KR102149010B1 - 체세포 핵 이식을 이용하는 단위생식 줄기세포 및 환자-특이적 인간 배아줄기세포의 제조 - Google Patents

체세포 핵 이식을 이용하는 단위생식 줄기세포 및 환자-특이적 인간 배아줄기세포의 제조 Download PDF

Info

Publication number
KR102149010B1
KR102149010B1 KR1020197018230A KR20197018230A KR102149010B1 KR 102149010 B1 KR102149010 B1 KR 102149010B1 KR 1020197018230 A KR1020197018230 A KR 1020197018230A KR 20197018230 A KR20197018230 A KR 20197018230A KR 102149010 B1 KR102149010 B1 KR 102149010B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oocyte
oocytes
cells
medium
hpsc
Prior art date
Application number
KR1020197018230A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190076074A (ko
Inventor
정영기
이동율
Original Assignee
의료법인 성광의료재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 의료법인 성광의료재단 filed Critical 의료법인 성광의료재단
Publication of KR20190076074A publication Critical patent/KR20190076074A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102149010B1 publication Critical patent/KR102149010B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/04—Cells produced using nuclear transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/10—Conditioning of cells for in vitro fecondation or nuclear transfer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

상이한 환자 집단과 적합성인 세포 또는 환자 특이적 세포를 포함하는 것인 면역적합성 다능성 줄기 세포(pSCs)는 재생 의학 치료법에서의 광범위한 적용을 발견한다. 여기서 기재된 것은 감소된 접합성의 바람직한 일배체형을 보유하는 세포, 복수의 환자 그룹에 항원적 적합성, 또는 환자-특이적 세포의 생성을 가능하게 하는 핵 이식을 야기하는 단위 생식과 같은 기법을 사용하여 생성된 면역적합성 pSCs이다. 여기서 기재된 방법은 단위생식, 핵 이식 또는 pSC 세포주 생성에 관한 것이다. 또한 여기서 기재된 것은 상기 언급된 기법에 의해 생성된 면역 적합성 pSCs 및 세포주의 조성물이다.

Description

체세포 핵 이식을 이용하는 단위생식 줄기세포 및 환자-특이적 인간 배아줄기세포의 제조{Production of parthenogenetic stem cells and patient-specific human embryonic stem cells using somatic cell nuclear transfer }
다른 출원의 상호 참조
본 출원은 U.S. 2013년 2월 15일에 각각 출원된 미국 가출원 제 61/765,548호, 및 제 61/765,563호에 대한 35 U.S.C.§119(e)조의 우선권을 포함한다.
본 발명은 환자-특이적 pSCs를 포함하는, 면역적합성 다능성 줄기세포(pSCs)에 관한 것이다. 단위생식 또는 핵 이식에 관한 본 명세서에 기재된 방법 및 이 기법에 의해 생성된 면역적합성 pSCs의 조성물은 재생 의학 치료법에서 광범위한 적용을 발견한다.
인간 다능성 줄기 세포 (human pluripotent stem cell: hPSC)는 사실상 체 내에서 모든 체세포 유형으로 분화할 수 있는 놀라운 능력 (다능성)을 소유하면서, 미분화 상태에서 증식 능력을 유지한다(자기-재생). hPSC의 이러한 고유한 특징들은 당뇨, 골관절염, 및 파킨슨병부터 많은 다른 질병에 이르는 질환 및 상태의 치료를 위해 이식가능한 세포 및 조직 재료를 생성할 기회를 제공한다. 수많은 인간 손상 및 질환은 단일 세포 종류의 결함을 포함하는, 세포적 결함이 원인이기 때문에, 적절한 줄기세포, 전구세포(progenitor cell), 또는 인비트로에서 분화된 세포로의 대체는 임상에서 신규 치료적 접근법으로 이어질 수 있다. 또한, 간 공여체, 사체 또는 태아 공급원이 이식 재료의 공급원으로서 역할을 해왔지만, 다능성 줄기 세포의 자기-재생능은 거의 제한 없는 이식 재료의 자원을 추가적으로 제공한다. 추가적 이점은 hPSCs 환자-특이적 방식으로 생성될 수 있으며, 그로 인해 면역거부반응 및 면역관용의 위험을 감소시키는 치료적 접근법으로 이어진다는 것이다. 따라서, 면역적합성 hPSC 및 환자-특이적 hPSC를 포함하는, 재생 세포 이식에 대해 상당히 열광적이다.
면역적합성 hPSC의 생성을 위한 일 전략은 hPSC 분리를 위한 배반포를 생성하기 위해 난모세포로부터 단위생식 (즉, 무성 생식)을 촉진하는 것이다. 간략하게, 이 접근법은 이배체 (2 산모 유전체) 반수성체(parthenote)를 초래하는, 정자 수정의 부재에서 감수분열 및 유사분열 과정을 겪도록 난모세포를 인공적으로 유도하는 것에 의존하며, 이는 hPSCs가 분리될 수 있는 배반포로 추가적으로 배양될 수 있다. 단위생식 접근법을 이용하여, 분리된 hPSC는 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포 (pn-hPSC)로 알려져 있다.
대안적 접근법은 체세포 핵 이식 (SCNT)을 통한 환자-특이적 hPSC의 생성을 가능하게 한다. 체세포 핵 이식은 공여자 환자의 체세포의 핵의 분리 및 탈핵된 수용자 난모세포로의 삽입을 포함한다. 수용자 난모세포의 세포질로 공여체 핵의 이식은 체세포 유전자의 침묵(silencing) 및 배아 유전자의 활성화를 통해 이식된 공여체 핵의 리프로그래밍을 초래한다. 재구축된 난모세포로부터, hPSC를 내세포괴 (inner cell mass: ICM)로부터 분리하기 위해 배양물 중 배반포를 확립할 수 있다. 핵 이식 hPSC (NT-hPSC)의 결과는 환자의 핵 유전적 물질을 보유하기 때문에, 이것은 환자-특이적이다. 두 기법과 관련된 기술적 절차에서 유의한 공통부분이 있다. 예를 들면, NT-hPSC 세포주를 얻기 위한 초기 시도는 pn-hPSC 세포주 생성의 우발적이고 최초로 알려진 사례를 야기하였다.
단위생식 및 SCNT 기법의 유망한 발전에도 불구하고, 현재, 실질적 임상적 적용을 불가능하게 하는 상당한 한계가 있다. 예를 들면, 기존의 단위생식 연구는 공여체 난모세포의 약 50%에서 성공적인 난모세포 활성화를 보고하였으나, 중요 한계는 배반포 형성의 유도인 것으로 여겨지며, 이는 활성화된 난모세포의 15% 이하까지 내려갈 수 있다. 종래 기법을 이용하는, 핵 이식과 관련된 바와 같이, 단지 재구축된 난모세포의 2% 이하만이 배반포 형성을 향한 8-세포 임계(threshold)를 넘는다. 동시에, 이들 한계는 공여체 난모세포의 10% 미만이 pn-hPSC로 성공적으로 배양될 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 후속 pn-hPSC는 이수성 또는 핵형 불안정과 같은 원하지 않는 속성으로부터 어려움을 겪을 수 있다.
일관되고 재생가능한 난모세포 활성화 및 배반포 형성을 허용하는 정확한 작용기전이 현재 불명확하기 때문에, 현재 pSC 세포주의 생성을 제한하는 장애물은 이 과정의 보다 나은 이해에 의해 분명히 도움을 받을 수 있다.
예를 들면, 단위생식에서 감수분열 단계 동안 발생하는 재조합 이벤트는 가변적인 양의 접합성(zygosity)을 유도할 수 있다. 그러므로, 이들 이벤트의 실시간 시각화는 배반포 형성 및 hPSC 세포주 생성에 대한 성공률을 개선시킬 뿐만 아니라, pn-hPSC 세포의 특이적, 유전적 및 면역학적 특성을 얻는 것을 목표로 한 조작 전략을 도울 것이다. 유사하게, NT-hPSC를 얻기 위해 통용되는 SCNT 접근법은 시험관 수정 클리닉으로부터의 난모세포를 이용한다. 또한 이수성, 핵형 불안정성 및/또는 비효율적인 핵 리프로그래밍에서 기인한, 높은 실패율은 NT-hPSC의 유도를 위해 보다 많은 수의 난모세포를 요구하고, 여전히 환자-특이적이지 않은 세포를 생성한다는 한계가 있다. 따라서, SCNT 및/또는 단위생식 기법을 이용하여 면역적합하고 환자-특이적인 hPSC의 일관되고 효율적인 생성을 허용하는 기법에 대한 당해 기술 분야에서의 큰 필요성이 있다.
면역적합성 및/또는 환자-특이적 hPSC의 확립을 위한 기법이 본 명세서에 기재된다. 일 양태에서, 효율적인 SCNT 및/또는 단위생식은 개선된 기법을 이용하여 설명된다. 이것은 세포적 손상을 감소시키는 현미조작(micromanipulation), 강한 염색제의 사용 및/또는 UV 광 노출 없이 실시간 시각화를 위한 폴스콥(poloscope) 현미경 관찰법의 개선을 포함한다. 보다 중요하게는, 효율적인 배반포 생성과 관련된 주요 장벽은 배반포 확장을 촉진하는 정자 유도체로부터 유사분열 구조 (예를 들어, 중심립)의 추가와 함께, 재구축된 난모세포 내에서 유전체 활성화를 촉진하는 메틸화-변형제의 적용에 의해 제거되었다, 이러한 개선된 기법의 적용은 집단의 광범위한 부분에 면역학적으로 적합한 세포를 제공하기 위하여 공통 인간 백혈구 항원 (HLA) 일배체형(haplotype)을 발현하는 pn-hPSC의 뱅크의 실현을 가능하게 한다. 모든 측면에 있어서, pn-hPSC 및 NT-hPSC는 동물 단백질-유리 배양 배지 상에서 자랄 수 있어서, 인간 환자를 궁극적으로 포함하는 임상적 적용에 대해 필수적이고, 유전적으로 및 후생적으로(epigenetically) 안정하고, 다능성인 이식가능 세포를 제공한다.
활성화 배지에서 인큐베이션하여 난모세포를 활성화하는 단계, 포스트-활성화 배지에서 상기 활성화된 난모세포를 인큐베이션하여 반수성체를 생성하는 단계, 배양 배지에서 상기 반수성체를 인큐베이션하여 배반포를 형성하는 단계, 및 상기 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 ICM 세포는 pn-hPSC 세포주로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포주 (pn-hPSC)를 생성하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 다른 구체예에서, 활성화 배지는 칼슘 이온운반체를 포함한다. 다른 구체예에서, 칼슘 이온운반체는 이오노마이신, A23187, 부베리신(beauvericin), X-537A, 및/또는 아베나시올리드(avenaciolide)를 포함한다. 다른 구체예에서, 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 푸로마이신, 에탄올, 시클로헥시미드 (CHX), 트리코스타틴 A (TSA), 및/또는 사이토칼라신 B (CB)를 포함한다. 다른 구체예에서, 포스트-활성화 배지는 제2 극체 방출을 막지 않는 화합물을 포함한다. 다른 구체예에서, 난모세포는 중기 II (MII) 단계 난모세포를 포함한다. 다른 구체예에서, 난모세포는 중기 I (MI) 단계 난모세포를 포함한다. 다른 구체예에서, 난모세포는 단일 전핵(pronuclear) 난모세포를 포함한다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 이형접합성(heterozygous)이다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 동형접합성(homozygous)이다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 집단의 1% 이상과 면역적합한 인간 백혈구 항원 (HLA) 일배체형(haplotype)을 갖는 다능성 세포를 포함한다. 다른 구체예에서, HLA 일배체형은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 난모세포 안으로 정자 인자를 주입하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 난모세포는 CARM 1 및/또는 Esrrb의 존재에서 인큐베이션된다.
또한 반수성체-유래 배반포의 내세포괴 (ICM) 세포로부터 분리된 다능성 세포를 포함하는 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포주 (pn-hPSC)가 본 명세서에 기재된다. 다른 구체예에서, 반수성체-유래 배반포는 활성화 배지에서 난모세포를 인큐베이션하여 생성된 반수체를 포함한다. 다른 구체예에서, 활성화 배지는 칼슘 이온운반체를 포함한다. 다른 구체예에서, 칼슘 이온운반체는 이오노마이신, A23187, 부베리신(beauvericin), X-537A, 및/또는 아베나시올리드를 포함한다. 다른 구체예에서, 반수성체-유래 배반포는 포스트-활성화 배지에서 활성화된 난모세포를 인큐베이션하여 생성된 반수성체를 포함한다. 다른 구체예에서, 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 푸로마이신, 에탄올, 시클로헥시미드 (CHX), 트리코스타틴 A (TSA), 및/또는 사이토칼라신 B (CB)를 포함한다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 이형접합성이다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 동형접합성이다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 집단의 1% 이상과 면역적합한 인간 백혈구 항원 (HLA) 일배체형을 갖는 다능성 세포를 포함한다. 다른 구체예에서, 다능성 세포는 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4), SSEA-3, 종양거절항원 1-81 (Tra-1-81), Tra-1-60, 옥타머 결합 전사 인자-4 (Oct-4), 성 결정 영역 Y-box-2 (Sox-2), nanog, 징크 핑거 단백질-42 (Rex-1/Zfp-42), 레프티 A(lefty A), 기형암종-유래 성장 인자 (teratocarcinoma-derived growth factor: Tdgf), 및 텔로미어 반복 결합 인자 (telomeric repeating binding factor: Terf-1)를 포함하는 군으로부터 하나 이상의 마커를 발현한다. 다른 구체예에서, 다능성 세포는 내배엽, 중배엽, 및 외배엽 배엽층으로부터 유래된 세포로 분화할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 난모세포로 정자 인자를 주입하는 단계를 추가적으로 포함한다. 다른 구체예에서, 난모세포는 CARM 1 및/또는 Esrrb의 존재에서 인큐베이션된다. 또한 하나 이상의 pn-hPSC 세포주를 포함하는 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포주(pn-hPSC)의 라이브러리가 본 명세서에 기재된다.
또한 난모세포의 핵을 제거하는 단계, 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계, 활성화 배지에서 인큐베이션하여 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계, 상기 활성화된 NT 난모세포로부터 배반포를 생성하는 단계, 및 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 ICM 세포는 NT-hPSC 세포주로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 핵 이식 인간 다능성 줄기 세포주 (NT-hPSC)를 생성하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 직접 주입을 포함하는 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 체세포 융합을 포함하는 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 체세포 융합은 하나 이상의 공여체 세포와 센다이 바이러스, 그의 단백질 또는 추출물의 접촉을 포함한다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 공여체 세포는 체세포 또는 생식 세포를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 자외선의 부재에서 수행된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 난모세포로 정자 인자를 주입하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 난모세포는 CARM 1 및/또는 Esrrb의 존재에서 인큐베이션된다. 또한 난모세포의 핵을 제거하는 단계, 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계, 활성화 배지에서 인큐베이션하여 상기 NT 난모세포를 활성화시키는 단계, 상기 활성화된 NT 난모세포로부터 배반포를 생성하는 단계, 및 상기 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 ICM 세포는 NT-hPSC 세포주로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 NT-hPSC 세포주가 본 명세서에 기재된다.
또한 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 난모세포에 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계, 및 난모세포의 숙주 핵을 제거하는 단계를 포함하는 핵 이식 방법이 본 명세서에 기재된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 활성화 배지에서 인큐베이션하여 NT 난모세포를 활성화시키는 단계, 활성화된 NT 난모세포로부터 배반포를 생성하는 단계, 및 상기 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 ICM 세포는 NT-hPSC 세포주로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 난모세포로 정자 인자를 주입하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 난모세포는 CARM 1 및/또는 Esrrb의 존재에서 인큐베이션된다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌들은 완전히 기재된 것처럼 그들의 전문으로서 참고로 인용된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 기술을 가진 자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. Allen et al., Remington : The Science and Practice of Pharmacy 22 nd ed., Pharmaceutical Press (Sep. 15, 2012); Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., revised ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 2006); Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7 th ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 2013); Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3 rd ed., Wiley-Blackwell (Nov. 28, 2012); 및 Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4 th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, N.Y. 2012),는 통상의 기술자에게 본 출원에서 사용된 수많은 용어에 대한 일반적인 안내를 제공한다. 항체 제조하는 방법에 대한 참조를 위해, Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2 nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor N.Y., 2013); Kohler and Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 July, 6(7):511-9; Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, U.S. Pat. No. 5,585,089 (1996 December); 및 Riechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar. 24, 332(6162):323-7를 참조한다.
당업계의 숙련된 기술자는 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 많은 방법들 및 물질들을 인식할 것이고, 이는 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 실제로, 본 발명은 어떤 방식으로든지 본원에 기재된 방법들로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 다음 용어들은 아래와 같이 정의된다.
본 명세서에 사용된 바의 "투여하는(administering)" 및/또는 "투여하다(administer)"는 약제학적 조성물 을 환자에게 전달하는 임의의 경로를 의미한다. 전달 경로들은 비-침습적 경구 (입을 통해), 국소 (피부), 점막 (코, 구강/설하, 질, 안구 및 직장) 및 흡입 경로들뿐만 아니라, 비경구 경로들, 및 당업계에 공지된 다른 방법들을 포함할 수 있다. 비경구적은 안와 내, 주입, 동맥내, 경동맥내, 관절낭내, 심장내, 피내, 근육내, 복강내, 폐 내, 척수내, 흉골내, 척수강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 피막하, 피하, 경점막, 또는 경기관을 포함하여 일반적으로 주입과 관련된 전달 경로를 의미한다. 비경구 경로를 통해, 조성물들은 주입 또는 주사를 위한 용액들 또는 현탁액들의 형태이거나, 또는 동결 건조된 분말들일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바의 "조절(modulation)" 또는 "조절한다(modulates)" 또는 "조절하는(modulating)"은 상향 조절 (즉, 활성화 또는 자극), 응답의 하향 조절 (즉, 저해 또는 억제) 또는 이들 둘의 조합이나 또는 별개를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바의 "약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically aceeptable carriers)"은 본 발명에 유용할 수 있는 종래의 제약학적으로 허용되는 담체들을 의미한다..
본 명세서에 사용된 바의 "촉진하다(promote)" 및/또는 "촉진하는(promoting)"은 세포 또는 유기체의 특정 작용에서의 증대를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바의 "개체(subject)"는 포유류 및 반려 동물들, 농장 동물들 및 동물원 동물들을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는 다른 동물들을 포함하는 모든 동물들을 포함한다. 용어 "동물"은 예를 들면, 포유 동물, 새, 유인원, 개, 고양이, 말, 소, 설치류, 등을 포함하는 범주인 임의의 살아있는 다세포 척추 동물 유기체들을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 용어 "포유 동물"은 인간 및 인간 이외의 포유 동물들 모두를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바의 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 치료 중인 개체에서 목적하는 효과를 얻기에 충분한 특정 조성물, 또는 조성물 중의 활성제의 양이다. 치료학적 유효량은 개체의 생리적 상태 (연령, 성별, 질병 유형 및 단계, 일반적인 신체 상태, 주어진 복용량에 대한 응답성, 원하는 임상 효과를 포함함) 및 투여 경로를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 각종 인자들에 따라 변화할 수 있다. 임상 분야 및 약리학적 분야의 숙련자라면 통상의 실험을 통해 치료학적 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
본 명세서에 사용된 바의 "치료한다(treat)", "치료하는(treating)" 및 "치료(treatment)"는 치료적 처치 및 예방적 처치 모두 또는 예방 조치들을 의미하고, 여기서 그 목적은 치료가 궁극적으로 성공적이지 않더라도 목적하는 상태, 질병 또는 장애 (총체적으로 "질병")을 방지하거나 또는 느리게 (경감)시키는 것이다. 치료가 필요한 사람들은 이미 그 질병에 걸린 사람들뿐만 아니라 그 질병에 걸릴 경향이 있는 사람들 또는 그 질병이 방지되어야 하는 사람들을 포함할 수 있다.
기재된 바와 같이, 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 분리 및 특성 분석, 및 포유류에서의 단위 생식(parthenogenesis) 및/또는 체세포 핵 이식(SCNT)에서의 새로운 발견은 조직 복구 및 이식 의학에서의 잠재적인 적용과 함께, 연구에 사용하기 위한 잠재적으로 제한되지 않는 hPSC의 세포원(source) 생성의 가능성을 일으켰다.
단위 생식에 대하여, 결과 세포에서의 부계 기여(paternal contribution)의 제거가 적용될 수 있고, 일부 예에 있어서, 이는 주조직 적합성 복합체(MHC)의 다양성을 최소화하기 위함이다. 이것은 넓은 범위의 환자 집단과의 광범위한 면역적합성인 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포(pn-hPSC)의 생성을 가능하게 한다. 동형 접합성(homozygous) pn-hPSC 세포주를 생성하는 것은 이형 접합성 변이를 제거함으로써 잠재적인 면역적합성을 더 개선한다. 오로지 하나의 대립형질 세트의 동형 접합성 발현의 예에 있어서, 이것은 결과 pn-hPSC 세포주가 더 용이하게 환자에 적합하도록 한다. 예를 들면, 공통 일배체형(common haplotypes)에 대하여 선택된 10 개 뿐인 동형 접합성 pn-hPSC 세포주의 패널은 영국인 수여자에 대한 거의 40% 및 유리하게는 거의 65%의 완전한 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR 일치를 제공할 수 있다는 것이 보고되었다. 치료적 설정에서의 SCNT의 적용을 고려할 때, 비슷한 이점이 존재한다. SCNT(NT-hPSC)를 통해 수득된 세포는 환자의 핵의 유전 물질을 지닐 수 있고, 이 점에서 세포는 개별적인 환자 특이적이다. 이러한 형태의 자가 이식은 면역 거부에 대해 유의적으로 감소된 위험을 갖는 환자에의 세포 이식을 가능하게 한다.
단위 생식 및 SNCT 기법은 인위적인 난모세포 활성화(artificial oocyte activation)를 포함하고, 이것은 자연발생적인 정자 수정 동안 일어나는 칼슘 신호 변화의 모방에 의존한다. 정상적인 난모세포 발달은 난모세포를 중기 II(MII) 단계에서 차단(arrest)하기 위한 고 수준의 중기 촉진 인자(Metaphase Promoting Factor)(MFP) 활성에 의존한다. MII 난모세포의 차단은 정자 진입에 기인한 세포내 칼슘 이온(Ca2+) 수준 변화에 의해 방해된다. 이후에, 사이클린 B(cyclin B)(MPF 조절 서브유닛)의 표적 분해가 일어나고, 이것은 세포주기 차단, 전핵 형성, 및 감수 분열 및 유사 분열 과정으로부터 난모세포를 풀어준다.
첫 번째 단계로서, 단위 생식성 난모세포 활성화는 세포주기 차단으로부터 배양된 난모세포를 풀어주기 위한 인위적인 칼슘-변화 전략에 의존한다. 예시는 칼슘 이온운반체, 지질 이중층을 통과하여 이온을 전달하는 지용성 분자, 예를 들면 이오노마이신 및 A23817의 첨가를 포함한다. 대안적인 전략은 전기적 활성 또는 이온의 직접적인 주입에 의존한다. 단위 생식에 있어서 두 번째 주요 단계는 제2 극체 방출(2PBE)의 방출을 막는 MPF/사이클린 B 억제를 유지하는 것을 포함한다. 이것은 pn-hPSC 세포 분리를 위해 배반포로 더 배양될 수 있는 이배체(2 산모 유전체) 반수성 개체의 생성을 유도한다. SCNT와 관련된 바와 같이, 핵 이식된(즉, 재구축된) 난모세포의 재구축 이후에 또한, 칼슘 변화 기법을 사용한 난모세포 활성화가 일어난다.
그러나, 이러한 SCNT 및/또는 단위 생식 기법 각각에 있어서 유의한 제한이 존재한다. 예를 들면, 단백질 포스파타아제 억제제 카페인의 양(sheep) 난모세포에의 첨가는 성숙-촉진 인자(Matruation Promoting Factor)(MPF) 및 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPKs)의 활성을 증가시킨다는 것이 보고되었고, 유사한 이점이 원숭이 난모세포에서 보고된 반면, 배반포 형성의 빈도는 증가하지 않았다. 또한, 칼슘 이온운반체, 전기적 활성화, 또는 직접적인 주입을 통한 칼슘 활성화는 자연발생적인 수정으로서 동일한 타이밍, 공간 조절, 또는 칼슘 진동을 일으키지 않는다. 추가적인 복잡성을 더하면 칼슘에 대한 영향은 또한, 종 특이적인 것으로 나타났다는 점이다. 일부 예에 있어서, 6-디메틸아미노퓨린(6-DMAP)과 같은 키나아제 억제제, 에탄올 및 사이클로헥시이미드(CHX)와 같은 단백질 합성 억제제로의 부가적인 처리의 사용은, 소, 마우스, 및 다른 동물 모델에서 알려진 바와 같이, MPF 불활성화를 증가시키기 위해 사용된다. 이러한 제제의 첨가는 효과적인 반면 다른 문제점을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 단위 생식성 활성화 동안 6-DMAP의 첨가는 제2 극체 방출 및 이배체 세포의 생성을 막는 반면에, 이러한 접근법은 더 광범위하게 면역적합성인 동형 접합성 hPSC 세포주의 생성을 가능하게 하지 않는다.
SCNT와 관련된 바와 같이, 존재하는 기업은 이수성 및 비효율적인 핵 리프로그래밍에 의해 방해 받고, 이는 고 수준의 발달 차단 및 세포사를 유도한다. 난모세포 활성화 비효율성과 함께, 핵의 제거, 재구축 동안의 구조적 및 유전 독성 스트레스, 및 SCNT 접합체의 제1 유사 분열 분리 동안의 결점은 모두 SCNT를 사용한 바람직하지 못한 발달 속도에 기여하는 것으로 제안되어졌다.
면역적합성 및/또는 환자 특이적 hPSC의 생성을 위한 효율적인 기법을 확립하기 위해, 본 발명자들은 1) 재구축, 2) 활성화, 및 3) 공여 세포에서의 변형을 갖는 상이한 프로토콜을 비교하였다. 세 개의 측면 모두의 개선된 이해는 효과적인 SCNT 기법을 제공할 수 있는 반면에, 난모세포 활성화의 개선된 방법은 단위 생식에 대한 우수한 접근법을 제공할 수 있다. 그러므로, 여기에 기재된 기법은 재구축, 활성화, 및 공여 세포 선택의 변형의 성능의 비교를 제공하고, 인간 단위 생식 및/또는 SCNT에 대한 효과적인 조건을 성공적으로 확인한다.
여기에 기재된 것은 체세포 핵 이식 (SCNT)을 위한 방법이다. 일 구체예에 있어서, SCNT를 위한 방법은 난모세포의 핵을 제거하는 단계, 하나 또는 그 이상의 공여 핵을 이식하는 단계, 재구축된 핵 이식된 난모세포(배아)를 활성화하는 단계, 및 선택적으로 배반포로 추가적인 배양하는 단계, 및 배반포로부터 다능성 줄기 세포(pSCs)를 유도(derivation)하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 이것은 탈핵된 난모세포로의 주입을 위한 하나 또는 그 이상의 공여 핵을 분리하는 단계를 포함한다.
다양한 구체예에 있어서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 중기 II(MII) 단계 난자 방추사를 제거하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 제1 극체(1PBE)는 제거된다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 난구 세포를 성숙의 완료 전에 벗기는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 난모세포는 실시간으로 1PBE에 대한 비-UV 빛 기반 관찰로 관찰된다. 또 다른 구체예에 있어서, 관찰은 염색 또는 라벨링 제제, 예를 들면 훽스트 염색(Hoechst staining)의 부재하에서 일어난다. 일 구체예에 있어서, 이것은 폴스콥(poloscope), 예를 들면, Research Instruments (CRi) Oosight™ 이미지 시스템의 사용을 포함한다. 예를 들면, 이것은 545 nm 평광으로 수집된 MII 난모세포에서의 투명대(zona pellucid) 및 방추사 복합체를 시각화하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 난모세포 막의 구멍 및 난모세포로부터의 1PBE의 제거를 가능하게 하는 형상을 갖는 마이크로피펫(contoured micropipette)의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 압전기 드릴(piezoelectric drill)의 사용을 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 핵을 제거하는 단계는 사이토칼라신 B 및 선택적으로, 단백질 포스파타아제 억제제, 예를 들면, 카페인을 함유하는 탈핵 배지에서 수행된다.
또 다른 구체예에 있어서, 공여 핵을 이식하는 단계는 난모세포 막 구조를 변형시키는 제제의 사용을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 난모세포 막 구조를 변형시키는 제제의 사용을 통한 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 체세포와의 융합을 포함한다. 예를 들면, 공여 핵을 이식하는 단계는 주입 피펫(예를 들면, 12 ㎛ 직경)으로 3 내지 4 공여 세포를 제공하는 단계, 파라믹소바이러스 또는 파라믹소 바이러스 단백질, 예를 들면 센다이 바이러스 외피 단백질을 함유하는 용액의 일정 양 중의 공여 세포를 배출하는 단계를 포함할 수 있다. 이후에, 선형으로 배열된 공여 세포로부터 일정 거리 떨어져서(4 내지 5 세포 길이) 주입 피펫을 사용하여 세포를 회수하는 단계, 홀딩 피펫으로 난모세포를 홀딩하는 단계, 공여 세포를 갖는 주입 피펫을 난모세포로 진전시키는 단계가 뒤따른다. 주입 피펫을 진전시키는 단계는 난황 원형질 막의 비파괴를 포함하고, 및 핵 공여 세포를 투명대 아래에 위치하는 난황 원형질 막과 접촉시키기 위하여 난모세포의 투명대 및 세포막 사이의 공간인 위란강(perivitelline space)에 하나의 핵 공여 세포의 삽입을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 피펫의 회수는 난황막과 공여 세포 사이의 접촉을 방해하지 않는다. 다양한 구체예에 있어서, 세포는 공여 세포 삽입 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 분 후에 융합된다. 다양한 구체예에 있어서, 세포는 공여 세포 삽입 10분 후에 융합된다. 선택적으로 상기 과정은 성공적으로 융합되지 않은 세포에 대하여 반복된다. 다양한 구체예에 있어서, 폴스콥, 예를 들면, Oosight™ 이미지 시스템이 전 과정에서 사용된다.
일 구체예에 있어서, 공여 핵을 이식하는 단계는 전기적 세포 조작, 예를 들면, 전기세포융합(electrofusion)을 포함할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 체세포 핵 공여체, 줄기 세포 핵 공여체, 및 정자 세포 핵 공여체의 핵을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 SCNT를 위한 체세포 핵을 분리하는 단계 후에 피펫 또는 압전기 주입(piezoelectric injection)을 통하여 하나 또는 그 이상의 공여 핵을 삽입하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 공여 핵은 세포, 예를 들면, 피부 섬유아세포, 백혈구, 모낭, 또는 다른 체세포 핵 공여체로부터 유래된다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 정자 세포 공여로부터 핵의 분리 및 제조를 포함하는 방법을 개시한다. 상이한 구체예에 있어서, 핵의 분리는 조직 생검, 수혈, 또는 조직 시료를 수득하기 위한 다른 방법, 기계적 분리, 콜라게나아제 소화, 세척, 원심분리 기반 밀도 구배 분리, 및/또는 표준 배양 배지로의 배양을 통한 조직의 가공을 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 체세포 핵 공여체, 줄기 세포 핵 공여체, 및 정자 세포 핵 공여체의 핵을 분리 및/또는 변형하는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 구체예에 있어서, 이것은 메틸화-변형제(methylation-altering agents), 예를 들면 후생적 크로마틴(epigenetic chromatin) 및 β 히스톤 변형제(histone modification agents), 및/또는 DNA 변형제를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 이것은 단백질 아르기닌 메틸-트랜스퍼라아제(PRMT1) 및 공활성화 인자-연관된 아르기닌 메틸트랜스퍼라아제 1(coactivator-associated arginine methyltransferase 1) (CARM1/PRMT4) 또는 핵 고아 수용체 에스트로겐(orphan nuclear receptor estrogen) 관련된 수용체 β (Esrrb) 단백질을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 메틸화-변형제 및/또는 DNA 변형제는 변형된 재조합 단백질로 발현된다. 예를 들면, CARM1 및 Esrrb는 7X아르기닌(7R)-세포-투과 펩티드(CPPs), 또는 통상의 기술자에게 세포막 및 핵막을 통과하여 단백질 및 펩티드의 투과를 증진시키고, DNA와의 결합 및/또는 전사활성화를 증시키는 것으로 알려진 다른 단백질로 변형될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 전사 인재-기반 재프로그래밍을 사용하여 옥타머 결합 전사 인자-4(octamer binding transcription factor-4)(Oct-4), 성 결정 부위 Y-박스-2(sex determining region Y-box-2)(Sox-2), nanog, 크루펠-유사 인자-4(Kruppel-like factor-4)(Klk-4), MyoD, c-Myc, 징크 파인더 단백질-42(zinc finder protein-42)(Rex-1/Zfp-42), 레프티 A(lefty A), 기형암종-유래 성장인자(teratocarcinoma-derived growth factor) (Tdgf), 및/또는 텔로머 반복 결합 인자(telomeric repeating binding factor)(Terf-1)로 핵 공여 세포를 후생적으로 재프로그래밍하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 방법은 직접적인 압전기 주입, 바이러스성 주입, 리포좀성 주입, 또는 다른 방법의 세포질내 주입을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 전사 인자는 탈핵된 난모세포로의 핵 이식 전에 적용될 수 있는 mRNA, 단백질, 및/또는 세포 추출물의 형태로 전달될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 HDAC 억제제(클래스 I, II, 및 III), 또는 DNMT3a 및 DNMT3b 억제제의 사용을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 재구축된 핵 이식된 난모세포를 활성화하는 방법을 개시한다. 일 구체예에 있어서, 재구축된 핵 이식된 난모세포의 활성화는 핵 이식 난모세포를 활성화 배지에서 37℃에서 5분 동안 처리하는 단계에 뒤이은 난할 배지(cleavage medium)에서 세척하는 단계를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지(cleavage assist medium), IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지(global human embryo culture medium)이다. 특정 구체예에 있어서, 활성화 배지는 칼슘 이온운반체를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 칼슘 이온운반체는 이오노마이신, A23187, 뷰베리신, X-537A, 아베나시올리드, 모노매크로사이클릭 폴리에테르(monomacrocyclic polyether), 또는 마크로바이오사이클릭 화합물(macrobiocyclic compounds) 또는 크립테이트(cryptates)이다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 알코올, 예를 들면, 에탄올을 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 티메로살(thimerosal)을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 μM의 이오노마이신을 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 MII 단계 난모세포의 전기적 활성화를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전기적 활성화는 전기적세포융합 배지에서의 전기적 펄스를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 전기적세포융합 배지는 0.1 내지 0.5 M 만니톨, 0.01 내지 1 mM MgSO4.7H2O, 0.01 내지 1 mg/ml 폴리비닐 알코올, 1 내지 10 mg/ml 인간 혈청 알부민, 0.005 내지 0.5 mM CaCl2.2H2O를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전기적세포융합 배지는0.3 M 만니톨, 0.1 mM MgSO4.7H2O, 0.1 mg/ml 폴리비닐 알코올, 3 mg/ml 인간 혈청 알부민, 0.05 mM CaCl2.2H2O를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 재구축된 핵 이식된 난모세포를 활성화하는 단계는 크로마틴 응축, 방추사 형성, 및 화학적 활성화를 가능하게 한다. 다른 구체예에 있어서, 전기적 펄스의 조합 이후에 선택적으로 6-DMAP가 적용될 수 있고, 예를 들면, 0.25M d-솔비톨 버퍼 및 6-DMAP (2 mM, 4 시간) 중 (2×50 μs DC 펄스, 2.7 kV/CM)이다. 다른 구체예에 있어서, 다양한 개시된 배지, 예를 들면, HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지는 선택적으로 성장인자, 예를 들면, GM-CSF 또는 IGF1을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 성장 인자는 핵 이식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이후의 일에 첨가될 수 있다.
다양한 구체예에 있어서, 핵 이식 난모세포는 완전한 활성화를 위해 포스트-활성화 배지(post-activation medium)에서 처리된다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 이후에 포스트-활성화 배지에서 인큐베이션된다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지이다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 푸로마이신(puromycin), 에탄올, 사이클로헥시이미드(CHX), 트리코스타틴 A(trichostatin A)(TSA), 및/또는 사이토칼라신 B(cytochalasin B)(CB)를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화된 난모세포는 포스트-활성화 배지에서 30, 30 내지 45, 45 내지 60, 60 내지 90, 90 내지 120, 120 내지 150, 150 내지 180, 180 내지 210, 210 내지 240, 240 내지 270, 300 내지 330, 330 내지 360, 360 내지 390분 미만, 또는 390분 초과 동안 인큐베이션된다. 특정 구체예에 있어서, 활성화된 난모세포는 240, 300, 또는 360분 동안 인큐베이션된다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화 및 포스트-활성화 단계는 저산소 조건하에서 수행된다. 특정 구체예에 있어서, 저산소 조건은 약 80 내지 85%, 85 내지 90%. 90 내지 95%, 95% 또는 그 이상의 N2, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 그 이상의 02, 및 약1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 또는 그 이상의 CO2를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 저산소 조건은 약 90% N2, 약 5% O2, 및 약 5% CO2를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 기체 혼합물, 예를 들면, 약 90% N2, 약 5% O2, 및 약 5% CO2 중 1, 2, 3, 4, 5, 5, 또는 그 이상의 시간 동안, 예를 들면, 37 ℃에서 인큐베이션된, 난할 배지 중 1, 2, 3, 4, 5, 5, 또는 그 이상의 mM의 6-DMAP를 포함한다.
포스트-활성화 배지에서 인큐베이션 후에, 포스트-활성화된 난모세포는 세척 배지에서 인큐베이션된다. 상이한 구체예에 있어서, 세척 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지이다. 또 다른 구체예에 있어서, 배양 배지는 글로벌 인간 배아 배양 배지와 같이 연속의 배지 교환을 요구하지 않는다. 특정 구체예에 있어서, 세척 배지는 TSA를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 난모세포는 TSA를 포함하는 세척 배지에서 240, 300, 또는 360분 동안 인큐베이션된다. 일 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 세척되고, 추가적으로 배양된다. 일 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 6-DMAP 제거 배지에서 세척된다. 다른 구체예에 있어서, 다양한 개시된 배지, 예를 들면, HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지는 선택적으로 성장인자, 예를 들면, GM-CSF 또는 IGF1을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 성장 인자는 핵 이식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이후의 일에 첨가될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 활성화 및/또는 포스트-활성화 단계는 정자로부터 분리된 인자, 그의 파생물 및 추출물을 첨가하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 인간 정자 인자는 기재된 주입 방법의 어느 것을 사용하여 활성화된 재구축된 난자에 주입된다. 일 구체예에 있어서, 인간 정자 인자는 기재된 주입 방법의 어느 것을 사용하여 포스트-활성화된 재구축된 난자에 주입된다. 다양한 구체예에 있어서, 약 1, 2, 3, 또는 4일 후에, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 난할 배지로 옮겨진다. 특정 구체예에 있어서, 약 1일 후에, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 난할 배지로 옮겨진다. 다양한 구체예에 있어서, 정자 인자는 예를 들면, 정자 세포의 내부 또는 외부에 존재하는 세포 단백질로부터 분리된 인자를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전체 정자 추출물은 계면 활성제 및 사정된 정자의 기계적 혼합을 사용하여 수득된다. 또 다른 구체예에 있어서, 전체 세포 추출물은 DNAase I 및 RNAase로 처리된다. 또 다른 구체예에 있어서, 조추출물(crude extract)은 버퍼로 세척되고 원심분리(2시간 동안 20,000 g)된다. 다른 구체예에 있어서, 신선한 사정된 인간 정자는 수입되고, 정액 혈장을 제거하기 위해 10분 동안 900 g에서 원심 분리된 이후, 5 mg/mL 소 혈청 알부민을 함유하는 스펌-TALP(Sperm-TALP)에서 펠렛의 재현탁 및 설정과 동시에 원심 분리된 이후, 상등액의 제거 및 핵 분리 배지(NIM: 125 mM KCl, 2.6 mM NaCl, 7.8 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 3.0 mM EDTA 디소듐 염; pH 7.45)에서 최종 농도 20×108 sperm/mL로 펠렛의 재현탁, 및 스펌-TALP를 제거하기 위해 원심 분리된다. 스펌-TALP가 제거된 이후, 1 mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol), 100 mM 루펩틴(leupeptin), 100 mM 안티패인(antipain), 및 100 mg/mL 소이빈 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor)를 함유하는 NIM에 동일한 부피로 펠렛의 재현탁 이후에 2 ℃에서 50분 동안 20,000X에서 밀집한 정자 펠렛 형성과 함께 4 주기의 동결(액체 N2에서 각 주기당 5분), 및 해동(15℃에서 각 주기당 5분)이 뒤따른다. 최종적으로 결과 상등액은 조심스럽게 제거되고, 적정되고, 사용될 때까지 -80℃에서 유지된다.
다양한 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 배반포로 더 배양된다. 일 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 SAGE 난할 배지, 예를 들면, 퀸 배지(Quinn's medium)에서 더 배양된다. 또 다른 구체예에 있어서, 배지, 예를 들면, 3i 배지 (신경기저 배지(Neuro basal medium) 50%, DMEM/F-12 50%, N2 첨가물 1/200 v/v, B27 첨가물 1/100 v/v, 100 mM L-글루타민 1/100 v/v, 0.1M β-ME 1/1000 v/v, SU5402 (FGFR 억제제) 2 μM, PD184352 (ERK 캐스케이드 억제제) 0.8 μM, CHIR99021 (GSK3 억제제) 3 μM) 또는 변형된 3i 배지(PD0325901 (MAPK 억제제) 0.4 μM 포함)는 다능성을 촉진한다. 일 구체예에 있어서, 추가적인 배양은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 5일 이상 동안이다. 일 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 리프로그래밍 인자 및/또는 메틸화-변형제를 갖는 배양 배지에서 제공된다. 다양한 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 CARM1 및/또는 Esrrb가 첨가된 G2 배지에서 3일 동안이다. 예를 들면, CARM1 및/또는 Esrrb는 각각 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 또는 그 이상의 μg/ml의 배지 중 농도로 제공될 수 있다. 일부 구체예에 있어서, CARM1 및/또는 Esrrb는 각각 2 μg/ml의 배지 중 농도로 제공된다.
다양한 구체예에 있어서, 배반포로의 추가적인 배양 및 배반포로부터 다능성 줄기 세포(pSCs)의 유도는 투명대(ZP)를 제거하기 위해 배양된 배반포를 산성 타이로드 용액(acidic Tyrode's solution)으로 처리하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 처리는 몇 초(예를 들면, 1 내지 5) 동안이다. 다양한 구체예에 있어서 ZP의 제거 이후에 HEPES-HTF 배지에서의 세척이 뒤따른다. 다양한 구체예에 있어서, 내세포괴(ICM)의 분리는 배반포의 영양포(trophoblast)를 폐기하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, ICM 세포는 플레이팅 하루 전에 제조된 마우스 배아 피더층(mouse embryonic feeder)(MEF)에 플레이팅된다. 일부 구체예에 있어서, 전체 배반포는 MEFs에 플레이팅된다. 예를 들면, 이 방법은 배반포의 투명대를 벗기는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 방법은 Hepes-HTF 배지 중 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1% 프로나아제(pronase)로 배반포의 투명대를 제거하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 Hepes-HTF 배지 중 0.5% 프로나아제(pronase)로 배반포의 투명대를 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 60, 60 내지 120, 120 내지 180, 또는 >180 초 동안 TH3 배지(SAGE 배반포 배지) 중 프로나아제를 적용하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 30 내지 60초 동안 HTF 배지 중 0.5% 프로나아제를 적용하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 배반포는 난모세포의 단위 생식으로부터 수득된 반수성체로부터 유래된다. 일 구체예에 있어서, hPSC 세포주는 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포(pn-hPSC) 세포주이다. 또 다른 구체예에 있어서, 배반포는 수여 난모세포로의 공여 세포 핵의 체세포 핵 이식(SCNT)으로부터 수득된 재구축된 핵 이식된 난모세포로부터 유래된다. 일 구체예에 있어서, hPSC 세포주는 체세포 핵 이식 인간 다능성 hPSC(NT-hPSC) 세포주이다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 영양외배엽성 세포(trophectodermal cell)로부터의 내세포괴(ICM)가 기계적 확산(mechanical dispersion)하는 단계를 포함하는 면역절제술(immunosurgery)을 위한 방법을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 벗겨진 배반포는 37℃에서 약 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 60분 동안 래빗 항-인간 비장 혈청으로 처리된다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 벗겨진 배반포를 TH3(SAGE 배반포 배지)로 세척하는 단계, 37℃에서 30분 동안 HECM-9(SAGE 배반포 배지)로 재구축된 기니 피그 보체에서 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 확장된 배반포의 투명대는 TH3(hepes-HTF) 배지 중 0.5% 프로나아제 또는 산성 타이로드 용액에의 약간의 노출(45 내지 60 초)로 제거된다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 선택적으로 영양외배엽성 세포로부터 내세포괴를 분리하기 위해 작은 구경 피펫팅(small bore pipetting), Ehsms zilos-tk unit(Hamilton Thorne)을 사용한 레이저 보조 부화 방법(laser assisted hatching method)을 사용하여 세포를 기계적으로 확산하는 단계를 포함한다.
일 구체예에 있어서, SCNT를 위한 방법은 난모세포의 핵을 제거하는 단계, 공여 핵을 이식하는 단계, 재구축된 핵 이식된 난모세포를 활성화하는 단계, 및 선택적으로 배반포로 더 배양하는 단계, 배반포로부터 다능성 줄기 세포(pSCs)로 유도하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 중기 II 단계 난자 방추사를 제거하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 제1 극체(1PBE)는 제거된다. 일 구체예에 있어서, 공여 핵을 이식하는 단계는 주입 피펫(예를 들면, 12 ㎛ 직경)으로 3 내지 4 공여 세포를 제공하는 단계, 센다이 바이러스 외피 단백질을 함유하는 용액의 일정 양 중의 공여 세포를 배출하는 단계, 선형으로 배열된 공여 세포로부터 일정 거리 떨어져서(4 내지 5 세포 길이) 주입 피펫을 사용하여 세포를 회수하는 단계, 홀딩 피펫으로 난모세포를 홀딩하는 단계, 공여 세포를 갖는 주입 피펫을 난모세포로 진전시키는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 주입 피펫을 진전시키는 단계는 난황 원형질 막의 비파괴를 포함하고, 및 핵 공여 세포를 투명대 아래에 위치하는 난황 원형질 막과 접촉시키기 위하여 위란강(perivitelline space)에 하나의 핵 공여 세포의 삽입을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 피펫의 회수는 난황막과 공여 세포 사이의 접촉을 방해하지 않는다. 다양한 구체예에 있어서, 난모세포는 더 인큐베이션된다. 다양한 구체예에 있어서, 세포는 공여 세포 삽입 10분 후에 융합된다. 선택적으로 상기 과정은 성공적으로 융합되지 않은 세포에 대하여 반복된다. 다양한 구체예에 있어서, 폴스콥, 예를 들면, Oosight™ 이미지 시스템이 전 과정에서 사용된다. 다른 구체예에 있어서, 핵을 제거하는 단계는 사이토칼라신 B 및 선택적으로, 단백질 포스파타아제 억제제, 예를 들면, 카페인을 함유하는 탈핵 배지에서 수행된다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 프로테아좀 억제제(proteasome inhibitor), 예를 들면, MG132의 사용을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, SCNT의 방법은 하나 또는 그 이상의 공여 핵을 이식하는 단계 이후에 난모세포의 핵을 제거하는 단계가 뒤따른다.
일 구체예에 있어서, 재구축된 핵 이식된 난모세포를 활성화하는 단계는 재구축된 핵 이식 난모세포를 활성화 배지에서 37℃에서 5분 동안 처리하는 단계에 뒤이은 난할 배지에서 세척하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 5 μM의 이오노마이신을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 핵 이식 난모세포는 완전한 활성화를 위해 포스트-활성화 배지에서 처리된다. 다양한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 5% CO2/5% O2/90% N2 대기 중 37℃에서 4시간 동안의 난할 배지 중 2 mM 6-DMAP를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 활성화된 핵 이식 난모세포는 세척되고, 및 추가적으로 배양된다. 일 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 SAGE 난할 배지에서 더 배양된다. 일 구체예에 있어서, 추가적인 배양은 2일 동인이다. 일 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 리프로그래밍 인자 및/또는 메틸화-변형제를 갖는 배양 배지에서 제공된다. 다양한 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 CARM1 및/또는 Esrrb가 첨가된 G2 배지에서 3일 동안이다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화된 핵 이식된 난모세포는 배반포로 더 배양된다. 다양한 구체예에 있어서, 배반포로의 추가적인 배양, 및 배반포로부터 다능성 줄기 세포(pSCs)의 유도는 투명대(ZP)를 제거하기 위해 배양된 배반포를 산성 타이로드 용액(예를 들면, pH 2.0)으로 처리하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 처리는 몇 초(예를 들면, 1 내지 5) 동안이다. 다양한 구체예에 있어서 ZP의 제거 이후에 HEPES-HTF 배지에서의 세척이 뒤따른다. 다양한 구체예에 있어서, 내세포괴(ICM)의 분리는 배반포의 영양포(trophoblast)를 폐기하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, ICM 세포는 플레이팅 하루 전에 제조된 마우스 배아 피더(mouse embryonic feeders)(MEFs)에 플레이팅된다. 일부 구체예에 있어서, 전체 배아는 MEFs에 플레이팅된다. 다양한 구체예에 있어서, PSC 유도 배지는 혈청 대체물(5% SR, Invitrogen) 첨가된 녹아웃-DMEM , FBS(10%, Hyclone), 플라스마메이트(plasmate) (5%), bFGF(32 ng/ml), 및 인간 LIF(2000 units/ml, Sigma-Aldrich)로 구성된다.
또한, 여기에 개시된 것은 체세포 핵 이식으로부터 유래된 인간 다능성 줄기 세포주(NT-hPSC)이다. 다양한 구체예에 있어서, NT-hPSC는 공여 핵과 유전적으로 동일하거나, 또는 거의 동일하다. 상이한 구체예에 있어서, NT-hPSC 세포주는 정상적인 46 염색체, XX/XY 핵형을 함유한다. 상이한 구체예에 있어서, NT-hPSC 세포주는 세 개의 배엽 형성이 모두 가능하다. 상이한 구체예에 있어서, NT-hPSC 세포주는 하나 또는 그 이상의 다능성 마커를 발현하고, 다능성 마커는 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4), SSEA-3, 종양 거부 항원1-81(Tra-1-81), Tra-1-60, 옥타머 결합 전사 인자-4(Oct-4), 성 결정 부위 Y-박스-2(Sox-2), nanog, 징크 파인더 단백질(Rex-1/Zfp-42), 레프티 A(lefty A), 기형암종-유래 성장 인자(Tdgf), 텔로머 반복 결합 인자(Terf-1), 및 발달 다능성-연관된 유전자 2(Dppa-2)를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, NT-hPSC 세포주는 열성 치사율(recessive lethality)을 포함하지 않는다. 상이한 구체예에 있어서, NT-hPSC 세포주는 고도의 알칼린 포스파타아제(AP) 및/또는 텔로머라아제 활성을 보유한다. 상이한 구체예에 있어서, NT-hPSC 세포주는 면역 결핍 동물 내에서 현탁액 중 배양체(embryoid body) 및/또는 세 개의 배엽 전부로부터 유래된 세포를 포함하는 기형종을 형성할 수 있다.
또한 여기에 기재된 것은 인간 난모세포의 단위 생식을 위한 방법이다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 단위 생식성 난모세포의 형성을 시작하기 위해 중기 II(MII) 단계 난모세포를 활성화 배지에서 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 활성화 배지는 칼슘 이온운반체를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 칼슘 이온운반체는 이오노마이신, A23187, 뷰베리신, X-537A, 아베나시올리드, 모노매크로사이클릭 폴리에테르, 또는 마크로바이오사이클릭 화합물 또는 크립테이트이다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 알코올, 예를 들면, 에탄올을 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 티메로살을 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 MII 단계 난모세포의 전기적 활성화를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전기적 활성화는 전기적세포융합 배지에서의 전기적 펄스를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 전기적세포융합 배지는 0.1 내지 0.5 M 만니톨, 0.01 내지 1 mM MgSO4.7H2O, 0.01 내지 1 mg/ml 폴리비닐 알코올, 1 내지 10 mg/ml 인간 혈청 알부민, 0.005 내지 0.5 mM CaCl2.2H2O를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전기적세포융합 배지는 0.3 M 만니톨, 0.1 mM MgSO4.7H2O, 0.1 mg/ml 폴리비닐 알코올, 3 mg/ml 인간 혈청 알부민, 0.05 mM CaCl2.2H2O를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 난모세포는 정자 인자와 함께 처음에 주입되고, 이후에 전기적으로 활성화된다.
특정 구체예에 있어서, MII 단계 난모세포는 30 ℃, 31 ℃, 32 ℃, 33 ℃, 34 ℃, 35 ℃, 36 ℃, 37 ℃, 38 ℃, 39 ℃, 40 ℃, 또는 그 이상의 온도에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 분 동안 활성화 배지에서 인큐베이션되고, 이후에 세척 배지에서 세척된다. 특정 구체예에 있어서, MII 단계 난모세포는 37 ℃ 온도에서 5분 동안 칼슘 이온운반체에 노출되고, 이후에 세척 배지에서 세척된다. 상이한 구체예에 있어서, 세척 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지이다.
상이한 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 이후에 포스트-활서오하 배지에서 인큐베이션된다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지이다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 푸로마이신, 에탄올, 사이클로헥시이미드(CHX), 트리코스타틴 A (TSA), 및/또는 사이토칼라신 B (CB)를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 포스트-활성화 배지에서 30, 30 내지 45, 45 내지 60, 60 내지 90, 90 내지 120, 120 내지 150, 150 내지 180, 180 내지 210, 210 내지 240, 240 내지 270, 300 내지 330, 330 내지 360, 360 내지 390분 미만, 또는 390분 초과 동안 인큐베이션된다. 특정 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 240, 300, 또는 360분 동안 인큐베이션된다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화 및 포스트-활성화 단계는 저산소 조건하에서 수행된다. 특정 구체예에 있어서, 저산소 조건은 약 80 내지 85%, 85 내지 90%. 90 내지 95%, 95% 또는 그 이상의 N2, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 그 이상의 02, 및 약1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 또는 그 이상의 CO2를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 저산소 조건은 약 90% N2, 약 5% O2, 및 약 5% CO2를 포함한다.
포스트-활성화 배지에서 인큐베이션 후에, 포스트-활성화된 단위 생식성 난모세포는 세척 배지에서 인큐베이션된다. 상이한 구체예에 있어서, 세척 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지이다. 또 다른 구체예에 있어서, 배양 배지는 글로벌 인간 배아 배양 배지와 같이 연속의 배지 교환을 요구하지 않는다. 특정 구체예에 있어서, 세척 배지는 TSA를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 난모세포는 TSA를 포함하는 세척 배지에서 240, 300, 또는 360분 동안 인큐베이션된다.
세척 배지에서 인큐베이션 후에, 포스트-활성화된 단위 생식성 난모세포는 배양 배지로 옮겨진다. 상이한 구체예에 있어서, 배양 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지이다. 또 다른 구체예에 있어서, 배양 배지는 글로벌 인간 배아 배양 배지와 같이 연속의 배지 교환을 요구하지 않는다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 단위 생식성 난모세포는 1, 2, 3, 4, 4 또는 그 이상 일 동안 난할 배지에서 배양될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 난할 배지에서의 배양은 2일 동안이다. 난할 배지에서 배양한 이후에, 난모세포는 1, 2, 3, 4, 4, 또는 그 이상 일 동안 배반포 형성 배지에서 배양된다. 특정 구체예에 있어서, 배반포 형성 배지에서의 배양은 3일 동인이다.
일 구체예에 있어서, 난모세포를 활성화하는 단계는 37 ℃에서 5분동안 활성화 배지에서 인큐베이션하는 단계에 뒤이은 난할 배지에서 세척하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화 배지는 5 μM의 이오노마이신을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 난모세포는 완전한 활성화를 위해 포스트-활성화 배지에서 처리된다. 다양한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 5% CO2/5% O2/90% N2 대기 중 37℃에서 4시간 동안의 난할 배지 중 2 mM 6-DMAP를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 활성화된 난모세포는 세척되고, 및 추가적으로 배양된다. 일 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 6-DMAp 제거 배지에서 세척된다. 일 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 SAGE 난할 배지, 예를 들면 퀸 배지에서 추가적으로 배양된다. 또 다른 구체예에 있어서, 배지, 예를 들면, 3i 배지 (신경기저 배지(Neuro basal medium) 50%, DMEM/F-12 50%, N2 첨가물 1/200 v/v, B27 첨가물 1/100 v/v, 100 mM L-글루타민 1/100 v/v, 0.1M β-ME 1/1000 v/v, SU5402 (FGFR 억제제) 2 μM, PD184352 (ERK 캐스케이드 억제제) 0.8 μM, CHIR99021 (GSK3 억제제) 3 μM) 또는 변형된 3i 배지(PD0325901 (MAPK 억제제) 0.4 μM 포함)는 다능성을 촉진한다. 일 구체예에 있어서, 추가적인 배양은 2일 동안이다. 일 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 리프로그래밍 인자 및/또는 메틸화-변형제를 갖는 배양 배지에서 제공된다. 다양한 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 CARM1 및/또는 Esrrb가 첨가된 G2 배지에서 3일 동안이다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화된 단위 생식성 난모세포는 배반포로 더 배양된다. 다양한 구체예에 있어서, 배반포로의 추가적인 배양, 및 배반포로부터 다능성 줄기 세포(pSCs)의 유도는 투명대(ZP)를 제거하기 위해 배양된 배반포를 산성 타이로드 용액(예를 들면, pH 2.0)으로 처리하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 처리는 몇 초(예를 들면, 1 내지 5) 동안이다. 다양한 구체예에 있어서 ZP의 제거 이후에 HEPES-HTF 배지에서의 세척이 뒤따른다. 다양한 구체예에 있어서, 내세포괴(ICM)의 분리는 배반포의 영양포(trophoblast)를 폐기하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, ICM 세포는 플레이팅 하루 전에 제조된 마우스 배아 피더(MEFs)에 플레이팅된다. 일부 구체예에서, 전 배아는 MEFs 상에서 플레이팅된다. 다양한 구체예에서, PSC 유도 배지는 혈청 대체물(5% SR, Invitrogen), FBS (10%, Hyclone), 플라스마네이트 (5%), bFGF (32 ng/ml), 및 인간 LIF (2000 units/ml, Sigma-Aldrich)로 보충된 녹아웃- DMEM으로 구성된다.
반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포 (pn-hPSC) 주가 본 명세서에 기재된다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 이형접합성 또는 동형접합성 난모세포로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 이형접합성 pn-hPSC 세포주는 민족(ehtnic) 집단에서 대립형질 변인 빈도에 의해 결정된 바와 같은, 민족 집단의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 이상과 면역접합성인 HLA 혈청형을 갖는 HLA 일배체형의 대립형질 변인을 포함한다. 특정 구체예에서, 동형접합성 pn-hPSC 세포주는 일 전핵 난모세포의 단위생식을 이용하여 도출된다. 특정 구체예에서, 동형접합성 pn-hPSC 세포주는 일 전핵 동형접합성 난모세포의 단위생식을 이용하여 도출된다. 다른 구체예에서, 동형접합성 pn-hPSC 세포주는 제2 극체 압출을 포함하는 단위생식을 이용하여 얻어진다. 특정 구체예에서, 동형접합성 pn-hPSC 세포주 민족 집단의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5% 이상과 면역접합성인 HLA 혈청형을 갖는 민족 집단의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5% 이상과 면역접합성인 HLA 혈청형을 갖는 HLA 일배체형을 포함한다. 예를 들면, HLA 일배체형 A*01, B*08, DRB1*03은 백인 인종에서 5% 초과의 빈도로 제시된다. 다른 구체예에서, HLA-혈청형은 HLA-A, HLA-B, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, 및 HLA-DR의 대립형질 변인을 포함한다. 다른 구체예에서, HLA-혈청형은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR의 대립형질 변인을 포함한다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 중기 I (MI) 단계 난모세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 중기 II (MII) 단계 난모세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 공여체 난모세포와 동일하거나 거의 동일한 미토콘드리아 유전체를 포함한다.
다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 정상적인 46 염색체, XX 핵형을 포함한다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 모든 3개의 배아 배엽층을 형성할 수 있다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4), SSEA-3, 종양거절항원 1-81 (Tra-1-81), Tra-1-60, 옥타머 결합 전사 인자-4 (Oct-4), 성 결정 영역 Y-box-2 (Sox-2), nanog, 징크 핑거 단백질-42 (Rex-1/Zfp-42), lefty A, 기형암종-유래 성장 인자 (Tdgf), 텔로미어 반복 결합 인자 (Terf-1), 및 발달 다능성-연관 유전자 2 (Dppa-2)를 포함하는, 하나 이상의 다능성 마커를 발현한다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 열성 치사율을 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 높은 알칼라인 포스파타제 (AP) 및/또는 텔로머라제 활성을 소유한다. 다른 구체예에서, pn-hPSC 세포주는 면역결핍 동물에서 서스펜션에서 배아체 및/또는 면역결핍 동물에서 테라토마를 형성할 수 있다.
또한 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포 (pn-hPSC)의 라이브러리가 본 명세서에 기재된다. 특정 구체예에서, 라이브러리는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20 이상의 pn-hPSC 세포주를 포함한다. 다양한 구체예에서, 라이브러리는 민족 집단의 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상과 면역접합성인HLA 혈청형을 갖는 pn-hPSC 세포주를 포함한다. 예를 들면, HLA 일배체형 A*01, B*08. DRB1*03은 백인 인종에서 5% 초과의 빈도로 나타난다. 다른 구체예에서, HLA-혈청형은 HLA-A, HLA-B, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, 및 HLA-DR의 대립형질 변인(allelic variant)을 포함한다. 다른 구체예에서, HLA-혈청형은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR의 대립형질 변인을 포함한다. 예를 들면, 이것은 HLA-A 혈청형 A1-A3, A9-A11, A23-A26, A28, A29, A30-34, A36, A43, A66, A68, A69, A74 및 A80, HLA-B 혈청형 B5, B7, B8, B12, B13, B14, B15, B16, B17, B18, B21, B22, B27, B35, B37-B72, B75-B78, B81, B*82 B*83, HLA-C 혈청형 CW01-CW08을 포함한다. 주조직접합성 복합체 II (MHCII)는 include HLA-DP 혈청형 DPA1 및 DPB1, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ 혈청형 DQ2-DQ9, HLA-DR 혈청형 DR1-D18을 포함한다.
다른 구체예에서, 라이브러리는the library includes pn-hPSC 세포주를 포함한다 , 그것의 각각이 인간 집단에서 제시된 하나 이상의 MHC 대립형질 에 대해 반접합성 또는 동형접합성이며, 상기 pn-hPSC의 라이브러리의 각 구성원은 라이브러리의 잔류 구성원에 상대적으로 MHC 대립형질의 상이한 세트에 대해 반접합성 또는 동형접합성이다. 추가 구체예에서, 인간 배아 줄기세포의 라이브러리는 인간 집단에서 제시된 모든 MHC 대립형질에 대한 반접합성 또는 동형접합성인 pn-hPSC의 라이브러리를 포함한다. 기재된 방법은 pn-hPSC의 라이브러리를 생성하는데 적용될 수 있으며, 그것의 각각은 인간 집단에서 제시된 하나 이상의 MHC 대립형질에 대해 반접합성 또는 동형접합성이며, pn-hPSC의 상기 라이브러리의 각 구성원은 MHC 대립형질의 상이한 집합에 대해 반접합성 또는 동형접합성이다. 추가 구체예에서, 이 방법들은 인간 집단에서 제시된 반접합성 또는 동형접합성인 pn-hPSC의 라이브러리를 생성한다. 따라서, 본 발명은 또한 그와 같은 방법에 의해 제조된 pn-hPSC의 라이브러리를 제공한다.
또한 “나이프 피펫(knife pipette)”으로 기재된, 특별하게 형상된 탈핵 피펫이 본 명세서에 기재된다. 일 구체에에서, 형상된 탈핵 피펫은 멸균 유리 관을 재-당김에 의해 제조되며, 이후 멸균 유리관은 깨지고, 파이어-폴리싱에 의해 무뎌진 둥근 비드 말단으로 녹여지고, 마이크로포르주에서 접촉 및 재-당김(re-pulling)에 의해 뾰족하게 깎여진다. 다양한 구체예에서, 형상된 탈핵 피펫은 다음을 포함한다: 1) 고형의 뾰족한 미세 팁, 2) 당겨진 비드 말단(pulled bead end)으로 인한 약간 둥근 형상의 가장자리, 및 3) 직경이 약 50 um 보다 큰 중공 튜브 본체.
다양한 구체예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 탈핵 방법이 침입한 분열의 핀칭을 위한 둥근 당겨진 비드 말단 및 분열의 가장자리 근처의 극체의 위치 설정을 통한, 난모세포 조작이 따르는 침입에 의한 난모세포 측면 가장자리에 대해 형상된 탈핵 피펫의 미세 팁을 담그면서, 형상된 탈핵 피펫을 이용하여 실시될 수 있으며, 분열 근처에 위치한 극체는 압출을 위해 압착될 수 있다.
인간 난모세포의 해제 유도 및/또는 분리하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 일 구체에에서, 해제된 및/또는 분리된 인간 난모세포는 단위생식에 이용된다. 다른 구체예에서, 해제된 및/또는 분리된 인간 난모세포는 체세포 핵 이식 (somatic nuclear transfer: SCNT)에 이용된다. 다양한 구체예에서, 난소 과잉자극은 여포 자극 호르몬 (FSH) 유사체에 의한 다중 난자의 생산을 자극하는데 및 고나도트로핀-방출 호르몬 (GnRH) 작용물질/길항물질(agonist/antagonist) 또는 기타 황체형성 호르몬 (LH) 서지 저해제의 사용에 의한 자연배란을 막는데 이용된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 2D 또는 3D 초음파 및 에스트라디올 수준 모니터링에 의한 여포 성숙 추적을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 인간 유모성 고나도트로핀 (hCG) 또는 hCG 유사체를 이용하여, 난소 여포 내에서 인간 난모세포의 인 비보 성숙에 이용한다. 일 구체에에서, 최종 난소 여포 성숙은 hCG 자극에 의해 난모세포 공여체 안에서 발생한다. 다른 구체예에서, 코스팅(coasting)은 OHSS의 위험 (난소 과잉자극 증후군)을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 동난포(antral follicle) 계수를 위한 2D 또는 3D 초음파의 이용을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 제1 극체 압출 (1PBE)에 대한 실시간 비-UV 광 기반 모니터링을 이용하여 hCG 자극 및 인비트로에서 난모세포 성숙을 완성하는 것 없이 인간 난모세포의 분리를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 난모세포 성숙의 비율을 정량화하기 위해 1PBE 비율을 결정하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 단위생식 및/또는 SCNT에 의해 배반포 형성 비율을 강화하기 위해 난모세포 서숙의 비율을 개선하는 것을 포함하며, 이로써, 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC) 생산의 효율을 개선할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 IV 진정, 전신, 또는 자궁경관주위 전달 마취에 의한 경질 접근법을 이용하여 난소여포의 흡입-지원, 초음파-유도 침 흡입술에 의해 다중 성숙 난모세포을 수거를 위한 경질 난자 회수의 이용을 포함한다. 다른 구체예에서, 국소 마취는 이용되지 않는다.
예시적인 구체예들은 참조된 도면들에 도시된다. 본 명세서에 개시된 구체예들 및 도면들은 제한적이기보다 예시적인 것으로 간주되도록 의도된다.
도 1. 난모세포의 탈핵. “나이프 피펫”의 형상은 (B) 홀딩 피펫(holding pipette)에 의해 정지 상태가 유지된 세포의 측면 가장자리를 향하여 접근할 때, (A) 견고하고 뾰족한 미세한 팁을 통해 투명대(zona pellucida)의 효과적인 침투(penetration)를 허용한다. (C) 침투에 뒤이은 틈(fissure)의 "핀칭(pinching)"d을 위해 둥근 당겨진 비드 말단(rounded pulled bead end)을 통한 난모세포 조작 및 (D) 틈의 가장자리에 가까운 극체의 위치설정. 사용자가 나이프 피펫을 보다 쉽게 붙잡기 위한 벌크 구조를 제공하는 더 큰 중공 튜브 본체를 이용하여, (E) 틈 근처에 위치한 극체는 이후 (F) 추출을 위해 압착될 수 있다.
도 2. NT-PSC의 유도. (A) 체세포 핵 이식된 배반포 (B) 투명대 제거 후 플레이팅된(plated) 배아 (C) NT-배아의 초기 결과물(outgrowth) (D) 3 계대 후 형성된 배아 세포 유사 콜로니.
하기 실시예들은 특허 청구된 발명을 예시하기 위해 제공된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 특정 물질들이 언급되는 정도까지 예시의 목적에 불과하며, 발명을 제한하려는 것이 아니다. 당업계의 숙련자는 독창적인 능력의 발휘 없이 및 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 동등한 수단, 조성물들 또는 반응물들을 개발할 수 있다.
실시예 1
단위생식(Parthenogenesis)과 관련된 일반적 과정
단위생식을 위한 중요한 과정은 1) 인간 MII 단계 난모세포의 제조 2) 난모세포의 활성화 3) 반수성체(parthenote)의 생성 4) 배반포 단계까지 추가 인비트로 배양 및 5) 배양된 배반포로부터 인간 다능성 줄기 세포(hPSC)의 유도를 포함한다. 이 방법을 통해 유도된 세포는 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포 (parthenote-derived human pluripotent stem cells: pn-hPSC)이다.
실시예 2
SCNT와 관련된 일반적 과정
체세포 핵 이식(Somatic cell nuclear transfer: SCNT)은 단위생식과 중복되는 기법을 포함하나, 주요한 차이점은 공여체 핵의 수여자 (recipient) 난모세포로의 이식 및 배아 재구축을 포함한다. 더 구체적으로, SCNT는 핵 공여 세포의 제조, 2) 인간 MII 단계 난모세포의 제조, 3) 난모세포의 탈핵, 4) 상기 탈핵된 난모세포로의 체세포 핵 이식, 5) 체세포 핵 이식된 (재구축된) 난자의 활성화, 6) 상기 재구축된 난자의 배반포 단계까지 인 비트로 배양, 및 7) 이들 배아로부터 배아 줄기 세포주의 유도를 포함한다. 이 방법을 통해 유래된 세포는 체세포 핵 이식 인간 다능성 줄기 세포 (NT-hPSC)이다.
실시예 3
성체 섬유아세포를 사용한 핵 공여 세포의 제조
공여 환자의 섬유아세포는 트립신처리법 (trypsinization), 또는 유사한 방법에 의한 단층막으로부터 회수된 개별 세포를 갖는 피부 생검으로부터 성장될 수 있다.
1. 국소 마취하에 피부 또는 다른 조직 생검을 수득한다 (50 mg, 0.5×0.5 cm).
2. PBS로 2번 조직 단편을 세척한다.
3. 100-mm 배양 디쉬에서 조직을 외과용 칼(blade)로 기계적으로 갈고(mince) 갈아진 조직으로부터 PBS를 주의하여 제거한다.
4. 10% FBS, 1% 비필수 아미노산 및 10 ug/ml 페니실린-스트렙토마이신 용액으로 보충된 4.5 ml DMEM, 및 콜라게나제 II형의 500 ul (2000 unit/ml) (Life Technologies)에 조직 펠렛을 재-현탁시킨다.
5. 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓아 둔다.
6. 3분 동안 300×G로 원심분리하고, 10% FBS를 갖는 DMEM에 세포 펠렛을 재-현탁시킨다.
7. 세포를 60-mm 배양 디쉬에 분주하고 뒤이어 10% FBS, 1% 비필수 아미노산 및 10 ug/mL 페닐실린-스트렙토마이신 용액을 포함하는 DMEM에 컨플루언트(confluent) 할 때까지 37 ℃, 5% CO2 및 95% 공기 중에서 배양한다.
8. 세포가 80% 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 초기 결과물(outgrowth)의 ½를 동결보존하고, 잔여 세포를 1:3 비율로 나누고, 이들을 상술된 배지에서 배양한다. 이 과정을 2번 이상 반복하여 SCNT 및 이후의 유전자형판별 분석을 위한 충분한 세포를 수득한다. 세포 배양의 끝에서, 10% DMSO로 보충된 FBS에 잔여 세포를 모두 동결보존한다.
신선하게 제조된 세포 또는 동결보존된 세포가 핵 공여체로 사용될 수 있다.
실시예 4
난구 세포(Cumulus Cell)를 이용한 핵 공여 세포주의 제조
SCNT를 위해, 공여 핵은 하기 기재된 공여체의 난구 세포, 또는 상업적으로 입수가능한 성체 줄기 세포를 포함하는 기타 조직으로부터 수득될 것이다. 핵산은 그 후 하기 실시예 프로토콜을 사용하여 난구 세포로부터 수득될 수 있다.
1. 각 개체로부터 유래된 세포 제제의 약 반이 핵 공여체로서 SCNT를 위해 사용되고, 나머지가 유전자형판별을 위해 스냅-동결(snap-frozen)될 것이다.
2. 상기 난구 세포를 노출(denudation) 과정 동안 1.5 ml 마이크로-원심부리 튜브에 수집한다. Hepes-HTF를 1.5 ml까지 첨가하고 1분 동안 1200 rpm으로 원심분리한다.
3. 상등액을 옮겨 부어 세포 펠렛만을 남기고, 100 ul의 4% PVP 용액 (PVP, MW 36000, Calbiochem, 및 San Diego, Calif.)과 함께 펠렛을 첨가하고 혼합한다. 이들세포는 핵 주입을 위해 이용할 수 있다.
실시예 5
난소 자극 프로토콜 및 난모세포 회수
환자는 7-14일 동안 저-용량 경구피임약으로 예비-처치된다. 경구 피임약을 중지한 이후, 성선자극호르몬(gonadotropin) ((Gonal-F 또는 폴리스팀(Follistim)) 및 (마이크로-용량 루프론(Lupronor) hCG 또는 Menopur))이 투여될 것이다. 투여 개시는 환자 특성 (연령, 3일 FSH, APC)에 기초하고 개별 의사에 의해 결정된다. 난포 성장 및 자궁내막 두께의 경질 초음파 평가는 6일째에 시작되고, 혈청 E2 수준이 8번의 연속적 임상 방문 중 각각 하나에서 측정된다. 그 이후, 초음파검사 확인 및 혈청 E2 수준에 기초하여, 모니터링의 빈도 및 성선자극호르몬의 양을 조정할 수 있다.
hCG 촉발의 일자 (및 그래서 자극의 총 일자)는 여포 크기 및 수, 및 혈청 E2 수준에 기초할 것이다. 루프론(Lupron) 또는 hCG의 투여량은 205 μg 용량으로 투여될 수 있다. 난자 회수는 hCG의 투여 후 36시간 수행된다. 상기 환자는 난자 회수 이후의 날에 경구 피임약을 재개할 것이다.
실시예 6
구체적으로, 난소 활성화
난자 회수는 하기 실시예 과정을 사용해 수행될 수 있다.
1. 20 내지 34살의 나이의 건강한 여성 공여자를 7-14일 동안의 저용량 경구 피임약 후에, 재조합 소낭 자극 호르몬 (follicular stimulating hormone: FSH) (폴리스팀(Follistim), 100-150 단위, Schering-Plough)으로 처리하고, 1일(Day 1)로 시작하는 마이크로-용량 재조합 LH (Lupron 또는 hCG, 250 ug) EMD Serono를 처리한다.
2. 상기 FSH는 일반적으로 100 내지 150 단위로 시작하고 난포형성(folliculogenesis)이 진행됨에 따라 조정될 수 있다.
3. 2개의 주요 여포가 난모세포 성숙을 유도하는 18 mm 직경에 도달하는 경우 단일 용량의 루프론(Lupron) 또는 hCG (250 ug)를 제공한다.
실시예 7
난모세포 수집
난모세포의 수집은 하기 실시예 과정을 이용해 수행될 수 있다.
*1. 퀸 어드벤테이지 수정 배지(Quinn's Advantage Fertilization medium) (SAGE 카탈로그 #1021)를 갖는 50×9 mm 페트리 디쉬 중 흡입된(aspirated) 여포성 체액(fluid)로부터 난구 덩어리를 수집한다.
2. 상기 수집된 난구 덩어리를 37℃. 5% CO2 가습 인큐베이터에서 약 2-3분 동안 상기 난구 세포가 분산될 때까지 히알루로니다제 (40 U/ml)로 처리한다.
3. 스트리퍼(stripper) 말단 (Mid-Atlantic Diagnostic, #MXL3-100 u)을 사용하여 잔여 과립막 세포를 제거한다.
4. 난모세포를 퀸 수정 배지로 2번 세척한다.
5. 윌코 디쉬(Willco-Dish) 유리 페트리 디쉬(50×9 mm)에 미네랄 오일로 덮혀진 소량 50 ul을 제조한다.
실시예 8
난모세포 회수 및 제조
난모세포 회수 및 제조를 녹색광(파장 >500 nm)으로 밝혀진 실험실에서 수행할 것이다.
1. 환자를 루프론(Lupron) 또는 hCG 주입 36시간 후 미다졸람(Midazolam) 5-7.5 mg (Versed, Roche, 및 Nutley. N.J., USA) 및 펜타닐(Fentanyl) 50-75 ug (Abbott Pharmaceutical, Abbott Park, Ill. USA)로 진정시키고 난모세포를 그 후 상기 기재된 초음파 지도를 사용해 회수한다.
2. IVF 배지 (Quinn's IVF 배지, SAGE Biopharma, Bedminster, N.J.) 중 신선하게-분리된 난구-난모세포 복합체 (cumulus-oocyte cell complexs: COCs)를 2시간 동안 5% CO2를 갖는 가습 인큐베이터에서 세척하고 인큐베이트한다.
3. COCs를 히알루로니아제 (100 IU/ml, Sigma, St. Louis, Mo. USA)로 2분 동안 처리하고 작은 구경 마이크로피펫(small bore micropipette) (150 um 직경)으로 벗긴다(denude). 단일 제1 극체를 갖는 벗겨진 난모세포를 중기 II (MII)로 분류하고 SCNT를 위해 사용한다.
실시예 9
체세포 핵 이식
중기 II (MII) 방추사를 Oosight™ 방추 이미징 시스템 (Cambridge Research & Instrumentation, Woburn, Mass. USA)을 사용하여 탈핵을 위해 시각화한다. 이 러한 접근법은 훽스트(Hoechst) 염색 및 UV 광 노출을 방지한다. 난모세포를 5분 동안 0.5 ug/ml 사이토칼라신을 포함하는 HEPES (Cooper Surgical)를 갖는 Quinn's Advantage® 배지에서 전-인큐베이트할 것이다.
난모세포의 탈핵을 탈핵 피펫(20 um의 직경)과 함께 압충격드릴(Piezo Impact drill) (PrimeTech, Tokyo, Japan)을 사용하여 수행할 것이다. 중기 방추사의 제거는 조작 피펫 내의 타원형(bright oval-shaped) 핵 복합체의 존재에 의해 확인될 것이다. 공여체 인간 섬유아세포 (또는 세포의 동등한 기타 유형)가 제조될 것이다. 이들 핵 공여 세포를 탈핵을 위해 사용되는 동일한 시스템을 사용하여 융합하거나 주입시킨다. 모든 과정을 직접적 접촉 및 형광 없이 수행한다.
실시예 10
체세포 핵 이식I : 직접 주입 방법
A) 난모세포의 탈핵
1. 뚜렷한 제1 극체를 가지는 난모세포 (10)의 배치를 사이토칼라신 B (5 ug/ml)를 포함하는 전-평형화된(pre-equilibrated) 배양 배지로 이동시킨다.
2. 상기 난모세포를 마이크로조작 디쉬 상에 준비된 소량의 탈핵 배지(Hepes-HTF+5 ug/ml cytochalasin B, Cooper Surgical)에 옮긴다.
3. 난모세포를 갖는 디쉬를 가열된 단계를 갖는 마이크로조작 시스템에 로딩한다.
4. 난모세포를 Oosight™ 이미징 시스템 (Cambridge Research & Instrumentation. Woburn, Mass. USA)을 사용하여 중기판 2시와 4시 위치에 홀딩하고 방추를 가시화한다.
5. 탈핵 피펫을 투명대 (3시 위치)의 표면에 놓고 PIEZO (PrimeTech, Tokyo, Japan) 펄스를 전달하여 상기 투명대를 따라 구멍(hole)을 제조한다.
6. 투명대를 뚫은 직후, 탈핵 피펫 (under very slight positive pressure)을 충격을 받은 영역으로 진전시킨다.
7. 염색체-방추 복합체를 작은 부피의 세포질과 함께 흡입하여 제거한다.
8. 모든 난모세포에 대한 과정을 반복한다.
9. 상기 탈핵된 난모세포를 배양 배지 (난할 배지, Cooper Surgical)에서 완전히 세척하여 소량의 사이토칼라신 B를 제거하고, 핵 주입 이전에 10 내지 15분 동안 신선한 배양 배지에서 배양한다.
B) 핵 이식
NT 이전에, 37℃에서 30초 동안 0.25% (v/v) 트립신-EDTA (Life Technologies)로 트립신처리하여 단층막으로부터 개별 배반포 세포 (또는 핵 공여 세포의 다른 유형)를 회수하고 이후 NT를 위해 사용하였다. 공여 섬유아세포 소량을 퀸 수정 배지와 천천히 혼합한다. 공여 핵은 벗겨진 세포, 및/또는 핵 이식 이전에 후생적 변형을 받은 세포로부터 유래될 수 있다.
1. 핵 공여 세포 (난구(cumulus) 세포, 피부 배반포 세포)를 Hepes-HTF (SAGE Biopharma)에서 세척하고, 원심분리하고, 4% PVP 용액에서 재구축한다.
2. 여러 펄스를 인가하고 PIEZO 시스템을 이용한 격렬한 피펫팅(pippetting)으로 핵을 분리시킨다.
3. 상기 핵을 PIEZO 시스템을 이용하여 탈핵된 난모세포의 난세포질로 주입한다.
4. 상기 주입된 난모세포를 신선한 배양 배지로 제거한다; 단백질 주입 이전 30분 동안 인큐베이트한다.
5. 주입된 난모세포를 조작 디쉬로 제거하고 중심체 코어 단백질의 혼합물을 주입한다 (인간 오로라 B 키나아제+hSET+NuMA). 모든 단백질은 CBI's lab에서 구입가능하다.
6. 상기 단백질을 난자 당 약 4 pL 주입한다.
7. 상기 주입된 난모세포를 활성화 이전에 30분 동안 배양 배지에서 제거하고 배양한다.
C) 재구축된 난자의 활성화
1. 활성화 배지 (5 uM 이오노마이신)에서 37℃ 5분 동안 NT 난자를 처리하고 난할 배지에서 이들을 완전히 세척한다.
2. 포스트-활성화 배지 (5 nM 트리코스타틴 A (TSA)를 포함하는 난할 배지 중 2 mM 6-DMAP)에서 4시간 동안 상기 난자를 재-처리한다.
3. 상기 활성화된 난자를 6-DMAP 제거 배지에서 세척하고 5 nM TSA를 포함하는 배양 배지 (난할 배지)에서 6시간 동안 인큐베이트하고 이들을 정상 배양 배지로 옮긴다.
4. 상기 활성화된 난자를 처음 2일 동안 SAGE 난할 배지에서, 다음 3일 동안 SAGE 배반포 배지에서 배양한다.
실시예 11
난모세포의 탈핵을 위한 개선된 기법
난모세포의 탈핵을 위한 일부 주요 기법은 전술한 압전기 드릴 피어싱(piercing) 및 흡입, 또는 중공 바늘 점 천자 및 방출을 포함한다. 또 다른 잘-알려진 기법은 큰 구경 흡입 홀딩 피펫 (large bore suction holding pipette) 및 미세한 팁 피펫을 통한 난모세포의 측면 가장자리 천자(lateral edge puncture)를 사용하고, 및 세포막의 일부를 전단(shearing)하는 "젓가락(chopstick)" 방법을 포함한다. 전단 운동을 통해, 상기 미세한 팁 피펫은 천자 구멍(puncture tear)과 추출을 위한 미세한 팁 피펫 사이에 극체의 격리(sequestration)를 통해 유전 물질의 추출을 가능하게 한다. 이들 기법의 단점은 조작된 난모세포에 위치된 기계적 응력이고, 이는 약해진 세포 생존력 및 비효율적 세포주 생성을 초래할 수 있다.
특별하게 설계된 탈핵 피펫을 사용한 탈핵 기법이 본 명세서에 기재된다. 이 “나이프 피펫 (knife pipette)”은 멸균 유리 튜브를 당기어 제조될 수 있고, 이는 그 후 가열-연단(fire-polishing)에 의해 무딘 둥근 비드 말단(blunted round bead end)으로 부서지고 용융된다. 상기 피펫의 무딘 둥근 비드 말단은 마이크로포르주(microforge)에 접촉하고 다시-당기어 날카롭게 되었다. 이 방법은 다양한 특징을 포함하는 "나이트 피펫" 형성을 초래한다: 1) 견고하고 뾰족한 미세 팁 (solid pointed fine tip), 2) 당겨진 비드 말단(pulled bead end)으로부터 야기된 약간 둥근 형상 가장자리(slightly rounded contour edge), 및 3) 약 50 um 직경의 더 큰 중공 튜브 본체(larger hollow tube body). 인간 성숙 난모세포를 정지되게 홀딩하는데 사용되는 가열-연마된 홀딩 피펫 (fire-polished holding pipette) (외부 직경: 120-150 um; 내부 직경: 20-30 um)과 조합되어, 탈핵을 위한 우수한 마이크로조작이 달성될 수 있다.
예를 들면, 도 1에 보이는 바와 같이, “나이프 피펫”의 형상은 (A) 견고하고 뾰족한 미세 팁을 통해 투명대의 효과적인 침투를 가능하게 하고, 상기 팁이 세포의 반대로 진전되는 경우 (B) 세포의 측면 가장자리가 홀딩 피펫에 의해 정지된 상태로 홀딩된다. (C) 침투에 뒤이어 틈의 "핀칭(pinching)"에 대하여 둥근 당겨진 비드 말단(rounded pulled bead end)을 통한 난모세포의 조작 및 (D) 상기 틈의 가장자리 근처 극체의 위치 설정(positioning)이 일어난다. 사용자가 상기 나이프 피펫을 더 용이하게 잡기 위한 벌크 구조체를 제공하는 더 큰 중공 튜브 본체(larger hollow tube body)로, (E) 틈(fissure) 근처에 위치된 극체는 그 후 추출을 위해 (F) 압착될 수 있다. 단일 핵 제거 피펫과 이들 특징의 조합은 단일 장치로 신속하게 수행될 단계를 가능하게 하여, 상기 난모세포의 물리적 조작을 줄이고 세포막 틈의 크기를 줄인다. 탈핵은 그 후 Oosight™ 이미징 시스템 (poloscopic microscopy)에 의해 확인될 수 있다.
실시예 12
체세포 핵 이식II:체세포 융합 방법
A) 난모세포의 탈핵 , 상기와 같음.
B) 위란강 ( Perivitellin Space)에서의 체세포의 이식
1. 주입 피펫 (12 um의 직경)에서 한 줄로 3-4개의 공여 세포를 집어 올린다. 이 과정 동안, 주의가 원형질막을 방해하지 않도록 수행되어야 한다.
2. 홀딩 피펫으로 난모세포를 잡는다.
3. 투명대의 표면으로 홀딩 피펫을 위치시키고 PIEZO 펄스를 인가하여 상기 투명대를 통하여 구멍을 만든다.
4. 난자세포막을 부수지 않고 상기 난모세포로 공여 세포를 포함하는 주입 피펫을 진전시키고 위란강에 하나의 핵 공여 세포를 난자세포막에 근접하게 접촉하는 방식으로 삽입한다.
5. 상기 피펫을 처음에는 상대적으로 신속하게, 그 후 느리고 부드럽게 후퇴시킨다.
6. 난모세포의 전체 군에 대한 이 과정을 완료하고 이들을 인큐베이터에 되돌린다.
C) 난모세포-체세포 융합
전기세포융합을 0.5 mm 전기융합 챔버를 이용한 BTX 200 Electro Cell Manipulator™ (BTX Harvard Apparatus, Holliston, Mass. USA)을 갖는 전기융합 버퍼 (0.3M D-소르비톨, 0.1 mM 칼슘 아세테이트, 0.5 mM 마그네슘 아세테이트, 0.1 mM HEPES, 0.5 mg/ml 폴리비닐피롤리돈, 50 uM D-myo-2,4,S, 이노시톨 트리포스페이트)에서 수행할 것이다.
1. 전기세포융합 버퍼로 덮인 전기세포융합 챔버의 2개의 전선 사이에 3 내지 4개의 난모세포-체세포를 두 개의 행으로 정렬시킨다.
2. 160 Kev/Cm의 DC 펄스를 5 μsec동안 인가시킨다. 또는 대안적으로, 20 μsec와 같은 더 긴 기간 인가시킬 수 있다.
3. 상기 재구축된 난모세포를 완전히 배아 배양 배지에서 세척하고 이들을 글로벌 배지(Global medium)(0.3% 인간 혈청 알부민+Global 배지)에서 4-웰 디쉬(10 cells/well)에서 배양한다.
4. 초기 펄스 후 30분에 융합을 확인한다. 융합되지 않은 두 개의 행에 대하여 한 번 이상 반복한다.
D) 재구축된 난자의 활성화
체세포 핵 이식 I에서와 동일한 방법을 이용해 재구축된 난모세포를 활성화한다.
실시예 13
센다이 바이러스-기반 난모세포-체세포 융합
난모세포-체세포 융합을 달성하기 위한 개선된 기법이 본 명세서에 기재되고, 이는 음성 센스, 단일-가닥 RNA 센다이 바이러스 (SeV)로부터의 재조합 단백질 외피의 적용에 의존한다. SeV 바이러스는 진핵생물의 융합을 위한 그의 능력이 알려져 있고, 유전 물질이 없는 재조합 SeV 표면 외피 단백질 (SeV-E)이 감염성 또는 증식성 능력의 위험 없이 적용될 수 있다.
난모세포-체세포 융합을 위한 SeV 적용은 제조자 프로토콜(GenomONE-CF EX, Ishihara Sangyo Kaisha, Cat #ISK-CF001-EX)에 따른 현탁 버퍼(suspension buffer)에 동결-건조된 SeV-E를 제조하여 시작한다. 현탁 버퍼 중 SeV-E가 그 후 이전에 20× 희석된 융합 버퍼로 첨가된다. 조합된 혼합물 버퍼 중 SeV-E는 그 후 공여 핵 체세포 및 수용체 탈핵된 난모세포를 포함하는 피펫 팁 사이에 추가 위치된 마이크로필렛을 통해 첨가된다. 상기 세포는 벗겨진(denuded) 세포, 및/또는 핵 이식 이전에 후생적 변형을 받은 세포로부터 유래될 수 있다. 공여 핵 체세포 및 수용체 탈핵된 난모세포의 세포막 표면의 미세액적을 통한 혼합물 버퍼 중 SeV-E로의 코팅은 체세포 융합이 전기융합의 사용 없이 발생하도록 한다. 수용체 난모세포에 대한 물리적 및 전기생리적 응력의 감소가 세포 생존성 및 효율적 세포주 생성을 증진시킨다.
실시예 14
센다이 바이러스-기반 체세포 융합을 이용한 개선된 기법
A) 난모세포의 탈핵
MII 난자 방추 복합체를 실시예 11 및 다른 곳 (도 1)에 기재된 "나이프 피펫" 방법을 이용하여 제거한다. Oosight™ (Spindle view)을 이 과정을 통하여 사용하고 UV 광에 난모세포의 노출을 제거하였다. 매 난모세포에서 제1 극체를 제거하는 것은 중요하고, 그렇지 않으면, 이는 융합 과정 동안에 난모세포와 융합될 수 있다.
B) 위란강에서 체세포의 이식
1. 주입 피펫 (12 um의 직경)에서 한 줄로 3-4개의 공여 세포를 집어 올린다. 이 과정 동안, 원형질막을 방해하지 않도록 주의해서 수행되어야 한다.
2. 상기 공여 세포를 소량의 상기 센다이 바이러스 외피 단백질에서 방출하고(expel) 이들을 각각의 세포 사이에 짧은 거리 (4-5 세포 길이)로 다시 집어 올린다.
3. 홀딩 피펫으로 난모세포를 잡는다.
4. 난자세포막을 부수지 않고 상기 난모세포로 공여 세포를 포함하는 주입 피펫을 전진시키고 위란강에 하나의 핵 공여 세포를 난자세포막에 근접하게 접촉하는 방식으로 삽입한다.
5. 상기 피펫을 난자세포막을 건드리지 않고 공여 세포 접촉 없이 천천히 후퇴시킨다.
6. 난모세포의 전체 군에 대한 이 과정을 완료하고 이들을 인큐베이터에 되돌린다.
7. 공여 세포 삽입 후 10분 상기 융합을 점검한다. 상기 융합 과정은 상대적으로 신속하게 일어나고, 따라서 상기 융합이 세포 융합 이후 15분 이내에 일어나지 않는다면 상기 과정을 반복한다.
D) 활성화 및 재구축된 난자의 배양
1. 활성화 배지 (5 uM 이오노마이신)에서 37℃ 5분 동안 NT 난자를 처리하고 난할 배지에서 이들을 완전히 세척한다.
2. 포스트-활성화 배지 (난할 배지 중 2 mM 6-DMAP)에서 상기 난자를 5% CO2/5% N2/90% N2 대기에서 37℃에서 4시간 동안 재-처리한다.
실시예 15
재구축된 난모세포 활성화를 위한 개선된 기법
현재, NT의 다양한 보고는, 난모세포 발생이 모계 RNA-기반 전사로부터 숙주 유전제 활성화로 전환됨에 따라, 효율적인 세포주 생성을 방지하는 제한적인 단계인 8-세포 단계에서 재구축된 핵 이식 난포세포 (배아)의 활성화를 제안한다. 재구축된 난모세포의 2%만이 이 중요한 한계점을 넘으나, 어떤 생물학적 인자가 게놈 활성화를 증진시킬 수 있는지는 현재 알려지지 않았다.
정자 머리에 존재하는 인자 구체적으로, 상기 중간-연결부, 및 정자 꼬리와 같은 정자 인자가 NT 동안 재구축된 난모세포의 유전체 활성화를 증진시키기 위해 적용될 수 있다는 알려지지 않은 발견이 본 명세서에 기재된다. 특정 이론에 구속되지 않고, 중심소체, 유사분열 방추 형성에 요구되는 중요한 복합체가 MII 단계 난모세포에 없다. 재구축된 난모세포 중 중심소체의 부재가 NT 동안 게놈 활성화에 대한 주요한 한계를 설명할 수 있다. 그러나 이들 단백질은 정자 머리와 인간 정자의 중간-연결 부분 사이에 연결부 내에 위치하는 것으로 알려져 있고, 활성화 과정 동안 정자 인자의 추가는 유사분열 분배에 필요한 생물학적 기구를 제공하여 게놈 활성화를 증진시킬 수 있다.
실시예 16
난모세포 활성화를 위한 정자 인자(Sperm Factor)의 제조
더 구체적으로, 정자 인자는 정자 세포의 내부 또는 외부에 존재하는 세포 단백질을 사정된 정자를 세제 및 기계적 블렌딩으로 처리하여 분리하고, 그 후 전체 정자 추출물을 DNAase I 및 RNAase로 처리하여 유전적 물질 오염물을 제거하여 수득될 수 있다. 최종 단계는 조추출물을 버퍼에서 세척하고 원심분리(2시간 동안 20,000 g)로 농축시키는 것이다.
1. 신선한 사정된 인간 정자를 수집하고, 10분 동안 900 g로 원심분리하여 정장(seminal plasma)을 제거한다.
2. 상기 펠렛을 5 mg/mL 소혈청 알부민을 포함하는 정자-TALP에 재현탁하고, 동일한 세팅으로 원심분리한다.
3. 상등액을 제거하고 정자 펠렛을 핵 분리 배지((NIM: 125 mM KCl, 2.6 mM NaCl, 7.8 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 3.0 mM EDTA disodium salt; pH 7.45 (Kuretake et al., 1996))에서 20×108 정자/mL의 최종 농도까지 재현탁하고 원심분리하여 Sperm-TALP를 제거한다.
4. 상기 펠렛을 1 mM 디티오트레이톨, 100 mM 류펩틴, 100 mM 안티파인, 및 100 mg/mL 소이빈 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor)를 포함하는 NIM으로 동일한 부피로 재현탁시킨다.
5. 그 후 상기 상등액에 4개의 주기의 동결 (액체 N2에서 주기당 5분) 및 해동 (15 ℃에서 주기당 5분.)을 수행하고, 그 후 정자는 2℃ 에서 50분 동안 20,000×로 펠렛팅된다.
6. 결과 상등액을 주의하여 제거하고, 적정하고, 사용할 때까지 -80 ℃에서 유지한다.
인간 정자 인자를 그 후 기재된 주입 방법을 이용하여 상기 재구축된 난자로 주입한다. 약 24시간 후에, 난모세포는 난할 배지로 전환된다. 추가적인 24시간 후에, 난모세포를 G2 배양 배지로 이동시킨다. 이 접근법을 이용해, 본 발명자는 성공적으로 재구축된 난모세포 활성화의 40-80% 성공률까지 달성할 수 있고, 성공적 NT를 위한 이전에 힘든 장애물을 사실상 제거할 수 있다.
실시예 17
*다능성 줄기 세포주 확립을 위한 개선된 기법
배양된 배반포로부터 다능성 줄기 세포를 확립하기 위한 일반적인 기법이 지난 10년간 유의하게 발전된 반면, NT에 대한 성공적 적용은 아직 달성되지 않았다. 임의의 특정 이론에 의해 얽매이는 것 없이, 하나 이상의 유의한 제한은 공여체 핵의 후생적 상태인 것으로 나타난다. 특히,성인 핵의 메틸화 상태, 또는 기타 후생적 인자는 수용자 난모세포의 배아 발달 과정으로 전달될 경우 효과적인 리프로그래밍을 막을 수 있다. 이와 관련하여, NT 이전에 배아 메틸화 상태에 대하여, 공여체 세포 및 그것의 핵의 변형이 NT-hPSC 세포주의 생성에서 장애물을 회피할 기회를 제시할 수 있다.
두 가지 접근법이 제안된다. 첫 번째 접근법은 NT 이전에 핵 공여체 세포로 전달된 리프로그래밍 인자의 이용을 포함한다. 리프로그래밍 인자의 예는 옥타머 결합 전사 인자-4 (Oct-4), 성 결정 영역 Y-box-2 (Sox-2), 크루펠-유사 인자(KLF-4), c-myc, 및 nanog를 포함한다. 그러한 리프로그래밍 인자는 이전에 성인 체세포로부터 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 생성에서 이용되어 왔고, 그로써, 보다 원시적 발달 상태에 대하여 핵 상태를 변경하는 그들의 잠재력을 입증하였다. 핵으로의 리프로그래밍 인자의 접근성이 표적 세포에서 리프로그래밍 효과의 효율을 강화할 수 있기 때문에, 고아 핵 수용체 에스트로겐 관련 수용체 β (Esrrb)와 같은, 다른 보다 최근에 기술된 리프로그래밍 인자가 유사하게 적용될 수 있다. 같은 방식으로, MyoD와 같은, 다른 초기 배아 전사 인자의 전사촉진(transactivation) 도메인은 동일한 효과를 얻기 위해 리프로그래밍 인자와 함께 융합될 수 있다 (예를 들어, Oct4-MyoD 융합 단백질).
두 번째 접근법은 NT 이전에 공여체 핵의 메틸화 상태를 변화시키는 메틸화-변형제에 의존하는 것이다. 이 접근법을 이용하여, 단백질 아르기닌 메틸-트랜스퍼라제 (PRMT1) 및 공활성인자-연관 아르기닌 메틸트랜스퍼라제 1 (CARM1/PRMT4)와 같은 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 메틸화 변화에 관여하는 것으로 알려진 공-활성인자 연관 단백질은 NT 이전에 공여체 핵 공여체 세포에 전달될 수 있다. 이 메틸-변형 단백질의 적용은 NT-hPSC 세포주 생성을 허용하는 후생적 변형을 생성하는 작용기전을 제공한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명가들은 활성화되고, 재구축된 난모세포로부터 거의 30% 효율로 NT-hPSC를 재현성 있게 생성하기 위해 7× 아르기닌 (7R)-세포-투과 펩티드 (CPP)와 접합된, 2개의 재조합 단백질, Esrrb 및 CARM1을 적용하였다. 인간 짧은 연쇄 반복 (short tandem-repeat: STR) 프로브를 이용하는 분자 DNA 지문분석은 핵 공여체와 동일한 또는 거의 동일한 특성을 소유하는 결과 NT-hPSC 세포주를 확인하였다. 다양한 적용에서, 다능성을 지지하는 것으로 알려진 배양 상태를 적용하는 것이 유리하다. 이것은 예를 들면, 3i 배지 (Neuro basal medium 50%, DMEM/F-12 50%, N2 보충제 1/200 v/v, B27 보충제 1/100 v/v, 100 mM L-글루타민 1/100 v/v, 0.1M β-ME 1/1000 v/v, SU5402 (FGFR 저해제) 2 μM, PD184352 (ERK 캐스캐이드 저해제) 0.8 μM, CHIR99021 (GSK3 저해제) 3 μM)의 적용, 또는 변형된 3i 배지 (PD0325901 (MAPK 저해제) 0.4 μM 포함)를 포함한다.
임의의 특정 이론에 제한됨이 없이, Esrrb 및 CARM1의 적용은 다능성 확립 및 유지에 관여하는 핵심 전사 인자와의 상호작용을 이용한다는 것을 시사한다. 예를 들면, Esrrb는 미분화된 상태의 유지에 중요한 역할을 하고, 정자 세포 및 배아에서 전사 인자로서 Oct-4 및 nanog 유전자의 발현을 조절한다. CARM1은 methylates다양한 전사 인자의 조절을 통해 많은 유전자들의 발현을 조절하는 것으로 알려진 H3 아르기닌 잔기 17 (H3R17) 및 R26을 메틸화한다. CPP-Esrrb 및 CPP-CARM1의 처리가 성인 줄기 세포의 Oct-4, Sox-2 및 nanog의 발현을 상향조절한다는 것이 보고되었다. 각각의 경우에, 세포막을 통한 침투, 및 배양 배지로의 단순 첨가 후 핵 입장이 다능성 마커 발현에 기여하는 것으로 보였다. 또한, 배양 배지에서 CPP-Esrrb and CPP-CARM1은 Oct4의 발현을 증가시킬 수 있다. 이로써, 이러한 상호작용은 유리화동결된(vitrified/warmed) 마우스 배아 및 복제된 인간 배아로부터 유래된 배반포의 세포 수를 돕는 것으로 보인다.
NT-hPSC 세포주 생성에서 이 획기적인 업적 달성은 NT 이전에 공여체 핵의 변형이 리프로그래밍 인자 및/또는 메틸화-변형제를 이용하여 성공적인 NT-hPSC 세포주 생성에 대한 핵심 단계라는 개념의 검증을 입증한다.
실시예 18
다능성 줄기세포주를 확립하기 위한 개선된 기법을 이용한 결과
A) 난모세포의 탈핵
실시예 11, 14 및 그외의 부분(도 1)에 기재된 방법에 따라 “knife pipette”을 이용하여 MII 단계 난자의 방추 복합체(spindle complex)를 제거한다.
B) 위란강(Perivitellin Space)에서 체세포의 이동
실시예 14 및 그외의 부분에 기재된 바와 같이 체세포 공여 핵을 이동시킨다.
D) 재구축된 난자의 활성화 및 배양
1. 활성화 배지에서 NT 난자를 5분간 37℃에서 처리(5 uM 이오노마이신)하고 난할 배지(cleavage medium)에서 완전히 세척한다.
2. 5% CO2/5% N2/90% N2의 대기 중 4시간 동안 37℃에서 활성화 후 배지(post-activation medium: 난할 배지 중 2 mM 6-DMAP)에서 난자를 재-처리한다.
3. 6-DMAP 불포함 배지에서 활성화된 난자를 세척하고 SAGE 난할 배지에서 활성화된 난자를 처음 2일간 배양 후 뒤이어 3일간 CARM1 및/또는 Esrrb가 보충된(각 2 μg/ml) G2 배지에서 배양한다.
E) 다능성 줄기 세포 유도
1. 배양된 배반포를 산성 타이로드 용액 (pH 2.0)으로 수 초간 처리하여 투명대(ZP)를 제거한다. ZP의 제거 후, 배아를 Hepes-HTF 배지에서 격렬하게 세척하여 미량의 Tyrode 용액까지도 제거한다.
2. ICM이 확인될 경우, 레이저-보조 배반포 절제 시스템(Hamilton-Thorne Inc.)을 이용하여 내세포괴(ICM)를 분리한다. 배반포의 잔여 부분(영양막)을 폐기하여 배반포가 더 이상 온전하지 않다는 것을 확인한다.
3. 플레이팅 1일 전 준비된 MEF 위에 ICM을 플레이팅한다. 그러나, 복제된 배반포가 구별할 수 없는 ICM을 가질 경우 전체 배아를 플레이팅한다. hPSC 유도 배지는 혈청 대체물(serum replacement) (5% SR, Invitrogen), FBS (10%, Hyclone), plasmamate (5%), bFGF (32 ng/ml), 및 human LIF (2000 units/mI, Sigma-Aldrich)가 보충된 넉아웃-DMEM으로 이루어진다.
4. 동일 배지에서 3일 동안 변화 없이 ICM을 배양한다.
5. 4일 차에 배지의 약 ⅓을 교체한다.
6. 6일 차부터 격일로 배지의 ½을 교체한다.
7. 플레이팅 후 7일 이내에 최초 결과물(outgrowth)이 확인된다.
8. 12일 차 이전에 콜로니를 확장하고 동결보존한다.
기술된 바와 같이, 통상의 기법을 이용하여 재구축된 난모세포 중 2% 이하만이 8-세포 한계점을 넘어, 배반포 형성 유도의 실패를 통해 NT-hPSC 생성을 효과적으로 제한한다. 그러나, 본 명세서에 기술된 기법을 이용하여, 본 발명자는 CARM 및 Esrrb과 같은 메틸화 변형제를 이용하여 이 장애를 제거하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 미처리 재구축 난모세포는 16개의 시료에서 초기 배반포 형성으로 진행하지 않았다. 현존 보고와 일치하게도, 그와 같은 난모세포의 대다수가 4-세포 및 8-세포 단계를 넘어 발달하는 것에 실패한다. 대조적으로, 9 CARM-처리 재구축 난모세포는 47개의 시료로부터 초기 배반포 단계에 도달할 수 있었다. 현저하게도, 이들 CARM-처리 재구축 난모세포 중 거의 ⅔가 추가로 확장하는 배반포를 형성할 수 있었다. 유사하게, Esrrb-처리 재구축 난모세포는 6개 시료로부터 최초 배반포를 형성할 수 있었고, 확장하는 배반포를 형성하지 않았다. 두 경우, CARM 및/또는 Esrrb 처리는 분명히 대조군에 비해 8-세포 단계를 넘어 재구축된 난모세포의 발달을 가능하게 하여, NT-hPSC 세포의 생성을 위해 이전에는 대처할 수 없었던 장벽을 제거한다 (표 1).
SCNT 배아 배양에 대한 CARM 및 Esrrb 단백질의 효과
처리 No. Oocyte 2-cell 4-cell 8-cell norular Early Blast Exp.Blast
미처리 16 15 14 3 1 0 0
CARM 47 43 37 28 16 9 6
Esrrb 6 6 6 6 3 3 0
NT-hPSC가 분리되고 배양될 수 있는 배반포를 형성하는 세포의 능력을 입증하기 위하여, 재구축된 난모세포를 추가로 배양하고, 마우스 배아 피더층 (MEF)에서 기술된 바와 같이 플레이팅하고, 여기서 초기 결과물이 관찰되었다. 추가의 배양 후, 내세포괴(ICM) 세포가 영양외배엽으로부터 분리되고 최초 계대에서 생존할 수 있었다. 도 2에서, (B) 투명대의 제거 후 플레이팅 된 (A) 체세포 핵이식 배반포 가 나타난다. NT-배아의 초기 결과물이 관찰되었으므로 (C) 그와 같은 세포는 생존할 수 있었다. ICM 세포의 분리는 3계대 후 형성된 배아 세포 유사 콜로니 (D)를 제공하였다. 적어도 CARM-처리의 경우, 배반포로부터 분리된 세포가 3계대를 초과하여 생존함으로써 NT-hPSC 세포주의 성공적인 발생을 입증하였다 (표 2).
NT-hPSC 세포 유도에 대한 CARM 단백질의 효과
처리 플레이팅 초기 결과물 계대 1 ≥3 계대
CARM 7 2 2 1
Esrrb 3 0 0 0
실시예 19난모세포의 단위생식
단위생식은 hPSC 세포를 발생시키는데 이용될 수 있었던 제2의 구별되는 접근법이다. 본 명세서에 반수체-유도 hPSC (parthenote-derived hPSC: pn-hPSC)로 기술된 단위생식을 통한 hPSC 세포의 생산은, 공여자의 난모세포와 유전적으로 동일하고 난자를 생산하는 여성에 있어서 hPSC 세포를 발생시키기 위한 방법을 제공한다. 또한, 단위생식은 부계의 기여를 포함하지 않으므로, 부계의 기여를 이용해 발생된 hSPC 세포에 비해 pn-hPSC의 HLA 복잡성이 실질적으로 감소된다. pn-hPSC은 집단의 상당 부분에 의해 광범위한 적합성을 위해 조작될 수 있으므로, 정확한 유전적 조직 매칭의 결여에도 불구하고, pn-hPSC 세포의 감소된 HLA 복잡성은 조직 적합성 문제를 매우 감소시킨다. 예를 들면, 높은 정도의 HLA 다형성이 존재하더라도 그것은 U.S. 백인 민족 내에 존재하는 약 200개의 공통 HLA 일배체에 불과하다. 공통 일배체에 대해 선택된 겨우 10개의 HLA 동형접합 hPSC 세포주 패널이, 영국인 수여자의 거의 40%에 맞는 완전한 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR을 제공하고 거의 65%의 유익한 매칭을 제공할 수 있었다. 이와 같은 광벙위한 집단에 의한 면역적합성은 이식 재료의 재생가능한 원천으로 hPSC 세포 은행의 가능성을 창출한다. 필수적으로, 광범위한 조직 적합성을 갖는 줄기세포 은행 내의 hPSC 세포주의 자가-재생 능력은 새로운 난모세포의 지속적인 공급을 위한 요구를 감소시킬 것이다.
실시예 20
단위생식적 활성화에 대한 가변적 접근법:pn - hPSC 세포주 특성
전술된 과정을 통해 수득된 일부 MII 단계 난자가 단위생식성 배아 세포주를 생성하는데 이용될 수 있다. pn-HPSC의 생성을 위해 온전한 난모세포를 체세포 핵 이식 I 에서 기술된 동일한 절차를 이용하여 활성화하고 배양하였다.
난모세포 활성화 및 포스트-활성화 기법에서 차이가 인간 단위생식의 기존의 보고가 결과로 얻은 pn-hPSC 세포주의 면역학적 특징을 정의하는 유전적 요소에 직접적 영향을 갖는다는 것을 입증한다는 것이 고려하는 것이 중요하다. 예를 들면, 2개의 특이적 접근법은 난모세포 공여체, 또는 집단의 상당한 부분과 조직접합적인 동형접합성 pn-hPSC와 전적으로 HLA 매칭되는 이형접합성 pn-hPSC의 생성이다. 단위생식이 부계 기여의 제거를 통해 pn-hPSC 세포주에서 유전적 변이를 감소시킬 수 있는 반면, 동형접합성 hPSC 생성은 추가적으로 대립형질 변이의 일 공급원을 제거 및 광범위한 범위의 개체와 조직접합성 세포를 제공함으로써 HLA 일배체형의 생성을 통해 유전적 이질성을 감소시킨다.
실시예 21
단위생식 I:이형접합 pn - hPSC의 생성
전술된 바와 같이, 난모세포 활성화를 위한 통상적인 방법은 정자가 들어감으로써 정상적으로 유발되는 칼슘-변경 효과를 모방하는 것이다. 일례로, 이형접합 HLA pn-hPSC 세포주가 난모세포 활성화를 위한 이오노마이신의 적용 및 뒤이은 푸로마이신 유사체 6-DMAP (6-aimtheylamino-purine)의 첨가에 의해 생성될 수 있고, 이는 가역적으로 히스톤 H1 키나아제의 활성화를 억제함으로써 자발적인 난핵포 붕괴를 방지한다.
이오노마이신 및 6-DMAP의 순차적인 첨가가 우선 칼슘 흐름을 개시하여, 단백질 인산화의 억제를 유도하고, 이 과정은 감수분열의 완료없이 전핵 형성을 유도한다. 기타 접근법은 난모세포의 전기적 활성화 및 뒤이은 ionomycin, 및 6-DMAP의 첨가에 의존한다. 그러나, 이들 기법에 공통적인 전핵 형성을 위해 6-DMAP의 첨가는 제2 극체의 방출을 방지하고 2배체 세포의 생성을 유도한다. 이것은 정상적으로는 초기 배발생동안 키아스마타의 형성(부계 및 모계 게놈 재조합)으로 인한 동형접합 hPSC 세포주의 생성을 가능하게 하지 않는다. 따라서, 첫 감수분열 이후, 남아있는 난모세포 핵은 모계 및 부계의 게놈을 모두 소유한 이형접합성이다.
보다 구체적으로, 이형접합 pn-hPSC 세포주의 생성을 위한 난모세포의 단위생식은 하기 과정을 통해 수득될 수 있다:
A) 난모세포의 회수(Retrieval) 및 준비
1. 난구-난모세포 복합체 (COC)를 히알루로니다제(100 IU/ml, Sigma, St. Louis, Mo. USA)로 2분간 처리하고 작은 구경 마이크로피펫 (직경 150 um)으로 벗긴다. 배주(germinal vesicle: GV)를 갖거나 제1 극체가 없는 벗겨진 난모세포는 사용되지 않는다. 단일의 제1 극체를 갖는 벗겨진 난모세포를 중기 II(MII) 난모세포로 분류한다.
대안적으로, COC를 SynVitro Hyadase로 처리하여 난구세포를 제거할 수 있고, 그 후 파라핀 오버레이(Paraffin overlay)를 갖는 IVF 배지로 30분 동안 인큐베이션을 수행한다.
B) 난모세포의 활성화
1. 활성화 배지에서 MII 난모세포를 5분간 37 ℃에서 처리(5 uM ionomycin)하고 난할 배지에서 완전히 세척한다.
2. 4시간 동안 활성화 후 배지(5 nM 트리코스타틴 A (TSA) 함유 난할 배지 중 1-2 mM 6-DMAP)에서 난자를 재-처리한다.
3. 6-DMAP 불포함 배지에서 활성화된 난자를 세척하고 정상 배양 배지로 이동시키기 전 6시간 동안 5 nM TSA를 함유하는 난할 배지에서 인큐베이션한다.
4. SAGE 난할 배지에서 처음 2일간 활성화된 난자를 배양한 후 뒤이은 3일간 SAGE 배반포 배지에서 배양한다.
대안적으로, 5분 동안 5 uM 이오노마이신 및 4시간 동안 1-2 mM 6-DMAP에의 연속 노출, 조심스러운 세척 및 파라핀 오버레이를 갖는 신선한 IVF 배지에서의 배양 후, 파라핀 오버레이를 갖는 IVF 배지에서 활성화를 수행할 수 있고, 뒤이어 다음날 난할 배지에서 배양을 수행할 수 있다.
실시예 22
단위생식 II: 동형접합 pn - hPSC의 생성
대조적으로, HLA 동형접합 hPSC 세포주의 생성을 위한 직접적인 접근법은 한 개의 전핵 난모세포(one-pronuclear oocyte)를 포함하는 HLA 동형접합 난모세포 공여자로부터 그와 같은 세포주를 생성시키는 것이다. 그러나, 이 접근법의 중요한 불리한 점은 집단에서 동형접합 공여자가 상대적으로 드물게 존재한다는 것이다. 대안적으로, HLA 동형접합 hPSC 세포주가 제2 극체 방출(2PBE)을 위해 6-DMAP 첨가를 제외하는 방법에 의해 이형접합 공여자로부터 수득될 수 있다.
활성자, 예를 들면 Ca2+ 이온운반체, A23817 또는 이오노마이신의 최초 첨가 및, 추후 사이토칼라신 B 가 없는 푸로마이신 또는 사이클로헥사마이드의 첨가에 의존하는 이 접근법은 제2 극체의 방출을 가능하게 하여, 중기 II 염색체 세트의 절반만을 갖는 반수성 개체(haploid parthenote)를 제공한다. 이 반수성 개체는 동형접합 유전자형의 형성을 위해 추가로 2배체 배반포로 배양될 수 있다.
보다 구체적으로, 동형접합 pn-hPSC 세포주의 생성을 위한 난모세포의 단위생식이 하기 과정을 통해 수득될 수 있다:
A) 난모세포의 회수 및 준비, 상기와 같음.
B) 난모세포의 활성화
1. 활성화 배지에서 MII 난모세포를 5분간 37 ℃에서 처리하고(5 uM A23187) 난할 배지에서 완전히 세척한다.
2. 4시간 동안 포스트-활성화 배지(10 ug/mL 푸로마이신 난할 배지 또는 사이토칼라신 B가 없는 사이클로헥사마이드)에서 난자를 재-처리한다.
3. 활성화된 난자를 세척하고 난할 배지에서 24시간 동안 또는 2세포 단계의 배아로 발달할때까지 인큐베이션한다. 그 후 2개의 할구를 만니톨 또는 소비톨 기반 융합 배지에서 전기 융합 기기 (BTX 2000, Harvard Electric)를 이용하여 20 마이크로초 동안 160 mV의 전기를 적용함으로써 전기융합시킨다(electrofuse). 선택적으로, 단일 펄스가 적용될 수 있고, 이는 할구를 융합시키는데 충분한 것으로 나타났다. 융합된 난자를 추가 1일 동안 SAGE 난할 배지에서 배양하고 뒤이은 3일간 SAGE 배반포 배지에서 배양한다.
실시예 23
hPSC 세포주의 생성
반수성체 (단위생식을 통함)의 생성 다음, 후속 배양은 주변의 영양외배엽(trophectodermal) 조직의 분리를 통해 hPSC가 내세포괴로부터 수득될 수 있는 것으로부터 배반포 형성으로 이어진다.
1. 배양된 배반포를 프로나제 (0.5%, Sigma-Aldrich) 또는 산성 타이로드 용액 (pH 2.0)으로 수초 동안 처리하여, 투명대 (ZP)를 제거한다. ZP 제거 후, Hepes-HTF 배지에서 배아를 힘차게 세척하여 프로나제 또는 타이로드 용액의 흔적을 제거한다.
2. 레이저-보조된 배반포 절제 시스템 (Hamilton-Thorne Inc.)을 이용하여 내세포괴 (ICM)를 분리한다. 배반포의 잔류 부분 (영양막)을 폐기하여 배반포가 더 이상 온전하지 않다는 것을 확실하게 한다.
3. 플레이팅 하루 전에 제조된 MEF의 위에 ICM을 플레이팅한다. hPSC 유도 배지는 혈청 대체물 (10% SR. Invitrogen), FBS (5% Hyclone), 플라즈마네이트(plasmamate) (5%), bFGF (32 ng/ml), 및 인간 LIF (2000 units/ml, Sigma-Aldrich)이 보충된 녹아웃-DMEM으로 구성된다.
4. 임의의 변화 없이 동일한 배지에서 3일 동안 ICM을 배양한다.
5. 4일 차에 배지의 약 ⅓을 교체한다.
6. 6일 차부터 격일로 배지의 ½을 교체한다.
7. 초기 결과물은 플레이팅 후 7일 안에 보인다.
8. 12일 전에 콜로니를 확장하고 동결보존한다.
실시예 24
pn - hPSC 및 NT- hPSC 세포주의 특성규명
여러 가지의 유전체, 전사체, 후생적, 단백질, 및/또는 기능적 연구가 결과로 생긴 pn-hPSC 및 NT-hPSC 세포주 특성을 규명하기 위해 수행될 수 있다. 일 실시예에서, hPSC 다능성 마커는 전사물 (예를 들어, 마이크로어레이, qRT-PCR) 또는 단백질 수준 (예를 들어, 웨스턴블롯, 면역세포화학, 2-D 겔)에서 측정될수 있다. 이 다능성 마커는 그 중에서, 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase: AP), 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4), SSEA-3, 종양거절항원 1-81 (Tra-1-81), Tra-1-60, 옥타머 결합 전사 인자-4 (Oct-4), 성 결정 영역 Y-box-2 (Sox-2), nanog, 징크 핑거 단백질-42 (Rex-1/Zfp-42), lefty A, 기형암종-유래 성장 인자 (Tdgf), 텔로미어 반복 결합 인자(Terf-1), 및 발달 다능성-연관 유전자(Dppa-2)를 포함한다.
추가적으로, 인간 짧은 연쇄반복 (STR) 프로브에 의한 DNA 지문분석이 pn-hPSC 및 NT-hPSC 세포주의 유전체 분석에 이용될 수 있다. pn-hPSC의 경우에, 결과로 얻은 세포주가 난모세포 공여체와 동일하거나, 또는 거의 동일하다. NT-hPSC의 경우에, 결과로 얻은 세포주는 핵 공여체와 동일하거나, 또는 거의 동일한 특성을 소유한다. NT-hPSC의 성공적 생성을 확인에서의 다른 핵심 쟁점은 탈핵 실패 가능성 및 후속 단위생식적 활성화의 가능성을 제거하는 것이다. 다른 실시예에서, 유전체 DNA는 유전적 등가성을 결정하기 위해 단일 염기 다형성 (SNP) 마이크로어레이를 이용하여 분석될 수 있다. 일 실시예에서, 바이너리(binary) SNP 마커의 이형접합성은 0.5의 최대 값을 가지고, 분석은 0.375 (집단에서 0.25 초과 0.75 미만 빈도) 초과의 이형접합성을 갖는 SNP 마커에서 수행될 수 있다. 다른 실시예에서, 0.1 cM와 같은 마커사이 거리는, 그들이 개별적 기준에서 보다 적은 정보를 제공하기 때문에, 밀접 연관(tight linkage)의 SNP 마커를 배제하는 데 이용될 수 있다.
다른 실시예에서, 후생적 연구가 수행될 수 있다. 예를 들면, 메틸화가 또한 CpG 부위의 질문(interrogation)을 허용하는, 아황산수소염 처리가 따르는 어레이에 적용되는 유전체 DNA를 이용하여 분석될 수 있다.
결국, hPSC의 핵심 특성은 내배엽, 중배엽, 및 외배엽의 모든 세개의 배아 배엽층으로부터 체세포로 분화하는 다능성 능력 및 자기-재생이다. 이처럼, 다능성은 적절한 동물 모델 (예를 들어, SCID 마우스)로 근육내 (IM) 주입을 통해, 또는 배아체 (EB) 형성 후 낮은 부착 조건에서 배양을 통해 테라토마 형성을 통해 평가될 수 있다. 게다가, 자기-재생능은 높은 증식 및 장-기간 (예를 들어, 1년, >50 계대)에 걸친 계속적 증식, 텔로머라제 활성 수준, 및/또는 안정한 핵형에 의해 관찰될 수 있다.
실시예 25
MHC -HL4 매칭
주조직 접합성 복합체 (MHC)-인간 백혈구 항원 (HLA) 매칭은 기관 기증 동안 면역관용을 위해 중요하다. MHC-HLA 매칭의 부재에서, 면역억제 의약이 요구된다. 면역 거부 위험의 정도는 공여체 및 단백질을 제시하는 수용자 세포-표면 항원 사이의 이격도(disparity) 정도의 함수이기 때문에, MHC-HLA profiles of 다양한 기재된 방법에 의해 생성된 pn-hPSC 및 NT-hPSC 세포주의 MHC-HLA 프로파일을 평가하는 것이 중요하다.
MHC class I 및 II HLA 일배체형은 부모로부터 함께 유전된 HLA-A, HLA-B, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, 및 HLA-DR 유전자좌(locus) 대립형질의 특정 세트이다. 고도의 HLA 다형성이 존재하더라도, U.S. 백인 인종에서 현존하는 단지 약 200개의 공통된 HLA 일배체형이 있다 .
이 MHC-HLA 매칭은 단위생식적 에러가 pn-hPSC 세포주의 생성에서 발생하지 않는다는 추가적인 증거를 제공한다. As related to NT-hPSC 세포주와 관련하여, 의도치않은 단위생식 활성화를 배제하는 성공적 핵 이식을 입증하는 것이 중요하다. 각 NT-hPSC 세포주를 확립하는 것이 우연히 생성된 pn-hPSC 세포주가 아니지만, NT-hPSC는 모든 이소타입에 대한 각 공여체의 것에 대해 확인된다.
실시예 26
MHC - HLA I 및 II 혈청형
상이한 실시예에서, HLA 유전형질분석은 혈액 또는 난구 세포(cumulus cell) 와 같은, 다양한 공여체 공급원으로부터 유전체 DNA를 추출하는 것 및 대립형질-특이적 시퀀싱 프라이머의 PCR을 통한 대립형질 변이를 분석하는 것에 의해 수행될 수 있다. 주조직적합성 복합체 I (MHCI는) HLA-A 혈청형s A1-A3, A9-A11. A23-A26, A28, A29, A30-34, A36, A43, A66, A68, A69, A74 및 A80, HLA-B 혈청형 B5, B7, B8, B12, B13, B14, B15, B16, B17, B 18, B21, B22, B27, B35, B37-B72, B75-B78, B81, B*82 B*83, HLA-C 혈청형 CW01-CW08을 포함한다. 주조직적합성 복합체 II (MHCII)는 HLA-DP 혈청형 DPA1 및 DPB1, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ 혈청형 DQ2-DQ9, HLA-DR 혈청형 DR1-D18을 포함한다.
실시예 27
HLA 동형접합성 HLA 유형 ES 세포주의 뱅킹
초기에 언급한 바와 같이, 고도의 HLA 다형성이 존재하지만, U.S. 백인 인종에 현존하는 단지 약 200개의 HLA 일배체형이 있다. 공통 일배체형을 위해 선택된 10개의 HLA 동형접합성 hPSC 세포주의 패널이 UK 수용자의 거의 40%에 대해 완전한 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR 매치를 및 거의 65%에 대해 유익한 매치를 제공할 수 있다는 것이 추산되었다. 광범위한 집단에 대한 면역접합성은 이식 재료의 재생성 공급원으로서 hPSC 세포 뱅킹의 가능성을 생성한다. 중대하게, 폭넓은 조직 접합성을 갖는 줄기세포의 뱅크안에서 hPSC 세포주의 자기-재생능은 신규 난모세포의 지속적인 공급에 대한 요구를 감소시킬 것이다.
HLA 동형접합성 hPSC 세포주의 생성을 위한 직접적인 접근법은 HLA 동형접합성 공여체로부터 수득된 체세포를 이용하는 그와 같은 세포주를 생성하는 것이다. 그러나, 이 접근법의 주요 약점은 집단에서 동형접합성 공여체의 상대적 희귀성이다. 이 약점을 극복하기 위한 일 전략은 뱅킹된 제대혈 세포를 스크리닝하는 것이다. 대부분 경우에서, 소정의 제대혈의 HLA 유형이 동결보관 전에 단순 문서 스크리닝에 의해 테스트되고 기록되며, 따라서 용이하게 발견된 그 HLA 동형접합성 제대혈 세포 (특히 단핵 세포, CD34+) 시료가 핵 이식 공여체 세포로서 분류되고, 수득되고 이용될 수 있다. 30 내지 50개 사이의 어느 HLA 동형접합성 세포주가 이식 재료로서 생성되고 뱅킹된다.
모든 핵 이식 절차 및 배아 줄기 세포 유도 절차는 본 출원에서 기재된 바와 동일하다.
상기한 다양한 방법들 및 기술들은 본 발명을 수행하기 위한 수많은 방식들을 제공한다. 물론, 반드시 기재된 모든 목적들 또는 이점들이 본원에 기재된 임의의 특정 구체예에 따라 달성 될 수는 없는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들면, 당업계의 숙련자들은 그 방법들이 본원에서 교시되거나 또는 제안될 수 있으므로 다른 목적들 또는 장점들을 반드시 달성하지 않고 본원에 교시된 바의 하나의 장점 또는 일군의 장점들을 달성하거나 또는 최적화하는 방식으로 수행될 수 있음을 인식할 것이다. 여러 가지 유리하고 불리한 대안들이 본원에 언급되어 있다. 일부 바람직한 구체예들은 구체적으로 하나의, 또 다른 또는 여러 가지 유리한 특징들을 포함하는 한편, 다른 구체예들은 구체적으로 하나의, 또 다른 또는 여러 가지 불유리한 특징들을 배제하는 반면에, 또 다른 구체예들은 하나의, 또 다른 또는 여러 가지 유리한 특징들을 포함시킴으로써 구체적으로 현재의 불리한 특징을 완화시키는 것이 이해되어야 한다.
또한, 당업계의 숙련자는 상이한 구체예들로부터 다양한 특징들의 적용성을 인식할 것이다 마찬가지로, 상기 고찰한 다양한 요소들, 특징들 및 단계들은 각각의 그러한 요소, 특징 또는 단계에 대한 다른 공지된 등가물과 마찬가지로 본 명세서에 기재된 원리들에 따라 방법들을 수행하기 위해 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의해 혼합되고 일치될 수 있다. 다양한 요소들, 특징들, 및 단계들 가운데 일부는 구체적으로 다양한 구체예들에 포함될 것이고, 다른 것들은 다양한 구체예들에서 배제될 것이다.
본 발명이 특정 구체예들 및 실시예의 맥락에서 개시되었더라도, 본 발명의 구체예들은 구체적으로 개시된 구체예들 너머로 다른 대안적인 구체예들 및/또는 용도 및 그의 변형 및 등가물들로 확장된는 것이 당업계의 숙련자들에 의해 이해될 것이다.
많은 변화들 및 대안적 요소들이 본 발명의 구체예들에 개시되어 있다. 또 다른 변화들 및 대안적 요소들은 당업계의 숙련자에게 명백할 것이다. 이러한 변화들 중, 제한 없이, 단위생식 방법, 체세포 핵 이식 방법, 단위생식 또는 체세포 핵 이식 기법에서 사용된 세포를 제조, 분리, 또는 변형 방법, 전술된 기법으로부터 다능성 세포주의 유도 방법, 본 발명의 교시와 관련된 질환 및/또는 상태의 치료 방법, 거기에서 이용된 기법 및 조성물 및 용액의 용도, 및 본 발명의 교시를 통해 생성된 산물의 특정 용도가 있다. 본 발명의 다양한 구체예들은 구체적으로 임의의 이들 변화들 또는 요소들을 포함하거나 또는 배제할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 특정 구체예들을 기재하고 특허 청구하기 위해 사용된 성분들의 양, 농도, 반응 조건들 등과 같은 특성들을 표현하는 숫자들은 경우에 따라 용어 "약(about)"에 의해 변경되는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 일부 구체예들에서, 서면 명세서 및 첨부된 특허 청구의 범위에 나타낸 수치 파라미터들은 특정 구체예에 의해 얻고자 하는 원하는 특성들에 따라 변화할 수 있는 근사치들이다. 일부 구체예들에서, 수치 매개 변수들은 보고된 유효 숫자의 수 및 비추어서 및 통상의 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다 본 발명의 몇몇 구체예들의 광범위한 범위를 나타내는 수치 범위들 및 매개 변수들이 근사치들임에도 불구하고, 특정 예들에 기재된 수치 값들은 정확하게 실행 가능한 것으로 보고되어 있다. 본 발명의 일부 구체예들에 나타낸 수치 값들은 이들의 각각의 시험 측청치들 중에서 발견되는 표준 편차로부터 반드시 특정 오류들을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 용어들 "하나의(a)" 및 "한 개의(an)" 및 "그(the)" 및 본 발명의 특정 구체예를 기재하는 맥락에서 사용된 유사한 참고 문헌들(특히 다음의 특허 청구의 범위의 특정 항의 맥락에서)은 단수 및 복수 모두를 커버하도록 해석될 수 있다. 본원에서 값들의 범위의 인용은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값에 개별적으로 연관된 약식 방식으로 작용하도록 의도된다. 본원에 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별적인 값은 마치 그것이 개별적으로 본원에 재인용된 것처럼 명세서에 기재되어 있다. 본원에 기재된 모든 방법들은 본원에 달리 지시되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있거나, 또는 그렇지 않으면 문맥상 명백히 모순될 것이다. 본원의 특정 구체예들와 관련하여 제공된 임의의 및 모든 예들, 또는 예시적인 언어 (예, "와 같은(such as)")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 조명하도록 의도되고 달리 요구되지 않는 한 본 발명의 범위에 대한 어떠한 제한도 부여하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 특허 청구되지 않은 요소로서 해석되지 않아야 한다.
본원에 개시된 발명의 대안의 요소들 또는 구체예들의 그룹화는 제한들로서 해석되지 않아야 된다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로, 또는 본원에서 발견된 그룹의 다른 구성원들 또는 다른 요소들과 조합하여 언급 및 특허 청구될 수 있다. 한 그룹의 하나 이상의 구성원들이 편의상 및/또는 특허 가능성의 이유로 포함될 수 있거나, 또는 그로부터 삭제될 수 있다. 임의의 그러한 포함 또는 삭제가 발생할 때, 본원에서 명세서는 수정된 그룹을 함유하고, 그에 따라 첨부된 특허 청구의 범위에 사용된 모든 마쿠쉬 그룹들의 서면 설명을 충족시킬 것으로 여겨진다.
본 발명의 바람직한 구체예들은, 본 발명을 실시하기 위하여 본 발명자에게 알려진 최선의 모드를 포함하여, 본원에 기재되어 있다. 이러한 바람직한 구체예들에 대한 변화들은 다음 설명을 읽게 됨에 따라 당업계의 통상의 기술을 가진 자들에게 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들은 그러한 변형들을 적절히 사용할 수 있고, 본 발명은 본원에 구체적으로 기재된 것과 달리 실행될 수 있음이 예상된다. 따라서, 본 발명의 많은 구체예들은 적용 가능한 법에 의해 허용되는 바와 같이 이에 첨부된 특허 청구의 범위에 열거된 주제의 모든 변형 및 동등물들을 포함한다. 더우기, 모든 가능한 변화들에서 상기 요소들의 임의의 조합은 본원에 달리 지시되지 않는 한 본 발명에 의해 포함되거나 또는 그렇지 않으면 문맥에 의해 분명히 모순된다.
또한, 다수의 참고 문헌들이 본 명세서 전반에 걸쳐 특허들 및 인쇄 출판물들에 대해 이루어졌다. 상기 인용된 참고 문헌들 및 인쇄된 출판물들 각각은 참고 문헌에 의해 그들의 실체로서 개별적으로 혼입된다.
끝으로, 본 명세서에 개시된 본 발명의 구체예들은 본 발명의 원리를 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형들은 본 발명의 범위 내에 있을 수 있다. 따라서, 예로서, 제한하지는 않지만, 본 발명의 대안적인 구성들은 본 명세서의 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서,본 발명의 구체예들은 정확하게 도시되고 설명된 것으로 제한되지 않는다.

Claims (36)

  1. 반수성체-유래 인간 다능성 줄기 세포주(pn-hPSC)를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    활성화 배지에서 인큐베이션하여 난모세포를 활성화하는 단계;
    트리코스타틴 A(TSA)를 포함하는 포스트-활성화 배지에서 상기 활성화된 난모세포를 인큐베이션하여 반수성체를 생성하는 단계;
    배양 배지에서 상기 반수성체를 히스톤과 DNA의 결합 정도를 변형시키는 메틸화 변형제(methylation altering agents)의 존재 하에서 인큐베이션하여 배반포를 형성하는 단계로서, 상기 메틸화 변형제는 히스톤 아르기닌 메틸화제, 히스톤 라이신 탈메틸화제, HDAC(Histone deacetylase) 억제제, DNMT3a(DNA methyltransferase 3a) 억제제, DNMT3b 억제제, 및 Esrrb로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 단계; 및
    상기 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 내세포괴 세포는 pn-hPSC로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 활성화 배지는 칼슘 이온운반체를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 칼슘 이온운반체는 이오노마이신, A23187, 부베리신(beauvericin), X-537A, 및 아베나시올리드(avenaciolide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 푸로마이신, 에탄올, 시클로헥시미드 (CHX), 및 사이토칼라신 B (CB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 난모세포는 중기 II (MII) 단계 난모세포를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 난모세포는 중기 I (MI) 단계 난모세포를 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 난모세포는 단일 전핵(pronuclear) 난모세포를 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 pn-hPSC 세포주는 면역적합성 인간 백혈구 항원 (HLA) 유전자에 대해 이형접합성(heterozygous)인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 pn-hPSC 세포주는 면역적합성 인간 백혈구 항원 (HLA) 유전자에 대해 동형접합성(homozygous)인 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 pn-hPSC 세포주는 세포 집단의 1% 이상과 면역적합성 인간 백혈구 항원 (HLA) 일배체형(haplotype)을 갖는 다능성 세포를 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 HLA 일배체형은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DR를 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 난모세포를 활성화하는 단계, 또는 상기 반수성체를 생성하는 단계의 전 또는 후에 난모세포로 정자 인자를 주입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 메틸화 변형제는 CARM1인 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 난모 세포는 전기적으로 활성화된 것인 방법.
  15. 핵 이식 인간 다능성 줄기 세포주 (NT-hPSC)를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    난모세포의 핵을 제거하는 단계;
    하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계;
    트리코스타틴 A(TSA)를 포함하는 포스트-활성화 배지에서 인큐베이션하여 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계;
    상기 활성화된 NT 난모세포로부터 히스톤과 DNA의 결합 정도를 변형시키는 메틸화 변형제(methylation altering agents)의 존재 하에서 배반포를 생성하는 단계로서, 상기 메틸화 변형제는 히스톤 아르기닌 메틸화제, 히스톤 라이신 탈메틸화제, HDAC(Histone deacetylase) 억제제, DNMT3a(DNA methyltransferase 3a) 억제제, DNMT3b 억제제, 및 Esrrb로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 단계; 및
    배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 ICM 세포는 NT-hPSC 세포주로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계는 직접 주입을 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계는 체세포 융합을 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 체세포 융합은 하나 이상의 공여체 세포와 센다이 바이러스, 그의 단백질 또는 추출물의 접촉을 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 15에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포는 체세포 또는 생식 세포를 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 15에 있어서, 상기 방법은 자외선의 부재 하에서 수행되는 것인 방법.
  21. 청구항 15에 있어서, 상기 난모세포를 활성화하는 단계의 전 또는 후에 난모세포로 정자 인자를 주입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 15에 있어서, 상기 메틸화 변형제는 CARM1인 것인 방법.
  23. 청구항 15에 있어서, 상기 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 단백질 포스파타아제 억제제를 함유하는 탈핵 배지(enucleation medium) 중 수행되는 것인 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 단백질 포스파타아제 억제제는 카페인인 것인 방법.
  25. 청구항 15에 있어서, 상기 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 푸로마이신, 에탄올, 시클로헥시미드 (CHX), 및 사이토칼라신 B (CB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 것인 방법.
  26. 청구항 15에 있어서, 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계는 전기적 펄스를 더 적용하는 것인 방법.
  27. 청구항 15의 방법에 의해 생산된 NT-hPSC 세포주.
  28. 핵 이식 방법으로서, 상기 방법은:
    하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 난모세포에 첨가하여 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계;
    난모세포의 숙주 핵을 제거하는 단계;
    트리코스타틴 A(TSA)를 포함하는 포스트-활성화 배지에서 인큐베이션하여 NT 난모세포를 활성화하는 단계;
    활성화된 NT 난모세포로부터 히스톤과 DNA의 결합 정도를 변형시키는 메틸화 변형제(methylation altering agents)의 존재 하에서 배반포를 생성하는 단계로서, 상기 메틸화 변형제는 히스톤 아르기닌 메틸화제, 히스톤 라이신 탈메틸화제, HDAC(Histone deacetylase) 억제제, DNMT3a(DNA methyltransferase 3a) 억제제, DNMT3b 억제제, 및 Esrrb로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 단계; 및
    상기 배반포로부터 내세포괴 (ICM) 세포를 분리하는 단계로서, 상기 ICM 세포는 NT-hPSC 세포주로 더 배양할 수 있는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 난모세포를 활성화하는 단계의 전 또는 후에 난모세포로 정자 인자를 주입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 메틸화 변형제는 CARM1인 것인 방법.
  31. 청구항 28에 있어서, 상기 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 것은 체세포 융합을 포함하는 것인 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 체세포 융합은 센다이 바이러스, 그의 단백질 또는 추출물의 적어도 하나의 공여체 세포와의 접촉을 포함하는 것인 방법.
  33. 청구항 28에 있어서, 상기 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 단백질 포스파타아제 억제제를 함유하는 탈핵 배지(enucleation medium) 중 수행되는 것인 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 단백질 포스파타아제 억제제는 카페인인 것인 방법.
  35. 청구항 28에 있어서, 상기 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 푸로마이신, 에탄올, 시클로헥시미드 (CHX), 및 사이토칼라신 B (CB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 것인 방법.
  36. 청구항 28에 있어서, 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계는 전기적 펄스를 더 적용하는 것인 방법.
KR1020197018230A 2013-02-15 2014-02-14 체세포 핵 이식을 이용하는 단위생식 줄기세포 및 환자-특이적 인간 배아줄기세포의 제조 KR102149010B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361765548P 2013-02-15 2013-02-15
US201361765563P 2013-02-15 2013-02-15
US61/765,563 2013-02-15
US61/765,548 2013-02-15
PCT/IB2014/000160 WO2014125363A1 (en) 2013-02-15 2014-02-14 Production of parthenogenetic stem cells and patient-specific human embryonic stem cells using somatic cell nuclear transfer

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157025396A Division KR20150122688A (ko) 2013-02-15 2014-02-14 체세포 핵 이식을 이용하는 단위생식 줄기세포 및 환자-특이적 인간 배아줄기세포의 제조

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190076074A KR20190076074A (ko) 2019-07-01
KR102149010B1 true KR102149010B1 (ko) 2020-08-27

Family

ID=51351484

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157025396A KR20150122688A (ko) 2013-02-15 2014-02-14 체세포 핵 이식을 이용하는 단위생식 줄기세포 및 환자-특이적 인간 배아줄기세포의 제조
KR1020197018230A KR102149010B1 (ko) 2013-02-15 2014-02-14 체세포 핵 이식을 이용하는 단위생식 줄기세포 및 환자-특이적 인간 배아줄기세포의 제조

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157025396A KR20150122688A (ko) 2013-02-15 2014-02-14 체세포 핵 이식을 이용하는 단위생식 줄기세포 및 환자-특이적 인간 배아줄기세포의 제조

Country Status (7)

Country Link
US (2) US10017733B2 (ko)
EP (1) EP2956542A4 (ko)
JP (2) JP6290931B2 (ko)
KR (2) KR20150122688A (ko)
CN (3) CN117821375A (ko)
AU (2) AU2014217550B2 (ko)
WO (1) WO2014125363A1 (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014125363A1 (en) 2013-02-15 2014-08-21 Sung Kwang Medical Foundation Production of parthenogenetic stem cells and patient-specific human embryonic stem cells using somatic cell nuclear transfer
WO2014144754A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 The New York Stem Cell Foundation Somatic cell nuclear transfer methods
EP3194581A4 (en) 2014-09-15 2018-04-25 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions to increase somatic cell nuclear transfer (scnt) efficiency by removing histone h3-lysine trimethylation
WO2017014513A1 (ko) * 2015-07-17 2017-01-26 의료법인 성광의료재단 Nt세포의 보관방법 및 뱅킹 시스템
JP6707636B2 (ja) * 2015-07-17 2020-06-10 スンクワン メディカル ファウンデーション Ｎｔ細胞の保管方法、及びそのバンキングシステム
EP3336176B1 (en) 2015-08-12 2022-04-20 Cha Biotech Co., Ltd. Improved umbilical cord-derived adhesive stem cells, preparation method therefor, and use thereof
CN109641015A (zh) * 2015-10-09 2019-04-16 儿童医疗中心有限公司 通过移除组蛋白h3-赖氨酸三甲基化增加人类体细胞核转移(scnt)效率，以及增加人类nt-esc衍生物的方法和组合物
US11535824B2 (en) 2015-10-29 2022-12-27 Sung Kwang Medical Foundation Nuclear transfer
KR102169122B1 (ko) * 2016-12-29 2020-10-23 의료법인 성광의료재단 중간엽 줄기세포의 제조방법
CN112656542B (zh) * 2020-12-17 2024-05-10 南京师范大学 一种特定位点辅助囊胚孵化的方法
CN114075542B (zh) * 2021-11-02 2024-02-20 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种胞浆机械脱离用培养液及其使用方法
CN114075575A (zh) * 2021-11-02 2022-02-22 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种灭活的仙台病毒低残留高效促融合方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6331659B1 (en) * 1998-01-21 2001-12-18 University Of Hawaii Cumulus cells as nuclear donors
AU2002360424A1 (en) * 2001-11-26 2003-06-10 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells
EP2679671B1 (en) * 2002-05-24 2019-12-11 Advanced Cell Technology, Inc. A bank of stem cells for producing cells for transplantation having HLA antigens matching those of transplant recipients, and methods for making and using such a stem cell bank
US20040091936A1 (en) * 2002-05-24 2004-05-13 Michael West Bank of stem cells for producing cells for transplantation having HLA antigens matching those of transplant recipients, and methods for making and using such a stem cell bank
EP1711599B1 (en) 2003-12-30 2010-02-17 H Bion Co., Ltd. Culture medium for human blastocysts
CN101535468A (zh) * 2005-10-21 2009-09-16 国际干细胞公司 单性生殖激活人类卵母细胞用于产生人类胚胎干细胞
US7732202B2 (en) 2005-10-21 2010-06-08 International Stem Cell Corporation Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells
EP2484308A1 (en) 2006-07-24 2012-08-08 International Stem Cell Corporation Synthetic cornea from retinal stem cells
CN101715485A (zh) 2007-04-06 2010-05-26 国际干细胞公司 源于人单性生殖胚泡的患者特异性干细胞系
US20100144549A1 (en) 2007-07-20 2010-06-10 Mitalipov Shoukhart M Parthenote-derived stem cells and methods of making and using them
CN101525592A (zh) * 2008-03-07 2009-09-09 广州医学院 具有两条活性x染色体的人孤雌胚胎干细胞系及其衍生物
US20120142107A1 (en) 2009-05-19 2012-06-07 Mazorel Ltd. Method and system for somatic cell nuclear transfer
WO2012029957A1 (ja) 2010-09-03 2012-03-08 独立行政法人理化学研究所 クローン動物の作出方法
WO2014125363A1 (en) 2013-02-15 2014-08-21 Sung Kwang Medical Foundation Production of parthenogenetic stem cells and patient-specific human embryonic stem cells using somatic cell nuclear transfer
US11535824B2 (en) 2015-10-29 2022-12-27 Sung Kwang Medical Foundation Nuclear transfer

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fan, Y. et al., Stem Cells and Development, (2011) 20*
Mai, Q. et al., Cell Research (2007) 17:1008-1019*
Torres-Padilla, ME. et al., Nature, (2007) 445*

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018046839A (ja) 2018-03-29
AU2017272196B2 (en) 2019-11-28
JP6290931B2 (ja) 2018-03-07
KR20150122688A (ko) 2015-11-02
EP2956542A1 (en) 2015-12-23
US20140234968A1 (en) 2014-08-21
CN117821375A (zh) 2024-04-05
US20180282688A1 (en) 2018-10-04
US10017733B2 (en) 2018-07-10
AU2017272196A1 (en) 2018-01-04
KR20190076074A (ko) 2019-07-01
AU2014217550B2 (en) 2017-09-07
EP2956542A4 (en) 2016-09-14
CN109797134A (zh) 2019-05-24
CN105209606A (zh) 2015-12-30
WO2014125363A1 (en) 2014-08-21
US11339369B2 (en) 2022-05-24
AU2014217550A1 (en) 2015-10-01
JP2016510220A (ja) 2016-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102149010B1 (ko) 체세포 핵 이식을 이용하는 단위생식 줄기세포 및 환자-특이적 인간 배아줄기세포의 제조
US20130102073A1 (en) Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells
Samiec et al. High developmental capability of porcine cloned embryos following trichostatin A-dependent epigenomic transformation during in vitro maturation of oocytes pre-exposed to R-roscovitine.
WO2018085792A1 (en) Production and therapeutic uses of epinul pluripotent cells and differentiated cells derived therefrom
CN118374434B (zh) 一种小鼠原始内胚层干细胞分离建系的方法
Do et al. Reprogramming somatic gene activity by fusion with pluripotent cells
KR102169122B1 (ko) 중간엽 줄기세포의 제조방법
JP2018524023A (ja) Ｎｔ細胞の保管方法、及びそのバンキングシステム
US20120142107A1 (en) Method and system for somatic cell nuclear transfer
Tosti Oocyte Maturation and Fertilization-A Long History for a Short Event
Du et al. In vitro spermatogenesis from pluripotent stem cells
Patel et al. An ideal oocyte activation protocol and embryo culture conditions for somatic cell nuclear transfer using sheep oocytes
Sun Effect of Pre-maturation of Immature Oocyte with a C-type Natriuretic Peptide (CNP) on Maturation and Subsequent Embryo Production from Unstimulated Mice
WO2008134522A1 (en) Deriving embryonic stem cells
Ying Using Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) as Feeder Cells for Production of Embryonic Stem Cell (ESC) Line in the Murine and Caprine
Goh Using mouse embryonic fibroblast (MEF) as feeder cells for production of embryonic stem cell (ESC) line in the murine and caprine/Goh Siew Ying
Keller Oocyte activation and sperm lyophilization: implications for intracytoplasmic sperm injection in the bovine
Kharche et al. 16.1 Natural Parthenogenesis
Fukunaga et al. Embryonic Stem Cells: A Novel Attractive Research Tool for Germ Cell Development
Lai et al. Animal Cloning
Floros et al. 10 Stem Cell–Based Therapeutic Approaches for Treatment of Male Infertility
Qiang Human Pluripotent Stem Cells In In vitro Conditions: Differentiation And Genomic Instability

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)