KR102169122B1 - 중간엽 줄기세포의 제조방법 - Google Patents

중간엽 줄기세포의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 다능성 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 중간엽 줄기세포는 다양한 질환 또는 장애의 치료를 가능하도록 한다. 당뇨, 골관절염 및 파킨슨병 등 다양한 질환에 치료를 위하여 이식가능한 세포 및 조직 재료를 제공할 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포의 제조방법{A METHOD FOR MANUFACTURING OF MESENCHYMAL STEM CELL}
본 발명은 인간 다능성 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.
세포 치료제는 질병 치료에 있어 약물이나 외과적 수술 등을 통하여 제한적으로 치료가 가능하다고 생각되었던 부분을 세포 특히 줄기세포를 통하여 '근본적인 치료'를 가능하도록 하여 의약계의 새로운 패러다임으로 급부상하고 있는 분야이다. 특히 재생의학(regenerative medicine) 분야에서 고령화, 질병, 사고 등으로 손상받거나 기능이 저하된 조직과 장기를 재생시키거나 대체하여 기능을 회복하도록 함으로써 질병에 대항하는 새로운 기술분야이며, 난치성 질환의 치료대안으로 부각되고 있는 분야이다.
한편, 재생의학 분야에 있어서 손상된 조직 회복에 유용하게 사용될 수 있는 것으로서 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)가 고려되어 왔다. 그러나 중간엽 줄기세포를 얻는 과정에서 외과적인 요소가 필요하고, 때로는 얻어진 중간엽 줄기세포들간의 특성 또한 불일치 되는 문제점이 있다. 따라서 많은 양의 중간엽 줄기세포를 얻기 위하여, 배아줄기세포, 핵 이식 다능성 줄기세포와 같은 다능성 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법이 요구되고 있다.
본 발명자들은 인간 다능성 줄기세포로부터 배아체를 형성하여 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법을 개발하여 본 발명을 이르게 되었다.
따라서, 본 발명은 인간 다능성 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 a) 인간 다능성 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 생성시키는 단계; b) 상기 인간 다능성 줄기세포를 배아체(EB, Embryoid body)로 형성시키는 단계; 및 c) 상기 배아체를 배양하여 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)로 제조하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
일례로 상기 인간 다능성 줄기세포는 핵 이식 다능성 줄기세포(NT-hPSC), 반수성체-유래 다능성 줄기세포(pn-hPSC), 역분화 만능 줄기세포(iPSC), 또는 배아줄기세포(ESC, Embryonic Stem Cell)인 것일 수 있다.
일례로 상기 a) 단계는 동형접합 세포로부터 핵을 분리하여 핵 이식 인간 다능성 줄기세포(NT-hPSC)를 생성시키는 단계이며, a) 단계 전에 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
다른 일례로 상기 스크리닝은 HLA(human leukocyte antigen)-A, HLA-B, HLA-DR의 유전자가 동형접합인 것일 수 있다.
일례로 상기 a) 단계는 핵 이식 인간 다능성 줄기세포(NT-hPSC)를 생성시키는 단계이며, 상기 a)단계는, 난모세포의 핵을 제거하는 단계; 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계; 포스트-활성화 배지에서 인큐베이션하여 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계; 상기 활성화된 NT 난모세포로부터 배반포를 생성하는 단계; 및 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 ICM 세포는 NT-hPSC 세포로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 일례로 상기 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 단백질 인산가수분해효소 저해제(protein phosphatase inhibitor)을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 단백질 인산가수분해효소 저해제는 카페인일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계는 직접 주입을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계는 체세포 융합을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵은 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)와 접촉된 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 후생학적 조절인자는 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질 및 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 후생학적 조절인자는 siRNA(small interfering RNA), 저분자, 단백질, 펩티드 또는 항체인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 후생학적 조절인자는 Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 Lin2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계는 센다이바이러스, 그의 단백질 또는 추출물을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 하나 이상의 공여체 세포는 체세포 또는 생식세포를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계에서의 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 퓨로마이신(puromycin), 에탄올(ethanol), CHX(cycloheximide), TSA(trichostatin A), 및 CB(cytochalasin B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 NT 난모세포는 후생학적 조절인자의 존재 하에서 배양된 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 a) 단계는 자외선의 부재 하에서 수행되는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 a) 단계는 난모세포로 정자 인자(sperm factors)를 주입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
일례로 상기 a) 단계는 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포(pn-hPSC)를 생성시키는 단계이며, 상기 a) 단계는, 난모세포를 활성화하는 단계; 포스트-활성화 배지에서 상기 활성화된 난모세포를 인큐베이션하여 반수성체를 생성하는 단계; 배양 배지에서 상기 반수성체를 인큐베이션하여 배반포를 형성하는 단계; 및 상기 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 내세포괴 세포는 pn-hPSC로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 일례로 전기적 및/또는 화학적 자극을 가하여 난모세포를 활성화시킬 수 있다.
또 다른 일례로 상기 난모세포를 활성화하는 단계에서의 화학적 자극은 활성화 배지에서 인큐베이션 하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 활성화 배지는 칼슘 이온운반체를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 칼슘 이온운반체는 이오노마이신, A23187, 부베리신(beauvericin), X-537A, 및 아베나시올리드(avenaciolide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 반수성체를 생성하는 단계에서의 포스트-활성화 배지는 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계에서의 활성화 배지는 6-DMAP, 퓨로마이신(puromycin), 에탄올(ethanol), CHX(cycloheximide), TSA(trichostatin A), 및 CB(cytochalasin B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 반수성체를 생성하는 단계에서의 포스트-활성화 배지는 제2극체 방출을 막지 않는 화합물을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 난모세포는 중기 II (MII) 단계 난모세포를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 난모세포는 중기 I (MI) 단계 난모세포를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 난모세포는 단일 전핵(pronuclear) 난모세포를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 pn-hPSC는 이형접합(heterozygous) 또는 동형접합(homozygous)인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 pn-hPSC는 집단의 1% 이상과 면역적합성 인간 백혈구 항원 (HLA) 일배체형(haplotype)을 갖는 다능성 세포를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 HLA 일배체형은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 a)단계는 난모세포로 정자 인자를 주입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 난모세포는 CARM 1 및/또는 Esrrb의 존재 하에서 인큐베이션되는 것일 수 있다.
일례로 상기 b) 단계는 hPSC를 현탁 배양하는 것일 수 있다.
다른 일례로 상기 현탁 배양기간은 1일 내지 14일인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 b) 단계는 hPSC를 넉아웃 혈청 대체제(KSR, knockout-serum replacement)가 첨가된 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지에서 배양하여 EB로 형성시키는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 b) 단계는 hPSC를 2개 이상의 군(clump)으로 분리한 후 배양하는 것일 수 있다.
일례로 상기 c)단계는, TGF-β 저해제가 첨가된 배지 및/또는 저포도당(low glucose) 조건의 배지에서 상기 EB를 배양하거나, EB를 TGF-β 저해제가 첨가된 배지에서 배양하는 단계; 및 저포도당 조건의 배지에서 상기 EB를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 일례로, 상기 EB를 bFGF가 없는 조건(bFGF free)에서 배양하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 저포도당 조건의 배지에서 EB를 부착 배양하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 c)단계는, EB를 TGF-β 저해제가 첨가된 배지에서 10 내지 18일간 배양하는 단계; 및 저포도당 조건의 배지에서 상기 EB를 12 내지 20일간 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 c)단계는, EB를 TGF-β 저해제 및 KSR이 보충된 DMEM/F12 배지에서 배양하는 단계; 및 혈청 및 항생제가 첨가된 저포도당 조건의 DMEM/F12 배지에서 상기 EB를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 c)단계는, TGF-β 저해제가 첨가된 배지 및/또는 저포도당 조건의 배지에서 상기 EB를 배양하는 단계; 및 상기 배지에서 배양된 EB의 결과물(outgrowth)을 MSC 증식 배지에서 배양하는 단계를 포함하거나, EB를 TGF-β 저해제가 첨가된 배지에서 배양하는 단계; 저포도당 조건의 배지에서 상기 EB를 배양하는 단계; 및 상기 배지에서 배양된 EB의 결과물을 MSC 증식 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC 증식 배지는 혈청, 항생제, 비필수 아미노산(NEAA) 및 β-머갑토에탄올(mercaptoethanol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 첨가된 DMEM 배지일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 EB의 결과물을 단일 세포로 분리하여 부착 배양 한 후 MSC 증식 배지에서 배양하는 것일 수 있다.
일례로, 상기 c)단계는 bFGF가 제외된 조건(bFGF free)에서 배양하는 것일 수 있다.
다른 일례로 상기 c)단계는 bFGF가 제외된 배지에서 EB를 배양한 후 TFG-β 저해제를 첨가하여 배양하는 단계; 저포도당 조건에서 상기 EB를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
일례로 상기 MSC의 80% 이상이 마커 CD29, CD44 및 CD90에 대하여 양성이며, 20% 이상이 마커 CD105에 대하여 양성인 것일 수 있다.
다른 일례로 상기 MSC의 80% 이상이 마커 CD29, CD44, CD90 및 CD105에 대하여 양성인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC의 5% 미만이 마커 TRA1-60, SSEA4, CD34 및 CD45에 대하여 음성인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC의 3% 미만이 마커 TRA1-60, SSEA4, CD34 및 CD45에 대하여 음성인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 5회의 계대(passage)를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 10회의 계대(passage)를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 15회의 계대(passage)를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC의 배가시간(doubling time)은 35 내지 48시간인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC의 배가시간(doubling time)은 41 내지 45시간인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC는 조혈모세포, 근육세포, 심근세포, 간 세포, 연골세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 분화능을 갖는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 방법은 d) 상기 제조된 중간엽 줄기세포(MSC)로부터 단일 세포를 분리하는 단계; 및 e) 상기 분리된 단일 세포를 배양하여 단일세포 유래 MSC를 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일례로, 상기 d) 단계의 중간엽 줄기세포는 초기 계대의 세포, 예를 들면, P1 내지 P9의 세포인 것일 수 있다.
또 다른 일례로, 상기 e) 단계의 배양은 bFGF를 포함하는 배지에서 배양하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 중간엽 줄기세포(MSC)를 제공한다.
일례로 상기 MSC의 80% 이상이 마커 CD29, CD44 및 CD90에 대하여 양성이며, 20% 이상이 마커 CD105에 대하여 양성인 것일 수 있다.
다른 일례로 상기 MSC의 80% 이상이 마커 CD29, CD44, CD90 및 CD105에 대하여 양성인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC의 5% 미만이 마커 TRA1-60, SSEA4, CD34 및 CD45에 대하여 음성인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC의 3% 미만이 마커 TRA1-60, SSEA4, CD34 및 CD45에 대하여 음성인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 5회의 계대(passage)를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 10회의 계대(passage)를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 15회의 계대(passage)를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC의 배가시간(doubling time)은 35 내지 48시간인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC의 배가시간(doubling time)은 41 내지 45시간인 것일 수 있다.
또 다른 일례로 상기 MSC는 조혈모세포, 근육세포, 심근세포, 간 세포, 연골세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 분화능을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 중간엽 줄기세포는 다양한 질환 또는 장애의 치료를 가능하도록 한다. 당뇨, 골관절염 및 파킨슨병 등 다양한 질환에 치료를 위하여 이식가능한 세포 및 조직 재료를 제공할 수 있다.
도 1은 현 제대혈 관리 및 연구에 관한 법률에 따라 세포수 7억개 미만일 경우 폐기용으로 분류됨을 나타낸 그림이다.
도 2는 실시예 1 공여세포의 염색체 검사결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 제조된 NT-hPSC의 염색체 검사결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1에서 제조된 NT-hPSC의 (a) genomic DNA 검사결과와 (b) mitochondrial DNA 검사결과로 공여 체세포 및 공여 난모세포와 비교하여 보여주는 것이다.
도 5는 실시예 1에서 제조된 NT-hPSC의 줄기세포 마커의 immunochemistry 분석 결과를 보여주는 것이다.
도 6은 실시예 1에서 제조된 NT-hPSC의 줄기세포 마커의 RT-PCR 분석결과를 보여주는 것이다.
도 7은 실시예 1에서 제조된 NT-hPSC의 삼배엽성 유래 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 확인하기 위한 실험 결과로, 배아체를 형성하여 14일간 배양 후 확인한 (a) 삼배엽성 분화 마커의 immunohistochemistry 분석결과 및 (b) 마커의 RT-PCR 결과와 (c) 면역결핍생쥐에 주입하여 형성된 테라토마의 조직분석결과를 보여준다.
도 8은 (a) 배아줄기세포 유래 RPE세포와 실시예 1에서 제조된 NT-hPSC 유래 RPE세포의 형태와 (b) RPE 세포의 마커를 비교한 결과로 차이가 없음을 보여주는 것이다.
도 9는 실시예 3에 따른 hPSC로부터의 MSC 제조과정을 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 3에 따른 hPSC로부터의 MSC 제조과정에서의 현미경 관찰 사진을 나타낸 것이다.
도 11의 (a)는 CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC) 및 CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC)의 배가시간(doubling time)을 나타낸 것이며, (b)는 계대별 CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC), CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC) 및 hBM-MSC의 누계 세포 수(cumulative cell numbers)를 나타낸 것이고, (c)는 CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC), CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC) 및 hBM-MSC의 누계 배가 수(cumulative doubling numbers)를 나타낸 것이다 (Bar: mean±SE, n=3, triplicate).
도 12는 CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC) 및 CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC)의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC), CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC) 및 hBM-MSC의 지방생성(adipogenesis), 골형성(osteogenesis) 및 연골발생(chondrogenesis) 분화능을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 골형성 마커(COL1, Runx2), 지방생성 마커 (PPARγ, C/EBPα) 및 연골발생 마커(COMP, Sox9)의 발현을 RT-PCR 기법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 CHA-hES 15 단일세포 유래 MSC(CHA-hES15(single-derived)-MPC), CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC) 및 hBM-MSC의 (a) 누계 세포 수 (cumulative cell numbers) 및 (b) 계대별 누계 배가 수(cumulative doubling numbers)를 나타낸 그래프이다.
도 16은 CHA-hES 15 단일세포 유래 MSC(CHA-hES15(single-derived)-MPC)의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 "줄기세포"는 자가재생할 수 있고 (미분화된 상태를 유지하면서 다수의 세포 분열 주기를 통과하는 능력을 갖고) 1종 이상의 다중분화능 (1종 이상의 전문화된 세포로 분화하는 성능)을 나타낼 수 있는 세포를 의미한다. 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포이다.
본 발명에서 "체세포"는 성세포 또는 이의 전구체를 제외한 체내의 임의의 조직세포를 의미한다.
본 발명에서 사용된 "성숙"은 최종적으로 분화된 세포 종류를 향하여 인도하는 조화된 생화학적 단계들로 구성된 과정을 의미한다.
본 발명에서 "분화"는 특정 형태 또는 기능에 대한 세포의 적응을 의미한다.
본 발명에서 "분화된 세포"는 본 명세서에 그 용어가 정의된 것처럼 이의 원래 형태에서 다능성이 아닌 임의의 체세포를 포함한다. 따라서, 용어 "분화된 세포"는 또한 부분 분화된 세포, 예컨대 다분화능 세포, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 및 방법을 이용하여 생성된 안정한, 비다능성 부분 재프로그래밍된 또는 부분 분화된 세포인 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 분화된 세포는 안정한 중간 세포, 예컨대 비다능성, 부분 재프로그래밍된 세포인 세포이다. 배양물 중에 많은 1차 세포를 위치시키면 완전 분화된 특성을 약간 소실할 수 있는 것에 유의해야 한다. 따라서, 이러한 분화된 또는 체세포를 단순히 배양하는 것은 이 세포가 비분화된 세포(예를 들면 미분화 세포) 또는 다능성 세포가 되게 하지 않는다. 분화된 세포(안정한, 비다능성 부분 재프로그래밍된 세포 중간체를 포함)의 전분화능으로의 전이는 배양물 중에 위치시킬 때 분화된 특성을 부분 소실시키는 자극을 넘는 재프로그래밍 자극을 필요로 한다. 재프로그래밍된, 몇몇 실시양태에서, 부분 재프로그래밍된 세포는 또한 일반적으로 배양물 중에 오직 제한된 수의 분열에 대한 능력을 갖는 더 낮은 발생 가능성을 갖는 모 세포에 비해 성장 가능성의 소실 없이 연장된 계대배양을 겪는 능력을 갖는 특성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 용어 "분화된 세포"는 또한 (예를 들면, 미분화 세포 또는 재프로그래밍된 세포로부터) 덜 특수화된 세포 유형(즉, 발생 가능성 증가)의 세포(여기서, 세포는 세포내 분화 공정을 겪음)로부터 유래한 더 특수화된 세포 유형(즉, 발생 가능성 감소)의 세포를 의미한다. 바람직하게는 본 발명에서 조혈모세포, 근육 세포, 심근 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 지방세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포, 중간엽 줄기세포(MSC) 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "면역적합항원 동형접합"이란, 공여자의 부계와 모계에서 물려받은 각각의 HLA-A, HLA-B, HLA-DR 유전자들의 유전형이 완전히 동일하여 6개가 아닌 3개의 HLA 유전형을 가진 것을 의미한다.
본 발명에서 "면역적합형 세포"는 특별히 이에 제한되지 않으나, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR 유전자가 동형적합 유사로 존재하는 세포를 말하며, 6쌍 중에 단 3개가 동일한 모든 HLA 유전형 조합의 수혜자에게 이식이 가능한 이점을 가질 수 있다.
본 발명에서 "뱅크"는 줄기세포의 저장장소를 의미하며, 필요에 따라 저장된 세포로부터 치료, 임상 또는 연구목적으로 개인 자신이나 다른 개인에게 그대로 또는 분화되어 사용될 수 있다.
본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 투여는 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 a) 인간 다능성 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 생성시키는 단계; b) 상기 인간 다능성 줄기세포를 배아체(EB, Embryoid body)로 형성시키는 단계; 및 c) 상기 배아체를 배양하여 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)로 제조하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
상기 다능성 줄기세포는 핵 이식 다능성 줄기세포(NT-hPSC), 반수성체-유래 다능성 줄기세포(pn-hPSC), 역분화 만능 줄기세포(iPSC), 또는 배아줄기세포(ESC, Embryonic Stem Cell)인 것일 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다.
상기 역분화 만능 줄기세포(iPSC, Induced Pluripotent Stem Cell)는 분화된 세포(예를 들어, 체세포)로부터 역분화되어 얻어진 만능분화능(pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 각종 장기 세포로 분화 가능하다. iPSC는 역분화 유도인자들에 의해 분화된 세포를 재프로그램화 (reprogramming)하여 얻어질 수 있다.
상기 상기 인간 배아줄기세포는 인간 상실배의 내부 세포 괴로부터 유래된 전능 세포를 포함한다. 상기 인간 배아줄기세포는 예를 들면, CHA-hES3 (Jumi Kim, Sung-Hwan Moon, Soo-Hong Lee, Dong-Ryul Lee, Gou-Young Koh, and Hyung-Min Chung, Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem cells (2007) STEM CELLS AND DEVELOPMENT 16:269.280) 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 인간 배아줄기세포는 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다.
상기 a) 단계는 동형접합 세포로부터 핵을 분리하여 핵 이식 인간 다능성 줄기세포(NT-hPSC)를 생성시키는 단계이며, a) 단계 전에 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
NT를 통하여 제조된 세포는 환자의 핵의 유전 물질을 지닐 수 있으며, 이러한 점에서 개별적인 환자 특이적이다. 따라서, 자가 이식 즉, 동종에서의 면역거부에 대하여 유의적으로 감소된 위험을 갖는 환자에의 세포이식을 가능하게 하는 것이다. 나아가 본 발명에서의 동형접합(homozygous)세포는 HLA 항원 타입(type)이 매칭되는 세포로 항 HLA 항체가 없는 이종의 사람에게 이식이 가능한 것이다. 즉, 상기 NT 유래 줄기세포는 동형접합형 타입을 가지고 있어 면역적합형 세포로 이식이 가능한 것이다.
따라서, 상기 스크리닝은 HLA(human leukocyte antigen)-A, HLA-B 및 HLA-DR의 유전자가 동형접합(homozygous)인 것을 선별하는 것이 바람직하다. HLA 유전형 스크리닝을 통해 서로 다른 면역적합 동형접합을 가진 공여자 140명을 찾게 되면 이들로부터 일본 전체 인구의 90% 이상 사람들에게 이식할 수 있는 면역적합 세포주를 미리 확보가 하는 것이 가능하다고 발표된 바 있다 (A more efficient method to generate integration-free human iPS cells, Nature Methods 8, 409-412 (2011)).
본 발명에서는 일차로 차병원 기증 제대혈은행을 데이터를 바탕으로 동형접합(homozygous) 세포를 스크리닝하였다. 현 제대혈 관리 및 연구에 관한 법률에 따르면, 세포수 7억개 미만일 경우 폐기용으로 보건복지부 제대혈위원회의 승인을 받아 필요시 연구에 사용할 수 있도록 되어져 있다 (도 1 참조).
아래의 표 1(International Journal of Immunogenetics (2013) 40: 515-523)은 총 4,128개의 제대혈을 대상으로 HLA A-B-DRB1 haplotype 빈도를 조사한 것이다 (0.1% 이상만 나타냄).
Figure 112017130058605-pat00001
따라서 이용될 세포로는 연구용으로 적합한 (7억개 미만의 세포수를 갖는) 냉동제대혈을 일차적으로 사용할 수 있으며, 이외에도 질병관리본부 장기이식관리센터 (KONOS)에 등록된 연구용 기증제대혈 전부를 포함할 수 있다. 이외에도 조혈모세포 기증자 네트워크 및 차병원 산하 의료기관에서 자체적으로 확보한 검체를 사용할 수 있다.
핵 이식 인간 다능성 줄기세포(NT-hPSC)를 생성시키는 단계는, 난모세포의 핵을 제거하는 단계; 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계; 포스트-활성화 배지에서 인큐베이션하여 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계; 상기 활성화된 NT 난모세포로부터 배반포를 생성하는 단계; 및 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 ICM 세포는 NT-hPSC 세포로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함할 수 있다.
일례로, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 중기 II(MII) 단계 난자 방추사를 제거하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 제1 극체(1PBE)는 제거된다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 난구 세포를 성숙의 완료 전에 벗기는 단계를 포함한다. 구체예에 있어서, 난모세포는 실시간으로 1PBE에 대한 비-UV 빛 기반 관찰로 관찰된다. 또 다른 구체예에 있어서, 관찰은 염색 또는 라벨링 제제, 예를 들면 훽스트 염색(Hoechst staining)의 부재하에서 일어난다. 구체예에 있어서, 이것은 폴리스코프(polscope), 예를 들면, Research Instruments (CRi) OosightTM 이미지 시스템의 사용을 포함한다. 예컨대, 이것은 545 nm 평광으로 수집된 MII 난모세포에서의 투명대(zona pellucid) 및 방추사 복합체를 시각화하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 난모세포 막의 구멍 및 난모세포로부터의 1PBE의 제거를 가능하게 하는 윤곽을 갖는 마이크로피펫(contoured micropipette)의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 압전기 드릴(piezoelectric drill)의 사용을 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 사이토칼라신 B 및 선택적으로, 단백질 포스파타아제 억제제, 예를 들면, 카페인을 함유하는 탈핵 배지에서 수행된다. 카페인은 단백질 인산가수분해효소 저해제로서 이른 활성화(premature activation)를 억제하여 복제배아의 성장을 개선시킴으로써 결과적으로 배반포의 형성율을 증가시킨다. 따라서, 바람직하게는 상기 난모세포의 탈핵은 단백질 인산가수분해효소 저해제(protein phosphatase inhibitor)를 포함하는 배지에서 이루어지는 것이며, 상기 단백질 인산가수분해효소 저해제는 카페인일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가함으로써 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계는 공여 핵을 이식하는 단계를 포함할 수 있다. 공여 핵을 이식하는 단계는 난모세포 막 구조를 변형시키는 제제의 사용을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 난모세포 막 구조를 변형시키는 제제의 사용을 통한 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 체세포와의 융합을 포함한다. 예를 들면, 공여 핵을 이식 하는 단계는 주입 피펫(예를 들면, 12 ㎛ 직경)으로 3 내지 4 공여 세포를 제공하는 단계, 파라믹소바이러스 또는 파라믹소 바이러스 단백질, 예를 들면 센다이 바이러스, 이들의 외피 단백질 또는 이들의 추출물을 함유하는 용액의 일정 양 중의 공여 세포를 배출하는 단계를 포함할 수 있다. 이후에, 선형으로 배열된 공여 세포로부터 일정 거리 떨어져서(4 내지 5 세포 길이) 주입 피펫을 사용하여 세포를 회수하는 단계, 홀딩 피펫으로 난모세포를 홀딩하는 단계, 공여 세포를 갖는 주입 피펫을 난모세포로 진전시키는 단계가 뒤따른다. 주입 피펫을 진전시키는 단계는 난황 원형질 막의 비파괴를 포함하고, 및 핵 공여 세포를 투명대 아래에 위치하는 난황 원형질 막과 접촉시키기 위하여 난모세포의 투명대 및 세포막 사이의 공간인 위란강(perivitelline space)에 하나의 핵 공여 세포의 삽입을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 피펫의 회수는 난황막과 공여 세포 사이의 접촉을 방해하지 않는다. 다양한 구체예에 있어서, 세포는 공여 세포 삽입 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 분 후에 융합된다. 다양한 구체예에 있어서, 세포는 공여 세포 삽입 10분 후에 융합된다. 선택적으로 상기 과정은 성공적으로 융합되지 않은 세포에 대하여 반복된다. 다양한 구체예에 있어서, 폴리스코프, 예를 들면, OosightTM 이미지 시스템이 전 과정에서 사용된다.
일례로, 공여 핵을 이식하는 방법은 직접 주입(direct injection)방법에 의할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 공여 핵을 이식하는 단계는 전기적 세포 조작, 예를 들면, 전기세포융합(electrofusion)을 포함할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 체세포 핵 공여체, 줄기 세포 핵 공여체, 및 정자 세포 핵 공여체의 핵을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 NT를 위한 체세포 핵을 분리하는 단계 후에 피펫 또는 압전기 주입(piezoelectric injection)을 통하여 하나 또는 그 이상의 공여 핵을 삽입하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 공여 핵은 세포, 예를 들면, 피부 섬유아세포, 백혈구, 모낭, 또는 다른 체세포 핵 공여체로부터 유래된다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 정자 세포 공여로부터 핵의 분리 및 제조를 포함하는 방법을 개시한다. 상이한 구체예에 있어서, 핵의 분리는 조직 생검, 수혈, 또는 조직 시료를 수득하기 위한 다른 방법, 기계적 분리, 콜라게나아제 소화, 세척, 원심분리 기반 밀도 구배 분리, 및/또는 표준 배양 배지로의 배양을 통한 조직의 가공을 포함한다.
바람직하게는, 상기 체세포의 핵을 융합키는 단계는 센다이바이러스 또는 센다이 바이러스 추출물을 포함하는 배지에서 이루어지는 것이다.
포스트-활성화 배지에서 인큐베이션 하기 전에 전기적 및/또는 화학적 방법을 이용하여 활성화를 시킬 수 있다. 상기 전기적 및/또는 화학적 방법은 당해 기술분야에서 공지된 칼슘 진동(calcium oscillation)을 일으켜 활성화 시키는 방법이 사용될 수 있으며, 예컨대 화학적 방법으로서 활성화 배지에서 인큐베이션 하여 활성화시킬 수 있다.
난모세포 활성화(artificial oocyte activation)는 자연발생적인 정자 수정 동안 일어나는 칼슘 신호 변화의 모방에 의존한다. 정상적인 난모세포 발달은 난모세포를 중기 II(MII) 단계에서 차단(arrest)하기 위한 고 수준의 중기 촉진 인자(Metaphase Promoting Factor)(MFP) 활성에 의존한다. MII 난모세포의 차단은 정자 진입에 기인한 세포내 칼슘 이온(Ca2 +) 수준 변화에 의해 방해된다. 이후에, 사이클린 B(cyclin B)(MPF 조절 서브유닛)의 표적 분해가 일어나고, 이것은 세포주기 차단, 전핵 형성, 및 감수 분열 및 유사 분열 과정으로부터 난모세포를 풀어준다.
난모세포 활성화는 세포주기 차단으로부터 배양된 난모세포를 풀어주기 위한 인위적인 칼슘-변화 전략에 의존한다. 예시는 칼슘 이온운반체, 지질 이중층을 통과하여 이온을 전달하는 지용성 분자, 예를 들면 이오노마이신(ionomycin) 및 A23817의 첨가를 포함한다. 대안적인 전략은 전기적 활성 또는 이온의 직접적인 주입에 의존한다.
NT와 관련된 바와 같이, 핵 이식된(즉, 재구축된) 난모세포의 재구축 이후에 또한, 칼슘 변화 기법을 사용한 난모세포 활성화가 일어난다.
그러나, 이러한 칼슘 이온주입 외에 NT 제조시 예를 들면, 단백질 포스파타아제 억제제 카페인의 양(sheep) 난모세포에의 첨가는 성숙-촉진 인자(Matruation Promoting Factor)(MPF) 및 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPKs)의 활성을 증가시킨다는 것이 보고되었고, 유사한 이점이 원숭이 난모세포에서 보고된 반면, 배반포 형성의 빈도는 증가하지 않았다. 또한, 칼슘 이온운반체, 전기적 활성화, 또는 직접적인 주입을 통한 칼슘 활성화는 자연발생적인 수정으로서 동일한 타이밍, 공간 조절, 또는 칼슘 진동을 일으키지 않는다. 추가적인 복잡성을 더하면 칼슘에 대한 영향은 또한, 종 특이적인 것으로 나타났다는 점이다. 일부 예에 있어서, 6-디메틸아미노퓨린(6-DMAP)과 같은 키나아제 억제제, 에탄올 및 사이클로헥시이미드(CHX)와 같은 단백질 합성 억제제로의 부가적인 처리의 사용은, MPF 불활성화를 증가시키기 위해 사용된다. TSA와 같은 히스톤 탈아세틸화효소 저해제는 개선된 NT 리프로그밍과 관계가 있다. TSA의 처리는 배반포의 형성을 촉진시킬 수 있다.
일례에서 체세포의 핵융합과정 및 활성화 과정에서 전기적 자극(electrical pulse)를 가할 수 있다. 전기적 활성화는 전기적 세포융합 배지에서의 전기적 펄스를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 전기적 세포융합 배지는 0.1 내지 0.5 M 만니톨, 0.01 내지 1 mM MgSO4.7H2O, 0.01 내지 1 mg/ml 폴리비닐 알코올, 1 내지 10 mg/ml 인간 혈청 알부민, 0.005 내지 0.5 mM CaCl2.2H2O를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전기적세포융합 배지는 0.3 M 만니톨, 0.1 mM MgSO4.7H2O, 0.1 mg/ml 폴리비닐 알코올, 3 mg/ml 인간 혈청 알부민, 0.05 mM CaCl2.2H2O를 포함한다.
다양한 구체예에 있어서, 핵 이식 난모세포는 완전한 활성화를 위해 포스트-활성화 배지(post-activation medium)에서 처리된다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 이후에 포스트-활성화 배지에서 인큐베이션된다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지이다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 퓨로마이신(puromycin), 에탄올, 사이클로헥시이미드(CHX), 트리코스타틴 A(trichostatin A)(TSA), 및 사이토칼라신 B(cytochalasin B)(CB)로부터 선택된 어느 하나이상을 포함할 수 있다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화된 난모세포는 포스트-활성화 배지에서 30 내지 45, 45 내지 60, 60 내지 90, 90 내지 120, 120 내지 150, 150 내지 180, 180 내지 210, 210 내지 240, 240 내지 270, 300 내지 330, 330 내지 360, 360 내지 390분 미만, 또는 390분 초과 동안 인큐베이션된다. 특정 구체예에 있어서, 활성화된 난모세포는 240, 300, 또는 360분 동안 인큐베이션된다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화 및 포스트-활성화 단계는 저산소 조건하에서 수행된다. 특정 구체예에 있어서, 저산소 조건은 약 80 내지 85%, 85 내지 90%. 90 내지 95%, 95% 또는 그 이상의 N2, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 그 이상의 O2, 및 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 또는 그 이상의 CO2를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 저산소 조건은 약 90% N2, 약 5% O2, 및 약 5% CO2를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 기체 혼합물, 예를 들면, 약 90% N2, 약 5% O2, 및 약 5% CO2 중 1, 2, 3, 4, 5, 5, 또는 그 이상의 시간 동안, 예를 들면, 37 ℃에서 인큐베이션된, 난할 배지 중 1, 2, 3, 4, 5, 5, 또는 그 이상의 mM의 6-DMAP를 포함한다.
포스트-활성화 배지에서 인큐베이션 후에, 포스트-활성화된 난모세포는 세척 배지에서 인큐베이션된다. 상이한 구체예에 있어서, 세척 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지이다. 또 다른 구체예에 있어서, 배양 배지는 글로벌 인간 배아 배양 배지와 같이 연속의 배지 교환을 요구하지 않는다. 특정 구체예에 있어서, 세척 배지는 TSA를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 난모세포는 TSA를 포함하는 세척 배지에서 240, 300, 또는 360분 동안 인큐베이션된다. 일 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 세척되고, 추가적으로 배양된다. 일 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 6-DMAP 제거 배지에서 세척된다. 다른 구체예에 있어서, 다양한 개시된 배지, 예를 들면, HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지는 선택적으로 성장인자, 예를 들면, GM-CSF 또는 IGF1을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 성장 인자는 핵 이식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이후의 일에 첨가될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 활성화 및/또는 포스트-활성화는 정자로부터 분리된 인자, 그의 파생물 및 추출물을 첨가할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 인간 정자 인자는 기재된 주입 방법의 어느 것을 사용하여 활성화된 재구축된 난자에 주입된다. 일 구체예에 있어서, 인간 정자 인자는 기재된 주입 방법의 어느 것을 사용하여 포스트-활성화된 재구축된 난자에 주입된다. 다양한 구체예에 있어서, 약 1, 2, 3, 또는 4일 후에, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 난할 배지로 옮겨진다. 특정 구체예에 있어서, 약 1일 후에, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 난할 배지로 옮겨진다. 다양한 구체예에 있어서, 정자 인자는 예를 들면, 정자 세포의 내부 또는 외부에 존재하는 세포 단백질로부터 분리된 인자를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전체 정자 추출물은 계면 활성제 및 사정된 정자의 기계적 혼합을 사용하여 수득된다. 또 다른 구체예에 있어서, 전체 세포 추출물은 DNAase I 및 RNAase로 처리된다. 또 다른 구체예에 있어서, 조추출물(crude extract)은 버퍼로 세척되고 원심분리(2시간 동안 20,000 g)된다. 다른 구체예에 있어서, 신선한 사정된 인간 정자는 수입되고, 정액 혈장을 제거하기 위해 10분 동안 900 g에서 원심 분리 된 이후, 5 mg/mL 소 혈청 알부민을 함유하는 스펌-TALP(Sperm-TALP)에서 펠렛의 재현탁 및 설정과 동시에 원심 분리된 이후, 상등액의 제거 및 핵 분리 배지(NIM: 125 mM KCl, 2.6 mM NaCl, 7.8 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 3.0 mM EDTA 디소듐 염; pH 7.45)에서 최종 농도 20 X 108 sperm/mL로 펠렛의 재현탁, 및 스펌-TALP를 제거하기 위해 원심 분리된다. 스펌-TALP가 제거된 이후, 1 mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol), 100 mM 루펩틴(leupeptin), 100 mM 안티패인(antipain), 및 100 mg=mL 소이빈 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor)를 함유하는 NIM에 동일한 부피로 펠렛의 재현탁 이후에 2 ℃에서 50분 동안 20,000X에서 밀집한 정자 펠렛 형성과 함께 4 주기의 동결(액체 N2에서 각 주기당 5분), 및 해동(15℃에서 각 주기당 5분)이 뒤따른다. 최종적으로 결과 상등액은 조심스럽게 제거되고, 적정되고, 사용될 때까지 -80℃에서 유지된다.
다양한 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 배반포로 더 배양된다. 일 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 SAGE 난할 배지, 예를 들면, 퀸 배지(Quinn's medium)에서 더 배양된다. 또 다른 구체예에 있어서, 배지, 예를 들면, 3i 배지 (뉴로 기본 배지(Neuro basal medium) 50%, DMEM/F-12 50%, N2 첨가물 1/200 v/v, B27 첨가물 1/100 v/v, 100 mM L-글루타민 1/100 v/v, 0.1M β-ME 1/1000 v/v, SU5402 (FGFR 억제제) 2 μM, PD184352 (ERK 캐스케이드 억제제) 0.8 μM, CHIR99021 (GSK3 억제제) 3 μM) 또는 변형된 3i 배지(PD0325901 (MAPK 억제제) 0.4 μM 포함)는 다능성을 촉진한다. 일 구체예에 있어서, 추가적인 배양은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 5일 이상 동안이다. 일 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 리프로그래밍 인자 및/또는 메틸화-변경제를 갖는 배양 배지에서 제공된다. 다양한 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 CARM1 CARM1, Esrrb, Kdm4a, Kdm4b 및 Kdm4d Esrrb 중 어느 하나가 첨가된 G2 배지에서 3일 동안이다. 예를 들면, CARM1 및/또는 Esrrb는 각각 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 또는 그 이상의 μg/ml의 배지 중 농도로 제공될 수 있다. 일부 구체예에 있어서, CARM1 및/또는 Esrrb는 각각 2 μg/ml의 배지 중 농도로 제공된다.
다양한 구체예에 있어서, 배반포로의 추가적인 배양 및 배반포로부터 다능성 줄기 세포(pSCs)의 유도는 투명대(ZP)를 제거하기 위해 배양된 배반포를 산성 티로드 용액(acidic Tyrode's solution)으로 처리하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 처리는 몇 초(예를 들면, 1 내지 5) 동안이다. 다양한 구체예에 있어서 ZP의 제거 이후에 HEPES-HTF 배지에서의 세척이 뒤따른다. 다양한 구체예에 있어서, 내세포괴(ICM)의 분리는 배반포의 영양포(trophoblast)를 폐기하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, ICM 세포는 플레이팅 하루 전에 제조된 마우스 배아 피더층(mouse embryonic feeder)(MEF)에 플레이팅된다. 일부 구체예에 있어서, 전체 배반포는 MEFs에 플레이팅된다. 예를 들면, 이 방법은 배반포의 투명대를 벗기는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 방법은 Hepes-HTF 배지 중 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1% 프로나아제(pronase)로 배반포의 투명대를 제거하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 Hepes-HTF 배지 중 0.5% 프로나아제(pronase)로 배반포의 투명대를 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 60, 60 내지 120, 120 내지 180, 또는 >180 초 동안 TH3 배지(SAGE 배반포 배지) 중 프로나아제를 적용하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 30 내지 60초 동안 HTF 배지 중 0.5% 프로나아제를 적용하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 배반포는 수여 난모세포로의 공여 세포 핵의 체세포 핵 이식(NT)으로부터 수득된 재구축된 핵 이식된 난모세포로부터 유래된다. 일 구체예에 있어서, 줄기 세포주는 체세포 핵 이식 인간 다능성 hPSC(human Pluripotent Stem Cell, NT-hPSC) 세포주이다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 영양외배엽성 세포(trophectodermal cell)로부터의 내세포괴(ICM)이 기계적 확산(mechanical dispersion)하는 단계를 포함하는 면역절제술(immunosurgery)을 위한 방법을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 벗겨진 배반포는 37℃에서 약 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 60분 동안 래빗 항-인간 비장 혈청으로 처리된다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 벗겨진 배반포를 TH3(SAGE 배반포 배지)로 세척하는 단계, 37℃에서 30분 동안 HECM-9(SAGE 배반포 배지)로 재구축된 기니 피그 보체에서 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 확장된 배반포의 투명대는 TH3(hepes-HTF) 배지 중 0.5% 프로나아제 또는 산성 티로드 용액에의 약간의 노출(45 내지 60 초)로 제거된다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 선택적으로 영양외배엽성 세포로부터 내세포괴를 분리하기 위해 작은 구경 피펫팅(small bore pipetting), Ehsms zilos-tk unit(Hamilton Thorne)을 사용한 레이저 보조 부화 방법(laser assisted hatching method)을 사용하여 세포를 기계적으로 확산하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 바람직하게는 상기 포스트 활성화 배지는 TSA를 포함하는 배지에서 이루어지는 것이며 또한, 포스트 활성화 배지는 6-DMAP를 포함하는 것이다. 더 바람직하게는 포스트 활성화 시 6-DMAP를 포함한 배지에서 배양한 후 추가로 TSA가 포함된 배지에서 배양하는 것이다.
다양한 구체예에 있어서, 성공적인 NT-hPSC 제조율을 높이기 위하여 적어도 하나의 공여세포의 핵을 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)와 집촉시킴으로써 변경될 수 있다. 후생학적 조절인자는 구체적으로 특정 단백질 또는 DNA의 메틸레이션 또는 아세틸레이션의 상태를 바꿈으로써 전사의 효율을 증가시키고 결과적으로 NT 효율을 높이도록 하는 것이다. 이러한 후생학적 조절인자의 표적(target)은 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질, 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질 등을 포함하며, 적어도 하나 이상을 포함한다. 이들 제제는 small interfering RNA(siRNA), 저분자(small molecule), 단백질, 펩티드, 항체등을 포함하는 것이다. 이들 제제들은 리프로그래밍 저항부위(reprogramming resistant region)와 연관된 후생성 타겟에 작용하는 것이다. NT 난모세포는 후생성 상태를 변경하는 제제의 존재하에 배양된다. 이들 제제들의 구체적인 예시는 아래 표 2 내지 5에 기술된다. 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질, 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질은 아래 예시에 제한되는 것은 아니다.
히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질
Target_ID (|domain #) Full name Uniprot _ID NCBI geneid
ATAT1 alpha tubulin acetyltransferase 1 Q5SQI0-1 79969
CLOCK clock homolog (mouse) O15516-1 9575
CREBBP CREB binding protein Q92793-1 1387
ELP3 elongation protein 3 homolog (S. cerevisiae) Q9H9T3-1 55140
EP300 E1A binding protein p300 Q09472-1 2033
GTF3C4 general transcription factor IIIC, polypeptide 4, 90kDa Q9UKN8-1 9329
HAT1 histone acetyltransferase 1 O14929-1 8520
KAT2A/GCN5L2 K(lysine) acetyltransferase 2A Q92830-1 2648
KAT2B/PCAF K(lysine) acetyltransferase 2B Q92831-1 8850
KAT5/TIP60 K(lysine) acetyltransferase 5 Q92993-1 10524
MYST1 K(lysine) acetyltransferase 8 Q9H7Z6-1 84148
MYST2 K(lysine) acetyltransferase 7 O95251-1 11143
MYST3 K(lysine) acetyltransferase 6A Q92794-1 7994
MYST4 K(lysine) acetyltransferase 6B Q8WYB5-1 23522
NCOA1 nuclear receptor coactivator 1 Q15788-1 8648
NCOA3 nuclear receptor coactivator 3 Q9Y6Q9-1 8202
TAF1 TAF1 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 250kDa P21675-1 6872
TAF1L TAF1 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 210kDa-like Q8IZX4-1 138474
히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질
Target_ID (|domain #) Full name Uniprot _ID NCBI geneid
HDAC1 histone deacetylase 1 Q13547_1 3065
HDAC10|1 histone deacetylase 10 Q969S8_1 83933
HDAC10|2 histone deacetylase 10 Q969S8_1 83933
HDAC10|1 histone deacetylase 10 Q969S8_2 83933
HDAC10 histone deacetylase 10 Q969S8_5 83933
HDAC11 histone deacetylase 11 Q96DB2_1 79885
HDAC2 histone deacetylase 2 Q92769_1 3066
HDAC3 histone deacetylase 3 O15379_1 8841
HDAC4 histone deacetylase 4 P56524_1 9759
HDAC5 histone deacetylase 5 Q9UQL6_1 10014
HDAC6|1 histone deacetylase 6 Q9UBN7_1 10013
HDAC6|2 histone deacetylase 6 Q9UBN7_1 10013
HDAC7 histone deacetylase 7 Q8WUI4_1 51564
HDAC8 histone deacetylase 8 Q9BY41_1 55869
HDAC9 histone deacetylase 9 Q9UKV0_1 9734
SIRT1 sirtuin 1 Q96EB6_1 23411
SIRT2 sirtuin 2 Q8IXJ6_1 22933
SIRT3 sirtuin 3 Q9NTG7_1 23410
SIRT4 sirtuin 4 Q9Y6E7_1 23409
SIRT5 sirtuin 5 Q9NXA8_1 23408
SIRT6 sirtuin 6 Q8N6T7_1 51548
SIRT6 sirtuin 6 Q8N6T7_2 51548
SIRT6 sirtuin 6 Q8N6T7_4 51548
SIRT7 sirtuin 7 Q9NRC8_1 51547
라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질
Target_ID (|domain #) Full name Uniprot _ID NCBI geneid
JARID2 jumonji, AT rich interactive domain 2 Q92833_1 3720
JHDM1D jumonji C domain containing histone demethylase 1 homolog D (S. cerevisiae) Q6ZMT4_1 80853
JMJD1C jumonji domain containing 1C Q15652_1 221037
JMJD5 jumonji domain containing 5 Q8N371_1 79831
KDM1A lysine (K)-specific demethylase 1A O60341_1 23028
KDM1B lysine (K)-specific demethylase 1B Q8NB78_1 221656
KDM1B lysine (K)-specific demethylase 1B Q8NB78_2 221656
KDM2A lysine (K)-specific demethylase 2A Q9Y2K7_1 22992
KDM2B lysine (K)-specific demethylase 2B Q8NHM5_1 84678
KDM3A lysine (K)-specific demethylase 3A Q9Y4C1_1 55818
KDM3B lysine (K)-specific demethylase 3B Q7LBC6_1 51780
KDM4A lysine (K)-specific demethylase 4A O75164_1 9682
KDM4B lysine (K)-specific demethylase 4B O94953_1 23030
KDM4C lysine (K)-specific demethylase 4C Q9H3R0_1 23081
KDM4D lysine (K)-specific demethylase 4D Q6B0I6_1 55693
KDM4DL lysine (K)-specific demethylase 4D-like B2RXH2_1 390245
KDM5A lysine (K)-specific demethylase 5A P29375_1 5927
KDM5B lysine (K)-specific demethylase 5B Q9UGL1_1 10765
KDM5C lysine (K)-specific demethylase 5C P41229_1 8242
KDM5D lysine (K)-specific demethylase 5D Q9BY66_1 8284
KDM6A lysine (K)-specific demethylase 6A O15550_1 7403
KDM6B lysine (K)-specific demethylase 6B O15054_1 23135
MINA MYC induced nuclear antigen Q8IUF8_1 84864
NO66 chromosome 14 open reading frame 169 Q9H6W3_1 79697
단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질
Target_ID (|domain #) Full name Uniprot _ID NCBI geneid
ASH1L ash1 (absent, small, or homeotic)-like (Drosophila) Q9NR48_1 55870
CARM1 coactivator-associated arginine methyltransferase 1 Q86X55_1 10498
DOT1L DOT1-like, histone H3 methyltransferase (S. cerevisiae) Q8TEK3_1 84444
EHMT1 euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 1 Q9H9B1_1 79813
EHMT2 euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2 Q96KQ7_1 10919
EZH1 enhancer of zeste homolog 1 (Drosophila) Q92800_1 2145
EZH2 enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila) Q15910_1 2146
EZH2 enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila) Q15910_5 2146
MDS1 MDS1 and EVI1 complex locus Q03112_3 2122
MLL myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila) Q03164_1 4297
MLL2 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 2 O14686_1 8085
MLL3 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 3 Q8NEZ4_1 58508
MLL4 - Q9UMN6_1 9757
MLL5 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 5 (trithorax homolog, Drosophila) Q8IZD2_1 55904
NSD1 nuclear receptor binding SET domain protein 1 Q96L73_1 64324
PRDM1 PR domain containing 1, with ZNF domain O75626_1 639
PRDM10 PR domain containing 10 Q9NQV6_1 56980
PRDM11 PR domain containing 11 Q9NQV5_1 56981
PRDM12 PR domain containing 12 Q9H4Q4_1 59335
PRDM13 PR domain containing 13 Q9H4Q3_1 59336
PRDM14 PR domain containing 14 Q9GZV8_1 63978
PRDM15 PR domain containing 15 P57071_1 63977
PRDM16 PR domain containing 16 Q9HAZ2_1 63976
PRDM2 PR domain containing 2, with ZNF domain Q13029_1 7799
PRDM4 PR domain containing 4 Q9UKN5_1 11108
PRDM5 PR domain containing 5 Q9NQX1_1 11107
PRDM6 PR domain containing 6 Q9NQX0_1 93166
PRDM7 PR domain containing 7 Q9NQW5_1 11105
PRDM8 PR domain containing 8 Q9NQV8_1 56978
PRDM9 PR domain containing 9 Q9NQV7_1 56979
PRMT1 protein arginine methyltransferase 1 Q99873_1 3276
PRMT2 protein arginine methyltransferase 2 P55345_1 3275
PRMT3 protein arginine methyltransferase 3 O60678_1 10196
PRMT5 protein arginine methyltransferase 5 O14744_1 10419
PRMT6 protein arginine methyltransferase 6 Q96LA8_1 55170
PRMT7|1 protein arginine methyltransferase 7 Q9NVM4_1 54496
PRMT7|2 protein arginine methyltransferase 7 Q9NVM4_1 54496
PRMT8 protein arginine methyltransferase 8 Q9NR22_1 56341
SETD1A SET domain containing 1A O15047_1 9739
SETD1B SET domain containing 1B Q9UPS6_1 23067
SETD2 SET domain containing 2 Q9BYW2_1 29072
SETD3 SET domain containing 3 Q86TU7_1 84193
SETD4 SET domain containing 4 Q9NVD3_1 54093
SETD5 SET domain containing 5 Q9C0A6_1 55209
SETD6 SET domain containing 6 Q8TBK2_1 79918
SETD6 SET domain containing 6 Q8TBK2_2 79918
SETD7 SET domain containing (lysine methyltransferase) 7 Q8WTS6_1 80854
SETD8 SET domain containing (lysine methyltransferase) 8 Q9NQR1_1 387893
SETDB1 SET domain, bifurcated 1 Q15047_1 9869
SETDB2 SET domain, bifurcated 2 Q96T68_1 83852
SETMAR SET domain and mariner transposase fusion gene Q53H47_1 6419
SMYD1 SET and MYND domain containing 1 Q8NB12_1 150572
SMYD2 SET and MYND domain containing 2 Q9NRG4_1 56950
SMYD3 SET and MYND domain containing 3 Q9H7B4_1 64754
SMYD4 SET and MYND domain containing 4 Q8IYR2_1 114826
SMYD5 SMYD family member 5 Q6GMV2_1 10322
SUV39H1 suppressor of variegation 3-9 homolog 1 (Drosophila) O43463_1 6839
SUV39H2 suppressor of variegation 3-9 homolog 2 (Drosophila) Q9H5I1_1 79723
SUV420H1 suppressor of variegation 4-20 homolog 1 (Drosophila) Q4FZB7_1 51111
SUV420H2 suppressor of variegation 4-20 homolog 2 (Drosophila) Q86Y97_1 84787
WHSC1 Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1 O96028_1 7468
WHSC1L1 Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1-like 1 Q9BZ95_1 54904
일반적으로 메틸기 전달효소는 공동기질 유사체(co-substrate analogues)에 의해 억제될 수 있다. 다양한 종류의 메틸기 전달효소를 억제하는 공동기질 유사체로는 세가지 종류가 알려져 있다. S-adenosylmethionone(SAM)에 구조적으로 유사한 항생제 화합물인 sinefugin, 피드백 저해제로서 디메틸화된 공동기질 SAH 및 메틸티오아데노신(methylthioadenosine)이다. 라이신 메틸기 저해제로는 가장 먼저 확인된 chaetocin와 G9a(KMT1C) 저해제인 Bix-01294를 포함한다. 이들은 SUV39H1 및 PRM1에 선택적이다. Bix-01338화합물은 라이신과 아르기닌 메틸기 전달효소사이에 선택성 없이 다소 비선택적인 억제제이며, G9a에 대하여 IC50 5mM을 보이는 반면, PRMT1에 대하여는 IC50 6mM을 보였다. UNC0224는 라이신 메틸기 전달효소 G9a에 대하여 IC50 15mM을 보이는 새로운 저해제로 제시되고 있다. EPZ5676, EPZ005687 및 GSK126과 같은 히스톤 메틸기 전달효소의 억제제는 또한 다양한 암 동물모델에서 항암활성을 보여주고 있다.
단백질 아르기닌 메틸화는 PRMTs에 의하여 이루어지며, 두개의 그룹으로 분류된다. Type I 메틸기 전달효소는 비대칭적으로 치환된 아르기닌 잔기를 형성시키도록 하며, type II 메틸기 전달효소는 대칭적으로 치환된 아르기닌 잔기를 형성시킨다. CARM1은 포롤린(proline)-글라이신(glycine)-메티오닌(methionine)-아르기닌(arginine)(소위 PGM 모티프)와 친화도(affinity)를 보여준다. PRMT5는 또한 PGM 모티프를 메틸레이트시킨다고 알려져 있다. Sinefungin과 같은 공동기질 유사체는 아르기닌 메틸기 전달효소의 억제제(또한, 아르기닌 메틸기 전달효소 억제제로서 AMIs로 알려진)로도 사용될 수 있다. AMI-1은 PRMT1에 대하여 IC50 9mM으로 가장 활성이 높은 억제제이다. Allatodapsone과 stilbamidine의 억제제들은 H4R3에서 하이포메틸화(hypomethylation)을 유도한다.
후생성 타겟(epigenetic target)의 다른 유형으로 NT 효율을 높이는 방법이 있을 수 있다. DNA 메틸기 전달효소(DNA mehtyltransferases, DNMTs)는 우선적으로 DNA의 CpG뉴클레오티드 서열을 메틸레이트시킨다. 포유류에서는 DNMT1, DNMT3A 및 DNMT3 세개의 DNA 메틸기 전달효소가 확인된 바 있다. 일반적으로 이들 프로모터 부위의 메틸화는 전사인자가 DNA에 결합하는 것을 방해함으로써 유전자의 발현을 저지한다. 추가적으로 메틸화된 DNA는 메틸-CpG결합 도메인 단백질(methyl-CpG binding domain protein)에 의하여 묶여 있으며, 이들 단백질은 히스톤 모델링 효소(histone modeling enzymes)을 끌어들이게 되며, 결과적으로 크로마틴 구조를 응축시켜 유전자 발현을 억제하는 메커니즘을 유도할 수 있다. DNMT inhibitors는 유전자 발현이 억제되는 것을 저지함으로써 결과적으로 NT 효율을 증가시킬 수 있다. 예시적으로 몇 개의 화합물이 있으며, chlorogenic acid, mithramycin, azacytide, bisdemethoxycurcumim, decitabine, lomegutatrib, benzylguanine, sorafenib 및sorafenib tosylate 등이 있다.
추가로, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase)는 히스톤의 N-아세틸 라이신 아미노산으로부터 아세틸기를 제거하는 기능을 하며, 결과적으로 더 많은 양전하를 띄게 되며 음전하를 띄는 DNA에 강하게 결합하게 된다. DNA 구조의 응축과 유전적 전사는 더 억제되게 된다. HDACs는 위치와 기능에 따라 4개의 세부그룹으로 분리될 수 있으며, Class I HDACs(1, 2, 3, 8 아형)은 주로 핵에서 발견되며, class II HDACs(4, 5, 6, 7, 9, 10)은 핵막을 통과하여 이동할 수 있으며 핵과 세포질 모두에서 발견된다. Type III HDACs는 silent information regulator 2 (Sir2)로 불리며, type IV HDACs(11 아형)는 핵과 세포질 모두에서 발견되며 주로 뇌, 심장, 근세포 등에 위치한다. HDACs 억제제는 다른 화학합성약물과 병용투여되었을 때 항암활성을 가진다. HDAC inhibitors는 DN의 전사를 촉진함으로써 결과적으로 NT 효율을 증가시킬 수 있다.
포스트 활성화 배지에 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents), 예를 들면 후생적 크로마틴(epigenetic chromatin) 및 β 히스톤 변형제(histone modification agents), 및/또는 DNA 변경제를 포함할 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 이것은 단백질 아르기닌 메틸-트랜스퍼라아제(PRMT1) 및 공활성화 인자-연관된 아르기닌 메틸트랜스퍼라아제 1(coactivator-associated arginine methyltransferase 1) (CARM1/PRMT4), 핵 고아 수용체 에스트로겐(orphan nuclear receptor estrogen) 관련된 수용체 β (Esrrb) 단백질 중에서 선택될 수 있으며, 또한, 라이신 특이적 디메틸라아제 4A(Lysine (K)-Specific Demethylase 4A, Kdm4a), 라이신 특이적 디메틸라아제 4B(Lysine (K)-Specific Demethylase 4B, Kdm4b) 또는 라이신 특이적 디메틸라아제 4D(Lysine (K)-Specific Demethylase 4D, Kdm4d)의 각각 RNA 또는 단백질 중에서 선택될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 메틸화-변경제 및/또는 DNA 변형제는 변형된 재조합 단백질로 발현된다. 예를 들면, CARM1 및 Esrrb는 7X아르기닌(7R)-세포-투과 펩티드(CPPs), 또는 통상의 기술자에게 세포막 및 핵막을 통과하여 단백질 및 펩티드의 투과를 증진시키고, DNA와의 결합 및/또는 전사활성화를 증가시키는 것으로 알려진 다른 단백질로 변형될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 전사 인재-기반 재프로그래밍을 사용하여 옥타머 결합 전사 인자-4(octamer binding transcription factor-4)(Oct-4), 성 결정 부위 Y-박스-2(sex determining region Y-box-2)(Sox-2), nanog, 크루펠-유사 인자-4(Kruppel-like factor-4)(Klk-4), MyoD, c-Myc, 징크 파인더 단백질-42(zinc finder protein-42)(Rex-1/Zfp-42), 레프티 A(lefty A), 기형암종-유래 성장인자(teratocarcinoma-derived growth factor) (Tdgf), 및/또는 텔로머 반복 결합 인자(telomeric repeating binding factor)(Terf-1)로 핵 공여 세포를 후생적으로 재프로그래밍하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 방법은 직접적인 압전기 주입, 바이러스성 주입, 리포좀성 주입, 또는 다른 방법의 세포질 내 주입을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 전사 인자는 핵이 제거된 난모세포로의 핵 이식 전에 적용될 수 있는 mRNA, 단백질, 및/또는 세포 추출물의 형태로 전달될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 HDAC 억제제(클래스 I, II, 및 III), 또는 DNMT3a 및 DNMT3b 억제제의 사용을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 바람직하게는 포스트 활성화(post activation) 배지는 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)를 포함한 것이다. 더 바람직하게는 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)는 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질, 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질 및 DNA 메틸기 전달효소(DNA mehtyltransferases, DNMTs)를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 관여하는 것이다. 본 발명에서 바람직하게는 NT세포 유래 줄기세포의 제조방법은, 상기 c)단계에서 줄기세포의 제조는 NT 세포를 활성화시킨 후 배반포를 생성하는 단계; 생성된 배반포로부터 내세포집단 (ICM) 세포를 단리하는 단계; 및 분리된 내세포집단 세포를 줄기세포로 추가로 배양하는 단계를 포함하는 것이다.
상기 a) 단계는 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포(pn-hPSC)를 생성시키는 단계이며, 상기 a) 단계는, 난모세포를 활성화하는 단계; 포스트-활성화 배지에서 상기 활성화된 난모세포를 인큐베이션하여 반수성체를 생성하는 단계; 배양 배지에서 상기 반수성체를 인큐베이션하여 배반포를 형성하는 단계; 및 상기 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 내세포괴 세포는 pn-hPSC로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 것일 수 있다.
난모세포의 활성화는 전기적 및/또는 화학적 자극을 가하여 난모세포를 활성화 시킬 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 단위 생식성 난모세포의 형성을 시작하기 위해 중기 II(MII) 단계 난모세포를 활성화 배지에서 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 활성화 배지는 칼슘 이온운반체를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 칼슘 이온운반체는 이오노마이신, A23187, 뷰베리신, X-537A, 아베나시올리드, 모노매크로사이클릭 폴리에테르, 또는 마크로바이오사이클릭 화합물 또는 크립테이트이다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 알코올, 예를들면, 에탄올을 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 티메로살을 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 MII 단계 난모세포의 전기적 활성화를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전기적 활성화는 전기적세포융합 배지에서의 전기적 펄스를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 전기적세포융합 배지는 0.1 내지 0.5 M 만니톨, 0.01 내지 1 mM MgSO4.7H2O, 0.01 내지 1 mg/ml 폴리비닐 알코올, 1 내지 10 mg/ml 인간 혈청 알부민, 0.005 내지 0.5 mM CaCl2.2H2O를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전기적세포융합 배지는 0.3 M 만니톨, 0.1 mM MgSO4.7H2O, 0.1 mg/ml 폴리비닐 알코올, 3 mg/ml 인간 혈청 알부민, 0.05 mM CaCl2.2H2O를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 난모세포는 정자 인자와 함께 처음에 주입되고, 이후에 전기적으로 활성화된다.
특정 구체예에 있어서, MII 단계 난모세포는 30 ℃, 31 ℃, 32 ℃, 33 ℃, 34 ℃, 35 ℃, 36 ℃, 37 ℃, 38 ℃, 39 ℃, 40 ℃, 또는 그 이상의 온도에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 분 동안 활성화 배지에서 인큐베이션되고, 이후에 세척 배지에서 세척된다. 특정 구체예에 있어서, MII 단계 난모세포는 37 ℃ 온도에서 5분 동안 칼슘 이온운반체에 노출되고, 이후에 세척 배지에서 세척된다. 상이한 구체예에 있어서, 세척 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지이다.
상이한 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 이후에 포스트-활성화 배지에서 인큐베이션된다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지이다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 푸로마이신, 에탄올, 사이클로헥시이미드(CHX), 트리코스타틴 A (TSA), 및/또는 사이토칼라신 B (CB)를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 포스트-활성화 배지에서 30, 30 내지 45, 45 내지 60, 60 내지 90, 90 내지 120, 120 내지 150, 150 내지 180, 180 내지 210, 210 내지 240, 240 내지 270, 300 내지 330, 330 내지 360, 360 내지 390분 미만, 또는 390분 초과 동안 인큐베이션된다. 특정 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 240, 300, 또는 360분 동안 인큐베이션된다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화 및 포스트-활성화 단계는 저산소 조건하에서 수행된다. 특정 구체예에있어서, 저산소 조건은 약 80 내지 85%, 85 내지 90%. 90 내지 95%, 95% 또는 그 이상의 N2, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 그 이상의 02, 및 약1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 또는 그 이상의 CO2를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 저산소 조건은 약 90% N2, 약 5% O2, 및 약 5% CO2를 포함한다.
포스트-활성화 배지에서 인큐베이션 후에, 포스트-활성화된 단위 생식성 난모세포는 세척 배지에서 인큐베이션 된다. 상이한 구체예에 있어서, 세척 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지이다. 또 다른 구체예에 있어서, 배양 배지는 글로벌 인간 배아 배양 배지와 같이 연속의 배지 교환을 요구하지 않는다. 특정 구체예에 있어서, 세척 배지는 TSA를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 난모세포는 TSA를 포함하는 세척 배지에서 240, 300, 또는 360분 동안 인큐베이션된다.
세척 배지에서 인큐베이션 후에, 포스트-활성화된 단위 생식성 난모세포는 배양 배지로 옮겨진다. 상이한 구체예에 있어서, 배양 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지이다. 또 다른 구체예에 있어서, 배양 배지는 글로벌 인간 배아 배양 배지와 같이 연속의 배지 교환을 요구하지 않는다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 단위 생식성 난모세포는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상 일 동안 난할 배지에서 배양될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 난할 배지에서의 배양은 2일 동안이다. 난할 배지에서 배양한 이후에, 난모세포는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상 일 동안 배반포 형성 배지에서 배양된다. 특정 구체예에 있어서, 배반포 형성 배지에서의 배양은 3일 동안이다.
일 구체예에 있어서, 난모세포를 활성화하는 단계는 37 ℃에서 5분 동안 활성화 배지에서 인큐베이션하는 단계에 뒤이은 난할 배지에서 세척하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 5 μM의 이오노마이신을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 난모세포는 완전한 활성화를 위해 포스트-활성화 배지에서 처리된다. 다양한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 5% CO2/5% O2/90% N2 대기 중 37℃에서 4시간 동안의 난할 배지 중 2 mM 6-DMAP를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 활성화된 난모세포는 세척되고, 및 추가적으로 배양된다. 일 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 6-DMAp 제거 배지에서 세척된다. 일 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 SAGE 난할 배지, 예를 들면 퀸 배지에서 추가적으로 배양된다. 또 다른 구체예에 있어서, 배지, 예를 들면, 3i 배지 (신경기저 배지(Neuro basal medium) 50%, DMEM/F-12 50%, N2 첨가물 1/200 v/v, B27 첨가물 1/100 v/v, 100 mM L-글루타민 1/100 v/v, 0.1M β-ME 1/1000 v/v, SU5402 (FGFR 억제제) 2 μM, PD184352 (ERK 캐스케이드 억제제) 0.8 μM, CHIR99021 (GSK3 억제제) 3 μM) 또는 변형된 3i 배지 (PD0325901 (MAPK 억제제) 0.4 μM 포함)는 다능성을 촉진한다. 일 구체예에 있어서, 추가적인 배양은 2일 동안 이다. 일 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 리프로그래밍 인자 및/또는 메틸화-변형제를 갖는 배양 배지에서 제공된다. 다양한 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 CARM1 및/또는 Esrrb가 첨가된 G2 배지에서 3일 동안이다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 배반포로 더 배양된다. 다양한 구체예에 있어서, 배반포로의 추가적인 배양, 및 배반포로부터 다능성 줄기 세포(pSCs)의 유도는 투명대(ZP)를 제거하기 위해 배양된 배반포를 산성 타이로드 용액(예를 들면, pH 2.0)으로 처리하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 처리는 몇 초(예를 들면, 1 내지 5) 동안이다. 다양한 구체예에 있어서 ZP의 제거 이후에 HEPES-HTF 배지에서의 세척이 뒤따른다. 다양한 구체예에 있어서, 내세포괴(ICM)의 분리는 배반포의 영양포(trophoblast)를 폐기하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, ICM 세포는 플레이팅 하루 전에 제조된 마우스 배아 피더(MEFs)에 플레이팅된다. 일부 구체예에서, 전 배아는 MEFs 상에서 플레이팅된다. 다양한 구체예에서, PSC 유도 배지는 혈청 대체물(5% SR, Invitrogen), FBS (10%, Hyclone), 플라스마네이트 (5%), bFGF (32 ng/ml), 및 인간 LIF (2000 units/ml, Sigma-Aldrich)로 보충된 녹아웃- DMEM으로 구성된다.
상기 pn-hPSC는 이형접합성 또는 동형접합성 난모세포로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 이형접합성 pn-hPSC는 민족(ehtnic) 집단에서 대립형질 변인 빈도에 의해 결정된 바와 같은, 민족 집단의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 이상과 면역접합성인 HLA 혈청형을 갖는 HLA 일배체형의 대립형질 변인을 포함한다. 특정 구체예에서, 동형접합성 pn-hPSC는 일 전핵 난모세포의 단위생식을 이용하여 도출된다. 특정 구체예에서, 동형접합성 pn-hPSC는 일 전핵 동형접합성 난모세포의 단위생식을 이용하여 도출된다. 다른 구체예에서, 동형접합성 pn-hPSC는 제2 극체 압출을 포함하는 단위생식을 이용하여 얻어진다. 특정 구체예에서, 동형접합성 pn-hPSC는 민족 집단의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5% 이상과 면역접합성인 HLA 혈청형을 갖는 민족 집단의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5% 이상과 면역접합성인 HLA 혈청형을 갖는 HLA 일배체형을 포함한다. 예를 들면, HLA 일배체형 A*01, B*08, DRB1*03은 백인 인종에서 5% 초과의 빈도로 제시된다. 다른 구체예에서, HLA-혈청형은 HLA-A, HLA-B, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, 및 HLA-DR의 대립형질 변인을 포함한다. 다른 구체예에서, HLA-혈청형은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR의 대립형질 변인을 포함한다. 다른 구체예에서, pn-hPSC는 중기 I (MI) 단계 난모세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, pn-hPSC는 중기 II (MII) 단계 난모세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, pn-hPSC는 공여체 난모세포와 동일하거나 거의 동일한 미토콘드리아 유전체를 포함한다.
상기 pn-hPSC 는 정상적인 46 염색체, XX 핵형을 포함한다. 다른 구체예에서, pn-hPSC는 모든 3개의 배아 배엽층을 형성할 수 있다. 다른 구체예에서, pn-hPSC는 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4), SSEA-3, 종양거절항원 1-81 (Tra-1-81), Tra-1-60, 옥타머 결합 전사 인자-4 (Oct-4), 성 결정 영역 Y-box-2 (Sox-2), nanog, 징크 핑거 단백질-42 (Rex-1/Zfp-42), lefty A, 기형암종-유래 성장 인자 (Tdgf), 텔로미어 반복 결합 인자 (Terf-1), 및 발달 다능성-연관 유전자 2 (Dppa-2)를 포함하는, 하나 이상의 다능성 마커를 발현한다. 다른 구체예에서, pn-hPSC는 열성 치사율을 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, pn-hPSC는 높은 알칼라인 포스파타제 (AP) 및/또는 텔로머라제 활성을 소유한다. 다른 구체예에서, pn-hPSC는 면역결핍 동물에서 서스펜션에서 배아체 및/또는 면역결핍 동물에서 테라토마를 형성할 수 있다.
상기 b) 단계는 hPSC를 현탁 배양하는 것일 수 있다. 상기 현탁 배양기간은 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 이상의 기간 동안 배양하는 것일 수 있으며, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일 또는 6일 이하의 기간 동안 배양하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, hPSC를 넉아웃 혈청 대체제(KSR, knockout-serum replacement)가 첨가된 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지에서 배양하여 배양하여 EB를 형성시킬 수 있다.
배양 전에 hPSC를 적절하게 분리하여, 예컨대 2 내지 5개의 군(clump)로 분리하여 배양할 수 있다. 이때, 적절한 물리적 또는 화학적 방법을 이용하여 hPSC를 분리할 수 있다.
상기 c) 단계는 TGF-β 저해제가 첨가된 배지 및/또는 저포도당(low glucose) 조건의 배지에서 상기 b) 단계에서 형성된 EB를 배양하는 것일 수 있다.
상기 저포도당 조건은 15mM 이하, 바람직하게는 10mM 이하, 더 바람직하게는 7mM이하, 가장 바람직하게는 3 내지 6mM의 글루코오스(glucose)가 배지에 포함되는 것일 수 있다. 예컨대, 5.5mM 의 D-glucose(1g/L)가 배지에 포함될 수 있다. 일반적으로 알려진 고포도당 조건(예를 들어, 약 25mM의 글루코오스가 포함)가 달리 저포도당 조건에서 배양함으로써 MSC를 효율적으로 제조할 수 있다.
일 구체예에 있어서, TGF-β 저해제가 첨가된 저포도당 조건에서 EB를 배양할 수 있으며, TGF-β 저해제가 첨가된 배지에서 일정기간 배양한 후 저포도당 조건의 배지에서 일정기간 배양할 수 있고, 저포도당 조건에서 일정기간 배양한 후 TGF-β 저해제가 첨가된 배지에서 일정기간 배양할 수도 있다. 바람직하게는, EB를 TGF-β 저해제가 첨가된 배지에서 배양한 후 저포도당 조건의 배지에서 상기 EB를 배양하는 것일 수 있다. 예컨대, EB를 TGF-β 저해제 및 KSR이 보충된 DMEM/F12 배지에서 배양한 후, 혈청 및 항생제가 첨가된 저포도당 조건의 DMEM/F12 배지에서 상기 EB를 배양할 수 있다. 상기 혈청으로 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다. 상기 항생제로는 페니실린 및 스트렙토마이신로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다. EB는 TGF-β 저해제가 첨가된 배지에서 10일, 11일, 12일 또는 13일 이상의 기간 동안 배양하는 것일 수 있으며, 18일, 17일, 16일 또는 15일 이하의 기간 동안 배양하는 것일 수 있다. 또한, 저포도당 조건의 배지에서 상기 EB를 12일, 13일, 14일 또는 15일 이상의 기간 동안 배양하는 것일 수 있으며, 20일, 19일, 18일 또는 17일 이하의 기간 동안 배양하는 것일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 저포도당 조건의 배지에서 EB를 부착 배양하는 것일 수 있다. 부착 배양을 위해 젤라틴(gelatin)이 이용될 수 있으나 특별히 이에 제한되지는 않는다.
다른 구체예에 있어서, 상기 b) 단계에서 형성된 EB를 bFGF(basic fibroblast growth factor, Invitrogen)가 제외된 배지에서 배양할 수 있다. 미분화상태를 유지하는 bFGF를 배지성분으로서 제외시켜 효율적으로 MSC(중간엽 줄기세포)를 제조할 수 있다. 예컨대, 형성된 EB를 bFGF가 제외된 KSR 및 DMEM/F12 배지에서 단기간, 예컨대 1 내지 3일, 배양한 후 TGF-β 저해제를 첨가하여 10 내지 18일간 배양하고, 저포도당 조건에서 12 내지 20일간 배양할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, EB를 TGF-β 저해제가 첨가된 배지 및/또는 저포도당 조건의 배지에서 배양한 EB 결과물을 MSC 증식 배지에서 배양하는 것일 수 있다. 예컨대, EB를 TGF-β 저해제가 첨가된 배지에서 배양한 후 저포도당 조건의 배지에서 배양된 EB의 결과물을 MSC 증식 배지에 배양하여 MSC를 제조하는 것일 수 있다. 상기 MSC 증식 배지로는 혈청, 항생제, 비필수 아미노산(NEAA) 및 β-머갑토에탄올(mercaptoethanol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 첨가된 DMEM 배지인 것일 수 있다. 상기 혈청으로 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다. 상기 항생제로는 페니실린 및 스트렙토마이신로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다.
다른 구체예에 있어서, EB 결과물을 MSC 증식 배지에 배양하기 전에 단일 세포(single cells)로 분리하여 배양하는 것일 수 있다. 예컨대, EB 결과물을 물리적 또는 화학적인 방법을 통하여 단일 세포로 분리하여 일정기간 부착 배양한 후 MSC 증식 배지에 옮겨 배양하는 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 d) 상기 제조된 중간엽 줄기세포(MSC)로부터 단일 세포를 분리하는 단계; 및 e) 상기 분리된 단일 세포를 배양하여 단일 세포 유래 MSC를 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 d) 단계는 피펫(예를 들면, 유리 피펫)을 이용해서, 중간엽 줄기세포 집단으로부터 단일 세포를 분리하는 것일 수 있다. 상기 단일 세포 분리는 중간엽 줄기세포를 배양액에 희석한 후, 현미경의 도움을 받아 단일 세포를 분리하는 것일 수 있다. 또한, 상기 단일 세포를 분리함에 있어, 초기 계대의 중간엽 줄기세포 집단, 예를 들면, p1 내지 p9, p2 내지 p8, p3 내지 p8, p4 내지 p7, 또는 p5 내지 p7의 계대의 중간엽 줄기세포 집단을 사용하는 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 e) 단계는, 웰 플레이트에 웰당 단일 세포를 분주하는 단계; 및 상기 분주된 세포를 콜로니가 형성될 때까지 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 e) 단계에 있어서, 상기 웰당 단일 세포가 분주되었는지 확인한 후, 배양을 시작하는 것일 수 있다. 상기 e) 단계의 배양은, 상기 단계 c)와 동일 또는 유사한 배양 조건, 또는 계대 배양수로 배양되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 단일 세포는 bFGF를 포함하는 배지(예를 들면, bFGF가 첨가된 MSC 증식 배지)에서 배양되는 것일 수 있다. 상기 배양은 적어도 2일, 5일, 10일, 11일, 12일 또는 13일 이상의 기간 동안 배양하는 것일 수 있으며, 이에 제한 되지 않고, 적어도 콜로니가 형성되는 기간까지 배양하는 것일 수 있다. 또한, 상기 배양은 계대 배양을 포함할 수 있다. 상기 계대 배양은 적어도 2회, 5회, 10회 이상 수행되는 것을 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 제조된 중간엽 줄기세포는 실질적으로 균질한 세포 집단일 수 있다. 상기 실질적으로 균질한 세포 집단(substantially homogeneous cell population)은 단일 세포로부터 유래하여 세포 집단 내의 다수의 세포(예를 들면, 적어도 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100%)가 동일한 세포 특성 또는 동일한 언급된 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다. 상기 단일 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포는 다른 종류의 세포로 분화하거나 기형종 등을 유발하는 안전성의 측면에서 장점을 가지므로, 임상에서 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 중간엽 줄기세포(MSC)은 CD29, CD44, CD90 및 CD105로 이루어진 군으부터 선택되는 1종 이상에 대해 양성인 것일 수 있다.
예컨대, MSC의 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이 CD29에 대해 양성인 것일 수 있다.
MSC의 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이 CD44에 대해 양성인 것일 수 있다.
MSC의 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이 CD90에 대해 양성인 것일 수 있다.
MSC의 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이 CD105에 대해 양성인 것일 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포(MSC)은 TRA60, SSEA4, CD34 및 CD45로 이루어진 군으부터 선택되는 1종 이상에 대해 음성인 것일 수 있다.
예컨대, MSC의 적어도 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.05% 이하가 TRA60에 대해 음성인 것일 수 있다.
MSC의 적어도 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.05% 이하가 SSEA4에 대해 음성인 것일 수 있다.
MSC의 적어도 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.05% 이하가 CD34에 대해 음성인 것일 수 있다.
MSC의 적어도 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.05% 이하가 CD45에 대해 음성인 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법으로 MSC는 세포 배양에서 적어도 5회, 6회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회 또는 15회 이상의 계대(passage)를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 MSC의 배가시간 (doubling time)은 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간, 40시간 또는 41시간 이상이고 48시간, 47시간, 46시간 또는 45시간 이하인 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 MSC는 분화된 세포로의 분화능을 가진다. 예컨대, 조혈모세포, 근육세포, 심근세포, 간 세포, 연골세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 분화능을 가질 수 있다.
본 발명의 MSC는 장래 사용을 위하여 냉동보존 될 수 있다. 한 실시양태에서 냉동보존제는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 에틸렌 글리콜, 글리세롤 및 프로판디올을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 냉동보호제; DMEM, MEM 및 상기 개시된 특허 배지를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 배양 배지; 수크로스, 덱스트란, 혈청 대체물 및 HEPES 완충제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 추가 물질을 포함하는 용액에 줄기세포를 냉동 보존한다. 한 실시양태에서, 상기 용액은 크리오스토어(CryoStor)(상표명) CS-10 배지(바이오라이프 솔루션스 인코포레이티드(BioLife Solutions Inc.), 미국 워싱톤주 보텔 소재)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 혈청 대체물은 넉아웃(Knockout) 혈청 대체물(인비트로겐(Invitrogen) 10828-028)이다.
MSC의 동결보존은 세포를 조절된 속도에서 동결하거나 "수동" 과정으로 동결한다. 조절된 속도 동결 절차는 조절된 속도 동결기를 켜고 조직 또는 세포 동결을 위한 동결 프로그램을 설정함으로써 시작된다. 조절된 속도 동결기는 액체 질소를 사용하여 내부 챔버 내의 온도를 감소시킬 것이다(이로써 상기 챔버의 임의의 내용물의 온도를 감소시킬 것임). 세포에 대한 동결 프로그램은 내부 챔버를 4℃로 냉각시키고 상기 절차를 계속하도록 자극될 때까지 상기 온도를 유지함으로써 시작된다. 조절된 속도 동결기가 냉각시키는 동안, 세포는 4℃로 냉각된 냉동보존 배지에 현탁된다. 상기 세포 현탁액을 냉동바이알(cryovial) 당 1 ㎖의 양으로 냉동바이알 내로 분취한다. 그 다음, 상기 냉동바이알을 표지하고 조절된 속도 동결기 챔버 내에 넣고 프로그램이 계속되도록 자극한다. 먼저, 상기 챔버의 온도를 4℃에서 추가 10분 동안 유지한다. 다음으로, 온도가 -80℃에 도달할 때까지 상기 챔버를 -1℃/분의 속도로 냉각시킨다. 그 다음, 상기 챔버가 -120℃의 온도에 도달할 때까지 상기 챔버를 -50℃/분의 속도로 냉각시킨다. -120℃에서 5분이 경과된 후, 동결된 세포의 온도는 -120℃로 평형화될 것이다. 그 다음, 상기 동결된 세포의 냉동바이알을 장기간 저장을 위해 액체 질소 드와(Dewar)로 옮긴다.
또한, 본 발명은 상기 MSC로부터 분화된 세포를 제공한다.
분화된 세포는 줄기세포로부터 조혈모세포, 근육 세포, 심근 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 지방세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포, 및 뉴런 세포 등 제한 없으며, 이들로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상의 세포로 분화된 것이며 제한없이 세포 이식을 통한 치료제로 사용될 수 있는 모든 세포를 의미한다. 동결보존된 세포 뱅킹으로부터 이종 환자의 HLA 스크리닝을 통한 면역접합한 세포를 선별하는 단계가 추가될 수 있다. 면역접합성은 이식재료로서 재생 치료의 최적의 공급가능성을 높임으로써 뱅킹이 가능하도록 하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 MSC의 제조방법으로 제조된 MSC를 포함하는 세포집단을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한, 여러 종류의 질환의 치료를 위한 MSC의 세포집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 세포 조성물은 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 0.001 내지 10 mg/kg이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 발명의 구체적인 실시예를 통해, 발명의 작용 및 효과를 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이러한 실시예는 발명의 예시로 제시된 것에 불과하며, 이에 의해 발명의 권리범위가 정해지는 것은 아니다.
실시예 1. 핵 이식 다능성 줄기세포(NT-hPSC)의 준비
1. 기증자 세포로부터 동형접합(Homozygous) 세포의 스크리닝 및 공여세포의 선별
차병원 기증 제대혈은행에서 7억개 미만의 폐기용 제대혈에 대하여 동형접합(homozygous) 세포를 스크리닝 했다. HLA-A, B, DRB1 genotyping을 위해 Gentra PuregeneTM Blood Kits (QIAGEN, Hilden, Germany)을 사용하여 genomic DNA를 추출한 뒤 SeCore A, B and DRB1 Locus Sequencing Kit (Invitrogen, Brown Deer, WI, USA)를 사용하여 Sequence-based typing을 실시했다. 특히 HLA-A와 B의 경우 exon 2-4, HLA-DRB1의 경우 exon 2를 키트(kit)에 포함되어져 있는 locus specific primer를 사용하여 증폭시켰으며, ABI3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 형성된 PCR product에 대한 시퀀싱(sequencing)을 수행했고, HLA SBT u-type software v3.0 (Invitrogen) 및 Sequencher (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, USA)을 사용하여 데이터분석을 실시했다. 결국 이와 같은 방법을 통해 기증제대혈로부터 한국인에게 가장 빈도수가 높은 HLA 동형접합(homozygous) 공여세포 (A*33:03-B*44:03-DRB1*13:02) (haplotype frequency: 4.6%)를 발견했으며, 만일 이로부터 NT-세포를 제작할 경우 전체 인구의 약 9%를 포괄할 수 있다.
상기 스크리닝한 결과로부터 HLA A-B-DRB1 haplotype의 조혈세포(hemapoietic cell)를 공여세포로 선별하여 세포 배양 플라스크에 5% CO2, 37℃ 조건하에 배양하였다. 10% DMSO, 30% FBS가 포함된 DMEM 배양액을 동결액으로 사용하여 cryo vial에 담아 동결하여 사용 시까지 액체질소 탱크에 보관한다. 이들 세포는 염색체 검사를 시행한다(도 2). 세포들은 NT 전에 해동시키고 4 웰 디쉬들에 confluency하게 배양하고 이들 세포는 0.5% FBS DMEM/F12 배지에 2일간 배양하면서 G0/G1단계로 동기화하였다.
1.2 난모세포의 회수 및 제조
CHARMI(CHA Regenerative Medicine Institute)의 SCRO(Stem cell Research Oversight) 위원회 및 EIRB(Essex Institutional Review Board) 승인 하에 진행되었다.
웹(web) 기반의 광고를 통하여 20-32세 여성들을 모집하였으며, ASRM(American Society for Reproductive Medicine) 가이드라인에 따라 상기 여성들의 생식학적, 의학적 및 정신학적인 건강상태를 검사하였다. 상기 검사에 따라 의학 및 정신학적인 검사를 모두 통과한 BMI <28 Kg/m2의 여성들을 대상으로 진행하였다.
난소 자극(Ovarian stimulation)은 정립된 임상 IVF 가이드라인에 따라 수행하였다 (Tachibana et al., 2013). 상기 여성들에게 루프론(Lupron) 또는 hCG 주입 후 36시간 Midazolam 5-7.5 mg (Versed, Roche, 및 Nutley. N.J., USA) 및 Fentanyl 50-75 ug (Abbott Pharmaceutical, Abbott Park, Ill. USA)로 진정시키고 난모세포를 그 후 이전에 기재된 초음파 지도를 사용해 회수하였다. IVF 배지 (Quinn's IVF 배지, SAGE Biopharma, Bedminster, N.J.) 중 신선하게-단리된 난구-난모세포 복합체 (cumulus-oocyte cell complexs: COCs)를 모아 10% 혈청대용물(SSS; Quinns Advantage Serum, Cooper Surgical)이 보충된 HTF-Hepes 배지(Global Medium)에 37℃ 조건하에 두었다. COCs를 히알루로니아제 (100 IU/ml, Sigma, St. Louis, Mo. USA)로 처리한 후 성숙정도에 따라 난모세포를 분류한 후 중기 II (MII) 시기의 난모세포를 NT를 위해 사용하였다.
1.3 난모세포의 탈핵, 체세포의 핵치환 및 활성화
난모세포의 탈핵은 이전에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며 (Tachibana et al., 2013), 난모세포의 탈핵 및 체세포의 핵치환은 스테이지 워머(stage warmer), 나리시게 마이크로마니퓰레이터(narishige micromanipulator), OosightTM 이미징 시스템 (poloscopic microscopy), 및 레이저를 갖춘 도립현미경(inverted microscope)을 사용하여 수행하였다. 레이저를 갖춘 도립현미경 대신에 피에조를 갖춘 도립현미경이 선택적으로 사용될 수 있다.
상기 난모세포를 사이토카라신 B(5 ㎍/ml) 및 카페인(1.25mM)를 포함한 HTF-Hepes 배지(Global Medium)의 드로플렛(droplet)에 위치시킨 후 상기 드로플렛을 조직배양(tissue culture) 오일로 덮어 37℃ 조건 하에 10 내지 15분 정도 두었다. 카페인은 단백질 인산가수분해효소 저해제로서 이른 활성화(premature activation)를 억제하여 복제배아의 성장을 개선시킴으로써 결과적으로 배반포의 형성율을 증가시킨다. 이후 방추사(spindle)가 2 내지 4시 방향에 가깝게 위치하도록 홀딩 피펫으로 난모세포를 고정시킨 후, 방추사 옆에 있는 투명대(zona pellucida)를 레이저 펄스로 뚫었으며, 뚫린 부분을 통해 주입 피펫을 넣었다. 상기 주입 피펫으로 원형질막(plasma membrane)로 둘러싸인 적은 양의 세포질과 접촉된 방추사를 흡입시켰다. 상기 투명대는 레이저 펄스 대신에 피에조 펄스가 선택적으로 이용될 수 있다.
이후, 공여세포를 마이크로 피펫에 흡입시켜 센다이 바이러스 외피 단백질(HJV-E extract, Isihara Sangyo Kaisha)를 포함하는 작은 드랍(drop)으로 옮겨 놓았다. 그리고는 상기 실시예 1의 핵 공여세포를 제1극체 반대편에 위치한 난황주위 공간(perivitelline space)에 삽입하였다.
이렇게 융합이 확인되면, 제조된 난자는 추가로 Global 10% SPS 배지에 30분 또는 2시간 동안 배양하였다.
활성화(activation)는 0.1 mM 아세트산칼륨, 0.5 mM 아세트산마그네슘, 0.5 mM HEPES, 1mg/ml 지방산이 없는 BSA(fatty-acid-free BSA)를 포함하는 0.25mM 디-소르비톨(d-sorbitol) 버퍼 하에서 전기자극(electrical pulse)(2X 50μs DC pulses, 2.7 kV/cm)을 가하여 수행하였다. 활성화된 세포는 5% CO2, 37℃조건 하에 2 mM DMAP를 포함하는 Global Medium(혈청 제외)에서 4시간 배양하였고, 5% CO2, 5% O2, 90% N2, 37℃ 조건 하에 10% FBS, 12 μM BME(β-mercaptoethanol), CARM(2 μg/ml) 및 10 nM TSA(Trichostatin A)가 보충된 Global Medium에서 12시간 배양하였다. 이후 전핵 형성(pronuclear formation)을 확인하였고, 5% CO2, 5% O2, 90% N2, 37℃ 조건 하에, TSA가 없고 10% FBS 및 12 μM BME이 보충된 Global Medium에서 최대 7일간 배양하였다. 이후 4세포기 시기에 마이크로 인젝션 시스템(micro injection system)을 사용하여 CARM mRNA를 할구에 주입한다. CARM 대신에 선택적으로 HDAC1, SIRT2 또는 KDM4D가 첨가될 수 있다.
1.4 stem cell line의 제조 및 특성 분석
상기 2에서 배양된 배반포를 산성 Tyrode 용액 (pH 2.0)으로 수 초간 처리하여 투명대(ZP)를 제거하였다. ZP의 제거 후, 배아를 Hepes-HTF 배지에서 힘차게(vigorously) 세척하여 미량의 Tyrode 용액까지도 제거하였다. 레이저-보조 배반포 절제 시스템(Hamilton-Thorne Inc.)을 이용하여 내세포괴(ICM)을 분리하고 배반포의 잔여 부분(영양막)을 폐기하여 배반포가 더 이상 온전하지 않다는 것을 확인하였다. 플레이팅 1일 전 준비된 MEF 위에 ICM을 플레이팅하고, 그러나, 복제된 배반포가 구별할 수 없는 ICM을 가질 경우 전체 배아를 플레이팅하였다. hPSC 유도 배지는 혈청 대체물(serum replacement) (5% SR, Invitrogen), FBS (10%, Hyclone), plasmamate (5%), bFGF (32 ng/ml), 및 human LIF (2000 units/mI, Sigma-Aldrich)가 보충된 넉아웃- DMEM를 포함하였다. 동일 배지에서 3일 동안 변화 없이 ICM을 배양한 후, 4일차에 배지의 약 1/3을 교체하였다. 6일차부터 격일로 배지의 1/2을 교체하였다. 플레이팅 후 7일 이내에 최초 성장(outgrowth)이 확인되었다.
ESC형 형상을 갖는 콜로니들을 추가적인 증식을 위해 선택, 특성화 및 세포유전학적 분석을 수행하였다. 그리고, 12일차 이전에 콜로니를 확장하고 동결보존하였다. 세포의 특성분석은 염색체 검사(karyotype, G-banding), DNA 지문검사 및 mitochondrial DNA 유전자형 검사를 시행하였다. 그 결과는 각각 도 3 및 도4에서 보여준다. 세포의 전분화능 줄기세포 마커의 발현을 확인하기 위하여 AP staining 으로 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase)활성을 확인하고 immunocytochemistry 로 Oct4, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81을 분석하였으며, RT-PCR로 Oct4, Nanog, Sox-2 마커의 발현을 분석하였다. 그 결과는 도 5 및 6에서 보여준다. 이들 결과로부터 도출된 세포가 줄기세포임을 확인하였다. 추가로 삼배엽성 (3 germ layers) 유래 세포로 분화할 수 잇는 전분화능을 확인하기위하여, 체외에서 배아체 (EB)를 형성하여 배양 후 Immunochemistry 및 RT-PCR를 통하여 삼배엽 유래 분화 마커의 발현을 확인하였다(도 7(a) 및 (b)). 체내에서 전분화능 확인을 위하여 면역결핍생쥐의 정소 도는 피하에 줄기세포를 주입하여 테라토마(teratoma) 형성을 유도한 후 조직학적으로 H-E 및 special staining을 통하여 분화능을 확인하였다. 결과는 도7 (c)에 나타내었다.
1.5 NT-hPSC의 동결보존 및 뱅킹
상기 3에서 제조된 세포를 동형접합성 세포에 따라 분류되어 보관되고 문서 또는 프로그램에 기록되도록 하는 것이다. 특히 세포 공여체의 정보가 같이 저장되도록 한다. 추후 동종(autologous) 또는 이종(allogenic) 수여자(환자)에 직접적으로 이용될 수 있거나 또는 분화된 세포로 이용될 수 있도록 저장된다.
1.6 NT-hPSC로부터 기능성 망막색소상피세포 (RPE)로의 분화
RPE로의 분화를 유도하기 위하여 미분화상태의 NT-hPSC를 해부현미경 하에서 멸균된 팁을 사용하여 기계적으로 여러 조각(clump-form of NT-ES cells; 한 조각은 약 300~600개의 미분화상태의 배아줄기세포주)으로 자른다. Clump 형태의 NT-hPSC는 low attachment 6-well plates (Corning, CA, USA)에 담아 배아체 배양액 (EBDM; knockoutTM DMEM (Thermo Scientific, CA, USA) supplemented with 15% (v/v) knockoutTM serum replacement (Thermo), 1% (v/v) glutamax (Thermo), 1% (v/v) NEAA (Thermo), 1% (v/v) penicillin-streptomycin (Thermo) and 0.1mM β-mercaptoethanol (Thermo)) 에서 부유상태로 4일간 배양한다. 배양된 배아체는 배양접시에 옮겨져 부착된 상태로 RPE 분화를 유도한다.
1.7 NT-hPSC로부터 분화된 망막색소상피세포의 분리
배아체는 0.1% 젤라틴 코팅이 된 6-well 배양접시에 옮겨 부착이 되도록 3일간 배양기안에 정치시킨 후 2~3일 간격으로 EBDM 배양액을 교체해주면서 배아체에서 뻗어나와서 자라는 세포들 중에서 망막색소상피세포가 나타날 때까지 약 50~55일간 배양하였다. 색소침착으로 색깔이 구분되는 RPE cell 들을 분리하기 위하여, 세포들은 생리식염수 (DPBS containing Ca2 +Mg2 + (Thermo))로 2회 세척 후 콜라게나아제 타입4가 포함된 생리식염수 (Type IV collagenase (Thermo) in DPBS with Ca2+Mg2+ (Thermo))로 교체하여 2시간 동안 37 ℃, 5% CO2 가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 효소를 제거하기 위하여, 배양접시에서 떨어져 나온 세포 덩어리들 (detached cell clusters)을 50ml 튜브에 모아 원심분리기(1500 rpm, 5분)를 이용하여 DMEM-FBS 배양액으로 2회 세척하였다. 세포 덩어리들은 60mm 페트리접시에 옮긴 후, 해부현미경 하에서 가늘게 뽑은 유리 피펫을 이용하여 망막색소상피세포 덩어리들(pigmented cell clusters)을 색소가 침착되지 않은 다른 세포덩어리들과 구분하여 수집하였다.
1.8 NT-hPSC로부터 분화된 망막색소상피세포의 성숙 및 증식
망막색소상피세포 덩어리들(pigmented cell clusters)은 단일세포로 분리하여 배양하기 위하여 칼슘과 마그네슘이 제거된 생리식염수 (DPBS without Ca2 +Mg2 + (Thermo))로 2회 세척 후 분리효소액 (1 : 1 mixture of 0.25% Trypsin-EDTA (Thermo) and Cell Dissociation Buffer (Thermo))을 처리하여 분리하였다. 단일세포로 분리된 망막색소상피세포는 원심분리기(1500 rpm, 5분)를 이용하여 DMEM-FBS 배양액으로 세척 한 후, EGM2 배양액(Lonza, PA, USA)으로 세포들을 풀어 200,000 세포/4well 배양접시 1개 well 의 농도로 0.1% 젤라틴 코팅된 4well 배양접시에 넣어 꽉 찰 때까지 EGM-2배양액에서 배양하였다. 약 3~4일 후 배양접시에 세포들이 차면 망막색소상피세포의 형태와 특성 (cobble stone morphology and pigmentation)을 보이도록 RPE 분화배양액 (RGMM; 1:1 mixture of EBDM and DMEM-FBS media)으로 배양액을 교체하여 7일간 배양하였다.
NT-hPSC로부터 분화된 망막색소상피세포들은 위와 동일한 분리효소액을 이용하여 계대 배양을 하고, EGM2 배양액을 이용한 증식과정과 RGMM 배양액을 이용한 숙성과정을 거쳐 기능성 망막색소상피세포들을 확보하였다. 2계대와 3계대에서 얻어진 망막색소상피세포 일부는 동결액 (90% (v/v) FBS (Thermo) and 10% (v/v) DMSO (Sigma))을 이용하여 2 million cells/mL/cryo vial 의 농도로 동결하여 사용시까지 보관하고 일부는 망막색소상피세포 특성분석을 수행하였다. 도 8은 배아줄기세포 유래 RPE세포와 상기 실시예 3에서 제조된 NT-hPSC 유래의 RPE세포의 형태와 분화마커에 차이가 없음을 보여주는 것이다(도 8의 (a), (b)).
실시예 2. 반수성체-유래 다능성 줄기세포(pn-hPSC)의 제조
2.1 단위 생식 Ⅰ: 이형접합 pn-hPSC의 생성
난모세포 활성화를 위한 통상적인 방법은 정자가 들어감으로써 정상적으로 유발되는 칼슘-변경 효과를 모방하는 것이다. 일례로, 이형접합 HLA pn-hPSC 세포주가 난모세포 활성화를 위한 이오노마이신의 적용 및 뒤이은 푸로마이신 유사체 6-DMAP (6-aimtheylamino-purine)의 첨가에 의해 생성될 수 있고, 이는 가역적으로 히스톤 H1 키나아제의 활성화를 억제함으로써 자발적인 난핵포 붕괴를 방지한다.
이오노마이신 및 6-DMAP의 순차적인 첨가가 우선 칼슘 흐름을 개시하여, 단백질 인산화의 억제를 유도하고, 이 과정은 감수분열의 완료없이 전핵 형성을 유도한다. 기타 접근법은 난모세포의 전기적 활성화 및 뒤이은 ionomycin, 및 6-DMAP의 첨가에 의존한다. 그러나, 이들 기법에 공통적인 전핵 형성을 위해 6-DMAP의 첨가는 제2 극체의 방출을 방지하고 2배체 세포의 생성을 유도한다. 이것은 정상적으로는 초기 배발생동안 키아스마타의 형성(부계 및 모계 게놈 재조합)으로 인한 동형접합 hPSC 세포주의 생성을 가능하게 하지 않는다. 따라서, 첫 감수분열 이후, 남아있는 난모세포 핵은 모계 및 부계의 게놈을 모두 소유한 이형접합성이다.
보다 구체적으로, 이형접합 pn-hPSC 세포주의 생성을 위한 난모세포의 단위생식은 하기 과정을 통해 수득될 수 있다:
A) 난모세포의 회수(Retrieval) 및 준비
1. 난구-난모세포 복합체 (COC)를 히알루로니다제(100 IU/ml, Sigma, St. Louis, Mo. USA)로 2분간 처리하고 작은 구경 마이크로피펫 (직경 150 um)으로 벗긴다. 배주(germinal vesicle: GV)를 갖거나 제1 극체가 없는 벗겨진 난모세포는 사용되지 않는다. 단일의 제1 극체를 갖는 벗겨진 난모세포를 중기 II(MII) 난모세포로 분류한다.
대안적으로, COC를 SynVitro Hyadase로 처리하여 난구세포를 제거할 수 있고, 그 후 파라핀 오버레이(Paraffin overlay)를 갖는 IVF 배지로 30분 동안 인큐베이션을 수행한다
B) 난모세포의 활성화
1. 활성화 배지에서 MII 난모세포를 5분간 37 ℃에서 처리(5 uM ionomycin)하고 난할 배지에서 완전히 세척한다.
2. 4시간 동안 활성화 후 배지(5 nM 트리코스타틴 A (TSA) 함유 난할 배지 중 1-2 mM 6-DMAP)에서 난자를 재-처리한다.
3. 6-DMAP 불포함 배지에서 활성화된 난자를 세척하고 정상 배양 배지로 이동시키기 전 6시간 동안 5 nM TSA를 함유하는 난할 배지에서 인큐베이션한다.
4. SAGE 난할 배지에서 처음 2일간 활성화된 난자를 배양한 후 뒤이은 3일간 SAGE 배반포 배지에서 배양한다.
대안적으로, 5분 동안 5 uM 이오노마이신 및 4시간 동안 1-2 mM 6-DMAP에의 연속 노출, 조심스러운 세척 및 파라핀 오버레이를 갖는 신선한 IVF 배지에서의 배양 후, 파라핀 오버레이를 갖는 IVF 배지에서 활성화를 수행할 수 있고, 뒤이어 다음날 난할 배지에서 배양을 수행할 수 있다.
2.2 단위 생식 Ⅱ: 동형접합 pn-hPSC의 생성
대조적으로, HLA 동형접합 hPSC 세포주의 생성을 위한 직접적인 접근법은 한 개의 전핵 난모세포(onepronuclear oocyte)를 포함하는 HLA 동형접합 난모세포 공여자로부터 그와 같은 세포주를 생성시키는 것이다. 그러나, 이 접근법의 중요한 불리한 점은 집단에서 동형접합 공여자가 상대적으로 드물게 존재한다는 것이다. 대안적으로, HLA 동형접합 hPSC 세포주가 제2 극체 방출(2PBE)을 위해 6-DMAP 첨가를 제외하는 방법에 의해 이형접합 공여자로부터 수득될 수 있다.
활성자, 예를 들면 Ca2 + 이온운반체, A23817 또는 이오노마이신의 최초 첨가 및, 추후 사이토칼라신 B 가 없는 푸로마이신 또는 사이클로헥사마이드의 첨가에 의존하는 이 접근법은 제2 극체의 방출을 가능하게 하여, 중기 II 염색체 세트의 절반만을 갖는 반수성 개체(haploid parthenote)를 제공한다. 이 반수성 개체는 동형접합 유전자형의 형성을 위해 추가로 2배체 배반포로 배양될 수 있다.
보다 구체적으로, 동형접합 pn-hPSC 세포주의 생성을 위한 난모세포의 단위생식이 하기 과정을 통해 수득될 수 있다:
A) 난모세포의 회수 및 준비, 상기와 같음.
B) 난모세포의 활성화
1. 활성화 배지에서 MII 난모세포를 5분간 37 ℃에서 처리하고(5 uM A23187) 난할 배지에서 완전히 세척한다.
2. 4시간 동안 포스트-활성화 배지(10 ug/mL 푸로마이신 난할 배지 또는 사이토칼라신 B가 없는 사이클로헥사마이드)에서 난자를 재-처리한다.
3. 활성화된 난자를 세척하고 난할 배지에서 24시간 동안 또는 2세포 단계의 배아로 발달할때까지 인큐베이션한다. 그 후 2개의 할구를 만니톨 또는 소비톨 기반 융합 배지에서 전기 융합 기기 (BTX 2000, Harvard Electric)를 이용하여 20 마이크로초 동안 160 mV의 전기를 적용함으로써 전기융합시킨다(electrofuse). 선택적으로, 단일 펄스가 적용될 수 있고, 이는 할구를 융합시키는데 충분한 것으로 나타났다. 융합된 난자를 추가 1일 동안 SAGE 난할 배지에서 배양하고 뒤이은 3일간 SAGE 배반포 배지에서 배양한다.
2.3. pn-hPSC의 생성
반수성체 (단위생식을 통함)의 생성 다음, 후속 배양은 주변의 영양외배엽(trophectodermal) 조직의 분리를 통해 hPSC가 내세포괴로부터 수득될 수 있는 것으로부터 배반포 형성으로 이어진다.
1. 배양된 배반포를 프로나제 (0.5%, Sigma-Aldrich) 또는 산성 타이로드 용액 (pH 2.0)으로 수초 동안 처리하여, 투명대 (ZP)를 제거한다. ZP 제거 후, Hepes-HTF 배지에서 배아를 힘차게 세척하여 프로나제 또는 타이로드 용액의 흔적을 제거한다.
2. 레이저-보조된 배반포 절제 시스템 (Hamilton-Thorne Inc.)을 이용하여 내세포괴 (ICM)를 분리한다. 배반포의 잔류 부분 (영양막)을 폐기하여 배반포가 더 이상 온전하지 않다는 것을 확실하게 한다.
3. 플레이팅 하루 전에 제조된 MEF의 위에 ICM을 플레이팅한다. hPSC 유도 배지는 혈청 대체물 (10% SR.Invitrogen), FBS (5% Hyclone), 플라즈마네이트(plasmamate) (5%), bFGF (32 ng/ml), 및 인간 LIF (2000 units/ml, Sigma-Aldrich)이 보충된 녹아웃-DMEM으로 구성된다.
4. 임의의 변화 없이 동일한 배지에서 3일 동안 ICM을 배양한다.
5. 4일 차에 배지의 약 1/3을 교체한다.
6. 6일 차부터 격일로 배지의 1/2을 교체한다.
7. 초기 결과물은 플레이팅 후 7일 안에 보인다.
8. 12일 전에 콜로니를 확장하고 동결보존한다.
실시예 3. 인간 다능성 줄기세포( hPSC ) 로부터 중간엽 줄기세포( MSC ) 로의 제조
3.1 EB 형성
인간배아줄기세포(hESC)주로서 H9 및 CHA-hES 15 세포들과 NT-hPSC주로서 CHA-hES NT4, CHA-hES NT5 및 CHA-hES NT8 세포들을 준비하였다. 구체적으로 7.5X104 cells/well (0.1% gelatin coated dish, 4well) 농도로 미리 준비된 MEF 배양보조세포 위에서 콜로니 형태로 공배양하였다.
EB 형성을 위하여, 상기 hESC 및 NT-hPSC 콜로니를 해부현미경 하에서 멸균된 팁을 사용하여 기계적으로 여러 군(2~4의 clump form)으로 분리하였으며, 20% KSR(knockout-serum replacement, Invitrogen)이 첨가된 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지의 60mm 페트리 접시 위에서 5일간 배양하였다.
3.2 MSC 제조
EB가 형성된 후, 20%KSR+DMEM/F12 배지(EB 배양액: hESC 배양액에서 bFGF만 제외한 배양액)에서 하루 배양한 후, 상기 EB 배양액에 1uM TGF-Beta inhibitor (SB431542)를 첨가하여 2주간(13일간) 배양하였으며, 배지는 이틀에 한번 교체해주었다.
이후 1웰(well)당 EB가 5 내지 7개의 밀도가 되도록 0.1% 젤라틴 (30min, air dry)으로 코팅된 6웰 플레이트로 옮겼으며, 10% FBS 및 1% P/S(penicillin-streptomycin, Invitrogen)가 첨가된 DMEM(low glucose; 5.5mM D-glucose (1g/L))에서 16일간 배양하였다. 배양 48시간 후, EB의 부착 및 EB로부터 뻗어 나오는 세포들을 확인하였으며, 배지는 일주일에 두 번 교체해주었다. 16일 후, EB에서 뻗어 나와 자란 세포들은 TrypLE solution (Invitrogen; 500 ul TrypLE per 1well, 2min incubation)으로 분리하며 0.1% 젤라틴이 코팅된 75T 플라스크로 옮겨 10% FBS 및 1% P/S가 첨가된 DMEM (low glucose; 5.5mM D-glucose (1g/L))에서 배양하였다.
다음 날, 10% FBS 및 1% P/S가 첨가된 DMEM(low glucose; 5.5mM D-glucose (1g/L))에서 MSC 증식 배지인 10% FBS, 1% P/S, 1% NEAA (nonessential amino acids, Invitrogen) 및 0.1% β-mercaptoethanol (Invitrogen)이 첨가된 DMEM (high glucose)로 교체하여 배양하여 MSC를 제조하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, MSC는 가늘고 긴(elongated) 방추사(spindled-shaped)의 형태를 보였다.
80% 컨플루언스(confluence)에 도달할 때 마다 0.05% Trysin-EDTA (1.5 ml per 75T flask, 2min incubation)을 이용하여 계대 배양하였으며, MSC를 보관하기 위하여 동결액(30% MSC 증식 배지+60% FBS(Thermo)+ 10% DMSO(Sigma))을 이용하여 동결 보존하였다.
3.3 단일 세포 유래 MSC 제조
단일 세포 유래 MSC를 제조하기 위해서, 상기 실시예 3.1의 CHA-hES 15 세포를 상기 실시예 3.2의 방법으로 MSC로 분화시킨 후, 초기 계대에 해당하는 p5 내지 p7의 MSC를 사용하였다. 먼저, 0.1% 젤라틴이 표면에 코팅된 96-웰 플레이트에 MSC 증식 배지인 10% FBS, 1% P/S, 1% NEAA (nonessential amino acids, Invitrogen) 및 0.1% β-mercaptoethanol (Invitrogen)이 첨가된 DMEM (high glucose)에 4 ng/ml hrbFGF을 첨가하여 전처리(pre-warming)하였다. 실시예 3.2에 기재된 바와 같이, 75T에 배양중인 세포들을 계대 배양 하듯이 0.05% Trysin-EDTA(1.5ml per 75T, 2min incubation)를 이용하여 세포들을 수확한 후 배양액에 희석하여 60mm 디쉬에 담았다. 이후에, 해부현미경 하에서 가늘게 뽑은 유리 피펫(glass pipette)을 사용하여 상기에서 준비한 96-웰 플레이트에 웰 당 1개의 세포를 분주하였다. 도립 위상차 현미경 하에서 웰당 1개씩 세포가 들어갔는지 확인 후 배양을 시작하였고, 세포가 콜로니를 형성할 때까지 배양하였다. 아래 표 6은 CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES15-MPC)를 상기와 같이 96 웰에 단일 세포로 분주하였을 때, 정확하게 단일 세포로 분주된 웰의 수(분주 효율), 및 이들 중 세포 분열을 하여 증식한 웰의 수(배가 효율)를 나타낸다.
Cell line (passage) 분주 효율 배가 효율
CHA-hES15-MPC (p5) 68/96(71%) 23/68(34%)
이후에, 세포가 웰을 채울 정도로 자란 후, 0.05% Trysin-EDTA (20ul per 1well, 2min incubation)를 이용하여 계대배양하였으며, 세포의 양에 따라 4웰, 6웰, 또는 12웰에 배양 디쉬에 배양한 후 75T에 배양하여 단일 세포 유래 MSC를 제조하였다.
실시예 4. MSC의 특성 분석
4.1 증식능 평가
hESC로부터 유래된 MSC, NT-hPSC로부터 유래된 MSC 및 hBM-MSC의 증식능(Proliferation potential)을 알아보기 위하여 성장 속도를 시간에 따라 모니터 하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11의 (a)는 CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC) 및 CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC)의 배가시간(doubling time)을 나타낸 것이며, (b)는 계대별 CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC), CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC) 및 hBM-MSC의 누계 세포 수(cumulative cell numbers)를 나타낸 것이고, (c)는 CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC), CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC) 및 hBM-MSC의 누계 배가 수(cumulative doubling numbers)를 나타낸 것이다 (Bar: mean±SE, n=3, triplicate).
도 11에 나타난 바와 같이, hESC로부터 유래된 MSC와 NT-hPSC로부터 유래된 MSC가 hBM-MSC와 비교하여 더 우수한 증식능을 보이는 것을 확인하였다.
4.2 표면 마커 분석
hESC로부터 유래된 MSC (passage 5) 및 NT-hPSC로부터 유래된 MSC (passage 6)를 유세포 분석(flow cytometry)을 이용하여 표면 마커를 분석하였고, 그 일례로서 CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC) 및 CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC)의 마커 분석 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC) 및 CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC)는 MSC 관련한 마커인 CD29, CD44, CD90과 CD105에 양성(positive)이며 ESC 마커인 TRA1-60과 SSEA4 및 조혈모 세포(hematopoietic cell) 마커인 CD34과 CD45에 음성(negative)인 것을 확인하였다.
4.3 분화능 분석
지방생성(adipogenesis), 골형성(osteogenesis) 및 연골발생(chondrogenesis)의 분화능을 분석하기 위하여, hESC로부터 유래된 MSC, NT-hPSC로부터 유래된 MSC 및 hBM-MSC를 각각 지방생성 배양 배지(StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit(GIB-A10070-01)), 골형성 배양 배지(StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit(GIB-A10071-01)) 및 연골발생 배양 배지(StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit(GIB-A10072-01))에 3 내지 4주간 배양하여 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC), CHA-NT4 유래 MSC(CHA-NT4-MPC) 및 hBM-MSC는 지방생성(adipogenesis), 골형성(osteogenesis) 및 연골발생(chondrogenesis)의 분화능을 가짐을 확인하였다.
분화 전 MSC와 분화된 세포의 유전자 발현을 RT-PCR 기법을 통하여 분석하였으며, 골형성 마커(COL1, Runx2), 지방생성 마커 (PPARγ, C/EBPα) 및 연골발생 마커(COMP, Sox9)의 발현을 측정하였고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
실시예 5. 단일 세포 유래 MSC의 특성 분석
5.1 증식능 평가
상기 실시예 3.3에서 제조한 hESC로부터 유래된, 단일세포 유래 MSC(CHA-hES15(single-derived)-MPC)의 성장 속도를 시간에 따라 모니터 하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15의 (a)는 CHA-hES 15 단일세포 유래 MSC(CHA-hES15(single-derived)-MPC), CHA-hES 15 유래 MSC(CHA-hES 15 MPC) 및 hBM-MSC의 누계 세포 수(cumulative cell numbers)를 나타낸 것이며, (b)는 상기 세포들의 계대별 누계 배가 수(cumulative doubling numbers)를 나타낸 것이다.
도 15에 나타낸 바와 같이, hESC로부터 유래된, 단일세포 유래 MSC는, hESC로부터 유래된 MSC와 유사한 증식능을 보이면서, hBM-MSC와 비교하여 더 우수한 증식능을 보이는 것을 확인하였다.
5.2 표면 마커 분석
상기 실시예 3.3에서 제조한 hESC로부터 유래된, 단일세포 유래 MSC(CHA-hES15(single-derived)-MPC)를 유세포 분석(flow cytometry)을 이용하여 표면 마커를 분석하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, hESC로부터 유래된, 단일세포 유래 MSC(CHA-hES15(single-derived)-MPC)는 MSC 관련한 마커인 CD29, CD44, CD90과 CD105에 양성(positive)이며 ESC 마커인 TRA1-60과 SSEA4 및 조혈모 세포(hematopoietic cell) 마커인 CD34과 CD45에 음성(negative)인 것을 확인하였다.
hESC로부터 유래된, 단일세포 유래 MSC는 균질한 세포 집단(homogeneous population)으로서, 세포 집단 내의 일부 전분화능 및 증식력을 가진 배아줄기세포들이 거의 없어 이들이 다른 종류의 세포로 분화하거나 기형종 등을 유발하는 안전성의 측면에서 장점을 갖는다.
이상의 결과로, hESC로부터 유래된, 단일세포 유래 MSC는 hESC로부터 유래된 MSC와 세포 증식능 및 표면 마커의 측면에서 실질적으로 동일하면서, 상기의 장점을 갖는 균질한 세포 집단으로서, 실제 임상 적용에 있어서 활용 가능성이 큰 세포임을 알 수 있다.

Claims (63)

  1. a) 인간 다능성 줄기세포(hPSC)를 생성시키는 단계;
    b) 상기 인간 다능성 줄기세포를 1일 내지 14일간 배양하여 배아체(EB)로 형성시키는 단계; 및
    c) 상기 배아체를 배양하여 중간엽 줄기세포(MSC)로 제조하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 제조방법으로서,
    상기 c) 단계는 bFGF가 제외된 배지에서 EB를 배양한 후 TGF-β 저해제를 첨가하여 10일 내지 18일간 배양하는 단계; 고포도당 조건인 25mM의 농도의 포도당보다 낮은 저포도당 조건에서 상기 EB를 12일 내지 20일간 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 다능성 줄기세포는 핵 이식 다능성 줄기세포(NT-hPSC), 반수성체-유래 다능성 줄기세포(pn-hPSC), 역분화 만능 줄기세포(iPSC), 또는 배아줄기세포(ESC)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 동형접합 세포로부터 핵을 분리하여 핵 이식 인간 다능성 줄기세포(NT-hPSC)를 생성시키는 단계이며,
    a) 단계 전에 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 스크리닝은 HLA(human leukocyte antigen)-A, HLA-B, HLA-DR의 유전자가 동형접합인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 핵 이식 인간 다능성 줄기세포(NT-hPSC)를 생성시키는 단계이며,
    상기 a)단계는, 난모세포의 핵을 제거하는 단계;
    하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계;
    포스트-활성화 배지에서 인큐베이션하여 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계;
    상기 활성화된 NT 난모세포로부터 배반포를 생성하는 단계; 및
    배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 ICM 세포는 NT-hPSC 세포로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 단백질 인산가수분해효소 저해제(protein phosphatase inhibitor)을 포함하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단백질 인산가수분해효소 저해제는 카페인인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계는 직접 주입을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계는 체세포 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵은 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)와 접촉된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자는 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질 및 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자는 siRNA(small interfering RNA), 저분자, 단백질, 펩티드 또는 항체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자는 Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 Lin2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계는 센다이바이러스, 그의 단백질 또는 추출물을 포함하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포는 체세포 또는 생식세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제5항에 있어서, 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계에서의 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 퓨로마이신(puromycin), 에탄올(ethanol), CHX(cycloheximide), TSA(trichostatin A), 및 CB(cytochalasin B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제5항에 있어서, 상기 NT 난모세포는 후생학적 조절인자의 존재 하에서 배양된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자는 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질 및 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자는 siRNA(small interfering RNA), 저분자, 단백질, 펩티드 또는 항체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  20. 제5항에 있어서, 상기 a) 단계는 자외선의 부재 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  21. 제5항에 있어서, 상기 a) 단계는 난모세포로 정자 인자(sperm factors)를 주입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포(pn-hPSC)를 생성시키는 단계이며,
    상기 a) 단계는,
    전기적 및/또는 화학적 자극을 가하여 난모세포를 활성화하는 단계;
    포스트-활성화 배지에서 상기 활성화된 난모세포를 인큐베이션하여 반수성체를 생성하는 단계;
    배양 배지에서 상기 반수성체를 인큐베이션하여 배반포를 형성하는 단계; 및
    상기 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 내세포괴 세포는 pn-hPSC로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 난모세포를 활성화하는 단계에서의 화학적 자극은활성화 배지에서 인큐베이션하는 것이며, 상기 활성화 배지는 칼슘 이온운반체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 칼슘 이온운반체는 이오노마이신, A23187, 부베리신(beauvericin), X-537A, 및 아베나시올리드(avenaciolide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 반수성체를 생성하는 단계에서의 포스트-활성화 배지는 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계에서의 활성화 배지는 6-DMAP, 퓨로마이신(puromycin), 에탄올(ethanol), CHX(cycloheximide), TSA(trichostatin A), 및 CB(cytochalasin B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 반수성체를 생성하는 단계에서의 포스트-활성화 배지는 제2극체 방출을 막지 않는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  27. 제22항에 있어서, 상기 난모세포는 중기 II (MII) 단계 난모세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  28. 제22항에 있어서, 상기 난모세포는 중기 I (MI) 단계 난모세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  29. 제22항에 있어서, 상기 난모세포는 단일 전핵(pronuclear) 난모세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  30. 제22항에 있어서, 상기 pn-hPSC는 이형접합(heterozygous)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  31. 제22항에 있어서, 상기 pn-hPSC는 동형접합(homozygous)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  32. 제22항에 있어서, 상기 pn-hPSC는 집단의 1% 이상과 면역적합성 인간 백혈구 항원 (HLA) 일배체형(haplotype)을 갖는 다능성 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 HLA 일배체형은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  34. 제22항에 있어서, 상기 a)단계는 난모세포로 정자 인자를 주입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  35. 제22항에 있어서, 상기 난모세포는 CARM 1 및/또는 Esrrb의 존재 하에서 인큐베이션되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  36. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는 hPSC를 현탁 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  37. 삭제
  38. 제36항에 있어서, 상기 b) 단계는 hPSC를 넉아웃 혈청 대체제(KSR, knockout-serum replacement)가 첨가된 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지에서 배양하여 EB로 형성시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 b) 단계는 hPSC를 2개 이상의 군(clump)으로 분리한 후 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 제1항에 있어서, 상기 저포도당 조건의 배지에서 EB를 부착 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  44. 제1항에 있어서, 상기 c)단계는,
    EB를 TGF-β 저해제 및 KSR이 보충된 DMEM/F12 배지에서 배양하는 단계; 및
    혈청 및 항생제가 첨가된 저포도당 조건의 DMEM/F12 배지에서 상기 EB를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  45. 제1항에 있어서, 상기 c)단계는,
    TGF-β 저해제가 첨가된 배지 및/또는 저포도당 조건의 배지에서 상기 EB를 배양하는 단계; 및
    상기 배지에서 배양된 EB의 결과물(outgrowth)을 MSC 증식 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  46. 제1항에 있어서, 상기 c)단계는,
    EB를 TGF-β 저해제가 첨가된 배지에서 배양하는 단계;
    저포도당 조건의 배지에서 상기 EB를 배양하는 단계; 및
    상기 배지에서 배양된 EB의 결과물을 MSC 증식 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 MSC 증식 배지는 혈청, 항생제, 비필수 아미노산(NEAA) 및 β-머갑토에탄올(mercaptoethanol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 첨가된 DMEM 배지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  48. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 EB의 결과물을 단일 세포로 분리하여 부착 배양 한 후 MSC 증식 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  49. 제1항에 있어서, 상기 MSC의 80% 이상이 마커 CD29, CD44 및 CD90에 대하여 양성이며, 20% 이상이 마커 CD105에 대하여 양성인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  50. 제1항에 있어서, 상기 MSC의 80% 이상이 마커 CD29, CD44, CD90 및 CD105에 대하여 양성인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  51. 제1항에 있어서, 상기 MSC의 5% 미만이 마커 TRA1-60, SSEA4, CD34 및 CD45에 대하여 음성인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  52. 제1항에 있어서, 상기 MSC의 3% 미만이 마커 TRA1-60, SSEA4, CD34 및 CD45에 대하여 음성인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  53. 제1항에 있어서, 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 5회의 계대(passage)를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  54. 제1항에 있어서, 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 10회의 계대를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  55. 제1항에 있어서, 상기 MSC는 세포 배양에서 적어도 15회의 계대를 진행할 수 있는 복제능을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  56. 제1항에 있어서, 상기 MSC의 배가시간(doubling time)은 35 내지 48시간인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  57. 제1항에 있어서, 상기 MSC의 배가시간은 41 내지 45시간인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  58. 제1항에 있어서, 상기 MSC는 조혈모세포, 근육세포, 심근세포, 간 세포, 연골세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 분화능을 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 제1항에 있어서, d) 상기 제조된 중간엽 줄기세포(MSC)로부터 단일 세포를 분리하는 단계; 및 e) 상기 분리된 단일 세포를 배양하여 단일세포 유래 MSC를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 d) 단계의 중간엽 줄기세포는 P(Passage) 1 내지 P9의 세포인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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