预防、治疗、延缓和/或减轻移植物抗宿主病的产品，其含有本发明的间充质干细胞群。在某些实施方案中，所述产品中还含有另外的活性成分，所述另外的活性成分如上文中定义。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。在某些实施方案中，所述产品为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂或胶囊剂。在某些实施方案中，所述产品为植入物。

心脏系统疾病

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗心脏系统疾病；或者，本发明提供预防和/或治疗心脏系统疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

心脏病是一类比较常见的循环系统疾病。循环系统由心脏、血管和调节血液循环的神经体液组织构成，循环系统疾病也称为心血管病，包括上述所有组织器官的疾病，在内科疾病中属于常见病，其中以心脏病最为多见，能显著地影响患者的劳动力。

1、心肌病

心肌病是一种心肌病变，影响心脏收缩或舒张功能，甚至导致心力衰竭或死亡。心肌病可能因为心脏损伤(如心脏病发作)或遗传性疾病而导致，表现为心室异常肥厚或扩张或其他病理生理改变。心肌病分为四类，分别是扩张型心肌、肥厚性心肌病、限制性心肌病、致心律失常性心肌病。

2、心肌缺血

心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。

3、冠心病

冠状动脉粥样硬化性心脏病是指冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血缺氧或坏死的常见的心血管系统疾病，简称冠心病，也称缺血性心脏病。

4、心肌梗死

心肌梗塞又叫心肌梗死，是一种常见的急性心血管系统疾病，主要由于供应心脏血液流动的主要血管闭塞，血流中断，从而导致心肌的缺血性坏死，属于急性冠状动脉综合征范畴。临床上以左心室心肌梗死较为常见，患者主要表现为剧烈而较持久的胸口痛、发热以及频繁的恶心、呕吐等，甚至可发生严重心律失常、休克、心力衰竭等，严重危及其生命安全。

5、缺血再灌注

近年来，随着休克治疗的进步以及动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、心脏外科体外循环、心肺脑复苏，断肢再植和器官移植等方法的建立和推广应用，使许多组织器官缺血后重新得到血液灌注，称之为缺血再灌注。

6、缺血再灌注损伤

机体组织因各种因素造成组织缺血后，经有效干预后组织恢复血液再灌注，使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。

预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤(Myocardialischemia/reperfusioninjury,MI/RI)

缺血性心脏病是导致人类死亡的主要原因，在治疗上，早期成功恢复心肌再灌注是改善临床转归的最有效方法。但缺血心肌恢复血流的过程可造成损伤，这一现象称为心肌缺血/再灌注损伤(Myocardialischemia/reperfusioninjury,MI/RI)。I/R将会带来一些不良效应，例如氧化应激，细胞内钙超载等，这些不良反应会导致心肌细胞凋亡。细胞凋亡是缺血再灌注组织损伤功能丧失的重要原因，它是一个很复杂的过程，其详细的触发机制尚不完全明确。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的用途，延缓或减少心肌缺血/再灌注损伤，或阻止减轻心肌缺血/再灌注损伤的药物中的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的用途，延缓或减少心肌缺血/再灌注损伤，或阻止减轻心肌缺血/再灌注损伤的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物可以改善心脏功能，减少心脏梗死面积，改善心肌缺血，或/和减轻心肌收缩前所受阻力或负荷。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在另一方面，本发明还提供了用于一种预防、治疗、延缓和/或减轻心脏系统疾病的产品，其含有本发明的间充质干细胞群。在某些实施方案中，所述产品中还含有另外的活性成分，所述另外的活性成分如上文中定义。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。在某些实施方案中，所述产品为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂或胶囊剂。在某些实施方案中，所述产品为植入物。

贫血

在一个方面，本发明提供所述间充质干细胞群或其培养上清在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗贫血；或者，本发明提供预防和/或治疗贫血的方法，包括向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的所述间充质干细胞群或其培养上清。

贫血是指人体外周血红细胞容量减少，低于正常范围下限，不能运输足够的氧至组织而产生的综合征。主要分为：

1、红细胞生成减少性贫血

红细胞生成三大要素，造血细胞、造血调节、造血原料中的任何一种和/或几种发生异常导致红细胞生成减少，进而发生贫血。

2、红细胞破坏过多性贫血

红细胞因自身因素和/或外部因素导致红细胞破坏，寿命缩短，当红细胞破坏的速度超过骨髓代偿能力造成的贫血。

3、失血性贫血

机体因创伤和/或疾病原因引起的血容量下降，导致血液携氧能力下降引发的综合征。

4、巨幼细胞贫血

叶酸或维生素B12缺乏或某些影响核苷酸代谢的药物导致细胞核脱氧核糖核酸合成障碍所致的贫血称巨幼细胞贫血。本病的特点是呈大红细胞性贫血，骨髓内出现巨幼红细胞、粒细胞及巨核细胞系列。

5、再生障碍性贫血

是一种可能由不同病因和机制引起的骨髓造血功能衰竭，主要表现为骨髓造血功能低下、全血细胞减少及所致的贫血、出血、感染综合征。

贫血是肿瘤患者的常见并发症，50％肿瘤患者合并贫血，它不仅带来多种临床症状，而且还使患者生活质量下降，也是影响预后的因素之一，同时还会因输血的增多而引起许多不良后果。肿瘤伴发贫血是一个多因素的结果，大部分是肿瘤本身引起，属于慢性贫血；另外，使用细胞毒性药物或肾毒性药物化疗也会刀子贫血的发生。顺铂是广泛应用于患者的化疗药，具有肾毒性，顺铂累计剂量增加，贫血加重。尽管红细胞生成素可以缓解慢性癌症性贫血，但有文献报道其纠正贫血的有效率为60％左右。如何进一步改善肿瘤患者贫血，提高患者预后和生活质量，仍是一个重要课题。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物在制备用于预防和/或治疗贫血(例如但不限于肿瘤伴发贫血、慢性贫血、使用细胞毒性药物或肾毒性药物化疗导致的贫血)，延缓或减轻硬皮病，或者阻止贫血(例如但不限于肿瘤伴发贫血、慢性贫血、使用细胞毒性药物或肾毒性药物化疗导致的贫血)的药物中的用途的用途；或者，本发明涉及预防和/或治疗贫血(例如但不限于肿瘤伴发贫血、慢性贫血、使用细胞毒性药物或肾毒性药物化疗导致的贫血)，延缓或减轻硬皮病，或者阻止贫血(例如但不限于肿瘤伴发贫血、慢性贫血、使用细胞毒性药物或肾毒性药物化疗导致的贫血)的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的间充质干细胞群、培养物、培养上清或药物组合物。

在某些实施方案中，所述药物能在治疗贫血中提高体重。

在某些实施方案中，所述药物能在治疗贫血中提高外周血白细胞的数量、提高外周血红细胞的数量，降低外周血红细胞体积、恢复外周血血常规指数，恢复外周血血红蛋白指数或和恢复骨髓。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的药物。在某些优选方案中，可以通过局部或静脉注射给药。

在另一方面，本发明还提供了用于一种预防、治疗、延缓和/或减轻贫血的产品，其含有本发明的间充质干细胞群。在某些实施方案中，所述产品中还含有另外的活性成分，所述另外的活性成分如上文中定义。在某些实施方案中，所述间充质干细胞群和所述另外的活性成分作为单独组分存在或作为单一配方存在。在某些实施方案中，所述产品为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂或胶囊剂。在某些实施方案中，所述产品为植入物。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、细胞培养、生物化学、细胞生物学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“胚状体(Embryoid Bodies，EBs)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由多能干细胞(例如胚胎干细胞)所形成的细胞聚集体，也可称为“EB球”。诱导多能干细胞(例如胚胎干细胞)形成胚状体的方法通常包括通过防止多能干细胞附着于培养容器的表面，从而允许悬浮的多能干细胞聚集并形成胚状体。

如本文中所使用的，术语“体外”指人为环境，和在其中的过程和反应。体外环境通过试管和细胞培养进行例证，但不限制于此。

如本文中所使用的，术语“体内”指自然环境(即动物或细胞)和在其中的过程和反应。

如本文中所使用的，术语“培养物”是指，将细胞(例如，本发明的间充质干细胞群)在培养基中培养后获得的产物。

如本文中所使用的，术语“培养上清”是指，对细胞(例如，本发明的间充质干细胞群)进行培养而得到的不含细胞本身的培养液。因而，例如可以通过在培养后分离去除细胞成分来得到可用于本发明的培养上清。该培养上清也可以经过其他处理，例如离心、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、保存等。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，稀释剂，佐剂，防腐剂等。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂是无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。

如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生或如果它发生作用减到最小而实施的方法。术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。有益或所需的临床结果包括但不限于，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后，无论是可检测或是不可检测的。有效缓解任何特定疾病症状的治疗剂的量可以根据诸如患者的疾病状态，年龄和体重以及药物在受试者中引起期望的反应的能力等因素而变化。疾病症状是否得到缓解可以通过任何临床测量来评估，这些测量通常由医生或其他熟练的医疗保健提供者用于评估该症状的严重程度或进展状态。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)、非人灵长类动物(例如，猕猴或食蟹猴)或人。

发明的有益效果

通过本发明的方法制备获得的间充质干细胞具备显著提高的MMP1表达量，适用于多种疾病(例如炎性疾病等)的预防及治疗，具有重大的临床价值。

附图说明

图1：流式细胞术检测hESC-M细胞表面蛋白表达情况。*，P<0.05；**，P<0.01。

图2A-2D：qPCR检测hESC-M细胞中细胞因子的mRNA表达水平。*，P<0.05；**，P<0.01。

图3：hESC-M细胞培养上清对肺成纤维细胞中α-SMA和Collagen I的表达水平的影响。

图4A-4C：IFN-γ刺激对hESC-M细胞的IDO(图4A)、PD-L1(图4B)、PGE2(图4C)表达水平的影响。

图5：实施例2(二)中不同配方形成的拟胚体及M细胞P0和P5代时的形态照片。

图6：实施例2(一)中配方1-M细胞的流式细胞结果。

图7：实施例2(一)中配方2-M细胞的流式细胞结果。

图8：实施例2(一)中配方3-M细胞的流式细胞结果。

图9：实施例2(一)中配方4-M细胞的流式细胞结果。

图10：实施例2(一)中配方5-M细胞的流式细胞结果。

图11：实施例2(一)中第一培养基不同配方产生的M细胞P5代时qPCR检测MMP1的表达。

图12：实施例2(一)中第一培养基不同配方产生的M细胞P5代时qPCR检测PGE2的表达。

图13：实施例2(二)中不同配方形成的拟胚体及M细胞P5代时的细胞形态。

图14：实施例2(二)中配方1-M细胞的流式细胞结果。

图15：实施例2(二)中配方2-M细胞的流式细胞结果。

图16：实施例2(二)中配方3-M细胞的流式细胞结果。

图17：实施例2(二)中配方4-M细胞的流式细胞结果。

图18：实施例2(二)中配方5-M细胞的流式细胞结果。

图19：实施例2(二)中第一培养基不同配方产生的M细胞P5代时qPCR检测MMP1的表达。

图20：实施例2(二)中第一培养基不同配方产生的M细胞P5代时qPCR检测PGE2的表达。

图21：实施例2(三)中不同配方形成的M细胞P5代时的细胞形态。

图22-图25：实施例2(三)中不同配方制备的M细胞的流式细胞结果。

图26：实施例2(三)中第二培养基不同配方产生的M细胞P5代时qPCR检测MMP1的表达。

图27：实施例2(三)中第二培养基不同配方产生的M细胞P5代时qPCR检测PGE2的表达。

图28：实施例2(四)中不同配方形成的M细胞P5代时的细胞形态。

图29：实施例2(四)中配方3-1制备M细胞的流式细胞结果。

图30：实施例2(四)中配方3-3制备M细胞的流式细胞结果。

图31：实施例2(四)中配方3-4制备M细胞的流式细胞结果。

图32：实施例2(四)中不同配方产生的M细胞P5代时qPCR检测MMP1的表达。

图33：实施例2(四)中不同配方产生的M细胞P5代时qPCR检测PGE2的表达。

图34：实施例2(五)中不同配方形成的M细胞P5代时的细胞形态。

图35：实施例2(五)中配方3-2-3制备M细胞的流式细胞结果。

图36：实施例2(五)中配方3-5-4制备M细胞的流式细胞结果。

图37：实施例2(五)中不同配方产生的M细胞P5代时qPCR检测MMP1的表达。

图38：实施例2(五)中不同配方产生的M细胞P5代时qPCR检测PGE2的表达。

图39：喷射M细胞的装置示意图。

图40：M细胞喷射前后增殖能力的检测。M细胞喷射前后，用CCK8检测增殖能力的变化，M细胞喷射后形态正常，增殖能力同非喷射细胞没有太大差别，说明喷射体系可以很好的支持M细胞的喷射应用。

图41：GFP标记的M细胞接种在胶原支架上荧光照片。结果显示，GFP标记的M细胞可以很好的贴附生长在胶原材料上。

图42：GFP标记的M细胞接种在明胶电纺丝上荧光照片。结果显示，GFP标记的M细胞可以很好的贴附生长在明胶电纺丝上。

图43：GFP标记的M细胞接种在胶原支架上荧光照片。结果显示，GFP标记的M细胞可以很好的贴附生长在胶原支架上。

图44：GFP标记的M细胞接种在皮肤修复膜上荧光照片。结果显示，GFP标记的M细胞可以很好的贴附生长在皮肤修复膜上。

图45：M细胞与胶原、透明质酸、海藻酸钠水凝胶的共培养。结果显示，GFP标记的M细胞可以很好的贴附生长在皮肤修复膜上。

图46：使用生理盐水重悬M细胞的细胞活率检测结果。

图47：使用乳酸钠林格注射液重悬M细胞的细胞活率检测结果。

图48：使用复方电解质注射液重悬M细胞的细胞活率检测结果。

图49：使用5％葡萄糖注射液重悬M细胞的细胞活率检测结果。

图50：使用20％HSA注射液重悬M细胞的细胞活率检测结果。

图51：使用琥珀酰明胶注射液重悬M细胞的细胞活率检测结果。

图52：使用MZJ注射液1重悬M细胞的细胞活率检测结果。

图53：使用琥珀酰明胶MIX注射液重悬M细胞的细胞活率检测结果。

图54：M细胞经MZJ注射液1-80℃冻存后的细胞活率检测结果。

图55：Cytodex3培养的M细胞。

图56：Cytodex3培养的M细胞的消化情况。

图57：Cytodex3培养M细胞的live-dead检测结果。

图58：Cytodex3培养M细胞的原位冻存检测结果。

图59：Cultispher培养的M细胞。

图60：Cultispher培养M细胞的消化情况。

图61：Cultispher培养M细胞的原位冻存检测结果。

图62：TableTrix培养的M细胞。

图63：TableTrix培养M细胞的消化情况。

图64：TableTrix培养M细胞的live-dead检测结果。

图65：TableTrix培养M细胞的原位冻存检测结果。

图66：Solohill培养M细胞。

图67：Solohill培养M细胞的消化情况。

图68：Solohill培养M细胞的live-dead检测结果。

图69：Solohill培养M细胞的原位冻存检测结果。

图70：Coring聚苯乙烯微载体培养的M细胞。

图71：Coring聚苯乙烯微载体培养M细胞的消化情况。

图72：Coring聚苯乙烯微载体培养M细胞的live-dead检测结果。

图73：Coring聚苯乙烯微载体培养M细胞的原位冻存检测结果。

图74：8Gel-甲苯法制备微载体培养M细胞。

图75：8Gel-甲苯法制备微载体培养M细胞的live-dead检测结果。

图76：8Gel-甲苯法制备微载体培养M细胞的传代情况。8Gel-甲苯法制备微载体培养M细胞可进行球传球传代，并增殖。

图77：8Gel-甲苯法制备微载体培养M细胞的live-dead检测。

图78：25GF-Gel微载体培养M细胞。

图79：25GF-Gel微载体培养M细胞的live-dead检测结果。

图80：25GF-Gel微载体培养M细胞的传代情况。

图81：25GF-Gel微载体培养M细胞的live-dead检测。

图82：Gel微载体培养M细胞。

图83：Gel微载体培养M细胞的live-dead检测结果。

图84：Gel微载体培养M细胞的传代情况。

图85：Gel微载体传代培养M细胞的live-dead检测。

图86：25GF-2HA微载体培养M细胞。

图87：25GF-2HA微载体培养M细胞的live-dead检测结果。

图88：实施例43中尘肺模型小鼠肺组织Masson染色结果。

图89：25GF-2HA微载体培养M细胞。

图90：25GF-2HA微载体培养M细胞live-dead检测结果。

图91：Alg微载体培养M细胞。

图92：Alg微载体培养M细胞的live-dead检测结果。

图93：Alg赖氨酸微载体培养M细胞。

图94：Alg赖氨酸微载体培养M细胞的live-dead检测结果。

图95：Gel赖氨酸微载体培养M细胞。

图96：Gel赖氨酸微载体培养M细胞的live-dead检测结果。

图97：Gel赖氨酸微载体培养M细胞的消化情况。

图98：Gel微载体传代培养M细胞的live-dead检测结果。

图99：TableTrix微载体动态培养M细胞的live-dead检测结果。

图100：TableTrix微载体动态培养M细胞的流式检测结果。

图101是本发明实施例9的子宫取材的光镜照片。模型组的子宫粘连更加明显，子宫内积液更多；而M细胞组，子宫粘连情况显著好转，子宫积液显著较少。说明M细胞可以很好地用于治疗宫腔粘连。

图102是本发明实施例9的子宫HE染色图片。模型组子宫内膜变薄，腺体消失；而经M细胞组观察到明显的子宫内膜及肌层均较厚，有大量血管、腺体和细胞，宫腔粘连的情况明显改善，恢复宫腔形态，子宫积液减少，说明M细胞可以促进损伤子宫内膜修复再生。

图103是本发明实施例9的M细胞在临床上对宫腔粘连的治疗。患者为中重度宫腔粘连，功底肌性粘连，且有瘢痕生成。输卵管有梗阻，开口不明显。M细胞宫腔璧注射治疗后，患者子宫形态恢复正常，未见粘连，瘢痕被修复，双侧输卵管开口可见。结果提示M细胞可用于临床治疗宫腔粘连。图示说明，(1)患者手术时宫腔粘连和双输梗阻，粘连为中重度(混合型)。粘连分离后注射M细胞(3×10 ⁶个)。(2)术后4周随访，可见瘢痕获得恢复。(3)术后4月随访，宫腔情况差。(4)术后8月随访，宫腔基本恢复正常。

图104是本发明实施例10的各组小鼠生存率的统计图。

图105是本发明实施例10的各组小鼠血清肝功能检测的统计图。

图106是本发明实施例11的ALS小鼠发病率统计。结果显示在27周M细胞组发病率明显低于溶剂组(50％VS 80％)，M细胞明显延迟小鼠发病。

图107是本发明实施例11的小鼠转棒行为学统计。M细胞组ALS小鼠在转棒上停留时间明显高于溶剂组，特别是在29周(144VS 244)，具有显著差异，**p＜0.01；表明M细胞可以明显改善小鼠的运动能力。

图108是本发明实施例11的小鼠抓力行为学统计。M细胞组小鼠抓力高于溶剂组，在29周具有显著差异，**p＜0.01；显示M细胞明显改善小鼠肌肉力量，间接说明M细胞可以减轻运动神经元损伤。

图109是本发明实施例12的2.5％DSS诱导得炎性肠病流程图。每组6只鼠，小鼠饮水诱导7天，在第0、3、6天，通过腹腔注射300μl细胞悬液，细胞量3×10 ⁶，细胞为P5代的M细胞。在第11天进行灌流取材。

图110是本发明实施例12的小鼠结肠取材光镜照片。在第11天时，小鼠进行麻醉灌流取材，并对小鼠结肠进行拍照统计。

图111是本发明实施例12的小鼠结肠长度。对取材的小鼠结肠进行长度统计，发现M细胞组的结肠长度要长于2.5％DSS组的，M细胞治疗组的结肠长度更加接近正常组，说明M细胞腹腔注射可以对小鼠的结肠起到保护作用。

图112是本发明实施例12的小鼠结肠HE染色图片。M细胞治疗组的小鼠结肠组织结构完整，炎性细胞浸润较少，而2.5％DSS诱导组的小鼠结肠炎性细胞浸润较多，隐窝结构被破坏，说明M细胞腹腔注射可以对小鼠的结肠起到保护作用，对炎性肠病起到有效的治疗作用。

图113是本发明实施例12的小鼠结肠HE染色病理评分统计.小鼠结肠HE切片的病理评分，M细胞组的明显低于2.5％DSS组的评分，并具有统计学差异，说明M细胞可以对小鼠的肠道起到很好的保护与治疗效果。

图114是本发明实施例12的5％DSS诱导得炎性肠病流程图。小鼠饮水诱导7天，在第0、3、6天，通过腹腔注射300μl细胞悬液，细胞量3×10 ⁶，细胞为P5代的M细胞。

图115是本发明实施例12的小鼠结肠HE染色图片。M细胞治疗组的小鼠结肠组织结构完整，炎性细胞浸润较少，而5％DSS诱导组的小鼠结肠炎性细胞浸润较多，隐窝结构被完全破坏。说明M细胞可以很好的保护小鼠的结肠组织，对炎性肠病起到有效的治疗作用。

图116是本发明实施例12的小鼠结肠HE染色病理评分统计。M细胞组的明显低于5％DSS组的评分，并具有统计学差异，说明M细胞可以对小鼠的肠道起到很好的保护与治疗效果。

图117是本发明实施例12的小鼠存活率的统计。在第11天模型组的小鼠全部死亡，而M细胞组在实验终点，第27天，生命体征趋于稳定，仍有7只存活(造模n＝12),说明M细胞治疗可以极大提高小鼠的存活率。

图118是本发明实施例13的不同天数伤口照片。对照组和M细胞组在不同天数的光镜照片,在第14天和第21天时M细胞组的伤口要明显小于对照组的伤口。说明M细胞可以加速皮肤伤口的愈合。

图119是本发明实施例13的伤口面积大小统计。对图118伤口面积大小的统计，用ImageJ进行统计。M细胞治疗组，伤口面积明显小于对照组，对于皮肤损伤的治疗，M细胞有较好的治疗趋势，说明M细胞可以很好的治疗皮肤损伤。

图120是本发明实施例13的伤口未愈合率统计。未愈合率＝(伤口面积/初始伤口面积)×100％。从未愈合率的统计看，M细胞的要明显低于对照组的，有着较好的治疗趋势，说明M细胞可以很好的治疗皮肤损伤，加速皮肤伤口的愈合。

图121是本发明实施例13的21天伤口面积大小统计。对照组未愈合面积为初始伤口面积的11.7％，而M细胞治疗组未愈合伤口面积为初始面积的5.7％，具有显著性差异，M细胞的要明显低于对照组的，有着较好的治疗趋势，说明M细胞可以很好的治疗皮肤损伤，加速皮肤伤口的愈合。采用Prism 7.0统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准误(Mean±SE)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

图122是本发明实施例13的HE和Masson染色。HE染色结果说明M细胞组的伤口愈合要优于对照组的愈合，M细胞组已经完全愈合，表皮已经完全愈合，而对照组伤口中间部分表皮还未完全愈合。Masson染色结果。对照组着色较深，胶原沉淀多，说明纤维化严重。而M细胞治疗组的着色前，胶原沉积少，纤维化程度低于对照组通过M细胞与Matrigel的移植治疗后，大鼠皮肤损伤的伤口恢复速度加快；组织切片，纤维化发生减少。

图123是本发明实施例14的睾丸光镜照片。第20天的取材结果，移植M细胞后，大鼠的睾丸有明显的恢复，而模型组组睾丸出现了明显的萎缩，储精囊变小。

图124是本发明实施例14的左侧睾丸与右侧睾丸的重量比值。M细胞组左侧睾丸与右侧睾丸的比值要明显高于模型组，且产生精子数量多，不健康精子数量少。采用Prism 7.0统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准误(Mean±SE)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

图125是本发明实施例14的睾丸HE染色图片。HE染色结果显示移植M细胞组大鼠睾丸曲细精管壁有支持细胞，官腔中央有细胞生成，官腔可见大量生殖细胞；而模型组曲细精管只有支持细胞，未见新的细胞形成。说明M细胞对无精子症大鼠睾丸具有很好的保护作用，有助于大鼠睾丸的恢复，对生殖细胞起到保护作用。

图126是本发明实施例15的大鼠初次癫痫发作潜伏期统计。大鼠初次癫痫发作潜伏期统计。总观察时长为30分钟，与正常对照组相比，溶剂组初次癫痫发作潜伏期显著缩短，具有显著性差异，*p＜0.05；溶剂组初次癫痫发作潜伏期为92.2秒，M细胞组初次癫痫发作潜伏期为429.5秒，时间明显延长，表明M细胞可以延迟癫痫发作。

图127是本发明实施例15的大鼠初次癫痫发作级别统计。M细胞组下调癫痫发作等级，从3级降至2级，表明M细胞可以减轻癫痫发作。

图128A是本发明实施例15的大鼠初次癫痫发作分级统计。尾静脉注射M细胞明显降低癫痫发作分级，说明M细胞可以减轻癫痫发作。

图128B是本发明实施例15的大鼠癫痫大发作潜伏期统计。

图129是本发明实施例15的大鼠癫痫大发作比例统计。尾静脉注射M细胞明显降低了癫痫大发作比例，较溶剂组相比，比例降低了43.3％，说明M细胞可以明显降低癫痫大发作次数。

图130是本发明实施例16的第28天时小鼠背部照片。28天取材时，可见BLM组，注射BLM皮肤部位，皮肤增厚，变硬，弹性变差；而M细胞注射组的小鼠皮肤更接近正常组，没有发生硬化的现象，说明M细胞可以减少皮肤硬化变厚的发生，对硬皮病起到有效的治疗作用。

图131是本发明实施例16的小鼠皮肤HE染色图片。可见BLM组真皮层明显增厚，毛囊数量明显减少；而M细胞治疗组与BLM组小鼠相比，毛囊数量较多，真皮层较薄，有明显的好转情况，说明M细胞治疗可以很好的缓解硬皮病的症状，对硬皮病起到有效的治疗作用。

图132是本发明实施例16的小鼠皮肤Masson染色图片。与正常组相比，BLM组，胶原纤维明显增粗、膨大，发生明显的纤维化，真皮层明显增厚，脂肪层明显变薄，皮肤附属器官减少；经M细胞治疗后，胶原纤维积聚减少，皮肤真皮层明显变薄，脂肪层没有变薄，可见正常的皮肤附属器。说明M细胞可以很好的治疗硬皮病小鼠。

图133是本发明实施例17的造模后不同时间节点皮肤伤口的光镜图片，M细胞组的伤口比模型组的伤口要小。

图134是本发明实施例17的对图133的伤口面积大小统计，利用ImageJ进行统计。在第21、28天时，M细胞组伤口面积明显小于模型组的伤口面积，并具有统计学差异，说明M细胞治疗可以加速伤口的愈合。采用Prism 7.0统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准误(Mean±SE)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

图135是本发明实施例17的伤口的未愈合比率。M细胞治疗组伤口未愈合比例明显低于模型组，并具有统计学差异，说明M细胞可以加速伤口的愈合，对皮肤损伤起到很好的治疗作用。

图136是本发明实施例18的贫血模型大鼠体重变化趋势。顺铂注射后3天，大鼠体重停止增长并开始下降，在细胞顺铂注射6天后体重下降到最低，然后缓慢上升。在试验终末期，对照组大鼠体重显著高于溶剂组和M细胞治疗组(P＜0.001)。在第7到21天，M细胞治疗组大鼠体重较溶剂组显著升高(P＜0.05)。以上结果显示，顺铂诱导大鼠贫血后，M细胞对于贫血大鼠模型体重有促进作用。

图137是本发明实施例18的顺铂诱导贫血模型大鼠外周血白细胞总数分析。顺铂注射后21天，顺铂+溶剂组大鼠血液中白细胞总数较对照组显著降低(P＜0.05)。结果表明模型鼠出现了贫血症状，表明模型构建成功。顺铂+M细胞治疗组大鼠的白细胞总数较顺铂+溶剂组显著升高(P＜0.05)，且与对照组+溶剂相比无显著差异。以上结果表明，M细胞对于贫血大鼠模型具有明显的治疗效果。

图138是本发明实施例18的顺铂诱导贫血模型大鼠外周血红细胞总数分析。顺铂注射后21天，顺铂+溶剂组大鼠血液中红细胞总数较对照组显著降低(P＜0.05)。结果表明模型鼠出现了贫血症状，表明模型构建成功。顺铂+M细胞治疗组大鼠的红细胞总数较顺铂+溶剂组显著升高(P＜0.05)。以上结果表明，M细胞对于贫血大鼠模型具有明显的治疗效果。

图139是本发明实施例18的顺铂诱导贫血模型大鼠外周血红蛋白含量分析。顺铂注射后21天，顺铂+溶剂组大鼠血液中血红蛋白含量较对照组显著降低(P＜0.05)。结果表明模型鼠出现了贫血症状，表明模型构建成功。顺铂+M细胞治疗组大鼠的血红蛋白含量较顺铂+溶剂组显著升高(P＜0.05)。以上结果表明，M细胞对于贫血大鼠模型具有明显的治疗效果。

图140是本发明实施例18的顺铂诱导贫血模型大鼠外周血红细胞比积分析。顺铂注射后21天，顺铂+溶剂组大鼠血液中红细胞比积较对照组显著降低(P＜0.05)。结果表明模型鼠出现了贫血症状，表明模型构建成功。顺铂+M细胞治疗组大鼠的红细胞比积较顺铂+溶剂组显著升高(P＜0.05)。以上结果表明，M细胞对于贫血大鼠模型具有明显的治疗效果。

图141是本发明实施例18的顺铂诱导贫血模型大鼠外周血平均血红蛋白浓度分析。顺铂注射后21天，顺铂+溶剂组大鼠血液中平均血红蛋白浓度较对照组显著降低(P＜0.05)。结果表明模型鼠出现了贫血症状，表明模型构建成功。顺铂+M细胞治疗组大鼠的平均血红蛋白浓度较顺铂+溶剂组显著升高(P＜0.05)。以上结果表明，M细胞对于贫血大鼠模型具有明显的治疗效果。

图142是本发明实施例18的顺铂诱导贫血模型大鼠外周血红细胞体积分布宽度分析。顺铂注射后21天，顺铂+溶剂组大鼠血液中红细胞体积分布宽度较对照组显著降低(P＜0.05)。结果表明模型鼠出现了贫血症状，表明模型构建成功。顺铂+M细胞治疗组大鼠的红细胞体积分布宽度较顺铂+溶剂组显著升高(P＜0.05)。以上结果表明，M细胞对于贫血大鼠模型具有明显的治疗效果。

图143是本发明实施例18的顺铂诱导贫血模型大鼠外周血血红蛋白含量分析。顺铂注射后21天，顺铂+溶剂组大鼠血液中血红蛋白含量较对照组显著降低(P＜0.05)。结果表明模型鼠出现了贫血症状，表明模型构建成功。顺铂+M细胞治疗组大鼠的血红蛋白含量较顺铂+溶剂组显著升高(P＜0.05)。以上结果表明，M细胞对于贫血大鼠模型具有明显的治疗效果。

图144是本发明实施例19的超声法测量各组肺动脉血流加速时间。

图145是本发明实施例19的超声法测量各组肺动脉内径。

图146是本发明实施例19的超声法测量各组右心室与左心室内径比值。

图147是本发明实施例19的超声法测量各组肺动脉平均压。

图148是本发明实施例19的各组石蜡切片HE染色结果。

图149是本发明实施例20的大鼠BBB评分。静脉注射M细胞后，大鼠的BBB评分明显升高，且M细胞治疗组的BBB评分一直高于模型组，说明M细胞可以提高脊髓损伤后大鼠的运动能力，起到对脊髓损伤的治疗。M细胞治疗组的BBB评分与模型组相比有显著性的差异。采用Prism 7.0统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准误(Mean±SE)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

图150是本发明实施例21的3、24、72小时的mNSS行为学评分。术后3小时静脉注射M细胞降低mNSS分数在术后24小时(12.67 vs 10.33)和72小时(6.33 vs 5.33)，表明M细胞可以改善脑卒中大鼠行为。

图151是本发明实施例21的72小时后大鼠脑梗死面积的统计。术后3小时静脉注射M细胞减少大脑组织梗死面积6.05％较溶剂组，说明M细胞减轻大脑组织坏死程度。

图152是本发明实施例21的72小时后大鼠大脑组织含水量的统计。术后3小时静脉注射M细胞降低大脑组织含水量2％较溶剂组(82.94 vs 80.49)，说明M细胞减轻大脑组织水肿程度。

图153是本发明实施例22的大鼠眼睛光学照片。与NaOH组和胶原组相比M细胞组大鼠的角膜浑浊度更低，瞳孔可见，新生血管少，证明M细胞对大鼠角膜碱具有很好的治疗效果。

图154是本发明实施例22的大鼠角膜浑浊度评分。对图153的角膜浑浊度评分统计,M细胞治疗组的大鼠角膜浑浊度低，在第21天时角膜透明，瞳孔可见，有着更低的评分，并具有统计学差异，说明M细胞治疗效果明显。采用Prism 7.0统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准误(Mean±SE)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

图155是本发明实施例22的大鼠取材眼球照片。大鼠取材发现，M细胞治疗组眼球更接近正常组，没有积液和淤血的累计。说明M细胞可以很好的减轻角膜碱烧伤动物模型的炎症情况，并促进角膜碱损伤的恢复。

图156是本发明实施例23的不同天数的小鼠背部图片。M细胞治疗组，小鼠的鳞屑更少，红疹程度更小，说明M细胞可以很好的缓解银屑病小鼠的症状，对银屑病起到有效的治疗作用。

图157是本发明实施例23的HE染色图片，与咪喹莫特组IMQ组相比，M细胞治疗后小鼠的角质层更薄，说明M细胞治疗可以改善小鼠皮肤的微环境，抑制炎症情况，皮肤附属器官比IMQ组也要多，说明M细胞可以保护皮肤的附属器官，对银屑病起到很好的治疗效果。

图158是本发明实施例24的小鼠穿越站台总次数统计。正常对照组总穿越次数为1次，与正常对照组相比，溶剂组小鼠总穿越次数为0次，具有显著差异，*p＜0.05；M细胞组小鼠总穿越次数为0.66次，显著多于溶剂组，说明M细胞有效改善小鼠空间学习记忆能力。

图159是本发明实施例24的小鼠首次到达站台所花费的时间的统计。M细胞组较溶剂组小鼠花费时间明显减少(38.0 vs 59.8秒)，说明M细胞有效改善小鼠空间学习记忆能力。

图160：大鼠关节光镜图片。模型组的关节表面粗糙且溃疡，关节周围形成骨赘，M细胞治疗组的关节得到了一定程度的恢复。说明M细胞治疗可以缓解关节炎的症状，能够很好的治疗关节炎。

图161：骨折模型大鼠给药后第10天左后肢CT图片。结果显示，M细胞治疗组的大鼠骨损伤的愈合相比模型组有较好的趋势。

图162：骨折模型大鼠给药后第22天左后肢CT图片。结果显示，M细胞治疗组的大鼠骨损伤的愈合相比模型组有明显的优势，骨损伤面积更小，说明M细胞移植可以加速骨损伤的愈合，M细胞对骨损伤有很好的治疗作用。

图163：骨折模型大鼠给药后第50天左后肢CT图片。结果显示，M细胞移植治疗组的骨损伤部位，已经完全愈合，而模型组还未完全愈合。说明M细胞可以很好的治疗骨损伤。

图164：鼻炎模型小鼠打喷嚏统计。经M细胞治疗后，小鼠打喷嚏的次数明显减少，说明M细胞对鼻炎症状的缓解有很好的治疗作用。

图165：鼻炎模型小鼠挠鼻子统计。经M细胞治疗后，小鼠挠鼻子的次数明显减少，说明M细胞对鼻炎症状的缓解有很好的治疗作用。

图166：以iPS为起始材料形成的拟胚体及M细胞P0和P5代时的细胞形态

图167：iPS-MSC细胞的流式细胞结果。

图168：iPS-MSC细胞的qPCR检测MMP1的表达情况。

图169：iPS-MSC细胞的qPCR检测PGE2的表达情况。

图170：GVHD动物模型各组小鼠体重变化率的统计图。对照组与GVHD组生存率存在明显差异(***p＜0.001)；GVHD组与GVHD+高剂量M细胞治疗组生存率存在明显差异(**p＜0.01)。

图171：GVHD动物模型各组小鼠生存率的统计图。GVHD+高剂量M细胞组骨髓嵌合率明显低于GVHD组(*p＜0.05)，说明M细胞通过减轻hPBMC在骨髓的浸润减轻GVHD。

图172：GVHD动物模型各组小鼠骨髓嵌合率的统计图。第14天时，取肠、肾、肝和肺进行石蜡切片后HE染色，结果显示，GVHD+低/高剂量M细胞的肠的隐窝结构明显优于GVHD组，有较完整的肠隐窝结构。GVHD+低/高剂量M细胞组各器官的炎症细胞浸润明显低于GVHD组，说明M细胞具有抑制炎症和维持组织结构完整的功能。

图173：GVHD动物模型各组小鼠器官HE染色图。结果显示，GVHD+低/高剂量M细胞的肠的隐窝结构明显优于GVHD组，有较完整的肠隐窝结构。GVHD+低/高剂量M细胞组各器官的炎症细胞浸润明显低于GVHD组，说明M细胞具有抑制炎症和维持组织结构完整的功能。结果表明，M细胞可以降低GVHD小鼠的炎症反应和组织损伤。

图174：M细胞注射治疗卵巢早衰小鼠后，其性激素水平、体重和卵巢重都有明显恢复

图175：M细胞注射治疗卵巢早衰小鼠后，期排卵水平得到显著恢复。

图176：肾纤维化模型各组小鼠体重统计。假手术组在各个时间点的体重均明显高于手术+溶剂组(P＜0.05)；手术+M细胞治疗组在第12天和第14天的体重均明显高于手术+溶剂组(P＜0.05)；而假手术组在第12天和第14天，与手术+M细胞治疗组体重无明显差异。以上结果显示M细胞治疗组对于肾纤维化小鼠的体重具有明显促进作用。

图177：肾纤维化模型各组小鼠尿微量白蛋白统计。对不同组别小鼠在第14天的尿微量白蛋白数值进行统计。手术+溶剂组尿微量白蛋白值显著高于假手术组(*,P＜0.05)，表明模型构建成功。M细胞治疗组尿微量白蛋白含量较假手术组无显著差异，较溶剂组显著降低(#,P＜0.05)，表明M细胞对于肾纤维化具有一定的治疗效果(P＜0.05)。

图178：肾纤维化模型各组小鼠尿液肌酐含量统计。对不同组别小鼠在第14天的尿液肌酐含量数值进行统计。手术+溶剂组尿液肌酐值显著高于假手术组(*,P＜0.05)，表明模型构建成功。M细胞治疗组尿液肌酐含量较假手术组无明显差异,较溶剂组显著降低(#,P＜0.05)，表明M细胞对于肾纤维化具有一定的治疗效果。

图179：肾纤维化模型各组小鼠尿素含量统计图。对不同组别小鼠在第14天的尿素含量数值进行统计。手术+溶剂组尿素值显著高于假手术组(**,P＜0.01)，表明模型构建成功。M细胞治疗组尿素含量较假手术组有显著升高(*,P＜0.05),较溶剂组有降低趋势，但无显著差异，表明M细胞对于肾纤维化具有一定程度的治疗趋势。

图180：肾纤维化模型各组小鼠尿酸含量统计。对不同组别小鼠在第14天的尿酸含量数值进行统计。手术+溶剂组尿酸值显著高于假手术组(*,P＜0.05)，表明模型构建成功。M细胞治疗组尿酸含量较溶剂组显著降低(#,P＜0.05)，表明M细胞对于肾纤维化具有一定程度的治疗效果。

图181：肾纤维化模型各组小鼠肾脏HE染色。对不同组别小鼠在第14天进行小鼠取材，肾脏进行包埋切片，随后进行HE染色。其中G1为假手术组，G2为手术+溶剂组，G3为手术+M细胞组。左肾为进行操作肾脏，右肾未进行操作，作为对照。从图中可看出，G2组小鼠肾脏基本结构消失，大量成纤维细胞增生；G3组小鼠肾脏结构有所改善，肾小管萎缩得到缓解，炎性因子浸润和成纤维细胞增生减少，坏死区域有所减缓。

图182：肾纤维化模型各组小鼠肾脏Masson染色。对不同组别小鼠在第14天进行小鼠取材，肾脏进行包埋切片，随后进行Masson染色。其中G1为假手术组，G2为手术+溶剂组，G3为手术+M细胞组。左肾为进行操作肾脏，右肾未进行操作，作为对照。从图中可看出，G1组肾脏组织无明显的胶原沉积；G2组中有被染成蓝色的片状阳性区域，且多分布在肾小管周围，表明有大量的胶原纤维沉积在肾间质；G3组大鼠肾脏组织蓝色区域明显减少，颜色减轻。以上结果证明M细胞能在小鼠肾纤维化模型中发挥抑制作用，改善肾脏结构，减少胶原沉积，延缓肾纤维化进展。

图183：肾纤维化模型各组小鼠肾脏免疫组化染色。对不同组别小鼠在第14天进行小鼠取材，肾脏进行α-SMA和CD31的免疫组化染色。其中G1为假手术组，G2为手术+溶剂组，G3为手术+M细胞组。左肾为进行操作肾脏，右肾未进行操作，作为对照。内皮细胞-间充质转分化(endothelial-mesenchymal transition，EndoMT),是受损伤肾脏产生肌成纤维细胞的重要机制。EndoMT是指内皮细胞失去其锚定连接与极性功能，进而转化为具有高度侵袭性、迁移性的瘦长梭形间充质细胞；内皮细胞形态与极性发生改变，生物化学性质亦改变，丢失其特征性标志物CD31等，而重新获得间充质细胞标志物α平滑肌激动蛋白(α-SMA)，转换成有活力的间充质细胞的过程。从图中可看出，与G1组左肾相比G2组肾脏组织在第14天时α-SMA的表达升高，CD31的表达量无明显变化，显示构建成功，小鼠出现肾纤维化模型。G3组左肾较G2组，在第十四天时，α-SMA表达有降低趋势，CD31表达有升高趋势。

图184：阿扑吗啡诱导帕金森模型大鼠旋转圈数统计。阿扑吗啡诱导大鼠旋转圈数分别在3周和7周进行统计。7周，M细胞组大鼠的旋转圈数明显低于溶剂组(240.5 vs 360.5)，表明M细胞可以减轻多巴胺能去神经，改善帕金森疾病程度。

图185：强迫游泳诱导小鼠抑郁模型中各组小鼠体重。

图186：强迫游泳诱导小鼠抑郁模型中各组小鼠强迫游泳的不动时间。

图187：皮炎模型小鼠在不同天数的背部图片。M细胞治疗组，小鼠的红疹程度更小，皮损缓解。说明M细胞可以很好的缓解皮炎小鼠的症状，对皮炎起到有效的治疗作用。

图188：皮炎模型小鼠HE染色图片。与OVA组相比，M细胞治疗后小鼠的角质层更薄，脂肪层增厚，说明M细胞治疗可以改善小鼠皮肤的微环境，抑制炎症情况，皮肤附属器官比OVA组也要多，说明M细胞可以保护皮肤的附属器官，对特应性皮炎起到很好的治疗效果。

图189：LPS诱导神经炎症小鼠脑组织中IL-1β(pg/ml)的含量统计结果。IL-1β促进炎症发生，是促炎因子，溶剂组脑组织中IL-1β含量与正常组相比较明显升高。同溶剂组相比，M细胞组有减少IL-1β含量的趋势。

图190：LPS诱导神经炎症小鼠脑组织中IL-6(pg/mg)的统计结果。溶剂组脑组织中IL-6含量与正常组相比明显升高。IL-6促进炎症发生，是促炎因子，与溶剂组相比，M细胞组有减少IL-6含量的趋势。

图191：LPS诱导神经炎症小鼠脑组织中IL-10(pg/mg)的统计。IL-10抑制炎症发生，是抑炎因子，M细胞组脑组织中IL-10浓度明显高于溶剂组(2.0 vs 2.7)，表明M细胞有抗炎作用。

图192：半月板损伤受试者VAS评分均值变化趋势图。两剂量组的VAS评分虽有上下波动，但整体上呈下降趋势，即受试者的膝关节疼痛接受研究药物注射后有一定程度的缓解。

图193：半月板损伤受试者Lysholm评分均值变化趋势图。两剂量组的受试者接受研究药物注射后，Lysholm总分数值呈上升的趋势，根据单项评估结果，研究药物注射后评分数值的上升主要体现在跛行、绞锁、疼痛方面，在其他单项评估上，评分数值无明显变化。因此，受试者接受研究药物注射后，Lysholm评分有一定改善，主要表现在跛行、交锁和疼痛缓解。

图194：半月板损伤受试者MRI图。M细胞治疗前有半月板损伤和严重的膝关节疼痛症状，经M细胞制剂关节腔内移植治疗3个月后，半月板损伤完全恢复，膝关节疼痛评分由原来的8分转为2分，局部水肿有减轻的效果，说明M细胞关节腔内移植可以很好的治疗半月板损伤。

图195：血液中ALT含量的统计。血液中ALT含量的结果显示，溶剂组ALT显著增多较正常对照组(58 vs 987)，而M细胞组明显降低了ALT含量与溶剂组相比。

图196：血液中AST含量的含量。溶剂组AST显著增多较正常对照组(81 vs 812)，而M细胞组明显降低了AST含量与溶剂组相比(473 vs 812)。

图197：肝脏中TG含量的统计。肝脏中TG含量的统计显示，溶剂组小鼠肝脏中TG浓度显著高于正常组(82.6 vs 4.8)***p＜0.001；M细胞组将TG浓度下降至49umol/g较溶剂组，具有显著性差异**p＜0.01。

图198：ARDS患者血氧饱和度。

图199：ARDS患者M细胞输注前(左图)、以及输注后(右图)胸部CT。第一次细胞输注前，患者胸部CT显示双肺多发双肺多发斑片、片状磨玻璃密度及高密度影(黄色箭头)。患者接受二次M细胞输注后(间隔6天)第二天，CT显示病灶部位吸收好转，第1次输注后1个月，CT显示回复正常，无纤维化形成

图200：ARDS患者体内IL-1RA水平变化。第一次输注后第八天，IL-1RA抑炎细胞因子水平升高。

图201：ARDS患者体内RANTES水平变化。第一次输注后第八天，RANTES抑炎细胞因子水平升高。

图202：ARDS患者体内IL-1α水平变化。第一次输注后第八天，IL-1α促炎细胞显著降低。

图203：ARDS患者体内IL-1β水平变化。IL-1β促炎细胞显著降低。

图204：ARDS患者体内IL-5水平变化。IL-5促炎细胞显著降低。

图205：ARDS患者体内IL-8水平变化。IL-8促炎细胞显著降低。

图206：ARDS患者体内IL-25水平变化。IL-25促炎细胞显著降低。

图207：ARDS患者体内CXCL10/IP-10水平变化。CXCL10/IP-10促炎细胞显著降低。

图208：IPF患者输注M细胞后胸部CT图像。M细胞输注前，患者胸部CT显示双肺多发双肺多发斑片、片状磨玻璃密度及高密度影(箭头所示)。患者接受M细胞输注后， CT显示全部患者病灶部位吸收好转，输注后1个月，CT显示基本恢复正常。50天后，所有患者肺部纤维化显著吸收好转。

图209：心肌缺血再灌注模型中的心脏LVEDP(mmHg)的统计结果。

图210：心肌缺血再灌注模型中的血液中LDH(U/L)含量的统计结果。

图211：心肌缺血再灌注模型中的血液中CK(U/L)含量的统计结果。

图212：肾切除模型中不同组大鼠体重统计结果。

图213：实施例46的各组血清抗双链DNA抗体水平的检测结果图。

图214：实施例43中尘肺模型小鼠肺组织HE染色结果。

图215：M细胞经MZJ注射液2冻存后的细胞活率检测结果。

图216：M细胞经MZJ注射液3冻存后的细胞活率检测结果。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

制备例1：人胚胎干细胞衍生的M细胞的制备

1.1胚状体(EB)的产生

a、移去原培养液，加入PBS清洗；

b、使用Dispase消化人胚胎干细胞(Q-CTS-hESC-2，国家干细胞资源库)；

c、弃酶液，加入1ml的KO-DMEM/F12，垂直画井字；

d、润枪头，将六孔板中的液体吹吸后转入15ml离心管中离心；

e、将离心好的克隆块去上清，在培养皿中取少量EB培养液重悬细胞，加入到低贴附的培养皿(Corning：货号3262)中，放入37℃培养箱中培养。

EB培养液(第一培养基)的配制：向KO-DMEM中加入10％(v/v)的KOSR、1％(v/v)的NEAA(即，0.1mM)、1％(v/v)的GlutaMAX(即，2mM)、8ng/mL的bFGF和0.1％(v/v)的β-巯基乙醇。

1.2 EB球的贴壁培养

a、在6孔板中包被玻连蛋白；

b、37℃预热MSC培养液；

c、将1.1中获得的EB球全部转移到50ml离心管中，静置5～10min；

d、把铺好的基质抽走，加入2ml MSC培养液；

e、移去上清，取1mL MSC培养液重悬EB球，在培养板孔中加入EB球；

f、晃匀放入培养箱中进行培养。

每天换液，直至14天左右，进行MSC的传代培养。

M细胞培养液(第二培养基)的配制：向α-MEM中加入1％(v/v)的Ultroser G、5％(v/v)的KOSR、1％(v/v)的NEAA、1％(v/v)的GlutaMAX、5μg/mL的抗坏血酸、5ng/mL的bFGF、5ng/mL的TGFβ。

1.3 MSC的传代

a、37℃预热上述MSC培养液；

b、移去原有的培养液，加入已经放至室温的PBS洗一遍；

c、加入Trypsin后，放入培养箱中，孵育消化2～3min；

d、待细胞从皿壁脱落时，加入与消化液等量的PBS终止消化；

e、用移液器轻柔吹打细胞，使细胞分散。

f、收集细胞悬液到离心管中离心，弃上清。

g、在新的培养皿中加入MSC培养液，接种至新的培养皿中，直至第五代，用于后续操作(例如细胞治疗)，或者使用Cryostor CS10进行冻存。

上述制备获得的M细胞可称为hESC-M细胞。

以上步骤中所涉及的试剂如下所示：

对比例1：人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞的制备

本实施例参考Hwang NS等人.Proc Natl Acad Sci U S A.2008Dec 30；105(52):20641-6.制备间充质干细胞。

1.EB的培养

1.1 EB培养液的配制

KnockOut DMEM/F12+15％FBS+5％KOSR+2mM NEAA+2mM谷氨酰胺+0.1mMβ-巯基乙醇

1.2 EB的形成

1.2.1移去原培养液，加入1mL的PBS清洗。

1.2.2加入1mL Dispase消化3-10min。

1.2.3弃酶液，加入1mL的KODMEM，垂直画井字。

1.2.4润枪头，将六孔板中的液体吹吸后转入离心管中离心。

1.2.5弃去上清，用EB培养液重悬后，加入到低贴附的10cm培养皿(Corning：货号3262)中，放入37℃培养箱中培养。

1.2.6每两天换液，直至第10天。

2.EB-M细胞的培养

2.1 EB-M细胞的培养

2.1.1预先用1mg/mL的明胶铺六孔板。

2.1.2将EB球全部转移到50mL离心管中，静置5～10min。

2.1.3待EB球沉降后，用泵抽走上清，取1mL EB培养液重悬后，接种于铺有明胶的六孔板中。

2.1.4放入培养箱中。

2.1.5每两天换液，直至第10天。

3.M细胞的培养

3.1 M细胞培养液的配制

DMEM+10％FBS+2mM谷氨酰胺

3.2 M细胞的传代培养

3.2.1用1mL DPBS清洗细胞，加1mL Trypsin，37℃消化3min左右，轻磕皿壁让细胞脱壁，加1mL DPBS终止消化。

3.2.2收集细胞，1200rpm，离心3min。

3.2.3弃上清，用5mL培养液重悬M细胞，细胞筛过滤细胞后，计数。

3.2.4按2×10 ⁵/cm ²的密度接种于10cm培养皿中，记为M P1。

3.2.5按同样方法，将MSC传代至第5代，进行后续操作。

以上步骤中所涉及的试剂如下所示：

KnockOut DMEM/F12(Gibco，10829018)

FBS(Gibco，16000044)

KOSR(Thermo，10828028)

NEAA(Gibco，11140050)

Glutamine(Gibco，A1286001)

β-巯基乙醇(Invitrogen，21985-023)

PBS(Gibco，C10010500BT)

Dispase(Gibco，17105041)

Trypsin(Gibco，25200072)

对比例2：原代间充质干细胞的制备

1、将脐带浸泡于PBS中，并在冰上运输至实验室。

2、将脐带剪成约3cm的小段，用含PBS洗至表面无血液。

3、剔除脐带中的3根血管。

4、将剔除血管后的脐带用眼科剪剪碎成细小组织块。

5、将剪碎的组织块贴于10cm皿中，并用镊子将每个组织块平均分开至皿的各处。

6、将皿倒放于CO ₂培养箱中过夜。

7、第二天将每个皿正置加入5mL培养液，放于CO ₂培养箱培养。

8、没隔一天换一次液体，约10天可见细胞爬出。

9、当细胞爬至70％左右进行传代。

实施例1-1：M细胞的表面标志物的检测

通过流式细胞术检测制备例1的M细胞表面蛋白的表达情况：

1.弃去培养上清，用PBS洗一遍，加入Trypsin消化3-5min，加入PBS终止。

2.收集细胞悬液，1200rpm离心3min。

3.弃上清，用PBS重悬后用细胞筛过滤，滤去细胞团，计数，按每管2×10 ⁶分装。

4. 1200rpm离心3min。

5.用2％BSA封闭液封闭20min后，1200rpm离心3min。

6.弃上清，用1％BSA抗体稀释液100μL重悬细胞后，加入直标抗体，常温孵育30-45 min。

7.用1mL PBS洗三遍，1200rpm离心3min，弃上清。

8. 300μL DPBS重悬后，用40μm细胞筛过滤后上机检测。

以上步骤中涉及抗体信息如下：

名称	公司	货号
CD10	BD	561002
CD24	BD	555428
IL-11	abcam	ab187167
AIRE-1	abcam	ab65040
ANG-1	abcam	ab102015
CXCL1	RD	IC275P
CD105	BioLegend	323206
CD73	eBioscience	11-0739-42
CD90	eBioscience	12-0909-42
CD13	BD	560998
CD29	BioLegend	303004
CD44	BD	561858
CD166	BD	560903
CD274	BD	561787
HLA-ABC	BD	560965
CD31	BD	560983
CD34	BD	555822
CD45	eBioscience	11-9459-42
CD133	BD	566593
FGFR2	RD	FAB684G
CD271	BD	560927
Stro-1	abcam	ab190282
CXCR4(CD184)	BD	561733
TLR3(CD283)	BD	565984

检测结果如图1所示，与原代MSC和现有技术方法获得的MSC相比，制备例1获得的M细胞在CD105、CD24、CD13、CD44、CD274和CD31表面标志物方面有显著差异。

实施例1-2：M细胞的细胞因子表达水平的检测

通过Real-time PCR测定制备例1的M细胞的细胞因子表达水平。

1、细胞RNA的提取

使用RNA提取试剂盒进行提取，具体步骤如下：

(1)每毫升RL裂解液中加入10μLβ-巯基乙醇，根据细胞量在冰上进行裂解细胞；

(2)将裂解后的液体转移至CS柱上，12000rpm，离心2min；

(3)向滤液中加入1倍体积70％乙醇，混匀后移至CR3中，12000rpm，离心1min；

(4)倒掉滤液，向CR3中加入350μL RW1，12000rpm，离心1min；

(5)倒掉滤液，向CR3中加入80μL DNase I工作液，室温15min；

(6)向CR3中加入350μL RW1，12000rpm，离心1min；

(7)倒掉滤液，向CR3中加入500μL RW，室温2min，12000rpm，离心1min；

(8)重复7步骤；

(9)倒掉滤液，不加任何液体，12000rpm，离心1min，离去残余漂洗液；

(10)将CR3转移至一个新的离心管中，晾干残余酒精后，加入30μL RNase-free水，室温2min，12000rpm，离心2min，得到RNA；

(11)用Nanodrop紫外分光光度计测RNA浓度；

(12)直接进行cDNA的合成或短期保存于-80℃冰箱。

2、反转录cDNA

使用反转录试剂盒进行单链cDNA的合成，具体步骤如下：

(1)加入oligo dt Primer、dNTP mixture、RNA模板和水，65℃反应5min，10μL反应体系如下：

(2)步骤1反应完毕后，立刻放入冰中。进行反转录的扩增反应，42℃反应60min；70℃，反应15min。

(3)反应完毕后，立刻放入冰中，短期保存于4℃冰箱备用。

3、荧光实时定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRCR)

使用TOYOBO Realtime PCR试剂盒进行qPCR，配制10μL反应体系，如下：

反应程序：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火并延伸45s，循环40次；溶解曲线。所显示的结果是三次重复实验的平均值。

4、所需试剂信息：

RNA提取试剂盒(天根，DP430)、cDNA反转录试剂盒(TAKARA，6110A)、SYBR Green Realtime PCR试剂盒(TOYOBO，QPS-201)。所涉及的引物信息如下：

检测结果如图2A-2D所示。结果显示，制备例1的M细胞的MMP1相对表达水平为 103.3014，对比例1的MSC的MMP1相对表达水平为1.151253，由此可见，本发明方法获得的M细胞的MMP1表达量显著提高，是现有技术方法获得的MSC的近90倍。MMP1是是一类蛋白水解酶，其能够降解多种结缔组织成分，它们包括明胶、纤维粘连蛋白、胶原、黏蛋白以及层粘连蛋白，已有研究证实MMP1在纤维化中有重要的作用。因此，可预期本发明的间充质干细胞在治疗肝纤维化、肺纤维化等方面具备更优的活性。

实施例1-3：iPSC衍生的M细胞的制备及其性质鉴定

(一)胚状体(EB)的产生

使用与制备例1.1相同的方法从人诱导多能干细胞(iPS)制备胚状体(EB)，其中EB培养液(第一培养基)为：KO-DMEM+20％KOSR+1％NEAA+1％Glutamine+5ng/mL bFGF

(二)EB球的贴壁培养

将EB球在包被VN的六孔板中进行培养，M细胞培养液(第二培养基)：向α-MEM中加入1％(v/v)的Ultroser G、5％(v/v)的KOSR、1％(v/v)的NEAA、1％(v/v)的GlutaMAX、5ng/mL的bFGF、5ng/mL的TGFβ。每两天换液，直至第14天。

(三)M细胞的传代培养

使用Tryple进行消化，在新的培养皿中加入MSC培养液，接种至新的培养皿中，直至第五代，用于后续操作(例如细胞治疗)，或者使用Cryostor CS10进行冻存。

以上所需试剂信息如下

VN(Gibco，A14700)、α-MEM(Gibco，12561-049)、KO-DMEM(Gibco，A12861-01)、KOSR(Gibco，A3020902)、NEAA(Gibco，11140050)、Glutamine(Gibco，A1286001)、Ultroser G(Pall,15950-017)、DPBS(Gibco，A1285801)、Dispase(Gibco，17105041)、Tryple(Gibco，A1285901)、bFGF(RD，233-FB)、TGFβ(RD，240-B)

通过上述方法获得的细胞可称为ips-M细胞。

(四)细胞形态学观察

形成拟胚体及ips-M细胞P0和P5代时的细胞形态如图166所示，结果显示可以得到正常形态的M细胞。

(五)流式检测M细胞的阳性和阴性表面标志物

通过流式测定ips-M细胞的表面标志物的表达，具体方法如实施例1-1所示。ips-M细胞的阳性和阴性表面标志物结果大部分与制备例1的M细胞类似(图167)。

(六)qPCR检测PGE2和MMP1的表达

通过qPCR测定PGE2和MMP1的表达，具体方法如实施例1-2所示。ips-M细胞的MMP1表达水平均在原代间充质干细胞的10倍以上(图168)。PGE2的qPCR结果见图169。

实施例2：不同培养基范围制备的人胚胎干细胞(hESCs)来源M细胞及其性质测定

一、细胞制备

1.EB培养

1.1 EB培养液的配制

①KO-DMEM+20％KOSR+1％NEAA+1％Glutamine+5ng/mL bFGF；或

②根据下文中所述的具体分组配制。

1.2 EB的形成

1.2.1用泵抽走原培养液，加入1mL的DPBS清洗。

1.2.2加入1mL Dispase消化3min(克隆块边缘卷缩)，代表消化完成。

1.2.3弃酶液，加入1mL的KO-DMEM，用5mL的离心管垂直画井字。

1.2.4润枪头，将六孔板中的液体吹吸后转入15mL离心管中800rpm离心3min。

1.2.5弃去上清，用EB培养液重悬后，加入到低贴附的10cm培养皿中，放入37℃培养箱中培养。

1.2.6每天换液，直至第5天。

2.EB-MSC的培养

2.1 EB-MSC的培养

2.1.1预先用1mg/mL的VN铺六孔板。

2.1.2将EB球全部转移到15mL离心管中，静置5～10min。

2.1.3待EB球沉降后，用泵抽走上清，取1mL EB培养液重悬后，按每个孔加入10个左右EB球的量接种于铺有VN的六孔板中。

2.1.4“8字法”晃匀放入培养箱中。

2.1.5每两天换液，直至第14天。

3.M细胞的培养

3.1 M细胞培养液的配制

①M细胞培养液的配制：向α-MEM中加入1％(v/v)的Ultroser G、5％(v/v)的KOSR、1％(v/v)的NEAA、1％(v/v)的GlutaMAX、5ng/mL的bFGF、5ng/mL的TGFβ。或，

②根据下文中所述的具体分组配制。

3.2 M细胞的传代培养

3.2.1用1mL DPBS清洗细胞，加1mL Tryple，37℃消化3min左右，轻磕皿壁让细胞脱壁，加1mL DPBS终止消化。

3.2.2收集细胞，1200rpm，离心3min。

3.2.3弃上清，用5mL M细胞培养液重悬细胞，70μm的细胞筛过滤细胞后，计数。

3.2.4按2×10 ⁵/cm ²的密度接种于10cm培养皿中，记为M细胞P1。

3.2.5按同样方法，将M细胞传代至第5代，进行检测。

4.以上所需试剂信息

VN(Gibco，A14700)

α-MEM(Gibco，12561-049)

KO-DMEM(Gibco，A12861-01)

KOSR(Gibco，A3020902)

NEAA(Gibco，11140050)

Glutamine(Gibco，A1286001)

Ultroser G(Pall,15950-017)

DPBS(Gibco，A1285801)

Dispase(Gibco，17105041)

Tryple(Gibco，A1285901)

bFGF(RD，233-FB)

TGFβ(RD，240-B)

EGF(Solarbio，P00033)

PDGF(Solarbio，P00031)

VEGF(Solarbio，P00063)

抗坏血酸(Selleck，Selleck)

5.以上所需仪器信息

试剂/设备

厂家

货号

CO2培养箱	Thermo	3131
生物安全柜	海尔	HR40-IIA2
离心机	湘仪	TD25-WS
细胞计数仪	Life technologies	CountessⅡFL
显微镜	Leica	DMi1
真空泵	KNF	N86KN.18
100-1000μL移液枪	eppendorf	J46045F
20-200μL移液枪	eppendorf	L22687F
10-100μL移液枪	eppendorf	M46287F
0.5-10μL移液枪	eppendorf	K19138F
0.1-2.5μL移液枪	eppendorf	L22220F
冰箱	海尔	BCD-256KDC
低贴附10cm皿	Corning	3262
10cm皿	Corning	430167
六孔板	Corning	3335

二、流式检测M细胞表面蛋白

1.弃去培养上清，用PBS洗一遍，加入Tryple消化3min，加入DPBS终止。

2.收集细胞悬液，1200rpm离心3min。

3.弃上清，用DPBS重悬后用40μm细胞筛过滤，滤去细胞团，计数，按每管2×10 ⁶分装。

4. 1200rpm离心3min。

5.用2％BSA封闭液封闭20min后，1200rpm离心3min。

6.弃上清，用1％BSA抗体稀释液100μL重悬细胞后，加入直标抗体，常温孵育30-45min。

7.用1mL PBS洗三遍，1200rpm离心3min，弃上清。

8. 300μL DPBS重悬后，用40μm细胞筛过滤后上机检测。

9.所需抗体信息如下：

10.所需仪器信息

试剂/设备	厂家	货号
CO2培养箱	Thermo	3131
生物安全柜	海尔	HR40-IIA2
离心机	湘仪	TD25-WS
细胞计数仪	Life technologies	CountessⅡFL
真空泵	KNF	N86KN.18
100-1000μL移液枪	eppendorf	J46045F
20-200μL移液枪	eppendorf	L22687F
10-100μL移液枪	eppendorf	M46287F
0.5-10μL移液枪	eppendorf	K19138F
0.1-2.5μL移液枪	eppendorf	L22220F
流式细胞仪	贝克曼	Cyto FLEX

三、Real-time PCR

3.1细胞RNA的提取

使用RNA提取试剂盒进行提取，具体步骤如下：

1.每毫升RL裂解液中加入10μL β-巯基乙醇，根据细胞量在冰上进行裂解细胞；

2.将裂解后的液体转移至CS柱上，12000rpm，离心2min；

3.向滤液中加入1倍体积70％乙醇，混匀后移至CR3中，12000rpm，离心1min；

4.倒掉滤液，向CR3中加入350μL RW1，12000rpm，离心1min；

5.倒掉滤液，向CR3中加入80μL DNase I工作液，室温15min；

6.向CR3中加入350μL RW1，12000rpm，离心1min；

7.倒掉滤液，向CR3中加入500μL RW，室温2min，12000rpm，离心1min；

8.重复7步骤；

9.倒掉滤液，不加任何液体，12000rpm，离心1min，离去残余漂洗液；

10.将CR3转移至一个新的离心管中，晾干残余酒精后，加入30μL RNase-free水，室温2min，12000rpm，离心2min，得到RNA；

11.用Nanodrop紫外分光光度计测RNA浓度；

12.直接进行cDNA的合成或短期保存于-80℃冰箱。

3.2反转录cDNA

使用反转录试剂盒进行单链cDNA的合成，具体步骤如下：

1.加入oligo dt Primer、dNTP mixture、RNA模板和水，65℃反应5min，10μL反应体系如下：

2.步骤1反应完毕后，立刻放入冰中。进行反转录的扩增反应，42℃反应60min；70℃，反应15min。

3.反应完毕后，立刻放入冰中，短期保存于4℃冰箱备用。

3.3荧光实时定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRCR)

反应程序：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火并延伸45s，循环40次；溶解曲线。

3.4所需试剂信息：

RNA提取试剂盒(天根，DP430)、cDNA反转录试剂盒(TAKARA，6110A)、SYBR Green Realtime PCR试剂盒(TOYOBO，QPS-201)

所需引物序列

3.5所需仪器信息：

试剂/设备	厂家	货号
100-1000μL移液枪	eppendorf	J46045F
20-200μL移液枪	eppendorf	L22687F
10-100μL移液枪	eppendorf	M46287F
0.5-10μL移液枪	eppendorf	K19138F
0.1-2.5μL移液枪	eppendorf	L22220F
冷冻离心机	Beckman	Allegra X-15R
荧光定量PCR仪	Agilent	M3005P

四、统计分析

采用Prism 7.0统计分析软件中的One-way ANOVA和T-TEST进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准误(Mean±SE)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

五、实验结果

(一)第一培养基浓度范围

1.第一培养基：浓度设置如下

表2-1：第一培养基各组分含量表。

2.步骤：利用上述5种培养基悬浮培养拟胚体，随后使用M细胞培养基培养M细胞，传代至第五代后进行检测。

3.细胞形态学观察

所有配方均可以得到EB球，贴壁后有细胞爬出，传代至第5代时，可以形成贴壁生长、呈梭形的M细胞。配方3在形成EB球时与其他配方有差异，但可以得到正常形态的M细胞(图5)。

4.流式检测M细胞的阳性和阴性表面标志物

不同配方制备的M细胞的阳性和阴性表面标志物结果大部分与制备例1的M细胞类似(图6-10，表2-2)。

表2-2：M细胞的流式细胞结果的统计

5.qPCR检测PGE2和MMP1的表达

第一培养基配方1～5的MMP1表达水平均在原代间充质干细胞的10倍以上(图11，表2-3)。PGE2的qPCR结果如图12、表2-4所示。

表2-3：第一培养基不同配方M细胞MMP1的qPCR结果的统计

表2-4：第一培养基不同配方M细胞PGE2的qPCR结果的统计

(二)第一培养基中NEAA浓度范围

1.第一培养基中NEAA浓度设置

对NEAA浓度设置浓度梯度如下：

表2-5：第一培养基NEAA含量表。

2.步骤：利用上述5种悬浮培养拟胚体，随后使用M细胞培养基培养M细胞，传代至第五代后进行检测。

3.形态学观察

所有配方均可以得到EB球，贴壁后有细胞爬出，传代至第5代时，可以形成贴壁生长、呈梭形的M细胞。形成EB球时，虽然配方5有一些死细胞，但可以得到正常形态的M细胞(图13)。

4.流式检测M细胞的阳性和阴性表面标志物

流式结果显示大部分检测指标与制备例1的M细胞类似(表2-6，图14-18)。

表2-6：M细胞的流式细胞结果的统计

	CD45	CD34	CD13	CD73	CD105	CD29	CD90	Strol-1
配方1	0.00	0.38	100.00	97.32	99.34	100.00	99.98	1.43
配方2	0.00	0.47	99.99	97.08	99.68	100.00	99.96	1.57
配方3	0.00	0.25	99.92	97.90	99.30	100.00	99.92	1.47
配方4	0.03	0.30	99.96	96.68	98.95	99.99	95.50	1.43
配方5	0.03	0.01	99.98	74.57	98.29	100.00	99.22	7.19

5.qPCR检测PGE2和MMP1的表达

第一培养基配方1～5产生的M细胞的MMP1表达水平均在原代间充质干细胞的10倍以上(表2-7，图19)。PGE2检测结果见表2-8、图20。

表2-7：第一培养基不同配方M细胞MMP1的qPCR结果的统计

表2-8：第一培养基不同配方M细胞PGE2的qPCR结果的统计

(三)第二培养基浓度范围

1.第二培养基中各组分浓度范围

表2-9 第二培养基各组分含量表

2.步骤：利用EB培养基悬浮培养拟胚体，随后使用上述11种配方培养M细胞，传代至第五代后进行检测。

3.形态学观察

配方3(所有组分最高浓度)的细胞凋亡无法培养，其他配方都可以得到贴壁生长、呈梭形的M细胞(图21)。

4.流式检测M细胞的阳性和阴性表面标志物

流式结果显示，所检测M细胞的阳性和阴性表面标志物结果基本与制备例1的M细胞类似(表2-10，图22-25)。

表2-10：M细胞的流式细胞结果的统计

5.qPCR检测PGE2和MMP1的表达

对于MMP1，大部分配方的MMP1表达量均在原代间充质干细胞的10倍以上(表2-11，图26)。PGE2的检测结果见表2-12、图27。

表2-11：第二培养基不同配方M细胞MMP1的qPCR结果的统计

表2-12：第二培养基不同配方M细胞PGE2的qPCR结果的统计

(四)第二培养基浓度范围

1.根据下表设置第二培养基各组分浓度

表2-13：第二培养基各组分含量表。

2.步骤：利用EB培养基悬浮培养拟胚体，随后使用上述5种配方培养M细胞，传代至第五代后进行检测。

3.细胞形态观察

配方3-2(Ultroser G最高浓度)和3-5(抗坏血酸最高浓度)细胞全部凋亡，其他配方都可以得到贴壁生长、呈梭形的M细胞(图28)。

4.流式检测M细胞的阳性和阴性表面标志物

所检测M细胞的阳性和阴性表面标志物结果大部分与制备例1的M细胞类似(表2-14，图29-31)。

表2-14：M细胞的流式细胞结果的统计。

5.qPCR检测PGE2和MMP1的表达

对于MMP1，所有配方均在原代间充质干细胞的10倍以上(表2-15，图32)。PGE2的结果见表2-16、图33。

表2-15：各培养基不同配方M细胞MMP1的qPCR结果的统计

表2-16：各培养基不同配方M细胞PGE2的qPCR结果的统计

(五)第二培养基浓度范围

1.基于(四)中的配方3-2和3-5，进一步设置Ultroser G和抗坏血酸浓度梯度。

表2-17：第二培养基各组分含量表

2.步骤：利用EB培养基悬浮培养拟胚体，随后使用上述7种配方培养MSC细胞，传代至第五代后进行检测。

3.细胞形态观察

配方3-2-1、3-5-1、3-5-2和3-5-3细胞全部凋亡。配方3-2-2细胞有少量存活，细胞生长缓慢。其他配方都可以得到贴壁生长、呈梭形的M细胞(图34)。

4.流式检测M细胞的阳性和阴性表面标志物

细胞流式结果显示，所检测M细胞的阳性和阴性表面标志物结果与制备例1的M细胞类似(表2-18，图35，图36)。

表2-18：M细胞的流式细胞结果的统计。

	CD45	CD34	CD13	CD73	CD105	CD29	CD90	Strol-1
配方3-2-3	0.37	0.53	100.00	99.50	99.87	99.98	99.96	0.28
配方3-5-4	0.12	0.38	100.00	99.44	99.57	100.00	100.00	0.92

5.qPCR检测PGE2和MMP1的表达

对于MMP1，所有配方均在原代间充质干细胞的10倍以上(表2-19，图37)。PGE2的结果见表2-20、图38。

表2-19：各培养基不同配方M细胞MMP1的qPCR结果的统计

表2-20：各培养基不同配方M细胞PGE2的qPCR结果的统计

如无特别说明，下述各实施例中所用M细胞的制备采用制备例1中的方法。

实施例3：喷射M细胞喷射体系

M细胞的制备培养：胚胎干细胞悬EB球，进行贴壁分化，获取P0代的M细胞，进行传代筛选，在P3代进行冻存，用于后续实验。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

1、喷射方法：将P5代的M细胞重悬在M细胞培养液(第二培养基)中，密度调整为8×10 ⁴cells/mL，利用喷图笔进行喷射，调整泵的压力<10kPa，孔径为0.8mm，喷射到10cm皿培养皿上。喷射M细胞的装置如图39所示。

喷射后细胞接种到96孔培养板上，每孔接种8000个细胞，未经喷射的M细胞以相同的密度接种到96孔板上，作为对照。隔天利用CCK8试剂盒检测M细胞喷射前后的增殖能力。

2、CCK8检测方法：

(1)制备细胞悬液，计数。

(2)在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μl，同样的样本可做3个重复。

(3)将培养板放入培养箱中预培养一段时间(37℃,5％CO ₂)，细胞贴壁4小时。

(4)每孔各加入10μl CCK-8溶液，加样的过程中尽量不要产生气泡。

(5)将培养板放入培养箱中孵育2小时。

(6)酶标仪测定450nm处的吸光值(OD)。

3、细胞损伤程度检测，LDH试剂盒法(碧云天，C0017)

4、流式检测M细胞表面蛋白

(1)弃去培养上清，用PBS洗一遍，加入Tryple消化3min，加入DPBS终止。

(2)收集细胞悬液，1200rpm离心3min。

(3)弃上清，用DPBS重悬后用40μm细胞筛过滤，滤去细胞团，计数，按每管2×10 ⁶分装。

(4)1200rpm离心3min。

(5)用2％BSA封闭液封闭20min后，1200rpm离心3min。

(6)弃上清，用1％BSA抗体稀释液100μL重悬细胞后，加入直标抗体，常温孵育30-45min。

(7)用1mL PBS洗三遍，1200rpm离心3min，弃上清。

(8)300μL DPBS重悬后，用40μm细胞筛过滤后上机检测。

(9)所需抗体信息如下：

所需仪器信息

试剂/设备	厂家	货号
CO2培养箱	Thermo	3131
生物安全柜	海尔	HR40-IIA2
离心机	湘仪	TD25-WS
细胞计数仪	Life technologies	CountessⅡFL
真空泵	KNF	N86KN.18
100-1000μL移液枪	eppendorf	J46045F
20-200μL移液枪	eppendorf	L22687F
10-100μL移液枪	eppendorf	M46287F
0.5-10μL移液枪	eppendorf	K19138F

0.1-2.5μL移液枪	eppendorf	L22220F
流式细胞仪	贝克曼	Cyto FLEX

5、悬液芯片系统检测炎症因子：

(1)开机Bio-Plex 200预热30min。将试剂盒放到室温，稀释液、洗液、检测液、标准品HB、检测抗体稀释液HB、样本稀释液HB放到室温，其他的试剂放到4℃。使用48因子试剂盒进行炎症因子的检测。

(2)从-80℃冰箱中取出冻存的细胞上清放到冰上，待溶解后，细胞培养上清加入0.5％BSA(w/v)稀释。

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(4)向标准品瓶中加入250μL的标准品稀释液HB，涡旋5s，立刻冰上孵育30min(时间要精确)。

(5)标准品的稀释，从S1到S9，四倍梯度浓度稀释；并准备空白孔。

(6)将磁珠涡旋振荡30s混匀，用Bio-Plex检测缓冲液稀释到1倍，避光保存。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μL的磁珠。

(8)用100μL的洗液洗板两次。

(9)涡旋样本、标准品、空白对照、已知浓度的对照品。每孔加50μl。

(10)用封板膜封板，在高频振荡器上，室温震荡850±50rpm，30min。

(11)步骤10中，震荡时间剩余10min时，涡旋振荡检测抗体5s，稀释到1倍。

(12)用100μL的洗液洗板两次。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μL。

(14)用封板膜封板，在高频振荡器上，室温震荡850±50rpm，30min。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(16)步骤14中，震荡时间剩余10min时，涡旋振荡SA-PE 5并稀释到1倍。

(17)用100μL的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μL。

(19)用封板膜封板，在高频振荡器上，室温震荡850±50rpm，30min。

(20)用100μL的洗液洗板三次。

(21)用125μL的检测液重悬磁珠，用封板膜封板，在高频振荡器上，室温震荡850±50rpm，30s。

(22)弃去封板膜，开始上机。

以上所使用的多因子悬浮芯片系统为

200(Bio-Rad)

6、细胞活率检测：(血球计数板法)来源于T/CSCB 0002-2020《人胚干细胞》

(1)细胞悬液制备

收集待检测细胞，用磷酸盐缓冲液配制细胞悬液，稀释至合适的浓度。每个1mm ²的方格中的细胞的数量应为

个细胞。如果高于200个细胞，则需要进行稀释。

(2)细胞染色

按1:1的体积比将台盼蓝染液与细胞悬液混合均匀。

(3)细胞计数

将盖玻片盖在血球计数板计数槽上，取10μL混合液滴在一侧计数室的盖玻片边缘，另取10μL混合液，滴在另一侧计数室的盖玻片边缘，使混合液充满盖玻片和计数板之间，静置30s，将计数板置显微镜下对被染色的细胞和细胞总数分别进行计数。

对16×25规格的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个1mm ²的中格(即100个小格)计数。对25×16规格的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下和中央5个中格(即80个小格)计数。当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和左线上的细胞(或只计数下方和右方线上的细胞)。

(4)计算与分析

细胞存活率按式(I)进行计算：

S＝(M－D)/M×100％ (I)

式(I)中：

S——细胞存活率

M——细胞总数

D——染色的细胞数

细胞存活率为2个样品的平均值。计算两次计数活细胞比率结果的平均值，记为细胞平均存活率。所使用的显微镜为DMi1(Leica)

通过检测细胞内LDH的含量，判断细胞受损程度。发现，喷射细胞与未喷射细胞的细胞损伤程度无差异。通过流式细胞术检测喷射细胞与未喷射细胞的标志蛋白表达情况，发现M细胞特异性标志物，例如CD73、CD105、CD29等无差异。检测喷射细胞与未喷射细胞对于免疫调节因子的分泌水平，结果发现IDO、IL1RA等无差异。喷射细胞与未喷射细胞活率无差异。细胞经过喷射后形态正常，增殖能力同非喷射细胞没有太大差别。CCK8法检测M细胞喷射前后的增殖能力的结果如图40所示。

实施例4：对M细胞的友好性培养材料

通过制备例1的方法，以GFP标记的胚胎干细胞为起始材料获得EB球，进一步通过贴壁分化获取P0代的GFP标记的M细胞，进行传代筛选，在P3代进行冻存，用于后续实验。

复苏P3代GFP标记的M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

将GFP标记的M细胞的密度调整为高密度的细胞悬液，滴加到材料上，24h后进行换液，之后在荧光镜下观察细胞的生长情况。

1、Live/Dead试剂盒检测。

2、CCK8检测方法，方法如实施例3中所述。

3、流式检测M细胞表面蛋白，方法如实施例3中所述。

4、悬液芯片系统检测炎症因子，方法如实施例3中所述。

5、细胞活率检测，方法如实施例3中所述。

6、扫描电镜：1)戊二醛固定细胞，弃上清，加入PBS洗3次，每次6min，7min，8min；2)加入50％乙醇浸泡14min；3)加入85％乙醇浸泡14min；4)加入95％乙醇浸泡15min；5)加入100％乙醇浸泡15min；6)临界点干燥；7)将样品粘至金属台中，喷金处理；8)扫描电镜观察。

7、实验结果：

将圆环型的胶原支架切成长5mm的长的小段材料，放到24孔板中，滴加高密度的细胞悬液(50μl含有2×10 ⁶的GFP标记的M细胞)在材料上，在37℃培养箱中培养1小时后，每孔加入1ml的GFP标记的M细胞培养液。之后每天换液，并在第1、3天进行荧光镜下的观察。荧光照片如图41所示。从荧光照片可以看出GFP标记的M细胞可以很好的贴附生长在胶原材料上。圆形的胶原支架材料可以用来做后续的脊髓损伤移植实验。

将明胶电纺丝裁剪成5mm×5mm大小的材料，放到24孔板中，滴加高密度的细胞悬液(50μl含有2×10 ⁶的GFP标记的M细胞)在材料上，在37℃培养箱中培养1小时后，每孔加入1ml的GFP标记的M细胞培养液。之后每天换液，并在第1、3天进行荧光镜下的观察。荧光照片如图42所示。从荧光照片可以看出GFP标记的M细胞可以很好的贴附生长在明胶电纺丝上。搭载细胞的明胶电纺丝可以用来做后续的皮肤、角膜、黏膜类等的移植治疗实验。

将胶原支架裁剪成5mm×5mm大小的材料，放到24孔板中，滴加高密度的细胞悬液(50μl含有2×10 ⁶的GFP标记的M细胞)在材料上，在37℃培养箱中培养1小时后，每孔加入1ml的GFP标记的M细胞培养液。之后每天换液，并在第5、7、9天进行荧光镜下的观察。荧光照片如图43所示。从荧光照片可以看出GFP标记的M细胞可以很好的贴附生长在胶原支架上。搭载细胞的胶原支架可以用来做后续的皮肤、角膜、黏膜类等的移植治疗实验。

将皮肤修复膜裁剪成5mm×5mm大小的材料，放到24孔板中，滴加高密度的细胞悬液(50μl含有2×10 ⁶的GFP标记的M细胞)在材料上，在37℃培养箱中培养1小时后，每孔加入1ml的GFP标记的M细胞培养液。之后每天换液，并在第5、7、9天进行荧光镜下的观察。荧光照片如图44所示。从荧光照片可以看出GFP标记的M细胞可以很好的贴附生长在皮肤修复膜上。搭载细胞的皮肤修复膜可以用来做后续的皮肤、角膜、黏膜类等的移植治疗实验。

按照2％胶原+1％透明质酸+1％海藻酸钠和2％胶原+2％海藻酸钠分别配制两种混合凝胶，放到24孔板中，滴加高密度的细胞悬液(50μl含有2×10 ⁶的GFP标记的M细胞)在材料上，在37℃培养箱中培养1小时后，每孔加入1ml的GFP标记的M细胞培养液。之后每天换液，并在第5、7、9天进行荧光镜下的观察。荧光照片如图45所示。从荧光照片可以看出GFP标记的M细胞可以很好的贴附生长在皮肤修复膜上。搭载细胞的皮肤修复膜可以用来做后续的皮肤、角膜、黏膜类等的移植治疗实验。M细胞接种在明胶上，能正常生长和增殖，具有正常的形态，表达正常水平的特异标记蛋白，分泌正常水平的免疫调节因子。

壳聚糖：通过CCK8试剂盒法检测M细胞在壳聚糖支架上的增殖情况，结果显示M细胞能在壳聚糖上正常生长和增殖。

M细胞接种到混合材料胶原-壳聚糖支架中，通过CCK8试剂盒法检测细胞在支架上的增殖情况，扫描电镜观察细胞在支架的生长、贴附情况。结果显示，M细胞能正常贴附、生长、增殖。

在壳聚糖与胶原或海藻酸形成高分子离子复合物中进行M细胞的培养，发现M细胞可以在复合物中生长，且复合物在细胞培养过程中不发生降解收缩，此结果有望成为较理想的组织工程支架。

海藻酸钠：通过CCK8试剂盒活性检测，细胞活率检测等方面详细考察M细胞在海藻酸水凝胶微球中的生长状态，结果发现:M细胞可以在海藻酸钠上生长，细胞贴壁形态呈梭状和纤维状,并且具备向骨,脂肪和软骨分化的能力。

海藻酸钠-壳聚糖：M细胞能在该组合材料上生长，经过细胞活率检测，发现细胞活率较高，形态正常。

丝素蛋白：用活细胞计数法，观察丝素蛋白对M细胞生长的影响。结果显示M细胞能在丝素蛋白上正常生长，呈现正常的生长增殖曲线。

纤维素聚乳酸：将M细胞复合于纤维素聚乳酸支架材料,通过扫描电镜及荧光电镜观察法，观测细胞生长情况。结果显示M细胞能正常在该材料上生长，M细胞结合该材料有望作为生物组织工程支架材料。

弹性蛋白原(tropoelastin)：将M细胞接种在弹性蛋白上，通过扫描电镜及荧光电镜观察，发现M细胞可以在弹性蛋白原生长。

透明质酸：将M细胞接种在透明质酸材料上，通过扫描电镜及荧光电镜观察，发现M细胞能在透明质酸材料上正常生长。

以上结果表明，胶原支架、皮肤修复膜、氨基化明胶、壳聚糖等材料可以搭载M细胞生长，并且可以让M细胞很好地分化。

实施例5：人胚干细胞来源M细胞即用型注射液及制备

本实施例提供几种有效保存人胚干细胞来源M细胞注射液制备方法，该方法操作简单，能够有效保存M细胞。

实验过程及方法：

将M细胞培养至P5代进行收获，使用DPBS进行细胞清洗后，分别使用生理盐水、5％葡萄糖注射液、乳酸钠林格注射液、复方电解质注射液、20％HSA注射液、琥珀酰明胶注射液进行重悬，细胞密度为3～6x10^6个细胞/mL，取样检测细胞活率，并将重悬后细胞悬液平均分为2管，分别保存在RT和4℃，定时进行活率检测，检测细胞保存效果。

所用试剂耗材及仪器：

(一)生理盐水细胞重悬液：

1、实验步骤：

(1)将培养至P5代的细胞进行收获，使用台盼蓝染色进行计数，估测细胞总数。

(2)取细胞悬液1.5ml置于15ml离心管中，1500rpm离心5min；

(3)弃上清，取3ml的生理盐水进行重悬；

(4)将细胞悬液平均分为两管，约1.5ml/管，其中一支放于室温(RT)，1支放于4℃保存，保存前取样50ul～100ul细胞悬液用于台盼蓝染色检测细胞密度及活率；

(5)依次按不同时间点进行取样检测：3h、5h、24h、48h。

2、实验结果：

表5-1：生理盐水重悬细胞活率检测结果

细胞活率检测结果如图46所示。使用生理盐水重悬M细胞沉淀后，在RT条件下，可在24小时内保持M细胞活率在80％以上；在4℃条件下，可在5小时内保持M细胞活率在80％以上；与4℃保存条件相比，RT保存条件下细胞活率更好。

(二)乳酸钠林格细胞重悬注射液：

1、实验步骤：

(2)取细胞悬液1.5ml置于15ml离心管中，1500rpm离心5min；

(3)弃上清，取3ml的乳酸钠林格注射液进行重悬；

(5)依次按不同时间点进行取样检测：3h、5h、24h、48h。

2、实验结果：

表5-2：乳酸钠林格注射液重悬细胞活率检测结果

细胞活率检测结果如图47所示。使用乳酸钠林格注射液重悬M细胞沉淀后，在RT和4℃条件下，可在5小时内保持M细胞活率在85％以上；RT和4℃保存条件无明显优劣。

(三)复方电解质细胞重悬注射液

1、实验步骤：

(2)取细胞悬液1.5ml置于15ml离心管中，1500rpm离心5min；

(3)弃上清，取3ml的复方电解质注射液进行重悬；

(5)依次按不同时间点进行取样检测：3h、5h、24h、48h。

2、实验结果：

表5-3：复方电解质注射液重悬细胞活率检测结果

细胞活率检测结果如图48所示。使用复方电解质注射液重悬M细胞沉淀后，在RT和4℃条件下，可在5小时内保持M细胞活率在85％以上；RT保存条件下，细胞活率均能达到85％以上；与4℃条件相比，在RT条件下保存M细胞效果更好。

(四)5％葡萄糖细胞重悬注射液

1、实验步骤：

(2)取细胞悬液1.5ml置于15ml离心管中，1500rpm离心5min；

(3)弃上清，取3ml的5％葡萄糖注射液进行重悬；

(5)依次按不同时间点进行取样检测：3h、5h、24h、48h。

2、实验结果：

表5-4：5％葡萄糖细胞重悬注射液

细胞活率检测结果如图49所示。使用5％葡萄糖注射液重悬M细胞后，立即取样检测细胞活率发现：细胞活率骤降，因此，后续使用时可能需要避免直接单独使用。

(五)20％HSA细胞重悬注射液

1、实验步骤：

(1)将培养至P5代的细胞进行收获，使用台盼蓝染色进行计数，估测细胞总数；

(2)取细胞悬液1.5ml置于15ml离心管中，1500rpm离心5min；

(3)弃上清，取3ml的20％HSA注射液进行重悬；

(5)依次按不同时间点进行取样检测：3h、5h、24h、48h、72h、100h、6天、8天、10天、14天。

2、实验结果：

表5-5：20％HSA注射液重悬细胞活率检测结果

细胞活率检测结果如图50所示。使用20％HSA注射液重悬M细胞沉淀后，在RT和4℃条件下保存14天，细胞活率均能达到85％以上；在4℃条件下保存M细胞效果更好，可在14天内保持M细胞活率在90％以上。

(六)琥珀酰明胶细胞重悬注射液：

1、实验步骤：

(2)取细胞悬液1.5ml置于15ml离心管中，1500rpm离心5min；

(3)弃上清，取3ml的琥珀酰明胶注射液进行重悬；

2、实验结果：

表5-6：琥珀酰明胶注射液重悬细胞活率检测结果

细胞活率检测结果如图51所示。使用琥珀酰明胶注射液重悬M细胞沉淀后，在RT和4℃条件下保存条件下，均可在24小时内保持M细胞活率在90％以上；72小时内保持M细胞活率在80％以上；RT和4℃两种条件保存无太大差异。

(七)MZJ注射液1(未冻存)

1、实验步骤：

(1)MZJ注射液1配制：分别取6.5ml复方电解质溶液、2.5ml20％HSA、1mlDMSO于50ml离心管中，混匀后，4℃保存；

将培养至P5代的细胞进行收获，使用台盼蓝染色进行计数，估测细胞总数；

(2)取细胞悬液1.5ml置于15ml离心管中，1500rpm离心5min；

(3)弃上清，取3ml的MZJ注射液进行重悬；

2、实验结果：

表5-7：MZJ注射液1重悬细胞活率检测结果

细胞活率检测结果如图52所示。使用MZJ注射液1重悬M细胞沉淀后，在RT和4℃保存条件下，均可在24小时内保持M细胞活率在90％以上；在4℃条件下保存M细胞效果更好，可在14day内保持M细胞活率在80％以上。

此外，使用MZJ注射液在-80℃对M细胞进行冻存，冻存后M细胞活率检测结果如图54所示。经MZJ注射液冻存的M细胞复苏后，在RT保存条件下，可在5小时内保持M细胞活率在90％以上，在24小时内保持M细胞活率在80％以上；在4℃条件下保存M细胞效果更好，可在5天内保持M细胞活率在80％以上。

(八)琥珀酰明胶MIX注射液

1、实验步骤：

(1)琥珀酰明胶MIX注射液配制：分别取6.5ml复方电解质溶液、2.5ml琥珀酰明胶注射液、1mlDMSO于50ml离心管中，混匀后，4℃保存；

(2)取细胞悬液1.5ml置于15ml离心管中，1500rpm离心5min；

(3)弃上清，取3ml的琥珀酰明胶MIX注射液进行重悬；

2、实验结果：

表5-8：琥珀酰明胶MIX注射液重悬细胞活率检测结果

细胞活率检测结果如图53所示。使用琥珀酰明胶MIX注射液重悬M细胞沉淀后，在RT保存条件下，均可在5小时内保持M细胞活率在80％以上；在4℃条件下保存M细胞效果更好，可在72小时内保持M细胞活率在90％以上。

(九)MZJ注射液1(冻存)

1.实验步骤

(2)取一定体积的细胞悬液置于50ml离心管中，1500rpm离心5min；

(3)弃上清，取MZJ注射液1进行重悬；

(4)将细胞悬液平均分为两管，1.0ml/管，放入程序冻存盒，-80℃程序冻存，24h后转移液氮或-80℃中长期保存。

(5)一段时间后，取出2支M细胞制剂使用复苏仪进行复苏，混合，平均分为2支，其中一支放于室温(RT)，1支放于4℃保存，保存前取样50ul～100ul细胞悬液用于台盼蓝染色检测细胞密度及活率；

(5)依次按不同时间点进行取样检测：30min、1h、4h、6h、24h、2day、3day、4day、5day、6day、7day。

2.实验结果：

表5-9：MZJ注射液1-80℃冻存后M细胞活率检测结果

细胞活率检测结果如图54所示。MZJ注射液1冻存M细胞复苏后，在RT保存条件下，可在5小时内保持M细胞活率在90％以上，在24小时内保持M细胞活率在80％以上；在4℃条件下保存M细胞效果更好，可在5day内保持M细胞活率在80％以上。

(十)MZJ注射液2(冻存)

1.实验步骤：

(1)MZJ注射液2配制：分别取6.5ml复方电解质溶液、2.5ml20％HSA、300ul3％腺苷、1mlDMSO于50ml离心管中，混匀后，4℃保存；

(2)取一定体积的细胞悬液置于50ml离心管中，1500rpm离心5min；

(3)弃上清，取MZJ注射液2进行重悬；

2.实验结果：

表5-10：MZJ注射液2冻存后M细胞活率检测结果

细胞活率检测结果如图215所示。MZJ注射液2冻存M细胞复苏后，在RT保存条件下，可在6h内保持M细胞活率在90％以上，在24小时内保持M细胞活率在80％以上；在4℃条件下保存M细胞效果更好，可在3day内保持M细胞活率在90％以上，在5day内保持M细胞活率在80％以上。

(十一)MZJ注射液3(冻存)

1.实验步骤

制剂溶液配制：取2.925ml复方电解质溶液于15ml离心管，加入2.925ml葡萄糖注射液混匀，加入900ul USP级DMSO混匀，最后加入2.25ml HSA混匀，封口膜封住，放入4℃预冷；

将M细胞悬液混匀，计数，平均分为两支，1200rpm，离心3min，弃上清，分别取4ml制剂溶液重悬细胞，计数(未记录)；

分装：600ul/管，放入程序降温盒中，-80℃保存；

24h后，分别从冻存盒中取出细胞，放入液氮冻存；

冻存14days后，每个样品分别取出3支进行复苏，重悬混匀后，分别取550ul细胞悬液加入550ul生理盐水稀释，4℃保存，在不同的时间点(0h、30min、1h、2h、3h、6h、9h、24h、48h、72h)进行细胞活率检测。

细胞活率检测：生物安全柜中，轻轻吹打混匀细胞悬液，取10ul细胞悬液，加入10ul台盼蓝混匀，取10ul混合液加入计数板一侧小室中，静置10-30s，插入计数仪中进行计数；每个样本检测3次；

表5-11：MZJ注射液3冻存后M细胞活率检测结果

细胞活率检测结果如图216所示。MZJ注射液3冻存M细胞复苏后，在4℃保存条件下，可在48h内保持M细胞活率在90％以上，在3day内保持M细胞活率在85％以上。

实施例6：一种微载体上人胚干细胞来源M细胞培养方法

实验过程及方法：

(1)不同微载体进行M细胞培养：

将M细胞培养至P4代进行收获，使用培养液重悬后，接种至商品化微载体上，置于37℃培养箱进行静态培养，并隔天换液。使用裂解液或Tryple消化，收获细胞后进行细胞表面marker鉴定。培养过程中取样进行live-dead检测，观察细胞生长状态。

(2)M细胞动态悬浮培养：

将M细胞培养至P2代进行收获，使用培养液重悬后，接种至多孔明胶微载体上，置于37℃培养箱进行转瓶培养。其中24h内使用间隔式孵育培养，24h小时之后恒速旋转培养，培养过程进行补换液，培养6day后，使用微载体裂解液将微载体裂解，传代，直至培养至P5，收获细胞后进行细胞表面marker鉴定。培养过程中取样进行live-dead检测，观察细胞生长状态。

所用仪器设备、试剂耗材：

一、Cytodex3培养M细胞：

1、实验步骤：

(1)细胞接种：

a.将T225培养的M细胞P4代进行消化：弃上清，加入10ml DPBS洗一次，加入10ml TrypLE，37℃消化3min，加入10ml DPBS终止反应，转移至50ml离心管中；1500rpm离心5min；弃上清，用培养液重悬细胞沉淀，台盼蓝计数；

b.1500rpm离心5min，弃上清，将细胞悬液重悬至密度4X10^6/ml

c.称量40mg微载体，灭菌，置于10cm低贴皿中，加入12ml培养液；接种上述细胞悬液200ul/每种微载体，37℃培养；

d.第一天补液至16ml，后续隔天换液：弃出8ml培养液，补加8ml。

(2)live-dead检测：

a.避光配制live-dead检测液：取10ml DPBS于15ml离心管中，分别加入5ul Calcein AM和20ul ethidium homodimer-1，混匀后4℃保存；

b.轻轻混匀微载体，取出1ml悬液于离心管中，静置沉降1-2min，弃上清，加入DPBS洗2次；

c.分别加入live-dead检测液，1ml/管，室温孵育30min；

d.弃上清，加入DPBS洗1遍，荧光显微镜拍照。

(3)细胞消化：

a.将微载体自然沉降1-2min，弃上清，DPBS洗一遍；

b.加入5ml TrypLE/10cm皿，37℃消化10min，加入5ml DPBS，转移至50ml离心管中，并放入70um滤网过滤收集细胞；

c.1200rpm离心3min，弃上清；

d.用培养液重悬后，进行台盼蓝染色计数；

e.取适量的细胞量，1200rpm离心3min收集细胞；

(4)流式检测：

a.2％BSA重悬细胞沉淀后，封闭细胞30min；

b.1200rpm离心3min，弃上清；

c.1％BSA重悬后分装，200ul/管；

d.按照抗体说明书加入抗体，室温孵育30min；

e.DPBS洗2遍；

f.DPBS重悬后0.22um滤网过滤；

g.上机检测。

(5)原位冻存：

a.将收获的P4代M cell细胞悬液，接种9.5X10^5，37℃孵育2h后补液；

b.37℃培养24小时后，进行补换液：弃3ml培养液，加入3ml新鲜的培养液；后续隔天换液：弃4ml培养液，加入4ml新鲜的培养液

c.冻存前取样进行live-dead检测细胞状态，培养5day后进行冻存；

d.配制冻存液MZJ：20ml＝13ml复方电解质溶液+5ml 20％HSA+2ml DMSO；

e.分别将微载体使用DPBS洗2遍，Cytodex3微载体平均分为3份，弃上清，分别用MZJ、CS10、玻璃化冻存液冻存；除玻璃化冻存外，其余均放入程序冻存盒中，24h后转移至液氮保存；

f.玻璃化冻存程序：(1)平衡液ES置换12-18min,0.5ml/管；(2)弃上清，加入玻璃化冷冻液VS30-50s；(3)弃上清，转移至冻存管；(4)冻存管立即放入液氮，瞬间速冻，转移至液氮罐保存；

g.液氮冻存12天后，从液氮中取出Cytodex3玻璃化冻存后进行复苏；玻璃化冻存复苏方法：(1)从液氮中取出立即放入300ul TS试剂中，放入金属浴37℃1min，静置约1min，弃去TS；(2)加入300ul DS试剂中，置于室温3min，弃上清，加入300ul WS1置于室温5min，弃上清，加入300ul WS2置于室温1-2min，弃上清，加入培养液清洗一次，移至2ml培养液/孔/6孔板中，置于37℃培养；

h.大约30min～1h后，取其中一部分用于live-dead检测，在荧光显微镜下观察，并拍照；

i.液氮冻存15day后，从液氮中中取出MZJ、CS10冻存微载体，使用复苏仪进行复苏，加入培养液洗2次，移至2ml培养液/孔/6孔板中，置于37℃培养；

j.大约30min～1h后，取其中一部分用于live-dead检测，在荧光显微镜下观察，并拍照。

2、实验结果：

在Cytodex3上培养的M细胞形态照片如图55，结果表明，M细胞可以在Cytodex3微载体上培养，并增殖。经消化后的M细胞形态照片如图56，结果表明M细胞可以使用TrypLE消化收获。live-dead检测结果如图57所示，M细胞可以在Cytodex3微载体上很好的贴附。

表面标志物的流式检测结果如下表所示，M细胞在Cytodex3微载体培养不影响其marker表达。

表6-1：Cytodex3培养M细胞流式检测结果

Cytodex3原位冻存检测结果如图58所示，结果表明Cytodex3原位冻存后有脱落现象。

二、Cultispher培养M细胞：

1、实验步骤：

(1)细胞接种：

b.1500rpm离心5min，弃上清，将细胞悬液重悬至密度4X10^6/ml

(2)live-dead检测：

c.分别加入live-dead检测液，1ml/管，室温孵育30min；

d.弃上清，加入DPBS洗1遍，荧光显微镜拍照。

(3)细胞消化：

a.将微载体自然沉降1-2min，弃上清，DPBS洗一遍；

c.1200rpm离心3min，弃上清；

d.用培养液重悬后，进行台盼蓝染色计数；

e.取适量的细胞量，1200rpm离心3min收集细胞；

(4)流式检测：

a.2％BSA重悬细胞沉淀后，封闭细胞30min；

b.1200rpm离心3min，弃上清；

c.1％BSA重悬后分装，200ul/管；

d.按照抗体说明书加入抗体，室温孵育30min；

e.DPBS洗2遍；

f.DPBS重悬后0.22um滤网过滤；

g.上机检测。

(5)原位冻存：

a.将收获的P4代M cell细胞悬液，接种1.1X10^6，37℃孵育2h后补液；

e.分别将微载体使用DPBS洗2遍，Cultispher微载体平均分为3份，弃上清，分别用MZJ、CS10、玻璃化冻存液冻存；除玻璃化冻存外，其余均放入程序冻存盒中，24h后转移至液氮保存；

g.液氮冻存12day后，从液氮中取出Cultispher玻璃化冻存后进行复苏；玻璃化冻存复苏方法：(1)从液氮中取出立即放入300ul TS试剂中，放入金属浴37℃1min，静置约1min，弃去TS；(2)加入300ul DS试剂中，置于室温3min，弃上清，加入300ul WS1置于室温5min，弃上清，加入300ul WS2置于室温1-2min，弃上清，加入培养液清洗一次，移至2ml培养液/孔/6孔板中，置于37℃培养；

2、实验结果：

经Cultispher培养的M细胞形态照片如图59所示，结果表明：M细胞在Cultispher微载体上培养，在镜下难以观察细胞增殖现象。经Cultispher培养的M细胞经消化后的形态照片如图60所示，结果表明M细胞可以使用TrypLE消化收获。

表面标志物的流式检测结果如下表所示，M细胞在Cultispher微载体培养不影响其marker表达。

表6-2：Cultispher培养M细胞流式检测结果

Marker	Cultispher
CD34	0.10％
CD90	98.92％
CD105	99.98％
CD73	99.99％
CD11b	0.08％
HLA-ABC	99.95％
HLA-DR	0.11％
CD19	0.08％
CD29	99.92％
CD45	0.56％

Cultispher原位冻存检测结果如图61所示，结果表明Cultispher原位冻存后细胞出现死亡现象。

三、TableTrix微载片培养M细胞：

1、实验方法：

(1)细胞接种：

a.将T225培养的M细胞P4代进行消化：弃上清，加入10ml DPBS洗一次，加入 10ml TrypLE，37℃消化3min，加入10ml DPBS终止反应，转移至50ml离心管中；1500rpm离心5min；弃上清，用培养液重悬细胞沉淀，台盼蓝计数；

b.1500rpm离心5min，弃上清，将细胞悬液重悬至密度4X10^6/ml

c.取2片TableTrix微载片置于10cm低贴皿中，每片微载体接种200ul上述细胞悬液，37℃孵育2h，补加12ml培养液/10cm皿；

(2)live-dead检测：

c.分别加入live-dead检测液，1ml/管，室温孵育30min；

d.弃上清，加入DPBS洗1遍，荧光显微镜拍照。

(3)细胞消化：

a.将微载体自然沉降1-2min，弃上清，DPBS洗一遍；

b.使用Digest裂解液裂解40～60min，中间吹打一次，转移至50ml离心管中；

c.1200rpm离心3min，弃上清；

d.用培养液重悬后，进行台盼蓝染色计数；

e.取适量的细胞量，1200rpm离心3min收集细胞；

(4)流式检测：

a.2％BSA重悬细胞沉淀后，封闭细胞30min；

b.1200rpm离心3min，弃上清；

c.1％BSA重悬后分装，200ul/管；

d.按照抗体说明书加入抗体，室温孵育30min；

e.DPBS洗2遍；

f.DPBS重悬后0.22um滤网过滤；

g.上机检测。

(5)原位冻存：

a.将收获的P4代M cell配制为密度4X10^6/ml的细胞悬液，取2片TableTrix微载片进行接种：每片微载体接种200ul上述细胞悬液，37℃孵育2h后补液；

e.分别将微载体使用DPBS洗2遍，TableTrix微载体平均分为3份，弃上清，分别用MZJ、CS10、玻璃化冻存液冻存；除玻璃化冻存外，其余均放入程序冻存盒中，24h后转移至液氮保存；

g.液氮冻存12day后，从液氮中取出TableTrix玻璃化冻存后进行复苏；玻璃化冻存复苏方法：(1)从液氮中取出立即放入300ul TS试剂中，放入金属浴37℃1min，静置约1min，弃去TS；(2)加入300ul DS试剂中，置于室温3min，弃上清，加入300ul WS1置于室温5min，弃上清，加入300ul WS2置于室温1-2min，弃上清，加入培养液清洗一次，移至2ml培养液/孔/6孔板中，置于37℃培养；

2、实验结果：

经TableTrix培养的M细胞形态照片如图62所示，结果表明M细胞可以在TableTrix微载体上培养，在镜下难以观察细胞增殖现象。经TableTrix培养的M细胞消化后的形态照片如图63所示，结果表明M细胞可以使用Digest、Tryple消化收获。TableTrix微载体可进行球传球传代。

live-dead检测结果如图64所示，结果表明M细胞可以在TableTrix微载体上很好的贴附。

表面标志物流式检测结果如下表所示，M细胞在TableTrix微载体培养不影响其marker表达。

表6-3：TableTrix培养M细胞流式检测结果

TableTrix原位冻存检测结果如图65所示，MZJ对TableTrix原位冻存保存效果更优。

四、Solohill微载体培养M细胞：

1、实验步骤：

(1)细胞接种：

b.1500rpm离心5min，弃上清，将细胞悬液重悬至密度4X10^6/ml

(2)live-dead检测：

c.分别加入live-dead检测液，1ml/管，室温孵育30min；

d.弃上清，加入DPBS洗1遍，荧光显微镜拍照。

(3)细胞消化：

a.将微载体自然沉降1-2min，弃上清，DPBS洗一遍；

c.1200rpm离心3min，弃上清；

d.用培养液重悬后，进行台盼蓝染色计数；

e.取适量的细胞量，1200rpm离心3min收集细胞；

(4)流式检测：

a.2％BSA重悬细胞沉淀后，封闭细胞30min；

b.1200rpm离心3min，弃上清；

c.1％BSA重悬后分装，200ul/管；

d.按照抗体说明书加入抗体，室温孵育30min；

e.DPBS洗2遍；

f.DPBS重悬后0.22um滤网过滤；

g.上机检测。

(5)原位冻存：

a.将收获的P4代M cell细胞悬液，接种8X10^5，37℃孵育2h后补液；

e.分别将微载体使用DPBS洗2遍，Solohill微载体平均分为2份，弃上清，分别用MZJ、CS10冻存；放入程序冻存盒中，24h后转移至液氮保存；

f.液氮冻存15day后，从液氮中取出Solohill微载体，使用复苏仪进行复苏，加入培养液洗2次，移至2ml培养液/孔/6孔板中，置于37℃培养；；

g.大约30min～1h后，取其中一部分用于live-dead检测，在荧光显微镜下观察，并拍照；

2、实验结果：

Solohill培养M细胞形态照片如图66所示，M细胞可以在Solohill微载体上培养，并增殖。Solohill培养M细胞消化后的形态照片如图67所示，M细胞可以使用TrypLE消化收获。

live-dead检测结果如图68所示，M细胞可以在Solohill微载体上很好的贴附。

表面标志物流式检测结果如下表所示，M细胞在Solohill微载体培养不影响其marker表达。

表6-4：Solohill培养M细胞流式检测结果

Solohill原位冻存检测结果如图69所示，Solohill原位冻存后有死亡现象。

五、Coring聚苯乙烯微载体培养M细胞：

1、实验步骤：

(1)细胞接种：

b.1500rpm离心5min，弃上清，将细胞悬液重悬至密度4X10^6/ml

(2)live-dead检测：

c.分别加入live-dead检测液，1ml/管，室温孵育30min；

d.弃上清，加入DPBS洗1遍，荧光显微镜拍照。

(3)细胞消化：

a.将微载体自然沉降1-2min，弃上清，DPBS洗一遍；

c.1200rpm离心3min，弃上清；

d.用培养液重悬后，进行台盼蓝染色计数；

e.取适量的细胞量，1200rpm离心3min收集细胞；

(4)流式检测：

a.2％BSA重悬细胞沉淀后，封闭细胞30min；

b.1200rpm离心3min，弃上清；

c.1％BSA重悬后分装，200ul/管；

d.按照抗体说明书加入抗体，室温孵育30min；

e.DPBS洗2遍；

f.DPBS重悬后0.22um滤网过滤；

g.上机检测。

(5)原位冻存：

e.分别将微载体使用DPBS洗2遍，Coring聚苯乙烯微载体平均分为2份，弃上清，分别用MZJ、CS10冻存；放入程序冻存盒中，24h后转移至液氮保存；

f.液氮冻存15day后，从液氮中取出Coring聚苯乙烯微载体，使用复苏仪进行复苏，加入培养液洗2次，移至2ml培养液/孔/6孔板中，置于37℃培养；；

2、实验结果：

Coring聚苯乙烯培养M细胞形态照片如图70所示，M细胞可以在Coring聚苯乙烯微载体上培养，并增殖。Coring聚苯乙烯培养M细胞消化后的形态照片如图71所示，M细胞可以使用TrypLE消化收获。

live-dead检测结果如图72所示，M细胞可以在Coring聚苯乙烯微载体上很好的贴附。

表面标志物流式检测结果如下表所示，M细胞在Coring聚苯乙烯微载体培养不影响其marker表达。

表6-5：Coring聚苯乙烯微载体培养M细胞流式检测结果

Marker	Coring
CD34	0.05％
CD90	99.39％
CD105	99.80％
CD73	99.93％

Coring聚苯乙烯原位冻存检测结果如图73所示，Coring聚苯乙烯原位冻存后有死亡现象，MZJ冻存效果相对较好。

六、8Gel-甲苯法制备微载体培养M细胞

8Gel-甲苯法是使用双乳法制备而成，主要材料成分有8％的Gelatin、5％Tween、5％甲苯，以明胶为原料,用悬浮成球、甲苯制孔的方法制备大孔明胶微载体。主要通过机械搅拌脱甲苯液滴的办法打碎甲苯液滴之间的薄弱环节，使孔形成连通性。

8Gel-甲苯法制备微载体培养M细胞，细胞形态照片如图74所示，M细胞可以在8Gel-甲苯法制备微载体上培养，并增殖。live-dead检测结果如图75所示，M细胞可以在8Gel-甲苯法制备微载体上很好的贴附。图76显示了8Gel-甲苯法制备微载体培养M细胞的传代情况，结果显示，8Gel-甲苯法制备微载体培养M细胞可进行球传球传代，并增殖。图77显示了8Gel-甲苯法制备微载体培养M细胞live-dead检测。

七、25GF-Gel微载体培养M细胞

25GF-Gel微载体主要由明胶-阿魏酸、Gelatin制成的多孔微球。

25GF-Gel微载体培养M细胞的形态照片如图78所示。图79显示了25GF-Gel微载体培养M细胞的live-dead检测结果。图80显示了25GF-Gel微载体制备微载体培养M细胞的传代情况。图81显示了25GF-Gel微载体培养M细胞传代的live-dead检测结果。M细胞可以在25GF-Gel微载体上培养，并增殖。

八、Gel微载体培养M细胞

Gel微载体主要由Gelatin通过乳化法制成的无孔微球。

Gel微载体培养M细胞的形态照片如图82所示。图83显示了Gel制备微载体培养M细胞的live-dead检测结果。M细胞可以在Gel微载体上培养，并增殖。图84显示了Gel微载体培养M细胞的传代情况。图85显示了Gel微载体培养M细胞传代的live-dead检测结果。Gel微载体培养M细胞可进行球传球传代，并增殖。

九、25GF-2HA微载体培养M细胞

25GF-2HA微载体主要由明胶-阿魏酸、透明质酸制成的多孔微球。

25GF-2HA微载体培养M细胞的形态照片如图86和图89所示。live-dead检测结果如图87和图90所示。M细胞不可以在25GF-2HA微载体上贴附。

十、Alg微载体培养M细胞

Alg微载体主要由海藻酸钠制成的无孔微球。

Alg微载体培养M细胞的形态照片如图91所示，live-dead检测结果如图92所示，M细胞不可以在Alg微载体上贴附。

十一、Alg赖氨酸微载体培养M细胞

Alg赖氨酸微载体主要由海藻酸钠、赖氨酸制成的无孔微球。

Alg赖氨酸微载体培养M细胞的形态照片如图93所示，live-dead检测结果如图94所示，M细胞不可以在Alg赖氨酸微载体上贴附。

十二、Gel赖氨酸微载体培养M细胞

Gel赖氨酸微载体主要由Gelatin、聚赖氨酸制成的无孔微球。

Gel赖氨酸微载体培养M细胞的形态照片如图95所示，live-dead检测结果如图96所示。M细胞不可以在Gel赖氨酸微载体上贴附。Gel赖氨酸微载体制备微载体培养M细胞的消化结果如图97所示，Gel赖氨酸微载体制备微载体培养M细胞可使用TrypLE消化。图98显示了Gel微载体传代培养M细胞live-dead检测结果。

十三、16Gel-6HA-bubbles微载体培养M细胞

16Gel-6HA-bubbles微载体主要由明胶、透明质酸制成的多孔微球，其中主要以NH4HCO3加热产生气体致孔。

16Gel-6HA-bubbles赖氨酸微载体培养M细胞的形态照片如图所示，live-dead检测结果如图所示。M细胞在16Gel-6HA-bubbles微载体上贴附较少。

十二、M细胞动态培养制备(多孔微载体、无孔/微孔微载体)：

1、实验方法：

(1)动态培养：

a.将T225培养的M细胞P2代进行消化：弃上清，加入10ml DPBS洗一次，加入10ml TrypLE，37℃消化3min，加入10ml DPBS终止反应，转移至50ml离心管中；1500rpm离心5min；弃上清，用培养液重悬细胞沉淀，台盼蓝计数；

b.转瓶内加入35ml培养液，加入2片TableTrix微载体，溶解10min，接种1.6X10^6细胞数，37℃动态培养；

c.培养第2天，弃上清30ml，补加培养液40ml；

d.培养第3天，弃上清35ml，补加培养液50ml；

e.培养第4天，弃上清45ml，补加培养液60ml；

f.培养第5天，弃30ml上清，将微载体转移至50ml离心管中，1500rpm离心5min；

g.弃上清，加入10ml裂解液裂解40～50min，中间吹打1次，1500rpm离心5min；

h.弃上清，加入6ml TrypLE置于37℃消化3min，加入6mlDPBS终止消化，1500rpm 离心5min；

i.弃上清，加入2ml培养液重悬后计数；

j.按8X10^5/片接种传代至P4代；

k.培养第2天，补加培养液20ml；

l.培养第3天，弃上清20ml，补加培养液30ml；

m.培养第4天，弃上清40ml，补加培养液50ml；

n.培养第5天，弃上清50ml，补加培养液100ml；

o.培养第6天，弃上清，将微载体转移至50ml离心管中，1500rpm离心5min；

p.弃上清，加入10ml裂解液裂解40～50min，中间吹打1次，1500rpm离心5min；

q.弃上清，加入6ml TrypLE置于37℃消化3min，加入6mlDPBS终止消化，1500rpm离心5min；

r.弃上清，加入培养液重悬后计数；

s.按8X10^5/片接种传代至P5代；

t.培养第2天，补加培养液20ml；培养第3天，弃上清40ml，补加培养液50ml；培养第4天，弃上清55ml，补加培养液65ml；培养第5天，弃上清60ml，补加培养液150ml；培养第6天，弃上清，将微载体转移至50ml离心管中，1500rpm离心5min；

u.弃上清，加入16ml裂解液裂解40～50min，中间吹打1次，1500rpm离心5min；

v.弃上清，加入10ml TrypLE置于37℃消化3min，加入10mlDPBS终止消化，1500rpm离心5min；

w.弃上清，加入4ml培养液重悬后计数。

(2)流式检测：

a.2％BSA封闭30min；

b.1200rpm离心3min，弃上清；

c.1％BSA重悬后分装，200ul/管，共8管；

d.按照抗体说明书加入抗体，室温孵育30min；

e.DPBS洗2遍；

f.DPBS重悬后0.22um滤网过滤；

g.上机检测。

(3)live-dead检测：

b.从转瓶内取出约200ul～500ul微载体悬液于离心管中，静置沉降1-2min，弃上清，加入DPBS洗2次；转移至96孔板中，弃上清；

c.分别加入live-dead检测液，1ml/管，室温孵育30min；

d.弃上清，加入DPBS洗1遍，荧光显微镜拍照。

2、实验结果：

2.1使用多孔微载体动态培养制备M细胞：

live-dead检测结果如图99所示，M细胞可以在TableTrix微载体上很好的贴附。表面标志物的流式结果如下表及图100所示，M细胞在TableTrix微载体培养不影响其marker表达。人胚干细胞来源M细胞能够多孔微载体上进行动态培养及制备，而且Marker表达正常。

表6-6：TableTrix微载体培养M细胞培养M细胞流式检测结果

Marker	检验结果
CD34	0.15％
SSEA-4	0.04％
CD90	97.78％
CD105	98.15％
CD73	99.97％
CD11b	0.30％
HLA-DR	0.05％
CD19	0.09％
CD29	99.98％
CD45	0.23％

2.2无孔或微孔微载体动态培养制备M细胞：

镜下观察细胞形态及贴附良好；

Live-dead检测结果表明：M细胞贴附率、生长状态良好；

扫描电镜观察细胞贴附形态；

传代方式验证：酶传和球传球均可实现，达到要求；

M细胞原位冻存表明：本微载体是否适合原位冻存；

消化后冻存：验证微载体培养细胞冻存后细胞存活率变化；

流式检测结果表明：微载体本身对细胞特性无影响；

质量检测：细胞活率、支原体、内毒素、无菌、病毒等检测均可达到标准；

RNA-seq或单细胞测序结果表明：微载体培养或分化收获的M细胞与2D收获细胞差异与优劣。

人胚干细胞来源M细胞能够在无孔或微孔微载体上进行动态培养及制备，而且Marker表达正常。

实施例7：M细胞对肺细胞纤维化的治疗活性评价

将接种人肺成纤维细胞HFL1(购自北纳生物)接种于六孔板中，得细胞融合达到70％时，按以下分组进行处理：(1)加入基础培养基(HF12K+10％FBS)；(2)加入基础培养基+10ng/mL TGF-β1(购自Peprotech，货号100-21)；(3)加入50％基础培养基+50％制备例1的MSC的培养上清+10ng/mL TGF-β1。其中，培养上清的获得方法为：将1×10 ⁶个MSC接种至10cm平皿中，待其达到50％时，更换为10mL新鲜培养基，培养24小时后，收集上清，1200rpm离心3分钟，取上清。

随后通过western blot分析经上述不同组处理后的细胞中的α-SMA(Anti-α-SMA抗体:Sigma，A5228)及I型胶原蛋白(Anti-Collagen I抗体:CST,84338)的表达情况。

结果如图3所示，TGF-β1处理导致肺成纤维细胞中α-SMA和I型胶原蛋白的表达水平升高，而使用MSC的培养上清处理后，能够明显降低α-SMA和Collagen I的表达水平。以上结果提示，本发明的M细胞培养上清能够抑制肺纤维化。

实施例8：M细胞的抗炎活性评价

将原代MSC与制备例1获得的MSC接种于六孔板中，等细胞达到70-80％聚合时，加入不同浓度的IFN-γ(0、25、50、100ng/ml)处理24h，随后通过RT-qPCR检测IDO、PD-L1、PGE2的mRNA表达水平。所显示的结果是三次重复实验的平均值。

IDO的检测结果如图4A及表8-1所示，PDL1的检测结果如图4B及表8-2所示，PGE2的检测结果如图4C及表8-3所示。结果显示，经IFN-γ刺激后，本发明M细胞的IDO、PD-L1、PGE2表达水平显著高于原代MSC。以上结果提示，本发明M细胞具备更优的免疫调节功能及抗炎活性。

表8-1：IDO的mRNA表达水平检测

表8-2：PD-L1的mRNA表达水平检测

表8-3：PGE2的mRNA表达水平检测

实施例9：M细胞对宫腔粘连的治疗活性评价

由于子宫内膜损伤导致子宫内膜纤维化，宫腔部分或全部闭塞，继而引起月经过少、闭经、不孕或反复流产。在继发性闭经患者中发病率占，女性不孕症中发病率占而流产后刮宫的发病率高达。近年来由于频繁的宫腔操作及宫腔镜手术的普及，的发病率和检出率逐渐上升，而且发病年龄呈年轻化趋势，已成为女性继发不孕的第二大病因。尽管临床医生不断寻求新的治疗方案，的治愈率和妊娠率仍无明显改善，且复发率较高(轻度患者治疗后复发率为，重度患者治疗后复发率更是高达，由此引起的不孕以及反复流产、早产、前置胎盘、胎盘粘连或植入等产科并发症严重威胁着女性的生殖健康。其高发病率及其所导致的女性生育功能损害已成为临床上亟待解决的问题。目前临床上针对的治疗旨在恢复宫腔形态，防止粘连复发，促进损伤子宫内膜修复再生，恢复正常生育功能。治疗的重要步骤是宫腔镜下宫腔粘连分离术、术中放置宫内

节育器以及术后应用雌孕激素，但存在着治疗周期长、治愈率低下、粘连易复发、妊娠率低、大剂量雌激素应用增加患者乳腺和子宫内膜肿瘤风险等问题而且严重的肌性或结缔组织性中子宫内膜基底层已被破坏，对雌孕激素反应较差。

本发明克服了宫腔镜手术机械性分离宫腔粘连，术后放置宫内节育器或防粘连材料，于术后给予雌激素促进内膜生长所带给子宫内膜严重损伤，无法解决内膜疤痕问题，不能实现内膜功能性修复，且极易发再次粘连等缺陷。

实验动物：SD大鼠，雌性，8周龄，动物购于北京维通利华公司。

所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级,适应性饲养一周。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

饲养条件：自由进食、饮水；12/12h昼夜交替，7:00-19:00为白昼，室温22±2℃，相对湿度在50％-60％。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5代用于后续实验。

动物造模：将SD大鼠麻醉后，在腹部剪开一个小口，用镊子将左侧子宫暴露在外，用两个止血钳(相距4cm)夹住子宫，并注射100μl 95％的乙醇，处理5分钟，之后用生理盐水进行冲洗三次，每次三分钟。造模完成，在第7天进行随机分组处理，第28天进行灌流取材分析。

分组：正常组、模型组、M细胞组，每组5只鼠。

正常组：不做任何处理。

模型组：第0天用95％的乙醇造模，第7天注射100μl的生理盐水，第28天进行灌流取材分析。

M细胞组：第0天用95％的乙醇造模，第7天注射100μl的生理盐水含有3×10 ⁶M细胞，第28天进行灌流取材分析。

标本取材：

采集标本时，大鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在大鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只大鼠需约50ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，用50ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，用多聚甲醛固定子宫，并进行切片分析。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(4)酒精梯度脱水：70％酒精1h，80％酒精1h，95％酒精1h，100％酒精40min，100％酒精40min。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(1)包埋的石蜡组织切片，厚度为5μm。切好的片子在42℃的展片机水中展片、贴片，37℃烘箱过夜烘干。

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

二甲苯Ⅰ 10min，二甲苯Ⅱ 10min，100％酒精Ⅰ 5min，100％酒精Ⅱ 5min，95％酒精5min，80％酒精5min，75％酒精5min。PBS冲洗3次，每次5min。

(3)染色：

苏木素染色3min，在镜下可观察到较深的蓝紫色细胞核，自来水终止染色。

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

封片：中性树胶封片，避免产生气泡，玻片晾干后，镜下观察。

M细胞对宫腔粘连的临床前药效学评价

将SD大鼠(购自维通利华)麻醉，在腹部剪开一个小口，用镊子将左侧子宫暴露在位。用两个止血钳(间隔4cm)夹住子宫，注射入100μL 95％的乙醇(购自阿拉丁，货号A298792)，五分钟后，用100μL生理盐水冲洗，共冲洗三次，每次三分钟，缝合伤口，造模完成。造模后第7天，将模型大鼠随机分为三组：正常组、模型组和M细胞组。正常组不做处理，模型组在造模后第7天注射100μL生理盐水，M细胞组在造模后注射3×10 ⁶个M细胞/100μL生理盐水。部分动物在造模后第14天与雄鼠合笼，连续观察42天，计算各组出生胎鼠数量，并选取35日龄子代大鼠，检测相关安全性。部分动物在造模后第 28天进行灌流，子宫取材拍照，观察子宫形态变化。石蜡组织切片，HE染色观察子宫内膜结构变化。

子宫取材的光镜照片结果如图101所示，95％的乙醇注射入子宫腔后，大鼠子宫出现严重的粘连现象，宫腔阻塞，并出现大量宫腔积液。宫腔积液在子宫内潴留形成透明的宫腔积液泡，结果显示成功诱导制备了宫腔粘连大鼠模型。M细胞治疗显著抑制宫腔粘连，宫腔内积液显著减少，宫腔积液泡体积及数量也显著减少，宫腔形态基本恢复正常。以上结果提示，本发明的M细胞能显著改善子宫形态，抑制宫腔粘连。

子宫HE染色结果如图102所示，利用95％的乙醇造模后，大鼠子宫内膜变薄，腺体消失，血管稀疏，结果显示成功制备获得宫腔粘连模型。经M细胞治疗后，子宫内膜及肌层显著增厚，新生血管、腺体数量显著增加。以上结果提示，本发明的M细胞可以促进损伤子宫内膜修复再生。

结果显示，M细胞治疗后，子代数量显著增加，数量比模型组增加1.2倍。对35日龄子代大鼠进行检测，结果显示子代生长状态正常，无明显生长缺陷。以上结果提示，本发明的M细胞可以治疗宫腔粘连，促进损伤子宫内膜修复再生，增强繁殖子代能力，且对子代生长发育无影响。

M细胞对宫腔粘连的临床药效学评价

患者诊断为中重度宫腔粘连。患者术前术评估子宫内膜容积，子宫内膜厚度及形态，瘢痕面积。宫腔镜于全麻及B超引导下进行。通过宫腔镜观察宫腔形态。在B超引导、宫腔镜直视下通过扩张棒或水囊进行粘连的钝性分离操作，辅以微型剪刀或者电切镜(尽量避免)锐性分离。在超声引导下用21G注射针将3×10 ⁶个M细胞悬液注入子宫内膜与肌层交界处。

M细胞在临床上对宫腔粘连的治疗结果如图103所示。患者为中重度宫腔粘连，功底肌性粘连，且有瘢痕生成。输卵管有梗阻，开口不明显。M细胞宫腔璧注射治疗后，患者子宫形态恢复正常，未见粘连，瘢痕被修复，双侧输卵管开口可见。结果提示M细胞可用于临床治疗宫腔粘连。图示说明，(1)患者手术时宫腔粘连和双输梗阻，粘连为中重度(混合型)。粘连分离后注射M细胞(3×10 ⁶个)。(2)术后4周随访，可见瘢痕获得恢复。(3)术后4月随访，宫腔情况差。(4)术后8月随访，宫腔基本恢复正常。

患者子宫内膜厚度显著增加，厚度≥7mm。患者成功妊娠，顺利诞下健康后代。患者月经恢复正常。以上结果提示，M细胞可让宫腔粘连患者恢复生殖力，且对后代生长发育无影响。

实施例10：M细胞对急性肝损伤的治疗活性评价

实验动物：C57小鼠，雄性，6-7周龄，动物购于北京维通利华公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5代用于后续动物实验。

试剂/设备	厂家	货号
正置相差显微镜	Carl Zeiss	Axioscope5
包埋机	Leica	EG1150H/C
切片机	Leica	RM2235
展片机	Leica	HI1210
水浴锅	赛欧华创	SDY-1
生理盐水	石家庄四药	无
多聚甲醛	LEAGENE	DF0135
二甲苯	北京试剂	无
石蜡	Leica	39601006
苏木素染色液	中杉金桥	ZLI-9610
伊红染色液	中杉金桥	ZLI-9644
中性树脂	索莱宝	G8590-100
玉米油	Aladdin	C116025
四氯化碳(CCl4)	Aladdin	C112040
血生化分析仪	Beckman	AU5800
离心机	湘仪	TD25-WS

电子秤

亚速旺

CC-1013-04

动物模型制备：腹腔注射四氯化碳(CCl4)(3ml/kg，1:1溶于玉米油)。

对照组：只注射等剂量玉米油；

CCl4组：腹腔注射四氯化碳(CCl4)(3ml/kg，1:1溶于玉米油)，注射CCL4后立即尾静脉注射生理盐水；

CCl4+M细胞组：腹腔注射四氯化碳(CCl4)(3ml/kg，1:1溶于玉米油)，注射CCl4后立即尾静脉注射3×10 ⁶细胞/只。

在第0、1、2、3、4、5、6天进行统计死亡率，在第7天取血清，用于血生化分析。

标本取材：

采集标本时，小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，打开腹腔，中央静脉取血。开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，生理盐水灌注完成后，用50mL多聚甲醛进行固定，灌流完成后，取肺脏，进行固定切片分析。所取血液5000rpm室温离心15min，取上清，用于血生化分析。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

统计分析

实验结果

(1)各组注射CCl4和M细胞后，每天称量小鼠体重。CCl4组小鼠体重不断下降。而CCl4+M细胞组小鼠体重的下降率明显低于CCl4组，表明M细胞可以降低急性肝损伤小鼠体重的下降速率。

(2)各组注射CCl4和M细胞后，每天统计小鼠死亡率。结果如下，在注射CCl4后3天内，CCl4组大量死亡。而CCl4+M细胞组小鼠未发生死亡事件(CCl4+M细胞组线条与对照组重合)，表明M细胞可以降低急性肝损伤小鼠的死亡率，能有效治疗急性肝损伤(表10-1，图104)。

(3)取小鼠血清进行肝功能的血生化检测，发现CCl4组的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶升高，显示出较明显的肝损伤。而CCl4+M细胞组则没有升高，显示M细胞可以降低血清中转氨酶和碱性磷酸酶的含量，可以保护肝脏功能(图105)。

(4)HE染色结果显示，CCl4组小鼠肝脏有大量肝细胞死亡，并有大量炎症细胞侵润。而CCl4+M细胞组小鼠肝脏未发现大量肝细胞死亡，也没有大量炎症细胞侵润。表明M细胞可以抑制CCl4对肝细胞的损伤，保护肝细胞的功能。

表10-1 各组小鼠生存率的统计图

生存率	对照组	CCl4组	CCl4+M细胞组
第0天剩余鼠数量	6	6	6
第1天剩余鼠数量	6	6	6

第2天剩余鼠数量	6	4	6
第3天剩余鼠数量	6	2	6
第4天剩余鼠数量	6	2	6
第5天剩余鼠数量	6	2	6
第6天剩余鼠数量	6	2	6

实施例11：M细胞对肌萎缩的治疗活性评价

M细胞的制备培养：

胚胎干细胞悬EB球，进行贴壁分化，获取P0代的M细胞，进行传代筛选，在P3代进行冻存，用于后续实验。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

实验动物：

C57BL6背景的雄性SOD1(G93A)小鼠(18周龄)，动物购于江苏金致和生物科技有限公司。所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

饲养条件：自由进食、饮水；12/12h昼夜交替，7:00-19:00为白昼，室温22±2℃，相对湿度在50％-60％。小鼠适应性喂养两周后开始实验。

实验材料：电子秤、一次性使用无菌注射器1ml

实验试剂：生理盐水、

仪器设备：小鼠转棒仪、小鼠抓力实验仪

实验分组：正常对照组、ALS小鼠+溶剂(溶剂组)、ALS小鼠+M细胞(M细胞组),每组3只。

统计：所有数据采用Prism 7.0统计分析软件中的T Test进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准差(Mean±SD)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

M细胞对肌萎缩侧索硬化症的药效学评价

ALS小鼠自购进后在动物房适应性喂养一周。之后的一周内进行为学训练。行为学训练包括：转棒实验(Rotarod test)、抓力实验(Grip streng test)。转棒实验：设置转棒转速和时间：5rpm开始到40rpm，300秒，之后将小鼠放置在装绑上适应30秒，之后开始训练，此实验重复三次，每次间隔30分钟。抓力实验是将小鼠放置在网格上，抓住小鼠尾巴向后拖拽，直到小鼠脱离网格，在此期间，会产生最大抓力即小鼠抓力。此实验重复三次，每次间隔30秒。训练一周完毕后，开始正式实验。记录小鼠体重，同时进行后肢伸展反射(Extension reflex)评分。根据这两点进行分组。之后，进行药物注射，正常对照组不做处理，ALS小鼠+溶剂组尾静脉注射200μl生理盐水，ALS小鼠+M细胞组尾静脉注射200μl细胞：3×10^6/只。每周进行如下监测：体重、存活率、转棒实验、抓力实验，步态分析。在实验结束时，小鼠安乐死后立刻灌流取腰椎脊髓，冰冻切片包埋，做免疫组化染色。

ALS小鼠发病率统计结果如图106所示。结果显示在27周M细胞组发病率明显低于溶剂组(50％VS 80％)，M细胞明显延迟小鼠发病。

结果分析：转棒实验可以监测小鼠肢体协调能力和运动能力，抓力实验可以监测肌肉力量。在24周和29周，溶剂组小鼠在转棒上停留时间少，肌肉力量薄弱，尤其是29周更为明显。然而，M细胞组ALS小鼠在转棒上停留时间明显高于溶剂组，特别是在29周(144VS 244)，具有显著差异，**p＜0.01(表11-1、图107)；表明M细胞可以明显改善小鼠的运动能力。且M细胞组小鼠抓力高于溶剂组，在29周具有显著差异，**p＜0.01(表11-2、图108)；显示M细胞明显改善小鼠肌肉力量，间接说明M细胞可以减轻运动神经元损伤。

表11-1，小鼠转棒实验统计

表11-2，小鼠抓力实验统计

小鼠体重和存活率结果显示，M细胞组促进小鼠体重增长，同时也提高了小鼠存活率。免疫组化结果显示，溶剂组腰椎脊髓运动神经元较少、小胶质细胞和星形胶质细胞明显增加。M细胞组小鼠腰椎脊髓运动神经元增加、小胶质细胞和星形胶质细胞减少。表明M细胞可以保护运动神经元，减轻疾病进程。

实施例12：M细胞对炎性肠病的治疗活性评价

炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种典型的与粘膜免疫系统和共生生态系统失调相关的慢性复发疾病，体现了宿主遗传学，宿主免疫学，微生物组和环境暴露之间的相互作用。IBD表现为两个主要临床实体：克罗恩病(Crohn’s disease,CD)CD)和溃疡性结肠炎((Ulcerative colitis,UC)。UC影响结肠，CD可能影响胃肠道的任何区域，但主要发生在小肠的末端回肠。

目前临床上关于IBD的治疗方法具有保守性，主要依赖减轻症状，抑制其过度恶化，来避免肠梗阻和结肠癌的物理切除手术。现阶段治疗方法主要有氨基水杨酸类药物、皮质类固醇类药物、免疫抑制剂、生物制剂等，这些药物降低了疾病相关的并发症，提高了患者的生活质量。5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid，5-ASA)常用于UC患者的抗炎治疗，可有效缓解组织炎症，并可能降低这些患者发生结肠炎相关肿瘤的风险，其作用的机制是通过抑制环氧酶的活性，减少前列腺素的合成，抑制促炎细胞因子和氧自由基产生，抑制中性粒细胞趋化性和肥大细胞活化。然而5-ASA在CD患者中却无法缓解组织炎症。皮质类固醇类药物的治疗可缓解溃疡性结肠炎的疾病症状，但它们并不能维持长期的治疗效果。糖皮质激素通过与特定的胞质受体结合后，转运入核，从而激活或抑制相关基因的表达。还可通过蛋白-蛋白的相互作用，如NF-κB和激活蛋白1((Activator protein-1,AP1)，使促炎转录因子失活，阻止炎性介质的激活。免疫抑制剂类的药物包括咪唑硫嘌呤(Azathioprine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、和环孢素A(Cyclosporin A)、他克莫司(Tacrolimus)，通过诱导细胞的凋亡影响免疫细胞的存活，进而抑制促炎基因的表达，来发挥作用。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)拮抗剂是该领域的主要进展。CD和UC的治疗，在临床已取得很好的治疗效果，说明TNF在IBD中的关键致病作用。但是，许多患者中缺乏或继发性丧失对抗TNF治疗的反应是一个重要的临床问题。上述的治疗方法并不能治疗所有的IBD患者，有一些IBD患者对上述的药物治疗具有抗性，症状得不到缓解，最后不得不采取手术切除的方法来进行治疗。近年来，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)治疗IBD得到越来越多的关注，并取得了较好的治疗效果。MSCs具有的组织修复、免疫调控的能力，使其在自身免疫疾病和IBD的治疗中有广泛的应用前景。

实验动物：7-8周的C57BL/6雌性小鼠(SPF级)，体重在18-19.5g之间，C57BL/6雌性小鼠购于北京维通利华公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

将C57BL/6雌性小鼠按体重随机分组，分为正常组、造模组、治疗组。

用葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium，DSS)(分子量36，000-50，000，MP)，通过饮水的方式进行实验性结肠炎造模。

2.5％DSS诱导得炎性肠病流程图如图109所示。

5％DSS诱导得炎性肠病流程图如图114所示。

正常对照组：饮用蒸馏水，作为对照。

造模组：2.5％DSS的配置(12.5g的DSS粉末加入到蒸馏水中，混匀溶解，最终定容为500ml)

5％DSS的配置(25g的DSS粉末加入到蒸馏水中，混匀溶解，最终定容为500ml)

治疗组：在第0、3、6天，通过腹腔注射300μl细胞悬液，细胞量3×10 ⁶。

小鼠生命体征观察：

每日早上对小鼠进行称重，观察粪便硬度、便血情况，DAI评分由是体重变化、粪便硬度、便血情况三项分数的累加总和组成。

DAI评分标准

标本取材

采集标本时，小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只小鼠需约20ml的生理盐水。暴露出腹腔组织，小心地分离从回肠到结肠的全段结肠。将结肠组织放在含平铺在纱布上，并拍照记录长度。

动物组织总蛋白提取

1.将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

2.将15-20mg组织放置于离心管柱上，用塑料棍扭转研磨50-60次，加入200μl细胞裂解液，继续研磨30-60次。

3.盖上盖子室温孵育1-2分钟，14000-16000rpm离心2分钟取出。

4.立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验，冻存在-80℃冰箱中。

悬液芯片系统检测因子分泌

(1)开机Bio-Plex 200预热30min。将试剂盒放到室温，稀释液、洗液、检测液、标准品HB、检测抗体稀释液HB、样本稀释液HB放到室温，其他的试剂放到4℃。

(2)从-80℃冰箱中取出冻存的样本，待溶解后，样本蛋白加入0.5％BSA(w/v)稀释。

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μl的磁珠。

(8)用100μl的洗液洗板两次。

(12)用100μl的洗液洗板两次。。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μl。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μl的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μl。

(20)用100μl的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

结肠组织形态评分标准

以盲评的方法进行组织学评分，隐窝结构(正常，0；严重的隐窝畸变，整个隐窝丢失， 3)，炎性细胞浸润程度(正常，0；致密炎症浸润，3)，肌肉增厚(隐窝位于粘膜上，0；明显的肌肉增厚，3)，隐窝脓肿(不存在，0；存在，1)和杯状细胞耗竭(不存在，0；存在，1)。总的组织学评分是每个子评分项的相加的和。

小鼠结肠取材光镜照片如图110所示。

小鼠结肠长度如图111和表12-1所示。

表12-1 小鼠结肠长度统计数值，小鼠结肠长度在第11天长度的统计。

表12-2 小鼠组织学评分统计

表12-2说明：对图112中小鼠结肠HE切片的病理评分统计。

样本蛋白利用多因子试剂盒和ELISA试剂盒检测(参照Xin Zhou,et.al,2019,Cell reports Emanuela Sala,et,al,Gastroenterology,2015)：M细胞组与2.5％DSS组相比，促炎因子的含量有明显的下降，比如IFN-γ、IL-6、TNF-α、iNOS等，抑炎因子有明显的上调，如IL-10，营养因子的含量也有明显的上调。如VEGF、HGF、SDF-1a等，说明M细胞在炎性肠病治疗中，可以抑制炎症的发生，分泌的营养因子促进结肠组织的修复，对炎性肠病的治疗达到抑制炎症促进组织修复的功能。

小鼠结肠HE染色病理评分统计如图113所示。

表12-3 小鼠组织学评分统计，对图115中小鼠结肠HE切片的病理评分统计。

小鼠结肠HE染色病理评分统计如图116所示。

小鼠存活率的统计如图117和表12-4所示。

表12-4 小鼠存活只数统计

样本蛋白利用多因子试剂盒和ELISA试剂盒检测，M细胞组与5％DSS组相比，促炎因子的含量有明显的下降，比如IFN-γ、IL-6、TNF-α、iNOS等，抑炎因子有明显的上调，如IL-10，营养因子的含量也有明显的上调。如VEGF、HGF、SDF-1a等，说明M细胞在炎性肠病治疗中，可以抑制炎症的发生，分泌的营养因子促进结肠组织的修复，对炎性肠病的治疗达到抑制炎症促进组织修复的功能。

免疫荧光染色发现，经M细胞治疗后，结肠组织中M2型巨噬细胞的比例明显上调，而M1型巨噬细胞的比例下调，这将有助于缓解炎症，促进组织修复。

以上结果说明，M细胞治疗可以减轻IBD小鼠的炎症情况，对结肠组织起到保护作用，且在高浓度DSS诱导的情况下，M细胞可以极大提高小鼠的存活率，综上M细胞可以减轻结肠炎症、促进结肠组织修复、提高小鼠存活率，对炎性肠病起到有效的治疗作用。

实施例13：M细胞对烫伤的治疗活性评价

迄今为止，皮肤损伤虽然通过自体皮肤移植或者人工皮肤移植进行治疗，但在大面积烧伤烫伤中，仍然捉襟见肘，间充质干细胞的出现为皮肤损伤带来了一些希望，结合材料联合治疗。

本发明克服自体皮肤移植数量有限，不能及时有效的对皮肤损伤进行治疗，不能功能性治疗损伤区域的皮肤。克服自体皮肤移植数量不足，来源有限，皮肤损伤后无功能性恢复等问题，解决皮肤移植来源有限、自体皮肤有限等问题，皮肤损伤后附属器官的构建，达到皮肤损伤后伤口的加速愈合，以及减少纤维化的发生，达到皮肤的功能性恢复。

达成效果：移植M细胞后，大鼠烫伤区域愈合速度明显加快，伤口面积变小，组织切片结果显示，M细胞结合Matrigel治疗可以较少纤维化的发生。

(1)M细胞的制备

(2)M细移植的方式与剂量

(3)大鼠的烫伤模型

实验动物：SD大鼠，雄性，7-8周龄，动物购于北京维通利华公司。

M细胞的制备培养：胚胎干细胞悬EB，进行贴壁分化，获取P0代的M细胞，进行传代筛选，在P3代进行冻存，用于后续实验。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

动物模型制备：SD大鼠用5％的水合氯醛进行麻醉，麻醉后剃去背部的毛发。将金属棒在水浴锅的沸水中加热5min，取出，用镊子把铝棒夹住，放在距大鼠背部中线1cm位置左右侧，靠铝棒的重力来烫伤20s，进行造模。两天后剪去损伤区域的皮肤，进行分组治疗。减去烫伤区域的皮肤，进行拍照，固定拍照高度，并在伤口旁边放一把有刻度的直尺，为了测量造模面积，用ImageJ软件进行测量确定。

分组：对照组、M细胞组。

对照组：只进行3M贴的包扎。

M细胞组：2×10 ⁶的M细胞(p5代)混于200ul的Matrigel中，每个伤口加200ul混合物进行治疗，并进行3M贴的包扎。

并在第0、7、10、14、21天进行拍照，在第21天进行灌流取材，取材样本在多聚甲醛中浸泡过夜，之后进行石蜡切片，并进行HE和Masson染色。

标本取材：

采集标本时，大鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在大鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只大鼠需约50ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，用50ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，剪去损伤区域皮肤，进行固定切片分析。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

Masson染色

(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-无水乙醇Ⅰ 10min-无水乙醇Ⅱ 10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。

(2)苏木素染细胞核：Masson染色试剂盒内Weigert氏铁苏木素染5min，自来水洗， 1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，流水冲洗数分钟返蓝。

(3)丽春红染色：Masson染色试剂盒内丽春红酸性品红液染5-10min，蒸馏水快速漂洗。

(4)磷钼酸处理：Masson染色试剂盒内磷钼酸水溶液处理约3-5min。

(5)苯胺蓝染色：不用水洗，直接用Masson染色试剂盒内苯胺蓝液复染5min。

(6)分化：1％冰醋酸处理1min。

(7)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-二甲苯Ⅰ 5min-二甲苯Ⅱ 5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

(8)显微镜镜检，图像采集分析。

免疫组化染色：

使用免疫组化试剂盒(福州迈新，KIT-9710)对石蜡切片进行免疫组化染色，具体步骤如下：

1.脱蜡：(1)二甲苯I、II，各10min；(2)梯度酒精：100％无水乙醇，2min；95％无水乙醇，2min；80％无水乙醇，2min；70％无水乙醇，2min；

2.水化：蒸馏水洗2次，每次5min(置于摇床)；

3.石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS冲洗3次，每次3分钟；

4.抗原修复液(10mM pH 6.0柠檬酸钠缓冲液)的配制：

(1)储备液的配制：A液：二水柠檬酸三钠29.41g+蒸馏水1000mL；B液：柠檬酸21g+蒸馏水1000mL；

(2)工作液的配制：A液82mL+B液18mL+蒸馏水900mL；

5.抗原修复：用切片放入盛有柠檬酸钠缓冲液的塑料或耐温玻璃容器内，淹没切片，使用微波炉中高或高档，5min；补充柠檬酸钠缓冲液，再选择中高或高档，5min；

6.加试剂A(过氧化酶阻断溶液)，室温孵育10min，阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗3遍，每遍3min；

7.弃去PBS，加1滴或50μL试剂B(正常非免疫动物血清)，室温孵育10min；

8.弃去血清，加1滴或50μL一抗，4℃过夜或室温孵育60min；PBS冲洗3遍，每遍3min；

9.弃去PBS，加1滴或50μL生物素标记的二抗(试剂C)，室温孵育10min；PBS 冲洗3遍，每遍3min；

10.弃去PBS，加1滴或50μL链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温孵育10min；PBS冲洗3遍，每遍3min；

11.弃去PBS，加2滴或100μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10min；

12.自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝；

13.使用DAB显色时，切片需经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固；

14.显微镜拍照。

免疫荧光染色：

(1)将组织切片脱蜡入水；

(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；

(3)正常羊血清封闭，37℃，60min；

(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；

(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；

(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。

(7)荧光显微镜观察拍照。

不同天数伤口照片如图118所示。

伤口面积大小统计如图119所示。

伤口未愈合率统计如图120所示。

21天伤口面积大小统计如图121所示。

表13-1表示对大鼠损伤区域皮肤面积在第0、3、7、10、14、21天的统计数值。

表13-1：伤口面积大小统计

表13-2：伤口未愈合率统计

表13-3表示对照组、M细胞组在21天时伤口面积的统计。

表13-3：21天伤口面积大小统计

HE和Masson染色结果如图122所示。HE染色结果说明M细胞组的伤口愈合要优于对照组的愈合，M细胞组已经完全愈合，表皮已经完全愈合，而对照组伤口中间部分表皮还未完全愈合。Masson染色结果。对照组着色较深，胶原沉淀多，说明纤维化严重。而M细胞治疗组的着色前，胶原沉积少，纤维化程度低于对照组通过M细胞与Matrigel的移植治疗后，大鼠皮肤损伤的伤口恢复速度加快；组织切片，纤维化发生减少。

对造模部位大鼠皮肤，在第5天和第7天进行免疫组化染色，M细胞组中CD3、F4/80、MPO的表达要明显低于模型组，说明M细胞可以减轻烫伤后，伤口部位的炎症情况，抑制炎症。在M细胞中K14的表达要显著高于模型组的表达，说明M细胞可以加速皮肤损伤后伤口的表皮化，加速伤口的愈合，对皮肤损伤起到有效的治疗作用。

对第14天大鼠皮肤切片进行免疫荧光鉴定，M细胞组中CD31marker的表达，要明显高于对照组，说明M细胞治疗可以促进皮肤伤口的血管再生，对皮肤损伤后的再生，具有重要的作用。

对皮肤伤口切片进行免疫荧光染色发现，在M细胞组中β-Catenin、CD133、Ki67的表达要显著高于模型组，说明M细胞组中，毛囊器官更多，M细胞治疗可以促进皮肤损伤后毛囊的再生。

综上，M细胞治疗可以加速皮肤伤口的愈合，减轻皮肤伤口的炎症情况，促进血管、毛囊的再生，减少胶原蛋白的沉积，抑制纤维化发生，因此M细胞可以有效治疗皮肤损伤。

实施例14：M细胞对男性生殖系统疾病的治疗活性评价

生殖系统的器官由生殖腺、生殖管道和附属器官等组成。生殖器官通过其各种活动、受精、妊娠等生理过程，达到繁衍后代的作用。生殖系统疾病主要包括，生殖系统的肿瘤，如睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫宫颈癌等；生殖系统感染，如特异性感染和非特异性感染，如结核菌感染、慢性前列腺炎、附睾炎等；生殖系统畸形，如像隐匿阴茎，蹼状阴茎，隐睾等；性功能障碍相关疾病，如男性阴茎勃起功能障碍、精索静脉曲张、女性多囊卵巢等。

男性生殖系统疾病包括与泌尿外科疾病有关的有排尿异常、脓尿、尿道异常分泌物、疼痛、肿块、性功能障碍及男性不育症等。主要有泌尿系统炎症，如膀胱炎、尿道炎、尿失禁、尿潴留等；生殖系统炎症，如睾丸附睾炎、精囊炎、前列腺炎等；生殖道结核，如睾丸附睾结核、精囊结核等；生殖道损伤，如睾丸挫伤、阴茎折断伤、尿道断裂等；男性不孕不育疾病，如精索静脉曲张、弱精子症、先天性输精管梗阻、输精管缺如等；男性性功能障碍性疾病，如男性勃起功能障碍、早泄、性欲减退、不射精、延迟射精等。随着生活环境污染、工作压力增加、饮食结构改变，现代男性生殖系统疾病发病率逐年增加。

男性不孕是指由于男性因素引起的不育一般把婚后同居2年以上未采取任何避孕措施而女方未怀孕，男性不孕包括睾丸萎缩、睾丸发育不全、少精子症、精子生成障碍、无精子症、阻塞性无精子症、弱精子症、克氏综合征、XYY综合征、Kallmann氏综合征、选择性LH缺陷症和FSH缺陷症、肾上腺皮质增生症、高泌乳素血症、精索静脉曲张、精子畸形症等。

少精子症是指精液中精子的数量低于正常健康有生育能力的男子，包括由内分泌功能障碍、生殖系统感染、精索静脉曲张、抗精子抗体、隐睾、鞒膜积液、营养不良、化学治疗、放射治疗、肥胖等导致的少精子症。

实验动物：SD大鼠，雄性，6周龄，动物购于北京维通利华公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

白消安的配制：称取0.4g白消安粉末溶于10ml二甲基亚砜溶液中40mg/ml，完全溶解后，将浓度为的白消安分装于离心管中4℃避光保存备用。

动物造模：将SD大鼠麻醉后，在腹部剪开一个小口，用镊子将左侧睾丸暴露在外，注射50μl配置好的白消安进行造模，之后分组处理，每组4只鼠。

模型组：注射100ul的生理盐水。

M细胞组：注射100ul含有3×10 ⁶M细胞的生理盐水(P5代)。

在第10天进行第二次治疗，第20天进行灌流取材，并对左右侧睾丸进行称重。

标本取材：

采集标本时，大鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在大鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只大鼠需约50ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，用50ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，用多聚甲醛固定睾丸，并进行切片分析。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

大鼠附睾精子浓度、活力、畸形率的检测

用精子计数板计数大鼠附睾精子密度和存活率。普通计数一般视动的精子均为有活力精子，包括直线运动、不规则运动和原地运动。

精子计数板计数(该方法用于精子密度较低时计数：从附睾尾部挤出乳白色精子团，用拉细圆头玻璃管将精子移入1ml受精液中，培养箱中培养30min，待精子全部散幵用于精子计数。每次精子计数板加10μl的精子，显微镜下计数10个视野中精子的总数，每个样本计数3次，取其平均值。精子密度的计算：

精子数/视野＝10个视野精子总数/10

精子畸形率检测：将稀释的精子滴在干净载玻片上，新盖玻片推片，干燥后，用固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)固定15min，载玻片背面缓慢流水冲洗，待完全冲洗干净，晾干。吉姆萨染色1.5小时，背面流水冲至正面无蓝色，瞭干镜检。10倍物镜随机取5个视野，每次计数200个精子，计出精子总数和畸形精子数，取平均值。

透射电镜观察超微结构

大鼠睾丸组织置于2.5％戊二醛中4℃固定12h；梯度乙醇脱水后，环氧树脂浸润包埋；枸橼酸铅和醋酸铀避光染色，半薄切片后普通光镜显微镜下观察，定位后做超薄切片，双铅染液电子染色，烤箱烘千20min后上机，透射电镜下观察睾丸超微组织结构。

睾丸光镜照片如图123所示。

左侧睾丸与右侧睾丸的重量比值如图124所示。

睾丸HE染色图片如图125所示。

表14-1表示第20天取材时，对大鼠睾丸重量的统计。

表14-1 大鼠睾丸重量统计

表14-2 左侧睾丸与右侧睾丸的重量比值

血细胞计数器检测精子密度和活率：

对大鼠附睾精子数量、活力和畸形率的检测发现，M细胞治疗组的精子密度显著高于模型组；M细胞治疗组大鼠的精子活力明显高于模型组的，且精子畸形率明显低于模型组，说明M细胞治疗可以促进精子的再生，对于维持精子活力、形态正常有着重要的作用。

透射电镜睾丸组织超微结构：发现M细胞治疗组的睾丸曲细精管内细胞空泡减少，细胞排列紧密，细胞核饱满，各细胞器清晰可见，可见到正常完整的精子；而模型组，细胞中央空泡明显，细胞结构破坏严重，细胞核皱缩，细胞器结构不清，说明M细胞治疗对精子正常形态的恢复有重要作用。

以上结果说明M细胞注射治疗可以促进精子的再生，对于维持精子活力、形态正常有着重要的作用，并对精子正常形态功能的恢复有重要作用，因此，M细胞注射可以有效治疗少精、无精等症状。

实施例15：M细胞对癫痫的治疗活性评价

癫痫是一种大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的慢性疾病。是脑卒中后第二常见的神经系统疾病。脑部神经元的“异常放电”引起癫痫发作，具有反复性和短暂性的特点。癫痫影响全球7000多万人，中国人群的发病率在5-7‰之间，全国有650-910万患者。一些脑血管并发症、头外伤、中枢神经系统感染等会导致继发性癫痫；睡眠、年龄、遗传与特发性癫痫发作息息相关。针对于癫痫治疗，应用最多的是抗癫痫药物。然而，尽管目前已有30种不同分子靶点的抗癫痫药物(Antiepileptic drugs,AEDs)，但在癫痫的药物治疗中仍存在许多挑战，如耐药、副作用、伴随着频繁依赖毒性和记忆缺陷等。此外，脑外科手术是最重要的替代治疗；然而，手术必须考虑是否可以入组以及风险和费用。目前，临床试验主要是药物治疗，有200多项处于Ⅲ期。MSC临床试验有1项，处于Ⅱ期。

M细胞的制备培养：

P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

实验动物：

雄性Sprague-Dawley大鼠，5-7周，动物购于北京斯贝福生物技术有限公司。所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。大鼠适应性喂养1周后，开始实验。

饲养条件：自由进食、饮水；12/12h昼夜交替，7:00-19:00为白昼，室温22±2℃，相对湿度在50％-60％。大鼠适应性喂养一周后开始实验。

实验分组：

正常对照组、PTZ+溶剂(溶剂组)、PTZ+M细胞(M细胞组),每组6只。

实验材料：1ml注射器

实验试剂：戊四唑(PTZ)、生理盐水

大鼠腹腔注射PTZ 50mg/kg后，立刻尾静脉注射受试物：PTZ+溶剂组尾静脉注射1ml生理盐水，PTZ+M细胞组尾静脉注射1ml细胞：5×10 ^{^6}/只。之后，将大鼠放在一个透明的玻璃笼内，记录初次癫痫发作所花费的时间、初次发作级别、发作分级、初次大发作的潜伏期以及大发作持续时间和比例。

统计：所有数据采用Prism 7.0统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准误(Mean±SD)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

大鼠初次癫痫发作潜伏期统计如图126所示。大鼠初次癫痫发作级别统计如图127所示。大鼠初次癫痫发作分级统计如图128A所示。大鼠初次癫痫发作分级统计如图128B。大鼠癫痫大发作比例统计如图129所示。

尾静脉注射M细胞组，大鼠癫痫初次发作潜伏期延长300多秒，癫痫发作等级从3级降至2级，发作分级从4级降至3级，延长了癫痫大发作潜伏期500多秒以及降低了癫痫大发作比例至66.7％秒较溶剂组相比，以上这些数据表明M细胞可以延迟、减少和减轻癫痫发作，具有良好的治疗效果。

表15-1表示大鼠初次癫痫发作潜伏期统计。

表15-1 大鼠初次癫痫发作潜伏期统计

表15-2、图127表示大鼠初次癫痫发作级别统计。M细胞组下调癫痫发作等级，从3级降至2级，表明M细胞可以减轻癫痫发作。

表15-2 大鼠初次癫痫发作级别统计

表15-3、图128A表示大鼠初次癫痫发作分级统计。尾静脉注射M细胞明显降低癫痫发作分级，说明M细胞可以减轻癫痫发作。

表15-3 大鼠初次癫痫发作分级统计

表15-4、图128B表示大鼠癫痫大发作潜伏期统计。尾静脉注射M细胞明显延长了癫痫大发作潜伏期，从约156.3秒延长至681.2秒，说明M细胞可以延迟癫痫大发作。

表15-4 大鼠癫痫大发作潜伏期统计

表15-5、图129表示大鼠癫痫大发作比例统计。尾静脉注射M细胞明显降低了癫痫大发作比例，较溶剂组相比，比例降低了33.3％，说明M细胞可以明显降低癫痫大发作次数。

表15-5 大鼠癫痫大发作比例统计

分组	正常对照	PTZ+溶剂	PTZ+M细胞
大发作比例统计	0.0	100.0	66.7

脑切片染色鉴定神经细胞类型和数量：

方法：鼠心脏灌注后取脑置于4％PFA中4℃过夜固定，用PBS配制的15％、30％蔗糖梯度脱水，OCT包埋后冷冻于-80℃冰箱。切片厚度12-15μm，用多聚赖氨酸包被的载玻片贴片。用2％BSA+0.2％TritonX100配制封闭透膜液室温封闭+透膜1h。4℃孵育一抗过夜。常温孵育二抗2h。Hoechst 33342常温孵育10min染核，最后封片观察。

切片染色发现，与对照相比，接受细胞移植的动物脑内GABA能神经元数量增多，小胶质细胞数量减少，证明GABA能神经元被激活，内源干细胞向GABA能谱系的分化能力增强，炎症反应得到抑制，细胞可以重塑和修复模型(受试者)中GABA能神经元缺陷的神经回路。

行为学检测：

方法参照Li et al.,2016,Frontiers in Aging Neuroscience

行为学检测结果表明试验组动物寻找特定目标的时间缩短，证明细胞移植可以改善模型动物(受试者)记忆和学习能力

质谱检测：

脑组织经研磨和匀浆后离心取上清，质谱仪检测。

脑蛋白质谱结果表明，试验组动物脑内GDNF等营养因子的分泌水平提高，证明细胞移植具有促神经营养因子分泌和神经保护的功能。

溶剂组显著缩短了癫痫发作潜伏期，具有较高的癫痫发作等级和分级，缩短了癫痫大发作潜伏期和减增加了癫痫大发作比例，这些数据表明溶剂组癫痫发作严重、且多次与正常对照组和细胞组相比较。

实施例16：M细胞对硬皮病的治疗活性评价

实验动物：C57BL/6，雌性小鼠，7-8周龄，动物购于北京维通利华公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

动物模型制备：按体重将C57BL/6雌性小鼠随机分组，从第0天到第21天，每天皮下注射配置好的博来霉素溶液，背部皮下单点注射，剂量为100μl(1mg/ml)，进行造模。在第14天随机分组，分为正常组、BLM(博来霉素)、M细胞组。

正常组：在第0天只剃毛，不进行其他处理。

BLM组：在第0天剃毛，从第0天到第21天，每天皮下注射博来霉素溶液，并在第14、21天时，皮下单点注射100μl的生理盐水，在第28天进行拍照取材，切片染色。

M细胞组：在第0天剃毛，从第0天到第21天，每天皮下注射博来霉素溶液，并在第14、21天时，皮下单点注射100μl的生理盐水含有3×10 ⁶M细胞，在第28天进行拍照取材，切片染色。

标本取材：

采集标本时，小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只小鼠需约20ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，用20ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，剪去造模区域皮肤，进行固定切片分析。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

Masson染色

(2)苏木素染细胞核：Masson染色试剂盒内Weigert氏铁苏木素染5min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，流水冲洗数分钟返蓝。

(6)分化：1％冰醋酸处理1min。

(8)显微镜镜检，图像采集分析。

动物组织总蛋白提取

标本取材：

采集标本时，小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只小鼠需约20ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，剪去造模区域皮肤。

(1).将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

(2).将15-20mg组织放置于离心管柱上，用塑料棍扭转研磨50-60次，加入200μl细胞裂解液，继续研磨30-60次。

(3).盖上盖子室温孵育1-2分钟，14000-16000rpm离心2分钟取出。

(4).立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验，冻存在-80℃冰箱中。

悬液芯片系统检测炎性因子

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μl的磁珠。

(8)用100μl的洗液洗板两次。

(12)用100μl的洗液洗板两次。。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μl。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μl的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μl。

(20)用100μl的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

免疫荧光检测a–SMA

方法见：Jong-Sung Park,Yumin Oh,Yong Joo Park,et al.,Targeting of dermal myofibroblasts through death receptor 5 arrests fibrosis in mouse models of scleroderma.Nat Commun.2019 Mar 8；10(1):1128.

结果：

提取小鼠皮下组织总蛋白，通过多因子检测系统，发现M细胞移植后，IL-17、IL-6、TNF等炎性细胞因子水平显著降低，IL-10含量明显升高。

提取小鼠皮下组织总蛋白，通过ELISA试剂盒检测，发现M细胞移植组，MMP1含量显著升高。

免疫荧光检测平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达水平，发现M细胞移植后，a–SMA的表达水平显著降低。

第28天时小鼠背部照片如图130所示。

小鼠皮肤HE染色图片如图131所示。

小鼠皮肤Masson染色图片如图132所示。

实施例17：M细胞对难治性皮肤破损的治疗活性评价

实验动物：ZDF大鼠，雄性，7-8周龄，动物购于北京维通利华公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，用于后续实验。

动物造模：用普通饲料饲养ZDF大鼠一周之后用高脂饲料进行诱导，每周检测大鼠随机血糖的变化，随机血糖水平大于≥11.1mmol/L，认定模型诱导成功。

模型诱导成功后，进行皮肤损伤的造模，将ZDF大鼠用气麻机麻醉，麻醉后剔去背部的毛发，并用喷有酒精的纱布擦拭，用剪刀剪去背部右侧的皮肤，大小为2×2cm，造成全皮层的皮肤缺损，进行分组处理。并在第7、14、21、28天进行拍照，在第28天进行灌流取材，对皮肤样本进行切片HE染色鉴定。

对照组：在伤口周围四点注射生理盐水，上下左右各一点，每点50μl的生理盐水，之后用3M贴进行包扎。

M细胞组：在伤口周围四点注射生理盐水，上下左右各一点，每点50μl的生理盐水，50μl生理盐水中含有7.5×10 ⁵的M细胞(P5代)，之后用3M贴进行包扎。

样本采集：

采集标本时，大鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在大鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只大鼠需约50ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，用50ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，减去损伤区域皮肤，进行固定切片分析。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

Masson染色

(6)分化：1％冰醋酸处理1min。

(8)显微镜镜检，图像采集分析。

免疫组化染色：

2.水化：蒸馏水洗2次，每次5min(置于摇床)；

3.石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS冲洗3次，每次3分钟；

4.抗原修复液(10mM pH 6.0柠檬酸钠缓冲液)的配制：

(2)工作液的配制：A液82mL+B液18mL+蒸馏水900mL；

9.弃去PBS，加1滴或50μL生物素标记的二抗(试剂C)，室温孵育10min；PBS冲洗3遍，每遍3min；

12.自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝；

14.显微镜拍照。

免疫荧光染色：

(1)将组织切片脱蜡入水；

(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；

(3)正常羊血清封闭，37℃，60min；

(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。

(7)荧光显微镜观察拍照。

结果：

造模后不同时间节点皮肤伤口的光镜图片如图133所示。

对图133的伤口面积大小统计如图134所示。

伤口的未愈合比率如图135所示。

表17-1表示对造模后第7、14、21、28天，皮肤伤口面积的统计数值。从表中可以看出在第7天时，两组面积趋于一致，但在28天时，M细胞组的要低于模型组的面积。说明M细胞在皮肤损伤中有治疗的效果，可以加速伤口的愈合。

表17-1 伤口面积数值统计

表17-2表示对皮肤伤口在不同天数未愈合比例的统计。

表17-2 伤口未愈合比例统计

4、对造模部位大鼠皮肤，在第5天和第7天进行免疫组化染色，M细胞组中CD3、F4/80、MPO的表达要明显低于模型组，说明M细胞可以减轻皮肤损伤部位的炎症情况，抑制炎症。在M细胞中K14的表达要显著高于模型组的表达，说明M细胞可以加速皮肤损伤后伤口的表皮化，加速伤口的愈合，对皮肤损伤起到有效的治疗作用。

5、对第14天大鼠皮肤切片进行免疫荧光鉴定，M细胞组中CD31marker的表达，要明显高于对照组，说明M细胞治疗可以促进皮肤伤口的血管再生，对皮肤损伤后的再生，具有重要的作用。

6、对皮肤伤口切片进行免疫荧光染色发现，在M细胞组中β-Catenin、CD133、Ki67的表达要显著高于模型组，说明M细胞组中，毛囊器官更多，M细胞治疗可以促进皮肤损伤后毛囊的再生。

在M细胞对糖尿病鼠治疗中，我们发现，M细胞移植治疗在糖尿病并发症中可以起到以下效果：

糖尿病肾病：M细胞移植可以使促炎因子IL-1β，IL-6和TNFα的表达降低，可以减少肾小球膜增厚和巨噬细胞浸润，降低糖尿病引起的肾小球病变，增加大鼠的肾脏重量，肾脏与体重指数，因此M细胞对糖尿病肾病可以起到很好的治疗效果。

糖尿病足：M细胞治疗可以加速糖尿病足的愈合，减轻皮肤伤口的炎症情况，促进血管、毛囊的再生，减少胶原蛋白的沉积，抑制纤维化发生，因此M细胞可以有效治疗皮肤损伤。

糖尿病眼部并发症：M细胞治疗可以起到降血糖和调节炎症反应的作用，显著降低空腹血糖和HbA1c水平，对视功能以及黄斑水肿具有一定的改善趋势，因此M细胞移植可以很好的治疗糖尿病眼部并发症。

糖尿病并发的血管钙化：M细胞移植可以抑制血管钙化，从而对并发症中血管钙化的疾病起到很好的治疗效果。

糖尿病神经病变：静脉注射M细胞可以增强星形胶质细胞抗氧化应激的能力，增强其清除脑内谷氨酸及维持脑内K+平衡的能力，从而促进神经元功能、脑内平衡和突触形成，改善糖尿病引起的认知障碍。

综上，M细胞治疗可以加速皮肤伤口的愈合，减轻皮肤伤口的炎症情况，促进血管、毛囊的再生，减少胶原蛋白的沉积，抑制纤维化发生，因此M细胞可以有效治疗皮肤损伤。此外，M细胞移植治疗，在糖尿病并发症也可以起到很好的治疗效果。

实施例18：M细胞对贫血的治疗活性评价

贫血并非是一种独立的疾病，意义上是指血液携氧能力降低，导致组织氧气供应不足和组织缺氧的状态。贫血本身病因和发病机制复杂多样，可涉及多种因素和系统疾病。基本病因可概括为三方面，包括红细胞生成减少或不足、红细胞破坏过多及失血。肿瘤患者是贫血的常见原因，50％肿瘤患者合并贫血，它不仅带来多种临床症状，而且还使患者生活质量下降，也是影响预后的因素之一，同时还会因输血的增多而引起许多不良后果。肿瘤伴发贫血是一个多因素的结果，大部分是肿瘤本身引起，属于慢性贫血；另外，使用细胞毒性药物或肾毒性药物化疗也会刀子贫血的发生。顺铂是广泛应用于患者的化疗药，具有肾毒性，顺铂累计剂量增加，贫血加重。尽管红细胞生成素可以缓解慢性癌症性贫血，但有文献报道其纠正贫血的有效率为60％左右。如何进一步改善肿瘤患者贫血，提高患者预后和生活质量，仍是一个重要课题。

实验动物：

Sprague-Dawley雄性大鼠，6-8周龄，动物购于维通利华(北京)生物技术有限公司

M细胞的制备培养

复苏P3代M细胞，进行消化传代，用于后续实验。

试验试剂设备

动物造模：

雌性分为三组，对照组、顺铂诱导贫血组、顺铂诱导贫血+M细胞治疗组，每组4只大鼠。贫血模型组腹腔注射顺铂(150mg/kg)，第5天采用白消安蒸馏水悬液灌胃(15mg/kg)，每周1次；对照组同贫血模型组，但采用生理盐水替换白消安蒸馏水悬液灌胃。顺铂第一次诱导3天后，细胞治疗组开始静脉输注细胞药物，5 x 10^6/只，共治疗两次，每次间隔一周。试验开始后，每周称量体重2次，第一次细胞输注18天后，采集大鼠全血进行血常规检测。

统计：所有数据采用T.test进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准差(Mean±SD)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

1、顺铂诱导贫血模型大鼠体重下降

实验方法：在模型诱导的不同时间点，取大鼠在电子秤上进行体重测量。

实验结果：

贫血模型大鼠体重变化趋势如图136所示。

表18-1表示对于顺铂诱导大鼠贫血模型的不同时间点进行体重检测，数据进行统计分析。

表18-1、顺铂诱导贫血模型大鼠体重数据分析

2、血液生化检测

实验方法：在模型诱导的第21天，取大鼠在血液，在动物血常规分析仪上进行血常规各项指标检测。

实验结果：

顺铂诱导贫血模型大鼠外周血白细胞总数分析如图137所示。顺铂诱导贫血模型大鼠外周血红细胞总数分析如图138所示。顺铂诱导贫血模型大鼠外周血红蛋白含量分析如图139所示。顺铂诱导贫血模型大鼠外周血红细胞比积分析如图140所示。顺铂诱导贫血模型大鼠外周血平均血红蛋白浓度分析如图141所示。顺铂诱导贫血模型大鼠外周血红细胞体积分布宽度分析如图142所示。顺铂诱导贫血模型大鼠外周血血红蛋白含量分布宽度分析如图143所示。

表18-2表示对于顺铂诱导大鼠贫血模型的第21天进行血液收集，随后进行血生化常规分析。数据统计如下表所示。

表18-2、顺铂诱导贫血模型血生化常规数据分析

3、骨髓细胞学检查

实验方法：骨髓象检查腹主动脉采血结束后，用手术剪刀剪掉大腿部的肌肉，充分暴露股骨，用大剪刀剪断股骨，中号镊子挤出骨髓，如果骨髓不易取出，可用直头眼科镊插入骨髓腔挑出骨髓，置骨髓于清洁的载玻片。

实验结果：与对照组骨髓涂片结果相比，顺铂+溶剂组骨髓涂片中骨髓脂肪化明显，细胞数量下降，非造血细胞增多，骨髓有核细胞增生极度低下，细胞数量稀少，造血细胞罕见，骨髓涂片油滴明显增多，即镜下空泡数量明显增多，并出现许多大或特大空泡，显示贫血症状。顺铂+M细胞治疗组骨髓增生活跃，脂肪细胞较少。以上结果表明M细胞治疗对于贫血的骨髓象恢复具有明显促进作用。

实施例19：M细胞对肺动脉高压的治疗活性评价

肺动脉高压(Pulmonary hypertension,PH)是指肺动脉压力超过一定界值的一种血流动力学异常状态。患者伴有体乏无力和呼吸困难等主要症状,不经治疗病程发展较快,往往发展为右心衰竭进而导致死亡。其特征包括肺血管重构,血管阻塞引起肺血管阻力(Pulmonary vascular resistance,PVR)、肺动脉压力增高和右心室肥厚。目前最有效的治疗方法是药物治疗,包括前列环素、内皮素-1受体拮抗剂、5型磷酸二酯酶抑制剂等3大类药物。这些药物虽然可以改善病情,但没有从根本上改善肺血管重构,且总体而言价格较高,不能满足长期治疗的需要。

近10余年来,干细胞治疗显示出巨大潜力。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)和间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)等细胞治疗在动物实验中取得了突破性的研究成果。越来越多的研究证明，干细胞治疗对于治疗肺动脉高压有一定的效果。在各种类型的干细胞中，MSCs是一类研究最为广泛,最具有再生医学研究价值的干细胞。使用MSCs治疗野百合碱(Monocrotaline，MCT)诱导的PH大鼠，可改善血流动力学,改善肺血管重构。有研究人员发现基因修饰的MSCs可通过分泌降钙素基因相关肽减轻MCT诱导的PH内皮功能失调。移植HGF基因修饰的MSCs到MCT诱导的PH大鼠体内后，心肺动力学指数也得到显著改善,优于MSCs单一治疗。目前对于MSCs的研究取得了阶段性的结果,但在治疗PH方面,与EPCs相比其未知的干预机制成为限制MSCs临床应用的主要因素。然而，成体组织来源MSCs临床应用中主要存在如下缺点：(1)无法从单个个体组织获得治疗量的成体组织来源MSCs；(2)成体组织来源MSC来源于不同的个体组织，无法实现产品质量的一致性；(3)即使同一个体组织来源的MSC也具有高度异质性；(4)成体组织来源MSC的供体组织来源复杂，具有潜在的传染性病原体感染风险；(5)成体组织来源MSC随着体外扩增会迅速衰老。因此，需要新的MSCs细胞来源，用于治疗肺动脉高压。

实验动物：

SD大鼠，雄性，6-8周龄。动物购于北京维通利华公司。

所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级，适应性饲养一周。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

M细胞的制备培养：

复苏P3代M细胞，进行消化传代，用于后续动物实验。

动物分组：

肺动脉高压模型：一次性腹腔注射60mg/kg野百合碱

细胞注射：

注射MCT一周后，鼠尾静脉注射5×10 ⁶细胞/只，两周后进行超声评价和取材。

超声评价：

取胸骨旁大动脉短轴切面，脉冲多普勒取样容积放在肺动脉瓣上，同步记录肺动脉瓣收缩期血流频谱和心电图，取肺动脉收缩期血流频谱起点至最高点的时间，即为肺动脉血流加速时间(PAT)。

胸骨旁心底大动脉短轴切面，以连续多普勒取样线获取肺动脉反流频谱，将频谱按时间分三等份，即舒张早、中、晚三期，测量舒张早期肺动脉瓣最大反流压差，即为肺动脉平均压。

取胸骨旁短轴切面，测量肺动脉内径。

取二维下的四腔心切面，测量右心室与左心室基底部内径，计算右心室与左心室基底部内径比值(RV/LV)。

右心室收缩压测量：

使用血压检测仪进行血液动力学检测，气管插管后，开胸，采用0.7mm×19mm密闭式留置针，从心尖处进针5mm测量右心室压力。

标本取材：

采集标本时，大鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在大鼠腹部正中剪开皮肤，打开腹腔，中央静脉取血。开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，生理盐水灌注完成后，用50ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，取肺脏，进行固定切片分析。

悬液芯片系统检测炎症因子：

(1)开机Bio-Plex 200预热30min。将试剂盒放到室温，稀释液、洗液、检测液、标准品HB、检测抗体稀释液HB、样本稀释液HB放到室温，其他的试剂放到4℃。使用24因子试剂盒进行炎症因子的检测。

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μL的磁珠。

(8)用100μL的洗液洗板两次。

(12)用100μL的洗液洗板两次。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μL。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μL的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μL。

(20)用100μL的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

统计分析：

二、实验结果

(1)右心室血压测量结果显示，MCT组右心室收缩压明显高于对照组。与MCT组相比，MCT+M细胞组的右心室收缩压明显降低。结果表明，M细胞可以降低肺动脉高压大鼠的右心室收缩压。

(2)超声结果显示，在注射MCT后，与对照组相比，MCT组的肺动脉血流加速时间变小，右室与左室直径比值变大，肺动脉平均压升高，说明MCT组产生了肺动脉高压(表19-1至表19-4，图144至图147)。输注M细胞后，与MCT组相比，MCT+M细胞组的肺动脉血流加速时间变大，右室与左室直径比值变小，肺动脉平均压降低，说明M细胞可以抑制肺动脉高压的形成(表19-1至表19-4，图144至图147)。然而，右室流出道直径在各组之间没有变化(表19-2，图145)。表明M细胞可以提高肺动脉血流加速时间、降低右室与左室直径比值、降低肺动脉平均压。

(3)HE染色结果显示，MCT组的肺动脉壁发生成纤维细胞大量增生，而MCT+M细胞组则没有发生增生(图148)。MCT组的肺细小动脉中膜厚度明显厚于MCT+M细胞组。同时，MCT组的肺细小动脉管壁面积/管总面积比值明显高于MCT+M细胞组。结果表明，M细胞可以降低肺动脉高压大鼠的肺细小动脉中膜厚度和肺细小动脉管壁面积。

(4)检测了各组血清中的炎症因子，结果显示，与MCT组比较，M细胞治疗组的促炎症因子水平明显降低，抑炎症因子水平明显升高。表明，M细胞有抑制炎症的作用。

表19-1 超声法测量各组肺动脉血流加速时间

表19-2 超声法测量各组肺动脉内径

表19-3 超声法测量各组右心室与左心室内径比值

表19-4 超声法测量各组肺动脉平均压

实施例20：M细胞对脊髓损伤的治疗活性评价

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是由外伤诱发的一种脊柱外科创伤性疾病，表现为在损伤节段以下出现感觉、运动和自主神经功能障碍。国外流行病学调查显示，每年全球有13万新发脊髓损伤患者，且有超过250万患者正饱受着不同程度的脊髓损伤后遗症困扰，而这些患者每年的医疗支出将超过60亿美元，给家庭及社会造成沉重负担。

实验动物：Wistar大鼠，雄性，7-8周龄，动物购于北京维通利华公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

动物造模：将Wistar大鼠麻醉后，剔去背部的毛发，找到大鼠脊髓的T9节段，用剪刀剪开背部的皮肤与肌肉，暴露椎板，用持针钳撬开T9节段的椎板，并用血管夹夹住T9节段的脊髓90s，夹伤后将肌肉层和皮肤缝合，并用碘酒擦拭。将缝合好的大鼠放到大鼠电热毯上，待大鼠苏醒后，放到笼中饲养。一周后进行BBB评分并分组处理。之后每周进行BBB评分。

分组：模型组、M细胞组，每组3只鼠。

模型组：静脉注射300ul生理盐水的注射。

M细胞组：静脉注射300ul生理盐水的注射含有3×10 ⁶的P5代的细胞。

BBB(Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale)行为学评分：将大鼠放入开口的行为箱中，轻敲箱壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况，进行录像4分钟，用于后续得BBB评分。

BBB评分(Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale)(大鼠脊髓损伤)标准：

0分：无可见后肢运动。

1分：一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节。

2分：一个关节大幅活动或一个关节大幅活动且有另一关节轻微活动。

3分：两个关节大幅活动。

4分：后肢全部三个关节可轻微活动。

5分：两个关节轻微活动，第三个关节可大幅活动。

6分：两个关节大幅活动，第三个关节可轻微活动。

7分：后肢全部三个关节可大幅活动。

8分：非承重情况下可以爪掌面着地。

9分：足底仅位于负重位，或偶尔/频繁/持续以足背负重步行，无足底负重步行。负重：足底负重位时或仅在后躯干抬高时，HL伸肌收缩。

10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作。

11分：可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作。

12分：可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作。

13分：常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作。

14分：有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动

15分：持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行

16分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。

17分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。

18分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。

19分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。

20分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。

21分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。

大鼠BBB评分如图149所示。

表20-1表示对大鼠在造模后第1周到第7周的行为学BBB评分。从表中可以得出M 细胞治疗组的BBB评分明显高于模型组的评分，说明M细胞静脉注射可以很好的治疗脊髓损伤。

表20-1 大鼠BBB评分统计

机械性疼痛和泌尿系统功能：

方法参照Fandel et.al.,2016,cell stem cell.

结果表明，脊髓损伤模型动物在接受M细胞治疗后，减轻了触觉异常性疼痛和痛觉过敏。通过自发排尿测试和有意识的膀胱测压，结果显示移植M细胞的动物的尿斑直径范围更广，表明动物恢复了部分膀胱控制，膀胱功能得到改善。同时，移植M细胞的动物显示出降低的膀胱出口阻力和逼尿肌过度活动，这与改善的排尿功能相对应。

切片染色：

方法参照Fandel et.al.,2016,cell stem cell.

结果表明，脊髓损伤模型动物在接受M细胞治疗后，损伤部位附近的神经元(TUJ1+)数量增多，且轴突长度增加，显示M细胞可以促进细胞存活并增强轴突再生。胶质细胞数量减少，且表达的胶原蛋白明显减少，显示M细胞有抑制胶质细胞活化和抗纤维化作用。而且可见小胶质细胞数量减少，证明M细胞可以有效降低损伤部位的炎症反应。

静脉注射M细胞，可以很好的提高脊髓损伤鼠的运动能力，其BBB评分有显著升高。说明M细胞能很好的对脊髓损伤进行治疗。

实施例21：M细胞对脑卒中的治疗活性评价

脑卒中是一种大脑血管狭窄、堵塞或破裂导致大脑组织缺血或出血致使大脑细胞和组织坏死的一类脑血管疾病。分为缺血性脑卒中(又称脑梗死)和出血性脑卒中(包括脑实质出血、脑室出血以及蛛网膜下腔出血)。缺血性脑卒中男性和女性发病率为212/10万和170/10万；出血性脑卒中：12-15/10万。然而，生活方式譬如吸烟、不良饮食、不运动等和患有并发症包括高血压、糖尿病、高血脂症、肥胖等的人往往容易发生脑卒中。目前，对于卒中的治疗，临床上应用最多的仍是溶栓药物组织纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t-PA)。应用t-PA治疗，需要患者符合入选条件，因此t-PA是针对特定脑卒中患者，而且，治疗时间窗短，局限于4.5小时。除此之外，血管内治疗也是一大治疗策略。但也存在弊端，血管内支架也只适用于解决大血管血流不通的问题。虽然，使用预防措施包括药物和健康生活方式以及有氧运动等使得脑卒中的发病率有所下降，但高复发率仍然无法有效解决。现有的临床试验主要研究了帮助卒中患者恢复的一些电子科技产品或软件系统，对卒中患者恢复进行的行为方式和生活方式改善以及药物治疗和细胞治疗。临床试验中，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)基本都是处于Ⅰ期和Ⅱ期。对于脑卒中的治疗，治疗方式存在局限性，适用范围较窄，且都是间接性的治疗，后期复发率高。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

实验动物：雄性SD大鼠(7周龄)，动物购于北京维通利华公司。所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

实验材料：手术器械、线栓、5-0手术缝合线、大鼠实验台、大鼠体重秤、一次性使用无菌注射器1ml、一次性使用无菌注射器5ml

实验试剂：异氟烷、碘伏、生理盐水、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer solution,PBS)、2，3，5－三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)

仪器设备：R540增强型小动物麻醉机

大脑中动脉梗塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型制备：气麻机内倒入适量异氟烷，大鼠放置在气麻盒内，将气麻机刻度调至3.5，之后大鼠深度麻醉且维持麻醉状态，将大鼠以仰卧姿势固定在大鼠实验台上，用碘伏擦拭颈部皮肤之后，中间皮肤纵向剪开1-2cm，分离肌肉层，暴露颈总、颈内和颈外动脉并进行分离，分别在颈总、颈内和颈外血管下埋线，颈外近心端和远心端各埋一根线，颈外侧枝小动脉埋线并结扎，用血管夹夹住颈总和颈内，颈外远心端的线结扎，从此处剪一小口，将线栓插入颈总后，系住颈外近心端的线，松开颈总和颈内动脉夹，将线栓插入颈内18mm，90分钟后，将线栓拔出，颈外结扎，缝合肌肉层和皮肤层即可。

实验分组：正常对照组、MCAO+溶剂(溶剂组)、MCAO+M细胞(M细胞组)，每组3只。

细胞注射：在术后3小时mNSS评分后，进行分组，按照≤7分淘汰；8-12分，13-18分入组，MCAO+溶剂组尾静脉注射500μl生理盐水，MCAO+M细胞组尾静脉注射5×10^6M cell/500μl/只。

行为学评分：术后3、24、72小时进行mNSS评分。mNSS评分，观察鼠的运动、感觉、反射功能。运动功能包括提尾实验和地板实验、平衡木实验。提尾实验包括：前肢屈曲(1分)、后肢屈曲(1分)、30s内头上仰(1分)；地板实验包括：不能走直线(1分)、偏瘫(1分)、旋转(1分)。平衡木实验又分为：紧抓平衡木边缘(1分)；紧抓平衡木，一肢体从平衡木垂落(2分)；紧抓平衡木，二肢体从平衡木上垂落或在平衡木上旋转(>60s)(3分)；试图在平衡木上保持平衡但跌落(>40s)(4分)；试图在平衡木上保持平衡但跌落(>20s)(5分)；直接跌落，未尝试在平衡木上平衡(<20s)(6分)。感触觉实验包括：视觉和触觉放置(1分)、本体觉放置(1分)。反射功能测试包括耳廓反射(1分)，角膜反射(1分)，惊跳反射(1分)，肌阵挛、肌张力障碍、惊厥发作(1分)。

脑梗死和脑水肿检测：在术后72小时，大鼠安乐死，取大脑组织称湿重并进行TTC染色，之后将脑组织烘干称干重。TTC染色过程：配制50ml 2％TTC染液(称取TTC 1g，加入50ml PBS溶解，避光)将所有组大鼠大脑组织放在-20℃冷冻30分钟后，逐一取出，进行切片，每片2mm，之后将脑片放于六孔板里，避光每孔加入3ml TTC染液，晃动脑片，防止脑片贴附在六孔板上，之后放在37℃恒温培养箱中孵育，15分钟后，翻动脑片，再次孵育15分钟。将脑片整齐摆放并拍照，之后用Image J软件进行梗死面积的统计。最后，将拍照后的脑片放入65℃烘箱中3天，之后称量脑片干重并记录。

结果分析：

术后24和72小时的mNSS评分结果中，M细胞组降低了mNSS分数，溶剂组vs细胞组：12.67 vs 10.33(24小时)，6.33 vs 5.33(72小时)，改善脑卒中大鼠(受试者)行为；脑梗死体现脑组织坏死情况，与溶剂对照组相比较，M细胞组降低大脑组织梗死程度(62.77 vs 56.72)梗死面积减少了6.05％；严重的脑水肿可引起颅内压增加，形成脑疝，溶剂组的脑组织含水量明显高于正常对照组(80.85 vs 82.94)，升高了2％，而M细胞组降低大鼠脑组织含水量2％较溶剂组(82.94 vs 80.49)，上述所有结果均表明M细胞对脑卒中大鼠(受试者)具有良好的治疗效果。

表21-1、图150表示3、24、72小时的mNSS行为学评分。术后3小时静脉注射M细胞降低mNSS分数在术后24小时(12.67 vs 10.33)和72小时(6.33 vs 5.33)，表明M细胞可以改善脑卒中大鼠(受试者)行为。

表21-1 3、24、72小时的mNSS行为学评分统计

表21-2、图151表示72小时后大鼠脑梗死面积的统计。术后3小时静脉注射M细胞减少大脑组织梗死面积6.05％较溶剂组，说明M细胞减轻大脑组织坏死程度。

表21-2 72小时后大鼠脑梗死面积的统计。

表21-3、图152表示72小时后大鼠大脑组织含水量的统计。术后3小时静脉注射M细胞降低大脑组织含水量2％较溶剂组(82.94 vs 80.49)，说明M细胞减轻大脑组织水肿程度。

表21-3 72小时后大鼠大脑组织含水量的统计。

大鼠前肢放置实验：

方法参考已发表文章：Matsuda F.,et al.,Acta Physiol Neurosci,2011.

48小时后通过前肢放置实验检测大鼠前肢使用能力，发现与溶剂对照组相比，移植M细胞组大鼠损伤对侧前肢使用率明显提高。

大鼠转棒实验：

方法参考已发表文章：Shen H.,et al.,J Neurosci Methods,2010

72小时后通过转棒实验检测大鼠运动协调能力，发现与溶剂对照组相比，移植M细胞组大鼠转棒运动时间明显提高。说明M细胞可以增强卒中动物(受试者)的运动能力。

MRI检测脑损伤情况：

方法：动物麻醉后进行小动物核磁成像，选择MRI T2序列平扫

72小时后MRI检测大鼠脑损伤情况，发现术后3小时静脉注射M细胞降低了脑梗死体积，说明M细胞能够减弱中风引起的神经细胞损伤程度。

大鼠脑冰冻切片染色与统计结果

方法参照已发表文献Kriks et al.,Nature,2011

72小时后冰冻切片染色检测大鼠神经细胞再生情况，发现与溶剂对照组相比，移植M细胞组大鼠在损伤部位有显著增加的新生神经元(Tuj1+)，缺血损伤区域边缘反应性星形胶质细胞(GFAP+)和小胶质细胞(IBA1+CD11B+)数量明显减少，损伤区域单位面积内神经元(NeuN+)数目明显提高。说明M细胞移植可以促进神经元再生，减少神经元损伤和死亡，对神经元具有提供营养和促突触再生作用。

大鼠脑组织炎症因子ELISA和WB检测结果

方法参照已发表文献Bétemps et al.,2015,J Vis Exp.

72小时后取大鼠脑组织检测炎症因子水平，与溶剂对照组相比，发现移植M细胞组大鼠脑组织TNF-α、IL1-β、IL-6等促炎因子水平明显下降，而IL-10、IL-3等抑炎因子水平明显下降。说明M细胞可以减弱中风后脑内炎症反应，改善脑内微环境。

实施例22：M细胞对眼表损伤的治疗活性评价

目前，对于严重的碱烧伤尚无有效的治疗手段，角膜移植是仍然是主要治疗手段，但是，角膜移植存在取材困难、远期植片存活率低、移植术后排斥反应等诸多困难，限制了其应用和疗效。除了角膜移植手术外，其他的手术治疗方法还包括:①自体角膜缘干细胞移植②异体角膜缘干细胞移植③羊膜移植也都存在着一些问题。本发明克服了角膜移植取材困难、移植排斥等问题，通过M细胞与材料支架的移植来进行治疗，可促进角膜上皮的愈合，角膜浑浊程度低，减少角膜血管的生成，可更为有效的修复角膜上皮组织，可用于角膜碱烧伤的治疗；

通过移植M细胞与胶原支架来对角膜碱损伤的大鼠进行治疗。将1×10 ⁵的M细胞接种在5×5mm大小的胶原支架上，每天换液，培养7天，在第7天进行移植治疗

本发明克服了角膜移植取材困难、移植排斥等问题，通过M细胞与材料支架的移植来进行治疗，可促进角膜上皮的愈合，角膜浑浊程度低，减少角膜血管的生成，可更为有效的修复角膜上皮组织，可用于角膜碱烧伤的治疗；

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

M细胞在胶原支架上的培养：将1×10 ⁵的M细胞(p4代)接种在5×5mm大小的胶原支架上，每天换液，培养7天，在第7天进行移植治疗。

动物造模：SD大鼠用5％的水合氯醛进行麻醉，麻醉后，进行造模。直径7mm的滤纸片在1mol/L的NaOH中浸泡30s，在干燥的滤纸上吸取多余的液体，放在大鼠右侧角膜中央30s,用生理盐水冲洗1min。冲洗完成后大鼠进行分组处理，并将眼睑缝合，在第3天将缝合线拆除。在第3、5、7、10、14、21天进行眼部的光学拍照，并在第21天进行取材。

分组：

对照组：NaOH组，只进行眼睑的缝合。

胶原组，放置5×5mm的胶原支架，并进行眼睑的缝合。

治疗组：M细胞组，将搭载M细胞的胶原支架放到大鼠角膜中央，并将眼睑缝合。3天后拆去缝合线，并在不同节点进行拍照，评分。

大鼠眼球的拍照：SD大鼠麻醉后，在体式镜下进行拍照，倍数调整为1.25倍，拍照时注意加比例尺，并避免长时间的强光刺激大鼠眼睛。

大鼠角膜混浊度评分：0分，完全透明的角膜；1分，角膜混浊较小，但虹膜清晰可见；2分，角膜轻度混浊，虹膜血管仍可见；3分，角膜中度混浊，瞳孔边缘有血管，但虹膜未出现血管；4分，角膜完全混浊，瞳孔不可见

标本取材：

采集标本时，大鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在大鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只大鼠需约50ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，用50ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，取下大鼠眼球，用多聚甲醛固定，存放于4℃，用于后续切片。

新生血管数目量化：

参见Joo Youn Oh et,al,Anti-inflammatory protein TSG-6reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury.2010,PNAS,107(39).16875–16880

H&E染色和免疫组织化学(IHC)

ELISA法检测相关因子浓度

结果：

大鼠眼睛光学照片如图153所示。

大鼠角膜浑浊度评分如图154所示。

大鼠取材眼球照片如图155所示。

表22-1表示不同组大鼠在第3、5、7、10、14、21天角膜浑浊度的评分统计值。

表22-1 大鼠角膜浑浊度评分

在第21天时角膜透明，瞳孔可见，有着更低的评分，并具有统计学差异，说明M细胞治疗效果明显。采用Prism 7.0统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准误(Mean±SE)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。大鼠取材发现，M细胞治疗组眼球更接近正常组，没有积液和淤血的累计。说明M细胞可以很好的减轻角膜碱烧伤动物模型的炎症情况，并促进角膜碱损伤的恢复。

通过H&E染色和免疫组织化学(IHC)检测发现，对照组中角膜损伤后第3天，中性粒细胞弹性蛋白酶表现为严重的中性粒细胞浸润。此外，在第21天观察到纤维血管角膜基质增厚。相比之下,M细胞治疗组在损伤后第3天，中性粒细胞浸润明显减少，第21天时上皮和基质恢复正常。

为了定量测量中性粒细胞浸润，通过ELISA法测定了眼角膜的髓过氧化物酶(MPO)浓度，发现M细胞治疗后，MPO浓度显著降低。

通过计算楔形面积的血管生长数目来量化角膜新生血管数目，结果显示，M细胞注射组，新生血管数目显著减少。

通过ELISA法检测整个角膜中MMP-9的水平，发现M细胞治疗组可以显著降低MMP-9的水平。

通过ELISA法检测发现，角膜损伤后第3天，对照组中，促炎细胞因子(IL-6和IL-1抑制因子)和趋化因子(CXCL1/cinc1和CCL2/MCP-1)水平显著升高。相反，M细胞治疗组中相应的因子显著低于对照组。

实施例23：M细胞对银屑病的治疗活性评价

目的：通过皮下点注射M细胞，来达到对银屑病的治疗。

达成效果：(1)缓解皮疹红斑；(2)缓解鳞屑；(3)缓解浸润程度；(4)减轻银屑病样皮炎表型；(5)减轻银屑病样皮损；(6)减少表皮棘层；(7)减少角质层厚度；

实验动物：BALB/c小鼠，雌性，雄性，7-8周龄，动物购于北京维通利华公司。

4-2M细胞的制备培养：胚胎干细胞悬EB球，进行贴壁分化，获取P0代的M细胞，进行传代筛选，在P3代进行冻存，用于后续实验。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

4-3实验方法：包括样品处理、实验步骤、具体条件/参数、先后顺序等；

4-3-1动物模型：BALB/c小鼠称重后，按体重随机分组。将BALB/c小鼠用气麻机麻醉后，剃去背部的毛发，进行分组处理，每组6只鼠。

4-3-2分组：

正常组：只剃毛，不做其他处理

咪喹莫特(IMQ)组：背部3点注射，每点50μl生理盐水。

M细胞组：背部3点注射，每点50μl生理盐水，含有1×10 ⁶的M细胞(P5代)。

以上处理记为-1天，在第0天到第6天，每天局部涂抹62.5mg的IMQ，并进行拍照，在第6天进行第二次治疗，处理同-1天。并在第8天，进行拍照灌流取材。

4-3-3标本取材：

采集标本时，小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只小鼠需约20ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，用20ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，剪去造模区域皮肤，取脾脏及淋巴结，进行固定切片分析。

4-3-4组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

4-3-5苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)HE染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

临床检查：

方法：对各组脾脏大小，淋巴结肿块数量进行比较。

实验结果：M细胞能有效的减少脾脏肿大和淋巴结(腋窝、腋侧、腹股沟)肿块明显减少。皮肤、脾脏、淋巴结内细胞组成检测。

1)细胞流式检测

(1)取出小鼠组织，用研磨器将组织研磨，吸取研磨液移入EP管中。离心机500G离心5min,弃掉上清，然后加入5ml红细胞裂解液，37℃孵育15min,再次离心，弃掉上清，调整细胞浓度为1x10 ⁶,将细胞吸入到离心管中，400G离心5min弃掉上清液，每管加入CD4抗体，涡旋震荡后，避光孵育30min。

(2)各组织所得细胞悬液一部分用H2DCFH-DA(5μM)上机检测总ROS含量

(3)另一部分使用1ml染色缓冲液洗两次后，首管加Gr1、CD11同性抗体，其余管各加2ulGr1、CD11抗体，涡旋震荡后，4℃孵育30min。

(4)加入500ulPBS重悬细胞，上机检测分析，根据CD4荧光确定CD4 ⁺T细胞门，每个标本计数10000个CD4 ⁺T，计算出T细胞总数和绝对数、中性粒细胞、树突状细胞含量。

2)免疫组织化学(IHC)染色法

2.水化：蒸馏水洗2次，每次5min(置于摇床)；

3.石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS冲洗3次，每次3分钟；

4.抗原修复液(10mM pH 6.0柠檬酸钠缓冲液)的配制：

(2)工作液的配制：A液82mL+B液18mL+蒸馏水900mL；

12.自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝；

14.显微镜拍照。

实验结果：M细胞治疗组降低了ROS水平，有效的减少脾脏中性粒细胞和树突状细胞的募集，炎性浸润细胞减少，显示M细胞具有较强的免疫调节作用。

3)特异性细胞因子和转录因子表达的检测

1、RNA的提取及RT-PCR的鉴定

采用Invitrogen的TRIZOL在通风柜中操作，进行提取RNA。

用电动研磨棒研磨样本组织，之后加到1.5ml的RNA-free管中，加入1ml的TRIZOL裂解细胞，收集到1.5ml的RNA-free的EP管中。在4℃孵育15min，每管加入500μl的三氯甲烷，涡旋振荡混匀，冰上静置10min；4℃离心，12000rpm/15min；用1ml移液枪收集液相分层的上层，转移到新的1.5ml的RNA-free的EP管中，加入与转移上层液体等量体积的异丙醇，涡旋振荡混匀，在冰上静置10min；4℃离心，12000rpm/10min；弃去上清，用75％乙醇洗涤沉淀两次，4℃离心，12000rpm/10min；弃去上清，在通风柜中干燥RNA 5-10min，干燥时间不可过长，否则降低RNA的溶解性，RNA的质量下降。加入RNA-free水，在55℃金属浴上加热10min。用Nanodrop测得RNA的浓度与OD值。

2、mRNA的反转录

(1)反转录提取的RNA 2μg，1μl的Oligo(dT)Primer，1μl的dNTP Mixture，加RNA-free水到10μl。65℃变性5min，4℃孵育3min。

(2)上述10μl的体系再加入以下试剂进行反应，总体系20μl。

(3)轻轻的混匀，42℃反应60min，70℃反应15min。

10μl反应体系

3、Real-time PCR

将反转录的cDNA稀释5倍，进行RT-PCR。

10μl反应体系

实验结果：注射M细胞可抑制IL-23诱导的皮肤促炎基因表达，抑制了促炎因子IL-6、IL-17、TNF-α的表达。

不同天数的小鼠背部图片如图156所示。

HE染色图片如图157所示。

实施例24：M细胞对阿尔茨海默病的治疗活性评价

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年期最常见的慢性病之一。全世界有3500 多万人受其影响。AD临床表现为进行性记忆丧失和认知功能障碍。阿尔茨海默病与两种致病特征有关，即细胞外淀粉样蛋白(Amyloid beta,Aβ)沉积和细胞内神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NTFs)，伴随神经炎症和广泛的神经元和突触丢失，导致进行性记忆丧失和认知功能障碍。目前还没有特效药能治愈阿尔兹海默病或者有效逆转疾病进程，联合使用药物治疗、非药物治疗和细心护理等能够减轻和延缓病情发生。因此，研发可以治愈AD或者延缓AD的有效治疗策略是很重要的。目前，已经上临床试验的主要是药物研究，临床Ⅲ期有200多项。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)临床试验有10项，处于临床Ⅰ期、Ⅱ期。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

实验动物：APP/PS1小鼠和C57bl/6小鼠雄性，7月龄，动物购于上海南方模式生物研究中心和北京斯贝福生物技术有限公司。所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

饲养条件：自由进食、饮水；12/12h昼夜交替，7:00-19:00为白昼，室温22±2℃，相对湿度在50％-60％。小鼠适应性喂养一周后开始实验。

实验分组：正常对照组、APP/PS1+溶剂、APP/PS1+M细胞，每组6只。

实验材料：手术器械、5-0手术缝合线、小鼠体重秤

实验试剂：生理盐水、碘伏、异氟烷

仪器设备：R540增强型小动物麻醉机、脑立体定位仪、微量注射泵、水迷宫

耗材/试剂/仪器	生产厂家	货号/型号
5-0手术缝合线	上海玉研科学仪器有限公司
异氟烷	瑞沃德	970-00026-00
碘伏	杭州朗索医用消毒剂有限公司
生理盐水	国产
R540增强型小动物麻醉机	瑞沃德	R540
脑立体定位仪	瑞沃德	69100
微量注射泵	瑞沃德	788130

水迷宫

Noldus

实验方法：包括样品处理、实验步骤、具体条件/参数、先后顺序等；

实验步骤：将麻醉机刻度线调至2.5，将小鼠放入盒子内，深度麻醉后，使用脑立体定位仪俯卧位固定小鼠，用碘伏擦拭小鼠大脑皮肤，剪口1cm，按下述位置定位：AP:-2.06,ML:±1.75,DV:-1.75相对于前囟，用微量注射泵进行注射，APP/PS1+溶剂双侧海马各注射1μl生理盐水，APP/PS1+M细胞双侧海马各注射1μl M细胞：5×105/1μL，注射10分钟，注射完毕后，留针5分钟，拔针，缝合皮肤即可。

水迷宫行为学：在术后24-27天进行水迷宫训练，包括获得性训练和探查训练。获得性训练包括(1)将小鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间(秒)。在前几次训练中，如果这个时间超过60秒，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10秒。(2)将动物移开、擦干，放回笼内。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔15-20分钟,连续训练5天。探查训练，在最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始60秒的探查训练。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。训练完成后，在第28天进行水迷宫检测。

结果：水迷宫可以客观的衡量动物(受试者)的空间记忆、工作记忆以及空间辨别能力的改变。小鼠穿越站台的统计和首次到达站台所花费时间的统计结果均表明M细胞可以有效改善小鼠(受试者)空间学习记忆能力。

表24-1、图158表示小鼠穿越站台总次数统计。正常对照组总穿越次数为1次，与正常对照组相比，溶剂组小鼠总穿越次数为0次，具有显著差异，*p＜0.05；M细胞组小鼠总穿越次数为0.66次，显著多于溶剂组，说明M细胞有效改善小鼠空间学习记忆能力。

表24-1 小鼠穿越站台总次数统计。

表24-2、图159表示小鼠首次到达站台所花费的时间的统计。M细胞组较溶剂组小鼠花费时间明显减少(38.0 vs 59.8秒)，说明M细胞有效改善小鼠空间学习记忆能力。

表24-2 小鼠首次到达站台所花费的时间的统计

淀粉样沉淀(Aβ)病理检测

方法参照已发表文献Paolicelli et al.,2017

对小鼠的切片荧光染色结果统计，无论单位面积内斑块数量和所占比，注射M细胞的模型鼠都显著小于对照组。说明M细胞可以降低淀粉样沉淀的累积，从而降低其对神经的不利影响。

大脑中炎症检测

方法参照已发表文献Paolicelli et al.,2017

利用ELLSA和WB检测炎症因子IL-6，Tnf-α，iNOS等，发现注射M细胞的模型鼠炎症因子的指标都显著小于对照组。说明M细胞可以降低小胶质细胞像促炎症形式转化，防止小胶质细胞过渡激活及功能紊乱。

免疫荧光染色检测：

方法参照已发表文献Pan et al.,2019

利用免疫荧光染色，对小胶质细胞的标记物进行检测，发现注射M细胞的模型鼠小胶质细胞的吞噬能力显著高于对照组。说明M细胞可以提高小胶质细胞吞噬能力，清除淀粉样沉淀与凋亡的细胞碎片。

发现注射M细胞的模型鼠A1型星型胶质细胞单位面积内数量小于对照组。说明M细胞抑制AD大脑炎症环境中A1星型胶质细胞的产生，抑制过渡激活的免疫。

同时还发现神经元(TUJ1+)数量增加，说明注射M细胞能够提高神经的存活，改善认知与记忆。

巴恩斯迷宫实验：

方法参照已发表文献Zhang et al.,2019

测试发现注射M细胞的模型鼠神无论是训练寻找平洞口，还是测试到达洞口时间与穿越次数成绩优于对照组。说明说明注射M细胞能够改善AD鼠(受试者)的记忆与认知的缺陷。

实施例25：M细胞对关节炎的治疗活性评价

骨关节炎(OA)已成为越来越普遍的关节疾病。已知，可使用一些抗发炎药物、镇痛剂、或润滑补充剂治疗OA，另可选择地，还可以一种包括钻孔、微骨折和自体骨软骨镶嵌移植术(mosaicplasty)的手术，进行缺损部位的修复或重建以治疗OA，但这种方式仅能暂时改善症状，无法永久治愈或使退化组织再生。

本实施例评价了M细胞对骨关节炎的治疗活性。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

试剂/设备	厂家	货号
R540增强型小动物麻醉机	瑞沃德	R540
异氟烷	瑞沃德	970-00026-00
一次性使用无菌注射器1ml	江苏治宇医疗器材有限公司	无
一次性使用无菌注射器5ml	江苏治宇医疗器材有限公司	无
生理盐水	石家庄四药	无
多聚甲醛	LEAGENE	DF0135
碘乙酸钠	Sigma	S104897-5g

动物造模：SD大鼠用气麻机麻醉后，剃去左侧关节的毛发，用喷有酒精的纱布擦拭，之后用1ml的注射其在关节腔注射50μl的MIA溶液，进行造模。每组6只鼠，进行分组处理，并在第21天进行取材分析。

分组：正常组、模型组、M细胞组。

正常组：不做任何处理。

模型组：第0天关节腔注射50μl碘乙酸钠(MIA)，第7、14天关节腔注射100μl的生理盐水。

M细胞组：第0天关节腔注射50μl碘乙酸钠(MIA)，第7、14天关节腔注射100μl的生理盐水含有3×10 ⁶的M细胞。

MIA的配置：碘乙酸钠(MIA)溶于生理盐水中，取1mg的MIA溶于1ml的生理盐水中，配置成浓度为100μg/μl MIA溶剂。

强迫步行评估(旋转杆测试)

将动物随机放在不断增加速度的旋转圆柱体上(Roto-rod)，迫使它们连续行走以避免跌倒，性能指标主要是包括患肢的运动学习和使用。首先是将实验鼠在旋转杆上放置5分钟，以适应该设备。适应期过后五分钟，将实验鼠再次置于Roto-rod上，并在5分钟的范围内将转速从5rpm增加到35rpm。跌落的等待时间由设备底部的机械传感器自动测量。在所有动物的第1天，以及在诱导后第7、14、21和28天评估动物运动活性的结果。

实验结果

实验结果表明：M细胞组的评分相对于模型组的评分较高、说明经过M细胞进行治疗后可以相对的改善骨关节炎的运动活性。

触觉性异常性疼痛评估(Von Frey test)

将实验鼠放在单个丙烯酸透明盒中，底面为5mm ²的网状网络格的适应环境中，在实验前先将1毫米粗的不可磨金属丝放置15分钟。在实验箱下方25厘米处放置镜子，以方便在后肢的足底区域观看。通过网格的孔，人员在后肢的中央区域施加线性增加的压力，直到对后肢进行刺激直到产生退缩反应。在同侧和对侧后肢中重复进行多达六次刺激，直到在动物表现出三次相似的后肢退缩反应。

实验结果

M细胞组的实验鼠产生退缩性反应的时间明显相较于模型组偏后，说明其可承受的刺激性压力明显强于模型组，M细胞在对其神经产生疼痛反面方面的抑制作用有相应的效果。

X射线照射评估

骨关节炎大鼠分别在给M细胞当天，第二次给细胞之前，以及取材时进行CT拍摄。CT拍摄：将实验鼠麻醉后置于CT台上进行固定，并保证X射线可以全过程照射在损伤腿上进行拍摄。拍摄后根据图像进行分析。

实验结果

大鼠关节光镜图片见图160。模型组可见明显的关节间隙变窄，关节表面不规则，关节软骨糜烂，可见骨赘。M细胞组关节表面不规则程度较低、关节软骨受侵蚀较轻微，轻微骨赘。说明M细胞对于骨关节炎在其组织损伤的影响上有部分效果。

标本取材

采集标本时，大鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在大鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只大鼠需约50ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，用50ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，剪去造模处关节部位，进行固定切片分析。

Safranin-O/Fast green染色和OARSI评分

工作液：0.1％番红染液：0.1g+100ml ddwater

0.15％固绿染液：0.15g+100ml ddwater

1％冰醋酸：2ml冰醋酸+198ml ddwater

步骤:制备石蜡切片，60℃烤片过夜后，依次浸入二甲苯、酒精、ddwater中，之后用Safranin O染色。内浸染4min，自来水中提拉3次在固绿染色液内浸染4min，自来水洗1min用冰醋酸溶液洗涤切片1-2min，自来水洗1min分别用95％乙醇、无水乙醇脱水10-15s后进行树胶封片。

使用国际骨关节炎研究协会OARSI推荐方法(总分0～24)对软骨退变进行评估。简单来说是将内侧胫骨平台软骨损伤深度和范围分别划分为6和4个等级，级数相乘即为得分，每个样本由3位观察者独立评分后取均值。

实验结果

模型组可见深及中层软骨的小范围缺损后期达到钙化软骨，M细胞治疗组软骨缺损深度较浅后期达到深层软骨，面积小于模型组，且OARSI评分低于模型组。

Ⅱ型胶原免疫组化及半定量分析

切片脱蜡、复水、抗原修复后，在4℃环境中敷大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(Santa Cruz)14～18h。次日将切片复温，并按说明书操作DAB免疫组化试剂盒(R&D system)，结束后脱水封片。使用Image Pro Plus 6.0软件计算内侧胫骨平台软骨层的累计阳性积分IOD，以及检测区域面积Area，以IOD/Area代表Ⅱ型胶原阳性程度。

实验结果

相较于M细胞治疗组模型组胫骨平台软骨层Ⅱ型胶原丢失更明显。

实施例26：M细胞对骨折的治疗效果评价

骨折是指骨结构的连续性部分或完全断裂，是一种临床上常见的骨损伤，多见于儿童及老年人，中青年人也时有发生，常为单发骨折，少数为多发性骨折，经及时恰当处理，多数能恢复原来的功能，少数病人可遗留不同程度的后遗症。发生骨折的主要原因可能是暴力直接或间接(通过纵向传导、杠杆作用或扭转作用等使暴力点远处骨骼同时发生骨折)作用于骨骼某一部位而致该部位骨折，常伴不同程度软组织损伤；长期、反复、轻微的直接或间接损伤可致使肢体某一特定部位骨折，又称疲劳骨折，也常见于多种职业病；此外，部分骨骼相关的遗传性疾病或结缔组织疾病也会伴有多发骨折的临床症状。骨折患者的典型临床表现是局部肿胀、变形、疼痛、淤血等，肢体等出现异常运动或运动障碍。

在骨折传统治疗中，复位、固定和功能锻炼是三项基本原则。然而，针对严重的骨损伤，传统骨折治疗，并不能良好的治愈，或治疗后造成畸形。因此，对于损伤或疾病引起的骨损伤，常依靠自体和同种异体骨移植进行骨修复。自体骨移植修复效果好，但存在自体供应移植骨量有限，需进行二次手术且术后并发症高达8％等局限性；而同种异体骨移植配型困难，且存在严重的免疫排异现象，并不是最理想的骨修复选择。

参考文献：

Mesenchymal stem cell sheet transplantation combined with locally released simvastatin enhances bone formation in a rat tibia osteotomy model；

Mesenchymal stem cell-conditioned medium facilitates angiogenesis and fracture healing in diabetic rats；

SYSTEMIC MESENCHYMAL STEM CELL ADMINISTRATION ENHANCES BONE FORMATION IN FRACTURE REPAIR BUT NOT LOAD-INDUCED BONE FORMATION；

Adipose derived pericytes rescue fractures from a failure of healing-non-union。

达成效果：通过M细胞移植，加速骨损伤部位的愈合，实现对骨损伤治疗效果。

实验动物：SD大鼠，雄性，12周龄，动物购于北京维通利华公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

标本取材：

采集标本时，大鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在大鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只大鼠需约50ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，用50ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，减去损伤部位的骨头，用多聚甲醛固定，进行切片分析。

造模：12周龄的老年SD大鼠，麻醉后，用微型手持颅钻，在大鼠左后肢进行钻孔，孔径为3mm，造模完成后进行分组处理，每组6只鼠。

模型组：在肌肉周围进行100ul生理盐水的注射。

M细胞组：同时在肌肉周围进行100ul生理盐水的注射含有3×10 ⁶个P5代M细胞。之后分别在第10天，22天和50天进行小动物CT拍照观察，结果见图161-163。

小动物CT的使用：将大鼠麻醉后，固定至PE Quantum FX仪器扫描位置。对大鼠骨损伤位点附近进行Micro-CT扫描。扫描条件为：源电压90kV、深度14bit、分辨率FOV为60mm，扫描时间为Fine 2min。以0°旋转进行扫描。

实验结果：在第10天的CT图中可以看出，M细胞治疗组的大鼠骨损伤的愈合相比模型组有较好的趋势；在第22天的CT图中可以看出，M细胞治疗组的大鼠骨损伤的愈合相比模型组有明显的优势，骨损伤面积更小，说明M细胞移植可以加速骨损伤的愈合，M细胞对骨损伤有很好的治疗作用；在第50天的CT图中可以看出，M细胞移植治疗组的骨损伤部位，已经完全愈合，而模型组，还未完全愈合。说明M细胞可以很好的治疗骨损伤。

X射线检查:将大鼠麻醉后，将其放置在高分辨率数字放射照相系统(Faxitron MX-20)中，使用32kV的电压持续10s。股骨骨折的愈伤组织宽度通过X射线照相通过Image-Pro Plus软件进行分析测定。

通过上述可以看出，M细胞治疗组对比模型组可以明显看出骨损伤的愈合时间少于模型组，M细胞治疗组骨损伤早于模型组先一步进行愈合，愈伤组织大小明显大于模型组，孔洞间隙更小，说明M细胞可以明显的加速骨损伤的愈合速度。

骨损伤愈合后骨密度的测定：骨密度测定的原理是通过X射线管球经过一定的装置所获得两种能量、即低能和高能光子峰。此种光子峰穿透身体后，将扫描后的信号送至计算机进行数据处理，得出骨矿物质含量。

通过Micro-CT分析：M细胞组的骨矿物质密度相对于模型组较优。

四点弯曲机械测试实验：将实验组织取材完成后，将切除后的组织24h内在室温下进行测试；通过四点弯曲装置(H25KS)；以5mm/min的恒定位移速率测试组织样本是否破裂。胫骨沿前后的方向放置在内部和外部跨度分别为8毫米和20毫米的刀片内。在测试过程中，胫骨的长轴垂直于刀片定向。测试完成后，通过内置软件(QMAT Professional Material测试软件)。记录并分析了极限荷载到破坏，破坏吸收的能量(载荷-位移曲线下的面积，称为韧性)，和分析弹性模量(E-模量，应力-应变曲线的斜率，称为组织刚度)。愈合性骨折的生物力学性能表示为对侧完整骨性能的百分比。

四点弯曲力学测试结果，明显表明M细胞治疗组的韧性、最终破坏载荷(F)和E-模量(G)均高于模型组。说明M细胞治疗后会加强其力学方面性能的恢复。

组织学分析(HE染色)：将取材后的胫骨在4％的福尔马林缓冲液中固定1天，然后用9％的甲酸脱钙5-7天。尝试通过使用切片刀将样品切成两半(纵向在矢状平面内)，以使每个样品在矢状中平面处的切片标准化。对样品进行组织处理，然后包埋在石蜡中。在旋转切片机(HM 355S)上沿矢状平面中每个胫骨的长轴切成薄片(7μ)。将切片安装在涂覆的载玻片上。通过将载玻片浸入二甲苯中(室温下两次，每5分钟进行一次更换)来去除石蜡。然后将载玻片通过浸入梯度的乙醇和蒸馏水，然后用苏木精和曙红(H&E)进行染色，最后脱水、固定。

HE分析结果：在M细胞组中的孔洞处已出现部分联合、虽然在未愈合的部位的愈伤组织中仍存在成熟骨细胞、软骨组织、纤维组织以及未分化组织，但其相对量高于模型组。说明M细胞对各种骨细胞的生成有其促进的作用。

免疫组织化学：将组织切片用PBS浸洗三次，后浸润在TBS封闭液((0.3％)Triton+(5％)BSA+PBS)30min，再在抗体稀释液((0.3％)Triton+(1％)BSA+PBS)+加一抗(rabbit anti-GFP；1：300)中浸泡过夜，PBS进行清洗两次，每次5min，之后在抗体稀释液和二抗(Cy3goat anti-rabbit IgG；1：1000)浸泡2h后使用DAPI进行10min核染，PBS进行清洗两次，每次5min，后进行观察拍照、使用ImageJ进行细胞定量。

免疫组织化学分析结果：观察到的成骨细胞的转录因子在M细胞治疗组中的含量多于模型组中的含量，去帮助骨损伤的愈合。

以下为筛选得到的优选的细胞剂量方案：

100ul生理盐水悬液1×10 ⁶的M细胞；

50ul生理盐水悬液1×10 ⁶的M细胞；

100ul生理盐水悬液3×10 ⁶的M细胞；

50ul生理盐水悬液3×10 ⁶的M细胞；

100ul生理盐水悬液5×10 ⁶的M细胞；

50ul生理盐水悬液5×10 ⁶的M细胞。

实施例27：M细胞对鼻炎的治疗活性评价

过敏性鼻炎(Allergic rhinitis,AR),又称变应性鼻炎,是常见的耳鼻咽喉科疾病,也是常见的呼吸道变应性疾病。该病是发生于鼻粘膜的变应性疾病,以鼻痒、喷嚏、鼻溢清涕、鼻粘膜肿胀为主要特点。过敏性鼻炎的患病率在10％-40％，其中花粉过敏症多见于欧洲和北美,常年性的过敏性鼻炎多见于亚洲。虽然过敏性鼻炎并不致死,但由于患者的鼻子和全身不适感很明显,影响患者的学习和工作。如果得不到正确的治疗,约30％的患者会发展为支气管哮喘,甚至肺心病等严重影响患者身体健康和生活质量的疾病。皮质类固醇和抗组胺药是目前治疗过敏性鼻炎的一线药物。过敏性鼻炎是在体外环境因素作用由IgE介导的,以鼻腔黏膜的免疫反应为主的变应性炎症反应。

参考文献：

Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cell Modulates the Immune Response of Allergic Rhinitis in a Rat Model。

本实施例评价了M细胞对鼻炎的治疗效果。实验结果显示，移植M细胞后，小鼠的打喷嚏和挠鼻子的次数明显减少；鼻炎症状有明显的好转。

M细胞的制备培养：胚胎干细胞悬EB球，进行贴壁分化，获取P0代的M细胞，进行传代筛选，在P3代进行冻存，用于后续实验。复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

试剂/设备	厂家	货号
卵清蛋白	Sigma	S25067-25g
氢氧化铝	Sigma	239186-500G
10μl枪头	Axygen	YC-HC01019
1ml枪头	Axygen	TF-1000-R-S
0.5-10μL	eppendorf	1449888
1000μL移液枪	eppendorf	J46096F
一次性使用无菌注射器1ml	江苏治宇医疗器材有限公司	无
一次性使用无菌注射器5ml	江苏治宇医疗器材有限公司	无
生理盐水	石家庄四药	无
多聚甲醛	LEAGENE	DF0135

动物造模及治疗：利用BALB/c小鼠进行鼻炎造模，分为正常组、模型组、M细胞组，每组6只鼠。

正常组：不做任何处理。

模型组：在第0、3、7天腹腔注射含有OVA的乳剂200μl，在第7到14天，每侧鼻内滴加10μl溶液含有OVA 100μg，第14、17天静脉注射100μl生理盐水，第21天进行取材分析。

M细胞组：在第0、3、7天腹腔注射含有OVA的乳剂200μl，在第7到14天，每侧鼻内滴加10μl溶液含有OVA 100μg，第14、17天静脉注射100μl生理盐水含有3×10 ⁶的M细胞，第21天进行取材分析。

检测方法及结果：

1)打喷嚏与挠鼻子的评价：

小鼠每侧鼻孔滴加10μl含有OVA 100μg的溶液，适应5分钟后，在空笼子中进行5分钟内打喷嚏与挠鼻子次数的统计，详见表27-1、表27-2、图164和图165。

表27-1 对小鼠在第21天刺激后，5分钟内打喷嚏统计数值

表27-2 对小鼠在第21天刺激后，5分钟内挠鼻子次数的统计数值

2)酶联免疫吸附试验(ELISA)

(1)包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度(5～20ug/ml)各0.3ml加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或37℃水浴2～3小时，贮存冰箱。

(2)洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。

(3)加被检标本：每凹孔加入用含有0.05％吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清各0.2ml，37℃，作用1～2小时。

(4)洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。

(5)加入酶结合物：每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物0.2ml 37℃作用1～2小时。

(6)洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。

(7)加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟(另作一空白对照，0.4ml底物加0.1ml终止剂)。

(8)加终止剂：每凹孔加2M H ₂SO ₄或2M柠檬酸0.05ml。

(9)观察记录结果：目测或用酶标比色计测定(OPD用492nm)OD值。

实验结果：M细胞治疗组特异性IgE、IgG1、IgG2a较AR模型组明显降低，PGE2水平较AR模型组显著增高，组胺水平较AR模型组显著降低。结果表明注射M细胞可降低血清抗原特异性抗体应答水平，降低炎症介质表达。

3)组织病理学检查

3-1标本取材：

采集标本时，小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只小鼠需约20ml的生理盐水，生理盐水灌注完成后，用20ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，取小鼠鼻腔，进行固定切片分析。

3-2组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

3-3苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

实验结果：OVA致敏原给药后鼻粘膜结构发生明显变化，上皮细胞丢失，粘膜脱落炎性细胞浸润炎症，血管减少。M细胞治疗后上皮细胞增多，少量细胞浸润，血管数量增多。结果显示M细胞可促进炎症部位血管生成，促进上皮细胞生成，降低炎性细胞浸润。

3-4 Masson’s染色

操作步骤：

(1)石蜡切片、脱蜡至水；

(2)1％高锰酸钾氧化切片5min；

(3)水洗，草酸漂白1min；

(4)水洗，蒸馏水洗；

(5)天冬石蓝染5min；

(6)水洗，甩去余液；

(7)滴染Mayer苏木素3-5min；

(8)流水冲洗5-10min；

(9)丽春红苦味酸饱和液染5min；

(10)1％醋酸水溶液洗；

(11)1％磷钼酸分化切片约5min；

(12)蒸馏水洗；

(13)1％甲苯胺蓝滴染30s；

(14)1％醋酸水溶液洗；

(15)95％乙醇分化；

(16)无水乙醇脱水；

(17)二甲苯透明；

(19)中性树胶封片。

实验结果：鼻炎模型组鼻粘膜基底板和固有层有明显胶原纤维聚集，胶原纤维沉积，M细胞治疗组鼻粘膜固有层胶原纤维较少，胶原纤维沉积明显减少显示M细胞可改善鼻炎上皮纤维化。

3-5透视电镜检测

方法：样品用1％奥司马酸固定30min，用PBS洗涤3次(每次10min)。用乙醇(30％、50％、70％、90％和无水乙醇)对样品进行脱水，每次浓度为30min。样品经丙酮浸泡1h后嵌入502树脂中。塑料模具采用切片机切割，用1％甲苯胺蓝染色。经半薄切片检查后，切取超薄切片(50～60nm厚)，用醋酸铀酰染色，再用柠檬酸铅染色，用透视电子显微镜对其进行检测和拍照。

实验结果：模型组上皮细胞表面破损严重，鼻纤毛减少，胞质空泡化核断裂，肥大细胞增多，粒细胞浸润。M细胞治疗组鼻粘膜上皮表面完整，纤毛完整，细胞器形态正常，成纤维细胞正常，胞浆胞质完整。

实施例28：M细胞对移植物抗宿主病的治疗活性评价

移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)主要是由于移植后异体供者移植中的T淋巴细胞，经过受者体内相关细胞因子的影响，增强了对受者抗原的免疫反应，以受者靶细胞为目标发动的细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标，而GVHD的发生主要有以下3点:(1)移植物中含有免疫活性细胞；(2)供体和受体的组织相容性抗原不同；(3)供体免疫活性细胞因不被排斥而存活，并识别不同组织相容性抗原而分裂增殖。一般认为参与GVHD的免疫活性细胞是混入的成熟T细胞，而且它混入率越高，发生GVHD的几率越大。

目前以类固醇、免疫抑制因子及单克隆抗体等作为治疗GVHD的一、二线药物。通过糖皮质激素治疗，其作用的机制是抑制T淋巴细胞介导的对受体的免疫攻击反应，但激素疗法却并不十分理想，大量激素治疗会增加机体感染和肿瘤复发率，因此治疗GVHD需要更加安全而有效的新疗法。近年来，间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSCs)的研究是现代生物领域中的热点，其作为一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，在一定诱导条件下可分化成多种功能细胞和组织器官，利用干细胞增殖和异性分化的能力，可为临床上的难治疗性疾病带来新希望，同时也渐渐成为现代临床医学中新的治疗方式。有研究发现MSCs可以通过抑制T细胞的增殖来抑制炎症反应，其具有免疫和炎症调节作用，这为治疗GVHD提供了新的研究方向。

大量动物实验均表明MSCs移植治疗GVHD展示出很好的疗效和安全性。然而，成体组织来源MSC临床应用中主要存在如下缺点：(1)无法从单个个体组织获得治疗量的成体组织来源MSC；(2)成体组织来源MSC来源于不同的个体组织，无法实现产品质量的一致性；(3)即使同一个体组织来源的MSC也具有高度异质性；(4)成体组织来源MSC的供体组织来源复杂，具有潜在的传染性病原体感染风险；(5)成体组织来源MSC随着体外扩增会迅速衰老。因此，需要新的MSC细胞来源，用于治疗GVHD。

参考文献：

(1)Functional dosing of mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles for the prevention of acute graft-versus-host-disease。

(2)Optimization of the Therapeutic Efficacy of Human Umbilical Cord Blood-Mesenchymal Stromal Cells in an NSG Mouse Xenograft Model of Graft-Versus-Host Disease。

(3)An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation:I.The roles of minor H antigens and endotoxin。

(4)Highly Sensitive Model for Xenogenic GVHD Using Severe Immunodeficient NOG Mice。

本实施例评价了M细胞对GVHD的治疗活性，并参考上述文献制定了本实施例的实验方案。

实验动物：NCG小鼠，雄性，6周龄。动物购于北京维通达生物技术有限公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，用于后续实验。

动物模型制备：

(1)小鼠经1.75G y射线照射6h后，鼠尾静脉移植5×10 ⁶hPBMC.

(2)实验分组：

对照组：不进行射线照射；

GVHD组：射线照射并移植hPBMC后第2、5、8天只注射生理盐水；

GVHD+低剂量M细胞组：射线照射并移植hPBMC后第2、5、8天鼠尾静脉注射1.5 ×10 ⁶M细胞；

GVHD+高剂量M细胞组：射线照射并移植hPBMC后第2、5、8天鼠尾静脉注射5×10 ⁶M细胞；

(3)测量体重，直至第14天；统计存活率，直至第19天。在第19天取骨髓，并进行灌流取肾脏、结肠、肺和肝脏，取材样本在多聚甲醛中浸泡过夜，之后进行石蜡切片，并进行HE染色。

标本取材：

采集标本时，小鼠腹腔麻醉后，俯卧位，在小鼠背部正中剪开皮肤，取骨髓。在小鼠腹部正中剪开皮肤，打开腹腔，中央静脉取血。开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，生理盐水灌注完成后，用50ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，取肾脏、结肠、肺和肝脏，进行固定切片分析。所取血液5000rpm室温离心15min，取上清，用于多因子ELISA分析。

流式检测骨髓中人CD45阳性细胞浸润

(1)无菌抽取骨髓液0.5ml。

(2)将骨髓标本滴入含1000U/mL肝素抗凝剂的1mL PBS液中。

(3)再加入PBS液稀释至10mL。

(4)用吸管吸取5mL稀释骨髓液徐徐加入盛有4mL的人类淋巴细胞分离液液面之上。

(5)在以上条件下，骨髓有核细胞分层在PBS人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上。

(6)吸取有核细胞层，加入到10mL PBS液中，混匀。

(7)以1000r/min离心5min。

(8)弃上清，用PBS重悬后用细胞筛过滤，滤去细胞团，计数，按每管2×10 ⁶分装。

(9)1200rpm离心3min。

(10)用2％BSA封闭液封闭20min后，1200rpm离心3min。

(11)弃上清，用1％BSA抗体稀释液100μL重悬细胞后，加入直标抗体，常温孵育30-45min。

(12)用1mL PBS洗三遍，1200rpm离心3min，弃上清。

(13)300μL PBS重悬后，用40μm细胞筛过滤后上机检测。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

悬液芯片系统检测炎症因子：

(1)开机Bio-Plex 200预热30min。将试剂盒放到室温，稀释液、洗液、检测液、标准品HB、检测抗体稀释液HB、样本稀释液HB放到室温，其他的试剂放到4℃。使用23因子试剂盒进行炎症因子的检测。

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μL的磁珠。

(8)用100μL的洗液洗板两次。

(12)用100μL的洗液洗板两次。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μL。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μL的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μL。

(20)用100μL的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

统计分析

二、实验结果

表28-1 各组体重变化率的统计表。

表28-2 各组小鼠存活数量的统计表。

表28-3 各组小鼠骨髓嵌合率统计表。

(1)体重监测结果表明，第14天时，GVHD组体重明显低于对照组(***p＜0.001)；GVHD组与低剂量M细胞组无明显差异，但明显低于高剂量M细胞组(**p＜0.01)；低、高剂量M细胞组体重无明显差异(表28-1，图170)。结果表明，M细胞可以提高GVHD小鼠体重。

(2)生存率统计结果显示，对照组与GVHD组生存率存在明显差异(***p＜0.001)；GVHD组与GVHD+高剂量M细胞治疗组生存率存在明显差异(**p＜0.01)(表28-2，图171)。结果表明，M细胞可以提高GVHD小鼠的生存率。

(3)第14天时，取骨髓，流式检测人和小鼠CD45阳性细胞，比较各组骨髓嵌合率。小鼠骨髓嵌合率结果显示，GVHD+高剂量M细胞组骨髓嵌合率明显低于GVHD组(*p＜0.05)，说明M细胞通过减轻hPBMC在骨髓的浸润减轻GVHD(表28-3，图172)。结果表明，M细胞可以降低GVHD小鼠的人CD45阳性细胞骨髓嵌合率。

(4)第14天时，取肠、肾、肝和肺进行石蜡切片后HE染色，结果显示，GVHD+低/高剂量M细胞的肠的隐窝结构明显优于GVHD组，有较完整的肠隐窝结构。GVHD+低/高剂量M细胞组各器官的炎症细胞浸润明显低于GVHD组，说明M细胞具有抑制炎症和维持组织结构完整的功能(图173)。结果表明，M细胞可以降低GVHD小鼠的炎症反应和组织损伤。

(5)小鼠血清炎症因子检测结果显示，与GVHD组比较，M细胞治疗组的促炎症因子水平明显降低，抑炎症因子水平明显升高。表明，M细胞有抑制炎症的作用。

非专利文献：

1.Functional dosing of mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles for the prevention of acute graft-versus-host-disease。

2.Optimization of the Therapeutic Efficacy of Human Umbilical Cord Blood-Mesenchymal Stromal Cells in an NSG Mouse Xenograft Model of Graft-Versus-Host Disease。

3.An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation:I.The roles of minor H antigens and endotoxin。

4.Highly Sensitive Model for Xenogenic GVHD Using Severe Immunodeficient NOG Mice。

专利文献：

1.具有增强的免疫抑制的间充质谱系前体或干细胞(CN201880036997.2)

2.选择用于治疗免疫病症的高效干细胞的方法(CN201780077281.2)

3.hAMSCs在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的用途(CN201811145836.5)

4.调节干细胞的免疫调节作用的方法(CN201811227664.6)

5.一种间充质干细胞在制备治疗M5型白血病药物中的应用(CN201610208206.2)

6.调节干细胞的免疫调节作用的方法(CN201380072996.0)

7.一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用(CN201410188453.1)

8.一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂及其制备方法(CN201110041925.7)

实施例29：M细胞对原发性卵巢功能不全治疗活性评价

POI的病因包括遗传、免疫、医源性(放化疗、免疫抑制剂和手术治疗等)等，但大部分POI原因不明。POI可能与多种内分泌疾病有关，包括甲状旁腺功能减退和肾上腺素功能减退。骨盆手术也可能导致卵巢功能受损。大约4％POI的患者存在肾上腺或卵巢抗体，说明这种疾病存在自身免疫性。在许多病例中，其机制尚不清楚 ^[1]。POI可致女性生育能力丧失，增加骨质疏松、脂代谢紊乱和心血管疾病的风险。生育期提早闭经，丧失生育能力，会增加女性心理负担，降低婚姻生活质量，从而产生一系列严重的心理和社会问题。

患者一旦确诊为POI，其治疗手段非常有限。目前主要治疗措施主要包括激素替代治疗、免疫抑制治疗、中西医结合治疗、心理治疗、接受赠卵、卵巢组织及卵巢移植。这些方法虽然有一定效果，但是都不能从根本上修复受损的卵巢功能，恢复患者的生育力。激素替代治疗可以缓解激素缺乏的临床症状，但长期应用雌孕激素的副作用会使患者难以长期应用。已有免疫抑制治疗免疫因素导致的POI而获得妊娠的报道，但免疫抑制治疗可引起严重副作用，临床上并不推荐盲目应用免疫抑制剂治疗POI。中药辅助治疗可以改善一些临床症状。赠卵辅助生殖技术可以实现生育愿望，但卵源极缺的现状限制了其在解决POI患者生育问题中的应用。上述方法都不能从根本上治疗原发性卵巢功能不全，恢复POI患者的生育力。

随着干细胞疗法的不断推广，今年已有多个研究组通过动物实验尝试干细胞治疗POI的安全性和有效性。Johnson等研究发现骨髓间充质干细胞经腹腔移植可以直接到达损伤的卵巢，减少颗粒细胞凋亡，修复化疗药物引起的卵巢损伤，从而改善卵巢功能。姚元庆教授的研究团队将脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)移植到POF小鼠，结果发现卵巢颗粒细胞凋亡减少，卵泡数量增加，卵巢功能恢复，性激素水平升高，但脐带间充质干细胞不能分化形成卵泡。上述研究提示干细胞具有修复受损的卵巢组织改善卵巢功能的作用。

但是，各种来源成体组织来源MSC在实际临床应用中也存在较多问题，如单个组织来源的MSC数量有限；不同组织来源MSCs存在高度异质性；供体组织来源个人，具有潜在的病原体感染风险；体外扩增时迅速衰老。以上缺点使组织来源MSCs无法标准化制备，细胞质量无法得到保证。随着胚胎干细胞诱导分化体系和培养方法逐渐成熟，胚胎干细胞能够在体外稳定分化形成间充质样细胞，从而弥补直接应用胚胎干细胞及成体组织来源MSCs的缺点，满足标准化制备和细胞成药标准。

本发明克服MSCs在临床应用中的局限，使用标准化程度更高的M细胞，治疗化学药物诱导的POI小鼠模型，为临床治疗POI提供更安全和有效的依据。

参考文献：

[1]Committee opinion no.605:primary ovarian insufficiency in adolescents and young women[J].Obstet Gynecol,2014,124(1):193-197.

[2]Tavassoli M,Crosby WH.Transplantation of marrow to extramedullary sites[J].Science,1968,161(3836):54-56.

[3]Johnson J,Bagley J,Skaznik-Wikiel M,et al.Oocyte generation in adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow and peripheral blood[J].Cell,2005,122(2):303-315.

[4]Wang S,Yu L,Sun M,et al.The therapeutic potential of umbilical cord mesenchymal stem cells in mice premature ovarian failure[J].Biomed Res Int,2013,2013:690491.

[5]Gibson,J.D.,et al.,Regeneration of Articular Cartilage by Human ESC-Derived Mesenchymal Progenitors Treated Sequentially with BMP-2 and Wnt5a.STEM CELLS Translational Medicine,2017.6(1):p.40-50.

[6]Gonzalo-Gil,E.,et al.,Human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells ameliorate collagen-induced arthritis by inducing host-derived indoleamine 2,3 dioxygenase.Arthritis Res Ther,2016.18:p.77.

[7]Ninagawa,N.T.,et al.,Transplantated mesenchymal stem cells derived from embryonic stem cells promote muscle regeneration and accelerate functional recovery of injured skeletal muscle.Biores Open Access,2013.2(4):p.295-306.

[8]Zhang,Y.,et al.,Improved cell survival and paracrine capacity of human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells promote therapeutic potential for pulmonary arterial hypertension.Cell Transplant,2012.21(10):p.2225-39.

[9]Wang,X.,et al.,Immune modulatory mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells through a trophoblast-like stage.Stem Cells,2016.34(2):p.380-385

实验动物：ICR小鼠，雌性，7-8周龄，动物购于北京维通利华公司。

所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中SPF级，适应性饲养一周。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5代用于后续实验。

试剂/设备	厂家	货号
R540增强型小动物麻醉机	瑞沃德	R540
正置相差显微镜	Carl Zeiss	Axioscope5
包埋机	Leica	EG1150H/C
切片机	Leica	RM2235
展片机	Leica	HI1210
异氟烷	瑞沃德	970-00026-00
一次性使用无菌注射器1ml	江苏治宇医疗器材有限公司	无
一次性使用无菌注射器5ml	江苏治宇医疗器材有限公司	无
生理盐水	石家庄四药	无
多聚甲醛	LEAGENE	DF0135
二甲苯	北京试剂	无
石蜡	Leica	39601006
苏木素染色液	中杉金桥	ZLI-9610
伊红染色液	中杉金桥	ZLI-9644
Masson染液	南京建成	D026-1-2
中性树脂	索莱宝	G8590-100

动物模型制备：SPF级雌性ICR小鼠，6周龄，100只。从斯贝福(北京)生物技术有限公司采购。实验动物的饲养和处理严格依据中国科学院动物研究所实验动物伦理委员会颁布的相关规定执行。通过阴道涂片法确定有4～5天正常动情周期的小鼠纳入实验。本实验选取白消安(BUS)和环磷酰胺(CTX)两种药物结合化疗。采用腹腔注射化疗的方式对小鼠给药，给药剂量依据小鼠体重，每只小鼠剂量为120mg/kg CTX+30mg/kg BUS。实验分三组：①正常组：小鼠腹腔注射溶剂DMSO，N＝35只；②模型组：化疗药剂处理后，尾静脉输注0.1M DPBS，N＝35只；③M细胞组：化疗药剂处理后，每只小鼠尾静脉输注100μL含有1×10 ⁶个M细胞的0.1M DPBS细胞悬液，N＝35只。

体重和卵巢重量测量：

采用分析平衡法测定体重和卵巢重量。

卵泡计数

M细胞治疗后10天收集卵巢，计数卵泡数目。新鲜卵巢标本用4％多聚甲醛(Sigma,P6148)固定至少12小时。脱水、石蜡包埋后，在5微米厚度连续切片，每隔5个切片进行一次贴壁。常规苏木精(Solarbio,G1080-100)和伊红(ZSGB-BIO,ZLI-9613)(H&E)染色进一步组织学检查。对原始滤泡、原发滤泡、继发滤泡和窦滤泡进行分类和计数。为了避免重复计数任何卵泡，只包括那些有卵母细胞的进一步分析。

细胞示踪

在细胞跟踪研究中，采用流式细胞术、动物成像和GFP信号检测方法。流式细胞术在humsc移植后1、4、24和48小时分别从每只小鼠的内皮细胞中采集静脉血。用全血红细胞裂解液室温孵育30分钟后，用PBS洗涤细胞悬液，流式细胞仪分析。为检测GFP信号，在细胞移植后7天处死小鼠。将卵巢标本石蜡包埋并如上所述进行切片。切片后用荧光显微镜观察GFP信号。

E2和FSH检测

在小鼠发情期从内皮细胞中采集静脉血。血液样本在室温下放置60分钟。凝固后，4℃，4000rpm/min离心15分钟。收集上清后送北京北方生物技术研究所(北京，中国)进行血清FSH和E2测定。

RNA的提取及RT-PCR的鉴定

采用Invitrogen的TRIZOL在通风柜中操作，进行提取RNA。

mRNA的反转录

(1)反转录提取的RNA 2μg，1μl的Oligo(dT)Primer，1μl的dNTP Mixture，加 RNA-free水到10μl。65℃变性5min，4℃孵育3min。

(2)上述10μl的体系再加入以下试剂进行反应，总体系20μl。

(3)轻轻的混匀，42℃反应60min，70℃反应15min。

10μl反应体系

Real-time PCR

将反转录的cDNA稀释5倍，进行RT-PCR。

10μl反应体系

结果：

1、造模后小鼠体内的激素水平出现明显变化，FSH水平升高，E2水平下降，体重和卵巢重则显著下降，呈卵巢早衰的病理特征，结果见图174。通过M细胞治疗，早衰小鼠的激素水平明显好转，其体重和卵巢重也显著升高。此外，卵巢早衰小鼠在经过M细胞注射治疗后，其排卵水平也有显著恢复。

2、荧光标记M细胞注射到小鼠卵巢中，3周后仍然可以检测出细胞，说明M细胞可以在小鼠体内存活，是理想的治疗POF的种子细胞。

3、通过检测卵泡颗粒细胞bcl-2基因mRNA表达的变化，判断颗粒细胞的凋亡情况。结果发现M细胞治疗组颗粒细胞bcl-2基因mRNA表达水平上升，凋亡减少。说明M细胞可以重建卵巢功能，减少颗粒细胞的凋亡。

4、通过与正常雄性小鼠交配，比较两组生育后代的能力，结果发现M细胞治疗组产生的子代总数显著高于对照组。

5、通过对卵巢进行切片染色，发现M细胞治疗组小鼠的卵巢结构更接近正常组小鼠的结构。

6、通过卵泡计数与比较，发现经M细胞治疗的小鼠卵泡数量显著高于对照组，结果见图175。

综上，M细胞移植治疗可以改善卵巢早衰的症状，排卵水平也有显著恢复；重建卵巢功能，减少颗粒细胞的凋亡。说明M细胞治疗可以很好的治疗卵巢早衰症状。

实施例30：M细胞对肾脏纤维化的治疗活性评价

肾脏纤维化是一种病理生理改变，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程。肾脏由于受到创伤、感染、炎症、血循环障碍，以及免疫反应等多种致病因素刺激，其固有细胞受损，发展到后期出现大量胶原沉积和积聚，造成肾实质逐渐硬化，形成瘢痕，直至肾脏完全丧失脏器功能。本实施例通过移植M细胞来达到对肾纤维化的治疗。

非专利文献：

1.Serum-Free Medium Enhances the Immunosuppressive and Antifibrotic Abilities of Mesenchymal Stem Cells Utilized in Experimental Renal Fibrosis

2.Mesenchymal Stem Cells Deliver Exogenous MicroRNA-let7c via Exosomes to Attenuate Renal Fibrosis

3.Rat Mesenchymal Stromal Cell Sheets Suppress Renal Fibrosis via Microvascular Protection

4.Mesenchymal stem cells attenuate renal fibrosis through immune modulation and remodeling properties in a rat remnant kidney model

专利文献：

1.人脐带MSC外泌体的新型抗肾纤维化的生物制剂及制备方法(CN201910389341.5)

2.一种增强人脂肪间充质干细胞抗炎能力的基因及其应用(CN201810277760.5)

3.专利名称：人脂肪来源的间充质干细胞在肾脏、眼底疾病中的用途(CN200910209321.1)

实验动物：C57BL/6J小鼠，雄性，7-8周龄，动物购于北京维通利华公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

动物造模：小鼠经腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉后固定，于下腹部正中位置切口1.5cm，游离左侧输尿管并结扎切断，使左肾完全梗阻。术后每只小鼠均应用青霉素注射进行抗感染治疗3天。共分为假手术组，手术+溶剂组，手术+受试物组，每组4只小鼠。

假手术组：仅游离左侧输尿管，不结扎切断。

溶剂组：注射100ul的生理盐水。

M细胞组：注射100ul含有3×10 ⁶M细胞的生理盐水(P5代)。

在手术当天进行治疗，第13天放入代谢笼，第14天收集尿液，取血并取材。

标本取材：

于移植后第13天，将各组大鼠放入代谢笼内，收集24h尿液，尾静脉采血分离血清。

移植后第14天处死各组小鼠，快速取肾，一半组织固定脱水后制成5μm石蜡切片，进行HE染色和Masson三色染色；另一半组织液氮急冻，进行α-SMA和CD31的免疫组化染色，观察肾脏结构病理改变及纤维化情况。

小鼠体重测量：

与移植当天(Day 1)以及移植后的第五天、第八天和第十四天分别取小鼠进行体重的测量，结果见图176。

组织石蜡切片操作步骤：

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色：

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

木素染色3min，在镜下可观察到较深的蓝紫色细胞核，自来水终止染色。

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

Masson染色：

(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ 10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。

(6)分化：1％冰醋酸处理1min。

(8)显微镜镜检，图像采集分析

生化检测：

采用Chemray 240型全自动生化分析仪检测24h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平，结果详见图177-183。

表30-1：肾纤维化模型各组小鼠在第1、5、8、12、14天的体重数值统计

表30-2：肾纤维化模型各组小鼠在第14天的尿微量白蛋白数值统计结果

表30-3：肾纤维化模型各组小鼠在第14天的尿酐(CREA)、尿素(UREA)、尿酸(UA)含量检测结果

表30-1和图176显示了肾纤维化模型各组小鼠在第1、5、8、12、14天的体重数值统计结果。其中，假手术组在各个时间点的体重均明显高于手术+溶剂组(P＜0.05)；手术+M细胞治疗组在第12天和第14天的体重均明显高于手术+溶剂组(P＜0.05)；而假手术组在第12天和第14天，与手术+M细胞治疗组体重无明显差异。以上结果显示M细胞治疗组对于肾纤维化小鼠的体重具有明显促进作用。

表30-2和图177显示了肾纤维化模型各组小鼠尿微量白蛋白统计结果。其中，手术+溶剂组尿微量白蛋白值显著高于假手术组(*,P＜0.05)，表明模型构建成功。M细胞治疗组尿微量白蛋白含量较假手术组无显著差异，较溶剂组显著降低(#,P＜0.05)，表明M细胞对于肾纤维化具有一定的治疗效果。

表30-3和图178显示了在第14天对肾纤维化模型各组小鼠尿液肌苷含量统计结果。其中，手术+溶剂组尿液肌酐值显著高于假手术组(*,P＜0.05)，表明模型构建成功。M细胞治疗组尿液肌酐含量较假手术组无明显差异,较溶剂组显著降低(#,P＜0.05)，表明M细胞对于肾纤维化具有一定的治疗效果。

表30-3和图179显示了对肾纤维化模型各组小鼠尿素含量统计结果。其中，手术+溶剂组尿素值显著高于假手术组(**,P＜0.01)，表明模型构建成功。M细胞治疗组尿素含量较假手术组有显著升高(*,P＜0.05),较溶剂组有降低趋势，但无显著差异，表明M细胞对于肾纤维化具有一定程度的治疗趋势。

表30-3和图180显示了对肾纤维化模型各组小鼠尿酸含量统计结果。其中，手术+溶剂组尿酸值显著高于假手术组(*,P＜0.05)，表明模型构建成功。M细胞治疗组尿酸含量较溶剂组显著降低(#,P＜0.05)，表明M细胞对于肾纤维化具有一定程度的治疗效果。

图181显示了在第14天对肾纤维化模型各组小鼠进行取材，肾脏进行包埋切片，随后进行HE染色结果。其中G1为假手术组，G2为手术+溶剂组，G3为手术+M细胞组。左肾为进行操作肾脏，右肾未进行操作，作为对照。从图中可看出，G2组小鼠肾脏基本结构消失，大量成纤维细胞增生；G3组小鼠肾脏结构有所改善，肾小管萎缩得到缓解，炎性因子浸润和成纤维细胞增生减少，坏死区域有所减缓。

图182显示了在第14天对肾纤维化模型各组小鼠进行取材，肾脏进行包埋切片，随后进行Masson染色结果。其中G1为假手术组，G2为手术+溶剂组，G3为手术+M细胞组。左肾为进行操作肾脏，右肾未进行操作，作为对照。从图中可看出，G1组肾脏组织无明显的胶原沉积；G2组中有被染成蓝色的片状阳性区域，且多分布在肾小管周围，表明有大量的胶原纤维沉积在肾间质；G3组大鼠肾脏组织蓝色区域明显减少，颜色减轻。以上结果证明M细胞在小鼠肾纤维化模型中发挥抑制作用，改善肾脏结构，减少胶原沉积，延缓肾纤维化进展。

图183显示了在第14天对肾纤维化模型各组小鼠进行取材，肾脏进行α-SMA和CD31的免疫组化染色。其中G1为假手术组，G2为手术+溶剂组，G3为手术+M细胞组。左肾为进行操作肾脏，右肾未进行操作，作为对照。内皮细胞-间充质转分化(endothelial-mesenchymal transition，EndoMT),是受损伤肾脏产生肌成纤维细胞的重要机制。EndoMT是指内皮细胞失去其锚定连接与极性功能，进而转化为具有高度侵袭性、迁移性的瘦长梭形间充质细胞；内皮细胞形态与极性发生改变，生物化学性质亦改变，丢失其特征性标志物CD31等，而重新获得间充质细胞标志物α平滑肌激动蛋白(α-SMA)，转换成有活力的间充质细胞的过程。从图中可看出，与G1组左肾相比G2组肾脏组织在第14天时α-SMA的表达升高，CD31的表达量无明显变化，显示构建成功，小鼠出现肾纤维化表型。G3组左肾较G2组，在第十四天时，α-SMA表达有降低趋势，CD31表达有升高趋势。以上结果显示M细胞治疗有减轻肾纤维化的趋势，其可能通过减轻EndoMT抑制肾纤维化进程。

蛋白质印迹检测各组大鼠肾组织TGF-β1及间质转换指标(HU Yu-yan,et.al.,2020,Journal of Jiangsu University(Medicine Edition))

实验结果：蛋白质印迹显示，手术+溶剂组TGF-β1和波形蛋白的表达高于假手术组，而E-钙黏蛋白表达下调；手术+M细胞组TGF-β1和波形蛋白的表达减少，E-钙黏蛋白含量上调。结果表明M细胞能够抑制肾间质中TGF-β1等促纤维化因子的表达，并且能够逆转间质转换，从而起到保护肾脏的作用。对于肾纤维疾病以及相关的，如肾小球疾病，输尿管阻塞和肾功能衰竭等疾病可能具有治疗效果。

实施例31：M细胞对帕金森病的治疗活性评价

帕金森病(Parkinson's Disease,PD)，又称“震颤麻痹”，是一种常见的老年神经系统退行性疾病，也是中老年人最常见的锥体外系疾病。该病具有特征性运动症状，包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍等，还会伴有非运动症状，包括便秘、嗅觉障碍、睡眠障碍、自主神经功能障碍及精神、认知障碍。在中国65岁以上人群中，每10万人中有1700PD患者。遗传因素、环境因素(长期暴露也在工业或农业毒素中)、年龄与PD的发生密切相关。针对PD的治疗，主要是药物治疗，至今已发展到第三代，第一代抗胆碱能药包括：抗胆碱能药物(苯海索、苯扎托品、丙环定、比哌立登、东莨菪碱)；第二代左旋多巴；第三代多巴胺受体激动剂和增强剂(苄丝肼)。药物治疗可以在五年内有效改善症状，提高生活质量，但药物的副作用和相关并发症目前还没有解决办法。手术治疗可以明显改善运动症状，尤其是对肢体震颤和肌强直，但对非运动症状则无明显作用。手术无法根治疾病，需要术后继续药物治疗。除此之外，还有一些治疗方式包括康复训练、营养支持以及心理支持等。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

实验动物：Sprague-Dawley雄性大鼠，6-8周，动物购于北京斯贝福生物技术有限公司。所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

实验分组：正常对照组、PD+溶剂(溶剂组)、PD+M细胞(M细胞组)。

实验材料：手术器械、5-0手术缝合线、大鼠体重秤。

实验试剂：6-羟基多巴胺、生理盐水、抗坏血酸(L-ascorbic acid)、盐酸阿朴吗啡、异氟烷、碘伏。

仪器设备：R540增强型小动物麻醉机、脑立体定位仪、微量注射泵

耗材/试剂/仪器	生产厂家	货号/型号
5-0手术缝合线	Stones	EB01
异氟烷	瑞沃德	970-00026-00
碘伏	杭州朗索医用消毒剂有限公司
生理盐水	国产
6-羟基多巴胺	Sigma	162957-1
抗坏血酸	Sigma	A8960
盐酸阿朴吗啡	Sigma	A4393-250MG
R540增强型小动物麻醉机	瑞沃德	R540

脑立体定位仪	瑞沃德	69100
微量注射泵	瑞沃德	788130

实验步骤：将麻醉机刻度调至3.5，麻醉大鼠并维持麻醉状态，大鼠俯卧位姿势，用棉签沾取碘伏，擦拭大鼠头部皮肤，剪口1-1.5cm，用棉签将脑膜擦去后，用脑立体定位仪固定大鼠头部，纹状体定位注射6-羟基多巴胺，2.5mg/mL，定位如下：+2mm中线左侧；-2.5mm前囟后；-8.5mm头骨下，注射4μl，1μl每分钟，注射完毕后，留针5分钟，之后拔针，缝合皮肤即可。

细胞注射：在纹状体定位6点注射，定位点如下：注射坐标1(+3mm中线左侧；+1mm前囟前；-5.0和-4.5mm头骨下)；注射坐标2(+3.7mm中线左侧；+0.1mm前囟前；-5.0和-4.5mm头骨下)；注射坐标3(+4.5mm中线左侧；+1.2mm前囟前；-5.0和-4.5mm头骨下)。PD+溶剂组注射生理盐水，PD+M细胞组注射M细胞：每个位点1×10^5/1ul，6个位点总细胞为6×10^5。

旋转实验：在术后3周、7周，腹腔注射阿扑吗啡(0.5mg/kg,0.1％抗坏血酸)，10分钟后，记录大鼠旋转圈数，记录时长35分钟。

结果分析：使用阿扑吗啡诱导帕金森大鼠旋转是一种测试单侧黑质纹状体病变的经典方法。通过记录在35分钟内大鼠旋转圈数来反应巴胺神经元损伤的严重程度。

图184中，M细胞组较溶剂组大鼠转圈数明显减少(240.5 vs 360.5)，说明在黑质纹状体病变的帕金森大鼠中，M细胞可以减轻多巴胺能去神经，改善帕金森疾病症状。

圆筒试验和脑神经细胞切片染色方法参照已发表文献Kriks et al.,Nature,2011。

圆筒试验结果表明动物接受移植后双侧前肢的触壁频率趋于一致，接近50％，表明细胞移植可以改善帕金森动物(受试者)肢体的僵硬程度，增强运动能力。

脑片染色结果表明，与对照相比，实验组纹状体内多巴胺能神经元数量增加，神经元长度和复杂性增加，胶质细胞及小胶质细胞数量减少，说明M细胞移植可以保护神经元，减少神经元损伤和死亡，对神经元有营养和促突触再生作用，同时减少脑内炎症发生，改善微环境。

实施例32：M细胞对抑郁症的治疗活性评价

抑郁症，现在已经成为了对人们健康产生巨大威胁的一种疾病。抑郁症的主要临床表现是：(1)心境低落。主要是指持续的心情低落、抑郁悲观等。(2)思维迟缓，反应迟缓。 (3)意志活动减退，行为缓慢。(4)认知功能出现障碍。(5)睡眠障碍、食欲下降。目前治疗抑郁症的主要方法是将药物治疗和认知行为治疗进行结合。但是这种治疗方法不能很好地治疗抑郁症，而且耐药性和服药等方面还有很大的难题。

对于抑郁症的发病原因，科学家也进行了大量研究。现在最被人们重视的是炎性免疫假说，主要内容就是机体的免疫系统在抑郁症中可以发挥相关作用。而且根据大量的研究表明，中枢炎性免疫是抑郁症的关键因素。

干细胞具有免疫调节的作用。因此科学家希望使用干细胞来治疗抑郁症。如今，随着干细胞疗法的出现，科学家希望可以研发出新的治疗抑郁症的干细胞疗法。

然而，成体组织来源MSC临床应用中主要存在如下缺点：(1)无法从单个个体组织获得治疗量的成体组织来源MSC；(2)成体组织来源MSC来源于不同的个体组织，无法实现产品质量的一致性；(3)即使同一个体组织来源的MSC也具有高度异质性；(4)成体组织来源MSC的供体组织来源复杂，具有潜在的传染性病原体感染风险；(5)成体组织来源MSC随着体外扩增会迅速衰老。因此，需要新的MSC细胞来源，用于治疗抑郁症。

实验动物：

CD-1小鼠，雄性，6-8周龄。动物购于北京维通利华公司。

M细胞的制备培养：

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续动物实验。

试剂/设备	厂家	货号
有机玻璃缸	Agilent	5982-9113
生理盐水	石家庄四药	无
脑定位仪	脑定位仪	51970

电子秤

亚速旺

CC-1013-04

动物分组：

侧脑室给药：

利用脑定位仪于侧脑室进行细胞移植，坐标为AP，-0.6mm；ML，1.2mm；DV，-1.8mm。受试药组每只动物注射5μL 1×10 ⁵/μL的M细胞悬液，共计5×10 ⁵个细胞。注射速度1μL/min，注射后原位留针8min，再缓慢退针2min，缝合伤口。每只动物移植前，细胞在注射器中停留时间尽量一致，避免细胞沉降导致的个体间差异。对照组脑室给予生理盐水，给药过程同受试药组。

小鼠强迫游泳实验：

侧脑室给药一周后，小鼠进行强迫游泳实验，将小鼠放入高28.5cm、直径11cm的圆柱形透明有机玻璃缸中，每缸1只，缸中水深采用15cm，水温(24±1)℃。实验时，小鼠在缸中游泳5min，记录后4min内小鼠的累计不动时间。不动时间(immobility time)是指小鼠在水中停止挣扎、呈现漂浮状态。

统计分析：

本实验的研究目的是评价M细胞对雄性CD-1小鼠在强迫游泳实验中不动时间即行为绝望的影响。本实验采用强迫游泳诱导小鼠抑郁模型，预先给予生理盐水或M细胞，观察并记录单次给药7天后各组小鼠在强迫游泳实验中的不动时间。实验结果显示，与生理盐水组相比，M细胞注射组小鼠的体重增加较快(表32-1，图185)，并且在强迫游泳实验中的不动时间有明显减少(表32-2，图186)。综上所述，M细胞对强迫游泳实验中小鼠抑郁行为有治疗作用。

表32-1 各组小鼠体重。

表32-2 各组小鼠强迫游泳的不动时间。

评估M细胞的神经源性潜力

使用实时PCR评估了M细胞中BDNF，FGF-2和IGF-1的mRNA表达，以分析这些细胞支持神经发生的潜力。构建了生物测定法以评估M细胞分泌因子在大鼠新生皮层细胞培养物中支持神经球发育的潜力。将M细胞与条件培养基(无血清高葡萄糖DMEM)一起温育24小时。收获的条件培养基用0.2μm无菌过滤器过滤，过滤器中补充有1％B27补充剂，并用于在24孔板中培养大鼠新生皮层细胞(10^4/孔)。在从刚刚处死的初生的Sprague-Dawley大鼠处获得皮质细胞和0.25％胰蛋白酶(Biological Industries)37℃下孵育10分钟，获得大鼠新生皮层细胞悬液。培养5天后，对在M细胞条件培养基中培养的大鼠新生皮层细胞的培养物中形成的神经球数进行了测定，并在显微镜下计数。使用Nestin，神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和双皮质素的免疫染色进一步分析神经球细胞是否存在分化的神经元和神经胶质细胞。

实验结果

实验结果显示扩增的未分化M细胞表达了多种神经营养因子(包括IGF-1，BDNF和FGF-2)的不同mRNA水平,M细胞分泌的因子对神经发生的旁分泌有促进的影响,DMEM组成的M细胞条件培养基能够支持新生大鼠皮层细胞培养物中神经祖细胞来源的神经球的生长和发育。

主导-顺从关系(DSR)范式

DSR范式使用单个设备，该设备具有两个通过隧道连接的腔室，该隧道在中点有给乳糖器。30只FSL大鼠随机配对。在每对中，将动物放在DSR设备的相对室中，并在适应30秒后让它们竞争乳汁5分钟。M细胞移植前每天重复测试10天。在每次测试中测量每只动物的饮乳汁时间。在每对中，对饮乳汁持续时间较短的动物的侧脑室注射M细胞，而对另一侧的动物注射媒介。手术后第10天，在DSR范式中再次测试了相同的动物对，并持续了7天。

实验结果

在DSR范式中，FSL大鼠对未能显示出显着的显性-服从关系。在每对中，得分较低的动物注射10^5个M细胞，而其配对动物注射媒介。注射后第17天，建立了显着的关系，以M细胞注射的动物为优势。

组织取材及免疫荧光实验

将FSL大鼠麻醉并经心内灌注10U ml-1肝素，然后加入PBS(pH 7.4)，最后加入0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的4％多聚甲醛(Sigma)。取出大脑，固定过夜，并在磷酸盐缓冲的30％蔗糖中平衡。在低温恒温器中制备20-40微米厚的自由漂浮冠状海马切片，并在免疫荧光之前于4℃下储存于0.1％叠氮化钠(Sigma)中。冷冻的组织切片和培养的细胞用PBS洗涤，在0.1％Triton X-100(Sigma)中孵育5分钟，然后用封闭溶液(PBS中的0.1％Triton X-100和5％牛血清蛋白)封闭45分钟。然后将样品与以下一级抗体在室温下孵育1小时：兔多克隆抗BDNF(6.6ng ml-1)，小鼠单克隆抗PCNA(1.4μgml-1)，小鼠单克隆抗Nestin(56μgml-1)，兔多克隆抗DCX(1μgml-1)和兔多克隆抗GFAP(1：100稀释)。随后在室温下以1：100的稀释度与适当的第二抗体(异硫氰酸荧光素山羊抗兔和山羊抗小鼠)孵育1小时。在孵育之间，将样品用PBS洗涤三次。使用荧光显微镜(TE2000-U，尼康，东京，日本)将样品测定结果可视化。

实验结果

免疫染色显示，同侧海马(放射状层)中的PCNA阳性核比对侧海马或注射对照的动物中更多。尽管治疗后2周在齿状回中未观察到PCNA阳性核，但与对侧齿状回和对照组动物相比，在同侧齿状回的颗粒细胞层中观察到DCX表达细胞的增加。类似地，在齿状回的亚颗粒区观察到表达BDNF的细胞增加，并且在齿状中观察到表达GFAP的细胞增加。重要的是要注意，尽管也发现一些植入的M细胞表达神经标记DCX和GFAP，但大多数植入的DiI标记的细胞却不表达。

相关文献：

1.Adipose-derived mesenchymal stem cells protect against CMS-induced depression-like behaviors in mice via regulating the Nrf2/HO-1 and TLR4/NF-κB signaling pathways.

实施例33：M细胞对特应性皮炎的治疗活性评价

特应性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是一种慢性、复发性、瘙痒性及炎症性皮肤病。AD已经成为一个重要的公共卫生问题，其中儿童患病率高达20％，成年人患病率3-10％。AD的发病机制是复杂的，涉及遗传、免疫及环境等多方面因素，而其中免疫功能的异常，特别是免疫细胞发挥免疫应答效应在AD发病中占有重要地位。

目前，AD的治疗通常涉及局部和(或)全身使用糖皮质激素及免疫抑制剂，但是局部使用糖皮质激素对于中、重度AD患者来说作用有限，而系统使用免疫制剂存在骨髓抑制及增加感染机会等风险；新的生物制剂如抗白细胞介素(IL)-4R单克隆抗体杜匹鲁单抗(Dupilum-ab)及抗免疫球蛋白IgE单克隆抗体奥马珠单抗(Omalizumab)等研究结果有限，并且存在差异性，因此发展新型及安全有效的治疗AD的方法十分必要。本发明通过皮下移植M细胞来对皮炎进行治疗。

参考文献：

Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells alleviate atopic dermatitis via regulation of B lymphocyte maturation。

Enhanced therapeutic effects of human mesenchymal stem cells transduced with superoxide dismutase 3 in a murine atopic dermatitis-like skin inflammation model。

Priming with Toll-like receptor 3 agonist or interferon-gamma enhances the therapeutic effects of human mesenchymal stem cells in a murine model of atopic dermatitis。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

试剂/设备	厂家	货号
R540增强型小动物麻醉机	瑞沃德	R540
正置相差显微镜	Carl Zeiss	Axioscope5
包埋机	Leica	EG1150H/C
切片机	Leica	RM2235
展片机	Leica	HI1210
异氟烷	瑞沃德	970-00026-00
一次性使用无菌注射器1ml	江苏治宇医疗器材有限公司	无
一次性使用无菌注射器5ml	江苏治宇医疗器材有限公司	无
生理盐水	石家庄四药	无
多聚甲醛	LEAGENE	DF0135
二甲苯	北京试剂	无
石蜡	Leica	39601006
苏木素染色液	中杉金桥	ZLI-9610
伊红染色液	中杉金桥	ZLI-9644
中性树脂	索莱宝	G8590-100
卵清蛋白(OVA)	Sigma	S25067-25g
氢氧化铝	Sigma	239186-500G

动物模型：BALB/c小鼠称重后，按体重随机分组。将BALB/c小鼠用气麻机麻醉后，剃去背部的毛发，进行分组处理，每组6只鼠。

分组：

正常组：只剃毛，不做其他处理。

OVA组：背部3点注射OVA+氢氧化铝，每点50μl生理盐水。

M细胞组：背部3点注射OVA+氢氧化铝，每点50μl生理盐水，含有1×10 ⁶的M细胞(P5代)。

以上处理记为0天，在第3天和第7天分别注射OVA+氢氧化铝，在第7天到第14天，每天仅注射100μg的OVA。在第14天和第17天，分别注射生理盐水或M细胞。

临床表现及严重程度评分：于第14天和第17天拍照记录皮损严重程度评分及临床表现，结果见图187。

我们发现M细胞皮下注射可以降低皮肤表皮增生程度，降低过敏性炎症反应，促进毛囊再生，很好的缓解了皮炎小鼠的症状，对皮肤炎起到有效的治疗作用。

(2)行为学观察：

观察小鼠对皮炎患处进行触碰抓挠的频率。

实验结果：我们发现M细胞组抓挠的频率明显低于模型组，显示治疗组降低了小鼠瘙痒程度。

(3)组织病理学分析：

1)标本取材：

2)组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

3)苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

图188显示了皮炎模型小鼠HE染色图片，与OVA组相比，M细胞治疗后小鼠的角质层更薄，脂肪层增厚，说明M细胞治疗可以改善小鼠皮肤的微环境，抑制炎症情况，皮肤附属器官比OVA组增多，说明M细胞可以保护皮肤的附属器官，对特应性皮炎起到很好的治疗效果。

4)甲苯胺蓝(TB)染色

1.组织切片常规脱蜡脱水

2.入甲苯胺蓝液30min

3.3.稍水洗

4.入0.5％冰醋酸液分化，直到胞核及颗粒清晰。

5.稍水洗，用冷风吹干

6.二甲苯透明，中性树胶封片。

实验结果：M细胞可降低肥大细胞增生.

5)脾脏Th1、Th2细胞流式检测

(5)取出小鼠脾脏，用研磨器将组织研磨，吸取研磨液移入EP管中。离心机500G离心5min,弃掉上清，然后加入5ml红细胞裂解液，37℃孵育15min,再次离心，弃掉上清，调整细胞浓度为1x10 ⁶,将细胞吸入到离心管中，400G离心5min弃掉上清液，每管加入CD4抗体，涡旋震荡后，避光孵育30min。

(6)使用1ml染色缓冲液洗两次后，首管加IL-4、IFN-γ同性抗体，其余管各加2ul IL-4、IFN-γ抗体，涡旋震荡后，4℃孵育30min。

(7)使用固定破膜液洗两次后，加入500ulPBS重悬细胞，上机检测分析，根据CD4荧光确定CD4 ⁺T细胞门，每个标本计数10000个CD4 ⁺T，计算出Th1(CD4 ⁺IFN-γ ⁺)、Th2(CD4 ⁺IL-4 ⁺)细胞的百分率。

实验结果：显示皮炎模型组Th1/Th2细胞会显著降低，M细胞治疗可调解Th1/Th2细胞失衡，抑制炎症反应。

5)B细胞的流式分析

(1)小鼠心脏采血，肝素钠抗凝，将血液加入到流式管中，每管100ul，每管加入BD红细胞裂解液，孵育15min,PBS洗两次。

(2)每管加入PerCP-CD19、PE-CD27、FITC-38抗体孵育30min。

(3)细胞内标记染色用BD细胞内染色缓冲液固定渗透。

(4)FCR阻断

(5)FITC-IgE抗体孵育。

(6)流式细胞仪上机检测。

实验结果：显示M细胞可能会降低CD19阳性细胞IgE表达强度，改善过敏性疾病。

综上，M细胞治疗可以降低小鼠的瘙痒程度，降低肥大细胞增生，调解Th1/Th2细胞失衡，抑制炎症反应，降低CD19阳性细胞IgE表达强度，改善过敏性疾病，因此,M细胞可以很好的治疗皮炎。

实施例34：M细胞对神经炎症的治疗活性评价

神经炎症涉及创伤性脑损伤、脑卒中、脑出血及各种神经退行性疾病。在正常情况下，神经炎症维持体内平衡并促进组织修复。然而，不受控制的神经炎症可能对大脑有害。因此，控制有害的炎症反应是一种很有前途的神经系统疾病的治疗方法。

参考文献：

Mesenchymal stem cells enhance microglia M2 polarization and attenuate neuroinflammation through TSG-6。

实验动物：C57bl/6小鼠，5-7周，动物购于维通利华实验动物技术有限公司。所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

实验分组：正常对照组、LPS+溶剂(溶剂组)、LPS+M细胞(M细胞组)，每组3只。

实验材料：手术器械、20ml注射器、一次性使用无菌注射器5ml、一次性使用无菌注射器20ml、电子秤。

实验试剂：生理盐水、脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)、RIPA裂解液、小鼠白介素1β酶联免疫试剂盒(Mouse Interleukin 1β,IL-1β ELISA Kit)、小鼠白介素6酶联免疫试剂盒(Mouse Interleukin 6,IL-6 ELISA KIT)、小鼠白介素10酶联免疫试剂盒(Mouse interleukin 10,IL-10 ELISA KIT)。

仪器设备：组织匀浆机

耗材/试剂/仪器	生产厂家	货号/型号
电子秤	亚速旺	CC-1013-04
一次性使用无菌注射器20ml	江苏治宇医疗器材有限公司
一次性使用无菌注射器5ml	江苏治宇医疗器材有限公司
生理盐水	国产
脂多糖	康为	CW2333S
RIPA裂解液	Sigma	A8960
组织匀浆机	IKA	201110158
小鼠白介素1β酶联免疫试剂盒	CUSABIO	CSB-E08054m
小鼠白介素6酶联免疫试剂盒	CUSABIO	CSB-E04639m
小鼠白介素10酶联免疫试剂盒	CUSABIO	CSB-E04594m

实验步骤：小鼠LPS注射前16小时禁食，之后腹腔注射LPS(0.05mg/kg)。24小时后取脑组织。小鼠安乐死后，立刻进行心脏灌流：剪开胸腔，暴露心脏，用20ml注射器吸取20ml生理盐水，将针头换为5ml针头，从心尖插入，剪破右心耳，快速推注20ml生理盐水，之后取小鼠大脑组织，按1：3比例加入RIPA裂解液后，用组织匀浆机匀浆，冰上放置5分钟后，离心，5000g，4℃，10分钟后，取上清进行检测酶联免疫检测。酶联免疫检测按照说明书上进行即可。

细胞注射：与LPS同时注射。LPS+溶剂组尾静脉注射100μl生理盐水，LPS+M细胞组尾静脉注射100μl M细胞：3×10^6/只。

统计：所有数据采用Prism 7.0统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准差(Mean±SD)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

结果分析：在LPS诱导神经炎症小鼠脑组织中，同溶剂组比较，M细胞组有减少促炎因子IL-1β、IL-6含量的趋势。而且，M细胞明显增加了抑炎因子IL-10的表达。所以， M细胞可以减轻炎症产生。

表34-1 LPS诱导神经炎症小鼠脑组织中IL-1β(pg/ml)含量

表34-1和图189显示了LPS诱导神经炎症小鼠脑组织中IL-1β(pg/ml)含量统计结果。IL-1β促进炎症发生，是促炎因子，溶剂组脑组织中IL-1β含量与正常组相比较明显升高。同溶剂组相比，M细胞组有减少IL-1β含量的趋势。

表34-2 LPS诱导神经炎症小鼠脑组织中IL-6(pg/mg)含量

表34-2、图190显示了LPS诱导神经炎症小鼠脑组织中IL-6含量统计结果。溶剂组脑组织中IL-6含量与正常组相比明显升高。IL-6促进炎症发生，是促炎因子，与溶剂组相比，M细胞组有减少IL-6含量的趋势。

表34-3 LPS诱导神经炎症小鼠脑组织中IL-10(pg/mg)含量

表34-3、图191显示了LPS诱导神经炎症小鼠脑组织中IL-10(pg/mg)的统计结果。IL-10抑制炎症发生，是抑炎因子，M细胞组脑组织中IL-10浓度明显高于溶剂组(2.0 vs 2.7)，表明M细胞有抗炎作用。

鼠脑冰冻切片染色与统计结果

方法参照已发表文献Kriks et al.,Nature,2011

脑冰冻切片染色检测鼠神经细胞再生情况，发现与对照组相比，移植M细胞组动物脑内及外周反应性星形胶质细胞(GFAP+)和小胶质细胞(IBA1+CD11B+)数量明显减少，说明M细胞移植可以促进神经元再生，减少神经元损伤和死亡，降低神经炎症反应，对神经元具有提供营养和促突触再生作用。

脑组织炎症因子ELISA和WB检测结果

方法参照已发表文献Bétemps et al.,2015,J Vis Exp.

取鼠脑组织检测炎症因子水平，与对照组相比，发现移植M细胞组脑组织TNF-α、IL1-β、IL-6等促炎因子水平明显下降，而IL-10、IL-3等抑炎因子水平明显升高。说明M细胞可以减弱炎症反应，改善神经系统微环境。

记忆检测：

方法参照已发表文献Lykhmus et al.,2019,Frontiers in Pharmacology

结果表明M细胞移植使模型动物(受试者)对场景记忆能力有显著改善。

与正常对照组比较，溶剂组中的促炎因子IL-1β、IL-6浓度显著增高，抑炎因子IL-10明显减少，表明溶剂组小鼠炎症程度较严重。

实施例35：M细胞对半月板损伤的治疗活性评价

半月板是两个半月状的纤维软骨，位于胫骨平台内侧和外侧的关节面，具有稳定膝关节、传递并分散膝关节负荷力及促进关节内营养的功能，是保持膝关节结构稳定、发挥运动功能的重要组织。半月板损伤多由扭转外力引起，造成关节疼痛、关节活动受限而导致肌肉萎缩及行走不便等危害，严重影响患者生活。半月板损伤是膝关节最常见的运动损伤之一。

半月板由外向内分别为：外侧10-20％左右为红区，由膝内外侧动脉供应血液，形成半月板周围动脉丛，内侧30％左右区域为白区，无血液供应，中间50-60％左右的区域为过渡的红白区。目前半月板损伤临床上应用的修复手段主要有：缝合，切除以及半月板假体移植。缝合的范围仅限于有血液供应的红区以及部分红白区的简单损伤，缝合后这些区域可自行愈合，但临床上此类病例较少，约占总半月板病例数的20-30％。而由于半月板的结构特点和受力特征，大多数损伤都发生在白区，此类损伤由于无血液供应因而不能自行愈合，需进行半月板切除手术，手术中奉行的原则是尽量保存较多的半月板组织，所以部分切除的情况比较常见，一些比较严重的病例实施次全切，即保留半月板红区最外层的一层边缘，只有极少数情况下才实施半月板全切手术。半月板部分切除或全切手术对症状以及疼痛的缓解作用明显，但是由于半月板功能的重要性，切除手术后长期随访结果表明关节软骨发生退行性改变，严重的甚至引发骨性关节炎。因此，一些行半月板切除手术之后的患者需要接受半月板假体移植手术以保护关节软骨、维持关节稳定，恢复运动功能。

非专利文献：

1.Meniscus repair using mesenchymal stem cells–a comprehensive review。

2.Mesenchymal stem cells in human meniscal regeneration:A systematic review

3.Role of mesenchymal stem cells in meniscal repair

专利文献：

CN103920188B一种组织工程半月板修复片及其制备方法

CN104398698A一种治疗半月板损伤的中药组合物

目的：通过移植M细胞来达到对半月板损伤的治疗。

达成效果：移植M细胞后，半月板损伤完全恢复

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

将P5代的M细胞用国家干细胞配置的临床制剂冻存，储存到液氮罐中，已备临床使用。

试剂/设备	厂家	货号
液氮柜	Thermo	7403TF
生物安全柜	Thermo	1389 A2

治疗方法：半月板损伤患者，关节腔内注射M细胞制剂进行治疗，分为低剂量组(1x10 ⁷/膝关节)和中剂量组(5x10 ⁷/膝关节)。注射M细胞制剂后，进行安全性和有效性的评价(膝关节疼痛、局部水肿)，并进行影像学的观察。

疼痛视觉模拟评分(VAS)：分为0-10。

0分完全不痛；

3分以下：有轻微的疼痛，能忍受；

4-6分：患者疼痛并影响睡眠，尚能忍受。

7-10分：患者有减强烈的疼痛，疼痛难忍，影响食欲，影响睡眠。

Lysholm评分：由Lysholm和Gillqui在1982年提出，被广泛地运用于各种膝关节疾病，如半月板损伤、软骨退变或软化。Lysholm评分总分100分，如果自评评分低于70分，说明膝关节功能状态已经很差。从评分内容上包括跛行、交锁、疼痛、支持、不稳定、肿胀、上楼困难、下蹲受限。Lysholm评分不仅能评价受试者最为重要的日常活动的功能感知，而且对于受试者不同强度的运动功能等级也能做出初步评估。

表35-1 低剂量组和中剂量组接受M细胞制剂治疗后的临床观察

表35-1说明：低剂量组6位受试者，干细胞移植后3个月，其中4位损伤的半月板均获不同程度的修复中剂量的受试者，干细胞移植后1个月，尚在随访中。

表35-2 受试者的VAS量表评分

结合表35-2和图192可以看到，两剂量组的VAS评分虽有上下波动，但整体上呈下降趋势，即受试者的膝关节疼痛接受研究药物注射后有一定程度的缓解。

表35-3 受试者的Lysholm评分-合计

说明：从表35-3和图193可以看出，两剂量组的受试者接受研究药物注射后，Lysholm总分数值呈上升的趋势，根据单项评估结果，研究药物注射后评分数值的上升主要体现在跛行、绞锁、疼痛方面，在其他单项评估上，评分数值无明显变化。因此，受试者接受研究药物注射后，Lysholm评分有一定改善，主要表现在跛行、交锁和疼痛缓解。

M细胞治疗前有半月板损伤和严重的膝关节疼痛症状，经M细胞制剂关节腔内移植治疗3个月后，半月板损伤完全恢复，膝关节疼痛评分由原来的8分转为2分，局部水肿有减轻的效果，说明M细胞关节腔内移植可以很好的治疗半月板损伤。移植M细胞后，半月板损伤有很好的修复效果，膝关节疼痛评分降低，局部水肿情况减轻。

实施例36：M细胞对非酒精性脂肪性肝炎的治疗活性评价

存在问题：NASH缺乏有效的治疗药物。

实验动物：C57bl/6小鼠，7-9周，动物购于斯贝福(北京)生物技术有限公司。所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

试剂及仪器设备：

实验分组：

正常饲料+加溶剂组：饲喂正常饲料，开始饲喂第2和4周，尾静脉注射100μL生理盐水；

MCD饲料+加溶剂组：饲喂MCD饲料，开始饲喂第2和4周，尾静脉注射100μL生理盐水；

MCD饲料+M细胞组：饲喂MCD饲料，开始饲喂第2和4周，尾静脉注射3×10 ⁶M细胞/只；

实验取材：

MCD喂食6周后，进行取材。小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，打开腹腔，中央静脉取血。开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，生理盐水灌注完成后，用50mL多聚甲醛进行固定，灌流完成后，取肝脏，进行固定切片分析。所取血液5000rpm室温离心15min，取上清，用于血生化分析。

悬液芯片系统检测炎症因子：

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μL的磁珠。

(8)用100μL的洗液洗板两次。

(12)用100μL的洗液洗板两次。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μL。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μL的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μL。

(20)用100μL的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(4)酒精梯度脱水：70％酒精1h，80％酒精1h，95％酒精1h，100％酒精40min， 100％酒精40min。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

免疫组化染色：

2.水化：蒸馏水洗2次，每次5min(置于摇床)；

3.石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS冲洗3次，每次3分钟；

4.抗原修复液(10mM pH 6.0柠檬酸钠缓冲液)的配制：

(2)工作液的配制：A液82mL+B液18mL+蒸馏水900mL；

12.自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝；

14.显微镜拍照。

油红O染色：

1.油红O的配制：称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于10mL异丙醇中，然后加异丙醇至100mL，棕色瓶密封(或锡箔纸包裹避光)4℃保存，为储存液，可长期保存。用时取6mL油红溶液加三蒸水4mL混匀，定性滤纸过滤，稀释后3小时内用完；

2.组织冰冻切片，用PBS漂洗一遍，加入4％PFA室温固定20min；

3.弃去4％PFA，用PBS漂洗一遍；

4.稀释油红储存液，油红：去离子水＝3：2，滤纸过滤，室温放置10min；

5.弃去油红染液，加入60％异丙醇漂洗一遍，除去多余的染料；

6.弃去60％异丙醇，加入PBS，显微镜下拍照。

统计分析

实验结果

(1)解剖学观察显示，MCD饲料+溶剂组小鼠肝脏颜色变白，表面呈颗粒状。而M 细胞组小鼠肝脏呈现正常的红褐色，表面光滑。表明，M细胞可以抑制肝脏的脂肪变性。

(2)肝脏称重，结果显示，M细胞可以明显降低肝脏的重量，抑制脂肪在肝脏中的积累。

(3)血生化分析结果显示，M细胞可以明显降低血液中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量(表36-1、36-2，图195、196)，表明M细胞可以降低转氨酶含量，改善肝功能。

表36-1 NASH模型小鼠血液中ALT含量。

表36-2 NASH模型小鼠血液中AST含量。

(4)血生化分析结果显示，M细胞可以明显降低血液中甘油三酯(TG)(表36-3，图197)和总胆固醇(CHO)含量，表明M细胞可以降低脂肪肝的指标。

表36-3 NASH模型小鼠肝脏中TG含量。

(5)HE染色结果显示，MCD饲料+溶剂组小鼠肝细胞内有大量脂肪滴和气泡状肝细胞，MCD饲料+M细胞组小鼠肝细胞形态正常，表明，M细胞可以降低肝脏的脂肪变性。

(6)油红O染色显示，MCD饲料+溶剂组小鼠肝细胞有大量脂滴存在，MCD饲料+M细胞组小鼠肝脏则只有少量脂滴存在，表明，M细胞可以降低肝脏的脂肪变性。

(7)免疫组化结果显示，MCD饲料+溶剂组小鼠肝脏有大量的Collagen I和α-SMA蛋白的表达，表现出纤维化的症状。MCD饲料+M细胞组小鼠肝脏则只有少量表达，表明，M细胞可以抑制纤维化的形成。

(8)HE染色结果显示，MCD饲料+溶剂组小鼠肝脏内有大量炎症细胞侵润，MCD饲料+M细胞组小鼠肝脏形态正常，表明，M细胞可以抑制炎症细胞侵润。

(9)小鼠血清中炎症因子检测结果显示，与MCD饲料+溶剂组比较，MCD饲料+M 细胞组的促炎症因子水平明显降低，抑炎症因子水平明显升高。表明，M细胞有抑制炎症的作用。

溶剂组血液中的ALT和AST含量显著增高，肝脏中TG浓度也显著增高相对于正常组。

实施例37：M细胞对呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)的治疗活性评价

SARS-CoV-2”感染导致的肺炎“COVID-19”潜伏期长，传染性强，危害性大。截止目前，COVID-19尚无有效治疗药物，但重型、危重型患者COVID-19患者的预后差，病死率高，其临床救治需求尤其迫切。

根据最新的流行病学数据，COVID-19中大约15.7％(173/1099例)患者病情严重，部分患者出现呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS),导致呼吸衰竭，进而累及其它脏器官功能，甚至导致死亡。目前资料显示，重症病例的病死率高达15％。ARDS表现为快速进展的呼吸困难、低氧血症、弥漫性肺浸润直至呼吸衰竭的临床综合症。ARDS目前的治疗方案仅局限于基础医疗护理和支持性通气策略等对症治疗，尚无法逆转疾病进程、提高患者生活质量及降低病死率。机械通气是急性呼吸窘迫综合征患者的主要治疗手段。在机械通气过程中，常出现呼吸机相关性肺炎、呼吸机相关肺损伤、深静脉血栓形成、机械通气脱机困难、肺间质纤维化等并发症。药物治疗手段包括：皮质类固醇、他汀类药物、阿司匹林、β-2受体激动剂、表面活性剂和吸入NO等，都没有显示出明显疗效。上述两种治疗手段，连同血液净化治疗、营养干预、液体控制等辅助性手段，都远远不能满足此次COVID-19所致ARDS的治疗。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是一种多潜能细胞，具有一定的自我更新和分化能力，在体外特定培养条件下，MSCs可定向分化成脂肪细胞、成软骨细胞和成骨细胞等。成体MSCs来源广泛，从骨髓、脐带或脂肪组织均可分离获得。MSCs具有低免疫原性的特点，且可分泌多种因子，包括内皮细胞因子和上皮生长因子，抗炎细胞因子和抗微生物肽等。临床前研究表明，MSCs在多种原因导致的ARDS模型治疗中具有较好的安全性和有效性，包括脓毒症性休克所致的ARDS，病原菌(如大肠埃希菌等)所致的急性肺损伤模型、呼吸机相关肺损伤模型、胸部外伤所致肺损伤动物模型和缺血再灌注肺损伤模型等。MSCs可通过调节机体免疫反应，减少肺组织免疫损害，分泌相关蛋白促进肺损伤恢复，促进病原菌清除等作用机制而用于COVID-19的临床治疗。

近年来，大量临床前及临床研究结果显示，干细胞技术有望治疗ARDS、PF等难治性肺部疾病。然而，成体组织来源MSC临床应用中主要存在如下缺点：(1)无法从单个个体组织获得治疗量的成体组织来源MSC；(2)成体组织来源MSC来源于不同的个体组织，无法实现产品质量的一致性；(3)即使同一个体组织来源的MSC也具有高度异质性；(4)成体组织来源MSC的供体组织来源复杂，具有潜在的传染性病原体感染风险；(5)成体组织来源MSC随着体外扩增会迅速衰老。

相关文献：

(1)Transplantation of ACE2-Mesenchymal Stem Cells Improves the Outcome of Patients with COVID-19 Pneumonia。

(2)Mesenchymal stem cell therapy in severe COVID-19:A retrospective study of short-term treatment efficacy and side effects

(3)Repair of Acute Respiratory Distress Syndrome by Stromal Cell Administration in COVID-19(REALIST-COVID-19):A structured summary of a study protocol for a randomised,controlled trial

(4)Safety and efficacy assessment of allogeneic human dental pulp stem cells to treat patients with severe COVID-19:structured summary of a study protocol for a randomized controlled trial(Phase I/II)

(5)Adipose-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of patients with severe SARS-CoV-2 pneumonia requiring mechanical ventilation.A proof of concept study

通过以上文献的调研，探究M细胞治疗ARDS的可能性，也为实验方案的制定提供了参考。

达成效果：移植M细胞后，治疗期间无干细胞药物相关不良反应和严重不良反应发生，输注后1个月，CT显示回复正常，无纤维化形成。

M细胞的制备培养：

复苏P3代M细胞，进行消化传代，用于后续临床试验。

病人病情简介：

男，44岁。因发热伴咳嗽6天就诊北京佑安医院。在院外曾按照甲型流感治疗6天，病情无好转。患者长居武汉，为陪家人就医来京。平素健康，无既往病史及家族史。入院查体：体温37.9℃，血压120/60mmHg，心率80次/分，呼吸21次/分。肺部听诊显示呼吸音粗。新冠病毒核酸阳性，确诊为新型冠状病毒肺炎，收治入院。胸部CT平扫，显示双肺多发磨玻璃密度影，以右下肺为著。入院后生命体征稳定，间断性发热伴咳嗽，最高体温达39℃。给予对症支持，罗匹那韦/利托那韦加中成药联合抗病毒治疗。入院后5天，患者出现憋气。复查胸部CT，显示肺部病变明显加重，双肺多发斑片、片状磨玻璃密度及高密度影，范围扩大；双肺出现多发囊状透亮影。入院后6天，病情进行性加重，憋气、胸闷，血氧饱和度下降。低钾血症。入院后7天，患者病情进一步恶化，未吸氧静息状态下指端氧饱和度91％。

干细胞治疗方案：

入院后7天，患者签署知情同意书后，静脉输注M细胞，3x10^6个细胞/kg体重。细胞输注7天，进行第二次细胞输注治疗。干细胞治疗期间患者一直接受抗病毒基础治疗。

实验结果：可以以文字描述、表格或者附图形式给出，最好加上对结果的分析和评价。

悬液芯片系统检测炎症因子：

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μL的磁珠。

(8)用100μL的洗液洗板两次。

(12)用100μL的洗液洗板两次。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μL。

14)用封板膜封板，在高频振荡器上，室温震荡850±50rpm，30min。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μL的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μL。

(20)用100μL的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

有效性评价

(1)临床症状：第一次细胞输注后，血氧饱和度升高(表37-1，图198)。第2天起，患者自诉憋喘减轻；第4天，临床症状消失，病情改善显著。

表37-1：患者血氧饱和度变化

	1月23日	1月29日	1月30日	2月1日
血氧饱和度	98％	96％	91％	98％

(2)胸部CT：第一次细胞输注前，患者胸部CT显示双肺多发双肺多发斑片、片状磨玻璃密度及高密度影(黄色箭头)。患者接受二次M细胞输注后(间隔6天)第二天， CT显示病灶部位吸收好转，第1次输注后1个月，CT显示回复正常，无纤维化形成(图199)。

(3)血生化及病毒检测：第一次输注后第2天，淋巴细胞绝对值0.79x10^9/L，第二次输注后升至1.02x10^9/L(表37-1)。第二次细胞输注后第2天和第3天，连续两次新冠病毒核酸检测阴性，病毒转阴两天后，达到出院标准。出院后两周回访，新冠病毒核酸阴性，血糖、肝功能、肾功能、肌钙蛋白、全血细胞分析均正常(表37-2)。

表37-2 患者接受M细胞输注前后血生化检测及病毒检测

*：CS，有临床意义；

#：NSC，无临床意义。

(4)细胞因子检测：第一次输注后第八天，IL-1RA、RANTES等抑炎细胞因子水平升高(表37-3、37-4，图200、201)。IL-1α、IL-1β、IL-5、IL-8、IL-25和CXCL10/IP-10 等促炎细胞显著降低(表37-5～表37-10，图202～图207)。与此对应，C-反应蛋白水平显著减低(表37-2)。综上所述，ARDS患者静脉输注M细胞后，未发生不良事件。M细胞输注具有促进病灶部位吸收好转、抑制炎症和促进肺部恢复的功能。

表37-3：患者体内IL-1RA水平变化

	第1天	第8天
IL-1RA(pg/mL)	40.50	54.65

表37-4 患者体内RANTES水平变化

	第1天	第8天
RANTES(pg/mL)	3457.00	3843.00

表37-5 患者体内IL-1α水平变化

表37-6 患者体内IL-1β水平变化

表37-7：患者体内IL-5水平变化

	第1天	第8天
IL-5(pg/mL)	10.91	6.69

表37-8 患者体内IL-8水平变化

	第1天	第8天
IL-8(pg/mL)	4.95	1.57

表37-9 患者体内IL-25水平变化

	第1天	第8天
IL-25(pg/mL)	279.22	109.78

表37-10 患者体内CXCL10/IP-10水平变化

	第1天	第8天
CXCL10/IP-10(pg/mL)	7993.00	1343.00

实施例38：M细胞对特发性肺纤维化的治疗效果评价

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性进展性的以肺间质纤维化为主要特征的肺部疾病，其病因目前仍不明确，老年人多见，近年来发病率呈上升趋势。但IPF的诊断目前仍是临床难题，IPF起病隐匿，早期常无明显临床表现，且影像学及肺功能表现不典型，因此IPF患者常在疾病的发展至出现多种并发症后才得以确诊。然而，IPF目前尚无有效治疗方案，患者的肺功能随疾病进展不断恶化，中位生存期仅为2-3年。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是成体干细胞的一种，具有自我更新、免疫源性低、多向分化、免疫调节和组织修复能力等特征。近年来研究发现，在损伤的肺组织中，间充质干细胞在CXCL8、SDF-1、CXCR4等炎性因子或受体通路的介导下，可定向分化为II型肺泡上皮细胞和成纤维细胞，提示多潜能间质基质细胞广泛参与肺损伤的修复和致纤维化作用。多项动物实验研究发现，在博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠中，静脉注射多潜能间质基质细胞可减少肺组织炎症反应和纤维化程度，提示多潜能间质基质细胞治疗可能成为未来治疗肺纤维化的新型手段。近年来，希腊、澳大利亚和美国相继开展了在IPF患者中应用多潜能间质基质细胞治疗的I期临床试验，在为期6至15个月的随访时间内，未见显著不良事件发生，提示多潜能间质基质细胞治疗IPF的安全性可靠。

然而，成体组织来源MSC临床应用中主要存在如下缺点：(1)无法从单个个体组织获得治疗量的成体组织来源MSCs；(2)成体组织来源MSC来源于不同的个体组织，无法实现产品质量的一致性；(3)即使同一个体组织来源的MSCs也具有高度异质性；(4)成体组织来源MSCs的供体组织来源复杂，具有潜在的传染性病原体感染风险；(5)成体组织来源MSCs随着体外扩增会迅速衰老。因此，需要新的MSC细胞来源，用于肺纤维化。

相关文献：

(1)Cell Therapy in Idiopathic Pulmonary Fibrosis。

(2)Idiopathic pulmonary fibrosis

(3)Mesenchymal stem cells in idiopathic pulmonary fibrosis

(4)Mesenchymal Stem Cells and Idiopathic Pulmonary Fibrosis

达成效果：移植M细胞后，治疗期间无干细胞药物相关不良反应和严重不良反应发生，输注M细胞后，CT显示受试者肺部病灶部位明显吸收好转。

M细胞的制备培养：

复苏P3代M细胞，进行消化传代，用于后续临床试验。

试剂/设备	厂家	货号
电子计算机断层扫描(CT)	飞利浦	Ingenuity CT

患者简介：

经筛选后，共四名新冠肺炎致肺纤维化患者入组。

干细胞治疗方案：

患者签署知情同意书后，静脉输注M细胞，3×10^6个细胞/kg体重。细胞输注后，CT扫描肺部，观察肺部纤维化情况。

有效性评价

(1)胸部CT：M细胞输注前，患者胸部CT显示双肺多发双肺多发斑片、片状磨玻璃密度及高密度影(箭头所示)。患者接受M细胞输注后，CT显示全部患者病灶部位吸收好转，输注后1个月，CT显示基本恢复正常。50天后，所有患者肺部纤维化消失(图208)。

实施例39：M细胞对心肌血管再灌注的治疗活性评价

1、实验方法：

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

实验动物：Sprague-Dawley大鼠，6-8周，动物购于维通利华实验动物技术有限公司。所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

实验分组：正常对照组、手术+溶剂(溶剂组)、手术+M细胞(M细胞组)，每组3只。

实验材料：手术器械、一次性使用无菌注射器1ml、3-0手术缝合线、体重秤

实验试剂：异氟烷、碘伏、2，3，5－三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)

仪器设备：

所有数据采用Prism 7.0统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，实验数据以平均数±标准差(Mean±SD)表示。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。

从维通利华够进SD雄性大鼠，适应性喂养一周后，采用结扎左冠状动脉前降支制作大鼠心肌梗死模型。将大鼠放入麻醉盒子内，麻醉大鼠并维持麻醉状态，胸前脱毛，用碘伏擦拭后，在胸骨左侧与胸骨平行做长约2cm的纵切口，切开皮肤，钝性分离胸大肌，用眼科开睑器于3～4肋间的肋间肌扩开胸腔，暴露心脏，分离心包膜。仔细辨别冠状动脉，用无损伤缝线于冠状动脉左前降支(left anterior descending，LAD)远端1/3处连同心肌一并结扎，系活结，缺血45分钟后进行再灌注。之后，立刻进行药物注射。正常对照组不做处理，手术+溶剂(溶剂组)组尾静脉注射1ml生理盐水，手术+M细胞(M细胞组)尾静脉注射2.5×10^6/1ml/只。在术后第3天，使用小动物B超仪，超声检测心脏功能指标变化，包括：左心室舒张末压(Left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)，左心室射血分数(Left ventricular ejection fraction,EF),左心室缩短分数(Left ventricular shortening fraction,FS),左室舒张末期内径(Left ventricular end diastolic diameter,LVEDD),左室收缩末期内径(Left ventricular end systolic diameter,LVESD),左室舒张末期容积(Left ventricular end diastolic volume,LVEDV)：左室收缩末期容积(Left ventricular end systolic volume,LVESV)以及左室游离壁。大鼠做完B超后深度麻醉，之后腹主动脉取血后进行灌流，取心脏，部分大鼠心脏组织进行TTC染色，部分大鼠心脏组织做马森三色染色。血样通过血生化仪检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)的含量。

2、实验结果：

结果分析：

(1)LVEDP可以反应心肌收缩之前所受的阻力或负荷，EF和FS反映左心室收缩功能，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV反应心脏收缩舒张功能。溶剂组LVEDP明显升高，EF和FS明显降低，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV显著升高。M细胞组LVEDP降低了13mmHg较溶剂组(表39-1、图209)。表明M细胞可以减轻心肌收缩前所受阻力或负荷。在M细胞组，EF和FS明显升高，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV降低。M细胞组左室收缩明显改善。上述结果均表明M细胞可以改善心肌缺血再灌注大鼠的心脏功能。

表39-1：心脏LVEDP(mmHg)

(2)LDH和CK可以反映心脏梗死程度。结果显示，溶剂组两种酶含量均明显升高。M细胞组LDH和CK明显较少，表明M细胞可以减轻心脏梗死程度(表39-2/图210、表39-3/图211)。TTC结果更直加直观证实上述结果。

表39-2：血液中LDH(U/L)含量

表39-3：血液中CK(U/L)含量

(3)马森三色染色，胶原富集的瘢痕组织染色为蓝色，活的心肌组织染色为红色。M细胞组瘢痕大小较小，左室壁厚度较大。

以上结果表明，M细胞能够改善心脏功能指标，减少心脏梗死面积。

实施例40：M细胞对肾切除的治疗活性评价

肾切除，是一种治疗肾脏疾病的外科手术。其适应症包括肾恶性肿瘤、肾结核、严重的肾盂积水或肾结石等、严重的肾损伤和一侧脓肾。本实施例通过移植M细胞来达到对肾切除或肾脏疾病进行治疗的目的。

1、实验方法：

实验动物：SD大鼠，雄性，6周龄，动物购于北京维通利华公司。所有动物饲养在中科院动物研究所实验动物中心SPF级,适应性饲养一周。动物的护理和使用得到了中科院动物研究所实验动物中心批准。按照中科院动物研究所实验动物福利和道德委员会的规定进行动物的所有实验程序。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

试剂/设备	厂家	货号
一次性使用无菌注射器1ml	江苏治宇医疗器材有限公司	无

一次性使用无菌注射器5ml	江苏治宇医疗器材有限公司	无
生理盐水	石家庄四药	无
Chemray 240型全自动生化分析仪	雷杜	Chemray 240
电子秤	亚速旺	CC-1013-04

动物造模：100ml/L水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，剖腹，暴露并钝性分离左肾及肾蒂，暴露左肾，分离肾周围脂肪囊后，弧行切除肾上下极，共切除左侧肾脏2/3，用明胶海绵压迫止血1min，复位肾脏，逐层关腹。1期手术后4d行2期手术，同样方法麻醉，剖腹，暴露右肾，结扎肾蒂，摘除右肾；两次手术共切除肾脏5/6。

共分为假手术组，手术+溶剂组，手术+受试物组。每组4只小鼠。

假手术组:仅游离肾周围组织及剥离肾包膜后关腹。

溶剂组：注射1mL的生理盐水。

M细胞组：注射1mL含有5×10 ⁶M细胞的生理盐水(P5代)。

手术当天记为第一天，在手术后两周进行治疗，第7、15、19、22、26、29、33、36、40、43、47、50、54、57天进行体重的称量。在第15、29、43天进行MSC的注射。在第57天进行血液和尿液的收集。

标本取材：

将大鼠放入代谢笼中，隔天收取24h的尿液。收取第14、29、43、57天的尿液进行检测。待建模57天时，处死小鼠，取得血液标本。

采用Chemray 240型全自动生化分析仪检测24h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平。

2、实验结果

(1)体重统计结果：

不同组大鼠的体重检测结果如下表和图212所示。假手术组在各个时间点的体重均明显高于手术+溶剂组(P＜0.05)；手术+M细胞治疗组在1-50天时，体重较手术+溶剂组有升高趋势，但无显著差异。在54和57天时，手术+M组治疗组体重显著高于手术+溶剂组(P＜0.05)；以上结果显示M细胞治疗组对于肾切除小鼠的体重具有明显促进作用。

表40-1：大鼠体重检测结果

(2)尿液和血生化检测

实验方法：将大鼠放入代谢笼中，隔天收取24h的尿液。收取第14、29、43、57天的尿液进行检测。待建模57天时，处死小鼠，取得血液标本。

实验结果：对不同组别小鼠在第57天的尿液和血生化相关检测，包括尿酸(UA)、尿素(UREA)和尿酐(CREA)含量的数值进行统计。结果发现，在第57天时，手术+溶剂组大鼠的尿酸、尿素、尿酐含量较假手术组均显著升高。表明肾切除手术模型构建成功，大鼠的肾脏受到严重损伤；M细胞治疗组第57天时，其体重升高，较手术+溶剂组有显著恢复。尿液和血生化检测的各项指标显示，M细胞治疗组的尿酸、尿素和尿酐含量较手术+溶剂组均显著降低。显示M细胞对于大鼠肾损伤具有保护作用，改善肾功能。移植M细胞后，肾切除大鼠模型的尿量以及尿酸在早期有一定程度的恢复。显示M细胞在肾切除手术的早期恢复具有一定的治疗作用。

(3)BMSC的分布

实验方法：肾组织BMSCs的存在:各组新鲜肺、肾组织进行冰冻连续切片(8μm厚)后应用荧光显微镜观察Hoechst33342标记的BMSCs，如果存在应显示蓝色荧光。

实验结果：建模后第57天，M细胞组大鼠肺脏可见大量集聚的蓝色荧光，肾皮质和肾髓质内可见少量分散均匀的蓝色荧光，显示M细胞移植后可定位至肾脏，其对于肾脏的损伤具有修复功能。可以预期M细胞对于肾脏损伤相关疾病(如肾纤维化、肾衰竭等)也有修复、治疗活性。

(4)组织形态学观察

实验方法：常规进行HE和Masson染色后，每张切片均观察30个肾小球和20个100倍的皮质视野，根据盲法原则由另外病理医师完成，采用半定量方法计算小球硬化指数和小管间质损伤指数，肾小球硬化定义为局灶或球性毛细血管袢的闭塞或玻璃样，肾小管问质损伤的定义为炎性细胞浸润、小管萎缩/代偿性扩张和问质纤维化。

实验结果：HE和Masson染色结果发现，手术+溶剂组的残肾组织出现广泛的肾小球明显肥大、部分肾小球出现节段性硬化或全球硬化、肾小管上皮细胞浊肿空泡变性，部分肾小管出现明显的扩张或萎缩；大量的炎性细胞浸润，肾间质灶性间质水肿或纤维化，M细胞治疗组的病理改变明显改善。进一步计算发现M细胞能够有效减少肾小球硬化指数和肾小管间质损伤指数。

实施例41：M细胞对神经性疼痛CCI的治疗活性评价

疼痛是人们一生中经常遇到的不愉快感觉，它的发生为躯体提供受到威胁的警报信号。另一方面，它又是各种疾病最常见的症状，神经病理性疼痛是由神经系统损伤或异常引起的一种难以治疗的疼痛状态。神经性疼痛就是发生在神经组织的疼痛。比如神经炎。这种疼痛主要以神经的病变为主，神经疼痛的特点，有一定的阵发性。有时候感觉到局部有疼痛，但是按压的时候并没有疼痛感。这就是神经性疼痛的特点。一般治疗神经疼痛，主要是使用营养神经的药物和配合止痛的药物治疗，最好是在医生指导下使用。本实施例通过移植M细胞来达到对神经性疼痛进行治疗的目的。

1、实验方法：

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

动物造模：

1、腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，40mg/kg。

2、水平固定其右后肢，以股骨作为参照物，在大腿中部位做一切口。

3、在大腿中部远端暴露坐骨神经至三根分叉部，分离结缔组织。在没有牵拉到神经构造的情况下，暴露坐骨神经的3个外周支神经(腓肠神经、腓总神经和胫神经)。

4、利用微创镊将5号手术丝线轻轻放置于腓总神经和胫神经下方。

5、结扎腓总神经和胫神经(避免神经拉扯或外科手术器材触碰到腓肠神经)。

6、分别缝合肌肉和皮肤；假手术组不进行结扎，其它操作步骤与上述相同。

7、共分为假手术组、手术+溶剂组、手术+M细胞组。

8、手术当天进行注射给药，记为第1天。分别在第1/5/8/12/14/19/21天进行M细胞的注射治疗，给药方式为：在造模部位肌肉注射2×10 ⁶个M细胞(分四点注射，每个点5×10 ⁵个M细胞)。在第14和21天进行弗莱毛和足称重检测以及弗莱毛检测。在第21天进行取材，收集血液。

测试一：

实验方法：机械性诱发痛测试：以up—down法推算50％缩足反射阈值。用vonfrey丝垂直刺激大鼠左侧后肢足底中部，持续时间≤4s，小鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。测定首先从最小刺激强度开始，当该力度的刺激不能引起阳性反应，则给予相邻大一级力度的刺激；如出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定4次，取平均值为阈值。分别于术前、制模后5、8、14、21进行测试。

实验结果：结果显示手术+溶剂组小鼠对于机械性诱发痛感的耐受程度显著低于假手术组，表明模型构建成功，模型小鼠对于机械性诱发痛感不耐受。M细胞治疗组大鼠在耐受程度显著升高，表明M细胞治疗对于神经性疼痛模型大鼠的机械性诱发疼痛的耐受程度具有明显的促进作用。

测试二：

实验方法：异常性冷痛测试：异常性冷痛测试是利用丙酮的挥发性导致的冷刺激进行。使用注射器在模型实施手术的外侧足底滴一滴约0.5mL的丙酮。观察受试动物反应，并根据动物的反应进行评分。评分规则如下：①无明显反应，0分；②有惊恐或震惊状，但无缩爪现象，1分；③有明显的缩爪现象，2分；④缩爪反应持续时间5～30s和舔爪现象，3分；⑤缩爪反应持续时问大于30s，或有发出叫声的，4分。分别于术前、制模后20天进行测试。

实验结果:结果显示手术+溶剂组小鼠对于异常性冷痛的耐受程度显著低于假手术组，表明模型构建成功，模型小鼠对于机械性诱发痛感不耐受。M细胞治疗组大鼠在异常性冷痛的耐受程度显著升高，表明M细胞治疗对于神经性疼痛模型大鼠的异常性冷痛的耐受程度具有明显的促进作用。

测试三：

实验方法：运动协调性能测试：动物的神经功能和运动协调性能的评估通过旋转电机测试(rotarodmotor test)。将受试动物放置一个均匀增加旋转速的圆形转杆上，在适应了30s时间后，圆杆转速由5r/min，缓慢增至40r/min。受试动物之间有一隔板将各个动物，测试仪器可以同时测试5只动物，相互不会受影响。若受试动物跌落到仪器的金属板上，仪器可自动停止时间记录。记录时间最大值为5min，超过5min则记录为5min。所有受试动物分别测试3次，每次间隔1h。取3次测试平均值为其在转杆上的维持时间。分别于术前、制模后20天进行测试。

实验结果:结果显示手术+溶剂组小鼠在转杆上维持平衡的时间显著缩短，表明模型构建成功，小鼠的运动协调能力受到显著影响。M细胞治疗组大鼠在转杆上维持平衡时间较溶剂组显著延长，表明M细胞治疗对于维持模型组大鼠的运动协调能力具有明显的促进作用。

测试四：

实验方法：ELISA测试：所有试验组的大鼠在进行最后一次行为学测试后立刻处死，并去其手术部位肌肉(长：宽：厚＝2cm：1em：0.5em)，加入适量生理盐水，匀浆，3000rmp/min，离心15min。处理完毕后，测定IL-1B、IL-10及IL-17炎性因子，实验步骤按照试剂盒(北京雅安达生物技术有限公司)说明书，进行操作。

实验结果:手术+溶剂组小鼠的炎性因子含量较假手术组显著升高，表明模型构建成功，小鼠体内存在炎症反应。M细胞治疗组大鼠的炎性因子含量较溶剂组显著下降，表明M细胞治疗对于神经性疼痛大鼠的炎症反应具有明显抑制作用。M细胞对于神经性疼痛的症状改善以及抑制炎症反应具有明显促进作用。

以上结果表明，移植M细胞后，神经性疼痛的协调运动能力明显改善，对于机械力以及异常性冷刺激的疼痛耐受能力的提高。M细胞可以抑制神经性疼痛的炎症反应。综上，M细胞对于神经性疼痛具有一定的治疗效果。

实施例42：M细胞对多发性硬化病的治疗活性评价

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

EAE模型的诱导：

200μl的CFA中添加200μg的MOG35-55和200μg结核分枝杆菌H37Ra，充分混匀后，注射在C57BL/6小鼠的右后侧和左后侧皮下。在免疫当天和免疫后2天，每只小鼠通过腹膜内注射接受200ng PTX(溶于生理盐水)。共分为3组：正常组、模型组、M细胞组，每组15只小鼠，在第30天进行取材。

正常组不进行任何处理，模型组与M细胞组造模后进行不同的治疗处理。M细胞组在第9、11、13进行尾静脉注射200μl生理盐水含有3×10 ⁶的M细胞；模型组尾静脉注射200μl生理盐水。

EAE评分标准：

从第一天开始，每天对小鼠进行EAE的临床体征评分。如下：0，无临床表达疾病；1，松弛的尾巴没有后肢无力；2，后肢无力；3，完全后肢瘫痪和松软的尾巴4，后肢瘫痪伴有软尾和尿或粪便失禁；5，垂死的。

标本取材

采集标本时，小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只小鼠需约20ml的生理盐水、20ml多聚甲醛。灌流完成后，取小鼠的脊髓，固定于多聚甲醛中，进行后续的切片鉴定。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

Fast Blue染色

1、石蜡切片5～8μm，脱蜡至水。

2、切片下行入95％乙醇稍洗。

3、入Luxol Fast Blue染色液室温染色。

4、入95％乙醇洗去多余染色液，蒸馏水冲洗。

5、分化液分色，入70％乙醇分色至灰白质清晰。

6、蒸馏水冲洗(如果分色不足，可重复4～5步骤)。

7、复染，水洗。

8、常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

免疫荧光染色：

(1)将组织切片脱蜡入水；

(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；

(3)正常羊血清封闭，37℃，60min；

(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。

(7)荧光显微镜观察拍照。

动物组织总蛋白提取

1.将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

3.盖上盖子室温孵育1-2分钟，14000-16000rpm离心2分钟取出。

悬液芯片系统检测因子分泌

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μl的磁珠。

(8)用100μl的洗液洗板两次。

(12)用100μl的洗液洗板两次。。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μl。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μl的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μl。

(20)用100μl的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

结果：

从EAE的评分结果中可以看到，模型组小鼠的临床评分在第15天达到4分，之后趋于稳定，而M细胞治疗组的评分，在第15天只有2分，之后一直在恢复，在实验终点30天取材时，评分仅有0-1分。说明M细胞尾静脉注射对EAE小鼠具有明显的治疗效果，因此M细胞在多发性硬化症方面有很好的治疗效果。

(Liming Du,et,al,2019,Cell Metabolism；Lianhua Bai,et,al,2012,Nature neuroscience)

从脊髓切片HE染色和Fast Blue染色(参照Du,et.al,2019,Cell Metabolism；Dang，et.al,2014,Autophagy；Bai,et.al,2012,Nature neuroscience)可以观察到经M细胞治疗后，脊髓脱髓鞘明显减少，且与模型组相比具有显著性差异。说明M细胞可以很好的减轻脊髓脱髓鞘化，在多发性硬化症中有很好的应用)。

从脊髓切片的免疫荧光图中可以看到，经M细胞治疗后，CD4+T细胞的比例与模型组相比有显著性下降，说明M细胞可以抑制脊髓部位的炎症，对缓解EAE小鼠脊髓节段的炎症有很好的治疗作用。

M细胞组与模型组性比，GFAP的比例下降了15％，A2B5上升了10％，O4上升了30％，β-tubulin上升了30％，说明M细胞治疗可以减少星型胶质细胞的数量，提高了少突胶质细胞的比例，说明M细胞可以很好的治疗EAE疾病小鼠，降低小鼠的脱髓鞘化。

对大鼠脊髓节段的蛋白，利用多因子试剂盒检测，发现经M细胞治疗后，促炎因子的含量明显下降，抑炎因子含量明显提高，营养因子含量明显提高。其中IFN-γ、IL-17、TNF-α、IL-2的下降尤为显著。抗炎因子IL-10有明显的上升。说明M细胞可以抑制炎症，调控脊髓的微环境，为M细胞治疗多发性硬化症提供证据。

综上：M细胞治疗可以减轻EAE小鼠的临床评分，降低脊髓的脱髓鞘化，抑制星型胶质细胞的增殖，保护少突胶质细胞，减低脊髓节段的促炎因子的含量，以上结果说明M细胞可以对EAE疾病小鼠起到有效的治疗效果。

实施例43：M细胞对尘肺的治疗活性评价

大量动物实验均表明MSCs移植治疗尘肺展示出很好的疗效和安全性。然而，成体组织来源MSC临床应用中主要存在如下缺点：(1)无法从单个个体组织获得治疗量的成体组织来源MSC；(2)成体组织来源MSC来源于不同的个体组织，无法实现产品质量的一致性；(3)即使同一个体组织来源的MSC也具有高度异质性；(4)成体组织来源MSC的供体组织来源复杂，具有潜在的传染性病原体感染风险；(5)成体组织来源MSC随着体外扩增会迅速衰老。因此，需要新的MSC细胞来源，用于治疗尘肺病。

相关文献：

(1)CT/NIRF dual-modal imaging tracking and therapeutic efficacy of transplanted mesenchymal stem cells labeled with Au nanoparticles in silica-induced pulmonary fibrosis。

(2)Therapeutic effects of adipose-tissue-derived mesenchymal stromal cells and their extracellular vesicles in experimental silicosis。

(3)Transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells attenuates pulmonary fibrosis of silicosis via anti-inflammatory and anti-apoptosis effects in rats。

目的：克服系统红斑狼疮干细胞治疗的细胞来源缺乏问题。

达成效果：移植M细胞后，减缓了血清中抗双链DNA抗体的上升速度，减缓了发病进程。

实验动物：C57小鼠，雄性，6-8周龄。动物购于北京维通利华。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，用于后续动物实验。

动物模型制备：

对照组：进行假手术，从颈部气管灌入1mL生理盐水；

模型组：手术从颈部气管灌入1mL 80％二氧化硅混悬液，造模后第7和21天尾静脉注射100μL生理盐水；

M细胞组：手术从颈部气管灌入1mL 80％二氧化硅混悬液，造模后第7和21天尾静脉注射3×106细胞/100μL/只。

标本取材：

造模后28天，试验结束，采集样本。小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，打开腹腔，中央静脉取血。开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，生理盐水灌注完成后，用50mL多聚甲醛进行固定，灌流完成后，取肺脏，进行固定切片分析。所取血液5000rpm室温离心15min，取上清，用于ELISA分析。

悬液芯片系统检测炎症因子：

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μL的磁珠。

(8)用100μL的洗液洗板两次。

(12)用100μL的洗液洗板两次。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μL。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μL的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μL。

(20)用100μL的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

免疫组化染色：

2.水化：蒸馏水洗2次，每次5min(置于摇床)；

3.石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS冲洗3次，每次3分钟；

4.抗原修复液(10mM pH 6.0柠檬酸钠缓冲液)的配制：

(2)工作液的配制：A液82mL+B液18mL+蒸馏水900mL；

12.自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝；

14.显微镜拍照。

Masson染色

(6)分化：1％冰醋酸处理1min。

(8)显微镜镜检，图像采集分析。

实验结果

(1)体重监测结果表明，模型组体重明显低于对照组和M细胞组；结果表明，M细胞可以提高尘肺小鼠体重。

(2)生存率统计结果表明，尘肺组体重明显低于对照组和M细胞组；结果表明，M细胞可以提高尘肺小鼠存活率。

(3)CT结果显示，与模型组相比，M细胞可以减少肺部致密部面积。

(4)肺功能测量结果显示，与模型组相比，M细胞可以改善肺功能，包括肺活量、最大通气量等得到改善，气道阻力变小。

(5)HE染色结果显示，模型组小鼠的肺组织呈典型的尘肺病样改变，可见各种炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，肺间质充血，出现细胞性结节(肉芽肿)，部分结节中心出现纤维化，或有大小不等的细胞性结节与纤维性结节同时存在，可见结节逐渐增大融合，甚至成片，肺泡结构明显减少。与模型组相比，M细胞可以降低炎性细胞浸润、减少细胞性结节的出现、维护肺泡结构的完整性(图214)。

(6)Masson染色结果显示，M细胞可以降低肺部纤维的含量，可以抑制纤维化的发生(图88)。

(7)免疫组化结果显示，M细胞可以降低肺部Collagen I和α-SMA蛋白的表达量，可以抑制纤维化的发生。

(8)检测了小鼠血清中的炎症因子，结果显示，与尘肺组比较，M细胞治疗组的促炎症因子水平明显降低，抑炎症因子水平明显升高。表明，M细胞有抑制炎症的作用。

总结：尘肺小鼠注射M细胞后，降低了血清中炎症因子水平，提高了小鼠肺功能，降低了肺部致密部面积，有更少的纤维化形成，显示出治疗尘肺很好的效果。同时，对其他呼吸系统疾病(例如肺纤维化、慢性肺阻等)有很好的治疗潜力。

实施例44：M细胞对慢性肺阻的治疗活性评价

复苏P3代M细胞，进行消化传代，用于后续动物实验。

动物模型制备：

对照组：进行假手术，从颈部气管灌入生理盐水；

慢阻肺组：手术从颈部气管灌入0.05U/g体重的胰酶，造模后第1和7天尾静脉注射100μL生理盐水；

慢阻肺+M细胞组：手术从颈部气管灌入0.05U/g体重的胰酶，造模后第1和7天尾静脉注射3×106细胞/100μL/只。

标本取材：

造模后21天，试验结束，采集样本。小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，打开腹腔，中央静脉取血。开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，生理盐水灌注完成后，用50mL多聚甲醛进行固定，灌流完成后，取肺脏，进行固定切片分析。所取血液5000rpm室温离心15min，取上清，用于ELISA分析。

悬液芯片系统检测炎症因子：

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μL的磁珠。

(8)用100μL的洗液洗板两次。

(12)用100μL的洗液洗板两次。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μL。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μL的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μL。

(20)用100μL的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

免疫组化染色：

2.水化：蒸馏水洗2次，每次5min(置于摇床)；

3.石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS冲洗3次，每次3分钟；

4.抗原修复液(10mM pH 6.0柠檬酸钠缓冲液)的配制：

(2)工作液的配制：A液82mL+B液18mL+蒸馏水900mL；

12.自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝；

14.显微镜拍照。

实验结果

(1)CT结果显示，与模型组相比，M细胞可以减少肺部致密部面积。

(2)肺功能测量结果显示，与模型组相比，M细胞可以改善肺功能，包括肺活量、最大通气量等得到改善，气道阻力变小。

(3)HE染色结果显示，与模型组相比，M细胞可以降低肺泡平均截距，能更好的维持肺部结构完整性。

(4)血气分析结果显示，与模型组相比，M细胞可以提高动脉血的氧分压。

(5)检测了小鼠血清中的炎症因子，结果显示，与尘肺组比较，M细胞可以降低促炎症因子水平，提高抑炎症因子水平。表明，M细胞有抑制炎症的作用。

(6)免疫组化结果显示，M细胞可以降低肺部Collagen I和α-SMA蛋白的表达量，可以抑制纤维化的发生。

总结：慢性肺阻小鼠注射M细胞后，降低了肺泡平均截距，降低了血清中炎症因子水平，提高了小鼠动脉血的氧分压和肺功能，降低了肺部致密部面积，有更少的纤维化形成，显示出治疗慢性肺阻很好的效果。同时，对其他呼吸系统疾病(例如肺纤维化、尘肺等)有很好的治疗潜力。

相关文献：

实施例45：M细胞对新月体肾炎的治疗活性评价

肾脏疾病为肾脏相关疾病，主要包括：原发性肾小球疾病、继发性肾小球肾炎、遗传性肾脏病、泌尿系统感染性肾脏病、肾小管疾病、间质性肾炎、肾结石和梗阻性肾病、囊肿性肾脏病和肾脏肿瘤、肾血管疾病、肾脏与高血压、妊娠与肾脏疾病、老年肾脏病、药(食物)源性肾损害、肾功能衰竭。相关流行病学资料显示，我国人群中慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)的发生率约为11～13％。据此，我国CKD患者超过1亿。肾脏繁杂的生理功能及其特有的组织结构特点使它在多种情况下易罹患损伤。

肾炎是指两侧肾脏非化脓性的炎性病变，是因肾小体受到损害出现浮肿、高血压、蛋白尿等肾炎现象，是肾脏疾病中最常见的一种。根据病因，肾炎可分为继发性和原发性肾小球肾炎。原发性肾小球肾炎占全部住院患者0.67-0.8％。继发性肾小球肾炎是由其他疾病(如糖尿病、高血压病、系统性红斑狼疮、过敏性紫癜、血管炎等)引起，是全身性疾病的肾脏受累及。根据临床分类，肾炎可分为急性、慢性和急进性肾炎综合征、隐匿性肾炎(无症状血尿和/或蛋白尿)。慢性肾炎包括系膜增生性肾小球肾炎、局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病、系膜毛细血管肾小球肾炎、硬化性肾炎。急进性肾炎病理改变特征为肾小球内新月体形成，又称为新月体性肾炎。

新月体肾炎又称为急进性肾炎。新月体肾炎是一组病情发展急骤，以血尿、蛋白尿、浮肿、高血压为主要临床表现，并迅速发展为少尿、无尿和肾功能衰竭的预后恶劣的肾小球肾炎的总称。按照病因，可分为原发性和继发性两大类。其中原发性新月体肾炎可分为抗肾小球基底膜抗体型、免疫复合物型、发病机理不明。继发性新月体肾炎可能是由于原发性肾小球疾病引起，如膜增生性肾炎，膜性肾病，IgA肾病(较少见)等；继发于感染性疾病：如感染性心内膜炎、链球菌感染后肾炎、隐匿性脏器细菌性病灶、乙型肝炎及流行性感冒等；继发于其它系统疾病：如系统性红斑狼疮、全身性血管炎，肺出血一肾炎综合征，过敏性紫癜、自发性冷球蛋白血症、恶性肿瘤及复发性多发性软骨炎等。

新月体肾炎是肾脏内科最为危重的肾小球疾病。该病进展急骤，进展快，预后差。临床表现为急进性肾小球肾炎，迅速进展至尿毒症，病理表现为大量新月体形成。半数以上的患者合并弥漫性肺泡出血，可因大咯血而窒息死亡。目前最为有效的治疗方式是血浆置换、糖皮质激素和环磷酰胺的联合治疗，属于肾脏疾病治疗的最强方案，需要耗费大量珍贵的血液资源和昂贵的费用。即使如此，患者的一年生存率只有70-80％，肾脏的一年存活率只有20-30％[Cui,Z.and M.H.Zhao,Nat Rev Nephrol,2011.7(12):697]。多数患者终生依赖透析或接受肾脏移植，患者生活质量低，医疗负担沉重，是肾脏疾病“因病致贫、因病返贫”的重要原因。因此该病的治疗急需新的突破，来减轻肾脏组织损伤、促进细胞修复和结构重建。

新月体肾炎是经典的自身免疫性肾脏病，也是研究肾小球疾病免疫炎症发病机制的理想疾病模型。其标志性特点是在患者的外周血中检测到抗基底膜(GBM)自身抗体，同时在肾组织的肾小球基底膜上见到抗体呈线条样沉积。同时多种炎症细胞和补体系统也参与了此病的发生发展，这些细胞分泌的各种细胞因子则参与疾病的调控。

间充质干细胞(MSCs)不但具有多向分化的潜能，而且具有分泌生物活性因子和免疫调节的作用，对减轻肾脏组织损伤、促进细胞修复和结构重建，具有很大的潜能。Furuhashi等人的研究发现少血清培养的脂肪来源的MSC可以有效减轻大鼠新月体肾炎的进展[Furuhashi,K.,et al,J Am Soc Nephrol,2013.24(4):587]，Suzuki等人的研究发现骨髓来源的MSC可以有效减轻大鼠抗GBM病的病情[Suzuki,T.,et al.,PLoS One,2013.8(6):e67475]。

动物模型：

实验动物：WKY大鼠，雄性，4-5周龄，动物购于北京维通利华公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，P5用于后续实验。

动物造模：每只WKY大鼠通过脚垫注射抗GBM病致病性的抗原表位P14 20ug，诱导疾病的发生。分组：正常组、模型组、M细胞治疗组。

正常组：不做任何处理。

模型组：尾静脉注射300μl的生理盐水，每周三次。

M细胞组处理：尾静脉注射300μl的生理盐水含有3×10 ⁶个M细胞，每周三次。

标本取材

采集标本时，大鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在大鼠腹部正中剪开皮肤，开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，每只大鼠需约50ml的生理盐水，取肾组织进行后续分析。

动物组织总蛋白提取

1.将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

3.盖上盖子室温孵育1-2分钟，14000-16000rpm离心2分钟取出。

悬液芯片系统检测因子分泌

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μl的磁珠。

(8)用100μl的洗液洗板两次。

(12)用100μl的洗液洗板两次。。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μl。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μl的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μl。

(20)用100μl的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

流式细胞术方法，借鉴文献(Taihei Suzuki,et,al,2013,Plos One)

结果：

与模型组相比，M细胞治疗组的大鼠肾的重量出现了明显的下降，对大鼠的尿蛋白和血肌酐的检测发现，M细胞注射治疗后尿蛋白和血肌酐出现了显著性的下降与模型组相比，说明M细胞可以有效恢复肾脏的功能。

用流式细胞学方法，对大鼠脾脏、肾脏中Th1、Th2、Th17和Treg细胞进行检测，结果发现经M细胞治疗后，Th1、Th2、Th17发生了明显的下调，而Treg细胞的比例出现了明显的上调，说明M细胞可以抑制肾脏的炎症情况，从而促进大鼠的恢复。

大鼠肾脏HE切片结果发现，模型组大鼠出现肾小球显示严重的纤维蛋白样坏死，细胞新月体数量较多，部分节段性肾小球硬化；而M细胞治疗组没有出现肾小球坏死，新月体数量较少，说明M细胞治疗可以抑制新月体的形成，对肾脏起到保护作用，在抗GBM病中有很好的治疗效果。

对肾脏组织切片进行免疫组化发现，经M细胞治疗后，肾脏组织中IL-1β、CD8、ED1细胞的比例出现了明显的下调，说明M细胞可以抑制肾脏的炎症情况，从而促进大鼠的恢复。

多因子检测结果，M细胞治疗组中促炎因子发生了明显的下调，比如IFN-γ、IL-6、TNF-α、iNOS等，抑炎因子IL-10发生了明显的上调。证明M细胞可以抑制新月体肾炎大鼠的炎症情况，有利于大鼠肾脏的恢复。

综上，M细胞治疗可以抑制炎症，降低模型鼠肾脏炎症情况，促进大鼠肾脏功能的恢复，说明M细胞可以有效治疗新月体肾炎。

实施例46：M细胞对系统红斑狼疮的治疗活性评价

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是自身免疫性疾病，目前其病因尚未肯定，大量研究表明与免疫异常有关。SLE是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病，常见于15～40岁的女性，临床上除有皮肤表现外，还有器官受累，以肾脏为主，临床出现肾损伤表现者占45％～85％。传统的治疗方法，如糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗等，虽能有效提高SLE患者的长期存活率，但部分患者仍然存在治疗抵抗，部分患者治疗无效，仍然有潜在的致死危险。目前认为SLE是在多种因素作用下，引起机体免疫调节功能紊乱，发生自身免疫反应，研究表明其主要发病机制与T、B淋巴细胞异常活化有关。近年来，大量研究表明MSCs对T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK)及树突状细胞(DC)有免疫调节作用，故也有学者认为SLE是一种干细胞疾病。因此，MSCs为SLE治疗提供一个新的视角。

大量动物实验均表明MSCs移植治疗SLE展示出很好的疗效和安全性。然而，成体组织来源MSC临床应用中主要存在如下缺点：(1)无法从单个个体组织获得治疗量的成体组织来源MSC；(2)成体组织来源MSC来源于不同的个体组织，无法实现产品质量的一致性；(3)即使同一个体组织来源的MSC也具有高度异质性；(4)成体组织来源MSC的供体组织来源复杂，具有潜在的传染性病原体感染风险；(5)成体组织来源MSC随着体外扩增会迅速衰老。因此，需要新的MSC细胞来源，用于治疗SLE。

目的：克服系统红斑狼疮干细胞治疗的细胞来源缺乏问题。

达成效果：移植M细胞后，减缓了血清中抗双链DNA抗体的上升速度，减缓了发病进程。本发明无毒副作用，治疗后小鼠死亡率很高，有明显的治疗效果。

实验动物：MRL/lpr小鼠(可自发产生红斑狼疮症状，ICR小鼠作为背景对照)，雌性，8周龄。动物购于南京君科生物工程有限公司。

复苏P3代M细胞，进行消化传代，用于后续实验。

动物模型制备：MRL/lpr小鼠(可自发产生红斑狼疮症状)，

①对照组：ICR小鼠；②模型组：MRL/lpr+生理盐水；③治疗组：MRL/lpr+M细胞。治疗组每两周鼠尾静脉注射3x10 ⁶细胞/只，共注射3次。

在第10、12、14、16周龄进行鼠尾静脉取血，进行ELISA检测抗双链DNA抗体水平。在第18周龄取血清，并进行灌流取肾脏，取材样本在多聚甲醛中浸泡过夜，之后进行石蜡切片，并进行HE染色。

标本取材：

采集标本时，小鼠腹腔麻醉后，仰卧位，在小鼠腹部正中剪开皮肤，打开腹腔，中央静脉取血。开胸，暴露心脏，用冰冷的生理盐水在心脏灌流，生理盐水灌注完成后，用50ml多聚甲醛进行固定，灌流完成后，取肾脏，进行固定切片分析。所取血液5000rpm室温离心15min，取上清，用于ELISA分析。

ELISA检测血清中抗双链DNA抗体

(1)鼠尾静脉取血，5000rpm，离心15min，取上清，可保存于-80℃冰箱或直接进行检测；

(2)将试剂盒置于室温中平衡30min；

(3)标准品的配制：用样本稀释配制20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.312ng/mL、0ng/mL浓度的标准品梯度；

(4)取出包被好的ELISA孔板，分别加入100μL待测品、标准品，37℃孵育2h；

(5)弃去液体，甩干，不用洗涤。

(6)每孔加入生物素标记的抗体100μL，37℃孵育1h；

(7)每孔加入Wash Buffer 200μL洗板子，洗5次；

(8)每孔加入辣根过氧化物酶标记的抗体100μL，37℃孵育1h；

(9)每孔加入200μL Wash Buffer洗板子，洗5次；

(10)每孔加入底物90μL，37℃避光孵育15～30min；

(11)待颜色变蓝稳定后，每孔加入50μL终止液，终止反应；

(12)用酶标仪在450nm处光测OD值，绘制标准曲线并计算样品中白蛋白的含量。

悬液芯片系统检测炎症因子：

(3)用Bio-Plex ManagerTM校准Bio-Plex系统。

(7)涡旋振荡稀释好的磁珠，每孔加入50μL的磁珠。

(8)用100μL的洗液洗板两次。

(12)用100μL的洗液洗板两次。

(13)涡旋振荡稀释好的抗体，每孔加250μL。

(15)标准品(试剂盒中有提供)、板子样本排布信息的输入。

(17)用100μL的洗液洗板两次。

(18)涡旋振荡稀释好的SA-PE，每孔加50μL。

(20)用100μL的洗液洗板三次。

(22)弃去封板膜，开始上机。

流式检测脾脏中T细胞的增殖

(1)取脾脏，消化成单细胞。

(2)以1000r/min离心5min。

(3)弃上清，用PBS重悬后用细胞筛过滤，滤去细胞团，计数，按每管2×106分装。

(4)1200rpm离心3min。

(5)用2％BSA封闭液封闭20min后，1200rpm离心3min。

(7)用1mL PBS洗三遍，1200rpm离心3min，弃上清。

(8)300μL PBS重悬后，用40μm细胞筛过滤后上机检测。

组织石蜡切片操作步骤

(1)固定：4％PFA浸泡组织，过夜固定。

(2)清洗：固定好的组织用PBS清洗3次。

(3)样本修剪：将样本修剪为合适大小，放到固定盒中。

(5)透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。

(6)浸蜡：二甲苯：石蜡(1:1)1h，石蜡Ⅰ 1h，石蜡Ⅱ 1h。

(7)包埋。

苏木素-伊红(HE)染色

(2)石蜡切片脱蜡、复水：

(3)染色：

分化：染色的石蜡切片在1％盐酸酒精中分化3-5s。

返蓝：自来水返蓝15min。

伊红染色：染色3min。

脱水透明：酒精梯度脱水，二甲苯透明。

三、实验结果

(1)每两周检测血清中抗双链DNA抗体水平。结果显示，随着周龄的增加，模型组和治疗组的抗双链DNA抗体水平逐渐升高，但是治疗组的抗双链DNA抗体水平的增加低于模型组，表明M细胞的注射可以减缓系统性红斑狼疮的发病进程。

各组血清抗双链DNA抗体水平的检测如图213所示。

表46-1 各组血清抗双链DNA抗体水平的检测

(2)解剖学观察发现，模型组小鼠的脾脏及颈部淋巴结明显肿大，显示有全身性的炎症。而移植M细胞组小鼠的脾脏及颈部淋巴结，则只有较轻微肿大。

(3)HE染色结果显示，M细胞组的肾小球新月体形成率高于模型组。

(4)检测了小鼠血清中的炎症因子，结果显示，与模型组比较，M细胞组的促炎症因子水平明显降低，抑炎症因子水平明显升高。表明，M细胞有抑制炎症的作用。

(5)脾脏细胞中，T细胞群体流式分析结果显示，M细胞组的CD3 ⁺T细胞、CD4 ⁺T细胞和CD4 ⁺T细胞均显著低于模型组。

总结：系统性红斑狼疮小鼠注射M细胞后，降低了血清中抗双链DNA抗体和炎症因子水平，提高了肾小球新月体形成率，降低了脾脏中T细胞群体数量，显示出治疗系统性红斑狼疮很好的效果。同时，对其他自身免疫性疾病(例如类风湿关节炎、系统性血管炎、皮肌炎等)有很好的治疗潜力。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

一种间充质干细胞群，其中，所述间充质干细胞群的平均MMP1表达水平是原代间充质干细胞的至少约10倍；和/或，所述间充质干细胞群的平均PGE2表达水平是原代间充质干细胞的至少约10倍。
权利要求1所述的间充质干细胞群，其具备以下特征：经IFN-γ刺激后，所述间充质干细胞群的平均PD-L1表达水平高于原代间充质干细胞；

优选地，经IFN-γ刺激后，所述间充质干细胞群的平均PD-L1表达水平是原代间充质干细胞的至少约2倍。
权利要求1或2所述的间充质干细胞群，其中，所述间充质干细胞群存在表达CD24的细胞；

优选地，所述CD24+细胞的比例不少于50％。
权利要求1-3任一项所述的间充质干细胞群，其中，所述间充质干细胞群还具有以下特征：

(1)包含≥80％(例如≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％)的细胞表达CD105、CD73、CD90、CD13、CD29、CD44、CD166和HLA-ABC中的一种或多种；

(2)包含≤2％(例如≤1％、≤0.5％、≤0.2％、≤0.1％或≤0.01％)的细胞表达CXCL1、CD34、CD45、CD133、FGFR2、CD271、Stro-1和CXCR4中的一种或多种。
权利要求1-4任一项所述的间充质干细胞群，其还具有以下特征中的一项或多项：

(1)存在表达CD274的细胞；例如，所述CD274+细胞的比例不少于80％；

(2)存在表达CD31的细胞；例如，所述CD31+细胞的比例不少于5％；

(3)所述间充质干细胞群的平均IDO表达水平高于原代间充质干细胞；例如，所述间充质干细胞群的平均IDO表达水平是原代间充质干细胞的至少约10倍。
权利要求1-5任一项所述的间充质干细胞群，其中，所述表达水平是mRNA水平或蛋白水平；

优选地，所述表达水平是mRNA水平。
权利要求1-6任一项所述的间充质干细胞群，其中，所述间充质干细胞群从干细胞产生；

优选地，所述干细胞是全能干细胞或多能干细胞；优选地，所述多能干细胞选自胚胎干细胞、单倍体干细胞、诱导多能干细胞、或成体干细胞。
一种产生间充质干细胞群的方法，其包括以下步骤：

(1)使用第一培养基培养干细胞以形成胚状体；其中，所述第一培养基是添加以下物质的基础培养基：一种或多种血清替代物、一种或多种非必需氨基酸、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、以及bFGF；

(2)使用第二培养基培养所述胚状体以诱导其分化为间充质干细胞；其中，所述第二培养基是添加以下物质的基础培养基：一种或多种血清替代物、一种或多种非必需氨基酸、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、以及一种或多种生长因子；

优选地，所述方法用于产生权利要求1-7任一项所述的间充质干细胞群。
权利要求8所述的方法，其中，所述干细胞是全能干细胞或多能干细胞；优选地，所述多能干细胞选自胚胎干细胞、单倍体干细胞、诱导多能干细胞、或成体干细胞。
权利要求8或9所述的方法，其中，所述第一培养基具备以下特征中的一项或多项：

(i)所述一种或多种血清替代物的总含量为3-30％(v/v)；

(ii)所述一种或多种非必需氨基酸各自的含量分别为0.1-0.5mM；

(iii)谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽的含量为1-5mM；

(iv)bFGF的含量为1-100ng/mL。
权利要求8-10任一项所述的方法，其中，所述第一培养基具备以下特征中的一项或多项：

(a)所述血清替代物选自KOSR、MSC无血清添加剂、Ultroser ^TMG及其任意组合；

(b)所述非必需氨基酸选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸及其组合；

(c)所述基础培养基选自KO-DMEM、KO-DMEM/F12、DMEM、α-MEM、F-12、MEM、BME、RPMI 1640、G-MEM及其任意组合；优选地，所述基础培养基选自KO-DMEM、KO-DMEM/F12、DMEM、DMEM/F12。
权利要求8-11任一项所述的方法，其中，所述第一培养基包括：KO-DMEM、KOSR、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、和bFGF；

优选地，所述第一培养基包含：3-30％(v/v)的KOSR、1-5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、1-100ng/mL的bFGF、以及浓度各自为0.1-0.5mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。
权利要求8-12任一项所述的方法，其中，所述第一培养基进一步包含β-巯基乙醇；

优选地，β-巯基乙醇的含量为0.1-0.5％(v/v)。
权利要求8-13任一项所述的方法，其中，所述第二培养基具备以下特征中的一项或多项：

(i)所述一种或多种血清替代物的总含量为1-40％(v/v)；

(ii)所述一种或多种非必需氨基酸各自的含量分别为0.1-0.5mM；

(iii)谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽的含量为1-5mM；

(iv)所述一种或多种生长因子各自的含量分别为1-100ng/mL。
权利要求8-14任一项所述的方法，其中，所述第二培养基具备以下特征中的一项或多项：

(a)所述血清替代物选自KOSR、MSC无血清添加剂、Ultroser ^TMG及其任意组合；

(b)所述非必需氨基酸选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、 L-脯氨酸、L-丝氨酸及其组合；

(c)所述基础培养基选自KO-DMEM、KO-DMEM/F12、α-MEM、DMEM、F12、MEM、BME、RPMI 1640、G-MEM及其任意组合；优选地，所述基础培养基选自KO-DMEM、KO-DMEM/F12、α-MEM、DMEM、DMEM/F12；

(d)所述一种或多种生长因子选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ或PDGF。
权利要求8-15任一项所述的方法，其中，所述第二培养基包含：KO-DMEM/F12、α-MEM、MSC无血清添加剂或Ultroser G、KOSR、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)；

优选地，所述第二培养基包含：1-10％(v/v)的Ultroser G、1-20％(v/v)的KOSR、1-5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、浓度各自为1-100ng/mL的的一种或多种生长因子(例如选自VEGF、bFGF、EGF、TGFβ、PDGF中的一种或多种)，以及浓度各自为0.1-0.5mM的下列氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。
权利要求8-16任一项所述的方法，其中，所述第二培养基进一步包含抗坏血酸；

优选地，抗坏血酸的含量为1-100μg/mL。
权利要求8-17任一项所述的方法，其中，所述步骤(1)包括在低吸附细胞培养皿中培养所述干细胞。
权利要求8-18任一项所述的方法，其中，所述步骤(2)包括在包被有明胶、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤维黏连蛋白或多聚赖氨酸的培养皿中培养所述胚状体。
权利要求8-19任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：(3)分离步骤(2)中附着于培养容器的细胞，从而获得间充质干细胞。
权利要求20所述的方法，其中，所述方法还包括对步骤(3)的间充质干细胞进行传代；

优选地，当细胞汇合度大于或等于约80％(例如，大于或等于约85％，大于或等于约90％，或大于或等于约95％)时，对所述细胞进行传代；

优选地，对所述间充质干细胞传代1代、2代、3代、4代或5代；

优选地，所述传代包括将细胞接种于所述第二培养基进行培养。
一种培养物，其包含权利要求1-7任一项所述的间充质干细胞群，以及培养基。
一种培养上清，其为在培养基中培养权利要求1-7任一项所述的间充质干细胞群所产生的培养上清。
一种组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的间充质干细胞群、权利要求22所述的培养物、或权利要求23所述的培养上清，以及载体或赋形剂；

优选地，所述组合物为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、栓剂、凝胶剂、口服剂、气雾剂、滴剂、软膏剂、埋置剂、胶囊剂或气雾剂；

优选地，所述组合物为注射剂；

优选地，所述组合物包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液；

优选地，所述组合物是药物组合物。
一种试剂盒，其包含第一培养基和第二培养基，其中，

所述第一培养基是添加以下物质的基础培养基：一种或多种血清替代物、一种或多种非必需氨基酸、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、和bFGF；

所述第二培养基是添加以下物质的基础培养基：一种或多种血清替代物、一种或多种非必需氨基酸、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、以及一种或多种生长因子；

优选地，所述第一培养基如权利要求10-13任一项中定义；

优选地，所述第二培养基如权利要求14-17任一项中定义；

优选地，所述第一培养基和第二培养基是分开提供的。
权利要求1-7任一项所述的间充质干细胞群、权利要求22所述的培养物、权利要求23所述的培养上清、或权利要求24所述的组合物，在制备用于在受试者中预防和/或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自骨关节病(例如，半月板损伤、骨关节炎、或骨损伤)、生殖系统疾病(例如，卵巢衰老、卵巢功能不全、子宫内膜损伤、子宫创伤、宫腔粘连、或薄型子宫)、心脏疾病(例如，心肌梗死)、肺部疾病(例如，特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫症、尘肺、或肺炎)、皮肤疾病(例如，银屑病、皮肤损伤、褥疮、压疮、或烧伤)、眼部疾病(例如，角膜损伤)、神经系统疾病(例如，脊髓损伤、脑瘫、脑中风、阿尔茨海默症、老年痴呆、或神经性疼痛)、消化系统疾病(例如，炎症性肠炎、结肠炎、克罗恩病、或肠激综合征)、肾脏疾病(例如，抗肾小球基底膜病、糖尿病肾病、狼疮性肾炎、或急性肾炎)、肝脏疾病(肝损伤、肝纤维化、肝炎、肝硬化、或肝功能衰竭)、自身免疫性疾病(例如，硬皮病、红斑狼疮、或多发性硬化)、移植排斥(例如，移植物抗宿主病)、代谢性疾病(例如，糖尿病)。