JP2022184911A - 胎盤幹細胞を使用する糖尿病性足部潰瘍の治療 - Google Patents
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Abstract
Description
号、2015年4月10日に出願された米国仮特許出願第62/145,551号、20
15年4月23日に出願された米国仮特許出願第62/151,726号、2015年6
月4日に出願された米国仮特許出願第62/170,757号、及び、2015年9月1
8日に出願された米国仮特許出願第62/220,620号、に対する優先権を主張し、
これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
糖尿病性足部潰瘍(DFU)の治療における、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、
例えば、胎盤幹細胞を使用する方法が、本明細書で提供される。
胎盤は特に、魅力的な幹細胞の供給源である。哺乳動物胎盤は、豊富であり、通常は医
療廃棄物として廃棄されるので、医学的に有用な幹細胞の特有の供給源である。
糖尿病性足部潰瘍(DFU)を治療することを、それを必要とする対象において行う方
法が提供され、該方法は、治療的有効量の組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば
、胎盤幹細胞、例えば、CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細
胞を、対象に投与することを含む。具体的な実施形態では、該胎盤細胞は、医薬組成物と
して製剤化される。
対象は、I型糖尿病に罹患している。別の具体的な実施形態では、本明細書で提供される
方法に従って治療されるDFUを有する対象は、II型糖尿病に罹患している。ある特定
の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療される対象は、1つより多いD
FUを有し、例えば、対象は、片足に1つより多いDFU、または各足に少なくとも1つ
のDFUを有する。具体的な実施形態では、対象は、片足または両足の裏に1つ以上のD
FUを有する。
ニューロパチー、例えば、脚及び/または足の神経のうちの1つ以上への損傷、を有する
。
の末梢血管系に血液の流れの中断を引き起こす状態のDFUを有する。具体的な実施形態
では、対象は、末梢動脈疾患(PAD)を有する。ある特定の実施形態では、該DFUが
、PADに起因及び/または関連する。具体的な実施形態では、対象は、末梢動脈疾患P
ADを有しない。
従って治療された対象において、DFUの1つ以上の症状を検出可能に改善することをも
たらす。DFUの例示的症状としては、脚及び/または下腿の傷、潰瘍、または水疱;脚
(若しくは足)及び/または下腿疼痛;歩行困難;足(または両足)の変色、例えば、足
(または両足)が黒く、青く、及び/または赤く見える:ならびに感染の徴候(例えば、
熱、皮膚の赤み、及び/または腫れ)が挙げられるが、これらに限定されない。
る検出可能な改善のために十分な量及び時間で、DFUを有する対象に、胎盤幹細胞(例
えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)を投与することを含み、改善の該徴候は、(i)潰
瘍サイズの低減;(ii)潰瘍閉鎖:ドレナージまたはドレッシングの必要性のない1つ
以上の潰瘍の皮膚閉鎖;(iii)閉鎖後の特定の期間、例えば、閉鎖後2週間、3週間
、4週間、5週間、または6週間、の潰瘍閉鎖の保持;(iv)潰瘍閉鎖時間の増加;(
v)、対象が静止している間に足首及び腕の血圧を測定し、次に、対象が動いている(例
えば、トレッドミルで歩く)間に繰り返される、PADの重症度を予測/評価するために
使用することができる検査である足関節上腕血圧比(ABI)の改善;(vi)足首血圧
ではなく足趾血圧を使用するABIに類似した検査である足趾上腕血圧比(TBI)の改
善;(vii)経皮酸素レベル、すなわち、潰瘍に近い皮膚の下の組織の酸素レベルの改
善(例えば、Ruangsetakit et al., J Wound Care,
2010, 19(5):202-6を参照のこと);(viii)血液測定用カフ及
び手持ち式超音波装置が、腕及び脚の動脈血流量についての情報を得るために使用される
非侵襲的血管検査である、脈容量記録の改善;(ix)大切断、例えば、足首の上での切
断の時間;(x)評価システム:グレード0(潰瘍性病変の前または後)、グレード1(
部分/全層潰瘍)、グレード2(腱または被膜に達する)、グレード3(骨髄炎を伴う深
部)、グレード4(部分的な足の壊疽)、及びグレード5(全足壊疽)、を使用して、潰
瘍の深さ及び骨髄炎または壊疽の存在を評価するWagnerの評価尺度の改善;(xi
)7つの分類ステージ、すなわちステージ0:無症状、ステージ1:軽度跛行、ステージ
2:中等度跛行、ステージ3:高度跛行、ステージ4:安静時疼痛、ステージ5:足指の
壊疽を超えない虚血性潰瘍形成、及びステージ6:高度虚血性潰瘍または明らかな壊疽、
を有する、末梢動脈疾患のステージングのために使用されるRutherfordの基準
の改善:ならびに、(xii)脚の安静時疼痛スコア、すなわち0が無痛であり、10が
最大の疼痛を表す疼痛の0~10尺度の改善、を含む。
健康調査(SF-36)(例えば、Ware et al., Medical Car
e 30(6):473-483を参照のこと);(ii)糖尿病性足部潰瘍の、生活の
質への影響を測定する糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版(DFS-SF)(例えば、Bann
et al., Pharmacoeconomics, 2003, 21(17)
:1277-90を参照のこと);(iii)経時的なニューロパチーの変化を評価する
ための、変化尺度の患者の全体的印象(例えば、Kamper et al., J.
Man. Manip. Ther., 2009, 17(3):163-170を参
照のこと);ならびに/または、(iv)患者の健康状態に対する記述的プロファイル及
び単一の指標値を得るために使用される健康質問票であるEuroQol5D(EQ-5
D(商標))尺度、で評価される場合の対象の生活の質における検出可能な改善のために
十分な量及び時間で、DFUを有する対象に、胎盤幹細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医
薬組成物)を投与することを含む。
幹細胞を含む医薬組成物)は、注射で投与される。本明細書に記載のDFUの治療方法の
別の具体的な実施形態では、胎盤細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)は、治療
されている対象に、胎盤細胞を含むマトリックスまたは足場の該対象への移植により投与
される。
幹細胞を含む医薬組成物)は、筋肉内投与される。本明細書に記載のDFUの治療方法の
別の具体的な実施形態では、胎盤細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)は、静脈
内投与される。本明細書に記載のDFUの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細
胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)は、皮下投与される。本明細書に記載のDF
Uの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組
成物)は、局所投与される。本明細書に記載のDFUの治療方法の別の具体的な実施形態
では、胎盤細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)は、全身投与される。
胞を含む医薬組成物の一部として)約1×103、3×103、5×103、1×104
、3×104、5×104、1×105、3×105、5×105、1×106、3×1
06、5×106、1×107、3×107、5×107、1×108、3×108、5
×108、1×109、5×109、または1×1010の胎盤細胞の投与を含む。ある
特定の実施形態では、本明細書に記載のDFUの治療方法は、(例えば、胎盤幹細胞を含
む医薬組成物の一部として)約1×103~3×103、3×103~5×103、5×
103~1×104、1×104~3×104、3×104~5×104、5×104~
1×105、1×105~3×105、3×105~5×105、5×105~1×10
6、1×106~3×106、3×106~5×106、5×106~1×107、1×
107~3×107、3×107~5×107、5×107~1×108、1×108~
3×108、3×108~5×108、5×108~1×109、1×109~5×10
9、または5×109~1×1010の胎盤細胞の投与を含む。具体的な実施形態では、
本明細書に記載のDFUの治療方法は、約3×106の胎盤細胞の投与を含む。別の具体
的な実施形態では、本明細書に記載のDFUの治療方法は、約1×107の胎盤細胞の投
与を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のDFUの治療方法は、約3×1
07の胎盤細胞の投与を含む。
盤幹細胞を含む医薬組成物)は、1週間の投与間隔で1回より多く、対象に筋肉内投与さ
れ、例えば、胎盤細胞は1日目(投与の最初の日)に投与され、胎盤幹細胞(例えば、胎
盤幹細胞を含む医薬組成物)の2回目投与が、1週間後(すなわち、8日目)に投与され
る。別の具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日(すなわち、1日目及び8
日目)の、約3×106の胎盤幹細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、方法は
、投与のそれぞれの日(すなわち、1日目及び8日目)の、約1×107の胎盤細胞の投
与を含む。別の具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日(すなわち、3日目
及び8日目)の、約3×107の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、胎
盤細胞は、約1週間の投与間隔で少なくとも3つの異なる機会に、対象に投与される。別
の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞が投与される対象は、PADを有する。
、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)は、1ヶ月の投与間隔で1回より多く、対象に投与され
、例えば、胎盤細胞は1日目(投与の最初の日)に投与され、胎盤幹細胞(例えば、胎盤
幹細胞を含む医薬組成物)の2回目投与が、約1ヶ月後(例えば、27、28、29、3
0、31、32、または33日目)に投与される。具体的な実施形態では、方法は、投与
のそれぞれの日における約3×106の胎盤幹細胞の投与を含む(例えば、3×106胎
盤幹細胞が1日目に投与され、約3×106胎盤幹細胞が1日目から1ヶ月後に、例えば
、27、28、29、30、31、32、または33日目に投与される)。別の具体的な
実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日における約3×107の胎盤細胞の投与を含
む(例えば、3×107胎盤幹細胞が1日目に投与され、約3×107胎盤幹細胞が1日
目から1ヶ月後に、例えば、27、28、29、30、31、32、または33日目に投
与される)。別の具体的な実施形態では、胎盤細胞は、約1ヶ月の投与間隔で少なくとも
3つの異なる機会に、対象に投与される。別の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞が投与
される対象は、PADを有する。
に記載のDFUを治療する方法に従って治療される対象の循環内皮細胞の数が測定される
。本明細書で提供される方法に従って治療される対象の循環内皮細胞の数は、治療中の任
意の時、または治療開始前に測定することができる。例えば、ある特定の実施形態では、
本明細書で提供される方法に従って治療される対象の循環内皮細胞の数は、(i)治療開
始前に(すなわち、胎盤幹細胞が、DFUを有する対象に投与される前に)、例えば、胎
盤幹細胞の投与の日(であるが、投与前)に、治療の開始の1、2、3、4、5、6、7
、8、9、若しくは10日前に、または治療開始の1、2、3、4、若しくは5週後に、
または治療開始の1、2、3、4、5、若しくは6ヶ月後に、及び、(ii)治療中に、
例えば、治療開始の1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10日後に、治療開
始の1、2、3、4、若しくは5週後に、または治療開始の1、2、3、4、5、若しく
は6ヶ月後に少なくとも1回、測定される。治療開始後に、測定される循環内皮細胞の数
が、治療前に測定された循環内皮細胞の数よりも少ない場合、DFUを有する対象の治療
は、有効とみなすことができる。
皮細胞の数は、(i)治療開始後の第1の時点で(すなわち、胎盤幹細胞が、DFUを有
する対象に投与された後に)、例えば、胎盤幹細胞の投与の日(であるが、投与後)に、
治療開始の1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10日後に、または治療開始
の1、2、3、4、若しくは5週後に、または治療開始の1、2、3、4、5、若しくは
6ヶ月後に、及び、(ii)治療開始後の第2の時点で、例えば、治療開始の1、2、3
、4、5、6、7、8、9、若しくは10日後に、治療開始の1、2、3、4、若しくは
5週後に、または治療開始の1、2、3、4、5、若しくは6ヶ月後に測定され、第2の
時点は、第1の時点よりも時間的に後にある。第2の時点の治療で測定された循環内皮細
胞の数は、第2の時点で測定された循環内皮細胞の数よりも少ない場合、DFUを有する
対象の治療は、有効とみなすことができる。
提供され、方法は、(a)対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること;(b)
対象に、1つ以上の用量の胎盤幹細胞を投与すること;及び、(c)胎盤幹細胞の投与後
の、対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること、を含み、胎盤幹細胞の投与前
の循環内皮細胞の数と比較した、胎盤幹細胞の投与後の循環内皮細胞の数の減少は、該対
象のDFUの治療が有効であることを示す。ある特定の実施形態では、対象のDFUの治
療が有効である場合、該対象に、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+
胎盤幹細胞を含む組成物の後続の用量が投与される。
書で提供され、方法は、(a)対象に、1つ以上の用量の胎盤幹細胞を投与すること;(
b)胎盤幹細胞の投与後の第1の時点で、対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定す
ること;及び、(c)胎盤幹細胞の投与後の第2の時点で、対象の血流中を循環する内皮
細胞の数を測定すること、を含み、第1の時点で測定された循環内皮細胞の数と比較した
、第2の時点で測定された循環内皮細胞の数の減少は、該対象のDFUの治療が有効であ
ることを示し、対象のDFUの治療が有効である場合、該対象に、CD10+、CD34
-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞を含む組成物の後続の用量が投与される。あ
る特定の実施形態では、対象のDFUの治療が有効である場合、該対象に、CD10+、
CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞を含む組成物の後続の用量が投与さ
れる。
、例えば、フローサイトメトリーで検出できるようなCD34-、CD10+、CD10
5+、及びCD200+である。本明細書で提供される方法で使用される胎盤細胞のさら
なる特徴は、セクション5.1に記載されている。本明細書で提供される方法で使用され
るべき組成物、例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物は、セクション5.3に記載されて
いる。
本明細書で使用される場合、記載された数値に言及する時の「約」という用語は、記載
された数値の±10%以内の値を示す。
」という用語は、細胞が、血管若しくは血管様発芽を形成することができること、または
、細胞が、別の細胞の集団、例えば、内皮細胞、における血管新生(例えば、血管若しく
は血管様構造の形成)を促進することができることを意味する。
製される、を意味する。例えば、胎盤由来接着細胞は、胎盤から単離される。「由来する
」という用語は、組織、例えば、胎盤、から直接単離された細胞から培養される細胞、及
び初代分離株から培養された、または拡大した細胞を包含する。
単離胎盤幹細胞」などは、幹細胞が由来する組織、例えば、胎盤、の他の異なる細胞から
実質的に分離される細胞を意味する。幹細胞が自然に結合する細胞、例えば、非幹細胞、
または異なるマーカープロファイルを示す幹細胞の少なくとも50%、60%、70%、
80%、90%、95%、または少なくとも99%が、例えば、幹細胞の収集及び/また
は培養中に、幹細胞から除去される場合、細胞は単離される。
組織、例えば、胎盤、の他の細胞から実質的に分離される細胞集団を意味する。
ず、初代分離株または培養された細胞のいずれかとして、例えば、下記セクション5.1
に記載されるように、哺乳動物胎盤から単離される、または、哺乳動物胎盤から単離され
る細胞から培養される幹細胞若しくは前駆細胞を指す。しかし、ある特定の実施形態では
、本明細書で使用される「胎盤細胞」という用語は、栄養芽細胞、細胞性栄養膜細胞、合
胞体栄養膜細胞、アンジオブラスト、ヘマンジオブラスト、胚性生殖細胞、胚性幹細胞、
胚盤胞の内部細胞塊から得られる細胞、または後期胚の生殖巣堤から得られる細胞、例え
ば、胚性生殖細胞を指さない。
て検出できる場合、マーカーに対して「陽性」である。特定のマーカーの検出は、例えば
、抗体の使用、または、マーカーをコードする遺伝子若しくはmRNAの配列に基づくオ
リゴヌクレオチドプローブ若しくはプライマーのいずれかにより達成することができる。
例えば、胎盤細胞は、例えば、CD73が、(例えば、アイソタイプ対照と比較して)バ
ックグラウンドを検出可能に超える量で、胎盤細胞上に検出できるので、CD73に対し
て「陽性」である。また、マーカーが、細胞により提示または発現される時に、少なくと
も1つの他の細胞型と識別するために使用することができる、または、細胞を選択若しく
は単離するために使用することができる場合、細胞は、そのマーカーに対しても陽性であ
る。例えば、抗体を介する検出との関連で、特定の細胞表面マーカーが存在する指標とし
ての「陽性」は、マーカーが、マーカーに特異的な抗体、例えば、蛍光標識抗体を使用し
て検出できることを意味し;「陽性」は、例えば、サイトメーターで、バックグラウンド
を超えて検出できるシグナルを発生させる量のマーカーを示す細胞も指す。例えば、細胞
が、CD200に特異的な抗体で検出可能に標識され、かつ、抗体からのシグナルが、対
照(例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照)のシグナルよりも検出可能に高
い場合、細胞は、「CD200+」である。逆に、同じ文脈における「陰性」は、細胞表
面マーカーが、対照(例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照)と比較して、
マーカーに特異的な抗体を使用して検出できないことを意味する。例えば、細胞が、対照
(例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照)よりも大きい程度に、CD34に
特異的な抗体で、再現可能で検出可能に標識されない場合、細胞は、「CD34-」であ
る。抗体を使用して検出されない、または検出できないマーカーは、適切な対照を使用し
て、同様の仕方で陽性または陰性と判定される。例えば、細胞または細胞の集団由来のR
NAで検出されるOCT-4RNAの量が、例えば、RNAを検出する方法、例えば、R
T-PCR、スロットブロットなど、で測定される場合、バックグラウンドよりも検出可
能に多い時、細胞または細胞の集団は、OCT-4+であると判定することができる。本
明細書において別途記載のない限り、分化抗原群(「CD」)マーカーは、抗体を使用し
て検出される。ある特定の実施形態では、OCT-4が、RT-PCRを使用して検出で
きる場合、OCT-4が存在すると判定され、細胞は「OCT-4+」である。
載の治療方法で治療される哺乳動物を指すために、同じ意味で使用され得る。具体的な実
施形態では、治療されるべき対象は、ヒトである。
方法が本明細書で提供され、該方法は、治療的有効量の組織培養プラスチック接着性胎盤
細胞、例えば、胎盤幹細胞、例えば、CD34-、CD10+、CD105+、CD20
0+胎盤幹細胞を、対象に投与することを含む。具体的な実施形態では、該胎盤細胞は、
医薬組成物として製剤化される。
対象は、I型糖尿病に罹患している。別の具体的な実施形態では、本明細書で提供される
方法に従って治療されるDFUを有する対象は、II型糖尿病に罹患している。ある特定
の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って治療される対象は、1つより多いD
FUを有し、すなわち、対象は、片足に1つより多いDFU、または各足に少なくとも1
つのDFUを有する。具体的な実施形態では、対象は、片足または両足の裏に1つ以上の
DFUを有する。
ニューロパチー、例えば、脚及び/または足の神経のうちの1つ以上への損傷、を有する
。
の末梢血管系に血液の流れの中断を引き起こす状態のDFUを有する。具体的な実施形態
では、対象は、末梢動脈疾患(PAD)を有する。ある特定の実施形態では、該DFUが
、PADに起因及び/または関連する。具体的な実施形態では、対象は、末梢動脈疾患(
PAD)を有しない。
従って治療された対象において、DFUの1つ以上の症状を検出可能に改善することをも
たらす。DFUの例示的症状としては、脚及び/または下腿の傷、潰瘍、または水疱;脚
(若しくは足)及び/または下腿疼痛;歩行困難;足(または両足)の変色、例えば、足
(または両足)が黒く、青く、及び/または赤く見える:ならびに感染の徴候(例えば、
熱、皮膚の赤み、及び/または腫れ)が挙げられるが、これらに限定されない。
る検出可能な改善のために十分な量及び時間で、DFUを有する対象に、胎盤幹細胞(例
えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)を投与することを含み、改善の該徴候は、(i)潰
瘍サイズの低減;(ii)潰瘍閉鎖:ドレナージまたはドレッシングの必要性のない1つ
以上の潰瘍の皮膚閉鎖;(iii)閉鎖後の特定の期間、例えば、閉鎖後2週間、3週間
、4週間、5週間、または6週間、の潰瘍閉鎖の保持;(iv)潰瘍閉鎖までの時間;(
v)対象が静止している間に足首及び腕の血圧を測定し、次に、対象が動いている(例え
ば、トレッドミルで歩く)間に繰り返される、PADの重症度を予測/評価するために使
用することができる検査である足関節上腕血圧比(ABI)の改善;(vi)足首血圧で
はなく足趾血圧を使用するABIに類似した検査である足趾上腕血圧比(TBI)の改善
;(vii)経皮酸素、すなわち、潰瘍に近い皮膚の下の組織の酸素レベルの改善(例え
ば、Ruangsetakit et al., J Wound Care, 201
0, 19(5):202-6を参照のこと);(viii)血液測定用カフ及び手持ち
式超音波装置が、腕及び脚の動脈血流量についての情報を得るために使用される非侵襲的
血管検査である脈容量記録の改善;(ix)大切断、例えば、足首の上での切断、までの
時間;(x)評価システム:グレード0(潰瘍性病変の前または後)、グレード1(部分
/全層潰瘍)、グレード2(腱または被膜に達する)、グレード3(骨髄炎を伴う深部)
、グレード4(部分的な足の壊疽)、及びグレード5(全足壊疽)、を使用して、潰瘍の
深さ及び骨髄炎または壊疽の存在を評価するWagnerの評価尺度の改善;(xi)7
つの分類ステージ:ステージ0:無症状、ステージ1:軽度跛行、ステージ2:中等度跛
行、ステージ3:高度跛行、ステージ4:安静時疼痛、ステージ5:足指の壊疽を超えな
い虚血性潰瘍形成、及びステージ6:高度虚血性潰瘍または明らかな壊疽、を有する、末
梢動脈疾患のステージングのために使用されるRutherfordの基準の改善:なら
びに、(xii)脚の安静時疼痛スコア、0が無痛であり、10が最大の疼痛を表す疼痛
の0~10尺度の改善、を含む。
健康調査(SF-36)(例えば、Ware et al., Medical Car
e 30(6):473-483を参照のこと);(ii)糖尿病性足部潰瘍の、生活の
質への影響を測定する糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版(DFS-SF)(例えば、Bann
et al., Pharmacoeconomics, 2003, 21(17)
:1277-90を参照のこと);(iii)経時的なニューロパチーの変化を評価する
ための、変化尺度の患者の全体的印象(例えば、Kamper et al., J.
Man. Manip. Ther., 2009, 17(3):163-170を参
照のこと);ならびに/または、(iv)患者の健康状態に対する記述的プロファイル及
び単一の指標値を得るために使用される健康質問票であるEuroQol5D(EQ-5
D(商標))尺度、で評価される場合の対象の生活の質における検出可能な改善のために
十分な量及び時間で、DFUを有する対象に、胎盤幹細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医
薬組成物)を投与することを含む。
幹細胞を含む医薬組成物)は、注射で投与される。本明細書に記載のDFUの治療方法の
別の具体的な実施形態では、胎盤細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)は、胎盤
細胞を含むマトリックスまたは足場の対象への移植により治療されている該対象に投与さ
れる。
幹細胞を含む医薬組成物)は、筋肉内投与される。本明細書に記載のDFUの治療方法の
別の具体的な実施形態では、胎盤細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)は、静脈
内投与される。本明細書に記載のDFUの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細
胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)は、皮下投与される。本明細書に記載のDF
Uの治療方法の別の具体的な実施形態では、胎盤細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組
成物)は、局所投与される。本明細書に記載のDFUの治療方法の別の具体的な実施形態
では、胎盤細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物)は、全身投与される。ある特定
の実施形態では、本明細書に記載のDFUの治療方法は、(例えば、胎盤幹細胞を含む医
薬組成物の一部として)約1×103、3×103、5×103、1×104、3×10
4、5×104、1×105、3×105、5×105、1×106、3×106、5×
106、1×107、3×107、5×107、1×108、3×108、5×108、
1×109、5×109、または1×1010の胎盤細胞の投与を含む。ある特定の実施
形態では、本明細書に記載のDFUの治療方法は、(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成
物の一部として)約1×103~3×103、3×103~5×103、5×103~1
×104、1×104~3×104、3×104~5×104、5×104~1×105
、1×105~3×105、3×105~5×105、5×105~1×106、1×1
06~3×106、3×106~5×106、5×106~1×107、1×107~3
×107、3×107~5×107、5×107~1×108、1×108~3×108
、3×108~5×108、5×108~1×109、1×109~5×109、または
5×109~1×1010の胎盤細胞の投与を含む。具体的な実施形態では、本明細書に
記載のDFUの治療方法は、約3×103の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形
態では、本明細書に記載のDFUの治療方法は、約3×104の胎盤細胞の投与を含む。
別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のDFUの治療方法は、約3×105の胎盤
細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のDFUの治療方法は、
約3×106の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載のD
FUの治療方法は、約1×107の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、
本明細書に記載のDFUの治療方法は、約3×107の胎盤細胞の投与を含む。
盤幹細胞を含む医薬組成物)は、1週間の投与間隔で筋肉内投与され、例えば、胎盤細胞
は1日目(投与の最初の日)に投与され、胎盤幹細胞(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組
成物)の2回目投与が、1週間後(すなわち、8日目)に投与される。別の具体的な実施
形態では、方法は、投与のそれぞれの日(すなわち、1日目及び8日目)の、約3×10
6の胎盤幹細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日
(すなわち、1日目及び8日目)の、約1×107の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的
な実施形態では、方法は、投与のそれぞれの日(すなわち、3日目及び8日目)の、約3
×107の胎盤細胞の投与を含む。別の具体的な実施形態では、胎盤幹細胞が投与される
対象は、PADを有する。
、例えば、フローサイトメトリーで検出できるようなCD34-、CD10+、CD10
5+、及びCD200+である。本明細書で提供される方法で使用される胎盤細胞のさら
なる特徴は、セクション5.1に記載されている。本明細書で提供される方法で使用され
るべき組成物、例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物は、セクション5.3に記載されて
いる。
本明細書ではPDACと称される場合がある、本明細書で提供されるDFUの治療方法
に有用である単離胎盤細胞は、胎盤またはその一部から得ることができ、組織培養基質に
接着し、多分化能細胞または幹細胞の特徴を有するが、栄養芽細胞ではない。ある特定の
実施形態では、本明細書に開示の方法に有用である単離胎盤細胞は、非胎盤細胞型に分化
する能力を有する。
であることができる(つまり、それぞれ、胎児または母親のいずれかの遺伝子型を有する
ことができる)。好ましくは、単離胎盤細胞及び単離胎盤細胞の集団は、由来が胎児であ
る。本明細書で使用される場合、「由来が胎児」または「由来が非母体」という表現は、
単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団が、胎児に関連する、すなわち、胎児遺伝子型を
有する、臍帯または胎盤構造から得られることを示す。本明細書で使用される場合、「由
来が母体」という表現は、細胞または細胞の集団が、母親と関連する、例えば、母体遺伝
子型を有する、胎盤構造体から得られることを示す。単離胎盤細胞、例えば、PDACま
たは単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、胎児若しくは母体単独である単離胎盤細胞を含む
ことができる、または胎児由来及び母体由来の両方の単離胎盤細胞の混合集団を含むこと
ができる。単離胎盤細胞、及び単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、以下で論じる形態的特
徴、マーカー特徴、及び培養特徴により特定及び選択することができる。ある特定の実施
形態では、本明細書に記載の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞、の
いずれも、レシピエント、例えば、DFUを有する個体、にとって自己由来である。他の
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多
分化能細胞、のいずれも、レシピエント、例えば、DFUを有する個体、にとって異種で
ある。
本明細書に記載の単離胎盤細胞(PDAC)は、初代培養または細胞培養で培養される
時、組織培養基質、例えば、培養容器表面(例えば、組織培養プラスチック)に、または
、ラミニン、コラーゲン(例えば、天然若しくは変性)、ゼラチン、フィブロネクチン、
オルニチン、ビトロネクチン、及び細胞外膜タンパク質(例えば、MATRIGEL(登
録商標)(BD Discovery Labware、マサチューセッツ州ベッドフォ
ード))などの細胞外マトリックス若しくはリガンドでコーティングされた組織培養表面
に、接着する。培養中の単離胎盤細胞は一般に、中心細胞体から延びる多くの細胞質突起
を有する、線維芽細胞様星状外観を呈する。しかし、単離胎盤細胞は、線維芽細胞よりも
多数のこのような突起を示すので、細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞と形態学
的に識別できる。形態学的に、単離胎盤細胞はまた、培養中に、より丸みのある、または
丸石の形態を一般に呈する造血幹細胞と識別できる。
地中で培養される時、胚様体様体を発達させる。胚様体様体は、増殖した単離胎盤細胞の
接着層の上部で成長することができる細胞の非連続的な塊である。細胞の塊が、胚性幹細
胞の培養物から成長する細胞の塊である胚様体に似ているので、「胚様体様」という用語
が、使用される。胚様体様体が、単離胎盤細胞の増殖培養物中で発生することができる成
長培地は、例えば、DMEM-LG(例えば、Gibco製);2%のウシ胎児血清(例
えば、Hyclone Labs.製);1×インスリン-トランスフェリン-セレン(
ITS);1×リノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA);10-9Mのデキサ
メタゾン(例えば、Sigma製);10-4Mのアスコルビン酸2-ホスフェート(例
えば、Sigma製);上皮成長因子10ng/mL(例えば、R&D Systems
製);及び、血小板由来成長因子(PDGF-BB)10ng/mL(例えば、R&D
Systems製)、を含む培地を含む。
本明細書の開示の方法、例えば、対象のDFUの治療方法、に有用な単離胎盤細胞、例
えば、単離多分化能胎盤細胞または単離胎盤幹細胞、及びこのような単離胎盤細胞の集団
は、多分化能細胞または幹細胞の特徴を有する組織培養プラスチック接着ヒト胎盤細胞で
あり、幹細胞を含む細胞または細胞の集団を特定及び/または単離するために使用するこ
とができる複数のマーカーを発現する。ある特定の実施形態では、PDACは、例えば、
インビトロまたはインビボの血管新生性である。本明細書に記載の単離胎盤細胞、及び胎
盤細胞集団(つまり、2つ以上の単離胎盤細胞)は、胎盤またはそれらの任意の部分(例
えば、絨毛膜、胎盤絨毛叢など)から直接得られる胎盤細胞及び胎盤細胞含有細胞集団を
含む。単離胎盤細胞集団は、培養中の単離胎盤細胞の複数集団(つまり、2つ以上)、及
び容器、例えば、バッグ中の集団も含む。本明細書に記載の単離胎盤細胞は、臍帯血、胎
盤血、または末梢血から得られる骨髄由来間葉系細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、または間
葉系細胞ではない。本明細書に記載の方法及び組成物に有用な胎盤細胞、例えば、胎盤多
分化能細胞及び胎盤細胞は、本明細書、及び例えば、米国特許第7,311,904号、
同第7,311,905号、及び同第7,468,276号、ならびに米国特許公開公報
第2007/0275362号に記載されており、これらの開示は、その全体が本明細書
で参照により組み込まれる。
施形態では、単離胎盤細胞は、単離胎盤多分化能細胞である。一実施形態では、単離胎盤
細胞、例えば、PDACは、フローサイトメトリーで検出されるようなCD34-、CD
10+及びCD105+である。別の具体的な実施形態では、単離CD34-、CD10
+、CD105+胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、及び/または軟
骨形成表現型の細胞に分化する可能性がある。別の具体的な実施形態は、単離CD34-
、CD10+、CD105+胎盤細胞はさらに、CD200+である。別の具体的な実施
形態では、単離CD34-、CD10+、CD105+胎盤細胞はさらに、CD45-ま
たはCD90+である。別の具体的な実施形態では、単離CD34-、CD10+、CD
105+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなCD45-及びC
D90+である。別の具体的な実施形態では、単離CD34-、CD10+、CD105
+、CD200+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなCD90
+またはCD45-である。別の具体的な実施形態では、単離CD34-、CD10+、
CD105+、CD200+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるよう
なCD90+及びCD45-であり、すなわち、細胞は、CD34-、CD10+、CD
45-、CD90+、CD105+及びCD200+である。別の具体的な実施形態は、
該CD34-、CD10+、CD45-、CD90+、CD105+、CD200+細胞
はさらに、CD80-及びCD86-である。
D34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、ならびに、CD38-、CD
45-、CD80-、CD86-、CD133-、HLA-DR,DP,DQ-、SSE
A3-、SSEA4-、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105
+、HLA-A,B,C+、PDL1+、ABC-p+、及び/またはOCT-4+のう
ちの1つ以上である。他の実施形態では、上記CD34-、CD10+、CD105+細
胞のいずれもさらに、CD29+、CD38-、CD44+、CD54+、SH3+、ま
たはSH4+のうちの1つ以上である。別の具体的な実施形態では、細胞はさらに、CD
44+である。上記単離CD34-、CD10+、CD105+胎盤細胞のいずれの別の
具体的な実施形態でも、細胞はさらに、CD117-、CD133-、KDR-(VEG
FR2-)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-、若しくはプログラム
死1リガンド(PDL1)+のうちの1つ以上、またはそれらの任意の組み合わせである
。
、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD6
2E-、CD62L-、CD62P-、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+
)、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/V
CAM+、CD117-、CD144/VEカドヘリンlow、CD184/CXCR4
-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC
-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,D
R-、HLA-G-、若しくはプログラム死1リガンド(PDL1)+のうちの1つ以上
、またはそれらの任意の組み合わせである。他の実施形態では、CD34-、CD10+
、CD105+細胞はさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD
44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P
-、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD
90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD14
4/VEカドヘリンlow、CD184/CXCR4-、CD200+、CD133-、
OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-
)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-、HLA-G-、及びプログラ
ム死1リガンド(PDL1)+である。
イトメトリーで検出されるようなABC-p+、またはRT-PCRで測定されるような
OCT-4+(POU5F1+)であり、ABC-pは、(乳癌耐性タンパク質(BCR
P)及びミトキサントロン耐性タンパク質(MXR)としても知られている)胎盤特異的
ABCトランスポータータンパク質であり、OCT-4は、オクタマー4タンパク質(P
OU5F1)である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞のいずれも
、さらに、フローサイトメトリーで測定されるようなSSEA3-またはSSEA4-で
あり、SSEA3は、ステージ特異的胚抗原3であり、SSEA4は、ステージ特異的胚
抗原4である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載の胎盤細胞のいずれも、さら
に、SSEA3-及びSSEA4-である。
I+(例えば、HLA-A,B,C+)、MHC-II-(例えば、HLA-DP,DQ
,DR-)、またはHLA-G-のうちの1つ以上である。別の具体的な実施形態では、
本明細書に記載の胎盤細胞のいずれも、さらに、MHC-I+(例えば、HLA-A,B
,C+)、MHC-II-(例えば、HLA-DP,DQ,DR-)、及びHLA-G-
のうちの1つ以上である。
胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団、例えば、胎盤細胞の集団、も本明
細書で提供される。単離胎盤細胞を含む細胞の集団が好ましく、細胞の集団が、例えば、
少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%
、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または
98%の単離CD10+、CD105+、及びCD34-胎盤細胞を含む、つまり、該集
団中の細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、4
5%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、9
5%、または98%が、単離CD10+、CD105+、及びCD34-胎盤細胞である
。具体的な実施形態では、単離CD34-、CD10+、CD105+胎盤細胞はさらに
、CD200+である。別の具体的な実施形態では、単離CD34-、CD10+、CD
105+、CD200+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなC
D90+またはCD45-である。別の具体的な実施形態では、単離CD34-、CD1
0+、CD105+、CD200+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出され
るようなCD90+及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、上記単離CD3
4-、CD10+、CD105+胎盤細胞のいずれも、さらに、CD29+、CD38-
、CD44+、CD54+、SH3+、またはSH4+のうちの1つ以上である。別の具
体的な実施形態では、単離CD34-、CD10+、CD105+胎盤細胞または単離C
D34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤細胞はさらに、CD44+であ
る。上記単離CD34-、CD10+、CD105+胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれ
の具体的な実施形態においても、単離胎盤細胞はさらに、CD13+、CD29+、CD
33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD62E-、CD62L
-、CD62P-、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、C
D86-、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD11
7-、CD144/VEカドヘリンlow、CD184/CXCR4-、CD200+、
CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(
VEGFR2-)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-、HLA-G-
、若しくはプログラム死1リガンド(PDL1)+のうちの1つ以上、またはそれらの任
意の組み合わせである。別の具体的な実施形態では、CD34-、CD10+、CD10
5+細胞はさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、C
D45-、CD54/ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3
+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、S
H2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VEカ
ドヘリンlow、CD184/CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4
+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA
-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-、HLA-G-、及びプログラム死1リガ
ンド(PDL1)+である。
CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54
+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT
-4+、及びABC-p+のうちの1つ以上、または全てであり、該単離胎盤細胞は、胎
盤組織の物理的及び/または酵素的破壊により得られる。具体的な実施形態では、単離胎
盤細胞は、OCT-4+及びABC-p+である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤
細胞は、OCT-4+及びCD34-であり、該単離胎盤細胞は、次の特徴のうちの少な
くとも1つを有する:CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、
CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及びSSEA4-。別の具体的な実施
形態では、単離胎盤細胞は、OCT-4+、CD34-、CD10+、CD29+、CD
44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及
びSSEA4-である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、OCT-4+、CD34-
、SSEA3-、及びSSEA4-である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は
、OCT-4+及びCD34-であり、SH2+またはSH3+のいずれかである。別の
具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、OCT-4+、CD34-、SH2+、及びS
H3+である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、OCT-4+、CD34-
、SSEA3-、及びSSEA4-であり、SH2+またはSH3+のいずれかである。
別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、OCT-4+及びCD34-であり、SH
2+またはSH3+のいずれかであり、CD10+、CD29+、CD44+、CD45
-、CD54+、CD90+、SSEA3-、またはSSEA4-のうちの少なくとも1
つである。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、OCT-4+、CD34-、C
D10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SSEA3
-、及びSSEA4-であり、SH2+またはSH3+のいずれかである。
+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+である。別の具体的な実施形態では、単離胎
盤細胞は、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、CD34-
、CD45-、SSEA3-、またはSSEA4-である。別の実施形態では、単離胎盤
細胞は、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及びSSEA4-である。別の
具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-
、及びSSEA4-、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、
OCT-4+、CD34-、またはCD45-である。
0+、CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、S
H2+、SH3+、及びSH4+であり、該単離胎盤細胞はさらに、OCT-4+、SS
EA3-、またはSSEA4-のうちの1つ以上である。
CD200+またはHLA-G-である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、CD
200+及びHLA-G-である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらに、
CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらに
、CD34-、CD38-、またはCD45-である。別の具体的な実施形態では、単離
胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施
形態では、該幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、及びCD1
05+である。別の具体的な実施形態では、該単離CD200+またはHLA-G-胎盤
細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団中
での胚様体様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、幹細
胞または多分化能細胞でない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単
離胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
+、HLA-G-幹細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団である。具体
的な実施形態では、該集団は、胎盤細胞の集団である。種々の実施形態では、該細胞集団
中の細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも
約40%、少なくとも約50%、または少なくとも約60%は、単離CD200+、HL
A-G-胎盤細胞である。好ましくは、該細胞集団中の細胞の少なくとも約70%は、単
離CD200+、HLA-G-胎盤細胞である。より好ましくは、該細胞の少なくとも約
90%、95%、または99%は、単離CD200+、HLA-G-胎盤細胞である。細
胞集団の具体的な実施形態では、該単離CD200+、HLA-G-胎盤細胞はまた、C
D73+及びCD105+である。別の具体的な実施形態では、該単離CD200+、H
LA-G-胎盤細胞はまた、CD34-、CD38-、またはCD45-である。別の具
体的な実施形態では、該単離CD200+、HLA-G-胎盤細胞はまた、CD34-、
CD38-、CD45-、CD73+、及びCD105+である。別の実施形態では、該
細胞集団は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、1つ以上の胚様体様
体を生じる。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単
離される。別の具体的な実施形態では、該単離CD200+、HLA-G-胎盤細胞は、
これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
3+、CD105+、及びCD200+である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細
胞は、HLA-G-である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、CD34-、
CD38-、またはCD45-である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、C
D34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細
胞は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G-である。別の具体的な実
施形態では、単離CD73+、CD105+、及びCD200+胎盤細胞は、単離胎盤細
胞を含む胎盤細胞の集団中で、集団が胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される
時、1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細
胞は、単離胎盤細胞でない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、単離胎
盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
3+、CD105+、CD200+胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞
の集団である。種々の実施形態では、該細胞集団中の細胞の少なくとも約10%、少なく
とも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、または
少なくとも約60%は、単離CD73+、CD105+、CD200+胎盤細胞である。
別の実施形態では、細胞の該集団中の該細胞の少なくとも約70%は、単離CD73+、
CD105+、CD200+胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞
の少なくとも約90%、95%、または99%は、単離CD73+、CD105+、CD
200+胎盤細胞である。該集団の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、HLA-G
-である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-
、またはCD45-である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらに、CD3
4-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は
さらに、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G-である。別の具体的な
実施形態では、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、細胞の該集団は、
1つ以上の胚様体様体を生じる。別の具体的な実施形態では、胎盤細胞の該集団は、幹細
胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、胎盤細胞の該集団は、
これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+
、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、HLA-G-、またはABC
-p+のうちの1つ以上である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、CD10+、
CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90
+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、及びOCT-4+で
ある。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、CD10+、CD29+、CD34
-、CD38-、CD45-、CD54+、SH2+、SH3+、及びSH4+である。
別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、C
D38-、CD45-、CD54+、SH2+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+
である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、CD10+、CD29+、CD3
4-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、HLA-G-、
SH2+、SH3+、SH4+である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、O
CT-4+及びABC-p+である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、SH
2+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+である。別の実施形態では、単離胎盤細胞
は、OCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-である。具体的な実施
形態では、該単離OCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-胎盤細胞
はさらに、CD10+、CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD54+
、CD90+、SH2+、SH3+、及びSH4+である。別の実施形態では、単離胎盤
細胞は、OCT-4+及びCD34-、ならびにSH3+またはSH4+のいずれかであ
る。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、CD34-、及びCD10+、CD29+、C
D44+、CD54+、CD90+、またはOCT-4+のいずれかである。
00+及びOCT-4+である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、CD73+及
びCD105+である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、HLA-G-で
ある。別の具体的な実施形態では、該単離CD200+、OCT-4+胎盤細胞は、CD
34-、CD38-、またはCD45-である。別の具体的な実施形態では、該単離CD
200+、OCT-4+胎盤細胞は、CD34-、CD38-、及びCD45-である。
別の具体的な実施形態では、該単離CD200+、OCT-4+胎盤細胞は、CD34-
、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+、及びHLA-G-である。別の
具体的な実施形態では、単離CD200+、OCT-4+胎盤細胞は、単離細胞を含む胎
盤細胞の集団による1つ以上の胚様体様体の産生を、集団が、胚様体様体の形成を可能に
する条件下で培養される時、容易にする。別の具体的な実施形態では、該単離CD200
+、OCT-4+胎盤細胞は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実
施形態では、該単離CD200+、OCT-4+胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎
盤細胞から単離される。
+、OCT-4+胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団である。種
々の実施形態では、該細胞集団中の細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少
なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、または少なくとも約60
%は、単離CD200+、OCT-4+胎盤細胞である。別の実施形態では、該細胞の少
なくとも約70%は、該単離CD200+、OCT-4+胎盤細胞である。別の実施形態
では、該細胞集団中の細胞の少なくとも約80%、90%、95%、または99%は、該
単離CD200+、OCT-4+胎盤細胞である。単離集団の具体的な実施形態では、該
単離CD200+、OCT-4+胎盤細胞はさらに、CD73+及びCD105+である
。別の具体的な実施形態では、該単離CD200+、OCT-4+胎盤細胞はさらに、H
LA-G-である。別の具体的な実施形態では、該単離CD200+、OCT-4+胎盤
細胞はさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施形態
では、該単離CD200+、OCT-4+胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、
CD45-、CD73+、CD105+、及びHLA-G-である。別の具体的な実施形
態では、細胞集団は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、1つ以上の
胚様体様体を生じる。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、単離CD200+、O
CT-4+胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該細
胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
3+、CD105+、及びHLA-G-である。別の具体的な実施形態では、単離CD7
3+、CD105+、及びHLA-G-胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、ま
たはCD45-である。別の具体的な実施形態では、単離CD73+、CD105+、H
LA-G-胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、またはCD45-である。別の
具体的な実施形態では、単離CD73+、CD105+、HLA-G-胎盤細胞はさらに
、OCT-4+である。別の具体的な実施形態では、単離CD73+、CD105+、H
LA-G-胎盤細胞はさらに、CD200+である。別の具体的な実施形態では、単離C
D73+、CD105+、HLA-G-胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、C
D45-、OCT-4+、及びCD200+である。別の具体的な実施形態では、単離C
D73+、CD105+、HLA-G-胎盤細胞は、該細胞を含む胎盤細胞の集団での胚
様体様体の形成を、集団が胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、容易に
する。別の具体的な実施形態では、該単離CD73+、CD105+、HLA-G-胎盤
細胞は、単離CD73+、CD105+、HLA-G-胎盤細胞ではない胎盤細胞から単
離される。別の具体的な実施形態では、該単離CD73+、CD105+、HLA-G-
胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
3+、CD105+、及びHLA-G-胎盤細胞を含む、例えば、これらが豊富である、
細胞の集団である。種々の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約10%、
少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、
または少なくとも約60%は、単離CD73+、CD105+、HLA-G-胎盤細胞で
ある。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約70%は、単離CD73
+、CD105+、HLA-G-胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の
細胞の少なくとも約90%、95%、または99%は、単離CD73+、CD105+、
HLA-G-胎盤細胞である。上記集団の具体的な実施形態では、該単離CD73+、C
D105+、HLA-G-胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、またはCD45
-である。別の具体的な実施形態では、該単離CD73+、CD105+、HLA-G-
胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施
形態では、該単離CD73+、CD105+、HLA-G-胎盤細胞はさらに、OCT-
4+である。別の具体的な実施形態では、該単離CD73+、CD105+、HLA-G
-胎盤細胞はさらに、CD200+である。別の具体的な実施形態では、該単離CD73
+、CD105+、HLA-G-胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、CD45
-、OCT-4+、及びCD200+である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は
、CD73+、CD105+、HLA-G-胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。
別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単
離される。
3+及びCD105+であり、該CD73+、CD105+細胞を含む単離胎盤細胞の集
団での1つ以上の胚様体様体の形成を、該集団が胚様体様体の形成を可能にする条件下で
培養される時、容易にする。別の具体的な実施形態では、該単離CD73+、CD105
+胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、またはCD45-である。別の具体的な
実施形態では、該単離CD73+、CD105+胎盤細胞はさらに、CD34-、CD3
8-、及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、該単離CD73+、CD10
5+胎盤細胞はさらに、OCT-4+である。別の具体的な実施形態では、該単離CD7
3+、CD105+胎盤細胞はさらに、OCT-4+、CD34-、CD38-、及びC
D45-である。別の具体的な実施形態では、該単離CD73+、CD105+胎盤細胞
は、該細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離CD7
3+、CD105+胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
、CD105+であり、該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時
、該細胞を含む単離胎盤細胞の集団での1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする単離胎
盤細胞を含む、例えば、これらが豊富である、細胞の集団である。種々の実施形態では、
細胞の該集団中の細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%
、少なくとも約40%、少なくとも約50%、または少なくとも約60%は、該単離CD
73+、CD105+胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少な
くとも約70%は、該単離CD73+、CD105+胎盤細胞である。別の実施形態では
、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約90%、95%、または99%は、該単離CD7
3+、CD105+胎盤細胞である。上記集団の具体的な実施形態では、該単離CD73
+、CD105+胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、またはCD45-である
。別の具体的な実施形態では、該単離CD73+、CD105+胎盤細胞はさらに、CD
34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、該単離CD7
3+、CD105+胎盤細胞はさらに、OCT-4+である。別の具体的な実施形態では
、該単離CD73+、CD105+胎盤細胞はさらに、CD200+である。別の具体的
な実施形態では、該単離CD73+、CD105+胎盤細胞はさらに、CD34-、CD
38-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+である。別の具体的な実施形態で
は、該細胞集団は、該単離CD73+、CD105+胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離
される。別の具体的な実施形態では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細
胞から単離される。
-4+であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該細胞を含む単離
胎盤細胞の集団での1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、
該単離OCT-4+胎盤細胞はさらに、CD73+及びCD105+である。別の具体的
な実施形態では、該単離OCT-4+胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、また
はCD45-である。別の具体的な実施形態では、該単離OCT-4+胎盤細胞はさらに
、CD200+である。別の具体的な実施形態では、該単離OCT-4+胎盤細胞はさら
に、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45
-である。別の具体的な実施形態では、該単離OCT-4+胎盤細胞は、OCT-4+胎
盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離OCT-4
+胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
+であり、該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該細胞を含
む単離胎盤細胞の集団での1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする単離胎盤細胞を含む
、例えば、これらが豊富である、細胞の集団である。種々の実施形態では、細胞の該集団
中の細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも
約40%、少なくとも約50%、または少なくとも約60%は、該単離CD73+、CD
105+胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約70
%は、該単離OCT-4+胎盤細胞である。別の実施形態では、細胞の該集団中の細胞の
少なくとも約80%、90%、95%、または99%は、該単離OCT-4+胎盤細胞で
ある。上記集団の具体的な実施形態では、該単離OCT-4+胎盤細胞はさらに、CD3
4-、CD38-、またはCD45-である。別の具体的な実施形態では、該単離OCT
-4+胎盤細胞はさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的
な実施形態では、該単離OCT-4+胎盤細胞はさらに、CD73+及びCD105+で
ある。別の具体的な実施形態では、該単離OCT-4+胎盤細胞はさらに、CD200+
である。別の具体的な実施形態では、該単離OCT-4+胎盤細胞はさらに、CD73+
、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の
具体的な実施形態では、該細胞集団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具
体的な実施形態では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離され
る。
LA-A,B,C+、CD45-、CD133-、及びCD34-胎盤細胞である。別の
実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、単離胎盤細胞を含
む細胞の集団であり、細胞の該単離集団中の細胞の少なくとも約70%、少なくとも約8
0%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%は、単離H
LA-A,B,C+、CD45-、CD133-、及びCD34-胎盤細胞である。具体
的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、HLA-A,B,C+
、CD45-、CD133-、及びCD34-胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される
。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が非母体である。別の具体的な実
施形態では、胎盤細胞の該単離集団は、母体成分を実施的に含まない、例えば、胎盤細胞
の該単離集団での該細胞の少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65
%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%、または99%は、由来
が非母体である。
D10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-、及びCD133-胎盤
細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、
単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、細胞の該集団中の細胞の少なくとも約70%、少
なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99
%は、単離CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-、及びCD
133-胎盤細胞である。具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の
集団は、該単離胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、
該単離CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-、及びCD13
3-胎盤細胞は、由来が非母体であり、すなわち、胎児遺伝子型を有する。別の具体的な
実施形態では、胎盤細胞の該単離集団中の該細胞の少なくとも約40%、45%、50%
、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%
、または99%は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞ま
たは単離胎盤細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
D10-、CD33-、CD44+、CD45-、及びCD117-胎盤細胞である。別
の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、単離胎盤細胞を
含む、例えば、これらが豊富な、細胞の集団であり、細胞の該集団中の細胞の少なくとも
約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少な
くとも約99%は、単離CD10-、CD33-、CD44+、CD45-、及びCD1
17-胎盤細胞である。具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集
団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤
細胞は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団中の該細胞の少な
くとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、
85%、90%、95%、98%、または99%は、由来が非母体である。別の具体的な
実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらのマーカーを示さな
い胎盤細胞から単離される。
D10-、CD13-、CD33-、CD45-、及びCD117-胎盤細胞である。別
の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な細胞集団は、単離CD10-
、CD13-、CD33-、CD45-、及びCD117-胎盤細胞を含む、例えば、こ
れらが豊富な、細胞の集団であり、該集団中の細胞の少なくとも約70%、少なくとも約
80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%は、CD
10-、CD13-、CD33-、CD45-、及びCD117-胎盤細胞である。具体
的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、該細胞ではない胎盤細
胞から単離される。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が非母体である
。別の具体的な実施形態では、該細胞集団中の該細胞の少なくとも約40%、45%、5
0%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、9
8%、または99%は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細
胞または単離胎盤細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離される。
A,B,C+、CD45-、CD34-、及びCD133-であり、さらに、CD10
+、CD13+、CD38+、CD44+、CD90+、CD105+、CD200+及
び/若しくはHLA-G-であり、かつ/またはCD117に対し陰性である。別の実施
形態では、本明細書に記載される方法に有用な細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集
団であり、該集団中の細胞の少なくとも約20%、25%、30%、35%、40%、4
5%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、9
5%、98%、または約99%は、HLA A,B,C-、CD45-、CD34-、C
D133-であり、さらに、CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD
105、CD200に対して陽性であり、かつ/または、CD117及び/若しくはHL
A-Gに対して陰性である単離胎盤細胞である。具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞
または単離胎盤細胞の集団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離される。別の具体的な実
施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が非母体である。別の具体的な実施形態では、該細
胞集団中の該細胞の少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、7
0%、75%、90%、85%、90%、95%、98%、または99%は、由来が非母
体である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、こ
れらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離される。
合で決定されるようなCD200+及びCD10+であり、抗体結合及びRT-PCRの
両方で決定されるようなCD117-である単離胎盤細胞である。別の実施形態では、本
明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、CD10+、CD29-、CD
54+、CD200+、HLA-G-、MHCクラスI+、及びβ-2ミクログロブリン
+である単離胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。別の実施形
態では、本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞は、少なくとも1つの細
胞マーカーの発現が間葉系幹細胞(例えば、骨髄由来間葉系幹細胞)場合よりも少なくと
も2倍高い、胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が非
母体である。別の具体的な実施形態では、該細胞集団中の該細胞の少なくとも約40%、
45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、
95%、98%、または99%は、由来が非母体である。
+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62E-、CD
62L-、CD62P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD
105+、CD106/VCAM+、CD144/VEカドヘリンlow、CD184/
CXCR4-、β2ミクログロブリンlow、MHC-Ilow、MHC-II-、HL
A-Glow、及び/またはPDL1lowのうちの1つ以上である単離胎盤細胞、例え
ば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は
、少なくともCD29+及びCD54+である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細
胞は、少なくともCD44+及びCD106+である。別の具体的な実施形態では、単離
胎盤細胞は、少なくともCD29+である。
胞を含み、該細胞集団中の細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、
95%、98%、または99%は、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、
CD54/ICAM+、CD62-E-、CD62-L-、CD62-P-、CD80-
、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106/VCAM+、
CD144/VEカドヘリンdim、CD184/CXCR4-、β2ミクログロブリン
dim、HLA-Idim、HLA-II-、HLA-Gdim、及び/またはPDL1
dimのうちの1つ以上である単離胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、該細胞
集団中の細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、
または99%は、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54/ICA
M+、CD62-E-、CD62-L-、CD62-P-、CD80-、CD86-、C
D103-、CD104-、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE
カドヘリンdim、CD184/CXCR4-、β2ミクログロブリンdim、MHC-
Idim、MHC-II-、HLA-Gdim、及びPDL1dimである。
0+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、C
D90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+
、及びABC-p+のうちの1つ以上または全てである単離胎盤細胞であり、ABC-p
は、胎盤特異的ABCトランスポータータンパク質(乳癌耐性タンパク質(BCRP)及
びミトキサントロン耐性タンパク質(MXR)としても知られている)であり、該単離胎
盤細胞は、残留血液を除去するために、臍帯血を排出され、灌流されている哺乳動物の胎
盤、例えば、ヒト胎盤、の灌流により得られる。
たは免疫原性マーカー)の発現は、フローサイトメトリーで決定され;別の具体的な実施
形態では、マーカーの発現は、RT-PCRで決定される。
、例えば、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞、と識別できることが確認され
る。本明細書に記載の単離胎盤細胞は、例えば、1つ以上の遺伝子の発現を基準にして、
間葉系幹細胞と識別することができ、これらの発現は、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して
、単離胎盤細胞において、またはある特定の単離臍帯幹細胞において有意に高い。特に、
本明細書で提供される治療の方法に有用な単離胎盤細胞は、1つ以上の遺伝子の発現を基
準にして、間葉系幹細胞と識別することができ、これらの発現は、細胞が、同等の条件で
成長する時、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも、単離胎盤細胞において有意に高く(
つまり、少なくとも2倍高く)、1つ以上の遺伝子は、ACTG2、ADARB1、AM
IGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、C
OL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F
2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、
ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KR
T8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCD
H7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6
GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、ZC3H12A、
または上述のもののいずれかの組み合わせである。例えば、米国特許公開公報第2007
/0275362号(この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参
照のこと。ある特定の具体的な実施形態では、該1つ以上の遺伝子の該発現は、例えば、
RT-PCRまたは例えば、U133-Aマイクロアレイ(Affymetrix)を使
用したマイクロアレイ分析で決定される。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は
、DMEM-LG(例えば、Gibco製);2%のウシ胎児血清(例えば、Hyclo
ne Labs.製);1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS);1×リ
ノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA);10-9Mのデキサメタゾン(例えば
、Sigma製);10-4Mのアスコルビン酸2-ホスフェート(例えば、Sigma
製);上皮成長因子10ng/mL(例えば、R&D Systems製);及び、血小
板由来成長因子(PDGF-BB)10ng/mL(例えば、R&D Systems製
)を含む培地で、多くの集団倍加、例えば、約3~約35の範囲の集団倍加のために培養
される時、該1つ以上の遺伝子を発現する。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞特
異的または単離臍帯細胞特異的遺伝子は、CD200である。
クセッション番号NM_001615(ACTG2)、BC065545(ADARB1
)、(NM_181847(AMIGO2)、AY358590(ARTS-1)、BC
074884(B4GALT6)、BC008396(BCHE)、BC020196(
C11orf9)、BC031103(CD200)、NM_001845(COL4A
1)、NM_001846(COL4A2)、BC052289(CPA4)、BC09
4758(DMD)、AF293359(DSC3)、NM_001943(DSG2)
、AF338241(ELOVL2)、AY336105(F2RL1)、NM_018
215(FLJ10781)、AY416799(GATA6)、BC075798(G
PR126)、NM_016235(GPRC5B)、AF340038(ICAM1)
、BC000844(IER3)、BC066339(IGFBP7)、BC01314
2(IL1A)、BT019749(IL6)、BC007461(IL18)、(BC
072017)KRT18、BC075839(KRT8)、BC060825(LIP
G)、BC065240(LRAP)、BC010444(MATN2)、BC0119
08(MEST)、BC068455(NFE2L3)、NM_014840(NUAK
1)、AB006755(PCDH7)、NM_014476(PDLIM3)、BC1
26199(PKP-2)、BC090862(RTN1)、BC002538(SER
PINB9)、BC023312(ST3GAL6)、BC001201(ST6GAL
NAC5)、BC126160またはBC065328(SLC12A8)、BC025
697(TCF21)、BC096235(TGFB2)、BC005046(VTN)
、及びBC005001(ZC3H12A)に見出すことができる。
同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも検出可能に高いレベルで、ACTG2、ADARB
1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD2
00、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOV
L2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HL
A-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT1
8、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1
、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6
、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、及びZC
3H12Aのそれぞれを発現する。
よりも検出可能に高いレベルで、CD200及びARTS1(1型腫瘍壊死因子のアミノ
ペプチダーゼ制御因子);ARTS-1及びLRAP(白血球由来アルギニンアミノペプ
チダーゼ);IL6(インターロイキン-6)及びTGFB2(トランスフォーミング成
長因子-β2);IL6及びKRT18(ケラチン18);IER3(即時初期応答3)
、MEST(中胚葉特異的転写ホモログ)及びTGFB2;CD200及びIER3;C
D200及びIL6;CD200及びKRT18;CD200及びLRAP;CD200
及びMEST;CD200及びNFE2L3(核因子(赤血球由来2)様3);またはC
D200及びTGFB2を発現する。該骨髄由来間葉系幹細胞は、該単離胎盤細胞が経て
いる継代数と同等の、培養での継代数を経ている。他の具体的な実施形態では、胎盤細胞
は、ARTS-1、CD200、IL6及びLRAP;ARTS-1、IL6、TGFB
2、IER3、KRT18、及びMEST;CD200、IER3、IL6、KRT18
、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2;ARTS-1、CD200、I
ER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2;ま
たはIER3、MEST及びTGFB2を発現する。同等数の骨髄由来間葉系幹細胞より
も検出可能に高いレベルBM-MSCで、該骨髄由来間葉系幹細胞は、該単離胎盤細胞が
経ている継代数と同等の、培養での継代数を経ている。
複数可)の配列を基準にしたプローブは個別に、従来技術により選択及び構築することが
できる。遺伝子の発現は、例えば、遺伝子のうちの1つ以上に対するプローブを含むマイ
クロアレイ、例えば、Affymetrix GENECHIP(登録商標)Human
Genome U133A 2.0 array、またはAffymetrix GE
NECHIP(登録商標)Human Genome U133 Plus 2.0(カ
リフォルニア州サンタクララ)で評価することができる。特定のGenBankアクセッ
ション番号に対する配列が補正される場合でも、補正された配列に特異的なプローブが、
周知の標準的な技術を使用して、容易に生成することができるので、これらの遺伝子の発
現は評価することができる。
とも複数の単離胎盤細胞を含む細胞の集団を特定するためなど、使用することができる。
識別が確認された単離胎盤細胞の集団は、クローン性、例えば、本明細書に記載されるよ
うな、単一の単離胎盤細胞から拡大した単離胎盤細胞の集団、または幹細胞の混合集団、
例えば、複数の単離胎盤細胞をから拡大した単独の単離胎盤細胞を含む細胞の集団、また
は単離胎盤細胞を含む細胞の集団、及び少なくとも1つの他の種類の細胞であることがで
きる。
ができる。例えば、細胞の集団、例えば、クローン拡大細胞は、上記遺伝子のうちの1つ
以上の発現が、間葉系幹細胞の同等の集団においてよりも、細胞の集団由来の試料におい
て有意に高い場合、選択されてもよい。このような選択は、複数の単離胎盤細胞集団由来
、複数の細胞集団(識別が不明)由来などの集団の選択とすることができる。
おける該1つ以上の遺伝子における発現のレベルと比較した、レベル、例えば、同等数の
骨髄由来間葉系幹細胞中の該1つ以上の遺伝子における発現のレベル、を基準にして選択
することができる。一実施形態では、同等数の間葉系幹細胞を含む試料における該1つ以
上の遺伝子の発現のレベルが、対照として使用される。別の実施形態では、特定の条件下
で試験される単離胎盤細胞に対する対照は、該条件下の間葉系幹細胞における該1つ以上
の遺伝子の発現のレベルを表す数値である。
AC)は、4~21日間、1~100ng/mLのVEGFに曝露した後、免疫局在法で
検出されるようなCD34を発現しない。ある特定の実施形態では、該胎盤接着細胞は、
組織培養プラスチックに接着している。別の具体的な実施形態では、細胞の該集団は、例
えば、MATRIGEL(商標)などの基質上、血管内皮成長因子(VEGF)、上皮成
長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、または塩基性線維芽細胞成長因子
(bFGF)などの血管新生因子の存在下で培養される時、内皮細胞が新芽または管腔様
構造を形成するように誘導する。
集団、または細胞の該単離集団中の細胞の少なくとも約50%、60%、70%、80%
、90%、95%、若しくは98%がPDACである細胞の集団は、細胞(複数可)が成
長する培地に、VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、
G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、
TIMP-2、uPAR、またはガレクチン-1のうちの1つ以上または全てを分泌する
。別の実施形態では、PDACは、正常酸素条件下(例えば、約20%または約21%の
02)と比較して、低酸素条件下(例えば、約5%未満のO2)で、増加したレベルのC
D202b、IL-8、及び/またはVEGFを発現する。
れも、該胎盤由来接着細胞と接触して、内皮細胞の集団における新芽または管腔様構造の
形成を引き起こすことができる。具体的な実施形態では、PDACは、例えば、少なくと
も4日間、胎盤コラーゲンまたはMATRIGEL(商標)などの基質中またはこれ上に
、例えば、I型及びIV型コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、ならびに/
または血管内皮成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(
PDGF)、若しくは塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)などの血管新生因子の存在
下で培養された時、新芽若しくは管腔様構造を形成する、または内皮細胞の新芽の形成を
サポートするヒト内皮細胞と共培養される。別の実施形態では、本明細書に記載の胎盤由
来接着細胞を含む細胞の集団のいずれも、例えば、胎盤コラーゲンまたはMATRIGE
L(商標)などの基質中またはこれ上に、I型及びIV型コラーゲンなどの細胞外マトリ
ックスタンパク質の存在下で培養される時、血管内皮成長因子(VEGF)、肝細胞成長
因子(HGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFG
F)、またはインターロイキン-8(IL-8)などの血管新生因子を分泌し、それによ
り、ヒト内皮細胞が新芽または管腔様構造を形成するように誘導することができる。
、血管新生因子を分泌する。具体的な実施形態では、細胞の集団は、血管内皮成長因子(
VEGF)、肝細胞成長因子(HGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、塩基性線維
芽細胞成長因子(bFGF)、及び/またはインターロイキン-8(IL-8)を分泌す
る。他の具体的な実施形態では、PDACを含む細胞の集団は、1つ以上の血管新生因子
を分泌し、それにより、ヒト内皮細胞が、インビトロ創傷治癒アッセイにおいて、遊走す
るように誘導する。他の具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団は、
ヒト内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細胞、または筋芽細胞の成熟、分化、または増殖を誘導
する。
ibco);2%のウシ胎児血清(FCS)(Hyclone Labs.);1×イン
スリン-トランスフェリン-セレン(ITS);1×リノール酸-ウシ血清アルブミン(
LA-BSA);10-9Mのデキサメタゾン(Sigma);10-4Mのアスコルビ
ン酸2-ホスフェート(Sigma);上皮成長因子(EGF)10ng/mL(R&D
Systems)、血小板由来成長因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D
Systems)、及び100Uのペニシリン/1000Uのストレプトマイシンを含む
培地で増殖中に、上記特徴(例えば、細胞表面マーカー及び/または遺伝子発現プロファ
イルの組み合わせ)を示す。
。本明細書に開示の胎盤細胞のいずれかのある特定の実施形態では、細胞マーカー特徴ま
たは遺伝子発現特徴は、ヒトマーカーまたはヒト遺伝子である。
細胞または集団は、拡大しており、例えば、少なくとも、約、若しくは多くとも1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18
、19、若しくは20倍以上継代されている、または、少なくとも、約、若しくは多くと
も1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3
0、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43
、44、45、46、47、48、49、若しくは50の集団倍加のために増殖されてい
る。該単離胎盤細胞または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、
該細胞または集団は、初代分離株である。本明細書に開示の単離胎盤細胞または単離胎盤
細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、由来が胎児であ
る(つまり、胎児遺伝子型を有する)。
めに製剤化された培地中での培養中に、例えば、成長培地での増殖中に、分化しない。別
の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、増殖するためにフィーダー層を必要としな
い。別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、フィーダー層の不存在下での培養中
に、分化しない。それは、単にフィーダー細胞層がないためである。
あり、複数の該単離胎盤細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価さ
れる場合、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)に対し陽性である。このようなアッ
セイは、当該技術分野で既知である(例えば、Bostian and Betts,
Biochem. J., 173, 787, (1978)を参照のこと)。ある特
定の実施形態では、該アッセイは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとして、
Aldefluor(登録商標)(Aldagen, Inc、オレゴン州アッシュラン
ド)を使用する。ある特定の実施形態では、該複数は、細胞の該集団中の細胞の約3%及
び25%の間にある。別の実施形態では、単離臍帯細胞、例えば、多分化能単離臍帯細胞
、の集団が、本明細書で提供され、複数の該単離臍帯細胞は、アルデヒドデヒドロゲナー
ゼ活性の指標としてAldefluo(登録商標)を使用するアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ活性アッセイにより評価される場合、アルデヒドデヒドロゲナーゼに対し陽性である。
具体的な実施形態では、該複数は、細胞の該集団中の細胞の約3%及び25%の間にある
。別の実施形態では、単離胎盤細胞の該集団または単離臍帯細胞は、ほぼ同じ数の細胞を
有し、かつ同じ条件下で培養された骨髄由来間葉系幹細胞の集団よりも少なくとも3倍、
または少なくとも5倍高いALDH活性を示す。
、細胞の該集団中の胎盤細胞は、母体遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず、例えば、
該集団中の胎盤細胞の少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、7
0%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%は、胎児遺伝子
型を有する。本明細書に記載の単離胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれかの他のある特定
の実施形態では、該胎盤細胞を含む細胞の集団は、母体遺伝子型を有する細胞を実施的に
含まず、例えば、該集団中の細胞の少なくとも40%、45%、50%、55%、60%
、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%は
、胎児遺伝子型を有する。
、細胞または該集団の細胞の少なくとも約95%または約99%の核型は、正常である。
上記胎盤細胞または細胞集団のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞または細胞の
集団中の細胞は、由来が非母体である。
、任意の比率で組み合わせることができる。上記単離胎盤細胞集団のうちの任意の2つ以
上は、単離胎盤細胞集団を形成するために組み合わせることができる。例えば、単離胎盤
細胞の集団は、上記マーカーの組み合わせのうちの1つにより規定される単離胎盤細胞の
第1の集団、及びマーカーの組み合わせのうちの別のものにより規定される単離胎盤細胞
の第2の集団を含むことができ、該第1及び第2の集団は、約1:99、2:98、3:
97、4:96、5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:
50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:
3、98:2、または約99:1の比率で組み合わされる。同様に、上記単離胎盤細胞ま
たは単離胎盤細胞集団のうちの任意の3つ、4つ、5つ、またはそれ以上を、組み合わせ
ることができる。
または用いない胎盤組織の破壊(セクション5.2.3を参照のこと)、または灌流(セ
クション5.2.4を参照のこと)により得ることができる。例えば、単離胎盤細胞の集
団は、臍帯血を排出され、残りの血液を除去するために灌流されている哺乳動物胎盤を灌
流すること;該胎盤に灌流液を灌流すること;及び該灌流液を収集すること(灌流後の該
灌流液は、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を含む);ならびに、細胞の該集団から、
複数の該単離胎盤細胞を単離することを含む方法に従って産生することができる。具体的
な実施形態では、灌流液は、臍静脈及び臍動脈の両方を通過し、胎盤から滲出した後に収
集される。別の具体的な実施形態では、灌流液は、臍静脈を通過して、臍動脈から収集さ
れ、または臍動脈を通過して、臍静脈から収集される。
は、胎盤細胞の該集団の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、
99%、または少なくとも99.5%である。別の具体的な実施形態では、灌流により収
集される単離胎盤細胞は、胎児及び母体細胞を含む。別の具体的な実施形態では、灌流に
より収集される単離胎盤細胞は、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、
95%、99%、または少なくとも99.5%の胎児細胞である。
盤細胞の集団を含む組成物が、本明細書で提供され、該組成物は、単離胎盤細胞を収集す
るために使用される灌流液の少なくとも一部を含む。
、組織破壊酵素で胎盤細胞を消化すること、及び該胎盤細胞の残部から、複数の胎盤細胞
を単離すること、または実質的に単離すること、により産生することができる。胎盤全体
、またはその任意の部分を、本明細書に記載の単離胎盤細胞を得るために、消化すること
ができる。具体的な実施形態では、例えば、該胎盤組織は、胎盤全体、羊膜、絨毛膜、羊
膜及び絨毛膜の組み合わせ、または上述のもののいずれかの組み合わせであることができ
る。他の具体的な実施形態では、組織破壊酵素は、トリプシンまたはコラゲナーゼである
。種々の実施形態では、胎盤を消化することにより得られる細胞の集団内に含有される単
離胎盤細胞は、胎盤細胞の該集団の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%
、95%、99%、または少なくとも99.5%である。
上記胎盤細胞の単離集団、及び単離胎盤細胞の集団は一般に、(例えば、胎盤幹細胞を含
む医薬組成物の一部として)約、少なくとも、若しくは多くとも1×103、3×103
、5×103、1×104、3×104、5×104、1×105、3×105、5×1
05、1×106、3×106、5×106、1×107、3×107、5×107、1
×108、3×108、5×108、1×109、5×109、若しくは1×1010単
離胎盤細胞、または(例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物の一部として)約1×103
~3×103、3×103~5×103、5×103~1×104、1×104~3×1
04、3×104~5×104、5×104~1×105、1×105~3×105、3
×105~5×105、5×105~1×106、1×106~3×106、3×106
~5×106、5×106~1×107、1×107~3×107、3×107~5×1
07、5×107~1×108、1×108~3×108、3×108~5×108、5
×108~1×109、1×109~5×109、若しくは5×109~1×1010の
単離胎盤細胞を含むことができる。本明細書に記載の治療方法に有用な単離胎盤細胞の集
団は、例えば、トリパンブルー排除法で、例えば、決定される場合、少なくとも50%、
55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、
または99%の生存可能な単離胎盤細胞を含む。
5.2.1 幹細胞収集組成物
胎盤細胞、例えば、上記セクション5.1に記載の単離胎盤細胞、を収集及び単離する
方法が、さらに本明細書で提供される。一般に、そのような細胞は、生理学的に許容され
る溶液、例えば、細胞収集組成物を使用して、哺乳動物胎盤から得られる。例示的細胞収
集組成物は、「Improved Medium for Collecting Pl
acental Stem Cells and Preserving Organs
」という名称の米国特許公開公報第2007/0190042号で詳細に記載されており
、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
は培養に適する任意の生理学的に許容される溶液、例えば、食塩水(例えば、リン酸緩衝
食塩水、クレブス液、変性クレブス液、イーグル液、0.9%のNaClなど)、培地(
例えば、DMEM、H.DMEMなど)、などを含むことができる。
り、単離胎盤細胞が死滅するのを防ぐ、または単離胎盤細胞の死滅を遅延させる、死滅す
る細胞の集団中の単離胎盤細胞の数を低減させるなどの傾向を有する、1つ以上の構成成
分を含むことができる。そのような構成成分は、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、
カスパーゼ阻害剤、若しくはJNK阻害剤);血管拡張薬(例えば、硫酸マグネシウム、
抗高血圧薬薬物、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、副腎皮質刺激ホルモン、コ
ルチコトロピン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三
リン酸、アデノシン、インドメタシン、若しくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラー
ゼ阻害剤など);壊死阻害剤(例えば、2-(1H-インドール-3-イル)-3-ペン
チルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、若しくはクロナゼパム);T
NF-α阻害剤;及び/または酸素含有ペルフルオロカーボン(例えば、ペルフルオロオ
クチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど)であることができる。
ロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNase、またはDNaseなどを含むことができる
。そのような酵素は、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III、またはI
V、Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼなど);デ
ィスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、リベラーゼ、ヒアルロニダーゼ
などを含むが、これらに限定されない。
定の非限定的実施形態では、抗生物質は、マクロライド(例えば、トブラマイシン)、セ
ファロスポリン(例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、
セファクロール、セフェキシム、またはセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリ
スロマイシン、ペニシリン(例えば、ペニシリンV)またはキノロン(例えば、オフロキ
サシン、シプロフロキサシン、若しくはノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレ
プトマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質は、グラム陽性及び/またはグ
ラム陰性細菌、例えば、Pseudomonas aeruginosa、Staphy
lococcus aureusなどに対し活性がある。一実施形態では、抗生物質は、
ゲンタマイシン、例えば、培地中約0.005%~約0.01%(w/v)である。
1mM~約50mM);D-グルコース(約20mM~約100mM);マグネシウムイ
オン(約1mM~約50mM);一実施形態では、内皮完全性及び細胞生存率を維持する
のに十分な量で存在する20,000ダルトンを超える分子量の巨大分子(例えば、約2
5g/l~約100g/l、または約40g/l~約60g/lで存在する合成若しくは
天然コロイド、デキストランなどの多糖類、またはポリエチレングリコール);酸化防止
剤(例えば、約25μM~約100μMで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチ
ル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC、またはビタミンE);還元剤(例
えば、約0.1mM~約5mMで存在するN-アセチルシステイン);カルシウムが細胞
に侵入するのを妨げる薬剤(例えば、約2μM~約25μMで存在するベラパミル);ニ
トログリセリン(例えば、約0.05g/L~約0.2g/L);一実施形態では、抗は
、残留血液の凝固を防ぐことに役立つのに十分な量で存在する、抗凝固剤(例えば、約1
000単位/l~約100,000単位/lの濃度で存在するヘパリンまたはヒルジン)
;あるいは、アミロライド含有化合物(例えば、約1.0μM~約5μMで存在するアミ
ロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルア
ミロライド、またはイソブチルアミロライド)。
一般に、ヒト胎盤は、出生後のそれの娩出後に、すぐに回収される。好ましい実施形態
では、胎盤は、インフォームドコンセント後に、かつ患者の完全な病歴が取られ、胎盤に
関連づけられた後に、患者から回収される。好ましくは、病歴は、分娩後に継続する。そ
のような病歴は、胎盤またはそこから採取された単離胎盤細胞の後続の使用を調整するた
めに使用することができる。例えば、単離ヒト胎盤細胞は、胎盤と関連する幼児、または
幼児の親、兄弟、若しくは他の親族の個別化医療のために、病歴に照らして使用すること
ができる。
実施形態では、分娩後に、胎盤の臍帯血は、回収される。胎盤は、従来の臍帯血回収プロ
セスに付すことができる。通常は、胎盤を瀉血するために、重力を用いて、針またはカニ
ューレが使用される(例えば、Anderson、米国特許第5,372,581号;H
esselら、米国特許第5,415,665号を参照のこと)。針またはカニューレは
通常、臍静脈中に入れられ、胎盤は、臍帯血を胎盤から排出させるのを助けるために、や
さしくマッサージすることができる。そのような臍帯血回収は、商業的に、例えばLif
eBank USA、ニュージャージー州シーダーノールズで、実施されてもよい。好ま
しくは、胎盤は、臍帯血回収中の組織破壊を最小限に抑えるために、さらなる操作なしに
重力で排出される。
ために、分娩または出産室から別の場所、例えば、研究室に輸送される。胎盤は好ましく
は、例えば、滅菌ジップロックプラスチックバッグに、隣接する臍帯を固定して胎盤を入
れて、次に、断熱容器に入れることにより、(胎盤の温度を20~28℃に維持する)滅
菌断熱輸送装置中で輸送される。別の実施形態では、胎盤は、係属中の米国特許第7,1
47,626号(この開示は、本明細書に参照により組み込まれる)に実質的に記載され
るような臍帯血収集キット中で、輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩の4~24時間
後に、研究室に送達される。ある特定の実施形態では、隣接する臍帯は、好ましくは、臍
帯血の回収前に、胎盤ディスクへの付着点の4~5cm(センチメートル)の範囲内に固
定される。他の実施形態では、隣接する臍帯は、臍帯血回収後であるが、胎盤のさらなる
処理前に、固定される。
することができる。胎盤は、任意の残留臍帯血を除去するために、胎盤を灌流する前に、
4~24時間の間、多くとも48時間、または48時間を超えて保存されてもよい。一実
施形態では、胎盤は、娩出の約0時間後~約2時間後の間に採取される。胎盤は好ましく
は、5℃~25℃の温度で、抗凝固剤溶液中で保存される。好適な抗凝固剤溶液は、当該
技術分野において周知である。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウムの溶液が
使用することができる。好ましい実施形態では、抗凝固剤溶液は、ヘパリンの溶液(例え
ば、1:1000溶液中1%(w/w))を含む。瀉血された胎盤は好ましくは、胎盤細
胞を収集する前の多くとも36時間の間保存される。
盤細胞を得るために、技術分野に既知の任意の仕方で処理することができ、例えば、灌流
または破壊でき、例えば、1つ以上の組織破壊酵素で消化することができる。
一実施形態では、幹細胞は、器官の部分または全部の物理的破壊により、哺乳動物胎盤
から収集される。例えば、胎盤またはその部分は、例えば、粉砕、剪断、細かく刻む、ダ
イスカット、チョップ、細かく砕くなどしてもよい。次に、組織は、単離胎盤細胞の集団
を得るために培養することができる。通常、胎盤組織は、例えば、培地、食塩水、または
幹細胞収集を使用して破壊される。
ることができる。単離胎盤細胞は、完全な胎盤からを含む、羊膜、絨毛膜、臍帯、胎盤絨
毛叢、またはそれらの任意の組み合わせの全部または一部から得ることができる。好まし
くは、単離胎盤細胞は、羊膜及び絨毛膜を含む胎盤組織から得られる。通常、単離胎盤細
胞は、胎盤組織の小さなブロックの破壊により得ることができ、例えば、胎盤組織のブロ
ックは、体積が約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50
、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700
、800、900、または約1000立方ミリメートルである。物理的破壊の任意の方法
を使用することができるが、但し、破壊方法は、例えば、トリパンブルー排除法で決定し
て、生存可能な該器官中の細胞の多数、より好ましくは大半、より好ましくは少なくとも
60%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%を残すことを条件とす
る。
は、娩出の約8時間後及び約18時間後の間に、胎盤またはその部分から収集することが
できる。
される。
物理的破壊は、1つ以上の組織消化酵素の使用により達成することができる酵素消化を含
む。胎盤またはその部分はまた、物理的に破壊されて、1つ以上の酵素で消化されてもよ
く、次に、得られる材料は、細胞収集組成物に浸漬される、またはこれに混合される。
壊するために使用することができる酵素は、パパイン;デオキシリボヌクレアーゼ;トリ
プシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、またはエラスターゼなどのセリ
ンプロテアーゼ、を含む。セリンプロテアーゼは、血清中のα2ミクログロブリンにより
阻害され得る、それ故、消化に使用される培地は通常、無血清である。EDTA及びDN
aseが一般に、細胞回収の効率を増加させるために、酵素消化手順で使用される。消化
液は好ましくは、粘性のある消化物内の細胞を捕捉するのを回避するために、希釈される
。
に対する代表的な濃度は、0.1%~約2%のトリプシン、例えば、約0.25%のトリ
プシンを含む。プロテアーゼの組み合わせ、つまり、同じ消化反応において2つ以上のプ
ロテアーゼを使用することができる、または、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞及び胎盤多
分化能細胞を遊離させるため順次使用することができる。例えば、一実施形態では、胎盤
またはその部分は、例えば、30分間、約1~約2mg/mlの適切な量のコラゲナーゼ
Iでまず消化され、続いて、例えば、37℃で10分間、約0.25%の濃度のトリプシ
ンで消化される。セリンプロテアーゼは好ましくは、他の酵素の使用後に、連続して使用
される。
胞収集組成物で単離される前に組織が破壊及び/若しくは消化される溶液に、キレート剤
、例えば、エチレングリコールビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-
テトラ酢酸(EGTA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加することによ
り、さらに破壊することができる。
播種される。次に、細胞は、特異な接着により単離され、例えば、生存率、細胞表面マー
カー、分化などに対し特徴付けられる。
分が、絨毛膜または絨毛叢を含む場合)、単離された胎盤細胞は、胎児源及び母体源の両
方に由来する胎盤細胞の混合物を含み得ることが理解されるであろう。胎盤の部分(例え
ば、羊膜)が、母体細胞を含まない、またはこれを無視できる数を含む場合、そこから単
離された胎盤細胞は、ほとんど排他的に胎児胎盤細胞を含むことになる(つまり、胎盤細
胞は、胎児の遺伝子型を有する)。
シン処理(下記セクション5.2.5を参照のこと)、続いて、新しい増殖培地の1つ以
上の新しい培養容器中での培養、任意に続いて、第2の特異なトリプシン処理により、破
壊された胎盤組織から単離することができる。
胎盤細胞、例えば、上記セクション5.1に記載されている胎盤細胞は、哺乳動物胎盤
の灌流により得ることもできる。胎盤細胞を得るために哺乳動物胎盤に灌流する方法は、
例えば、Hariri、米国特許第7,045,148号及び同第7,255,729号
、米国特許公開公報第2007/0275362号及び同第2007/0190042号
に開示されており、これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込
まれる。
中の灌流により収集することができる。一実施形態では、哺乳動物胎盤は、臍動脈及び臍
静脈の一方またはその両方を灌流液が通過することにより灌流される。灌流液の胎盤を通
る流れは、例えば、胎盤への重力流を使用して達成されてもよい。好ましくは、灌流液は
、ポンプ、例えば、蠕動ポンプを使用して、胎盤を強制的に通過させる。臍静脈は、例え
ば、滅菌チューブなどの滅菌接続器具に接続されているカニューレ、例えば、TEFLO
N(登録商標)またはプラスチックカニューレ、をカニューレ挿入することができる。滅
菌接続器具は、灌流マニホールドに接続されている。
うに配置される(例えば、吊される)。胎盤は、灌流液の、胎盤脈管構造及び周囲組織中
の通過により灌流することができる。胎盤は、灌流液の臍静脈への通過及び臍動脈からの
収集、または、灌流液の臍動脈への通過及び臍動脈からの収集により、灌流することもで
きる。
液のリザーバに接続されているピペットに同時に接続される。灌流液は、臍静脈及び動脈
を通過する。灌流液は、胎盤の周囲の組織へ、血管の壁から滲出し、及び/またはこれら
を通過し、妊娠中の母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放容器に収集され
る。灌流液はまた、臍帯開口部を通して導入されてもよく、母体の子宮壁と接続される胎
盤の壁の開口部から流出または浸出させてもよい。「pan」法と称することができる本
方法により収集される胎盤細胞は通常は、胎児及び母体細胞の混合物である。
動脈を通過して、臍静脈から収集される。「閉回路」法と称することができる本方法によ
り収集される胎盤細胞は通常、ほとんど排他的に胎児である。
た後に、収集されるが、胎児及び母体細胞の混合物をもたらすことが理解されるであろう
。その結果、本方法により収集された細胞は、由来が胎児及び母体の両方の胎盤細胞の混
合集団、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含むことができる。対照的に、閉
回路法における胎盤脈管構造単独での灌流は、それにより、灌流液が、1つまたは2つの
胎盤血管を通過し、残りの血管(複数可)単独で収集されるが、ほぼ排他的に胎児由来で
ある胎盤細胞の集団の収集をもたらす。
出生後の約48時間内に得られる。臍帯は、固定され、クランプの上で切断される。臍帯
は、廃棄することができる、または、例えば、臍帯幹細胞を回収するために、及び/若し
くは生体材料の製造のために臍帯膜を処理するために、処理することができる。羊膜は、
灌流の間保持することができる、または例えば、指での鈍的切開を使用して、絨毛膜から
分離することができる。羊膜は、灌流前に絨毛膜から分離される場合、例えば、廃棄する
ことができ、または例えば、酵素消化により幹細胞を得るために、若しくは例えば、羊膜
生体材料、例えば、米国特許出願公開第2004/0048796号(この開示はその全
体が本明細書に参照により組み込まれる)に記載の生体材料を製造するために、処理する
ことができる。例えば、滅菌ガーゼを使用して、全ての目に見える凝血塊及び残留血液の
ある胎盤を清浄した後、臍帯血管は、例えば、臍帯の断面を露出させるために、臍帯膜を
部分的に切断することにより、露出する。血管は、識別され、例えば、各血管の切断端を
通って、閉じたアリゲータークランプを進めることにより開かれる。次に、器具、例えば
、灌流装置または蠕動ポンプに接続されているプラスチックチューブは、胎盤動脈のそれ
ぞれに挿入される。ポンプは、目的に適する任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプであるこ
とができる。次に、滅菌収集リザーバ、例えば、250mLの収集バッグなどの血液バッ
グに接続されているプラスチックチューブが、胎盤静脈に挿入される。あるいは、ポンプ
に接続されているチューブは、胎盤静脈に挿入され、収集リザーバ(複数可)へのチュー
ブは、胎盤動脈の一方または両方に挿入される。次に、胎盤は、ある体積の灌流液、例え
ば、約750mlの灌流液、で灌流される。次に、灌流液中の細胞は、例えば、遠心分離
により収集される。ある特定の実施形態では、胎盤は、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞及
び/または胎盤多分化能細胞、を収集するための灌流前に、残留血液を除去するために、
灌流液、例えば、100~300mLの灌流液、で灌流される。別の実施形態では、胎盤
は、胎盤細胞を収集するための灌流前に、残留血液を除去するために灌流液で灌流されな
い。
スクへの付着点の4~5cm(センチメートル)以内に固定される。
は胎盤血の残留赤血球で色を帯びる。灌流液は、灌流プロセス時に無色になり、残留臍帯
血細胞は、胎盤から洗い流される。一般に、30~100ml(ミリリットル)の灌流液
は、胎盤を最初に瀉血するのに適切であるが、幾分灌流液は、観察された結果に応じて使
用されてもよい。
イズ、単一の胎盤からなされるべき収集の数などに応じて変化し得る。種々の実施形態で
は、灌流液の体積は、50mL~5000mL、50mL~4000mL、50mL~3
000mL、100mL~2000mL、250mL~2000mL、500mL~20
00mL、または750mL~2000mLであってよい。通常、胎盤は、瀉血後に、7
00~800mLの灌流液で灌流される。
流される場合、胎盤は、容器または他の好適な容器中、無菌条件下で維持または培養され
て、細抗凝固剤(例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキ
シクマリン)を用いてまたは用いずに、及び/または、抗菌剤(例えば、β-メルカプト
エタノール(0.1mM);ストレプトマイシン(例えば、40~100μg/mlで)
、ペニシリン(例えば、40U/ml)、アンホテリシンB(例えば、0.5μg/ml
)などの抗生物質)を用いてまたは用いずに、胞収集組成物または標準的な灌流液(例え
ば、リン酸緩衝生理食塩水(「PBS」)などの生理食塩水)で灌流されてもよい。一実
施形態では、胎盤が、灌流及び灌流液の収集の1、2、3、4、5、6、7、8、9、1
0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23
、若しくは24時間前、または、2若しくは3日間、またはそれ以上前に、維持または培
養されるように、単離胎盤は、灌流液を収集することなしに、しばらくの間維持または培
養される。灌流された胎盤は、1以上のさらなる時間(複数可)、例えば、1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、1
9、20、21、22、23、24、またはそれ以上の時間で維持することができ、2回
目、例えば、700~800mLの灌流液で灌流することができる。胎盤は、1、2、3
、4、5、またはそれ以上の回数、例えば、1、2、3、4、5、または6時間ごとに1
回、灌流することができる。好ましい実施形態では、胎盤の灌流及び灌流液、例えば、細
胞収集組成物の収集は、回収された有核細胞が100細胞/mlより低くなるまで繰り返
される。異なる時点での灌流液は、細胞、例えば、幹細胞、の時間依存的な集団を回収す
るために、個別にさらに処理することができる。異なる時点からの灌流液は、プールする
こともできる。好ましい実施形態では、胎盤細胞は、娩出後約8時間及び約18時間の間
に1回または何回も、収集される。
酵素消化により)胎盤細胞を得るために別途処理されていない哺乳動物胎盤から得ること
ができる数よりも有意に多い胎盤細胞の収集をもたらす。本文脈中、「有意に多い」は、
少なくとも10%多いことを意味する。灌流は、例えば、胎盤またはその部分が培養され
ている培地から単離できる胎盤細胞の数よりも、有意に多い胎盤細胞を生じる。
胎盤から単離することができる。ある特定の実施形態では、胎盤若しくはその部分(例え
ば、羊膜、羊膜及び絨毛膜、胎盤小葉若しくは子葉、臍帯、または上述のいずれかの組み
合わせ)は、25~37℃にされ、30分間、200mLの培地で、1つ以上の組織破壊
酵素とインキュベーションされる。灌流液からの細胞は、収集され、4℃にされ、5mM
のEDTA、2mMのジチオスレイトール、及び2mMのβ-メルカプトエタノールを含
む冷阻害剤混合物で洗浄される。胎盤細胞は、冷(例えば、4℃)幹細胞収集組成物で数
分後に洗浄される。
単離胎盤細胞、例えば、上記セクション5.1に記載されている細胞は、灌流または物
理的破壊、例えば、酵素消化により得られたものであれ、Ficoll勾配遠心分離によ
り、他の細胞から最初に精製(すなわち、単離)することができる。そのような遠心分離
は、遠心分離速度などについて、任意の標準プロトコールに従うことができる。一実施形
態では、例えば、胎盤から収集された細胞は、例えば、汚染屑及び血小板から細胞を分離
する、15分間5000×gの遠心分離により、灌流液から回収される。別の実施形態で
は、胎盤灌流液は、約200mlまで濃縮され、Ficoll上に静かに層状にされ、2
2℃で20分間約1100×gで遠心分離され、細胞の低密度界面層は、さらなる処理の
ために収集される。
した培地、例えば、2U/mlのヘパリン及び2mMのEDTAを含有するIMDM無血
清培地(GibcoBRL、ニューヨーク)中に再懸濁することができる。全単核細胞画
分は、製造者の推奨手順に従って、例えば、Lymphoprep(Nycomed P
harmaノルウェー・オスロ)を使用して単離することができる。
%のEDTAとの溶液(Sigma、ミズーリ州セントルイス)を使用して、例えば、さ
らにまたは最初に分別的トリプシン処理により単離することができる。分別的トリプシン
処理は、組織培養プラスチック接着性がある単離胎盤細胞は通常、約5分以内にプラスチ
ック表面から離れるので、可能であるが、他の接着集団は通常、20~30分を超えるの
インキュベーションを必要とする。離れた胎盤細胞は、例えば、トリプシン中和溶液(T
NS、Cambrex)を使用して、トリプシン処理及びトリプシン中和後に、採取する
ことができる。接着細胞の単離の一実施形態では、例えば、約5~10×106細胞のア
リコートは、いくつかのT-75フラスコ、好ましくは、フィブロネクチンでコーティン
グされたT75フラスコ、のそれぞれに入れる。そのよう実施形態では、細胞は、市販の
Mesenchymal Stem Cell Growth Medium(MSCG
M)(Cambrex)と培養でき、組織培養インキュベーター(37℃、5%のCO2
)に入れることができる。10~15日後、非接着細胞は、PBSで洗浄することにより
、フラスコから除去される。次に、PBSは、MSCGMと交換される。フラスコは好ま
しくは、種々の接着細胞型の存在について、特に、線維芽細胞様細胞のクラスタの特定及
び拡大について、毎日試験される。
胞選別、免疫細胞化学(例えば、組織特異的または細胞マーカー特異的抗体で染色する)
、蛍光活性化細胞選別(FACS)、磁気活性化細胞選別(MACS)などの標準細胞検
出技術を使用して、形態及び細胞表面マーカーの変化を測定すること、光学若しくは共焦
点顕微鏡を使用した細胞の形態の試験により、ならびに/または、PCR及び遺伝子発現
プロファイルなどの当該技術分野において周知の技術を使用して遺伝子発現の変化を測定
することにより、監視することができる。これらの技術は、1つ以上の特定のマーカーに
対して陽性である細胞を特定するために、使用することもできる。例えば、CD34に対
する抗体を使用して、細胞が、検出可能な量のCD34を含むかどうかを、上記の技術を
使用して判定することができ、そうであれば、細胞は、CD34+である。同様に、細胞
が、RT-PCRにより検出できることに十分なOCT-4、または成体細胞よりも有意
に多いOCT-4を産生する場合、細胞は、OCT-4+である。細胞表面マーカーに対
する抗体(例えば、CD34などのCDマーカー)及びOCT-4などの幹細胞特異的遺
伝子の配列は、当該技術分野で周知である。
されている細胞は、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して選別されてもよい。蛍光
活性化細胞選別(FACS)は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離する
ための周知の方法である(Kamarch, 1987, Methods Enzym
ol, 151:150-165)。個々の粒子における蛍光部分のレーザー励起は、混
合物からの正及び負の粒子の電磁気的分離を可能にする小さな電荷をもたらす。一実施形
態では、細胞表面マーカー特異的抗体またはリガンドは、明確な蛍光標識で標識される。
細胞は、使用される抗体に結合する能力に基づいて、細胞の分離を可能にする細胞選別機
により処理される。FACSで選別された粒子は、分離及びクローニングを容易にするた
めに、96ウェルまたは384ウェルプレートの個々のウェルに直接沈着されてもよい。
CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4、及び/またはHL
A-Gのうちの1つ以上の発現に基づいて選別される。これは、培養中の接着特性に基づ
いて、このような細胞を選択するための手順に関連して達成することができる。例えば、
組織培養プラスチック接着選択は、マーカー発現に基づく選別の前後で達成することがで
きる。一実施形態では、例えば、細胞は、CD34の発現に基づいて最初に選別され、C
D34-細胞が保持され、さらにCD200+及びHLA-G-であるCD34-が、他
の全てのCD34-細胞から分離される。別の実施形態では、胎盤からの細胞は、マーカ
ーCD200及び/またはHLA-Gの発現に基づいて選別され、例えば、CD200を
示し、かつHLA-Gを欠損する細胞が、さらなる使用のために単離される。例えば、C
D200を発現し、かつ/または例えば、HLA-Gを欠損する細胞は、具体的な実施形
態では、CD73及び/若しくはCD105、または抗体SH2、SH3、若しくはSH
4により認識されるエピトープの発現、あるいはCD34、CD38、またはCD45の
発現の欠損に基づいてさらに選別することができる。例えば、別の実施形態では、胎盤細
胞は、CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38、及びCD
45の発現またはその欠損により選別され、CD200+、HLA-G-、CD73+、
CD105+、CD34-、CD38-、及びCD45-である胎盤細胞は、さらなる使
用のために他の胎盤細胞から単離される。
細胞集団の細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または95%は
、該単離胎盤細胞である。胎盤細胞は、上記セクション5.1に記載のマーカーのいずれ
かのうちの1つ以上により選別することができる。
0+、CD34-、及びCD105+である胎盤細胞が、他の胎盤細胞から選別(すなわ
ち、単離)される。別の具体的な実施形態では、(1)組織培養プラスチックに接着し、
(2)CD10+、CD34-、CD105+、及びCD200+である胎盤細胞が、他
の胎盤細胞から選別(すなわち、単離)される。別の具体的な実施形態では、(1)組織
培養プラスチックに接着し、(2)CD10+、CD34-、CD45-、CD90+、
CD105+、及びCD200+である胎盤細胞が、他の胎盤細胞から選別(すなわち、
単離)される。
カーに対する配列は、GenBankまたはEMBLなどの公的に利用可能なデータベー
スで容易に入手できる。
に関しては、特定のマーカーに特異的な任意の抗体は、任意のフルオロフォアまたは細胞
の検出及び選別(例えば、蛍光活性化細胞選別)に適する他の標識と組み合わせて使用す
ることができる。マーカーに特異的な抗体/フルオロフォアの組み合わせとしては、HL
A-Gに対するフルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲートモノクロ
ーナル抗体(Serotec, Raleigh、ノースカロライナ州から入手)、CD
10(BD Immunocytometry Systems、カリフォルニア州サン
ノゼから入手)、CD44(BD Biosciences Pharmingen、カ
リフォルニア州サンノゼから入手)、及びCD105(R&D Systems Inc
、ミネソタ州ミネアポリスから入手);CD44、CD200、CD117、及びCD1
3に対するフィリコエリトリン(PE)コンジュゲートモノクローナル抗体(BD Bi
osciences Pharmingen);CD33及びCD10に対するフィリコ
エリトリンCy7(PE Cy7)コンジュゲートモノクローナル抗体(BD Bios
ciences Pharmingen);アロフィコシアニン(APC)コンジュゲー
トストレプトアビジン及びCD38に対するモノクローナル抗体(BD Bioscie
nces Pharmingen);ならびに、ビオチン化CD90(BD Biosc
iences Pharmingen)が挙げられるが、これらに限定されない。使用す
ることができる他の抗体としては、CD133-APC(Miltenyi)、KDR-
ビオチン(CD309、Abcam)、サイトケラチンK-FITC(Sigmaまたは
Dako)、HLA ABC-Fitc(BD)、HLA DR,DQ,DP-PE(B
D)、β-2ミクログロブリンPE(BD)、CD80-PE(BD)、及びCD86-
APC(BD)が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる他の抗体
/標識の組み合わせとしては、CD45-PerCP(ペリジンクロロフィルタンパク質
);CD44-PE;CD19-PE;CD10-F(フルオレセイン);HLA-G-
F及び7-アミノ-アクチノマイシンD(7-AAD);HLA-ABC-Fなどが挙げ
られるが、これらに限定されない。このリストは、網羅的でなく、他の供給元からの他の
抗体も市販されている。
Cy5)コンジュゲートストレプトアビジン及びCD117またはCD133に対するビ
オチンコンジュゲートモノクローナル抗体を使用してCD117またはCD133につい
てアッセイすることができ、しかし、この系を使用して、細胞は、比較的高いバックグラ
ウンドのために、CD117またはCD133に対してそれぞれ陽性であるように見える
可能性がある。
る。胎盤細胞は同時に、異なるマーカーに対する複数の抗体で標識することもできる。
は、磁気ビーズ(直径0.5~100μm)に結合する能力に基づいて粒子を分離するた
めの方法である磁気活性化細胞選別(MACS)技術を使用して選別されてもよい。特定
の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の
有用な修飾を、磁気マイクロスフェア上に実施することができる。次に、ビーズは、結合
させるために、細胞と混合される。次に、細胞は、特異的な細胞表面マーカーを有する細
胞を分離するために、磁場を通過する。一実施形態では、次に、これらの細胞は、単離さ
れて、追加の細胞表面マーカーに対する抗体と結合された磁気ビーズと再混合することが
できる。細胞は再度、両方の抗体に結合された細胞を単離する磁場を通過する。次に、こ
のような細胞は、クローン単離のためのマイクロタイター皿などの別の皿に希釈すること
ができる。
ともできる。例えば、単離胎盤細胞は、例えば、培養中の線維芽細胞様外観を有するもの
として特徴付けることができ、及び/または、これに基づいて選択することができる。単
離胎盤細胞は、胚様体様体を形成する能力を有するものとして特徴付けることもでき、及
び/または、これに基づいて選択することもできる。一実施形態では、例えば、形状が線
維芽細胞様であり、CD73及びCD105を発現し、培養中に1つ以上の胚様体様体を
産生する胎盤細胞が、他の胎盤細胞から単離される。別の実施形態では、培養中に1つ以
上の胚様体様体を産生するOCT-4+胎盤細胞が、他の胎盤細胞から単離される。
付けることができる。MesenCult(商標)培地(Stem Cell Tech
nologies, Inc.、コロンビア州バンクーバーブリティッシュ)などのコロ
ニー形成単位アッセイは、当該技術分野で周知である。
ロピジウム取り込みアッセイ、及びチミジン取り込みアッセイ、(増殖をアッセイするた
めの)MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテ
トラゾリウムブロミド)細胞増殖アッセイなどの当該技術分野において既知の標準的な技
術を使用して生存率、増殖力、及び寿命に対し評価することができる。寿命は、当該技術
分野において周知方法により、例えば、拡大した培養物中の集団倍加の最大数を測定する
ことにより、測定されてもよい。
において既知の他の技術、例えば、所望の細胞の選択的成長(正の選択)、不要な細胞の
選択的破壊(負の選択);例えば、大豆アグルチニンとしての混合集団における特異な細
胞凝集に基づく分離、凍結融解手順;濾過;従来の遠心分離及びゾーン遠心分離;遠心水
簸(カウンターストリーミング遠心分離);単位重力分離;向流分配法;電気泳動などを
使用して、他の胎盤細胞から分離することもできる。
本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞、例えば、上記セクション5,
1に記載の単離胎盤細胞、の集団も本明細書で提供される。単離胎盤細胞の集団は、1つ
以上の胎盤から直接単離することができ、つまり、細胞集団は、単離胎盤細胞を含む胎盤
細胞の集団であることができ、単離胎盤細胞は、灌流液から得られる、若しくはこの中に
含有される、または、破壊された胎盤細胞、例えば、胎盤組織消化物(つまり、胎盤若し
くはその部分の酵素消化により得られた細胞の収集)から得られる、若しくはこの中に含
有される。本明細書に記載の単離胎盤細胞は、単離胎盤細胞の集団を産生するために、培
養及び拡大することもできる。単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団は、胎盤細胞集団を産
生するために、培養及び拡大することもできる。
細書のセクション5.1に記載の単離胎盤細胞を含む。種々の実施形態では、胎盤細胞集
団中の細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、8
0%、90%、95%、または99%は、単離胎盤細胞である。つまり、単離胎盤細胞の
集団は、例えば、単離胎盤細胞でない1%、5%、10%、20%、30%、40%、5
0%、60%、70%、80%、90%ほどの細胞を含むことができる。
は灌流から誘導されるものであろうと、特定のマーカー及び/または特定の培養若しくは
形態学的特徴を発現する単離胎盤細胞を選択することにより産生することができる。一実
施形態では、例えば、(a)基質に接着し、(b)CD200を発現し、HLA-Gの発
現を欠損する、胎盤細胞を選択すること、及び、細胞集団を形成するために、該細胞を他
の細胞から単離することにより細胞集団を産生する方法が、本明細書で提供される。別の
実施形態では、細胞集団は、CD200を発現し、HLA-Gの発現を欠損する胎盤細胞
を選択すること、及び、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離すること
により産生される。別の実施形態では、細胞集団は、(a)基質に接着し、(b)CD7
3、CD105、及びCD200を発現する胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集
団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形
態では、細胞集団は、CD73、CD105、及びCD200を発現する胎盤細胞を特定
すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することに
より産生される。別の実施形態では、細胞集団は、(a)基質に接着し、(b)CD20
0及びOCT-4を発現する胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するた
めに、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細胞集
団は、CD200及びOCT-4を発現する胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集
団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形
態では、細胞集団は、(a)基質に接着し、(b)CD73及びCD105を発現し、(
c)胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該幹細胞を含む胎盤細胞の集
団において、該集団が、1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする胎盤細胞を選択するこ
と、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産
生される。別の実施形態では、細胞集団は、CD73及びCD105を発現し、胚様体様
体の形成を可能にする条件下で培養される時、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、
該集団が、1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする胎盤細胞を選択すること、ならびに
、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別
の実施形態では、細胞集団は、(a)基質に接着し、(b)CD73及びCD105を発
現し、HLA-Gの発現を欠損する胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成
するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、
細胞集団は、CD73及びCD105を発現し、HLA-Gの発現を欠損する胎盤細胞を
選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離するこ
とにより産生される。別の実施形態では、細胞集団を産生する方法は、(a)基質に接着
し、(b)OCT-4を発現し、(c)胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養され
る時、該集団が、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、1つ以上の胚様体様体の形成
を容易にする盤細胞を選択すること、及び、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細
胞から単離することを含む。別の実施形態では、細胞集団は、OCT-4を発現し、胚様
体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団におい
て、該集団が、1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする胎盤細胞を選択すること、及び
、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。
を発現し、CD34を発現しない胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成す
るために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の実施形態では、細
胞集団は、CD10及びCD105を発現し、CD34を発現しない胎盤細胞を選択する
こと、ならびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより
産生される。別の実施形態では、細胞集団は、(a)基質に接着し、(b)CD10、C
D105、及びCD200を発現し、CD34を発現しない胎盤細胞を選択すること、な
らびに、細胞集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生され
る。別の実施形態では、細胞集団は、CD10、CD105、及びCD200を発現し、
CD34を発現しない胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団を形成するために、
該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の具体的な実施形態では、細胞
集団は、(a)基質に接着し、(b)CD10、CD90、CD105、及びCD200
を発現し、CD34及びCD45を発現しない胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞
集団を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。別の具体
的な実施形態では、細胞集団は、CD10、CD90、CD105、及びCD200を発
現し、CD34及びCD45を発現しない胎盤細胞を選択すること、ならびに、細胞集団
を形成するために、該細胞を他の細胞から単離することにより産生される。
む細胞集団の選択を、同様に、単離することができる、または得ることができる。
BCトランスポータータンパク質、例えば、Allikmets et al., Ca
ncer Res. 58(23):5337-9 (1998)を参照のこと)を発現
する胎盤細胞を選択することをさらに含むことができる。方法は、例えば、間葉系幹細胞
に特有の少なくとも1つの特徴、例えば、CD44の発現、CD90の発現、または上述
の組み合わせの発現を示す細胞を選択することを含むこともできる。
達成することができる任意の表面であることができる。通常、基質は、プラスチック、例
えば、組織培養皿またはマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチッ
クは、生体分子、例えば、ラミニンまたはフィブロネクチンでコーティングすることがで
きる。
より、胎盤細胞集団について選択することができる。例えば、細胞は、1つ以上の細胞表
面マーカーに対する抗体(複数可)を使用して、例えば、フローサイトメトリーまたはF
ACSで選択することができる。選択は、磁気ビーズと共に抗体を使用して達成すること
ができる。特定の幹細胞関連マーカー特異的である抗体は、当該技術分野で既知である。
例えば、OCT-4(Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ)、CD200(A
bcam)、HLA-G(Abcam)、CD73(BD Biosciences P
harmingen、カルフォルニア州サンディエゴ)、CD105(Abcam;Bi
oDesign International、メイン州ソコー)に対する抗体などであ
る。他のマーカーに対する抗体もまた、市販されており、例えば、CD34、CD38、
及びCD45に対するものは、例えば、StemCell Technologiesま
たはBioDesign Internationalから入手可能である。
とができる。
盤由来接着細胞ではない胎盤細胞、または、例えば、胎盤細胞ではない細胞、を含むこと
ができる。例えば、胎盤由来接着細胞の単離集団は、第2型の細胞の集団を含むことがで
き、例えば、これと組み合わせることができ、該第2型の細胞は、例えば、胚性幹細胞、
血液細胞(例えば、胎盤血、胎盤血細胞、臍帯血、臍帯血細胞、末梢血、末梢血細胞、胎
盤血由来の有核細胞、臍帯血、または末梢血など)、血液から単離された幹細胞(例えば
、胎盤血、臍帯血、または末梢血から単離された幹細胞)、胎盤灌流液由来の有核細胞、
例えば、胎盤灌流液の全有核細胞;臍帯幹細胞、血液由来有核細胞の集団、骨髄由来間葉
系間質細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来造血幹細胞、粗骨髄、成体(体性)幹細胞
、組織内に含有される幹細胞の集団、培養細胞、例えば、培養幹細胞、完全分化細胞(例
えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓細胞など)の集団、周
皮細胞などである。具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団は、胎盤
幹細胞または臍帯由来の幹細胞を含む。第2型の細胞が、血液または血液細胞である、あ
る特定の実施形態では、赤血球が、細胞の集団から除去されている。
、例えば、未処理の胎盤、臍帯血、または末梢血内;胎盤血、臍帯血、または末梢血由来
の全有核細胞中;胎盤血、臍帯血、または末梢血由来のCD34+細胞の単離集団中;未
処理の骨髄中;骨髄由来の全有核細胞中;骨髄由来のCD34+細胞の単離集団中などに
含有される可能性がある。
駆細胞と組み合わされる。種々の実施形態では、細胞は、内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細
胞、心筋細胞、周皮細胞、血管芽細胞、筋芽細胞、または心筋芽細胞である。
を発現するために、培養中操作された非胚性細胞型である。
型の細胞の一方またはその両方は、細胞の意図されるレシピエントに対し自己由来である
、または同種異系である。
具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞及び間葉系間質または幹細胞、例え
ば、骨髄由来間葉系間質または幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、骨
髄由来造血幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞及び
造血前駆細胞細胞、例えば、骨髄、胎児の血液、臍帯血、胎盤血及び/または末梢血由来
の造血前駆細胞細胞、を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞
及び体性幹細胞を含む。より具体的な実施形態では、該体性幹細胞は、神経幹細胞、肝臓
幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、または筋幹細胞である。
は多くとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または
50%を占める。他の具体的な実施形態では、該組成物中のPDACは、該組成物中の細
胞の少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%また
は90%を占める。他の具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞は、該集団中の細胞の
約、少なくとも、または多くとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、4
0%、または45%を占める。
00,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、1
0,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,00
0,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50
,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1
、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:
1、5:1、2:1、1:1;1:2;1:5;1:10;1:100;1:200;1
:500;1:1,000;1:2,000;1:5,000;1:10,000;1:
20,000;1:50,000;1:100,000;1:500,000;1:1,
000,000;1:2,000,000;1:5,000,000;1:10,000
,000;1:20,000,000;1:50,000,000;または約1:100
,000,000の比率で、別の型の複数の細胞と、例えば、幹細胞の集団と、組み合わ
せることができる。胎盤由来接着細胞の単離集団中の細胞は、同様に、複数の細胞型の複
数の細胞と組み合わせることができる。
形成胎盤接着細胞(OPAC)、例えば、「Methods and Composit
ions for Treatment of Bone Defects With
Placental Stem Cells」という名称の2009年8月24日に出願
された特許出願第12/546,556号に記載のOPACと組み合わされる、または羊
膜由来血管新生細胞(AMDAC)、例えば、「Amnion Derived Ang
iogenic Cells」という名称の米国特許出願第12/622,352号(こ
の開示は、その全体が本明細書で参照により組み込まれる)に記載のAMDACと組み合
わされる。
本明細書、例えば、セクション5.1、に記載の胎盤細胞は、本明細書に記載の方法及
び組成物に使用される、生理学的に許容されるまたは医学的に許容される化合物、組成物
、またはデバイスと組み合わせることができる。本明細書で提供される治療の方法に有用
な組成物は、本明細書に記載の胎盤細胞のうちの任意の1つ以上を含むことができる。あ
る特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される組成物、例えば、薬学的に許容さ
れる担体中の胎盤細胞を含む組成物、である。
胞化マトリックスまたは合成マトリックス、をさらに含む。別の具体的な実施形態では、
該マトリックスは、三次元の足場である。別の具体的な実施形態では、該マトリックスは
、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン、または
ビトロネクチンを含む。別の具体的な一実施形態では、マトリックスは、羊膜または羊膜
由来生体材料である。別の具体的な実施形態では、該マトリックスは、細胞外膜タンパク
質を含む。別の具体的な実施形態では、該マトリックスは、合成化合物を含む。別の具体
的な実施形態では、該マトリックスは、生物活性化合物を含む。別の具体的な実施形態で
は、該生物活性化合物は、成長因子、サイトカイン、抗体、または5,000ダルトン未
満の有機分子である。
胞のいずれか、または上述の胎盤細胞集団のいずれかにより馴化された培地を含む。
本明細書に記載の方法及び組成物に有用な単離胎盤細胞集団は、保存、例えば、後で使
用するために低温保存することができる。幹細胞などの細胞の低温保存のための方法は、
当該技術分野において周知である。単離胎盤細胞集団は、個体に容易に投与することがで
きる形態、例えば、医療用途に適する容器に含有される単離胎盤細胞集団、に調製するこ
とができる。そのような容器は、例えば、シリンジ、滅菌プラスチックバッグ、フラスコ
、ジャー、または単離胎盤細胞集団が容易に出すことができる他の容器であることができ
る。例えば、容器は、血液バッグまたは液体のレシピエントに対する静脈内投与に適する
他のプラスチックの医学的に許容されるバッグであることができる。ある特定の実施形態
では、容器は、組み合わされた細胞集団の低温保存を可能にするものである。
胞を含むことができる。単離胎盤細胞集団は、意図されるレシピエントに完全にHLA適
合である、または、部分的若しくは完全にHLA不適合である可能性がある。
培養プラスチック接着性胎盤細胞集団を含む組成物の形態で本明細書に記載することがで
きる。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、低温保存される。別の具体的な実施形態
では、容器は、バッグ、フラスコ、または瓶である。別の具体的な実施形態では、該バッ
グは、滅菌プラスチックバッグである。別の具体的な実施形態では、該バッグは、例えば
、静脈内注入による、該単離胎盤細胞集団の静脈内投与に適する、可能にする、または容
易にする。バッグは、投与の前または間に、単離胎盤細胞及び1つ以上の他の溶液、例え
ば、薬物、の混合を可能にするために相互に連結される複数のルーメンまたはコンパート
メントを含むことができる。別の具体的な実施形態では、組成物は、組み合わされた細胞
集団の低温保存を容易にする1つ以上の化合物を含む。別の具体的な実施形態では、該単
離胎盤細胞集団は、生理学的に許容される水溶液内に含有される。別の具体的な実施形態
では、該生理学的に許容される水溶液は、0.9%のNaCl溶液である。別の具体的な
実施形態では、該単離胎盤細胞集団は、該細胞集団のレシピエントにHLA適合である胎
盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、該組み合わされた細胞集団は、該細胞集団の
レシピエントに少なくとも部分的にHLA不適合である胎盤細胞を含む。別の具体的な実
施形態では、該単離胎盤細胞は、複数のドナーに由来する。
D105+胎盤細胞であり、該細胞は、低温保存されており、容器内に含有されている。
具体的な実施形態では、該CD10+、CD34-、CD105+胎盤細胞はまた、CD
200+である。別の具体的な実施形態では、該CD10+、CD34-、CD105+
、CD200+胎盤細胞はまた、CD45-またはCD90+である。別の具体的な実施
形態では、該CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤細胞はまた、C
D45-及びCD90+である。別の具体的な実施形態では、CD34-、CD10+、
CD105+胎盤細胞はさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、C
D44+、CD45-、CD54+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH
3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、
SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VE
カドヘリンdim、CD184/CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-
4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HL
A-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-、HLA-G-、若しくはプログラム死
1リガンド(PDL1)+のうちの1つ以上、またはそれらの任意の組み合わせである。
別の具体的な実施形態では、CD34-、CD10+、CD105+胎盤細胞はさらに、
CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54
/ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+(CD73+)、
SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+(CD105
+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VEカドヘリンdim、C
D184/CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、
SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A,B,C+、H
LA-DP,DQ,DR-、HLA-G-、及びプログラム死1リガンド(PDL1)+
である。
-胎盤細胞であり、該細胞は、低温保存されており、容器内に含有されている。別の実施
形態では、単離胎盤細胞は、低温保存されており、容器内に含有されているCD73+、
CD105+、CD200+細胞である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、低温保存
されており、容器内に含有されているCD200+、OCT-4+幹細胞である。別の実
施形態では、単離胎盤細胞は、低温保存されており、容器内に含有されているCD73+
、CD105+細胞であり、該単離胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で
胎盤細胞の集団と培養される時、1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする。別の実施形
態では、単離胎盤細胞は、低温保存されており、容器内に含有されているCD73+、C
D105+、HLA-G-細胞である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、低温保存さ
れており、容器内に含有されているOCT-4+胎盤細胞であり、該細胞は、胚様体様体
の形成を可能にする条件下で胎盤細胞の集団と培養される時、1つ以上の胚様体様体の形
成を容易にする。
るようなCD34-、CD10+及びCD105+(例えば、PDAC)である胎盤幹細
胞または胎盤多分化能細胞である。別の具体的な実施形態では、単離CD34-、CD1
0+、CD105+胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、または軟骨形
成表現型の細胞に分化する可能性がある。別の具体的な実施形態では、単離CD34-、
CD10+、CD105+胎盤細胞はさらに、CD200+である。別の具体的な実施形
態では、単離CD34-、CD10+、CD105+胎盤細胞はさらに、フローサイトメ
トリーで検出されるようなCD90+またはCD45-である。別の具体的な実施形態で
は、単離CD34-、CD10+、CD105+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリ
ーで検出されるようなCD90+またはCD45-である。別の具体的な実施形態では、
CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤細胞はさらに、フローサイト
メトリーで検出されるようなCD90+またはCD45-である。別の具体的な実施形態
では、CD34-、CD10+、CD105+、CD200+細胞はさらに、フローサイ
トメトリーで検出されるようなCD90+及びCD45-である。別の具体的な実施形態
では、CD34-、CD10+、CD105+、CD200+、CD90+、CD45-
細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるようなCD80-及びCD86-であ
る。別の具体的な実施形態では、CD34-、CD10+、CD105+細胞はさらに、
CD29+、CD38-、CD44+、CD54+、CD80-、CD86-、SH3+
、またはSH4+のうちの1つ以上である。別の具体的な実施形態では、細胞はさらに、
CD44+である。上記単離CD34-、CD10+、CD105+胎盤細胞のいずれか
の具体的な実施形態では、細胞はさらに、CD117-、CD133-、KDR-(VE
GFR2-)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-、及び/またはPD
L1+のうちの1つ以上である。
ッグである。種々の具体的な実施形態では、該容器は、約少なくともまたは多くとも1×
106の該単離胎盤細胞、5×106の該単離胎盤細胞、1×107の該単離胎盤細胞、
5×107の該単離胎盤細胞、1×108の該単離胎盤細胞、5×108の該単離胎盤細
胞、1×109の該単離胎盤細胞、5×109の該単離胎盤細胞、1×1010の該単離
胎盤細胞、または1×1010の該単離胎盤細胞を含む。上述の低温保存された集団のい
ずれかの他の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞は、約、少なくとも、または多くと
も5回、多くとも10回、多くとも15回、または多くとも20回継代されている。上述
の低温保存された単離胎盤細胞のいずれかの別の具体的な実施形態では、該単離胎盤細胞
は、該容器内で拡大されている。
ある特定の実施形態では、胎盤由来接着細胞の単回単位用量は、種々の実施形態では、約
、少なくとも、または多くとも1×103、3×103、5×103、1×104、3×
104、5×104、1×105、3×105、5×105、1×106、3×106、
5×106、1×107、3×107、5×107、1×108、3×108、5×10
8、1×109、5×109、または1×1010の胎盤細胞を含むことができる。ある
特定の実施形態では、胎盤由来接着細胞の単回単位用量は、1×103~3×103、3
×103~5×103、5×103~1×104、1×104~3×104、3×104
~5×104、5×104~1×105、1×105~3×105、3×105~5×1
05、5×105~1×106、1×106~3×106、3×106~5×106、5
×106~1×107、1×107~3×107、3×107~5×107、5×107
~1×108、1×108~3×108、3×108~5×108、5×108~1×1
09、1×109~5×109、または5×109~1×1010の間の胎盤細胞を含む
ことができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、50%以
上の生細胞を含む(つまり、集団中の細胞の少なくとも50%は、機能しうる、または生
きている)胎盤由来接着細胞の集団を含む。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも60
%は、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団中の細胞の少なくとも70
%、80%、90%、95%、または99%は、生存可能である。
単離胎盤細胞の集団、例えば、PDAC、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、イ
ンビボで、例えば、本明細書で提供される治療方法で、使用される医薬組成物に製剤化す
ることができる。このような医薬組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、食塩水、
または他の許容される、インビボ投与に対し生理学的に許容される溶液中に、単離胎盤細
胞の集団、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団を含む。本明細書に記載の単離胎盤細胞
を含む医薬組成物は、本明細書の他の箇所に記載の、単離胎盤細胞集団、または単離胎盤
細胞のいずれか、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。医薬組成物は、
胎児、母体、または胎児及び母体両方の単離胎盤細胞を含むことができる。本明細書で提
供される医薬組成物は、単一の個体若しくは胎盤から、または、複数の個体若しくは胎盤
から得られた単離胎盤細胞をさらに含むことができる。
えば、単回単位用量の胎盤由来接着細胞は、約、少なくとも、若しくは多くとも1×10
3、3×103、5×103、1×104、3×104、5×104、1×105、3×
105、5×105、1×106、3×106、5×106、1×107、3×107、
5×107、1×108、3×108、5×108、1×109、5×109、若しくは
1×1010の胎盤細胞、または、1×103~3×103、3×103~5×103、
5×103~1×104、1×104~3×104、3×104~5×104、5×10
4~1×105、1×105~3×105、3×105~5×105、5×105~1×
106、1×106~3×106、3×106~5×106、5×106~1×107、
1×107~3×107、3×107~5×107、5×107~1×108、1×10
8~3×108、3×108~5×108、5×108~1×109、1×109~5×
109、若しくは5×109~1×1010の胎盤細胞を含むことができる。
する対象に1回投与される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物
は、糖尿病性足部潰瘍に罹患している対象に、複数回、例えば、2回、3回、4回、5回
、6回、7回、8回、9回、10回、または10回を超えて投与される。投薬間の間隔は
、毎週、隔週、毎月、隔月、または毎年であることができる。間隔は、不規則であること
もできる。このようなレジメンに従って投与される胎盤幹細胞の用量は、1×103、3
×103、5×103、1×104、3×104、5×104、1×105、3×105
、5×105、1×106、3×106、5×106、1×107、3×107、5×1
07、1×108、3×108、5×108、1×109、5×109、若しくは1×1
010の胎盤細胞、または、1×103~3×103、3×103~5×103、5×1
03~1×104、1×104~3×104、3×104~5×104、5×104~1
×105、1×105~3×105、3×105~5×105、5×105~1×106
、1×106~3×106、3×106~5×106、5×106~1×107、1×1
07~3×107、3×107~5×107、5×107~1×108、1×108~3
×108、3×108~5×108、5×108~1×109、1×109~5×109
、若しくは5×109~1×1010の胎盤幹細胞を含むが、これらに制限されない。具
体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、1×103の胎盤幹細胞であ
る。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、3×103の胎盤
幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、3×1
04の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量
は、3×105の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹
細胞の用量は、1×106の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物
中の胎盤幹細胞の用量は、3×106の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、
医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、3×107の胎盤幹細胞である。
0+、CD34-胎盤幹細胞)を含む医薬組成物は、単回投与として、糖尿病性足部潰瘍
に罹患している対象に1回投与される。ある特定の実施形態では、胎盤幹細胞(例えば、
CD10+、CD105+、CD200+、CD34-胎盤幹細胞)を含む医薬組成物は
、単回投与、続いて、約1週間後に2回目投与、として糖尿病性足部潰瘍を有する対象に
投与される。ある特定の実施形態では、胎盤幹細胞(例えば、CD10+、CD105+
、CD200+、CD34-胎盤幹細胞)を含む医薬組成物は、単回投与、続いて、約1
週間後に2回目投与及びその約1週間後(すなわち、最初の投与の約2週間後)に3回目
投与として糖尿病性足部潰瘍を有する対象に投与される。このようなレジメンに従って投
与される胎盤幹細胞の用量は、1×103、3×103、5×103、1×104、3×
104、5×104、1×105、3×105、5×105、1×106、3×106、
5×106、1×107、3×107、5×107、1×108、3×108、5×10
8、1×109、5×109、若しくは1×1010の胎盤細胞、または、1×103~
3×103、3×103~5×103、5×103~1×104、1×104~3×10
4、3×104~5×104、5×104~1×105、1×105~3×105、3×
105~5×105、5×105~1×106、1×106~3×106、3×106~
5×106、5×106~1×107、1×107~3×107、3×107~5×10
7、5×107~1×108、1×108~3×108、3×108~5×108、5×
108~1×109、1×109~5×109、若しくは5×109~1×1010の胎
盤幹細胞を含むが、これらに制限されない。具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤
幹細胞の用量は、1×103の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成
物中の胎盤幹細胞の用量は、3×103の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では
、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、3×104の胎盤幹細胞である。別の具体的な実
施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、3×105の胎盤幹細胞である。別の
具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、1×106の胎盤幹細胞で
ある。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、3×106の胎
盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、3×
107の胎盤幹細胞である。
0+、CD34-胎盤幹細胞)を含む医薬組成物は、単回投与、続いて、その約1ヶ月後
(例えば、最初の投与の約27、28、29、30、31、32、または33日後)に2
回目投与、として糖尿病性足部潰瘍を有する対象に投与される。ある特定の実施形態では
、胎盤幹細胞(例えば、CD10+、CD105+、CD200+、CD34-胎盤幹細
胞)を含む医薬組成物は、単回投与、続いて、約1ヶ月後に2回目投与及びその約1ヶ月
後(すなわち、最初の投与の約2ヶ月後、例えば、最初の投与後55、56、57、58
、59、60、61、62、63、または64日目またはその頃)に3回目投与として、
糖尿病性足部潰瘍を有する対象に投与される。このようなレジメンに従って投与される胎
盤幹細胞の用量は、1×103、3×103、5×103、1×104、3×104、5
×104、1×105、3×105、5×105、1×106、3×106、5×106
、1×107、3×107、5×107、1×108、3×108、5×108、1×1
09、5×109、若しくは1×1010の胎盤細胞、または、1×103~3×103
、3×103~5×103、5×103~1×104、1×104~3×104、3×1
04~5×104、5×104~1×105、1×105~3×105、3×105~5
×105、5×105~1×106、1×106~3×106、3×106~5×106
、5×106~1×107、1×107~3×107、3×107~5×107、5×1
07~1×108、1×108~3×108、3×108~5×108、5×108~1
×109、1×109~5×109、若しくは5×109~1×1010の胎盤幹細胞を
含むが、これらに制限されない。具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用
量は、1×103の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤
幹細胞の用量は、3×103の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、医薬組成
物中の胎盤幹細胞の用量は、3×104の胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では
、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、3×105の胎盤幹細胞である。別の具体的な実
施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、1×106の胎盤幹細胞である。別の
具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、3×106の胎盤幹細胞で
ある。別の具体的な実施形態では、医薬組成物中の胎盤幹細胞の用量は、3×107の胎
盤幹細胞である。
なくとも50%は、機能しうる、または生きている)を含む細胞の集団を含む。好ましく
は、集団中の細胞の少なくとも60%は、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物
中の集団中の細胞の少なくとも70%、80%、90%、95%、または99%は、生存
可能である。
えば、抗T細胞受容体抗体、免疫抑制剤など);アルブミン、デキストラン40、ゼラチ
ン、ヒドロキシエチル、デンプン、プラズマライト(Plasmalyte)などの安定
剤を含むことができる。
のHSA及び約2.5%のデキストランを含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、
5%のHSA及び10%のデキストランを含む、任意に、免疫抑制剤、例えば、10mg
/kgの、例えば、シクロスポリンAを含む溶液中、約5×106細胞/mL~約2×1
07細胞/mLを含む。
、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含み、該医薬組成物は、約1.0±0.
3×106細胞/mL~約5.0±1.5×106細胞/mLを含む。他の実施形態では
、医薬組成物は、約1.5×106細胞/mL~約3.75×106細胞/mLを含む。
他の実施形態では、医薬組成物は、約1×106細胞/mL~約50×106細胞/mL
、約1×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約1×106細胞/mL~約3
0×106細胞/mL、約1×106細胞/mL~約20×106細胞/mL、約1×1
06細胞/mL~約15×106細胞/mL、または約1×106細胞/mL~約10×
106細胞/mLを含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、目に見える細胞塊(
すなわち、マクロ細胞塊)を含まない、またはこのような目に見える塊を実質的に含まな
い。本明細書で使用される場合、「マクロ細胞塊」は、拡大なしで目に見える、例えば、
裸眼で見える、細胞の凝集を意味し、一般に、約150ミクロンよりも大きい細胞凝集を
指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約2.5%、3.0%、3.5%、4.
0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.
0%、8.5%、9.0%、9.5%、または10%のデキストラン、例えば、デキスト
ラン40を含む。具体的な実施形態では、該組成物は、約7.5%~約9%のデキストラ
ン40を含む。具体的な実施形態では、該組成物は、約5.5%のデキストラン40を含
む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約1%~約15%のヒト血清アルブミン(
HSA)を含む。具体的な実施形態では、医薬組成物は、約1%、2%、3%、4%、5
%、65、75、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、または15%
のHSAを含む。具体的な実施形態では、該細胞は、低温保存及び解凍されている。別の
具体的な実施形態では、該細胞は、70μM~100μMのフィルタに通して濾過されて
いる。別の具体的な実施形態では、該組成物は、目に見える細胞塊を含まない。別の具体
的な実施形態では、該組成物は、106の細胞当たり約200未満の細胞塊を含み、該細
胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡、のみで見える。別の具体的な実施形態では、該組
成物は、106細胞当たり約150未満の細胞塊を含み、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、
光学顕微鏡、のみで見える。別の具体的な実施形態では、該組成物は、106細胞当たり
約100未満の細胞塊を含み、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡、のみで見える
。
.5%のデキストラン40(w/v)、約10%のHSA(w/v)、及び約5%のDM
SO(v/v)を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書で提供される胎盤幹細胞を
含む医薬組成物は、約5.75%のデキストラン40、約10%のヒト血清アルブミン、
及び約2.5%のDMSOを含む。
胞、例えば、複数の単離胎盤細胞を含み、医薬組成物は、約1.0±0.3×106細胞
/mL及び~約5.0±1.5×106細胞/mLを含み、該組成物は、肉眼で目に見え
る細胞塊を含まない(すなわち、マクロ細胞塊を含まない)。いくつかの実施形態では、
医薬組成物は、約1.5×106細胞/mL~約3.75×106細胞/mLを含む。あ
る特定の実施形態では、該細胞は、低温保存及び解凍されている。別の具体的な実施形態
では、該細胞は、70μM~100μMのフィルタに通して濾過されている。別の具体的
な実施形態では、該組成物は、106の細胞当たり約200マイクロ未満の細胞塊(つま
り、拡大でのみ見える細胞塊)を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、10
6の細胞当たり約150マイクロ未満の細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、医薬
組成物は、106の細胞当たり約100マイクロ未満の細胞塊を含む。別の具体的な実施
形態では、医薬組成物は、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8
%、7%、6%、5%、4%、3%、若しくは2%未満のDMSO、または1%、0.9
%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、若しく
は0.1%未満のDMSOを含む。
の1つにより生成される。例えば、一実施形態では、医薬組成物は、細胞を含み、医薬組
成物は、濾過された細胞含有溶液を形成するために、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞また
は胎盤多分化能細胞、を含む溶液を濾過すること;例えば、低温保存の前に、約1~50
×106、1~40×106、1~30×106、1~20×106、1~15×106
、または1~10×106細胞/mLまで、第1の溶液で、濾過された細胞含有溶液を希
釈すること;及び、該組成物を生成するために、デキストランを含むが、ヒト血清アルブ
ミン(HSA)を含まない第2の溶液で、得られた濾過された細胞含有溶液を希釈するこ
と、を含む方法により生成される。ある特定の実施形態では、該希釈は、多くとも約15
×106細胞/mLまでである。ある特定の実施形態では、該希釈は、多くとも約10±
3×106細胞/mLまでである。ある特定の実施形態では、該希釈は、多くとも約7.
5×106細胞/mLまでである。他のある特定の実施形態では、濾過された細胞含有溶
液が、希釈前に、約15×106細胞/mL未満を含む場合、濾過は、任意である。他の
ある特定の実施形態では、濾過された細胞含有溶液が、希釈前に、約10±3×106細
胞/mL未満を含む場合、濾過は、任意である。他のある特定の実施形態では、濾過され
た細胞含有溶液が、希釈前に、約7.5×106細胞/mL未満を含む場合、濾過は、任
意である。
釈の間に、低温保存される。別の具体的な実施形態では、第1の希釈液は、デキストラン
及びHSAを含む。第1の希釈液または第2の希釈液中のデキストランは、任意の分子量
のデキストラン、例えば、約10kDa~約150kDaの分子量を有するデキストラン
であることができる。いくつかの実施形態では、該第1の希釈液または該第2の溶液中の
該デキストランは、約2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、
5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%8.0%、8.5%、9.0%、9
.5%、または10%のデキストランである。別の具体的な実施形態では、該第1の希釈
液または該第2の希釈液中のデキストランは、デキストラン40である。別の具体的な実
施形態では、該第1の希釈液及び該第2の希釈液中のデキストランは、デキストラン40
である。別の具体的な実施形態では、該第1の希釈液中の該デキストラン40は、5.0
%のデキストラン40である。別の具体的な実施形態では、該第1の希釈液中の該デキス
トラン40は、5.5%のデキストラン40である。別の具体的な実施形態では、該第2
の希釈液中の該デキストラン40は、10%のデキストラン40である。別の具体的な実
施形態では、HSAを含む該溶液中の該HSAは、1~15%のHSAである。別の具体
的な実施形態では、HSAを含む該溶液中の該HSAは、約1%、2%、3%、4%、5
%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、または15%
のHSAである。別の具体的な実施形態では、HSAを含む該溶液中の該HSAは、10
%のHSAである。別の具体的な実施形態では、該第1の希釈液は、HSAを含む。別の
具体的な実施形態では、該第1の希釈液中の該HSAは、10%のHSAである。別の具
体的な実施形態では、該第1の希釈液は、凍結防止剤を含む。別の具体的な実施形態では
、該凍結防止剤は、DMSOである。別の具体的な実施形態では、該第2の希釈液中の該
デキストラン40は、約10%のデキストラン40である。別の具体的な実施形態では、
細胞を含む該組成物は、約7.5%~約9%のデキストランを含む。別の具体的な実施形
態では、医薬組成物は、約1.0±0.3×106細胞/mL~約5.0±1.5×10
6細胞/mLを含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、約1.5×106細胞
/mL~約3.75×106細胞/mLを含む。
低温保存前に、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞、を含む細胞含有
溶液を濾過すること;(b)約1~50×106、1~40×106、1~30×106
、1~20×106、1~15×106、または1~10×106細胞/mLの、濾過さ
れた細胞含有溶液中の細胞を低温保存すること;(c)細胞を解凍すること;及び、(d
)デキストラン40溶液で、約1:1~約1:11(v/v)に、濾過された細胞含有溶
液を希釈すること、を含む方法により作製される。ある特定の実施形態では、細胞の数が
、ステップ(a)の前に、約10±3×106未満細胞/mLである場合、濾過は任意で
ある。別の具体的な実施形態では、ステップ(b)の細胞は、約10±3×106細胞/
mLで低温保存される。別の具体的な実施形態では、ステップ(b)の細胞は、約5%~
約10%のデキストラン40及びHSAを含む溶液中で低温保存される。ある特定の実施
形態では、ステップ(b)の該希釈は、多くとも約15×106細胞/mLまでである。
SAを含む5.5%のデキストラン40溶液に、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎
盤多分化能細胞、を懸濁すること;(b)70μMのフィルタに通して、細胞含有溶液を
濾過すること;(c)約1~50×106、1~40×106、1~30×106、1~
20×106、1~15×106、または1~10×106細胞/mLまで、5.5%の
デキストラン40、10%のHSA、及び5%のDMSOを含む溶液で、細胞含有溶液を
希釈すること;(d)細胞を低温保存すること;(e)細胞を解凍すること;ならびに、
(f)10%のデキストラン40で、1:1~1:11(v/v)に、細胞含有溶液を希
釈すること、を含む方法により作製される。ある特定の実施形態では、ステップ(c)の
該希釈は、多くとも約15×106細胞/mLである。ある特定の実施形態では、ステッ
プ(c)の該希釈は、多くとも約10±3×106細胞/mLである。ある特定の実施形
態では、ステップ(c)の該希釈は、多くとも約7.5×106細胞/mLである。
遠心分離すること;(b)5.5%のデキストラン40中に、細胞を再懸濁すること;(
c)細胞を収集するために、細胞を遠心分離すること;(d)10%のHSAを含む5.
5%のデキストラン40溶液中に、細胞を再懸濁すること;(e)70μMのフィルタに
通して、細胞を濾過すること;(f)約1~50×106、1~40×106、1~30
×106、1~20×106、1~15×106、または1~10×106細胞/mLま
で、5.5%のデキストラン40、10%のHSA、及び5%のDMSO中に、細胞を希
釈すること;(g)細胞を低温保存すること;(h)細胞を解凍すること;ならびに、(
i)10%のデキストラン40で、1:1~1:11(v/v)に細胞を希釈すること、
を含む方法により作製される。ある特定の実施形態では、ステップ(f)の該希釈は、多
くとも約15×106細胞/mLである。ある特定の実施形態では、ステップ(f)の該
希釈は、多くとも約10±3×106細胞/mLである。ある特定の実施形態では、ステ
ップ(f)の該希釈は、多くとも約7.5×106細胞/mLである。他のある特定の実
施形態では、細胞の数が、約10±3×106未満細胞/mLである場合、濾過は任意で
ある。
の単離胎盤細胞のいずれかを含むことができる。
児遺伝子型を有する単離胎盤細胞を含み;例えば、少なくとも約90%、95%、98%
、99%、または約100%は、由来が非母体である。例えば、一実施形態では、医薬組
成物は、CD200+及びHLA-G-;CD73+、CD105+、及びCD200+
;CD200+及びOCT-4+;CD73+、CD105+及びHLA-G-;CD7
3+及びCD105+であり、単離胎盤細胞の該集団を含む胎盤細胞の集団において、胎
盤細胞の該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される時、1つ以上の胚
様体様体の形成を容易にする;若しくは、OCT-4+であり、単離胎盤細胞の該集団を
含む胎盤細胞の集団において、胎盤細胞の該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件
下で培養される時、1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする;または、上述の組み合わ
せである単離胎盤細胞の集団を含み、該単離胎盤細胞の少なくとも70%、80%、90
%、95%、または99%は、由来が非母体である。別の実施形態では、医薬組成物は、
CD10+、CD105+、及びCD34-;CD10+、CD105+、CD200+
、及びCD34-;CD10+、CD105+、CD200+、CD34-、及びCD9
0+若しくはCD45-のうちの少なくとも1つ;CD10+、CD90+、CD105
+、CD200+、CD34-、及びCD45-;CD10+、CD90+、CD105
+、CD200+、CD34-、及びCD45-;CD200+、及びHLA-G-;C
D73+、CD105+、及びCD200+;CD200+、及びOCT-4+;CD7
3+、CD105+、及びHLA-G-;CD73+及びCD105+であり、該単離胎
盤細胞を含む胎盤細胞の集団において、胎盤細胞の該集団が、胚様体様体の形成を可能に
する条件下で培養される時、1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする;OCT-4+で
あり、該単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団において、胎盤細胞の該集団が、胚様体様体
の形成を可能にする条件下で培養される時、1つ以上の胚様体様体の形成を容易にする;
または、CD117-、CD133-、KDR-、CD80-、CD86-、HLA-A
,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-及び/若しくはPDL1+のうちの1つ以上で
ある;あるいは、上述の組み合わせである単離胎盤細胞の集団を含み、該単離胎盤細胞の
少なくとも70%、80%、90%、95%、または99%が、由来が非母体である。具
体的な実施形態では、医薬組成物はさらに、胎盤から得られない幹細胞を含む。
ーまたは複数のドナーに由来する胎盤細胞を含むことができる。単離胎盤細胞は、意図さ
れるレシピエントに完全にHLA適合である、または、部分的若しくは完全にHLA不適
合である可能性がある。
胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団を含むマトリックス、ヒドロゲル、足場などを含
む組成物がさらに、本明細書で提供される。そのような組成物は、懸濁液中の細胞の代わ
りに、またはそれに加えて使用することができる。
体材料上に播種することができる。そのような羊膜材料は、例えば、哺乳動物胎盤から直
接切除された羊膜;固定または熱処理された羊膜、実質的に乾燥した(すなわち、20%
未満のH2O)羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛
膜などであることができる。単離胎盤細胞が播種することができる好ましい胎盤生体材料
は、Hariri、米国特許出願公開第2004/0048796号に記載されており、
この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ことができる。そのような組成物に好適なヒドロゲルは、RAD16などの自己組織化ペ
プチドを含む。一実施形態では、細胞を含むヒドロゲル溶液は、移植のための、細胞がそ
の内部に分散したマトリックスを形成するために、例えば、鋳型内で、硬化させることが
できる。そのようなマトリックス中の単離胎盤細胞は、移植前に、細胞が有糸分裂的に拡
大するように培養することもできる。ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、ま
たは水素結合を介して架橋されて、ゲルを形成するために水分子を捕捉する3次元の開格
子構造を形成している、有機ポリマー(天然または合成)である。ヒドロゲル形成材料は
、イオン的に架橋される、アルギネート及びその塩などの多糖類、ペプチド、ポリホスフ
ァジン(polyphosphazines)、ならびにポリアクリレート、または、そ
れぞれ温度若しくはpHにより架橋されている、ポリエチレンオキシドポリプロピレング
リコールブロックコポリマーなどのブロックポリマーを含む。いくつかの実施形態では、
ヒドロゲルまたはマトリックスは、生分解性である。
米国特許公開公報第2002/0022676号(この開示は、全体が参照により本明細
書に組み込まれる);Anseth et al., J. Control Rele
ase, 78(1-3):199-209 (2002);Wang et al.,
Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003)を参照の
こと)。
性塩を有する、水、緩衝塩水溶液、またはアルコール水溶液などの水溶液に少なくとも部
分的に可溶性である。カチオンと反応することができる酸性側鎖基を有するポリマーの例
は、ポリ(ホスファゼン(phosphazenes))、ポリ(アクリル酸)、ポリ(
メタクリル酸)、アクリル酸及びメタクリル酸のコポリマー、ポリ(酢酸ビニル)、なら
びにスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリルまたはメタクリ
ル酸及びビニルエーテルモノマーまたはポリマーの反応により形成される酸性側鎖基を有
するコポリマーを、使用することもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基
、ハロゲン化(好ましくはフッ素化)アルコール基、フェノールOH基、及び酸性OH基
である。
CLコポリマー若しくはブレンド、またはヒアルロン酸、から作製されるマルチフィラメ
ントヤーンからなることができるフェルトである。ヤーンは、クリンピング、カッティン
グ、カーディング、及びニードリングからなる標準的な繊維加工技術を使用して、フェル
トに作製される。別の好ましい実施形態では、本発明の細胞は、コンポジット構造であり
得るフォーム足場上に播種される。加えて、3次元のフレームワークは、修復、交換、ま
たは向上されるべき、身体の特定の構造などの有用な形状に成形されてもよい。使用する
ことができる足場の他の例としては、不織布マット、多孔質フォーム、または自己組織化
ペプチドが挙げられる。不織布マットは、グリコール酸及び乳酸(例えば、PGA/PL
A)(VICRYL、Ethicon,Inc.、ニュージャージー州サマヴィル)合成
吸収性コポリマーからなる繊維を使用して形成することができる。例えば、凍結乾燥、ま
たは真空凍結乾燥(例えば、米国特許第6,355,699号を参照のこと)などのプロ
セスにより形成されるポリ(ε-カプロラクトン)/ポリ(グリコール酸)(PCL/P
GA)コポリマーからなるフォームも、足場として使用することもできる。
足場上に播種することができ、インビボで移植することができる。そのようなフレームワ
ークは、任意の1つ以上の成長因子、細胞、薬物、または他の構成成分、例えば、組織形
成を刺激する成分、と組み合わせて移植することができる。
組織化ペプチドが挙げられる。不織布マットは、グリコール酸及び乳酸(例えば、PGA
/PLA)(VICRYL、Ethicon,Inc.、ニュージャージー州サマヴィル
)合成吸収性コポリマーからなる繊維を使用して形成することができる。例えば、凍結乾
燥、または真空凍結乾燥などのプロセスにより形成されるポリ(ε-カプロラクトン)/
ポリ(グリコール酸)(PCL/PGA)コポリマーからなるフォーム(例えば、米国特
許第6,355,699号を参照のこと)も、足場として使用することができる。
くはブレンド、またはヒアルロン酸などの生体吸収材料から作製されるマルチフィラメン
トヤーンからなることができるフェルト上に播種することができる、または、これと接触
することができる。
るフォーム足場上に播種することができる。このようなフォーム足場は、修復、交換、ま
たは向上されるべき、身体中の特定の構造の一部のものなどの有用な形状に形成すること
ができる。いくつかの実施形態では、フレームワークは、細胞付着を増強するために、細
胞の接種前に、例えば、0.1Mの酢酸で処理され、続いて、ポリリシン、PBS、及び
/またはコラーゲン中でインキュベートされる。マトリックスの外部表面は、例えば、マ
トリックスを血漿コーティングすること、または、1つ以上のタンパク質(例えば、コラ
ーゲン、弾性繊維、網状繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、(例えば、ヘパ
リンスルフェート、コンドロイチン-4-スルフェート、コンドロイチン-6-スルフェ
ート、デルマタンスルフェート、ケラチンスルフェートなど)、細胞マトリックス、及び
/またはゼラチン、アルギネート、アガー、アガロース、及びゴムなどのこれらに限定さ
れない他の材料の添加により、細胞の付着または成長及び組織の分化を改善するために修
飾されてもよい。
処理される。これらの処理及び材料は、内皮成長、遊走、及び細胞外マトリックス沈着を
促進及び持続することもある。これらの材料及び処理の例としては、ラミニン及びIV型
コラーゲンなどの基底膜タンパク質などの天然材料、EPTFEならびにPURSPAN
(商標)(The Polymer Technology Group, Inc.、
カリフォルニア州バークレー)などのセグメント化ポリウレタン尿素シリコーンなどの合
成材料、が挙げられるが、これらに限定されない。足場は、ヘパリンなどの抗血栓剤を含
むこともでき、足場は、単離胎盤細胞を播種する前に、表面電荷を変えるために処理する
こと(例えば、血漿でコーティングすること)もできる。
二カルシウム、リン酸三カルシウム、α-リン酸三カルシウム、β-リン酸三カルシウム
、及びリン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウ
ム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウ
ム、BIOGLASS(登録商標)などの生物学的に活性なガラス、ならびにそれらの混
合物を含むが、これらに限定されない生理学的に許容されるセラミック材料上に播種する
こともできる、またはこれと接触できる。現在市販されている多孔性生体適合性セラミッ
ク材料は、URGIBONE(登録商標)(CanMedica Corp.、カナダ)
、ENDOBON(登録商標)(Merck Biomaterial France、
フランス)、CEROS(登録商標)(Mathys,AG、スイス・ベットラッハ)、
ならびに、HEALOS(商標)(DePuy,Inc.、マサチューセッツ州レイナム
)及びVITOSS(登録商標)、RHAKOSS(商標)、及びCORTOSS(登録
商標)(Orthovita、ペンシルベニア州モルバーン)などの石灰化コラーゲン骨
移植製品を含む。フレームワークは、天然及び/または合成材料の混合物、ブレンド、ま
たはコンポジットであることができる。
適な足場上に播種される、またはこれと接触する。
本実施例は、胎盤細胞(PDACとも呼ばれているCD10+、CD34-、CD10
5+、CD200+胎盤幹細胞)による、血管新生因子の分泌を実証する。
ome)プロファイリング
マルチプレックスビーズアッセイ:継代6回の胎盤由来接着細胞を、成長培地に、等し
い細胞数でプレーティングし、馴化培地を、48時間後に収集した。細胞馴化培地中の複
数の血管新生サイトカイン/成長因子の同時定性分析を、磁気ビーズをベースとするマル
チプレックスアッセイ(Bio-Plex Pro(商標)、Bio-Rad、カリフォ
ルニア州)を使用して実施した。アッセイは、血清、血漿、及び細胞/組織培養上清を含
む多様なマトリックス中の血管新生バイオマーカーの測定を可能にするものである。これ
らの96ウェルプレートフォーマットのビーズをベースとするアッセイは、捕捉サンドイ
ッチイムノアッセイと類似している。所望の血管新生標的に対する抗体が、内部染色され
たビーズに共有結合的に結合される。結合されたビーズを、血管新生標的を含有する試料
と反応させる。結合していないタンパク質を除去するための一連の洗浄後に、異なるエピ
トープに特異的なビオチン化検出抗体を、反応物に添加する。結果は、血管新生標的の周
りの抗体のサンドイッチの形成である。次に、ビーズ表面上のビオチン化検出抗体に結合
するために、ストレプトアビジンPEを、添加する。要約すると、マルチプレックスアッ
セイを、製造者の使用説明書に従って実施し、馴化培地中のそれぞれの血管新生成長因子
の量を評価した。
使用して、細胞馴化培地中の単一の血管新生サイトカイン/成長因子の定量的分析を実施
した。要約すると、ELISAアッセイを、製造者の使用説明書に従って実施し、馴化培
地中のそれぞれの血管新生成長因子の量を評価した。
M-1(CD31;血小板内皮細胞接着分子)、ラミニン、及びフィブロネクチンを分泌
することも確認された。
本実施例は、血管新生及び分化能力と関連する胎盤細胞(PDACとも呼ばれる、CD
10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞)の異なる特徴を実証する
。
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、3日間、EGM-2培地(Cambrex、ニ
ュージャージー州イーストラザフォード)中、継代3回以下で継代培養し、約70%~8
0%のコンフルエンシーで採取した。HUVECを、基礎培地/抗生物質(DMEM/F
12(Gibco))で1回洗浄し、所望の濃度で、同じ培地中に再懸濁した。HUVE
Cを、調製から1時間以内に使用した。ヒト胎盤コラーゲン(HPC)を、10mMのH
Cl(pH 2.25)中で1.5mg/mLの濃度にし、pH 7.2に緩衝液で中和
し、使用するまで氷上に保った。HPCを、4000細胞/μlの最終細胞濃度で、HU
VEC懸濁液と組み合わせた。得られたHUVEC/HPC懸濁液を、3μl/ウェルで
、96ウェルプレートに直ちにピペッティングした(プレート周囲は、蒸発を避けるため
に、滅菌PBSで予め充填しなければならない、条件ごとにn=5)。HUVEC滴を、
培地添加なしに、75~90分、37℃及び5%のCO2でインキュベートして、コラー
ゲンの重合を可能にした。「ドライ」インキュベーションの完了時に、各ウェルに、20
0μlの馴化PDAC培地(n=2細胞株)または対照培地(例えば、陰性対照としての
DMEM/F12、及び陽性対照としてのEGM-2)を静かに充填し、20時間、37
℃及び5%のCO2でインキュベートした。4~6時間、成長培地中、継代6回のPDA
Cをインキュベートすることにより、馴化培地を調製し;付着させて広げた後、培地を、
24時間、DMEM/F12に変更した。インキュベーション後に、培地を、HUVEC
滴を乱すことなく、ウェルから除去し、細胞をPBSで1回洗浄した。次に、HUVEC
滴を、Diff-Quik細胞染色キットを使用して、10秒間固定して、1分間染色し
、続いて、滅菌水で3回すすいだ。染色した滴を空気乾燥させ、Zeiss SteRe
o Discovery V8顕微鏡を使用して、各ウェルの画像を得た。次に、コンピ
ュータソフトウエアパッケージImageJ及び/またはMatLabを使用して、画像
を分析した。画像を、カラーから8ビットグレースケール画像に変換し、閾値を決定して
、白黒画像に変換した。次に、粒子分析機能を使用して画像を分析し、分析は、アッセイ
における内皮管腔形成の量と同等である、カウント(個々の粒子の数)、総面積、(個々
の粒子の)平均サイズ、及び面積率を含む、ピクセル密度データを提供した。
らす(図2を参照のこと)。
本実験は、胎盤由来接着細胞の血管新生能力を実証した。HUVECを、フィブロネク
チン(FN)コーティングされた12ウェルプレート中で、単一層コンフルエンスまで成
長させ、単一層を、1mLのプラスチックピペットの先端で「傷つけ」て、ウェル全体に
、細胞のない線を作成した。「傷つけた」細胞を、成長の3日後に、PDACから得られ
た無血清馴化培地(EBM2;Cambrex)でインキュベートすることにより、HU
VECの遊走を試験した。細胞を含まないEBM2培地を、対照として使用した。15時
間後に、倒立顕微鏡を使用して、細胞のない部分への細胞遊走を記録した(n=3)。次
に、コンピュータソフトウエアパッケージImageJ及び/またはMatLabを使用
して、写真を分析した。画像を、カラーから8ビットグレースケール画像に変換し、閾値
を決定して、白黒画像に変換した。次に、粒子分析機能を使用して画像を分析し、分析は
、アッセイにおける内皮遊走の量に等しい、カウント(個々の粒子の数)、総面積、(個
々の粒子の)平均サイズ、及び面積率を含む、ピクセル密度データを提供した。細胞遊走
の程度を、最初に記録された創傷線のサイズに対しスコア化し、結果を1x106の細胞
に正規化した。
に、内皮細胞に血管新生効果をもたらした(図3)。
ートの底部で培養し、続いて、EBM中で半日飢餓にした。同時に培地で培養されたPD
ACを解凍し、一晩、トランスウェル(8μM)中で培養した。EC飢餓の後、トランス
ウェルと共に馴化無血清DMEMを、一晩の増殖のために、ECに移した。4回の反復を
、各実験に含め、24時間後の増殖を、PromegaのCell Titer Glo
アッセイで評価した。EBM-2培地を、陰性対照として使用し、EGM-2を、陽性対
照として使用した。エラーバーは、分析的反復(n=3)の標準偏差を表す。
UVEC増殖を示す。図4を参照のこと。
一般に細胞の血管新生能及びVEGFの細胞の分化能における効果を評価するために、
VEGFを含まない成長培地中、またはVEGFを含むEGM2-MV中のいずれかで、
PDACを成長させた。管腔形成に対する対照としてのHUVECを、EGM2-MV中
で成長させた。細胞が70~80%のコンフルエンスに達するまで、細胞を、4~7日間
、各培地中で培養した。冷(4℃)MATRIGEL(商標)溶液(50μL;BD B
iosciences)を、12ウェルプレートのウェルに分注し、プレートを、37℃
で60分間インキュベートして、溶液をゲル化させた。PDAC及びHUVEC細胞を、
トリプシン処理し、(VEGFを含む及び含まない)適切な培地に再懸濁し、100μl
の希釈された細胞(1~3×104細胞)を、MATRIGEL(商標)含有ウェルのそ
れぞれに添加した。0.5~100ngのVEGFの存在下または不存在下での、重合さ
れたMATRIGEL(商標)上の細胞を、37℃、5%のCO2のインキュベーター内
に4~24時間置いた。インキュベーション後に、標準的な光学顕微鏡を使用して、細胞
を管腔形成の徴候について評価した。
通して、誘導/分化されて、管腔様構造を形成した。図5を参照のこと。
内皮細胞及び/または内皮前駆細胞の血管新生機能性を評価するために、細胞を、低酸
素及び正常酸素条件下での血管新生成長因子を分泌する能力に関して評価することができ
る。低酸素条件下での培養は通常、内皮細胞または内皮前駆細胞のいずれかによる血管新
生成長因子の分泌の増加を誘導し、これは、馴化培地中で測定できる。胎盤由来接着細胞
を、標準的な成長培地中、等しい細胞数でプレーティングし、成長させて約70~80%
のコンフルエンスに至らせた。続いて、細胞を、無血清培地(EBM-2)に切り替え、
24時間、正常酸素(21%のO2)または低酸素(1%のO2)条件下でインキュベー
トした。馴化培地を収集し、市販のR&D Systems製ELISAキットを使用し
て、血管新生成長因子の分泌を分析した。ELISAアッセイを、製造者の使用説明書に
従って実施し、馴化培地中のそれぞれの血管新生成長因子(VEGF及びIL-8)の量
を、1×106の細胞に正規化した。
図6を参照のこと。
PDACを、60%のDMEM-LG(Gibco)、40%のMCBD-201(S
igma)、2%のFBS(Hyclone Labs)、1×インスリン-トランスフ
ェリン-セレン(ITS)、10ng/mLのリノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-
BSA)、1nのデキサメタゾン(Sigma)、100μMのアスコルビン酸2-ホス
フェート(Sigma)、10ng/mLの上皮成長因子(R&D Systems)、
及び10ng/mLの血小板由来成長因子(PDGF-BB)(R&D Systems
)を含有する成長培地で、48時間培養し、次に、無血清培地で、さらに48時間培養し
た。PDAC培養物由来の馴化培地を、収集し、使用して、5、15、及び30分間、血
清飢餓HUVECを刺激した。続いて、HUVECを、溶解させ、血管新生経路シグナル
伝達に関与することが知られているリンタンパク質について、BD(商標) CBA(C
ytometric Bead Assay)Cell Signaling Flex
Kit (BD Biosciences)で染色した。PDACは、HUVECにお
ける、AKT-1(アポトーシスプロセスを阻害する)、AKT-2(インスリンシグナ
ル伝達経路における重要なシグナル伝達タンパク質である)、及びERK 1/2細胞増
殖経路の強いアクチベーターであることが判明した。これらの結果は、PDACの血管新
生能力をさらに実証する。
本実施例は、上記実施例1に記載されるようなPDACが、ニワトリ漿尿膜(CAM)
を使用して、インビボアッセイで血管新生を促進することを実証する。
調製物由来のインタクトな細胞ペレットを評価した。第2のCAMアッセイでは、異なる
PDAC調製物の上清を評価した。線維芽細胞増殖因子(bFGF)を、陽性対照として
使用し、MDA-MB-231ヒト乳癌細胞を参照として、ビヒクル、及び培地対照を陰
性対照として使用した。試験のエンドポイントは、全ての治療及び対照群の血管密度を測
定することであった。
上記のように調製され、低温保存されたPDACを使用した。PDACを、投与のため
に解凍し、CAM上に投与される細胞の数を決定した。
ュベーター内で、3日間インキュベートした。3日目に、卵を無菌条件下で割り、胚を、
20枚の100mmプラスチック皿に置き、一番下の棚上に貯水器を有する胚インキュベ
ーター内で、37℃で培養した。インキュベーター内の湿度を一定に保つように、小型ポ
ンプを使用して、空気を貯水器に連続的にバブリングした。6日目、滅菌シリコン「O」
リングを、各CAM上に置き、次に、7.69×105細胞/40μLの培地/MATR
IGEL(商標)混合物(1:1)の密度のPDACを、滅菌フード内の各「O」リング
に供給した。表2A及び2Bは、使用された細胞の数及び投与のための各細胞調製物に添
加された培地の量を表す。ビヒクル対照胚は、40μLのビヒクル(PBS/MATRI
GEL(商標)、1:1)を与えられ、陽性対照は、40μlのDMEM培地/MATR
IGEL(商標)混合物(1:1)中の100ng/mlのbFGFを与えられ、培地対
照は、40μlのDMEM培地単独を与えられた。各投与を完了した後に、胚をインキュ
ベーターに戻した。8日目に、胚をインキュベーターから取り出し、100倍の倍率で画
像キャプチャーシステムを使用して、血管密度を、各「O」リングの下で決定する間、室
温に保った。
たは指数の数1~32を使用した血管新生スコアリングシステムにより測定した。高いス
コア数は、高い血管密度を表したのに対し、0は、血管新生が無かったことを示した。各
個々の実験について対照試料から得られた平均スコアで割ったその部位で記録されたスコ
アを使用して、各投与部位での阻害のパーセントを計算した。8~10の胚からその投与
ついて得られた全ての結果をプールすることにより、所与の化合物の各投与に対する阻害
のパーセントを計算した。
投与のための最終細胞懸濁液の正規化のために、各細胞調製物に添加された培地の量
血管密度スコアの結果を、図7に提示する。結果は、PDAC細胞懸濁液、または10
0ng/mLのbFGF、またはMDAMB231乳癌細胞懸濁液で処理されたニワトリ
漿尿膜の血管密度スコアは、ビヒクル対照CAMのものと比較して統計的に有意に高かっ
たことを明確に示す(P<0.001、スチューデントの「t」検定)。PDACを培養
するために使用される培地(陰性対照)は、血管密度に何ら影響を及ぼさなかった。さら
に、PDAC調製物の血管密度の誘導は、多少の変動を示したが、変動は、統計的に有意
ではなかった。
MDA-MB-231細胞及びPDACからの上清試料を、上記のように第2のCAM
アッセイで使用した。bFGF及びMDA-MB-231上清を、陽性対照として使用し
、培地及びビヒクルを、陰性対照として使用した。
同じものであった。唯一の違いは、各幹細胞調製物またはMDA-MB-231細胞から
の上清が試験材料として使用されたことであった。投与のために、各上清をMATRIG
EL(商標)(容量で1:1)と混合し、40μLの混合物を、各胚に投与した。
の誘導が異なったことを示す。PDACからの上清試料は、それぞれ、P<0.01、P
<0.001、及びP<0.02(スチューデントの「t」検定)の血管誘導に有意な効
果を示した。予想通り、陽性対照bFGFも、上記CAMアッセイ番号1(P<0.00
1、スチューデントの「t」検定)に示されるように血管形成の強力な誘導を示した。し
かし、MDA-MB-231ヒト乳癌細胞からの上清は、ビヒクル対照と比較して、血管
形成に有意な誘導を示さなかった。先に示したように、培地単独は、何ら影響を及ぼさな
かった。
本実施例は、PDACが、酸素-グルコース欠乏(OGD)侵襲アッセイを使用して、
低酸素及び低グルコース条件で、ニューロン保護効果を有し、活性酸素種を低減させるこ
とを実証する。したがって、これらの結果は、PDACが、脳卒中または末梢血管疾患な
どの虚血状態の治療に有用であろうこと示す。
り培養した。要約すると、培養容器を、37℃で1時間、滅菌蒸留水中のポリ-L-リシ
ン(2μg/mL)でコーティングした。容器を、2回蒸留したH2Oで3回洗浄した。
ニューロン培地(ScienCell)を、容器に添加し、インキュベーター内で37℃
に平衡化した。ニューロンを解凍し、遠心分離なしに容器に直接添加した。後続の培養中
に、培地を、培養開始の翌日、及びその後1日おきに交換した。ニューロンは通常、4日
目までに侵襲の準備ができていた。
に温めることにより調製し、部分的に、液体培地中の酸素の溶解性を低減させた。溶存酸
素を除去するために、0.5μmの拡散石を使用して、100%の窒素を、培地に30分
間バブリングした。HEPES緩衝液を、1mMの終濃度で添加した。培地を、スパージ
の終わりに、直接ニューロンに添加した。ディップ式酸素センサを使用して酸素レベルの
確認のために、培地の少量試料を等分した。酸素レベルは通常、0.9%~約5.0%の
酸素に低減した。
ンキュベーター内にチャンバを置くことにより準備した。培養容器中の培地を除去し、脱
気された培地と交換し、培養容器を、低酸素チャンバ内に置いた。次に、低酸素チャンバ
を、少なくとも5分間、20~25Lpmの速度で系を通した95%のN2/5%のCO
2ガスでフラッシュした。系を、4時間、37℃のインキュベーター内でインキュベーシ
ョンし、1位時間後にもう一度チャンバを脱気した。
4~28時間後に、ニューロン培地中に懸濁されたPDAC及びニューロンを、6ウェル
プレートの1ウェル当たりそれぞれ100,000細胞の同等の数でプレーティングし、
ニューロンに添加し、6日間共培養した。
ューロン形態を有する細胞を、特定し、神経突起の長さを記録した。神経突起の平均長は
、ニューロンの健康状態と正相関し、ニューロン及びPDACの共培養において、より長
く、PDACが細胞を侵襲から保護していたことを示している。
PDACは、低酸素時に、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、及びヘムオキ
シゲナーゼ遺伝子を発現することが見出された。活性酸素種発生剤としての過酸化水素を
使用するアッセイにおいて、PDACの、活性酸素種を除去する及び細胞をこのような種
から保護する能力を決定した。
Laboratories)を、6000/cm2で、ポリ-L-リシンでプレコーテ
ィングされた96ウェル黒ウェルプレートに播種した。アストロサイトを、5%の二酸化
炭素と共に、37℃で成長培地中に一晩付着させる。翌日、培地を除去し、細胞を、蛍光
発生プローブである細胞透過性色素DCFH-DA(ジクロロフルオレシンジアセタート
)とインキュベートした。過剰な染料を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水またはハンク
の緩衝塩溶液で洗浄することにより除去した。次に、細胞を、30~60分間、1000
μMの過酸化水素の添加により、活性酸素種で侵襲した。次に、過酸化水素含有培地を除
去し、無血清グルコース不含成長培地と交換した。PDACを、6000/cm2で添加
し、細胞を、さらに24時間培養した。次に、細胞を、480Ex及び530Emの標準
蛍光プレートリーダーで、読み取った。培地の活性酸素種含有量は、細胞サイトゾル中の
DCFH-DAのレベルに正比例した。予め決定されたDCF標準曲線との比較により、
活性酸素種含有量を測定した。全ての実験を、N=24で行った。
トック溶液を1×に希釈すること及び均質に撹拌することにより、使用する直前に、1×
DCFH-DAを、調製した。過酸化水素(H202)希釈物を、必要に応じてDMEM
またはDPBS中で調製した。細胞培地中で、細胞培地中で、1mMのDCF標準液を希
釈すること、100μlのDCF標準液を、蛍光測定に適する96ウェルプレートに移す
こと、及び、100μlの細胞溶解緩衝液を加えることにより、標準的な曲線を、0μM
~10μMの範囲の濃度の1:10の希釈系列として、調製した。蛍光を、480Ex及
び530Emで読み取った。
。図9を参照のこと。
6.5.1 胎盤幹細胞を使用した糖尿病性足部潰瘍の治療
I型糖尿病の52歳男性は、左足に潰瘍を有する。糖尿病性足部潰瘍の診断を行う。診
断後に、対象を、次のレジメンに従ってCD10+、CD34-、CD105+、CD2
00+胎盤幹細胞で治療する:1×106~3×107のCD10+、CD34-、CD
105+、CD200+胎盤幹細胞を、筋肉内投与する。該個人を、特に、DFUが、サ
イズが低減しているか、または閉鎖されているかを判定するために、DFUの任意の症状
における改善の徴候について次の24時間にわたって監視する。DFUの症状のいずれか
が、監視期間中に改善する場合、治療的効果が確立される。
18~80歳の、末梢動脈疾患(PAD)を伴う糖尿病性足部潰瘍(DFU)を有する
対象を、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞で治療する。
胎盤幹細胞を、次の用量1日目(治療の初日)及び8日目に筋肉内投与する:(i)3×
106のCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞;(ii)1
×107のCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞;または、
(iii)3×107のCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細
胞。
DFUを治療するためのCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹
細胞の有効性に対する主要臨床エンドポイントは、治療されているDFU(複数可)の閉
鎖とすることができる。潰瘍閉鎖は、ドレナージまたはドレッシングの必要性のない皮膚
閉鎖により表すことができる。完全閉鎖は、閉鎖の判定後少なくとも4週間の、潰瘍閉鎖
の保持により表すことができる。潰瘍閉鎖は、胎盤幹細胞で処理した後3ヶ月で評価する
ことができる。
ついての有効性に対する他の臨床エンドポイントは、(i)治療後24時間まで評価する
ことができる有害事象の頻度及び重症度の低減;(ii)治療後6ヶ月で評価することが
できる潰瘍閉鎖までの時間;(ii)治療後6ヶ月で評価することができる足関節上腕血
圧比(ABI)の改善;(iii)治療後6ヶ月で評価することができる足趾上腕血圧比
(TBI)の改善;(iv)治療後24ヶ月まで評価することができるDFUのサイズ及
び数の低減;(v)治療後6ヶ月で評価することができる経皮酸素レベルの改善;(vi
)治療後6ヶ月で評価することができる脈容量記録の改善;(vii)治療後24時間ま
で評価することができる大切断までの時間;(viii)治療後24時間まで評価するこ
とができるWagnerの評価尺度の改善;(ix)治療後6ヶ月で評価することができ
るRutherfordの基準の改善;ならびに、(x)治療後24時間まで評価するこ
とができる脚の安静時疼痛スコアの改善;ならびに、(xi)(i)36項目簡易健康調
査(SF-36)(例えば、Ware et al., Medical Care 3
0(6):473-483を参照のこと);(ii)糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版(DF
S-SF)(例えば、Bann et al., Pharmacoeconomics
, 2003, 21(17):1277-90を参照のこと);(iii)変化尺度の
患者の全体的印象(例えば、Kamper et al., J. Man. Mani
p. Ther., 2009, 17(3):163-170を参照のこと);及び/
または、(iv)EuroQol5D(EQ-5D(商標))尺度、で評価される、対象
の生活の質の改善、を含むことができる。
次の適格基準が、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞で
の治療が適切と考えられる対象を選択するために使用されてもよい。この治療プロトコー
ルが特定の対象に適するかどうかを決定する時、全ての関連する病状及び非病状を、考慮
に入れる。
少なくとも18歳以上の男性及び女性。
・関連する任意の試験の前に、インフォームドコンセント文書を理解して、自発的に署名
する。
・試験訪問スケジュール及び他のプロトコール要件を厳守できる。
・1型または2型真性糖尿病。
・足趾上に存在する場合を除いて、少なくとも1cm2のサイズの従来の潰瘍治療に適切
に応答していない1ヶ月間を超えるWagnerの評価尺度のグレード1(全層のみ)ま
たはグレード2の重症度の糖尿病性足部潰瘍。指標潰瘍の最大病変サイズは、≦6.25
cm2である。指標潰瘍の測定は、スクリーニング訪問時の(必要に応じて)デブリード
マン後に、評価及び測定することになる。
・指標潰瘍を有する足における動脈循環不全の次の基準のうちの1つ以上を満たす対象。
a.ABI≧0.4及び≦0.8またはTBI>0.30及び≦0.65の末梢動脈疾患
。
b.20~40mmHgの間での経皮酸素(TcPO2)測定値。TcPO2で測定され
たエリアは、浮腫及び肥厚した皮膚があってはならない。
・スクリーニング訪問後の次の3ヶ月にわたって、血管再生または切断を計画しない。
・スクリーニングは、失敗した再灌流介入の少なくとも14日後及び成功した再灌流介入
の少なくとも30日後までは、始めてはならない。
・対象は、高血圧及び糖尿病ならびに継続的なケアを必要とする他の任意の慢性の病状に
対し、適切な医学療法を受けているべきである。
・妊娠可能性のある女性(FCBP)は、スクリーニング時に血清妊娠検査で陰性で、か
つ試験療法で治療する前に尿妊娠検査で陰性でなければならない。加えて、性的に活発な
FCBPは、試験期間及びフォローアップ期間に、同時に、次の適切な形態の避妊方法、
例えば、経口、注射用、または移植用ホルモン避妊;卵管結紮;IUD;殺精子剤を有す
るバリア避妊具;または精管切除されたパートナー、のうちの2つを使用することに同意
しなければならない。
・男性(精管切除術を受けている者を含む)は、試験期間及びフォローアップ期間に、F
CBPとの生殖性の性行為において、避妊(ラテックスコンドーム)をする時、バリア避
妊(ラテックスコンドーム)を使用することに同意しなければならない。
る。
・対象が試験に参加することを妨げることになる任意の重大な病状、検査異常、または精
神病。
・対象が、試験に参加しなければならなかった場合の、対象を容認できない危険にさらす
検査異常の存在を含む任意の状態。
・試験からのデータを解釈する能力を混乱させる任意の状態。
・ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、またはB型肝炎ウイルスでの活動性感染に
ついて陽性であることが知られている。
・妊娠中または授乳中の女性。
・スクリーニング時において肥満度指数>40の対象。
・スクリーニング時における、AST(SGOT)またはALT(SGPT)>2.5×
正常上限(ULN)。
・腎疾患食事療法試験式(Levey、2006)を使用して計算された、スクリーニン
グ時における推定糸球体濾過量(eGFR)<30mL/分/1.73m2、または過去
1年以内に、eGFR低下>15mL/分/1.73m2の病歴。
・スクリーニング時における、アルカリホスファターゼ>2.5×ULN。
・スクリーニング時における、ビリルビンレベル>2mg/dL(対象が、既知のギルバ
ート病有しない限り)。
・未治療の慢性感染症または全身性抗生物質での、潰瘍部位を含む任意の感染症の治療は
、腹腔内投与の前に1週間以内に、抗生物質を含んではならない。
・指標潰瘍に、またはこれに隣接した活動性骨髄炎、感染症、または蜂巣炎。
・スクリーニング/ランイン期間中に、≧30%サイズが減少した、または増加した指標
潰瘍。
・四肢虚血に起因する安静時疼痛。
・指標潰瘍を有する足における経皮酸素測定値≦20mmHg。
・踵潰瘍。
・非管理高血圧(対象が少なくとも5分間座る及び安静にする間に取られた2回の独立し
た測定の、スクリーニング時の拡張期血圧>100mmHgまたは収縮期血圧>180m
mHgとして定義される)。
・管理不良の真性糖尿病(ヘモグロビンA1c>12%または血清グルコースのスクリー
ニング≧300mg/dl)。
・未治療の増殖性網膜症。
・インフォームドコンセントフォーム(ICF)に署名する前の過去6ヶ月間の、悪性心
室性不整脈、CCSクラスIII-IV狭心症、心筋梗塞/経皮的冠動脈介入(PCI)
/冠状動脈バイパス移植片(CABG)の病歴、次の3ヶ月間の保留中の冠動脈血行再建
、ICFに署名する前の過去6ヶ月間の、一過性虚血発作/脳血管障害、及び/またはニ
ューヨーク心臓協会[NYHA]のステージIII若しくはIVうっ血性心不全。
・異常なECG:ICFに署名する前の3ヶ月間の新しい右脚ブロック(BBB)≧12
0ミリ秒。
・非管理の凝固亢進。
・付随する病気に起因する、ICFに署名した時の、2年未満の平均余命。
・責任医師の意見で、対象は、細胞療法には適していない。
・皮膚の基底細胞若しくは扁平上皮癌を除く、ICFに署名する前の5年以内の悪性腫瘍
の病歴、または治癒されていると目下みなされる癌の既往歴、または後続の陰性経過観察
を伴う陽性の子宮頸部細胞診。
・(ウシまたはブタ産生物、デキストラン40、及びジメチルスルホキシド[DMSO]
を含む)製品の製剤の構成成分のいずれかに過敏症の病歴。
・対象は、試験療法での治療前の90日以内(若しくは5半減期のどちらか長い方)に、
治験薬-任意の適応症における市販の使用のために米国食品医薬品局(FDA)により承
認されていない薬剤若しくはデバイス-を与えられている、またはこの試験の完了前に、
別の治療試験への参加が計画されている。
・対象は、以前の試験遺伝子療法または細胞療法を受けている。
1つ以上の臨床エンドポイントの改善が実証される場合、DFUの治療におけるCD1
0+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞の有効性が確認される。
少なくとも18歳の、末梢動脈疾患(PAD)を伴う糖尿病性足部潰瘍(DFU)を有
する対象を、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞で治療す
る。対象群I:3×106のCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤
幹細胞を、1日目(治療の初日)、29日目、及び57日目に筋肉内投与する。対象群I
I:3×107のCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞を、
1日目(治療の初日)、29日目、及び57日目に筋肉内投与する。対象群III:プラ
シーボを、1日目(治療の初日)、29日目、及び57日目に筋肉内投与する。
DFUを治療するための、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤
幹細胞の有効性の主要な臨床エンドポイントは、足関節上腕血圧比(ABI);経皮酸素
測定(TCOM)、近赤外線分光法、フルデオキシグルコース陽電子放出断層撮影/コン
ピュータ断層撮影(FGD PET/CT)、ドップラー超音波、磁気共鳴映像法(MR
I)、血管造影法、及び/または酸素測定の測定により評価する場合、四肢の血管機能の
改善とすることができる。四肢の血管機能の改善は、治療後約1年で評価することができ
る。
ついての有効性に対する他の臨床エンドポイントは、(i)治療後約1年で評価すること
ができる、指標潰瘍の潰瘍閉鎖及び完全な創傷閉鎖(潰瘍閉鎖は、ドレナージまたはドレ
ッシングの必要性のない皮膚閉鎖により表すことができ;完全閉鎖は、閉鎖の判定後少な
くとも4週間は、潰瘍閉鎖の保持により表すことができる)。(ii)治療後約1年で評
価することができる有害事象の頻度及び重症度の低減;(iii)治療後約1年で評価す
ることができる、全ての潰瘍の数、サイズの低減及び指標潰瘍の50%の閉鎖;(iv)
治療後約1年で評価することができる治療された足の大切断までの時間の低減;(v)治
療後約1年で評価することができるWagnerの評価尺度の改善;(vi)治療後約1
年で評価することができるRutherfordの基準の改善;(vii)治療後約1年
で評価することができる脚の安静時疼痛スコアの改善;ならびに、(viii)ニューロ
パチーの変化の患者の全体的印象(PGICN)を使用して評価される場合の対象の生活
の質の改善、を含むことができる。
次の適格基準が、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞で
の治療が適切と考えられる対象を選択するために使用されてもよい。この治療プロトコー
ルが特定の対象に適するかどうかを決定する時、全ての関連する病状及び非病状を、考慮
に入れる。
・少なくとも18歳以上の男性及び女性。
・1型または2型真性糖尿病。
従来の潰瘍治療に適切に応答していない1ヶ月間を超えるWagnerの評価尺度のグ
レード1(全層のみ)またはグレード2の重症度の糖尿病性足部潰瘍。
・指標潰瘍を有する足における動脈循環不全の次の基準のうちの1つ以上を満たす対象。
a.ABI≧0.4及び≦0.8またはTBI>0.30及び≦0.65の末梢動脈疾
患。
b.20~40mmHgの間での経皮酸素(TcPO2)測定。
・スクリーニング訪問後の次の3ヶ月にわたって、血管再生または切断を計画しない。
・投与は、失敗した再灌流治療の少なくとも14日後及び成功した再灌流治療の少なくと
も30日後までは、始めてはならない。
る。
・対象が試験に参加することを妨げることになる任意の重大な病状、検査異常、または精
神病。
・対象が、試験に参加しなければならなかった場合の、対象を容認できない危険にさらす
検査異常の存在を含む任意の状態。
・妊娠中または授乳中の女性。
スクリーニング時において肥満度指数>40の対象。
・腎疾患食事療法試験式(Levey、2006)を使用して計算された、スクリーニン
グ時に推定糸球体濾過量(eGFR)<30mL/分/1.73m2、または過去1年以
内に、eGFR低下>15mL/分/1.73m2の病歴。
・未治療の慢性感染症または全身性抗生物質での、潰瘍部位を含む任意の感染症の治療は
、腹腔内投与前の1週間以内に、抗生物質を含んではならない。
・指数潰瘍に、またはこれに隣接した既知の骨髄炎、感染症、または蜂巣炎。
・四肢虚血に起因する安静時の四肢疼痛。
・非管理高血圧(対象が少なくとも5分間座る及び安静にする間に取られた2回の独立し
た測定の、スクリーニング時の拡張期血圧>100mmHgまたは収縮期血圧>180m
mHgとして定義される)。
・管理不良の真性糖尿病(ヘモグロビンA1c>12%または血清グルコースのスクリー
ニング≧300mg/dl)。
・未治療の増殖性網膜症。
・インフォームドコンセントフォーム(ICF)に署名する前の過去6ヶ月間の、悪性心
室性不整脈、CCSクラスIII-IV狭心症、心筋梗塞/経皮的冠動脈介入(PCI)
/冠状動脈バイパス移植片(CABG)の病歴、次の3ヶ月間の保留中の冠動脈血行再建
、ICFに署名する前の過去6ヶ月間の、一過性虚血発作/脳血管障害、及び/またはニ
ューヨーク心臓協会[NYHA]のステージIII若しくはIVうっ血性心不全。
・異常なECG:ICFに署名する前の3ヶ月間の新しい右脚ブロック(BBB)≧12
0ミリ秒。
・非管理の凝固亢進。
・付随する病気に起因する、ICFに署名した時の、2年未満の平均余命。
・責任医師の意見で、対象は、細胞療法には適していない。
・皮膚の基底細胞若しくは扁平上皮癌を除く、ICFに署名する前の5年以内の悪性腫瘍
の病歴、または治癒されていると目下みなされる癌の既往歴、または後続の陰性経過観察
を伴う陽性の子宮頸部細胞診。
・(ウシまたはブタ産生物、デキストラン40、及びジメチルスルホキシド[DMSO]
を含む)製品の製剤の構成成分のいずれかに過敏症の病歴。
・対象は、試験療法での治療前の90日以内(若しくは5半減期のどちらか長い方)に、
治験薬-任意の適応症における市販の使用のために米国食品医薬品局(FDA)により承
認されていない薬剤若しくはデバイス-を与えられている、またはこの試験の完了前に、
別の治療試験への参加が計画されている。
・対象は、以前の試験遺伝子療法または細胞療法を受けている。
1つ以上の臨床エンドポイントの改善が実証される場合、DFUの治療におけるCD1
0+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞の有効性が確認される。
糖尿病性足部潰瘍(DFU)を有する対象を、上記実施例6で概説したものと同様の第
I相臨床試験において、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細
胞で治療した。
106のCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞を、3人の対
象に筋肉内投与した;(ii)1×107のCD10+、CD34-、CD105+、C
D200+胎盤幹細胞を、3人の対象に筋肉内投与した;(iii)3×107のCD1
0+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞を、3人の対象に筋肉内投与
した;及び、(iv)1×108のCD10+、CD34-、CD105+、CD200
+胎盤幹細胞を、6人の対象に筋肉内投与した;
った。
5人の対象が、潰瘍閉鎖を示した:2人の対象が、部分的(約50%)潰瘍治癒を示した
。足関節上腕血圧比(ABI)の増加傾向が、治療された患者で観察された。さらに、A
BIの増加が、DFUが治癒しなかった患者と比較して、DFUが治癒した患者で観察さ
れた。
5+、CD200+胎盤幹細胞の筋肉内投与が安全で、良好な認容されたことを示す。さ
らに、結果は、糖尿病性足部潰瘍を有するヒト対象の、CD10+、CD34-、CD1
05+、CD200+胎盤幹細胞での治療が、糖尿病性足部潰瘍の症状の改善、及び糖尿
病性足部潰瘍の完全閉鎖をもたらすことができること示す。
る
6.9.1 PDACは、虚血マウスの血流量及び血管造影スコアを促進する
血管再生及び創傷治癒におけるCD10+、CD34-、CD105+、CD200+
胎盤幹細胞の有効性を評価するために、糖尿病性四肢虚血の外科マウスモデルを使用した
。糖尿病性四肢虚血の効果をモデリングするために、db/db糖尿病マウスに、後肢虚
血(HLI)手術を受けさせ、後続のCD10+、CD34-、CD105+、CD20
0+胎盤幹細胞の投与あり、なしで、創傷修復、炎症、及び血管再生の種々のレベルにつ
いて監視した。
al., Tokai J. Exp. Clin. Med. 31(3):128
-132 (2006)を参照のこと。
以内に、50μlの胎盤幹細胞または50μlのビヒクル対照のいずれかを、外科的創傷
の部位の近くに筋肉内投与した。胎盤幹細胞を、3,000細胞、30,000細胞、ま
たは300,000細胞の投薬量で投与し、血流量及び血管造影スコアを、手術後1日目
、14日目、28日目、42日目、及び49日目に決定した。非接触レーザードップラー
を使用して、血流量を測定し、対応する手術をしない四肢の血流量に正規化した。血管造
影スコアを、Bollinger et al., Atherosclerosis,
1981, 38(3-4):339-46に従って測定した。
盤幹細胞の投与は、手術の28日後に、HLIの開始後の血流量の増加及び観察期間の終
わりまで持続することをもたらした。投与された胎盤幹細胞の全投薬量は、28日目に有
効であり、1投与当たり30,000細胞の投薬量は、ビヒクル対照で処置された動物と
比較して、測定された全ての時点で有効であった。同様に、図10Bに示されるように、
3,000または30,000のいずれかの胎盤幹細胞は、ビヒクル対照で処置された動
物と比較して、血管造影スコアを改善するのに有効であった。これらのデータは、CD1
0+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞の投与が、末梢動脈疾患及び
2型糖尿病の動物モデルにおける虚血性創傷の治癒の臨床手段を改善することができるこ
とを示す。
マウスの毛管密度及び血管成熟を促進する
HLI手術を実施し、続いて、上記セクション6.9.1のようにCD10+、CD3
4-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞の筋肉内投与を実施した。(i)ビヒクル
対照、(ii)3,000のPDAC、または(iii)30,000のPDAC、のい
ずれかの投与後に、大腿四頭筋を取り出し、HOPE固定剤で固定し、パラフィンに包理
した。組織を、標準的な手順に従って切片化及び染色した。各処置群の3つの代表的な動
物からの3つの切片部分を、デジタル画像化及び定量化した。図11に示されるように、
いずれの投薬量のPDACで処置された動物も、ビヒクル対照で処置された動物と比較し
て、血管のCD31染色の増加(図11A及び11C)ならびに血管壁のα平滑筋アクチ
ンの増加(図11B及び11D)を示した。これらのデータは、CD10+、CD34-
、CD105+、CD200+胎盤幹細胞での虚血四肢の処置が、急性虚血傷害後の新し
い血管の成長及び成熟を促進することができることを示した。
組織において、筋肉修復を促進し、脂肪浸潤を低減する
HLI手術及びCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞での
処置、続いて、大腿四頭筋の分離及び切片化を、上記セクション6.9.1及び6.9.
2のように実施した。切片化された組織を、標準的な手順に従ってH&Eで染色した。図
12に示されるように、胎盤幹細胞で処置された虚血動物は、ビヒクル対照で処置された
動物と比較して、中心核を有する筋線維の数が多く、脂肪組織の浸潤が少なかった(矢印
を参照のこと)。有核筋繊維は、筋肉再生に関連している一方、筋肉組織の脂肪組織浸潤
は、筋肉の弱化及び変性に寄与すると考えられる前炎症性免疫応答に関連している(Do
nath & Shoelson, Nat Rev Immunol. 2011 F
eb;11(2):98-107)。合わせると、これらのデータは、CD10+、CD
34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞が、虚血動物の筋肉再生を促進し、急性
虚血傷害後の炎症性シグナル伝達を防ぎ得ることを示唆する。
、後肢虚血後に、脂肪組織において、マクロファージ分化をM2表現型にシフトさせる
HLI手術及びCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞での
処置を、上記セクション6.9.1のように実施した。手術の3日後及び14日後の鼠径
部脂肪パッドを、マクロファージの表現型を判定するために、単離し、DAPI及びAr
g1またはCD206のいずれかに対する抗体(M2マクロファージのマーカー)で染色
した。図13に示されるように、PDACで処置した動物は、ビヒクル対照で処置された
動物と比較して、手術の3日後及び14日後の両方で、抗炎症性M2マクロファージのレ
ベルが高いことを示した。これらのデータは、M2マクロファージが、虚血傷害後に、ビ
ヒクル対照で処置された動物と比較して、CD10+、CD34-、CD105+、CD
200+胎盤幹細胞で処置された動物において非常に高いレベルを呈することを示す。
、脂肪組織中のアディポカイン(adipokine)産生を調節する
HLI手術及びCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞での
処置、続いて、上記セクション6.9.4のような鼠径部脂肪パッドの分離後に、鼠径部
脂肪パッドを、単一細胞懸濁液に解離させ、いくつかのサイトカインの分泌について分析
した。要約すると、胎盤幹細胞で処置された及びビヒクル対照で処置された動物からの1
×1015の脂肪細胞を、96ウェルプレートにプレーティングし、ウェルの半分を、2
4時間、1μg/mlのリポ多糖体(LPS)で刺激した。次に、刺激及び非刺激細胞か
らの上清を、単離し、MAPサイトカイン/ケモカイン磁気ビーズパネル(Millip
ore)を使用して、サイトカインレベルを測定した。図14に示されるように、前炎症
性サイトカインIL-6及びTNFαは、ビヒクル対照で治療された動物と比較して、L
PS刺激後の胎盤幹細胞で処置された細胞懸濁液中で低減した一方、抗炎症性サイトカイ
ンIL-10は、ビヒクル対照で処置された動物と比較して、LPS刺激後の胎盤幹細胞
で処置された細胞懸濁液中で増加した。結果は、CD10+、CD34-、CD105+
、CD200+胎盤幹細胞が、前炎症性サイトカインを阻害すること及び同時に抗炎症性
サイトカインを促進することの両方により、脂肪細胞の炎症状態を調節することができる
こと示す。
18~80歳の、末梢動脈疾患(PAD)を伴うまたは伴わない糖尿病性足部潰瘍(D
FU)を有する対象を、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細
胞で治療する。胎盤幹細胞を、次の用量で、1日目(治療の初日)及び8日目に筋肉内投
与する:(i)3×106のCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤
幹細胞;(ii)1×107のCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎
盤幹細胞;または、(iii)3×107のCD10+、CD34-、CD105+、C
D200+胎盤幹細胞。
DFUを治療するためのCD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹
細胞の有効性に対する主要臨床エンドポイントは、治療されているDFU(複数可)の閉
鎖とすることができる。潰瘍閉鎖は、ドレナージまたはドレッシングの必要性のない皮膚
閉鎖により表すことができる。完全閉鎖は、閉鎖の判定後少なくとも4週間の、潰瘍閉鎖
の保持により表すことができる。潰瘍閉鎖は、胎盤幹細胞で治療した後3ヶ月で評価する
ことができる。
ついての有効性に対する他の臨床エンドポイントは、以下を含むことができる:(i)治
療後24時間まで評価することができる有害事象の頻度及び重症度の低減;(ii)治療
後6ヶ月で評価することができる潰瘍閉鎖までの時間;(ii)治療後6ヶ月で評価する
ことができる足関節上腕血圧比(ABI)の改善;(iii)治療後6ヶ月で評価するこ
とができる足趾上腕血圧比(TBI)の改善;(iv)治療後24ヶ月まで評価すること
ができるDFUのサイズ及び数の低減;(v)治療後6ヶ月で評価することができる経皮
酸素レベルの改善;(vi)治療後24時間まで評価することができる大切断までの時間
;(vii)治療後24時間まで評価することができるWagnerの評価尺度の改善;
(viii)治療後6ヶ月で評価することができるRutherfordの基準の改善;
(ix)治療後24時間まで評価することができる脚の安静時疼痛スコアの改善;ならび
に、(x)(a)36項目簡易健康調査(SF-36)(例えば、Ware et al
., Medical Care 30(6):473-483を参照のこと);(b)
糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版(DFS-SF)(例えば、Bann et al., P
harmacoeconomics, 2003, 21(17):1277-90を参
照のこと);及び/若しくは(c)変化尺度の患者の全体的印象(例えば、Kamper
et al., J. Man. Manip. Ther., 2009, 17(
3):163-170を参照のこと);ならびに/または(iv)EuroQol5D(
EQ-5D(商標)尺度で評価される場合の対象の生活の質の改善。
次の適格基準が、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞で
の治療が適切と考えられる対象を選択するために使用されてもよい。この治療プロトコー
ルが特定の対象に適するかどうかを決定する時、全ての関連する病状及び非病状を、考慮
に入れる。
・少なくとも18歳以上の男性及び女性。
・関連する任意の試験の前に、インフォームドコンセント文書を理解して、自発的に署名
する。
・試験訪問スケジュール及び他のプロトコール要件を厳守できる。
・1型または2型真性糖尿病。
・足趾上に存在する場合を除いて、少なくとも1cm2のサイズの従来の潰瘍治療に適切
に応答していない1ヶ月間を超えるWagnerの評価尺度のグレード1(全層のみ)ま
たはグレード2の重症度の糖尿病性足部潰瘍。指標潰瘍の最大病変サイズは、≦10cm
2である。指標潰瘍の測定は、スクリーニング訪問時の(必要に応じて)デブリードマン
後に、評価及び測定することになる。
・スクリーニング訪問後の次の3ヶ月にわたって、血管再生または切断を計画しない。
・スクリーニングは、失敗した再灌流介入の少なくとも14日後及び成功した再灌流介入
の少なくとも30日後までは、始めてはならない。
・対象は、高血圧及び糖尿病ならびに継続的なケアを必要とする他の任意の慢性の病状に
対し、適切な医学療法を受けているべきである。
・妊娠可能性のある女性(FCBP)は、スクリーニング時に血清妊娠検査で陰性で、か
つ試験療法で治療する前に尿妊娠検査で陰性でなければならない。加えて、性的に活発な
FCBPは、試験期間及びフォローアップ期間に、同時に、次の適切な形態の避妊方法、
例えば、経口、注射用、または移植用ホルモン避妊;卵管結紮;IUD;殺精子剤を有す
るバリア避妊具;または精管切除されたパートナー、のうちの2つを使用することに同意
しなければならない。
・男性(精管切除術を受けている者を含む)は、試験期間及びフォローアップ期間に、F
CBPとの生殖性の性行為において、避妊(ラテックスコンドーム)をする時、バリア避
妊(ラテックスコンドーム)を使用することに同意しなければならない。
る。
・対象が試験に参加することを妨げることになる任意の重大な病状、検査異常、または精
神病。
・対象が、試験に参加しなければならなかった場合の、対象を容認できない危険にさらす
検査異常の存在を含む任意の状態。
・試験からのデータを解釈する能力を混乱させる任意の状態。
・ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、またはB型肝炎ウイルスでの活動性感染に
ついて陽性であることが知られている。
・妊娠中または授乳中の女性。
・スクリーニング時において肥満度指数>45の対象。
・スクリーニング時における、AST(SGOT)またはALT(SGPT)>2.5×
正常上限(ULN)。
・異常な腎機能のための腎臓透析。
・指標潰瘍を有する脚において、ABI<0.4及び/またはTBI<0.3。
・スクリーニング時における、アルカリホスファターゼ>2.5×ULN。
・スクリーニング時における、ビリルビンレベル>2mg/dL(対象が、既知のギルバ
ート病有しない限り)。
・未治療の慢性感染症または全身性抗生物質での、潰瘍部位を含む任意の感染症の治療は
、腹腔内投与の前に1週間以内に、抗生物質を含んではならない。
・指標潰瘍に、またはこれに隣接した活動性骨髄炎、感染症、または蜂巣炎。
・スクリーニング/ランイン期間中に、≧30%サイズが減少した、または増加した指標
潰瘍。
・四肢虚血に起因する安静時疼痛。
・指標潰瘍を有する足における経皮酸素測定値≦20mmHg。
・踵潰瘍。
・非管理高血圧(対象が少なくとも5分間座る及び安静にする間に取られた2回の独立し
た測定の、スクリーニング時の拡張期血圧>100mmHgまたは収縮期血圧>180m
mHgとして定義される)。
・管理不良の真性糖尿病(ヘモグロビンA1c>12%または血清グルコースのスクリー
ニング≧300mg/dl)。
・未治療の増殖性網膜症。
・インフォームドコンセントフォーム(ICF)に署名する前の過去6ヶ月間の、悪性心
室性不整脈、CCSクラスIII-IV狭心症、心筋梗塞/経皮的冠動脈介入(PCI)
/冠状動脈バイパス移植片(CABG)の病歴、次の3ヶ月間の保留中の冠動脈血行再建
、ICFに署名する前の過去6ヶ月間の、一過性虚血発作/脳血管障害、及び/またはニ
ューヨーク心臓協会[NYHA]のステージIII若しくはIVうっ血性心不全。
・異常なECG:ICFに署名する前の3ヶ月間の新しい右脚ブロック(BBB)≧12
0ミリ秒。
・非管理の凝固亢進。
・付随する病気に起因する、ICFに署名した時の、2年未満の平均余命。
・責任医師の意見で、対象は、細胞療法には適していない。
・皮膚の基底細胞若しくは扁平上皮癌を除く、ICFに署名する前の5年以内の悪性腫瘍
の病歴、または治癒されていると目下みなされる癌の既往歴、または後続の陰性経過観察
を伴う陽性の子宮頸部細胞診。
・(ウシまたはブタ産生物、デキストラン40、及びジメチルスルホキシド[DMSO]
を含む)製品の製剤の構成成分のいずれかに過敏症の病歴。
・対象は、試験療法での治療前の90日以内(若しくは5半減期のどちらか長い方)に、
治験薬-任意の適応症における市販の使用のために米国食品医薬品局(FDA)により承
認されていない薬剤若しくはデバイス-を与えられている、またはこの試験の完了前に、
別の治療試験への参加が計画されている。
・対象は、以前の試験遺伝子療法または細胞療法を受けている。
1つ以上の臨床エンドポイントの改善が実証される場合、DFUの治療におけるCD1
0+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞の有効性が確認される。
Veridex platform(Janssen Diagnostics)を使
用して、上記実施例8に記載された対象の循環内皮細胞の数を、試験期間の1日目、8日
目、14日目、及び29日目に評価した。試験8日目~試験29日目の全体にわたって、
治癒したDFU(n=5)を有する対象において、循環内皮細胞の統計的に有意な減少を
観察した。図15Aを参照のこと;中央値の位置のノンパラメトリック検定を使用して、
ベースライン(1日目、投与前)からの変化に対するP値を計算した。そのような減少は
、非治癒のDFUを有する対象では観察されたなかった。図15Bを参照のこと。
0+胎盤幹細胞でのDFUの治療効果を評価するためのバイオマーカーとして使用できる
ことを実証する。
本開示は、本明細書に記載の具体的な実施形態による範囲に限定されない。実に、本明
細書で提供される主題の種々の修正は、記載されているものに加えて、上述の記載及び添
付の図から、当業者らには明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の
範囲の範囲内に入ることが意図される。
体が参照により組み込まれる。
とができる。単離胎盤細胞は、完全な胎盤からを含む、羊膜、絨毛膜、臍帯、胎盤絨毛叢
、またはそれらの任意の組み合わせの全部または一部から得ることができる。好ましくは
、単離胎盤細胞は、羊膜及び絨毛膜を含む胎盤組織から得られる。通常、単離胎盤細胞は
、胎盤組織の小さなブロックの破壊により得ることができ、例えば、胎盤組織のブロック
は、体積が約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、6
0、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、8
00、900、または約1000立方ミリメートルである。物理的破壊の任意の方法を使
用することができるが、但し、破壊方法は、例えば、トリパンブルー排除法で決定して、
生存可能な該器官中の細胞の多数、より好ましくは大半、より好ましくは少なくとも60
%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%を残すことを条件とする。
%のEDTAとの溶液(Sigma、ミズーリ州セントルイス)を使用して、例えば、さ
らにまたは最初に分別的トリプシン処理により単離することができる。分別的トリプシン
処理は、組織培養プラスチック接着性がある単離胎盤細胞は通常、約5分以内にプラスチ
ック表面から離れるので、可能であるが、他の接着集団は通常、20~30分を超えるイ
ンキュベーションを必要とする。離れた胎盤細胞は、例えば、トリプシン中和溶液(TN
S、Cambrex)を使用して、トリプシン処理及びトリプシン中和後に、採取するこ
とができる。接着細胞の単離の一実施形態では、例えば、約5~10×106細胞のアリ
コートは、いくつかのT-75フラスコ、好ましくは、フィブロネクチンでコーティング
されたT75フラスコ、のそれぞれに入れる。そのよう実施形態では、細胞は、市販のM
esenchymal Stem Cell Growth Medium(MSCGM
)(Cambrex)と培養でき、組織培養インキュベーター(37℃、5%のCO2)
に入れることができる。10~15日後、非接着細胞は、PBSで洗浄することにより、
フラスコから除去される。次に、PBSは、MSCGMと交換される。フラスコは好まし
くは、種々の接着細胞型の存在について、特に、線維芽細胞様細胞のクラスタの特定及び
拡大について、毎日試験される。
具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞及び間葉系間質または幹細胞、例え
ば、骨髄由来間葉系間質または幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、骨
髄由来造血幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞及び
造血前駆細胞、例えば、骨髄、胎児の血液、臍帯血、胎盤血及び/または末梢血由来の造
血前駆細胞、を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞及び体性
幹細胞を含む。より具体的な実施形態では、該体性幹細胞は、神経幹細胞、肝臓幹細胞、
膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、または筋幹細胞である。
二カルシウム、リン酸三カルシウム、α-リン酸三カルシウム、β-リン酸三カルシウム
、及びリン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウ
ム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウ
ム、BIOGLASS(登録商標)などの生物学的に活性なガラス、ならびにそれらの混
合物を含むが、これらに限定されない生理学的に許容されるセラミック材料上に播種する
こともできる、またはこれと接触できる。現在市販されている多孔性生体適合性セラミッ
ク材料は、SURGIBONE(登録商標)(CanMedica Corp.、カナダ
)、ENDOBON(登録商標)(Merck Biomaterial France
、フランス)、CEROS(登録商標)(Mathys,AG、スイス・ベットラッハ)
、ならびに、HEALOS(商標)(DePuy,Inc.、マサチューセッツ州レイナ
ム)及びVITOSS(登録商標)、RHAKOSS(商標)、及びCORTOSS(登
録商標)(Orthovita、ペンシルベニア州モルバーン)などの石灰化コラーゲン
骨移植製品を含む。フレームワークは、天然及び/または合成材料の混合物、ブレンド、
またはコンポジットであることができる。
Veridex platform(Janssen Diagnostics)を使
用して、上記実施例8に記載された対象の循環内皮細胞の数を、試験期間の1日目、8日
目、14日目、及び29日目に評価した。試験8日目~試験29日目の全体にわたって、
治癒したDFU(n=5)を有する対象において、循環内皮細胞の統計的に有意な減少を
観察した。図15Aを参照のこと;中央値の位置のノンパラメトリック検定を使用して、
ベースライン(1日目、投与前)からの変化に対するP値を計算した。そのような減少は
、非治癒のDFUを有する対象では観察されなかった。図15Bを参照のこと。
Claims (19)
- 糖尿病性足部潰瘍を有する対象を治療する方法であって、CD10+、CD34-、C
D105+、CD200+胎盤幹細胞を含む組成物を、前記対象に投与することを含む、
前記方法。 - 前記対象が、1つより多い糖尿病性足部潰瘍を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、末梢動脈疾患を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 胎盤幹細胞を含む前記組成物が、筋肉内投与される、請求項1~3のいずれか1項に記
載の方法。 - 前記組成物が、1×105~1×106、1×106~3×106、3×106~5×
106、5×106~1×107、1×107~3×107、3×107~5×107、
5×107~1×108、1×108~3×108、3×108~5×108、5×10
8~1×109、1×109~5×109、または5×109~1×1010の胎盤幹細
胞を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記組成物が、約1×105、3×105、5×105、1×106、3×106、5
×106、1×107、3×107、5×107、1×108、3×108、5×108
、1×109、5×109、または1×1010の胎盤幹細胞を含む、請求項1~4のい
ずれか1項に記載の方法。 - 前記組成物が、約3×106の胎盤幹細胞を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記組成物が、約1×107の胎盤幹細胞を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記組成物が、約3×107の胎盤幹細胞を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記治療が、前記糖尿病性足部潰瘍のサイズの低減をもたらす、請求項1~9のいずれ
か1項に記載の方法。 - 前記治療が、前記糖尿病性足部潰瘍の閉鎖をもたらす、請求項1~9のいずれか1項に
記載の方法。 - 前記治療が、前記糖尿病性足部潰瘍の1つ以上の症状の改善をもたらす、請求項1~9
のいずれか1項に記載の方法。 - 前記1つ以上の症状が、前記対象の足及び/または下腿の傷、潰瘍、または水疱;前記
対象の足(複数可)及び/または下腿の疼痛;歩行困難;前記対象の足(複数可)の変色
;ならびに/または、前記対象の足(複数可)の感染、である、請求項12に記載の方法
。 - 前記治療が、前記糖尿病性足部潰瘍の閉鎖までの時間の増加、前記対象の足関節上腕血
圧比(ABI)の改善、前記対象の足趾上腕血圧比(TBI)の改善、前記対象の経皮酸
素レベルの改善、前記対象の脈容量記録の改善、主要の切断までの時間の低減、Wagn
erの評価尺度の改善、Rutherfordの基準の改善、及び/または、前記対象の
脚の安静時疼痛スコアの改善、をもたらす、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。 - 治療の必要な対象のDFUを治療するための方法であって、(a)前記対象の血流中を
循環する内皮細胞の数を測定すること;(b)前記対象に、CD10+、CD34-、C
D105+、CD200+胎盤幹細胞を含む組成物を投与すること;及び、(c)前記胎
盤幹細胞の投与後の、前記対象の血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること、を含み
、胎盤幹細胞の投与前の循環内皮細胞の数と比較した、胎盤幹細胞の投与後の循環内皮細
胞の数の減少が、前記対象のDFUの治療が有効であることを示す、前記方法。 - 治療の必要な対象のDFUを治療するための方法であって、(a)前記対象に、CD1
0+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞を含む組成物を投与すること
;(b)前記胎盤幹細胞の投与後の第1の時点で、前記対象の血流中を循環する内皮細胞
の数を測定すること;及び、(c)前記胎盤幹細胞の投与後の第2の時点で、前記対象の
血流中を循環する内皮細胞の数を測定すること、を含み、前記第1の時点で測定された循
環内皮細胞の数と比較した、前記第2の時点で測定された循環内皮細胞の数の減少が、前
記対象のDFUの治療が有効であることを示す、前記方法。 - 前記対象が、前記対象のDFUの治療が有効である場合、CD10+、CD34-、C
D105+、CD200+胎盤幹細胞を含む組成物の後続の用量を投与される、請求項1
5または16に記載の方法。 - 前記組成物が、1×105~1×106、1×106~3×106、3×106~5×
106、5×106~1×107、1×107~3×107、3×107~5×107、
5×107~1×108、1×108~3×108、3×108~5×108、5×10
8~1×109、1×109~5×109、または5×109~1×1010の胎盤幹細
胞を含む、請求項15~17のいずれか1項に記載の方法。 - 前記組成物が、約1×105、3×105、5×105、1×106、3×106、5
×106、1×107、3×107、5×107、1×108、3×108、5×108
、1×109、5×109、または1×1010の胎盤幹細胞を含む、請求項15~17
のいずれか1項に記載の方法。
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