JP2022548997A - 多能性幹細胞、医薬組成物、並びにそれらの調製方法及びそれらの適用 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞療法の分野に関し、詳細には、間葉系幹細胞集団を製造する方法、その方法により製造される間葉系幹細胞集団及びその培養上清、並びにそのような細胞又はその培養上清を含む医薬組成物に関する。本発明は更に、疾患の予防及び治療のための、間葉系幹細胞集団及びその培養上清の使用に関する。

Description

本発明は、細胞療法の分野に関する。詳細には、本発明は、間葉系幹細胞集団を製造する方法、その方法により製造される間葉系幹細胞集団及びその培養上清、並びにそのような細胞又はその培養上清を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、疾患の予防及び／又は治療のための、間葉系幹細胞集団及びその培養上清、並びにそのような細胞又はその培養上清を含む医薬組成物の使用に関する。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、自己複製能力及び多方向分化能を備えた成体幹細胞であり、これらは脳、脾臓、肝臓、腎臓、肺、骨髄等のような広範な供給源に由来し、ほぼ全ての結合組織から分離され得る。過去数十年にわたって、研究者らはＭＳＣを幹細胞治療研究の対象としてきた。ＭＳＣは、様々な結合組織から簡単に得られ、大量に増殖させて多数の細胞を得ることができる。胚性幹細胞（ＥＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、それらの潜在的な腫瘍形成性及び倫理的問題のため臨床利用が制限されている。間葉系幹細胞は多方向分化能、免疫調節機能、及び低い免疫原性を有するにもかかわらず、腫瘍形成性が認められていないため、幹細胞治療に関する臨床利用に役立つシード細胞となっている。

これまで、殆どの治療用途は、成人の骨髄又は臍帯に由来するＭＳＣを研究対象としている。これらは骨髄及び臍帯から容易に分離することができるが、供給源が限られていること、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養時間の増加に伴ってそれらの増殖能力及び分化能が低下すること等の問題が依然として存在する。したがって、細胞の量及び質が不安定であるという問題は、骨髄源に由来するＭＳＣの臨床利用に影響を及ぼす。

ＭＳＣの供給源の問題を解決するために、ＭＳＣの新しい供給源を開拓することが可能である。胚性幹細胞は無制限に増殖する能力を有し、中胚葉、内胚葉、及び外胚葉の様々な細胞及び組織に分化する能力を有するため、これらをＭＳＣの新しい供給源として使用することができる。近年、多くの研究で、ヒト胚性幹細胞から間葉状細胞を誘導する方法が報告されている。しかしながら、誘導効率が低く、誘導プロセスが複雑であり、そして誘導時間が長い等の不利点が依然として存在し、殆どの方法では血清等の異種物質を使用する必要があるため、これらを臨床的に使用することができない。

結論として、間葉系幹細胞を取得する現在の方法が幾つかの不利点により制限されているという事実を考慮すると、間葉系幹細胞を高純度、高収率、及び短時間で作製して、様々な疾患の臨床的な治療及び予防に使用する方法を見出すことが非常に必要とされる。

本発明の内容
多くの実験及び繰り返しの調査の末、本出願の発明者らは、幹細胞（例えば、全能性幹細胞又は多能性幹細胞）からｉｎ ｖｉｔｒｏで間葉系幹細胞を製造する方法を得た。この方法により得られた間葉系幹細胞はサイトカイン分泌量を大幅に改善し、こうして本発明の完成に至った。本明細書において、本発明の細胞又は本発明の方法によって得られた細胞は、Ｍ細胞と呼ばれることがある。

間葉系幹細胞集団
したがって、第１の態様においては、本発明は、間葉系幹細胞集団であって、初代間葉系幹細胞よりも少なくとも約１０倍（例えば、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２０００倍、少なくとも約３０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約８０００倍、少なくとも約１００００倍、又は少なくとも約１２０００倍）高い平均ＭＭＰ１発現レベル（例えば、遺伝子改変の不存在下で）を有する、及び／又は初代間葉系幹細胞よりも少なくとも約１０倍（例えば、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、又は少なくとも約８０倍）高い平均ＰＧＥ２発現レベル（例えば、遺伝子改変の不存在下で）を有する、間葉系幹細胞集団を提供する。

本明細書において使用される場合に、「初代間葉系幹細胞」という用語は、身体から直接取り出された組織（例えば、脂肪組織、臍帯、骨髄、又は臍帯血）から分離された間葉系幹細胞を指す。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団のＭＭＰ１発現レベルは、同量の初代間葉系幹細胞のそれよりも少なくとも約１０倍（例えば、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２０００倍、少なくとも約３０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約８０００倍、少なくとも約１００００倍、又は少なくとも約１２０００倍）高い。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団のＰＧＥ２発現レベルは、同量の初代間葉系幹細胞のそれよりも少なくとも約１０倍（例えば、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、又は少なくとも約８０倍）高い。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団のＰＧＥ２発現レベルは、同量の初代間葉系幹細胞のそれよりも約８０倍高い。

或る特定の実施の形態においては、ＩＦＮ－γ（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ）による刺激後に、間葉系幹細胞集団は、初代間葉系幹細胞よりも高い平均ＰＤ－Ｌ１発現レベル（例えば、遺伝子改変の不存在下で）を有する。或る特定の実施の形態においては、ＩＦＮ－γ（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ）による刺激後に、間葉系幹細胞集団の平均ＰＤ－Ｌ１発現レベルは、初代間葉系幹細胞のそれよりも少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約３倍）高い。或る特定の実施の形態においては、５０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γによる刺激後に、間葉系幹細胞集団の平均ＰＤ－Ｌ１発現レベルは、初代間葉系幹細胞のそれよりも約３倍高い。或る特定の実施の形態においては、ＩＦＮ－γ（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ）による刺激後に、間葉系幹細胞集団の平均ＰＤ－Ｌ１発現レベルは、同量の初代間葉系幹細胞のそれよりも少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約３倍）高い。或る特定の実施の形態においては、５０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γによる刺激後に、間葉系幹細胞集団の平均ＰＤ－Ｌ１発現レベルは、同量の初代間葉系幹細胞のそれよりも約３倍高い。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団の平均ＩＤＯ発現レベル（例えば、遺伝子改変の不存在下で）は、初代間葉系幹細胞のそれよりも高い。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団の平均ＩＤＯ発現レベルは、初代間葉系幹細胞のそれよりも少なくとも約１０倍（例えば、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１１０倍）高い。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団の平均ＩＤＯ発現レベルは、初代間葉系幹細胞のそれよりも約１１０倍高い。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、同量の初代間葉系幹細胞よりも少なくとも約１０倍（例えば、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１１０倍）高いＩＤＯ発現レベルを有する。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、同量の初代間葉系幹細胞よりも少なくとも約１１０倍高いＩＤＯ発現レベルを有する。

本明細書においては、発現は、遺伝子の完全長ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ断片、完全長タンパク質、又はタンパク質断片のレベルを測定することによってモニタリングされ得る。したがって、或る特定の実施の形態においては、発現レベルは、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルである。

幾つかの実施の形態においては、発現は、遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の発現を分析することによって評価される。例えば、細胞集団における上述の遺伝子の発現は、ＲＴ－ＰＣＲによって細胞集団におけるＩＤＯ、ＭＭＰ１、ＰＤＬ１、又はＰＧＥ２のｍＲＮＡの存在又は含有量を決定することによって決定される。

他の実施の形態においては、発現は、遺伝子のタンパク質産物の発現を分析することによって評価される。例えば、細胞集団における上述の遺伝子の発現は、免疫学的検出によって細胞集団の培養上清におけるＩＤＯタンパク質、ＭＭＰ１タンパク質、ＰＤＬ１タンパク質、又はＰＧＥ２タンパク質の存在又は含有量を決定することによって決定される。したがって、或る特定の実施の形態においては、遺伝子（例えば、ＩＤＯ、ＭＭＰ１、ＰＤＬ１、又はＰＧＥ２）の発現レベルは、培養上清において分泌された対応するタンパク質のレベルによって評価される。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、遺伝子改変の不存在下で上述の遺伝子発現特質の１つ以上を有する。ここで、「遺伝子改変の不存在下で」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの形の外因性遺伝物質を細胞の全遺伝物質に導入する過程を経ていないことを指し、「外因性遺伝物質」という用語は、遺伝子改変されていない細胞に対して外因性である人工的に導入されたヌクレオチド配列を指し得る。上述の「遺伝子改変の不存在下で」は、本発明の間葉系幹細胞集団が上述の遺伝子発現特質の１つ以上を有するという条件を説明するだけに使用され、本発明の間葉系幹細胞集団が遺伝子改変を含んではならないという限定として使用されることがないことは容易に理解される。したがって、或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は１つ以上の遺伝子改変を含み得る。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は幹細胞から作製される。或る特定の実施の形態においては、幹細胞は全能性幹細胞又は多能性幹細胞である。或る特定の実施の形態においては、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、半数体幹細胞、人工多能性幹細胞、又は成体幹細胞から選択される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から作製される。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製される。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、以下の特徴：
（１）ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、及びＨＬＡ－ＡＢＣからなる群から選択される１つ以上を発現する細胞を８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）含むという特徴、
（２）ＣＸＣＬ１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ－１、及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１つ以上を発現する細胞を２％以下（例えば、１％以下、０．５％以下、０．２％以下、０．１％以下、又は０．０１％以下）含むという特徴、
を更に有する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は更に、以下の特質：
（３）ＣＤ２７４を発現する細胞を有すること、
（４）ＣＤ２４を発現する細胞を有すること、
（５）ＣＤ３１を発現する細胞を有すること、
の１つ以上を有する。

或る特定の実施の形態においては、ＣＤ２７４^＋細胞は、８０％以上、例えば８０％～９５％、例えば約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、又は約９５％の割合を有する。

或る特定の実施の形態においては、ＣＤ２４^＋細胞は、５０％以上、例えば５０％～７０％、例えば約５０％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、又は約７０％の割合を有する。

或る特定の実施の形態においては、ＣＤ３１^＋細胞は、５％以上、例えば５％～２０％、例えば約５％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、又は約２０％の割合を有する。

本発明の間葉系幹細胞集団は、医薬組成物として製剤化されて投与され得る。そのような医薬組成物は、好ましくは注射（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である、医療分野において知られるあらゆる形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

間葉系幹細胞集団の調製方法
第２の態様においては、本発明は、間葉系幹細胞集団を製造する方法、又は第１の態様において記載される間葉系幹細胞集団を製造する方法であって、以下の工程：
（１）第１の培養培地を使用して幹細胞を培養して胚様体を形成する工程であって、第１の培養培地が、以下の物質：１つ以上の血清代替品、１つ以上の非必須アミノ酸、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及びｂＦＧＦが補充された基礎培地である、工程と、
（２）第２の培養培地を使用して胚様体を培養して、間葉系幹細胞へのその分化を誘導する工程であって、第２の培養培地が、以下の物質：１つ以上の血清代替品、１つ以上の非必須アミノ酸、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及び１つ以上の成長因子が補充された基礎培地である、工程と、
を含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、工程（２）は、胚様体を培養容器に付着させ、それを第２の培養培地を用いて培養することを含む。

本明細書において使用される場合に、「基礎培地」という用語は、細胞成長を支持することができ、典型的には無機塩、ビタミン、グルコース、緩衝剤系、及び必須アミノ酸を含み、かつ典型的には約２８０ｍＯｓｍｏｌ～３３０ｍＯｓｍｏｌのオスモル濃度を有するあらゆる培養培地を指す。

或る特定の実施の形態においては、工程（１）において記載される幹細胞は、全能性幹細胞又は多能性幹細胞である。或る特定の実施の形態においては、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、半数体幹細胞、人工多能性幹細胞、又は成体幹細胞から選択される。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、以下の特質：
（ｉ）１つ以上の血清代替品が、３％（容量／容量）～３０％（容量／容量）、例えば約３％（容量／容量）、約５％（容量／容量）、約８％（容量／容量）、約１０％（容量／容量）、約１２％（容量／容量）、約１５％（容量／容量）、約１８％（容量／容量）、約２０％（容量／容量）、約２２％（容量／容量）、約２５％（容量／容量）、約２８％（容量／容量）、又は約３０％（容量／容量）の総含有量を有すること、
（ｉｉ）１つ以上の非必須アミノ酸がそれぞれ、０．１ｍＭ～０．５ｍＭ、例えば約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、又は約０．５ｍＭの含有量を有すること、
（ｉｉｉ）グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチドが、１ｍＭ～５ｍＭ、例えば約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、又は約５ｍＭの含有量を有すること、
（ｉｖ）ｂＦＧＦが、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば２ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、又は５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約５５ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約８５ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約９５ｎｇ／ｍｌ、又は約１００ｎｇ／ｍｌの含有量を有すること、
の１つ以上を有する。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、以下の特質：
（ａ）血清代替品が、ＫＯＳＲ、ＭＳＣ無血清サプリメント、Ｕｌｔｒａｓｅｒ（商標）Ｇ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されること、好ましくは、血清代替品が、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＳＲ（例えば、Thermo：カタログ番号１０８２８０２８）（以下、ＫＯＳＲと呼ぶ）であること、
（ｂ）非必須アミノ酸が、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されること、
（ｃ）基礎培地が、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ（例えば、Gibco：カタログ番号１０８２９０１８）（以下、ＫＯ－ＤＭＥＭと呼ぶ）、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（例えば、Gibco：カタログ番号１２６６０－０１２）（以下、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２と呼ぶ）、ＤＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ １６４０、Ｇ－ＭＥＭ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されること、好ましくは、基礎培地が、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる群から選択されること、好ましくは、基礎培地が、ＫＯ－ＤＭＥＭであること、
の１つ以上を有する。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯＳＲ、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及びｂＦＧＦを含む。或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、３％（容量／容量）～３０％（容量／容量）のＫＯＳＲ、１ｍＭ～５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、β－メルカプトエタノールを更に含む。或る特定の実施の形態においては、β－メルカプトエタノールは、０．１％（容量／容量）～０．５％（容量／容量）、例えば約０．１％（容量／容量）、約０．２％（容量／容量）、約０．３％（容量／容量）、約０．４％（容量／容量）、又は約０．５％（容量／容量）の含有量を有する。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、本質的に、以下の成分：ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯＳＲ、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ｂＦＧＦ、及びβ－メルカプトエタノールからなる。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、３％（容量／容量）～３０％（容量／容量）のＫＯＳＲ、１ｍＭ～５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、０．１％（容量／容量）～０．５％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、約１５％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、約０．１％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、約１８％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、約０．１％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、約２０％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、約０．１％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、約２２％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、約０．２％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地は、約２２％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、約０．１％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及びそれぞれ約０．２ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第１の培養培地は、本質的に、ＫＯ－ＤＭＥＭ（Gibco：カタログ番号１０８２９０１８）、ＫＯＳＲ（Thermo：カタログ番号１０８２８０２８）、ＮＥＡＡ（Gibco：カタログ番号１１１４００５０）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco：カタログ番号Ａ１２８６００１）、ｂＦＧＦ、及びβ－メルカプトエタノールからなる。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第１の培養培地は、１８％（容量／容量）～２２％（容量／容量）のＫＯＳＲ、０．５％（容量／容量）～１．５％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、０．１％（容量／容量）～０．５％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及び１％（容量／容量）～２％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第１の培養培地は、約１５％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約０．５％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、約０．１％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第１の培養培地は、約１８％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約０．５％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、約０．１％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第１の培養培地は、約２０％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、約０．１％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第１の培養培地は、約２２％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、約０．２％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第１の培養培地は、約２２％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、約０．１％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノール、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、以下の特質：
（ｉ）１つ以上の血清代替品が、１％（容量／容量）～４０％（容量／容量）、例えば１％（容量／容量）～３５％（容量／容量）、１％（容量／容量）～３０％（容量／容量）、２％（容量／容量）～３０％（容量／容量）、５％（容量／容量）～３０％（容量／容量）、１％（容量／容量）～２０％（容量／容量）、２％（容量／容量）～２０％（容量／容量）、５％（容量／容量）～２０％（容量／容量）、１％（容量／容量）～１０％（容量／容量）、２％（容量／容量）～１０％（容量／容量）、又は５％（容量／容量）～１０％（容量／容量）、例えば約１％（容量／容量）、約２％（容量／容量）、約３％（容量／容量）、約５％（容量／容量）、約８％（容量／容量）、約１０％（容量／容量）、約１２％（容量／容量）、約１５％（容量／容量）、約１８％（容量／容量）、約２０％（容量／容量）、約２２％（容量／容量）、約２５％（容量／容量）、約２８％（容量／容量）、又は約３０％（容量／容量）の総含有量を有すること、
（ｉｉ）１つ以上の非必須アミノ酸がそれぞれ、０．１ｍＭ～０．５ｍＭ、例えば０．１ｍＭ～０．２ｍＭ、例えば約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、又は約０．５ｍＭの含有量を有すること、
（ｉｉｉ）グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチドが、１ｍＭ～５ｍＭ、例えば１ｍＭ～３ｍＭ、例えば約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、又は約５ｍＭの含有量を有すること、
（ｉｖ）１つ以上の成長因子がそれぞれ、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約５５ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約８５ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約９５ｎｇ／ｍｌ、又は約１００ｎｇ／ｍｌの含有量を有すること、
の１つ以上を有する。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、以下の特質：
（ａ）血清代替品が、ＫＯＳＲ、ＭＳＣ無血清サプリメント、Ｕｌｔｒｏｓｅｒ（商標）Ｇ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されること、
（ｂ）非必須アミノ酸が、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されること、
（ｃ）基礎培地が、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ １６４０、Ｇ－ＭＥＭ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されること、好ましくは、基礎培地が、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる群から選択されること、
の１つ以上を有する。

或る特定の実施の形態においては、血清代替品は、ＫＯＳＲ、及びＭＳＣ無血清サプリメント（例えば、TBD：カタログ番号ＳＣ２０１３－Ｇ－Ｂ）及びＵｌｔｒａｓｅｒ（商標）Ｇ（例えば、PALL：カタログ番号１５９５０－０１７）（以下、Ｕｌｔｒｏｓｅｒ Ｇとして挙げられる）からなる群から選択される血清代替品である。或る特定の実施の形態においては、ＫＯＳＲ対ＭＳＣ無血清サプリメント又はＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇの容量比は、２：１～１５０：１の範囲、例えば約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約８０：１、約１００：１、約１２０：１、又は約１５０：１である。或る特定の実施の形態においては、ＫＯＳＲ対ＭＳＣ無血清サプリメント又はＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇの容量比は、１０：１～１：２、例えば約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、又は約１：２である。

或る特定の実施の形態においては、ＫＯＳＲは、約１％（容量／容量）～３０％（容量／容量）、約１％（容量／容量）～２０％（容量／容量）、約１％（容量／容量）～１０％（容量／容量）、約２％（容量／容量）～１０％（容量／容量）、又は約５％（容量／容量）～１０％（容量／容量）の含有量を有する。或る特定の実施の形態においては、ＭＳＣ無血清サプリメント又はＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇは、約１％（容量／容量）～１０％（容量／容量）、又は約１％（容量／容量）～５％（容量／容量）の含有量を有する。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２、α－ＭＥＭ、ＭＳＣ無血清サプリメント又はＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇ、ＫＯＳＲ、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）を含む。或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、１％（容量／容量）～１０％（容量／容量）のＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇ、１％（容量／容量）～２０％（容量／容量）のＫＯＳＲ、１ｍＭ～５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、それぞれ１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及びそれぞれ０．１ｍＭ～０．５ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、アスコルビン酸を更に含む。或る特定の実施の形態においては、アスコルビン酸は、１μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌ、例えば１μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ～５０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、又は５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、例えば約１μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、又は約１０００μｇ／ｍｌの含有量を有する。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、本質的に、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２、α－ＭＥＭ、ＭＳＣ無血清サプリメント又はＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、ＫＯＳＲ、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、アスコルビン酸、及び１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）からなる。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、１％（容量／容量）～５％（容量／容量）（例えば、約１％（容量／容量）、約２％（容量／容量）、約３％（容量／容量）、約４％（容量／容量）、又は約５％（容量／容量））のＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇ、２％（容量／容量）～２０％（容量／容量）（例えば、約２％（容量／容量）、約４％（容量／容量）、約６％（容量／容量）、約８％（容量／容量）、約１０％（容量／容量）、約１２％（容量／容量）、約１４％（容量／容量）、約１６％（容量／容量）、約１８％（容量／容量）、又は約２０％（容量／容量））のＫＯＳＲ、１ｍＭ～５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、１μｇ／ｍｌ～１０００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦから選択される１つ以上）、及びそれぞれ０．１ｍＭ～０．５ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、約１％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約４％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、約１％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約６％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、約１％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約８％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、約２％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約４％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、約２％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約６％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の培養培地は、約２％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約８％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及びそれぞれ約０．１ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第２の培養培地は、本質的に、以下の成分：ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Gibco：カタログ番号１２６６０－０１２）、α－ＭＥＭ（HyClone：カタログ番号ＳＨ３０２６５．０１Ｂ）、Ｕｌｔｒａｓｅｒ Ｇ（PALL：カタログ番号１５９５０－０１７）、ＫＯＳＲ（Thermo：カタログ番号１０８２８０２８）、ＮＥＡＡ（Gibco：カタログ番号１１１４００５０）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco：カタログ番号Ａ１２８６００１）、アスコルビン酸、１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）からなる。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第２の培養培地は、１％（容量／容量）～２％（容量／容量）のＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇ、４％（容量／容量）～６％（容量／容量）のＫＯＳＲ、０．５％（容量／容量）～１．５％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、１μｇ／ｍｌ～１０００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及び１％（容量／容量）～２％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第２の培養培地は、約１％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約４％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第２の培養培地は、約１％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約６％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第２の培養培地は、約１％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約８％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約１％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第２の培養培地は、約２％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約４％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約０．５％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第２の培養培地は、約２％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約６％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約０．５％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の例示的な実施の形態においては、第２の培養培地は、約２％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、約８％（容量／容量）のＫＯＳＲ、約０．５％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、それぞれ約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦからなる群から選択される１つ以上）、及び約１％（容量／容量）のＮＥＡＡを含む。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地及び第２の培養培地に含まれる成分は、全て細胞療法グレード（ＣＴＳグレード）である。或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地及び第２の培養培地に含まれる基礎培地（例えば、ＫＯ－ＤＭＥＭ）、血清代替品（例えば、ＫＯＳＲ）、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチドは、全て細胞療法グレード（ＣＴＳグレード）である。

或る特定の実施の形態においては、工程（１）は、低付着性細胞培養容器において多能性幹細胞を培養することを含む。

本明細書において使用される場合に、「低付着性細胞培養容器」という用語は、培養容器の表面上でのタンパク質の吸着を防ぎ、それによって培養容器への単層細胞の付着を最小限に抑えるコーティングを表面に備えた培養容器を指す。そのような細胞培養容器は、当業者に既知であり、限定されるものではないが、Corningの低付着性ディッシュ（カタログ番号３２６２）が挙げられる。

或る特定の実施の形態においては、工程（１）における培養は、３日～１４日、例えば約３日、約４日、約５日、約７日、約１０日、又は約１４日の継続時間を伴う。

或る特定の実施の形態においては、工程（１）における培養は、４日～７日、例えば約５日の継続時間を伴う。

或る特定の実施の形態においては、工程（２）は、工程（１）の胚様体を培養容器内に約１個の胚様体／ｃｍ^２の密度で接種することを含む。

或る特定の実施の形態においては、工程（２）は、胚様体を、ゼラチン、コラーゲンタイプＩ、コラーゲンタイプＩＶ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、又はポリリジンでコーティングされた培養容器において培養することを含む。

或る特定の実施の形態においては、工程（２）は、胚様体を、ビトロネクチンでコーティングされた培養容器において培養することを含む。

或る特定の実施の形態においては、工程（２）における培養は、１０日～２１日、例えば約１０日、約１４日又は約２１日の継続時間を伴う。

或る特定の実施の形態においては、工程（２）における培養は、１０日～１４日、例えば約１４日の継続時間を伴う。

或る特定の実施の形態においては、工程（２）は、毎日、又は１日～７日ごとに（例えば、１日ごとに、２日ごとに、３日ごとに、４日ごとに、５日ごとに、６日ごとに、又は７日ごとに）新しい第２の培養培地と交換することを含む。或る特定の実施の形態においては、工程（２）は、毎日、又は１日～７日ごとに（例えば、１日ごとに、２日ごとに、３日ごとに、４日ごとに、５日ごとに、６日ごとに、又は７日ごとに）使用済みの培地を廃棄して、新しい第２の培養培地と交換することを含む。

或る特定の実施の形態においては、工程（１）～工程（２）において、培養は、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で行われる。或る特定の実施の形態においては、工程（１）～工程（２）において、培養は、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内で行われる。

幾つかの実施の形態においては、工程（２）において培養容器に付着させた細胞は、Ｐ０（継代０）の間葉系幹細胞である。或る特定の実施の形態においては、工程（２）において記載されるように培養容器に付着させた細胞が約８０％以上（例えば、約８５％以上、約９０％以上、又は約９５％以上）の集密度を有する場合に、細胞を培養容器から分離して、Ｐ０（継代０）の間葉系幹細胞を得ることができる。

したがって、或る特定の実施の形態においては、上記方法は、（３）工程（２）において培養容器に付着させた細胞を分離することにより、間葉系幹細胞を得ることを更に含む。

或る特定の実施の形態においては、上記方法は、工程（３）の間葉系幹細胞を継代することを更に含む。

或る特定の実施の形態においては、細胞は、細胞が約８０％以上（例えば、約８５％以上、約９０％以上、又は約９５％以上）のコンフルエンスを有するときに継代される。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、１継代、２継代、３継代、４継代、又は５継代にわたり継代される。

細胞を継代する方法は、当業者に既知である。例えば、この方法は、培養容器から細胞を分離し、細胞を培養培地中で均一に分散させ、次にそれらを培養容器に接種することを含み得る。適切な量の培地を添加した後に、細胞成長状態に応じて規則的な間隔で（例えば、１日～５日ごとに）適切な量の新しい培養培地との交換を行い、細胞が成長して７０％～１００％のコンフルエンスに達するまで継代作業を繰り返す。細胞が継代されるたびに、継代は１ずつ増加する。

或る特定の実施の形態においては、継代は、約５×１０^３個～５×１０^４個の細胞／ｃｍ^２（例えば、約５×１０^３個の細胞／ｃｍ^２、約１×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、約２×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、約３×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、約４×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、又は約５×１０^４個の細胞／ｃｍ^２）の細胞密度で継代を行うことを含む。

或る特定の実施の形態においては、継代は、細胞を第２の培養培地に接種して培養することを含む。

或る特定の実施の形態においては、分離は、間葉系幹細胞の培養容器への付着を以下の方法によって破壊することを含む：（ｉ）培養物をトリプシン又はその類似体、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、パパイン、コラゲナーゼ及びディスパーゼの混合物、並びにコラゲナーゼ及びトリプシン又はその類似体の混合物からなる群から選択される１つ以上の酵素と接触させること、（ｉｉ）セルスクレーパー等を使用することによって機械的分離を行うこと、或いは（ｉｉｉ）培養物をＥＤＴＡ又はＥＧＴＡと接触させること。

或る特定の実施の形態においては、分離は、間葉系幹細胞の培養容器への付着を酵素消化によって破壊することを含む。

或る特定の実施の形態においては、酵素はトリプシン（例えば、Gibco：カタログ番号２５２０００７２）である。

任意に、臍帯間葉系幹細胞を培養により得た後に、細胞成長曲線をＭＴＴ法、ＷＳＴ法、ＤＮＡ含有量検出法、ＡＴＰ検出法等により決定して、臍帯間葉系幹細胞の成長活性を評価することができる。さらに、分離され培養された臍帯間葉系幹細胞を、細胞表面マーカーのフローサイトメトリー検出、三方向分化アッセイ、及びＰＣＲによる細胞発現遺伝子の検出によって特定することができる。

工程（１）の前に、幹細胞（例えば、全能性幹細胞又は多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞、半数性幹細胞、人工多能性幹細胞、又は成体幹細胞）を、当該技術分野において知られる任意の培養方法を使用して増殖及び維持することができる。例えば、胚性幹細胞は、マウス細胞（例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ））、ヒトフィーダー細胞（例えば、成体皮膚細胞、新生児皮膚線維芽細胞（ＨＮＤＦ）等）等のフィーダー細胞の存在下で培養され得る。例えば、胚性幹細胞を、生体異物不含の培養において、及び／又はフィーダー細胞を含まない条件下で培養することができる。Klimanskaya et al, Lancet. 2005 May 7 to 13; 365(9471):1636-41、Richards et al, stem cell Cells. 2003; 21(5): 546-56、米国特許第７，４１０，７９８号、Ilic et al., stem cells Dev., 2009 Nov; 18(9): 1343-5、Xu et al., Nat Biotechnol., 2001 Oct;19(10): 971-4（これらの各参考文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）を参照。例えば、胚性幹細胞をマトリックス上で培養することができ、このマトリックスは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、ネスチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、ヘパラン硫酸、マトリゲル（商標）（エンゲルブレス－ホルム－スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm）（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来する可溶性調製物）、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ、ヒト基底膜抽出物、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。

第３の態様においては、本発明はまた、第２の態様の方法によって製造される間葉系幹細胞集団に関する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、第１の態様において定義される通りである。

キット
第４の態様においては、本発明は、別々に準備された第１の培養培地及び第２の培養培地を含むキットであって、
第１の培養培地が、以下の物質：１つ以上の血清代替品、１つ以上の非必須アミノ酸、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及びｂＦＧＦが補充された基礎培地であり、
第２の培養培地が、以下の物質：１つ以上の血清代替品、１つ以上の非必須アミノ酸、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及び１つ以上の成長因子が補充された基礎培地である、キットを提供する。

或る特定の実施の形態においては、第１の培養培地及び第２の培養培地は、第２の態様の実施の形態のいずれか１つにおいて定義される通りである。

培養物及び培養上清
第５の態様においては、本発明は、第１の態様又は第３の態様の間葉系幹細胞集団と、培養培地とを含む培養物を提供する。

培養培地は、幹細胞の培養に使用することができるあらゆる培養培地であり、その例としては、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＫＯ－ＤＭＥＭ及びＦ－１２の等量の混合物）、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＤＭＥＭ及びＦ－１２の等量の混合物）、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｆ－１２、ＲＰＭＩ１６４０、及び上記の任意の組合せによって形成された混合培養培地が挙げられる。上記の培養培地は、任意に、血清（例えば、ウシ胎児血清、ヒト血清、ヤギ血清等）、血清代替品（例えば、ＫＯＳＲ等）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、ビタミン、ミネラル等の補充物質を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、培養培地は、第２の態様の実施の形態のいずれか１つにおいて定義される第２の培養培地である。

本発明の培養物は、医薬組成物として製剤化されて投与され得る。そのような医薬組成物は、医療分野において知られるあらゆる形態、好ましくは注射（注射液、凍結乾燥粉末を含む）であり得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

第６の態様においては、本発明は、第５の態様において記載される培養物の上清である培養上清を提供し、或いは、第１の態様又は第３の態様に記載される間葉系幹細胞集団を培養培地において培養することによって製造される培養上清である。

或る特定の実施の形態においては、培養培地は、第２の態様の実施の形態のいずれか１つにおいて定義される第２の培養培地である。

或る特定の実施の形態においては、培養上清は、間葉系幹細胞集団を含まない。

本発明の培養上清は、医薬組成物として製剤化されて投与され得る。そのような医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）及び他の形態等の医療分野において知られるあらゆる形態であり得る。

第７の態様においては、本発明はまた、本明細書に記載される培養上清を調製する方法であって、以下の工程：
（１）第１の態様又は第３の態様の間葉系幹細胞集団を培養する工程と、
（２）工程（１）において得られた培養物の上清（すなわち、培養上清）を回収する工程と、
を含む、方法に関する。

或る特定の実施の形態においては、上記方法は、（３）工程（２）において得られた上清を処理に供することを更に含み、ここで、処理は、遠心分離、濃縮、溶剤置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存、及びそれらの任意の組合せから選択される。

本発明においては、本発明の間葉系幹細胞集団を、幹細胞を培養するのに使用することができる当該技術分野において知られるあらゆる培養培地及び培養条件を使用して培養することができる。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、工程（１）において、第２の態様の実施の形態のいずれか１つにおいて定義される第２の培養培地を使用して培養される。

或る特定の実施の形態においては、本発明の培養上清は、安全性の改善のために血清を含まない。したがって、或る特定の例示的な実施の形態においては、工程（１）において、間葉系幹細胞集団は、無血清培養培地（例えば、基礎培地又は無血清培地）を使用して培養され得るため、無血清培養上清が得られる。そのような実施の形態においては、無血清培養培地は、培養プロセス全体にわたって、又は最後の継代若しくは最後の数回の継代における培養に使用され得る。或る特定の例示的な実施の形態においては、工程（２）において得られた培養上清を透析又は溶剤置換に供して血清を除去することによって、無血清培養上清を得ることもできる。

マイクロキャリア及び凍結保存法
第８の態様においては、本発明はまた、マイクロキャリアを使用することを含む、第１の態様又は第３の態様の間葉系幹細胞集団を培養する方法に関する。或る特定の実施の形態においては、マイクロキャリアとしては、キャリアテーブル（carrier table）（例えば、ＴａｂｌｅＴｒｉｘ）、キャリアスフェア（例えば、ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ、Ｃｏｒｉｎｇ、Ｃｙｔｏｄｅｘ １、Ｃｙｔｏｄｅｘ ２、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３、Ｓｏｌｏｈｉｌｌ、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ）等、又は液体マイクロキャリア、マクロ孔質ゼラチンマイクロキャリア、ポリスチレンマイクロキャリア、ＰＨＥＭＡマイクロキャリア、キチンマイクロキャリア、ポリウレタンフォームマイクロキャリア、アルギン酸ゲルマイクロキャリア、及び磁性マイクロキャリア等が挙げられる。

或る特定の実施の形態においては、本発明のマイクロキャリアは、凍結保存後の間葉系幹細胞集団の生存率を改善することができる。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び／又はマイクロキャリア上で培養された間葉系幹細胞集団は、３７℃±３℃、３７℃±２℃、又は３７℃±１℃の範囲内で、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、半年、及び１年にわたって凍結保存した後に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の生存率を回復することができる。

或る特定の実施の形態においては、マイクロキャリアは、タンパク質、セルロース、ポリエチレン、ポリスチレン、ガラス、デキストラン、ジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）－デキストラン、コラーゲン、コラーゲン－グルコース－アミノグリカン、ゼラチン、アクリルアミド（例えば、ポリアクリルアミド）、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される物質を含む、それらからなる、又は本質的にそれらからなる。

或る特定の実施の形態においては、マイクロキャリアは、マトリックスコーティングを有しない。或る特定の実施の形態においては、マイクロキャリアの表面は、マトリックスでコーティングされている。

或る特定の実施の形態においては、マトリックスとしては、細胞外マトリックスが挙げられる。或る特定の実施の形態においては、マトリックスは、マトリゲル（商標）（BD Biosciences）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸からなる群から選択される１つ以上を含む。

或る特定の実施の形態においては、マイクロキャリアは、非多孔質マイクロキャリアである。或る特定の実施の形態においては、マイクロキャリアは、多孔質マイクロキャリアである。

或る特定の実施の形態においては、マイクロキャリアでの培養は、静的培養条件下で行われる。

或る特定の実施の形態においては、マイクロキャリアでの培養は、動的培養条件下で行われる。

或る特定の実施の形態においては、培養は、間葉系幹細胞集団のマイクロキャリアでの培養を培養培地中で行うことを含む方法によって行われ、ここで、成長培養培地は、以下の物質：１つ以上の血清代替品、１つ以上の非必須アミノ酸、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及び１つ以上の成長因子を含む基礎培地である。或る特定の実施の形態においては、成長培養培地は、第２の態様の実施の形態のいずれか１つにおいて記載される第２の培養培地である。

医薬組成物
第９の態様においては、本発明は、以下：第１の態様又は第３の態様において記載される間葉系幹細胞集団、第５の態様において記載される培養物、第６の態様において記載される培養上清から選択される少なくとも１つ以上を含む、医薬組成物を提供する。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体若しくは賦形剤、又は必要とされ得る他のアジュバントを更に含む。

本明細書において、「アジュバント」という用語は、医薬調剤の調製又は製剤化において必要な主要な薬物以外の物質を指す。一般に、そのような物質は、生理学的活性を有さず、かつ医薬調剤における薬物の有効性、含有量の決定、及び安定性に影響を及ぼさないことが必要とされる。アジュバントを添加する主な目的は、調剤の調製及び臨床利用を容易にすることである。好ましくは、本発明の医薬組成物において使用されるアジュバントは、薬学的に許容可能であり、活性成分と適合性でもある。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン（例えば、コラーゲンゲル、コラーゲン足場、ゼラチンマイクロキャリア）、ゼラチン（例えば、ゼラチンゲル、ゼラチンエレクトロスピニングシルク、ゼラチン足場、ゼラチンマイクロキャリア等）、アミノ化ゼラチン（例えば、アミノ化ゼラチンゲル、アミノ化ゼラチンエレクトロスピニングシルク、アミノ化ゼラチン足場、アミノ化ゼラチンマイクロキャリア等）、キトサン（例えば、キトサンゲル、キトサン足場等）、脱細胞化足場（例えば、子宮脱細胞化足場、心臓脱細胞化足場等）、皮膚修復膜、骨修復膜、口腔修復膜、セルロース、フィブリン、ポリ乳酸、セルロースポリ乳酸、ポリウレタン、トロポエラスチン、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）、ケイ酸塩、シリコーンゴム、細胞外マトリックス、又はそれらの任意の組合せ等を含む薬学的に許容可能な生体材料を含む。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの好ましい実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）又はエアロゾル剤である。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、皮膚の表面再建又は皮膚移植等に使用することができるスプレー剤である。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液（serous fluid）、又は混合物の形態で移植され得る。

本発明の間葉系幹細胞集団を含む医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射液（生理食塩水、乳酸リンゲル液、複合電解質注射液、５％グルコース注射液、２０％ＨＳＡ注射液、スクシニル化ゼラチン注射液、スクシニル化ゼラチンＭＩＸ注射液、ＭＺＪ注射液１、ＭＺＪ注射液２、ＭＺＪ注射液３、ヒト血清タンパク質注射液、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、塩化カリウム注射液、硫酸マグネシウム注射液、重炭酸ナトリウム注射液、グルコース塩化ナトリウム注射液、複合塩化ナトリウム注射液（リンゲル液）、デキストラン－２０グルコース注射液（小分子）、アミノ酸注射液、ヒドロキシエチルデンプン－４０塩化ナトリウム注射液、ヒドロキシエチルデンプン－４０塩化ナトリウム注射液、ヒドロキシエチルデンプン－４０塩化ナトリウム注射液、注射用低分子量ヘパリンカルシウム、ヘパリンナトリウム注射液、注射用補酵素Ａ、シチジン三リン酸二ナトリウム、注射用塩酸リジン、ビタミンＣ注射液、シチコリン塩化ナトリウム、注射用脂溶性ビタミンＩＩ、注射用還元グルタチオン、注射用脳タンパク質加水分解物、デオキシヌクレオチドナトリウム注射液、多重微量元素注射液ＩＩ、マンニトール注射液、塩酸アルギニン注射液、塩化カリウム注射液、注射用シチジン三リン酸二ナトリウム、注射用アスパラギン酸オルニチン等を含む）と、以下の材料：プロピレングリコール、重炭酸ナトリウム、コレステロール、ヘパリン、ＦＢＳ、培養培地、ジメチルスルホキシド、グリセロリン酸ナトリウム溶液、ヒドロキシエチルデンプン、マンニトール溶液、エチレングリコール、ポリビニルアルコール、トレハロース、ポリビニルピロリドン、ヒト臍帯間葉系幹細胞由来のエクソソーム溶液、ヒト臍帯間葉系幹細胞由来の短いペプチド又はポリペプチド化合物溶液、乳酸ナトリウム、マンニトール、デキストラン、塩化カリウム、塩化カルシウム、アゾン、低分子デキストランの１つ以上を含む混合物とを含む。幾つかの実施の形態においては、上記細胞は、医薬組成物中での非凍結保存後又は凍結保存後に１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、又は１日の範囲内で、約４℃にて少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の生存率を維持することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な生体材料（例えば、限定されるものではないが、コラーゲン足場、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸）を含む。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの好ましい実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）又はエアロゾル剤である。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、溶液型注射剤等の注射剤である。

幾つかの実施の形態においては、注射剤は、例えば、可溶化剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、懸濁剤、キレート化剤、酸化防止剤、静菌剤、局所麻酔薬、等張性改変剤、充填剤、保護剤、及びそれらの任意の組合せから選択される、注射用の１つ以上の添加剤を含む。

幾つかの実施の形態においては、注射剤は、等張溶液又は高張溶液を含み、好ましくは、該溶液は、ＮａＣｌ注射液（例えば、０．９％～２．７％のＮａＣｌ注射液）、グルコース注射液（例えば、４％～５％のグルコース注射液）、乳酸ナトリウムリンゲル注射液、複合電解質注射液、ＨＳＡ注射液（例えば、１０％～２０％のＨＳＡ注射液）、スクシニル化ゼラチン注射液（例えば、４％～５％のスクシニル化ゼラチン注射液）、及びそれらの任意の組合せから選択される。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞は、１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、別の例としては、１×１０^５個～１×１０^８個、７×１０^５個～７×１０^６個、１×１０^６個～５×１０^６個、好ましくは１×１０^６個、３×１０^６個、５×１０^６個の細胞／ｍｌ、より好ましくは３×１０^６個の細胞／ｍｌ）の投与量で投与される。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞は、１×１０^３個以上の細胞／ｋｇ（例えば、１×１０^３個以上の細胞／ｋｇ、３×１０^３個以上の細胞／ｋｇ、５×１０^３個以上の細胞／ｋｇ、７×１０^３個以上の細胞／ｋｇ、１×１０^４個以上の細胞／ｋｇ、３×１０^４個以上の細胞／ｋｇ、５×１０^４個以上の細胞／ｋｇ、７×１０^４個以上の細胞／ｋｇ、１×１０^５個以上の細胞／ｋｇ、３×１０^５個以上の細胞／ｋｇ、５×１０^５個以上の細胞／ｋｇ、７×１０^５個以上の細胞／ｋｇ、１×１０^６個以上の細胞／ｋｇ、３×１０^６個以上の細胞／ｋｇ、５×１０^６個以上の細胞／ｋｇ、７×１０^６個以上の細胞／ｋｇ、１×１０^７個以上の細胞／ｋｇ、３×１０^７個以上の細胞／ｋｇ、５×１０^７個以上の細胞／ｋｇ、７×１０^７個以上の細胞／ｋｇ、１×１０^８個以上の細胞／ｋｇ、３×１０^８個以上の細胞／ｋｇ、５×１０^８個以上の細胞／ｋｇ、７×１０^８個以上の細胞／ｋｇ、１×１０^９個以上の細胞／ｋｇ、３×１０^９個以上の細胞／ｋｇ、５×１０^９個以上の細胞／ｋｇ、７×１０^９個以上の細胞／ｋｇ、１×１０^１０個以上の細胞／ｋｇ、３×１０^１０個以上の細胞／ｋｇ、５×１０^１０個以上の細胞／ｋｇ、又は７×１０^１０個以上の細胞／ｋｇ、別の例としては、１×１０^５個～１×１０^８個、７×１０^５個～７×１０^６個、１×１０^６個～５×１０^６個の細胞、好ましくは１×１０^６個、３×１０^６個、５×１０^６個の細胞／ｋｇ、より好ましくは３×１０^６個の細胞／ｋｇ）の投与量で投与される。

幾つかの実施の形態においては、投与する投与量は、１×１０^４個以上の細胞／回（例えば、１×１０^４個以上の細胞／回、３×１０^４個以上の細胞／回、５×１０^４個以上の細胞／回、７×１０^４個以上の細胞／回、１×１０^５個以上の細胞／回、３×１０^５個以上の細胞／回、５×１０^５個以上の細胞／回、７×１０^５個以上の細胞／回、１×１０^６個以上の細胞／回、３×１０^６個以上の細胞／回、５×１０^６個以上の細胞／回、７×１０^６個以上の細胞／回、１×１０^７個以上の細胞／回、３×１０^７個以上の細胞／回、５×１０^７個以上の細胞／回、７×１０^７個以上の細胞／回、１×１０^８個以上の細胞／回、３×１０^８個以上の細胞／回、５×１０^８個以上の細胞／回、７×１０^８個以上の細胞／回、１×１０^９個以上の細胞／回、３×１０^９個以上の細胞／回、５×１０^９個以上の細胞／回、７×１０^９個以上の細胞／回、１×１０^１０個以上の細胞／回、３×１０^１０個以上の細胞／回、５×１０^１０個以上の細胞／回、又は７×１０^１０個以上の細胞／回）、好ましくは３×１０^６個～６×１０^６個の細胞／回である。

幾つかの実施の形態においては、注射剤は、以下の機能的成分：
（１）間葉系幹細胞の活性を維持する成分、
（２）間葉系幹細胞の増殖を促進する成分、及び／又は、
（３）間葉系幹細胞の分化を促進する成分、
を更に含む。

幾つかの実施の形態においては、機能的成分は、血清代替品、非必須アミノ酸、グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、成長因子、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

幾つかの実施の形態においては、機能的成分は、ＫＯＳＲ、ＭＳＣ無血清サプリメント、Ｕｌｔｒａｓｅｒ（商標）Ｇ、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、皮膚の表面再建又は皮膚移植等に使用することができるスプレー剤である。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

本発明の間葉系幹細胞集団を含む医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射液（生理食塩水、乳酸リンゲル液、複合電解質注射液、５％グルコース注射液、２０％ＨＳＡ注射液、スクシニル化ゼラチン注射液、スクシニル化ゼラチンＭＩＸ注射液、ＭＺＪ注射液１、ＭＺＪ注射液２、ＭＺＪ注射液３、ヒト血清タンパク質注射液、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、塩化カリウム注射液、硫酸マグネシウム注射液、重炭酸ナトリウム注射液、グルコース塩化ナトリウム注射液、複合塩化ナトリウム注射液（リンゲル液）、デキストラン－２０グルコース注射液（小分子）、アミノ酸注射液、ヒドロキシエチルデンプン－４０塩化ナトリウム注射液、ヒドロキシエチルデンプン－４０塩化ナトリウム注射液、ヒドロキシエチルデンプン－４０塩化ナトリウム注射液、注射用低分子量ヘパリンカルシウム、ヘパリンナトリウム注射液、注射用補酵素Ａ、シチジン三リン酸二ナトリウム、注射用塩酸リジン、ビタミンＣ注射液、シチコリン塩化ナトリウム、注射用脂溶性ビタミンＩＩ、注射用還元グルタチオン、注射用脳タンパク質加水分解物、デオキシヌクレオチドナトリウム注射液、多重微量元素注射液ＩＩ、マンニトール注射液、塩酸アルギニン注射液、塩化カリウム注射液、注射用シチジン三リン酸二ナトリウム、注射用アスパラギン酸オルニチン等を含む）と、以下の材料：プロピレングリコール、重炭酸ナトリウム、コレステロール、ヘパリン、ＦＢＳ、培養培地、ジメチルスルホキシド、グリセロリン酸ナトリウム溶液、ヒドロキシエチルデンプン、マンニトール溶液、エチレングリコール、ポリビニルアルコール、トレハロース、ポリビニルピロリドン、ヒト臍帯間葉系幹細胞由来のエクソソーム溶液、ヒト臍帯間葉系幹細胞由来の短いペプチド又はポリペプチド化合物溶液、乳酸ナトリウム、マンニトール、デキストラン、塩化カリウム、塩化カルシウム、アゾン、低分子デキストランの１つ以上を含む混合物とを含む。幾つかの実施の形態においては、上記細胞は、医薬組成物中での非凍結保存後又は凍結保存後に１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、又は１日の範囲内で、約４℃にて少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の生存率を維持することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な生体材料（例えば、限定されるものではないが、コラーゲン足場、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸）を含む。

生体足場
一態様においては、本発明は、間葉系幹細胞集団と生体足場とを含む物品であって、間葉系幹細胞集団が、初代間葉系幹細胞の少なくとも約１０倍の平均ＭＭＰ１発現レベルを有する、及び／又は間葉系幹細胞集団が、初代間葉系幹細胞の少なくとも約１０倍の平均ＰＧＥ２発現レベルを有する、物品を提供する。

別の態様においては、本発明は、間葉系幹細胞集団と生体足場とを含む物品であって、間葉系幹細胞集団が、初代間葉系幹細胞の少なくとも約１０倍の平均ＭＭＰ１発現レベルを有し、任意に、間葉系幹細胞集団が、初代間葉系幹細胞の少なくとも約１０倍の平均ＰＧＥ２発現レベルを有する、物品を提供する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製される。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、上記に定義又は記載される通りである。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、生体足場に部分的に又は全体的に負荷される。

或る特定の実施の形態においては、生体足場は、生分解性材料又は非生分解性材料を用いて調製される。

或る特定の実施の形態においては、生体足場は、天然に存在する材料、人工的に合成された材料、組換え的に製造された材料、変性された材料、又はそれらの任意の組合せを用いて調製される。

或る特定の実施の形態においては、天然に存在する材料は、コラーゲン（例えば、タイプＩコラーゲン、タイプＩＩコラーゲン、タイプＩＩＩコラーゲン）、フィブリン、シルクタンパク質、セルロース、キトサン、アルギン酸塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）、デンプン、ヒアルロン酸、ラミニン、エラスチン、アガロース、ゼラチン、デキストラン、細胞外マトリックス、ケイ酸塩、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、人工的に合成された材料は、ポリホスファゼン、ポリアクリル酸及びその誘導体（例えば、ポリメタクリル酸、アクリル酸及びメタクリル酸のコポリマー）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－グリコール酸のコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン）、ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸－グリコール酸、シリコーンゴム、脱細胞化足場、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、変性された材料は、変性アルギン酸塩、変性ゼラチン、又はそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、変性アルギン酸塩は、酸化アルギン酸塩（例えば、酸化アルギン酸ナトリウム）であり、好ましくは、変性ゼラチンは、アミノ化ゼラチンである。

或る特定の実施の形態においては、生体足場を調製するのに使用される材料は、コラーゲン、アミノ化ゼラチン、キトサン、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、生体足場は、固体又は半固体（例えば、ゲル）である。

或る特定の実施の形態においては、生体足場は、層状構造（例えば、単層、二層、又は多層、例えばバイオフィルム、皮膚修復膜）、又はシート状構造（例えば、矩形、正方形、円形、楕円形、六角形、又は不規則な形状のシート状構造）、又は中空管状構造若しくは中空環状（例えば、円形リング状）構造、又は中空三次元構造（例えば、中空立方体、中空球、中空矩形柱、中空円筒、又は中空の不規則な形状の三次元構造）、又は中実の三次元構造（例えば、中実立方体、中実球、中実矩形柱、中実円柱、又は中実の不規則な形状の三次元構造）、又はそれらの任意の組合せを有する。

或る特定の実施の形態においては、生体足場は、天然の組織又は臓器の形状を模している。

或る特定の実施の形態においては、生体足場は、シート状構造、層状構造、又は中空環状（例えば、円形リング状）構造を有する。

或る特定の実施の形態においては、生体足場は、コラーゲン足場、皮膚修復膜、ゼラチン足場、アミノ化ゼラチン足場、キトサン足場からなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、生体足場には、１×１０^４個以上／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上／ｍｌ、３×１０^４個以上／ｍｌ、５×１０^４個以上／ｍｌ、７×１０^４個以上／ｍｌ、１×１０^５個以上／ｍｌ、３×１０^５個以上／ｍｌ、５×１０^５個以上／ｍｌ、７×１０^５個以上／ｍｌ、１×１０^６個以上／ｍｌ、３×１０^６個以上／ｍｌ、５×１０^６個以上／ｍｌ、７×１０^６個以上／ｍｌ、１×１０^７個以上／ｍｌ、３×１０^７個以上／ｍｌ、５×１０^７個以上／ｍｌ、７×１０^７個以上／ｍｌ、１×１０^８個以上／ｍｌ、３×１０^８個以上／ｍｌ、５×１０^８個以上／ｍｌ、７×１０^８個以上／ｍｌ、１×１０^９個以上／ｍｌ、３×１０^９個以上／ｍｌ、５×１０^９個以上／ｍｌ、７×１０^９個以上／ｍｌ、１×１０^１０個以上／ｍｌ、３×１０^１０個以上／ｍｌ、５×１０^１０個以上／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上／ｍｌ）の量で間葉系幹細胞が負荷される。

或る特定の実施の形態においては、物品は、追加の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、生体足場に部分的に又は全体的に負荷される。

或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、骨関節症（例えば、半月板損傷、骨損傷）を治療する薬物、心疾患（例えば、心筋梗塞）を治療する薬物、神経系疾患（例えば、脊髄損傷）を治療する薬物、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷、火傷、熱傷）を治療する薬物、眼疾患（例えば、角膜アルカリ火傷）を治療する薬物、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、骨関節症を治療する薬物は、硫酸グルコサミンカプセル剤、アミノ化コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸ナトリウム注射剤、抗過骨症錠剤、オソチド（ossotide）錠、横骨（Henggu）創傷治癒剤、ゲントンピン（Gentongping）顆粒、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、ロキソプロフェンナトリウム錠、ジクロフェナクナトリウム徐放錠、セレコキシブ、メロキシカム、インドメタシン錠、ボルタレン軟膏）、又はそれらの任意の組合せから選択される。

或る特定の実施の形態においては、心疾患を治療する薬物は、アスピリン、クロピドグレル、チカグレロル、ＡＣＥ１、ＡＲＢ類、β遮断薬、カルシウム拮抗薬、硝酸血管拡張薬、トリメタジジン塩酸塩、ニコランジル、リドカイン、アミオダロン、キニジン、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、神経系疾患を治療する薬物は、カルバマゼピン、フェノバルビタール、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、クロナゼパム、ラモトリジン、オキシカルバゼピン、ドネペジル、メマンチン、ビタミンＢ１、ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物（Vaccinia vaccination of rabbits inflammation of the skin extract）、アルテプラーゼ、アスピリン、クロピドグレル、低分子量ヘパリン、エダラボン、尿中カリジノゲナーゼ、ブチルフタリド、注射用ガンマグロブリン、ピリドスチグミン、グルココルチコイド、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、皮膚疾患を治療する薬物は、エバスチン錠、ロラタジン錠、セチリジン錠、フロ酸モメタゾン軟膏、ハロメタゾン軟膏、ムピロシン軟膏、フシジン酸軟膏、セフィキシム錠、ロキシスロマイシン錠、ナフチフィンケトコナゾール軟膏、セルタコナゾール軟膏、イトラコナゾール錠、テルビナフィン錠、アシクロビル錠、バラシクロビル錠、ペンシクロビル軟膏、インターフェロンゲル、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、眼疾患を治療する薬物は、抗細菌薬及び抗炎症薬である。

或る特定の実施の形態においては、物品は、細胞を培養する／分化させる成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、細胞を培養する／分化させる成分は、血清代替品、非必須アミノ酸、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、成長因子、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、血清代替品は、ＫＯＳＲ、ＭＳＣ無血清サプリメント、Ｕｌｔｒｏｓｅｒ（商標）Ｇ、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、非必須アミノ酸は、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、成長因子は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

別の態様においては、本発明は、被験体における骨関節症（例えば、半月板損傷、骨損傷）、心疾患（例えば、心筋梗塞）、神経系疾患（例えば、脊髄損傷）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷、火傷、熱傷）、眼疾患（例えば、角膜アルカリ火傷）、又はそれらの任意の組合せを治療及び／又は予防する医薬の製造における上述の物品の使用を提供する。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、被験体における脊髄損傷、皮膚損傷、角膜アルカリ火傷、又はそれらの任意の組合せの治療及び／又は予防に使用される。

別の態様においては、本発明は、被験体における疾患を治療及び／又は予防する方法であって、それを必要とする被験体に上述の物品を投与（例えば、移植又は接着、好ましくは移植）することを含み、上記疾患が、骨関節症（例えば、半月板損傷、骨損傷）、心疾患（例えば、心筋梗塞）、神経系疾患（例えば、脊髄損傷）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷、火傷、熱傷）、眼疾患（例えば、角膜アルカリ火傷）、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、上記疾患は、脊髄損傷、皮膚損傷、角膜アルカリ火傷、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

疾患の予防及び／又は治療のための使用
第１０の態様においては、本発明は、被験体における疾患の予防及び／又は治療のための、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、若しくは医薬組成物の使用、又は被験体における疾患を予防及び／又は治療する医薬の製造のための使用、及び被験体における疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、若しくは本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、上記疾患は、骨関節症（例えば、半月板損傷、骨関節炎、又は骨損傷等）、生殖器系疾患（例えば、卵巣老化、卵巣不全、子宮内膜損傷、子宮外傷、子宮腔内癒着、又は子宮菲薄化等）、心臓疾患（例えば、心筋梗塞等）、肺疾患（例えば、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫障害、塵肺症、又は肺炎等）、皮膚疾患（例えば、乾癬、皮膚病変、褥瘡、圧迫潰瘍、又は火傷等）、眼疾患（例えば、角膜損傷等）、神経系疾患（例えば、脊髄損傷、脳性麻痺、脳卒中、アルツハイマー病、老年性認知症、又は神経障害性疼痛等）、消化器系疾患（例えば、炎症性腸疾患、大腸炎、クローン病、又は過敏性腸症候群等）、腎臓疾患（例えば、抗糸球体基底膜疾患、糖尿病性腎症、ループス腎炎、又は急性腎炎等）、肝臓疾患（肝臓損傷、肝臓線維症、肝炎、肝硬変、又は肝臓不全等）、自己免疫疾患（例えば、強皮症、エリテマトーデス、又は多発性硬化症等）、移植拒絶反応（例えば、移植片対宿主病等）、代謝性疾患（例えば、糖尿病等）からなる群から選択される。

本発明においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団若しくは培養物、又は間葉系幹細胞集団若しくは培養物を含む医薬組成物を、様々な適切な手段によって被験体に投与することができる。或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。本発明の培養上清は、薬物として製剤化されて投与され得る。そのような医薬組成物は、治療有効量の培養上清を含み得る。

本発明においては、本発明の培養上清、又は培養上清を含む医薬組成物は、様々な適切な様式で被験体に投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の培養上清、又は培養上清を含む医薬組成物は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。

女性生殖器系疾患
一態様においては、本発明は、女性生殖器系疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、女性生殖器系疾患の疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、女性生殖器系疾患としては、（１）外陰炎、膣炎、子宮頸炎、子宮内膜炎、子宮炎、及び骨盤内炎、付属器炎等の婦人科炎症、（２）良性腫瘍及び悪性腫瘍等の婦人科腫瘍、（３）月経困難症、月経出血増加、月経出血減少等の月経障害、（４）排卵機能不全によって引き起こされる不妊症、卵管閉塞によって引き起こされる不妊症、免疫不妊症等の不妊症が挙げられる。或る特定の実施の形態においては、女性生殖器系疾患は、卵巣老化、卵巣不全、子宮内膜損傷、子宮外傷、子宮腔内癒着、子宮菲薄化からなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、子宮内膜損傷は、主に、不規則な月経周期、又は少ない全体的な月経出血及び月経出血期間の短縮によって現れる子宮内膜基底層の損傷である。概して、子宮内膜損傷の殆どは、誘発中絶又は医学的人工中絶を含む中絶後に発生する。さらに、関連する子宮内手術も子宮内膜損傷を引き起こす可能性がある。

或る特定の実施の形態においては、子宮内膜炎は子宮内膜の炎症である。子宮内膜炎は、疾患の期間に応じて、急性子宮内膜炎と慢性子宮内膜炎とに分けることができる。

或る特定の実施の形態においては、「子宮腔癒着」は、女性生殖器系疾患に属する一種の子宮疾患であり、妊娠中及び非妊娠中の子宮外傷を含む様々な原因によって引き起こされ、子宮内膜基底層損傷がもたらされるため、子宮腔及び（又は）子宮頸管が部分的に又は完全に閉塞し、子宮壁が互いに癒着し、こうして異常月経、不妊症、又は反復流産等を引き起こす子宮内膜損傷を指し、これは通常、典型的な症状を有しない。その性質は、子宮内膜線維症である。例としては、子宮内膜病変、子宮内異物、良性子宮内膜病変、子宮奇形、悪性子宮内膜病変等が挙げられる。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分を含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、エストロゲン、抗エストロゲン若しくは選択的エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン、抗アンドロゲン、又はプロゲスチンからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個～１×１０^１０個（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個、１×１０^６個～１×１０^７個、又は１×１０^６個～５×１０^６個）の量で含有する。

別の態様においては、本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞集団を含む、女性生殖器系疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する製品を提供する。或る特定の実施の形態においては、製品は、上記に定義される追加の活性成分を更に含む。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。或る特定の実施の形態においては、製品は、注射剤、微量注射剤（microinjection）、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口剤、エアロゾル剤、ドロップ剤（drop）、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤であり、好ましくは注射剤である。或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤である。

子宮腔内癒着
子宮腔内癒着（子宮内膜線維症、子宮内膜損傷によって引き起こされ、後に稀発月経、無月経、不妊症、又は反復性流産等を誘発する子宮腔の部分的若しくは完全な閉塞を含む）。近年、子宮腔の頻繁な手術及び子宮鏡手術の普及により、子宮腔内癒着の発生率及び検出率が徐々に増加し、発症年齢がより若くなり、女性の続発性不妊症の２番目の主な原因となっている。臨床医は新しい治療の選択肢を模索し続けているが、その治癒率及び妊娠率はあまり改善されておらず、その再発率は高く（治療後の軽度の患者の再発率は高く、治療後の重症患者の再発率は更に高い）、それにより不妊症、再発性流産、早産、前置胎盤、胎盤癒着、又は胎盤着床等の産科合併症が引き起こされ、これは女性のリプロダクティブヘルスに深刻な脅威となる。その高い発生率及びその結果としての女性の生殖機能への損傷は、解決すべき緊急の臨床的問題となっている。現在の臨床治療は、子宮腔の形状を回復し、癒着の再発を防ぎ、損傷した子宮内膜の修復及び再生を促進し、正常な生殖機能を回復することを目的としている。治療工程は、子宮腔内癒着の子宮鏡による分離、子宮内デバイスの術中配置、並びにエストロゲン及びプロゲステロンの術後投与を含むが、治療周期が長い、治癒率が低い、癒着が再発し易い、妊娠率が低い、患者における乳房腫瘍及び子宮内膜腫瘍のリスクを高める高用量のエストロゲン適用等の問題があり、重度の筋肉組織又は結合組織の癒着においては、子宮内膜基底層が破壊されており、エストロゲン及びプロゲステロンに対して十分に奏効しない可能性がある。

これまで、国内外の学者によりこの疾患の病因について多くの研究が行われており、子宮内膜修復の障害が形成の主なメカニズムであり得ることが合意されている。例えば、中絶又は他の子宮腔手術の後に、幾つかの病理学的要因のため、子宮内膜の修復が妨げられ、瘢痕形成及び癒着がもたらされる。

一態様においては、本発明は、子宮腔内癒着を予防、治療、遅延、及び／又は軽減する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、子宮腔内癒着を予防、治療、遅延、及び／又は軽減する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、子宮内膜を肥厚化し、血管、腺、及び細胞を増加させ、子宮腔内癒着を改善し、子宮腔形状を回復し、及び／又は子宮滲出液を減少させることができる。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、子宮癒着の症状を予防又は治療し、例えば子宮滲出液の蓄積を減少させることができる。

或る特定の実施の形態においては、子宮腔内癒着としては、不妊患者の子宮癒着又は中絶によって引き起こされる子宮癒着等が挙げられる。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、子宮形態を改善し、子宮腔内癒着を抑制することができる。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、損傷した子宮内膜の修復及び再生等の子宮内膜の修復及び再生を促進して、子孫を生殖する能力を増強することができる。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、子宮瘢痕を回復して、子宮腔内癒着を予防又は治療することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分を含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、エストロゲン、抗エストロゲン若しくは選択的エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン、抗アンドロゲン、又はプロゲストーゲンからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個～１×１０^１０個（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個、１×１０^６個～１×１０^７個、又は１×１０^６個～５×１０^６個）の量で含有する。

原発性卵巣機能不全
原発性卵巣機能不全（ＰＯＩ）とは、４０歳以前の女性における卵巣機能の喪失を指す。２０１５年のＥＳＨＥＲのガイドラインにおいては、次のように定義されている：（１）少なくとも４ヶ月間の無月経／稀発月経、（２）２回の２５Ｕ／Ｌを上回る血中ＦＳＨ（モニタリング時間間隔は少なくとも４週間である）。ＰＯＩは、月経障害（無月経又は稀発月経）、ゴナドトロピンの上昇、及び低エストロゲンレベル（ホットフラッシュ、発汗、顔面紅潮、低性欲等）を特徴とする。ＰＯＩの発生率は約１％であり、発生率は異なる民族集団間で僅かに異なる。早発無月経を伴う患者におけるＰＯＩの発生率は１０％～２８％であり、続発性無月経を伴う患者におけるＰＯＩの発生率は４％～１８％である。

ＰＯＩの原因としては、遺伝的原因、免疫的原因、医原性原因（放射線療法、化学療法、免疫抑制療法、及び外科的治療等）及び他の原因が挙げられるが、殆どのＰＯＩの原因は未知である。ＰＯＩは、副甲状腺機能低下症及び副腎機能低下症を含む様々な内分泌障害に関連している可能性がある。骨盤手術も卵巣機能の障害につながる可能性がある。ＰＯＩを伴う患者のおよそ４％に副腎抗体又は卵巣抗体が存在することから、この疾患が自己免疫性であることが示唆される。多くの場合に、そのメカニズムは不明である。ＰＯＩは女性の受胎能の喪失を引き起こし、骨粗鬆症、脂質代謝障害、及び心血管疾患のリスクを高める可能性がある。生殖期の間の早期無月経及び受胎能の喪失は女性の心理的負担を高め、結婚生活の質を低下させるため、一連の深刻な心理的問題及び社会的問題がもたらされる。

一態様においては、本発明は、卵巣不全（例えば、原発性卵巣機能不全）を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、卵巣不全（例えば、原発性卵巣機能不全）を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、血中性ホルモン（例えば、ＦＳＨ及びＥ２）レベルを改善し、卵胞数を増加させ、体重及び卵巣重量を改善し、排卵レベルを回復し、及び／又は受胎能レベルを改善し得る。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の実施の形態においては、投与は、腹部注射又は静脈内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分を含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、エストロゲン、抗エストロゲン若しくは選択的エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン、抗アンドロゲン、又はプロゲストーゲンからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個～１×１０^１０個（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個、１×１０^６個～１×１０^７個、又は１×１０^６個～５×１０^６個）の量で含有する。

男性生殖器系疾患
男性生殖器系疾患は、泌尿器系疾患に関連する異常な排尿、膿尿、異常な尿道分泌物、痛み、腫瘤、性機能不全、及び男性不妊症を含み、主に膀胱炎、尿道炎、尿失禁、尿閉等の泌尿器系の炎症、精巣上体炎、精嚢炎、前立腺炎等の生殖器系の炎症、精巣上体結核（testicular epididymal tuberculosis）、精嚢結核等の生殖管結核、精巣挫傷、陰茎折症、尿道破裂等の生殖器系管の損傷、精索静脈瘤、精子無力症、先天性射精管閉塞症、射精管欠如等の男性不妊疾患、男性の勃起機能不全、早漏症、性欲減退（hypaphrodisia）、無射精症、射精遅延等の男性の性機能障害疾患が挙げられる。この文献においては、「男性不妊症」という用語は、男性の要因によって引き起こされる不妊症を指し、一般に、女性は結婚後妊娠しておらず、その際、２年を超える同棲にわたって避妊措置が取られていない。男性不妊症としては、精巣萎縮、精巣発育不全、精子減少症、精子形成不全、無精子症、閉塞性無精子症、精子無力症、クラインフェルター症候群、ＸＹＹ症候群、カルマン症候群、選択的ＬＨ欠乏症及びＦＳＨ欠乏症、副腎皮質過形成、高プロラクチン血症、精索静脈瘤、精子奇形等が挙げられる。本明細書において使用される場合に、「精子減少症」という用語は、内分泌機能不全、生殖器系感染症、精索静脈瘤、抗精子抗体、停留精巣、水腫、栄養失調、化学療法、放射線療法、肥満等によって引き起こされる精子減少症を含む、正常な健康な妊孕性のある男性よりも精液中の精子数がより少ないことを指す。

一態様においては、本発明は、男性生殖器系疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、男性生殖器系疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、男性生殖器系疾患は、無精子症又は精子減少症である。或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団を無精子症において使用して、精子濃度を増加させ、精子運動性を増加させ、精巣を回復し、及び／又は精嚢機能を回復することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の実施の形態においては、投与は、精巣内注射又は精細管注射又は静脈内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分を含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、エストロゲン、抗エストロゲン若しくは選択的エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン、抗アンドロゲンからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個～１×１０^１０個（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個、１×１０^６個～１×１０^７個、又は１×１０^６個～５×１０^６個）の量で含有する。

別の態様においては、本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞集団を含む、男性生殖器系疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する製品を提供する。或る特定の実施の形態においては、製品は追加の活性成分を更に含み、追加の活性成分は上記に定義される通りである。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。或る特定の実施の形態においては、製品は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤である。或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤である。

消化器系疾患
一態様においては、本発明は、消化器系疾患の予防及び／又は治療に使用される医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、消化器系疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、消化器系疾患は、食道疾患、胃疾患、腸疾患、肝臓疾患、胆嚢疾患、膵臓疾患、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

腸疾患は、十二指腸潰瘍、機能性結腸疾患、腸ポリープ、結腸癌、直腸癌、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、直腸炎、過敏性腸症候群、消化不良、機能性便秘、胃食道逆流症、食道炎、腹膜炎、自己免疫性肝臓疾患、胃炎、結核性腸疾患、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、腸疾患は、腸炎症性疾患である。

或る特定の実施の形態においては、腸炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、直腸炎、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、腸炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。

胃腸疾患（胃疾患、腸疾患）は、主に一般的な炎症性胃腸疾患（急性胃炎又は慢性胃炎、急性虫垂炎又は慢性虫垂炎等）、消化性潰瘍、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、及び過敏性腸症候群等を指す。炎症性腸疾患は、胃腸管における疾患である。

肝臓疾患は、肝臓において発生するあらゆる疾患の総称である。肝臓損傷の様々な原因に応じて、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎等を含むウイルス性肝臓疾患、並びに異常代謝性肝臓疾患、アルコール性肝臓疾患、薬物誘発性肝臓疾患又は毒性肝臓疾患、及び非アルコール性脂肪性肝臓疾患、自己免疫性肝臓疾患等に分けられる。肝臓疾患は、発症の速度に応じて、慢性肝臓疾患及び急性肝臓疾患に分けられる。

肝臓疾患は、肝臓損傷、肝臓線維症、肝炎（例えば、ウイルス性Ａ型肝炎、ウイルス性Ｂ型肝炎、ウイルス性Ｃ型肝炎）、肝硬変、腎臓不全、肝臓膿瘍、肝臓嚢胞、肝内血管腫、肝臓癌、肝内胆管石、肝吸虫疾患、肝包虫疾患、アルコール性肝臓疾患、非アルコール性脂肪性肝臓疾患、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

肝臓疾患としては、脂肪性肝臓が挙げられる。本明細書において、「脂肪性肝臓」という用語は、様々な原因による肝臓細胞における脂肪の過剰な蓄積によって引き起こされる病理学的変化を指し、これは、独立した疾患ではなく一般的な肝臓の病理学的変化である。脂肪性肝臓は一般に、アルコール性脂肪性肝臓及び非アルコール性脂肪性肝臓の２つのカテゴリーに分けられる。

肝臓疾患としては、脂肪性肝炎が挙げられ、本明細書においては、「脂肪性肝炎」という用語は脂肪性肝臓の一種である。軽度の脂肪性肝臓は一般に、明らかな肝臓損傷及び明らかな症状を有しない。中等度から重度の脂肪性肝臓は一般に、肝臓細胞損傷を伴い、脂肪性肝炎と呼ばれ、対応する臨床症状を有する。

肝臓疾患としては、非アルコール性脂肪性肝臓疾患が挙げられる。この文脈において、「非アルコール性脂肪性肝臓疾患」という用語は、主に肝臓細胞における脂肪の過剰な沈着を特徴とし、アルコール及び他の明確な肝臓障害因子を除く因子によって引き起こされる臨床病理学的症候群を指し、これは、インスリン抵抗性及び遺伝的感受性と密接に関連する後天的な代謝ストレス誘発性肝臓損傷である。これには、単純な脂肪性肝臓、非アルコール性脂肪性肝炎、及び関連する肝硬変が含まれる。

肝臓疾患としては、非アルコール性脂肪性肝炎が挙げられ、本明細書において使用される「非アルコール性脂肪性肝炎」という用語は、脂肪肝及び肝細胞損傷（バルーニング変化）及び炎症のエビデンスを伴い、肝臓線維症を有する又は有しない、非アルコール性脂肪性肝臓疾患の炎症性サブタイプを指す。時間の経過とともに、非アルコール性脂肪性肝炎は、肝臓線維症、肝硬変、末期肝臓疾患、又は要肝臓移植に進行する可能性がある。

肝臓疾患としては、脂肪肝が挙げられ、本明細書において使用される「脂肪肝」という用語は、肝細胞の細胞質内に脂肪滴が存在することを指す。脂肪肝が発生した場合に、軽度の症例では、肉眼観察による明らかな異常は見られず、重度の症例では、肝臓が肥大し、質感は柔らかく、色は淡黄色から黄土色で、切断面の構造は毛羽だっており、脂ぎっている。検鏡的には、変性した肝臓細胞質中に様々なサイズの液胞が現れ、重度の症例では、これらが融合して脂肪細胞に似た大きな液胞となっている場合がある。

肝臓疾患としては、肝臓損傷が挙げられる。肝臓損傷は、急性肝臓損傷、慢性肝臓損傷、化学的肝臓損傷、物理的肝臓損傷、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。本明細書において使用される場合に、「肝臓損傷」という用語は、様々な肝臓疾患の病理学的帰結である。様々な有害因子によって引き起こされる肝臓損傷としては、主にウイルス性肝臓損傷、アルコール誘発性肝臓損傷、薬物誘発性肝臓損傷等が挙げられる。或る特定の実施の形態においては、肝臓損傷は急性肝臓損傷である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、担体又は賦形剤を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、担体は、ゼラチン、キトサン、アルギン酸ナトリウム、コラーゲン、シルクタンパク質、セルロース、フィブリン、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）、ケイ酸塩、シリコーンゴム、細胞外マトリックス、脱細胞化足場、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、担体は、ゼラチン、コラーゲン、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、第２の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、アスコルビン酸ジイソプロピルアミン、塩化コリン、イノシトール、デヒドロコール酸、硫酸マグネシウム、ポリエンホスファチジルコリン（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｅ）、グルクロノラクトン（グルクロン）、グルタチオン（グルチオン、アトモラン）、チオプロニン（Ｃａｐｅｎ）、グリチルリチン調剤、アデノシルメチオニン（Ｔｒａｎｓｍｅｔｉｌ）、肝細胞成長促進因子、チョウセンゴミシ（Schisandra chinensis）（ビフェニルジエステル）、シリマリン（シリビニン、レガロン、保肝寧（Baoganning）、オレアノール酸（肝舒錠（Ganshu tablet））、茵梔黄調剤（Yinzhihuang preparation）、インチンコウ（Herba Artemisiae Capillariae）、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、アミノサリチル酸薬、コルチコステロイド薬、免疫抑制剤、生物剤、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。或る特定の実施の形態においては、アミノサリチル酸薬は、５－アミノサリチル酸である。或る特定の実施の形態においては、コルチコステロイド薬はグルココルチコイドである。或る特定の実施の形態においては、免疫抑制剤は、アザチオプリン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリンＡ、タクロリムス、又はそれらの任意の組合せから選択される。或る特定の実施の形態においては、生物剤は、ＴＮＦアンタゴニストである。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上の／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上の／ｍｌ、３×１０^４個以上の／ｍｌ、５×１０^４個以上の／ｍｌ、７×１０^４個以上の／ｍｌ、１×１０^５個以上の／ｍｌ、３×１０^５個以上の／ｍｌ、５×１０^５個以上の／ｍｌ、７×１０^５個以上の／ｍｌ、１×１０^６個以上の／ｍｌ、３×１０^６個以上の／ｍｌ、５×１０^６個以上の／ｍｌ、７×１０^６個以上の／ｍｌ、１×１０^７個以上の／ｍｌ、３×１０^７個以上の／ｍｌ、５×１０^７個以上の／ｍｌ、７×１０^７個以上の／ｍｌ、１×１０^８個以上の／ｍｌ、３×１０^８個以上の／ｍｌ、５×１０^８個以上の／ｍｌ、７×１０^８個以上の／ｍｌ、１×１０^９個以上の／ｍｌ、３×１０^９個以上の／ｍｌ、５×１０^９個以上の／ｍｌ、７×１０^９個以上の／ｍｌ、１×１０^１０個以上の／ｍｌ、３×１０^１０個以上の／ｍｌ、５×１０^１０個以上の／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上の／ｍｌ）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個～１×１０^１０個（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個、１×１０^６個～１×１０^７個、又は１×１０^６個～５×１０^６個）の量で含有する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞の投与経路は、注射投与、塗抹投与、接着投与、浣腸投与、灌流投与、直腸投与、及び経口投与からなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、上記方法は、それを必要とする被験体に、先に記載又は定義された第２の活性成分を投与することを更に含む。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

別の態様においては、本発明は、第１の活性成分として間葉系幹細胞集団を含む、消化器系疾患を治療する製品を提供する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、消化器疾患は、上記に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、製品は、第２の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、第１の活性成分及び第２の活性成分は、単独で又は組合せにおいて存在する。

或る特定の実施の形態においては、第１の活性成分は、先に記載されたものから選択される第２の活性成分との組合せにおいて投与される。

或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤であり、好ましくは、インプラント剤は、微小環境を改善し、免疫拒絶反応を抑制するのに使用される。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

急性肝臓損傷
この文献において、「急性肝臓損傷」という用語は、異常な肝臓機能、更には一部の患者においては肝臓不全を伴って肝臓細胞の急性損傷又は壊死が短期間で発生することを指す。急性肝臓損傷の原因としては、主にウイルス感染、不適切な薬物使用、食品添加物、エタノールの過剰摂取、有毒食品の誤摂取、放射線障害等が挙げられる。急性肝臓損傷としては、ウイルス性肝臓損傷、化学的肝臓損傷、及び薬物誘発性肝臓損傷が挙げられる。

本明細書において使用される場合に、「化学的急性肝臓損傷」という用語は、化学的肝毒性物質によって引き起こされる肝臓損傷を指す。これらの化学物質としては、アルコール、環境内の化学毒物（例えば、四塩化炭素）及び或る特定の薬物が挙げられる。

肝臓は強力な防御能力及び修復能力を有する。肝臓損傷が様々な理由によって引き起こされる場合に、肝臓構造を再建し、肝臓機能を回復するのに肝細胞再生に頼ることができる。急性肝臓損傷は、ウイルス、薬物、アルコール、自己免疫異常、及び他の要因によって引き起こされる短期間の肝臓不全を特徴とする疾患の一種である。主な病理学的変化は、肝臓細胞の広範な壊死及びアポトーシスであり、それにより、肝臓は正常な合成及び代謝機能を発揮することができなくなる。疾患の進行が短期間で介入されなければ、疾患は急速に悪化し、凝固機能不全、黄疸、腹水症、及び肝性脳症が引き起こされ、更に多臓器不全につながる可能性がある。肝臓不全に進行すると、急速に進行し、治療が困難であるため、全体的な予後は極めて悪くなる。自家肝臓移植は重度の肝臓損傷の治療に最も効果的な方法であるが、肝臓ドナーの不足、高い手術費、術後合併症、及び免疫拒絶反応等の様々なリスクがあるため、肝臓移植の適用は限られている。急性肝臓損傷の高い死亡率及び肝臓移植の限界を考えると、幹細胞治療が、急性肝臓疾患及び慢性肝臓疾患の治療において大きな可能性及び利点を示している。

一態様においては、本発明は、被験体における急性肝臓損傷を予防及び／又は治療するための、又は被験体における急性肝臓損傷を予防及び／又は治療する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。上記使用は、肝臓を保護し、肝臓機能を維持及び／又は延長及び／又は改善することができる。

より詳細には、或る特定の実施の形態において、医薬組成物は、急性肝臓損傷を伴う患者の減量速度を抑制又は低減し、急性肝臓損傷を伴う患者の死亡率を低下させることができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、血清中のトランスアミナーゼ及び／又はアルカリホスファターゼの含有量を低下させることができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、炎症性細胞浸潤を予防することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の実施の形態においては、本発明の培養上清、又は培養上清を含む医薬組成物は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張水溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

非アルコール性脂肪性肝炎
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、代謝性脂肪性肝炎としても知られ、炎症及び肝細胞損傷（例えば、バルーニング変化）を伴い、肝臓線維症を有する又は有しない５％以上の脂肪肝が存在すると定義される、進行型の非アルコール性脂肪性肝臓疾患である。ＮＡＳＨは、肝硬変、肝臓癌、及びその他の疾患に発展し易い。世界中に３％～５％のＮＡＳＨ患者がいる。中国には肝硬変を伴う患者が約１０９万人おり、２０３０年には２３２万人に増加すると予想される。ＮＡＳＨの発症は、遺伝（ＰＮＰＬＡ３の多型）、生活習慣（宿主の食習慣、食事の回数、睡眠覚醒周期等）、肥満、メタボリックシンドローム等と密接に関連している。ＮＡＳＨの一般的な症状としては、食欲不振、倦怠感、腹部膨満、吐き気及び嘔吐、肝臓領域における鈍痛、並びに肝腫大が挙げられる。環境的要因、代謝的要因、及び遺伝的要因により、肝臓において遊離脂肪酸の蓄積がもたらされ、それが更に一連の細胞損傷を引き起こす。現在、ＮＡＳＨ治療には非臨床治療及び臨床治療がある。非臨床治療としては、疾患の経過を改善するライフスタイルの変更が挙げられ、一方で、臨床治療としては、肝臓移植、手術、及び該疾患を治療する調査中の薬物が挙げられる。アジュバント療法には、健康的なライフスタイルに進展させる治療戦略がより適切である。肝臓移植には費用がかかり、ドナーが不足している。外科的治療は、患者が適格基準を満たすことを必要とし、制限がある。現在、ＮＡＳＨの治療に関してＦＤＡが承認した薬物は存在しない。したがって、ＮＡＳＨの治療は依然として緊急の不足状態にある。

一態様においては、本発明は、被験体における非アルコール性脂肪性肝炎を予防及び／又は治療するための、又は被験体における非アルコール性脂肪性肝炎を予防する、若しくは非アルコール性脂肪性肝炎を遅延若しくは軽減する、若しくは非アルコール性脂肪性肝炎を予防／緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、肝臓重量を減少させ、肝臓における脂肪蓄積を抑制し、及び／又は脂肪肝を軽減することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、トランスアミナーゼの含有量を低下させ、肝臓機能を改善することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、線維症を抑制し、及び／又は炎症を抑制することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、宿主遺伝学、宿主免疫学、微生物叢、及び環境曝露の間の相互作用を体現する粘膜免疫系及び共生生態系の調節不全に関連する典型的な慢性再燃性疾患である。

ＩＢＤは、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の２つの主要な病型によって現れる。ＵＣは結腸を冒し、ＣＤは胃腸管の任意の領域を冒す可能性があるが、主に小腸の回腸末端で発生する。

ＩＢＤの腸の合併症としては、膿瘍、腸閉塞、腸穿孔、結腸癌、裂肛、瘻孔、月経症状の悪化、及び中毒性巨大結腸症が挙げられる。ＩＢＤの特定の合併症（クローン病及び潰瘍性大腸炎）は生命を脅かす可能性があり、より深刻な疾患を防ぐのに迅速な治療を必要とする。

膿瘍：潰瘍性大腸炎よりもクローン病においてより一般的な膿瘍は、感染部位での膿の蓄積である。膿瘍は、腸内壁、腸外壁等の体内、皮膚内等において目に付かずに発生する場合がある。内部膿瘍は抗生物質を用いて治療することができるが、解消することができなければ、排膿が必要とされる。これは、皮膚を通して膿瘍部位にカテーテルを挿入することによって行うことができる。胃壁を通す等の他の方法において、カテーテルを挿入することもできる。排膿のために手術が必要となる場合もある。

腸閉塞：腸閉塞とは、小腸又は大腸の一部が部分的又は完全に閉塞しており、それにより身体が排泄物を分泌することが妨げられることを指す。腸閉塞は通常、激痛、嘔吐、及び便秘を伴う。場合によっては、症状を和らげるのに経鼻胃管が役立つ場合があるが、閉塞を取り除くには手術が必要となる場合がある。

腸穿孔：腸穿孔（孔）のリスクは稀であるが、ＩＢＤの致命的となる可能性のある合併症である。腸穿孔は、潰瘍性大腸炎の最初のエピソードの間に、重度の疾患のため腸壁が非常に薄くなった人において最も一般的である。腸穿孔は、殆どの場合、孔を修復するか、又は更には腸の一部を除去するのに外科的に治療される。

結腸癌：ＩＢＤを伴う患者、特に結腸全体の潰瘍性大腸炎を８年間～１０年間患っている患者は、結腸癌を発症するリスクが高くなっている。クローン病を伴う患者もリスクに曝されているが、リスクの程度についての情報は殆どない。ＩＢＤを伴う人、特に最高のリスクに曝されている人については、結腸内視鏡検査によって結腸癌を注意深く監視しなければならない。

裂肛：裂肛は、出血を引き起こし得る肛門管における痛みを伴う裂傷である。殆どの裂傷は手術なしで治癒し、局所クリーム等の治療を使用して、張りのないスムーズな排便を保証することができる。治癒せずに慢性化する裂傷には、手術が必要となる場合がある。

瘻孔：瘻孔は、２つの体腔間又は体腔と皮膚との間の異常な接続である。瘻孔は潰瘍性大腸炎よりもクローン病においてより一般的であり、実際、クローン病を伴う患者の約２５パーセントはそれらの疾患の過程の間の或る時点で瘻孔を発症する場合がある。一部の瘻孔は薬物療法により治療され得るが、それらがより重度又は広域であるほど、それらは手術を必要とする可能性が高くなる。

月経前症候群：ＩＢＤを伴う一部の女性は、月経中にその症状が悪化することに気付く。月経前及び月経中に下痢及び痛みが増す場合がある。これらの症状の原因は、月経周期の間のホルモンの増加である可能性がある。

中毒性巨大結腸症：中毒性巨大結腸症は稀であるが、これは生命を脅かす疾患である。治療せずに放っておくと、中毒性巨大結腸症は、ショック、穿孔、又は腹部若しくは血液の感染症を引き起こす可能性がある。場合によっては、医薬で治療される場合もあるが、重度の症例では手術が必要となる場合がある。

一態様においては、本発明は、被験体における炎症性腸疾患を予防及び／又は治療するための、又は被験体における炎症性腸疾患を予防及び／又は治療する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、及び／又は医薬組成物の使用に関する。

上述の使用は、炎症細胞の浸潤を予防及び治療し、結腸を保護し、炎症因子（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＴＦＮ－α、ｉＮＯＳ等）を減少させ、抗炎症因子（例えば、ＩＬ１０等）を増加させ、又は上方調節し、炎症の発症を抑制し、栄養因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＤＦ－１ａ等）を分泌し、結腸組織の修復等を促進して、炎症性腸疾患の予防及び／又は治療において、炎症の抑制及び組織修復の促進等の機能を実現し、それにより結腸組織を保護し、腸を保護し、かつ組織修復能力を改善することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、クローン病（ＣＤ）及び／又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を治療することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の実施の形態においては、本発明の培養上清、又は培養上清を含む医薬組成物は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、静脈内注射又は腹腔内注射によって投与される。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物はまた、限定されるものではないが、５－アミノサリチル酸、ＮＦ－κＢ及びアクチベータータンパク質－１（アクチベータータンパク質－１、ＡＰ１）、免疫抑制薬（アザチオプリン）、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリンＡ、タクロリムス、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、アンタゴニスト等を含む別の薬学的組合せ（pharmaceutical combination）を含む。

神経系疾患
一態様においては、本発明は、神経系疾患の予防及び／又は治療に使用される医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、神経系疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

神経系疾患は、主に神経系の機能不全によって現れる疾患であり、その症状としては、主に異常な精神行動、健忘症、不眠症、情緒変化、及び知的変化が挙げられる。神経系疾患としては、脳血管疾患、神経系の変性疾患、中枢神経系の感染性疾患、中枢神経系の脱髄性疾患、運動障害、癲癇、脊髄疾患、神経系の遺伝性疾患、神経系の異形成、中枢神経系の全身中毒疾患、中枢神経系の腫瘍疾患、中枢神経系の免疫疾患等が挙げられる。例としては、脳血管疾患、周期性四肢麻痺、進行性筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、運動失調、不眠症、神経衰弱症、癲癇、三叉神経痛、神経変性疾患、神経因性頭痛（例えば、片頭痛等）、及び神経障害等が挙げられる。

神経障害
神経障害は、中枢神経系、末梢神経系、及び自律神経系の感覚機能不全、運動機能不全、意識機能不全、及び自律神経機能不全の臨床症状を伴う疾患である。

神経変性疾患
神経変性疾患は、ニューロンが徐々に構造若しくは機能を失うか、又は更にはそれが死ぬことによって引き起こされる機能不全の疾患であり、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、癲癇、ハンチントン病、及び脊髄筋萎縮症、脳損傷、様々な種類の脊髄小脳失調症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、伝達性海綿状脳症、原発性側索硬化症、多発性硬化症、心血管性認知症及び脳血管性認知症、神経因性疼痛、緑内障、外傷性脊髄損傷、多系統萎縮症等が挙げられる。

（１）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）：
一般にＡＬＳとして知られる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動皮質の上位運動ニューロンと、脳幹及び脊髄の下位運動ニューロンとを冒す特発性の致命的な神経変性疾患である。多数の運動ニューロンが失われると、筋消耗がもたらされ、自発収縮及び痙攣が引き起こされる。ＡＬＳは、家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）と散発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）との２つのカテゴリーに分けられ、家族性ＡＬＳが１０％を占め、散発性ＡＬＳが９０％を占める。ＡＬＳ患者の発症年齢は通常４０歳以降であり、ＦＡＬＳ及びＳＡＬＳの高い発生率はそれぞれ４７歳～５２歳及び５８歳～６３歳であり、発生率は８０歳以降に減少し、女性よりも男性の方がこの疾患になりやすい。患者は一般的に、疾患の発症から３年～５年生存する。遺伝的性質、職業、ライフスタイル、年齢等の様々な要因がＡＬＳの発生率と密接に関連している。一方で、ＡＬＳの病因は、星状細胞がシナプス内に蓄積されたグルタミン酸を時間内に回復することができず、グルタミン酸興奮毒性を引き起こすことであり、他方で、ＳＯＤ１、ＵＢＱＬＮ２、ＯＰＴＮ、ＶＣＰ、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、Ｃ９ＯＲＦ７２を含む突然変異遺伝子は、毒性をもたらす誤ったタンパク質コンフォメーション多量体の産生、及び運動ニューロンの損傷を悪化させる毒性ＲＮＡ種の産生をもたらし、シナプス退縮を引き起こし、シナプス後膜受容体に結合することができず、完全な電気信号の伝達がうまくいかず、最終的に臨床症状が見られる。ＡＬＳの治療には薬物治療が利用可能である。現在、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）及び欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって承認された２つの神経保護薬だけが、一部の患者の寿命を数ヶ月延長することができる：過剰なグルタミン神経伝達を遮断することができるリルゾール、酸化ストレスによる損傷を防ぐことができるエダラボン、外科的治療：患者が嚥下困難又は咀嚼困難である場合は、経鼻胃栄養法又は胃瘻造設術を行う場合がある。呼吸筋が麻痺している場合は、気管切開術をできるだけ早く行って、換気を使用して呼吸を維持するべきであり、補助療法：リハビリテーション訓練もある。臨床的には、特定の症状に対応する特定の治療法がある。上述の治療法は、患者の生存期間を数ヶ月だけ延長することができるが、患者の生活の質を大幅に改善することはない。したがって、依然としてより効果的な治療が緊急に必要とされている。上記の治療法に加えて、遺伝子編集は現在、前臨床研究において注目の話題である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集系を介したＳＯＤ１の直接的な編集は、筋萎縮性側索硬化症の治療にｉｎ ｖｉｔｒｏで及びトランスジェニックマウスにおいて使用されている。しかしながら、遺伝子編集にはまだ多くの不確実性がある。

幾つかの実施の形態においては、本発明の医薬は、上述の投与方法に加えて、静脈内注射又は脳組織注射によって投与され得る。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、疾患の発症を遅延させる。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、四肢の協調、運動能力、握力等の反応能力等を強化することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、筋力を改善し、筋萎縮性側索硬化症における運動ニューロンの損傷を軽減することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、運動ニューロンを改善し、ミクログリア及び星状細胞を減少させ、筋萎縮性側索硬化症における疾患の進行を緩和することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの実施の形態においては、本発明の培養上清、又は培養上清を含む医薬組成物は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、静脈内注射又は脳組織注射によって投与される。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張水溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

（２）癲癇
癲癇は、様々な病因によって引き起こされる慢性脳疾患であり、脳ニューロンの過剰発火によって引き起こされる突然の再発性及び一過性の中枢神経系機能不全を特徴としている。癲癇としては、特発性癲癇症候群、症候性癲癇症候群、症候性の可能性のある癲癇症候群又は原因不明癲癇、反射性癲癇症候群、良性癲癇症候群、癲癇性脳症が挙げられる。

癲癇は、明らかな理由もなく突然発生する発作の再発を特徴とする慢性脳障害であり、脳卒中に次いで２番目に多い神経障害である。脳内のニューロンの「異常な発火」は、反復的で短期的な癲癇発作を引き起こす。世界中で７０００万人を超える人が癲癇に罹患しており、中国の人口における発生率は５‰から７‰の間であり、全国的に６５０万人～９１０万人の患者がいる。一部の脳血管合併症、頭部外傷、中枢神経系感染症等が二次性癲癇を引き起こす可能性があり、睡眠、年齢、及び遺伝的性質が特発性癲癇と密接に関連している。癲癇の治療においては、抗癲癇薬が最も広く使用されている。しかしながら、分子標的が異なる３０種類の抗癲癇薬（ＡＥＤ）が存在するにもかかわらず、癲癇の薬物治療には、薬剤耐性、副作用、頻繁な依存毒性に関連する毒性、及び記憶障害等の多くの問題が依然として存在する。さらに、脳外科手術は最も重要な代替治療であるが、登録の適格性、並びにリスク及びコストを考慮しなければならない。現在、臨床試験は主に薬物治療であり、２００件超が第ＩＩＩ相にある。

一態様においては、本発明は、癲癇を予防及び／又は治療する、癲癇性発作を遅延若しくは緩和する、又は癲癇性発作を予防する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、癲癇を予防及び／又は治療する、癲癇性発作を遅延若しくは緩和する、又は癲癇性発作を予防する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

本発明の間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物は、癲癇を予防し、又は癲癇性発作を遅延若しくは緩和し、又は癲癇性発作を予防することができる。

幾つかの好ましい実施の形態においては、投与は、脳内注射又は静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、脳内のＧＡＢＡ作動性ニューロンの数を増加させ、又はＧＡＢＡ作動性ニューロンを活性化し、又はミクログリアの数を減少させ、又はモデルにおけるＧＡＢＡ作動性ニューロンが欠損している神経回路を再構築及び修復し、又は内因性幹細胞がＧＡＢＡ作動性系譜に分化する能力を促進し、又は炎症反応を抑制することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、モデル動物における記憶及び学習能力を改善することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、栄養分子（例えば、ＧＤＮＦ）の脳内分泌レベルを提供して、神経学的機能を保護することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の培養上清、又は培養上清を含む医薬組成物は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、脳内注射又は静脈内注射によって投与される。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

（３）アルツハイマー病（ＡＤ）
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老年姓認知症の最も一般的な形態であり、老年期に最も一般的な慢性疾患の１つであり、老年姓認知症の約５０％～７０％を占める。世界中で３５００万人以上がＡＤに罹患している。ＡＤの臨床症状は、進行性の記憶喪失及び認知機能不全である。アルツハイマー病は、２つの病原性の特色、すなわち、細胞外アミロイドベータ（Ａβ）沈着及び細胞内神経原線維変化（神経原線維変化、ＮＴＦ）に関連しており、神経炎症並びに広範なニューロン及びシナプスの欠損を伴い、進行性の記憶喪失及び認知機能不全を引き起こす。現在、アルツハイマー病を治癒することができ、又は疾患の過程を効果的に回復に向かわせることができる特定の薬物は存在しない。薬物療法、非薬物療法、及び手厚い看護の組合せにより、疾患の発症を緩和し、遅延させることができる。したがって、ＡＤを治癒することができ、又はＡＤを回復に向かわせることができる効果的な治療戦略を開発することが重要である。現在、主に薬物研究に対して臨床試験が行われており、２００件を超える臨床試験がある。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の臨床試験は１０件あり、臨床第Ｉ相及び臨床第ＩＩ相にある。

一態様においては、本発明は、アルツハイマー病若しくは脳血管疾患を予防及び／又は治療する、アルツハイマー病若しくは脳血管疾患を遅延若しくは緩和する、又はアルツハイマー病若しくは脳血管疾患を予防及び緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、アルツハイマー病若しくは脳血管疾患を予防及び／又は治療する、アルツハイマー病を遅延若しくは緩和する、又はアルツハイマー病若しくは脳血管疾患を予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、学習能力及び記憶能力を改善し、記憶障害及び認知障害を改善することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、脳内のアミロイド沈着物の蓄積を減少させ、神経に対するアミロイド沈着物の悪影響を低下させることができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、ミクログリアの炎症誘発性形態への変換を阻害し、ミクログリアの過剰な活性化及び機能不全を抑制することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、ミクログリアの食作用能力を増加させ、アミロイド沈着物及びアポトーシス細胞破片を取り除き、ＡＤ脳の炎症性環境におけるＡ１星状細胞の産生を阻害し、かつ過剰活性化免疫を阻害することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、神経細胞生存を増加させ、認知及び記憶を改善することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、医薬は単位用量形態であり、医薬の単位投与量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、好ましくは３×１０^６個～６×１０^６個）の量で含有する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含み、好ましくは、担体は、ゼラチン、キトサン、アルギン酸ナトリウム、コラーゲン、シルクタンパク質、セルロース、繊維状タンパク質、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）、ケイ酸塩、シリコーンゴム、細胞外マトリックス、脱細胞化足場、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、好ましくは、担体は、ゼラチン、コラーゲン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、好ましくは、医薬は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤、好ましくは注射剤であり、好ましくは、医薬は、薬学的に許容可能な滅菌の等張の水性又は非水性の溶液、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを更に含む。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、追加の活性成分を更に含み、追加の活性成分は、例えば、β－セクレターゼ阻害剤（例えば、ＯＭ９９－２）、γ－セクレターゼ阻害剤（例えば、Ｒ－フルルビプロフェン）、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル、塩酸ドネペジル、リバスチグミン、フペルジンＡ、タクリン、ガランタミン、又はガランタミン臭化水素酸塩）、Ｍコリン受容体アゴニスト又はアンタゴニスト（例えば、ザノメリン、サッコメリン（saccomeline）、ネフィラセタム、ＡＦ－１０２Ｂ、及びＳＲ－４６５５９Ａを含むＭ１コリン受容体アゴニスト、ＢＩＢＮ－９９及びＡＦ－ＤＸ１１を含むＭ２コリン受容体アンタゴニスト、又はニコチン及びＡＢＴ－４１８を含むＮ－コリン受容体アゴニスト）、グルタミン酸受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン、塩酸メマンチン、又はリルゾール）、カルシウムイオンアンタゴニスト（例えば、ニモジピン又はフルナリジン）、抗酸化剤（例えば、ビタミンＥ、Ｌ－デプレニル、メラトニン、メラトニン、デフェロキサミン、イデベノン、又はメシル酸チリタザド（tiritazad））、Ａβ阻害薬（例えば、エストロゲン、クロロキン、コンゴーレッド、又はアミノフェニル酢酸フェニル）、ドーパミン代替物（例えば、レボドパ）、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤（例えば、カルビドパ又はベンセラジド）、ドーパミンＤ受容体アゴニスト（例えば、ブロモクリプチン、ペルゴリド、アポモルフィン、プラミペキソール、又はロピニロール）、神経分化誘導剤（例えば、ピペラセタム（piperacetam）、アニラセタム、オキシラセタム、プラミラセタム、又はネフィラセタム）、抗コリン作用薬（例えば、塩酸トリヘキシフェニジル、プロシクリジン、ビペリデン、又はベンズトロピン）、抗鬱薬（例えば、アミトリプチリン、フェネルジン、トラニルシプロミン、イソカルボキサジド、又はイストラデフィリン）、５－ヒドロキシトリプタミンアゴニスト（例えば、サリゾタン又はブジピン）、ＭＡＯ－Ｂ阻害剤（例えば、セレギリン又はラサギリン）、ドーパミンβ－ヒドロキシラーゼ阻害剤（例えば、フサリン酸）、ＣＯＭＴ阻害剤（例えば、エンタカポン又はトルカポン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリンＡ、又はタクロリムス）、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、好ましくは、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、単独で又は組合せにおいて存在する。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの好ましい実施の形態においては、投与は、脳内注射又は静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

幾つかの実施の形態においては、投与する投与量は、１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^４個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^５個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^６個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^７個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^８個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、７×１０^９個以上の細胞／ｍｌ、１×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、３×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、５×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上の細胞／ｍｌ）である。

幾つかの実施の形態においては、予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団は、注射投与、粘膜投与、腔内投与（cavity administration）、経口投与、気道投与、又は皮膚投与によって被験体に投与される。

幾つかの実施の形態においては、上記方法は、予防有効量及び／又は治療有効量の追加の活性成分を被験体に同時に、逐次に、又は交互に投与することを更に含み、ここで、追加の活性成分は、例えば、β－セクレターゼ阻害剤（例えば、ＯＭ９９－２）、γ－セクレターゼ阻害剤（例えば、Ｒ－フルルビプロフェン）、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル、塩酸ドネペジル、リバスチグミン、フペルジンＡ、タクリン、ガランタミン、又はガランタミン臭化水素酸塩）、Ｍコリン受容体アゴニスト又はアンタゴニスト（例えば、ザノメリン、サッコメリン、ネフィラセタム、ＡＦ－１０２Ｂ、及びＳＲ－４６５５９Ａを含むＭ１コリン受容体アゴニスト、ＢＩＢＮ－９９及びＡＦ－ＤＸ１１を含むＭ２コリン受容体アンタゴニスト、又はニコチン及びＡＢＴ－４１８を含むＮ－コリン受容体アゴニスト）、グルタミン酸受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン、塩酸メマンチン、又はリルゾール）、カルシウムイオンアンタゴニスト（例えば、ニモジピン又はフルナリジン）、抗酸化剤（例えば、ビタミンＥ、Ｌ－デプレニル、メラトニン、メラトニン、デフェロキサミン、イデベノン、又はメシル酸チリタザド）、Ａβ阻害薬（例えば、エストロゲン、クロロキン、コンゴーレッド、又はアミノフェニル酢酸フェニル）、ドーパミン代替物（例えば、レボドパ）、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤（例えば、カルビドパ又はベンセラジド）、ドーパミンＤ受容体アゴニスト（例えば、ブロモクリプチン、ペルゴリド、アポモルフィン、プラミペキソール、又はロピニロール）、神経分化誘導剤（例えば、ピペラセタム、アニラセタム、オキシラセタム、プラミラセタム、又はネフィラセタム）、抗コリン作用薬（例えば、塩酸トリヘキシフェニジル、プロシクリジン、ビペリデン、又はベンズトロピン）、抗鬱薬（例えば、アミトリプチリン、フェネルジン、トラニルシプロミン、イソカルボキサジド、又はイストラデフィリン）、５－ヒドロキシトリプタミンアゴニスト（例えば、サリゾタン又はブジピン）、ＭＡＯ－Ｂ阻害剤（例えば、セレギリン又はラサギリン）、ドーパミンβ－ヒドロキシラーゼ阻害剤（例えば、フサリン酸）、ＣＯＭＴ阻害剤（例えば、エンタカポン又はトルカポン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリンＡ、又はタクロリムス）、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、好ましくは、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、単独で又は組合せにおいて存在する。

（４）錐体外路障害及び運動障害
パーキンソン病、続発性パーキンソン病、他に分類される疾患によって引き起こされるパーキンソン病、大脳基底核の他の変性疾患、ジストニア、他の錐体外路障害及び運動障害、他に分類される疾患によって引き起こされる錐体外路障害及び運動障害を含む、錐体外路障害及び運動障害。

錐体外路疾患としても知られる運動障害は、主に、筋力、感覚機能、及び小脳機能を冒さない随意運動調節の機能不全を特徴としている。この群の疾患は、大脳基底核の機能不全に起因し、通常、筋緊張亢進－運動の減少及び筋緊張低下－過度の運動の２つのカテゴリーに分けられる。筋緊張亢進は運動の欠如を特徴とし、筋緊張低下は主に異常な不随意運動を特徴とする。

パーキンソン病（ＰＤ）は運動障害であり、中枢神経系、主に運動神経系を冒す慢性神経変性疾患である。その症状は通常、時間の経過とともにゆっくりと現れ、最も明白な初期症状は、振戦、四肢の硬直、運動機能の低下、及び異常歩行であり、認知及び行動の問題が存在する場合もある。認知症は重度の疾患を伴う患者において非常によく見られるが、大鬱病性障害及び不安障害も３分の１を上回る症例において発生する。その他の考えられる症状としては、知覚問題、睡眠問題、及び感情的問題が挙げられる。パーキンソン病に関連する主な運動症状は、総じてパーキンソン症候群として知られている。

一態様においては、本発明は、パーキンソン病を予防及び／又は治療する、パーキンソン病を遅延若しくは緩和する、又はパーキンソン病を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、パーキンソン病を予防及び／又は治療する、パーキンソン病を遅延若しくは緩和する、又はパーキンソン病を予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、ドーパミン作動性除神経を減少させ、及び／又はパーキンソン病の進行を寛解することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、四肢の硬直を改善し、及び／又は運動能力を高めることができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、ニューロンを保護し、ニューロンの損傷及び死を減少させ、ニューロンに対する栄養性効果及びシナプス再生効果を有し、脳内の炎症を軽減し、及び／又は脳内の微小環境を改善することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの実施の形態においては、投与は、静脈内注射又は脳内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

脊髄損傷（ＳＣＩ）
「脊髄損傷」とは、様々な病原性因子（外傷、炎症、腫瘍等）によって引き起こされる脊髄の構造及び機能の横断性損傷を指し、それにより、一次脊髄損傷と二次脊髄損傷とに分けられる損傷したセグメントのレベルより下の脊髄神経機能（運動機能、感覚機能、括約筋機能、及び自律神経機能）の障害が引き起こされ、ここで、一次脊髄損傷としては、外傷性脊髄損傷が挙げられ、二次脊髄損傷としては、脊髄結核、脊髄化膿性感染症、横断性脊髄炎、脊髄変性疾患、先天性脊柱側弯症、脊髄係留症候群が挙げられる。

脊髄損傷（ＳＣＩ）は、外傷によって引き起こされる外傷性脊髄外科疾患であり、損傷したセグメントより下の感覚機能不全、運動機能不全、及び自律神経機能不全として現れる。外国の疫学調査によれば、世界中に毎年１３００００人の新たな脊髄損傷患者がおり、２５０万人を超える患者が種々の程度の脊髄損傷後遺症に苦しんでおり、これらのＳＣＩ患者の年間医療費は６０億米ドルを超え、家族及び社会に大きな負担がかかることとなる。

一次脊髄損傷の２つの主な共通の転帰：脊髄挫傷及び脊髄圧迫（外的力又は内的力）がある。二次損傷とは、外力に誘発される脊髄浮腫、脊柱管内の小血管の出血によって形成された血腫、圧迫骨折、及び椎間板組織の破壊によって引き起こされる脊髄圧迫による脊髄の二次損傷を指す。

一態様においては、本発明は、脊髄損傷を予防及び／又は治療する、脊髄損傷を遅延若しくは緩和する、又は脊髄損傷を予防及び緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団若しくはその培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、脊髄損傷を予防及び／又は治療する、脊髄損傷を遅延若しくは緩和する、又は脊髄損傷を予防及び緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、運動能力を改善することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、膀胱出口部抵抗及び排尿筋過活動を低減し、排尿機能を改善することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、細胞の生存を促進し、軸索再生を増強し、グリア細胞の活性化、抗線維化を抑制し、かつ損傷部位での炎症反応を低減することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、上述の薬物に加えて、プロスタサイクリン、エンドセリン－１受容体アンタゴニスト、及び／又はホスホジエステラーゼ５型阻害剤を更に含む。

脳血管疾患
「脳血管疾患」とは、脳卒中、脳麻痺、脳アテローム性動脈硬化症、脳動脈炎、脳動脈損傷、脳動脈瘤、頭蓋内血管奇形、脳動静脈瘻、脳血管発作、脳血管攣縮等を含む、頭蓋内血液循環障害によって引き起こされる脳組織損傷及び脳機能不全に関連する、脳血管において発生する一群の疾患を指す。

（１）脳卒中
脳卒中とは、虚血性及び出血性の２つのカテゴリーを含む、脳内の血管の突然の破裂又は血液の脳内への流入を妨げる血管の閉塞による脳組織損傷に関連する一群の疾患を指す。虚血性脳卒中は、脳血栓症、脳塞栓症、脳梗塞を含み、一方で、出血性脳卒中は、クモ膜下出血、高血圧性脳出血等を含む。

脳卒中は、脳血管が狭窄し、閉塞し、又は破裂して、脳組織の虚血又は出血をもたらし、脳細胞及び脳組織の壊死を引き起こす脳血管疾患の一種である。脳卒中は、虚血性脳卒中（脳梗塞としても知られる）と、出血性脳卒中（脳実質出血、脳室出血、及びクモ膜下出血を含む）とに分けられる。男性及び女性における虚血性脳卒中の発生率は、それぞれ２１２／１０００００及び１７０／１０００００であり、出血性脳卒中の発生率は１２～１５／１０００００である。しかしながら、喫煙、粗食、不活動等のライフスタイルの人、そして高血圧、糖尿病、高脂血症、肥満等を含む合併症を伴う人は、しばしば脳卒中を起こしやすい。現在、脳卒中の治療に最も広く使用されているのは、血栓溶解薬の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）である。ｔ－ＰＡ治療の適用には、患者が適格基準を満たす必要があるため、ｔ－ＰＡは特定の脳卒中患者向けであり、治療時間枠は短く、４．５時間に限定されている。さらに、血管内療法も主要な治療戦略である。しかしながら、不利点もあり、血管内ステントは、大きな血管の血流が遮断されるという問題を解決するためだけに適している。薬物療法及び健康的なライフスタイル及び有酸素運動を含む予防措置の使用により脳卒中の発生率は減少に導かれたが、再発率が高いことは頭痛の種である。したがって、脳卒中の治療は依然として大きな問題である。既存の臨床試験は主に、脳卒中患者の回復を助ける幾らかの電子技術製品又はソフトウェアシステム、行動及びライフスタイルの改善、脳卒中患者の回復用の薬物療法及び細胞療法に焦点を合わせている。臨床試験においては、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は基本的に臨床第Ｉ相及び臨床第ＩＩ相にある。

一態様においては、本発明は、脳卒中を予防及び／又は治療する、脳卒中を遅延若しくは緩和する、又は脳卒中を予防する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、脳卒中を予防及び／又は治療する、脳卒中を遅延若しくは緩和する、又は脳卒中を予防する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、脳梗塞の程度を軽減し、脳組織の梗塞サイズを減少させ、脳組織の水分含有量を低下させ、外側前肢の利用率を増加させ、運動時間を増加させ、脳卒中による神経細胞損傷の程度を減弱させることができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、ニューロンの再生を促進し、ニューロンの損傷及び死を減少させ、ニューロンに栄養をもたらし、シナプス再生を促進することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、脳内の炎症反応を減弱させ、脳内の微小環境を改善することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの実施の形態においては、投与は、静脈内注射又は脳組織注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

神経因性疼痛
神経因性疼痛は、身体の末梢神経、神経系、感覚神経等を冒す原発性病変又は機能不全等の疾患によって誘発され又は引き起こされる疼痛を指し、自発痛、異痛症、及び痛覚過敏を特徴とする。この疾患は、外傷及び（又は）疾患に誘発される末梢神経、脊髄後根、脊髄、及び中枢神経系の一部への損傷によって引き起こされる可能性がある。例としては、片側顔面痙攣、糖尿病性神経障害性疼痛、筋膜疾患、中枢神経痛、末梢神経因性疼痛、根性痛、術後腰部症候群（post-surgical back syndrome）、慢性局所疼痛症候群及び末梢神経損傷）、虚血性疼痛（例えば、末梢血管疾患及びアンギナ）、癲癇発作、パーキンソン症候群に関連する運動障害（例えば、振戦、麻痺、硬直、及び運動異常）、脊髄損傷に関連する神経因性疼痛、椎間板起因の疼痛、大後頭神経痛、坐骨神経痛、肋間神経痛、脳血管疾患、癲癇、脳浮腫、水頭症、癌性神経痛、脳炎、髄膜炎、神経皮膚炎、神経因性頭痛、及び他の神経因性疼痛が挙げられる。

神経因性疼痛は、神経系の損傷又は異常によって引き起こされる治療困難な疼痛状態であり、神経炎等の神経組織において発生する疼痛である。この種の疼痛は主に神経病変及び神経痛を特徴とし、或る程度は発作性である。局所疼痛を感じることもあるが、押しても痛みはない。これが神経因性疼痛についての全てである。神経痛の一般的な治療は、主に神経に栄養を与える薬物及び痛みを和らげる薬物を、好ましくは医師の指導の下で使用することである。

一態様においては、本発明は、神経因性疼痛に誘発される損傷（neuropathic pain-induced injury）若しくは関連の神経因性疼痛を予防及び／又は治療する、又は神経因性疼痛を予防する、又は神経因性疼痛を遅延させる若しくは軽減する、又は神経因性疼痛を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、神経因性疼痛に誘発される損傷若しくは関連の神経因性疼痛を予防及び／又は治療する、又は神経因性疼痛を予防する、又は神経因性疼痛を遅延させる若しくは軽減する、又は神経因性疼痛を予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、被験体の疼痛に対する耐性、異痛症に対する耐性を改善し、運動協調を促進することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、炎症誘発性因子（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＩＬ－１７）を減少させ、炎症反応を阻害することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

脱髄性疾患
脱髄性疾患は、様々な病因及び様々な臨床症状を伴うが、同様の特徴を有する一群の後天性疾患であり、その特徴的な病理学的変化は、比較的無傷の神経細胞を有する神経線維の脱髄である。ミエリン鞘の機能は、ニューロンを保護し、ニューロン上で神経インパルスを迅速に伝達させることであるため、ミエリン鞘の喪失は神経インパルスの伝達に影響を及ぼす。

中枢神経系における脱髄性疾患としては、多発性硬化症、他の急性播種性脱髄、及び中枢神経系の他の脱髄性疾患が挙げられる。

多発性硬化症
多発性硬化症：多発性硬化症（ＭＳ）は脱髄性神経障害であり、ここで、患者の脳又は脊髄における神経細胞の表面にある絶縁物質（すなわち、ミエリン）が損傷し、神経系における情報伝達が損なわれ、その結果、患者の活動、精神、及び更には精神状態に影響を与える可能性のある様々な症状が引き起こされる。これらの症状としては、複視、片側視力障害、筋力低下、異常感覚、又は協調運動障害が挙げられ得る。多発性硬化症は様々な状態であり、患者はエピソードの反復又は症状の悪化を経験する場合がある。エピソードの間に症状が完全に消える場合があるが、特に重症の患者においては、永続的な神経損傷が残る。

一態様においては、本発明は、多発性硬化症を予防及び／又は治療する、又は多発性硬化症を予防する、又は多発性硬化症を遅延若しくは軽減する、又は多発性硬化症を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、多発性硬化症を予防及び／又は治療する、又は多発性硬化症を予防する、又は多発性硬化症を遅延若しくは軽減する、又は多発性硬化症を予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、脊髄脱髄を減少させることができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、脊髄部位での炎症を抑制し、星状細胞の数を減少させ、希突起膠細胞を保護し、及び／又は脊髄セグメントにおける炎症を軽減することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、炎症誘発性因子（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、ＴＦＮ－α、ＩＬ－２）の含有量を低下させ、抗炎症因子（例えば、ＩＬ－１０）を増加させ、炎症を抑制することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

神経炎症
神経炎症は、外傷性脳損傷、脳卒中、脳出血、及び様々な神経変性疾患によって引き起こされる末梢神経の炎症性及び変性疾患である。正常な状態では、神経炎症は恒常性を維持し、組織修復を促進する。しかしながら、制御不能な神経炎症は脳に有害である場合がある。したがって、有害な炎症反応の制御は、神経学的障害の有望な治療アプローチである。

「神経炎症」とは、中毒、感染症、栄養障害及び代謝障害、免疫異常、加齢、遺伝的変異等によって引き起こされる中枢神経炎症及び末梢神経炎症を含む様々な理由による神経又は神経群の変性又は悪化によって引き起こされる炎症を指す。

「中枢神経系感染症」とは、中枢神経系の実質、被膜、及び血管に侵入する様々な生物学的病原体（ウイルス、細菌、リケッチア、スピロヘータ、寄生虫、プリオンタンパク質等を含む）によって引き起こされる、例えばウイルス感染、細菌感染、真菌感染、及び寄生虫感染によって引き起こされる脳炎、小脳炎、間脳炎、脳幹炎、脳脊髄炎、髄膜脳炎を含む急性又は慢性の炎症性（又は非炎症性）疾患を指す。

本明細書において使用される場合に、「細菌性髄膜脳炎」という用語は、ストレプトコッカス（streptococcus）、スタフィロコッカス（staphylococcus）、ニューモコッカス（pneumococcus）、ディプロコッカス（diplococcus）、パルツレラ・ムルトシダ（pasteurella multocida）、バチルス・ピオゲネス（bacillus pyogenes）、ネクロバチルス（necrobacillus）、プロテウスバチルス（proteusbacillus）、コリネバクテリウム・ピオゲネス（corynebacterium pyogenes）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）等によって引き起こされる髄膜炎、脳炎、又は髄膜脳炎、並びに外傷性脳損傷、中耳炎、鼻咽喉炎、その他の頭部の局所的炎症、及び感染巣の破裂後のリンパ又は血液を介した塞栓の移動によって引き起こされる細菌性髄膜炎、脳炎、又は髄膜脳炎を含む、細菌感染によって引き起こされる軟膜及び脳実質の炎症を指す。

一態様においては、本発明は、神経炎症を予防及び／又は治療する、神経炎症を遅延若しくは軽減する、又は神経炎症を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、神経炎症を予防及び／又は治療する、神経炎症を遅延若しくは軽減する、又は神経炎症を予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、炎症誘発性因子（例えば、ＩＬ－１β、ＩＬ－６）を減少させ、抗炎症因子（例えば、ＩＬ－１０）を増加させ、炎症を軽減することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、ニューロンの再生を促進し、ニューロンの損傷及び死を減少させ、神経炎症反応を低減させ、ニューロンに栄養をもたらし、シナプス再生を促進することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、炎症反応を減弱させ、神経系の微小環境を改善することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、文脈記憶を改善することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

精神障害
精神障害とは、認知、感情、行動、及び意志等の精神活動において様々な程度の障害をもたらす脳機能活動における障害の総称である。一般的な精神障害としては、感情障害、脳器質性精神障害が挙げられる。病原性因子は多面的である：先天性遺伝、人格特徴及び身体的要因、器質的要因、社会的環境要因等。精神障害としては、統合失調症、躁鬱病性精神障害、妄想性障害（妄想、幻覚）、恐怖症性障害（恐怖症、不安症）、行動的意志障害（behavioral volitional disorder）（強迫性障害）、分娩後精神障害（分娩後精神病、分娩後鬱病、母体鬱病）、閉経期障害、パラノイド精神障害、及び器質的病変による様々な精神障害（譫妄、健忘症候群、認知症、過食症／精神性無食欲症、外傷後ストレス障害）が挙げられる。

（１）気分障害
情動性精神障害としても知られる気分障害は、様々な理由によって引き起こされる顕著で長期にわたる感情変化又は気分変化を主な特徴とする一群の障害を指す。臨床的には、気分障害は、主に気分高揚又は気分沈滞として現れ、対応する認知変化及び行動変化並びに幻覚及び妄想等の精神病症状を伴う。気分障害としては、鬱病、躁病、双極性障害、持続性気分障害、及び気分変調症が挙げられる。

（２）鬱病
鬱病性障害としても知られる鬱病は、顕著で持続的な気分の落ち込みを特徴とする主な種類の気分障害である。

主な臨床症状は、鬱病、思考緩徐、意志活動の低下、認知障害、及び睡眠障害、並びにその他の身体症状である。

一態様においては、本発明は、鬱病を予防及び／又は治療する、又は鬱病を遅延若しくは軽減する、又は鬱病を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、鬱病を予防及び／又は治療する、又は鬱病を遅延若しくは軽減する、又は鬱病を予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、神経成長及び神経発達を促進することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの実施の形態においては、投与は、静脈内注射又は脳内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

別の態様においては、本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞集団を含む、神経系疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する製品を提供する。幾つかの実施の形態においては、製品は追加の活性成分を更に含み、追加の活性成分は上記に定義される通りである。幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。幾つかの実施の形態においては、製品は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤である。或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤である。

皮膚疾患
一態様においては、本発明は、皮膚疾患を予防及び／又は治療する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、皮膚疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

皮膚は人体において最大の表面積を有する器官である。皮膚は、機械的損傷、微生物感染、紫外線、及び極端な温度の影響から内部組織を保護するに当たっての重要な構造物である。

皮膚系疾患としては、ウイルス性皮膚疾患、細菌性皮膚疾患、真菌性皮膚疾患、動物性皮膚疾患、物理的皮膚疾患、皮膚炎、湿疹、薬物発疹、蕁麻疹性皮膚疾患、掻痒性皮膚疾患、紅斑性鱗屑性皮膚疾患、結合組織疾患、水疱性皮膚疾患、血管炎性皮膚疾患、皮膚付属器疾患、色素性障害皮膚疾患（pigmentary disorder skin disease）、遺伝性皮膚疾患、皮膚腫瘍、性感染症が挙げられる。

鱗屑性皮膚疾患は、乾癬、類乾癬、多形紅斑、環状紅斑、単純性粃糠疹、バラ色粃糠疹、連圏状粃糠疹、石綿状粃糠疹、扁平苔癬、光沢苔癬、念珠状紅色苔癬、硬化性萎縮性苔癬、線状苔癬、剥脱性皮膚炎、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

乾癬は、紅斑性鱗屑性皮膚疾患の一種である。

皮膚炎は皮膚炎症性疾患である。

皮膚炎は、殆どが首の後ろ又はその両側、肘窩、膝窩、前腕、大腿部、ふくらはぎ、及び腰仙部等において発生し、しばしば薄板、三角形又は多角形の平らな上部の丘疹、肥厚した皮膚、隆起した皮膚の隆線、深くなった皮膚の溝、苔状の形状、しばしば帯赤褐色又は淡褐色で現れる明らかな皮膚病変を有する。皮膚炎は、皮膚が剥がれ、薄片状に剥がれ、肥厚化し、変色し、触れると痒くなる現象を特徴とする。皮膚炎は以下を含む。

神経皮膚炎：若年及び中年の人により一般的であり、最初に重度の痒みがあり、次に皮膚病変を伴い、その発疹は平らな丘疹であり、苔癬様で滲出液を伴わず、その発疹は、首、四肢の伸筋側、腰仙部、膝窩、及び外陰部においてより一般的であり、その経過は慢性的であり、しばしば再発する。

アトピー性皮膚炎：最初の病変は主に頬上である。最初の病変は散在した又は集まった小さな赤い丘疹又は紅斑であり、これらが徐々に増加し、小さな水膨れ、黄色から白色の鱗屑性の痂皮が見られ、滲出、びらん及び二次感染が見られる場合がある。激しい痒みがある。慢性症状は、乾燥したより大きな隆起した帯褐色の赤い丘疹、そして粗大な鱗屑性の淡褐色の苔癬様の変化であり、これらが融合して破片となる場合がある。掻いた後に、しばしば少しの滲出、落屑、及び掻き傷が見られる。

夏の皮膚炎：最初は、皮膚病変は小さな点のサイズの紅斑及び丘疹であるが、痒みにより掻いた後に、掻き傷、血痂、皮膚肥厚、及び色素沈着過剰が現れる場合があり、びらん及び滲出は見られず、成人の四肢の伸筋（extensor limbs）に発生する傾向がある。気温が下がるとその状態は明らかに改善し、自然に治癒する場合があり、その状態と気候との間に明らかな関係性がある。

脂漏性皮膚炎：その発疹は、毛包開口部の周りの小さな赤い丘疹として始まり、徐々に発達し、融合して脂ぎった鱗屑又は痂皮で覆われた黄色から赤色の斑点となる。病変の位置が異なるため、臨床症状は僅かに異なる。

乳児脂漏性皮膚炎は通常、生後１ヶ月～３ヶ月で発生する。前頭頂部又は頭皮全体が様々な厚さの脂ぎった帯灰色から黄色又は帯黄色から褐色の痂皮で覆われる場合があり、これには、眉毛領域、法令線、耳の後ろ等が含まれる場合があり、僅かな痒みを伴う。乳児脂漏性皮膚炎は通常３週間～４週間以内に癒える。癒えずに継続すると、感染症又はアトピー性皮膚炎を合併することが多い。

日光皮膚炎：日光によって誘発される遅発性の光アレルギー性皮膚疾患である。臨床症状は、紅斑、丘疹、水膨れ、びらん、鱗屑、及び苔癬化を伴う多形発疹であり、或る特定の発疹が占めていることが多い。

カンジダ皮膚炎は、殆どが鼠径部、肛門周囲の臀裂、腋窩、女性の胸の下の皮膚等の皮膚のひだにおいて発生し、亀頭包皮、大陰唇及び小陰唇、爪溝、並びに口角にも発生する場合がある。その発疹は主に局所的な皮膚の紅潮であり、軽く腫れ、表面のびらん及び臭いのある分泌物を伴う。時にはそれが乾燥して落屑する場合もある。小児カンジダ皮膚炎はまた、しばしば体幹及び首の皮膚にも影響し、帯赤色の汗疹のように見える広範囲で密な赤い斑状丘疹状発疹を示す。カンジダ皮膚炎は口腔又は外陰部の粘膜を襲う場合もあり、しばしば偽膜性であるチーズのような分泌物を伴う。

蚊刺咬性皮膚炎：蚊刺咬性皮膚炎は、昆虫による刺咬、昆虫の毒液又は粉状毛との接触によって引き起こされる皮膚炎である。一般的な害虫は、ノミ、シラミ、ユスリカ、棘芋虫、蛾、蚊、トコジラミ、ミツバチ等である。紅斑、丘疹、及び膨疹等の症状が現れる場合がある。重度の症例においては、水膨れ又は水疱が現れる場合があり、刺された部位に点状出血又は水膨れが見られる場合がある。

ホルモン依存性皮膚炎は、局所ホルモンを長期間にわたって繰り返し不適切に使用することによって引き起こされる皮膚炎である。同じ部位で高効率コルチコステロイドを、３週間を超えて局所使用した後に、紅斑、丘疹、乾性落屑、萎縮、線状皮膚萎縮症、毛細血管拡張症、紫斑病、挫創、異常色素沈着、酒さ様皮膚炎、口囲皮膚炎、光線過敏症、毛の生えた認識不可能な白癬、魚鱗癬様変化、及び他の二次症状が皮膚に現れる場合があり、局所的な明らかな自覚掻痒、又は灼熱感が起こる場合がある。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、担体又は賦形剤を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、担体は、ゼラチン、キトサン、アルギン酸ナトリウム、コラーゲン、シルクタンパク質、セルロース、フィブリン、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）、ケイ酸塩、シリコーンゴム、細胞外マトリックス、脱細胞化足場、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、担体は、ゼラチン、コラーゲン、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、第２の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、エバスチン錠、ロラタジン錠、セチリジン錠、フロ酸モメタゾン軟膏、ハロメタゾン軟膏、ムピロシン軟膏、フシジン酸軟膏、セフィキシム錠、ロキシスロマイシン錠、ナフチフィンケトコナゾール軟膏、セルタコナゾール軟膏、イトラコナゾール錠、テルビナフィン錠、アシクロビル錠、バラシクロビル錠、ペンシクロビル軟膏、インターフェロンゲル、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、単位剤形で存在し、該医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上（例えば、１×１０^４個以上、３×１０^４個以上、５×１０^４個以上、７×１０^４個以上、１×１０^５個以上、３×１０^５個以上、５×１０^５個以上、７×１０^５個以上、１×１０^６個以上、３×１０^６個以上、５×１０^６個以上、７×１０^６個以上、１×１０^７個以上、３×１０^７個以上、５×１０^７個以上、７×１０^７個以上、１×１０^８個以上、３×１０^８個以上、５×１０^８個以上、７×１０^８個以上、１×１０^９個以上、３×１０^９個以上、５×１０^９個以上、７×１０^９個以上、１×１０^１０個以上、３×１０^１０個以上、５×１０^１０個以上、又は７×１０^１０個以上、好ましくは１×１０^６個、３×１０^６個、５×１０^６個、より好ましくは３×１０^６個）の量で含有する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞の投与する投与量は、１×１０^４個以上／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上／ｍｌ、３×１０^４個以上／ｍｌ、５×１０^４個以上／ｍｌ、７×１０^４個以上／ｍｌ、１×１０^５個以上／ｍｌ、３×１０^５個以上／ｍｌ、５×１０^５個以上／ｍｌ、７×１０^５個以上／ｍｌ、１×１０^６個以上／ｍｌ、３×１０^６個以上／ｍｌ、５×１０^６個以上／ｍｌ、７×１０^６個以上／ｍｌ、１×１０^７個以上／ｍｌ、３×１０^７個以上／ｍｌ、５×１０^７個以上／ｍｌ、７×１０^７個以上／ｍｌ、１×１０^８個以上／ｍｌ、３×１０^８個以上／ｍｌ、５×１０^８個以上／ｍｌ、７×１０^８個以上／ｍｌ、１×１０^９個以上／ｍｌ、３×１０^９個以上／ｍｌ、５×１０^９個以上／ｍｌ、７×１０^９個以上／ｍｌ、１×１０^１０個以上／ｍｌ、３×１０^１０個以上／ｍｌ、５×１０^１０個以上／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上／ｍｌ、好ましくは１×１０^６個／ｍｌ、３×１０^６個／ｍｌ、５×１０^６個／ｍｌ、より好ましくは３×１０^６個／ｍｌ）である。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞の投与経路は、注射投与、塗抹投与、接着投与、浣腸投与、灌流投与、直腸投与、及び経口投与からなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、上記方法は、それを必要とする被験体に、先に記載又は定義された第２の活性成分を投与することを更に含む。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

別の態様においては、本発明は、第１の活性成分として間葉系幹細胞集団を含む、皮膚疾患を治療する製品を提供する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、皮膚疾患は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、製品は、第２の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、先に定義又は記載される通りである。

或る特定の実施の形態においては、第１の活性成分及び第２の活性成分は、単独で又は組合せにおいて存在する。

或る特定の実施の形態においては、第１の活性成分は、先に記載されたものから選択される第２の活性成分との組合せにおいて投与される。

或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤であり、好ましくは、インプラント剤は、微小環境を改善し、免疫拒絶反応を抑制するのに使用される。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

アトピー性皮膚炎（ＡＤ）
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、慢性、再発性、掻痒性、及び炎症性の皮膚疾患である。ＡＤは重大な公衆衛生問題になっており、有病率は小児で最大２０％、成人で３％～１０％である。ＡＤの病因は複雑であり、遺伝学、免疫、及び環境等の多くの要因が関与しており、中でも異常な免疫機能、特に免疫細胞の免疫応答効果がＡＤの発症に重要な役割を担っている。

現在、ＡＤの治療には通常、グルココルチコイド及び免疫抑制剤の局所的使用及び／又は全身的使用が必要とされるが、グルココルチコイドの局所的使用は中等度から重度のＡＤ患者においては限られた効果しか示さず、一方で、免疫調剤の全身的使用は、骨髄抑制及び感染機会の増加等のリスクを伴い、抗インターロイキン（ＩＬ）－４Ｒモノクローナル抗体のデュピルマブ及び抗免疫グロブリンＩｇＥモノクローナル抗体のオマリズマブ等の新しい生物剤は、限定的な研究結果及び大きな相違を示すため、ＡＤを治療する新しく安全で効果的な方法を開発する必要がある。

一態様においては、本発明は、被験体におけるアトピー性皮膚炎を予防及び／又は治療するための、又は被験体におけるアトピー性皮膚炎を予防する、若しくはアトピー性皮膚炎を遅延若しくは軽減する、若しくはアトピー性皮膚炎を予防及び緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。

本発明は、Ｍ細胞を用いたアトピー性皮膚炎の治療を提供する。Ｍ細胞治療は、マウスの皮膚の微小環境を改善し、炎症を抑制することができる。皮膚付属器がＯＶＡ群よりも多いことから、Ｍ細胞が皮膚付属器を保護することができ、アトピー性皮膚炎に対して非常に優れた治療効果が達成されることを示している。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、紅斑性発疹を緩和し、アトピー性皮膚炎の表現型を軽減し、ＡＤ様病変を軽減し、脂肪層の厚さを低減し、及び／又は角質層の厚さを低減することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、掻痒の程度を低減し、皮膚の付属器を保護し、肥満細胞の増殖を減少させ、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞の不均衡を媒介し、ＣＤ１９陽性細胞のＩｇＥ発現の強度を低減し、アレルギー性疾患を改善し、及び／又は炎症反応を抑制することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の実施の形態においては、投与は、皮下注射又は皮下スポット注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物はまた、生物学的抗体（例えば、限定されるものではないが、デュピルマブ、オマリズマブ）を含む。

火傷又は熱傷
火傷：火傷は一般に、主に皮膚及び／又は粘膜に関係する、高温の液体（水、スープ、油等）、蒸気、高温ガス、炎、高温の金属の液体又は固体（例えば、溶融鋼、鋼のインゴット）等を含む熱によって引き起こされる組織損傷を指し、重度の症例では、筋肉、骨、関節、及び更には臓器等の皮下組織及び／又は粘膜下組織が損傷される場合もある。熱傷は、高温の液体、蒸気等によって引き起こされる組織損傷であり、熱損傷の一種である。

熱傷：熱傷は、炎のない高温の液体（沸騰したお湯、熱した油、溶鋼）、高温の固体（加熱された金属等）、又は高温の蒸気によって引き起こされる組織損傷である。低熱熱傷（low-heat scalds）は一般的であり、低熱熱傷は低温熱傷としても知られており、これは、体温よりも高い低熱物体に皮膚を長時間曝すことによって引き起こされる熱傷である。

火傷はしばしば大規模な皮膚損傷を引き起こすため、皮膚バリア機能の喪失及び内部環境バランスの乱れをもたらし、創傷治癒には長い時間がかかる。臨床治療にはしばしば大面積の皮膚移植が必要となるが、火傷患者の皮膚は限られており、皮膚摘出の間に二次的な損傷があり、創傷感染症は、困難な創傷治癒及び敗血症性ショック、感染した壊死性創傷の進行性の深化等の様々な合併症を引き起こす可能性があり、創傷治癒後の瘢痕治癒により拘縮変形が引き起こされ、こうして見苦しい外観及び機能障害がもたらされる可能性がある。患者の予後は悪く、機能回復が悪く、その後のリハビリ治療は患者の心理的負担及び経済的負担を高める。したがって、創傷治癒をより素早く促進し、皮膚の外観及び機能をより良く回復することができる方法を見出すことが、火傷の分野において解決されるべき課題となっている。

これまで、皮膚損傷は皮膚の自家移植又は人工皮膚の移植によって治療されてきたが、大面積の火傷及び熱傷においては依然として不十分である。間葉系幹細胞の出現及び材料との併用治療により、皮膚損傷への幾らかの希望がもたらされた。

一態様においては、本発明は、被験体における火傷若しくは熱傷の予防及び／又は治療のための、又は被験体における火傷若しくは熱傷を予防及び／又は治療する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物を使用して、皮膚損傷後の機能回復がないこと、限られた皮膚移植源、限られた自家皮膚等の課題を解決することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、付属器を再生し、創傷治癒を加速させ、皮膚損傷後の線維症等を減少させ、それにより皮膚機能を回復し、創傷面積を減少させ、皮膚損傷を治療し、そして皮膚を保護することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、熱傷後の創傷部位での炎症を軽減し、それにより炎症を抑制することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、皮膚創傷における血管再生を促進することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、毛包再生を促進し、β－カテニン、ＣＤ１３３、Ｋｉ６７等の因子を上方調節することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、コラーゲン沈着を低減し、それにより皮膚損傷を治療することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の実施の形態においては、本発明の培養上清、又は培養上清を含む医薬組成物は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの好ましい実施の形態においては、医薬組成物は、局所適用、表面移植若しくは表面注射、又は表面スプレーによって投与される。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

難治性皮膚損傷
難治性皮膚損傷は、繰り返しの皮膚潰瘍形成、部分的な皮膚機能の喪失、並びに瘢痕及び他の皮膚過形成組織の容易な生成によって現れる、様々な疾患又は損傷によって引き起こされる皮膚損傷の現象である。難治性皮膚損傷の一般的な原因としては、火傷、糖尿病（糖尿病足につながる）、エリテマトーデス、及び乾癬が挙げられる。

糖尿病足：糖尿病足疾患の主な症状は下肢疼痛及び皮膚潰瘍である。糖尿病足潰瘍及び壊疽は、臨床的な非外傷性切断の主な原因であり、糖尿病患者の作業能力及び生活の質も深刻に危うくする。糖尿病足は通常、下肢神経障害、血管疾患、及び感染症の組合せの結果である。

糖尿病性合併症
１．糖尿病性腎症
糖尿病性腎症は、糖尿病患者にとって最も重要な併存症の１つである。中国においても糖尿病性腎症の発生率が上昇しており、様々な糸球体腎炎に次ぐ２番目の末期腎疾患の原因となっている。その複雑な代謝障害のために、糖尿病性腎症が末期腎疾患に進行すると、しばしば他の腎臓疾患よりも治療が困難である。しかしながら、積極的かつ適切な介入措置は、特に疾患経過の初期段階において糖尿病性腎症の発生を大幅に減らし、遅延させることができる。

２．糖尿病性眼合併症
（１）糖尿病性網膜症は、糖尿病性細小血管障害の最も重要な症状であり、特定の変化を伴う眼底疾患であり、糖尿病の重篤な合併症の１つである。臨床的には、網膜血管新生の有無に応じて、網膜血管新生を伴わない糖尿病性網膜症を非増殖性糖尿病性網膜症（又は単純型若しくは背景型）と呼び、網膜血管新生を伴う糖尿病性網膜症を増殖性糖尿病性網膜症と呼ぶ。

（２）糖尿病関連ブドウ膜炎は、一般的に大まかに以下の４つの状態を含む：（ｉ）糖尿病自体に関連するブドウ膜炎、（ｉｉ）糖尿病患者における内因性感染性眼内炎の可能性が正常な人よりも大幅に高い感染性ブドウ膜炎、（ｉｉｉ）幾つかの特定の型を伴い、その２つが偶然の一致である又は固有の関連があるブドウ膜炎、（ｉｖ）眼内手術後の感染性眼内炎又は無菌性眼内炎。糖尿病関連ブドウ膜炎は主に糖尿病を伴う中年及び高齢の患者に発生する。

（３）糖尿病性白内障は、血糖値が十分に制御されない若年性糖尿病患者において発生する。糖尿病性白内障は殆ど、両眼に発生し、急速に発展し、数日、数週間、又は数ヶ月以内に完全な混濁に発展することさえある。

３．糖尿病足
足は、多系統疾患である糖尿病の複雑な標的器官である。糖尿病患者における末梢神経障害及び末梢血管疾患の組合せのため、過度の機械的圧力が足の軟組織及び骨関節系の破壊及び変形を引き起こした後に、軽度の神経学的症状から重度の潰瘍、感染症、血管疾患、シャルコー関節症、及び神経因性骨折（neuropathic fractures）にまで及ぶ一連の足の問題をもたらす可能性がある。実際、同様の病理学的変化が上肢、顔、及び体幹にも発生する場合があるが、糖尿病足の発生率は他の部分よりも大幅に高い。

４．糖尿病性心血管合併症
糖尿病性心血管合併症としては、心臓及び大血管における微小血管疾患、心筋症、心自律神経障害が挙げられ、これは糖尿病患者における主な死因である。冠状動脈性心臓疾患は、糖尿病の主な大血管合併症である。研究によれば、糖尿病患者における冠状動脈性心臓疾患による死亡のリスクは、非糖尿病患者よりも３倍～５倍高いことが示されている。病理学的メカニズムはアテローム性動脈硬化症であり、高血糖、高収縮期血圧、高コレステロール、低密度リポタンパク質の増加、高密度リポタンパク質の減少、年齢、性別、喫煙、及び家族歴は全てその発症にとっての危険因子である。

５．糖尿病性脳血管疾患
糖尿病性脳血管疾患とは、糖尿病によって引き起こされる頭蓋内の大血管及び微小血管の病変を指す。統計によれば、２型糖尿病を伴う患者の２０％～４０％は主に脳動脈硬化症、虚血性脳血管疾患、脳出血、脳萎縮等として現れる脳血管疾患を発症することとなるため、それが糖尿病を伴う患者における主な死因の１つである。

６．糖尿病性神経障害
糖尿病性神経障害の最も一般的な種類は、慢性遠位性対称性感覚運動多発性神経障害、つまり糖尿病性末梢神経障害であり、これは高い発生率を有する。一部の患者は、新たに糖尿病と診断されたときに既に末梢神経障害を患っている。残念ながら、特に糖尿病性神経障害の根治的な治癒における治療に関して、根治的な治癒は非常に困難であるため、その発生を防ぎ、その発症を制御することに焦点が当てられている。

難治性皮膚損傷は疾患ではなく、様々な疾患又は損傷によって引き起こされる皮膚損傷の現象であり、これは、容易な繰り返しの皮膚潰瘍形成、部分的な皮膚機能の喪失、瘢痕及び他の皮膚過形成組織の容易な生成によって現れる。難治性皮膚損傷に導く一般的な要因としては、火傷及び熱傷、糖尿病、エリテマトーデス、及び乾癬が挙げられる。現在、これらの問題に対する汎用的な解決手段は存在しない。それというのも、そのような損傷はしばしば複雑な免疫障害及び組織再生障害を伴い、単一の治療計画であらゆる問題を解決することはできないからである。

一態様においては、本発明は、被験体における難治性皮膚損傷を予防及び／又は治療するための、又は被験体における難治性皮膚損傷を予防する、若しくは強皮症を遅延若しくは緩和若しくは予防する、若しくは難治性皮膚損傷の症状を緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。場合によっては、難治性皮膚損傷はこれらの要因（例えば、限定されるものではないが、火傷及び熱傷、糖尿病、エリテマトーデス、乾癬等）に起因する。

或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、皮下注射によって実施され得る。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、難治性皮膚損傷の治療の間に、創傷の治癒速度を加速させ、創傷面積を減少させ、皮膚創傷における血管再生を促進し、損傷後に皮膚を再生させることができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、難治性皮膚損傷の治療の間に、ＣＤ３、Ｆ４／８０、ＭＰＯの遺伝子又はタンパク質の発現を減少させ、炎症を抑制することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、難治性皮膚損傷の治療の間に、β－カテニン、ＣＤ１３３、Ｋｉ６７、ＣＤ３１の遺伝子又はタンパク質の発現を増加させることができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、毛包再生を促進することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、糖尿病性腎症における炎症誘発性因子のＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＴＮＦαの発現を減少させ、メサンギウム肥厚及びマクロファージ浸潤を減少させ、糖尿病誘発性糸球体症を軽減し、ラットにおける腎臓重量、腎臓、及びボディマス指数を増加させることができるため、これは糖尿病性腎症に対して良好な治療効果を有し得る。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、糖尿病足の治癒を加速させ、皮膚創傷の炎症を軽減し、血管及び毛包の再生を促進し、コラーゲンの沈着を低減させ、糖尿病足における線維症の発生を抑制することができるため、これは皮膚損傷を効果的に治療することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、糖尿病性眼合併症における血糖を低下させ、炎症反応を調節し、空腹時血糖及びＨｂＡ１ｃレベルを大幅に低下させ、視覚機能及び黄斑浮腫を或る程度改善することができるため、これは糖尿病性眼合併症を十分に治療することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、糖尿病を合併する血管石灰化における血管石灰化を抑制することができるため、これは合併症における血管石灰化疾患に対して良好な治療効果を有する。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、糖尿病性神経障害における酸化ストレスに抵抗する星状細胞の能力を増強し、脳内グルタミン酸を除去し、脳内Ｋ^＋バランスを維持するそれらの能力を増強し、それによりニューロン機能、脳恒常性、及びシナプス形成を促進し、糖尿病によって引き起こされる認知障害を改善することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、皮下注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

乾癬
乾癬は、難治性かつ再発性の特徴を有する一般的な慢性炎症性皮膚疾患である。乾癬は、その病因は未知であるが、現在、遺伝的要因、環境的要因、及びその他の要因の相互作用によって引き起こされる疾患であると考えられている。

臨床的には、尋常性、膿疱性、関節性、及び紅皮性の４つの一般的な型に分けられる。その皮膚病変は、最初に紅斑性丘疹、その表面上に銀白色の鱗屑の層による被覆、乾燥皮膚、落屑、及び痂皮を特徴とし、地図のように幾つかの皮膚症状がつなぎ合わさり、掻痒、膿及び水、そして見るに耐えない血痕を伴う場合もある。

尋常性乾癬は、皮膚炎によって引き起こされた緑豆のサイズを有する赤い丘疹が次にゆっくりと成長して銀白色の乾燥した鱗屑を形成するため、非常に明白である。重度の症例では、大きな白い鱗屑が身体を覆い、特に見た目が恐ろしい。尋常性乾癬は出血を伴うこともあるが、これを受け入れることはできない。

膿疱型：様々なサイズの非常に密度の高い水膿疱が見られる。疾患の悪化に伴い、膿疱は成長し続け、最終的に紅斑を形成する。この症状は緊急事態であり、突然発生する。この型の乾癬を伴う人は発熱を有し、関節の痛み及び腫れを覚える。

紅皮性乾癬：全身のびまん性の紅潮、浸潤、及び腫れとして現れ、ふすまのような鱗屑を多数伴い、その間にフレーク状の正常な皮膚が存在し、発熱、表在性リンパ節腫脹等の全身症状を伴うこともある。この疾患の過程は長く、再燃しやすい。

関節炎乾癬：皮膚病変に加えて、関節病変が発生する場合があり、肘、大膝関節、小指及びつま先の関節、脊椎及び仙腸関節を含むあらゆる関節が冒される可能性がある。関節炎乾癬は、関節の腫れ及び痛み、動きの制限、重度の症例では関節変形、並びに進行性の発達として現れる場合があるが、リウマチ因子検査は陰性であることが多い。

乾癬（一般に疥癬として知られる）は既知の皮膚疾患である。乾癬が発生すると、皮膚に赤い丘疹又はプラークが見られる場合があり、これは銀白色の鱗屑の複数の層で覆われている。乾癬は四肢、頭及び背中、更には全身に発生する傾向があり、ほぼ一生続く場合もある。現在、効果的な治療は存在しない。この疾患は主に若年及び中年の人がかかり、患者の身体の健康及び精神状態に大きな影響を与え、社会及び経済に大きな負担を引き起こしている。疫学調査によれば、中国には現在約６５０万人の乾癬患者がいることが示されており、発生率は０．４７％である。

現在、乾癬は、樹状細胞（ＤＣ）及びＴリンパ球の優位性、自然免疫及び獲得免疫の関与、並びに遺伝的背景及び環境要因の相互作用によって引き起こされる自己免疫性皮膚疾患であると考えられている。乾癬の特徴的な病変としては、炎症状態によって引き起こされるケラチノサイトの過剰な増殖等が挙げられる。乾癬の病因における主要なサイトカイン（ＴＦＮ－α、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１７）を標的とする拮抗的生物剤は、臨床治療において極めて効果的であるものの、長期治療を維持するための高いコスト、そして潜在的な深刻な有害反応が、そのような生物剤の幅広い適用を制限している。

一態様においては、本発明は、被験体における乾癬を予防及び／又は治療するための、又は被験体における乾癬を予防する、若しくは乾癬を遅延若しくは緩和する、若しくは乾癬を予防及び緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、紅斑性発疹を緩和し、鱗屑を緩和し、浸潤を緩和し、乾癬性皮膚炎の表現型を軽減し、乾癬性病変を軽減し、表皮の有棘層を減少させ、又は角質層の厚さを低減することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、ＲＯＳレベルを低下させ、脾臓好中球細胞及び樹状細胞の動員を低下させ、炎症性浸潤細胞を低下させ、及び／又は免疫機能を調節することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、背部注射又は静脈内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

自己免疫疾患
免疫系疾患とは、免疫系の損傷によって引き起こされる病理学的反応を指す。免疫系疾患としては、主に、感染性疾患、過敏性疾患、自己免疫疾患、免疫増殖性疾患、免疫不全疾患、及び免疫関連疾患が挙げられる。本明細書において使用される場合に、「自己免疫疾患」という用語は、免疫系の機能不全により身体が自身の組織を攻撃する疾患を指す。一般的な自己免疫疾患は、しばしば多数の系及び器官（例えば、皮膚、骨、筋肉、内臓等）に関係し、こうして全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、関節リウマチ、乾癬、紅皮症、糸球体腎炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、強皮症、原発性全身性アミロイドーシス、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性胃炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑、橋本甲状腺炎、円形脱毛症、湿疹、１型糖尿病を含む全身性自己免疫疾患を形成する。

一態様においては、本発明は、自己免疫疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、自己免疫疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、自己免疫疾患は、強皮症、エリテマトーデス（例えば、全身性エリテマトーデス）、乾癬、関節リウマチ、皮膚筋炎、多発性硬化症、重症筋無力症、多発性筋炎、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ））、シェーグレン症候群、血管炎（例えば、全身性血管炎）、成人スティル病、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分を含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、抗炎症薬又は免疫抑制剤からなる群から選択される。或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ジクロフェナク、ナプロキセン、インドメタシン、ピロキシカム、メロキシカム、ナブメトン、又はニメスリド）、ステロイド性抗炎症薬（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、又はヒドロコルチゾン）、炎症誘発性サイトカインの抗体若しくはアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、又はＰＡＦの抗体又は受容体アンタゴニスト）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、又はＴＧＦβ）、抗増殖薬／代謝拮抗薬（例えば、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上の細胞（例えば、１×１０^４個以上の細胞、３×１０^４個以上の細胞、５×１０^４個以上の細胞、７×１０^４個以上の細胞、１×１０^５個以上の細胞、３×１０^５個以上の細胞、５×１０^５個以上の細胞、７×１０^５個以上の細胞、１×１０^６個以上の細胞、３×１０^６個以上の細胞、５×１０^６個以上の細胞、７×１０^６個以上の細胞、１×１０^７個以上の細胞、３×１０^７個以上の細胞、５×１０^７個以上の細胞、７×１０^７個以上の細胞、１×１０^８個以上の細胞、３×１０^８個以上の細胞、５×１０^８個以上の細胞、７×１０^８個以上の細胞、１×１０^９個以上の細胞、３×１０^９個以上の細胞、５×１０^９個以上の細胞、７×１０^９個以上の細胞、１×１０^１０個以上の細胞、３×１０^１０個以上の細胞、５×１０^１０個以上の細胞、又は７×１０^１０個以上の細胞）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^５個～１×１０^８個の細胞（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個の細胞、１×１０^６個～１×１０^７個の細胞、又は１×１０^６個～５×１０^６個の細胞）の量で含有する。

別の態様においては、本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞集団を含む、自己免疫疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する製品を提供する。或る特定の実施の形態においては、製品は上記に定義される追加の活性成分を更に含む。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。或る特定の実施の形態においては、製品は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤である。或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤である。

エリテマトーデス
エリテマトーデスは、１５歳～４０歳の女性により一般的である典型的な自己免疫性結合組織疾患である。エリテマトーデスは、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）、亜急性皮膚型エリテマトーデス（ＳＣＬＥ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、深在性エリテマトーデス（ＬＥＰ）、新生児エリテマトーデス（ＮＬＥ）、及び薬物誘発性エリテマトーデス（ＤＩＬ）等の幾つかのサブタイプに分けることができるスペクトラム疾患である。「全身性エリテマトーデス」という用語は、発症が遅く、発症が潜行性であり、かつ臨床症状が多種多様である、細胞性免疫機能不全及び体液性免疫機能不全のために多数の自己抗体が生成される多くの系及び器官に関係する自己免疫疾患を指す。全身性エリテマトーデスは、皮膚、漿膜、関節、腎臓、及び中枢神経系を冒す可能性があり、自己免疫を特徴としている。患者には様々な自己抗体があり、これは体液性免疫だけでなく細胞性免疫にも影響を及ぼし、補体系も変化する。

一態様においては、本発明は、エリテマトーデス（例えば、全身性エリテマトーデス）を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、エリテマトーデス（例えば、全身性エリテマトーデス）を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、抗二本鎖ＤＮＡ抗体を減少させることにより全身性の病因的過程を遅らせることができる。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、脾臓及び項リンパ節の拡大を回避又は予防又は抑制することによりエリテマトーデスの病因的過程を遅らせることができる。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、糸球体の形成を促進することができる。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、炎症誘発性因子を阻害することができる。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、脾臓におけるＴ細胞集団（例えば、ＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞）の数を減少させることができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分を含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、抗炎症薬又は免疫抑制剤からなる群から選択される。或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ジクロフェナク、ナプロキセン、インドメタシン、ピロキシカム、メロキシカム、ナブメトン、又はニメスリド）、ステロイド性抗炎症薬（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、又はヒドロコルチゾン）、炎症誘発性サイトカインの抗体若しくはアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、又はＰＡＦの抗体又は受容体アンタゴニスト）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、又はＴＧＦβ）、抗増殖薬／代謝拮抗薬（例えば、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上の細胞（例えば、１×１０^４個以上の細胞、３×１０^４個以上の細胞、５×１０^４個以上の細胞、７×１０^４個以上の細胞、１×１０^５個以上の細胞、３×１０^５個以上の細胞、５×１０^５個以上の細胞、７×１０^５個以上の細胞、１×１０^６個以上の細胞、３×１０^６個以上の細胞、５×１０^６個以上の細胞、７×１０^６個以上の細胞、１×１０^７個以上の細胞、３×１０^７個以上の細胞、５×１０^７個以上の細胞、７×１０^７個以上の細胞、１×１０^８個以上の細胞、３×１０^８個以上の細胞、５×１０^８個以上の細胞、７×１０^８個以上の細胞、１×１０^９個以上の細胞、３×１０^９個以上の細胞、５×１０^９個以上の細胞、７×１０^９個以上の細胞、１×１０^１０個以上の細胞、３×１０^１０個以上の細胞、５×１０^１０個以上の細胞、又は７×１０^１０個以上の細胞）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個～１×１０^１０個の細胞（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個の細胞、１×１０^６個～１×１０^７個の細胞、又は１×１０^６個～５×１０^６個の細胞）の量で含有する。

強皮症
皮膚は人体において最大の表面積を有する器官である。皮膚は、機械的損傷、微生物感染、紫外線、及び極端な温度から内部組織を保護するに当たっての重要な構造物である。皮膚系疾患としては、ウイルス性皮膚疾患、細菌性皮膚疾患、真菌性皮膚疾患、動物性皮膚疾患、物理的皮膚疾患、皮膚炎、湿疹、薬物発疹、蕁麻疹性皮膚疾患、掻痒性皮膚疾患、紅斑性鱗屑性皮膚疾患、結合組織疾患、水疱性皮膚疾患、血管炎性皮膚疾患、皮膚付属器疾患、皮膚色素障害、遺伝性皮膚疾患、皮膚腫瘍、性感染症が挙げられる。

強皮症は、皮膚結合組織疾患の一種である。強皮症又は全身性硬化症（ＳＳＣ）は、皮膚線維芽細胞による細胞外マトリックスにおける過剰なタンパク質の沈着を特徴とする、皮膚線維症としても知られる進行性の衰弱性自己免疫疾患である。典型的な皮膚病変は、腫れ、浸潤、及び萎縮の３つの段階を順次経過する。病変は対称的であり、病変は殆どが指から近位端まで広がり、心臓、肺、腎臓、及び消化管等の内臓の結合組織に関係する。

強皮症は、皮膚の肥厚化及び限局性線維症又はびまん性線維症を特徴とする、肺、腎臓、肝臓、心臓、及びその他の器官を冒す可能性がある自己免疫疾患である。その病因は未知である。現在の研究では、この疾患は主に小血管疾患、細胞外マトリックスの過剰な蓄積によって引き起こされる線維症、及び免疫異常の３つの側面を含むことが分かっている。炎症性細胞浸潤は、強皮症の初期段階における主な特色であり、主にＴリンパ球浸潤である。研究によれば、Ｔリンパ球は様々なサイトカインを放出し、炎症及び血管病変を引き起こし、線維芽細胞を活性化し、コラーゲン線維の合成を促進し得ることが示されている。現在、強皮症には免疫抑制剤及び対症治療が主に使用されるが、治療効果は理想的ではなく、副作用が多く見られるため、より効果的な治療法を見出す必要がある。

一態様においては、本発明は、強皮症を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、強皮症を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、真皮を大幅に菲薄化し、強皮症におけるコラーゲン線維の蓄積を減少させることができる。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、強皮症における皮膚硬化及び肥厚化の発生を減少させることができ、強皮症に対して効果的な治療効果を有する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、毛包の数を増加させ、強皮症における真皮の厚さを減少させることができる。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、強皮症において脂肪層が大幅に菲薄化するのを防ぎ、皮膚付属器の減少を防ぐことができる。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、炎症因子（例えば、ＩＬ－１７、ＩＬ－６、ＴＮＦ）を阻害し、炎症因子の発現レベルを抑制し、及び／又は抗炎症因子の発現レベル（例えば、ＩＬ１０）を増加させ、ＭＭＰ１タンパク質の発現レベルを増加させ、強皮症における平滑筋アクチン（ａ－ＳＭＡ）の発現を減少させ又は抑制することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、皮下注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分を含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、抗炎症薬又は免疫抑制剤からなる群から選択される。或る特定の実施の形態においては、追加の活性成分は、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ジクロフェナク、ナプロキセン、インドメタシン、ピロキシカム、メロキシカム、ナブメトン、又はニメスリド）、ステロイド性抗炎症薬（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、又はヒドロコルチゾン）、炎症誘発性サイトカインの抗体若しくはアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、又はＰＡＦの抗体又は受容体アンタゴニスト）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、又はＴＧＦβ）、抗増殖薬／代謝拮抗薬（例えば、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^５個以上の細胞（例えば、１×１０^５個以上の細胞、５×１０^５個以上の細胞、１×１０^６個以上の細胞、２×１０^６個以上の細胞、３×１０^６個以上の細胞、４×１０^６個以上の細胞、５×１０^６個以上の細胞、６×１０^６個以上の細胞、７×１０^６個以上の細胞、８×１０^６個以上の細胞、９×１０^６個以上の細胞、１×１０^７個以上の細胞、３×１０^７個以上の細胞、５×１０^７個以上の細胞、７×１０^７個以上の細胞、１×１０^８個以上の細胞、３×１０^８個以上の細胞、５×１０^８個以上の細胞、７×１０^８個以上の細胞）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^５個～１×１０^８個の細胞（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個の細胞、１×１０^６個～１×１０^７個の細胞、又は１×１０^６個～５×１０^６個の細胞）の量で含有する。

呼吸器疾患
一態様においては、本発明は、呼吸器疾患を予防及び／又は治療する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、呼吸器疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

呼吸器系は、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、並びに多数の肺胞、血管、リンパ管、神経、及び胸膜から構成される肺等の組織を含む、人体と外気との間のガス交換に関連する一連の器官の総称である。臨床的には、鼻、咽頭、及び喉頭はしばしば上気道と呼ばれ、気管の下のガス通路の一部（肺内の全てのレベルの気管支を含む）は下気道と呼ばれる。

肺疾患とは、肺自体の疾患又は全身性疾患の肺症状を指す。肺疾患としては、主に、感染性肺疾患、大気汚染及び喫煙関連肺疾患、職業関連肺疾患、免疫関連肺疾患、遺伝関連肺疾患、並びに原因不明の肺疾患が挙げられる。幾つかの実施の形態においては、肺疾患は、肺血管疾患、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫、塵肺症、及び肺炎からなる群から選択される。幾つかの実施の形態においては、肺血管疾患は、肺高血圧症、肺性心、肺塞栓症、肺血管炎、慢性閉塞性肺疾患、及び間質性肺疾患からなる群から選択される。幾つかの実施の形態においては、肺疾患は肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）である。

職業関連肺疾患：
職業関連肺疾患とは、或る特定の職業において有害な粉塵、煙霧、又は毒物を吸入することによって引き起こされた肺損傷によって引き起こされる、塵肺症等の肺疾患を指す。危険な粉塵としては、シリカ（すなわち、石英）、ケイ酸塩、石炭、鉄、及びスズが挙げられる。煙霧としては、二酸化硫黄、二酸化窒素、アンモニウム、塩酸、塩素、ホスゲン、並びにその他の有害ガス及び強酸の煙霧が挙げられる。毒性物質としては、ウラン、ニッケル、クロム酸塩、アスベスト、ジクロロメチルエーテル等が挙げられる。

塵肺症：
塵肺症は、主に、職業活動中の生産性粉塵（灰）の長期吸入及び肺内でのその保持によって誘発される肺組織のびまん性線維症（瘢痕）によって現れる全身性疾患である。塵肺症は、吸入した粉塵の種類に応じて、無機塵肺症と有機塵肺症とに分けられる。生産労働における無機粉塵の吸入によって引き起こされる塵肺症は、無機塵肺症と呼ばれる。殆どの塵肺症は無機塵肺症である。綿糸塵肺症及び農夫肺症等の有機粉塵の吸入によって引き起こされる塵肺症は、有機塵肺症と呼ばれる。

塵肺症は進行性の慢性疾患である。短期間に明らかな治療効果が認められ得る急性感染症又はその他の慢性疾患（例えば、結核、高血圧、糖尿病等）とは異なり、塵肺症は一般的に、より明白な治癒効果を得るのに数年間の長期治療を必要とする。

一態様においては、本発明は、塵肺症を予防及び／又は治療する、又は塵肺症を遅延若しくは軽減若しくは予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、塵肺症を予防及び／又は治療する、又は塵肺症を遅延若しくは軽減若しくは予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、本発明の医薬は、血清中の炎症因子レベルを低下させ、肺機能を改善し、肺密集域（lung compact area）を低減し、及び／又は線維症形成を減少させることができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

肺炎：
肺炎は、細菌性病原体、ウイルス性病原体、及び他の病原体によって引き起こされ得る、肺胞、遠位気道、及び肺間質の感染性炎症を指し、中でも細菌性肺炎及びウイルス性肺炎が最も一般的である。広義には、肺炎は、病原性微生物、物理化学的要因、免疫損傷、アレルギー、及び薬物によって引き起こされる場合がある。患者は、しばしば発熱、咳、及び呼吸困難等の典型的な症状を示す。

肺気腫：
肺気腫は、遠位終末細気管支の気道弾性が低下し、過膨張し、膨張し、そして肺気量が増加し、又は気道壁の破壊を伴う病理的状態である。その病因に応じて、肺気腫には、以下の種類：老年姓肺気腫、代償性肺気腫、間質性肺気腫、限局性肺気腫、傍中隔肺気腫、閉塞性肺気腫がある。

気管支炎：
気管支炎は、気管、気管支粘膜、及びその周辺組織の慢性的な非特異的炎症である。気管支炎の主な原因は、ウイルス及び細菌による繰り返しの感染による気管支の慢性的な非特異的炎症である。気管支炎としては、主に急性気管支炎及び慢性気管支炎が挙げられる。

慢性気管支炎：
慢性気管支炎は、気管、気管支粘膜、及びその周辺組織の慢性的な非特異的炎症である。主な症状は、咳、喀痰、又は喘鳴である。

慢性閉塞性肺疾患：
慢性閉塞性肺疾患は、気流閉塞を特徴とする慢性気管支炎及び／又は肺気腫であり、これは更に肺性心及び呼吸不全等の一般的な慢性疾患に発展する可能性がある。慢性閉塞性肺疾患は、有害ガス及び有害粒子に対する異常な炎症反応に関係しており、障害率及び致死率が高い。

一態様においては、本発明は、慢性肺閉塞症を予防及び／又は治療する、又は慢性肺閉塞症を遅延若しくは軽減する、又は慢性肺閉塞症を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、慢性肺閉塞症を予防及び／又は治療する、又は慢性肺閉塞症を遅延若しくは軽減若しくは予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、本発明の医薬は、肺密集域を減少させ、肺活量を含む肺機能を改善し、最大換気を改善し、気道抵抗を減少させ、平均肺胞径を減少させ、肺構造の完全性を維持し、及び／又は動脈血中酸素分圧を増加させることができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、炎症誘発性因子レベルを低下させ、抗炎症因子レベルを増加させ、そして炎症を抑制することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、肺内のコラーゲンＩ及びα－ＳＭＡタンパク質の発現レベルを低下させることができ、線維症の発生を抑制することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

免疫関連肺疾患：
免疫関連肺疾患は、肺が外部アレルゲンによって攻撃されたときの肺における防御免疫応答及びアレルギー応答を指す。免疫関連肺疾患は、主に急性、亜急性、又は慢性の間質性肺炎において現れる。

感染性肺疾患：
感染性肺疾患は、肺における病原性微生物感染によって引き起こされる疾患を指す。感染性肺疾患は、主に細菌性肺炎、ウイルス性肺炎、マイコプラズマ肺炎、真菌性肺炎、及び結核に分けられる。細菌性肺炎は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、グラム陰性菌によって引き起こされる肺炎及びその他の感染症を含む、細菌感染症によって引き起こされる肺炎である。ウイルス性肺炎は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス（ＳＡＲＳウイルス、ＭＥＲＳウイルス、及び新型コロナウイルス）及び一部のエンテロウイルス等によって引き起こされる、主にインフルエンザ、咽頭炎、非定型肺炎（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、及び新型コロナウイルス肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）を含む上気道におけるウイルス感染によって引き起こされる肺炎である。マイコプラズマ肺炎は、マイコプラズマ・ニューモニエ（mycoplasma pneumoniae）肺炎によって引き起こされる肺炎である。真菌性肺炎としては、アスペルギルス（Aspergillus）等の真菌によって引き起こされる肺炎が挙げられる。結核は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）による感染によって引き起こされる肺疾患である。

急性呼吸不全：
急性呼吸不全は、重度の呼吸器感染症、急性呼吸器閉塞性疾患、重度又は重篤な喘息、様々な原因の急性肺水腫、肺血管疾患、胸部外傷又は外科的疾患等の呼吸器疾患によって誘発される低換気、自然気胸及び胸膜滲出液の急激な増加、急性頭蓋内感染、頭蓋脳外傷、呼吸中心を直接的に又は間接的に阻害する脳血管疾患等、灰白随炎、重症筋無力症、有機リン中毒、神経筋伝達系を損傷する頸椎外傷等によって引き起こされる肺換気機能不全及び／又は換気機能不全によって引き起こされる急性呼吸不全である。

呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）：
呼吸窮迫症候群は、様々な理由で、肺血管組織の液交換機能不全が肺水分量の増加、肺コンプライアンスの低下、肺胞の崩壊、及び換気血流比の不均衡を引き起こす急性呼吸不全の一種である。典型的な症状は、重度の低酸素血症及び極度の呼吸窮迫である。呼吸窮迫症候群は主に、重度の感染症、外傷、及びショック等の内的要因及び外的要因によって引き起こされる。呼吸窮迫症候群としては、急性呼吸窮迫症候群及び新生児呼吸窮迫症候群が挙げられる。

新型コロナウイルス「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」の感染によって引き起こされる肺炎「ＣＯＶＩＤ－１９」は潜伏期間が長く、感染性が高く、有害性が高い。これまでのところ、ＣＯＶＩＤ－１９には有効な治療はないが、ＣＯＶＩＤ－１９を伴う重度かつ重症の患者は予後が悪く、死亡率が高く、それらの臨床治療が特に緊急に必要とされている。

最新の疫学データによれば、ＣＯＶＩＤ－１９の一部の患者は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を発症し、これが呼吸不全につながり、更には他の臓器の機能が冒されて、死に至ることさえある。ＡＲＤＳは、急速進行性呼吸困難、低酸素血症、びまん性肺浸潤、及び呼吸不全の臨床症候群として現れる。ＡＲＤＳに関する現在の治療の選択肢は、基本的な医療及び支持換気戦略等の対症治療に限定されており、未だに疾患過程を回復に向かわせ、患者の生活の質を改善し、死亡率を低下させることはできない。機械的換気は、急性呼吸窮迫症候群を伴う患者についての治療の主力である。機械的換気の過程では、人工呼吸器関連肺炎、人工呼吸器関連肺損傷、深部静脈血栓症、機械的換気からの離脱困難、及び肺線維症等の合併症がしばしば発生する。薬物治療法としては、コルチコステロイド、スタチン、アスピリン、β－２受容体アゴニスト、界面活性剤、及び吸入ＮＯが挙げられるが、これらは全て顕著な有効性を示していない。上記の２つの治療法は、血液浄化治療、栄養介入、水分管理等の補助的方法と一緒でも、ＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされるＡＲＤＳの治療に対処することができない。

一態様においては、本発明は、呼吸窮迫症候群を予防及び／又は治療する、又は呼吸窮迫症候群を遅延若しくは軽減する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、呼吸窮迫症候群を予防及び／又は治療する、又は呼吸窮迫症候群を遅延若しくは軽減若しくは予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、喘息を緩和し、病変部位での吸収及び改善を促進し、炎症を抑制し、及び／又は肺機能を回復することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－２５、及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０）を減少させ、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１ＲＡ、ＲＡＮＴＥＳ）レベルを増加させることができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。好ましくは、投与は、静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

特発性間質性肺炎：
突発性が原因不明であることを意味する特発性間質性肺線維症としても知られる特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）は、一群の未知の原因の進行性下気道疾患であり、その病理学的過程は一般に、最終的に肺胞構造の破壊につながり、結果として肺胞腔における完全な線維症及び嚢胞性蜂巣肺をもたらす緩徐進行性のびまん性肺胞炎及び／又は肺胞構造障害である。ＩＩＰは、主要型ＩＩＰ、希少型ＩＩＰ、及び分類不能型ＩＩＰに分けられる。特発性肺線維症（ＩＰＦ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、間質性肺疾患を伴う呼吸細気管支炎（ＲＢ－ＩＬＤ：respiratory bronchiolitis accompanied with interstitial lung disease）、剥離性間質性肺炎（ＤＩＰ）、特発性器質化肺炎（ＣＯＰ）、急性間質性肺炎（ＡＩＰ）の６種類の主要型のＩＩＰが存在する。特発性リンパ球性間質性肺炎（ｉＬＩＰ）及び特発性胸膜肺実質線維弾性症（ｉＰＰＦＥ）の２種類の希少型のＩＩＰが存在する。

特発性肺線維症（ＩＰＦ）：
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、主に肺間質性線維症を特徴とする慢性進行性肺疾患であり、その原因はまだ知られていない。特発性肺線維症は、最も一般的な種類の主要型の特発性間質性肺炎である。この疾患は高齢者により一般的であり、その発生率は近年増加している。しかしながら、ＩＰＦの診断は依然として臨床上の問題である。ＩＰＦの発症は潜行性であり、初期段階では明らかな臨床症状が見られないことが多く、イメージング及び呼吸機能症状は典型的ではない。したがって、疾患が複数の合併症に進行した後に、ＩＰＦを伴う患者が診断されることが多い。しかしながら、現在、ＩＰＦに有効な治療は存在せず、患者の肺機能は疾患の進行とともに悪化し続け、中央生存期間はわずか２年～３年である。

一態様においては、本発明は、突発性肺線維症を予防及び／又は治療する、又は突発性肺線維症を遅延若しくは軽減する、又は突発性肺線維症を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、突発性肺線維症を予防及び／又は治療する、又は突発性肺線維症を遅延若しくは軽減する、又は突発性肺線維症を予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、肺病変部位での吸収及び改善を促進し、肺線維症を軽減することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。好ましくは、投与は、静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

肺血管疾患：
肺血管疾患は、肺動脈、肺静脈、及び肺微小血管における病変を含む、肺循環の構造及び／又は機能における先天性、遺伝性、又は後天性の変化である。その主な症状は、肺高血圧症の一次病変又は二次病変、及び肺静脈閉塞性疾患である。主な理由は、遺伝的感受性及び環境要因の相互作用に関連している。二次性肺高血圧症は、肺静脈高血圧症、慢性低酸素症、血栓性疾患、又は塞栓性疾患に関連しており、肺血管障害を直接伴う場合もある。

肺高血圧症（ＰＨ）：
肺高血圧症は、肺動脈圧が或る特定の閾値を超えて上昇し、それにより右心不全につながり得る、独立した疾患、合併症、又は症候群であり得る血行力学的及び病態生理学的状態を指す。患者は、衰弱及び呼吸困難等の主要な症状を伴う。治療を行わないと、疾患の経過は急速に進行し、しばしば右心不全に発展し、死に至る。肺高血圧症は、肺血管リモデリング、肺血管抵抗（Pulmonary vascular resistance、ＰＶＲ）を引き起こす血管閉塞、肺動脈圧上昇、及び右心室肥大を特徴としている。

病理学的症状、血行力学的特徴、並びに臨床診断及び治療戦略に応じて、肺高血圧症は、（ｉ）動脈性肺高血圧症、（ｉｉ）左心疾患によって引き起こされる肺高血圧症、（ｉｉｉ）低酸素症及び／又は肺疾患によって引き起こされる肺高血圧症、（ｉｖ）慢性血栓塞栓性肺高血圧症、（ｖ）複数のメカニズム及び／又は未知のメカニズムによって引き起こされる肺高血圧症の５つのカテゴリーに分けることができる。

現在、最も有効な治療法は、プロスタサイクリン、エンドセリン－１受容体アンタゴニスト、及びホスホジエステラーゼ５型阻害剤の３つのカテゴリーの薬物を含む薬物療法である。これらの薬物は状態を改善することはできるが、肺血管リモデリングを根本的に改善せず、全体的な価格が高く、長期治療の要求を満たすことができない。

一態様においては、本発明は、肺高血圧症を予防及び／又は治療する、肺高血圧症を遅延若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、肺高血圧症を予防及び／又は治療する、肺高血圧症を遅延若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、肺高血圧症の治療において右心室収縮期血圧を低下させることができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、肺動脈性高血圧症の治療における肺動脈性高血圧症の形成を抑制し、肺動脈血流の加速時間を増加させ、右心室対左心室の直径比を減少させ、平均肺動脈圧を減少させ、肺動脈性高血圧症ラットにおける肺細動脈中膜の厚さ及び肺細動脈壁面積を減少させることができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、炎症を抑制し、抗炎症因子レベルを増加させ、炎症誘発性因子レベルを低下させることができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、単位用量形態で存在し、該医薬の単位投与量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上（例えば、１×１０^４個以上、３×１０^４個以上、５×１０^４個以上、７×１０^４個以上、１×１０^５個以上、３×１０^５個以上、５×１０^５個以上、７×１０^５個以上、１×１０^６個以上、３×１０^６個以上、５×１０^６個以上、７×１０^６個以上、１×１０^７個以上、３×１０^７個以上、５×１０^７個以上、７×１０^７個以上、１×１０^８個以上、３×１０^８個以上、５×１０^８個以上、７×１０^８個以上、１×１０^９個以上、３×１０^９個以上、５×１０^９個以上、７×１０^９個以上、１×１０^１０個以上、３×１０^１０個以上、５×１０^１０個以上、又は７×１０^１０個以上、好ましくは１×１０^６個、３×１０^６個、５×１０^６個、より好ましくは３×１０^６個～６×１０^６個）の量で含有する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、追加の活性成分を更に含み、例えば、追加の活性成分は、プロスタサイクリン類似体、エンドセリン受容体アンタゴニスト及びホスホジエステラーゼ阻害剤からなる群から選択され、好ましくは、プロスタサイクリン類似体は、ベラプロストナトリウム、イロプロスト、エポプロステノール、トレプロスチニル、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、好ましくは、エンドセリン受容体アンタゴニストは、ボセンタン、アンブリセンタン、マシテンタン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、好ましくは、ホスホジエステラーゼ阻害剤は、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、リオシグアト、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含み、好ましくは、担体は、ゼラチン、キトサン、アルギン酸ナトリウム、コラーゲン、シルクタンパク質、セルロース、繊維状タンパク質、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）、ケイ酸塩、シリコーンゴム、細胞外マトリックス、脱細胞化足場、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、好ましくは、担体は、ゼラチン、コラーゲン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、好ましくは、医薬は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤、好ましくは注射剤であり、好ましくは、医薬は、薬学的に許容可能な滅菌の等張の水性又は非水性の溶液、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを更に含む。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

幾つかの実施の形態においては、投与する投与量は、１×１０^４個以上の細胞／回（例えば、１×１０^４個以上の細胞／回、３×１０^４個以上の細胞／回、５×１０^４個以上の細胞／回、７×１０^４個以上の細胞／回、１×１０^５個以上の細胞／回、３×１０^５個以上の細胞／回、５×１０^５個以上の細胞／回、７×１０^５個以上の細胞／回、１×１０^６個以上の細胞／回、３×１０^６個以上の細胞／回、５×１０^６個以上の細胞／回、７×１０^６個以上の細胞／回、１×１０^７個以上の細胞／回、３×１０^７個以上の細胞／回、５×１０^７個以上の細胞／回、７×１０^７個以上の細胞／回、１×１０^８個以上の細胞／回、３×１０^８個以上の細胞／回、５×１０^８個以上の細胞／回、７×１０^８個以上の細胞／回、１×１０^９個以上の細胞／回、３×１０^９個以上の細胞／回、５×１０^９個以上の細胞／回、７×１０^９個以上の細胞／回、１×１０^１０個以上の細胞／回、３×１０^１０個以上の細胞／回、５×１０^１０個以上の細胞／回、又は７×１０^１０個以上の細胞／回）、好ましくは３×１０^６個～６×１０^６個の細胞／日である。

幾つかの実施の形態においては、予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団は、注射投与、粘膜投与、腔内投与（lumen administration）、経口投与、気道投与、又は皮膚投与によって被験体に投与される。

幾つかの実施の形態においては、上記方法は、予防有効量及び／又は治療有効量の追加の活性成分を被験体に同時に、逐次に、又は交互に投与することを更に含み、例えば、追加の活性成分は、プロスタサイクリン類似体、エンドセリン受容体アンタゴニスト、及びホスホジエステラーゼ阻害剤からなる群から選択され、好ましくは、プロスタサイクリン類似体は、ベラプロストナトリウム、イロプロスト、エポプロステノール、トレプロスチニル、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、好ましくは、エンドセリン受容体アンタゴニストは、ボセンタン、アンブリセンタン、マシテンタン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、好ましくは、ホスホジエステラーゼ阻害剤は、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、リオシグアト、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

別の態様においては、本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞集団を含む、呼吸器疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する製品を提供する。幾つかの実施の形態においては、製品は上記に定義される追加の活性成分を更に含む。幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。幾つかの実施の形態においては、製品は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤である。幾つかの実施の形態においては、製品はインプラント剤である。

眼疾患
一態様においては、本発明は、眼疾患を予防及び／又は治療する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、眼疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

眼疾患は、眼表面損傷（例えば、角膜損傷）、ドライアイ、マイボーム腺機能不全（ＭＧＤ）、緑内障、白内障、結膜炎、角膜炎、眼瞼炎、霰粒腫、麦粒腫、網膜症、網膜脱出、眼底静脈血管障害（fundus venous vasculopathy）、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、担体又は賦形剤を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、担体は、ゼラチン、キトサン、アルギン酸ナトリウム、コラーゲン、シルクタンパク質、セルロース、フィブリン、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）、ケイ酸塩、シリコーンゴム、細胞外マトリックス、脱細胞化足場、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、担体は、ゼラチン、コラーゲン、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、第２の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、例えば、抗細菌薬又は抗炎症薬である。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、塩酸テトラサイクリン点眼剤、酢酸プレドニゾン眼軟膏、酢酸ヒドロコルチゾン点眼剤、酢酸ヒドロコルチゾン眼軟膏、デキサメタゾン点眼液、ポリミキシンＢ点眼剤、グルタチオン点眼剤、エリスロマイシン眼軟膏、黄色酸化水銀眼軟膏、クロルテトラサイクリン眼軟膏、硫酸アトロピン眼軟膏、ホウ酸眼軟膏、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、単位剤形で存在し、該医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上（例えば、１×１０^４個以上、３×１０^４個以上、５×１０^４個以上、７×１０^４個以上、１×１０^５個以上、３×１０^５個以上、５×１０^５個以上、７×１０^５個以上、１×１０^６個以上、３×１０^６個以上、５×１０^６個以上、７×１０^６個以上、１×１０^７個以上、３×１０^７個以上、５×１０^７個以上、７×１０^７個以上、１×１０^８個以上、３×１０^８個以上、５×１０^８個以上、７×１０^８個以上、１×１０^９個以上、３×１０^９個以上、５×１０^９個以上、７×１０^９個以上、１×１０^１０個以上、３×１０^１０個以上、５×１０^１０個以上、又は７×１０^１０個以上、好ましくは３×１０^６個、５×１０^６個、より好ましくは３×１０^６個）の量で含有する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞の投与量は、１×１０^４個以上／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上／ｍｌ、３×１０^４個以上／ｍｌ、５×１０^４個以上／ｍｌ、７×１０^４個以上／ｍｌ、１×１０^５個以上／ｍｌ、３×１０^５個以上／ｍｌ、５×１０^５個以上／ｍｌ、７×１０^５個以上／ｍｌ、１×１０^６個以上／ｍｌ、３×１０^６個以上／ｍｌ、５×１０^６個以上／ｍｌ、７×１０^６個以上／ｍｌ、１×１０^７個以上／ｍｌ、３×１０^７個以上／ｍｌ、５×１０^７個以上／ｍｌ、７×１０^７個以上／ｍｌ、１×１０^８個以上／ｍｌ、３×１０^８個以上／ｍｌ、５×１０^８個以上／ｍｌ、７×１０^８個以上／ｍｌ、１×１０^９個以上／ｍｌ、３×１０^９個以上／ｍｌ、５×１０^９個以上／ｍｌ、７×１０^９個以上／ｍｌ、１×１０^１０個以上／ｍｌ、３×１０^１０個以上／ｍｌ、５×１０^１０個以上／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上／ｍｌ、好ましくは１×１０^６個／ｍｌ、３×１０^６個／ｍｌ、５×１０^６個／ｍｌ、より好ましくは３×１０^６個／ｍｌ）である。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞の投与経路は、注射投与、塗抹投与、接着投与、浣腸投与、灌流投与、直腸投与、及び経口投与からなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、上記方法は、それを必要とする被験体に、先に記載又は定義された第２の活性成分を投与することを更に含む。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

別の態様においては、本発明は、第１の活性成分として間葉系幹細胞集団を含む、眼疾患を治療する製品を提供する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、眼疾患は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、製品は、第２の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、第１の活性成分及び第２の活性成分は、単独で又は組合せにおいて存在する。

或る特定の実施の形態においては、第１の活性成分は、先に記載されたものから選択される第２の活性成分との組合せにおいて投与される。

或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤であり、好ましくは、インプラント剤は、微小環境を改善し、免疫拒絶反応を抑制するのに使用される。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

眼表面損傷
眼表面損傷は、眼（例えば、角膜）の化学的火傷（例えば、アルカリ、酸火傷）、眼（例えば、角膜）の熱損傷、角膜損傷、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

眼表面損傷は、世界的な失明の主な原因の１つであり、中でも最も一般的な原因は、眼の化学的火傷（例えば、アルカリ火傷及び酸火傷）及び熱損傷であり、これらは眼表面に深刻な損傷を与え、治療が困難であり、予後は悪く、しばしば失明どころか眼球の喪失につながる。角膜アルカリ火傷は最も深刻な化学的火傷である。アルカリ性物質は、角膜組織の液化及び壊死を引き起こし、角膜上皮幹細胞に深刻な損傷を与える可能性がある。角膜上皮幹細胞の激しい枯渇は、持続性の炎症、角膜及び結膜の上皮化生、新生血管の内部成長（ingrowth）、及び角膜実質の瘢痕化をもたらす。その後に誘発される免疫炎症反応は、深部に発展し、角膜潰瘍及び穿孔、続発性緑内障及び併発白内障を引き起こし、眼の解剖学的構造及び視覚機能に深刻な損傷を与える可能性が高い。

一態様においては、本発明は、被験体における眼表面損傷を予防及び／又は治療するための、又は被験体における眼表面損傷を予防する、又は眼表面損傷を遅延若しくは軽減若しくは予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。

角膜アルカリ火傷は、眼表面損傷の一種である。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、角膜アルカリ火傷を治療し、角膜アルカリ火傷を緩和し、角膜アルカリ損傷からの回復を促進し、炎症を軽減し、角膜ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）濃度を低下させ、新生血管の数を減少させ、ＭＭＰ－９レベルを減少させ、及び／又は炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ－６阻害剤及びＩＬ－１阻害剤）及びケモカイン（ＣＸＣＬ１／ｃｉｎｃｌ及びＣＣＬ２／ＭＣＰ－１）のレベルを減少させることができる。

角膜：角膜は、眼球壁の前端の血管のない透明な線維性膜であり、丸みがあり、外層領域の６分の１を占め、主に無血管結合組織から構成されており、組織学的には、前方から後方に向かって上皮層、前弾性層、間質層、後弾性層、及び内皮層の５つの層が存在する。角膜は透明性が高く、滑らかな表面を有し、前方が膨らんで、後方が窪んでおり、凸凹レンズのような形状を有しており、球面のように湾曲しており、屈折効果を有する。

角膜アルカリ火傷：アルカリ性物質の溶液、粉塵、又はガスが角膜に接触した後に、脂肪及びタンパク質が溶解し、組織が破壊され、これにより更にアルカリ性物質が深部組織へと拡散及び浸透し続けることが促され、こうして角膜組織細胞の分解及び壊死がもたらされ、これは大抵、化学プラント、研究所、又は建設現場において発生する。

角膜炎：角膜炎は、角膜の防御能力が弱まっているときに外因性又は内因性の病原性因子による角膜組織の侵入によって引き起こされる炎症である。患者の主な症状は、眼痛、羞明、流涙、及び眼瞼痙攣等の眼の炎症であった。初期段階には、角膜炎は一般的に角膜の一部に限定されており、有効な治療が利用可能でない場合に徐々に進行する可能性がある。進行した段階では、角膜炎は不可逆的な視覚障害を引き起こす場合がある。感染性角膜炎は大抵、角膜の中心領域において発生するが、免疫性角膜炎は角膜の周辺領域において発生する傾向がある。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、角膜注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

運動系疾患及び骨関連疾患
運動系疾患とは、骨、関節、筋肉、靭帯等において発生する疾患を指し、臨床診療において一般的である。運動系疾患は、局所性疾患又は全身性疾患として現れ得る。局所性疾患としては、例えば、外傷、骨折、脱臼、変形等が挙げられる。関節リウマチ等の全身性疾患は、手、手首、膝、及び股関節において発生し得る。骨関節結核は、脊椎、股関節、及びその他の部分において発生することが多い。運動系の多くの局所病変は、整形外科学において診断され治療される。運動系の一部の全身性疾患（例えば、関節リウマチ）は内科学において診断され治療されるが、一部（例えば、骨関節結核）は依然として整形外科学において診断され治療される。運動系疾患は病因又は疾患の部位によって分類され得る。一般的な教科書では、運動系疾患は、外傷及び骨疾患の２つのカテゴリーに分けられる場合がある。外傷は更に骨折、脱臼、及び軟部組織損傷等に分けられる。骨疾患は病因又は解剖学的部分によって分類される。

骨関連疾患としては、骨、関節、靭帯、軟骨、並びに四肢、首、及び背中を支える構造物に関連するあらゆる疾患が挙げられる。その関連疾患は、軟骨の捻挫、挫傷、及び裂傷、関節炎、滑液包炎、急性腰痛及び慢性腰痛、骨粗鬆症、ばね指、骨形成不全症、及びそれらの併存症等からなる群から選択される。

一態様においては、本発明は、運動系疾患又は骨関連疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、運動系疾患又は骨関連疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、運動系疾患としては、例えば、外傷（例えば、骨折、脱臼、軟部組織損傷等）、又は骨疾患が挙げられる。或る特定の実施の形態においては、骨関連疾患は、軟骨の捻挫、挫傷、及び裂傷、関節炎、滑液包炎、急性腰痛及び慢性腰痛、骨粗鬆症、ばね指、骨形成不全症、及びそれらの併存症等からなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分を含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上（例えば、１×１０^４個以上、３×１０^４個以上、５×１０^４個以上、７×１０^４個以上、１×１０^５個以上、３×１０^５個以上、５×１０^５個以上、７×１０^５個以上、１×１０^６個以上、３×１０^６個以上、５×１０^６個以上、７×１０^６個以上、１×１０^７個以上、３×１０^７個以上、５×１０^７個以上、７×１０^７個以上、１×１０^８個以上、３×１０^８個以上、５×１０^８個以上、７×１０^８個以上、１×１０^９個以上、３×１０^９個以上、５×１０^９個以上、７×１０^９個以上、１×１０^１０個以上、３×１０^１０個以上、５×１０^１０個以上、又は７×１０^１０個以上）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個～１×１０^１０個（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個、１×１０^６個～１×１０^７個、又は１×１０^６個～５×１０^６個）の量で含有する。

別の態様においては、本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞集団を含む、運動系疾患又は骨関連疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する製品を提供する。或る特定の実施の形態においては、製品は、上記に定義される追加の活性成分を更に含む。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。或る特定の実施の形態においては、製品は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤である。或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤である。

関節炎又は関節損傷
関節炎は関節を冒すあらゆる疾患であり、その症状としては、しばしば関節痛及び硬直が挙げられ、その他の考えられる症状としては、冒された関節における発赤、熱感、腫れ、及び可動域の低下が挙げられる。或る特定の関節炎は、関節以外の他の臓器を冒す場合もある。その発症は、段階的又は突発的かつ急性であり得る。１００種類を超える関節炎があり、最も一般的なものは変形性関節症（変形性関節疾患）及び関節リウマチである。

本明細書において使用される場合に、「変形性関節症」という用語は、関節軟骨の変性、破壊、及び骨過形成を特徴とする慢性関節疾患を指す。変形性関節症の殆どの症例の原因は未知であり、「原発性変形性関節症」と呼ばれている。変形性関節症の原因が知られている場合に、それは「続発性変形性関節症」と呼ばれる。続発性変形性関節症は、他の疾患又は状態に起因する。続発性変形性関節症につながり得る状態としては、関節構造物への繰り返しの損傷又は手術、出生時の関節異常（先天性異常）、痛風、糖尿病、及びその他のホルモン障害が挙げられる。関節炎の他の形態としては、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデス等の全身性疾患が挙げられる。

一態様においては、本発明は、関節炎又は関節損傷を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、関節炎又は関節損傷を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、関節炎は、変形性関節症、外傷性関節炎、及び自己免疫性関節炎からなる群から選択される。或る特定の実施の形態においては、関節損傷は半月板損傷である。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、被験体における変形性関節症（ＯＡ）を予防、治療、遅延、及び／又は緩和するのに使用される。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、運動活動を改善し、神経により生成される疼痛を抑制し、組織損傷を治療し、及び／又は関節炎の症状を和らげることができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

本発明の間葉系幹細胞集団は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、関節内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、間葉系幹細胞集団から形成された細胞スフェアを含む。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、細胞スフェア及び生体材料の混合物を含む。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分（例えば、変形性関節症を治療するための追加の治療薬）を更に含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上（例えば、１×１０^４個以上、３×１０^４個以上、５×１０^４個以上、７×１０^４個以上、１×１０^５個以上、３×１０^５個以上、５×１０^５個以上、７×１０^５個以上、１×１０^６個以上、３×１０^６個以上、５×１０^６個以上、７×１０^６個以上、１×１０^７個以上、３×１０^７個以上、５×１０^７個以上、７×１０^７個以上、１×１０^８個以上、３×１０^８個以上、５×１０^８個以上、７×１０^８個以上、１×１０^９個以上、３×１０^９個以上、５×１０^９個以上、７×１０^９個以上、１×１０^１０個以上、３×１０^１０個以上、５×１０^１０個以上、又は７×１０^１０個以上）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個～１×１０^１０個（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個、１×１０^６個～１×１０^７個、又は１×１０^６個～５×１０^６個）の量で含有する。

半月板損傷
半月板は膝関節を構成する重要な構造物の１つであり、２つの半月板線維軟骨から構成され、大腿顆と脛骨プラトーとの間に位置している。その外側縁はより厚く、その内側縁はより薄い。内側半月は「ｃ」字形状であり、外側半月はほぼ「ｏ」字形状である。半月板の機能は、膝関節を安定化し、膝関節の負荷力を伝達し、関節内栄養を促進することである。半月板損傷とは、回転力、圧迫、及び半月板自体の疾患等の要因によって引き起こされる半月板の破裂を指し、これは、激しい膝痛、伸展不能、及び腫れとして現れ、膝への最も一般的な損傷の１つである。膝半月板損傷は、膝関節における局所的な痛みとして現れ、一部の患者は、跛行、又は膝関節ロッキングの現象を伴う。

一態様においては、本発明は、半月板損傷を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、半月板損傷を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、膝痛を軽減し、局所浮腫を軽減し、歩行困難を緩和し、関節ロッキングを緩和し、及び／又は痛みを緩和することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

本発明の間葉系幹細胞集団は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分（例えば、半月板損傷を治療するための追加の治療薬）を更に含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上（例えば、１×１０^４個以上、３×１０^４個以上、５×１０^４個以上、７×１０^４個以上、１×１０^５個以上、３×１０^５個以上、５×１０^５個以上、７×１０^５個以上、１×１０^６個以上、３×１０^６個以上、５×１０^６個以上、７×１０^６個以上、１×１０^７個以上、３×１０^７個以上、５×１０^７個以上、７×１０^７個以上、１×１０^８個以上、３×１０^８個以上、５×１０^８個以上、７×１０^８個以上、１×１０^９個以上、３×１０^９個以上、５×１０^９個以上、７×１０^９個以上、１×１０^１０個以上、３×１０^１０個以上、５×１０^１０個以上、又は７×１０^１０個以上）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個～１×１０^１０個（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個、１×１０^６個～１×１０^７個、又は１×１０^６個～５×１０^６個）の量で含有する。

骨損傷
骨損傷は、先天的要因又は後天的要因によって引き起こされる骨欠損又は欠損修復、並びに骨構造の連続性の完全断裂又は部分断裂を指す運動系の疾患である。例えば、骨折としては、しばしば多発骨折、骨盤骨折、大腿骨骨折、鎖骨骨折、大腿骨頸部骨折、股関節骨折、胸腰椎骨折、骨粗鬆症による圧迫骨折、尺骨骨折、踵骨骨折、橈骨遠位端骨折、脛骨骨幹部骨折、脛骨プラトー骨折、転子間骨折、足首骨折、下肢骨折、長骨骨幹部骨折、脊椎骨折、及び重度の開放骨折が挙げられる。骨欠損は、粉砕骨折、開放骨折、外傷、炎症、骨疾患等によって引き起こされる大きな骨組織欠損等の外傷又は手術又は損傷による骨不足、炎症によって引き起こされる骨壊死及び剥離、骨梗塞による大きな骨片の壊死又は骨虚血性壊死等による、全て疾患によって引き起こされる骨欠損に属する骨欠損である。骨欠損としては、手術によって引き起こされる骨欠損、外傷に際して四肢を貫通した骨折、又は開放骨折の創傷清拭の間の不活性化された骨（deactivated bone）の除去も挙げられる。骨損傷は、損傷の位置に応じて異なる症状を有する。主な症状は、痛み、腫れ、及び可動制限である。例えば、半月板が損傷した場合に、患者は、引き裂き感及び破砕感（crunchy feeling）、膝関節の局所的な痛み及び圧痛、膝の完全な伸展の不能、並びに動くときの膝関節の音を感じる。慢性期においては、関節痛の症状は和らぐが、膝関節は弱々しく、階段の昇降に際して痛みが悪化し、休息後には和らぐ場合がある。時間の経過とともに、外傷性関節炎及び大腿四頭筋萎縮を伴う場合がある。一部の患者は、膝のロッキング症状を伴う場合もある。

一態様においては、本発明は、骨損傷を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、骨損傷を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、骨病変の治癒を加速し、神経により生成される疼痛を抑制し、組織損傷を治療し、及び／又は関節炎の症状を緩和することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

本発明の間葉系幹細胞集団は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、筋肉内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、間葉系幹細胞集団から形成された細胞スフェアを含む。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、細胞スフェア及び生体材料の混合物を含む。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、追加の活性成分と組み合わせて投与されるため、医薬は追加の活性成分（例えば、骨損傷を治療するための追加の治療薬）を更に含む場合もある。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞は、追加の治療剤とともに同時に、別々に、又は逐次に投与される。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。

或る特定の実施の形態においては、医薬は単位剤形であり、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上（例えば、１×１０^４個以上、３×１０^４個以上、５×１０^４個以上、７×１０^４個以上、１×１０^５個以上、３×１０^５個以上、５×１０^５個以上、７×１０^５個以上、１×１０^６個以上、３×１０^６個以上、５×１０^６個以上、７×１０^６個以上、１×１０^７個以上、３×１０^７個以上、５×１０^７個以上、７×１０^７個以上、１×１０^８個以上、３×１０^８個以上、５×１０^８個以上、７×１０^８個以上、１×１０^９個以上、３×１０^９個以上、５×１０^９個以上、７×１０^９個以上、１×１０^１０個以上、３×１０^１０個以上、５×１０^１０個以上、又は７×１０^１０個以上）の量で含有する。或る特定の実施の形態においては、医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個～１×１０^１０個（例えば、１×１０^６個～１×１０^８個、１×１０^６個～１×１０^７個、又は１×１０^６個～５×１０^６個）の量で含有する。

粘膜免疫系
粘膜免疫系（ＭＩＳ）とは、気道、胃腸管、尿生殖器管、及び一部の外分泌腺の粘膜において広く分布しているリンパ組織を指し、局所的な特定の免疫機能を発揮するための主要な部位である。粘膜免疫系は、腸粘膜関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）、気管支粘膜関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）、眼結膜関連リンパ組織（ＣＡＬＴ）、及び泌尿生殖器粘膜関連リンパ組織（ＵＡＬＴ）の４つの部分からなり、これらは、抗ウイルス免疫応答において非常に重要な役割を果たす。いわゆる粘膜関連リンパ組織は、呼吸管、消化管、泌尿生殖器管、及び一部の外分泌腺（ハーダー腺、膵臓、乳房、涙管、唾液腺分泌管等）の粘膜上皮に沿って分布し、上皮の下に広く存在するリンパ組織であり、粘膜が抗原と接触してそれを取り込み、初期の免疫応答が起こる部位である。関連疾患としては、胃腸粘膜損傷（胃腸感染症、胃炎、腸炎等）、尿生殖器管関連疾患（尿道感染症、尿道粘膜炎症、生殖管感染症、及び関連炎症等）、口腔粘膜疾患（口腔粘膜感染性疾患、口腔粘膜アレルギー性疾患、口腔粘膜潰瘍性疾患、口腔粘膜水疱性疾患、口腔粘膜条痕疾患（oral mucosal streak disease）、口腔粘膜肉芽腫性疾患、唇及び舌の疾患、性感染症、口腔粘膜色素異常等）、中耳粘膜炎症（中耳炎等）、鼻粘膜病変（副鼻腔炎、嗅覚障害、アレルギー性鼻炎等）、呼吸器粘膜疾患（慢性閉塞性肺疾患、喘息、細菌乾癬又はウイルス感染による呼吸器疾患）等が挙げられる。

一態様においては、本発明は、粘膜免疫系疾患を予防及び／又は治療する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、粘膜免疫系疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

鼻疾患
一態様においては、本発明は、鼻疾患を予防及び／又は治療する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、鼻疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

「鼻の疾患」としては、外鼻、鼻前庭、鼻腔、及び副鼻腔の疾患が挙げられ、感染症、出血、アレルギー、腫瘍、外傷、異物、先天性奇形、及び構造異常に分けることができる。鼻は外的有害要因によって冒されることが多く、様々な疾患にかかりやすい。微生物感染症は、鼻せつ、鼻前庭炎、鼻粘膜及び副鼻腔の炎症を引き起こす場合があり、鼻腔は、アレルゲンが体内に侵入する入口であり、アレルギー性疾患の部位でもあるため、花粉症及びアレルギー性鼻炎が一般的な疾患である。歯根感染症等の或る特定の口腔疾患は、歯性上顎洞炎を引き起こす可能性がある。外鼻は顔の真ん中に位置し、外傷を受けやすい。外鼻は、適切な見た目を維持するのに重要なシンボルである。したがって、先天性及び後天性の鼻変形に対する外科的要求はより高い。鼻腔及び副鼻腔は悪性腫瘍の最も一般的な部位であり、上顎洞癌が最も一般的であり、それに続いて鼻腔癌及び篩骨洞癌が一般的である。鼻は、解剖学的に頭蓋腔、眼窩、及び口腔に隣接している。鼻前庭、鼻腔、及び副鼻腔の疾患は、髄膜炎、眼窩蜂巣炎等の深刻な合併症を引き起こす可能性があり、血流を介して、これらは海綿静脈洞の感染症を引き起こす場合があり、重度の症例では失明どころか死につながる可能性がある。

「鼻粘膜」という用語は、鼻腔の表面を覆う粘膜を指し、その下には、軟骨、骨、又は骨格筋がある。一般的な鼻粘膜病変としては、副鼻腔炎（副鼻腔の粘膜が呼吸器粘膜とつながっているため、鼻炎及び風邪が副鼻腔炎を引き起こしやすい）、嗅覚障害（炎症性感染症又は局所的な空間占有病変の場合に、粘膜が腫れて充血し、分泌が過剰となり、一方で、これは鼻づまりを引き起こすため、嗅覚要素を運ぶ気流が遮断され、嗅覚領域に到達することができない）、アレルギー性鼻炎（アレルギー性鼻炎と呼ばれ、これは身体がアレルゲンに曝された後に主にＩｇＥによって媒介される鼻粘膜の非感染性炎症性疾患である）等が挙げられる。

鼻疾患は、鼻炎、副鼻腔炎、鼻前庭炎、鼻粘膜疾患、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

鼻炎
「鼻炎」という用語は、ウイルス、細菌、アレルゲン、様々な物理化学的要因、及び或る特定の全身性疾患によって引き起こされる鼻粘膜の炎症である、鼻腔の炎症性疾患を指す。鼻炎は主に以下の４つの種類：慢性鼻炎、急性鼻炎、薬物誘発性鼻炎、及び萎縮性鼻炎に分けられ、これらの鼻炎としては、慢性単純性鼻炎、慢性肥厚性鼻炎、慢性乾燥性鼻炎、アレルギー性鼻炎（季節性鼻炎、通年性鼻炎）、乾燥性鼻炎、血管運動性鼻炎、好酸球性非アレルギー性鼻炎、過反射性鼻炎、特発性鼻炎、構造性鼻炎、局所アレルギー性鼻炎が挙げられる。局所的要因及び環境的要因に加えて、内分泌障害、心血管疾患等の長期的な慢性疾患、ビタミン欠乏症、タバコ及びアルコールの過剰使用、並びに血液薬の長期使用は、鼻の血管拡張を引き起こし、鼻炎及びその他の症状を引き起こす可能性がある。血液疾患、結核、糖尿病、リウマチ、急性感染性疾患、並びに慢性心臓疾患、慢性肝臓疾患、及び慢性腎臓疾患を含む慢性疾患は、鼻粘膜において長期的鬱血又は反射性鬱血を引き起こす場合があり、鼻腔及び副鼻腔の慢性炎症、又は隣接する感染部位の影響により、慢性鼻炎の発生が促される。

鼻アレルギーとしても知られるアレルギー性鼻炎（ＡＲ）は、一般的な耳鼻咽喉科疾患であり、一般的な呼吸器アレルギー性疾患である。この疾患は、鼻粘膜において発生するアレルギー性疾患であり、痒み、くしゃみ、鼻漏、鼻粘膜の腫れを特徴としている。アレルギー性鼻炎の有病率は１０％～４０％であり、中でも花粉アレルギーは欧州及び北米においてより一般的であり、通年性アレルギー性鼻炎はアジアにおいてより一般的である。アレルギー性鼻炎は致命的ではないが、患者の鼻及び全身の不快感は明らかであり、これは患者の勉強及び仕事に影響を及ぼす。適切に治療しなければ、患者の約３０％が気管支喘息を発症し、それどころか肺性心疾患及びその他の疾患さえも発症し、患者の健康及び生活の質に深刻な影響を及ぼす。コルチコステロイド及び抗ヒスタミン薬は現在、アレルギー性鼻炎の第一選択薬である。アレルギー性鼻炎は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで環境要因の作用下にＩｇＥによって媒介されるアレルギー性炎症反応であり、鼻粘膜の免疫応答によって支配される。

一態様においては、本発明は、被験体における鼻炎（例えば、アレルギー性鼻炎）を予防及び／又は治療するための、又は被験体における鼻炎を予防する、若しくは鼻炎を遅延若しくは軽減する、若しくは鼻炎を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、鼻炎によって引き起こされるくしゃみを減らし、被験体が鼻を掻く回数を減らすことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組合せは、血清抗原特異的抗体応答のレベルを低下させ、炎症性メディエーターの発現を低下させることができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組合せは、炎症部位での血管新生を促進し、上皮細胞の生成を促進し、炎症性細胞浸潤を減少させることができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組合せは、鼻粘膜上皮表面を回復し、繊毛を正常化し、線維芽細胞を正常化し、細胞質性細胞質（cytoplasmic cytoplasm）を正常化することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、担体又は賦形剤を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、担体は、ゼラチン、キトサン、アルギン酸ナトリウム、コラーゲン、シルクタンパク質、セルロース、フィブリン、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）、ケイ酸塩、シリコーンゴム、細胞外マトリックス、脱細胞化足場、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、担体は、ゼラチン、コラーゲン、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、第２の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、グルココルチコイド、鼻充血除去薬、抗ヒスタミン薬（例えば、アゼラスチン）、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト（例えば、モンテルカストナトリウム）、抗コリン作動薬（例えば、臭化イプラトロピウム）、抗アレルギー薬（例えば、クロモグリク酸ナトリウム）、粘液溶解薬（例えば、マートル油）、抗細菌薬、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、グルココルチコイドは、プロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、フロ酸モメタゾン、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、抗細菌剤は、アモキシシリン、セフポドキシムプロキセチル、セフロキシムアキセチル、セフジニル、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ドキシサイクリン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、セフトリアキソン、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、単位剤形で存在し、該医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上（例えば、１×１０^４個以上、３×１０^４個以上、５×１０^４個以上、７×１０^４個以上、１×１０^５個以上、３×１０^５個以上、５×１０^５個以上、７×１０^５個以上、１×１０^６個以上、３×１０^６個以上、５×１０^６個以上、７×１０^６個以上、１×１０^７個以上、３×１０^７個以上、５×１０^７個以上、７×１０^７個以上、１×１０^８個以上、３×１０^８個以上、５×１０^８個以上、７×１０^８個以上、１×１０^９個以上、３×１０^９個以上、５×１０^９個以上、７×１０^９個以上、１×１０^１０個以上、３×１０^１０個以上、５×１０^１０個以上、又は７×１０^１０個以上、例えば１×１０^５個～１×１０^８個、７×１０^５個～７×１０^６個、１×１０^６個～５×１０^６個、好ましくは１×１０^６個、３×１０^６個、５×１０^６個、より好ましくは３×１０^６個）の量で含有する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞の投与する投与量は、１×１０^４個以上／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上／ｍｌ、３×１０^４個以上／ｍｌ、５×１０^４個以上／ｍｌ、７×１０^４個以上／ｍｌ、１×１０^５個以上／ｍｌ、３×１０^５個以上／ｍｌ、５×１０^５個以上／ｍｌ、７×１０^５個以上／ｍｌ、１×１０^６個以上／ｍｌ、３×１０^６個以上／ｍｌ、５×１０^６個以上／ｍｌ、７×１０^６個以上／ｍｌ、１×１０^７個以上／ｍｌ、３×１０^７個以上／ｍｌ、５×１０^７個以上／ｍｌ、７×１０^７個以上／ｍｌ、１×１０^８個以上／ｍｌ、３×１０^８個以上／ｍｌ、５×１０^８個以上／ｍｌ、７×１０^８個以上／ｍｌ、１×１０^９個以上／ｍｌ、３×１０^９個以上／ｍｌ、５×１０^９個以上／ｍｌ、７×１０^９個以上／ｍｌ、１×１０^１０個以上／ｍｌ、３×１０^１０個以上／ｍｌ、５×１０^１０個以上／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上／ｍｌ、例えば１×１０^５個～１×１０^８個／ｍｌ、７×１０^５個～７×１０^６個／ｍｌ、１×１０^６個～５×１０^６個／ｍｌ、好ましくは１×１０^６個／ｍｌ、３×１０^６個／ｍｌ、５×１０^６個／ｍｌ、より好ましくは３×１０^６個／ｍｌ）である。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞の投与経路は、注射投与、塗抹投与、接着投与、浣腸投与、灌流投与、直腸投与、及び経口投与からなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、上記方法は、それを必要とする被験体に、先に記載又は定義された第２の活性成分を投与することを更に含む。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

別の態様においては、本発明は、第１の活性成分として間葉系幹細胞集団を含む、鼻疾患を治療する製品を提供する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、鼻疾患は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、製品は、第２の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、第１の活性成分及び第２の活性成分は、単独で又は組合せにおいて存在する。

或る特定の実施の形態においては、第１の活性成分は、先に記載されたものから選択される第２の活性成分との組合せにおいて投与される。

或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤であり、好ましくは、インプラント剤は、微小環境を改善し、免疫拒絶反応を抑制するのに使用される。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

腎臓疾患
一態様においては、本発明は、腎臓疾患を予防及び／又は治療する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、腎臓疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

腎臓疾患は、様々な要因により腎臓を損傷する又は腎臓の機能を低下させる疾患である。腎臓疾患は、ヒトの健康を深刻に危うくする一般的な疾患の総称である。腎臓疾患としては、主に様々な種類の腎炎、急性腎不全、腎結石、腎嚢胞、慢性腎臓疾患等が挙げられる。腎臓疾患の主な臨床症状は、タンパク尿、血尿、浮腫、高血圧、及び腎不全である。

「腎臓疾患」とは、主に原発性糸球体疾患、続発性糸球体腎炎、遺伝性腎臓疾患、尿路感染性腎臓疾患、腎尿細管疾患、間質性腎炎、腎結石、及び閉塞性腎症、嚢胞性腎臓疾患、及び腎臓腫瘍、腎血管疾患、腎臓及び高血圧（kidney and hypertension）、妊娠及び腎臓疾患（pregnancy and kidney disease）、高齢者の腎臓疾患、薬物（食物）誘発性腎臓障害、腎不全を含む腎臓関連疾患を指す。

腎臓疾患としては、腎損傷疾患が挙げられる。腎損傷の主な症状は、浮腫、高血圧、嘔吐、及び腎不全である。

腎臓疾患としては、腎不全が挙げられる。腎不全は、様々な理由によって引き起こされる、激しく損傷した糸球体が代謝廃棄物の排出、並びに水、電解質、及び酸塩基平衡の調節に関して障害を引き起こす一群の症候群である。腎不全は急性腎不全と慢性腎不全とに分けることができる。腎不全の予後は悪く、生命を脅かす主要な状態の１つである。腎不全の原因は、以下のようにまとめることができる：ａ．腎疾患：例えば、急性糸球体腎炎及び慢性糸球体腎炎、腎盂腎炎、腎結核、化学的毒性物質及び生物学的毒性物質によって引き起こされる急性腎尿細管変性及び壊死、腎腫瘍、並びに先天性腎臓疾患等；ｂ．腎外疾患：例えば、全身性血液循環障害（ショック、心不全、高血圧）、全身性代謝障害（例えば、糖尿病）、及び尿路疾患（尿路結石症、腫瘍圧迫（oncothlipsis））等。

腎臓疾患としては、腎摘出術が挙げられる。腎摘出術は、腎臓疾患を治療する外科手術である。その適応症としては、腎悪性腫瘍、腎結核、重度の水腎症又は腎結石、重度の腎損傷、及び一側性腎盂腎症が挙げられる。

腎臓疾患としては、腎線維症が挙げられる。

腎臓疾患としては、腎炎が挙げられる。

「腎炎」とは、浮腫、高血圧、腎小体損傷によるタンパク尿等の腎炎現象を伴う、両腎臓の非化膿性炎症性病変を指し、最も一般的な種類の腎臓疾患である。病因に応じて、腎炎は続発性糸球体腎炎と原発性糸球体腎炎とに分けることができる。続発性糸球体腎炎は、他の疾患（例えば、糖尿病、高血圧、全身性エリテマトーデス、アレルギー性紫斑病、血管炎等）によって引き起こされ、腎臓に関係する全身性疾患である。臨床分類に応じて、腎炎は、急性、慢性、及び急速進行性の腎炎症候群、潜伏性腎炎（無症候性血尿及び／又はタンパク尿）に分けることができる。慢性腎炎としては、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、膜性腎症、メサンギウム毛細血管性糸球体腎炎、及び硬化性腎炎が挙げられる。急速進行性腎炎の病理学的変化は、糸球体における半月体の形成を特徴とし、半月体形成性腎炎としても知られている。

腎臓疾患としては、薬物誘発性腎臓疾患が挙げられる。

「薬物誘発性腎臓疾患」とは、疾患の治療に際して抗感染薬、非ステロイド性抗炎症薬、尿酸降下薬、抗腫瘍化学療法薬、免疫抑制剤、及び漢方薬を使用することによって引き起こされる薬物誘発性の腎臓への損傷を指す。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、担体又は賦形剤を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、担体は、ゼラチン、キトサン、アルギン酸ナトリウム、コラーゲン、シルクタンパク質、セルロース、フィブリン、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）、ケイ酸塩、シリコーンゴム、細胞外マトリックス、脱細胞化足場、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、担体は、ゼラチン、コラーゲン、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、第２の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、グルココルチコイド（プレドニゾン、プレドニゾロン）、他の免疫抑制剤（シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ロイケラン）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、胃腸管吸着剤、酸塩基平衡調節剤、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、単位剤形で存在し、該医薬の単位用量は、間葉系幹細胞を１×１０^４個以上（例えば、１×１０^４個以上、３×１０^４個以上、５×１０^４個以上、７×１０^４個以上、１×１０^５個以上、３×１０^５個以上、５×１０^５個以上、７×１０^５個以上、１×１０^６個以上、３×１０^６個以上、５×１０^６個以上、７×１０^６個以上、１×１０^７個以上、３×１０^７個以上、５×１０^７個以上、７×１０^７個以上、１×１０^８個以上、３×１０^８個以上、５×１０^８個以上、７×１０^８個以上、１×１０^９個以上、３×１０^９個以上、５×１０^９個以上、７×１０^９個以上、１×１０^１０個以上、３×１０^１０個以上、５×１０^１０個以上、又は７×１０^１０個以上、例えば１×１０^５個～１×１０^８個、７×１０^５個～７×１０^６個、１×１０^６個～５×１０^６個、好ましくは１×１０^６個、３×１０^６個、５×１０^６個、より好ましくは３×１０^６個）の量で含有する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞の投与する投与量は、１×１０^４個以上／ｍｌ（例えば、１×１０^４個以上／ｍｌ、３×１０^４個以上／ｍｌ、５×１０^４個以上／ｍｌ、７×１０^４個以上／ｍｌ、１×１０^５個以上／ｍｌ、３×１０^５個以上／ｍｌ、５×１０^５個以上／ｍｌ、７×１０^５個以上／ｍｌ、１×１０^６個以上／ｍｌ、３×１０^６個以上／ｍｌ、５×１０^６個以上／ｍｌ、７×１０^６個以上／ｍｌ、１×１０^７個以上／ｍｌ、３×１０^７個以上／ｍｌ、５×１０^７個以上／ｍｌ、７×１０^７個以上／ｍｌ、１×１０^８個以上／ｍｌ、３×１０^８個以上／ｍｌ、５×１０^８個以上／ｍｌ、７×１０^８個以上／ｍｌ、１×１０^９個以上／ｍｌ、３×１０^９個以上／ｍｌ、５×１０^９個以上／ｍｌ、７×１０^９個以上／ｍｌ、１×１０^１０個以上／ｍｌ、３×１０^１０個以上／ｍｌ、５×１０^１０個以上／ｍｌ、又は７×１０^１０個以上／ｍｌ、好ましくは１×１０^６個／ｍｌ、３×１０^６個／ｍｌ、５×１０^６個／ｍｌ、より好ましくは３×１０^６個／ｍｌ）である。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞の投与経路は、注射投与、塗抹投与、接着投与、浣腸投与、灌流投与、直腸投与、及び経口投与からなる群から選択される。

或る特定の実施の形態においては、上記方法は、それを必要とする被験体に、先に記載又は定義された第２の活性成分を投与することを更に含む。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

別の態様においては、本発明は、第１の活性成分として間葉系幹細胞集団を含む、腎臓疾患を治療する製品を提供する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、腎臓疾患は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、製品は、第２の活性成分を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、第２の活性成分は、先に記載又は定義される通りである。

或る特定の実施の形態においては、第１の活性成分及び第２の活性成分は、単独で又は組合せにおいて存在する。

或る特定の実施の形態においては、第１の活性成分は、先に記載されたものから選択される第２の活性成分との組合せにおいて投与される。

或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤であり、好ましくは、インプラント剤は、微小環境を改善し、免疫拒絶反応を抑制するのに使用される。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、体重を回復することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、尿酸、尿素、及び尿酸無水物を低下させることができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、腎損傷に対する保護効果を生じ、腎機能を改善することができる。

半月体形成性腎炎
「半月体形成性腎炎」は、急速進行性腎炎としても知られている。半月体形成性腎炎は、主な臨床症状として血尿、タンパク尿、浮腫、及び高血圧を伴って急速に発症し、乏尿、無尿、及び腎不全に急速に発展し、予後が不良な一群の糸球体腎炎の総称である。病因に応じて、半月体形成性腎炎は、原発性及び続発性の２つのカテゴリーに分けることができる。中でも、原発性半月体形成性腎炎は、抗糸球体基底膜抗体型、免疫複合体型、及び病因不明型に分けることができる。続発性半月体形成性腎炎は、膜性増殖性腎炎、膜性腎症、ＩｇＡ腎症（あまり一般的ではない）等の原発性糸球体疾患によって引き起こされ、感染性心内膜炎、連鎖球菌感染後腎炎、潜伏性内臓細菌病変（occult visceral bacterial lesion）、Ｂ型肝炎、及びインフルエンザ等の感染性疾患に続発し、全身性エリテマトーデス、全身性血管炎、肺出血腎炎症候群、アレルギー性紫斑病、特発性クリオグロブリン血症、悪性腫瘍、及び再燃性多発軟骨炎等の他の全身性疾患に続発し得る。

一態様においては、本発明は、被験体における半月体形成性腎炎を予防及び／又は治療するための、又は被験体における半月体形成性腎炎を予防する、若しくは半月体形成性腎炎を遅延若しくは軽減若しくは予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、尿中タンパク質及び血清クレアチニンを減少させ、腎臓機能を回復し、及び／又は半月体形成を抑制することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、脾臓及び腎臓におけるＴｈ１因子、Ｔｈ２因子、及びＴｈ１７因子を下方調節し、ＩＬ－１β遺伝子、ＣＤ８遺伝子、及びＥＤ１遺伝子を発現する細胞を減少させ、Ｔｒｅｇ細胞を増加させ、そして腎臓炎症を抑制することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、被験体における、炎症誘発性因子（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＴＦＮ－α、ｉＮＯＳ等）の発現を低下させ、抗炎症因子ＩＬ－１０の発現を増加させ、炎症を抑制することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われ得る。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

腎線維症
「腎臓線維症」とは、腎臓の病態生理学的変化を指し、進行性慢性腎臓疾患であり、腎臓の機能が健康から損傷後に障害へ、最終的には機能喪失へと変化する段階的な過程である。外傷、感染、炎症、血液循環障害、及び免疫応答等の様々な病原性因子の刺激により、腎臓の内因性細胞が障害を受け、発達の後期において大量のコラーゲンの沈着及び蓄積が起こることから、腎臓が臓器機能を完全に失うまで、腎実質が徐々に硬化して瘢痕を形成する原因となる。腎臓内の内因性細胞の線維化及び硬化の過程も、腎線維症の過程である。腎線維症は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の異常な沈着を特徴とする。例えば、急性腎臓損傷、急性腎臓損傷、糸球体疾患、糸球体疾患、糖尿病性腎症、可逆性後脳症症候群、慢性腎不全、急性腎不全等。

一態様においては、本発明は、被験体における腎線維症を予防及び／又は治療するための、又は被験体における腎線維症を予防する、若しくは腎線維症を遅延若しくは軽減する、若しくは腎線維症を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、被験体において、体重を回復し、尿中微量アルブミン（例えば、無水尿酸、尿素、尿酸）を減少させることができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、腎臓構造を改善し、コラーゲン沈着を減少させ、腎線維症の進行を遅延させることができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、腎間質におけるＴＧＦ－β１等の線維形成促進因子の発現を阻害することができ、間質移行を逆行させ、それにより腎臓を保護することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

腎摘出術誘発性腎疾患又は関連腎疾患
腎摘出術は、腎臓疾患を治療する外科手術である。その適応症としては、腎悪性腫瘍、腎結核、重度の水腎症又は腎結石、重度の腎損傷、及び一側性腎盂腎症が挙げられる。

一態様においては、本発明は、被験体における腎摘出術誘発性損傷若しくは関連腎疾患を予防及び／又は治療するための、又は被験体における腎摘出術誘発性損傷若しくは関連腎疾患を予防する、若しくは腎摘出術誘発性損傷若しくは関連腎疾患を遅延若しくは軽減する、若しくは腎摘出術誘発性損傷若しくは関連腎疾患を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関する。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、体重を回復することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、尿酸、尿素、及び尿酸無水物を低下させることができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、腎損傷に対する保護効果を生じ、腎機能を改善することができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、腎臓を修復し、腎線維症及び腎不全等の腎臓損傷関連疾患を抑制することができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、血液循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液又は滅菌等張非水溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、上述の生体足場、又は限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、医薬は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）
移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）とは、ドナーとレシピエントとの間のマイナー組織適合性抗原の違いのため、移植された組織と宿主レシピエントとの間で発生する病理学的反応を指す。移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）は、上皮組織、特に皮膚、肝臓、及び胃腸管粘膜を攻撃する傾向がある。ＧＶＨＤは、主に急性ＧＶＨＤ（皮膚、胃腸管、及び肝臓損傷等の副作用を引き起こし得る）と、慢性ＧＶＨＤ（皮膚、胃腸管、及び肝臓に加えて肺及び眼を含むより多くの部分において感染症を引き起こし得る）とに分けられる。現在、ＧＶＨＤは、一般的に造血幹細胞及び固形臓器移植後に見られる。さらに、ＧＶＨＤは、同種異系のＴリンパ球が免疫不全患者に移植されたときに起こり得る致命的となり得る臨床的合併症と見なすこともできる。実施例により、Ｍ細胞がｈＰＢＭＣ移植によって引き起こされるＧＶＨＤに明らかな治療効果を有し、キメラマウスの生存率を改善し、細胞キメラ化率を低下させ、ＧＶＨＤに誘発される抗炎症因子の腸、腎臓、肝臓、及び肺における発現を増加させることが明らかになった。

移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）は主に、移植後の同種異系ドナー移植片におけるＴリンパ球が、レシピエントにおける関連サイトカインの影響により、レシピエント抗原に対する免疫応答を増強し、皮膚、肝臓、及び腸管を主要な標的とするレシピエントの標的細胞に対する細胞傷害性攻撃を開始するということに起因する。ＧＶＨＤの発生は、主に次の３つの点に依存する：（１）移植片が免疫担当細胞を含むこと、（２）ドナーとレシピエントとの組織適合性抗原が異なること、（３）拒絶されないためドナーの免疫担当細胞が生存し、異なる組織適合性抗原を認識すると分裂して増殖すること。ＧＶＨＤに関与する免疫担当細胞が汚染された成熟Ｔ細胞であり、汚染率が高いほど、ＧＶＨＤの確率が高くなると一般に考えられている。

一態様においては、本発明は、移植片対宿主疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、移植片対宿主疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、被験体の体重を増加させることができる。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、被験体の生存率を改善することができる。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、骨髄への外因性細胞の浸潤を低減し、及び／又は炎症反応及び組織損傷を低減することができる。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、炎症を抑制し、炎症誘発性因子レベルを低下させ、抗炎症因子レベルを増加させることができる。

或る特定の実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

或る特定の実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の間葉系幹細胞集団は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われ得る。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則は、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年に見出すことができる。

或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、スラリー剤、又は混合物の形態で移植され得る。

別の態様においては、本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞集団を含む、移植片対宿主疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する製品を提供する。或る特定の実施の形態においては、製品は上記に定義される追加の活性成分を更に含む。或る特定の実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。或る特定の実施の形態においては、製品は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤である。或る特定の実施の形態においては、製品はインプラント剤である。

心臓疾患
一態様においては、本発明は、心臓系疾患を予防及び／又は治療する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、心臓系疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

心臓疾患は、比較的一般的な循環器系疾患である。循環器系は、心臓、血管、及び血液循環を調節する神経液性組織からなる。循環器系疾患は心血管疾患とも呼ばれ、上述の全ての組織及び器官の疾患を含む。循環器系疾患は内科学において一般的な疾患であり、中でも心臓疾患が最も一般的であり、患者の労働能力に大きな影響を与える可能性がある。

１．心筋症
心筋症は、心臓の収縮機能又は拡張機能を冒し、心不全又は死につながることさえもある心筋の疾患である。心筋症は、心臓損傷（例えば、心臓発作）又は遺伝的障害に起因する場合があり、心室の異常な肥大若しくは拡張又は他の病態生理学的変化として現れる。心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、及び不整脈源性心筋症の４つのカテゴリーに分けられる。

２．心筋虚血
心筋虚血とは、心臓の血液灌流が低下し、その結果、心臓への酸素供給が減少し、心筋のエネルギー代謝が異常になり、心臓の正常な働きを支持することができなくなる病理的状態を指す。

３．冠状動脈性心臓疾患
冠状動脈アテローム硬化性心臓疾患は、内腔の狭窄若しくは閉塞をもたらし、心筋虚血、低酸素症、又は壊死につながる、冠状動脈のアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる一般的な心血管系疾患であり、これは短く、冠状動脈性心臓疾患とも呼ばれ、虚血性心臓疾患としても知られる。

４．心筋梗塞
心筋梗塞は、心筋梗塞（miocrdil infrction）としても知られ、一般的な急性心血管疾患である。心筋梗塞は主に、心臓に供給する主要な血管の閉塞及び血流の遮断に起因し、結果として、心筋の虚血性壊死が引き起こされる。心筋梗塞は急性冠症候群のカテゴリーに属する。臨床的には、左心室心筋梗塞がより一般的であり、患者は主に重度で長期にわたる胸痛、発熱、及び頻繁な吐き気、嘔吐等、更には重度の不整脈、ショック、心不全等を呈し、深刻に命に関わる。

５．虚血再灌流
近年、ショックの治療の進歩、並びに動脈バイパス手術、血栓溶解療法、経皮経管冠動脈形成術、心肺バイパス、心肺脳蘇生、切断四肢再移植及び臓器移植、並びに他の方法の確立及び促進に伴い、多くの組織及び臓器は、虚血後に血液灌流を取り戻し、これは虚血再灌流と呼ばれる。

６．虚血再灌流障害
様々な要因によって引き起こされる組織虚血後に、組織は効果的な介入後に血液の再灌流を回復するため、組織及び器官の機能が回復し、障害を受けた構造物が修復され、患者の状態が改善及び回復するが、虚血後の再灌流は、時々、組織及び器官の機能を回復させないだけでなく、組織及び器官の機能不全及び構造的障害を悪化させることがある。虚血を基礎とする、血流の回復後に組織障害が悪化し、更には不可逆的な障害が発生するこの種の現象は、虚血再灌流障害と呼ばれる。

心筋虚血／再灌流障害（ＭＩ／ＲＩ）の予防及び／又は治療
虚血性心臓疾患はヒトにおける主な死因であり、心筋再灌流の早期かつ好結果の回復が臨床転帰を改善するのに最も効果的な方法である。しかしながら、虚血性心筋への血流を回復する過程は障害を引き起こす可能性があり、この現象は心筋虚血／再灌流障害（ＭＩ／ＲＩ）と呼ばれる。Ｉ／Ｒは、酸化ストレス、細胞内カルシウム過負荷等の幾つかの有害作用をもたらし、これらの有害作用は心筋細胞のアポトーシスにつながる可能性がある。アポトーシスは、虚血再灌流障害における組織機能の喪失についての重要な理由である。これは非常に複雑な過程であり、その詳細な誘発メカニズムは完全には明らかではない。

一態様においては、本発明は、心筋虚血／再灌流障害を予防及び／又は治療する、又は心筋虚血／再灌流障害を遅延若しくは軽減する、又は心筋虚血／再灌流障害を予防若しくは緩和する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、心筋虚血／再灌流障害を予防及び／又は治療する、又は心筋虚血／再灌流障害を遅延若しくは軽減する、又は心筋虚血／再灌流障害を予防若しくは緩和する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、心機能を改善し、心臓梗塞サイズを減少させ、心筋虚血を寛解させ、及び／又は心筋の収縮前抵抗又は負荷を軽減することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われ得る。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

別の態様においては、本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞集団を含む、心臓系疾患を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する製品を提供する。幾つかの実施の形態においては、製品は上記に定義される追加の活性成分を更に含む。幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。幾つかの実施の形態においては、製品は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤である。幾つかの実施の形態においては、製品はインプラント剤である。

貧血症
一態様においては、本発明は、貧血症を予防及び／又は治療する医薬の製造における間葉系幹細胞集団又はその培養上清の使用を提供し、或いは、本発明は、貧血症を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に予防有効量及び／又は治療有効量の間葉系幹細胞集団又はその培養上清を投与することを含む、方法を提供する。

貧血症とは、ヒトの末梢血における赤血球の容積が減少し、正常範囲の下限を下回り、組織に十分な酸素を輸送することができない症候群を指す。貧血症は主に以下のものに分けられる。

１．赤血球形成の減少を伴う貧血症
３つの主要な要素、すなわち造血細胞、造血調節、及び造血原料のいずれか１つ及び／又は幾つかが異常であると、赤血球形成の減少がもたらされ、貧血症が発生する。

２．赤血球の過度の破壊によって引き起こされる貧血症
赤血球はそれ自体の要因及び／又は外的要因により破壊され、その寿命が短くなる。赤血球の破壊率が骨髄の代償能力を超えると貧血症が発生する。

３．出血性貧血
出血性貧血は、外傷及び／又は疾患により身体の血液量が減少し、血液の酸素運搬能力の低下がもたらされる症候群である。

４．巨赤芽球性貧血症
葉酸若しくはビタミンＢ１２、又はヌクレオチド代謝に影響を与える幾つかの薬物の不足による核デオキシリボ核酸合成の障害によって引き起こされる貧血症は、巨赤芽球性貧血症と呼ばれる。この疾患は、骨髄において巨赤芽球性系列、顆粒球系列、及び巨核球系列を伴う大球性貧血症を特徴としている。

５．再生不良性貧血症
再生不良性貧血症は、様々な病因及びメカニズムによって引き起こされ得る、主に骨髄造血機能の低下、汎血球減少症、その結果としての低酸素血症、出血、及び感染症を伴う症候群として現れる一種の骨髄造血不全である。

貧血症は、癌患者の一般的な合併症であり、癌患者の５０％が貧血症を伴い、これは様々な臨床症状をもたらすだけでなく、患者の生活の質を低下させ、予後に影響を与える要因の１つでもある。さらに、貧血症は、輸血の増加により多くの悪い結果を引き起こす場合もある。腫瘍関連貧血症は複数の要因の結果であり、その殆どは腫瘍自体によって引き起こされ、慢性貧血症に属し、さらに、化学療法のための細胞傷害性薬物又は腎毒性薬物の使用も貧血症を引き起こす場合がある。シスプラチンは患者において広く使用されている化学療法薬であり、腎毒性を有し、シスプラチンの累積用量が増えると貧血症は悪化する。エリスロポエチンは慢性癌性貧血症を和らげることができるが、貧血症を治すことについてのその有効率は約６０％であることが文献において報告されている。腫瘍患者の貧血症を更に改善し、患者の予後及び生活の質を改善する方法は、依然として重要な話題である。

一態様においては、本発明は、貧血症（例えば、限定されるものではないが、腫瘍関連貧血症、慢性貧血症、細胞傷害性薬物又は腎毒性薬物を用いた化学療法によって引き起こされる貧血症）を予防及び／又は治療する、強皮症を遅延若しくは緩和する、又は貧血症（例えば、限定されるものではないが、腫瘍関連貧血症、慢性貧血症、細胞傷害性薬物又は腎毒性薬物を用いた化学療法によって引き起こされる貧血症）を予防する医薬の製造における、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物の使用に関し、或いは、本発明は、貧血症（例えば、限定されるものではないが、腫瘍関連貧血症、慢性貧血症、細胞傷害性薬物又は腎毒性薬物を用いた化学療法によって引き起こされる貧血症）を予防及び／又は治療する、強皮症を遅延若しくは緩和する、又は貧血症（例えば、限定されるものではないが、腫瘍関連貧血症、慢性貧血症、細胞傷害性薬物又は腎毒性薬物を用いた化学療法によって引き起こされる貧血症）を予防する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の本明細書において記載される間葉系幹細胞集団、培養物、培養上清、又は医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、貧血症の治療において体重を増加させることができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、貧血症の治療において、末梢白血球の数を増加させ、末梢赤血球の数を増加させ、末梢赤血球の容積を減少させ、末梢血の血液ルーチン指数を回復し、末梢血のヘモグロビン指数を回復し、又は骨髄を回復することができる。

幾つかの実施の形態においては、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

幾つかの実施の形態においては、医薬は、治療有効量の間葉系幹細胞集団及び／又は培養物、及び／又は治療有効量の本明細書において記載される培養上清を含む。

幾つかの実施の形態においては、本明細書において記載される間葉系幹細胞集団又は医薬組成物は、局所注射移植（例えば、定位脳内注射移植又は脊髄局所注射移植）、循環経路移植（例えば、静脈注射移植又は動脈内注射移植）、又は脳脊髄液経路移植（例えば、腰椎穿刺クモ膜下注射移植）によって被験体に投与される。当業者は、病変の位置及び性質に応じて適切な細胞移植経路を選択する方法を認識している。

幾つかの実施の形態においては、本発明の医薬は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与等によって投与され得る。幾つかの好ましい実施の形態においては、投与は、静脈内注射によって行われ得る。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、医療分野において知られる任意の形態であり得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）である。幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、滅菌の薬学的に許容可能な等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。この医薬組成物の製剤化に関する一般原則については、Cell Therapy: stem cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn and W. Sheridanによる編集, ケンブリッジ大学出版局, 1996年、及びHematopoietic stem cell treatment, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000年を参照することができる。

幾つかの実施の形態においては、医薬組成物は、限定されるものではないが、コラーゲン足場、マトリゲル、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、シルクフィブロイン、セルロースポリ乳酸、弾性プロテイノゲン、ヒアルロン酸等を含む、薬学的に許容可能な生体材料を含む。

幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団は、懸濁剤、ゲル剤、コロイド剤、漿液、又は混合物の形態で移植され得る。

別の態様においては、本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞集団を含む、貧血症を予防、治療、遅延、及び／又は緩和する製品を提供する。幾つかの実施の形態においては、製品は上記に定義される追加の活性成分を更に含む。幾つかの実施の形態においては、間葉系幹細胞集団及び追加の活性成分は、別個の成分として、又は単一の製剤として存在する。幾つかの実施の形態においては、製品は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、又はカプセル剤である。幾つかの実施の形態においては、製品はインプラント剤である。

用語の定義
本発明において、他に規定のない限り、本明細書において使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、本明細書において用いられる分子遺伝学、核酸化学、細胞培養、生化学、細胞生物学等の操作工程は全て、対応する分野において広く用いられる日常的な工程である。加えて、本発明をより良好に理解するために、関連用語の定義及び説明を下に提示する。

本明細書において使用される場合に、「胚様体（ＥＢ）」という用語は、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞）によって形成される細胞凝集体を指す当業者によって一般的に理解される意味を有し、「ＥＢスフェア」としても知られ得る。多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞）を誘導して胚様体を形成させる方法は、一般に、多能性幹細胞が培養容器の表面に付着するのを防ぐことによって、懸濁した多能性幹細胞を凝集させて胚様体を形成することを含む。

本明細書において使用される場合に、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的環境、並びにその中での過程及び反応を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境は、限定されるものではないが、試験管及び細胞培養によって例示される。

本明細書において使用される場合に、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、天然環境（すなわち、動物又は細胞）、並びにその中での過程及び反応を指す。

本明細書において使用される場合に、「培養物」という用語は、培養培地において細胞（例えば、本発明の間葉系幹細胞集団）を培養した後に得られる生成物を指す。

本明細書において使用される場合に、「培養上清」という用語は、細胞（例えば、本発明の間葉系幹細胞集団）を培養することによって得られるが、細胞自身を含まない培養液を指す。したがって、本発明において使用可能な培養上清は、例えば、培養後に細胞成分を分離及び除去することによって得ることができる。培養上清はまた、遠心分離、濃縮、溶剤置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等の他の処理に供され得る。

本明細書において使用される場合に、「薬学的に許容可能な担体又は賦形剤」という用語は、当該技術分野において既知である、被験体及び活性成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合性のある担体及び／又は賦形剤を指し（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Gennaro ARによる編集, 第19版 Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995年を参照）、限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、イオン強度増強剤、浸透圧を維持する作用物質、吸収を遅延させる作用物質、希釈剤、アジュバント、防腐剤等が挙げられる。例えば、ｐＨ調整剤としては、限定されるものではないが、リン酸緩衝液が挙げられる。界面活性剤としては、限定されるものではないが、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、又はＴｗｅｅｎ－８０等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。イオン強度増強剤としては、限定されるものではないが、塩化ナトリウムが挙げられる。浸透圧を維持する作用物質としては、限定されるものではないが、糖、ＮａＣｌ等が挙げられる。吸収を遅延させる作用物質としては、限定されるものではないが、モノステアリン酸塩及びゼラチンが挙げられる。希釈剤としては、限定されるものではないが、水、水性緩衝液（例えば、緩衝生理食塩水）、アルコール、及びポリオール（例えば、グリセロール）等が挙げられる。アジュバントとしては、限定されるものではないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント）等が挙げられる。防腐剤としては、限定されるものではないが、チメロサール、２－フェノキシエタノール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の様々な抗細菌剤及び抗真菌剤が挙げられる。或る特定の実施の形態においては、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤は、滅菌の等張の水性又は非水性の溶液（例えば、平衡塩類溶液又は生理食塩水）、分散液、懸濁液、又はエマルジョンである。

本明細書において使用される場合に、「予防」という用語は、被験体における疾患又は障害又は症状を予防する若しくはその発生を遅延させる、又は発生した場合にその影響を最小限に抑えるために行われる方法を指す。「治療」という用語は、有益な又は所望の臨床転帰を得るために行われる方法を指す。有益な又は所望の臨床転帰としては、限定されるものではないが、検出可能か又は検出不可能かにかかわらず、疾患の進行速度の低下、病状の改善又は緩和、及び退縮若しくは予後の改善が挙げられる。任意の特定の疾患の症状を和らげるのに有効な治療剤の量は、患者の病状、年齢及び体重、並びに薬物が被験体において所望の奏効を誘発する能力等の要因に応じて変動し得る。病気の症状の緩解をあらゆる臨床的手段によって評価することができ、これらの措置は、医師又は他の熟練した医療提供者によって症状の重症度又は進行状態を評価するのに一般的に使用される。

本明細書において使用される場合に、「有効量」という用語は、所望の効果を得るのに又はそれを少なくとも部分的に得るのに十分な量を指す。例えば、予防有効量とは、疾患を予防、抑制、又はその発症を遅延させるのに十分な量を指し、治療有効量とは、既に疾患に罹患している患者における疾患及びその合併症を治癒又はそれらを少なくとも部分的に予防するのに十分な量を指す。そのような有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、治療有効量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の全身状態、患者の年齢、体重、及び性別等の一般的な条件、投与方式、並びにその他の同時に適用される療法等に左右される。

本明細書において使用される場合に、「被験体」という用語には、限定されるものではないが、哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ科、齧歯動物（例えば、マウス又はラット）、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル又はカニクイザル）、又はヒト等の様々な動物が含まれる。

本発明の方法によって調製された間葉系幹細胞は、大幅に増加したＭＭＰ１発現レベルを有し、様々な疾患（例えば、炎症性疾患等）の予防及び治療に適しており、大きな臨床的価値を有する。

ｈＥＳＣ－Ｍ細胞表面タンパク質発現のフローサイトメトリー検出を示す図である。^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１。 図２Ａ～図２ＤはｈＥＳＣ－Ｍ細胞におけるサイトカインｍＲＮＡ発現レベルのｑＰＣＲ検出を示す図である。^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１。 肺線維芽細胞におけるα－ＳＭＡ及びコラーゲンＩの発現レベルに対するｈＥＳＣ－Ｍ細胞培養上清の効果を示す図である。 ｈＥＳＣ－Ｍ細胞におけるＩＤＯ（図４Ａ）、ＰＤ－Ｌ１（図４Ｂ）、及びＰＧＥ２（図４Ｃ）の発現レベルに対するＩＦＮ－γ刺激の効果を示す図である。 実施例２（ＩＩ）における種々の配合物によって形成されたＰ０世代及びＰ５世代での胚様体及びＭ細胞の形態学的写真を示す図である。 実施例２（Ｉ）における配合物１のＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（Ｉ）における配合物２のＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（Ｉ）における配合物３のＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（Ｉ）における配合物４のＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（Ｉ）における配合物５のＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（Ｉ）における第１の培養培地の種々の配合物を用いて生成されたＰ５世代のＭ細胞についてのｑＰＣＲによって検出されたＭＭＰ１の発現を示す図である。 実施例２（Ｉ）における第１の培養培地の種々の配合物を用いて生成されたＰ５世代のＭ細胞についてのｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２の発現を示す図である。 胚様体、及び実施例２（ＩＩ）における種々の配合物によって形成されたＰ５世代のＭ細胞の細胞形態を示す図である。 実施例２（ＩＩ）における配合物１のＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＩ）における配合物２のＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＩ）における配合物３のＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＩ）における配合物４のＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＩ）における配合物５のＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＩ）における第１の培養培地の種々の配合物を用いて生成されたＰ５世代のＭ細胞についてのｑＰＣＲによって検出されたＭＭＰ１の発現を示す図である。 実施例２（ＩＩ）における第１の培養培地の種々の配合物を用いて生成されたＰ５世代のＭ細胞についてのｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２の発現を示す図である。 実施例２（ＩＩＩ）における種々の配合物を用いて形成されたＰ５世代のＭ細胞の細胞形態を示す図である。 実施例２（ＩＩＩ）における種々の配合物を用いて調製されたＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＩＩ）における種々の配合物を用いて調製されたＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＩＩ）における種々の配合物を用いて調製されたＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＩＩ）における種々の配合物を用いて調製されたＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＩＩ）における第２の培養培地の種々の配合物を用いて生成されたＰ５世代のＭ細胞についてのｑＰＣＲによって検出されたＭＭＰ１の発現を示す図である。 実施例２（ＩＩＩ）における第２の培養培地の種々の配合物を用いて生成されたＰ５世代のＭ細胞についてのｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２の発現を示す図である。 実施例２（ＩＶ）における種々の配合物によって形成されたＰ５世代のＭ細胞の細胞形態を示す図である。 実施例２（ＩＶ）における配合物３－１を用いて調製されたＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＶ）における配合物３－３を用いて調製されたＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＶ）における配合物３－４を用いて調製されたＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（ＩＶ）における種々の配合物を用いて生成されたＰ５世代のＭ細胞についてのｑＰＣＲによって検出されたＭＭＰ１の発現を示す図である。 実施例２（ＩＶ）における種々の配合物を用いて生成されたＰ５世代のＭ細胞についてのｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２の発現を示す図である。 実施例２（Ｖ）における種々の配合物によって形成されたＰ５世代のＭ細胞の細胞形態を示す図である。 実施例２（Ｖ）における配合物３－２－３によって調製されたＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（Ｖ）における配合物３－５－４を用いて調製されたＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 実施例２（Ｖ）における種々の配合物を用いて生成されたＰ５世代のＭ細胞についてのｑＰＣＲによって検出されたＭＭＰ１の発現を示す図である。 実施例２（Ｖ）における種々の配合物を用いて生成されたＰ５世代のＭ細胞についてのｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２の発現を示す図である。 Ｍ細胞をスプレーする装置の概略図を示す図である。 スプレー前後のＭ細胞の増殖能の検出を示す図である。Ｍ細胞のスプレー前後に、ＣＣＫ８を使用して増殖能の変化を検出した。Ｍ細胞のスプレー後に、形態は正常であり、増殖能はスプレーされていない細胞とあまり相違しなかったことから、これは、スプレーシステムがＭ細胞のスプレーの適用を十分に支持し得たことを示している。 コラーゲン足場に接種されたＧＦＰ標識Ｍ細胞の蛍光写真を示す図である。これらの結果により、ＧＦＰ標識Ｍ細胞がコラーゲン材料上に十分に接着して成長し得ることが明らかになった。 電界紡糸ゼラチン繊維に接種されたＧＦＰ標識Ｍ細胞の蛍光写真を示す図である。これらの結果により、ＧＦＰ標識Ｍ細胞が電界紡糸ゼラチン繊維上に十分に接着して成長し得ることが明らかになった。 コラーゲン足場に接種されたＧＦＰ標識Ｍ細胞の蛍光写真を示す図である。これらの結果により、ＧＦＰ標識Ｍ細胞がコラーゲン足場上に十分に接着して成長し得ることが明らかになった。 皮膚修復膜に接種されたＧＦＰ標識Ｍ細胞の蛍光写真を示す図である。これらの結果により、ＧＦＰ標識Ｍ細胞が皮膚修復膜上に十分に接着して成長し得ることが明らかになった。 コラーゲン、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウムヒドロゲルを用いたＭ細胞の共培養を示す図である。これらの結果により、ＧＦＰ標識Ｍ細胞が皮膚修復膜上に十分に接着して成長し得ることが明らかになった。 生理食塩水中に再懸濁されたＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。 乳酸リンゲル注射液中に再懸濁されたＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。 複合電解質注射剤中に再懸濁されたＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。 ５％グルコース注射剤中に再懸濁されたＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。 ２０％ＨＳＡ注射剤中に再懸濁されたＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。 スクシニル化ゼラチン注射液中に再懸濁されたＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。 ＭＺＪ注射液１中に再懸濁されたＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。 スクシニル化ゼラチンＭＩＸ注射液中に再懸濁されたＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。 ＭＺＪ注射液１を用いて－８０℃で凍結されたＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。 Ｃｙｔｏｄｅｘ３を用いて培養したＭ細胞を示す図である。 Ｃｙｔｏｄｅｘ３を用いて培養したＭ細胞の消化を示す図である。 Ｃｙｔｏｄｅｘ３を用いて培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 Ｃｙｔｏｄｅｘ３を用いて培養したＭ細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの凍結保存アッセイの結果を示す図である。 Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒを用いて培養したＭ細胞を示す図である。 Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒを用いて培養したＭ細胞の消化を示す図である。 Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒを用いて培養したＭ細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの凍結保存アッセイの結果を示す図である。 ＴａｂｌｅＴｒｉｘを用いて培養したＭ細胞を示す図である。 ＴａｂｌｅＴｒｉｘを用いて培養したＭ細胞の消化を示す図である。 ＴａｂｌｅＴｒｉｘを用いて培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 ＴａｂｌｅＴｒｉｘを用いて培養したＭ細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの凍結保存アッセイの結果を示す図である。 Ｓｏｌｏｈｉｌｌを用いて培養したＭ細胞を示す図である。 Ｓｏｌｏｈｉｌｌを用いて培養したＭ細胞の消化を示す図である。 Ｓｏｌｏｈｉｌｌを用いて培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 Ｓｏｌｏｈｉｌｌを用いて培養したＭ細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの凍結保存アッセイの結果を示す図である。 Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンマイクロキャリア上で培養したＭ細胞を示す図である。 Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンマイクロキャリア上で培養したＭ細胞の消化を示す図である。 Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンマイクロキャリア上で培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンマイクロキャリア上で培養したＭ細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの凍結保存アッセイの結果を示す図である。 ８ＧｅＬ－トルエン法（8GeL-toluene method）によって調製されたマイクロキャリア上で培養したＭ細胞を示す図である。 ８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリア上で培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 ８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリア上で培養したＭ細胞の継代を示す図である。８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリア上で培養したＭ細胞をスフェアからスフェアへと継代させて、増殖させることができた。 ８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリア上で培養したＭ細胞の生死アッセイを示す図である。 ２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞を示す図である。 ２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 ２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の継代を示す図である。 ２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死アッセイを示す図である。 Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞を示す図である。 Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の継代を示す図である。 Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の継代物の生死アッセイを示す図である。 ２５ＧＦ－２ＨＡマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞を示す図である。 ２５ＧＦ－２ＨＡマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 実施例４３における塵肺症モデルマウスの肺組織のマッソン染色の結果を示す図である。 ２５ＧＦ－２ＨＡマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞を示す図である。 ２５ＧＦ－２ＨＡマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 Ａｌｇマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞を示す図である。 Ａｌｇマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 Ａｌｇ－リジンマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞を示す図である。 Ａｌｇ－リジンマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 Ｇｅｌ－リジンマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞を示す図である。 Ｇｅｌ－リジンマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 Ｇｅｌ－リジンマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の消化を示す図である。 Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の継代物の生死アッセイの結果を示す図である。 ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリア上で動的に培養したＭ細胞の生死アッセイの結果を示す図である。 ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリア上で動的に培養したＭ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 本発明の実施例９における子宮の光学顕微鏡写真を示す図である。モデル群における子宮癒着はより明白であり、子宮水腫はより重度であったのに対して、Ｍ細胞群においては、子宮癒着及び子宮水腫は大幅な改善を示した。これにより、Ｍ細胞が子宮腔内癒着の治療において十分に使用され得ることが明らかになった。 本発明の実施例９における子宮のＨＥ染色写真を示す図である。モデル群においては、子宮内膜がより薄くなり、腺が消失したのに対して、Ｍ細胞群においては、子宮内膜及び子宮筋層の両方がより厚く、多数の血管、腺、及び細胞を有し、子宮腔内癒着が大幅に改善され、子宮腔の形態が回復し、子宮内に蓄積した液が減少したことから、Ｍ細胞が損傷を受けた子宮内膜の修復及び再生を促進し得たことを示している。 本発明の実施例９におけるＭ細胞による子宮腔内癒着の臨床治療を示す図である。患者は中等度から重度の子宮腔内癒着を有し、子宮底部に筋肉癒着とともに、瘢痕の形成を伴っていた。卵管が閉塞しており、開口部がはっきりしなかった。子宮壁注射によるＭ細胞での治療後に、患者の子宮の形状は正常に戻り、癒着は見られず、瘢痕は修復され、両側の卵管の開口部が見て取れた。これらの結果により、Ｍ細胞が子宮腔内癒着の臨床治療に十分に使用され得ることが示唆された。この図は、（１）患者が子宮腔内癒着及び両側尿管閉塞を有し、手術時に癒着は中等度から重度（混合型）であり、癒着の分離後にＭ細胞（３×１０^６個の細胞）を注射したこと、（２）４週間のフォローアップの間に、瘢痕の回復が見られたこと、（３）４ヶ月のフォローアップの間に、子宮腔の状態が悪かったこと、及び（４）８ヶ月のフォローアップの間に、子宮腔が基本的に正常に戻ったことを示した。 本発明の実施例１０における各群のマウスの生存率の統計的グラフを示す図である。 本発明の実施例１０における各群のマウスの血清肝臓機能検出の統計的グラフを示す図である。 本発明の実施例１１におけるＡＬＳマウスの発生率の統計を示す図である。これらの結果により、Ｍ細胞群の発生率が２７週間後に溶剤群の発生率よりも大幅に低く（５０％対８０％）、Ｍ細胞がマウスにおける発症を大幅に遅延させることが明らかになった。 本発明の実施例１１におけるマウスのロータロッド行動統計を示す図である。Ｍ細胞群におけるロータロッド上でのＡＬＳマウスの滞留時間は、特に２９週間後に溶剤群における滞留時間よりも有意に長く（１４４対２４４）、有意差（^＊＊ｐ＜０．０１）を有することから、Ｍ細胞がマウスの運動能力を有意に改善し得たことを示している。 本発明の実施例１１におけるマウスの握力行動統計を示す図である。Ｍ細胞群におけるマウスの握力は２９週後に溶剤群における握力よりも高く、有意差（^＊＊ｐ＜０．０１）を有した。これにより、Ｍ細胞がマウスにおける筋力を有意に改善することが明らかになり、間接的にＭ細胞が運動ニューロンの損傷を軽減し得ることが示された。 本発明の実施例１２における２．５％ＤＳＳによって誘発された炎症性腸疾患のフローチャートを示す図である。各群には６匹のマウスがおり、マウスを７日間飲料水によって誘導した。０日目、３日目、及び６日目に、３００μｌの細胞懸濁液を３×１０^６個の細胞の量で腹腔内注射し、該細胞はＰ５世代のＭ細胞であった。１１日目に灌流サンプリングを行った。 本発明の実施例１２のマウス結腸試料の光学顕微鏡写真を示す図である。１１日目に、マウスに麻酔をかけ、灌流して試料採取し、マウスの結腸を写真撮影し、統計を行った。 本発明の実施例１２のマウス結腸長さを示す図である。採取したマウス結腸の長さの統計を行ったところ、Ｍ細胞群における結腸長さは２．５％ＤＳＳ群における結腸長さよりも長く、Ｍ細胞治療群における結腸長さは正常群の結腸長さにより近いことが判明したことから、Ｍ細胞の腹腔内注射がマウス結腸の保護において役割を果たし得たことを示している。 本発明の実施例１２におけるＨＥ染色されたマウス結腸の写真を示す図である。Ｍ細胞治療群におけるマウスの結腸組織の構造は無傷であり、炎症性細胞浸潤がより少なかったのに対して、２．５％ＤＳＳ誘導群におけるマウスは、より多くの結腸炎症性細胞浸潤とともに、腸陰窩構造の破壊を伴っていたことから、Ｍ細胞の腹腔内注射がマウス結腸の保護において役割を果たすことができ、炎症性腸疾患に対して効果的な治療効果を有したことを示している。 本発明の実施例１２におけるＨＥ染色されたマウス結腸の病理スコアの統計を示す図である。Ｍ細胞群のマウス結腸ＨＥ切片の病理スコアは２．５％ＤＳＳ群の病理スコアよりも有意に低く、統計的差異があったことから、Ｍ細胞がマウスの腸管に対して良好な保護効果及び治療効果を有し得たことを示している。 本発明の実施例１２における５％ＤＳＳに誘発された炎症性腸疾患のフローチャートを示す図である。マウスの誘導を７日間飲料水によって行い、０日目、３日目、及び６日目に、３００μｌの細胞懸濁液を３×１０^６個の細胞量で腹腔内注射し、該細胞はＰ５世代のＭ細胞であった。 本発明の実施例１２におけるＨＥ染色されたマウス結腸の写真を示す図である。Ｍ細胞治療群におけるマウスの結腸組織の構造は無傷であり、炎症性細胞浸潤がより少なかったのに対して、５％ＤＳＳ誘導群におけるマウスは、より多くの結腸炎症性細胞浸潤とともに、腸陰窩構造の完全な破壊を伴っていたことから、Ｍ細胞がマウスの結腸組織を十分に保護し、炎症性腸疾患において効果的な治療的役割を果たし得たことを示している。 本発明の実施例１２におけるＨＥ染色されたマウス結腸の病理スコアの統計を示す図である。Ｍ細胞群のスコアは５％ＤＳＳ群のスコアよりも有意に低く、統計的差異があったことから、Ｍ細胞がマウスの腸管に対して良好な保護効果及び治療効果を有し得たことを示している。 本発明の実施例１２におけるマウスの生存率の統計を示す図である。１１日目に、モデル群における全てのマウスが死亡したのに対して、Ｍ細胞群の７匹のマウスは、実験の終了時（２７日目）に安定したバイタルサインを伴って依然として生存していたことから（モデリング、ｎ＝１２）、Ｍ細胞治療がマウスの生存率を大幅に改善し得たことを示している。 本発明の実施例１３における種々の日の創傷の写真を示す図である。種々の日のコントロール群及びＭ細胞群の光学顕微鏡写真により、Ｍ細胞群の創傷が１４日目及び２１日目のコントロール群の創傷よりも大幅に小さいことが示された。これは、Ｍ細胞が皮膚創傷の治癒を加速し得たことを示している。 本発明の実施例１３の創傷面積サイズ統計を示す図である。図１１８における創傷面積の統計については、ＩｍａｇｅＪを統計に使用した。Ｍ細胞治療群においては、創傷面積はコントロール群よりも大幅に小さかった。皮膚損傷の治療については、Ｍ細胞がより良好な治療傾向を示したことから、Ｍ細胞が皮膚損傷を効果的に治療し得たことを示している。 本発明の実施例１３の創傷の非治癒率の統計を示す図である。非治癒率＝（創傷面積／初期創傷面積）×１００％。非治癒率の統計によれば、Ｍ細胞群の非治癒率はコントロール群よりも大幅に低く、より良好な治療傾向を示したことから、Ｍ細胞が皮膚損傷を十分に治療し、皮膚創傷の治癒を加速し得たことを示している。 本発明の実施例１３の２１日目の創傷面積サイズの統計を示す図である。コントロール群の非治癒面積は初期創傷面積の１１．７％であったのに対して、Ｍ細胞治療群の非治癒創傷面積は初期創傷面積の５．７％であり、有意差があった、すなわちＭ細胞の非治癒率がコントロール群の非治癒率よりも有意に低かったことから、Ｍ細胞がより良好な治療傾向を示し、皮膚損傷を十分に治療し、皮膚損傷の治癒を加速させ得たことを示している。Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡを分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。 本発明の実施例１３におけるＨＥ染色及びマッソン染色を示す図である。ＨＥ染色の結果により、Ｍ細胞群における創傷治癒がコントロール群よりも良好であることが明らかになった。Ｍ細胞群は完全な治癒を示した、すなわち、表皮が完全に治癒したのに対して、コントロール群における創傷の表皮の中央部分はまだ完全には治癒していなかった。マッソン染色の結果により、コントロール群においては、呈色がより暗色であり、より多くのコラーゲンの沈着を伴うことが明らかになったことから、重度の線維症を示しており、一方で、Ｍ細胞治療群においては、呈色は薄く、コラーゲンの沈着がより少なく、線維化の程度はコントロール群よりも低かった。Ｍ細胞及びマトリゲルを用いた移植治療後に、ラットの皮膚損傷の創傷回復速度が加速され、組織切片により線維症がより少ないことが明らかになった。 本発明の実施例１４における精巣の光学顕微鏡写真を示す図である。２０日目の試料の結果により、Ｍ細胞の移植後に、ラットの精巣が大幅に回復したことが明らかになったのに対して、モデル群の精巣は明らかな萎縮を示し、精嚢はより小さくなった。 本発明の実施例１４における左精巣対右精巣の重量比を示す図である。Ｍ細胞群は、モデル群よりも有意に高い左精巣対右精巣の比率を有し、より多くの精子を産生し、不健康な精子はより少なかった。Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡを分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。 本発明の実施例１４における精巣のＨＥ染色写真を示す図である。ＨＥ染色の結果により、Ｍ細胞移植群のラットにおいては、精巣精細管の壁にセルトリ細胞が見られ、尿細管腔の中央に細胞が形成され、細管腔内に多数の生殖細胞が見られることが明らかになったのに対して、モデル群においては、精細管内にはセルトリ細胞しかなく、新しい細胞は形成されなかった。これにより、Ｍ細胞が無精子症ラットの精巣に対して良好な保護効果を有し、これがラット精巣の回復を助け、生殖細胞に対して保護効果を有することが明らかになった。 本発明の実施例１５におけるラットの初期癲癇発作潜時の統計を示す図である。ラットにおける初期癲癇発作潜時の統計についての総観察時間は３０分であった。正常なコントロール群と比較して、溶剤群の初期癲癇発作潜時は有意に短縮され、有意差（^＊ｐ＜０．０５）を有し、溶剤群の初期癲癇発作潜時は９２．２秒であり、Ｍ細胞群の初期癲癇発作潜時は４２９．５秒であり、時間が有意に延長されたことから、Ｍ細胞が癲癇発作を遅延させ得たことを示している。 本発明の実施例１５におけるラットの初期癲癇発作グレードの統計を示す図である。Ｍ細胞群は発作のグレードをグレード３からグレード２に下方調節したことから、Ｍ細胞が癲癇発作を緩和し得たことを示している。 本発明の実施例１５におけるラットの初期癲癇発作グレードの統計を示す図である。Ｍ細胞の尾静脈注射は癲癇発作のグレードを有意に低下させたことから、Ｍ細胞が癲癇発作を緩和し得たことを示している（図１２８Ａ）。本発明の実施例１５におけるラットの大発作潜時の統計を示す図である（図１２８Ｂ）。 本発明の実施例１５におけるラットの大発作の割合の統計を示す図である。Ｍ細胞の尾静脈注射は大発作の割合を大幅に減少させ、溶剤群と比較して、その割合が４３．３％減少したことから、Ｍ細胞が大発作の頻度を大幅に減少させ得たことを示している。 本発明の実施例１６における２８日目のマウスの背面写真を示す図である。２８日目に試料を採取したときに、ＢＬＭ群においては、ＢＬＭ注射部位の皮膚が肥厚化し、硬化し、その弾力性が悪くなったのに対して、Ｍ細胞注射群においては、マウスの皮膚は正常群の皮膚により近く、硬化症は発生しなかったことから、Ｍ細胞が硬化症及び皮膚肥厚化の発生を減らすことができ、強皮症に対して効果的な治療効果を有したことを示している。 本発明の実施例１６におけるマウス皮膚のＨＥ染色写真を示す図である。ＢＬＭ群においては、真皮が大幅に肥厚化し、毛包の数が大幅に減少したことが分かったのに対して、Ｍ細胞治療群においては、ＢＬＭ群と比較してより多くの毛包があり、真皮がより薄く、大幅な改善が示されたことから、これにより、Ｍ細胞治療が強皮症の症状を十分に緩和することができ、強皮症に対して効果的な治療効果を有することが示された。 本発明の実施例１６におけるマウス皮膚のマッソン染色写真を示す図である。正常群と比較して、ＢＬＭ群においては、コラーゲン線維が大幅に太くなり肥大し、明らかな線維症が発生し、真皮が大幅に肥厚化し、脂肪層が大幅に薄くなり、皮膚付属器が減少したのに対して、Ｍ細胞での治療後に、コラーゲン線維の蓄積は減少し、皮膚の真皮が明らかに薄くなり、脂肪層は薄くならず、正常な皮膚付属器が観察された。これにより、Ｍ細胞がマウスにおける強皮症を十分に治療し得ることが示された。 本発明の実施例１７におけるモデリング後の種々の時点での皮膚創傷の光学顕微鏡写真を示す図であり、ここでは、Ｍ細胞群における創傷はモデル群における創傷よりも小さかった。 本発明の実施例１７における図１３３の創傷の面積サイズの統計を示す図であり、統計にはＩｍａｇｅ Ｊを使用した。２１日目及び２８日目に、Ｍ細胞群の創傷面積はモデル群の創傷面積よりも有意に小さく、統計的差異があったことから、Ｍ細胞治療が創傷治癒を加速させ得たことを示している。Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡを分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。 本発明の実施例１７における創傷の非治癒率を示す図である。Ｍ細胞治療群における非治癒創傷の割合はモデル群における割合よりも有意に低く、統計的差異があったことから、Ｍ細胞が創傷治癒を加速することができ、皮膚損傷に対して良好な治療効果を有したことを示している。 本発明の実施例１８における貧血症モデルラットの体重変化の動向を示す図である。シスプラチン注射後３日目に、ラットの体重は増加を止めて減少し始めたが、シスプラチン注射の６日後に体重が最小まで減少した後に、ゆっくりと増加した。実験の終わりに、コントロール群におけるラットの体重は、溶剤群及びＭ細胞治療群におけるラットの体重よりも有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。７日目から２１日目まで、Ｍ細胞治療群におけるラットの体重は溶剤群におけるラットの体重よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。上記結果により、ラットにおけるシスプラチンに誘発された貧血症の後に、Ｍ細胞が貧血症モデルラットにおける体重を向上させ得ることが明らかになった。 本発明の実施例１８におけるシスプラチンに誘発された貧血症モデルラットの末梢血中の白血球の総数の分析を示す図である。シスプラチン注射後２１日目に、シスプラチン＋溶剤群のラットの血液中の白血球の総数は、コントロール群の総数よりも有意に少なかった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果により、モデルラットが貧血症の症状を有することが明らかになったことから、モデルを構築することに成功したことを示している。シスプラチン＋Ｍ細胞治療群におけるラットの白血球の総数は、シスプラチン＋溶剤群における総数よりも有意に多く（Ｐ＜０．０５）、コントロール群＋溶剤と比較して有意差はなかった。上記結果により、Ｍ細胞が貧血症モデルラットにおいて明確な治療効果を有することが明らかになった。 本発明の実施例１８におけるシスプラチンに誘発された貧血症モデルラットの末梢血中の赤血球の総数の分析を示す図である。シスプラチン注射後２１日目に、シスプラチン＋溶剤群のラットの血液中の赤血球の総数は、コントロール群の総数よりも有意に少なかった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果により、モデルラットが貧血症の症状を有することが明らかになったことから、モデルを構築することに成功したことを示している。シスプラチン＋Ｍ細胞治療群におけるラットの赤血球の総数は、シスプラチン＋溶剤群における総数よりも有意に多かった（Ｐ＜０．０５）。上記結果により、Ｍ細胞が貧血症モデルラットにおいて明確な治療効果を有することが明らかになった。 本発明の実施例１８におけるシスプラチンに誘発された貧血症モデルラットの末梢血中のヘモグロビン含有量の分析を示す図である。シスプラチン注射後２１日目に、シスプラチン＋溶剤群のラットの血液中のヘモグロビン含有量は、コントロール群のヘモグロビン含有量よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果により、モデルラットが貧血症の症状を有することが明らかになったことから、モデルを構築することに成功したことを示している。シスプラチン＋Ｍ細胞治療群におけるヘモグロビン含有量は、シスプラチン＋溶剤群におけるヘモグロビン含有量よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。上記結果により、Ｍ細胞が貧血症モデルラットにおいて明確な治療効果を有することが明らかになった。 本発明の実施例１８におけるシスプラチンに誘発された貧血症モデルラットの末梢血のヘマトクリットの分析を示す図である。シスプラチン注射後２１日目に、シスプラチン＋溶剤群におけるラットの血液のヘマトクリットは、コントロール群におけるヘマトクリットよりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果により、モデルラットが貧血症の症状を有することが明らかになったことから、モデルを構築することに成功したことを示している。シスプラチン＋Ｍ細胞治療群のヘマトクリットは、シスプラチン＋溶剤群のヘマトクリットよりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。上記結果により、Ｍ細胞が貧血症モデルラットにおいて明確な治療効果を有することが明らかになった。 本発明の実施例１８におけるシスプラチンに誘発された貧血症モデルラットの末梢血の平均ヘモグロビン濃度の分析を示す図である。シスプラチン注射後２１日目に、シスプラチン＋溶剤群におけるラットの血液の平均ヘモグロビン濃度は、コントロール群における平均ヘモグロビン濃度よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果により、モデルラットが貧血症の症状を有することが明らかになったことから、モデルを構築することに成功したことを示している。シスプラチン＋Ｍ細胞治療群における平均ヘモグロビン濃度は、シスプラチン＋溶剤群における平均ヘモグロビン濃度よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。上記結果により、Ｍ細胞が貧血症モデルラットにおいて明確な治療効果を有することが明らかになった。 本発明の実施例１８におけるシスプラチンに誘発された貧血症モデルラットの末梢血の赤血球容積分布幅の分析を示す図である。シスプラチン注射後２１日目に、シスプラチン＋溶剤群におけるラットの血液の赤血球分布幅は、コントロール群における赤血球分布幅よりも有意に小さかった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果により、モデルラットが貧血症の症状を有することが明らかになったことから、モデルを構築することに成功したことを示している。シスプラチン＋Ｍ細胞治療群における赤血球容積分布幅は、シスプラチン＋溶剤群における赤血球容積分布幅よりも有意に大きかった（Ｐ＜０．０５）。上記結果により、Ｍ細胞が貧血症モデルラットにおいて明確な治療効果を有することが明らかになった。 本発明の実施例１８におけるシスプラチンに誘発された貧血症モデルラットのラットの末梢血中のヘモグロビン含有量の分析を示す図である。シスプラチン注射後２１日目に、シスプラチン＋溶剤群におけるラットの血液中のヘモグロビン含有量は、コントロール群におけるヘモグロビン含有量よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果により、モデルラットが貧血症の症状を有することが明らかになったことから、モデルを構築することに成功したことを示している。シスプラチン＋Ｍ細胞治療群におけるヘモグロビン含有量は、シスプラチン＋溶剤群におけるヘモグロビン含有量よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。上記結果により、Ｍ細胞が貧血症モデルラットにおいて明確な治療効果を有することが明らかになった。 本発明の実施例１９における超音波検査法により測定された各群の肺動脈血流加速時間を示す図である。 本発明の実施例１９における超音波検査法により測定された各群における肺動脈の内径を示す図である。 本発明の実施例１９における超音波検査法により測定された各群における右心室対左心室の内径比を示す図である。 本発明の実施例１９における超音波検査法により測定された各群における平均肺動脈圧を示す図である。 本発明の実施例１９の各群におけるパラフィン切片のＨＥ染色の結果を示す図である。 本発明の実施例２０のラットのＢＢＢスコアを示す図である。Ｍ細胞の静脈内注射後に、ラットのＢＢＢスコアは有意に増加し、Ｍ細胞治療群のＢＢＢスコアはモデル群のＢＢＢスコアよりも常に高かったことから、Ｍ細胞が脊髄損傷後のラットの運動能力を改善することができ、脊髄損傷に対する治療効果を有したことを示している。Ｍ細胞治療群のＢＢＢスコアは、モデル群のＢＢＢスコアに対して有意差を有する。Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡを分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。 本発明の実施例２１における３時間後、２４時間後、及び７２時間後のｍＮＳＳ行動スコアを示す図である。Ｍ細胞の静脈内注射により、手術後３時間以内、手術後２４時間以内（１２．６７対１０．３３）、及び手術後７２時間以内（６．３３対５．３３）にｍＮＳＳスコアが低下したことから、Ｍ細胞が脳卒中ラットの行動を改善し得たことを示している。 本発明の実施例２１における７２時間後のラットの脳梗塞面積の統計を示す図である。Ｍ細胞の静脈内注射により、溶剤群と比較して、手術後３時間以内に脳組織の梗塞サイズが６．０５％減少したことから、Ｍ細胞が脳組織壊死の程度を低下させたことを示している。 本発明の実施例２１における７２時間後のラットの脳組織の含水量の統計を示す図である。Ｍ細胞の静脈内注射により、溶剤群と比較して、手術後３時間以内に脳組織の含水量が２％減少したことから（８２．９４対８０．４９）、Ｍ細胞が脳組織浮腫の程度を低下させたことを示している。 本発明の実施例２２のラットの眼の光学写真を示す図である。ＮａＯＨ群及びコラーゲン群と比較して、Ｍ細胞群におけるラットの角膜混濁はより低く、瞳孔が見て取れ、新生血管がより少なかったことから、これにより、Ｍ細胞がラットにおける角膜アルカロイド火傷（alkaloid burn）に対して良好な治療効果を有することが確認された。 本発明の実施例２２のラットの角膜混濁スコアを示す図である。図１５３における角膜混濁スコアの統計によれば、Ｍ細胞治療群におけるラットの角膜混濁はより低く、２１日目には角膜は透明であり、瞳孔が見て取れ、スコアはより低く、統計的差異があったことから、Ｍ細胞治療により明らかな効果が見られたことを示している。Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡを分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。 本発明の実施例２２におけるラットの眼球の写真を示す図である。ラットの試料から、Ｍ細胞治療群の眼球は正常群の眼球により近く、液の蓄積及び溢血は見られないことが判明した。これにより、Ｍ細胞が角膜アルカリ火傷動物モデルの炎症を軽減し、角膜アルカリ損傷の回復を促進し得ることが明らかになった。 本発明の実施例２３における種々の日のマウスの背面写真を示す図である。Ｍ細胞治療群においては、マウスがより少ない鱗屑及びより少ない発疹を示したことから、Ｍ細胞が乾癬マウスの症状を十分に緩和することができ、乾癬に対する効果的な治療効果を有したことを示している。 本発明の実施例２３のＨＥ染色写真を示す図である。イミキモド群及びＩＭＱ群と比較して、Ｍ細胞治療後のマウスの角質層はより薄かったことから、Ｍ細胞治療がマウスの皮膚微小環境を改善し、炎症を抑制し得たことを示しており、そしてＩＭＱ群と比較してより多くの皮膚付属器が存在したことから、Ｍ細胞が皮膚付属器を保護することができ、乾癬に対して良好な治療効果を有したことを示している。 本発明の実施例２４においてマウスがプラットフォームを横切った総回数の統計を示す図である。正常なコントロール群の横切る総回数は１回であったのに対して、正常なコントロール群と比較して、溶剤群におけるマウスが横切る総回数は０回であり、有意差（^＊ｐ＜０．０５）を有し、Ｍ細胞群におけるマウスが横切る総回数は０．６６回であり、これは溶剤群の総回数よりも有意に多かったことから、Ｍ細胞がマウスにおける空間学習及び記憶能力を効果的に改善し得たことを示している。 本発明の実施例２４においてマウスがプラットフォームに初めて到達した時間の統計を示す図である。溶剤群と比較して、Ｍ細胞群のラットが滞留する時間は有意に短縮されたことから（３８．０秒対５９．８秒）、Ｍ細胞がマウスの空間学習及び記憶能力を効果的に改善し得たことを示している。 ラット関節の光学顕微鏡写真を示す図である。モデル群の関節表面は粗く潰瘍化しており、関節周囲に骨棘が形成されたのに対して、Ｍ細胞治療群の関節は或る程度回復した。これにより、Ｍ細胞治療が関節炎の症状を和らげることでき、関節炎を非常に十分に治療し得ることが明らかになった。 投与後１０日目の骨折モデルラットの左後肢ＣＴ画像を示す図である。これらの結果により、Ｍ細胞治療群における骨損傷の治癒がモデル群における治癒よりも良好な動向を示すことが明らかになった。 投与後２２日目の骨折モデルラットの左後肢ＣＴ画像を示す図である。これらの結果により、Ｍ細胞治療群における骨損傷の治癒はモデル群と比較して明らかな利点を有し、骨損傷面積がより小さいことが明らかになったことから、Ｍ細胞移植が骨損傷の治癒を加速することができ、Ｍ細胞が骨損傷に対して良好な治療効果を有したことを示している。 投与後５０日目の骨折モデルラットの左後肢ＣＴ画像を示す図である。これらの結果により、Ｍ細胞移植治療群における骨損傷部位は完全に治癒したのに対して、モデル群はまだ完全には治癒していないことが明らかになった。これにより、Ｍ細胞が骨損傷を非常に十分に治療し得ることが明らかになった。 鼻炎モデルマウスにおけるくしゃみの統計を示す図である。Ｍ細胞治療後に、マウスにおけるくしゃみの回数は有意に減少したことから、Ｍ細胞が鼻炎の症状の緩和に対して良好な治療効果を有したことを示している。 鼻炎モデルマウスにおける鼻掻きの統計を示す図である。Ｍ細胞治療後に、マウスにおける鼻掻きの回数は有意に減少したことから、Ｍ細胞が鼻炎症状の緩和に対して良好な治療効果を有したことを示している。 出発材料としてｉＰＳを用いて形成された胚様体、並びにＰ０世代及びＰ５世代のＭ細胞の細胞形態を示す図である。 ｉＰＳ－ＭＳＣ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。 ｉＰＳ－ＭＳＣ細胞におけるＭＭＰ１発現のｑＰＣＲ検出を示す図である。 ｉＰＳ－ＭＳＣ細胞におけるＰＧＥ２発現のｑＰＣＲ検出を示す図である。 ＧＶＨＤ動物モデルの各群におけるマウスの重量変化率の統計的グラフを示す図である。コントロール群とＧＶＨＤ群との間で生存率において有意差があった（^＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＧＶＨＤ群とＧＶＨＤ＋高用量Ｍ細胞治療群との間で生存率において有意差があった（^＊＊ｐ＜０．０１）。 ＧＶＨＤ動物モデルの各群におけるマウスの生存率の統計的グラフを示す図である。ＧＶＨＤ＋高用量Ｍ細胞群における骨髄キメラ率はＧＶＨＤ群における骨髄キメラ率よりも有意に低かったことから（^＊ｐ＜０．０５）、Ｍ細胞が骨髄へのｈＰＢＭＣの浸潤を減少させることによりＧＶＨＤを緩和したことを示している。 ＧＶＨＤ動物モデルの各群におけるマウスの骨髄キメラ率の統計的グラフを示す図である。１４日目に、腸、腎臓、肝臓、及び肺を採取してパラフィン切片にし、ＨＥ染色を行った。これらの結果により、ＧＶＨＤ＋低／高用量Ｍ細胞群の腸陰窩構造がＧＶＨＤ群の腸陰窩構造よりも有意に良好であり、より完全な腸陰窩構造を有することが明らかになった。ＧＶＨＤ＋低／高用量Ｍ細胞群における様々な器官への炎症細胞の浸潤は、ＧＶＨＤ群における浸潤よりも有意に少なく、Ｍ細胞が、炎症を抑制し、組織構造の完全性を維持する機能を有していたことを示している。 ＧＶＨＤ動物モデルの各群におけるマウス器官のＨＥ染色図を示す図である。これらの結果により、ＧＶＨＤ＋低／高用量Ｍ細胞群の腸陰窩構造がＧＶＨＤ群の腸陰窩構造よりも大幅により良好であり、より完全な腸陰窩構造を有することが明らかになった。ＧＶＨＤ＋低／高用量Ｍ細胞群における様々な器官への炎症細胞の浸潤は、ＧＶＨＤ群における浸潤よりも大幅に少なく、Ｍ細胞が、炎症を抑制し、組織構造の完全性を維持する機能を有していたことを示している。これらの結果により、Ｍ細胞がＧＶＨＤマウスにおける炎症及び組織損傷を軽減し得ることが明らかになった。 早発卵巣不全を伴うマウスにおけるＭ細胞の注射後に、それらの性ホルモンレベル、体重、及び卵巣重量が有意に回復することを示す図である。 早発卵巣不全を伴うマウスにおけるＭ細胞の注射後に、排卵が有意に回復することを示す図である。 腎線維症モデルの各群におけるマウスの体重の統計を示す図である。各時点での偽手術群の体重は、手術＋溶剤群の体重よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。１２日目及び１４日目での手術＋Ｍ細胞治療群の体重は、それぞれ手術＋溶剤群の体重よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。１２日目及び１４日目では、偽手術群と手術＋Ｍ細胞治療群との間で体重に有意差はなかった。上記結果により、Ｍ細胞治療群が腎線維症マウスの体重に対して有意な促進効果を有することが明らかになった。 腎線維症モデルの各群におけるマウスの尿中微量アルブミンの統計を示す図である。１４日目での種々の群のマウスの尿中微量アルブミン値の統計を行った。手術＋溶剤群の尿中微量アルブミン値は、偽手術群の尿中微量アルブミン値よりも有意に高かったことから（^＊、Ｐ＜０．０５）、モデルを構築することに成功したことを示している。Ｍ細胞治療群の尿中微量アルブミン含有量は、偽手術群の尿中微量アルブミン含有量と有意差がなかったが、溶剤群の尿中微量アルブミン含有量よりも有意に低かったことから（^＃、Ｐ＜０．０５）、Ｍ細胞が腎線維症に対して或る特定の治療効果を有したことを示している（Ｐ＜０．０５）。 腎線維症モデルの各群におけるマウスの尿中クレアチニン含有量の統計を示す図である。１４日目での種々の群のマウスの尿クレアチニン含有量値の統計を行った。手術＋溶剤群の尿クレアチニン値は、偽手術群の尿クレアチニン値よりも有意に高かったことから（^＊、Ｐ＜０．０５）、モデルを構築することに成功したことを示している。Ｍ細胞治療群の尿中クレアチニン含有量は、偽手術群の尿中クレアチニン含有量と有意差がなかったが、溶剤群の尿中クレアチニン含有量よりも有意に低かったことから（^＃、Ｐ＜０．０５）、Ｍ細胞が腎線維症に対して或る特定の治療効果を有したことを示している。 腎線維症モデルにおけるマウスの各群での尿素含有量の統計的グラフを示す図である。１４日目での種々の群のマウスの尿素含有量値の統計を行った。手術＋溶剤群の尿素値は、偽手術群の尿素値よりも有意に高かったことから（^＊＊、Ｐ＜０．０１）、モデルを構築することに成功したことを示している。Ｍ細胞治療群の尿素含有量は偽手術群の尿素含有量よりも有意に高く（^＊、Ｐ＜０．０５）、溶剤群と比較して減少傾向を示したが、有意差はなかったことから、Ｍ細胞が腎線維症について或る特定の治療傾向を有したことを示している。 腎線維症モデルにおけるマウスの各群での尿酸含有量の統計を示す図である。１４日目での種々の群のマウスの尿酸含有量値の統計を行った。手術＋溶剤群の尿酸値は、偽手術群の尿酸値よりも有意に高かったことから（^＊、Ｐ＜０．０５）、モデルを構築することに成功したことを示している。Ｍ細胞治療群の尿酸含有量は溶剤群の尿酸含有量よりも有意に低かったことから（^＃、Ｐ＜０．０５）、Ｍ細胞が腎線維症に対して或る程度の治療効果を有したことを示している。 腎線維症モデルの各群におけるマウスの腎臓のＨＥ染色を示す図である。１４日目に種々の群のマウスから試料を採取し、得られた腎臓を包埋して切片化した後に、ＨＥ染色した。その中で、Ｇ１は偽手術群であり、Ｇ２は手術＋溶剤群であり、Ｇ３は手術＋Ｍ細胞群であった。左腎臓は手術される腎臓であり、右腎臓は手術せずにコントロールとして使用した。この図から、Ｇ２群におけるマウスの基本的な腎臓構造は失われ、多数の線維芽細胞が増殖し、Ｇ３群におけるマウスの腎臓構造は或る程度改善し、腎臓尿細管萎縮は緩和し、炎症因子の浸潤及び線維芽細胞の増殖は減少し、壊死領域は或る程度減少することが分かった。 腎線維症モデルの各群におけるマウスの腎臓のマッソン染色を示す図である。１４日目に種々の群のマウスから試料を採取し、得られた腎臓を包埋して切片化した後に、マッソン染色した。その中で、Ｇ１は偽手術群であり、Ｇ２は手術＋溶剤群であり、Ｇ３は手術＋Ｍ細胞群であった。左腎臓は手術される腎臓であり、右腎臓は手術せずにコントロールとして使用した。この図から、Ｇ１群の腎臓組織においては明らかなコラーゲン沈着は見られず、Ｇ２群においてはシート状の陽性領域が青色に染色され、これらが殆ど腎細管の周囲に分布していることから、多数のコラーゲン線維が腎間質に沈着したことを示しており、Ｇ３群におけるラットの腎臓組織の青色の領域は大幅に減少し、色が明るくなることが分かった。上記結果により、Ｍ細胞が腎線維症のマウスモデルにおいて抑制効果を示し、腎構造を改善し、コラーゲン沈着を減少させ、腎線維症の進行を遅延させることが実証された。 腎線維症モデルの各群におけるマウスの腎臓の免疫組織化学的染色を示す図である。１４日目に種々の群のマウスから試料を採取し、得られた腎臓にα－ＳＭＡ及びＣＤ３１についての免疫組織化学的染色を行った。その中で、Ｇ１は偽手術群であり、Ｇ２は手術＋溶剤群であり、Ｇ３は手術＋Ｍ細胞群であった。左腎臓は手術される腎臓であり、右腎臓は手術せずにコントロールとして使用した。内皮間葉移行（ＥｎｄｏＭＴ）は、損傷した腎臓において筋線維芽細胞を生成するのに重要なメカニズムである。ＥｎｄｏＭＴとは、内皮細胞がそれらの係留接続及び極性機能を失い、その後に侵入性が高く移動性の細長い紡錘形の間葉系細胞へと変形する過程を指し、内皮細胞は、形態及び極性だけでなく生化学的特性の点で変化し、特徴的なマーカーＣＤ３１等を喪失するが、間葉系細胞マーカーであるα平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）を回復し、それにより生存可能な間葉系細胞へと転換する。この図から、Ｇ１群の左腎臓と比較して、Ｇ２群の腎臓組織におけるα－ＳＭＡの発現が１４日目に増加し、ＣＤ３１の発現は大幅に変化しないことが分かったことから、マウスを腎線維症モデルに発達させる構築に成功したことを示している。１４日目に、Ｇ３群の左腎臓におけるα－ＳＭＡの発現がＧ２群の発現よりも低く、ＣＤ３１の発現はより高かった。 アポモルフィンに誘発されたパーキンソンモデルラットにおける回転数の統計を示す図である。アポモルフィンに誘発されたラットの回転数の統計を、それぞれ３週目及び７週目に行った。７週目では、Ｍ細胞群の回転数は溶剤群の回転数よりも有意に少なかったことから（２４０．５対３６０．５）、Ｍ細胞がドーパミン作動性除神経を緩和し、パーキンソン病の重症度を改善し得たことを示している。 強制水泳に誘発されたマウス鬱病モデルの各群におけるマウスの体重を示す図である。 強制水泳に誘発されたマウス鬱病モデルの各群におけるマウスの強制水泳の間の無動時間を示す図である。 種々の日における皮膚炎モデルマウスの背面写真を示す図である。Ｍ細胞治療群においては、マウスの発疹の重症度はより軽く、皮膚病変は和らいだ。Ｍ細胞が皮膚炎マウスの症状を十分に和らげ、皮膚炎に対して効果的な治療効果を有することが明らかになった。 皮膚炎モデルマウスのＨＥ染色写真を示す図である。ＯＶＡ群と比較して、Ｍ細胞治療後のマウスの角質層がより薄く、脂肪層がより厚かったことから、Ｍ細胞治療がマウスの皮膚微小環境を改善し、炎症を抑制し得たことを示しており、そしてＯＶＡ群よりも多くの皮膚付属器が存在したことから、Ｍ細胞が皮膚付属器を保護することができ、アトピー性皮膚炎に対して良好な治療効果を有したことを示している。 ＬＰＳに誘発された神経炎症を伴うマウスの脳組織におけるＩＬ－１β含有量（ｐｇ／ｍｌ）の統計結果を示す図である。ＩＬ－１βは炎症を促進し、炎症誘発性因子である。溶剤群の脳組織におけるＩＬ－１βの含有量は、正常群の含有量よりも大幅に高かった。溶剤群と比較して、Ｍ細胞群におけるＩＬ－１βの含有量は減少傾向を示した。 ＬＰＳに誘発された神経炎症を伴うマウスの脳組織におけるＩＬ－６（ｐｇ／ｍｇ）の統計結果を示す図である。正常群と比較して、溶剤群の脳組織におけるＩＬ－６の含有量は大幅に増加した。ＩＬ－６は炎症を促進し、炎症誘発性因子である。溶剤群と比較して、Ｍ細胞群におけるＩＬ－６の含有量は減少傾向を示した。 ＬＰＳに誘発された神経炎症を伴うマウスの脳組織におけるＩＬ－１０（ｐｇ／ｍｇ）の統計を示す図である。ＩＬ－１０は炎症の発生を抑制し、抗炎症因子である。Ｍ細胞群の脳組織におけるＩＬ－１０の濃度は溶剤群の濃度よりも大幅に高かったことから（２．０対２．７）、Ｍ細胞が抗炎症効果を有したことを示している。 半月板損傷を伴う被験体における平均ＶＡＳスコアの傾向チャートを示す図である。２つの用量群のＶＡＳスコアは上下に変動したが、全体としては下降傾向を示した。つまり、試験薬の注射を受けた後に、被験体の膝痛は或る程度和らいだ。 半月板損傷を伴う被験体における平均リスホルムスコアの傾向チャートを示す図である。２つの用量群における被験体が試験薬の注射を受けた後に、リスホルムスコアの合計は上昇傾向を示した。単一の評価結果によれば、試験薬の注射後のスコア値の増加は主に跛行、ロッキング、及び疼痛に現れた。他の単一の評価において、スコアに大きな変化はなかった。したがって、被験体が試験薬の注射を受けた後に、主に跛行、ロッキング、及び疼痛の緩和において、リスホルムスコアにおける幾らかの改善が見られた。 半月板損傷を伴う被験体のＭＲＩ画像を示す図である。Ｍ細胞治療の前に、半月板損傷及び激しい膝関節痛が見られた。Ｍ細胞調製物の関節内移植の３ヶ月後に、半月板損傷は完全に回復し、膝関節痛スコアは８ポイントから２ポイントに変化し、局所浮腫は緩和されたことから、Ｍ細胞の関節内移植が半月板損傷を効果的に治療し得たことを示している。 血中のＡＬＴ含有量の統計を示す図である。血中ＡＬＴ含有量の結果により、溶剤群のＡＬＴが正常なコントロール群のＡＬＴと比較して大幅に増加するのに対して（５８対９８７）、Ｍ細胞群は溶剤群と比較して大幅に減少したＡＬＴ含有量を有することが明らかになった。 血中のＡＳＴ含有量の統計を示す図である。溶剤群のＡＳＴは正常なコントロール群と比較して大幅に増加したのに対して（８１対８１２）、Ｍ細胞群は溶剤群と比較して大幅に減少したＡＳＴ含有量を有した（４７３対８１２）。 肝臓におけるＴＧ含有量の統計を示す図である。肝臓におけるＴＧ含有量の統計により、溶剤群のマウスの肝臓におけるＴＧ濃度が正常群におけるＴＧ濃度よりも有意に高く（８２．６対４．８）（^＊＊＊ｐ＜０．００１）、Ｍ細胞群は溶剤群と比較して４９μｍｏｌ／ｇまで減少したＴＧ濃度を有し、有意差（^＊＊ｐ＜０．０１）があることが明らかになった。 ＡＲＤＳ患者における血中酸素飽和度を示す図である。 Ｍ細胞の注入前（左）及び注入後（右）のＡＲＤＳ患者の胸部ＣＴを示す図である。１回目の細胞注入の前に、患者の胸部ＣＴには、両方の肺に複数のパッチ、シート状のすりガラス状陰影、及び高密度の影（黄色の矢印）が示された。患者がＭ細胞の２回目の注入（間隔は６日であった）を受けた後の２日目に、ＣＴにより病変の吸収が改善したことが示され、１回目の注入の１ヶ月後に、ＣＴにより病変が正常に戻り、線維症が見られないことが示された。 ＡＲＤＳ患者におけるＩＬ－１ＲＡレベルの変化を示す図である。１回目の注入後の８日目に、抗炎症性サイトカインのＩＬ－１ＲＡのレベルが上昇した。 ＡＲＤＳ患者におけるＲＡＮＴＥＳレベルの変化を示す図である。１回目の注入後の８日目に、抗炎症性サイトカインのＲＡＮＴＥＳのレベルが上昇した。 ＡＲＤＳ患者におけるＩＬ－１αレベルの変化を示す図である。１回目の注入後の８日目に、ＩＬ－１α炎症誘発性細胞が大幅に減少した。 ＡＲＤＳ患者におけるＩＬ－１βレベルの変化を示す図である。ＩＬ－１β炎症誘発性細胞は大幅に減少した。 ＡＲＤＳ患者におけるＩＬ－５レベルの変化を示す図である。ＩＬ－５炎症誘発性細胞は大幅に減少した。 ＡＲＤＳ患者におけるＩＬ－８レベルの変化を示す図である。ＩＬ－８炎症誘発性細胞は大幅に減少した。 ＡＲＤＳ患者におけるＩＬ－２５レベルの変化を示す図である。ＩＬ－２５炎症誘発性細胞は大幅に減少した。 ＡＲＤＳ患者におけるＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０レベルの変化を示す図である。ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０炎症誘発性細胞は大幅に減少した。 Ｍ細胞の注入後のＩＰＦ患者の胸部ＣＴ画像を示す図である。Ｍ細胞の注入前に、患者の胸部ＣＴには、複数のパッチ、シート状のすりガラス状陰影、及び高密度の影（矢印により示される）が示された。患者がＭ細胞の注入を受けた後に、ＣＴにより全ての患者において病変の吸収が改善することが示され、注入の１ヶ月後に、ＣＴにより病変が基本的に正常に戻ることが示された。５０日後に、肺線維症は全ての患者において大幅に吸収され、改善した。 心筋虚血－再灌流モデルにおける心臓ＬＶＥＤＰ（ｍｍＨｇ）の統計結果を示す図である。 心筋虚血－再灌流モデルにおける血中ＬＤＨ（Ｕ／Ｌ）含有量の統計結果を示す図である。 心筋虚血－再灌流モデルにおける血中ＣＫ（Ｕ／Ｌ）含有量の統計結果を示す図である。 腎摘出術モデルにおける種々の群のラットの体重の統計結果を示す図である。 実施例４６の各群における血清抗二本鎖ＤＮＡ抗体レベルの検出結果のグラフを示す図である。 実施例４３における塵肺症モデルマウスの肺組織のＨＥ染色の結果を示す図である。 ＭＺＪ注射液２を用いた凍結保存後のＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。 ＭＺＪ注射液３を用いた凍結保存後のＭ細胞の細胞生存率アッセイの結果を示す図である。

配列情報
本発明に関係する部分配列の情報を以下の表１に示す。

本発明を以下の実施例を参照して更に説明するが、これらの実施例は本発明を例示することを意図するものであって、限定するものではない。

特段の指示がない限り、実施例において記載される実験及び方法は、本質的に、当該技術分野において既知であり、様々な参考文献に記載される従来の方法に従って行われた。実施例において具体的な条件が示されていない場合は、これは、従来の条件又は製造元によって提案される条件に従って行われる。製造元の指示なしに使用される試薬又は機器は、市場から入手され得る従来の製品である。当業者によれば、実施例は本発明を例として説明するものであって、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解される。本明細書において挙げられる全ての出版物及びその他の参考文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。

調製例１：ヒト胚性幹細胞由来Ｍ細胞の調製
１．１ 胚様体（ＥＢ）の作製
ａ．当初の培養培地を除去した後に、ＰＢＳで洗浄した。
ｂ．ディスパーゼを使用して、ヒト胚性幹細胞（Ｑ－ＣＴＳ－ｈＥＳＣ－２、国立幹細胞リソースバンク）を消化した。
ｃ．酵素溶液を廃棄し、１ｍｌのＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２を加え、ピペットをプレートに垂直に保持することにより、井桁状に配置して線を引いた。
ｄ．ピペットチップを湿らせた後に、６ウェルプレート中の液体をピペット操作して、１５ｍｌの遠心分離チューブに移して遠心分離した。
ｅ．遠心分離後の上清を除去し、細胞を培養ディッシュにおいて少量のＥＢ培養培地で再懸濁し、低付着性培養ディッシュ（Corning：カタログ番号３２６２）に加え、３７℃のインキュベーター内で培養した。

ＥＢ培養培地（第１の培養培地）の調製：１０％（容量／容量）のＫＯＳＲ、１％（容量／容量）のＮＥＡＡ（すなわち、０．１ｍＭ）、１％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ（すなわち、２ｍＭ）、８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び０．１％（容量／容量）のβ－メルカプトエタノールをＫＯ－ＤＭＥＭに添加した。

１．２ ＥＢスフェアの接着培養
ａ．６ウェルプレートにおいてビトロネクチンをコーティングした。
ｂ．ＭＳＣ培養培地を３７℃に予熱した。
ｃ．１．１において得られた全てのＥＢスフェアを５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、５分～１０分間静置した。
ｄ．コーティングされたマトリックスを吸い出し、２ｍｌのＭＳＣ培養培地を加えた。
ｅ．上清を除去し、１ｍＬのＭＳＣ培養培地を取ってＥＢスフェアを再懸濁し、ＥＢスフェアを培養プレートのウェルに加えた。
ｆ．よく振盪した後に、インキュベーター内で培養を行った。

培養培地を約１４日まで毎日交換し、ＭＳＣを継代した。

Ｍ細胞培養培地（第２の培養培地）の調製：１％（容量／容量）のＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇ、５％（容量／容量）のＫＯＳＲ、１％（容量／容量）のＮＥＡＡ、１％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、５μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβをα－ＭＥＭに加えた。

１．３ ＭＳＣの継代
ａ．上記ＭＳＣ培養培地を３７℃に予熱した。
ｂ．当初の培養培地を除去し、室温に置いたＰＢＳを加えて１回洗浄した。
ｃ．トリプシンを加えた後に、それをインキュベーター内に入れて、２分～３分間のインキュベーション及び消化を行った。
ｄ．細胞がディッシュの壁から落ちたら、消化液と同量のＰＢＳを加えて消化を止めた。
ｅ．細胞が分散するまで細胞を優しくピペッティングした。
ｆ．細胞懸濁液を収集し、遠心分離チューブ中で遠心分離し、上清を廃棄した。
ｇ．ＭＳＣ培養培地を新しい培養ディッシュに加え、細胞を新しい培養ディッシュに接種し、第５世代を、その後の操作（例えば、細胞療法）、又はＣｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０による凍結保存に使用した。

上記で調製されたＭ細胞はｈＥＳＣ－Ｍ細胞とも呼ばれ得る。

上記の工程に関係する試薬は以下の通りであった：

比較例１：ヒト胚性幹細胞由来間葉系幹細胞の調製
この例においては、Hwang NS et al. Proc Natl Acad Sci US A. 2008 Dec 30;105(52):20641 to 6に従って間葉系幹細胞を調製した。

１．ＥＢの培養
１．１ ＥＢ培養培地の調製
ＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１５％のＦＢＳ＋５％のＫＯＳＲ＋２ｍＭのＮＥＡＡ＋２ｍＭのグルタミン＋０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール。

１．２ ＥＢの形成
１．２．１ 当初の培養培地を除去し、１ｍＬのＰＢＳを加えて洗浄した。
１．２．２ １ｍＬのディスパーゼを加えて、３分～１０分間消化した。
１．２．３ 酵素溶液を廃棄し、１ｍｌのＫＯＤＭＥＭを加え、ピペットをプレートに垂直に保持することにより、井桁状に配置して線を引いた。
１．２．４ ピペットチップを湿らせ、６ウェルプレート中の液体をピペット操作して、遠心分離チューブに移して遠心分離した。
１．２．５ 上清を廃棄し、細胞をＥＢ培地で再懸濁し、１０ｃｍの低付着性培養ディッシュ（Corning：カタログ番号３２６２）に加え、３７℃のインキュベーター内で培養した。
１．２．６ 培養培地を１０日目まで２日ごとに交換した。

２．ＥＢ－Ｍ細胞の培養
２．１ ＥＢ－Ｍ細胞の培養
２．１．１ ６ウェルプレートを１ｍｇ／ｍｌのゼラチンで予備コーティングした。
２．１．２ 全てのＥＢスフェアを５０ｍＬの遠心分離チューブに移し、５分～１０分間静置した。
２．１．３ ＥＢスフェアが沈降した後に、上清をポンプで排出し、１ｍＬのＥＢ培養培地を取って再懸濁し、ゼラチンで覆われた６ウェルプレートに接種を行った。
２．１．４ これをインキュベーター内に入れた。
２．１．５ 培養培地を１０日目まで２日ごとに交換した。

３．Ｍ細胞の培養
３．１ Ｍ細胞培養培地の調製
ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋２ｍＭのグルタミン。

３．２ Ｍ細胞の継代
３．２．１ 細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで洗浄し、１ｍＬのトリプシンを加え、３７℃で約３分間消化を行い、ディッシュの壁を軽く叩いて細胞を剥がし、１ｍＬのＤＰＢＳを加えて消化を止めた。
３．２．２ 細胞を収集し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
３．２．３ 上清を廃棄し、Ｍ細胞を５ｍＬの培養培地で再懸濁し、細胞をセルシーブ（cell sieve）で濾過し、計数した。
３．２．４ ２×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の密度で１０ｃｍの培養ディッシュに接種を行い、これをＭ Ｐ１として示した。
３．２．５ ＭＳＣを同様の方法によって第５世代まで継代し、その後の操作を行った。

上記の工程に関係する試薬は以下の通りであった：
ＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Gibco、１０８２９０１８）
ＦＢＳ（Gibco、１６００００４４）
ＫＯＳＲ（Thermo、１０８２８０２８）
ＮＥＡＡ（Gibco、１１１４００５０）
グルタミン（Gibco、Ａ１２８６００１）
β－メルカプトエタノール（Invitrogen、２１９８５－０２３）
ＰＢＳ（Gibco、Ｃ１００１０５００ＢＴ）
ディスパーゼ（Gibco、１７１０５０４１）
トリプシン（Gibco、２５２０００７２）

比較例２：初代間葉系幹細胞の調製
１．臍帯をＰＢＳ中に浸漬し、氷上で実験室に輸送した。
２．臍帯を約３ｃｍの小片に切断し、表面から血液がなくなるまでＰＢＳで洗浄した。
３．臍帯の３本の血管を除去した。
４．血管を除去した後に、眼科用ハサミを用いて臍帯を小さな組織片に切断した。
５．組織片を１０ｃｍのディッシュに付着させ、各組織片をディッシュの各部分に均等に隔離した。
６．ディッシュを逆さまにしてＣＯ_２インキュベーター内に一晩置いた。
７．２日目に、各ディッシュを直立に置き、５ｍＬの培養培地を加え、ＣＯ_２インキュベーター内に入れて培養した。
８．液を１日置きに交換し、細胞は約１０日以内に這い出して見えることとなった。
９．細胞の約７０％が這い出たときに継代を行った。

実施例１－１：Ｍ細胞の表面マーカーの検出
調製例１において得られたＭ細胞の表面タンパク質の発現をフローサイトメトリーによって検出した：

１．培養上清を廃棄し、ＰＢＳを加えることにより１回洗浄を行い、トリプシンを加えることにより３分～５分間消化を行い、ＰＢＳを加えることにより消化を止めた。
２．細胞懸濁液を収集し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
３．上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、セルシーブを通して濾過して細胞クラスターを除去し、計数し、チューブ当たり２×１０^６個の細胞で小分けにした。
４．遠心分離を１２００ｒｐｍで３分間行った。
５．２％のＢＳＡブロッキング溶液で２０分間ブロッキングした後に、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った。
６．上清を廃棄し、細胞を１００μＬの１％ＢＳＡ抗体希釈液で再懸濁し、直接標識抗体を加え、室温で３０分～４５分間インキュベートした。
７．１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄を行い、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
８．３００μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁した後に、細胞を４０μｍのセルシーブを用いて濾過した後に、ロードして検出した。

上記の工程に関係する抗体情報は以下の通りであった：

検出結果を図１に示した。初代ＭＳＣ及び従来技術の方法によって得られたＭＳＣと比較して、調製例１において得られたＭ細胞は、表面マーカー：ＣＤ１０５、ＣＤ２４、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ２７４、及びＣＤ３１に関して有意差を有した。

実施例１－２：Ｍ細胞におけるサイトカイン発現レベルの検出
調製例１のＭ細胞のサイトカイン発現レベルをリアルタイムＰＣＲによって決定した。

１．細胞ＲＮＡの抽出
抽出にはＲＮＡ抽出キットを使用し、具体的な手順は以下の通りであった：

（１）１ｍｌ当たり１０μＬのβ－メルカプトエタノールをＲＬ溶解液に加え、細胞の量に応じて細胞を氷上で溶解した。
（２）溶解した液体をＣＳカラムに移し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
（３）１容量の７０％エタノールを濾液に加え、よく混ぜてＣＲ３に移し、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
（４）濾液を廃棄し、３５０μＬのＲＷ１をＣＲ３に加え、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った。
（５）濾液を廃棄し、８０μＬのＤＮアーゼＩ作業溶液をＣＲ３に加え、室温で１５分間静置した。
（６）ＣＲ３に３５０μＬのＲＷ１を加え、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った。
（７）濾液を廃棄し、５００μＬのＲＷをＣＲ３に加え、室温で２分間静置し、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った。
（８）工程（７）を繰り返した。
（９）濾液を廃棄し、液体を一切加えずに１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行って、残留すすぎ液を除去した。
（１０）ＣＲ３を新しい遠心分離チューブに移し、空気中で乾燥させて残留アルコールを除去し、３０μＬのＲＮアーゼフリー水を加え、室温で２分間静置し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してＲＮＡを得た。
（１１）ＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ ＵＶ分光光度計で測定した。
（１２）それを直接ｃＤＮＡ合成又は－８０℃の冷蔵庫内での短期貯蔵に供した。

２．ｃＤＮＡの逆転写
逆転写キットを使用して一本鎖ｃＤＮＡを合成し、具体的な手順は以下の通りであった：

（１）オリゴｄｔプライマー、ｄＮＴＰ混合物、ＲＮＡテンプレート、及び水を加えた後に、６５℃で５分間反応を行った。１０μＬの反応系は以下の通りであった：

（２）工程（１）における反応が完了した後に、それを直ちに氷に入れた。逆転写の増幅反応を４２℃で６０分間、７０℃で１５分間行った。

（３）反応が完了した後に、それを直ちに氷に入れ、４℃の冷蔵庫において短時間貯蔵した。

３．リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＣＲ）
ｑＰＣＲにはTOYOBOのリアルタイムＰＣＲキットを使用し、１０μＬの反応系を以下の通りに調製した：

反応プログラム：９５℃で１分間の予備変性、９５℃で１５秒間の変性、６０℃で４５秒間のアニーリング及び伸長、４０サイクル；解離曲線。示された結果は３回の反復実験の平均値であった。

４．必要とされる試薬の情報：
ＲＮＡ抽出キット（Tiangen、ＤＰ４３０）、ｃＤＮＡ逆転写キット（TAKARA、６１１０Ａ）、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲキット（TOYOBO、ＱＰＳ－２０１）。関係するプライマー情報は以下の通りであった：

検出結果を図２Ａ～図２Ｄに示した。これらの結果により、調製例１のＭ細胞におけるＭＭＰ１の相対的発現レベルが１０３．３０１４であり、比較例１のＭＳＣにおけるＭＭＰ１の相対的発現レベルが１．１５１２５３であることが明らかになった。本発明の方法によって得られたＭ細胞のＭＭＰ１発現レベルは有意に増加したことが分かり、その発現レベルは、従来技術の方法によって得られたＭＳＣのほぼ９０倍であった。ＭＭＰ１は、ゼラチン、フィブロネクチン、コラーゲン、ムチン、及びラミニンを含む様々な結合組織成分を分解し得るタンパク質分解酵素の一種である。研究により、ＭＭＰ１が線維症において重要な役割を果たすことが確認されている。したがって、本発明の間葉系幹細胞は、肝臓線維症、肺線維症等の治療においてより良好な活性を有することが期待され得る。

実施例１－３：ｉＰＳＣ由来Ｍ細胞の調製及びその特性評価の特定
（Ａ）胚様体（ＥＢ）の作製
胚様体（ＥＢ）を、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）から調製例１．１と同じ方法を使用して調製した。ここで、ＥＢ培養培地（第１の培養培地）は、ＫＯ－ＤＭＥＭ＋２０％のＫＯＳＲ＋１％のＮＥＡＡ＋１％のグルタミン＋５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦであった。

（２）ＥＢスフェアの接着培養
ＥＢスフェアを、ＶＮでコーティングされた６ウェルプレートにおいて、Ｍ細胞培養培地（第２の培養培地）：１％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、５％（容量／容量）のＫＯＳＲ、１％（容量／容量）のＮＥＡＡ、１％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβを添加したα－ＭＥＭ中で培養した。培養培地を１４日目まで２日ごとに交換した。

（３）Ｍ細胞の継代
Ｔｒｙｐｌｅを用いて消化を行い、ＭＳＣ培養培地を新しいディッシュに加え、細胞を新しいディッシュに接種し、第５世代を、その後の操作（例えば、細胞療法）、又はＣｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０を使用する凍結保存に使用した。

上記で必要とされる試薬の情報は以下の通りであった：
ＶＮ（Gibco、Ａ１４７００）、α－ＭＥＭ（Gibco、１２５６１－０４９）、ＫＯ－ＤＭＥＭ（Gibco、Ａ１２８６１－０１）、ＫＯＳＲ（Gibco、Ａ３０２０９０２）、ＮＥＡＡ（Gibco、１１１４００５０）、グルタミン（Gibco、Ａ１２８６００１）、Ｕｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ（Pall、１５９５０－０１７）、ＤＰＢＳ（Gibco、Ａ１２８５８０１）、ディスパーゼ（Gibco、１７１０５０４１）、Ｔｒｙｐｌｅ（Gibco、Ａ１２８５９０１）、ｂＦＧＦ（RD、２３３－ＦＢ）、ＴＧＦβ（RD、２４０－Ｂ）。

上記方法によって得られた細胞は、ｉｐｓ－Ｍ細胞とも呼ばれ得る。

（４）細胞形態の観察
図１６６は、胚様体並びにＰ０世代及びＰ５世代のｉｐｓ－Ｍ細胞の細胞形態を示す。これらの結果により、正常な形態を有するＭ細胞が得られたことが明らかになった。

（５）フローサイトメトリーによって検出されたＭ細胞の陽性及び陰性の表面マーカー
ｉｐｓ－Ｍ細胞の表面マーカーの発現をフローサイトメトリーによって決定した。具体的な方法は実施例１－１に示されている。ｉｐｓ－Ｍ細胞についての陽性及び陰性の表面マーカーの結果は、調製例１からのＭ細胞と殆ど同様であった（図１６７）。

（６）ｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２及びＭＭＰ１の発現
ＰＧＥ２及びＭＭＰ１の発現をｑＰＣＲによって決定した。具体的な方法は実施例１－２に示されている。ｉｐｓ－Ｍ細胞におけるＭＭＰ１の発現レベルは、初代間葉系幹細胞における発現レベルよりも１０倍超高かった（図１６８）。ＰＧＥ２のｑＰＣＲの結果を図１６９に示した。

実施例２：種々の培養培地の範囲において調製されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来するＭ細胞及びそれらの特性の決定
１．細胞調製
１．ＥＢ培養
１．１ ＥＢ培養培地の調製
（１）ＫＯ－ＤＭＥＭ＋２０％のＫＯＳＲ＋１％のＮＥＡＡ＋１％のグルタミン＋５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、又は、
（２）以下に記載される特定の区分けに従って配合する。

１．２ ＥＢの配合物
１．２．１ 当初の培養液をポンプで排出し、１ｍＬのＤＰＢＳを加えて洗浄した。
１．２．２ １ｍＬのディスパーゼを添加することにより３分間消化を行った（クローン集塊の辺縁が捲縮した）（これは消化が完了したことを示している）。
１．２．３ 酵素溶液を廃棄し、１ｍＬのＫＯ－ＤＭＥＭを加え、５ｍＬの遠心分離チューブをプレートに垂直に保持することにより、井桁状に配置して線を引いた。
１．２．４ ピペットチップを湿らせ、６ウェルプレート中の液体をピペット操作して、１５ｍＬの遠心分離チューブに移し、８００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
１．２．５ 上清を廃棄し、細胞をＥＢ培養培地で再懸濁した後に、１０ｃｍの低付着性培養ディッシュに移し、３７℃のインキュベーター内で培養した。
１．２．６ 培養培地を５日目まで毎日交換した。

２．ＥＢ－ＭＳＣの培養
２．１ ＥＢ－ＭＳＣの培養
２．１．１ ６ウェルプレートを１ｍｇ／ｍｌのＶＮで予備コーティングした。
２．１．２ 全てのＥＢスフェアを１５ｍＬの遠心分離チューブに移し、５分～１０分間静置した。
２．１．３ ＥＢスフェアが沈降した後に、上清をポンプで除去し、１ｍＬのＥＢ培養培地を取ってそれらを再懸濁し、約１０個のＥＢスフェアを各ウェルに加え、ＶＮで覆った６ウェルプレートに接種した。
２．１．４ 「８の字法」でよく振盪した後に、それをインキュベーター内に入れた。
２．１．５ 培養培地を１４日目まで２日ごとに交換した。

３．Ｍ細胞の培養
３．１ Ｍ細胞培養培地の調製
（１）Ｍ細胞培養培地の調製：１％（容量／容量）のＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇ、５％（容量／容量）のＫＯＳＲ、１％（容量／容量）のＮＥＡＡ、１％（容量／容量）のＧｌｕｔａＭＡＸ、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβをα－ＭＥＭに加え、又は、
（２）以下に記載される特定の区分けに従って配合する。

３．２ Ｍ細胞の継代
３．２．１ 細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで洗浄し、１ｍＬのＴｒｙｐｌｅを加えることにより３７℃で約３分間消化を行い、ディッシュの壁を僅かに叩いて細胞を剥がし、１ｍＬのＤＰＢＳを加えて消化を止めた。
３．２．２ 細胞を収集し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
３．２．３ 上清を廃棄し、細胞を５ｍＬのＭ細胞培養培地中に再懸濁し、細胞を７０μｍのセルシーブで濾過し、計数した。
３．２．４ 細胞を２×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の密度で１０ｃｍの培養容器に接種し、これをＭ細胞Ｐ１として記録した。
３．２．５ 同じ方法に従って、Ｍ細胞を第５世代まで継代して検出した。

４．上記で必要とされる試薬の情報
ＶＮ（Gibco、Ａ１４７００）
α－ＭＥＭ（Gibco、１２５６１－０４９）
ＫＯ－ＤＭＥＭ（Gibco、Ａ１２８６１－０１）
ＫＯＳＲ（Gibco、Ａ３０２０９０２）
ＮＥＡＡ（Gibco、１１１４００５０）
グルタミン（Gibco、Ａ１２８６００１）
Ｕｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ（Pall、１５９５０－０１７）
ＤＰＢＳ（Gibco、Ａ１２８５８０１）
ディスパーゼ（Gibco、１７１０５０４１）
Ｔｒｙｐｌｅ（Gibco、Ａ１２８５９０１）
ｂＦＧＦ（RD、２３３－ＦＢ）
ＴＧＦβ（RD、２４０－Ｂ）
ＥＧＦ（Solarbio、Ｐ０００３３）
ＰＤＧＦ（Solarbio、Ｐ０００３１）
ＶＥＧＦ（Solarbio、Ｐ０００６３）
アスコルビン酸（Selleck、Ｓｅｌｌｅｃｋ）

５．上記で必要とされる機器の情報

２．Ｍ細胞の表面タンパク質のフローサイトメトリー検出
１．培養上清を廃棄し、ＰＢＳで洗浄を行い、Ｔｒｙｐｌｅを加えて消化を３分間行い、ＤＰＢＳを加えて止めた。
２．細胞懸濁液を収集し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
３．上清を廃棄し、細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁し、４０μｍのセルシーブを通して濾過して細胞クラスターを除去し、計数し、チューブ当たり２×１０^６個の細胞で小分けにした。
４．遠心分離を１２００ｒｐｍで３分間行った。
５．２％のＢＳＡブロッキング溶液で２０分間ブロッキングした後に、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った。
６．上清を廃棄し、細胞を１００μＬの１％ＢＳＡ抗体希釈液で再懸濁し、直接標識抗体を加え、室温で３０分～４５分間インキュベートした。
７．１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した後に、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
８．３００μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁した後に、細胞を４０μｍのセルシーブを用いて濾過し、ロードして検出した。
９．必要とされる抗体の情報は以下の通りであった：

１０．必要とされる機器の情報

３．リアルタイムＰＣＲ
３．１．細胞ＲＮＡの抽出
抽出にはＲＮＡ抽出キットを使用し、具体的な手順は以下の通りであった：

１．１ｍｌのＲＬ溶解液当たり１０μＬのβ－メルカプトエタノールを加え、細胞の量に応じて細胞を氷上で溶解した。
２．溶解後の液体をＣＳカラムに移し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
３．１容量の７０％エタノールを濾液に加え、よく混ぜてＣＲ３に移し、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．濾液を廃棄し、３５０μＬのＲＷ１をＣＲ３に加え、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った。
５．濾液を廃棄し、８０μＬのＤＮアーゼＩ作業溶液をＣＲ３に加え、室温で１５分間静置した。
６．ＣＲ３に３５０μＬのＲＷ１を加え、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った。
７．濾液を廃棄し、５００μＬのＲＷをＣＲ３に加え、室温で２分間静置し、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った。
８．工程７を繰り返した。
９．濾液を廃棄し、液体を一切加えずに１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行って、残留すすぎ液を除去した。
１０．ＣＲ３を新しい遠心分離チューブに移し、空気中で乾燥させて残留アルコールを除去し、３０μＬのＲＮアーゼフリー水を加え、室温で２分間静置し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してＲＮＡを得た。
１１．ＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ ＵＶ分光光度計で測定した。
１２．それを直接ｃＤＮＡ合成又は－８０℃の冷蔵庫内での短期貯蔵に供した。

３．２ ｃＤＮＡの逆転写
逆転写キットを使用して一本鎖ｃＤＮＡを合成し、具体的な手順は以下の通りであった：

１．オリゴｄｔプライマー、ｄＮＴＰ混合物、ＲＮＡテンプレート、及び水を加えた後に、６５℃で５分間反応を行い、１０μＬの反応系は以下の通りであった：

２．工程１における反応が完了した後に、それを直ちに氷に入れた。逆転写の増幅反応を４２℃で６０分間、７０℃で１５分間行った。

３．反応が完了した後に、それを直ちに氷に入れ、４℃の冷蔵庫において短時間貯蔵した。

３．３ リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＣＲ）
ｑＰＣＲにはTOYOBOのリアルタイムＰＣＲキットを使用し、１０μＬの反応系を以下の通りに調製した：

反応プログラム：９５℃で１分間の予備変性、９５℃で１５秒間の変性、６０℃で４５秒間のアニーリング及び伸長、４０サイクル；解離曲線。

３．４ 必要とされる試薬の情報：
ＲＮＡ抽出キット（Tiangen、ＤＰ４３０）、ｃＤＮＡ逆転写キット（TAKARA、６１１０Ａ）、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲキット（TOYOBO、ＱＰＳ－２０１）。

必要とされるプライマー配列

３．５ 必要とされる機器の情報：

４．統計分析
Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡ及びｔ検定を分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

５．実験結果
（１）第１の培養培地の濃度範囲
１．第１の培養培地：濃度を以下の通りに設定した。

２．手順：胚様体を上述の５つの培養培地を使用して懸濁培養した後に、Ｍ細胞培養培地を使用してＭ細胞を培養し、第５世代まで継代した後に検出を行った。

３．細胞形態の観察
全ての配合物からＥＢスフェアを得た。接着後に細胞が這い出した。第５世代まで継代すると、接着成長及び紡錘形状を伴うＭ細胞が形成された。配合物３は、ＥＢスフェアの形成において他の配合物とは異なっていたが、正常な形態を有するＭ細胞が得られた（図５）。

４．Ｍ細胞の陽性及び陰性の表面マーカーについてのフローサイトメトリー
種々の配合物を用いて調製されたＭ細胞の陽性及び陰性の表面マーカーの結果は、調製例１のＭ細胞の結果と殆ど同様であった（図６～図１０、表２－２）。

５．ｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２及びＭＭＰ１の発現
第１の培養培地の配合物１～配合物５についてのＭＭＰ１の発現レベルは、初代間葉系幹細胞の発現レベルの１０倍超であった（図１１、表２－３）。ＰＧＥ２のｑＰＣＲの結果を図１２及び表２－４に示した。

（２）第１の培養培地におけるＮＥＡＡの濃度範囲
１．第１の培養培地におけるＮＥＡＡ濃度設定
ＮＥＡＡ濃度についての濃度勾配を以下の通りに設定した：

２．手順：上述の５種の配合物を胚様体の懸濁培養に使用し、次にＭ細胞培養培地を用いてＭ細胞を培養し、第５世代まで継代した後に検出した。

３．形態学的観察
全ての配合物からＥＢスフェアを得た。接着後に細胞が這い出した。第５世代まで継代すると、接着成長及び紡錘形状を伴うＭ細胞が形成された。ＥＢスフェアが形成されたときに、配合物５において幾らかの死細胞が見られたが、正常な形態を有するＭ細胞が得られた（図１３）。

４．Ｍ細胞の陽性及び陰性の表面マーカーについてのフローサイトメトリー
フローサイトメトリーの結果により、検出された指標の殆どが、調製例１のＭ細胞の指標と類似していることが明らかになった（表２－６、図１４～図１８）。

５．ｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２及びＭＭＰ１の発現
第１の培養培地の配合物１～配合物５を用いて製造されたＭ細胞のＭＭＰ１発現レベルは、全てが初代間葉系幹細胞の発現レベルの１０倍超であった（表２－７、図１９）。ＰＧＥ２の検出結果を表２－８及び図２０に示した。

（３）第２の培養培地の濃度範囲
１．第２の培養培地における各成分の濃度範囲

２．手順：ＥＢ培地を用いて胚様体を懸濁培養し、次に上記の１１種の配合物を使用してＭ細胞を培養し、第５世代まで継代した後に試験した。

３．形態学的観察
配合物３（全ての成分が最高濃度）における細胞は死んで、培養することができず、他の配合物によって接着成長及び紡錘形のＭ細胞を得ることができた（図２１）。

４．Ｍ細胞の陽性及び陰性の表面マーカーについてのフローサイトメトリー
フローサイトメトリーの結果により、検出されたＭ細胞の陽性及び陰性の表面マーカーの結果が基本的に調製例１のＭ細胞の結果と類似していることが明らかになった（表２－１０、図２２～図２５）。

５．ｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２及びＭＭＰ１の発現
ＭＭＰ１については、殆どの配合物におけるＭＭＰ１の発現レベルは、初代間葉系幹細胞の発現レベルの１０倍超であった（表２－１１、図２６）。ＰＧＥ２の検出結果を表２－１２及び図２７に示した。

（４）第２の培養培地の濃度範囲
１．第２の培養培地の各成分の濃度を以下の表に従って設定する。

２．手順：ＥＢ培地を用いて胚様体を懸濁培養し、次に上述の５種の配合物を使用してＭ細胞を培養し、第５世代まで継代した後に検出した。

３．細胞形態の観察
配合物３－２（最高濃度のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ）及び配合物３－５（最高濃度のアスコルビン酸）については、全ての細胞がアポトーシスを起こしたのに対して、他の配合物については、接着成長及び紡錘形のＭ細胞が得られた（図２８）。

４．Ｍ細胞の陽性及び陰性の表面マーカーについてのフローサイトメトリー
検出されたＭ細胞の陽性及び陰性の表面マーカーの結果は、殆どが調製例１のＭ細胞の結果と類似していた（表２－１４、図２９～図３１）。

５．ｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２及びＭＭＰ１の発現
ＭＭＰ１に関しては、全ての配合物についてのそのレベルは、初代間葉系幹細胞のレベルよりも１０倍超高かった（表２－１５、図３２）。ＰＧＥ２の結果を表２－１６及び図３３に示した。

（５）第２の培養培地の濃度範囲
１．（４）における配合物３－２及び配合物３－５に基づいて、Ｕｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ及びアスコルビン酸の濃度勾配を更に設定した。

２．手順：ＥＢ培地を用いて胚様体を懸濁培養し、次に上述の７種の配合物を使用してＭＳＣ細胞を培養し、第５世代まで継代した後に検出した。

３．細胞形態の観察
配合物３－２－１、配合物３－５－１、配合物３－５－２、及び配合物３－５－３の細胞は全てアポトーシスを起こした。配合物３－２－２の少数の細胞が生存し、これらの細胞はゆっくりと成長した。他の全ての配合物については、接着成長及び紡錘体形状のＭ細胞が得られた（図３４）。

４．Ｍ細胞の陽性及び陰性の表面マーカーについてのフローサイトメトリー
フローサイトメトリーの結果により、検出されたＭ細胞の陽性及び陰性の表面マーカーの結果が調製例１のＭ細胞の結果と類似していることが明らかになった（表２－１８、図３５、図３６）。

５．ｑＰＣＲによって検出されたＰＧＥ２及びＭＭＰ１の発現
ＭＭＰ１に関しては、全ての配合物についてのそのレベルは、初代間葉系幹細胞のレベルよりも１０倍超高かった（表２－１９、図３７）。ＰＧＥ２の結果を表２－２０及び図３８に示した。

特段の指定がない限り、以下の実施例において使用されるＭ細胞は、調製例１における方法によって調製した。

実施例３：Ｍ細胞をスプレーするスプレーシステム
Ｍ細胞の調製及び培養：ＥＢスフェアとしての懸濁した胚性幹細胞を接着分化させてＰ０世代のＭ細胞を得て、これを継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生し、消化し、継代し、Ｐ５をその後の実験用に使用した。

１．スプレー法：Ｐ５世代のＭ細胞をＭ細胞培養培地（第２の培養培地）中で再懸濁し、密度が８×１０^４個の細胞／ｍｌになるように調整し、スプレーペンでスプレーした。ここで、ポンプの圧力は１０ｋＰａ未満に調整され、孔径は０．８ｍｍであり、細胞は１０ｃｍのディッシュ上にスプレーされた。Ｍ細胞をスプレーする装置を図３９に示した。

スプレー後に、細胞を９６ウェル培養プレートにおいて１ウェル当たり８０００個の細胞で接種した。コントロールとして、Ｍ細胞を９６ウェルプレートにおいて同じ密度でスプレーによらずに接種した。スプレー前後のＭ細胞の増殖能をＣＣＫ８キットにより１日置きに検出した。

２．ＣＣＫ８の検出法：
（１）細胞懸濁液を調製し、計数した。
（２）細胞懸濁液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり約１００μｌで接種し、１つの試料について３回繰り返した。
（３）培養プレートをインキュベーター内に入れて、一定時間前培養（３７℃、５％ＣＯ_２）を行い、４時間以内に細胞が壁に接着した。
（４）各ウェルに１０μｌのＣＣＫ－８溶液を加え、試料を加える過程で気泡の発生を避けるよう試みた。
（５）培養プレートをインキュベーター内に入れ、２時間インキュベートした。
（６）マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度値（ＯＤ）を測定した。

３．細胞損傷の検出：ＬＤＨキット法（Biyuntian、Ｃ００１７）
４．Ｍ細胞の表面タンパク質のフローサイトメトリー検出
（１）培養上清を廃棄し、ＰＢＳで１回洗浄を行い、Ｔｒｙｐｌｅを加えて消化を３分間行い、ＤＰＢＳを加えて消化を止めた。
（２）細胞懸濁液を収集し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁し、４０μｍのセルシーブを用いて濾過して細胞クラスターを除去し、計数し、チューブ当たり２×１０^６個の細胞で小分けにした。
（４）遠心分離を１２００ｒｐｍで３分間行った。
（５）２％のＢＳＡブロッキング溶液で２０分間ブロッキングした後に、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った。
（６）上清を廃棄し、細胞を１００μＬの１％ＢＳＡ抗体希釈液で再懸濁した後、直接標識抗体を加え、室温で３０分～４５分間インキュベートした。
（７）１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄を行い、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った後、上清を廃棄した。
（８）３００μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁した後に、細胞を４０μｍのセルシーブを用いて濾過した後に、ロードして検出した。
（９）必要とされる抗体の情報は以下の通りであった：

必要とされる機器の情報

５．サスペンションチップ（suspension chip）システムによる炎症因子の検出：
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。４８種の因子のキットを炎症因子の検出に使用した。
（２）凍結保存した細胞上清を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上に置いた。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を細胞培養上清に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランク、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

上記で使用された多因子のサスペンションチップシステムは、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ（商標）２００（Bio-Rad）であった。

６．細胞生存率の検出：（血球計算盤法）Ｔ／ＣＳＣＢ ０００２－２０２０「ヒト胚性幹細胞」から
（１）細胞懸濁液の調製
試験される細胞を収集し、リン酸緩衝液と配合して細胞懸濁液を得て、適切な濃度に希釈した。各１ｍｍ^２平方での細胞数は、２０個～５０個の細胞であるべきである。２００個を超える細胞の場合に希釈が必要であった。

（２）細胞染色
トリパンブルー染色液と細胞懸濁液とを１：１の容量比でよく混ぜた。

（３）細胞計数
血球計算盤の計数チャンバーにカバースリップを置き、１０μＬの混合物を取り、計数チャンバーの一方の側のカバースリップ端に滴下し、別の１０μＬの混合物を取り、計数チャンバーのもう一方の側のカバースリップ端に滴下し、こうして、混合物はカバースリップと計数プレートとの間に充填された。３０秒間静置した後に、計数プレートを顕微鏡下に置き、染色された細胞及び細胞の総数をそれぞれ計数した。

１６×２５サイズの計数チャンバーの場合には、対角位置による左上、右上、左下、及び右下に１ｍｍ^２の４つの中グリッド（すなわち、１００個の小グリッド）を計数のために採用した。２５×１６サイズの計数チャンバーの場合には、対角位置による左上、右上、左下、右下、及び中央に５つの中グリッド（すなわち、８０個の小グリッド）を計数のために採用した。大グリッドの線上で細胞に出くわした場合に、一般に、大グリッドの上側及び左側の線上の細胞のみ（又は下側及び右側の線上の細胞のみ）を計数した。

（４）計算及び分析
細胞生存率を式（Ｉ）に従って計算した：
Ｓ＝（Ｍ－Ｄ）／Ｍ×１００％ （Ｉ）
式（Ｉ）中：
Ｓ：細胞生存率
Ｍ：細胞の総数
Ｄ：染色された細胞の数

細胞生存率は２つの試料の平均であった。２回の計数の生細胞比の平均を計算し、平均細胞生存率として記録した。使用した顕微鏡はＤＭｉ１（Leica）であった。

細胞内ＬＤＨの含有量を検出することにより、細胞損傷の程度を判断した。スプレーされた細胞とスプレーされていない細胞との間で細胞損傷の程度に差がないことが判明した。スプレーされた細胞及びスプレーされていない細胞のマーカータンパク質の発現をフローサイトメトリーによって検出したところ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ２９等のＭ細胞特異的マーカーに差がないことが判明した。スプレーされた細胞及びスプレーされていない細胞の免疫調節因子の分泌レベルを検出した結果、ＩＤＯ及びＩＬ１ＲＡ等に差がないことが明らかになった。スプレーされた細胞とスプレーされていない細胞との間で生存率に差はなかった。細胞はスプレー後に正常な形態を有し、それらの増殖能はスプレーされていない細胞の増殖能と大きな差はなかった。図４０は、スプレー前後のＣＣＫ８法によって検出されたＭ細胞の増殖能の結果を示している。

実施例４：Ｍ細胞に使いやすい培養材料
調製例１の方法によって、ＧＦＰ標識胚性幹細胞を出発材料として使用することによってＥＢスフェアを得て、Ｐ０世代のＧＦＰ標識Ｍ細胞を接着分化によって更に得て、これを継代及びスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＧＦＰ標識Ｍ細胞を蘇生し、消化し、継代し、Ｐ５のＭ細胞をその後の実験用に使用した。

ＧＦＰ標識Ｍ細胞の密度を調整して高密度細胞懸濁液を形成し、これを材料に滴加し、２４時間後に培養培地を交換し、次に細胞成長を蛍光透視鏡下で観察した。

１．生／死キットを使用して検出した。
２．ＣＣＫ８検出法を採用し、その方法は実施例３に記載される通りであった。
３．フローサイトメトリーを使用してＭ細胞表面タンパク質を検出し、その方法は実施例３に記載される通りであった。
４．サスペンションチップシステムを使用して炎症因子を検出し、その方法は実施例３に記載される通りであった。
５．細胞生存率を検出し、その方法は実施例３に記載される通りであった。
６．走査型電子顕微鏡：１）細胞をグルタルアルデヒドで固定し、上清を廃棄し、ＰＢＳを添加することによりそれぞれ６分間、７分間、及び８分間で３回洗浄を行った。２）５０％のエタノールを加えて１４分間浸漬した。３）８５％のエタノールを加えて１４分間浸漬した。４）９５％のエタノールを加えて１５分間浸漬した。５）１００％のエタノールを加えて１５分間浸漬した。６）臨界点乾燥を行った。７）試料を金属プラットフォームに接着し、金の吹き付け処理を施した。８）走査型電子顕微鏡により観察を行った。

７．実験結果：
リング状のコラーゲン足場を５ｍｍ長の材料片に切断し、２４ウェルプレートに入れ、高密度細胞懸濁液（２×１０^６個のＧＦＰ標識Ｍ細胞を含む５０μｌ）を材料に滴加し、インキュベーター内で３７℃にて１時間培養した後に、１ｍｌのＧＦＰ標識Ｍ細胞培養培地を各ウェルに加えた。その後に毎日培養培地を交換し、１日目及び３日目に蛍光透視法で観察を行った。蛍光写真を図４１に示した。蛍光写真から、ＧＦＰ標識Ｍ細胞がコラーゲン材料によく付着して成長することが分かった。リング状のコラーゲン足場を、その後の脊髄損傷移植実験において使用することができた。

電界紡糸ゼラチン繊維を５ｍｍ×５ｍｍの材料に切断し、２４ウェルプレートに入れ、高密度細胞懸濁液（２×１０^６個のＧＦＰ標識Ｍ細胞を含む５０μｌ）を材料に滴加し、インキュベーター内で３７℃にて１時間培養した後に、１ｍｌのＧＦＰ標識Ｍ細胞培養培地を各ウェルに加えた。その後に毎日培養培地を交換し、１日目及び３日目に蛍光透視法で観察を行った。蛍光写真を図４２に示した。蛍光写真から、ＧＦＰ標識Ｍ細胞が電界紡糸ゼラチン繊維によく付着して成長することが分かった。細胞が負荷された電界紡糸ゼラチン繊維を、皮膚、角膜、粘膜等に対するその後の移植治療実験において使用することができた。

コラーゲン足場を５ｍｍ×５ｍｍの材料に切断し、２４ウェルプレートに入れ、高密度細胞懸濁液（２×１０^６個のＧＦＰ標識Ｍ細胞を含む５０μｌ）を材料に滴加し、インキュベーター内で３７℃にて１時間培養した後に、１ｍｌのＧＦＰ標識Ｍ細胞培養培地を各ウェルに加えた。その後に毎日培養培地を交換し、５日目、７日目及び９日目に蛍光透視法で観察を行った。蛍光写真を図４３に示した。蛍光写真から、ＧＦＰ標識Ｍ細胞がコラーゲン足場によく付着して成長することが分かった。細胞が負荷されたコラーゲン足場を、皮膚、角膜、粘膜等のその後の移植治療実験において使用することができた。

皮膚修復膜を５ｍｍ×５ｍｍの材料に切断し、２４ウェルプレートに入れ、高密度細胞懸濁液（２×１０^６個のＧＦＰ標識Ｍ細胞を含む５０μｌ）を材料に滴加し、インキュベーター内で３７℃にて１時間培養した後に、１ｍｌのＧＦＰ標識Ｍ細胞培養培地を各ウェルに加えた。その後に毎日培養培地を交換し、５日目、７日目及び９日目に蛍光透視法で観察を行った。蛍光写真を図４４に示した。蛍光写真から、ＧＦＰ標識Ｍ細胞が皮膚修復膜によく付着して成長することが分かった。細胞が負荷された皮膚修復膜を、皮膚、角膜、粘膜等のその後の移植治療実験において使用することができた。

それぞれ２％のコラーゲン＋１％のヒアルロン酸＋１％のアルギン酸ナトリウム、及び２％のコラーゲン＋２％のアルギン酸ナトリウムによる２つの混合ゲルを調製し、２４ウェルプレートに入れ、高密度細胞懸濁液（２×１０^６個のＧＦＰ標識Ｍ細胞を含む５０μｌ）をこれらの材料に滴加し、インキュベーター内で３７℃にて１時間培養した後に、１ｍｌのＧＦＰ標識Ｍ細胞培養培地を各ウェルに加えた。その後に毎日培養培地を交換し、５日目、７日目、及び９日目に蛍光透視法で観察を行った。蛍光写真を図４５に示した。蛍光写真から、ＧＦＰ標識Ｍ細胞が皮膚修復膜によく付着して成長することが分かった。細胞が負荷された皮膚修復膜を、皮膚、角膜、粘膜等のその後の移植治療実験において使用することができた。Ｍ細胞をゼラチンに接種した場合に、これらは正常に成長及び増殖し、正常な形態を有し、正常なレベルの特定のマーカータンパク質を発現し、そして正常なレベルの免疫調節因子を分泌することができた。

キトサン：キトサン足場上でのＭ細胞の増殖をＣＣＫ８キット法によって検出した結果、Ｍ細胞がキトサン上で正常に成長及び増殖し得ることが明らかになった。

Ｍ細胞をコラーゲン－キトサン混合足場に接種し、足場上での細胞の増殖をＣＣＫ８キット法により検出し、足場上での細胞の成長及び付着を走査型電子顕微鏡により観察した。これらの結果により、Ｍ細胞が正常に付着し、成長し、増殖し得ることが明らかになった。

Ｍ細胞をキトサン及びコラーゲン又はアルギン酸によって形成された高分子イオン複合体において培養したところ、Ｍ細胞が該複合体において成長することができ、該複合体は細胞培養過程の間に分解及び収縮しないことが判明した。この結果により、該複合体が組織工学にとって理想的な足場であり得ることが明らかになった。

アルギン酸ナトリウム：アルギン酸－ヒドロゲルミクロスフェアにおけるＭ細胞の成長状態を、ＣＣＫ８キットによる活性検出及び細胞生存率の検出によって詳細に調査した。これらの結果により、Ｍ細胞がアルギン酸ナトリウム上で成長することができ、接着細胞が紡錘状で繊維状の形態であり、骨、脂肪、及び軟骨に分化する能力を有することが明らかになった。

アルギン酸ナトリウム－キトサン：Ｍ細胞はこの複合材料上で成長することができた。細胞生存率のアッセイ後に、該細胞は高い生存率及び正常な形状を有することが判明した。

シルクフィブロイン：Ｍ細胞の成長に対するシルクフィブロインの効果を、生細胞計数法によって観察した。これらの結果により、Ｍ細胞がシルクフィブロイン上で正常に成長することができ、正常な成長及び増殖曲線を示すことが明らかになった。

セルロースポリ乳酸：Ｍ細胞をセルロースポリ乳酸足場に配合し、走査型電子顕微鏡及び蛍光電子顕微鏡によって細胞成長を観察した。これらの結果により、Ｍ細胞が該材料上で正常に成長し得ることが明らかになり、Ｍ細胞とこの材料との組合せは、生体組織工学用の足場材料として使用することが期待された。

トロポエラスチン：Ｍ細胞をトロポエラスチンに接種し、走査型電子顕微鏡及び蛍光電子顕微鏡によって観察したところ、Ｍ細胞がトロポエラスチン上で成長し得ることが判明した。

ヒアルロン酸：Ｍ細胞をヒアルロン酸材料に接種し、走査型電子顕微鏡及び蛍光電子顕微鏡によって観察したところ、Ｍ細胞がヒアルロン酸材料上で正常に成長し得ることが判明した。

上記結果により、コラーゲン足場、皮膚修復膜、アミノ化ゼラチン、キトサン、及び他の材料がＭ細胞を担持して成長させ、Ｍ細胞を十分に分化させ得ることが明らかになった。

実施例５：ヒト胚性幹細胞由来のＭ細胞のすぐに使用可能な注射剤の調製
この実施例は、操作が簡単で、Ｍ細胞を効果的に保存し得るヒト胚性幹細胞由来Ｍ細胞注射剤を効果的に保存する幾つかの調製方法を提供した。

実験過程及び方法：
Ｍ細胞をＰ５世代まで培養して回収し、細胞をＤＰＢＳで洗浄した後に、生理食塩水、５％のグルコース注射剤、乳酸ナトリウムリンゲル注射剤、複合電解質注射剤、２０％ＨＳＡ注射剤、及びスクシニル化ゼラチン注射剤でそれぞれ再懸濁し、細胞は３×１０^６個～６×１０^６個の細胞／ｍｌの細胞密度を有した。試料採取及び細胞生存率の検出後に、再懸濁した各細胞懸濁液を２本のチューブに分け、それぞれ室温及び４℃で貯蔵し、定期的に生存率検出を行って、細胞保存効果を決定した。

使用した試薬、消耗品、及び機器は以下の通りであった：

（Ｉ）生理食塩水中に再懸濁した細胞
１．実験手順：
（１）Ｐ５世代まで培養した細胞を回収し、トリパンブルーで染色して計数し、細胞の総数を推定した。
（２）１．５ｍｌの細胞懸濁液を取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、３ｍｌの生理食塩水を取って再懸濁を行った。
（４）細胞懸濁液をチューブ当たり約１．５ｍｌで２本のチューブに均等に分け、一方を室温（ＲＴ）に保ち、もう一方を４℃で貯蔵した。５０μｌ～１００μｌの細胞懸濁液の試料を貯蔵前に取り、トリパンブルーで染色し、細胞密度及び生存率の検出を行った。
（５）試料採取及び検出を、３時間、５時間、２４時間、４８時間の異なる時点で順番に行った。

２．実験結果：

細胞生存率の検出結果を図４６に示した。Ｍ細胞ペレットを生理食塩水中に再懸濁した後に、Ｍ細胞の生存率は室温で２４時間の範囲内で８０％より高く維持され、４℃では、Ｍ細胞の生存率は５時間の範囲内で８０％より高く維持され、室温の貯蔵条件下では細胞生存率は、４℃の貯蔵条件と比較してより良好であった。

（ＩＩ）乳酸ナトリウムリンゲル注射液中に再懸濁した細胞：
１．実験手順：
（１）Ｐ５世代まで培養した細胞を回収し、トリパンブルーで染色して計数し、細胞の総数を推定した。
（２）１．５ｍｌの細胞懸濁液を取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、３ｍｌの乳酸ナトリウムリンゲル注射液を取って再懸濁を行った。
（４）細胞懸濁液をチューブ当たり約１．５ｍｌで２本のチューブに均等に分け、一方を室温（ＲＴ）に保ち、もう一方を４℃で貯蔵した。５０μｌ～１００μｌの細胞懸濁液の試料を貯蔵前に取り、トリパンブルーで染色し、細胞密度及び生存率の検出を行った。
（５）試料採取及び検出を、３時間、５時間、２４時間、４８時間の異なる時点で順番に行った。

２．実験結果：

細胞生存率の検出結果を図４７に示した。Ｍ細胞ペレットを乳酸ナトリウムリンゲル注射剤中に再懸濁した後に、Ｍ細胞の生存率は室温及び４℃で５時間の範囲内で８５％より高く維持された。つまり、室温及び４℃の貯蔵条件間では利点又は不利点において明らかな違いはなかった。

（ＩＩＩ）複合電解質注射液中に再懸濁した細胞
１．実験手順：
（１）Ｐ５世代まで培養した細胞を回収し、トリパンブルーで染色して計数し、細胞の総数を推定した。
（２）１．５ｍｌの細胞懸濁液を取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、３ｍｌの複合電解質注射液を取って再懸濁を行った。
（４）細胞懸濁液をチューブ当たり約１．５ｍｌで２本のチューブに均等に分け、一方を室温（ＲＴ）に保ち、もう一方を４℃で貯蔵した。５０μｌ～１００μｌの細胞懸濁液の試料を貯蔵前に取り、トリパンブルーで染色し、細胞密度及び生存率の検出を行った。
（５）試料採取及び検出を、３時間、５時間、２４時間、４８時間の異なる時点で順番に行った。

２．実験結果：

細胞生存率の検出結果を図４８に示した。Ｍ細胞ペレットを複合電解質注射液中に再懸濁した後に、Ｍ細胞の生存率は室温及び４℃で５時間の範囲内で８５％より高く維持されたのに対して、室温の貯蔵条件下では、細胞生存率は８５％より高くに達し得た。４℃の条件と比較して、室温条件はＭ細胞に対してより良い保存効果を示した。

（ＩＶ）５％グルコース注射液中に再懸濁した細胞
１．実験手順：
（１）Ｐ５世代まで培養した細胞を回収し、トリパンブルーで染色して計数し、細胞の総数を推定した。
（２）１．５ｍｌの細胞懸濁液を取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、３ｍｌの５％グルコース注射液を取って再懸濁を行った。
（４）細胞懸濁液をチューブ当たり約１．５ｍｌで２本のチューブに均等に分け、一方を室温（ＲＴ）に保ち、もう一方を４℃で貯蔵した。５０μｌ～１００μｌの細胞懸濁液の試料を貯蔵前に取り、トリパンブルーで染色し、細胞密度及び生存率の検出を行った。
（５）試料採取及び検出を、３時間、５時間、２４時間、４８時間の異なる時点で順番に行った。

２．実験結果：

細胞生存率の検出結果を図４９に示した。Ｍ細胞を５％グルコース注射剤で再懸濁した後に、直ちに試料採取及び細胞生存率の検出を行ったところ、細胞生存率が急激に低下することが判明した。したがって、その後の使用における単独での直接使用を避ける必要があるかもしれない。

（Ｖ）２０％ＨＳＡ細胞注射液中に再懸濁した細胞
１．実験手順：
（１）Ｐ５世代まで培養した細胞を回収し、トリパンブルーで染色して計数し、細胞の総数を推定した。
（２）１．５ｍｌの細胞懸濁液を取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、３ｍｌの２０％ＨＳＡ注射液を取って再懸濁を行った。
（４）細胞懸濁液をチューブ当たり約１．５ｍｌで２本のチューブに均等に分け、一方を室温（ＲＴ）に保ち、もう一方を４℃で貯蔵した。５０μｌ～１００μｌの細胞懸濁液の試料を貯蔵前に取り、トリパンブルーで染色し、細胞密度及び生存率の検出を行った。
（５）試料採取及び検出を、３時間、５時間、２４時間、４８時間、７２時間、１００時間、６日、８日、１０日、１４日の異なる時点で順番に行った。

２．実験結果：

細胞生存率の検出結果を図５０に示した。Ｍ細胞ペレットを２０％ＨＳＡ注射液で再懸濁し、それぞれ室温及び４℃で１４日間貯蔵した後に、細胞生存率は８５％より高くに達し得たのに対して、４℃の条件下でのＭ細胞の保存効果ははるかに優れており、Ｍ細胞の生存率は１４日の範囲内で９０％より高く保たれた。

（ＶＩ）スクシニル化ゼラチン注射液中に再懸濁した細胞：
１．実験手順：
（１）Ｐ５世代まで培養した細胞を回収し、トリパンブルーで染色して計数し、細胞の総数を推定した。
（２）１．５ｍｌの細胞懸濁液を取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、３ｍｌのスクシニル化ゼラチン注射液を取って再懸濁を行った。
（４）細胞懸濁液をチューブ当たり約１．５ｍｌで２本のチューブに均等に分け、一方を室温（ＲＴ）に保ち、もう一方を４℃で貯蔵した。５０μｌ～１００μｌの細胞懸濁液の試料を貯蔵前に取り、トリパンブルーで染色し、細胞密度及び生存率の検出を行った。
（５）試料採取及び検出を、３時間、５時間、２４時間、４８時間、７２時間、１００時間、６日、８日、１０日、１４日の異なる時点で順番に行った。

２．実験結果：

細胞生存率の検出結果を図５１に示した。Ｍ細胞ペレットをスクシニル化ゼラチン注射剤で再懸濁した後に、Ｍ細胞生存率は２４時間の範囲内で９０％より高く維持され、Ｍ細胞の生存率は、室温及び４℃の両方の貯蔵条件下で７２時間の範囲内で８０％より高く維持された。つまり、ＲＴ及び４℃の貯蔵条件間に大きな差はなかった。

（ＶＩＩ）ＭＺＪ注射液１（凍結保存されていない）
１．実験手順：
（１）ＭＺＪ注射液１の調製：６．５ｍｌの複合電解質溶液、２．５ｍｌの２０％ＨＳＡ、１ｍｌのＤＭＳＯをそれぞれ取り、５０ｍｌの遠心分離チューブに入れ、よく混ぜ、４℃で貯蔵した。
Ｐ５世代まで培養した細胞を回収し、トリパンブルーで染色して計数し、細胞の総数を推定した。
（２）１．５ｍｌの細胞懸濁液を取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、３ｍｌのＭＺＪ注射液を取って再懸濁を行った。
（４）細胞懸濁液をチューブ当たり約１．５ｍｌで２本のチューブに均等に分け、一方を室温（ＲＴ）に保ち、もう一方を４℃で貯蔵した。５０μｌ～１００μｌの細胞懸濁液の試料を貯蔵前に取り、トリパンブルーで染色し、細胞密度及び生存率の検出を行った。
（５）試料採取及び検出を、３時間、５時間、２４時間、４８時間、７２時間、１００時間、６日、８日、１０日、１４日の異なる時点で順番に行った。

２．実験結果：

細胞生存率の検出結果を図５２に示した。Ｍ細胞ペレットをＭＺＪ注射液１で再懸濁した後に、Ｍ細胞の生存率は、室温及び４℃の両方の貯蔵条件下で２４時間の範囲内で９０％より高く保たれ、４℃の条件下でＭ細胞を保存する効果ははるかに優れており、Ｍ細胞の生存率は１４日の範囲内で８０％より高く維持された。

さらに、ＭＺＪ注射剤を使用して－８０℃でＭ細胞を凍結保存し、凍結保存後のＭ細胞の生存率の検出結果を図５４に示した。ＭＺＪ注射剤で凍結保存されたＭ細胞を蘇生した後に、室温の貯蔵条件下で、Ｍ細胞の生存率は５時間の範囲内で９０％より高く維持され、Ｍ細胞の生存率は２４時間の範囲内で８０％より高く維持され、４℃の条件下でＭ細胞を保存する効果ははるかに優れており、Ｍ細胞の生存率は５日の範囲内で８０％より高く維持された。

（ＶＩＩＩ）スクシニル化ゼラチンＭＩＸ注射剤
１．実験手順：
（１）スクシニル化ゼラチンＭＩＸ注射剤の調製：６．５ｍｌの複合電解質溶液、２．５ｍｌのスクシニル化ゼラチン注射剤、及び１ｍｌのＤＭＳＯをそれぞれ取り、５０ｍｌの遠心分離チューブに入れ、よく混ぜ、４℃で貯蔵した。
Ｐ５世代まで培養した細胞を回収し、トリパンブルーで染色して計数し、細胞の総数を推定した。
（２）１．５ｍｌの細胞懸濁液を取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、３ｍｌのスクシニル化ゼラチンＭＩＸ注射剤を取って再懸濁を行った。
（４）細胞懸濁液をチューブ当たり約１．５ｍｌで２本のチューブに均等に分け、一方を室温（ＲＴ）に保ち、もう一方を４℃で貯蔵した。５０μｌ～１００μｌの細胞懸濁液の試料を貯蔵前に取り、トリパンブルーで染色し、細胞密度及び生存率の検出を行った。
（５）試料採取及び検出を、３時間、５時間、２４時間、４８時間、７２時間、１００時間、６日、８日、１０日、１４日の異なる時点で順番に行った。

２．実験結果：

細胞生存率の検出結果を図５３に示した。Ｍ細胞ペレットをスクシニル化ゼラチンＭＩＸ注射剤で再懸濁した後に、Ｍ細胞の生存率は、室温の貯蔵条件下で５時間の範囲内で８０％より高く維持され、４℃の貯蔵条件下でＭ細胞を保存する効果ははるかに優れており、Ｍ細胞の生存率は７２時間の範囲内で９０％より高く維持された。

（ＩＸ）ＭＺＪ注射剤１（凍結保存された）
１．実験手順：
（１）ＭＺＪ注射液１の調製：６．５ｍｌの複合電解質溶液、２．５ｍｌの２０％ＨＳＡ、１ｍｌのＤＭＳＯをそれぞれ取り、５０ｍｌの遠心分離チューブに入れ、よく混ぜ、４℃で貯蔵した。
Ｐ５世代まで培養した細胞を回収し、トリパンブルーで染色して計数し、細胞の総数を推定した。
（２）或る特定の容量の細胞懸濁液を取り、５０ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、ＭＺＪ注射液１を取って再懸濁を行った。
（４）細胞懸濁液をチューブ当たり１．０ｍｌで２つのチューブに均等に分け、これらをプログラムされた凍結保存ボックスに入れ、－８０℃でプログラムされた凍結保存を行い、２４時間後にこれらを液体窒素に移すか、又は長期保存の場合は－８０℃で貯蔵した。
（５）一定期間後に、Ｍ細胞の２つのチューブを取り出し、蘇生器によって蘇生し、混合し、２つのチューブに均等に分け、そのうちの一方を室温（ＲＴ）に保ち、もう一方を４℃で貯蔵した。５０μｌ～１００μｌの細胞懸濁液の試料を貯蔵前に取り、トリパンブルーで染色し、細胞密度及び生存率の検出を行った。
（５）試料採取及び検出を、３０分、１時間、４時間、６時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日の異なる時点で順番に行った。

２．実験結果：

細胞生存率の検出結果を図５４に示した。ＭＺＪ注射液１で凍結保存されたＭ細胞を蘇生した後に、室温の貯蔵条件下で、Ｍ細胞の生存率は５時間の範囲内で９０％より高く維持され、Ｍ細胞の生存率は２４時間の範囲内で８０％より高く維持され、４℃の条件下でＭ細胞を保存する効果はより優れており、Ｍ細胞の生存率は５日の範囲内で８０％より高く維持された。

（Ｘ）ＭＺＪ注射液２（凍結保存された）
１．実験手順：
（１）ＭＺＪ注射液２の調製：６．５ｍｌの複合電解質溶液、２．５ｍｌの２０％ＨＳＡ、３００μｌの３％アデノシン、及び１ｍｌのＤＭＳＯをそれぞれ取り、５０ｍｌの遠心分離チューブに入れ、よく混ぜ、４℃で貯蔵した。
Ｐ５世代まで培養した細胞を回収し、トリパンブルーで染色して計数し、細胞の総数を推定した。
（２）或る特定の容量の細胞懸濁液を取り、５０ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、ＭＺＪ注射液２を取って再懸濁を行った。
（４）細胞懸濁液をチューブ当たり１．０ｍｌで２つのチューブに均等に分け、これらをプログラムされた凍結保存ボックスに入れ、－８０℃でプログラムされた凍結保存を行い、２４時間後にこれらを液体窒素に移すか、又は長期保存の場合は－８０℃で貯蔵した。
（５）一定期間後に、Ｍ細胞の２つのチューブを取り出し、蘇生器によって蘇生し、混合し、２つのチューブに均等に分け、そのうちの一方を室温（ＲＴ）に保ち、もう一方を４℃で貯蔵した。５０μｌ～１００μｌの細胞懸濁液の試料を貯蔵前に取り、トリパンブルーで染色し、細胞密度及び生存率の検出を行った。
（５）試料採取及び検出を、３０分、１時間、４時間、６時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日の異なる時点で順番に行った。

２．実験結果：

細胞生存率の検出結果を図２１５に示した。ＭＺＪ注射液２で凍結保存されたＭ細胞を蘇生した後に、室温の貯蔵条件下で、Ｍ細胞の生存率は６時間の範囲内で９０％より高く維持され、Ｍ細胞の生存率は２４時間の範囲内で８０％より高く維持され、４℃の条件下でＭ細胞を保存する効果ははるかに優れており、Ｍ細胞の生存率は３日の範囲内で９０％より高く維持され、Ｍ細胞の生存率は５日の範囲内で８０％より高く維持された。

（ＸＩＩ）ＭＺＪ注射剤３（凍結保存された）
１．実験手順：
調製溶液の調製：２．９２５ｍｌの複合電解質溶液を取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、２．９２５ｍｌのグルコース注射剤を加えてよく混ぜ、９００μｌのＵＳＰグレードのＤＭＳＯを加えてよく混ぜ、最後に２．２５ｍｌのＨＳＡを加えてよく混ぜ、パラフィルムで封止し、４℃で静置して予冷した。

Ｍ細胞懸濁液を均一に混合し、計数し、２つのチューブに均等に分け、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を廃棄し、４ｍｌの調製溶液をそれぞれ取り、細胞を再懸濁して計数した（記録していない）。

小分け：チューブ当たり６００μｌでプログラムされた冷却ボックスに入れ、－８０℃で貯蔵した。

２４時間後に、細胞をそれぞれ凍結保存ボックスから取り出し、液体窒素に入れて凍結保存した。

１４日間凍結保存した後に、各試料の３つのチューブを取り出して蘇生し、再懸濁して均一に混合した後に、５５０μｌの細胞懸濁液を取り出し、５５０μｌの生理食塩水を加えて希釈し、４℃で貯蔵し、異なる時点（０時間、３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、２４時間、４８時間、７２時間）で細胞生存率の検出を行った。

細胞生存率の検出：生物学的安全キャビネットにおいて、細胞懸濁液をピペッティングにより優しく混ぜ、１０μｌの細胞懸濁液を取り、１０μｌのトリパンブルーを加えてよく混ぜ、１０μｌの混合物を取り、計数プレートの一方の側のチャンバーに加え、１０秒～３０秒静置した後に、カウンターに挿入して計数し、各試料を３回検出した。

細胞生存率の検出結果を図２１６に示した。ＭＺＪ注射液３で凍結保存されたＭ細胞を蘇生した後に、４℃の貯蔵条件下で、Ｍ細胞の生存率は４８時間の範囲内で９０％より高く維持され、Ｍ細胞の生存率は３日の範囲内で８５％より高く維持された。

実施例６：マイクロキャリア上でヒト胚性幹細胞由来Ｍ細胞を培養する方法
実験過程及び方法：
（１）種々のマイクロキャリアを用いたＭ細胞の培養：
Ｍ細胞をＰ４世代まで培養して回収し、培養培地中に再懸濁し、市販のマイクロキャリア上に接種し、３７℃の静置培養用インキュベーター内に入れ、培養培地を１日置きに交換した。溶解液又はＴｒｙｐｌｅを使用することにより消化を行い、細胞を回収して細胞表面マーカーの特定を行った。培養過程の間に、試料を採取して生死検出を行い、細胞成長状態を観察した。

（２）Ｍ細胞の動的懸濁培養：
Ｍ細胞をＰ２世代まで培養して回収し、培養培地中に再懸濁し、多孔質ゼラチンマイクロキャリア上に接種し、３７℃の回転培養用インキュベーター内に入れ、そこで２４時間の範囲内でインターバル型のインキュベーションを使用し、２４時間後に、一定速度での回転培養を行い、培養の間に培養培地を交換した。培養６日後に、マイクロキャリアをマイクロキャリア溶解液で溶解し、次に細胞がＰ５まで培養されるまで継代を行い、回収した細胞を表面マーカーの特定に供した。培養の間に、試料を採取して生死検出を行い、細胞成長状態を観察した。

使用した機器／装置、試薬、及び消耗品は以下の通りであった：

Ｉ．Ｃｙｔｏｄｅｘ３上で培養したＭ細胞
１．実験手順：
（１）細胞接種：
ａ．Ｔ２２５を用いて培養したＰ４世代のＭ細胞を消化し、上清を廃棄し、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、１０ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加え、３７℃で３分間消化を行い、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて反応を止め、５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し、細胞ペレットを培養培地で再懸濁し、トリパンブルーを使用することにより計数した。
ｂ．１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し、細胞懸濁液を４×１０^６個の細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。
ｃ．４０ｍｇのマイクロキャリアを秤量し、滅菌し、１０ｃｍの低付着性ディッシュに入れ、１２ｍｌの培養培地を加え、上記細胞懸濁液を各マイクロキャリア当たり２００μｍで接種し、３７℃で培養した。
ｄ．初日に培地を補充して１６ｍｌにした後に、１日置きに培養培地を交換し、８ｍｌの培養培地を廃棄し、８ｍｌを加えた。

（２）生死検出：
ａ．生死検出液を暗所で調製した：１０ｍｌのＤＰＢＳを取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、それぞれ５μｌのカルセインＡＭ及び２０μｌのエチジウムホモダイマー－１を加え、よく混ぜて４℃で貯蔵した。
ｂ．マイクロキャリアを優しく混ぜ、１ｍｌの懸濁液を取り出して遠心分離チューブに入れ、１分～２分間休め、上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて２回洗浄した。
ｃ．生死検出液をチューブ当たり１ｍｌで加え、室温で３０分間インキュベートした。
ｄ．上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、蛍光顕微鏡で写真を撮影した。

（３）細胞消化：
ａ．マイクロキャリアを１分～２分間自然沈殿させ、上清を廃棄し、ＤＰＢＳで洗浄を行った。
ｂ．１０ｃｍディッシュ当たり５ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加え、３７℃で１０分間消化を行い、５ｍｌのＤＰＢＳを加え、５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、７０μｍフィルターを使用して細胞を濾過して収集した。
ｃ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｄ．培養培地で再懸濁した後に、トリパンブルー染色を行って計数した。
ｅ．適切な量の細胞を取り、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞を収集した。

（４）フローサイトメトリー：
ａ．細胞ペレットを２％ＢＳＡ中に再懸濁した後に、細胞を３０分間ブロッキングした。
ｂ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｃ．１％ＢＳＡ中に再懸濁した後に、細胞をチューブ当たり２００μｌで小分けにした。
ｄ．抗体の指示に従って抗体を加えた後に、室温で３０分間インキュベーションを行った。
ｅ．洗浄をＤＰＢＳで２回行った。
ｆ．ＤＰＢＳ中に再懸濁した後に、細胞を０．２２μｍフィルターで濾過した。
ｇ．ロードした後に、検出を行った。

（５）ｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存：
ａ．採取したＰ４世代のＭ細胞懸濁液を９．５×１０^５個で接種し、インキュベーションを３７℃で２時間行った後に、培地の補充を行った。
ｂ．３７℃で２４時間培養した後に、培地を補充して交換し、３ｍｌの培養培地を廃棄し、３ｍｌの新しい培地を加え、その後、培養培地を１日置きに交換し、４ｍｌの培養培地を廃棄し、４ｍｌの新しい培地を加えた。
ｃ．凍結保存の前に試料採取及び生死検出を行って細胞の状態を検出し、培養５日後に凍結保存を行った。
ｄ．凍結保存液ＭＺＪ（２０ｍｌ＝１３ｍｌの複合電解質溶液＋５ｍｌの２０％ＨＳＡ＋２ｍｌのＤＭＳＯ）を調製した。
ｅ．マイクロキャリアをそれぞれＤＰＢＳで２回洗浄し、Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアを３等分し、上清を廃棄し、残留物をそれぞれＭＺＪ、ＣＳ１０、及びガラス化凍結保存液を用いて凍結保存したが、ガラス化凍結保存液を除いて、他のものはプログラムされた凍結保存ボックスに入れ、液体窒素に移して２４時間後に貯蔵した。
ｆ．ガラス化凍結保存手順：（１）平衡溶液ＥＳとの交換をチューブ当たり０．５ｍｌで１２分～１８分間行い、（２）上清を廃棄した後に、ガラス化凍結保存液ＶＳ３０－５０ｓを加え、（３）上清を廃棄し、残留物を凍結保存チューブに移し、（４）凍結保存チューブを直ちに液体窒素に入れて瞬時に急速凍結を行った後に、液体窒素タンクに移して貯蔵した。
ｇ．液体窒素中で１２日間凍結保存した後に、ガラス化凍結保存後のＣｙｔｏｄｅｘ３を液体窒素から取り出し、蘇生した（ここで、ガラス化凍結保存のための蘇生法は、以下を含む：（１）液体窒素から取り出した後に、それを直ちに３００μｌのＴＳ試薬に入れ、３７℃の金属浴に１分間入れ、約１分間静置し、ＴＳを破棄し、（２）３００μｌのＤＳ試薬を加え、室温で３分間静置し、上清を廃棄し、３００μｌのＷＳ１を加え、室温で５分間静置し、上清を廃棄し、３００μｌのＷＳ２を加え、室温で１分～２分間静置し、上清を廃棄し、培養液を加えて１回洗浄した後に、それを１ウェル当たり２ｍｌの培養液で６ウェルプレートに移し、３７℃で培養した）。
ｈ．約３０分～１時間後に、その一部を取り、生死検出に使用し、その部分を蛍光顕微鏡下で観察し、その写真を撮影した。
ｉ．液体窒素中で１５日間凍結保存した後に、ＭＺＪ及びＣＳ１０中で凍結保存したマイクロキャリアを液体窒素から取り出し、蘇生器を使用して蘇生し、培養培地を加えて２回洗浄した後に、これらを１ウェル当たり２ｍｌの培養培地で６ウェルプレートに移し、３７℃で培養した。
ｊ．約３０分～１時間後に、その一部を取って生死検出を行い、その部分を蛍光顕微鏡下で観察し、その写真を撮影した。

２．実験結果：
Ｃｙｔｏｄｅｘ３上で培養したＭ細胞の形態学的写真を図５５に示した。これらの結果により、Ｍ細胞がＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリア上で培養及び増殖され得ることが明らかになった。消化後のＭ細胞の形態学的写真を図５６に示した。これらの結果により、Ｍ細胞がＴｒｙｐＬＥ消化によって回収され得ることが明らかになった。生死検出の結果を図５７に示した。これにより、Ｍ細胞がＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアによく付着し得ることが示された。

表面マーカーについてのフローサイトメトリーの結果を下の表に示した。これにより、Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリア上でＭ細胞を培養してもそれらのマーカーの発現に影響がないことが示された。

Ｃｙｔｏｄｅｘ３のｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存の検出結果を図５８に示した。これらの結果により、Ｃｙｔｏｄｅｘ３のｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存後に剥離が観察され得ることが明らかになった。

ＩＩ．Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ上で培養したＭ細胞：
１．実験手順：
（１）細胞接種：
ａ．Ｔ２２５を用いて培養したＰ４世代のＭ細胞を消化し、上清を廃棄し、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、１０ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加え、３７℃で３分間消化し、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて反応を止め、５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを培養培地で再懸濁し、トリパンブルーを用いて計数を行った。
ｂ．１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し、細胞懸濁液を４×１０^６個の細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。
ｃ．４０ｍｇのマイクロキャリアを秤量し、滅菌し、１０ｃｍの低付着性ディッシュに入れ、１２ｍｌの培養培地を加え、上記細胞懸濁液を各マイクロキャリア当たり２００μｌで接種し、３７℃で培養した。
ｄ．初日に培地を補充して１６ｍｌにした後に、１日置きに培養培地を交換し、８ｍｌの培養培地を廃棄し、８ｍｌを加えた。

（２）生死検出：
ａ．生死検出液を暗所で調製した：１０ｍｌのＤＰＢＳを取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、それぞれ５μｌのカルセインＡＭ及び２０μｌのエチジウムホモダイマー－１を加え、よく混ぜて４℃で貯蔵した。
ｂ．マイクロキャリアを優しく混ぜ、１ｍｌの懸濁液を取り出して遠心分離チューブに入れ、１分～２分間休め、上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて２回洗浄した。
ｃ．生死検出液をチューブ当たり１ｍｌで加え、室温で３０分間インキュベートした。
ｄ．上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、蛍光顕微鏡で写真を撮影した。

（３）細胞消化：
ａ．マイクロキャリアを１分～２分間自然沈殿させ、上清を廃棄し、ＤＰＢＳで洗浄を行った。
ｂ．１０ｃｍディッシュ当たり５ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加え、３７℃で１０分間消化を行い、５ｍｌのＤＰＢＳを加え、５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、７０μｍフィルターを使用して細胞を濾過して収集した。
ｃ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｄ．培養培地で再懸濁した後に、トリパンブルー染色を行って計数した。
ｅ．適切な量の細胞を取り、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞を収集した。

（４）フローサイトメトリー：
ａ．細胞ペレットを２％ＢＳＡ中に再懸濁した後に、細胞を３０分間ブロッキングした。
ｂ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｃ．１％ＢＳＡ中に再懸濁した後に、細胞をチューブ当たり２００μｌで小分けにした。
ｄ．抗体の指示に従って抗体を加えた後に、室温で３０分間インキュベーションを行った。
ｅ．洗浄をＤＰＢＳで２回行った。
ｆ．ＤＰＢＳ中に再懸濁した後に、細胞を０．２２μｍフィルターで濾過した。
ｇ．ロードした後に、検出を行った。

（５）ｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存：
ａ．採取したＰ４世代のＭ細胞懸濁液を１．１×１０^６個で接種し、３７℃で２時間インキュベートした後に、培地の補充を行った。
ｂ．３７℃で２４時間培養した後に、培地を補充して交換し、３ｍｌの培養培地を廃棄し、３ｍｌの新しい培地を加え、その後、培養培地を１日置きに交換し、４ｍｌの培養培地を廃棄し、４ｍｌの新しい培地を加えた。
ｃ．凍結保存の前に試料採取し、生死検出を行って細胞の状態を検出し、培養５日後に凍結保存を行った。
ｄ．凍結保存液ＭＺＪ（２０ｍｌ＝１３ｍｌの複合電解質溶液＋５ｍｌの２０％ＨＳＡ＋２ｍｌのＤＭＳＯ）を調製した。
ｅ．マイクロキャリアをそれぞれＤＰＢＳで２回洗浄し、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒマイクロキャリアを３等分し、上清を廃棄し、残留物をそれぞれＭＺＪ、ＣＳ１０、及びガラス化凍結保存液を用いて凍結保存したが、ガラス化凍結保存液を除いて、他のものはプログラムされた凍結保存ボックスに入れ、液体窒素に移して２４時間後に貯蔵した。
ｆ．ガラス化凍結保存手順：（１）平衡溶液ＥＳとの交換をチューブ当たり０．５ｍｌで１２分～１８分間行い、（２）上清を廃棄した後に、ガラス化凍結保存液ＶＳ３０－５０ｓを加え、（３）上清を廃棄し、残留物を凍結保存チューブに移し、（４）凍結保存チューブを直ちに液体窒素に入れて瞬時に急速凍結を行った後に、液体窒素タンクに移して貯蔵した。
ｇ．液体窒素中で１２日間凍結保存した後に、ガラス化凍結保存後のＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒを液体窒素から取り出し、蘇生した（ここで、ガラス化凍結保存のための蘇生法は、以下を含む：（１）液体窒素から取り出した後に、それを直ちに３００μｌのＴＳ試薬に入れ、３７℃の金属浴に１分間入れ、約１分間静置し、ＴＳを破棄し、（２）３００μｌのＤＳ試薬を加え、室温で３分間静置し、上清を廃棄し、３００μｌのＷＳ１を加え、室温で５分間静置し、上清を廃棄し、３００μｌのＷＳ２を加え、室温で１分～２分間静置し、上清を廃棄し、培養液を加えて１回洗浄した後に、それを１ウェル当たり２ｍｌの培養液で６ウェルプレートに移し、３７℃で培養した）。
ｈ．約３０分～１時間後に、その一部を取り、生死検出に使用し、その部分を蛍光顕微鏡下で観察し、その写真を撮影した。
ｉ．液体窒素中で１５日間凍結保存した後に、ＭＺＪ及びＣＳ１０中で凍結保存したマイクロキャリアを液体窒素から取り出し、蘇生器を使用して蘇生し、培養培地を加えて２回洗浄した後に、これらを１ウェル当たり２ｍｌの培養培地で６ウェルプレートに移し、３７℃で培養した。
ｊ．約３０分～１時間後に、その一部を取って生死検出を行い、その部分を蛍光顕微鏡下で観察し、その写真を撮影した。

２．実験結果：
Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ上で培養したＭ細胞の形態学的写真を図５９に示した。これらの結果により、Ｍ細胞がＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒマイクロキャリア上で培養されることが明らかになり、細胞増殖を顕微鏡下で観察することは困難であった。Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒを用いて培養したＭ細胞の消化後の形態学的写真を図６０に示した。これらの結果により、Ｍ細胞がＴｒｙｐＬＥ消化によって回収され得ることが明らかになった。

表面マーカーについてのフローサイトメトリーの結果を下の表に示した。これにより、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒマイクロキャリア上でＭ細胞を培養してもそれらのマーカーの発現に影響がないことが示された。

Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒのｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存の結果を図６１に示した。これらの結果により、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒのｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存後に細胞が死ぬことが明らかになった。

ＩＩＩ．ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロスライド上で培養したＭ細胞：
１．実験方法：
（１）細胞接種：
ａ．Ｔ２２５を用いて培養したＰ４世代のＭ細胞を消化し、上清を廃棄し、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、１０ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加え、３７℃で３分間消化し、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて反応を止め、５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを培養培地で再懸濁し、トリパンブルーを用いて計数を行った。
ｂ．１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し、細胞懸濁液を４×１０^６個の細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。
ｃ．２つのＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロスライドを取り、１０ｃｍの低付着性ディッシュに入れ、２００μｌの上記細胞懸濁液を各マイクロキャリア上に接種し、３７℃で２時間インキュベートし、１０ｃｍのディッシュ当たり１２ｍｌの培養液になるよう補充した。
ｄ．初日に培地を補充して１６ｍｌにした後に、１日置きに培養培地を交換し、８ｍｌの培養培地を廃棄し、８ｍｌを加えた。

（２）生死検出：
ａ．生死検出液を暗所で調製した：１０ｍｌのＤＰＢＳを取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、それぞれ５μｌのカルセインＡＭ及び２０μｌのエチジウムホモダイマー－１を加え、よく混ぜて４℃で貯蔵した。
ｂ．マイクロキャリアを優しく混ぜ、１ｍｌの懸濁液を取り出して遠心分離チューブに入れ、１分～２分間休め、上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて２回洗浄した。
ｃ．生死検出液をチューブ当たり１ｍｌで加え、室温で３０分間インキュベートした。
ｄ．上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、蛍光顕微鏡で写真を撮影した。

（３）細胞消化：
ａ．マイクロキャリアを１分～２分間自然沈殿させ、上清を廃棄し、ＤＰＢＳで洗浄を行った。
ｂ．Ｄｉｇｅｓｔ溶解バッファーを使用して４０分～６０分間溶解し、中央で１回ピペッティングし、５０ｍｌの遠心分離チューブに移した。
ｃ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｄ．培養培地で再懸濁した後に、トリパンブルー染色を行って計数した。
ｅ．適切な量の細胞を取り、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞を収集した。

（４）フローサイトメトリー：
ａ．細胞ペレットを２％ＢＳＡ中に再懸濁した後に、細胞を３０分間ブロッキングした。
ｂ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｃ．１％ＢＳＡ中に再懸濁した後に、細胞をチューブ当たり２００μｌで小分けにした。
ｄ．抗体の指示に従って抗体を加えた後に、室温で３０分間インキュベーションを行った。
ｅ．洗浄をＤＰＢＳで２回行った。
ｆ．ＤＰＢＳ中に再懸濁した後に、細胞を０．２２μｍフィルターで濾過した。
ｇ．ロードした後に、検出を行った。

（５）ｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存：
ａ．回収したＰ４世代のＭ細胞を、４×１０^６個の密度を有する細胞懸濁液へと配合し、２つのＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロスライドに接種した：各マイクロスライドに上記細胞懸濁液を接種し、３７℃で２時間インキュベートした後に、培地の補充を行った。
ｂ．３７℃で２４時間培養した後に、培地を補充して交換し、３ｍｌの培養培地を廃棄し、３ｍｌの新しい培地を加え、その後、培養培地を１日置きに交換し、４ｍｌの培養培地を廃棄し、４ｍｌの新しい培地を加えた。
ｃ．凍結保存の前に試料採取し、生死検出を行って細胞の状態を検出し、培養５日後に凍結保存を行った。
ｄ．凍結保存液ＭＺＪ（２０ｍｌ＝１３ｍｌの複合電解質溶液＋５ｍｌの２０％ＨＳＡ＋２ｍｌのＤＭＳＯ）を調製した。
ｅ．マイクロキャリアをそれぞれＤＰＢＳで２回洗浄し、ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロスライドを３等分し、上清を廃棄し、残留物をそれぞれＭＺＪ、ＣＳ１０、及びガラス化凍結保存液を用いて凍結保存したが、ガラス化凍結保存液を除いて、他のものはプログラムされた凍結保存ボックスに入れ、液体窒素に移して２４時間後に貯蔵した。
ｆ．ガラス化凍結保存手順：（１）平衡溶液ＥＳとの交換をチューブ当たり０．５ｍｌで１２分～１８分間行い、（２）上清を廃棄した後に、ガラス化凍結保存液ＶＳ３０－５０ｓを加え、（３）上清を廃棄し、残留物を凍結保存チューブに移し、（４）凍結保存チューブを直ちに液体窒素に入れて瞬時に急速凍結を行った後に、液体窒素タンクに移して貯蔵した。
ｇ．液体窒素中で１２日間凍結保存した後に、ガラス化凍結保存後のＴａｂｌｅＴｒｉｘを液体窒素から取り出し、蘇生した（ここで、ガラス化凍結保存のための蘇生法は、以下を含む：（１）液体窒素から取り出した後に、それを直ちに３００μｌのＴＳ試薬に入れ、３７℃の金属浴に１分間入れ、約１分間静置し、ＴＳを破棄し、（２）３００μｌのＤＳ試薬を加え、室温で３分間静置し、上清を廃棄し、３００μｌのＷＳ１を加え、室温で５分間静置し、上清を廃棄し、３００μｌのＷＳ２を加え、室温で１分～２分間静置し、上清を廃棄し、培養液を加えて１回洗浄した後に、それを１ウェル当たり２ｍｌの培養液で６ウェルプレートに移し、３７℃で培養した）。
ｈ．約３０分～１時間後に、その一部を取り、生死検出に使用し、その部分を蛍光顕微鏡下で観察し、その写真を撮影した。
ｉ．液体窒素中で１５日間凍結保存した後に、ＭＺＪ及びＣＳ１０中で凍結保存したマイクロキャリアを液体窒素から取り出し、蘇生器を使用して蘇生し、培養培地を加えて２回洗浄した後に、これらを１ウェル当たり２ｍｌの培養培地で６ウェルプレートに移し、３７℃で培養した。
ｊ．約３０分～１時間後に、その一部を取って生死検出を行い、その部分を蛍光顕微鏡下で観察し、その写真を撮影した。

２．実験結果：
ＴａｂｌｅＴｒｉｘを用いて培養したＭ細胞の形態学的写真を図６２に示した。これらの結果により、Ｍ細胞がＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリア上で培養され得ることが明らかになり、細胞増殖現象を顕微鏡下で観察することは困難であった。図６３は、ＴａｂｌｅＴｒｉｘ上で培養したＭ細胞の消化後の形態学的写真を示しており、これらの結果により、Ｍ細胞がＤｉｇｅｓｔ及びＴｒｙｐｌｅによって回収され得ることが明らかになった。ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリアは、スフェア間での継代（sphere-to-sphere passaging）を可能にした。

生死検出の結果を図６４に示した。これらの結果により、Ｍ細胞がＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリアによく付着し得ることが明らかになった。

表面マーカーについてのフローサイトメトリー検出の結果を下の表に示した。これにより、ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリア上でＭ細胞を培養してもそれらのマーカーの発現に影響がないことが示された。

ＴａｂｌｅＴｒｉｘのｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存実験の結果を図６５に示した。ＭＺＪはＴａｂｌｅＴｒｉｘのｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存に対してより良好な効果を示した。

ＩＶ．Ｓｏｌｏｈｉｌｌマイクロキャリア上で培養したＭ細胞：
１．実験手順：
（１）細胞接種：
ａ．Ｔ２２５を用いて培養したＰ４世代のＭ細胞を消化し、上清を廃棄し、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、１０ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加え、３７℃で３分間消化し、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて反応を止め、５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを培養培地で再懸濁し、トリパンブルーを用いて計数を行った。
ｂ．１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し、細胞懸濁液を４×１０^６個の細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。
ｃ．４０ｍｇのマイクロキャリアを秤量し、滅菌し、１０ｃｍの低付着性ディッシュに入れ、１２ｍｌの培養培地を加え、２００μｌの上記細胞懸濁液を各マイクロキャリア上に接種し、３７℃で２時間インキュベートした。
ｄ．初日に培地を補充して１６ｍｌにした後に、１日置きに培養培地を交換し、８ｍｌの培養培地を廃棄し、８ｍｌを加えた。

（２）生死検出：
ａ．生死検出液を暗所で調製した：１０ｍｌのＤＰＢＳを取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、それぞれ５μｌのカルセインＡＭ及び２０μｌのエチジウムホモダイマー－１を加え、よく混ぜて４℃で貯蔵した。
ｂ．マイクロキャリアを優しく混ぜ、１ｍｌの懸濁液を取り出して遠心分離チューブに入れ、１分～２分間休め、上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて２回洗浄した。
ｃ．生死検出液をチューブ当たり１ｍｌで各チューブに加え、室温で３０分間インキュベートした。
ｄ．上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、蛍光顕微鏡で写真を撮影した。

（３）細胞消化：
ａ．マイクロキャリアを１分～２分間自然沈殿させ、上清を廃棄し、ＤＰＢＳで洗浄を行った。
ｂ．１０ｃｍのディッシュ当たり５ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加え、３７℃で１０分間消化し、５ｍｌのＤＰＢＳを加え、５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、７０μｍフィルターで濾過して細胞を収集した。
ｃ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｄ．培養培地で再懸濁した後に、トリパンブルー染色を行って計数した。
ｅ．適切な量の細胞を取り、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞を収集した。

（４）フローサイトメトリー：
ａ．細胞ペレットを２％ＢＳＡ中に再懸濁した後に、細胞を３０分間ブロッキングした。
ｂ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｃ．１％ＢＳＡ中に再懸濁した後に、細胞をチューブ当たり２００μｌで小分けにした。
ｄ．抗体の指示に従って抗体を加えた後に、室温で３０分間インキュベーションを行った。
ｅ．洗浄をＤＰＢＳで２回行った。
ｆ．ＤＰＢＳ中に再懸濁した後に、細胞を０．２２μｍフィルターで濾過した。
ｇ．ロードした後に、検出を行った。

（５）ｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存：
ａ．回収したＰ４世代のＭ細胞世代を回収し、８×１０^５個で接種し、３７℃で２時間インキュベートし、培地を補充した。
ｂ．３７℃で２４時間培養した後に、培地を補充して交換し、３ｍｌの培養培地を廃棄し、３ｍｌの新しい培地を加え、その後、培養培地を１日置きに交換し、４ｍｌの培養培地を廃棄し、４ｍｌの新しい培地を加えた。
ｃ．凍結保存の前に試料採取し、生死検出を行って細胞の状態を検出し、培養５日後に凍結保存を行った。
ｄ．凍結保存液ＭＺＪ（２０ｍｌ＝１３ｍｌの複合電解質溶液＋５ｍｌの２０％ＨＳＡ＋２ｍｌのＤＭＳＯ）を調製した。
ｅ．マイクロキャリアをそれぞれＤＰＢＳで２回洗浄し、Ｓｏｌｏｈｉｌｌマイクロスライドを２等分し、上清を廃棄し、残留物をそれぞれＭＺＪ、ＣＳ１０を用いて凍結保存し、プログラムされた凍結保存ボックスに入れ、液体窒素に移して２４時間後に貯蔵した。
ｆ．液体窒素中で１５日間凍結保存した後に、Ｓｏｌｏｈｉｌｌマイクロキャリアを液体窒素から取り出し、蘇生器を使用して蘇生し、培養液を加えて２回洗浄した後に、それを１ウェル当たり２ｍｌの培養液で６ウェルプレートに移し、３７℃で培養した。
ｇ．約３０分～１時間後に、その一部を取り、生死検出に使用し、その部分を蛍光顕微鏡下で観察し、写真を撮影した。

２．実験結果：
Ｓｏｌｏｈｉｌｌを用いて培養したＭ細胞の形態学的写真を図６６に示した。これらの結果により、Ｍ細胞がＳｏｌｏｈｉｌｌマイクロキャリア上で培養及び増殖され得ることが明らかになった。図６７は、Ｓｏｌｏｈｉｌｌ上で培養したＭ細胞の消化後の形態学的写真を示しており、これらの結果により、Ｍ細胞がＴｒｙｐｌｅＥによる消化によって回収され得ることが明らかになった。

生死検出の結果を図６８に示した。これらの結果により、Ｍ細胞がＳｏｌｏｈｉｌｌマイクロキャリアによく付着し得ることが明らかになった。

表面マーカーについてのフローサイトメトリー検出の結果を下の表に示した。これにより、Ｓｏｌｏｈｉｌｌマイクロキャリア上でＭ細胞を培養してもそれらのマーカーの発現に影響がないことが示された。

Ｓｏｌｏｈｉｌｌのｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存の結果を図６９に示した。Ｓｏｌｏｈｉｌｌのｉｎ－ｓｉｔｕでの冷凍保存後に死の現象が観察された。

Ｖ．Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンマイクロキャリア上で培養したＭ細胞：
１．実験手順：
（１）細胞接種：
ａ．Ｔ２２５を用いて培養したＰ４世代のＭ細胞を消化し、上清を廃棄し、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、１０ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加え、３７℃で３分間消化し、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて反応を止め、５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを培養培地で再懸濁し、トリパンブルーを用いて計数を行った。
ｂ．１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し、細胞懸濁液を４×１０^６個の細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。
ｃ．４０ｍｇのマイクロキャリアを秤量し、滅菌し、１０ｃｍの低付着性ディッシュに入れ、１２ｍｌの培養培地を加え、２００μｌの上記細胞懸濁液を各マイクロキャリア上に接種し、３７℃で２時間インキュベートした。
ｄ．初日に培地を補充して１６ｍｌにした後に、１日置きに培養培地を交換し、８ｍｌの培養培地を廃棄し、８ｍｌを加えた。

（２）生死検出：
ａ．生死検出液を暗所で調製した：１０ｍｌのＤＰＢＳを取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、それぞれ５μｌのカルセインＡＭ及び２０μｌのエチジウムホモダイマー－１を加え、よく混ぜて４℃で貯蔵した。
ｂ．マイクロキャリアを優しく混ぜ、１ｍｌの懸濁液を取り出して遠心分離チューブに入れ、１分～２分間休め、上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて２回洗浄した。
ｃ．生死検出液をチューブ当たり１ｍｌで各チューブに加え、室温で３０分間インキュベートした。
ｄ．上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、蛍光顕微鏡で写真を撮影した。

（３）細胞消化：
ａ．マイクロキャリアを１分～２分間自然沈殿させ、上清を廃棄し、ＤＰＢＳで洗浄を行った。
ｂ．１０ｃｍのディッシュ当たり５ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加え、３７℃で１０分間消化し、５ｍｌのＤＰＢＳを加え、５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、７０μｍフィルターで濾過して細胞を収集した。
ｃ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｄ．培養培地で再懸濁した後に、トリパンブルー染色を行って計数した。
ｅ．適切な量の細胞を取り、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞を収集した。

（４）フローサイトメトリー：
ａ．細胞ペレットを２％ＢＳＡ中に再懸濁した後に、細胞を３０分間ブロッキングした。
ｂ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｃ．１％ＢＳＡ中に再懸濁した後に、細胞をチューブ当たり２００μｌで小分けにした。
ｄ．抗体の指示に従って抗体を加えた後に、室温で３０分間インキュベーションを行った。
ｅ．洗浄をＤＰＢＳで２回行った。
ｆ．ＤＰＢＳ中に再懸濁した後に、細胞を０．２２μｍフィルターで濾過した。
ｇ．ロードした後に、検出を行った。

（５）ｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存：
ａ．回収したＰ４世代のＭ細胞世代を回収し、８×１０^５個で接種し、３７℃で２時間インキュベートし、培地を補充した。
ｂ．３７℃で２４時間培養した後に、培地を補充して交換し、３ｍｌの培養培地を廃棄し、３ｍｌの新しい培地を加え、その後、培養培地を１日置きに交換し、４ｍｌの培養培地を廃棄し、４ｍｌの新しい培地を加えた。
ｃ．凍結保存の前に試料採取し、生死検出を行って細胞の状態を検出し、培養５日後に凍結保存を行った。
ｄ．凍結保存液ＭＺＪ（２０ｍｌ＝１３ｍｌの複合電解質溶液＋５ｍｌの２０％ＨＳＡ＋２ｍｌのＤＭＳＯ）を調製した。
ｅ．マイクロキャリアをそれぞれＤＰＢＳで２回洗浄し、Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンマイクロキャリアを２等分し、上清を廃棄し、残留物をそれぞれＭＺＪ、ＣＳ１０を用いて凍結保存し、プログラムされた凍結保存ボックスに入れ、液体窒素に移して２４時間後に貯蔵した。
ｆ．液体窒素中で１５日間凍結保存した後に、Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンマイクロキャリアを液体窒素から取り出し、蘇生器を使用して蘇生し、培養液を加えて２回洗浄した後に、それを１ウェル当たり２ｍｌの培養液で６ウェルプレートに移し、３７℃で培養した。
ｇ．約３０分～１時間後に、その一部を取り、生死検出に使用し、その部分を蛍光顕微鏡下で観察し、写真を撮影した。

２．実験結果：
Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンにおいて培養したＭ細胞の形態学的写真を図７０に示した。これにより、Ｍ細胞がＣｏｒｉｎｇポリスチレンマイクロキャリア上で培養及び増殖され得ることが示された。Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンにおいて培養したＭ細胞の消化後の形態学的写真を図７１に示した。これにより、Ｍ細胞がＴｒｙｐＬＥ消化により回収され得ることが示された。

生死検出の結果を図７２に示した。これにより、Ｍ細胞がＣｏｒｉｎｇポリスチレンマイクロキャリアによく付着し得ることが示された。

表面マーカーについてのフローサイトメトリー検出の結果を下の表に示した。これにより、Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンマイクロキャリア上でＭ細胞を培養してもそれらのマーカーの発現に影響がないことが示された。

Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンのｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存の検出結果を図７３に示した。これにより、Ｃｏｒｉｎｇポリスチレンのｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存後に死の現象が見られ、ＭＺＪ凍結保存の効果は比較的良好であることが示された。

ＶＩ．８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリア上で培養したＭ細胞
８ＧｅＬ－トルエン法は、主材料成分が８％のゼラチン、５％のＴｗｅｅｎ、及び５％のトルエンであり、ゼラチンを原料として使用し、懸濁して球体にしてトルエンにより細孔を作製することによってマクロ孔質ゼラチンマイクロキャリアを調製するダブルエマルジョン法である。主に機械的に撹拌してトルエン液滴を除去することによって、トルエン液滴間の弱い連結を破壊して、細孔の接続を形成した。

８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリア上で培養したＭ細胞について、細胞形態の写真を図７４に示した。これにより、Ｍ細胞が８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリア上で培養及び増殖し得ることが示された。生死検出の結果を図７５に示した。これにより、Ｍ細胞が８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリアによく付着し得ることが示された。８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリア上で培養したＭ細胞の継代物を図７６に示した。これらの結果により、８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリア上で培養したＭ細胞が継代及び増殖され得ることが明らかになった。８ＧｅＬ－トルエン法によって調製されたマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死検出を図７７に示した。

ＶＩＩ．２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞
２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアは、主にゼラチン－フェルラ酸及びゼラチンからできた多孔質ミクロスフェアであった。

２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の形態学的写真を図７８に示した。２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死検出の結果を図７９に示した。２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアから調製されたマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の継代物を図８０に示した。２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の継代物の生死検出の結果を図８１に示した。Ｍ細胞を２５ＧＦ－Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養及び増殖させることができた。

ＶＩＩＩ．Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞
Ｇｅｌマイクロキャリアは、乳化法により主にゼラチンからできた非多孔質ミクロスフェアであった。

Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の形態学的写真を図８２に示した。Ｇｅｌを用いて調製されたマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の生死検出の結果を図８３に示した。Ｇｅｌマイクロキャリアを用いてＭ細胞を培養及び増殖させることができた。Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の継代物を図８４に示した。Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の継代物の生死検出の結果を図８５に示した。Ｇｅｌマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞をスフェア間で継代し、増殖させることができた。

ＩＸ．２５ＧＦ－２ＨＡマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞
２５ＧＦ－２ＨＡマイクロキャリアは、主にゼラチン－フェルラ酸及びヒアルロン酸からできた多孔質ミクロスフェアであった。

２５ＧＦ－２ＨＡマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の形態学的写真を図８６及び図８９に示した。生死検出の結果を図８７及び図９０に示した。Ｍ細胞は２５ＧＦ－２ＨＡマイクロキャリアに付着することができなかった。

Ｘ．Ａｌｇマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞
Ａｌｇマイクロキャリアは、主にアルギン酸ナトリウムからできた非多孔質ミクロスフェアであった。

Ａｌｇマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の形態学的写真を図９１に示し、生死検出の結果を図９２に示した。Ｍ細胞はＡｌｇマイクロキャリアに付着することができなかった。

ＸＩ．Ａｌｇ－リジンマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞
Ａｌｇ－リジンマイクロキャリアは、主にアルギン酸ナトリウム及びリジンからできた非多孔質ミクロスフェアであった。

Ａｌｇ－リジンマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の形態学的写真を図９３に示し、生死検出の結果を図９４に示した。Ｍ細胞はＡｌｇ－リジンマイクロキャリアに付着することができなかった。

ＸＩＩ．Ｇｅｌ－リジンマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞
Ｇｅｌ－リジンマイクロキャリアは、主にゼラチン及びポリリジンからできた非多孔質ミクロスフェアであった。

Ｇｅｌ－リジンマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の形態学的写真を図９５に示し、生死検出の結果を図９６に示した。Ｍ細胞はＧｅｌ－リジンマイクロキャリアに付着することができなかった。Ｇｅｌ－リジンマイクロキャリアから調製されたマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の消化の結果を図９７に示した。これにより、Ｇｅｌ－リジンマイクロキャリアから調製されたマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞がＴｒｙｐＬＥで消化され得ることが示された。Ｇｅｌマイクロキャリアを用いたＭ細胞の継代物の生死検出の結果を図９８に示した。

ＸＩＩＩ．１６ＧｅＬ－６ＨＡ－ｂｕｂｂｌｅｓマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞
１６ＧｅＬ－６ＨＡ－ｂｕｂｂｌｅｓマイクロキャリアは、主にＮＨ_４ＨＣＯ_３の加熱によって生成されたガスによって細孔がもたらされた、主にゼラチン及びヒアルロン酸でできた多孔質ミクロスフェアであった。

１６ＧｅＬ－６ＨＡ－ｂｕｂｂｌｅｓリジンマイクロキャリアを用いて培養したＭ細胞の形態学的写真を図に示し、生死検出の結果を図に示した。Ｍ細胞は１６ＧｅＬ－６ＨＡ－ｂｕｂｂｌｅｓマイクロキャリアに殆ど付着しなかった。

ＸＩＩ．動的培養によるＭ細胞の調製（多孔質マイクロキャリア、非多孔質／ミクロ孔質マイクロキャリア）：
１．実験方法：
（１）動的培養：
ａ．Ｔ２２５を用いて培養したＰ２世代のＭ細胞を消化した：上清を廃棄し、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、１０ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加え、３７℃で３分間消化を行い、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて反応を止め、それを５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し、細胞ペレットを培養培地で再懸濁し、トリパンブルーを用いて計数を行った。
ｂ．３５ｍｌの培養培地をスピナーフラスコに加え、２片のＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリアを加え、溶解を１０分間行い、１．６×１０^６個の細胞の量で接種を行い、３７℃で動的培養を行った。
ｃ．培養２日目に３０ｍｌの上清を廃棄し、４０ｍｌの培養培地を加えた。
ｄ．培養３日目に３５ｍｌの上清を廃棄し、５０ｍｌの培養培地を加えた。
ｅ．培養４日目に４５ｍｌの上清を廃棄し、６０ｍｌの培養培地を加えた。
ｆ．培養５日目に３０ｍｌの上清を廃棄し、マイクロキャリアを５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
ｇ．上清を廃棄し、１０ｍｌの溶解液を加えて４０分～５０分間溶解し、途中で１回ピペッティングを行い、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
ｈ．上清を廃棄し、６ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加えて３７℃で３分間消化を行い、６ｍｌのＤＰＢＳを加えて消化を止め、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
ｉ．上清を廃棄し、２ｍｌの培養培地を加えて再懸濁し、計数を行った。
ｊ．１片当たり８×１０^５個で接種を行い、Ｐ４世代まで継代を行った。
ｋ．培養２日目に２０ｍｌの培養培地を加えた。
ｌ．培養３日目に２０ｍｌの上清を廃棄し、３０ｍｌの培養培地を加えた。
ｍ．培養４日目に４０ｍｌの上清を廃棄し、５０ｍｌの培養培地を加えた。
ｎ．培養５日目に５０ｍｌの上清を廃棄し、１００ｍｌの培養培地を加えた。
ｏ．培養６日目に上清を廃棄し、マイクロキャリアを５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
ｐ．上清を廃棄し、１０ｍｌの溶解バッファーを加えて４０分～５０分間溶解し、途中で１回ピペッティングを行い、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
ｑ．上清を廃棄し、６ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加えて３７℃で３分間消化を行い、６ｍｌのＤＰＢＳを加えて消化を止め、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
ｒ．上清を廃棄し、培養培地を加えて再懸濁し、計数を行った。
ｓ．１片当たり８×１０^５個で接種を行い、Ｐ５世代まで継代を行った。
ｔ．培養２日目に２０ｍｌの培養培地を加え、培養３日目に、４０ｍｌの上清を廃棄し、５０ｍｌの培養培地を加え、培養４日目に５５ｍｌの上清を廃棄し、６５ｍｌの培養培地を加え、培養５日目に６０ｍｌの上清を廃棄し、１５０ｍｌの培養培地を加え、培養６日目に上清を廃棄し、マイクロキャリアを５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
ｕ．上清を廃棄し、１６ｍｌの溶解液を加えて４０分～５０分間溶解し、途中で１回ピペッティングを行い、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
ｖ．上清を廃棄し、１０ｍｌのＴｒｙｐＬＥを加えて３７℃で３分間消化を行い、１０ｍｌのＤＰＢＳを加えて消化を止め、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
ｗ．上清を廃棄し、４ｍｌの培養培地を加えて再懸濁し、計数を行った。

（２）フローサイトメトリー：
ａ．２％のＢＳＡを加えて、３０分間ブロッキングした。
ｂ．１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
ｃ．１％のＢＳＡで再懸濁し、それをチューブ当たり２００μｌで合計８つのチューブに小分けした。
ｄ．抗体の指示に従って抗体を加えた後に、室温で３０分間インキュベートした。
ｅ．洗浄をＤＰＢＳで２回行った。
ｆ．ＤＰＢＳで再懸濁した後に、０．２２μｍフィルターで濾過を行った。
ｇ．ロードした後に、検出を行った。

（３）生死検出：
ａ．生死検出液を暗所で調製した：１０ｍｌのＤＰＢＳを取り、１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、それぞれ５μｌのカルセインＡＭ及び２０μｌのエチジウムホモダイマー－１を加え、よく混ぜて４℃で貯蔵した。
ｂ．約２００μｌ～５００μｌのマイクロキャリア懸濁液をスピナーフラスコから取り出し、遠心分離チューブに入れ、１分～２分間休め、上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて２回洗浄した後に、それを９６ウェルプレートに移し、上清を廃棄した。
ｃ．生死検出液をチューブ当たり１ｍｌで加え、室温で３０分間インキュベーションを行った。
ｄ．上清を廃棄し、ＤＰＢＳを加えて１回洗浄し、蛍光顕微鏡で写真を撮影した。

２．実験結果：
２．１ 多孔質マイクロキャリアを用いた動的培養によるＭ細胞の調製：
生死検出の結果を図９９に示した。これにより、Ｍ細胞がＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリアによく付着し得ることが示された。表面マーカーのフローサイトメトリーの結果を以下の表及び図１００に示した。これにより、ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリアを用いてＭ細胞を培養してもそれらのマーカーの発現に影響がないことが示された。ヒト胚性幹細胞由来Ｍ細胞を多孔質マイクロキャリア上で動的培養及び調製することができ、マーカーの発現は正常であった。

２．２ 非多孔質又はミクロ孔質のマイクロキャリアを用いた動的培養によるＭ細胞の調製：
顕微鏡下で観察すると、細胞の形態及び接着は良好であった。

生死検出の結果により、Ｍ細胞の接着率及び成長状態が良好であることが明らかになった。

走査型電子顕微鏡を使用して、細胞付着形態を観察した。

継代法の検証：酵素継代及びスフェアでの継代（sphere-passage）の両方を実現することができ、要件を満たしている。

Ｍ細胞のｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存を行って、マイクロキャリアがｉｎ－ｓｉｔｕでの凍結保存に適しているかどうかを示した。

消化後の凍結保存：これを使用して、マイクロキャリアを用いて培養した細胞を凍結保存した後の細胞生存率の変化を検証した。

フローサイトメトリーの結果により、マイクロキャリア自体が細胞の特徴に影響を与えないことが明らかになった。

品質検査：これにより、細胞生存率、マイコプラズマ、エンドトキシン、無菌性、ウイルス等の検出が全て基準を満たしていることが示された。

ＲＮＡ－ｓｅｑ又はシングルセルシーケンシングの結果により、２Ｄキャリアにより回収された細胞と比較して、マイクロキャリアを用いた培養又は分化によって回収されたＭ細胞の利点及び不利点における違いが明らかになった。

ヒト胚性幹細胞由来Ｍ細胞を非多孔質又はミクロ孔質のマイクロキャリア上で動的培養及び調製することができ、マーカーの発現は正常であった。

実施例７：肺細胞の線維症に対するＭ細胞の治療活性の評価
ヒト肺線維芽細胞ＨＦＬ１（Beina Bioから購入）を６ウェルプレートに接種し、細胞融合が７０％に達したときに、これらを以下の群：（１）基礎培地（ＨＦ１２Ｋ＋１０％のＦＢＳ）を添加する群、（２）基礎培地＋１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β１（Peprotechから購入、カタログ番号１００－２１）を添加する群、（３）５０％の基礎培地＋調製例１の５０％のＭＳＣ培養上清＋１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β１を添加する群に従って処理し、ここで、培養上清を得る方法は、以下の通りであった：１×１０^６個のＭＳＣを１０ｃｍのディッシュに接種し、これが５０％に達したら、培地を１０ｍＬの新しい培地に交換し、２４時間培養した後に、上清を収集し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を取った。

引き続き、上記の種々の群で処理された細胞におけるα－ＳＭＡ（抗α－ＳＭＡ抗体：Sigma、Ａ５２２８）及びＩ型コラーゲン（抗コラーゲンＩ抗体：CST、８４３３８）の発現をウェスタンブロットによって分析した。

結果を図３に示した。これにより、ＴＧＦ－β１による治療が肺線維芽細胞におけるα－ＳＭＡ及びＩ型コラーゲンの発現レベルの増加をもたらすのに対して、ＭＳＣ培養上清による治療がα－ＳＭＡ及びコラーゲンＩの発現レベルを大幅に低下させ得ることが示された。上記結果により、本発明のＭ細胞培養上清が肺線維症を抑制し得ることが示唆された。

実施例８：Ｍ細胞の抗炎症活性の評価
初代ＭＳＣ及び調製例１において得られたＭＳＣを６ウェルプレートに接種し、細胞が７０％～８０％の凝集に達したら、ＩＦＮ－γを種々の濃度（０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）で添加することにより２４時間処理し、次にＩＤＯ、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＧＥ２のｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって検出した。示された結果は３回の反復実験の平均であった。

ＩＤＯの検出結果を図４Ａ及び表８－１に示し、ＰＤＬ１の検出結果を図４Ｂ及び表８－２に示し、ＰＧＥ２の検出結果を図４Ｃ及び表８－３に示した。これらの結果により、ＩＦＮ－γで刺激した後に、本発明のＭ細胞におけるＩＤＯ、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＧＥ２の発現レベルが初代ＭＳＣにおける発現レベルよりも大幅に高いことが示された。上記結果により、本発明のＭ細胞がより良好な免疫調節機能及び抗炎症活性を有することが示唆された。

実施例９：子宮腔内癒着に対するＭ細胞の治療活性の評価
子宮内膜損傷は、子宮内膜線維症、子宮腔の部分的又は完全な閉塞をもたらす場合があり、これが更には稀発月経、無月経、不妊症、又は再発性流産を引き起こし、これは続発性無月経、女性不妊症、及び流産後の掻爬術を伴う患者において発生した。近年、子宮腔の頻繁な手術及び子宮鏡手術の普及により、発生率及び検出率が徐々に増加し、発症年齢がより若くなり、女性の続発性不妊症の２番目の主な原因となっている。臨床医は新しい治療の選択肢を模索し続けているが、その治癒率及び妊娠率は依然としてあまり改善されておらず、その再発率は相対的に高く（軽度の状態を伴う患者の場合に、治療後の再発率は高く、重度の状態を伴う患者の場合には、治療後の再発率は更に高い）、不妊症、再発性流産、早産、前置胎盤、胎盤癒着、又は胎盤着床等の産科合併症は女性のリプロダクティブヘルスに深刻な脅威となる。その高い発生率及びその結果としての女性の生殖機能への損傷は、解決すべき緊急の臨床的問題となっている。現在の臨床治療は、子宮腔の形状を回復し、癒着の再発を防ぎ、損傷した子宮内膜の修復及び再生を促進し、正常な生殖機能を回復することを目的としている。重要な治療工程は、子宮癒着の子宮鏡による分離、子宮内デバイスの術中配置、並びにエストロゲン及びプロゲステロンの術後適用であるが、治療周期が長い、治癒率が低い、癒着が再発し易い、妊娠率が低い、患者における乳房腫瘍及び子宮内膜腫瘍のリスクを高める高用量のエストロゲン適用等の問題があり、子宮内膜基底層における重度の筋肉又は結合組織の損傷のため、エストロゲン及びプロゲステロンに対して奏効に乏しい。

これまで、国内外の学者によりこの疾患の病因について多くの研究が行われており、子宮内膜修復の障害がその形成の主なメカニズムであり得ることが合意されている。例えば、中絶後の掻爬術又は他の子宮腔手術のため、幾つかの病理学的要因により子宮内膜の修復が妨げられ、瘢痕形成及び癒着がもたらされる。

本発明は、子宮鏡手術における子宮内膜癒着の機械的分離、子宮内デバイス又は癒着防止材料の術後配置、エストロゲンの術後投与による子宮内膜成長の促進によって引き起こされる重篤な子宮内膜損傷、及び修復することができない子宮内膜瘢痕、並びに子宮内膜の機能的修復が不可能であるような傷、及び癒着の再発等の問題を克服する。

実験動物：ＳＤラット、雌、８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアを形成し、接着分化を行い、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生し、消化し、継代し、その後の実験用にＰ５世代で使用した。

動物モデリング：ＳＤラットに麻酔した後に、腹部に小さな切り込みを入れ、左子宮を鉗子で露出させ、子宮を２つの止血鉗子でクランプし（４ｃｍ間隔）、１００μｌの９５％エタノールを注入して５分間処理した後に、毎回３分間にて生理食塩水で３回すすいだ。モデリングが完了した後に、７日目に無作為な群分けを行い、２８日目に灌流サンプリング及び分析を行った。

群分け：正常群、モデル群、Ｍ細胞群、各群に５匹のマウス。
正常群：非処理。
モデル群：０日目に９５％エタノールでモデリングを行い、７日目に１００μｌの生理食塩水を注射し、２８日目に灌流サンプリング及び分析を行った。
Ｍ細胞群：０日目に９５％エタノールでモデリングを行い、７日目に３×１０^６個のＭ細胞を含む１００μｌの生理食塩水を注射し、２８日目に灌流サンプリング及び分析を行った。

試料収集：
標本を収集する際に、ラットに腹腔内麻酔をかけた後に、ラットを仰臥位にし、腹部の正中で皮膚切開し、開胸し、心臓を露出させ、心臓を氷冷生理食塩水で灌流した。各ラットに約５０ｍｌの生理食塩水が必要であった。生理食塩水灌流が完了した後に、子宮を５０ｍｌのパラホルムアルデヒドで固定した。灌流が完了した後に、子宮をパラホルムアルデヒドで固定し、切片を分析した。

組織パラフィン切片作製の手順：
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に一晩浸した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し（returning to blue）：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

子宮腔内癒着に対するＭ細胞の前臨床薬力学的評価
ＳＤラット（Weitong Lihuaから購入）に麻酔をし、腹部に小さな切り込みを入れ、左子宮を鉗子で露出させた。子宮を２つの止血鉗子でクランプし（４ｃｍ間隔）、１００μＬの９５％エタノール（Aladdinから購入、カタログ番号Ａ２９８７９２）を注入し、５分後に、毎回３分間にて１００μＬの生理食塩水で３回すすぎ、傷を縫合し、モデリングを完了した。モデリング後７日目に、モデルラットを無作為に３つの群：正常群、モデル群、及びＭ細胞群に分けた。正常群は非処理であり、モデル群にはモデリング後７日目に１００μＬの生理食塩水を注射し、Ｍ細胞群にはモデリング後に１００μＬの生理食塩水当たり３×１０^６個のＭ細胞を注射した。一部の動物をモデリング後１４日目に雄ラットとともにケージに入れ、４２日間継続的に観察した。各群で生まれた胎児ラットの数を数え、３５日齢の子孫ラットを選択して関連する安全検査を行った。モデリング後２８日目に一部の動物を灌流し、その子宮を写真撮影して子宮の形態変化を観察した。パラフィン組織切片をＨＥで染色して、子宮内膜の構造変化を観察した。

図１０１は、子宮試料の光学顕微鏡写真の結果を示している。９５％エタノールを子宮腔に注入した後に、ラットの子宮は重度の癒着を示し、子宮腔が閉塞し、大量の子宮滲出液が見られた。子宮内滲出液は子宮内に保持され、透明な子宮滲出液の泡が形成された。これらの結果により、子宮腔内癒着のラットモデルの誘導に成功したことが明らかになった。Ｍ細胞治療は、子宮腔内癒着を大幅に抑制し、子宮内滲出液を大幅に減少させ、子宮滲出液の泡の容積及び数を大幅に減少させ、子宮腔の形状は基本的に正常に戻った。上記結果により、本発明のＭ細胞が子宮の形状を大幅に改善し、子宮腔内癒着を抑制し得ることが示唆された。

子宮のＨＥ染色の結果を図１０２に示した。９５％エタノールでモデリングした後に、ラットの子宮内膜はより薄くなり、腺は消失し、血管はまばらになった。これらの結果により、子宮腔内癒着モデルの構築に成功したことが明らかになった。Ｍ細胞治療後に、子宮内膜及び子宮筋層は大幅に肥厚化し、新生血管及び腺の数は大幅に増加した。上記結果により、本発明のＭ細胞が損傷した子宮内膜の修復及び再生を促進し得ることが示唆された。

これらの結果により、Ｍ細胞治療後に、子孫の数が大幅に増加し、その数がモデル群と比較して１．２倍増加したことが明らかになった。３５日齢の子孫ラットを試験した結果、子孫は正常な成長状態を示し、明らかな成長の欠陥を示さなかった。上記結果により、本発明のＭ細胞が子宮腔内癒着を治療し、損傷した子宮内膜の修復及び再生を促進し、子孫を増やす能力を増強し、子孫の成長及び発達に影響を及ぼさないことが示唆された。

子宮腔内癒着に対するＭ細胞の臨床薬力学的評価
患者は中等度から重度の子宮腔内癒着と診断された。患者の子宮内膜容積、子宮内膜の厚さ及び形状、並びに瘢痕面積を術前に評価した。全身麻酔及び超音波検査のガイド下で子宮鏡検査を行った。子宮鏡検査により子宮腔の形状を観察した。Ｂ超音波検査のガイド及び子宮鏡検査下での直視の下で、拡張ロッド又は水嚢を通して癒着の鈍的切開を行い、マイクロシザーズ又は切除鏡により鋭的切開を補った（可能な限り避ける）。超音波検査のガイド下で、２１Ｇシリンジ針を用いて子宮内膜と子宮筋層との接合部に懸濁液の３×１０^６個のＭ細胞を注射した。

子宮腔内癒着に対するＭ細胞の臨床治療の結果を図１０３に示した。患者は中等度から重度の子宮腔内癒着を有し、子宮底部に筋肉癒着とともに、瘢痕の形成を伴っていた。卵管が閉塞しており、開口部がはっきりしなかった。子宮壁へのＭ細胞注射による治療後に、患者の子宮の形状は正常に戻り、癒着は見られず、瘢痕は修復され、両側の卵管の開口部が見て取れた。これらの結果により、Ｍ細胞が子宮腔内癒着の臨床治療に十分に使用され得ることが示唆された。この図は、（１）患者が手術時に子宮腔内癒着及び両側の卵管に閉塞を有し、癒着は中等度から重度（混合型）であり、癒着の分離後にＭ細胞（３×１０^６個の細胞）を注射したこと、（２）４週間のフォローアップ後に瘢痕の回復が見られたこと、（３）４ヶ月のフォローアップの間に子宮腔の状態が悪かったこと、及び（４）８ヶ月のフォローアップの間に子宮腔が基本的に正常に戻ったことを示した。

患者の子宮内膜の厚さは大幅に増加し、厚さは７ｍｍ以上であった。患者は妊娠に成功し、健康な子孫を出産した。患者の月経は正常に戻った。上記結果により、Ｍ細胞が子孫の成長及び発達に影響を与えずに子宮腔内癒着を伴う患者の受胎能を回復し得ることが示唆された。

実施例１０：急性肝臓損傷に対するＭ細胞の治療活性の評価
実験動物：Ｃ５７マウス、雄、６週齢～７週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化を行い、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生し、消化し、継代し、その後の実験用にＰ５世代で使用した。

動物モデルの作製：四塩化炭素（ＣＣｌ_４）（３ｍｌ／ｋｇ、コーン油中に１：１で溶解）を腹腔内注射した。
コントロール群：同じ用量のコーン油のみを注射した。
ＣＣｌ_４群：四塩化炭素（ＣＣｌ_４）（３ｍｌ／ｋｇ、コーン油中に１：１で溶解）を腹腔内注射し、ＣＣｌ_４注射の直後に生理食塩水の尾静脈注射を行った。
ＣＣｌ_４＋Ｍ細胞群：四塩化炭素（ＣＣｌ_４）（３ｍｌ／ｋｇ、コーン油中に１：１で溶解）を腹腔内注射し、ＣＣｌ_４注射直後にマウス当たり３×１０^６個の細胞を尾静脈に注射した。

０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、及び６日目に死亡率の統計を行い、７日目に血清を収集して血液生化学的分析を行った。

試料収集：
標本を収集する際に、マウスに腹腔麻酔をし、仰臥位にした。腹部の正中で皮膚切開し、腹腔を開き、中心静脈から血液を収集した。開胸し、心臓を露出させ、心臓を氷冷生理食塩水で灌流した。生理食塩水灌流が完了した後に、５０ｍＬのパラホルムアルデヒドで固定した。灌流が完了した後に、肺を採取して固定切片の分析を行った。収集した血液を室温にて５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を取って血液生化学的分析を行った。

組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

統計分析
Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡ及びｔ検定を分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

実験結果
（１）各群においてＣＣｌ_４及びＭ細胞を注射した後に、マウスを毎日秤量した。ＣＣｌ_４群のマウスの重量は減少し続けた。ＣＣｌ_４＋Ｍ細胞群のマウスの減量速度はＣＣｌ_４群の減量速度よりも大幅に低かったことから、Ｍ細胞が急性肝臓損傷を伴うマウスの減量速度を低下させ得ることを示している。

（２）各群にＣＣｌ_４及びＭ細胞を注射した後に、マウスの死亡率を毎日計算した。結果は以下の通りであり、ＣＣｌ_４の注射後３日以内に、ＣＣｌ_４群において多数の死亡が観察された。しかしながら、ＣＣｌ_４＋Ｍ細胞群におけるマウスは死ななかったことから（ＣＣｌ_４＋Ｍ細胞群の系統はコントロール群の系統と重複していた）、Ｍ細胞が急性肝臓損傷を伴うマウスの死亡率を低下させることができ、急性肝臓損傷を効果的に治療し得たことを示している（表１０－１、図１０４）。

（３）マウスの血清を収集して肝臓機能の血液生化学的検出を行ったところ、ＣＣｌ_４群においてアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びアルカリホスファターゼのレベルが上昇することが判明し、これは明らかな肝臓損傷を示している。しかしながら、ＣＣｌ_４＋Ｍ細胞群におけるレベルは増加を示さなかったことから、Ｍ細胞が血清中のトランスアミナーゼ及びアルカリホスファターゼのレベルを低下させ、肝臓機能を保護し得たことを示している（図１０５）。

（４）ＨＥ染色の結果により、ＣＣｌ_４群のマウスの肝臓において多数の肝臓細胞が死に、多数の炎症性細胞が浸潤することが明らかになった。ＣＣｌ_４＋Ｍ細胞群においては、マウスの肝臓において多数の肝臓細胞死も多数の炎症細胞の浸潤も見られなかった。これにより、Ｍ細胞がＣＣｌ_４の肝細胞への損傷を抑制し、肝細胞の機能を保護し得ることが示された。

実施例１１：筋萎縮症に対するＭ細胞の治療活性の評価
一般にＡＬＳとして知られる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動皮質の上位運動ニューロンと、脳幹及び脊髄の下位運動ニューロンとを冒す特発性の致命的な神経変性疾患である。多数の運動ニューロンが失われると、筋消耗がもたらされ、自発収縮及び痙攣が引き起こされる。ＡＬＳは、家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）と散発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）との２つのカテゴリーに分けられ、家族性ＡＬＳが１０％を占め、散発性ＡＬＳが９０％を占める。ＡＬＳ患者の発症年齢は通常４０歳以降であり、ＦＡＬＳ及びＳＡＬＳの高い発生率はそれぞれ４７歳～５２歳及び５８歳～６３歳であり、発生率は８０歳以降に減少し、女性よりも男性の方がこの疾患になりやすい。患者は一般的に、疾患の発症から３年～５年生存する。遺伝的性質、職業、ライフスタイル、年齢等の様々な要因がＡＬＳの発生率と密接に関連している。一方で、ＡＬＳの病因は、星状細胞がシナプス内に蓄積されたグルタミン酸を時間内に回復することができず、グルタミン酸興奮毒性を引き起こすことであり、他方で、ＳＯＤ１、ＵＢＱＬＮ２、ＯＰＴＮ、ＶＣＰ、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、Ｃ９ＯＲＦ７２を含む突然変異遺伝子は、毒性をもたらす誤ったタンパク質コンフォメーション多量体の産生、及び運動ニューロンの損傷を悪化させる毒性ＲＮＡ種の産生をもたらし、シナプス退縮を引き起こし、シナプス後膜受容体に結合することができず、完全な電気信号の伝達がうまくいかず、最終的に臨床症状が見られる。ＡＬＳの治療には薬物治療が利用可能である。現在、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）及び欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって承認された２つの神経保護薬だけが、一部の患者の寿命を数ヶ月延長することができる：過剰なグルタミン神経伝達を遮断することができるリルゾール、酸化ストレスによる損傷を防ぐことができるエダラボン、外科的治療：患者が嚥下困難又は咀嚼困難である場合は、経鼻胃栄養法又は胃瘻造設術を行う場合がある。呼吸筋が麻痺している場合は、気管切開術をできるだけ早く行って、換気を使用して呼吸を維持するべきであり、補助療法：リハビリテーション訓練もある。臨床的には、特定の症状に対応する特定の治療法がある。上述の治療法は、患者の生存期間を数ヶ月だけ延長することができるが、患者の生活の質を大幅に改善することはない。したがって、依然としてより効果的な治療が緊急に必要とされている。上記の治療法に加えて、遺伝子編集は現在、前臨床研究において注目の話題である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集系を介したＳＯＤ１の直接的な編集は、筋萎縮性側索硬化症の治療にｉｎ ｖｉｔｒｏで及びトランスジェニックマウスにおいて使用されている。しかしながら、遺伝子編集にはまだ多くの不確実性がある。

Ｍ細胞の調製及び培養：
胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生し、消化し、継代し、Ｐ５をその後の実験用に使用した。

実験動物：
Ｃ５７ＢＬ６のバックグラウンドを有する雄のＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）マウス（１８週齢）をJiangsu Jinzhihe Biotechnology Co., Ltd.から購入した。全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターのＳＰＦグレードで保持した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。実験をマウスにおける適応給餌の２週間後に開始した。

実験材料：電子スケール、使い捨て滅菌シリンジ（１ｍｌ）

実験試薬：生理食塩水

装置：マウス用ロータロッド、マウス用握力試験装置

実験群：正常なコントロール群、ＡＬＳマウス＋溶剤（溶剤群）、ＡＬＳマウス＋Ｍ細胞（Ｍ細胞群）、各群において３匹のマウス。

統計：全てのデータをＰｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおいてｔ検定によって分析して、分散分析及び有意性検定を行い、実験データを平均±標準偏差（平均±ＳＤ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

筋萎縮性側索硬化症におけるＭ細胞の薬力学的評価
ＡＬＳマウスを、購入後１週間にわたり動物室において適応のために給餌した。翌週に行動訓練を行った。行動訓練は、ロータロッド試験及び握力試験を含んでいた。ロータロッド実験：ロータロッドの回転速度及び時間：５ｒｐｍ～４０ｒｐｍ、３００秒、その後、マウスをリグに載せて３０秒間適応させた後に、訓練を開始した。この実験を毎回３０分間隔で３回繰り返した。握力実験を以下のように実施した。マウスをグリッド上に載せ、マウスの尾を掴み、マウスがグリッドから離れるまで引き戻した。この実験を毎回間に３０秒の間隔を置いて３回繰り返した。１週間の訓練の後に、正式な実験を開始した。マウスの体重を記録し、同時に後肢伸展反射を記録した。マウスをこれらの２つの点に従って群分けした。その後に、薬物注射を行い、正常なコントロール群は非治療のままにした。ＡＬＳマウス＋溶剤群には、尾静脈を通じて２００μｌの生理食塩水を注射し、ＡＬＳマウス＋Ｍ細胞群には、尾静脈を通じて２００μｌの細胞をマウス当たり３×１０^６個で注射した。以下のモニタリングを毎週実施した：体重、生存率、ロータロッド試験、握力試験、歩行分析。実験の終わりに、マウスを安楽死させた直後に灌流によって腰髄を採取し、凍結させ、切片を作製し、包埋し、免疫組織化学的染色に供した。

ＡＬＳマウスの発生率の統計結果を図１０６に示した。これらの結果により、Ｍ細胞群の発生率が２７週間で溶剤群の発生率よりも大幅に低く（５０％対８０％）、Ｍ細胞がマウスにおける発症を大幅に遅延させることが明らかになった。

結果の分析：ロータロッド試験はマウスの四肢の協調及び運動能力をモニタリングすることができ、握力試験は筋力をモニタリングすることができる。２４週目及び２９週目においては、溶剤群におけるマウスはロータロッド上に滞在する時間がより短く、特に２９週目においてはそれらの筋力は弱かった。しかしながら、Ｍ細胞群におけるＡＬＳマウスの滞留時間は、特に２９週間目に溶剤群における滞留時間よりも有意に長く（１４４対２４４）、有意差（^＊＊ｐ＜０．０１）を有することから（表１１－１、図１０７）、Ｍ細胞がマウスの運動能力を有意に改善し得ることが示された。さらに、Ｍ細胞群におけるマウスの握力は２９週目に溶剤群の握力よりも高く、有意差（^＊＊ｐ＜０．０１）があったことから（表１１－２、図１０８）、Ｍ細胞がマウスの筋力を有意に改善することが示され、間接的にＭ細胞が運動ニューロンの損傷を軽減し得ることが示された。

マウスの体重及び生存率の結果により、Ｍ細胞がマウスの体重増加を促進し、マウスの生存率も改善し得ることが明らかになった。免疫組織化学的結果により、溶剤群においては、腰髄運動ニューロンがより少なく、ミクログリア及び星状細胞が大幅に増加したのに対して、Ｍ細胞群においては、腰髄運動ニューロンが増加し、ミクログリア及び星状細胞が減少することが明らかになった。これにより、Ｍ細胞が運動ニューロンを保護し、疾患進行を緩和し得ることが示された。

実施例１２：炎症性腸疾患に対するＭ細胞の治療活性の評価
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、宿主遺伝学、宿主免疫学、微生物叢、及び環境曝露の間の相互作用を体現する粘膜免疫系及び共生生態系の調節不全に関連する典型的な慢性再燃性疾患である。効果。ＩＢＤは、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の２つの主要な病型として現れる。ＵＣは結腸を冒し、ＣＤは胃腸管の任意の領域を冒す可能性があるが、主に小腸の終端の回腸において発生する。

ＩＢＤの現在の臨床治療は保守的であり、主に症状を緩和し、その過度の悪化を抑制することに頼り、腸閉塞及び結腸癌の物理的切除を避けている。現在の治療法としては、主にアミノサリチル酸薬、コルチコステロイド、免疫抑制剤、生物剤等が挙げられる。これらの薬物は、疾患に関連する合併症を軽減し、患者の生活の質を改善する。５－アミノサリチル酸（５－ＡＳＡ）は、ＵＣ患者の抗炎症治療に一般的に使用されており、組織炎症を効果的に緩和することができ、これらの患者における結腸炎関連腫瘍のリスクを軽減する場合があり、その作用メカニズムは、シクロオキシゲナーゼの活性を阻害することにより、プロスタグランジンの合成を低下させ、炎症誘発性サイトカイン及び酸素フリーラジカルの産生を阻害し、好中球の走化性及び肥満細胞の活性化を阻害することである。しかしながら、５－ＡＳＡはＣＤ患者における組織炎症を和らげることはできない。コルチコステロイドによる治療は潰瘍性大腸炎の症状を和らげることができるが、長期的な効果は維持されない。特定の細胞質受容体に結合した後に、グルココルチコイドは核内に輸送され、それによって関連遺伝子の発現を活性化又は阻害する。グルココルチコイドはまた、炎症誘発性転写因子を不活性化し、ＮＦ－κＢ及びアクチベータータンパク質－１（ＡＰ１）等のタンパク質間相互作用を通じて炎症性メディエーターの活性化を防ぐこともできる。免疫抑制薬としては、アザチオプリン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリンＡ、タクロリムスが挙げられ、これらは、細胞のアポトーシスを誘導し、免疫細胞の生存に影響を与え、それによって炎症誘発性遺伝子の発現を阻害することによって作用する。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニストはこの分野における主な進展である。ＴＮＦアンタゴニストは臨床においてＣＤ及びＵＣの良好な治療を達成したことから、ＩＢＤにおけるＴＮＦの重要な病因的役割を説明している。しかしながら、多くの患者における抗ＴＮＦ療法に対する応答の欠如又は二次的喪失は重要な臨床的問題である。上述の治療アプローチによりＩＢＤを伴うあらゆる患者が治療されるわけではなく、一部のＩＢＤ患者は上述の薬物治療に耐性があり、それらの症状を和らげることができない。最後に、外科的切除を治療に使用する必要がある。近年、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ＩＢＤの治療にますます使用されており、良好な治療効果を達成している。ＭＳＣは組織修復及び免疫制御の能力を有することから、自己免疫疾患及びＩＢＤの治療において幅広い応用の見込みがある。

実験動物：７週齢から８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（ＳＰＦグレード）、１８ｇ～１９．５ｇの体重、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスはBeijing Weitong Lihua Companyから購入した。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生し、消化し、継代し、その後の実験用にＰ５世代で使用した。

Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを、それらの体重に応じて、正常群、モデル群、及び治療群に無作為に分けた。

デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）（分子量３６０００～５００００、MP）を使用することにより、飲料水によって実験的結腸炎モデルを樹立した。

２．５％ＤＳＳに誘発された炎症性腸疾患のフローチャートを図１０９に示した。

５％ＤＳＳに誘発された炎症性腸疾患のフローチャートを図１１４に示した。

正常なコントロール群：蒸留水を飲ませたものをコントロールとして使用した。
モデル群：２．５％ＤＳＳの構成（１２．５ｇのＤＳＳ粉末を蒸留水に加え、混合して溶解し、最終的な一定容量は５００ｍｌであった）；５％ＤＳＳの構成（２５ｇのＤＳＳ粉末を蒸留水に加え、混合して溶解し、最終的な一定容量は５００ｍｌであった）。
治療群：０日目、３日目、及び６日目に３００μｌの細胞懸濁液を腹腔内注射し、細胞量は３×１０^６個であった。

マウスのバイタルサインの観察：
毎朝、マウスの秤量を行い、便の硬さ及び便中の血液を観察した。ＤＡＩスコアは、体重変化、便の硬さ、及び便中の血液の３つのスコアの累積合計から構成された。

試料収集
標本を収集する際に、マウスに腹腔内麻酔をした後に、マウスを仰臥位にし、マウスの皮膚を腹部の正中で切開し、開胸し、心臓を露出させ、心臓を氷冷生理食塩水で灌流した。各マウスに約２０ｍｌの生理食塩水が必要であった。腹膜組織を露出させ、回腸から結腸までの結腸全体を注意深く摘出した。結腸組織をガーゼ上に平らに置き、写真を撮影してその長さを記録した。

動物組織からの総タンパク質の抽出
１．遠心分離チューブカラム及び受容チューブカニューレ（receiver tube cannula）を氷上で予冷した。
２．１５ｍｇ～２０ｍｇの組織を遠心分離チューブカラムに入れ、プラスチック棒で回して５０回～６０回磨砕し、２００μｌの細胞溶解液を加え、３０回～６０回磨砕を続けた。
３．これに蓋をして、室温で１分～２分間インキュベートを行った後に、１４０００ｒｐｍ～１６０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。
４．収集チューブを直ちに氷上に置き、遠心分離チューブカラムを廃棄した。タンパク質抽出が完了した後に、これを後続の実験において使用することができ、－８０℃の冷蔵庫内で凍結保存した。

サスペンションチップシステムによる因子分泌の検出
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。
（２）凍結保存した試料を－８０℃の冷蔵庫から取り出した。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を試料に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランクコントロール、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

組織パラフィン切片作製の手順：
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

結腸組織形態学についてのスコアリング基準
組織学的スコアリングは盲検的に行った：陰窩構造（正常、０；重度の陰窩異常、陰窩全体の喪失、３）、炎症性細胞浸潤の程度（正常、０；高密度炎症性浸潤、３）、筋肉肥厚化（粘膜上に位置する陰窩、０；明らかな筋肉肥厚化、３）、陰窩膿瘍（不存在、０；存在、１）、及び杯細胞枯渇（不存在、０；存在、１）。総組織学的スコアは、各サブスコア項目の合計であった。

マウス結腸試料の光学顕微鏡写真を図１１０に示した。

マウス結腸の長さを図１１１及び表１２－１に示した。

図１１２におけるマウス結腸のＨＥ切片の病理学的スコアの統計を表１２－２に示した。

試料タンパク質を多因子キット及びＥＬＩＳＡキットによって検出した（Xin Zhou, et.al, 2019, Cell reports、Emanuela Sala, et, al, Gastroenterology, 2015を参照）：２．５％ＤＳＳ群と比較して、Ｍ細胞群では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＴＦＮ－α、ｉＮＯＳ等の炎症誘発性因子の含有量が大幅に減少し、ＩＬ－１０等の抗炎症因子の含有量が大幅に増加し、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＤＦ－１ａ等の栄養因子の含有量も大幅に増加したことから、Ｍ細胞が炎症性腸疾患の治療において炎症の発生を抑制し、栄養因子の分泌を増加させて結腸組織の修復を促進することができ、炎症性腸疾患の治療において炎症を抑制し、組織修復を促進する機能を有したことを示している。

マウス結腸のＨＥ染色の病理学的スコアの統計を図１１３に示した。

マウス結腸のＨＥ染色の病理学的スコアの統計を図１１６に示した。

マウス生存の統計を図１１７及び表１２－４に示した。

試料タンパク質を多因子キット及びＥＬＩＳＡキットによって検出した。５％ＤＳＳ群と比較して、Ｍ細胞群では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＴＦＮ－α、ｉＮＯＳ等の炎症誘発性因子の含有量が大幅に減少し、ＩＬ－１０等の抗炎症因子の含有量が大幅に増加し、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＤＦ－１ａ等の栄養因子の含有量も大幅に増加したことから、Ｍ細胞が炎症性腸疾患の治療において炎症の発生を抑制し、栄養因子の分泌を増加させて結腸組織の修復を促進することができ、炎症性腸疾患の治療において炎症を抑制し、組織修復を促進する機能を有したことを示している。

免疫蛍光染色において、Ｍ細胞治療後に、結腸組織におけるＭ２型マクロファージの割合が大幅に上方調節される一方で、Ｍ１型マクロファージの割合が下方調節されることから、炎症を和らげ、組織修復を促進するのに役立つこととなることが判明した。

上記結果により、Ｍ細胞治療がＩＢＤマウスにおける炎症を軽減し、結腸組織を保護することができ、高濃度ＤＳＳでの誘導の場合には、Ｍ細胞がマウスの生存率を大幅に改善し得ることが明らかになった。結論として、Ｍ細胞は結腸の炎症を軽減し、結腸組織の修復を促進し、マウスの生存率を改善し、炎症性腸疾患に対する効果的な治療効果を有し得た。

実施例１３：火傷に対するＭ細胞の治療活性の評価
火傷は広範囲にわたる皮膚損傷を引き起こすことが多く、皮膚バリア機能の喪失及び内部環境バランスの乱れを招き、創傷治癒には長い時間がかかる。臨床治療には大きい面積の皮膚移植が必要になることがよくあるが、火傷の患者は皮膚が限られており、皮膚の採取に二次的な損傷がある。創傷感染は、創傷治癒困難及び敗血症性ショック、感染及び壊死性創傷の進行性の深化、及び創傷治癒後の瘢痕治癒等の様々な合併症を引き起こし、拘縮変形につながり、結果として見苦しい外観及び機能障害をもたらす。患者の予後は悪く、機能回復は不良であり、後のリハビリ治療は患者の心理的及び経済的負担を増大させる。したがって、火傷の分野では、迅速な創傷治癒を促進し、皮膚の外観及び機能をより良く回復させることができる方法を見つけることが必要になっている。

これまでのところ、皮膚損傷は自家皮膚移植又は人工皮膚移植によって治療されてきたが、大きな面積の火傷及び熱傷の治療にはまだ不十分である。間葉系幹細胞の出現、及び材料との併用治療は、皮膚損傷の治療に幾らかの希望をもたらした。

本発明は、自家移植のための皮膚の数が限られている、皮膚損傷を適時かつ効果的に治療することができない、損傷領域の皮膚を機能的に治療することができない等の問題を克服する。本発明は、自家移植のための皮膚の数が不十分であり、その供給源が限られている、皮膚の損傷後に機能を回復させることができないという問題を克服する。本発明は、移植用の皮膚の供給源が限られている、及び自家移植用の皮膚が限られている等の問題を解決し、皮膚損傷後に付属器を構築し、皮膚損傷後の創傷治癒の加速を達成し、線維症の発生を低減させ、皮膚の機能回復を達成する。

達成した効果：Ｍ細胞の移植後、ラットの熱傷領域の治癒速度が著しく加速され、創傷面積が小さくなった。組織切片の結果は、マトリゲル治療と組み合わせたＭ細胞は、線維症の発生を低減させ得ることを示した。
（１）Ｍ細胞の調製
（２）Ｍ細胞移植の方法及び投与量
（３）ラット熱傷モデル

実験動物：ＳＤラット、雄、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代をその後の実験に使用した。

動物モデルの準備：ＳＤラットを５％抱水クロラールで麻酔し、麻酔後に背毛を剃った。金属棒を水浴の沸騰水中で５分間加熱し、取り出し、アルミニウム棒をピンセットで留め、ラット背部の正中線から左右に１ｃｍ離して置き、重力の作用で２０秒間アルミニウム棒によって火傷を引き起こし、それによってモデルを作製した。２日後、損傷領域の皮膚を切り取り、ラットを群分けして治療した。熱傷領域の皮膚を切り取り、写真を撮影し、撮影の高さを固定し、創傷の隣に目盛りのある定規を置いた。モデリング領域を測定するため、測定及び決定にはＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用した。

群分け：コントロール群、Ｍ細胞群。
コントロール群：３Ｍの包帯のみを適用した。
Ｍ細胞群：２×１０^６個のＭ細胞（ｐ５世代）を２００μｌのマトリゲルに混合し、２００μｌの混合物を各創傷に加えて治療し、３Ｍ包帯を適用した。

０日目、７日目、１０日目、１４日目、及び２１日目に写真を撮影し、２１日目に灌流及びサンプリングを行い、試料をパラホルムアルデヒドに一晩浸漬した後、パラフィン切片の作製を行い、ＨＥ染色及びマッソン染色を実施した。

試料収集：
標本を収集する際、ラットを腹腔内麻酔し、次いでラットを仰臥位にし、ラットの腹部の中央で皮膚を切り、胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。各ラットには約５０ｍｌの生理食塩水が必要であった。生理食塩水灌流が完了した後、５０ｍｌのパラホルムアルデヒドを固定に使用した。灌流が完了した後、損傷領域の皮膚を切り取り、固定し、切片を作製し、分析した。

組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

マッソン染色
（１）パラフィン切片を水に脱蝋する：切片をキシレンＩに２０分間、キシレンＩＩに２０分間、無水エタノールＩに１０分間、無水エタノールＩＩに１０分間、９５％アルコールに５分間、９０％アルコールに５分間、８０％アルコールに５分間、７０％アルコールに５分間順次入れ、蒸留水で洗浄した。
（２）核のヘマトキシリン染色：マッソン染色キットでワイゲルト鉄ヘマトキシリンを用いて５分間染色を行い、水道水で洗浄した後、１％塩酸アルコールで数秒間分別を行い、水道水ですすぎを行い、流水で数分間すすぐことによって色出しした。
（３）ポンソーレッド染色：マッソン染色キットのポンソーレッド・酸フクシン溶液で５分～１０分間染色を行い、蒸留水によるすすぎを迅速に行った。
（４）リンモリブデン酸処理：マッソン染色キットのリンモリブデン酸水溶液による処理を約３分～５分間行った。
（５）アニリンブルー染色：水で洗浄する代わりに、マッソン染色キットのアニリンブルー溶液で５分間対比染色を行った。
（６）分別：１％の氷酢酸による処理を１分間行った。
（７）脱水及び封入：切片を９５％アルコールＩに５分間、９５％アルコールＩＩに５分間、無水エタノールＩに５分間、無水エタノールＩＩに５分間、キシレンＩに５分間、キシレンＩＩに５分間順次入れて脱水及び透明化を行い、次いで切片をキシレンから取り出し、わずかに風乾させ、中性樹脂で封入した。
（８）顕微鏡で顕微鏡検査を行い、画像を取得して分析した。

免疫組織化学染色：
免疫組織化学キット（Fuzhou Maixin、ＫＩＴ－９７１０）を使用して、パラフィン切片に対して免疫組織化学染色を行った。具体的な手順は次の通りであった：
１．脱蝋：（１）キシレンＩ、ＩＩ、各１０分、（２）勾配アルコール：１００％無水エタノール、２分間、９５％無水エタノール、２分間、８０％無水エタノール、２分間、７０％無水エタノール、２分間。
２．水和：蒸留水で２回、毎回５分（シェーカーに置く）洗浄した。
３．パラフィン切片の脱パラフィン化及び水和後、すすぎをＰＢＳで３回、毎回３分間行った。
４．抗原賦活化溶液（１０ｍＭ ｐＨ６．０クエン酸ナトリウムバッファー）の調製：
（１）原液の調製：溶液Ａ：クエン酸三ナトリウム二水和物２９．４１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ；溶液Ｂ：クエン酸２１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ。
（２）作業液の調製：溶液Ａ８２ｍＬ＋溶液Ｂ１８ｍＬ＋蒸留水９００ｍＬ。
５．抗原賦活化：切片をクエン酸ナトリウムバッファーで満たしたプラスチック製又は耐熱性のガラス容器に入れ、切片を浸漬し、電子レンジでミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間処理し、クエン酸ナトリウムバッファーを補充し、ミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間再び処理を行った。
６．試薬Ａ（ペルオキシダーゼブロッキング溶液）を添加し、室温で１０分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼの活性を遮断し、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
７．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬの試薬Ｂ（正常な非免疫動物血清）を加え、室温で１０分間インキュベートした。
８．血清を廃棄し、１滴又は５０μＬの一次抗体を加え、４℃で一晩又は室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
９．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのビオチン標識二次抗体（試薬Ｃ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１０．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのストレプトアビジンペルオキシダーゼ溶液（試薬Ｄ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１１．ＰＢＳを廃棄し、２滴又は１００μＬの新たに調製したＤＡＢ溶液を加え、顕微鏡下で３分～１０分間観察を行った。
１２．すすぎを水道水で行い、ヘマトキシリンで対比染色を行い、ＰＢＳ又は水道水ですすぎを行って色出しした。
１３．発色にＤＡＢを使用する場合、切片を勾配アルコールで脱水して乾燥させる必要があり、キシレンで透明化を行い、中性樹脂で封入を行った。
１４．顕微鏡で写真を撮影した。

免疫蛍光染色：
（１）組織切片を脱蝋し、水に移した。
（２）抗原マイクロ波賦活化を９２℃～９６℃の温度で１０分～１５分間行い、室温まで自然冷却した。
（３）正常ヤギ血清ブロッキングを３７℃で６０分間行った。
（４）過剰の血清を捨て、一次抗体を滴加し、３７℃で２時間又は４℃で一晩静置し、ＰＢＳで５分×３回すすぎを行った。
（５）フルオレセイン標識二次抗体を滴下し、３７℃で６０分間暗所に静置し、０．０１Ｍ ＰＢＳで５分×３回すすぎを行った。
（６）切片をクエンチ防止（anti-quenching）封入剤で封入し、暗所にて４℃で保存した。
（７）蛍光顕微鏡による観察及び撮影を行った。

異なる日の創傷の写真を図１１８に示した。

創傷面積サイズの統計を図１１９に示した。

創傷非治癒率の統計を図１２０に示した。

２１日目の創傷面積サイズの統計を図１２１に示した。

表１３－１は、０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目及び２１日目のラットの損傷皮膚面積の統計値を示した。

表１３－３は、２１日目のコントロール群及びＭ細胞群の創傷面積の統計を示した。

ＨＥ染色及びマッソン染色の結果を図１２２に示した。ＨＥ染色の結果は、Ｍ細胞群の創傷治癒がコントロール群の創傷治癒よりも良好であることを示した。Ｍ細胞群の創傷は完全に治癒し、表皮は完全に治癒していたが、コントロール群の創傷の表皮の中央部はまだ完全には治癒していなかった。マッソン染色の結果は、コントロール群で着色がより濃く、コラーゲンが沈殿していることを示し、これは重度の線維症を示す。しかしながら、Ｍ細胞治療群は染色前のコラーゲン沈着が少なく、線維化の程度はコントロール群よりも低かった。Ｍ細胞及びマトリゲルの移植後、ラットの皮膚損傷の創傷回復速度が加速され、組織切片の線維化が少なくなった。

５日目及び７日目に、モデリング部位のラットの皮膚に免疫組織化学染色を行った。Ｍ細胞群におけるＣＤ３、Ｆ４／８０及びＭＰＯの発現はモデル群よりも有意に低く、Ｍ細胞が火傷をした後の創傷部位の炎症を軽減し、炎症を抑制し得ることを示した。Ｍ細胞におけるＫ１４の発現はモデル群よりも有意に高く、Ｍ細胞が皮膚損傷後の創傷の表皮化を加速し、創傷治癒を加速し、皮膚損傷において効果的な治療的役割を果たし得ることを示した。

１４日目のラット皮膚切片の免疫蛍光同定は、Ｍ細胞群におけるＣＤ３１マーカーの発現がコントロール群よりも有意に高いことを示し、Ｍ細胞治療が、皮膚創傷の血管新生を促進し、損傷後の皮膚の再生に重要な効果を有することを示した。

皮膚創傷切片の免疫蛍光染色は、Ｍ細胞群におけるβ－カテニン、ＣＤ１３３及びＫｉ６７の発現がモデル群よりも有意に高いことを示し、Ｍ細胞群では毛包器官が多く、Ｍ細胞治療により皮膚損傷後の毛包の再生が促進され得ることを示した。

結論として、Ｍ細胞治療は、皮膚創傷の治癒を加速し、皮膚の創傷の炎症を軽減し、血管及び毛包の再生を促進し、コラーゲンの沈着を減らし、線維症の発生を抑制することができた。したがって、Ｍ細胞は皮膚損傷を効果的に治療することができた。

実施例１４：男性生殖器系疾患に対するＭ細胞の治療活性の評価
生殖器系の器官は、生殖腺、生殖管、及び付属器で構成される。生殖器官は、様々な活動、受精、妊娠、及びその他の生理学的プロセスを通じて子孫を繁殖させるように機能する。生殖器系疾患としては、主に、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌等の生殖器系腫瘍；結核感染、慢性前立腺炎、精巣上体炎等の特異的感染症及び非特異的感染症等の生殖器系感染症；埋没陰茎、有帆陰茎、停留精巣等の生殖器系の奇形；男性の勃起不全、精索静脈瘤、女性の多嚢胞性卵巣等の性機能障害関連疾患が挙げられる。

男性生殖器系の疾患としては、排尿異常、膿尿、異常な尿道分泌物、疼痛、腫瘤、性機能障害、及び泌尿器疾患に関連する男性不妊症が挙げられる。男性生殖器系の疾患としては、主に、膀胱炎、尿道炎、尿失禁、尿閉等の泌尿器系の炎症；精巣上体炎、精嚢炎、前立腺炎等の生殖器系の炎症；精巣上体結核（testicular epididymal tuberculosis）、精嚢結核等の生殖管結核；精巣挫傷、陰茎折症、尿道断裂等の生殖器系路損傷；精索静脈瘤、精子無力症、先天性輸精管閉塞、輸精管の欠如等の男性不妊の疾患；男性の勃起不全、早漏、性欲減退、非射精（non-ejaculation）、射精遅延等の男性の性機能障害疾患が挙げられる。生活環境の汚染、労働圧力の高まり、及び食事構造の変化に伴い、現代の男性の生殖器系疾患の発生率は年々増加している。

男性不妊症は、男性の要因によって引き起こされる不妊症を指し、一般的に、避妊措置を講じずに結婚後２年超同居していて、女性が妊娠していない場合をいう。男性不妊症としては、精巣萎縮症、精巣発育不全、精子減少症、精子形成障害、無精子症、閉塞性無精子症、精子無力症、クラインフェルター症候群、ＸＹＹ症候群、カルマン症候群、選択的ＬＨ欠乏症及びＦＳＨ欠乏症、副腎過形成、高プロラクチン血症、精索静脈瘤、精子奇形症等が挙げられる。

精子減少症は、内分泌機能障害、生殖器系感染、精索静脈瘤、抗精子抗体、停留精巣、陰嚢水腫、栄養失調、及び化学療法、放射線療法、肥満によって引き起こされる精子減少症等を含む、精液中の精子の数が正常で健康な生殖能力のある男性よりも少ないと定義される。

実験動物：ＳＤラット、雄、６週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

ブスルファンの調製：ブスルファン粉末０．４ｇを計量し、ジメチルスルホキシド１０ｍｌに溶解して、４０ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。完全に溶解した後、該濃度のブスルファンを遠心管に小分けにし、後で使用するために暗所にて４℃で保存した。

動物のモデリング：ＳＤラットを麻酔した後、腹部に小さな切開部を切り、左精巣をピンセットで露出させ、調製したブスルファン５０μｌをモデリングのために注射した後、ラットを各群に４匹ずつ群に分けた。

モデル群：１００μｌの生理食塩水を注射した。
Ｍ細胞群：３×１０^６個のＭ細胞（Ｐ５世代）を含む生理食塩水１００μｌを注射した。

２回目の治療を１０日目に、灌流及びサンプリングを２０日目に行い、左右の精巣を計量した。

試料収集：
標本を収集する際、ラットを麻酔し、次いで仰臥位にし、ラットの腹部の中央で皮膚を切り、胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。各ラットには約５０ｍｌの生理食塩水が必要であった。生理食塩水灌流が完了した後、５０ｍｌのパラホルムアルデヒドを用いて固定を行った。灌流が完了した後、睾丸をパラホルムアルデヒドで固定し、切片を作製し、分析した。

組織パラフィン切片作製の手順：
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に一晩浸した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

ラット精巣上体における精子の濃度、運動性、及び奇形率の検出
ラット精巣上体の精子密度及び生存率を、精子カウントプレートで計数することにより決定した。一般的には、直線運動、不規則運動、及びｉｎ－ｓｉｔｕ運動を含む運動中の精子は全て、生存可能な精子であると見なされた。

精子計数プレートによる計数（精子密度が低いときの計数にこの方法を使用）：精巣上体の尾部から乳白色の精子の塊を絞り出し、細く引き延ばされた丸い頭部を有するガラス管を使用して精子を１ｍｌの受精液に移し、インキュベーターで３０分間インキュベーションを行い、精子が全て分散したら計数した。精子計数プレートに毎回１０μｌの精子を加え、顕微鏡下、１０視野で精子の総数を計数し、試料ごとに３回の計数を繰り返し、平均値を計算した。精子密度の計算は次の通りであった。
精子数／視野＝１０視野の精子の総数／１０

精子奇形率の検出：希釈した精子を清潔なガラススライドに落とし、新しいカバーガラスで押し、乾燥させ、固定液（メタノール：氷酢酸＝３：１）で１５分間固定し、スライドの背面を流水でゆっくりとすすぎ、完全にすすいできれいにした後、風乾させた。ギムザ染色を１．５時間行い、前面が青くならなくなるまで背面を流水ですすぎ、風乾させ、顕微鏡検査に供した。１０倍の対物レンズを用いて５つの視野を無作為に選択し、毎回２００個の精子を計数し、精子の総数及び奇形精子の数を数え、平均値をとった。

透過型電子顕微鏡検査による超微細構造の観察
ラット精巣組織を２．５％のグルタルアルデヒドにおいて４℃で１２時間固定し、勾配エタノールで脱水し、浸潤させてエポキシ樹脂に包埋し、暗所でクエン酸鉛及び酢酸ウラニルで染色し、半薄切片を作製した後、通常の光学顕微鏡下で観察を行った。位置決め後、超薄切片を電子顕微鏡検査用の二重鉛染色に供し、オーブンで２０分間乾燥させ、透過型電子顕微鏡下で精巣の超微細構造を観察した。

精巣の光学顕微鏡写真を図１２３に示した。

左精巣と右精巣との重量比を図１２４に示した。

精巣のＨＥ染色像を図１２５に示した。

表１４－１は、２０日目に試料を採取した際のラットの精巣の重量の要約を示した。

血球計による精子密度及び生存率の検出：
ラットの精巣上体における精子の数、運動性、及び異常率の検出は、Ｍ細胞治療群における精子密度がモデル群よりも有意に高く、Ｍ細胞治療群における精子運動性がモデル群よりも有意に高く、精子の異常率がモデル群よりも有意に低いことを示しており、これらはＭ細胞治療が精子の再生を促進し、精子の運動性及び正常な形態の維持に重要な効果を有することを示した。

透過型電子顕微鏡による精巣組織の超微細構造：Ｍ細胞治療群では、精巣精細管の細胞液胞が減少し、細胞が密接に配置され、核がいっぱいになり、細胞小器官がはっきりと見え、正常で完全な精子が見えるのに対し、モデル群では、細胞中心において液胞が明らかであり、細胞構造がひどく損傷しており、核が収縮し、細胞小器官の構造が不明確であることがわかり、このことはＭ細胞治療が正常な精子形態の回復に重要な役割を果たしたことを示した。

以上の結果は、Ｍ細胞注射療法が精子の再生を促進し、精子の運動性及び正常な形態を維持する上で重要な役割を果たし、正常な精子の形態及び機能の回復に重要な役割を果たすことを示した。したがって、Ｍ細胞注射は、精子減少症及び無精子症、並びにその他の症状を効果的に治療し得る。

実施例１５：癲癇に対するＭ細胞の治療活性の評価
癲癇は、脳のニューロンが突然異常に放電し、一過性の脳機能障害をもたらす慢性疾患である。癲癇は、脳卒中後２番目に多い神経疾患である。脳内のニューロンの「異常な発火」は癲癇発作を引き起こし、反復的で一過性の特徴がある。癲癇は全世界で７０００万人超が罹患しており、中国の人口の発症率は５‰～７‰で、全国で６５０万人～９１０万人の患者がいる。一部の脳血管合併症、頭部外傷、中枢神経系感染症等は、続発性癲癇を引き起こす可能性があり、睡眠、年齢、及び遺伝的性質は特発性癲癇と密接に関係している。癲癇の治療について、最も広く使用されている治療法は抗癲癇薬である。しかしながら、分子標的の異なる抗癲癇薬（ＡＥＤ）が３０種類存在しているにもかかわらず、癲癇の薬物治療には、薬剤耐性、副作用、頻度依存（frequent dependence）に伴う毒性、及び記憶障害等、依然として多くの課題がある。さらに、脳外科手術は最も重要な代替治療であるが、登録の適格性と並んでリスク及び費用を考慮する必要がある。現在、臨床試験は主に薬物治療であり、２００件超が第ＩＩＩ相にある。第ＩＩ相のＭＳＣ臨床試験が１つある。

Ｍ細胞の調製及び培養：
胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を消化し、継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

実験動物：
５週齢～７週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットをBeijing Sibeifu Biotechnology Co., Ltdから購入した。全ての動物を、中国科学院動物学研究所の実験動物センターのＳＰＦグレードで飼育した。動物の世話及び使用は、中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物の実験手順は全て、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施された。ラットの適応給餌の１週間後、実験を開始した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。実験を、ラットの適応給餌の１週間後に開始した。

実験群：
正常コントロール群、ＰＴＺ＋溶剤（溶剤群）、ＰＴＺ＋Ｍ細胞（Ｍ細胞群）、各群に６匹のラット。

実験材料：１ｍｌシリンジ

実験試薬：ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）、生理食塩水

ＰＴＺ５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射後、試験物質を直ちに尾静脈に注射した。ＰＴＺ＋溶剤群の尾静脈に１ｍｌの生理食塩水を注射し、ＰＴＺ＋Ｍ細胞群の尾静脈に１ｍｌの細胞を注射した：５×１０^６／ラット。その後、ラットを透明なガラスケージに入れ、初期発作に費やした時間、初期発作のグレード、発作グレード、初期大発作潜時、並びに大発作の持続時間及び割合を記録した。

統計：全てのデータを、分散分析及び有意性検定のためＰｒｉｓｍ ７．０統計解析ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡによって分析し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＤ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

図１２６はラットにおける初期発作潜時の統計を示した。図１２７はラットにおける初期発作レベルの統計を示した。ラットにおける初期発作の分類統計（grading statistics）を図１２８Ａに示した。ラットにおける初期発作の分類統計を図１２８Ｂに示した。図１２９はラットにおける大発作の割合の統計を示した。

尾静脈注射のＭ細胞群では、ラットの初期発作潜時が３００秒超延長され、癲癇発作のグレードがグレード３からグレード２に低下し、発作グレードがグレード４からグレード３に低下し、大発作潜時は５００秒超延長され、癲癇発作の割合は溶剤群と比較して６６．７％に減少した。上記のデータは、Ｍ細胞が癲癇発作を遅らせ、軽減し、緩和することができ、良好な治療効果が有することを示唆した。

表１５－１はラットにおける初期発作潜時の統計を示した。

表１５－２及び図１２７は、ラットにおける初期発作グレードの統計を示した。Ｍ細胞群では、発作グレードがグレード３からグレード２に下方調節され、Ｍ細胞が発作を緩和できることを示唆した。

表１５－３及び図１２８Ａはラットにおける初期発作の分類統計を示した。Ｍ細胞の尾静脈注射により、発作グレードが有意に低下し、Ｍ細胞が発作を緩和できることを示した。

表１５－４及び図１２８Ｂはラットにおける大発作潜時の統計を示した。Ｍ細胞の尾静脈注射により、大発作潜時が約１５６．３秒から６８１．２秒に有意に延長され、Ｍ細胞が大発作を遅延できることを示した。

表１５－５及び図１２９はラットにおける大発作の割合の統計を示した。Ｍ細胞の尾静脈注射により、大発作の割合が有意に減少し、溶剤群と比較して割合が３３．３％減少し、Ｍ細胞が大発作の数を有意に減らすことができることを示した。

脳切片の染色による神経細胞の種類及び数の同定：
方法：ラットの心臓灌流後、脳を取り出して４℃の４％ＰＦＡで一晩固定し、ＰＢＳで調製した１５％及び３０％のスクロース溶液で徐々に脱水し、ＯＣＴに包埋し、－８０℃の冷蔵庫で冷凍した。切片の厚さは１２μｍ～１５μｍであり、ポリリジンコーティングされたスライドガラスに貼り付けた（patched on）。２％ＢＳＡ＋０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で調製したブロッキング溶液を用いて、室温で１時間ブロッキング＋透過処理を行った。一次抗体とのインキュベーションを４℃で一晩実施した。二次抗体とのインキュベーションを室温で２時間実施した。ヘキスト３３３４２とのインキュベーションを室温で１０分間行い、核を染色し、最後にスライドに封入して観察を行った。

染色切片から、コントロールと比較して、細胞移植を受けた動物の脳内のＧＡＢＡ作動性ニューロンの数が増加し、ミクログリアの数が減少したことがわかり、ＧＡＢＡ作動性ニューロンが活性化され、またＧＡＢＡ作動性系譜への内因性幹細胞の分化能力が増強され、炎症反応が抑制され、モデル（被験体）のＧＡＢＡ作動性ニューロンを欠いた神経回路を再構築し修復できることを証明した。

行動試験：
方法については、Li et al., 2016, Frontiers in Aging Neuroscienceを参照する。

行動試験の結果は、実験群の動物は特定の標的探索に費やす時間がより少ないことを示し、細胞移植によってモデル動物（被験体）の記憶及び学習の能力が向上し得ることが証明された。

質量分析検出：
脳組織を粉砕して均質化し、遠心分離により上清を収集し、質量分析計で検出した。

脳タンパク質の質量分析結果は、実験群の動物の脳内のＧＤＮＦ及びその他の栄養因子の分泌レベルが上昇することを示し、細胞移植には神経栄養因子の分泌及び神経保護を促進する機能があることが証明された。

溶剤群は、発作潜時が有意に短縮され、発作のグレード及び分類が高くなり、大発作潜時が短縮され、大発作の割合が減少した。これらのデータは、正常コントロール群及び細胞群と比較して、溶剤群が重度の発作及び多発発作を有することを示した。

実施例１６：強皮症に対するＭ細胞の治療活性の評価
強皮症は、皮膚の肥厚、及び局部的又はびまん性の線維症を特徴とする自己免疫疾患であり、肺、腎臓、肝臓、心臓、及びその他の臓器に影響を与える可能性があり、その病因は不明である。現在の研究では、該疾患は主に小血管疾患、細胞外マトリックスの過剰な蓄積によって引き起こされる線維症、及び免疫異常の３つの側面を有することがわかっている。炎症性細胞浸潤は強皮症の初期段階の主な特徴であり、主にＴリンパ球浸潤を含む。Ｔリンパ球は様々なサイトカインを放出し、炎症及び血管病変を引き起こし、線維芽細胞を活性化して、コラーゲン線維の合成を促進する可能性があることが研究からわかっている。現在、免疫抑制剤及び対症療法が主に強皮症の治療法として用いられているが、それらの治療効果は理想的ではなく、有害反応が多いため、より効果的な治療法を見つける必要がある。

実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６、雌マウス、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

動物モデルの準備：Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを体重に応じて無作為に群に分けた。０日目から２１日目まで、調製したブレオマイシン溶液を毎日皮下注射、すなわち背中の単一点に１００μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）の用量で皮下注射してモデリングを行った。１４日目に、マウスを正常群、ＢＬＭ（ブレオマイシン）群、及びＭ細胞群に無作為に分けた。

正常群：マウスを０日目に剃毛しただけで、他の治療は行わなかった。
ＢＬＭ群：０日目にマウスを剃毛し、０日目から２１日目まで毎日ブレオマイシン溶液を皮下注射し、１４日目及び２１日目に背中の単一点に生理食塩水１００μｌを皮下注射し、２８日目に撮影及びサンプリングに供し、試料を切片作製及び染色に供した。
Ｍ細胞群：０日目にマウスを剃毛し、０日目から２１日目まで毎日ブレオマイシン溶液を皮下注射し、１４日目及び２１日目に背中の単一点に３×１０^６個のＭ細胞を含有する生理食塩水１００μｌを皮下注射し、次いで２８日目に撮影及びサンプリングに供し、試料を切片作製及び染色に供した。

試料収集：
標本を収集する際、マウスを腹腔内麻酔した後、マウスを仰臥位にし、マウスの腹部の中央で皮膚を切り、胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。各マウスには約２０ｍｌの生理食塩水が必要であり、生理食塩水灌流が完了した後、２０ｍｌのパラホルムアルデヒドを固定に使用した。灌流が完了した後、モデリング領域の皮膚を切り取り、固定、切片作製及び分析に供した。

組織パラフィン切片作製の手順：
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に一晩浸した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライド上での封入：気泡を避けるためにスライドを中性樹脂で密閉し、スライドを風乾させた後、顕微鏡下で観察した。

マッソン染色
（１）パラフィン切片を水に脱蝋する：切片をキシレンＩに２０分間、キシレンＩＩに２０分間、無水エタノールＩに１０分間、無水エタノールＩＩに１０分間、９５％アルコールに５分間、９０％アルコールに５分間、８０％アルコールに５分間、７０％アルコールに５分間順次入れ、蒸留水で洗浄した。
（２）核のヘマトキシリン染色：マッソン染色キットでワイゲルト鉄ヘマトキシリンを用いて５分間染色を行い、水道水で洗浄した後、１％塩酸アルコールで数秒間分別を行い、水道水ですすぎを行い、流水で数分間すすぐことによって色出しした。
（３）ポンソーレッド染色：マッソン染色キットのポンソーレッド・酸フクシン溶液で５分～１０分間染色を行い、蒸留水によるすすぎを迅速に行った。
（４）リンモリブデン酸処理：マッソン染色キットのリンモリブデン酸水溶液による処理を約３分～５分間行った。
（５）アニリンブルー染色：水で洗浄する代わりに、マッソン染色キットのアニリンブルー溶液で５分間対比染色を行った。
（６）分別：１％の氷酢酸による処理を１分間行った。
（７）脱水及び封入：切片を９５％アルコールＩに５分間、９５％アルコールＩＩに５分間、無水エタノールＩに５分間、無水エタノールＩＩに５分間、キシレンＩに５分間、キシレンＩＩに５分間順次入れて脱水及び透明化を行い、次いで切片をキシレンから取り出し、わずかに風乾させ、中性樹脂で封入した。
（８）顕微鏡で顕微鏡検査を行い、画像を取得して分析した。

動物組織からの全タンパク質の抽出
試料収集：
標本を収集する際、マウスを腹腔内麻酔した後、マウスを仰臥位に置き、腹部の中央で皮膚を切り、胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。各マウスには約２０ｍｌの生理食塩水が必要であった。生理食塩水灌流が完了した後、モデリング領域の皮膚を切り取った。

（１）遠心カラム及び受容チューブを氷上で予冷した。
（２）１５ｍｇ～２０ｍｇの組織を遠心カラムに入れ、プラスチック棒で５０回～６０回ねじって粉砕し、２００μｌの細胞溶解液を加え、３０回～６０回粉砕し続けた。
（３）蓋をして室温で１分～２分間インキュベーションを行った後、１４０００ｒｐｍ～１６０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。
（４）受容チューブを直ちに氷上に置き、遠心分離カラムを廃棄した。タンパク質の抽出が完了すると、－８０℃の冷蔵庫で凍結保存し、下流の実験に使用することができた。

サスペンションチップシステムによる炎症因子の検出
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。
（２）凍結保存した試料を－８０℃の冷蔵庫から取り出した。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を試料に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランクコントロール、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

ａ－ＳＭＡの免疫蛍光検出
方法は以下を参照した：Jong-Sung Park, Yumin Oh, Yong Joo Park, et al., Targeting of dermal myofibroblasts through death receptor 5 arrests fibrosis in mouse models of scleroderma. Nat Commun. 2019 Mar 8;10(1):1128.

結果：
マウスの皮下組織から抽出された全タンパク質について、多因子検出システムにより、Ｍ細胞移植後、ＩＬ－１７、ＩＬ－６、及びＴＮＦ等の炎症性サイトカインのレベルが有意に低下し、ＩＬ－１０の含有量が有意に増加することがわかった。

ＥＬＩＳＡキットにより、マウスの皮下組織の全タンパク質を抽出し、検出した。Ｍ細胞移植群におけるＭＭＰ１の含有量が有意に増加したことがわかった。

免疫蛍光検出により平滑筋アクチン（ａ－ＳＭＡ）の発現レベルを検出し、Ｍ細胞移植後にａ－ＳＭＡの発現レベルが有意に低下したことがわかった。

２８日目のマウス背部の写真を図１３０に示した。

マウス皮膚のＨＥ染色写真を図１３１に示した。

マウス皮膚のマッソン染色写真を図１３２に示した。

実施例１７：難治性皮膚病変に対するＭ細胞の治療活性の評価
難治性皮膚損傷は疾患ではないが、様々な疾患又は損傷によって引き起こされる皮膚損傷の現象であり、皮膚潰瘍の繰り返し、部分的な皮膚機能の喪失、並びに瘢痕及びその他の皮膚過形成組織の容易な生成によって現れる。難治性皮膚損傷を引き起こす一般的な要因としては、火傷、糖尿病、エリテマトーデス、及び乾癬が挙げられる。現在、かかる損傷には複雑な免疫障害及び組織再生障害が伴うことが多く、単一の治療計画で全ての問題を解決できないため、これらの問題に対する万能の解決策はない。

実験動物：ＺＤＦラット、雄、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、その後の実験に使用した。

動物のモデリング：ＺＤＦラットに通常の食餌を１週間給餌した後、高脂肪食で誘導した。ラットのランダム血糖値の変化を毎週検出し、ランダム血糖値が１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上になると、モデルの誘導が成功したと判断した。

モデルの誘導に成功した後、皮膚損傷のモデリングを行った。ＺＤＦラットをガス麻酔装置で麻酔した。麻酔後、背中の毛を取り除き、アルコールを噴霧したガーゼで皮膚を拭いた。背中の右側の皮膚をハサミで切り取り、サイズ２ｃｍ×２ｃｍで、全厚の皮膚欠損を生じた。次いで、ラットを群分けした。写真を７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に撮影し、灌流及びサンプリングを２８日目に行った。皮膚試料の切片を作製し、ＨＥ染色によって識別した。

コントロール群：創傷周囲の４点、すなわち上下左右の点に生理食塩水（１点当たり５０μｌの生理食塩水）を注射した後、３Ｍ包帯を適用した。
Ｍ細胞群：創傷周囲の４点、すなわち上下左右の点に生理食塩水（７．５×１０^５個のＭ細胞（Ｐ５世代時）を含有する生理食塩水を１点当たり５０μｌ）を注射し、３Ｍ包帯を適用した。

試料収集：
標本を収集する際、ラットを腹腔内麻酔した後、ラットを仰臥位にし、ラットの腹部の中央で皮膚を切り、胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。各ラットには約５０ｍｌの生理食塩水が必要であり、生理食塩水灌流が完了した後、５０ｍｌのパラホルムアルデヒドを固定に使用した。灌流が完了した後、損傷領域の皮膚を切り取り、固定し、切片を作製し、分析した。

組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）清浄化：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

マッソン染色
（１）パラフィン切片を水に脱蝋する：切片をキシレンＩに２０分間、キシレンＩＩに２０分間、無水エタノールＩに１０分間、無水エタノールＩＩに１０分間、９５％アルコールに５分間、９０％アルコールに５分間、８０％アルコールに５分間、７０％アルコールに５分間順次入れ、蒸留水で洗浄した。
（２）核のヘマトキシリン染色：マッソン染色キットでワイゲルト鉄ヘマトキシリンを用いて５分間染色を行い、水道水で洗浄した後、１％塩酸アルコールで数秒間分別を行い、水道水ですすぎを行い、流水で数分間すすぐことによって色出しした。
（３）ポンソーレッド染色：マッソン染色キットのポンソーレッド・酸フクシン溶液で５分～１０分間染色を行い、蒸留水によるすすぎを迅速に行った。
（４）リンモリブデン酸処理：マッソン染色キットのリンモリブデン酸水溶液による処理を約３分～５分間行った。
（５）アニリンブルー染色：水で洗浄する代わりに、マッソン染色キットのアニリンブルー溶液で５分間対比染色を行った。
（６）分別：１％の氷酢酸による処理を１分間行った。
（７）脱水及び封入：切片を９５％アルコールＩに５分間、９５％アルコールＩＩに５分間、無水エタノールＩに５分間、無水エタノールＩＩに５分間、キシレンＩに５分間、キシレンＩＩに５分間順次入れて脱水及び透明化を行い、次いで切片をキシレンから取り出し、わずかに風乾させ、中性樹脂で封入した。
（８）顕微鏡で顕微鏡検査を行い、画像を取得して分析した。

免疫組織化学染色：
免疫組織化学キット（Fuzhou Maixin、ＫＩＴ－９７１０）を使用して、パラフィン切片に対して免疫組織化学染色を行った。具体的な手順は次の通りであった：
１．脱蝋：（１）キシレンＩ、ＩＩ、各１０分、（２）勾配アルコール：１００％無水エタノール、２分間、９５％無水エタノール、２分間、８０％無水エタノール、２分間、７０％無水エタノール、２分間。
２．水和：蒸留水で２回、毎回５分（シェーカーに置く）洗浄した。
３．パラフィン切片の脱パラフィン化及び水和後、すすぎをＰＢＳで３回、毎回３分間行った。
４．抗原賦活化溶液（１０ｍＭ ｐＨ６．０クエン酸ナトリウムバッファー）の調製：
（１）原液の調製：溶液Ａ：クエン酸三ナトリウム二水和物２９．４１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ；溶液Ｂ：クエン酸２１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ。
（２）作業液の調製：溶液Ａ８２ｍＬ＋溶液Ｂ１８ｍＬ＋蒸留水９００ｍＬ。
５．抗原賦活化：切片をクエン酸ナトリウムバッファーで満たしたプラスチック製又は耐熱性のガラス容器に入れ、切片を浸漬し、電子レンジでミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間処理し、クエン酸ナトリウムバッファーを補充し、ミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間再び処理を行った。
６．試薬Ａ（ペルオキシダーゼブロッキング溶液）を添加し、室温で１０分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼの活性を遮断し、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
７．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬの試薬Ｂ（正常な非免疫動物血清）を加え、室温で１０分間インキュベートした。
８．血清を廃棄し、１滴又は５０μＬの一次抗体を加え、４℃で一晩又は室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
９．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのビオチン標識二次抗体（試薬Ｃ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１０．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのストレプトアビジンペルオキシダーゼ溶液（試薬Ｄ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１１．ＰＢＳを廃棄し、２滴又は１００μＬの新たに調製したＤＡＢ溶液を加え、顕微鏡下で３分～１０分間観察を行った。
１２．すすぎを水道水で行い、ヘマトキシリンで対比染色を行い、ＰＢＳ又は水道水ですすぎを行って色出しした。
１３．発色にＤＡＢを使用する場合、切片を勾配アルコールで脱水して乾燥させる必要があり、キシレンで透明化を行い、中性樹脂で封入を行った。
１４．顕微鏡で写真を撮影した。

免疫蛍光染色：
（１）組織切片を脱蝋し、水中に移した。
（２）抗原マイクロ波賦活化を９２℃～９６℃の温度で１０分～１５分間行い、室温まで自然冷却した。
（３）正常ヤギ血清ブロッキングを３７℃で６０分間行った。
（４）過剰の血清を捨て、一次抗体を滴加し、３７℃で２時間又は４℃で一晩静置し、ＰＢＳで５分×３回すすぎを行った。
（５）フルオレセイン標識二次抗体を滴加し、３７℃で６０分間暗所に静置し、０．０１Ｍ ＰＢＳで５分×３回すすぎを行った。
（６）切片をクエンチ防止封入剤で封入し、暗所にて４℃で保存した。
（７）蛍光顕微鏡による観察及び撮影を行った。

結論：
モデリング後の異なる時点における皮膚創傷の光学顕微鏡写真を図１３３に示した。

図１３３の創傷面積サイズの統計を図１３４に示した。

創傷の非治癒率を図１３５に示した。

表１７－１は、モデリング後７日目、１４日目、２１日目及び２８日目の皮膚創傷面積の統計値を示した。表からわかるように、７日目には２つの群の面積が同じになる傾向があったが、２８日目にはＭ細胞群の面積がモデル群よりも低かった。Ｍ細胞は皮膚損傷に治療効果があり、創傷治癒を加速できることを示した。

表１７－２は、異なる日の皮膚創傷の治癒していない割合の統計を示した。

４．ラットのモデリング部位の皮膚に対して、５日目及び７日目に免疫組織化学染色を行った。Ｍ細胞群におけるＣＤ３、Ｆ４／８０及びＭＰＯの発現はモデル群よりも有意に低く、Ｍ細胞が損傷部位の皮膚炎症を和らげ、炎症を抑制できることを示した。Ｍ細胞群におけるＫ１４の発現はモデル群よりも有意に高く、Ｍ細胞が皮膚損傷後の創傷の表皮化を加速し、創傷治癒を加速し、皮膚損傷において効果的な治療的役割を果たし得ることを示した。

５．１４日目にラットの皮膚切片に対して免疫蛍光同定を行ったところ、Ｍ細胞群のＣＤ３１マーカーの発現がコントロール群よりも有意に高いことが示され、Ｍ細胞治療は皮膚創傷の血管再生を促進することができ、損傷後の皮膚の再生に重要な効果を有することを示した。

６．皮膚創傷切片の免疫蛍光染色は、Ｍ細胞群におけるβ－カテニン、ＣＤ１３３及びＫｉ６７の発現がモデル群よりも有意に高いことを示し、Ｍ細胞群では毛包が多く、Ｍ細胞治療により皮膚損傷後の毛包の再生が促進され得ることを示した。

マウスにおいてＭ細胞を用いた糖尿病治療では、本発明者らは、Ｍ細胞移植治療が糖尿病の合併症に以下のような効果を有し得ることを見出した：

糖尿病性腎症：Ｍ細胞移植は、炎症誘発性因子ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦαの発現を減少させ、メサンギウム肥厚及びマクロファージ浸潤を減少させ、糖尿病誘発性糸球体症を軽減し、ラットの腎臓重量、腎臓及びボディマス指数を増加させるため、Ｍ細胞が糖尿病性腎症に対して良好な治療効果を有する可能性がある。

糖尿病性足病変：Ｍ細胞治療は、糖尿病性足病変の治癒を加速し、皮膚の創傷の炎症を軽減し、血管及び毛包の再生を促進し、コラーゲンの沈着を減らし、線維症の発生を阻害し得る。したがって、Ｍ細胞は皮膚の損傷を効果的に治療できる可能性がある。

糖尿病性眼合併症：Ｍ細胞治療は、血糖を下げ、炎症反応を調節し、空腹時血糖及びＨｂＡ１ｃレベルを有意に低下させ、視覚機能及び黄斑浮腫を改善することができるため、Ｍ細胞移植は糖尿病性眼合併症をうまく治療できる可能性がある。

糖尿病に伴う血管石灰化：Ｍ細胞移植は血管石灰化を阻害することができるため、合併症における血管石灰化に良好な治療効果を有する。

糖尿病性ニューロパチー：Ｍ細胞の静脈内注射は、星状膠細胞が酸化ストレスに抵抗する能力を高め、脳内のグルタミン酸を除去する能力を高め、脳内のＫ＋バランスを維持し、それによって神経機能、脳の恒常性及びシナプス形成を促進し、糖尿病によって引き起こされる認知障害を改善できる可能性がある。

結論として、Ｍ細胞治療は、皮膚創傷の治癒を加速し、皮膚の創傷の炎症を軽減し、血管及び毛包の再生を促進し、コラーゲンの沈着を減らし、線維症の発生を抑制することができる。したがって、Ｍ細胞は皮膚の損傷を効果的に治療することができた。さらに、Ｍ細胞移植治療は、糖尿病合併症に対しても良好な治療効果を有する可能性がある。

実施例１８：貧血に対するＭ細胞の治療活性の評価
貧血は独立した病気ではないが、血液の酸素運搬能力が低下し、酸素供給が不十分になり、組織が低酸素状態になる状態を指す。貧血自体の病因（etiology and pathogenesis）は複雑で多様であり、様々な要因及び全身性疾患が関与している可能性がある。基本的な病因は、赤血球生成の減少又は不足、赤血球の過度の破壊、及び失血を含む３つの側面に要約され得る。癌は貧血の一般的な原因であり、癌患者の５０％が貧血を患い、様々な臨床症状を引き起こすだけでなく、患者の生活の質を低下させ、これもまた予後に影響を与える要因の１つである。同時に、輸血の増加により多くの有害事象を引き起こす場合もある。腫瘍関連貧血は複数の要因の結果であり、その殆どは慢性貧血に属しており腫瘍自体によって引き起こされ、さらに、化学療法に細胞傷害性薬物又は腎毒性薬物を使用することも貧血を引き起こす可能性がある。シスプラチンは患者に広く使用されている化学療法薬であり、腎毒性がある。シスプラチンの累積投与量が増加すると、貧血が悪化する。エリスロポエチンは慢性癌性貧血を和らげる可能性があるが、貧血の改善に有効な割合は約６０％であることが文献で報告されている。したがって、どのようにして腫瘍患者の貧血を更に改善し、予後を改善して患者の質を高めるかは、依然として重要なテーマである。

実験動物：
６週齢～８週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを、Weitong Lihua (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.から購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養
胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、その後の実験に使用した。

実験試薬及び装置

動物のモデリング：
雌ラットを、コントロール群、シスプラチン誘発性貧血群、及びシスプラチン誘発性貧血＋Ｍ細胞治療群の３群（各群４匹のラット）に分けた。貧血モデル群には、シスプラチン（１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射及び蒸留水懸濁液中のブスルファン（１５ｍｇ／ｋｇ）の胃内投与を５日目に週１回行い、コントロール群は貧血モデル群と同じ投与を受けたが、胃内投与は、蒸留水懸濁液中のブスルファンの代わりに生理食塩水を使用した。シスプラチンが初めて導入されてから３日後、細胞治療群は、合計２回の治療で細胞薬（５×１０^６細胞／ラット）の静脈内注入を受け、治療ごとに１週間間隔で行った。実験開始後、体重を週に２回計量し、最初の細胞注入の１８日後に、定期的な血液検査のためにラットの全血を収集した。

統計：全てのデータを分散分析及び有意性検定のためにｔ検定によって分析し、実験データを平均±標準偏差（平均±ＳＤ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

１．シスプラチン誘発性貧血モデルラットにおける体重減少
実験方法：モデル誘発の異なる時点で、電子スケールでラットの体重測定を行った。

実験結果：
図１３６は、貧血モデルラットの体重変化の傾向を示した。

表１８－１には、シスプラチン誘発ラット貧血モデルについて異なる時点で検出した体重を示し、データを統計分析に供した。

２．血液生化学検査
実験方法：モデル誘発の２１日目にラットの血液を収集し、動物血液ルーチンアナライザで血液ルーチンの様々な指標を検出した。

実験結果：
図１３７は、シスプラチン誘発性貧血モデルラットの末梢血中の白血球の総数分析を示した。図１３８は、シスプラチン誘発性貧血モデルラットの末梢血中の赤血球の総数分析を示した。図１３９は、シスプラチン誘発性貧血モデルラットの末梢ヘモグロビン含有量の分析を示した。図１４０は、シスプラチン誘発性貧血モデルラットの末梢血ヘマトクリット分析を示した。図１４１は、シスプラチン誘発性貧血モデルラットの末梢血の平均ヘモグロビン濃度の分析を示した。図１４２は、シスプラチン誘発性貧血モデルラットにおける末梢血赤血球の体積分布幅の分析を示した。図１４３は、シスプラチン誘発性貧血モデルラットにおける末梢血ヘモグロビン含有量の分布幅の分析を示した。

表１８－２は、シスプラチン誘発性ラット貧血モデルの２１日目に採血を行った後のルーチンの血液生化学分析を示した。統計を以下の表に示す。

３．骨髄細胞診
実験方法：骨髄造影検査及び腹部大動脈採血が完了した後、手術用ハサミで大腿の筋肉を切り取り、大腿骨を完全に露出させ、大腿骨を大きなハサミで切断し、中型の鉗子で骨髄を絞り出した。骨髄を取り出すのが難しい場合は、端部がまっすぐな眼科用ピンセットを骨髄腔に挿入して骨髄を摘出することができ、骨髄を清潔なスライドガラスの上に置いた。

実験結果：コントロール群の骨髄塗抹標本の結果と比較して、シスプラチン＋溶剤群の骨髄塗抹標本は有意に脂肪質であり、細胞数は減少し、非造血細胞の数は増加し、骨髄有核細胞の増殖は極めて少なく、細胞数はまばらで、造血細胞の数は極めて少なく、骨髄塗抹標本の油滴が有意に増加し、すなわち、顕微鏡下の液胞の数が有意に増加し、多くの大型の液胞又は超大型の液胞が現れ、貧血の症状を示した。シスプラチン＋Ｍ細胞治療群では、骨髄増殖が活発で、脂肪細胞が少なかった。以上の結果は、Ｍ細胞治療は貧血治療における骨髄造影の回復に有意な促進効果があることを示した。

実施例１９：肺高血圧症に対するＭ細胞の治療活性の評価
肺高血圧症（ＰＨ）は、肺動脈圧が一定の閾値を超える血行力学的異常である。患者は衰弱及び呼吸困難等の主要な症状を伴い、疾患の経過は治療なしでは急速に進行し、しばしば右心不全に発展し、死に至る。肺血管リモデリング、血管閉塞誘発性肺血管抵抗（ＰＶＲ）、肺動脈圧の上昇、及び右心室肥大を特徴とする。現在、最も有効な治療法は、プロスタサイクリン、エンドセリン－１受容体拮抗薬、及びホスホジエステラーゼ５型阻害剤の３つのカテゴリーの薬物を含む薬物療法である。これらの薬は状態を改善することができるが、肺血管リモデリングを根本的に改善するものではなく、全体的なコストが高く、長期治療のニーズを満たすことができない。

過去１０年間で、幹細胞治療は大きな可能性を示してきた。内皮前駆細胞（ＥＰＣ）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）等の細胞療法は、動物実験において画期的な研究成果を上げている。幹細胞療法が肺高血圧症の治療に一定の効果を有することは、ますます多くの研究が証明している。様々な種類の幹細胞の中で、ＭＳＣは最も広く研究されており、再生医療研究にとって最も価値の高い細胞である。モノクロタリン（ＭＣＴ）誘発性ＰＨラットをＭＳＣで治療すると、血行力学及び肺血管リモデリングが改善される可能性がある。一部の研究者は、遺伝子改変ＭＳＣがカルシトニン遺伝子関連ペプチドを分泌することにより、ＭＣＴ誘発性ＰＨ内皮機能障害を緩和できることを見出した。ＨＧＦ遺伝子改変ＭＳＣをＭＣＴ誘発性ＰＨラットに移植した後、心肺動態指数も有意に改善され、これはＭＳＣによる単独療法よりも良好であった。現在、ＭＳＣに関する研究は段階的な結果を達成しているが、ＰＨの治療では、ＥＰＣと比較して未知の介入メカニズムがＭＳＣの臨床応用を制限する主な要因となっている。しかしながら、成人組織由来ＭＳＣの臨床応用には、主に以下の欠点がある：（１）治療的に有効な量の成人組織由来ＭＳＣは、単一の個別組織からは得られない；（２）成人組織由来ＭＳＣは、異なる個別組織に由来するため、要求される製品品質の一貫性を達成することができない；（３）同じ個体の組織に由来するＭＳＣでさえ依然として非常に不均一である；（４）成人組織由来ＭＳＣのドナー組織源は複雑であり、潜在的に感染性病原体感染のリスクがある；（５）成人組織由来ＭＳＣはｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖とともに急速に老化する。したがって、肺高血圧症の治療には、ＭＳＣの新たな細胞供給源が必要である。

実験動物：
ＳＤラット、雄、６週齢～８週齢。動物をBeijing Weitong Lihua Companyから購入した。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：
胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、その後の動物実験に使用した。

動物の群分け：

肺動脈性肺高血圧モデリング：６０ｍｇ／ｋｇモノクロタリンの１回の腹腔内注射。

細胞注射：
ＭＣＴ注射の１週間後、５×１０^６細胞／ラットのラット尾静脈注射を行い、２週間後に超音波検査による評価及びサンプリングを行った。

超音波検査による評価：
傍胸骨大動脈の短軸切片を採取し、パルスドップラーサンプリング量を肺動脈弁に配置し、肺動脈弁収縮期血流スペクトル及び心電図を同時に記録し、肺動脈収縮期血流スペクトルの始点から最高点までの時間は、肺動脈血流加速時間（ＰＡＴ）であった。

傍胸骨心底大動脈の短軸切片を採取し、連続ドップラーサンプリングラインで肺動脈逆流スペクトルを得て、スペクトルを時間によって３つの等しい部分、すなわち拡張期の初期、中期及び後期に分け、拡張期初期における最大肺動脈弁逆流圧差、すなわち平均肺動脈圧を測定した。

傍胸骨短軸切片を採取し、肺動脈の内径を測定した。

二次元で四室視野を撮影し、右心室及び左心室の基底部内径を測定し、右心室対左心室の基底部内径比（ＲＶ／ＬＶ）を計算した。

右心室収縮期血圧の測定：
血行力学的検査には血圧計を使用した。気管挿管後、胸部を開き、０．７ｍｍ×１９ｍｍの閉じた留置針を心臓の心尖部に５ｍｍ挿入して右心室圧を測定した。

試料収集：
標本を収集する際には、ラットを腹腔内麻酔して仰臥位に置き、ラットの腹部の中央で皮膚を切って腹腔を開き、中心静脈から採血した。胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。生理食塩水の灌流が完了した後、５０ｍｌのパラホルムアルデヒドを用いて固定を行った。灌流が完了した後、肺を採取し、固定し、切片を作製し、分析した。

サスペンションチップシステムによる炎症因子の検出：
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。４８種の因子のキットを炎症因子の検出に使用した。
（２）凍結保存した細胞上清を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上に置いた。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を細胞培養上清に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランク、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

組織パラフィン切片作製の手順：
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

統計分析：
Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡ及びｔ検定を分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

２．実験結果
（１）右心室血圧の測定結果は、ＭＣＴ群における右心室収縮期血圧がコントロール群よりも有意に高いことを示した。ＭＣＴ群と比較して、ＭＣＴ＋Ｍ細胞群における右心室収縮期血圧は有意に低かった。結果は、肺高血圧症のラットでは、Ｍ細胞が右心室収縮期血圧を低下させる可能性があることを示した。

（２）超音波検査の結果は、ＭＣＴの注射後、コントロール群と比較して、ＭＣＴ群の肺動脈血流加速時間が短くなり、右心室対左心室の直径比が大きくなり、平均肺動脈圧が上昇したことを示し、このことはＭＣＴ群における肺高血圧症の発生を示した（表１９－１～表１９－４、図１４４～図１４７）。Ｍ細胞の注入後、ＭＣＴ群と比較して、ＭＣＴ＋Ｍ細胞群における肺動脈血流加速時間が増加し、右心室対左心室の直径比が減少し、平均肺動脈圧が低下し、Ｍ細胞が肺高血圧症の形成を阻害できることを示した（表１９－１～表１９－４、図１４４～図１４７）。しかしながら、右心室流出路径は群間で変化しなかった（表１９－２、図１４５）。Ｍ細胞は、肺動脈血流加速時間を増加させ、右心室対左心室の直径比を低下させ、平均肺動脈圧を下げることができることを示した。

（３）ＨＥ染色の結果は、線維芽細胞がＭＣＴ群では肺動脈壁で大量に増殖したが、ＭＣＴ＋Ｍ細胞群では増殖しなかったことを示した（図１４８）。ＭＣＴ群における肺細動脈内膜中膜複合体厚は、ＭＣＴ＋Ｍ細胞群よりも有意に大きかった。同時に、ＭＣＴ群における肺細動脈壁面積／総肺動脈面積の比率は、ＭＣＴ＋Ｍ細胞群よりも有意に高かった。これらの結果は、肺動脈高血圧症ラットにおいて、Ｍ細胞が肺細動脈内膜中膜複合体厚及び肺細動脈壁面積を減少できることを示した。

（４）各群の血清中の炎症因子を検出した。結果は、ＭＣＴ群と比較して、Ｍ細胞治療群における炎症誘発因子のレベルが有意に低下し、抗炎症因子のレベルが有意に増加したことを示した。Ｍ細胞は炎症を抑制する効果を有することを示した。

実施例２０：脊髄損傷に対するＭ細胞の治療活性の評価
脊髄損傷（ＳＣＩ）は、外傷によって引き起こされる脊髄手術の外傷性疾患であり、損傷した部分より下の感覚、運動、及び自律神経の機能障害として現れる。外国の疫学調査は、世界中に毎年１３万人の新たな脊髄損傷患者がおり、２５０万人を超える患者が様々な程度の脊髄損傷後遺症に苦しみ、これらの患者の年間医療費は６０億米ドルを超え、家族及び地域社会に大きな負担をかけている。

実験動物：Ｗｉｓｔａｒラット、雄、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代をその後の実験に使用した。

動物のモデリング：Ｗｉｓｔａｒラットを麻酔し、背毛を取り除き、ラット脊髄のＴ９セグメントを見つけ、背中の皮膚及び筋肉をハサミで切って椎板を露出させ、Ｔ９セグメントの椎板を針鉗子でこじ開け、Ｔ９セグメントの脊髄を９０秒間血管クランプで締めた。締め付けた後、筋肉層と皮膚とを縫合し、ヨウ素で拭いた。縫合したラットをラット用電気毛布に置き、ラットが目覚めた後にケージに入れた。一週間後、ラットをＢＢＢスコアリングに供し、群分けした。その後、ＢＢＢスコアリングを毎週行った。

群分け：モデル群、Ｍ細胞群、各群に３匹のラット。
モデル群：３００μｌの生理食塩水による静脈内注射を行った。
Ｍ細胞群：Ｐ５世代の３×１０^６個の細胞を含む生理食塩水３００μｌの静脈内注射を行った。

ＢＢＢ（バッソ・ビーティ・ブレスナハン運動評価尺度、ＢＢＢ尺度）行動スコアリング：ラットを開いた行動ボックスに入れ、箱の壁を軽くたたいて這うように強制し、動物の腰、膝、足首の関節の歩行、体幹の動き、及びそれらの協調を、その後のＢＢＢスコアリングのために４分間ビデオ録画した。

ＢＢＢスコアリング（バッソ・ビーティ・ブレスナハン運動評価尺度、ＢＢＢ尺度）（ラット脊髄損傷）基準：
０点：後肢の動きが見られなかった。
１点：１つ又は２つの関節（通常は股関節及び／又は膝関節）がわずかに可動性であった。
２点：１つの関節が大きく可動性であるか、又は１つの関節を大きく可動性であり、かつ別の関節はわずかに可動性である。
３点：２つの関節が大きく可動性であった。
４点：後肢の３つの関節は全てわずかに可動性であった。
５点：２つの関節がわずかに可動性であり、３つ目の関節が大きく可動性であった。
６点：２つの関節が大きく可動であり、３つ目の関節がわずかに可動性であった。
７点：後肢の３つの関節は全て大きく可動性であった。
８点：非耐荷重負荷条件下で足を着地させることができた。
９点：足底が体重を支える（weight-bearing）位置にのみあったか、又は足の甲で体重を支える歩行が時折／頻繁／継続的に発生し、足底で体重を支える歩行は起こらなかった。体重を支える：ＨＬ伸筋は、足底が体重を支える位置にあるとき、又は後部の胴体が持ち上げられたときのみ収縮した。
１０点：足の表面で体重を支える動きが時折発生し、前肢と後肢との協調運動は観察されなかった。
１１点：掌面で体重を支える動きがより多く発生したが、前肢と後肢との協調運動は観察されなかった。
１２点：掌面で体重を支える動きがより多く発生し、前肢と後肢との協調運動が時折観察された。
１３点：掌面で体重を支える動きが頻繁に発生し、前肢と後肢との協調運動が頻繁に観察された。
１４点：掌面で体重を支える動き、及び前肢と後肢との協調運動が継続的に発生したか、又は掌面の頻繁な動き、前肢と後肢との継続的な協調運動、及び時折爪の背部の動きが観察された。
１５点：掌面で体重を支える動き、及び前肢と後肢との協調運動が継続的に発生し、前肢の前方移動中に地面把握（grasping ground）は見られないか時折観察され、アクティブクロー（active claw）の位置は、最初の接触時に身体と平行であった。
１６点：歩行中に掌面の継続的な動き、及び前肢と後肢との継続的な協調運動が観察され、前肢の前方移動中に頻繁に地面把握が観察され、アクティブクローの位置は、最初の接触時に身体と平行で、体重負荷の移動後に回転した。
１７点：歩行中に掌面の継続的な動き、及び前肢と後肢との継続的な協調運動が観察され、前肢の前方移動中に頻繁に地面把握が観察され、アクティブクローの位置は、最初の接触時及び体重負荷の移動後に身体と平行であった。
１８点：歩行中に掌面の継続的な動き、及び前肢と後肢との継続的な協調運動が観察され、前肢の前方移動中に継続的に地面把握が観察され、アクティブクローの位置は、最初の接触時に身体と平行で、体重負荷の移動後に回転した。
１９点：歩行中に掌面の継続的な動き、及び前肢と後肢との継続的な協調運動が観察され、前肢の前方移動中に継続的に地面把握が観察され、アクティブクローの位置は、最初の接触時及び体重負荷の移動後に身体と平行であった。尾は時々、又は常に垂れ下がっていた。
２０点：掌面の継続的な動き、継続的な協調歩行、及びつま先での継続的な地面把握が観察され、アクティブクローの位置は最初の接触時及び体重負荷の移動後に常に身体と平行であり、胴体は安定せず、尾は継続的に持ち上げられた。
２１点：掌面の継続的な動き、継続的な協調歩行、及びつま先での継続的な地面把握が観察され、運動中アクティブクローの位置は常に身体と平行であり、胴体は継続的に安定し、尾は継続的に持ち上げられた。

ラットのＢＢＢスコアを図１４９に示した。

表２０－１は、モデリング後の１週目から７週目までのラットの行動ＢＢＢスコアを示した。この表から、Ｍ細胞治療群のＢＢＢスコアはモデル群のＢＢＢスコアよりも有意に高く、Ｍ細胞の静脈内注射が脊髄損傷を効果的に治療し得ることを示したと結論付けることができた。

機械的疼痛及び泌尿器系の機能：
方法は、Fandel et. al., 2016, cell stem cellを参照した。

結果は、Ｍ細胞で治療した脊髄損傷モデル動物では、接触性アロディニア及び痛覚過敏が減少することを示した。自発排尿検査及び意識的膀胱内圧測定法を用いると、結果は、Ｍ細胞移植動物の尿スポット径の幅がより広いことを示し、このことは動物が膀胱の部分制御を取り戻し、膀胱機能が改善されたことを示した。同時に、Ｍ細胞を移植した動物は、膀胱出口抵抗の低下及び排尿筋の活動亢進を示し、これは排尿機能の改善に対応していた。

切片染色：
方法は、Fandel et. al., 2016, cell stem cellを参照した。

結果は、脊髄損傷モデル動物では、Ｍ細胞治療後、損傷部位付近のニューロン（ＴＵＪ１＋）の数が増加し、軸索の長さが増加したことを示し、このことはＭ細胞が細胞の生存を促進し、軸索再生を促進できることを示した。グリア細胞の数が減少し、コラーゲンの発現が有意に減少し、Ｍ細胞がグリア細胞の活性化を阻害する効果及び抗線維化の機能を有することを示した。さらに、ミクログリアの数が減少し、Ｍ細胞が損傷部位の炎症反応を効果的に低下し得ることを証明した。

Ｍ細胞を静脈内注射すると、脊髄損傷マウスの運動能力が向上し、ＢＢＢスコアが有意に増加した。Ｍ細胞が脊髄損傷を非常にうまく治療し得ることを示した。

実施例２１：脳卒中に対するＭ細胞の治療活性の評価
脳卒中は、脳血管が狭くなり、閉塞して、又は破裂して、脳組織の虚血又は出血を引き起こし、脳の細胞及び組織の壊死をもたらす脳血管疾患の一種である。脳卒中は、虚血性脳卒中（脳梗塞としても知られる）及び出血性脳卒中（実質内出血、脳室内出血、及びくも膜下出血を含む）に分けられる。男性と女性の虚血性脳卒中の発生率は２１２／１０００００と１７０／１０００００であり、出血性脳卒中は１２～１５／１０００００である。しかしながら、喫煙、貧しい食生活、運動不足等の生活習慣を持つ人、及び高血圧、糖尿病、高脂血症、肥満等を含む合併症のある人は、脳卒中を起こしやすい。現在、脳卒中の治療のために、最も広く使用されている血栓溶解薬は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）である。ｔ－ＰＡ治療を適用するには、患者が適格基準を満たす必要があるため、ｔ－ＰＡは特定の脳卒中患者向けであり、治療期間枠が短く、４．５時間に制限されている。さらに、血管内療法も主要な治療戦略である。しかしながら、欠点もあり、血管内ステントは大血管の血流遮断の問題を解決するためにのみ適している。薬物療法、並びに健康的な生活習慣及び有酸素運動を含む予防措置を講じることで、脳卒中の発生率は低下しているが、高い再発率は未解決のままである。既存の臨床試験では、主に脳卒中患者の回復、行動及び生活習慣の改善、脳卒中患者の回復のための薬物療法及び細胞療法を支援する幾つかの電子技術製品又はソフトウェアシステムが調査されている。臨床試験では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は基本的に第Ｉ相及び第ＩＩ相にある。脳卒中の治療には、治療法に制限があり、適用範囲が狭く、全て間接的な治療であり、後期の再発率が高い。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

実験動物：雄ＳＤラット（７週齢）の動物をBeijing Weitong Lihua Companyから購入した。全ての動物を、中国科学院動物学研究所の実験動物センターのＳＰＦグレードで飼育した。動物の世話及び使用は、中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物の実験手順は全て、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施された。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。実験を、ラットの適応給餌の１週間後に開始した。

実験材料：手術機器、縫合糸栓子、５－０外科用縫合糸、ラット実験台、ラット体重計、１ｍｌ使い捨て滅菌シリンジ、５ｍｌ使い捨て滅菌シリンジ。

実験試薬：イソフルラン、ヨードホール、生理食塩水、リン酸バッファー（ＰＢＳ）、２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）

装置：Ｒ５４０増強型小動物麻酔装置

中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルの作製：適量のイソフルランをガス麻酔機に注ぎ、ラットをガス麻酔ボックスに入れ、ガス麻酔機のスケールを３．５に調整した後、ラットを深く麻酔して麻酔状態に維持し、仰臥位のラットをラット実験台に固定し、頸部の皮膚をヨードホールで拭き、中心の皮膚を縦方向に１ｃｍ～２ｃｍ切り、筋肉層を分離し、総頸動脈、内頸動脈、及び外頸動脈を露出させて分離し、縫合糸をそれぞれ総頸動脈、内頸動脈及び外頸動脈の血管の下に埋め、縫合糸を外頸動脈血管の近位端と遠位端にそれぞれ埋め、縫合糸を外頸動脈側副細動脈に埋め込んで結紮し、総頸動脈と内頸動脈を血管クランプで留め、外頸動脈の遠位端を結紮して切り、小さな開口部を形成し、縫合糸を総頸動脈に挿入し、総頸動脈の近位端を結紮し、総頸動脈と内頸動脈で血管クランプを緩め、縫合糸栓子を内頸動脈に１８ｍｍ挿入し、９０分後に縫合糸を抜き、外頸動脈を結紮し、筋肉層と皮膚層を縫合した。

実験群：正常コントロール群、ＭＣＡＯ＋溶剤（溶剤群）、ＭＣＡＯ＋Ｍ細胞（Ｍ細胞群）、各群に３匹のラット。

細胞注射：手術とｍＮＳＳスコアリングの３時間後、ラットを群分けし、７点以下のラットを排除し、８点～１２点、１３点～１８点のラットを群分けし、ＭＣＡＯ＋溶剤群に尾静脈から５００μｌの生理食塩水を注射し、ＭＣＡＯ＋Ｍ細胞群に尾静脈から５×１０^６Ｍ細胞／５００μｌ／ラットを注射した。

行動スコアリング：ｍＮＳＳスコアリングを、手術の３時間後、２４時間後及び７２時間後に実施した。ｍＮＳＳスコアリングは、ラットにおける運動、感覚、及び反射機能の観察を含んだ。運動機能は、テールリフティングテスト（tail-lifting test）、フロアテスト、及び平均台テストを含んだ。テールリフティングテストは、前肢の屈曲（１点）、後肢の屈曲（１点）、３０秒以内の頭部持ち上げ（１点）を含んだ。フロアテストは、直線を歩くことができない（１点）、片麻痺（１点）、回転（１点）を含んだ。平均台テストを以下に更に分けた：平均台の端をつかむ（１点）；平均台をしっかりとつかみ、1本の肢が平均台から落ちる（２点）；平均台をつかみ、２本の肢が平均台から落ちる、又は平均台で回転する（６０秒超）（３点）；平均台でバランスをとろうとするが落下する（４０秒超）（４点）；平均台でバランスをとろうとするが落下する（２０秒超）（５点）；平均台でバランスを取ろうとせずに直接落下する（２０秒未満）（６点）。触覚（sensory touch）テストは、視覚及び触覚の配置（placement）（１点）、固有感覚の配置（１点）を含んだ。また、反射機能テストは、耳介反射（１点）、角膜反射（１点）、驚愕反射（１点）、ミオクローヌス、ジストニア及び発作（１点）を含んだ。

脳梗塞及び脳浮腫の検出：手術から７２時間後、ラットを安楽死させ、脳組織を湿潤重量及びＴＴＣ染色のために採取し、次いで脳組織を乾燥重量用に乾燥させた。ＴＴＣ染色プロセスは以下を含んだ：２％ＴＴＣ染色液（１ｇのＴＴＣを計量し、５０ｍｌのＰＢＳに加えて溶解させ、光から保護した）５０ｍｌを調製し、全ての群のラットの脳組織を－２０℃で３０分間静置し、１つずつ取り出し、２ｍｍ切片を形成するように切片を作製し、次いで脳切片を６ウェルプレートに入れ、３ｍｌのＴＴＣ染色液を暗所で各ウェルに加え、脳切片を振って脳切片が６ウェルプレートにくっつかないようにし、３７℃の恒温インキュベーターでインキュベートした。１５分後、脳切片をひっくり返して再び１５分間インキュベートした。脳切片をきれいに配置して撮影し、梗塞サイズの統計をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって実施した。最後に、撮影した脳切片を６５℃のオーブンに３日間入れ、その後、脳切片の乾燥重量を計量して記録した。

統計：全てのデータを、分散分析及び有意性検定のためＰｒｉｓｍ ７．０統計解析ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡによって分析し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＤ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

結果の分析：
手術から２４時間後及び７２時間後のｍＮＳＳスコアの結果では、Ｍ細胞群はｍＮＳＳスコアの低下を示し（溶剤群対細胞群：１２．６７対１０．３３（２４時間）、６．３３対５．３３（７２時間））、このことは脳卒中ラット（被験体）の行動の改善を示した。脳梗塞は脳組織の壊死を反映し、溶剤コントロール群と比較して、Ｍ細胞群は脳梗塞の程度の低下（６２．７７対５６．７２）を示し、梗塞のサイズは６．０５％減少した。重度の脳浮腫は頭蓋内圧の上昇を引き起こす可能性があり、脳ヘルニアが形成されて、溶剤群の脳組織の水分含有量は正常コントロール群よりも有意に高く（８０．８５対８２．９４）、２％増加したのに対し、Ｍ細胞群は溶剤群と比較して、ラットにおける脳組織の水分含有量の２％の減少を示した（８２．９４対８０．４９）。上記の全ての結果は、Ｍ細胞が脳卒中ラット（被験体）において良好な治療効果を有することを示した。

表２１－１及び図１５０は、３時間、２４時間、及び７２時間のｍＮＳＳ行動スコアを示した。手術の３時間後にＭ細胞を静脈注射すると、手術後２４時間（１２．６７対１０．３３）及び７２時間（６．３３対５．３３）のｍＮＳＳスコアを低下させることができ、Ｍ細胞は脳卒中ラット（被験体）の行動を改善できることを示した。

表２１－２及び図１５１は、７２時間後のラットにおける脳梗塞サイズの統計を示した。手術の３時間後にＭ細胞を静脈注射すると、溶剤群と比較して、脳組織の梗塞サイズを６．０５％減少させることができ、Ｍ細胞が脳組織の壊死の程度を低下させ得ることを示した。

表２１－３及び図１５２は、７２時間後のラットにおける脳組織の水分含有量の統計を示した。手術の３時間後にＭ細胞を静脈注射すると、溶剤群と比較して、脳組織の水分含有量を２％減少させることができ（８２．９４対８０．４９）、Ｍ細胞が脳組織の浮腫の程度を低下させ得ることを示した。

ラット前肢配置テスト：
方法はMatsuda F., et al., Acta Physiol Neurosci, 2011の公開された論文を参照した。

４８時間後、前肢配置テストによりラットの前肢使用能力を検出すると、溶剤コントロール群と比較して、移植されたＭ細胞群におけるラットの対側前肢の使用率が有意に増加することがわかった。

ラットロータロッド試験：
方法はShen H., et al., J Neurosci Methods, 2010の公開された論文を参照した。

７２時間後、ロータロッド試験によりラットの運動協調能力を検出すると、溶剤コントロール群と比較して、Ｍ細胞移植群のラットのロータロッド運動時間が有意に増加することがわかった。Ｍ細胞が脳卒中動物（被験体）の運動能力を高めることができることを示した。

ＭＲＩによる脳損傷の検出：
方法：動物を麻酔した後、小動物核磁気共鳴画像法を実施し、ＭＲＩ Ｔ２配列をプレーンスキャン用に選択した。

７２時間後、ＭＲＩによってラットの脳損傷を検出すると、Ｍ細胞の静脈内注射により、手術の３時間後に脳梗塞体積が減少することがわかり、このことはＭ細胞が脳卒中による神経細胞損傷の程度を減弱させ得ることを示した。

ラット脳凍結切片の染色の統計的結果
方法はKriks et al., Nature, 2011の公開された論文を参照した。

７２時間後、凍結切片を染色してラットにおける神経細胞の再生を検出した。Ｍ細胞移植群のラットは、溶剤コントロール群と比較して、損傷部位の新たなニューロン（Ｔｕｊ１＋）が有意に増加し、虚血性損傷領域の端にある反応性星状細胞（ＧＦＡＰ＋）及びミクログリア（ＩＢＡ１＋ＣＤ１１Ｂ＋）の数が有意に減少し、損傷領域の単位面積当たりのニューロン数（ＮｅｕＮ＋）が有意に増加したことがわかった。Ｍ細胞移植は、ニューロンの再生を促進し、ニューロンの損傷及び死を減らし、ニューロンに栄養を供給し、シナプス再生を促進し得ることを示した。

ラットにおける脳組織炎症因子のＥＬＩＳＡ及びＷＢ検出結果
方法はBetemps et al., 2015, J Vis Expの公開された論文を参照した。

７２時間後、ラットの脳組織を採取して炎症因子のレベルを検出した。溶剤コントロール群と比較して、移植されたＭ細胞群のラットの脳組織におけるＴＦＮ－α、ＩＬ１－β、ＩＬ－６及びその他の炎症誘発因子のレベルは有意に低下し、ＩＬ－１０及びＩＬ－３等の抗炎症因子のレベルは有意に低下することがわかった。Ｍ細胞は脳卒中後の脳の炎症反応を弱め、脳の微小環境を改善できることを示した。

実施例２２：眼表面の損傷に対するＭ細胞の治療活性の評価
眼表面損傷は世界の失明の主な原因の１つであり、その中で最も一般的な原因は、眼の化学火傷（アルカリ及び酸性火傷等）及び熱損傷であり、眼の表面に深刻な損傷を与え、治療が困難であり、予後が悪く、しばしば失明、さらには眼球の喪失にもつながる。角膜アルカリ火傷は、最も深刻な化学火傷である。アルカリ性物質は角膜組織の液状化及び壊死を引き起こし、角膜上皮幹細胞に深刻な損傷を与える可能性がある。角膜上皮幹細胞の重度の枯渇は、持続的な炎症、角膜及び結膜化生、新たな血管の内殖（ingrowth）、及び角膜間質の瘢痕化をもたらす。その後に誘発される免疫炎症反応は、深部まで発達し、角膜潰瘍及び穿孔、続発性緑内障及び併発白内障を引き起こし、眼の解剖学的構造及び視覚機能に深刻な損傷を与える可能性が高い。

現在、重度のアルカリ火傷に対する効果的な治療はなく、角膜移植が依然として主な治療法である。しかしながら、角膜移植は、材料の入手困難、長期移植片の生存率の低さ、及び移植後の拒絶反応等、多くの困難があり、その適用と有効性が制限される。角膜移植に加えて、（１）自家角膜上皮幹細胞移植、（２）同種角膜上皮幹細胞移植、及び（３）羊膜移植を含むその他の外科的治療にも幾つかの問題がある。本発明は、角膜移植のための材料の入手困難、移植拒絶反応等の問題を克服し、Ｍ細胞及び材料足場の移植による治療に用いることができ、これを、角膜上皮の治癒を促進し、角膜の濁りの程度を減らし、角膜血管の生成を減らし、角膜上皮組織をより効果的に修復し、角膜アルカリ火傷の治療に使用することができる可能性がある。

角膜アルカリ損傷を有するラットをＭ細胞及びコラーゲン足場の移植により治療し、５ｍｍ×５ｍｍのコラーゲン足場に１×１０^５個のＭ細胞を接種し、培養培地を毎日交換し、７日間培養し、７日目に移植治療を行った。

本発明は、材料の入手困難、移植拒絶反応等の問題を克服し、Ｍ細胞及び材料足場の移植による治療に用いられ、これが角膜上皮の治癒を促進し、角膜の濁りの程度を減らし、角膜血管の生成を減らし、角膜上皮組織をより効果的に修復することができ、角膜アルカリ火傷の治療に使用できる可能性がある。

実験動物：ＳＤラット、雄、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

コラーゲン足場上でのＭ細胞の培養：５ｍｍ×５ｍｍのコラーゲン足場に１×１０^５個のＭ細胞（ｐ４世代）を接種し、培養培地を７日間毎日交換した。７日目に移植を行った。

動物のモデリング：ＳＤラットを５％抱水クロラールで麻酔し、麻酔後にモデリングを行った。直径７ｍｍの濾紙シートを１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨに３０秒間浸漬し、余分な液体を乾いた濾紙に吸収した後、ラットの右角膜の中央に３０秒間置き、生理食塩水で１分間すすぎを行った。すすぎ後、ラットを群分けし、まぶたを縫合した。３日目に、縫合糸を除去した。３日目、５日目、７日目、１０日目、１４日目及び２１日目に眼の光学写真を撮影し、２１日目にサンプリングを行った。

群分け：
コントロール群：
ＮａＯＨ群、まぶたを縫合するのみ。
コラーゲン群、５ｍｍ×５ｍｍのコラーゲン足場を配置し、まぶたを縫合した。
治療群：Ｍ細胞群、Ｍ細胞を保有するコラーゲン足場をラット角膜の中心に置き、まぶたを縫合した。３日後、縫合糸を除去し、スコアリングのため異なる時点で写真を撮影した。

ラット眼球の撮影：ＳＤラットを麻酔した後、実体顕微鏡下で写真を撮影し、倍率を１．２５倍に調整した。写真を撮影する際には、比例尺度を追加し、ラットの眼に対する長期間の強い光刺激を避ける必要がある。

ラット角膜混濁スコア：０点、完全に透明な角膜；１点、角膜混濁は少なく虹彩がはっきりと見える；２点、軽度の角膜混濁、虹彩血管はまだ見える；３点、中程度の角膜混濁、瞳孔縁に血管があるが、虹彩には血管がない；４点、完全に不透明な角膜、瞳孔が見えない。

試料収集：
標本を収集する際、ラットを麻酔した後、ラットを仰臥位に置き、ラットの腹部の中央で皮膚を切り、胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。各ラットには約５０ｍｌの生理食塩水が必要であった。生理食塩水灌流が完了した後、５０ｍｌのパラホルムアルデヒドを用いて固定を行った。灌流が完了した後、ラットの眼球を取り出し、パラホルムアルデヒドで固定し、その後の切片作製のため４℃で保存した。

新たな血管の数の定量：
Joo Youn Oh et, al, anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. 2010, PNAS, 107(39). 16875-16880を参照されたい。

Ｈ＆Ｅ染色及び免疫組織化学（ＩＨＣ）
Joo Youn Oh et, al, anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. 2010, PNAS, 107(39). 16875-16880を参照されたい。

ＥＬＩＳＡ法による関連因子の濃度の検出
Joo Youn Oh et, al, anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. 2010, PNAS, 107(39). 16875-16880を参照されたい。

結論：
ラット眼球の光学写真を図１５３に示した。

ラットの角膜混濁スコアを図１５４に示した。

ラット眼球の試料写真を図１５５に示した。

表２２－１は、３日目、５日目、７日目、１０日目、１４日目及び２１日目の異なる群のラットにおける角膜混濁スコアの統計を示した。

２１日目には、角膜がはっきりし、瞳孔が見え、低いスコアが得られ、統計的な差があり、Ｍ細胞治療の効果が明らかであることを示した。Ｐｒｉｓｍ ７．０統計解析ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡを、分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。Ｍ細胞治療群の眼球は正常群の眼球とより類似しており、体液の蓄積及び鬱血はないことがわかった。Ｍ細胞が角膜アルカリ火傷動物モデルの炎症を軽減し、角膜アルカリ損傷の回復を促進できることを示した。

Ｈ＆Ｅ染色及び免疫組織化学（ＩＨＣ）の検出から、コントロール群において角膜損傷後３日目に好中球エラスターゼが重度の好中球浸潤を示すことがわかった。さらに、２１日目には線維血管角膜間質の肥厚が観察された。対照的に、損傷後３日目のＭ細胞治療群では好中球浸潤が有意に減少し、２１日目に上皮及び間質は正常に戻った。

好中球浸潤を定量的に測定するために、角膜ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）濃度をＥＬＩＳＡで測定したところ、Ｍ細胞による治療後、ＭＰＯ濃度が有意に低下することがわかった。

くさび形の領域で成長した血管の数を計算することで、角膜の新たな血管の数を定量した。結果は、Ｍ細胞注射群では新たな血管の数が有意に減少したことを示した。

角膜全体のＭＭＰ－９のレベルをＥＬＩＳＡで検出すると、Ｍ細胞治療群ではＭＭＰ－９のレベルが有意に低下していることがわかった。

ＥＬＩＳＡにより、コントロール群における炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ－６及びＩＬ－１阻害因子）及びケモカイン（ＣＸＣＬ１／ｃｉｎｃ１及びＣＣＬ２／ＭＣＰ－１）のレベルが、角膜損傷後３日目に有意に増加することがわかった。対照的に、Ｍ細胞治療群の対応する因子は、コントロール群よりも有意に低かった。

実施例２３：乾癬に対するＭ細胞の治療活性の評価
乾癬（一般にセルペド（serpedo）として知られている）は、よく知られている皮膚疾患である。乾癬が発生すると、赤い丘疹又はプラークが皮膚に現れることがあり、複数の層の銀白色の鱗屑で覆われる。四肢、頭及び背中、更には全身にまで発生する傾向がある。場合によっては、ほぼ一生続くこともある。現在、有効な治療法はない。この疾患は主に若年者及び中年の人を冒し、患者の身体の健康及び精神状態に大きな影響を及ぼし、社会及び経済に大きな負担をかけている。疫学調査によると、中国には現在約６５０万人の乾癬患者がおり、発生率は０．４７％である。

現在、乾癬は、樹状細胞（ＤＣ）とＴリンパ球の支配、自然免疫と適応免疫の関与、及び遺伝的背景と環境要因との相互作用によって引き起こされる自己免疫性皮膚疾患であると考えられている。乾癬の特徴的な病変としては、炎症状態によって引き起こされるケラチノサイトの過剰な増殖等が挙げられる。乾癬の病因における主要なサイトカイン（ＴＦＮ－α、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１７）を標的とする拮抗性の生物学的製剤は、臨床治療において非常に効果的であるが、長期治療を維持するための高いコストと潜在的な重篤な有害反応により、かかる生物学的製剤の幅広い適用が制限されている。

目的：Ｍ細胞の皮下ポイント注射による乾癬の治療を達成する。

達成された結果：（１）発疹及び紅斑の緩和、（２）鱗屑の緩和、（３）浸潤の程度の緩和、（４）乾癬性皮膚炎の表現型の緩和、（５）乾癬性皮膚病変の緩和、（６）表皮棘層の低減、（７）角質層の厚さの低減。

実験動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雌、雄、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

４－２．Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

４－３．実験方法：試料加工、実験工程、特定の条件／パラメータ、順序等を含む。

４－３－１．動物モデル：ＢＡＬＢ／ｃマウスの体重を測定し、体重に応じて無作為に群に分けた。ＢＡＬＢ／ｃマウスをガス麻酔機で麻酔した後、背毛を剃り、マウスを各群に６匹のマウスで群分けした。

４－３－２．群分け：
正常群：剃毛を行ったのみで、他の処置を受けない。
イミキモド（ＩＭＱ）群：背中の３点に、１点当たり５０μｌの生理食塩水を注射する。
Ｍ細胞群：背中の３点に、１点当たり１×１０^６個のＭ細胞（Ｐ５世代）を含む５０μｌの生理食塩水を注射する。

上記の処置の日を－１日目として記録した。０日目から６日目まで、毎日６２．５ｍｇのＩＭＱを局所的に塗布し、写真を撮影した。６日目に、－１日目と同じ方法で２回目の治療を行った。８日目には、撮影、灌流及びサンプリングを行った。

４－３－３．試料収集：
標本を収集する際、マウスを腹腔内麻酔した後、マウスを仰臥位にし、マウスの腹部の中央で皮膚を切り、胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。各マウスには約２０ｍｌの生理食塩水が必要であった。生理食塩水灌流が完了した後、２０ｍｌのパラホルムアルデヒドを用いて固定を行った。灌流が完了した後、モデリング領域の皮膚を切り取り、脾臓及びリンパ節を採取し、固定し、切片を作製して分析した。

４－３－４．組織パラフィン切片作製の手順：
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

４－３－５．ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）ＨＥ染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

臨床検査：
方法：各群における脾臓の大きさ及びリンパ節腫瘤の数を比較した。

実験結果：Ｍ細胞は脾臓肥大を効果的に減少させることができ、リンパ節（腋窩、上腕、鼠径部）腫瘤は有意に減少した。皮膚、脾臓、及びリンパ節の細胞組成の検出。

１）フローサイトメトリーによる検出
（１）マウスの組織を取り出し、粉砕機で粉砕し、粉砕液をＥＰチューブに移し、５００Ｇの遠心分離機で５分間遠心分離し、上清を廃棄し、次いで赤血球溶解物５ｍｌを加え、３７℃で１５分間インキュベートし、再び遠心分離し、上清を廃棄し、細胞濃度を１×１０^６に調整し、細胞を遠心管に移し、４００Ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、ＣＤ４抗体を各チューブに添加し、ボルテックスして、暗所で３０分間インキュベートした。

（２）各組織から得られた細胞懸濁液の一部をＨ２ＤＣＦＨ－ＤＡ（５μＭ）にロードし、総ＲＯＳ含有量を検出した。

（３）別の部分を１ｍｌの染色バッファーで２回洗浄し、最初のチューブにＧｒ１及びＣＤ１１イソフィル抗体を添加し、他のチューブに２μｌのＧｒ１及びＣＤ１１抗体を加え、ボルテックス後、４℃で３０分間インキュベーションを行った。

（４）５００μｌのＰＢＳを添加して細胞を再懸濁し、検出及び分析を行うためにロードし、ＣＤ４蛍光に基づいてＣＤ４^＋Ｔ細胞ゲートを決定し、各試料で１００００個のＣＤ４^＋Ｔ細胞を計数し、Ｔ細胞の総数と絶対数、及び好中球と樹状細胞の含有量を計算した。

２）免疫組織化学（ＩＨＣ）染色
免疫組織化学キット（Fuzhou Maixin、ＫＩＴ－９７１０）を使用して、パラフィン切片に対して免疫組織化学染色を行った。具体的な手順は次の通りであった：
１．脱蝋：（１）キシレンＩ、ＩＩ、各１０分、（２）勾配アルコール：１００％無水エタノール、２分間、９５％無水エタノール、２分間、８０％無水エタノール、２分間、７０％無水エタノール、２分間。
２．水和：蒸留水で２回、毎回５分（シェーカーに置く）洗浄した。
３．パラフィン切片の脱パラフィン化及び水和後、すすぎをＰＢＳで３回、毎回３分間行った。
４．抗原賦活化溶液（１０ｍＭ ｐＨ６．０クエン酸ナトリウムバッファー）の調製：
（１）原液の調製：溶液Ａ：クエン酸三ナトリウム二水和物２９．４１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ；溶液Ｂ：クエン酸２１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ。
（２）作業液の調製：溶液Ａ８２ｍＬ＋溶液Ｂ１８ｍＬ＋蒸留水９００ｍＬ。
５．抗原賦活化：切片をクエン酸ナトリウムバッファーで満たしたプラスチック製又は耐熱性のガラス容器に入れ、切片を浸漬し、電子レンジでミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間処理し、クエン酸ナトリウムバッファーを補充し、ミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間再び処理を行った。
６．試薬Ａ（ペルオキシダーゼブロッキング溶液）を添加し、室温で１０分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼの活性を遮断し、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
７．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬの試薬Ｂ（正常な非免疫動物血清）を加え、室温で１０分間インキュベートした。
８．血清を廃棄し、１滴又は５０μＬの一次抗体を加え、４℃で一晩又は室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
９．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのビオチン標識二次抗体（試薬Ｃ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１０．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのストレプトアビジンペルオキシダーゼ溶液（試薬Ｄ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１１．ＰＢＳを廃棄し、２滴又は１００μＬの新たに調製したＤＡＢ溶液を加え、顕微鏡下で３分～１０分間観察を行った。
１２．すすぎを水道水で行い、ヘマトキシリンで対比染色を行い、ＰＢＳ又は水道水ですすぎを行って色出しした。
１３．発色にＤＡＢを使用する場合、切片を勾配アルコールで脱水して乾燥させる必要があり、キシレンで透明化を行い、中性樹脂で封入を行った。
１４．顕微鏡で写真を撮影した。

実験結果：Ｍ細胞治療群では、ＲＯＳのレベルが低下し、脾臓内の好中球と樹状細胞の動員が効果的に減少し、炎症性浸潤細胞が減少し、Ｍ細胞に強い免疫調節効果があることを示した。

３）特定のサイトカイン及び転写因子の発現の検出
１．ＲＮＡ抽出及びＲＴ－ＰＣＲ同定
ＲＮＡ抽出は、InvitrogenのＴＲＩＺＯＬをドラフト内で用いて行った。

試料組織を電動研削棒で粉砕し、１．５ｍｌのＲＮＡフリーチューブに移し、１ｍｌのＴＲＩＺＯＬを加えて細胞を溶解し、溶解物を収集して１．５ｍｌのＲＮＡフリーＥＰチューブに加えた。インキュベーションを４℃で１５分間行い、各チューブに５００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックス及び振盪によって混合し、氷上に１０分間置いた。遠心分離を４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間行った。分離された液体層の上層を１ｍｌのピペットで収集し、新しい１．５ｍｌ ＲＮＡフリーＥＰチューブに移し、移した上層と等量のイソプロパノールを加え、ボルテックス及び振盪によって混合し、氷上に１０分間置いた。遠心分離を４℃、１２０００ｒｐｍ／１０分で行った。上清を廃棄し、ペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、４℃、１２０００ｒｐｍ／１０分で遠心分離した。上清を廃棄し、ＲＮＡをドラフト内で５分～１０分間乾燥させた（乾燥時間が長すぎないようする必要があり、そうでない場合はＲＮＡの溶解度が低下し、ＲＮＡの品質が低下する）。ＲＮＡフリー水を加え、金属浴上において５５℃で１０分間加熱した。ＲＮＡ濃度及びＯＤ値をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。

２．ｍＲＮＡの逆転写
（１）逆転写により抽出したＲＮＡ ２μｇ、オリゴ（ｄＴ）プライマー１μｌ、ｄＮＴＰ混合物１μｌにＲＮＡフリー水を加えて１０μｌとした。変性を６５℃で５分間、インキュベーションを４℃で３分間行った。
（２）反応のため上記の１０μｌ系に更に以下の試薬を加え、系の合計は２０μｌとした。
（３）穏やかに混合した後、４２℃で６０分間反応を行った後、７０℃で１５分間反応を行った。

３．リアルタイムＰＣＲ
逆転写したｃＤＮＡを５倍に希釈し、ＲＴ－ＰＣＲを行った。

実験結果：Ｍ細胞の注射は、皮膚炎症誘発性遺伝子のＩＬ－２３誘発性発現を阻害し、炎症誘発因子ＩＬ－６、ＩＬ－１７及びＴＦＮ－αの発現を阻害し得る。

異なる日のマウスの背中の写真を図１５６に示した。

ＨＥ染色の写真を図１５７に示した。

実施例２４：アルツハイマー病に対するＭ細胞の治療活性の評価
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老年期に最も一般的な慢性疾患の１つである。ＡＤは世界中で３５００万人を超える人々を冒している。ＡＤの臨床症状は、進行性の記憶喪失及び認知障害である。アルツハイマー病は、２つの病原性特徴、すなわち細胞外アミロイドベータ（Ａβ）沈着及び細胞内神経原線維変化（ＮＴＦ）と関連しており、神経炎症、並びに広範なニューロン及びシナプスの喪失を伴い、進行性の記憶喪失及び認知障害につながる。現在、アルツハイマー病を治癒させるか、疾患のプロセスを効果的に逆転させることができる特定の薬はない。薬物療法、非薬物療法及び注意深い看護の組合せにより、疾患を軽減し、その発症を遅らせることができる。したがって、ＡＤを治癒するか又はＡＤを遅延させることができる効果的な治療戦略を開発することが重要である。現在、薬物研究を中心に臨床試験が実施されており、臨床試験は２００件を超えている。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の臨床試験は１０件あり、これらは臨床第Ｉ相及び第ＩＩ相にある。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代をその後の実験に使用した。

実験動物：７月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウス及び雄Ｃ５７ｂｌ／６マウスを、Shanghai Southern Model Organism Research Center及びBeijing Sibeifu Biotechnology Co., Ltd.から購入した。全ての動物を、中国科学院動物学研究所の実験動物センターのＳＰＦグレードで飼育した。動物の世話及び使用は、中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物の実験手順は全て、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施された。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。実験を、マウスの適応給餌の１週間後に開始した。

実験群：正常コントロール群、ＡＰＰ／ＰＳ１＋溶剤、ＡＰＰ／ＰＳ１＋Ｍ細胞、各群に６個の細胞。

実験材料：手術機器、５－０縫合糸、マウス体重計

実験試薬：生理食塩水、ヨードホール、イソフルラン

装置：Ｒ５４０増強型小動物麻酔装置、脳定位計測器、マイクロインジェクションポンプ、水迷路

実験方法：試料処理、実験工程、特定の条件／パラメータ、順序等を含む。

実験工程：麻酔機のスケールラインを２．５に調整し、マウスを箱に入れた。深麻酔後、脳定位計測器を用いてマウスを腹臥位に固定し、マウスの脳の皮膚をヨードホールで拭き、切って１ｃｍの開口部を形成し、以下の位置に従って位置決めを実施した：十字縫合に対してＡＰ：－２．０６、ＭＬ：±１．７５、ＤＶ：－１．７５、注射をマイクロインジェクションポンプで行い、ＡＰＰ／ＰＳ１＋溶剤群の場合、両側海馬にそれぞれ１μｌの生理食塩水を注射した。ＡＰＰ／ＰＳ１＋Ｍ細胞群では、両側海馬にそれぞれ１μｌのＭ細胞：５×１０^５／１μＬを注射した。注射を１０分間行い、注射後、針を５分間保持した後、針を引き抜き、皮膚を縫合した。

水迷路の行動：獲得トレーニング及び探索的トレーニングを含む水迷路トレーニングを、手術後の２４日目～２７日目に実施した。獲得トレーニングは、以下を含んだ：（１）マウスの頭をプールの壁に向けて水に入れ、配置位置を東西南北の４つの開始位置の１つから無作為に選択する。動物が水中のプラットフォームを発見した時間（秒単位）を記録した。最初の数回のトレーニングセッションで、この時間が６０秒を超えると、動物をプラットフォームに誘導した。動物をプラットフォームに１０秒間留まらせた。（２）動物を取り出し、乾かし、ケージに戻した。各動物に対し、１日４回、２回のトレーニングセッションの間に１５分～２０分の間隔をおいて、５日間連続してトレーニングを行った。探索的トレーニングでは、最後の獲得トレーニングの翌日に、プラットフォームを取り外し、６０秒間の探索的トレーニングを開始した。動物を元のプラットフォームの区画の反対側から水中に入れた。標的区画（プラットフォームが最初に配置された区画）において費やされた時間、及び動物が区画に入った回数を空間記憶の指標として記録した。トレーニングの後、２８日目に水迷路テストを行った。

統計：全てのデータを、分散分析及び有意性検定のためＰｒｉｓｍ ７．０統計解析ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡによって分析し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＤ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

結果：水迷路は、動物（被験体）の空間記憶、作業記憶、及び空間識別能力の変化を客観的に測定することができた。プラットフォームを横断するマウスの統計と、プラットフォームに初めて到達するまでの時間の統計は、Ｍ細胞がマウス（被験体）の空間学習と記憶能力を効果的に改善できることを示した。

表２４－１及び図１５８は、マウスがプラットフォームを横断した合計回数の統計を示した。正常コントロール群の合計横断回数は１回であった。正常コントロール群と比較して、溶剤群のマウスの合計横断回数は０回であり、有意差は^＊ｐ＜０．０５であった。Ｍ細胞群のマウスの合計横断回数は０．６６回であり、有意差があり、溶剤群よりも回数が多く、Ｍ細胞がマウスの空間学習能力と記憶能力を効果的に改善できることを示した。

表２４－２及び図１５９は、マウスが初めてプラットフォームに到達するまでに費やした時間の統計を示した。溶剤群と比較して、Ｍ細胞群では費やされる時間は有意に減少し（３８．０秒対５９．８秒）、Ｍ細胞がマウスの空間学習能力と記憶能力を効果的に改善できることを示した。

アミロイド沈着（Ａβ）の病理学的検出
方法はPaolicelli et al., 2017の公開された論文を参照した。

マウスの切片の蛍光染色結果の統計によると、Ｍ細胞を注射したモデルマウスでは、単位面積当たりのプラークの数と割合がコントロール群よりも有意に減少した。これは、Ｍ細胞がアミロイド沈着の蓄積を減らし、それによって神経への悪影響を減らすことができることを示した。

脳内炎症の検出
方法はPaolicelli et al., 2017の公開された論文を参照した。

ＥＬＬＳＡ及びＷＢを用いてＩＬ－６、ＴＦＮ－α、ｉＮＯＳ等の炎症因子を検出したところ、Ｍ細胞を注射したモデルマウスでは、コントロール群と比較して炎症因子の指標が有意に低下したことがわかった。これは、Ｍ細胞がミクログリアの炎症誘発性形態への変換を減少させ、ミクログリアの過剰な活性化と機能障害を防ぐことができることを示した。

免疫蛍光染色検出：
方法はPan et al., 2019の公開された論文を参照した。

免疫蛍光染色法を用いてミクログリアのマーカーを検出したところ、Ｍ細胞を注射したモデルマウスにおけるミクログリアの食作用能力は、コントロール群よりも有意に高いことがわかった。これは、Ｍ細胞がミクログリアの食作用能力を改善し、アミロイド沈着とアポトーシス細胞破片を除去できることを示した。

Ｍ細胞を注射したモデルマウスにおける単位面積当たりのＡ１星状膠細胞の数は、コントロール群よりも少ないことが分かった。これは、Ｍ細胞がＡＤ脳の炎症環境におけるＡ１星状膠細胞の生成を阻害し、一過性の免疫活性化を阻害し得ることを示した。

同時に、ニューロン（ＴＵＪ１＋）の数が増加し、Ｍ細胞を注射することで神経の生存が改善され、認知及び記憶が改善され得ることもわかった。

バーンズ迷路試験：
方法はZhang et al., 2019の公開された論文を参照した。

この試験から、Ｍ細胞を注射したマウスモデルは、平らな穴を見つけるトレーニング、又は穴に到達するまでの時間、及び交差時間の点で、コントロール群よりも優れていることがわかった。これは、Ｍ細胞を注射することで、ＡＤマウス（被験体）の記憶障害及び認知障害を改善し得ることを示した。

実施例２５：関節炎に対するＭ細胞の治療活性の評価
変形性関節症（ＯＡ）は、ますます一般的な関節疾患になっている。ＯＡは、幾つかの抗炎症薬、鎮痛剤、又は潤滑補助剤を使用して治療できることが知られており、また代わりに、穿孔、微小骨折、及び自家骨軟骨モザイク移植（骨軟骨柱移植術）を伴う手術を行って、欠損部位を修復又は再構築してＯＡを治療することができるが、このアプローチは一時的に症状を改善するだけであり、変性した組織を永久に治癒又は再生することはない。

この実施例では、変形性関節症に対するＭ細胞の治療活性を評価する。

実験動物：ＳＤラット、雄、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアを形成し、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

動物のモデリング：ＳＤラットをガス麻酔機で麻酔し、左関節の毛を削り取り、アルコールを噴霧したガーゼで拭いた後、５０μｌのＭＩＡ溶液を１ｍｌシリンジで関節腔に注射してモデリングした。マウスを各群に６匹のマウスで群分けし、２１日目に分析した。

群分け：正常群、モデル群、Ｍ細胞群。
正常群：治療しない。
モデル群：０日目に５０μｌのヨード酢酸ナトリウム（ＭＩＡ）を関節腔に注射し、７日目及び１４日目に１００μｌの生理食塩水を関節腔に注射した。
Ｍ細胞群：０日目に５０μｌのヨード酢酸ナトリウム（ＭＩＡ）を関節腔に注射し、７日目及び１４日目に、３×１０^６個のＭ細胞を含む１００μｌの生理食塩水を関節腔に注射した。

ＭＩＡの調製：ヨード酢酸ナトリウム（ＭＩＡ）を生理食塩水に溶解し、１ｍｇのＭＩＡを１ｍｌの生理食塩水に溶解し、濃度を１００μｇ／μｌのＭＩＡ溶剤に調整した。

強制歩行の評価（ロータロッドテスト）
動物を、速度を上げながら回転するシリンダー（ロトロッド（Roto-rod））に無作為に置き、落下を避けるように継続的に強制歩行させ、パフォーマンス指標は主に運動学習及び患肢の使用を含んだ。最初に、装置に慣れるために、試験ラットをロトロッドに５分間置いた。順応期間の５分後、ラットを再びロトロッド上に置き、５分間かけて回転速度を５ｒｐｍから３５ｒｐｍに増加させた。落下の待ち時間は、装置底面にある機械式センサーによって自動的に測定される。動物の運動活動の結果を、全ての動物で１日目、並びに誘導後７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に評価した。

実験結果
実験結果は、Ｍ細胞群のスコアがモデル群よりも高いことを示し、このことは変形性関節症を有するラットの運動活動は、Ｍ細胞治療後に比較的改善され得ることを示した。

接触性アロディニアの評価（Ｖｏｎ Ｆｒｅｙテスト）
試験マウスを底部に５ｍｍ²のグリッドがある単一のアクリル透明ボックスに入れ、順応環境で、実験前に厚さ１ｍｍの非研磨金属線を１５分間置いた。実験ボックスの２５ｃｍ下に鏡を置いて、後肢の足底領域を見やすくした。試験器は、グリッドの穴を通して、後肢が刺激されて離脱反応が起こるまで、後肢の中央領域に直線的に増加する圧力を加えた。動物が３つの同様の後肢離脱反応を示すまで、同側及び対側の後肢に対して刺激を最大６回繰り返した。

実験結果
モデル群と比較して、Ｍ細胞群の試験マウスは離脱反応時間が有意に遅れ、マウスが耐えることができる刺激圧がモデル群よりも有意に高く、Ｍ細胞は痛みを引き起こす神経を阻害する効果があったことを示した。

Ｘ線曝露の評価
変形性関節症ラットは、Ｍ細胞投与日、細胞の２回目の投与前、及びサンプリング時にＣＴ撮像を受けた。ＣＴ撮像：試験マウスを麻酔し、ＣＴ台に置いて固定し、これにより、撮像の全過程で、損傷した脚にＸ線を照射することができた。画像を撮像後に分析した。

実験結果
ラット関節鏡検査の写真を図１６０に示した。モデル群では、明らかな関節腔の狭窄、不規則な関節表面、関節軟骨の侵食、及び骨棘が観察された。Ｍ細胞群では、関節表面の凹凸が低く、関節軟骨がわずかに侵食され、わずかな骨棘があった。これは、組織損傷に関して、Ｍ細胞が変形性関節症に部分的に効果があることを示した。

標本収集
標本を収集する際、ラットを腹腔内麻酔後に仰臥位に置き、ラットの腹部の中央で皮膚を切って胸部を開き、心臓を露出させ、心臓に氷冷した生理食塩水を灌流した。各ラットには約５０ｍｌの生理食塩水が必要であった。生理食塩水の灌流が完了した後、モデリング部位の関節を切り取り、固定し、切片を作製し、分析した。

サフラニン－Ｏ／ファストグリーン染色及びＯＡＲＳＩスコアリング
作業液：０．１％サフラニン染色液：０．１ｇ＋重水素減少水１００ｍｌ
０．１５％ファストグリーン染色液：０．１５ｇ＋重水素減少水１００ｍｌ
１％氷酢酸：氷酢酸２ｍｌ＋重水素減少水１９８ｍｌ

工程：パラフィン切片を調製するため、切片を６０℃で一晩焼いた後、キシレン、アルコール、及び重水素減少水に順番に浸漬し、次いでサフラニンＯ溶液で４分間染色し、水道水中で３回引っ張り（pulled）、ファストグリーン染色液に４分間浸漬して染色し、水道水で１分間洗浄した後、切片を氷酢酸溶液で１分～２分間洗浄し、水道水で１分間洗浄し、それぞれ９５％エタノール及び無水エタノールで脱水し、１０秒～１５秒後に樹脂による封入を行った。

軟骨変性は、国際変形性関節症学会（ＯＡＲＳＩ：Osteoarthritis Research Society International）が推奨する方法を用いて評価した（合計スコア：０～２４）。簡潔には、脛骨内側プラトーの軟骨損傷の深度及び程度をそれぞれ６グレード及び４グレードに分けて、グレードを掛けてスコアを取得した。各試料は３人の観測者によって個別にスコアリングされ、平均値が取得された。

実験結果
モデル群では、後期に石灰化軟骨に達する、中軟骨までの深さの小さな欠損が観察されたのに対し、Ｍ細胞治療群では、軟骨欠損の深さは小さく、後期に深部軟骨に達し、モデル群よりも面積が小さく、ＯＡＲＳＩスコアはモデル群のスコアよりも低かった。

ＩＩ型コラーゲン免疫組織化学及び半定量分析
脱パラフィン化、再水和及び抗原賦活化後、切片にラットＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体（Santa Cruz）を４℃で１４時間～１８時間適用した。翌日、切片の再加温を行い、指示に従ってＤＡＢ免疫組織化学キット（R＆D systems）を操作した。終了後、切片を脱水して封入した。Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ６．０ソフトウェアを使用して、脛骨内側プラトーの軟骨層の累積正積分ＩＯＤ、及びＩｏＤ／面積がＩＩ型コラーゲンの陽性度を表す検出区域の面積を計算した。

実験結果
Ｍ細胞治療群と比較して、モデル群では脛骨プラトーの軟骨層でのＩＩ型コラーゲンの損失がより明白であった。

実施例２６：骨折に対するＭ細胞の治療効果の評価
骨折とは、骨構造の連続部分が完全に破損することを指す。これは一般的な臨床的骨損傷であり、子供及び高齢者によく見られ、若年及び中年の人にも発生する。多くの場合、単一の骨折であり、多発性骨折は少ない。適時及び適切な治療により、殆どの場合、元の機能を回復することができ、様々な程度の後遺症を残す可能性がある患者は少ない。骨折の主な理由は、直接的又は間接的に（縦方向の伝導、てこの作用又はねじれ等による、暴力の点から遠く離れた骨の同時骨折を引き起こす）暴力が骨の特定の部分に作用することであり、これにはしばしば種々の程度の軟部組織の損傷を伴い、長期、繰り返し、軽度の直接的又は間接的な損傷は、様々な職業病でもよく見られる疲労骨折とも呼ばれる四肢の特定の部分に骨折を引き起こす可能性がある。さらに、一部の骨関連遺伝性疾患又は結合組織疾患は、多発性骨折の臨床症状も伴う場合がある。骨折患者の典型的な臨床症状は、局所的な腫脹、変形、疼痛、鬱血等、及び四肢の異常な動き又は運動障害である。

骨折の伝統的な治療では、整復、固定、及び機能的運動が３つの基本原則である。しかしながら、重度の骨損傷の場合、従来の骨折治療ではうまく治癒できないか、又は治療後に変形を引き起こす可能性がある。したがって、損傷又は疾患による骨損傷の場合、自家及び同種骨移植片を頼って骨修復を行うことがよくある。自家骨移植は良好な修復効果を有するが、自家骨移植片の量が限られている、二次手術の必要性、及び術後合併症が８％にもなる等の制限があり、一方、同種骨移植は適合するのが難しく、深刻な免疫拒絶現象があり、したがって骨修復のための最も理想的な選択ではない。

参考文献：
局所的に放出されるシンバスタチンと組み合わせた間葉系幹細胞シート移植は、ラットの脛骨骨切り術モデルにおける骨形成を増強する（Mesenchymal stem cell sheet transplantation combined with locally released simvastatin enhances bone formation in a rat tibia osteotomy model）。
間葉系幹細胞馴化培養培地は、糖尿病ラットにおける血管新生及び骨折治癒を促進する（Mesenchymal stem cell-conditioned culture medium facilitates angiogenesis and fracture healing in diabetic rats）。
全身間葉系幹細胞投与は、骨折修復における骨形成を増強するが、負荷誘発性骨形成は促進しない（SYSTEMIC MESENCHYMAL stem cell ADMINISTRATION ENHANCES BONE FORMATION IN FRACTURE REPAIR BUT NOT LOAD-INDUCED BONE FORMATION）。
脂肪由来の周皮細胞は、治癒の失敗（すなわち、偽関節）から骨折を救済する（Adipose derived pericytes rescue fractures from a failure of healing - non-union）。

達成した効果：Ｍ細胞移植により、骨損傷部位の治癒が加速され、骨損傷に対する治療効果が達成された。

実験動物：ＳＤラット、雄、１２週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアを形成し、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

試料収集：
標本を収集する際、ラットを腹腔内麻酔後に仰臥位に置き、ラットの腹部の中央で皮膚を切って胸部を開き、心臓を露出させ、心臓に氷冷した生理食塩水を灌流した。各ラットには約５０ｍｌの生理食塩水が必要であった。生理食塩水灌流が完了した後、５０ｍｌのパラホルムアルデヒドを用いて固定を行った。灌流が完了した後、損傷部位の骨を切断し、パラホルムアルデヒドで固定し、切片を作製し、分析した。

モデリング：１２週齢のＳＤラットを麻酔し、次いでラットの左後肢にミニチュア手持頭蓋ドリルで穴を開け、直径３ｍｍの穴を形成した。モデリング後、ラットを群ごとに６匹のラットに群分けした。

モデル群：筋肉の周囲に１００μｌの生理食塩水を注射した。
Ｍ細胞群：Ｐ５世代時の３×１０^６個のＭ細胞を含む生理食塩水１００μｌを筋肉周囲に注射し、その後、１０日目、２２日目、及び５０日目に小動物ＣＴを用いてラットをそれぞれ撮影し、観察した。その結果を図１６１～図１６３に示した。

小動物ＣＴの使用：ラットを麻酔した後、ＰＥ Ｑｕａｎｔｕｍ ＦＸ機器のスキャン位置に固定した。ラットの骨損傷部位付近でマイクロＣＴスキャンを実施した。スキャン条件は、電源電圧９０ｋＶ、深さ１４ビット、解像度ＦＯＶ ６０ｍｍ、及びスキャン時間Ｆｉｎｅ ２分であった。スキャンを０度回転で実施した。

実験結果：１０日目のＣＴ画像では、Ｍ細胞治療群における骨損傷の治癒傾向がモデル群よりも良好であることがわかった。２２日目のＣＴ画像では、モデル群と比較して、Ｍ細胞治療群における骨損傷の治癒には明らかな利点があり、骨損傷領域が小さく、Ｍ細胞移植が骨損傷の治癒を加速できること、及びＭ細胞が骨損傷に対する良好な治療効果を有することを示した。５０日目のＣＴ画像から、Ｍ細胞移植治療群の骨損傷部位は完全に治癒したが、モデル群ではまだ完全には治癒していないことがわかった。これは、Ｍ細胞が骨損傷を非常にうまく治療できることを示した。

Ｘ線検査：ラットを麻酔した後、３２ｋＶの電圧を１０秒間使用して、高解像度デジタルＸ線撮影システム（Ｆａｘｉｔｒｏｎ ＭＸ－２０）に入れた。大腿骨骨折の仮骨幅をＸ線撮影によって決定し、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェアによって分析した。

以上のことから、Ｍ細胞治療群における骨損傷の治癒時間はモデル群よりも有意に短く、Ｍ細胞治療群における骨損傷はモデル群よりも早く治癒し、仮骨の大きさはモデル群よりも有意に大きく、穴のギャップが小さく、Ｍ細胞が骨損傷の治癒速度を著しく加速する可能性があることを示した。

骨損傷治癒後の骨密度の測定：骨ミネラル密度測定の原理は、主に低エネルギーと高エネルギーの光子ピークの２種類のエネルギーが、特定のデバイスを介してＸ線管を通して取得され、光子ピークが身体を貫通した後、スキャンされたシグナルをコンピューターに送信し、データ処理することで骨ミネラル含有量を取得することであった。

マイクロＣＴ分析による：Ｍ細胞群の骨ミネラル密度はモデル群よりも良好であった。

四点曲げ機械試験：実験組織を採取した後、切除した組織を２４時間以内の室温で試験し、四点曲げ装置（Ｈ２５ＫＳ）により、５ｍｍ／分の一定の変位率を使用して、組織試料が壊れているかどうかを試験した。脛骨を、それぞれ８ｍｍ及び２０ｍｍの内側スパン及び外側スパンを有するブレード内に前後方向に配置した。試験中、脛骨の長軸をブレードに対して垂直に配向させた。試験が完了した後、内蔵ソフトウェア（ＱＭＡＴプロフェッショナル材料試験ソフトウェア）を使用して、破壊（failure）までの最終的な荷重、破壊によって吸収されるエネルギー（荷重－変位曲線下面積、靭性と称される）、及び弾性率（Ｅ－係数、応力－歪み曲線の傾き、組織剛性と呼ばれる）を記録し、分析した。治癒した骨折の生体力学的特性を、対側の無傷の骨の特性に対するパーセンテージとして表した。

四点曲げ機械試験の結果は、Ｍ細胞治療群の靭性、最終破壊荷重（Ｆ）、及びＥ－係数（Ｇ）がモデル群よりも高いことを明確に示した。これは、Ｍ細胞治療後の機械的特性の回復が促進され得ることを示した。

組織学的分析（ＨＥ染色）：サンプリング後の脛骨を４％緩衝ホルマリン溶液で１日固定した後、９％ギ酸で５日～７日間脱灰した。スライサー（縦方向は矢状面）を用いて試料を半分に切断しようとしたため、各試料に対する中矢状面の断面を正規化した。試料を組織処理に供した後、パラフィン包埋した。回転ミクロトーム（ＨＭ ３５５Ｓ）上の矢状面の各脛骨の長軸に沿って薄切片（７μ）を作製した。切片をコーティングされたスライドガラスに封入した。スライドをキシレンに浸漬してパラフィンを除去した（室温で２回、５分ごとに交換）。次いで、スライドを段階的エタノール及び蒸留水に浸し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、最後に脱水して固定した。

ＨＥ分析の結果：Ｍ細胞群では、未治癒部の仮骨にはまだ成熟した骨細胞、軟骨組織、線維組織、及び未分化組織があったが、穴に幾つかの結合が現れ、その相対量がモデル群よりも多く、Ｍ細胞が様々な骨細胞の形成を促進し得ることを示した。

免疫組織化学：組織切片をＰＢＳで３回洗浄し、次いでＴＢＳブロッキング溶液（（０．３％）Ｔｒｉｔｏｎ＋（５％）ＢＳＡ＋ＰＢＳ）に３０分間浸漬し、次いで一次抗体（ウサギ抗ＧＦＰ；１：３００）を含む抗体希釈液（（０．３％）Ｔｒｉｔｏｎ＋（１％）ＢＳＡ＋ＰＢＳ）に一晩浸漬し、ＰＢＳで２回それぞれ５分間洗浄し、次いで抗体希釈液及び二次抗体（Ｃｙ３ヤギ抗ウサギＩｇＧ；１：１０００）に２時間浸漬し、ＤＡＰＩによる核染色に１０分間供し、ＰＢＳで毎回５分間洗浄した後、観察及び撮影し、細胞をＩｍａｇｅＪで定量した。

免疫組織化学分析の結果：Ｍ細胞治療群で観察された骨芽細胞転写因子の含有量は、モデル群よりも多く、骨損傷の治癒促進を示した。

スクリーニング後の好ましい細胞投与レジメンは、以下の通りであった：
１×１０^６個のＭ細胞を含む１００μｌの生理食塩水懸濁液。
１×１０^６個のＭ細胞を含む５０μｌの生理食塩水懸濁液。
３×１０^６個のＭ細胞を含む１００μｌの生理食塩水懸濁液。
３×１０^６個のＭ細胞を含む５０μｌの生理食塩水懸濁液。
５×１０^６個のＭ細胞を含む１００μｌの生理食塩水懸濁液。
５×１０^６個のＭ細胞を含む５０μｌの生理食塩水懸濁液。

実施例２７：鼻炎に対するＭ細胞の治療活性の評価
鼻アレルギーとしても知られるアレルギー性鼻炎（ＡＲ）は、一般的な耳鼻咽喉科疾患であり、一般的な呼吸器アレルギー性疾患である。この疾患は、鼻粘膜に発生するアレルギー性疾患であり、かゆみ、くしゃみ、鼻漏及び鼻汁、並びに鼻粘膜の腫脹を特徴とする。アレルギー性鼻炎の有病率は１０％～４０％であり、そのうちヨーロッパ及び北米では花粉アレルギーがより一般的であり、アジアでは多年生植物のアレルギー性鼻炎がより一般的である。アレルギー性鼻炎は致命的ではないが、鼻及び全身に明らかな不快感があるため、患者の勉強及び仕事に影響する。適切に治療しないと、約３０％の患者が気管支喘息、更には肺心臓疾患及び患者の健康と生活の質に深刻な影響を与えるその他の疾患を発症する。コルチコステロイド及び抗ヒスタミン薬が現在、アレルギー性鼻炎の第一選択治療法である。アレルギー性鼻炎は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの環境因子の作用下でＩｇＥによって媒介されるアレルギー性炎症反応であり、鼻粘膜の免疫応答が支配的である。

参考文献：
脂肪組織由来間葉系幹細胞は、ラットモデルにおけるアレルギー性鼻炎の免疫応答を調節する（Adipose Tissue-Derived Mesenchymal stem cell Modulates the Immune Response of Allergic Rhinitis in a Rat Model）。

この実施例では、鼻炎に対するＭ細胞の治療効果を評価した。実験結果は、Ｍ細胞を移植した後、マウスのくしゃみ及び鼻を掻く回数が有意に減少し、鼻炎の症状が有意に改善されたことを示した。

実験動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雌、雄、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

動物のモデリング及び治療：鼻炎のモデリングにはＢＡＬＢ／ｃマウスを使用し、正常群、モデル群及びＭ細胞群に分けて、各群に６匹のマウスを用いた。

正常群：治療を行わなかった。
モデル群：０日目、３日目、及び７日目にＯＶＡ含有エマルジョン２００μｌの腹腔内注射を行い、１００μｇのＯＶＡを含む溶液１０μｌの鼻腔内滴下を７日目から１４日目に各鼻孔に適用し、１４日目及び１７日目に生理食塩水１００μｌを静脈内注射し、２１日目に分析のためにサンプリングを行った。
Ｍ細胞群：０日目、３日目、及び７日目にＯＶＡ含有エマルジョン２００μｌの腹腔内注射を行い、１００μｇのＯＶＡを含む溶液１０μｌの鼻腔内滴下を７日目から１４日目に各鼻孔に適用し、１４日目及び１７日目に３×１０^６個のＭ細胞を含有する生理食塩水１００μｌを静脈内注射し、２１日目に分析のためにサンプリングを行った。

検出方法及び結果：
１）くしゃみ及び鼻掻き行動の評価：
マウスの各鼻孔に１００μｇのＯＶＡを含む溶液１０μｌを滴下し、５分間順応させた後、空ケージ内での５分以内のくしゃみ及び鼻掻きの回数の統計を行い、表２７－１、表２７－２、図１６４及び図１６５に詳述した。

２）酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
（１）抗原のコーティング：抗原をコーティングバッファーで最適濃度（５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ）に希釈し、マイクロ反応プレートの各ウェルに０．３ｍｌで添加し、４℃で一晩又は３７℃の水浴中で２時間～３時間静置し、冷蔵庫で保存した。
（２）洗浄：コーティング溶液を除去し、洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）でウェルを３回（毎回５分間）洗浄した。
（３）試験する試料の添加：各ウェルに、試験する血清０．２ｍｌを添加し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む希釈バッファーで希釈し、３７℃で１時間～２時間静置した。
（４）洗浄：コーティング溶液を除去し、洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）でウェルを３回（毎回５分間）洗浄した。
（５）酵素コンジュゲートの添加：希釈バッファーで希釈した酵素コンジュゲート０．２ｍｌを各ウェルに加え、３７℃で１時間～２時間作用させた。
（６）洗浄：コーティング溶液を除去し、洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）でウェルを３回（毎回５分間）洗浄した。
（７）各ウェル（ＯＰＤ又はＯＴ）に、０．２ｍｌの基質溶液を添加し、室温で３０分間作用させた（別のブランクコントロールを設定し、基質０．４ｍｌ＋停止剤０．１ｍｌを添加した）。
（８）停止剤の添加：０．０５ｍｌの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４又は２Ｍクエン酸を各ウェルに添加した。
（９）観察及び記録結果：ＯＤ値を目視又は酵素標識比色計（ＯＰＤは４９２ｎｍ）で測定した。

実験結果：ＡＲモデル群と比較して、Ｍ細胞治療群の特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａは有意に低く、ＰＧＥ２のレベルはＡＲモデル群よりも有意に高く、ヒスタミンのレベルはＡＲモデル群よりも有意に低かった。結果は、Ｍ細胞を注射すると、血清抗原特異的抗体応答のレベルが低下し、炎症メディエーターの発現が低下し得ることを示した。

３）病理組織学的検査
３－１．標本収集：
標本を収集する際、マウスを腹腔内麻酔後に仰臥位にし、マウスの腹部の中央で皮膚を切って胸部を開き、心臓を露出させ、心臓に氷冷した生理食塩水を灌流した。各マウスには約２０ｍｌの生理食塩水が必要であった。生理食塩水灌流が完了した後、２０ｍｌのパラホルムアルデヒドを用いて固定を行った。灌流が完了した後、マウスの鼻腔を採取し、固定し、切片を作製し、分析した。

３－２．組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

３－３．ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

実験結果：ＯＶＡアレルゲンの投与後、鼻粘膜の構造が著しく変化し、上皮細胞が失われ、粘膜が剥離し、炎症細胞が浸潤し、血管が減少した。Ｍ細胞治療後、上皮細胞が増加し、僅かな細胞が浸潤し、血管の数が増加した。結果は、Ｍ細胞は炎症部位の血管新生を促進し、上皮細胞の生成を促進し、炎症細胞の浸潤を減少させ得ることを示した。

３－４．マッソン染色
操作工程：
（１）パラフィン切片を準備し、水に脱蝋させた。
（２）１％の過マンガン酸カリウムで切片を５分間酸化した。
（３）水で洗浄し、シュウ酸で１分間漂白した。
（４）水で洗浄し、蒸留水で洗浄した。
（５）セレスティンブルーで５分間染色した。
（６）水で洗浄し、残った液体を振り落とした。
（７）メイヤーヘマトキシリンを３分～５分間滴下して染色した。
（８）流水で５分～１０分間すすいだ。
（９）ポンソーレッド・ピクリン酸飽和溶液で５分間染色した。
（１０）１％酢酸水溶液で洗浄した。
（１１）切片を１％のリンモリブデン酸で約５分間分別した。
（１２）蒸留水で洗浄した。
（１３）１％トルイジンブルーを３０秒間滴下して染色した。
（１４）１％酢酸水溶液で洗浄した。
（１５）９５％エタノールで分別した。
（１６）無水エタノールで脱水した。
（１７）キシレンで透明化した。
（１９）中性樹脂で封入した。

実験結果：鼻炎モデル群における鼻粘膜の基底板及び固有層には、明らかなコラーゲン線維の凝集及びコラーゲン線維の沈着があった。Ｍ細胞治療群では、鼻粘膜固有層におけるコラーゲン線維が少なく、コラーゲン線維の沈着が有意に減少し、Ｍ細胞が鼻炎上皮線維症を改善し得ることを示した。

３－５．透過型電子顕微鏡検査による検出
方法：試料を１％オスミン酸で３０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した（毎回１０分）。試料をエタノール（３０％、５０％、７０％、９０％、及び無水エタノール）で各濃度において３０分間脱水した。試料をアセトンに１時間浸漬した後、５０２樹脂に包埋した。プラスチック型をミクロトームで切断し、１％トルイジンブルーで染色した。半薄切片の検査後、極薄切片（厚さ５０ｎｍ～６０ｎｍ）を切断し、酢酸ウラニルで染色した後、クエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡で検出して撮影した。

実験結果：モデル群では、上皮細胞の表面がひどく損傷し、鼻繊毛が減少し、細胞質の空胞核が破壊され、肥満細胞が増加し、顆粒球が浸潤した。Ｍ細胞治療群では、鼻粘膜上皮表面は無傷であり、繊毛は無傷であり、オルガネラ形態は正常であり、線維芽細胞は正常であり、細胞質は無傷であった。

実施例２８：移植片対宿主病に対するＭ細胞の治療活性の評価
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、主に移植後、同種ドナー移植においてＴリンパ球が、レシピエントの関連サイトカインの影響により、レシピエント抗原に対する免疫応答を増強し、その結果、皮膚、肝臓及び腸管が主な標的である患者の標的細胞を標的にして細胞傷害性の攻撃が開始されるという事実に起因し、ＧＶＨＤの発生には主に次の３つのポイントがある：（１）移植片は免疫担当細胞を含む；（２）ドナーは組織適合性抗原がレシピエントと異なる；（３）ドナーの免疫担当細胞は拒絶されないため生存し、異なる組織適合性抗原を認識すると分裂して増殖する。一般に、ＧＶＨＤに関与する免疫担当細胞は汚染された成熟Ｔ細胞であり、汚染率が高いほどＧＶＨＤの可能性が高くなると考えられている。

現在、ステロイド、免疫抑制因子、及びモノクローナル抗体は、ＧＶＨＤの治療のための第１選択薬及び第２選択薬として使用されている。グルココルチコイド療法の作用機序は、Ｔリンパ球が媒介する受容体に対する免疫攻撃反応を阻害することであるが、ホルモン療法はあまり理想的ではなく、高用量のホルモン療法は身体の感染及び腫瘍の再発率を増加させるため、新たな、より安全で効果的な治療が依然としてＧＶＨＤの治療に必要とされている。近年、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の研究は現代生物学の分野でホットスポットとなっている。自己複製及び多方向分化の可能性がある幹細胞のクラスとして、ＭＳＣは或る特定の誘導条件下で様々な機能性細胞及び器官に分化することができ、それらの幹細胞の増殖能及び多方向分化能を活かして、臨床的に難治性疾患に新たな希望をもたらすことができ、現代の臨床医学における新たな治療法となりつつある。幾つかの研究は、ＭＳＣが、免疫及び炎症の調節作用を有するＴ細胞の増殖を阻害することによって炎症反応を阻害することができ、ＧＶＨＤ治療の新たな研究の方向性を提供することを見出した。

多くの動物実験により、ＧＶＨＤの治療におけるＭＳＣ移植は良好な有効性及び安全性を示すことが示されている。しかしながら、成人組織由来ＭＳＣの臨床応用には、主に以下の欠点がある：（１）単一個体の組織からは治療量の成体組織由来ＭＳＣを殆ど得ることができない；（２）成人組織由来ＭＳＣは異なる個体の組織に由来するため、製品品質の高い一貫性を達成することは殆どできない；（３）同じ個体の組織に由来するＭＳＣでさえ非常に不均一である；（４）成人組織由来ＭＳＣのドナー組織源は複雑であり、潜在的な感染性病原体感染リスクがある；（５）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大に伴って成人組織由来ＭＳＣの急速な老化が起こる。したがって、ＧＶＨＤの治療にはＭＳＣ細胞の新たな供給源が必要である。

参考文献：
（１）Functional dosing of mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles for the prevention of acute graft-versus-host to disease.
（２）Optimization of the Therapeutic Efficacy of Human Umbilical Cord Blood to Mesenchymal Stromal Cells in an NSG Mouse Xenograft Model of Graft-versus-Host Disease.
（３）An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.
（４）Highly Sensitive Model for Xenogenic GVHD Using Severe Immunodeficient NOG Mice.

この実施例は、ＧＶＨＤに対するＭ細胞の治療活性を評価し、この実施例の実験プロトコルは、前述の文献を参照して考案された。

実験動物：ＮＣＧマウス、雄、６週齢。動物をBeijing Weitongda Biotechnology Co. Ltd.から購入した。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアを形成し、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、その後の実験に使用した。

動物モデルの作製：
（１）１．７５Ｇのγ線をマウスに６時間照射した後、５×１０^６個のｈＰＢＭＣをマウスの尾静脈に移植した。
（２）実験の群分け：
コントロール群：照射されない。
ＧＶＨＤ群：照射及びｈＰＢＭＣの移植後２日目、５日目、及び８日目に生理食塩水のみを注射した。
ＧＶＨＤ＋低用量Ｍ細胞群：照射及びｈＰＢＭＣの移植後の２日目、５日目、及び８日目に１．５×１０^６個のＭ細胞をマウスの尾静脈に注射した。
ＧＶＨＤ＋高用量Ｍ細胞群：照射及びｈＰＢＭＣの移植後の２日目、５日目、及び８日目に５×１０^６個のＭ細胞をマウスの尾静脈に注射した。
（３）体重を１４日目まで測定し、生存率を１９日目まで数えた。１９日目に、骨髄を採取し、灌流を実施し、腎臓、結腸、肺及び肝臓を収集し、収集した試料をパラホルムアルデヒドに一晩浸漬し、続いてパラフィン切片の作製及びＨＥ染色を行った。

試料収集：
標本を収集する際は、腹腔内麻酔後にマウスを腹臥位に置き、マウスの腹部の中央で皮膚を切り、腹腔を開き、中心静脈から採血した。胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。生理食塩水灌流が完了した後、５０ｍｌのパラホルムアルデヒドを用いて固定を行った。灌流後、腎臓、結腸、肺及び肝臓を採取し、固定し、切片を作製し、分析した。収集した血液を室温にて５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、多因子ＥＬＩＳＡ分析のため上清を収集した。

フローサイトメトリーによる骨髄におけるヒトＣＤ４５陽性細胞浸潤の検出
（１）０．５ｍｌの骨髄液を無菌的に抽出した。
（２）１０００Ｕ／ｍｌのヘパリン抗凝固剤を含むＰＢＳ １ｍＬに骨髄試料を滴下した。
（３）次いで、それをＰＢＳで１０ｍＬに希釈した。
（４）希釈した骨髄液５ｍＬをピペッティングし、４ｍＬのヒトリンパ球分離液の表面にゆっくりと加えた。
（５）上記の条件下で、ＰＢＳヒトリンパ球分離液の間に形成された界面に、骨髄有核細胞を重ねた。
（６）有核細胞の層を吸引し、１０ｍＬのＰＢＳに加え、よく混合した。
（７）遠心分離を１０００ｒ／分で５分間行った。
（８）上清を廃棄し、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、セルシーブで濾過して細胞クラスターを除去し、細胞を計数し、１チューブ当たり２×１０^６個で小分けにした。
（９）遠心分離を１２００ｒｐｍで３分間行った。
（１０）２％ＢＳＡブロッキング溶液で２０分間ブロッキングした後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った。
（１１）上清を廃棄し、１００μＬの１％ＢＳＡ抗体希釈液で細胞を再懸濁し、直接標識抗体を添加し、室温で３０分～４５分間インキュベートした。
（１２）１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄を実施し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
（１３）３００μＬのＰＢＳに再懸濁した後、細胞を４０μｍのセルシーブで濾過し、検出用機械に装入した。

組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に一晩浸した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

サスペンションチップシステムによる炎症因子の検出：
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。２３種の因子のキットを炎症因子の検出に使用した。
（２）凍結保存した細胞上清を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上に置いた。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を細胞培養上清に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランク、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

統計分析
Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡ及びｔ検定を分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

２．実験結果

（１）体重モニタリングの結果は、１４日目のＧＶＨＤ群の体重はコントロール群の体重よりも有意に低く（^＊＊＊ｐ＜０．００１）、ＧＶＨＤ群と低用量Ｍ細胞群との間に有意差はなかったが、高用量Ｍ細胞群よりも有意に低く（^＊＊ｐ＜０．０１）、低用量Ｍ細胞群と高用量Ｍ細胞群とで体重に有意差は認められなかったことを示した（表２８－１、図１７０）。結果は、Ｍ細胞がＧＶＨＤマウスの体重を増加させ得ることを示した。
（２）生存率統計は、コントロール群とＧＶＨＤ群との間の生存率に有意差があり（^＊＊＊ｐ＜０．００１）、ＧＶＨＤ群とＧＶＨＤ＋高用量Ｍ細胞治療群との間の生存率に有意差があった（^＊＊ｐ＜０．０１）ことを示した（表２８－２、図１７１）。結果は、Ｍ細胞がＧＶＨＤマウスの生存率を改善できることを示した。
（３）１４日目に骨髄を採取し、フローサイトメトリーによりヒト及びマウスのＣＤ４５陽性細胞を検出し、各群の骨髄キメラ率を比較した。マウスの骨髄キメラ率の結果は、ＧＶＨＤ＋高用量Ｍ細胞群の骨髄キメラ率はＧＶＨＤ群よりも有意に低く（^＊ｐ＜０．０５）、Ｍ細胞は骨髄におけるｈＰＢＭＣの浸潤を減少させることでＧＶＨＤを緩和したことを示した（表２８－３、図１７２）。結果は、Ｍ細胞がＧＶＨＤマウスにおいてヒトＣＤ４５陽性細胞の骨髄キメラ率を低下させ得ることを示した。
（４）１４日目に、腸、腎臓、肝臓、及び肺を採取し、パラフィン切片を作製し、ＨＥ染色を行った。結果は、ＧＶＨＤ＋低／高用量Ｍ細胞群の腸陰窩構造はＧＶＨＤ群よりも有意に良好であり、より完全な腸陰窩構造が存在することを示した。ＧＶＨＤ＋低／高用量Ｍ細胞群では、様々な臓器への炎症細胞の浸潤がＧＶＨＤ群よりも有意に低く、Ｍ細胞が炎症を抑制し、組織の完全性を維持する機能を有することを示した（図１７３）。結果は、Ｍ細胞がＧＶＨＤマウスにおいて炎症及び組織損傷を軽減できることを示した。
（５）マウスにおける血清炎症因子の検出結果は、ＧＶＨＤ群と比較して、Ｍ細胞治療群における炎症誘発因子のレベルが有意に低下し、抗炎症因子のレベルが有意に増加したことを示した。Ｍ細胞は炎症を抑える効果を有することが示された。

非特許文献：
１．Functional dosing of mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles for the prevention of acute graft-versus-host-disease.
２．Optimization of the Therapeutic Efficacy of Human Umbilical Cord Blood to Mesenchymal Stromal Cells in an NSG Mouse Xenograft Model of Graft-versus-Host Disease.
３．An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.
４．Highly Sensitive Model for Xenogenic GVHD Using Severe Immunodeficient NOG Mice.

特許文献：
１．免疫抑制が強化された間葉系譜前駆体又は幹細胞（Mesenchymal lineage precursor or stem cells with enhanced immunosuppression）（中国特許出願公開第２０１８８００３６９９７．２号）
２．免疫障害治療のための高効率幹細胞の選択方法（Method for selecting high-efficiency stem cells for the treatment of immune disorders）（中国特許出願公開第２０１７８００７７２８１．２号）
３．急性移植片対宿主病の医薬の製造におけるｈＡＭＳＣの使用（Use of hAMSCs in the manufacture of medicament for the treatment of acute graft-versus-host disease）（中国特許出願公開第２０１８１１１４５８３６．５号）
４．幹細胞の免疫調節効果を調節する方法（Method for regulating immunomodulatory effect of stem cells）（中国特許出願公開第２０１８１１２２７６６４．６号）
５．Ｍ５白血病の治療薬の製造における間葉系幹細胞の使用（Use of mesenchymal stem cells in the manufacture of a drug for the treatment of M5 leukemia）（中国特許出願公開第２０１６１０２０８２０６．２号）
６．幹細胞の免疫調節効果を調節する方法（Method for regulating immunomodulatory effect of stem cells）（中国特許出願公開第２０１３８００７２９９６．０号）
７．免疫抑制剤の製造における組換え間葉系幹細胞の使用（Use of recombinant mesenchymal stem cells in the manufacture of immunosuppressive agent）（中国特許出願公開第２０１４１０１８８４５３．１号）
８．免疫抑制及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療のための調剤及びその調製方法（Preparation for suppressing immunity and treating graft-versus-host disease (GVHD) and preparation method thereof）（中国特許出願公開第２０１１１００４１９２５．７号）

実施例２９：原発性卵巣機能不全に対するＭ細胞の治療活性の評価
原発性卵巣機能不全（ＰＯＩ）とは、４０歳前の女性の卵巣機能の喪失を指す。２０１５年のＥＳＨＥＲガイドラインでは、次のように定義されている：（１）少なくとも４ヶ月間の無月経／稀発月経；（２）２血液ＦＳＨ＞２５Ｕ／Ｌ（モニタリング時間の間隔は少なくとも４週間である）。月経障害（無月経又は稀発月経）、ゴナドトロピンの上昇、及びエストロゲンレベルの低下（ほてり、発汗、顔面紅潮、性欲低下等）を特徴とする。ＰＯＩの発生率は約１％で、発生率は民族間で若干異なる。原発性無月経を有する患者におけるＰＯＩの発生率は１０％～２８％であり、続発性無月経を有する患者におけるＰＯＩの発生率は４％～１８％である。

ＰＯＩの原因としては、遺伝的、免疫的、医原性（放射線療法、化学療法、免疫抑制療法、及び外科的治療等）等が挙げられるが、ＰＯＩの原因は殆ど不明である。ＰＯＩは、副甲状腺機能低下症及び副腎機能低下症を含む、様々な内分泌障害と関連している可能性がある。骨盤手術は、卵巣機能障害を引き起こすこともある。副腎抗体又は卵巣抗体がＰＯＩを有する患者のおよそ４％に存在し、この疾患が自己免疫性であることを示唆している。多くの場合、そのメカニズムは不明である^［１］。ＰＯＩは女性の生殖能力の喪失を引き起こし、骨粗鬆症、脂質代謝障害、及び心血管疾患のリスクを高める可能性がある。生殖期間中の早期の無月経及び生殖能力の喪失は、女性の心理的負担を増大させ、結婚生活の質を低下させ、一連の深刻な心理的及び社会的問題をもたらす。

患者がＰＯＩと診断されると、治療の選択肢は非常に限られている。現在、主な治療の手段としては、主にホルモン補充療法、免疫抑制療法、漢方薬と西洋医学との統合療法、心理療法、卵子提供を受けること、卵巣組織及び卵巣の移植が挙げられる。これらの方法には一定の効果があるが、損傷した卵巣機能を根本的に修復し、患者の生殖能力を回復することはできない。ホルモン補充療法はホルモン欠乏症の臨床症状を和らげる可能性があるが、エストロゲン及びプロゲステロンの長期使用による副作用のため、患者が長期間使用することが困難になる。免疫因子誘発性ＰＯＩを免疫抑制療法で治療することで妊娠が達成されたと報告されているが、免疫抑制療法は重篤な副作用を引き起こす可能性があり、ＰＯＩに対する免疫抑制療法の盲目的適用は臨床診療では推奨されていない。漢方薬の補助療法は、幾つかの臨床症状を改善する可能性がある。卵子提供生殖補助技術は受精の希望を実現するかもしれないが、現在の卵供給源の不足は、ＰＯＩ患者の生殖能力の問題の解決においてその適用を制限している。上記の方法はいずれも、原発性卵巣機能不全を根本的に治療し、ＰＯＩ患者の生殖能力を回復させることはできない。

幹細胞治療の継続的な推進により、今年幾つかの研究グループが動物実験を通じてＰＯＩに対する幹細胞治療の安全性及び有効性を試みてきた。Johnson et al.は、骨髄間葉系幹細胞の腹腔内移植が、損傷された卵巣に直接到達し、顆粒膜細胞のアポトーシスを減少させ、化学療法薬による卵巣損傷を修復し、卵巣機能を改善できることを見出した。Yao Yuanqing教授の研究チームは臍帯間葉系幹細胞（ＵＣＭＳＣ）をＰＯＦマウスに移植したところ、卵巣顆粒膜細胞のアポトーシスが減少し、卵胞数が増加し、卵巣機能が回復し、性ホルモンレベルが上昇したが、臍帯間葉系幹細胞は分化して卵胞を形成することができないことを見出した。上記の研究は、幹細胞が損傷した卵巣組織を修復し、卵巣機能を改善する可能性があることを示唆する。

しかしながら、成人組織由来ＭＳＣの様々な供給源も、単一の組織に由来するＭＳＣの数が限られている；異なる組織源からのＭＳＣの高い不均一性；潜在的な病原体感染リスクのある個体のドナー組織源；ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖する際の急速な老化等、実際の臨床適用において多くの問題を有する。上記の欠点により、組織由来ＭＳＣの調製を標準化することは不可能であり、細胞の品質は保証できない。胚性幹細胞分化誘導システム及び培養方法が徐々に成熟するにつれて、胚性幹細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで安定に分化して間葉系細胞を形成し、それによって胚性幹細胞及び成体組織由来ＭＳＣを直接適用することの欠点を克服し、標準化された調剤及び細胞医薬の基準を満たすことができる。

本発明は、臨床適用におけるＭＳＣの限界を克服し、化学薬物により誘導されるＰＯＩマウスモデルを治療するために、より高い標準化度を有するＭ細胞を使用し、ＰＯＩの臨床治療のためのより安全で効果的な基礎を提供する。

参考文献
［１］Committee opinion no. 605: primary ovarian insufficiency in adolescents and young women [J]. Obstet Gynecol, 2014, 124(1):193 to 197.
［２］Tavassoli M, Crosby WH. Transplantation of marrow to extramedullary sites [J]. Science, 1968, 161(3836):54 to 56.
［３］Johnson J, Bagley J, Skaznik-Wikiel M, et al. Oocyte generation in adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow and peripheral blood [J]. Cell, 2005, 122(2):303 to 315.
［４］Wang S, Yu L, Sun M, et al. The therapeutic potential of umbilical cord mesenchymal stem cells in mice premature ovarian failure [J]. Biomed Res Int, 2013, 2013:690491.
［５］Gibson, J.D., et al., Regeneration of Articular Cartilage by Human ESC-Derived Mesenchymal Progenitors Treated Sequentially with BMP to 2 and Wnt5a. stem cellS Translational Medicine, 2017. 6(1): p. 40 to 50.
［６］Gonzalo to Gil, E., et al., Human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells ameliorate collagen-induced arthritis by inducing host-derived indoleamine 2,3 dioxygenase. Arthritis Res Ther, 2016. 18: p. 77.
［７］Ninagawa, N.T., et al., Transplantated mesenchymal stem cells derived from embryonic stem cells promote muscle regeneration and accelerate functional recovery of injured skeletal muscle. Biores Open Access, 2013. 2(4): p. 295 to 306.
［８］Zhang, Y., et al., Improved cell survival and paracrine capacity of human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells promote therapeutic potential for pulmonary arterial hypertension. Cell Transplant, 2012. 21(10): p. 2225 to 39.
［９］Wang, X., et al., Immune modulatory mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells through a trophoblast to like stage. stem cells, 2016. 34(2): p. 380 to 385

実験動物：ＩＣＲマウス、雌、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を、中国科学院動物学研究所の実験動物においてＳＰＦグレードに保ち、１週間適応飼育した。動物の世話及び使用は、中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物の実験手順は全て、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施された。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温２２±２℃、相対湿度５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアを形成し、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

動物モデルの作製：ＳＰＦグレードの雌ＩＣＲマウス、６週齢を１００匹、Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.から購入した。実験動物の給餌及び取り扱いは、中国科学院動物学研究所の実験動物倫理委員会が公布した関連規則に厳密に従って実施された。実験では、膣スミア法で判定した４日～５日の正常な発情周期を有するマウスを採用した。この実験では、ブスルファン（ＢＵＳ）及びシクロホスファミド（ＣＴＸ）を選択し、併用して化学療法を実施した。マウスに化学療法剤を腹腔内注射により投与し、用量はマウスの体重に応じて１２０ｍｇ／ｋｇ ＣＴＸ＋３０ｍｇ／ｋｇ ＢＵＳであった。実験を３つの群に分けた：（１）正常群：マウスに溶剤ＤＭＳＯを腹腔内注射した、Ｎ＝３５マウス；（２）モデル群：化学療法薬治療後、０．１Ｍ ＤＰＢＳを尾静脈に注入した、Ｎ＝３５マウス；（３）Ｍ細胞群：化学療法薬治療後、各マウスに１００μＬの０．１Ｍ ＤＰＢＳ細胞懸濁液（１×１０^６個のＭ細胞を含む）を、尾静脈を介して注入した、Ｎ＝３５マウス。

体重及び卵巣重量の測定：
体重及び卵巣重量を、分析バランス法を用いて測定した。

卵胞の計数
Ｍ細胞治療後１０日目に卵巣を収集し、卵胞の数を数えた。新鮮な卵巣標本を４％のパラホルムアルデヒド（Sigma、Ｐ６１４８）で少なくとも１２時間固定した。脱水及びパラフィン包埋の後、厚さ５μｍの連続切片を作製し、５切片に１回接着を実施した。更なる組織学的検査のため、通例のヘマトキシリン（Solarbio、Ｇ１０８０－１００）及びエオシン（ZSGB-BIO、ＺＬＩ－９６１３）（Ｈ＆Ｅ）染色を実施した。原始卵胞、一次卵胞、二次卵胞、及び洞卵胞（sinus follicles）を分類し、数えた。卵胞の二重カウントを避けるため、卵母細胞を有する卵胞のみを更なる分析のため含めた。

細胞トレーシング
細胞追跡研究では、フローサイトメトリー、動物イメージング、及びＧＦＰシグナル検出の方法を用いた。ｈｕｍｓｃ移植後１時間、４時間、２４時間及び４８時間で、各マウスの内皮細胞から静脈血を収集するためにフローサイトメトリーを使用した。全血赤血球溶解物とともに室温で３０分間インキュベーションした後、細胞懸濁液をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。ＧＦＰシグナルを検出するため、細胞移植後７日目にマウスを屠殺した。卵巣標本を上記のようにパラフィン包埋し、切片を作製した。切片作製後、蛍光顕微鏡でＧＦＰシグナルを観察した。

Ｅ２及びＦＳＨの検出
マウスの発情期に内皮細胞から静脈血を収集した。血液試料を室温で６０分間静置した。凝固後、４０００ｒｐｍ／分の遠心分離を４℃で１５分間行った。上清を収集し、Beijing Northern Institute of Biotechnology（中国、北京）に送り、血清ＦＳＨ及びＥ２を決定した。

ＲＮＡ抽出及びＲＴ－ＰＣＲ同定
ＲＮＡ抽出は、InvitrogenのＴＲＩＺＯＬをドラフト内で用いて行った。

試料組織を電動粉砕棒で粉砕し、１．５ｍｌのＲＮＡフリーチューブに移し、１ｍｌのＴＲＩＺＯＬを加えて細胞を溶解し、溶解物を収集して１．５ｍｌのＲＮＡフリーＥＰチューブに加えた。インキュベーションを４℃で１５分間行い、各チューブに５００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックス及び振盪によって混合し、氷上に１０分間静置した。遠心分離を４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間行った。分離された液層の上層を１ｍｌのピペットで収集し、新しい１．５ｍｌ ＲＮＡフリーＥＰチューブに移し、移した上層と等量のイソプロパノールを加え、ボルテックス及び振盪することによって混合し、氷上に１０分間置いた。遠心分離を４℃、１２０００ｒｐｍ／１０分で行った。上清を廃棄し、ペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、４℃、１２０００ｒｐｍ／１０分で遠心分離した。上清を廃棄し、ＲＮＡをドラフト内で５分～１０分間乾燥させ、乾燥時間が長すぎないようにする。これは、乾燥時間が長すぎた場合は、ＲＮＡの溶解度が低下し、ＲＮＡの品質が低下するためである。ＲＮＡフリー水を加え、金属浴で５５℃にて１０分間加熱した。ＲＮＡ濃度及びＯＤ値をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。

ｍＲＮＡの逆転写
（１）逆転写により抽出したＲＮＡ２μｇ、オリゴ（ｄＴ）プライマー１μｌ、ｄＮＴＰ混合物１μｌにＲＮＡフリー水を添加して１０μｌとした。変性を６５℃で５分間、インキュベーションを４℃で３分間行った。
（２）上記の１０μｌ系に更に、以下の試薬を反応のため加え、系の合計は２０μｌであった。
（３）穏やかに混合した後、４２℃で６０分間反応を行い、そして７０℃で１５分間反応を行った。

リアルタイムＰＣＲ
逆転写したｃＤＮＡを５倍に希釈し、ＲＴ－ＰＣＲを実施した。

結果：
１．モデリング後、マウスにおいてホルモンレベルは有意に変化し、ＦＳＨレベルが上昇し、Ｅ２レベルが低下し、体重及び卵巣重量が有意に減少し、早発卵巣不全の病理学的特徴を示した。結果を図１７４に示した。Ｍ細胞治療により、早発卵巣不全を有するマウスにおいてホルモンレベルが有意に改善され、それらのマウスの体重及び卵巣重量も有意に増加した。さらに、早発卵巣不全を有するマウスの排卵レベルも、Ｍ細胞注射治療後に有意に回復した。

２．蛍光標識されたＭ細胞をマウスの卵巣に注射し、３週間経っても細胞を検出できたことから、Ｍ細胞はマウスにおいて生存することができ、ＰＯＦの治療に理想的なシード細胞であることを示した。

３．卵胞顆粒膜細胞におけるｂｃＬ－２遺伝子ｍＲＮＡ発現の変化を検出することにより、顆粒膜細胞のアポトーシスを決定した。結果は、Ｍ細胞治療群において、顆粒膜細胞におけるｂｃＬ－２遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルが増し、アポトーシスを低下させることを示した。これは、Ｍ細胞が卵巣機能を再構築し、顆粒膜細胞のアポトーシスを減少させ得ることを示した。

４．正常な雄マウスと交配することにより、２つの群間で子孫を産生する能力を比較したところ、Ｍ細胞治療群で産生される子孫の総数は、コントロール群よりも有意に多いことがわかった。

５．卵巣の切片作製及び染色により、Ｍ細胞治療群のマウスの卵巣構造が正常群のマウスに近いことがわかった。

６．卵胞を数えることにより、Ｍ細胞で治療したマウスでは、コントロール群よりも卵胞の数が有意に多いことがわかった。結果を図１７５に示した。

結論として、Ｍ細胞移植治療は早発卵巣不全の症状を改善し、排卵レベルも有意に回復する可能性があり、卵巣機能を再構築し、顆粒膜細胞のアポトーシスを低下させる可能性がある。これは、Ｍ細胞治療が早発卵巣不全の症状を非常にうまく治療できることを示した。

実施例３０：Ｍ細胞の腎線維症に対する治療活性の評価
腎線維症は病態生理学的変化であり、腎臓の機能が健康な状態から損なわれた状態、次いで損傷した状態へと変化し、最終的に機能が失われる段階的なプロセスである。外傷、感染、炎症、血液循環障害、及び免疫応答等の様々な病原因子の刺激により、腎臓の内在細胞が損傷し、発症後期に大量のコラーゲン沈着及び蓄積が起こり、腎臓がその臓器機能を完全に失うまで腎臓実質が徐々に硬化して瘢痕を形成する。この実施例では、腎線維症の治療がＭ細胞の移植によって達成された。

非特許文献：
１．Serum-free medium Enhances the Immunosuppressive and Antifibrotic Abilities of Mesenchymal stem cells Utilized in Experimental Renal Fibrosis
２．Mesenchymal stem cells Deliver Exogenous MicroRNA-let7c via Exosomes to Attenuate Renal Fibrosis
３．Rat Mesenchymal Stromal Cell Sheets Suppress Renal Fibrosis via Microvascular Protection
４．Mesenchymal stem cells attenuate renal fibrosis through immune modulation and remodeling properties in a rat remnant kidney model

特許文献：
１．ヒト臍帯ＭＳＣエクソソームの新規抗腎線維症生物学的調剤及びその調製方法（Novel anti-renal fibrosis biological preparation of human umbilical cord MSC exosomes and preparation method thereof）（中国特許出願公開第２０１９１０３８９３４１．５号）
２．ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の抗炎症能を高める遺伝子及びその使用（Gene enhancing anti-inflammatory ability of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and uses thereof）（中国特許出願公開第２０１８１０２７７７６０．５号）
３．特許の名称：腎疾患及び眼底疾患におけるヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の使用（Use of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in kidney and fundus diseases）（中国特許出願公開第２００９１０２０９３２１．１号）

実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、雄、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

動物モデリング：マウスを１０％抱水クロラール溶液の腹腔内注射で麻酔した後、固定し、下腹部中央部を１．５ｃｍ切開した。左尿管を解離し、結紮し、切り取って、左腎を完全に閉塞させた。手術後、各マウスをペニシリン注射で３日間処置した。マウスをシャム手術群、手術＋溶剤群、及び手術＋試験物質群に分け、各群に４匹のマウスを用いた。
シャム手術群：左尿管のみを解離させ、結紮及び切断を行わなかった。
溶剤群：１００μｌの生理食塩水を注射した。
Ｍ細胞群：３×１０^６個のＭ細胞（Ｐ５世代）を含む生理食塩水１００μｌを注射した。

手術当日に治療を実施し、１３日目にマウスを代謝ケージに入れ、１４日目に尿、血液、及び試料を収集した。

試料収集：
移植後１３日目に、各群のマウスを代謝ケージに入れ、２４時間尿を収集し、尾静脈から採血して血清を分離した。

移植後１４日目に、各群のマウスを屠殺し、腎臓をすぐに摘除した。組織の半分を固定して脱水し、次いでＨＥ染色及びマッソン染色のため５μｍのパラフィン切片にし、残りの半分の組織を液体窒素で急速に凍結し、α－ＳＭＡ及びＣＤ３１の免疫組織化学染色に供し、観察して腎臓の構造の病理学的変化及び線維症を特定した。

マウスの体重測定：
マウスの体重を、移植当日（１日目）と移植後５日目、８日目及び１４日目にそれぞれ測定した。結果を図１７６に示した。

組織パラフィン切片作製の手順：
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

マッソン染色：
（１）パラフィン切片を水に脱蝋する：切片をキシレンＩに２０分間、キシレンＩＩに２０分間、無水エタノールＩに１０分間、無水エタノールＩＩに１０分間、９５％アルコールに５分間、９０％アルコールに５分間、８０％アルコールに５分間、７０％アルコールに５分間順次入れ、蒸留水で洗浄した。
（２）核のヘマトキシリン染色：マッソン染色キットでワイゲルト鉄ヘマトキシリンを用いて５分間染色を行い、水道水で洗浄した後、１％塩酸アルコールで数秒間分別を行い、水道水ですすぎを行い、流水で数分間すすぐことによって色出しした。
（３）ポンソーレッド染色：マッソン染色キットのポンソーレッド・酸フクシン溶液で５分～１０分間染色を行い、蒸留水によるすすぎを迅速に行った。
（４）リンモリブデン酸処理：マッソン染色キットのリンモリブデン酸水溶液による処理を約３分～５分間行った。
（５）アニリンブルー染色：水で洗浄する代わりに、マッソン染色キットのアニリンブルー溶液で５分間対比染色を行った。
（６）分別：１％の氷酢酸による処理を１分間行った。
（７）脱水及び封入：切片を９５％アルコールＩに５分間、９５％アルコールＩＩに５分間、無水エタノールＩに５分間、無水エタノールＩＩに５分間、キシレンＩに５分間、キシレンＩＩに５分間に順次入れて脱水及び透明化を行い、次いで切片をキシレンから取り出し、わずかに風乾させ、中性樹脂で封入した。
（８）顕微鏡で顕微鏡検査を行い、画像を取得して分析した。

生化学検査：
２４時間の尿タンパク質、血清クレアチニン、及び血中尿素窒素濃度をＣｈｅｍｒａｙ ２４０自動生化学分析装置で検出した。結果を図１７７～図１８３に示した。

表３０－１及び図１７６は、１日目、５日目、８日目、１２日目、及び１４日目の腎線維症モデルの各群のマウスの体重値の統計結果を示し、各時点でのシャム手術群の体重は、手術＋溶剤群よりも有意に高く（Ｐ＜０．０５）、１２日目及び１４日目の手術＋Ｍ細胞治療群の体重値は、手術＋溶剤群よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）が、１２日目及び１４日目のシャム手術群と手術＋Ｍ細胞治療群との間の体重に有意差はなかった。以上の結果は、Ｍ細胞治療が腎線維症マウスの体重に対して有意な促進効果を有することを示した。

表３０－２及び図１７７は、腎線維症モデルの各群におけるマウスの尿中微量アルブミンの統計結果を示し、手術＋溶剤群の尿中微量アルブミン値がシャム手術群よりも有意に高く（^＊、Ｐ＜０．０５）、モデルの構築に成功したことを示した。シャム手術群と比較して、Ｍ細胞治療群の尿中微量アルブミン含有量には有意差はなかったが、溶剤群よりも有意に低く（^＃、Ｐ＜０．０５）、Ｍ細胞が腎線維症に対して一定の治療効果を有することを示した。

表３０－３及び図１７８は、１４日目の腎線維症モデルの各群におけるマウスの尿クレアチニン含有量の統計結果を示し、手術＋溶剤群の尿クレアチニン値がシャム手術群よりも有意に高く（^＊、Ｐ＜０．０５）、モデルが正常に構築されたことを示した。シャム手術群と比較して、Ｍ細胞治療群における尿クレアチニン含有量には有意差はなかったが、溶剤群よりも有意に低く（^＃、Ｐ＜０．０５）、Ｍ細胞が腎線維症に対して一定の治療効果を有することを示した。

表３０－３及び図１７９は、腎線維症モデルの各群におけるマウスの尿素含有量の統計結果を示し、手術＋溶剤群の尿素値がシャム手術群よりも有意に高く（^＊＊、Ｐ＜０．０１）、モデルの構築に成功したことを示した。シャム手術群と比較して、Ｍ細胞治療群の尿素含有量は有意に高く（^＊、Ｐ＜０．０５）、溶剤群よりも低かったが、有意差はなく、Ｍ細胞が腎線維症に対して一定の治療傾向を有することを示した。

表３０－３及び図１８０は、腎線維症モデルの各群におけるマウスの尿酸含有量の統計結果を示し、手術＋溶剤群における尿酸値がシャム手術群よりも有意に高く（^＊、Ｐ＜０．０５）、モデルの構築に成功したことを示した。Ｍ細胞治療群における尿酸含有量は、溶剤群よりも有意に低く（^＃、Ｐ＜０．０５）、Ｍ細胞が腎線維症に対して一定の治療効果を有することを示した。

図１８１は、１４日目に腎線維症モデルの各群のマウスをサンプリングし、腎臓を包埋して切片を作製し、続いてＨＥ染色を行った結果を示し、Ｇ１がシャム手術群、Ｇ２が手術＋溶剤群、及びＧ３が手術＋Ｍ細胞群であった。左腎は手術を行った腎臓であり、右腎は手術をせずにコントロールとして使用した。図からわかるように、Ｇ２群のマウスの腎臓の基本構造が消失し、多数の線維芽細胞が増殖し、Ｇ３群のマウスの腎臓構造が改善され、尿細管萎縮が緩和され、炎症因子の浸潤及び線維芽細胞の増殖が減少し、壊死領域が或る程度減少した。

図１８２は、１４日目に腎線維症モデルの各群のマウスをサンプリングし、腎臓を包埋して切片を作製し、続いてマッソン染色を行った結果を示し、Ｇ１がシャム手術群、Ｇ２が手術＋溶剤群、及びＧ３が手術＋Ｍ細胞群であった。左腎は手術を行った腎臓であり、右腎は手術をせずにコントロールとして使用した。図からわかるように、Ｇ１群の腎臓組織には明らかなコラーゲン沈着はなく、Ｇ２群では青く染色されたシート状の陽性領域があり、殆どが腎尿細管の周りに分布しており、腎臓間質に多数のコラーゲン線維が沈着していたことを示し、Ｇ３群のマウスの腎臓組織の青い領域は有意に減少し、色は明るくなった。上記の結果は、Ｍ細胞がマウス腎線維症モデルにおいて阻害的な役割を果たし、腎構造を改善し、コラーゲン沈着が減少し、腎線維症の進行が遅れたことを示した。

図１８３は、１４日目に腎線維症モデルの各群のマウスをサンプリングし、α－ＳＭＡ及びＣＤ３１について腎臓を免疫組織化学染色に供した結果を示し、Ｇ１はシャム手術群、Ｇ２は手術＋溶剤群、及びＧ３は手術＋Ｍ細胞群であった。左腎は手術を行った腎臓であり、右腎は手術をせずにコントロールとして使用した。上皮間葉転換（ＥｎｄｏＭＴ）は、損傷された腎臓における筋線維芽細胞の生成に重要なメカニズムである。ＥｎｄｏＭＴとは、内皮細胞が固定接続と極性機能を失い、次いで高侵襲で移動性の細い紡錘状の間葉系細胞に変わり、内皮細胞が、形態及び極性、並びに生化学的特性が変化し、それらの特徴的なマーカーＣＤ３１等を失う一方で、間葉系幹細胞マーカーであるα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）を取り戻し、生存可能な間葉系細胞に変換するプロセスを指す。図からわかるように、Ｇ１群の左腎と比較して、Ｇ２群の腎臓組織におけるα－ＳＭＡの発現は１４日目に増加し、ＣＤ３１の発現は有意に変化せず、モデルの構築に成功したことを示し、マウスは腎線維症表現型を示したことがわかった。１４日目には、Ｇ３群の左腎におけるα－ＳＭＡの発現はＧ２群よりも低く、ＣＤ３１の発現は高かった。上記の結果は、Ｍ細胞治療は腎線維症を緩和する傾向があり、ＥｎｄｏＭＴを減少させることで腎線維症のプロセスを阻害できることを示した。

各群のマウスの腎臓組織におけるＴＧＦ－β１及び間葉系転換指標をウェスタンブロット法により検出した（HU Yu to yan, et. Al., 2020, Journal of Jiangsu University (Medicine Edition)）。

実験結果：ウェスタンブロッティングの結果は、手術＋溶剤群におけるＴＧＦ－β１及びビメンチンの発現がシャム手術群の発現よりも高かったが、Ｅ－カドヘリンの発現が下方調節され、手術＋Ｍ細胞群におけるＴＧＦ－β１及びビメンチンの発現が減少し、Ｅ－カドヘリン含有量がアップレートされたことを示した。結果は、Ｍ細胞は腎臓間質におけるＴＧＦ－β１等の線維化促進因子の発現を阻害し、間質転換を逆転させて腎臓を保護できることを示した。Ｍ細胞は、腎線維症、並びに糸球体疾患、尿管閉塞及び腎不全等の関連疾患に対して治療効果を有し得る。

実施例３１：パーキンソン病に対するＭ細胞の治療活性の評価
「振戦麻痺」としても知られるパーキンソン病（ＰＤ）は、高齢者によく見られる神経変性疾患であり、中高年で最も一般的な錐体外路疾患である。この疾患は、安静時振戦、動作緩慢、筋強直症及び姿勢平衡障害を含む特徴的な運動症状と並んで、便秘、嗅覚障害、睡眠障害、自律神経機能障害、並びに精神障害、認知及び認知障害を含む非運動症状を有する。６５歳超の中国人のうち、１０万人当たり１７００人のＰＤ患者がいる。遺伝的要因、環境要因（産業毒素又は農業毒素への長期曝露）、及び年齢は、ＰＤの発症と密接に関係している。ＰＤの治療は主に薬物療法であり、これまでに第３世代まで発展してきた。第１世代の抗コリン薬としては、抗コリン薬（トリヘキシフェニジル、ベンザトロピン、プロサイクリジン、ビペリデン、スコポラミン）が挙げられ、第２世代はレボドパであり、第３世代はドーパミン受容体アゴニスト及びエンハンサー（ベンセラジド）である。薬物療法は５年以内に症状を効果的に改善し、生活の質を改善することができるが、現在、薬物の副作用及び関連する合併症に対する解決策はない。外科的治療は、運動症状、特に四肢の振戦及び筋肉の硬直を顕著に改善できるが、運動以外の症状には大きな効果はない。手術ではこの疾患を治すことができず、手術後も治療が必要である。加えて、リハビリトレーニング、栄養サポート、及び心理的サポートを含む幾つかの治療法がある。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を回収、消化、及び継代し、Ｐ５世代をその後の実験に使用した。

実験動物：Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雄ラット、６週齢～８週齢、Beijing Sibeifu Biotechnology Co., Ltd.から購入。全ての動物を、中国科学院動物学研究所の実験動物センターのＳＰＦグレードで飼育した。動物の世話及び使用は、中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物の実験手順は全て、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施された。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温２２±２℃、相対湿度５０％～６０％であった。実験を、ラットの適応給餌の１週間後に開始した。

実験群：正常コントロール群、ＰＤ＋溶剤（溶剤群）、ＰＤ＋Ｍ細胞（Ｍ細胞群）。

実験材料：手術機器、５－０外科用縫合糸、ラット体重計。

実験試薬：６－ヒドロキシドーパミン、生理食塩水、Ｌ－アスコルビン酸、塩酸アポモルヒネ、イソフルラン、ヨードホール。

装置：Ｒ５４０増強型小動物麻酔装置、脳定位計測器、マイクロインジェクションポンプ

実験工程：麻酔機のスケールを３．５に調整し、ラットを麻酔して麻酔状態に維持し、ラットは腹臥位にあり、ラット頭部の皮膚をヨードホールに浸した綿棒で拭き、１ｃｍ～１．５ｃｍの切開を行い、綿棒で髄膜を除去した後、ラットの頭部を脳定位計測器で固定し、線条体に２．５ｍｇ／ｍｌの６－ヒドロキシドーパミンを注射し、以下の通り位置を決めた：正中線の左に＋２ｍｍ、ブレグマの後ろに－２．５ｍｍ、頭蓋骨の下に－８．５ｍｍ、注入量４μｌ、毎分１μｌ、注射後、針を５分間保持してから引き抜き、皮膚を縫合した。

細胞注射：線条体で６点での注射を実施し、位置決め点は次の通りであった：注射座標１（正中線の左＋３ｍｍ、前部ブレグマの前に＋１ｍｍ、頭蓋骨下－５．０ｍｍ及び－４．５ｍｍ）；注射座標２（正中線の左に＋３．７ｍｍ、前部ブレグマの前に＋０．１ｍｍ、頭蓋骨下－５．０ｍｍ及び－４．５ｍｍ）；注射座標３（正中線から左に＋４．５ｍｍ、前部ブレグマの前に＋１．２ｍｍ、頭蓋骨下－５．０ｍｍ及び－４．５ｍｍ）。ＰＤ＋溶剤群に生理食塩水を注射し、ＰＤ＋Ｍ細胞群にＭ細胞を注射した：１部位当たり１×１０^５／１μｌ、６部位の合計細胞数は６×１０^５個であった。

回転実験：手術後３週間及び７週間で、アポモルヒネ（０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１％アスコルビン酸）を腹腔内注射し、１０分後にラットの回転数を記録し、記録時間は３５分であった。

結果の分析：アポモルヒネを用いたパーキンソン病ラットの回転誘導は、片側性黒質線条体病変を検査する古典的な方法である。ドーパミンニューロン損傷の重症度は、ラットの回転数を３５分間にわたって記録することによって測定した。

図１８４において、Ｍ細胞群のラットの回転数は溶剤群よりも有意に少なく（２４０．５対３６０．５）、黒線条体病変を有するパーキンソン病ラットでは、Ｍ細胞がドーパミン作動性除神経を減少させ、パーキンソン病の症状を改善できることを示した。

シリンダー試験及び脳神経細胞切片の染色法は、公開された文献Kriks et al., Nature, 2011を参照した。

シリンダー試験の結果は、動物が移植を受けた後、両側前肢の壁接触頻度は同じになる傾向を示し、これは５０％近くであり、細胞移植により四肢の硬直が改善され、パーキンソン病の動物（被験体）において運動能力が向上し得ることを示した。

脳切片の染色結果は、コントロール群と比較して、実験群の線条体におけるドーパミン作動性ニューロンの数が増加し、ニューロンの長さと複雑さが増し、グリア細胞とミクログリアの数が減少し、Ｍ細胞移植がニューロンを保護し、ニューロンの損傷及び死を減らすことができ、ニューロンに栄養を与えてシナプス再生を促進し、脳の炎症を軽減し、微小環境を改善する効果を有することを示した。

実施例３２：鬱病に対するＭ細胞の治療活性の評価
鬱病は現在、人々の健康に大きな脅威となる疾患になっている。鬱病の主な臨床症状は次の通りである：（１）主に持続的な気分の低下、抑鬱、及び悲観論を指す抑鬱気分；（２）思考が遅く、反応が遅い；（３）随意活動の低下及び行動の遅さ；（４）認知障害の発生；（５）睡眠障害及び食欲減退。現在、鬱病の治療は薬物療法と認知行動療法との併用が主流であるが、この治療は鬱病の治療には適しておらず、薬剤耐性及び薬物療法の観点でもまだ大きな問題がある。

科学者たちはまた、鬱病の原因について多くの研究を行ってきた。現在、最も重要なのは炎症性免疫仮説であり、主な内容は、身体の免疫系が鬱病に関連する役割を果たす可能性があるということである。また、多くの研究によると、中枢性炎症性免疫は鬱病の重要な要素である。

幹細胞は免疫調節作用を有する。そのため、科学者は鬱病を治療するために幹細胞を使用することを望んでいる。現在、幹細胞治療の出現により、科学者らは鬱病に対する新たな幹細胞療法の開発を望んでいる。

しかしながら、成人組織由来ＭＳＣの臨床適用には、主に以下の欠点がある：（１）単一個体の組織からは治療量の成体組織由来のＭＳＣを殆ど得ることができない；（２）成人組織由来ＭＳＣは異なる個体の組織に由来するため、製品品質の高い一貫性を達成することは殆どできない；（３）同じ個体の組織に由来するＭＳＣでさえ非常に不均一である；（４）成人組織由来ＭＳＣのドナー組織源は複雑であり、潜在的な感染性病原体感染リスクがある；（５）成人組織由来ＭＳＣの急速な老化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大に伴って起こる。したがって、鬱病の治療には新たなＭＳＣ細胞源が必要とされている。

実験動物：
ＣＤ－１マウス、雄、６週齢～８週齢。動物をBeijing Weitong Lihua Companyから購入した。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：
胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代をその後の動物実験に使用した。

動物の群分け：

側脳室内投与：
細胞移植を、脳立体ポジショナーを用いて側脳室で実施し、座標は以下の通りであった：ＡＰ、－０．６ｍｍ；ＭＬ、１．２ｍｍ；ＤＶ、－１．８ｍｍ。試験薬群の各動物に、５μＬの１×１０^５／μＬのＭ細胞懸濁液を注射し、合計で５×１０^５個の細胞を注射した。注射速度は１μＬ／分で、注射後８分間針を所定の位置に保ち、針を２分間ゆっくりと引き抜き、創傷を縫合した。移植前、細胞沈降による個体差を避けるため、細胞をできる限り一定時間シリンジに保持した。コントロール群には生理食塩水を脳室に与え、投与プロセスは試験薬群と同じであった。

マウスの強制水泳試験：
側脳室内投与の１週間後、マウスを強制水泳検査に供した。マウスを高さ２８．５ｃｍ及び直径１１ｃｍの円筒形の透明なプレキシガラスタンクに入れ、タンクごとに１匹のマウスを入れた。水槽内の水深は１５ｃｍ、水温は（２４±１）℃であった。試験中、マウスはタンク内で５分間泳ぎ、４分以内のマウスの累積不動時間を記録した。不動の時間は、マウスがもがき反応をやめ、水に浮かんでいるように見えたことを意味した。

統計分析：
Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡ及びｔ検定を分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

この試験の目的は、強制水泳試験において、雄ＣＤ－１マウスの不動時間又は行動的絶望に対するＭ細胞の影響を評価することであった。この試験では、強制水泳を用いてマウス鬱病モデルを誘導し、生理食塩水又はＭ細胞をあらかじめ投与し、強制水泳試験における各群のマウスの不動時間を観察し、単回投与の７日後に記録した。実験結果は、生理食塩水群と比較して、Ｍ細胞注射群のマウスの体重がより速く増加することを示し（表３２－１、図１８５）、強制水泳試験における不動時間が有意に短縮された（表３２－２、図１８６）。結論として、Ｍ細胞は強制水泳試験においてマウスの抑鬱行動に治療効果を示した。

Ｍ細胞の神経原性可能性（nurogenic potential）の評価
リアルタイムＰＣＲを用いて、Ｍ細胞におけるＢＤＮＦ、ＦＧＦ－２及びＩＧＦ－１のｍＲＮＡ発現を評価し、これらの細胞が神経新生を支援する可能性を分析した。ラット新皮質細胞培養におけるニューロスフェアの発達を支援するＭ細胞分泌因子の可能性を評価するためのバイオアッセイを構築した。Ｍ細胞を馴化培養培地（無血清高グルコースＤＭＥＭ）で２４時間インキュベートした。採取した馴化培養培地を、１％Ｂ２７サプリメントを添加した０．２μｍ滅菌フィルターで濾過し、２４ウェルプレートでラット新皮質細胞（１０^４／ウェル）を培養するために使用した。新たに屠殺されたナイーブＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットから得られた皮質細胞及び０．２５％トリプシン（Biological Industries）の存在下で、３７℃で１０分間インキュベーションを実施し、ラット新皮質細胞の懸濁液を得た。５日間のインキュベーション後、Ｍ細胞馴化培養培地で成長させたラット新皮質細胞の培養中に形成されるニューロスフェアの数を決定し、顕微鏡下で計数した。ネスチン、神経膠原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、及びダブルコルチンを用いた免疫染色を実施して、ニューロスフェア細胞がニューロン及びグリア細胞に分化したかどうかを更に分析した。

実験結果
実験結果は、増殖した未分化Ｍ細胞が様々な神経栄養因子（ＩＧＦ－１、ＢＤＮＦ、及びＦＧＦ－２を含む）の異なるｍＲＮＡレベルを発現し、Ｍ細胞によって分泌される因子が神経新生のパラクリンに促進作用を有し、ＤＭＥＭで構成されるＭ細胞馴化培養培地が、新生児ラット皮質細胞培養において神経前駆細胞由来のニューロスフェアの成長及び発達を支援し得ることを示した。

支配的従順関係（ＤＳＲ：Dominant-submissive relationship）パラダイム
ＤＳＲパラダイムでは、単一の装置を使用し、装置には２つのチャンバーがトンネルで接続され、トンネルの中点にラクトースフィーダーがあった。３０匹のＦＳＬラットを無作為にペアリングした。各ペアでは、動物をＤＳＲ装置の対向するチャンバーに置き、３０秒間の順応後に５分間ミルクを求めて競争させた。この試験を、Ｍ細胞移植前の１０日間毎日繰り返した。各試験では、各動物のミルキング（milking）時間を測定した。各ペアでは、Ｍ細胞をより短いミルキング時間で動物の側脳室に注射し、反対側の動物にはビヒクルを注射した。手術後１０日目に、同じ動物ペアをＤＳＲパラダイムで再度試験し、試験を７日間続けた。

実験結果
ＤＳＲパラダイムでは、ＦＳＬラットペアは有意な支配的従順関係を示すことができなかった。各ペアでは、スコアが低い動物に１０^５個のＭ細胞を注射し、ペアになった動物にビヒクルを注射した。注射後１７日目に、Ｍ細胞注射動物に有利な有意な関係が確立された。

組織サンプリング及び免疫蛍光検査
ＦＳＬラットを麻酔し、１０Ｕ／ｍＬのヘパリンで心内灌流し、続いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、最後に０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド（Sigma）を添加した。脳を取り出し、一晩固定し、リン酸塩緩衝３０％スクロースで平衡にした。免疫蛍光試験に先立って、厚さ２０μｍ～４０μｍの自由浮遊冠状海馬切片をクライオスタットで作製し、０．１％のアジ化ナトリウム（Sigma）に４℃で保存した。凍結組織切片及び培養細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Sigma）で５分間インキュベートした後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び５％ウシ血清アルブミン）で４５分間ブロックした。次いで、試料を次の一次抗体：ウサギポリクローナル抗ＢＤＮＦ（６．６ｎｇ／ｍＬ）、マウスモノクローナル抗ＰＣＮＡ（１．４μｇ／ｍＬ）、マウスモノクローナル抗ネスチン（５６μｇ／ｍＬ）、ウサギポリクローナル抗ＤＣＸ（１μｇ／ｍＬ）及びウサギポリクローナル抗ＧＦＡＰ（１：１００希釈）と室温で１時間インキュベートし、続いて、適切な二次抗体（フルオレセインイソチオシアネートヤギ抗ウサギ及びヤギ抗マウス）を用いて、室温にて１：１００希釈で１時間インキュベーションを行った。インキュベーションの合間に、試料をＰＢＳで３回洗浄した。試料のアッセイ結果は、蛍光顕微鏡（ＴＥ２０００－Ｕ、Nicon、日本国東京）を用いて可視化した。

実験結果
免疫染色結果は、対側海馬又はコントロールを注射した動物と比較して、同側海馬（放射状層）にＰＣＮＡ陽性核が多く存在することを示した。治療の２週間後に歯状回にＰＣＮＡ陽性核は観察されなかったが、対側歯状回及びコントロール動物と比較して、同側歯状回の顆粒膜細胞層にＤＣＸ発現細胞の増加が観察された。同様に、歯状回の顆粒下領域ではＢＤＮＦ発現細胞の増加が観察され、歯状回ではＧＦＡＰ発現細胞の増加が観察された。幾つかの移植されたＭ細胞は神経マーカーＤＣＸ及びＧＦＡＰを発現することもわかったが、移植されたＤｉＩ標識細胞の大部分はかかる発現を示さなかったことに注意することが重要であった。

関連文献：
１．Adipose-derived mesenchymal stem cells protect against CMS-induced depression-like behaviors in mice via regulating the Nrf2/HO-1 and TLR4/NF-κB signaling pathways.

実施例３３：アトピー性皮膚炎に対するＭ細胞の治療活性の評価
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、慢性、再発性、掻痒性及び炎症性の皮膚疾患である。ＡＤは公衆衛生上の重要な問題となっており、小児では最大２０％、成人では３％～１０％の有病率となっている。ＡＤの病因は複雑で、遺伝学、免疫、及び環境因子等の多くの要因が関与しており、その中で免疫機能の異常、特に免疫細胞の免疫応答作用がＡＤの病因に重要な役割を果たしている。

現在、ＡＤの治療は通常、グルココルチコイド及び免疫抑制剤の局所的及び／又は全身的な使用を含むが、中等度から重度のＡＤ患者ではグルココルチコイドの局所使用が制限されており、免疫調剤の全身使用には骨髄抑制、及び感染機会とその他のリスクの増加があり、抗インターロイキン（ＩＬ）－４Ｒモノクローナル抗体デュピルマブ及び抗免疫グロブリンＩｇＥモノクローナル抗体オマリズマブ等の新たな生物製剤は研究結果に限りがあり、有意な差がある。したがって、ＡＤの治療のための新たな安全で効果的な方法を開発する必要がある。本発明は、Ｍ細胞を皮下移植することにより皮膚炎を治療する。

文献：
Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells alleviate atopic dermatitis via regulation of B lymphocyte maturation.
Enhanced therapeutic effects of human mesenchymal stem cells transduced with superoxide dismutase 3 in a murine atopic dermatitis to like skin inflammation model.
Priming with Toll-like receptor 3 agonist or interferon to gamma enhances the therapeutic effects of human mesenchymal stem cells in a murine model of atopic dermatitis.

実験動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雌、雄、７週齢～８週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

動物モデル：ＢＡＬＢ／ｃマウスの体重を計量し、体重に応じて無作為に群分けした。ＢＡＬＢ／ｃマウスをガス麻酔機で麻酔した後、背毛を剃り、各群６匹のマウスでマウスを群分けした。

群分け：
正常群：剃毛を行ったのみで、他の治療は行わなかった。
ＯＶＡ群：ＯＶＡ＋水酸化アルミニウムを背中の３点に注射した（１点当たり５０μｌの生理食塩水）。
Ｍ細胞群：ＯＶＡ＋水酸化アルミニウムを背面の３点に注入した、（１点当たり、１×１０^６個のＭ細胞（Ｐ５世代）を含有する、５０μｌの生理食塩水）。

上記の治療を０日目として記録し、３日目と７日目にそれぞれＯＶＡ＋水酸化アルミニウムを注射し、７日目から１４日目まで毎日１００μｇのＯＶＡのみを注射した。１４日目と１７日目に、生理食塩水又はＭ細胞をそれぞれ注射した。

臨床症状及び重症度スコア：１４日目と１７日目に、皮膚病変の重症度スコア及び臨床症状を記録するために写真を撮影した。結果を図１８７に示した。

Ｍ細胞の皮下注射は、皮膚表皮過形成の程度を低下させ、アレルギー性炎症反応を低下させ、毛包再生を促進し、皮膚炎マウスの症状を和らげ、皮膚炎において効果的な治療的役割を果たし得ることがわかった。

（２）行動研究
マウスにおいて、皮膚炎の患部に触れたり引っ掻いたりする頻度を観察した。

実験結果：Ｍ細胞群の引っ掻き頻度はモデル群よりも有意に低いことがわかり、このことは治療群ではマウスの痒みの程度が減少することを示した。

（３）病理組織学的解析：
１）標本収集：
標本を収集する際、マウスは腹腔内麻酔後に仰臥位にあり、マウスの腹部の中央で皮膚を切って胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。各マウスには約２０ｍｌの生理食塩水が必要であった。生理食塩水灌流が完了した後、２０ｍｌのパラホルムアルデヒドを用いて固定を行った。灌流が完了した後、モデリング領域の皮膚を切り取り、固定し、切片を作製し、分析した。

２）組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

３）ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

図１８８は、皮膚炎モデルマウスのＨＥ染色写真を示した。ＯＶＡ群と比較して、Ｍ細胞治療後のマウスの角質層が薄く、脂肪層が厚くなっていることから、Ｍ細胞治療はマウスの皮膚の微小環境を改善し、炎症を抑制できることが示され、皮膚付属器の数はＯＶＡよりも多く、Ｍ細胞が皮膚付属器を保護し、アトピー性皮膚炎に対して良好な治療効果を有することを示した。

４）トルイジンブルー（ＴＢ）染色
１．組織切片を通例の脱蝋及び脱水に供した。
２．トルイジンブルー溶液に３０分間加えた。
３．水で少しすすいだ。
４．核及び粒子が透明になるまで、分別のため０．５％の氷酢酸溶液に加えた。
５．水で少しすすぎ、冷風で乾燥させた。
６．キシレンで透明化させ、中性樹脂で封入した。

実験結果：Ｍ細胞は肥満細胞の増殖を減少させることができた。

５）フローサイトメトリーによる脾臓内のＴｈ１細胞及びＴｈ２細胞の検出
（５）マウスの脾臓を取り出し、組織を粉砕機で粉砕し、粉砕液をＥＰチューブに移し、５００Ｇの遠心分離機で５分間遠心分離し、上清を廃棄し、次に赤血球溶解液５ｍｌを加え、３７℃で１５分間インキュベートし、再び遠心分離し、上清を廃棄し、細胞濃度を１×１０^６に調整し、細胞を遠心管にピペッティングし、４００Ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、ＣＤ４抗体を各チューブに添加し、ボルテックスして、暗所で３０分間インキュベートした。
（６）１ｍｌの染色バッファーで２回洗浄し、最初のチューブにＩＬ－４及びＩＦＮ－γイソフィル抗体を添加し、他の各チューブに２μｌのＩＬ－４及びＩＦＮ－γ抗体を添加し、ボルテックス後、４℃で３０分間インキュベーションを実施した。
（７）固定浸透液で２回洗浄した後、５００μｌのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、分析用機械に装入した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞ゲートをＣＤ４蛍光に従って決定し、各標本中、１００００個のＣＤ４^＋Ｔ細胞を計数し、Ｔｈ１（ＣＤ４^＋ＩＦＮ－γ^＋）及びＴｈ２（ＣＤ４^＋ＩＬ－４^＋）細胞のパーセンテージを計算した。

実験結果は、皮膚炎モデル群においてＴｈ１／Ｔｈ２細胞が有意に減少し、Ｍ細胞治療がＴｈ１／Ｔｈ２細胞の不均衡を媒介し、炎症反応を阻害できることを示した。

５）Ｂ細胞のフローサイトメトリー
（１）マウスの心臓から採血し、ヘパリンナトリウムで抗凝固し、フローサイトメトリー用のチューブに１チューブ当たり１００μｌの血液を加え、ＢＤ赤血球溶解液を各チューブに加え、１５分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。
（２）ＰｅｒＣＰ－ＣＤ１９、ＰＥ－ＣＤ２７、及びＦＩＴＣ－３８の抗体を各チューブに加え、３０分間インキュベートした。
（３）細胞内マーカー染色では、ＢＤ細胞内染色バッファーを用いて固定及び浸透を行った。
（４）ＦＣＲブロッキングを実施した。
（５）ＦＩＴＣ－ＩｇＥ抗体インキュベーションを実施した。
（６）フローサイトメーターに負荷をかけて検出した。

実験結果：Ｍ細胞はＣＤ１９陽性細胞のＩｇＥ発現強度を低下させ、アレルギー疾患を改善できることが示された。

結論として、Ｍ細胞治療は、マウスの掻痒の程度を減らし、肥満細胞の増殖を減らし、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞の不均衡を媒介し、炎症反応を阻害し、ＣＤ１９陽性細胞におけるＩｇＥ発現の強度を低下させ、アレルギー疾患を改善することができた。したがって、Ｍ細胞は皮膚炎をうまく治療することができた。

実施例３４：神経炎症に対するＭ細胞の治療活性の評価
神経炎症は、外傷性脳損傷、脳卒中、脳出血、及び様々な神経変性疾患に関与している。正常な状態では、神経炎症は恒常性を維持し、組織の修復を促進する。しかしながら、制御されていない神経炎症は脳に害を及ぼす可能性がある。したがって、有害な炎症反応を制御することは、神経系疾患に対する有望な治療アプローチである。

文献：
Mesenchymal stem cells enhance microglia M2 polarization and attenuate neuroinflammation through TSG-6.

実験動物：Ｃ５７ｂｌ／６マウス、５週齢～７週齢、Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から購入。全ての動物を、中国科学院動物学研究所の実験動物センターのＳＰＦグレードで飼育した。動物の世話及び使用は、中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物の実験手順は全て、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施された。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温２２±２℃、相対湿度５０％～６０％であった。実験を、マウスの適応給餌の１週間後に開始した。

実験群：正常コントロール群、ＬＰＳ＋溶剤（溶剤群）、ＬＰＳ＋Ｍ細胞（Ｍ細胞群）、各群に３匹のマウスを用いた。

実験材料：手術機器、２０ｍｌシリンジ、５ｍｌ使い捨て滅菌シリンジ、２０ｍｌ使い捨て滅菌シリンジ、電子スケール。

実験試薬：生理食塩水、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＲＩＰＡ溶解液、マウスインターロイキン１β ＥＬＩＳＡキット（マウスインターロイキン１β、ＩＬ－１β ＥＬＩＳＡキット）、マウスインターロイキン６ ＥＬＩＳＡキット（マウスインターロイキン６、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット）、マウスインターロイキン１０ ＥＬＩＳＡキット（マウスインターロイキン１０、ＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡキット）。

装置：組織ホモジナイザー

実験手順：マウスをＬＰＳ注射前に１６時間絶食させた後、ＬＰＳ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。脳組織を２４時間後に採取した。マウスを安楽死させた直後に、心臓灌流を実施した。胸腔を開いて心臓を露出させ、２０ｍｌのシリンジを使用して２０ｍｌの生理食塩水を引き、シリンジを５ｍｌシリンジに交換し、心尖から挿入し、右心耳を切り、２０ｍｌの生理食塩水をすばやく注入した後、マウスの脳組織を取り出し、ＲＩＰＡ溶解液を１：３の比率で加え、次いで、組織ホモジナイザーで均質化し、氷上に５分間置き、５０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、ＥＬＩＳＡ検出のため上清を採取した。ＥＬＩＳＡを指示に従って行った。

細胞注射：ＬＰＳの注射と同時に実施した。ＬＰＳ＋溶剤群を尾静脈から１００μｌの生理食塩水の注射に供し、ＬＰＳ＋Ｍ細胞群を、尾静脈を介して１００μｌのＭ細胞（３×１０^６／細胞）の注射に供した。

統計：全てのデータを、分散分析及び有意性検定のためＰｒｉｓｍ ７．０統計解析ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡによって分析し、実験データを平均±標準偏差（平均±ＳＤ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

結果の分析：ＬＰＳ誘発性神経炎症を有するマウスの脳組織では、溶剤群と比較して、Ｍ細胞群は炎症誘発因子ＩＬ－１β及びＩＬ－６の含有量を減少させる傾向を有した。さらに、Ｍ細胞は抗炎症因子ＩＬ－１０の発現を有意に増加させた。したがって、Ｍ細胞は炎症を軽減する可能性がある。

表３４－１及び図１８９は、ＬＰＳ誘発性神経炎症を有するマウスの脳組織におけるＩＬ－１β含有量（ｐｇ／ｍｌ）の統計的結果を示した。ＩＬ－１βは炎症を促進し、炎症誘発因子であった。溶剤群の脳組織におけるＩＬ－１βの含有量は、正常群よりも有意に高かった。溶剤群と比較して、Ｍ細胞群はＩＬ－１βの含有量が減少する傾向を有した。

表３４－２及び図１９０は、ＬＰＳ誘発性神経炎症を有するマウスの脳組織におけるＩＬ－６含有量の統計結果を示した。正常群と比較して、溶剤群の脳組織におけるＩＬ－６の含有量は有意に増加した。ＩＬ－６は炎症を促進し、炎症誘発因子であった。溶剤群と比較して、Ｍ細胞群はＩＬ－６の含有量が減少する傾向を有した。

表３４－３及び図１９１は、ＬＰＳ誘発性神経炎症マウスの脳組織におけるＩＬ－１０（ｐｇ／ｍｇ）の統計結果を示した。ＩＬ－１０は炎症の発生を阻害し、抗炎症因子であった。Ｍ細胞群の脳組織におけるＩＬ－１０の濃度は、溶剤群よりも有意に高く（２．０対２．７）、Ｍ細胞が抗炎症作用を有することを示した。

凍結マウス脳切片の染色及び統計的結果
方法は、公開された文献Kriks et al., Nature, 2011を参照した。

凍結脳切片の染色を、マウスにおける神経細胞の再生を検出するために使用した。コントロール群と比較して、移植したＭ細胞群の動物の脳及び末梢組織における反応性星状細胞（ＧＦＡＰ＋）及びミクログリア（ＩＢＡ１＋ＣＤ１１Ｂ＋）の数が有意に減少していることがわかった。Ｍ細胞移植は、ニューロンの再生を促進し、ニューロンの損傷及び死を減少させ、神経炎症を軽減し、ニューロンに栄養を供給し、シナプス再生を促進できることを示した。

脳組織における炎症因子のＥＬＩＳＡ及びＷＢの検出結果
方法は、公開された文献Betemps et al., 2015, J Vis Expを参照した。

マウスの脳組織を採取して、炎症因子のレベルを検出した。コントロール群と比較して、移植されたＭ細胞群の脳組織におけるＴＦＮ－α、ＩＬ１－β、ＩＬ－６及びその他の炎症誘発因子のレベルは有意に低下したのに対し、ＩＬ－１０及びＩＬ－３等の抗炎症因子のレベルは有意に増加することがわかった。Ｍ細胞が炎症反応を減弱し、神経系の微小環境を改善できることを示した。

記憶試験：
方法は、公開された文献Lykhmus et al., 2019, Frontiers in Pharmacologyを参照した。

結果は、Ｍ細胞移植が、モデル動物（被験体）において場面記憶力を有意に改善することを示した。

正常コントロール群と比較して、溶剤群における炎症誘発因子ＩＬ－１β及びＩＬ－６の濃度が有意に増加し、抗炎症因子ＩＬ－１０が有意に減少し、溶剤群のマウスがより重度の炎症を有したことを示した。

実施例３５：半月板損傷に対するＭ細胞の治療活性の評価
半月板は、脛骨プラトーの内側と外側の関節表面に位置する２つの半月形の線維軟骨であり、膝関節を安定させ、膝関節の負荷力を伝達及び分散させ、関節内栄養を促進する機能を持ち、膝関節の安定性及び運動機能を維持するのに重要な器官である。半月板損傷は主にねじれ外力によって引き起こされ、関節痛、関節の動きの制限をもたらし、筋萎縮及び歩行不便につながり、患者の生活に深刻な影響を及ぼす。半月板損傷は、膝関節に対する最も一般的なスポーツ傷害の１つである。

外側から内側に向かって、半月板は次のように分けられる：外側の１０％～２０％は内側と外側の膝動脈から血液が供給され半月板の周囲に動脈叢を形成する赤色領域（red area）、内側の３０％程度は血液供給のない白色領域（white area）であり、中央の５０％～６０％程度は移行性の赤－白領域（transitional red-white area）である。現在、半月板損傷の臨床的修復方法としては、主に縫合、切除、及び半月板補綴物移植が挙げられる。縫合糸は、血液供給のある赤色領域及び赤白領域の一部の単純な傷害に限られ、これらの領域は縫合後に自然に治癒するが、かかる症例は臨床診療ではまれであり、半月板全体の症例の約２０％～３０％を占めている。しかしながら、半月板の構造的特徴及び応力特徴により、殆どの傷害は白い領域で発生し、かかる傷害は血液の供給不足により自然に治癒することができず、そのため、半月板切除術が必要であり、手術の原則はできるだけ多くの半月板を保存することであるため、部分切除が一般的であり、より重篤な症例では亜全切除が実施されることがあり、すなわち、半月板の赤色領域の最外層が保持され、ごくまれに全半月板切除術が実施される。部分的又は完全な半月切除術は症状及び疼痛を明らかに和らげることができるが、半月板機能の重要性により、半月板切除後の長期追跡結果は、関節軟骨が変性し、重度の変形性関節症も発生することを示す。したがって、半月板切除術後の一部の患者は、関節軟骨を保護し、関節の安定性を維持し、運動機能を回復するために、半月板補綴物移植を必要とする。

非特許文献：
１．Meniscus repair using mesenchymal stem cells-a comprehensive review.
２．Mesenchymal stem cells in human meniscal regeneration: A systematic review
３．Role of mesenchymal stem cells in meniscal repair

特許文献：
中国特許第１０３９２０１８８号：組織工学半月板修復シート及びその調製方法（Tissue engineering meniscus repair sheet and preparation method thereof）
中国特許出願公開第１０４３９８６９８号：半月板損傷を治療するための漢方薬組成物（Traditional Chinese medicine composition for treating meniscus injury）

目的：Ｍ細胞の移植による半月板損傷の治療を達成すること。

達成された効果：Ｍ細胞移植後、半月板損傷は完全に回復した。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアを形成し、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

Ｐ５世代のＭ細胞を、国立幹細胞リソースバンクが調製した臨床調剤で凍結保存し、液体窒素タンクに保管し、後の臨床使用に備えた。

治療方法：半月板損傷を有する患者を、Ｍ細胞調剤の関節内注射で治療し、低用量群（１×１０^７／膝関節）と中用量群（５×１０^７／膝関節）に分けた。Ｍ細胞調剤の注射後、安全性及び有効性（膝関節痛、局所浮腫）を評価し、画像観察を実施した。

疼痛の視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）：０～１０に換算
０点：痛みは全くない。
３点以下：わずかな痛み、耐えられる。
４点～６点：患者の睡眠に影響を与えるが、それでも耐えられる痛み。
７点～１０点：耐え難い激しい痛み、患者の食欲及び睡眠に影響する。

リスホルムスコア：１９８２年にLysholm及びGillquiによって提案され、半月板損傷、軟骨変性又は軟化等の様々な膝関節疾患に広く使用されている。リスホルムの合計スコアは１００点である。自己評価スコアが７０点未満の場合、膝関節の機能状態はすでに非常に悪いことを示している。スコアの内容は、跛行、ロッキング（locking）、疼痛、支持装具（support）、不安定性、腫脹、階段を上ることが困難、及びしゃがみ込みの制限（restricted squatting）を含む。リスホルムスコアは、被験体の最も重要な日常活動の機能的知覚を評価するだけでなく、様々な強度での被験体の運動機能レベルの予備的評価も行うことができる。

表３５－１の説明：幹細胞移植から３ヶ月後の低用量群の６人の被験体について、そのうち４人は修復された半月板の程度が異なり、中用量の被験体は、幹細胞移植の１ヶ月後、まだ追跡中であった。

表３５－２と図１９２を合わせると、２つの用量群のＶＡＳスコアは上下変動したが、全体として下降傾向を示し、すなわち、被験体の膝の痛みは試験薬の注射を受けた後に或る程度和らげられたことがわかった。

注：表３５－３及び図１９３から、２つの用量群の被験体が試験薬注射を受けた後、リスホルムの合計スコアは上昇傾向を示したことがわかった。単一の評価結果によると、試験薬の注射後のスコア値の増加は、主に跛行、ロッキング及び疼痛の観点から反映されていたが、他の単一の評価ではスコアに有意な変化はなかった。したがって、被験体が試験薬の注射を受けた後、主に跛行、ロッキング及び疼痛の緩和において、リスホルムスコアに幾つかの改善が見られた。

Ｍ細胞治療前は、半月板損傷と激しい膝関節痛があった。Ｍ細胞調剤の関節内移植の３ヶ月後、半月板損傷は完全に回復し、膝関節痛スコアは８点から２点に変化し、局所浮腫が緩和され、Ｍ細胞の関節内移植が半月板損傷を効果的に治療できることを示した。Ｍ細胞の移植後、半月板損傷には良好な修復効果があり、膝関節痛スコアが低下し、局所浮腫が減少した。

実施例３６：非アルコール性脂肪性肝炎に対するＭ細胞の治療活性の評価
代謝性脂肪性肝炎としても知られる非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、進行型の非アルコール性脂肪性肝臓疾患であり、線維症の有無にかかわらず、脂肪肝に付随する炎症及び肝細胞損傷（例えば、風船様変性）を有する肝細胞が５％以上存在することと定義される。ＮＡＳＨは肝硬変、肝臓癌、及びその他の疾患に発展しやすい。ＮＡＳＨの患者は世界全体で３％～５％である。中国では約１０９万人の肝硬変患者がおり、２０３０年には２３２万人に増加する見込みである。ＮＡＳＨの発症は、遺伝（ＰＮＰＬＡ３の多型）、生活習慣（宿主の食習慣、食事の回数、睡眠覚醒サイクル等）、肥満、メタボリックシンドローム等と密接に関係している。ＮＡＳＨの一般的な症状としては、食欲不振、疲労、腹部膨満、吐き気及び嘔吐、肝臓領域の鈍い痛み、並びに肝腫大が挙げられる。環境、代謝及び遺伝的要因により、肝臓に遊離脂肪酸が蓄積し、一連の細胞損傷を引き起こす。現在、ＮＡＳＨ治療には非臨床治療と臨床治療がある。前者は、疾患の経過を改善するためのライフスタイルの変更を含み、後者は、肝臓移植、手術及び疾患を治療するための調査中の薬物を含む。健康的なライフスタイルを形成するための治療戦略は、補助療法により適している。肝臓移植は高価でドナーが不足しており、外科的治療は患者が適格基準を満たす必要があって制限もあり、現在、ＮＡＳＨのＦＤＡ承認薬はない。そのため、ＮＡＳＨの治療は依然として緊急の不足状態にある。

課題：ＮＡＳＨには有効な治療がない。

実験動物：Ｃ５７ｂｌ／６のマウス、７週齢～９週齢、Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.から購入。全ての動物を、中国科学院動物学研究所の実験動物センターのＳＰＦグレードで飼育した。動物の世話及び使用は、中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物の実験手順は全て、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施された。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温２２±２℃、相対湿度５０％～６０％であった。実験を、マウスの適応給餌の１週間後に開始した。

試薬及び装置：

実験群：
通常の飼料＋溶剤群：通常の飼料を給餌し、給餌の２週目と４週目に、１００μＬの生理食塩水を尾静脈に注射した。
ＭＣＤ飼料＋溶剤群：ＭＣＤ飼料を給餌し、給餌の２週目と４週目に、１００μＬの生理食塩水を尾静脈に注射した。
ＭＣＤ飼料＋Ｍ細胞群：ＭＣＤ飼料を給餌し、給餌の２週目と４週目に、マウス１匹当たり３×１０^６個のＭ細胞を尾静脈に注射した。

実験材料：
ＭＣＤで６週間給餌した後、サンプリングを実施した。腹腔内麻酔後、マウスを仰臥位に置き、マウスの腹部の中央で皮膚を切って腹腔を開き、中心静脈から採血した。胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。生理食塩水灌流の完了後、５０ｍＬのパラホルムアルデヒドを用いて固定を実施した。灌流が完了した後、肝臓を採取し、固定し、切片を作製し、分析した。収集した血液を室温にて５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を血液生化学分析のため上清を採取した。

サスペンションチップシステムによる炎症因子の検出：
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。２３種の因子のキットを炎症因子の検出に使用した。
（２）凍結保存した細胞上清を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上に置いた。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を細胞培養上清に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランク、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

免疫組織化学染色：
免疫組織化学キット（Fuzhou Maixin、ＫＩＴ－９７１０）を使用して、パラフィン切片に対して免疫組織化学染色を行った。具体的な手順は次の通りであった：
１．脱蝋：（１）キシレンＩ、ＩＩ、各１０分、（２）勾配アルコール：１００％無水エタノール、２分間、９５％無水エタノール、２分間、８０％無水エタノール、２分間、７０％無水エタノール、２分間。
２．水和：蒸留水で２回、毎回５分（シェーカーに置く）洗浄した。
３．パラフィン切片の脱パラフィン化及び水和後、すすぎをＰＢＳで３回、毎回３分間行った。
４．抗原賦活化溶液（１０ｍＭ ｐＨ６．０クエン酸ナトリウムバッファー）の調製：
（１）原液の調製：溶液Ａ：クエン酸三ナトリウム二水和物２９．４１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ；溶液Ｂ：クエン酸２１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ。
（２）作業液の調製：溶液Ａ８２ｍＬ＋溶液Ｂ１８ｍＬ＋蒸留水９００ｍＬ。
５．抗原賦活化：切片をクエン酸ナトリウムバッファーで満たしたプラスチック製又は耐熱性のガラス容器に入れ、切片を浸漬し、電子レンジでミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間処理し、クエン酸ナトリウムバッファーを補充し、ミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間再び処理を行った。
６．試薬Ａ（ペルオキシダーゼブロッキング溶液）を添加し、室温で１０分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼの活性を遮断し、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
７．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬの試薬Ｂ（正常な非免疫動物血清）を加え、室温で１０分間インキュベートした。
８．血清を廃棄し、１滴又は５０μＬの一次抗体を加え、４℃で一晩又は室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
９．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのビオチン標識二次抗体（試薬Ｃ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１０．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのストレプトアビジンペルオキシダーゼ溶液（試薬Ｄ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１１．ＰＢＳを廃棄し、２滴又は１００μＬの新たに調製したＤＡＢ溶液を加え、顕微鏡下で３分～１０分間観察を行った。
１２．すすぎを水道水で行い、ヘマトキシリンで対比染色を行い、ＰＢＳ又は水道水ですすぎを行って色出しした。
１３．発色にＤＡＢを使用する場合、切片を勾配アルコールで脱水して乾燥させる必要があり、キシレンで透明化を行い、中性樹脂で封入を行った。
１４．顕微鏡で写真を撮影した。

オイルレッドＯ染色：
１．オイルレッドＯの調製：事前に粉砕して細かくしたオイルレッド乾燥粉末０．５ｇを計量し、１０ｍＬのイソプロパノールに溶解した後、イソプロパノールを加えて１００ｍＬにし、密閉して４℃で褐色の（又は光から保護するためにスズ箔で包んだ）ボトルに保管し、この溶液は貯蔵溶液であり、長期にわたって保管可能であった。使用する場合、６ｍＬのオイルレッド溶液を取り、４ｍＬの３回蒸留水（triple-distilled water）を加えてよく混合し、定性濾紙で濾過し、希釈後３時間以内に使用した。
２．組織を凍結して切片を作製し、ＰＢＳですすぎ、室温にて４％ＰＦＡで２０分間固定した。
３．４％のＰＦＡを廃棄し、ＰＢＳで１回すすぎを実施した。
４．オイルレッド原液をオイルレッド：脱イオン水＝３：２に希釈し、濾紙で濾過し、室温で１０分間静置した。
５．オイルレッド染色液を廃棄し、６０％イソプロパノールを添加して１回すすぎ、過剰な染料を除去した。
６．イソプロパノール６０％を廃棄し、ＰＢＳを添加し、顕微鏡下で写真を撮影した。
統計分析
Ｐｒｉｓｍ ７．０統計分析ソフトウェアにおける一元配置ＡＮＯＶＡ及びｔ検定を分散分析及び有意性検定に使用し、実験データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

実験結果
（１）解剖学的観察は、ＭＣＤ飼料＋溶剤群のマウスの肝臓が白色になり、表面が顆粒状になったことを示した。しかしながら、Ｍ細胞群のマウスの肝臓は正常な赤褐色であり、表面が滑らかで、Ｍ細胞が脂肪肝を阻害できることを示した。
（２）肝臓を計量した結果、Ｍ細胞は肝臓の重量を有意に減らし、肝臓への脂肪の蓄積を阻害できることを示した。
（３）血液生化学解析の結果は、Ｍ細胞が血液中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の含有量を有意に低下できたことを示し（表３６－１、表３６－２、図１９５及び図１９６）、Ｍ細胞がアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルを下げ、肝機能を改善できることを示した。

（４）血液生化学解析の結果は、Ｍ細胞が血中トリグリセリド（ＴＧ）（表３６－３、図１９７）及び総コレステロール（ＣＨＯ）のレベルを有意に低下できたことを示し、Ｍ細胞が脂肪性肝臓の指標を低下させ得ることを示した。

（５）ＨＥ染色の結果は、ＭＣＤ飼料＋溶剤群のマウスの肝細胞において脂肪滴及び気泡様肝細胞が多数存在し、ＭＣＤ飼料＋Ｍ細胞群の肝細胞の形状は正常であることを示し、Ｍ細胞が脂肪肝を軽減できることを示した。
（６）オイルレッドＯ染色は、ＭＣＤ飼料＋溶剤群のマウスの肝臓細胞に多数の脂肪滴があることを示したが、ＭＣＤ飼料＋Ｍ細胞群のマウスの肝臓には少量の脂肪滴しか存在せず、Ｍ細胞が脂肪肝を軽減できることを示した。
（７）免疫組織化学の結果は、ＭＣＤ飼料＋溶剤群のマウスの肝臓が大量のコラーゲンＩ及びα－ＳＭＡタンパク質を発現し、線維症の症状を示すことを示した。ＭＣＤ飼料＋Ｍ細胞群のマウスの肝臓はわずかしか発現しておらず、Ｍ細胞が線維化の形成を阻害し得ることを示した。
（８）ＨＥ染色結果は、ＭＣＤ飼料＋溶剤群ではマウスの肝臓に多数の炎症細胞が浸潤しているが、ＭＣＤ飼料＋Ｍ細胞群のマウスの肝臓形態は正常であり、Ｍ細胞が炎症細胞の浸潤を阻害し得ることを示した。
（９）マウスの血清中の炎症因子の検出結果は、ＭＣＤ飼料＋溶剤群と比較して、ＭＣＤ飼料＋Ｍ細胞群の炎症誘発因子のレベルが有意に低下し、抗炎症因子のレベルが有意に増加したことを示した。Ｍ細胞は炎症を抑える効果を有することが示された。

溶剤群の血液中のＡＬＴ及びＡＳＴのレベルは有意に増加し、肝臓におけるＴＧ濃度も正常群と比較して有意に増加した。

実施例３７：急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に対するＭ細胞の治療活性の評価
「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」感染による肺炎「ＣＯＶＩＤ－１９」は、潜時が長く、感染力が強く、大きな害がある。これまでのところ、ＣＯＶＩＤ－１９に対する有効な治療法は存在していないが、重症で重篤なＣＯＶＩＤ－１９を有する患者の予後は不良であり、死亡率が高く、特にその臨床的治療ニーズが急務となっている。

最新の疫学データによると、ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者の約１５．７％（１７３／１０９９症例）が重病であり、一部の患者は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を発症し、呼吸不全を引き起こし、他の臓器の機能に影響を与え、死に至ることさえある。現在のデータは、重症例の死亡率は１５％にも達していることを示している。ＡＲＤＳは、急速に進行する呼吸困難、低酸素血症、びまん性肺浸潤、及び呼吸不全の臨床症候群として現れる。現在のＡＲＤＳの治療選択肢は、基本的な医学的ケア及び支持的換気戦略等の対症療法に限られており、依然として疾患プロセスを逆転させ、患者の生活の質を改善し、死亡率を低下させることができない。人工呼吸は、急性呼吸窮迫症候群を有する患者に対する治療の頼みの綱である。人工呼吸の過程で、人工呼吸器関連肺炎、人工呼吸器関連肺損傷、深部静脈血栓症、人工呼吸からの離脱困難、及び肺線維症等の合併症がしばしば発生する。薬物治療方法としては、コルチコステロイド、スタチン、アスピリン、β－２受容体作動薬、界面活性剤、及び吸入ＮＯが挙げられるが、いずれも顕著な有効性を示すものではない。上記の２つの治療法は、血液浄化治療、栄養介入、及び体液管理等の補助的な方法と相まって、ＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされるＡＲＤＳの治療を満足させるにはほど遠い。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、一定の自己複製及び分化能を有する多能性細胞である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの特定の培養条件下で、ＭＳＣを脂肪細胞、軟骨芽細胞、及び骨芽細胞に分化するように指示することができる。成人のＭＳＣは幅広い供給源に由来し、骨髄、臍帯、又は脂肪組織から単離できる。ＭＳＣは免疫原性が低いという特徴があり、内皮及び上皮増殖因子、抗炎症性サイトカイン、並びに抗菌ペプチドを含む、様々な因子を分泌する。前臨床試験は、ＭＳＣが、敗血症性ショックによって引き起こされるＡＲＤＳ、病原体（大腸菌（E.coli）等）によって引き起こされる急性肺損傷モデル、人工呼吸器関連肺損傷モデル、胸部外傷誘発肺損傷動物モデル、及び虚血再灌流肺損傷モデル等を含む、様々な理由で引き起こされるＡＲＤＳモデルの治療において良好な安全性及び有効性を有することを示した。ＭＳＣは、体の免疫応答を調節し、肺組織の免疫損傷を減らし、関連タンパク質を分泌して肺損傷の回復を促進し、病原菌のクリアランスを促進することにより、ＣＯＶＩＤ－１９の臨床治療に使用できる。

近年、ＡＲＤＳ及びＰＦ等の難治性肺疾患の治療するため、幹細胞技術が期待される前臨床及び臨床研究の結果が数多く示されている。しかしながら、成体組織由来のＭＳＣの臨床適用には、主に以下の欠点がある：（１）単一の個体の組織からは治療量の成体組織由来のＭＳＣを殆ど得ることができない；（２）成体組織由来ＭＳＣは異なる個体の組織に由来し、製品品質の高い一貫性を達成することは殆どできない；（３）同じ個体の組織由来ＭＳＣでさえも非常に不均一である；（４）成体組織由来ＭＳＣのドナー組織源は複雑であり、感染性病原体の感染リスクがある；（５）成体組織由来のＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大に伴って急速に老化する。

関連文献：
（１）Transplantation of ACE2 to Mesenchymal stem cells Improves the Outcome of Patients with COVID-19 Pneumonia.
（２）Mesenchymal stem cell treatment in severe COVID-19: A retrospective study of short-term treatment efficacy and side effects
（３）Repair of Acute Respiratory Distress Syndrome by Stromal Cell Administration in COVID-19 (REALIST-COVID-19): A structured summary of a study protocol for a randomised, controlled trial
（４）Safety and efficacy assessment of allogeneic human dental pulp stem cells to treat patients with severe COVID-19: structured summary of a study protocol for a randomized controlled trial (Phase I/II)
（５）Adipose to derived mesenchymal stromal cells for the treatment of patients with severe SARS-CoV-2 pneumonia requiring mechanical ventilation. A proof of concept study

上記の文献の研究を通じて、ＡＲＤＳに対するＭ細胞治療の可能性が探求され、実験プロトコルの策定のための参照も提供した。

達成された結果：Ｍ細胞の移植後、幹細胞薬物関連の有害反応はなく、治療期間中に重篤な有害反応は発生しなかった。注入の１ヶ月後、ＣＴは、正常に戻り、線維症は形成されなかったことを示した。

Ｍ細胞の調製及び培養：
胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、その後の臨床試験に使用した。

患者プロファイル：
男性、４４歳。彼は発熱と咳のために北京友安病院に６日間入院した。病院の外では、Ａ型インフルエンザの治療を６日間受けたが、状態は改善しなかった。患者は武漢に長く住んでいて、治療のため家族に同行して北京に来た。彼は概ね健康で、過去の病歴又は家族歴はなかった。入院時の身体検査：体温３７．９℃、血圧１２０／６０ｍｍＨｇ、心拍数８０拍／分、呼吸２１回／分。肺聴診は粗い呼吸音を明らかにした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸検出は陽性で、ＣＯＶＩＤ－１９と診断され、入院した。胸部のプレーンＣＴスキャンは、両肺、特に右下肺に複数のすりガラス影を示した。入院後、彼のバイタルサインは安定しており、断続的な発熱と咳があり、最高体温は３９℃であった。対症支援が与えられ、ロピナビル／リトナビルと中国特許薬を併用抗ウイルス療法に使用した。入院から５日後、患者は呼吸困難を起こした。胸部ＣＴを繰り返すと、肺病変が著しく悪化し、両肺に複数の斑状で薄片状のすりガラス密度及び高密度の影があり、範囲が拡大し、両肺に複数の嚢胞性半透明の影が現れた。入院から６日後、彼の状態は悪化し、窒息、胸部圧迫感、血中酸素飽和度の低下、低カリウム血症を伴った。入院から７日後、患者の状態は更に悪化し、酸素吸入のない安静状態では指の酸素飽和度は９１％であった。

幹細胞治療レジメン：
入院後７日目、患者がインフォームドコンセントに署名した後、Ｍ細胞を３×１０^６細胞／体重ｋｇで静脈内に注入した。細胞を７日間注入した後、２回目の細胞注入治療を実施した。幹細胞治療中、患者は抗ウイルス基礎療法を受けていた。

実験結果：好ましくは結果の分析及び評価とともに、テキスト記述、表又は図面の形式で提供され得る。

サスペンションチップシステムによる炎症因子の検出：
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。４８種の因子のキットを炎症因子の検出に使用した。
（２）凍結保存した細胞上清を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上に置いた。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を細胞培養上清に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランク、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

有効性評価
（１）臨床症状：最初の細胞注入後、血中酸素飽和度は上昇した（表３７－１、図１９８）。２日目から、患者は息切れが和らいだと報告し、４日目には臨床症状が消失し、状態は大幅に改善された。

（２）胸部ＣＴ：最初の細胞注入の前に、患者の胸部ＣＴは両肺に複数の斑模様、シート状のすりガラス密度、及び高密度の影（黄色の矢印）を示した。患者が２回目（６日間隔）のＭ細胞注入を受けてから２日目、ＣＴは病変部位での吸収の改善を示し、１回目の注入から１ヶ月後にＣＴは線維化なしで正常に戻っていることを示した（図１９９）。
（３）血液生化学及びウイルス検出：最初の注入後２日目に、リンパ球の絶対値は０．７９×１０^９／Ｌであり、２回目の注入後は１．０２×１０^９／Ｌに上昇した（表３７－１）。２回目の細胞注入から２日目及び３日目に、新型コロナウイルスの核酸検査は２日間連続で陰性であった。ウイルスが陰性になってから２日後、退院基準が満たされた。退院２週間後、病院に戻り、新型コロナウイルスの核酸が陰性であり、血糖値、肝機能、腎機能、トロポニン、及び全血球分析が全て正常であることがわかった（表３７－２）。

（４）サイトカインの検出：初回注入後８日目には、ＩＬ－１ＲＡ及びＲＡＮＴＥＳ等の抗炎症性サイトカインの濃度が上昇し（表３７－３及び表３７－４、図２００及び図２０１）、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－２５及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０等の炎症誘発性サイトカインが有意に減少した（表３７－５～表３７－１０、図２０２～図２０７）。これに対応して、Ｃ反応性タンパク質レベルは有意に低下した（表３７－２）。結論として、ＡＲＤＳ患者におけるＭ細胞の静脈内注入後に有害事象は発生しなかった。Ｍ細胞注入は、病変部位の吸収改善を促進し、炎症を阻害し、肺の回復を促進する機能を有していた。

実施例３８：特発性肺線維症に対するＭ細胞の治療効果の評価
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺間質性線維症を特徴とする慢性進行性肺疾患である。その病因はまだ不明であり、高齢者で多く見られ、近年発生率が上昇傾向にある。しかしながら、ＩＰＦの診断は依然として臨床上の課題である。ＩＰＦの発症は潜行性であり、初期段階では明らかな臨床症状がないことが多く、画像診断及び肺機能の症状は典型的ではない。したがって、ＩＰＦを有する患者は、疾患の発症後、様々な合併症の発生までに診断されることが多い。しかしながら、ＩＰＦに対する有効な治療法は現在なく、患者の肺機能は疾患の進行とともに悪化し続け、生存期間の中央値はわずか２年～３年である。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は成体幹細胞の一種で、自己複製、低免疫原性、多方向分化、免疫調節、及び組織修復能力の特徴を有する。近年、損傷された肺組織では、炎症因子又はＣＸＣＬ８、ＳＤＦ－１、及びＣＸＣＲ４等の受容体経路の媒介下で、間葉系幹細胞を誘導してＩＩ型肺胞上皮細胞及び線維芽細胞に分化できることが研究からわかっており、多能性間質性間質細胞は肺の損傷の修復及び線維化に広く関与することを示唆した。多くの動物実験研究から、ブレオマイシン誘発肺線維症モデルマウスにおいて、多能性間質細胞の静脈内注射により肺の炎症と線維化を軽減することができることがわかり、多能性間葉系間質細胞療法が将来の肺線維症の新たな治療アプローチになる可能性があることを示唆している。近年、ギリシャ、オーストラリア及び米国では、ＩＰＦ患者に対する多能性間葉系間質細胞療法の第Ｉ相臨床試験が相次いで行われている。６ヶ月～１５ヶ月の追跡期間中、重大な有害事象は発生せず、多能性間葉系間質細胞がＩＰＦの治療において安全で信頼できることを示唆している。

しかしながら、成体組織由来ＭＳＣの臨床適用には、主に以下の欠点がある：（１）単一個体の組織からは治療量の成体組織由来ＭＳＣを殆ど得ることができない；（２）成体組織由来ＭＳＣは異なる個々の組織に由来し、これは製品品質の高い一貫性を殆ど達成できない；（３）同じ個体の組織に由来するＭＳＣでさえも非常に不均一である；（４）成体組織由来ＭＳＣのドナー組織源は複雑であり、感染性病原体の感染リスクがある；（５）成体組織由来ＭＳＣはｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大に伴って急速に老化する。したがって、肺線維症には新たなＭＳＣ供給源が必要とされている。

関連文献：
（１）Cell Therapy in Idiopathic Pulmonary Fibrosis.
（２）Idiopathic pulmonary fibrosis
（３）Mesenchymal stem cells in idiopathic pulmonary fibrosis
（４）Mesenchymal stem cells and Idiopathic Pulmonary Fibrosis

達成された結果：Ｍ細胞移植後、幹細胞薬物関連の有害反応はなく、治療期間中に重篤な有害反応は発生しなかった。Ｍ細胞を注入した後、ＣＴは被験体の肺病変の吸収が有意に改善されたことを示した。

Ｍ細胞の調製及び培養：
胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、後続する臨床試験に使用した。

患者プロファイル：
スクリーニング後、ＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされた肺線維症を有する患者が合計４名登録された。

幹細胞治療レジメン：
患者がインフォームドコンセントに署名した後、Ｍ細胞を３×１０^６細胞／体重ｋｇで静脈内に注入した。細胞を注入した後、肺のＣＴスキャンを実施して肺線維症を観察した。

有効性評価
（１）胸部ＣＴ：Ｍ細胞注入の前、患者の胸部ＣＴは、両側肺の複数の斑模様、シート状のすりガラス密度、及び高密度の影（矢印で示される）を示した。患者がＭ細胞注入を受けた後、ＣＴは全ての患者の病変の吸収が改善されたことを示し、注入の１ヶ月後、ＣＴは肺が基本的に正常に戻ったことを示した。５０日後、全ての患者で肺線維症が消失した（図２０８）。

実施例３９:心筋血管再灌流に対するＭ細胞の治療活性の評価
虚血性心臓疾患はヒトの主要な死因であり、心筋再灌流の早期回復を成功させることは臨床転帰を改善する最も効果的な方法である。しかしながら、虚血性心筋への血流を回復させる過程は、心筋虚血／再灌流障害（ＭＩ／ＲＩ）と呼ばれる現象である損傷を引き起こす可能性がある。Ｉ／Ｒは、酸化ストレス、細胞内カルシウム過負荷等の幾つかの悪影響をもたらし、心筋細胞のアポトーシスにつながる可能性がある。アポトーシスは、虚血再灌流障害における組織機能の喪失の重要な原因である。これは非常に複雑なプロセスであり、その詳細なトリガーメカニズムは完全には明らかではない。

１．実験方法：
Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代をその後の実験に使用した。

実験動物：Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット、６週齢～８週齢、Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から購入。全ての動物を、中国科学院動物学研究所の実験動物センターのＳＰＦグレードで飼育した。動物の世話及び使用は、中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物の実験手順は全て、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施された。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温２２±２℃、相対湿度５０％～６０％であった。実験を、ラットの適応給餌の１週間後に開始した。

実験群：正常コントロール群、手術＋溶剤（溶剤群）、手術＋Ｍ細胞（Ｍ細胞群）、各群に３匹のラットを用いた。

実験材料：手術機器、使い捨て滅菌シリンジ１ｍｌ、３－０外科用縫合糸、体重計。

実験試薬：イソフルラン、ヨードホール、２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）

装置：

全てのデータを、分散分析及び有意性検定のためＰｒｉｓｍ ７．０統計解析ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡによって分析し、実験データを平均±標準偏差（平均±ＳＤ）として表した。^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

ＳＤ雄ラットをWeitong Lihuaから購入し、１週間の適応給餌後、左前下行冠動脈を結紮することにより、心筋梗塞のラットモデルを確立した。ラットを麻酔箱に入れ、麻酔して麻酔状態を維持し、胸部を脱毛し、ヨードホールで拭き取り、胸骨の左側に胸骨と平行して約２ｃｍの縦切開を行い、皮膚を切り、大胸筋をむき出しにして（bluntly）分離し、第３肋骨と第４肋骨との間の肋間筋に眼瞼オープナーを用いて胸腔を拡張し、心臓を露出させ、心膜を分離した。冠状動脈を注意深く識別し、非侵襲的縫合糸を用いて左前下行冠動脈（ＬＡＤ）の遠位１／３を心筋とともに結紮し、スリップノットで留め、４５分間の虚血後に再灌流を実施した。その直後に、薬物注射を実施した。正常コントロール群はそのまま治療せず、手術＋溶剤（溶剤群）群に１ｍｌの生理食塩水を注射し、手術＋Ｍ細胞（Ｍ細胞群）に尾静脈を介して２．５×１０^６／１ｍｌ／ラットを注射した。手術後３日目に、小動物Ｂ超音波検査を使用して、左心室末期拡張期圧（ＬＶＥＤＰ）、左心室駆出率（ＥＦ）、左心室短縮率（ＦＳ）、左心室末端拡張期径（ＬＶＥＤＤ）、左心室末期収縮期径（ＬＶＥＳＤ）、左心室末期拡張容積（ＬＶＥＤＶ）、左心室末期収縮期容積（ＬＶＥＳＶ）、及び左心室自由壁を含む心機能指標の変化を検出した。Ｂ超音波検査後にラットを深く麻酔した後、腹部大動脈を灌流のために採取し、心臓を採取した。幾つかのラットの心臓組織をＴＴＣで染色し、幾つかのラットの心臓組織をマッソンのトリクロームで染色した。血液試料の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）とクレアチンキナーゼ（クレアチンキナーゼ、ＣＫ）の含有量を血液生化学分析装置で検査した。

２．実験結果：
結果分析：
（１）ＬＶＥＤＰは心筋収縮前の抵抗又は負荷を反映することができ、ＥＦ及びＦＳは左心室収縮機能を反映し、ＬＶＥＤＤ、ＬＶＥＳＤ、ＬＶＥＤＶ及びＬＶＥＳＶは心臓の収縮及び拡張機能を反映した。溶剤群では、ＬＶＥＤＰが有意に増加し、ＥＦ及びＦＳが有意に減少し、ＬＶＥＤＤ、ＬＶＥＳＤ、ＬＶＥＤＶ及びＬＶＥＳＶが有意に増加した。Ｍ細胞群のＬＶＥＤＰは溶剤群と比較して１３ｍｍＨｇ減少した（表３９－１、図２０９）。これは、Ｍ細胞が心筋収縮前に抵抗又は負荷を減らすことができることを示した。Ｍ細胞群では、ＥＦ及びＦＳは有意に増加したのに対し、ＬＶＥＤＤ、ＬＶＥＳＤ、ＬＶＥＤＶ及びＬＶＥＳＶは減少した。左心室収縮はＭ細胞群で有意に改善された。上記の全ての結果は、Ｍ細胞が心筋虚血再灌流を伴うラットの心機能を改善できることを示した。

（２）ＬＤＨ及びＣＫは心筋梗塞の程度を反映し得る。結果は、溶剤群では両方の酵素の含有量が有意に増加することを示した。Ｍ細胞群はＬＤＨ及びＣＫが有意に少なく、Ｍ細胞が心筋梗塞の程度を低下させ得ることを示した（表３９－２／図２１０、表３９－３／図２１１）。ＴＴＣの結果は、上記の結果をより直接的で直感的に確認する。

（３）マッソンのトリクローム染色は、コラーゲンが豊富な瘢痕組織が青色に染色され、生きている心筋組織が赤く染色されたことを示した。Ｍ細胞群では、瘢痕の大きさが小さく、左心室壁の厚さが大きかった。

上記の結果は、Ｍ細胞が心機能指標を改善し、心筋梗塞のサイズを縮小できることを示した。

実施例４０：腎摘除術に対するＭ細胞の治療活性の評価
腎摘出術は、腎臓疾患を治療するための外科的処置である。その適応症としては、腎悪性腫瘍、腎結核、重度の水腎症又は腎臓結石、重度の腎損傷及び片側性膿腎症が挙げられる。この実施例では、腎摘出術又は腎臓疾患の治療目的を、Ｍ細胞を移植することによって達成する。

１．実験方法：
実験動物：ＳＤラット、雄、６週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。全ての動物を、中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードに保ち、１週間適応飼育した。動物の世話及び使用は、中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物の実験手順は全て、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施された。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温２２±２℃、相対湿度５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

動物のモデリング：ラットを腹腔内注射により１００ｍｌ／Ｌ抱水クロラール、３００ｍｇ／ｋｇで麻酔し、開腹術を実施し、左腎及び腎茎を露出させ、むき出しにして分離し、左腎を露出させ、腎臓の周りの脂肪嚢を分離し、上下の腎臓を切除し、左腎の合計２／３を切除し、ゼラチンスポンジで１分間圧迫して止血し、腎臓を元の位置に戻し、腹部を層ごとに閉じた。第２段階の手術を、第１段階の手術の４日後に実施した。同じ方法を麻酔、開腹術、右腎の露出、腎茎の結紮及び右腎の摘除に用い、２回の手術で合計５／６の腎臓を摘除した。

動物をシャム群、手術＋溶剤群、及び手術＋試験物質群に分けて、１群につき４匹のラットを用いた。
シャム群：腎被膜を取り除いた後、腎臓の周りの組織のみを解放させ、腹部を閉じた。
溶剤群：１ｍＬの生理食塩水を注射した。
Ｍ細胞群：５×１０^６個のＭ細胞（Ｐ５世代）を含む生理食塩水１ｍＬを注射した。

手術の日を１日目として記録し、手術の２週間後に治療を実施し、７日目、１５日目、１９日目、２２日目、２６日目、２９日目、３３日目、３６日目、４０日目、４３日目、４７日目、５０日目、５４日目、５７日目に体重を計った。ＭＳＣの注射を１５日目、２９日目及び４３日目に実施した。５７日目に血液及び尿のサンプリングを実施した。

試料収集：
ラットを代謝ケージに入れ、２４時間尿を１日おきに収集した。１４日目、２９日目、４３日目及び５７日目の尿試料を検査のため収集した。モデリングの５７日後、ラットを屠殺して血液試料を得た。

２４時間の尿タンパク質、血清クレアチニン、及び血中尿素窒素レベルをＣｈｅｍｒａｙ ２４０自動生化学分析装置で検出した。

２．実験結果
（１）体重の統計：
異なる群のラットの体重試験結果を以下の表及び図２１２に示した。各時点におけるシャム群の体重は、手術＋溶剤群の体重よりも有意に高く（Ｐ＜０．０５）、手術＋Ｍ細胞治療群の体重は１日目～５０日目に手術＋溶剤群の体重よりも高かったが、有意差はなかった。５４日目及び５７日目では、手術＋Ｍ治療群の体重は手術＋溶剤群の体重よりも有意に高く（Ｐ＜０．０５）、上記の結果は、Ｍ細胞治療群が腎摘出ラットの体重に対して有意な促進効果を有することを示した。

（２）尿及び血液の生化学試験
実験方法：ラットを代謝ケージに入れ、２４時間尿を１日おきに収集した。尿を１４日目、２９日目、４３日目、及び５７日目に検査のため収集した。モデリングの５７日後、ラットを屠殺して血液試料を採取した。

２４時間の尿タンパク質、血清クレアチニン、及び血中尿素窒素レベルをＣｈｅｍｒａｙ ２４０自動生化学分析装置で検出した。

実験結果：５７日目に、異なる群のラットを尿及び血液の生化学的検査に供し、尿酸（ＵＡ）、尿素（ＵＲＥＡ）及び尿クレアチニン（ＣＲＥＡ）の含有量を含む値の統計を行った。結果は、５７日目に、手術＋溶剤群のラットの尿酸、尿素及び尿クレアチニンの含有量は、シャム群よりも有意に高いことを示した。腎摘出モデルが正常に構築され、ラットの腎臓がひどく損傷していることが示され、Ｍ細胞治療群の体重は５７日目に増加し、手術＋溶剤群よりも有意に高かった。尿及び血液の生化学試験は、Ｍ細胞治療群の尿酸、尿素及び尿クレアチニンの含有量は、手術＋溶剤群よりも有意に低いことを示した。Ｍ細胞はラットの腎損傷に対して保護効果を有し、腎機能を改善することを示した。Ｍ細胞の移植後、腎摘出ラットモデルの尿量及び尿酸は初期に或る程度回復した。これは、Ｍ細胞が腎摘出術の早期回復に一定の治療効果を有することを示した。

（３）ＢＭＳＣの分布
実験方法：腎臓組織中のＢＭＳＣの存在：各群の新鮮な肺及び腎臓組織を凍結し、連続切片（厚さ８μｍ）を作製し、ヘキスト３３３４２標識ＢＭＳＣを蛍光顕微鏡で観察した。存在する場合、青色蛍光を示すはずである。

実験結果：モデリング後５７日目には、Ｍ細胞群のラットの肺に大量の青色蛍光が観察され、少量の青色蛍光が腎皮質及び腎髄質に均一に分散しており、移植後、Ｍ細胞が腎臓に局在し、腎損傷に対して修復機能を有することを示した。また、Ｍ細胞には腎損傷関連疾患（腎線維症、腎不全等）の修復及び治療の活性も期待できる。

（４）組織形態観察
実験方法：通例のＨＥ及びマッソンの染色の後、１００倍の３０の糸球体視野及び２０の皮質視野を各切片で観察し、これを盲検の原則に従って別の病理学者によって完了した。糸球体硬化指数及び尿細管間質損傷指数を計算するため、半定量的方法を使用し、糸球体硬化症は、限局性又は糸球体毛細血管ループの閉塞又はヒアリン化（hyalinization）として定義され、尿細管間質損傷は、炎症性細胞浸潤、尿細管萎縮／代償性拡張、及び間質性線維症として定義された。

実験結果：ＨＥ及びマッソンの染色結果は、手術＋溶剤群の残留腎臓組織が、一部の糸球体に広範な糸球体肥大、分節性硬化症又は全体の硬化症、腎尿細管上皮細胞の濁り及び空胞変性を示し、また幾つかの腎尿細管は明らかな拡大又は萎縮を示し、多数の炎症細胞が浸潤し、腎間質に限局性間質浮腫又は線維症がある一方で、Ｍ細胞治療群の病理学的変化は有意に改善されたことを示した。更なる計算により、Ｍ細胞は糸球体硬化指数及び尿細管間質損傷指数を効果的に低下させ得ることがわかった。

実施例４１：神経障害性疼痛ＣＣＩに対するＭ細胞の治療活性の評価
疼痛は、人々が生涯にわたって頻繁に経験する不快な感覚であり、その発生は身体に危険が迫っているという警告シグナルを提供する。一方、疼痛は様々な疾患で最も多く見られる症状であり、神経障害性疼痛は、神経系の損傷又は異常によって引き起こされる難治性疼痛状態である。神経障害等の神経障害性疼痛は、神経組織に生じる疼痛である。この種の疼痛は主に神経の病理学的変化に基づいており、神経障害性疼痛の特徴は発作性である。局所的疼痛が感じられることもあるが、圧迫しても痛みはない。これが神経障害性疼痛の特徴である。神経障害性疼痛の一般的な治療は、主に、好ましくは医師の指導の下で、神経に栄養を与えるための薬物及び鎮痛薬の使用である。この実施例では、神経障害性疼痛の治療の目的がＭ細胞を移植することによって達成される。

１．実験方法：
実験動物：ＳＤラット、雄、６週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。全ての動物を、中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードに保ち、１週間適応飼育した。動物の世話及び使用は、中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物の実験手順は全て、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施された。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温２２±２℃、相対湿度５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代及びスクリーニングし、その後の実験のためにＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代をその後の実験に使用した。

動物のモデリング：
１．麻酔を４０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によって実施した。
２．右後肢を水平に固定し、大腿骨を基準とし、大腿部の中央を切開した。
３．坐骨神経を大腿中部の遠位端で三股に露出させ、結合組織を分離した。坐骨神経の３つの末梢枝（腓腹神経、総腓骨神経、脛骨神経）を、神経構造を破壊せずに露出させた。
４．低侵襲鉗子を使用して、総腓骨神経及び脛骨神経の下に５番の手術糸を静かに配置した。
５．総腓骨神経及び脛骨神経を結紮した（手術器具で神経を引っ張ったり、外皮神経に触れたりしないようにする）。
６．筋肉及び皮膚を別々に縫合した（シャム群では結紮は実施せず、他の手術手順は上記と同じであった）。
７．動物をシャム群、手術＋溶剤群、手術＋Ｍ細胞群に分けた。
８．注射を手術の日に行い、１日目として記録した。Ｍ細胞を１日目、５日目、８日目、１２日目、１４日目、１９日目、２１日目にそれぞれ注射し、投与方法は以下の通りであった：２×１０^６個のＭ細胞をモデリング部位に筋肉内注射した（４点注射、各点に５×１０^５個のＭ細胞）。１４日目にフォンフレイヘア（Von Frey hair）試験及び足荷重（foot-weighing）試験を実施し、２１日目にフォンフレイヘア試験を実施した。２１日目にサンプリングを実施し、採血した。

試験Ｉ：
実験方法：機械的誘発性疼痛（Mechanically induced pain）試験：５０％の逃避反射（withdrawal reflex）閾値をアップダウン法により計算した。ラットの左後肢の足底中部をフォンフレイヘアで４秒以下の持続時間垂直方向に刺激し、ラットが足を持ち上げたり舐めたりした場合は陽性反応とみなし、それ以外の場合は陰性反応とみなした。測定を最小刺激強度から開始した。この強度の刺激が陽性反応を引き起こさない場合、隣接するより高い強度の刺激が与えられ、陽性反応があった場合、隣接するより低い強度の刺激が与えられ、かかる進行を、陽性反応及び陰性反応が最初に入れ替わるまで続け、その後、測定を４回連続して行い、その平均値を閾値として取った。試験を手術前、並びに成形後５日目、８日目、１４日目及び２１日目に実施した。

実験結果：結果は、手術＋溶剤群のラットの機械的誘発性疼痛に対する耐性はシャム群よりも有意に低いことを示し、モデルの構築に成功し、モデルラットは機械的誘発性疼痛に耐えられないことを示した。Ｍ細胞治療群のラットの耐性度が有意に上昇し、神経障害性疼痛モデルラットにおいて、Ｍ細胞治療が機械的誘発性疼痛に対する耐性度に有意な促進効果を有することを示した。

試験ＩＩ：
実験方法：冷感異痛検査：アセトンの揮発性に起因する低温刺激を用いて冷感異痛試験を実施した。シリンジを使用して、手術が実施されたモデルの足底外側に約０．５ｍＬのアセトンを１滴置いた。試験動物の反応を観察し、動物の反応に従ってスコアリングを行った。スコアリングの規則は以下の通りであった：（１）明らかな反応なし、０点；（２）恐怖又はショックを受けたが、肢の離脱はない、１点、（３）顕著な肢の離脱、２点、（４）５秒～３０秒間続く肢の離脱及び足舐め現象、３点、（５）肢の離脱が３０秒を超えて続く、又は鳴く（squawking）、４点。試験を手術前及び成形後２０日目に実施した。

実験結果：結果は、手術＋溶剤群のラットの冷感異痛に対する耐性はシャム群よりも有意に低いことが示され、このことはモデルの構築に成功し、モデルラットは機械的誘発性疼痛に耐えられないことを示していた。冷感異痛に対するＭ細胞治療群のラットの耐性が有意に上昇し、神経障害性疼痛モデルラットにおいて、Ｍ細胞治療が冷感異痛に対する耐性に有意な促進効果を有することを示した。

試験ＩＩＩ：
実験方法：運動協調性能試験：ロータロッド運動試験により、動物の神経機能及び運動協調性能を評価した。試験動物を、回転速度が均一に増加する円筒形のロータロッド上に置いた。３０秒の適応後、ロータロッドの回転速度を５ｒ／分から４０ｒ／分にゆっくりと増加した。試験動物の間には各動物を分離するための仕切りがあり、試験機器は互いに影響を与えることなく同時に５匹の動物を試験することができた。対象の動物が機器の金属板に落ちた場合、機器は自動的に時間記録を停止することが可能であった。最大記録時間は５分であり、５分を超えた場合には５分として記録した。全ての試験動物を３回、１回につき１時間の間隔で試験した。３つの試験の平均値を、ロータロッドの保持時間として取った。試験を手術前及び成形後２０日目に実施した。

実験結果：結果は、手術＋溶剤群のラットがロータロッド上でバランスを維持する時間が有意に短縮されたことを示し、このことは、モデルの構築に成功し、ラットの運動協調能力に顕著な影響があったことを示していた。溶剤群と比較して、Ｍ細胞治療群ではロータロッド上でのバランス維持時間が有意に長くなり、モデル群のラットの運動協調能力の維持にＭ細胞治療が有意な促進効果を有することを示した。

試験ＩＶ：
実験方法：ＥＬＩＳＡ試験：全ての実験群のラットは、最後の行動試験の直後に殺傷し、手術部位の筋肉を摘除し（長さ：幅：厚さ＝２ｃｍ：１ｃｍ：０．５ｃｍ）、適量の生理食塩水を加え、均質化し、３０００ｒｍｐ／分で１５分間遠心分離した。治療後、炎症因子ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－１０及びＩＬ－１７を決定し、キット（Beijing Yaanda Biotechnology Co., Ltd.）の指示に従って実験工程を実施した。

実験結果：手術＋溶剤群のマウスの炎症因子の含有量は、シャム群よりも有意に高く、モデルの構築に成功し、ラットに炎症反応があったことを示した。Ｍ細胞治療群の炎症因子の含有量は溶剤群よりも有意に低く、神経障害性疼痛を有するラットの炎症反応に対してＭ細胞治療が有意な抑制効果を有することを示した。Ｍ細胞は、神経障害性疼痛の症状を改善し、炎症反応を抑制する上で重要な役割を果たした。

上記の結果は、Ｍ細胞の移植後、神経障害性疼痛を有するラットの協調能力及び運動能力が有意に改善され、機械的力及び異常な寒冷刺激に対する疼痛耐性能力が改善されたことを示した。神経障害性疼痛を有するラットでは、Ｍ細胞が炎症反応を抑制することができた。結論として、Ｍ細胞は神経障害性疼痛に対して一定の治療効果を有した。

実施例４２：多発性硬化症に対するＭ細胞の治療活性の評価
実験動物：７週齢～８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（ＳＰＦグレード）、体重１８ｇ～１９．５ｇのＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、Beijing Weitong Lihua Companyから購入した。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代をその後の実験に使用した。

ＥＡＥモデルの誘導：
２００μｌのＣＦＡに、２００μｇのＭＯＧ３５－５５及び２００μｇのマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒａを加え、よく混合し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左右後ろ側に皮下注射した。免疫当日及び免疫後２日目に、腹腔内注射により各マウスは２００ｎｇのＰＴＸ（生理食塩水に溶解）を受けた。マウスを正常群、モデル群、Ｍ細胞群の３つの群に分けて、各群に１５匹のマウスを用い、３０日目に試料を収集した。

正常群は治療を受けず、モデル群及びＭ細胞群はモデリング後に異なる治療を受けた。９日目、１１日目及び１３日目に、Ｍ細胞群に３×１０^６個のＭ細胞を含む２００μｌの生理食塩水を、尾静脈を介して注射し、モデル群には尾静脈から２００μｌの生理食塩水を注射した。

ＥＡＥスコアリング基準：
１日目から、マウスをＥＡＥの臨床徴候について毎日採点した。以下の通り：０、臨床的に示された疾患はない；１、後肢の衰弱を伴わない弛緩した尾；２、後肢の衰弱；３、完全な後肢麻痺及び垂れ下がった尾；４、軟尾及び尿失禁又は便失禁を伴う後肢麻痺；５、瀕死状態。

試料収集
標本を収集する際、マウスを腹腔内麻酔後に仰臥位に置き、マウスの腹部の中央で皮膚を切って胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水を灌流した。各マウスには約２０ｍｌの生理食塩水及び２０ｍｌのパラホルムアルデヒドが必要であった。灌流が完了した後、マウスの脊髄を採取し、その後の切片作製及び特定のためパラホルムアルデヒド中で固定した。

組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

ファストブルー染色
１．５μｍ～８μｍのパラフィン切片を水に脱蝋した。
２．切片を入れ、９５％エタノールで軽く洗浄した。
３．室温にてＬｕｘｏｌファストブルー染色液で染色した。
４．９５％エタノールですすぎ、余分な染色液を除去し、蒸留水ですすいだ。
５．分別液中の色分解に供し、７０％エタノールに入れて灰白質（cinereum matter）が透明になるまで色分解を実施した。
６．蒸留水ですすいだ（色分解が不十分な場合は、工程４から工程５を繰り返す）。
７．対比染色及び洗浄を行った。
８．従来の脱水処理に供し、キシレンで透明化し、中性樹脂で封入した。

免疫蛍光染色：
（１）組織切片を水に脱蝋した。
（２）９２℃～９６℃の温度で１０分～１５分間抗原マイクロ波賦活化に供し、室温まで自然冷却した。
（３）正常ヤギ血清、３７℃、６０分でブロックした。
（４）過剰の血清を捨て、一次抗体を滴加し、３７℃で２時間又は４℃で一晩静置し、ＰＢＳで５分×３回すすいだ。
（５）フルオレセイン標識二次抗体を滴加し、光から保護し、３７℃で６０分間静置し、０．０１Ｍ ＰＢＳで５分×３回すすいだ。
（６）切片を４℃でクエンチ防止（anti-quenching）封入剤を用いて封入、暗所で保存した。
（７）観察及び撮影には蛍光顕微鏡を用いた。

動物組織からの総タンパク質の抽出
１．遠心分離チューブカラム及び受容チューブカニューレを氷上で予冷した。
２．１５ｍｇ～２０ｍｇの組織を遠心分離チューブカラムに入れ、プラスチック棒で回して５０回～６０回磨砕し、２００μｌの細胞溶解液を加え、３０回～６０回磨砕を続けた。
３．これに蓋をして、室温で１分～２分間インキュベートを行った後に、１４０００ｒｐｍ～１６０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。
４．収集チューブを直ちに氷上に置き、遠心分離チューブカラムを廃棄した。タンパク質抽出が完了した後に、これを－８０℃の冷蔵庫内で凍結保存し、後続の実験において使用することができた。

サスペンションチップシステムによる因子分泌の検出
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。
（２）凍結保存した試料を－８０℃の冷蔵庫から取り出した。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を試料に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランクコントロール、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

結論：
ＥＡＥのスコア結果から、モデル群のマウスの臨床スコアは１５日目に４点に達し、その後安定していることがわかるが、Ｍ細胞治療群のスコアは１５日目にわずか２点であり、それ以来回復しており、実験終了時の３０日目にサンプリングを収集した時点では、スコアは僅か０から１に過ぎなかった。これは、Ｍ細胞の尾静脈注射がＥＡＥマウスに対して明らかな治療効果を有し、その結果、Ｍ細胞が多発性硬化症に対して良好な治療効果を有することを示した（Liming Du, et. al, 2019, Cell Metabolism; Lianhua Bai, et. al, 2012, Nature neuroscience）。

脊髄切片のＨＥ染色及びファストブルー染色（Du, et.al, 2019, Cell Metabolism; Dang, et. al, 2014, Autophagy; Bai, et. al, 2012, Nature neuroscienceを参照されたい）から、Ｍ細胞治療後、脊髄脱髄が有意に減少し、モデル群と比較して有意な差があることがわかった。これは、Ｍ細胞が脊髄脱髄を非常によく軽減し、多発性硬化症にうまく適用できることを示した。

脊髄切片の免疫蛍光画像から、Ｍ細胞治療後、モデル群と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が有意に減少することがわかり、このことはＭ細胞が脊髄の炎症を阻害し、ＥＡＥマウスの脊髄分節性炎症の緩和に対して良好な治療効果を有することを示していた。

モデル群と比較して、Ｍ細胞群ではＧＦＡＰ比が１５％減少し、Ａ２Ｂ５比が１０％増加し、Ｏ４比が３０％増加し、β－チューブリン比が３０％増加し、Ｍ細胞治療が星状細胞の数を減らし、乏突起膠細胞の割合を増加させることができることを示し、またＭ細胞がＥＡＥ病を有するマウスを効果的に治療し、マウスの脱髄を減少させることができることを示唆した。

多因子キットを使用してラットの脊髄分節のタンパク質を検出すると、Ｍ細胞治療後、炎症誘発因子の含有量が有意に減少し、抗炎症因子の含有量が有意に増加し、栄養因子の含有量が有意に増加したことがわかった。その中でも、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、ＴＦＮ－α、及びＩＬ－２の減少が特に顕著であった。抗炎症因子ＩＬ－１０の含有量は有意に増加した。Ｍ細胞が炎症を阻害し、脊髄の微小環境を調節し、多発性硬化症の治療におけるＭ細胞の証拠を提供できることを示した。

結論：Ｍ細胞治療は、ＥＡＥマウスの臨床スコアを下げ、脊髄の脱髄を減らし、星状細胞の増殖を阻害し、乏突起膠細胞を保護し、脊髄分節における炎症誘発因子の含有量を減らすことができた。以上の結果は、Ｍ細胞がＥＡＥ病マウスに対して有効な治療効果を有し得ることを示した。

実施例４３：塵肺症に対するＭ細胞の治療活性の評価
塵肺症は、主に職業活動中の生産性粉塵（灰）の長期吸入及び肺における滞留によって引き起こされる肺組織のびまん性線維症（瘢痕）によって現れる全身性疾患である。塵肺症は、吸入する粉塵の種類に応じて、無機塵肺症及び有機塵肺症に分類され得る。生産労働における無機粉塵の吸入により引き起こされる塵肺症は、無機塵肺症と呼ばれる。塵肺症の大半は無機塵肺症である。綿塵肺症（cotton pneumoconiosis）及び農夫肺等の有機粉塵の吸入による塵肺症は、有機塵肺症と呼ばれる。

塵肺症は進行性の慢性疾患である。短期間で明らかな治療効果が見られる急性感染症又はその他の慢性疾患（例えば、結核、高血圧、糖尿病等）とは異なり、より明白な治癒効果を得るには一般に数年の長期治療が必要である。

多くの動物実験は、塵肺症の治療においてＭＳＣ移植が優れた有効性及び安全性を示すことを示している。しかしながら、成体組織由来ＭＳＣの臨床適用には、主に以下の欠点がある：（１）単一個体の組織からは治療量の成体組織由来のＭＳＣを殆ど得ることができない；（２）異なる個体の組織からの成体組織由来ＭＳＣは、製品品質の高い一貫性を殆ど達成できない；（３）同じ個体の組織に由来するＭＳＣでさえも非常に不均一である；（４）成体組織由来ＭＳＣのドナー組織源は複雑であり、感染性病原体の感染リスクがある；（５）成体組織由来ＭＳＣはｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大に伴って急速に老化する。したがって、塵肺症の治療には新たなＭＳＣ細胞供給源が必要である。

関連文献：
（１）CT/NIRF duaL-modal imaging tracking and therapeutic efficacy of transplanted mesenchymal stem cells labeled with Au nanoparticles in silica-induced pulmonary fibrosis.
（２）Therapeutic effects of adipose-tissue-derived mesenchymal stromal cells and their extracellular vesicles in experimental silicosis.
（３）Transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells attenuates pulmonary fibrosis of silicosis via anti-inflammatory and anti-apoptosis effects in rats.

目的：全身性エリテマトーデスの幹細胞治療のための細胞供給源の欠如を克服すること。

達成された効果：Ｍ細胞の移植後、血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体の増加速度が遅くなり、疾患の経過が遅くなった。

実験動物：Ｃ５７マウス、雄、６週齢～８週齢。動物をBeijing Weitong Lihuaから購入した。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、その後の動物実験に使用した。

動物モデルの構築：
コントロール群：シャム手術を実施し、１ｍＬの生理食塩水を頸部気管に点滴注入した。
モデル群：１ｍＬの８０％シリカ懸濁液を頸部気管に点滴注入し、モデリング後７日目及び２１日目に１００μＬの生理食塩水を尾静脈に注射した。
Ｍ細胞群：８０％シリカ懸濁液１ｍＬを頸部気管から点滴注入し、モデリング後７日目及び２１日目に、３×１０^６細胞／１００μＬ／マウスを尾静脈に注射した。

試料収集：
モデリング後２８日目に実験を終え、試料を収集した。腹腔内麻酔後、マウスを仰臥位に置き、マウスの腹部の中央で皮膚を切って腹腔を開き、中心静脈から採血した。胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。生理食塩水灌流が完了した後、５０ｍＬのパラホルムアルデヒドを用いて固定を実施した。灌流が完了した後、肺を採取し、固定し、切片を作製し、分析した。収集した血液を室温にて５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡ分析のため上清を収集した。

サスペンションチップシステムによる炎症因子の検出：
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。２３種の因子のキットを炎症因子の検出に使用した。
（２）凍結保存した細胞上清を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上に置いた。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を細胞培養上清に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランク、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

免疫組織化学染色：
免疫組織化学キット（Fuzhou Maixin、ＫＩＴ－９７１０）を使用して、パラフィン切片に対して免疫組織化学染色を行った。具体的な手順は次の通りであった：
１．脱蝋：（１）キシレンＩ、ＩＩ、各１０分、（２）勾配アルコール：１００％無水エタノール、２分間、９５％無水エタノール、２分間、８０％無水エタノール、２分間、７０％無水エタノール、２分間。
２．水和：蒸留水で２回、毎回５分（シェーカーに置く）洗浄した。
３．パラフィン切片の脱パラフィン化及び水和後、すすぎをＰＢＳで３回、毎回３分間行った。
４．抗原賦活化溶液（１０ｍＭ ｐＨ６．０クエン酸ナトリウムバッファー）の調製：
（１）原液の調製：溶液Ａ：クエン酸三ナトリウム二水和物２９．４１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ；溶液Ｂ：クエン酸２１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ。
（２）作業液の調製：溶液Ａ８２ｍＬ＋溶液Ｂ１８ｍＬ＋蒸留水９００ｍＬ。
５．抗原賦活化：切片をクエン酸ナトリウムバッファーで満たしたプラスチック製又は耐熱性のガラス容器に入れ、切片を浸漬し、電子レンジでミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間処理し、クエン酸ナトリウムバッファーを補充し、ミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間再び処理を行った。
６．試薬Ａ（ペルオキシダーゼブロッキング溶液）を添加し、室温で１０分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼの活性を遮断し、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
７．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬの試薬Ｂ（正常な非免疫動物血清）を加え、室温で１０分間インキュベートした。
８．血清を廃棄し、１滴又は５０μＬの一次抗体を加え、４℃で一晩又は室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
９．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのビオチン標識二次抗体（試薬Ｃ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１０．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのストレプトアビジンペルオキシダーゼ溶液（試薬Ｄ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１１．ＰＢＳを廃棄し、２滴又は１００μＬの新たに調製したＤＡＢ溶液を加え、顕微鏡下で３分～１０分間観察を行った。
１２．すすぎを水道水で行い、ヘマトキシリンで対比染色を行い、ＰＢＳ又は水道水ですすぎを行って色出しした。
１３．発色にＤＡＢを使用する場合、切片を勾配アルコールで脱水して乾燥させる必要があり、キシレンで透明化を行い、中性樹脂で封入を行った。
１４．顕微鏡で写真を撮影した。

マッソン染色
（１）パラフィン切片を水に脱蝋する：切片をキシレンＩに２０分間、キシレンＩＩに２０分間、無水エタノールＩに１０分間、無水エタノールＩＩに１０分間、９５％アルコールに５分間、９０％アルコールに５分間、８０％アルコールに５分間、７０％アルコールに５分間順次入れ、蒸留水で洗浄した。
（２）核のヘマトキシリン染色：マッソン染色キットでワイゲルトの鉄ヘマトキシリンを用いて５分間染色を行い、水道水で洗浄した後、１％塩酸アルコールで数秒間分別を行い、水道水ですすぎを行い、流水で数分間すすぐことによって色出しした。
（３）ポンソーレッド染色：マッソン染色キットのポンソーレッド・酸フクシン溶液で５分～１０分間染色を行い、蒸留水によるすすぎを迅速に行った。
（４）リンモリブデン酸処理：マッソン染色キットのリンモリブデン酸水溶液による処理を約３分～５分間行った。
（５）アニリンブルー染色：水で洗浄する代わりに、マッソン染色キットのアニリンブルー溶液で５分間対比染色を行った。
（６）分別：１％の氷酢酸による処理を１分間行った。
（７）脱水及び封入：切片を９５％アルコールＩに５分間、９５％アルコールＩＩに５分間、無水エタノールＩに５分間、無水エタノールＩＩに５分間、キシレンＩに５分間、キシレンＩＩに５分間に順次入れて脱水及び透明化を行い、次いで切片をキシレンから取り出し、わずかに風乾させ、中性樹脂で封入した。
（８）顕微鏡で顕微鏡検査を行い、画像を取得して分析した。

実験結果
（１）体重モニタリングの結果は、モデル群の体重はコントロール群及びＭ細胞群よりも有意に低いことを示し、結果は、Ｍ細胞が塵肺症マウスの体重を増加させ得ることを示した。
（２）生存率の統計結果は、塵肺症群の体重がコントロール群及びＭ細胞群の体重よりも有意に低いことを示し、結果は、Ｍ細胞が塵肺症マウスの生存率を改善できることを示した。
（３）ＣＴの結果は、モデル群と比較して、Ｍ細胞が肺密集部の面積を減らすことができることを示した。
（４）肺機能測定の結果は、モデル群と比較して、Ｍ細胞が、肺活量及び最大換気の改善、並びに気道抵抗の低下を含む、肺機能を改善できることを示した。
（５）ＨＥ染色の結果は、モデル群のマウスの肺組織は、典型的な塵肺症のような変化、様々な種類の炎症性細胞浸潤、肺胞壁の肥厚、肺間質性鬱血、細胞結節（肉芽腫）、幾つかの結節の中心における線維症、又は種々のサイズの細胞結節及び繊維状結節の共存、シート状にさえ形成される目に見える結節の漸進的な拡大及び融合、並びに肺胞構造の有意な減少を示すことを示した。モデル群と比較して、Ｍ細胞は炎症細胞の浸潤を減少させ、細胞結節の出現を減少させ、肺胞構造の完全性を維持することができた（図２１４）。
（６）マッソン染色の結果は、Ｍ細胞が肺線維の含有量を減らし、線維症の発生を阻害できることを示した（図８８）。
（７）免疫組織化学的の結果は、Ｍ細胞が肺のコラーゲンＩ及びα－ＳＭＡタンパク質の発現を低下させ、線維症の発生を阻害できることを示した。
（８）マウスの血清中の炎症因子を検出したところ、結果は、塵肺症群と比較して、Ｍ細胞治療群の炎症誘発因子のレベルが有意に低下し、抗炎症因子のレベルが有意に増加したことを示した。Ｍ細胞が炎症を抑える効果を有することが示された。

結論：塵肺症マウスにＭ細胞を注射した後、血清中の炎症因子のレベルが低下し、マウスの肺機能が改善され、肺密集部の面積が減少し、線維症が少なく、塵肺症の治療に良好な効果を示した。同時に、他の呼吸器疾患（例えば、肺線維症、慢性肺閉塞等）に対しても良好な治療可能性を有していた。

実施例４４：慢性肺閉塞に対するＭ細胞の治療活性の評価
実験動物：Ｃ５７マウス、雄、６週齢～８週齢。動物をBeijing Weitong Lihuaから購入した。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、その後の動物実験に使用した。

動物モデルの構築：
コントロール群：シャム手術に供し、頸部気管を通して生理食塩水を点滴注入した。
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）群：手術に供し、頸部気管を通して０．０５Ｕ／体重ｇの膵臓酵素を点滴注入し、モデリング後１日目及び７日目に尾静脈を介して１００μＬの生理食塩水を注射した。
ＣＯＰＤ＋Ｍ細胞群：手術に供し、頸部気管から０．０５Ｕ／体重ｇのトリプシンを点滴注入し、モデリング後１日目及び７日目に尾静脈を介して３×１０^６細胞／１００μＬ／マウスを注射した。

試料収集：
モデリング後２１日目に実験を終え、試料を収集した。腹腔内麻酔後、マウスを仰臥位に置き、マウスの腹部の中央で皮膚を切って腹腔を開き、中心静脈から採血した。胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。生理食塩水灌流が完了した後、５０ｍＬのパラホルムアルデヒドを用いて固定を実施した。灌流が完了した後、肺を採取し、固定し、切片を作製し、分析した。収集した血液を室温にて５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡ分析のため上清を収集した。

サスペンションチップシステムによる炎症因子の検出：
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。２３種の因子のキットを炎症因子の検出に使用した。
（２）凍結保存した細胞上清を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上に置いた。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を細胞培養上清に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランク、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

免疫組織化学染色：
免疫組織化学キット（Fuzhou Maixin、ＫＩＴ－９７１０）を使用して、パラフィン切片に対して免疫組織化学染色を行った。具体的な手順は次の通りであった：
１．脱蝋：（１）キシレンＩ、ＩＩ、各１０分、（２）勾配アルコール：１００％無水エタノール、２分間、９５％無水エタノール、２分間、８０％無水エタノール、２分間、７０％無水エタノール、２分間。
２．水和：蒸留水で２回、毎回５分（シェーカーに置く）洗浄した。
３．パラフィン切片の脱パラフィン化及び水和後、すすぎをＰＢＳで３回、毎回３分間行った。
４．抗原賦活化溶液（１０ｍＭ ｐＨ６．０クエン酸ナトリウムバッファー）の調製：
（１）原液の調製：溶液Ａ：クエン酸三ナトリウム二水和物２９．４１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ；溶液Ｂ：クエン酸２１ｇ＋蒸留水１０００ｍＬ。
（２）作業液の調製：溶液Ａ８２ｍＬ＋溶液Ｂ１８ｍＬ＋蒸留水９００ｍＬ。
５．抗原賦活化：切片をクエン酸ナトリウムバッファーで満たしたプラスチック製又は耐熱性のガラス容器に入れ、切片を浸漬し、電子レンジでミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間処理し、クエン酸ナトリウムバッファーを補充し、ミッドレンジ又はハイレンジの電力で５分間再び処理を行った。
６．試薬Ａ（ペルオキシダーゼブロッキング溶液）を添加し、室温で１０分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼの活性を遮断し、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
７．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬの試薬Ｂ（正常な非免疫動物血清）を加え、室温で１０分間インキュベートした。
８．血清を廃棄し、１滴又は５０μＬの一次抗体を加え、４℃で一晩又は室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
９．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのビオチン標識二次抗体（試薬Ｃ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１０．ＰＢＳを廃棄し、１滴又は５０μＬのストレプトアビジンペルオキシダーゼ溶液（試薬Ｄ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回、毎回３分間すすぎを行った。
１１．ＰＢＳを廃棄し、２滴又は１００μＬの新たに調製したＤＡＢ溶液を加え、顕微鏡下で３分～１０分間観察を行った。
１２．すすぎを水道水で行い、ヘマトキシリンで対比染色を行い、ＰＢＳ又は水道水ですすぎを行って色出しした。
１３．発色にＤＡＢを使用する場合、切片を勾配アルコールで脱水して乾燥させる必要があり、キシレンで透明化を行い、中性樹脂で封入を行った。
１４．顕微鏡で写真を撮影した。

実験結果
（１）ＣＴの結果は、モデル群と比較して、Ｍ細胞が肺部分の面積を減らすことができることを示した。
（２）肺機能測定の結果は、モデル群と比較して、Ｍ細胞は、肺活量及び最大換気の改善、並びに気道抵抗の低下を含む、肺機能を改善できることを示した。
（３）ＨＥ染色結果は、モデル群と比較して、Ｍ細胞が平均肺胞径を減らし、肺の構造的完全性をより良好に維持できることを示した。
（４）血液ガス分析の結果は、モデル群と比較して、Ｍ細胞が動脈血中の酸素分圧を上昇させ得ることを示した。
（５）マウスの血清中の炎症因子を検出した。結果は、塵肺症群と比較して、Ｍ細胞は炎症誘発因子のレベルを下げ、抗炎症因子のレベルを上げることができることを示した。Ｍ細胞が炎症を抑える効果を有することが示された。
（６）免疫組織化学の結果は、Ｍ細胞が肺においてコラーゲンＩ及びα－ＳＭＡタンパク質の発現を低下させ、線維症の発生を阻害できることを示した。

結論：慢性肺閉塞マウスにＭ細胞を注射した後、平均肺胞径が減少し、血清中の炎症因子レベルが低下し、動脈血中の酸素分圧及びマウスの肺機能が高まり、肺密集部の面積が減少し、形成された線維症が少なく、慢性肺閉塞の治療に良好効果があることを示している。同時に、他の呼吸器疾患（例えば、肺線維症、塵肺症等）に対しても良好な治療可能性を有していた。

関連文献：
（１）CT/NIRF dual-modal imaging tracking and therapeutic efficacy of transplanted mesenchymal stem cells labeled with Au nanoparticles in silica-induced pulmonary fibrosis.
（２）Therapeutic effects of adipose to tissue-derived mesenchymal stromal cells and their extracellular vesicles in experimental silicosis.
（３）Transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells attenuates pulmonary fibrosis of silicosis via anti-inflammatory and anti-apoptosis effects in rats.

実施例４５：半月体形成性腎炎に対するＭ細胞の治療活性の評価
腎疾患は、主に原発性糸球体疾患、続発性糸球体腎炎、遺伝性腎臓疾患、尿路感染症腎臓疾患、腎尿細管疾患、間質性腎炎、腎結石及び閉塞性腎症、嚢胞性腎臓疾患及び腎臓腫瘍、腎血管疾患、腎臓関連高血圧、妊娠関連腎臓疾患、高齢腎臓疾患、薬物（食物）誘発性腎損傷、腎不全を含む腎臓関連疾患である。関連する疫学データによると、中国の人口における慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）の発生率は約１１％～１３％であることが示されている。したがって、中国には１億人を超えるＣＫＤ患者がいる。腎臓の複雑な生理学的機能及び独自の組織化特性により、多くの場合、腎臓は損傷を受けやすくなる。

腎炎とは、浮腫、高血圧、腎小体の損傷によるタンパク尿等の腎炎現象を伴う、両方の腎臓の非化膿性炎症性病変を指し、最も一般的なタイプの腎臓疾患である。病因学によると、腎炎は続発性糸球体腎炎と原発性糸球体腎炎に分けることができる。原発性糸球体腎炎は、全入院患者の０．６７％～０．８％を占めている。続発性糸球体腎炎は、他の疾患（糖尿病、高血圧、全身性エリテマトーデス、アレルギー性紫斑病、血管炎等）によって引き起こされ、腎臓が関与する全身性疾患である。臨床分類によれば、腎炎は急性、慢性及び急速に進行する腎炎症候群、潜伏性腎炎（無症候性血尿及び／又はタンパク尿）に分けることができる。慢性腎炎としては、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、膜性腎症、メサンギウム毛細血管糸球体腎炎、及び硬化性腎炎が挙げられる。急速に進行する腎炎の病理学的変化は、糸球体に半月体が形成されることを特徴とし、半月体形成性腎炎としても知られる。

半月体形成性腎炎は、急速進行性腎炎としても知られている。半月体形成性腎炎は、血尿、タンパク尿、浮腫、及び高血圧を主な臨床症状として急速に発症し、急速に乏尿、無尿及び腎不全に発展し、予後不良の糸球体腎炎群の総称である。病因学によると、半月体形成性腎炎は原発性と続発性の２つのカテゴリーに分類され得る。その中でも、原発性半月体形成性腎炎は、抗糸球体基底膜抗体型、免疫複合型、及び病因不明型に分けることができる。続発性半月体形成性腎炎は、膜性増殖性腎炎、膜性腎症、ＩｇＡ腎症（あまり一般的ではない）等の原発性糸球体疾患によって引き起こされ、感染性心内膜炎、連鎖球菌感染後腎炎、潜伏性内臓細菌病変、Ｂ型肝炎及びインフルエンザ等の感染性疾患に続発し、全身性エリテマトーデス、全身性血管炎、肺出血－腎炎症候群、アレルギー性紫斑病、特発性クリオグロブリン血症、悪性腫瘍及び再燃性多発軟骨炎等の他の全身性疾患に続発し得る。

半月体形成性腎炎は、腎臓学において最も重篤な糸球体疾患である。この疾患は急速に進行し、進行が急速で、予後は不良である。臨床症状は急速に進行する糸球体腎炎であり、尿毒症に急速に進行し、病理学的症状は大量の半月体形成である。患者の半数以上がびまん性肺胞出血を合併しており、大量の喀血により窒息及び死に至る可能性がある。現在、最も効果的な治療法は、血漿交換とグルココルチコイドとシクロホスファミドとの併用治療であり、これは腎臓疾患の最も強力な治療法であり、多くの貴重な血液資源及び多大な費用を必要とする。それでも、患者の１年生存率はわずか７０％～８０％で、腎臓の１年生存率はわずか２０％～３０％である［Cui, Z. and M.H. Zhao, Nat Rev Nephrol, 2011. 7(12):697］。殆どの患者は生涯透析に依存するか、又は腎臓移植を受ける。患者の生活の質の低さ及び医療負担の重いことが、腎臓疾患を有する患者の「病気による貧困、病気による貧困への回帰」の大きな要因である。したがって、腎組織の損傷を軽減し、細胞の修復及び構造の再建を促進するために、この疾患の治療における新たなブレークスルーが緊急に必要とされている。

半月体形成性腎炎は典型的な自己免疫性腎臓疾患であり、糸球体疾患における免疫炎症の病因を研究するための理想的な疾患モデルである。その特徴は、患者の末梢血中の抗基底膜（ＧＢＭ）自己抗体が検出され、抗体が腎臓組織の糸球体基底膜に線状の沈着として見えることである。同時に、様々な炎症細胞及び補体系も疾患の発生及び発症に関与しており、これらの細胞から分泌される様々なサイトカインが疾患の調節に関与している。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、多方向分化の可能性だけでなく、生理活性因子の分泌及び免疫調節の機能も備えているため、腎組織の損傷を軽減し、細胞の修復及び構造再建を促進する大きな可能性を秘めている。Furuhashi et al.は、より少ない血清で培養した脂肪由来ＭＳＣが、ラットの半月体形成性腎炎の進行を効果的に緩和できることを見出し［Furuhashi, K., et al, J Am Soc Nephrol, 2013. 24(4):587］、Suzuki et alは、骨髄由来ＭＳＣがラットにおいて抗ＧＢＭ疾患の状態を効果的に緩和できることを見出した［Suzuki, T., et al., PloS One, 2013. 8(6): e67475］。

動物モデル：
実験動物：ＷＫＹラット、雄、４週齢～５週齢、Beijing Weitong Lihua Companyから購入。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢとし、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、Ｐ５世代時にその後の実験に使用した。

動物のモデリング：各ＷＫＹラットに２０μｇの抗ＧＢＭ病原性エピトープＰ１４を足蹠から注射し、疾患の発生を誘導した。群分け：正常群、モデル群、Ｍ細胞治療群。
正常群：治療に供しない。
モデル群：週に３回、３００μｌの生理食塩水を尾静脈に注射した。
Ｍ細胞治療群：週に３回、３×１０^６個のＭ細胞を含む３００μｌの生理食塩水を尾静脈に注射した。

試料収集
標本を収集する際、ラットを腹腔内麻酔後に仰臥位に置き、ラットの腹部の中央で皮膚を切って胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水を灌流した。各ラットには約５０ｍｌの生理食塩水が必要であった。腎臓組織を採取し、その後の分析に供した。

動物組織からの総タンパク質の抽出
１．遠心分離チューブカラム及び受容チューブカニューレを氷上で予冷した。
２．１５ｍｇ～２０ｍｇの組織を遠心分離チューブカラムに入れ、プラスチック棒で回して５０回～６０回磨砕し、２００μｌの細胞溶解液を加え、３０回～６０回磨砕を続けた。
３．これに蓋をして、室温で１分～２分間インキュベートを行った後に、１４０００ｒｐｍ～１６０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。
４．収集チューブを直ちに氷上に置き、遠心分離チューブカラムを廃棄した。タンパク質抽出が完了した後に、これを－８０℃の冷蔵庫内で凍結保存した。

サスペンションチップシステムによる因子分泌の検出
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。
（２）凍結保存した試料を－８０℃の冷蔵庫から取り出した。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を試料に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランクコントロール、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

組織パラフィン切片作製の手順：
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に浸し、一晩固定した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

結果：
モデル群と比較して、Ｍ細胞治療群のラットの腎臓重量は有意に減少し、ラットの尿タンパク質及び血清クレアチニンの検出から、Ｍ細胞注射治療後、ラットの尿タンパク質及び血清クレアチニンがモデル群と比較して有意に減少することがわかり、Ｍ細胞が腎臓の機能を効果的に回復できることを示した。

フローサイトメトリーを使用して、ラットの脾臓及び腎臓においてＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ細胞を検出し、その結果、Ｍ細胞治療後、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７が有意に下方調節され、Ｔｒｅｇ細胞の割合が有意に上方調節され、Ｍ細胞が腎臓の炎症を抑制し、それによってラットの回復を促進できたことを示した。

ラットの腎臓ＨＥ染色の結果は、モデル群が糸球体の重度のフィブリノイド壊死、多数の細胞性半月体（cell crescents）、及び部分的な分節性糸球体硬化症を示したことを示したが、Ｍ細胞治療群は糸球体壊死を発症せず、半月体が少なかったことを示し、このことは、Ｍ細胞治療が、半月体の形成を阻害し、腎臓に対する保護効果を有し、抗ＧＢＭ疾患に対して良好な治療効果を有し得ることを示していた。

腎臓組織切片の免疫組織化学は、Ｍ細胞治療後、腎臓組織内のＩＬ－１β、ＣＤ８、ＥＤ１の細胞の割合が有意に下方調節されたことを示し、このことは、Ｍ細胞が腎臓の炎症を阻害し、ラットの回復を促進できることを示していた。

多因子検出の結果は、Ｍ細胞治療群では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＴＦＮ－α、ｉＮＯＳ等の炎症誘発因子が有意に下方調節され、抗炎症因子ＩＬ－１０が有意に上方調節されていることを示した。半月体形成性腎炎を有するラットでは、Ｍ細胞が炎症を阻害することができ、ラットの腎臓の回復に有益であることが証明された。

結論として、Ｍ細胞治療は、モデルラットの炎症を阻害し、腎臓の炎症を軽減し、ラットにおいて腎機能の回復を促進することができ、Ｍ細胞が半月体形成性腎炎を効果的に治療できることを示した。

実施例４６：全身性エリテマトーデスに対するＭ細胞の治療活性の評価
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は自己免疫疾患であり、その病因はまだ解明されていない。多くの研究が、免疫異常に関連していることを示している。ＳＬＥは、複数の臓器及び系が関与する自己免疫疾患である。ＳＬＥは１５歳～４０歳の女性によく見られる。皮膚症状に加えて、主に腎臓にも臓器の関与があり、腎損傷の臨床症状は４５％～８５％を占めている。グルココルチコイドと免疫抑制療法の併用等の従来の治療法は、ＳＬＥ患者の長期生存率を効果的に改善できるが、一部の患者は依然として治療抵抗性があり、一部の患者は効果がなく、依然として潜在的な死亡リスクがある。現在、ＳＬＥは様々な要因によって引き起こされ、免疫調節の障害及び自己免疫反応の発生につながると考えられている。ＳＬＥの主な病因は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球の異常な活性化に関連していることが研究により示されている。近年、ＭＳＣはＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、及び樹状細胞（ＤＣ）に対して免疫調節作用を有することが多くの研究で示されている。したがって、ＳＬＥは幹細胞疾患であると考える学者もいる。したがって、ＭＳＣはＳＬＥ療法の新たな視点を提供する。

多くの動物実験が、ＭＳＣ移植はＳＬＥの治療において良好な有効性及び安全性を示すことを示している。しかしながら、成体組織由来のＭＳＣの臨床応用には、主に以下の欠点がある：（１）単一個体の組織からは治療量の成体組織由来ＭＳＣを殆ど得ることができない；（２）異なる個体の組織からの成体組織由来ＭＳＣは、製品品質の高い一貫性を殆ど達成できない；（３）同じ個体の組織に由来するＭＳＣでさえも非常に不均一である；（４）成体組織由来ＭＳＣのドナー組織源は複雑であり、感染性病原体の感染リスクがある；（５）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大に伴って、成体組織由来のＭＳＣの急速な老化が起こる。したがって、ＳＬＥの治療には新たなＭＳＣ細胞供給源が必要とされている。

目的：全身性エリテマトーデスの幹細胞治療のための細胞供給源の欠如を克服すること。

達成された効果：Ｍ細胞の移植後、血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体の増加速度が遅くなり、疾患の経過が遅くなった。本発明は、毒性及び副作用がなく、治療後のマウスの死亡率が低く、明らかな治療効果を有する。

実験動物：ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（自然発症したエリテマトーデス症状、ＩＣＲマウスをバックグラウンドコントロールとして使用した）、雌、８週齢。動物をNanjing Junke Biological Engineering Co., Ltd.から購入した。

全ての動物を中国科学院動物学研究所の実験動物センターにおいてＳＰＦグレードで保持し、１週間適応のために飼育した。動物の世話及び使用は中国科学院動物学研究所の実験動物センターによって承認された。動物に関する全ての実験手順を、中国科学院動物学研究所の実験動物福祉倫理委員会の規則に従って実施した。

給餌条件：自由給餌及び飲水；１２／１２時間の昼夜交替、７時～１９時は昼時間、室温は２２±２℃、相対湿度は５０％～６０％であった。

Ｍ細胞の調製及び培養：胚性幹細胞を懸濁してＥＢスフェアを形成し、接着分化に供し、Ｐ０世代のＭ細胞を得て、継代してスクリーニングし、その後の実験用にＰ３世代で凍結保存した。

Ｐ３世代のＭ細胞を蘇生、消化、及び継代し、その後の実験に使用した。

動物モデルの作製：ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（エリテマトーデス症状を自然発症することができた）、
（１）コントロール群：ＩＣＲマウス、（２）モデル群：ＭＲＬ／ｌｐｒ＋生理食塩水；（３）治療群：ＭＲＬ／ｌｐｒ＋Ｍ細胞。治療群のマウスには、２週間ごとに尾静脈を介して３×１０^６細胞／マウスを注射し、合計３回の注射を行った。

１０週齢、１２週齢、１４週齢及び１６週齢にマウスの尾静脈から採血を行い、ＥＬＩＳＡを実施して抗二本鎖ＤＮＡ抗体のレベルを検出した。血清を１８週齢で収集し、腎臓を灌流によって収集した。試料をパラホルムアルデヒドに一晩浸した後、パラフィン切片を作製してＨＥで染色した。

試料収集：
標本を収集する際、腹腔内麻酔後、マウスを仰臥位にし、マウスの腹部の中央で皮膚を切って腹腔を開き、中心静脈から採血した。胸部を開き、心臓を露出させ、心臓を氷冷した生理食塩水で灌流した。生理食塩水の灌流が完了した後、５０ｍｌのパラホルムアルデヒドを用いて固定を実施した。灌流が完了した後、腎臓を採取し、固定し、切片を作製し、分析した。収集した血液を室温にて５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡ分析のため上清を収集した。

ＥＬＩＳＡによる血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体の検出
（１）マウスの尾静脈から血液を採取し、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を採取した（上清を－８０℃の冷蔵庫に保存するか、又は直接検査することができた）。
（２）キットを室温で３０分間平衡にした（balanced）。
（３）標準液の作製：２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、１．２５ｎｇ／ｍｌ、０．６２５ｎｇ／ｍｌ、０．３１２ｎｇ／ｍｌ、０ｎｇ／ｍｌの勾配濃度の標準液を試料希釈剤で調製した。
（４）コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを取り、試験する試料及び標準液をそれぞれ１００μＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。
（５）液体を廃棄し、洗わずにスピンさせて乾燥させた。
（６）１００μＬのビオチン標識抗体を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。
（７）各ウェルに２００μＬの洗浄バッファーを加え、プレートを５回洗浄した。
（８）１００μＬのセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗体を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。
（９）各ウェルに２００μＬの洗浄バッファーを加え、プレートを５回洗浄した。
（１０）９０μＬの基質を各ウェルに加え、暗所で３７℃にて１５分～３０分間インキュベートした。
（１１）色が青く安定した後、各ウェルに５０μＬの停止溶液を加えて反応を停止した。
（１２）４５０ｎｍでのＯＤ値をマイクロプレートリーダーで光学的に測定し、標準曲線を描き、試料中のアルブミン含有量を計算した。

サスペンションチップシステムによる炎症因子の検出：
（１）Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００を起動し、３０分間予熱した。キットを室温で静置し、希釈液、洗浄液、検出液、標準ＨＢ、検出抗体希釈液ＨＢ、試料希釈液ＨＢを室温で静置し、他の試薬を４℃で静置した。４８種の因子のキットを炎症因子の検出に使用した。
（２）凍結保存した細胞上清を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上に置いた。解凍後に、０．５％のＢＳＡ（重量／容量）を細胞培養上清に加えて希釈した。
（３）Ｂｉｏ－ＰｌｅｘシステムをＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）で較正した。
（４）２５０μＬの標準希釈液ＨＢを標準ボトルに加え、５秒間ボルテックスし、直ちに氷上で３０分間インキュベートした（時間は正確でなければならない）。
（５）標準を４倍連続希釈でＳ１からＳ９まで希釈し、ブランクのウェルを準備した。
（６）磁性ビーズを３０秒間ボルテックスすることにより混合し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ検出バッファーで１倍に希釈し、暗所に貯蔵した。
（７）希釈した磁性ビーズをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの磁性ビーズを加えた。
（８）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（９）試料、標準、ブランク、及び既知の濃度のコントロールをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１０）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１１）工程（１０）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、検出抗体を５秒間ボルテックスし、１倍に希釈した。
（１２）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１３）希釈した抗体をボルテックスし、各ウェルに２５０μＬの量で加えた。
（１４）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（１５）標準（キットに付属）、プレート、及び試料の配置情報を入力した。
（１６）工程（１４）において、残り１０分間の振盪時間が残っているときに、ＳＡ－ＰＥ ５をボルテックスし、１倍に希釈した。
（１７）プレートを１００μＬの洗浄液で２回洗浄した。
（１８）希釈したＳＡ－ＰＥをボルテックスし、各ウェルに５０μＬの量で加えた。
（１９）プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて８５０±５０ｒｐｍで室温にて３０分間振盪した。
（２０）プレートを１００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
（２１）磁性ビーズを１２５μＬの検出液で再懸濁し、プレートを封止フィルムで封止し、高振動数シェイカーにおいて室温で８５０±５０ｒｐｍにて３０秒間振盪した。
（２２）封止フィルムを廃棄した後に、機械へのローディングを開始した。

フローサイトメトリーによる脾臓におけるＴ細胞増殖の検出
（１）脾臓を採取し、消化して単一細胞を形成した。
（２）１０００ｒ／分で５分間遠心分離した。
（３）上清を廃棄し、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、セルシーブで濾過して細胞クラスターを除去し、計数し、１チューブ当たり２×１０^６個で小分けにした。
（４）１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
（５）２％ＢＳＡブロッキング溶液で２０分間ブロッキングした後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を実施した。
（６）上清を廃棄し、１００μＬの１％ＢＳＡ抗体希釈液で細胞を再懸濁し、直接標識抗体を添加し、室温で３０分～４５分間インキュベートした。
（７）１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄を実施し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
（８）細胞を３００μＬのＰＢＳに再懸濁した後、４０μｍのセルシーブで濾過し、検出用機械に装入した。

組織パラフィン切片作製の手順
（１）固定：組織を４％ＰＦＡ中に一晩浸した。
（２）洗浄：固定した組織をＰＢＳで３回洗浄した。
（３）試料トリミング：試料を適切なサイズにトリミングし、固定ボックスに入れた。
（４）アルコール勾配脱水：７０％アルコールで１時間、８０％アルコールで１時間、９５％アルコールで１時間、１００％アルコールで４０分間、１００％アルコールで４０分間。
（５）透明化：キシレンＩで２０分間、キシレンＩＩで２０分間。
（６）含浸ワックス：キシレン：パラフィン（１：１）で１時間、パラフィンＩで１時間、パラフィンＩＩで１時間。
（７）包埋。

ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色
（１）パラフィン中に包埋された組織を５μｍの厚さで切片にした。得られた切片を４２℃の切片展開装置において水中で展開して封入し、３７℃のオーブンにおいて一晩乾燥させた。

（２）パラフィン切片の脱蝋及び再水和：
キシレンＩで１０分間、キシレンＩＩで１０分間、１００％アルコールＩで５分間、１００％アルコールＩＩで５分間、９５％アルコールで５分間、８０％アルコールで５分間、７５％アルコールで５分間。毎回５分間にてＰＢＳで３回すすぐ。

（３）染色：
３分間のヘマトキシリン染色の後に顕微鏡下で暗青紫色の核を観察することができ、水道水で染色を止めた。

分別：染色されたパラフィン切片を１％の塩酸－アルコール中で３秒～５秒間分別した。

色出し：色出しを水道水で１５分間行った。

エオシン染色：染色を３分間行った。

脱水及び透明化：勾配脱水にアルコールを使用し、透明化にキシレンを使用した。

スライドへの封入：中性樹脂を用いて切片を封入した。気泡は避けるべきである。スライドを風乾した後に、これらを顕微鏡下で観察した。

３．実験結果
（１）血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体のレベルを２週間ごとに検出した。その結果、週齢の増加に伴い、モデル群及び治療群の抗二本鎖ＤＮＡ抗体レベルは徐々に増加したが、治療群の抗二本鎖ＤＮＡ抗体レベルの上昇はモデル群よりも低いことが示され、このことは、Ｍ細胞の注射が、全身性エリテマトーデスの発症を遅らせる可能性があることを示していた。

各群における血清抗二本鎖ＤＮＡ抗体レベルの検出を図２１３に示した。

（２）解剖学的観察は、モデル群のマウスの脾臓及び頸部リンパ節が著しく肥大していることを示し、このことは全身性炎症を示していた。しかしながら、Ｍ細胞移植群のマウスの脾臓及び頸部リンパ節はわずかに肥大しただけであった。
（３）ＨＥ染色の結果は、Ｍ細胞群における糸球体半月体の形成速度がモデル群よりも高いことを示した。
（４）マウスの血清中の炎症因子を検出した。結果は、モデル群と比較して、Ｍ細胞群の炎症誘発因子のレベルが有意に低下し、抗炎症因子のレベルが有意に増加したことを示した。Ｍ細胞は炎症を抑える効果を有することが示された。
（５）脾臓細胞では、Ｔ細胞集団のフローサイトメトリーの結果、Ｍ細胞群のＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞は全てモデル群よりも有意に低いことが示された。

結論：全身性エリテマトーデスマウスにおけるＭ細胞注射は、抗二本鎖ＤＮＡ抗体及び炎症因子の血清レベルを低下させ、糸球体半月体の形成速度を増加させ、脾臓内のＴ細胞集団の数を減少させることができ、全身性エリテマトーデスの治療におけるより良好な効果を示唆した。同時に、Ｍ細胞注射は、他の自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性血管炎、皮膚筋炎等）に対する良好な治療可能性も有していた。

本発明の特定の実施形態が詳細に説明されるが、当業者は、公開された全ての教示に照らして、詳細に様々な修正及び変更を加えることができること、並びにこれらの変更が全て本発明の範囲内にあることを理解する。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれに相当するものによって与えられる。

Claims (26)

1. 間葉系幹細胞集団であって、初代間葉系幹細胞よりも少なくとも約１０倍高い平均ＭＭＰ１発現レベルを有し、及び／又は初代間葉系幹細胞よりも少なくとも約１０倍高い平均ＰＧＥ２発現レベルを有する、間葉系幹細胞集団。
2. 以下の特徴：
   前記間葉系幹細胞集団が、ＩＦＮ－γによる刺激後に初代間葉系幹細胞よりも高い平均ＰＤ－Ｌ１発現レベルを有するという特徴、好ましくは、前記間葉系幹細胞集団が、ＩＦＮ－γによる刺激後に初代間葉系幹細胞よりも少なくとも２倍高い平均ＰＤ－Ｌ１発現レベルを有するという特徴、
   を有する、請求項１に記載の間葉系幹細胞集団。
3. 前記間葉系幹細胞集団は、ＣＤ２４を発現する細胞を有し、好ましくは、ＣＤ２４^＋細胞の割合は、５０％以上である、請求項１又は２に記載の間葉系幹細胞集団。
4. 前記間葉系幹細胞集団は、以下の特徴：
   （１）ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、及びＨＬＡ－ＡＢＣからなる群から選択される１つ以上を発現する細胞を８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）含むという特徴、
   （２）ＣＸＣＬ１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＦＧＦＲ２、ＣＤ２７１、Ｓｔｒｏ－１、及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１つ以上を発現する細胞を２％以下（例えば、１％以下、０．５％以下、０．２％以下、０．１％以下、又は０．０１％以下）含むという特徴、
   を更に有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞集団。
5. 以下の特徴：
   （１）ＣＤ２７４を発現する細胞を有するという特徴、例えば、ＣＤ２７４^＋細胞の割合が８０％以上であるという特徴、
   （２）ＣＤ３１を発現する細胞を有するという特徴、例えば、ＣＤ３１^＋細胞の割合が５％以上であるという特徴、
   （３）前記間葉系幹細胞集団が、初代間葉系幹細胞よりも高い平均ＩＤＯ発現レベルを有するという特徴、例えば、前記間葉系幹細胞集団が、初代間葉系幹細胞よりも少なくとも約１０倍高い平均ＩＤＯ発現レベルを有するという特徴、
   の１つ以上を更に有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞集団。
6. 前記発現レベルは、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルであり、好ましくは、前記発現レベルは、ｍＲＮＡレベルである、請求項１～５のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞集団。
7. 前記間葉系幹細胞集団は、幹細胞から誘導され、好ましくは、前記幹細胞は、全能性幹細胞又は多能性幹細胞であり、好ましくは、前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞、半数体幹細胞、人工多能性幹細胞、又は成体幹細胞からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞集団。
8. 間葉系幹細胞集団を製造する方法であって、
   （１）第１の培養培地を使用することにより幹細胞を培養して胚様体を形成する工程であって、前記第１の培養培地が、以下の物質：１つ以上の血清代替品、１つ以上の非必須アミノ酸、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及びｂＦＧＦが補充された基礎培地である、工程と、
   （２）第２の培養培地を使用することにより胚様体を培養して、間葉系幹細胞へのその分化を誘導する工程であって、前記第２の培養培地が、以下の物質：１つ以上の血清代替品、１つ以上の非必須アミノ酸、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及び１つ以上の成長因子が補充された基礎培地である、工程と、
   を含み、
   好ましくは、前記方法を使用して、請求項１～７のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞集団が作製される、方法。
9. 前記幹細胞は、全能性幹細胞又は多能性幹細胞であり、好ましくは、前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞、半数体幹細胞、人工多能性幹細胞、又は成体幹細胞からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 前記第１の培養培地は、以下の特徴：
    （ｉ）前記１つ以上の血清代替品が、３％（容量／容量）～３０％（容量／容量）の総含有量を有するという特徴、
    （ｉｉ）前記１つ以上の非必須アミノ酸がそれぞれ、０．１ｍＭ～０．５ｍＭの含有量を有するという特徴、
    （ｉｉｉ）前記グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチドが、１ｍＭ～５ｍＭの含有量を有するという特徴、
    （ｉｖ）前記ｂＦＧＦが、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの含有量を有するという特徴、
    の１つ以上を有する、請求項８又は９に記載の方法。
11. 前記第１の培養培地は、以下の特徴：
    （ａ）前記血清代替品が、ＫＯＳＲ、ＭＳＣ無血清サプリメント、Ｕｌｔｒｏｓｅｒ（商標）Ｇ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されるという特徴、
    （ｂ）前記非必須アミノ酸が、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、及びそれらの組合せからなる群から選択されるという特徴、
    （ｃ）前記基礎培地が、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ １６４０、Ｇ－ＭＥＭ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されるという特徴、好ましくは、前記基礎培地が、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる群から選択されるという特徴、
    の１つ以上を有する、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１の培養培地は、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯＳＲ、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及びｂＦＧＦを含み、
    好ましくは、前記第１の培養培地は、３％（容量／容量）～３０％（容量／容量）のＫＯＳＲ、１ｍＭ～５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及びそれぞれ０．１ｍＭ～０．５ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第１の培養培地は、β－メルカプトエタノールを更に含み、好ましくは、前記β－メルカプトエタノールは、０．１％（容量／容量）～０．５％（容量／容量）の含有量を有する、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記第２の培養培地は、以下の特徴：
    （ｉ）前記１つ以上の血清代替品が、１％（容量／容量）～４０％（容量／容量）の総含有量を有するという特徴、
    （ｉｉ）前記１つ以上の非必須アミノ酸がそれぞれ、０．１ｍＭ～０．５ｍＭの含有量を有するという特徴、
    （ｉｉｉ）前記グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチドが、１ｍＭ～５ｍＭの含有量を有するという特徴、
    （ｉｖ）前記１つ以上の成長因子がそれぞれ、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの含有量を有するという特徴、
    の１つ以上を有する、請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記第２の培養培地は、以下の特徴：
    （ａ）前記血清代替品が、ＫＯＳＲ、ＭＳＣ無血清サプリメント、Ｕｌｔｒｏｓｅｒ（商標）Ｇ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されるという特徴、
    （ｂ）前記非必須アミノ酸が、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、及びそれらの組合せからなる群から選択されるという特徴、
    （ｃ）前記基礎培地が、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ １６４０、Ｇ－ＭＥＭ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されるという特徴、好ましくは、前記基礎培地が、ＫＯ－ＤＭＥＭ、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる群から選択されるという特徴、
    （ｄ）前記１つ以上の成長因子が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、又はＰＤＧＦからなる群から選択されるという特徴、
    の１つ以上を有する、請求項８～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記第２の培養培地は、ＫＯ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２、α－ＭＥＭ、ＭＳＣ無血清サプリメント又はＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇ、ＫＯＳＲ、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＦＧからなる群から選択される１つ以上）を含み、
    好ましくは、前記第２の培養培地は、１％（容量／容量）～１０％（容量／容量）のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、１％（容量／容量）～２０％（容量／容量）のＫＯＳＲ、１ｍＭ～５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、それぞれ１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度の１つ以上の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＦＧからなる群から選択される１つ以上）、及びそれぞれ０．１ｍＭ～０．５ｍＭの濃度の以下のアミノ酸：グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリンを含む、請求項８～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記第２の培養培地は、アスコルビン酸を更に含み、好ましくは、前記アスコルビン酸は、１μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの含有量を有する、請求項８～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記工程（１）は、前記幹細胞を低付着性細胞培養容器において培養することを含む、請求項８～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記工程（２）は、前記胚様体をゼラチン、コラーゲンタイプＩ、コラーゲンタイプＩＶ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、又はポリリジンでコーティングされた培養ディッシュにおいて培養することを含む、請求項８～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記方法は、（３）工程（２）において培養容器に付着した細胞を分離することにより、間葉系幹細胞を得ることを更に含む、請求項８～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記方法は、工程（３）の前記間葉系幹細胞を継代することを更に含み、
    好ましくは、前記細胞を、該細胞が約８０％以上（例えば、約８５％以上、約９０％以上、又は約９５％以上）のコンフルエンスを有するときに継代し、
    好ましくは、前記間葉系幹細胞を、１継代、２継代、３継代、４継代、又は５継代にわたり継代し、
    好ましくは、前記継代は、細胞を前記第２の培養培地に接種して培養することを含む、
    請求項２０に記載の方法。
22. 請求項１～７のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞集団と、培養培地とを含む培養物。
23. 請求項１～７のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞集団を培養培地において培養することによって製造される培養上清である、培養上清。
24. 請求項１～７のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞集団、請求項２２に記載の培養物、又は請求項２３に記載の培養上清と、担体又は賦形剤とを含む組成物であって、
    好ましくは、前記組成物は、注射剤、微量注射剤、粘膜パッチ剤、浣腸剤、坐剤、ゲル剤、経口調剤、エアロゾル剤、ドロップ剤、軟膏剤、インプラント剤、カプセル剤、又はエアロゾル剤であり、
    好ましくは、前記組成物は、注射剤であり、
    好ましくは、前記組成物は、薬学的に許容可能な滅菌の等張の水性又は非水性の溶液、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含み、
    好ましくは、前記組成物は、医薬組成物である、組成物。
25. 第１の培養培地及び第２の培養培地を含むキットであって、
    前記第１の培養培地は、以下の物質：１つ以上の血清代替品、１つ以上の非必須アミノ酸、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及びｂＦＧＦが補充された基礎培地であり、
    前記第２の培養培地は、以下の物質：１つ以上の血清代替品、１つ以上の非必須アミノ酸、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、及び１つ以上の成長因子が補充された基礎培地であり、
    好ましくは、前記第１の培養培地は、請求項１０～１３のいずれか一項に規定された通りであり、
    好ましくは、前記第２の培養培地は、請求項１４～１７のいずれか一項に規定された通りであり、
    好ましくは、前記第１の培養培地及び前記第２の培養培地は、別々に準備される、キット。
26. 被験体における疾患を予防及び／又は治療する医薬の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞集団、請求項２２に記載の培養物、請求項２３に記載の培養上清、又は請求項２４に記載の組成物の使用であって、前記疾患が、骨関節症（例えば、半月板損傷、骨関節炎、又は骨損傷）、生殖器系疾患（例えば、卵巣老化、卵巣不全、子宮内膜損傷、子宮外傷、子宮腔内癒着、又は子宮菲薄化）、心疾患（例えば、心筋梗塞）、肺疾患（例えば、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫障害、塵肺症、又は肺炎）、皮膚疾患（例えば、乾癬、皮膚損傷、褥瘡、圧迫潰瘍、又は火傷）、眼疾患（例えば、角膜損傷）、神経系疾患（例えば、脊髄損傷、脳性麻痺、脳卒中、アルツハイマー病、認知症、又は神経障害性疼痛）、消化器系疾患（例えば、炎症性腸疾患、大腸炎、クローン病、又は過敏性腸症候群）、腎臓疾患（例えば、抗糸球体基底膜疾患、糖尿病性腎症、ループス腎炎、又は急性腎炎）、肝臓疾患（肝臓損傷、肝臓線維症、肝炎、肝硬変、又は肝臓不全）、自己免疫疾患（例えば、強皮症、エリテマトーデス、又は多発性硬化症）、移植拒絶反応（例えば、移植片対宿主病）、代謝性疾患（例えば、糖尿病）からなる群から選択される、使用。

Images