CN109641015A - 通过移除组蛋白h3-赖氨酸三甲基化增加人类体细胞核转移(scnt)效率，以及增加人类nt-esc衍生物的方法和组合物 - Google Patents

通过移除组蛋白h3-赖氨酸三甲基化增加人类体细胞核转移(scnt)效率，以及增加人类nt-esc衍生物的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供用来改善人类细胞的体细胞核转移(SCNT)效率及人类核转移ESC(hNT‑ESC)的后续产生的方法和组合物。更具体地，本发明涉及下述发现：人类供体的体细胞的细胞核遗传物质中重编对抗区域(RRR)内的组蛋白H3赖氨酸9(H3K9me3)的三甲基化，阻止了有效的人类体细胞核重编或SCNT。本发明提供降低方法中的H3K9me3的方法和组合物，以通过KDM4家族的去甲基化酶的外源性或过表达而改善hSCNT，及/或通过抑制组蛋白甲基转移酶SUV39h1及/或SUV39h2来抑制H3K9me3的甲基化。

Description

通过移除组蛋白H3-赖氨酸三甲基化增加人类体细胞核转移 (SCNT)效率，以及增加人类NT-ESC衍生物的方法和组合物
相关申请的交叉引用
基于35 U.S.C.§119(e)，本申请主张2015年10月9日提交的美国临时专利申请US62/239,318和2015年10月15日提交的美国临时专利申请US 62/242,050的权益，该两件美国临时专利申请各自的内容通过引用而并入本文。
序列表
本申请含有序列表，序列表已经通过EFS-Web以ASCII格式递交，并由此通过引用而以其整体并入本文。2016年10月7日创建的所述ASCII拷贝名为701039-085852-PCT_SL.txt，其大小为157,721字节。
技术领域
本发明通常涉及体细胞核转移(SCNT)领域，更具体涉及通过去甲基化酶KDM4家族的过表达及/或通过抑制SUV39h1及/或SUV39h2组蛋白甲基转移酶而抑制H3K9me3的甲基化，增加人类SCNT的效率和生产人类核转移ESC(hNT-ESC)。
背景技术
当经由体细胞核转移(SCNT)将细胞核被暴露于卵母细胞细胞质的分子环境时，分化的体细胞基因组可重编回胚胎状态中(Gurdon，1962)，从而能够从终末分化体细胞生成多能(pluripotent)胚胎干细胞(ESC)(Wakayama et al.，2001)。因为源自SCNT的ESC(NT-ESC)在基因上与细胞核供体体细胞为自体同源，hSCNT在包括疾病模型和细胞/组织替代疗法在内的治疗和再生医学中潜力巨大(Hochedlinger and Jaenisch，2003；Yang et al.，2007)。因此，hSCNT可用来修整线粒体基因相关的缺陷，而该修整不能通过基于转录因子的重编而进行(Ma et al.，2015)。尽管人类NT-ESC的潜力巨大，技术难度令其极难应用于人类治疗(French et al.，2008；Noggle et al.，2011；Simerly et al，2003)。
第一个NT-ESC是由Mitalipov小组使用分化的胎儿和婴儿成纤维细胞作为供体生成的(Tachibana et al，2013)。使用他们的最佳条件，发明人和其他人成功地从成年和老年患者体细胞得到NT-ESC(Chung et al.，2014；Yamada et al.，2014)。但是，由于SCNT胚胎发育至囊胚阶段的概率极低，NT-ESC衍生物仍相当困难。目前，仅来自某些雌性的具有最高质量的卵母细胞能支持SCNT胚胎发育至囊胚阶段(Chung et al.，2014；Tachibana etal，2013)，限制了可用的卵母细胞供体池。
当通过体细胞核转移(SCNT)手段将终末分化体细胞转移入去核的卵母细胞内时，该终末分化体细胞可被重编为全能状态(Gurdon，1962)。因为SCNT允许从分化体细胞的单一细胞核生成整个动物，其在农业、生物医学工业、和濒危物种保存中潜力巨大(Y ang etal，2007)。事实上，自1997年对绵羊首次进行成功的哺乳动物克隆(Wilmut et al，1997)以来，已经通过SCNT克隆了超过20个哺乳动物物种(Rodriguez-Osorio et al.，2012)。此外，因为可从SCNT生成的囊胚建立多能胚胎干细胞(Wakayama et al.，2001)，SCNT在人类治疗中大有前途(Hochedlinger and Jaenisch，2003)。在最近首次成功地获取人类细胞核转移胚胎干细胞(hNT-ESC)(Tachibana et al.，2013)以及从老龄成年细胞或人类患者细胞生成人类hNT-ESC(Chung et al.，2014；Yamada et al.，2014)后，这一希望愈加接近现实。这些hNT-ESC可作为有价值的细胞来源用于体外疾病模型中，亦可作为细胞来源用于再生疗法和细胞/组织替代疗法中。
尽管其潜力极大，若干技术问题仍阻止了SCNT的实际用途，特别是它生产克隆动物的效率极低。例如，大约一半的鼠SCNT胚胎在转移前显示发育停止，仅1％至2％的转移入代孕母体的胚胎发育成型(Ogura et al.，2013)。除了具有较高比率的生殖性克隆效率(5％至20％)的牛科动物物种以外，所有其它物种的整体生殖性克隆效率均非常低(1％至5％)(Rodriguez-Osorio et al.，2012)。而且，由于胚胎植入前的发育极差，hNT-ESC建立的成功率也低(10％至25％发展至囊胚阶段；Tachibana et al.，2013；Yamada et al，2014)。
为了实现SCNT的应用潜力，已经做出尝试以改善SCNT克隆效率。首先，已有报导，使用组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂如曲古抑菌素(Tricostatin A(TSA))或scriptaid对1细胞SCNT胚胎的短暂处理，改善了包括鼠(Kishigami et al.，2006；Van Thuan et al，2009)、猪(Zhao et al.，2009)、牛(Akagi et al.，2011)、和人(Tachibana et al.，2013；Yamada et al.，2014)在内的多个哺乳动物物种的重编效率。其次，已有报导，Xist的敲去(knockout)或敲除(knockdown)改善了鼠SCNT胚胎植入子宫后的发育(Inoue et al，2010；Matoba et al.，2011)。但是，这些方法对人类SCNT的克隆效率的改善，无一足以令人类SCNT可用于生成用于治疗性克隆或再生疗法中的人类全能和多能干细胞(如，人类NT-ESC)。
在受精卵基因激活(ZGA)的时间点，开始出现SCNT胚胎的发育缺陷，对于鼠，出现在2细胞阶段，而对于猪、牛和人，出现在4至8细胞阶段(Schultz，2002)。由于供体细胞基因组中预先存在的不明确的表观遗传屏障，SCNT胚胎在ZGA中具有难度。尽管已经证实，鼠2细胞SCNT胚胎(Inoue et al.，2006；Suzuki et al，2006；Vassena et al，2007)和后期裂解阶段的人类SCNT胚胎(Noggle et al.，2011)中存在大量的失调基因，SCNT胚胎中“预先存在的表观遗传屏障”的天性及其与受损的ZGA的关系尚不为人知。
据此，对于下述方法存在需求：通过移除供体细胞核基因组中这些表观遗传屏障而改善人类SCNT克隆效率，因此人类SCNT胚胎可通过受精卵基因激活(ZGA)有效地进展而无发育停止，并成功地通过2、4、和8细胞阶段发育成囊胚而没有发育缺陷或活力丧失。
发明内容
本发明至少部分地基于下述发现：在人类体细胞中，H3K9me3也作为屏障用于人类SCNT重编中。发明人已经证明，KDM4A过表达(如，通过注射外源性KDM4AmRNA)终止了在受精卵基因激活(ZGA)时间点的发育停止，并显着改善人类SCNT胚胎发育，允许使用从供体获得的人类卵母细胞进行患者特异性NT-ESC的有效生产，在受控的实验中，在无KDM4A过表达的帮助下，该供体的卵母细胞未成功发育成囊胚。因此，发明人已经发现一种方法来扩展人类卵母细胞供体用于人类SCNT(hSCNT)的可用性，并建立组蛋白去甲基化酶辅助的SCNT，如，过表达KDM4家族的成员可用于该方法中，用来改善人类SCNT在治疗性克隆和人类细胞核转移ESC(NT-ESC)中的可用性，特别是源自患者的人类NT-ESC在治疗性用途和研究和疾病模型中的可用性。本发明的目的不在于人类的生殖性克隆。
哺乳动物(非人类)卵母细胞可将体细胞重编为全能状态，在该状态下允许通过体细胞核转移(SCNT)的动物生殖性克隆，或从发育自SCNT胚胎的囊胚生产ES细胞系(NT-ESC)。但是，由于不明确的重编缺陷，大多数SCNT胚胎未能发育为囊胚或发育成型。哺乳动物SCNT的无效率是发展用于再生医学应用的患者特异性hESC系的关键限制因素。
尽管已有使用人类供体体细胞生产源自人类SCNT的人类囊胚的报导，该囊胚质量和发育效率不足以允许人类胚胎干细胞系(人类ntESC，亦称hNT-ESC)的生产(French AJet al，StemCells 26，485-493(2008))。已经报导了人类细胞核转移胚胎干细胞(hNT-ESC)(Tachibana et al.，2013)，以及从老龄成年细胞或人类患者细胞生成人类hNT-ESC(Chunget al.，2014；Yamada et al，2014)。但是，由于转移前的发育极差，人类hNT-ESC建立的成功率非常低(仅10至25％发育至囊胚阶段；Tachibana et al.，2013；Yamada et al，2014)。因此，对于改善人类SCNT胚胎至囊胚阶段的发育，从而降低SCNT所需的供体卵母细胞数，并成功生产用于研究和基于细胞的疗法的人类和患者特异性同基因胚胎干细胞系，人类SCNT技术的细化是关键。
使用体细胞核转移(SCNT)获取人类胚胎干细胞(hNT-ESC)的极低效率限制了其应用潜力。从人类SCNT胚胎形成囊胚以低比率出现，且仅一些卵母细胞供体可实现。SCNT胚胎的极差的发育潜力并不限于人类，也普遍见于所有被检查的哺乳动物物种(Rodriguez-Osorio et al.，2012)。
通过鼠体外受精(IVF)与SCNT胚胎的比较性转录组学分析和表观遗传学分析，发明人先前已经证实，供体的体细胞基因组中的组蛋白H3赖氨酸9三甲基化(H3K9me3)作用为防止鼠细胞通过SCNT进行转录重编，导致受精卵基因组激活(ZGA)的失败和胚胎植入前发育的失败(Matoba et al，2014)。发明人先前也证实，可通过异位过表达鼠KDM4d——一种H3K9me3去甲基化酶，而移除鼠供体的体细胞中的这一表观遗传学屏障。H3K9me3的移除促进ZGA，并因此改善鼠SCNT胚胎到达囊胚阶段的发育，导致鼠NT-ESC生产的比率和效率提高(mNT-ESC)(Matoba et al.，2014)。
更具体地，发明人先前证实，在鼠体内，通过H3K9me3去甲基化酶KDM4d的异位表达降低组蛋白H3赖氨酸9三甲基化(H3K9me3)，极大地改善SCNT鼠胚胎发育，这揭示在通过引用而以其整体并入本文的国际专利申请WO2016/044271中。
与先前研究形成对照，本文中，发明人证实，H3K9me3去甲基化酶KDM4A在人类细胞中的过表达令人惊讶地改善人类SCNT，而人类体细胞基因组中的H3K9me3是阻止人类SCNT胚胎通过受精卵基因激活(ZGA)有效发育的SCNT重编屏障。由于人类ES细胞与鼠ES细胞差异巨大，而且，不可能预计到在鼠细胞中发挥作用的物质会在人类细胞中发挥作用，这一现象出乎意料。
更具体地，由于鼠细胞和人类细胞中的受精卵基因激活(ZGA)出现在不同的时间点，无法预计移除鼠细胞中ZGA屏障的重编方法也可在移除人类细胞中完全不同时间框架内的ZGA屏障中发挥作用。如本文中图2A和图2E所述，增加鼠细胞中SCNT效率的过程及/或方法(见，图2A)不同于增加人类细胞中SCNT效率的过程及/或方法(见，如，图2E)。本文中，发明人令人惊讶地演示，KDM4A的过表达通过促进转录重编而显着改善了人类SCNT胚胎的囊胚形成比率，允许从不同的人类患者群体有效获取人类NT-ESC，如，发明人已经演示了从成年的年龄相关性黄斑变性(AMD)患者体细胞核供体生成hNT-ESC。因此，本文中关于增加人类SCNT效率的方法的发现，在包括再生医学和治疗性克隆在内的多种情境中具有潜在应用。
特别地，发明人已经发现，分化的人类体细胞的供体细胞核基因组中的组蛋白H3赖氨酸9三甲基化(H3K9me3)，是阻挡人类细胞通过SCNT有效重编的主要的预先存在的表观遗传学屏障；还发现，降低人类供体细胞核中或激活的SCNT胚胎中的H3K9me3甲基化，可增加人类SCNT的效率，特别是增加人类SCNT胚胎在胚胎植入前发育至8细胞或囊胚阶段的效率。
更具体地，通过比较性分析，发明人已经发现了人类SCNT胚胎中对抗受精卵基因激活(ZGA)的人类供体细胞核的基因组区域。与其它哺乳动物如ZGA出现在2细胞阶段的鼠、ZGA出现在4至细胞阶段的猪和牛(Schultz，2002)不同，人类的ZGA出现在8细胞阶段(Schultz，2002)。本文中，发明人已经发现，人类供体遗传物质中的重编对抗区域(reprogramming resistant regions(RRR))富含阻抑性组蛋白修饰H3K9me3，而移除人类供体体细胞中的这一表观遗传学标记物可增加人类SCNT的效率。本文中揭露的方法和组合物中涵盖两种改善人类SCNT效率的途径，包括：(i)增加卵母细胞或激活的SCNT胚胎(如，在杂交卵母细胞已经被融合或激活后)中H3K9me3特异性去甲基化酶的表达或激活，如，过表达人类KDM4家族的至少一个成员(如，表达外源性人类KMD4A、KDM2B、KDM4C、KDM4D或KDM4EmRNA)；及/或(ii)敲除或抑制人类供体的体细胞核中人类H3K9甲基转移酶如人类SUV39h1或人类SUV39h2或两者(即，SUV39h1/2)的表达或功能。该方法不仅削弱人类供体细胞核中的ZGA缺陷并再次激活该RRR，而且极大改善人类SCNT的效率，如，增加SCNT胚胎发育至2细胞、4细胞和8细胞或囊胚阶段的百分比。
因此，SUV39h1/2介导的H3K9me3是人类SCNT的“表观遗传学屏障”，而在人类体细胞供体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞或人类SCNT胚胎的细胞核中，抑制及/或移除H3K9me3的三甲基化(经由KDM4A/JHDM3A或人类KDM4家族任何其它成员的过表达，如，人类KDM4A、人类KDM4B、人类KDM4C、人类KDM4D、人类KDM4E基因中任何一种或多种基因的过表达)及/或使用人类SUV39h1/2蛋白或基因的抑制剂，可用于本文中揭露的方法、组合物和试剂盒中，该方法、组合物和试剂盒用于移除出现在人类细胞重编，特别是经由人类SCNT进行的人类体细胞重编中ZGA中的表观遗传学屏障，且为改善人类SCNT克隆效率的方法所涵盖。
据此，本发明基于发明人的下述发现：在人类细胞中，H3K9me3富集在用于生产SCNT胚胎的人类体细胞的RRR中，且人类体细胞中的H3K9me3屏障可通过KDM4D家族成员的过表达移除。
重要的是，发明人已经证明，通过人类KDM4家族蛋白质的至少一个成员如人类KDM4A、人类KDM4B、人类KDM4C、人类KDM4D、人类KDM4E的过表达(如，通过引入编码KDM4家族成员如KDM4A mRNA或cDNA的外源性mRNA)移除hSCNT胚胎(如，处于5hpa与10hpa之间、或处于2细胞阶段与8细胞阶段之间)、接纳体卵母细胞中的H3K9me3，导致人类SCNT克隆的效率令人惊讶地显着增加。特别地，发明人令人惊讶地证明，注射KDM4A的hSCNT胚胎发育为囊胚的比率增加超过20％(即，通过KDM4A注射，从4.2％增加至26.8％)，且14％的注射KDM4A的hSCNT胚胎发育至扩展囊胚阶段(与无一发育的对照hSCNT胚胎对比)。
据此，本发明的多个方面基于下述发现：人类供体体细胞中组蛋白H3赖氨酸9的三甲基化(H3K9me3)阻止有效的人类体细胞核重编(hSCNT)。由于发明人先前证明，对鼠供体的体细胞核中SUV39h1/2的抑制令人惊讶地增加了哺乳动物SCNT效率(如在2015年9月15日提交的国际申请PCT/US2015/050178，该申请公开为WO2016/044271，且通过引用而以其整体并入本文)，本文中揭露的方法和组合物涵盖两种改善人类SCNT效能的途径，该两种途径包括：(i)通过使用去甲基化酶KDM4家族成员如KDM4A(亦称JMJD2A或JHDM3A)的过表达(即，外源性表达，或异位表达)促进H3K9me3的去甲基化；及/或(ii)通过抑制人类组蛋白甲基转移酶SUV39H1及/或SUV39H2而抑制H3K9me3的甲基化。因此，KDM4A/JHDM3 A、或人类KDM4家族其它成员的过表达(如，人类KDM4A、人类KDM4B、人类KDM4C、人类KDM4D、人类KDM4E基因中一种或多种基因的过表达)，及/或对人类SUV39h1/2蛋白质或基因的抑制，可用于本文中揭露的方法、组合物和试剂盒中，该方法、组合物和试剂盒用于移除出现在人类细胞重编，特别是经由人类SCNT进行的人类体细胞重编中ZGA中的表观遗传学屏障。
据此，本发明的多个方面涉及通过降低人类SCNT胚胎中H3K9me3甲基化而增加人类SCNT效率的方法、组合物和试剂盒，该降低通过下述任一项实施：(i)表达能将H3K9me3去甲基化的组蛋白去甲基化酶，如，KDM4家族的组蛋白去甲基化酶成员，例如但不限于，JMJD2A/KDM4A及/或JMJD2D/KDM4D及/或JMJD2B/KDM4B及/或JMJD2C/KDM4C及/或JMJD2E/KDM4E；及/或(ii)抑制牵涉入H3K9me3甲基化的人类组蛋白甲基转移酶，例如，抑制人类SUV39h1、人类SUV39h2或人类SETDB1中任一种或其组合。一些具体例中，根据本文中揭露的方法，将增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶至少一个成员如JMJD2A/KDM4A及/或JMJD2D/KDM4D及/或JMJD2B/KDM4B及/或JMJD2C/KDM4C及/或JMJD2E/KDM4E的表达或活性的试剂注射入或接触人类SCNT胚胎。
尽管已有报导将H3K9me3的去甲基化(通过KDM4c/Jmjd2c)用以增加体细胞重编的效率(如，诱导多能干(iPS)细胞的生成(Sridharan et al.，2013))，但H3K9me3的去甲基化用于增加来自终末分化体细胞的SCNT效率尚未有报导。Antony等人报导了KDM4B/JMJD2B在源自多能ES细胞的供体细胞核的SCNT中的使用(Antony et al，″Transient JMJD2B-Mediated Reduction of H3K9me3 Levels Improve reprogramming of Embryonic StemCells in Cloned Embryos.″Mol.Cell Biol.，2013，33(5)，974)。多能ES细胞是与终末分化体细胞不相同的发育不成熟细胞。重要的是，全球表观遗传状态的胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞与分化体细胞相比较，存在显着差异。多能ES细胞具有较少的表观遗传学屏障(如，较少的甲基化，特别是在重编对抗区域(RRR)中)，因此，使用ES细胞核作为供体细胞核时生产的SCNT胚胎的效率，与使用来自终末分化体细胞的细胞核时生产的SCNT胚胎的效率差异巨大(Rideout et al，2000，Nature Genetics，24(2)，109-10)。
与Antony等人的报导形成对照，发明人在本文中证明，在激活之前或激活之后，降低杂交卵母细胞如包含供体体细胞遗传物质的去核卵母细胞中的H3K9me3水平(如，借由过表达人类KDM4AmRNA)，导致8细胞SCNT后的发育中的令人惊讶的增长，如，32％的经处理人类SCNT胚胎发育为桑椹胚，26.8％发育为囊胚，而14.3％发育为并且超越扩展囊胚阶段(与未处理人类SCNT胚胎无一到达扩展囊胚阶段的0％相对比)。这是14％的增长。考虑到Antony等人报导，即便使用源自供体细胞核的作为不具有与终末分化体细胞相同表观遗传标记物的发育不成熟细胞的ES细胞，在配体植入前发育中仅造成约9％的改善，这一结果非常出乎意料。
而且，尽管已有大量关于H3K9me3去甲基化增加重编体细胞至早期发育阶段(如，诱导多能干(iPS)细胞的生成)的效率的报导(如，通过引用而以其整体并入本文的美国专利申请US 2011/0136145和US 2012/0034192)，重编体细胞用以生成iPS细胞的机制显着不同于重编体细胞用以生成SCNT胚胎的机制(如Pasque et al，2011，Mechanisms ofnuclear reprogramming by eggs andoocytes：a deterministic process？Nat.Rev.Mol.Cell Biol.12，453-459；和Apostolou，E.，and Hochedlinger，K.，2013，Chromatin dynamics during cellular reprogramming.Nature 502，462-471中所探讨的)。因此，在iPS细胞的生成中从H3K9me3去甲基化中学到的东西是不相关的或不可用，且不能转移至成功生成SCNT人类胚胎的方法或增加胚胎植入前和植入后的人类SCNT胚胎效率的方法中。
特别地，存在于人类SCNT中的屏障与存在于人类iPS重编中的屏障之间存在显着差异，且人类SCNT与鼠SCNT重编之间也存在显着差异。首先，主要通过SETDB1建立鼠iPSC重编中的H3K9me3屏障(Chen et al.，2013；Sridharan et al.，2013)。其次，成功的iPSC与SCNT重编所必需的下游基因网络是不同的。例如，在iPSC重编中，被H3K9me3屏障阻抑的关键核心多能网络基因如Nanog和Sox 2，在重编的相对晚期阶段中被表达(Chen et al.，2013；Sridharan et al.，2013)。相反，在SCNT重编中，被H3K9me3阻抑的基因在2细胞胚胎阶段被变大，且在该阶段具有重要功能(于下文中探讨)。每一情境中，这一区别最可能源于成功的重编所需的成套转录因子之间的差异。事实上已经证明，iPSC重编所需的核心转录因子Oct4/Pou5fl在SCNT重编中可有可无(Wu et al.，2013)。因此，尽管H3K9m3似乎是iPS细胞生成与成功的SCNT两者共有的重编屏障，但其沉积及其如何影响重编过程与重编以生成iPS细胞的方法和重编以生成SCNT胚胎的方法中差异巨大。
因此，即使已经证明了人类体细胞重编为人类iPS细胞中的H3K9me3屏障被移除，但因为iPS细胞生成中使用不同的重编基因和重编机制，没有迹象显示该方法会在人类SCNT胚胎的生成中对重编人类体细胞产生作用。事实上，US 2011/0136145和US 2012/0034192两篇申请具体地阐明，其方法仅用于体细胞至iPSC的重编，而不适用于全能细胞的生成或用于人类SCNT胚胎的产生。因此，US 2011/0136145和US 2012/0034192两篇申请的教导与本发明相距甚远。
而且，如下表1中概述，iPSC的生成中体细胞重编所采用的机制与SCNT胚胎的生成中所采用的机制差异巨大，从重编体细胞中产生的用以产生iPSC的干细胞明显不同于从SCNT胚胎获得的干细胞(Ma et al，2014，Abnormalities in human pluripotent cellsdue toreprogramming mechanisms.Nature，511(7508)，177-183)。
表1.SCNT介导的重编与iPS介导的重编之间关键差异的总结
据此，如上所述，由于人类体细胞重编为人类iPS细胞的重编基因和机制显着不同于人类体细胞重编为人类SCNT的重编基因和机制，且由于所得细胞也显着不同，没有迹象或原因令人相信，在重编以生产iPSC中起作用的方法会在生成人类SCNT的重编中起作用。特别地，正常iPSC保留作为亲本体细胞典型特征的残余DNA甲基化模式，而DNA甲基化和NTES细胞的转录组情况与源自IVF的ES细胞密切相关(见，Ma et al.，Nature.2014 Jul 10，51 1(7508)：177-183)。
据此，本发明的一方面涉及增加人类体细胞核转移(hSCNT)效率的方法，包含令供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞(如，包含融合或激活前的供体遗传物质的去核人类卵母细胞)或人类SCNT胚胎(即，该供体细胞核与该去核卵母细胞融合之后)的至少一者与降低该供体人类细胞、接纳体人类卵母细胞或人类SCNT胚胎中的H3K9me3甲基化的试剂接触，从而增加人类SCNT的效率，如，与未经处理的人类SCNT胚胎相比，增加所得人类SCNT发育为囊胚及其以后的效率。
一些具体例中，本发明提供一种增加人类体细胞核转移(hSCNT)效率的方法，包含下述至少一项：(i)令供体人类体细胞或接纳体人类卵母细胞与至少一种降低该供体人类体细胞或该接纳体人类卵母细胞中的H3K9me3甲基化的试剂(如，KDM4A mRNA)接触；其中，该接纳体人类卵母细胞是有核的或去核的卵母细胞；若该接纳体人类卵母细胞是有核的，则将该人类卵母细胞去核；将来自该供体人类体细胞的细胞核转移至该去核的卵母细胞内，以形成杂交卵母细胞；以及，激活该杂交卵母细胞，以形成人类SCNT胚胎；或(ii)令杂交卵母细胞与至少一种降低该杂交卵母细胞中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，杂交卵母细胞是包含人类体细胞遗传物质的去核人类卵母细胞；以及，激活该杂交卵母细胞，以形成人类SCNT胚胎；或(iii)令激活后的人类SCNT胚胎与至少一种降低人类SCNT胚胎中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该SCNT胚胎是从去核的人类卵母细胞与人类体细胞遗传物质的融合生成的；以及，将该SCNT胚胎孵化足够的时间以形成囊胚。一些具体例中，从该囊胚采集至少一个卵裂球，并培养该卵裂球以形成至少一个人类NT-ESC。
一些具体例中，降低H3K9me3甲基化的试剂是下述至少一种：(i)增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶成员的表达或激活或功能的试剂，及/或(ii)H3K9甲基转移酶抑制剂，从而移除RRR中的表观遗传学屏障并增加人类SCNT的效率。
一些具体例中，增加人类体细胞核转移(SCNT)的效率包含：令处于激活后至少5小时(5hpa)、或处于10hpa与12hpa之间(即，处于1细胞阶段)、或处于约20hpa(即，早期2细胞阶段)或处于20hpa与28hpa之间(即，2细胞阶段)的SCNT胚胎(如，去核人类卵母细胞与该供体细胞的人类遗传物质融合后)与至少(i)KDM4家族的组蛋白去甲基化酶(如，KDM4A mRNA)及/或(ii)H3K9甲基转移酶抑制剂(如，人类SUV39h1/2的抑制剂)的至少一种接触。
一些具体例中，通过人类KDM4基因如hKDM4A、hKDM4B、hKDM4C、hKDM4D或hKDM4E在该人类供体卵母细胞(去核前或去核后)、或该杂交卵母细胞(如，包含供体细胞核遗传物质但在激活之前的去核卵母细胞)、或该人类SCNT胚胎中(如，激活后至少5小时(5hpa)或处于1细胞阶段、或处于2细胞阶段)、或移除遗传物质之前的该供体人类体细胞的任一种或其组合中的过表达或外源性表达，出现H3K9me3甲基化的减少。
一些具体例中，人类KDM4基因如KDM4A的外源性表达出现在人类供体卵母细胞中。一些具体例中，人类KDM4基因如KDM4A的外源性表达出现在去核人类供体卵母细胞中、或杂交卵母细胞(如，包含供体细胞核遗传物质但在激活之前的去核卵母细胞)。一些具体例中，KDM4基因如KDM4A的外源性表达出现在处于下述任一阶段的SCNT胚胎：5hpa、10hpa至12hpa之间(即，1细胞阶段)、约20hpa(即，早期2细胞阶段)或20hpa至28hpa之间(即，2细胞阶段)。一些具体例中，若该人类SCNT胚胎与抑制H3K9me3的试剂接触，该试剂，如增加人类KDM4基因如KDM4A(如，KDM4A mRNA或mod-RNA)的外源性表达的试剂，则将该KDM4A激活剂或过表达剂注射入SCNT胚胎(如，2细胞胚胎、或4细胞胚胎)的每一细胞(如，将KDM4A mRNA注射入SCNT胚胎的每一细胞)。
其它具体例中，通过在人类供体卵母细胞(去核前或去核后)、或杂交卵母细胞(即，包含激活之前的供体遗传物质的去核卵母细胞)、或SCNT胚胎(如，激活后至少5小时(5hpa)或处于1细胞阶段、或处于2细胞阶段、或处于4细胞阶段)、或供体人类体细胞的一种或其组合中，抑制SUV39h1及/或SUV39h2、或两者(SUV39h1/2)的表达，出现本文中揭露的降低供体遗传物质中H3K9me3甲基化的方法。
一些具体例中，对SUV39h1及/或SUV39h2、或两者(SUV39h1/2)的抑制出现在供体人类体细胞中，如，在移除用于转移至该去核人类供体卵母细胞的细胞核或遗传物质之前至少约24小时、或至少约48小时、或至少约3天或至少约4天或超过4天的时间点出现。一些具体例中，通过siRNA抑制SUV39h1及/或SUV39h2、或两者(SUV39h1/2)的表达，且该抑制在移除该细胞核之前的时间段内出现至少12小时、或至少24小时或更久，。
本发明的另一方面涉及增加人类体细胞核转移(SCNT)效率的方法，该方法包含：令人类SCNT胚胎、人类卵母细胞或杂交卵母细胞、或供体人类体细胞与降低H3K9me3甲基化的试剂(如，KDM4A mRNA)接触，从而增加SCNT的效率。一些具体例中，该接纳体人类卵母细胞是质量极差的人类卵母细胞，其质量不阻抑使用IVF过程成功受精。一些具体例中，在注射供体人类细胞核或遗传物质之前接触该人类卵母细胞。一些具体例中，该接纳体人类卵母细胞是去核的人类卵母细胞。一些具体例中，该SCNT胚胎是1细胞阶段、或2细胞阶段的SCNT胚胎。一些具体例中，在使用来自终末分化人类体细胞的细胞核或遗传物质进行细胞核转移之前，该降低H3K9me3甲基化的试剂(如，KDM4A mRNA)接触接纳体人类卵母细胞或去核的人类卵母细胞。
一些具体例中，该接触接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞、人类供体的体细胞、或人类SCNT胚胎的试剂，增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的至少一个成员的表达或活性，该至少一个成员是，例如，人类KDM4A(SEQ ID NO：1)、人类KDM4B(SEQ ID NO：2)、人类KDM4C(SEQ ID NO：3)或人类KDM4D(SEQ ID NO：4)所组成的人类KDM4(JMJD2)家族的至少一个成员。一些具体例中，该增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂，增加KDM4D(JMJD2D)或KDM4A(JMJD2A)或KDM4B或KDM4C的表达或活性。一些具体例中，该试剂包含一核酸序列，该核酸序列来自人类的KDM4，如，KDM4A(SEQ ID NO：1)、人类KDM4B(SEQ IDNO：2)、人类KDM4C(SEQ ID NO：3)或人类KDM4D(SEQ ID NO：4)或人类KDM4E(SEQ ID NO：45)、或其生物学活性片段或其序列一致性为至少80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％的同源物，该生物学活性片段或同源物将人类SCNT的效率增加至与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45相对应序列类似或更大的程度(如，增加至少约110％、或至少约120％、或至少约130％、或至少约140％、或至少约150％、或超过150％)。
一些具体例中，该接触接纳体人类卵母细胞或人类SCNT胚胎的试剂，增加SEQ IDNO：9的人类KDM4A蛋白的表达，及/或包含对应于SEQ ID NO：1的人类KDM4A核酸序列、或其生物学活性片段，该生物学活性片段将人类SCNT的效率增加至与SEQ ID NO：1的核酸序列类似或更大的程度(如，增加至少约110％、或至少约120％、或至少约130％、或至少约140％、或至少约150％、或超过150％)。
一些具体例中，接触接纳体人类卵母细胞或人类SCNT胚胎的试剂，增加SEQ IDNO：12的人类KDM4D蛋白的表达，及/或包含对应于SEQ ID NO：4的人类KDM4D核酸序列、或其生物学活性片段。一些具体例中，SEQ ID NO：12的KDM4D的生物学活性片段包含SEQ ID NO：12的氨基酸1至424，如Antony等人，自然(Nature)，2013年中所揭露。一些具体例中，SEQ IDNO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：12的氨基酸1至424，其亦缺少位于SEQ ID NO：12的氨基酸1至424的C端或N端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸，或缺少位于SEQ ID NO：12的氨基酸1至424的C端和N端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。
候选的具体例中，接触供体人类细胞如终末分化细胞的供体细胞核接触的试剂，增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性，该酶是，例如但不限于，如上文探讨的KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D或KDM4E组成的KDM4家族。
本发明的另一方面涉及增加人类体细胞核转移(SCNT)效率的方法，该方法包含：令供体人类细胞如终末分化体细胞的细胞核与降低该供体人类体细胞的细胞核中H3K9me3甲基化的试剂接触，从而增加SCNT的效率。
一些具体例中，在本发明的所有方面，接触供体人类体细胞的试剂是H3K9甲基转移酶的抑制剂，例如但不限于，人类SUV39h1、人类SUV39h2或人类SETDB1表达或蛋白质功能的抑制剂。一些具体例中，在该方法中，可使用人类SUV39h1、人类SUV39h2或人类SETDB1的至少一种抑制剂或该抑制剂的任意组合来增加人类SCNT的效率。一些具体例中，H3K9甲基转移酶的抑制剂不是人类SETDB1的抑制剂。
一些具体例中，H3K9甲基转移酶的抑制剂选自下列组成的群组：RNAi剂、siRNA剂、shRNA、寡核苷酸、CRISPR/Cas9、CRISPR/cpf1、中和抗体或抗体片段、适配体、小分子、蛋白质、肽、小分子、avidimir、及其功能性片段或衍生物等。一些具体例中，该H3K9甲基转移酶抑制剂是RNAi剂，如，siRNA或shRNA分子。一些具体例中，该试剂包含核酸抑制剂，以抑制人类SUV39H1蛋白(SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：48)的表达。一些具体例中，该试剂包含核酸抑制剂，以抑制人类SUV39H2蛋白(SEQ ID NO：6)的表达。一些具体例中，人类SUV39h1的siRNA抑制剂包含下述至少一种：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22或SEQ ID NO：23或其至少10个接续核苷酸的片段，或与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中任何一个的序列一致性为至少80％(或序列一致性为至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％)的核酸序列。一些具体例中，人类SUV39h1的siRNA抑制剂包含下述至少一种：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23或其至少10个接续核苷酸的片段，或与SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23中任何一个的序列一致性为至少80％(或序列一致性为至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％)的核酸序列。
一些具体例中，siRNA或其它核酸抑制剂完全或部分地杂交至位于人类SUV39h1的SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：47(分别对应于SUV39h1变体2和SUV39h1变体1)任何一个核苷酸区域内的靶标序列。
一些具体例中，人类SUV39h2的siRNA抑制剂包含下述至少一种：SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19、或SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、或其至少10个接续核苷酸的片段，或与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19、或SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％)的核酸序列。一些具体例中，人类SUV39h2的siRNA抑制剂包含下述至少一种：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、或其至少10个接续核苷酸的片段，或与SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27的序列一致性为少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％)的核酸序列。
一些具体例中，siRA或其它核酸抑制剂完全或部分地杂交至位于人类SUV39h2的SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53(hSUV39h2变体1至5)中任何一个核苷酸区域内的靶标序列。
一些具体例中，该试剂可在激活之前、或激活后大约5小时、或当该人类SCNT胚胎处于1细胞阶段、2细胞阶段或4细胞阶段时，与该SCNT胚胎接触。候选的具体例中，该试剂可在激活后5小时或当该人类SCNT胚胎处于2细胞阶段时，与该人类SCNT胚胎接触。一些具体例中，将该试剂注射入该接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞或人类SCNT胚胎，例如，将KDM4A mRNA注射入该接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞或人类SCNT胚胎的细胞核及/或细胞质内。一些具体例中，该试剂增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶至少一个成员的表达或活性。
一些具体例中，在将供体人类细胞的细胞核注射入去核的人类卵母细胞内之前，降低H3K9me3甲基化的试剂(如，KDM4A mRNA)接触或注射入该供体人类细胞如终末分化体细胞的细胞核或细胞质中。一些具体例中，此剂与供体人类体细胞接触至少1小时、或至少2小时或更长时间，其中，在将细胞核从供体人类体细胞移除并转移至去核的人类卵母细胞内之前，该接触出现至少1天(24小时)、或至少2天、或至少3天、或超过3天。
在本发明的所有方面，该人类SCNT胚胎的制备方法为，将来自分化体细胞(一般为终末分化细胞，但不是ES细胞或iPSC)的供体人类体细胞核注射入去核的人类卵母细胞，其中，该供体细胞核并非来自胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞、或胎儿细胞。在本发明的所有方面，该人类SCNT胚胎是通过下述产生的：将来自终末分化人类体细胞的供体细胞核注射入去核的人类卵母细胞内。一些具体例中，该供体人类体细胞遗传物质被注射入非人类接纳体卵母细胞。一些具体例中，该人类SCNT胚胎在杂交卵母细胞激活(或融合)后发育。一些具体例中，该杂交卵母细胞包含去核的人类卵母细胞，该去核的人类卵母细胞包含来自人类供体的体细胞的细胞核遗传物质，以及来自第三位人类供体(即，对于该去核卵母细胞为非原生的mtDNA)的线粒体遗传物质(如，线粒体DNA或mtDNA)。
在本发明的所有方面，该供体的体细胞、接纳体卵母细胞或SCNT胚胎是人类细胞，如，人类供体细胞、接纳体人类卵母细胞或人类SCNT胚胎。
据此，在本发明的所有方面，该方法导致人类SCNT的效率比在不存在降低H3K9me3甲基化的试剂(即，不存在增加KDM4家族成员的表达或激活的试剂)下的人类SCNT增加至少约5％、或至少约10％、或至少约13％、或至少约15％、或至少30％、或增加至少50％、或增加50％至80％、或增加超过80％。换种说法，本文中揭露的方法增加转移前SCNT胚胎发育的效率，或增加hSCNT胚胎至囊胚阶段的发育、或增加hSCNT胚胎至扩展囊胚阶段的发育，借此，至少约5％、或7％、或10％、或12％或超过12％发育至扩展囊胚阶段。另一具体例中，该方法增加人类SCNT胚胎发育的效率，例如，与在不存在降低H3K9me3甲基化的试剂下制备的hSCNT胚胎相比，将成功发育至囊胚阶段的效率增加至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍或超过8倍。一些具体例中，如本文中揭露所提供的方法和组合物增加人类SCNT效率，指的是增加源自胚胎干细胞(人类NT-ESC)的人类SCNT胚胎的生成或产率。
本发明的另一方面涉及一种组合物，该组合物包含人类SCNT胚胎、接纳体人类卵母细胞、或杂交卵母细胞或人类囊胚的至少一种，以及下述至少一种：(i)增加KDM4家族(Jmjd2)的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂或(ii)抑制H3K9甲基转移酶的的试剂。
一些具体例中，该组合物包含接纳体人类卵母细胞，该接纳体人类卵母细胞是去核的人类卵母细胞或注射从终末分化体细胞获得的供体细胞核之前的人类卵母细胞。一些具体例中，该组合物包含杂交卵母细胞(如，包含激活之前供体细胞核遗传物质的去核人类卵母细胞)。一些具体例中，该人类SCNT胚胎是1细胞阶段、或2细胞、或4细胞阶段人类SCNT胚胎。一些具体例中，该组合物包含一种剂，该试剂增加至少一种编码KDM4家族的组蛋白去甲基化酶成员的基因，或增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的至少一个成员如KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D或KDM4E的活性。一些具体例中，该试剂增加KDM4D(JMJD2D)或KDM4A(JMJD2A)、或其生物学活性片段或其同源物的表达或活性，其将SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45相对应序列的程度。一些具体例中，该组合物包含对应于SEQ ID NO：1的人类KDM4A核酸序列、或其生物学活性片段，其将SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：1的核酸序列的程度。
一些具体例中，该组合物包含一种剂，该试剂是H3K9甲基转移酶的抑制剂，例如但不限于，人类SUV39h1、人类SUV39h2或人类SETDB1的抑制剂。一些具体例中，可在该方法中使用人类SUV39h1、人类SUV39h2或人类SETDB 1的抑制剂中的至少一种或其任意组合，以增加人类SCNT的效率。
一些具体例中，该组合物包含选自siRNA、shRNA、中和抗体或抗体片段、适配体、小分子、蛋白质、肽、小分子等所组成组的H3K9甲基转移酶的抑制剂。一些具体例中，该H3K9甲基转移酶抑制剂是抑制人类SUV39h1或人类SUV39h2或人类SETDB1的siRNA或shRNA分子。一些具体例中，该组合物包含核酸抑制剂，该核算抑制剂完全或部分地杂交至位于人类SUV39h1的SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：47(分别对应于SUV39h1变体2和变体1)、或人类SUV39h2的SEQ ID NOS：15、SEQ ID NOS：49、SEQ ID NOS：51、SEQ ID NOS：52和SEQ ID NOS：53(hSUV39h2变体1至5)中任意核苷酸区域内的靶标序列。
一些具体例中，该组合物包含人类SUV39h1的siRNA抑制剂，其完全或部分地结合至SEQ ID NO：7或其至少10个接续核苷酸的片段的靶标序列，或与SEQ ID NO：7的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％的序列一致性)的核酸序列。一些具体例中，该组合物包含人类SUV39h1的siRNA抑制剂，其包含SEQ ID NO：8或其至少10个接续核苷酸的片段，或与SEQ ID NO：8的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％的序列一致性)的核酸序列。一些具体例中，该组合物包含siRNA或其它核酸抑制剂，其完全或部分地杂交至位于人类SUV39h1的SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：47(分别对应于SUV39h1变体2和变体1)中任意核苷酸区域内的靶标序列。
一些具体例中，该组合物包含siRNA或其它核酸抑制剂，其完全或部分地杂交至位于人类SUV39h2的SEQ ID NOS：15、SEQ ID NOS：49、SEQ ID NOS：51、SEQ ID NOS：52和SEQID NOS：53(hSUV39h2变体1至5)中任意核苷酸区域内的靶标序列。
一些具体例中，该组合物包含处于1细胞或2细胞或4细胞阶段的人类SCNT胚胎。一些具体例中，该组合物包含去核的人类卵母细胞或杂交卵母细胞。一些具体例中，该组合物包含人类SCNT胚胎、接纳体人类卵母细胞、人类杂交卵母细胞或人类囊胚。
另一具体例涉及一种试剂盒，该试剂盒包含(i)增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂，如，包含人类KDM4家族成员的mRNA；及/或(ii)抑制H3K9甲基转移酶的试剂。
在优选具体例中，本文中揭示的内容并不涉及用于克隆人类的过程、用于修饰人类的生殖细胞系遗传同一性、或将人类SCNT胚胎用于工业或商业目的或用于修饰人类遗传同一性的过程，该过程可能造成该胚胎受苦而对接受这些过程的人没有任何实质性医疗益处。
附图说明
图1A至1F显示，体细胞中的人类重编对抗区域(RRR)富含H3K9me3。图1A是该试验过程的示意图。用于RNA-seq的样品以虚线矩形标记。图1B植入前是IVF人类胚胎的转录组的热图图解。每一片表示通过滑动窗分析获得的区域内峰的平均值。显示了IVF胚胎中从4细胞阶段激活为8细胞阶段的707个区域。RNA-seq数据集是从现有出版物(Xue et al.，2013)获得的。图1C是比较供体体细胞、IVF与处于8细胞阶段的SCNT胚胎的转录组的热图图解。显示了图1A中鉴别的707个区域。基于SCNT胚胎与IVF 8细胞胚胎之间转录水平的倍数变化(FC)，这些区域归类为三组。FRR、PRR、及RRR分别指示完全重编的区域(FC＜＝2)、部分重编的区域(2＜FC＜＝5)和重编对抗区域(FC＞5)。图1D显示，人类纤维原细胞(Nhlf)中H3K9me3及H3K4me3的平均ChlP-seq强度，显示了与200kb侧翼区相比的FRR、PRR、和RRR内的强度。组蛋白修饰ChlP-seq数据集是从ENCODE项目(Bernstein et al.，2012；The EncodeConsortium Project，2011)获得的。图1E和图1F是箱型图，其比较不同的体细胞类型中FRR、PRR和RRR内H3K9me3-ChIP-seq(图1E)和DNasel-seq(图1F)的平均强度。ChlP-seq数据集和DNasel-seq数据集是从ENCODE项目(ENCODE Project Consortium，2011)获得的。着色区域中的中线指示中值，该边缘指示25th/75th百分位数(Dercentile)，且须状线指示2.5th/97.5th百分位数。***p＜0.001，**p＜0.01。也见图5、表5和表6。(缩写：RRR＝重编对抗区域；PRR＝部分重编区域；FRR＝完全重编区域)。
图2A至2H显示，注射人类KDM4A mRNA改善鼠SCNT胚胎和人类SCNT胚胎的发育。图2A是鼠SCNT过程的示意图。图2B显示，在mRNA注射后5小时，使用抗H3K9me3和DAPI染色的1细胞阶段SCNT胚胎的代表性细胞核图像。图2C显示，KDM4A mRNA注射极大改善了鼠SCNT胚胎的植入前发育。显示的是到达所指示阶段的胚胎的百分比。误差线指示标准偏差。图2D显示，在体外培养120小时后，SCNT胚胎的代表性图像。比例尺为100Jim。图2E是人类SCNT过程的示意图。图2F是使用来自四位不同供体的卵母细胞所获得的人类SCNT胚胎在7天的体外培养过程中的平均发育效率。使用到达2细胞阶段的胚胎数目计算效率。Blast：囊胚，ExBlast：扩展囊胚。通过确切概率法(Fisher′s exact test)对发育率进行统计学分析。图2G显示，在体外培养7天后，SCNT胚胎的代表性图像。图2H显示源自每一雌性供体卵母细胞的人类SCNT胚胎的发育率的柱状图。也见表3和表4。
图3A至3J显示从AMD患者建立NTK-ESC并表征。图3A是使用AMD患者纤维原细胞作为细胞核供体，通过KDM4A辅助SCNT紧邻的NT-ESC系的总表。图3B显示NTK-ESC的代表性相衬和免疫组化染色图像。比例尺为100Jim。图3C是基于RNA-seq数据来显示多能特异性基因和纤维原细胞特异性基因的表达水平的柱状图。图3D是散点图，比较对照ESC系(ESC 15)与代表性的NTK-ESC——NTK6之间的基因表达水平。差异表达的基因(FC＞3.0)显示为黑点。图3E显示基于RNA-seq数据集的NTK-ESC、对照ESC和供体皮肤纤维原细胞的分层聚类。图3F是在体外自发分化2周的免疫组化染色的拟胚体(EB)的代表性图像。比例尺为100Jim。图3G显示，在转移后12周，源自NTK6的畸胎瘤的代表性组织学图像。比例尺为100μm。图3H显示NTK6的细胞生成G显带分析的代表性图像。图3I显示使用16STR标记物的细胞核DNA基因分型。图3J显示代表性单核苷酸多态性(SNP)位点的线粒体DNA基因分型。也见图6和图7。图3J揭露分别作为SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59的rs2853826(m.10398 A＞G)序列，以出现先后排序；以及作为SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59的rs2853826(m.10400 C＞T)序列，以出现先后排序。
图4A至4C显示，当KDM4A mRNA注射入SCNT 8细胞胚胎时，转录的部分恢复。图4A显示热图，其比较处于晚期8细胞阶段的318个RRR的转录水平。在应答KDM4AmRNA注射方面，318个RRR中的158个的表达水平得以显着(FC＞2)增加。图4B显示206 KDM4A应答基因的基因本体论分析(FC＞2)。图4C显示，IVF或SCNT(进行或不进行KDM4A mRNA注射)8细胞胚胎中，两种代表性KDM4A应答基因UBTFL1和THOC5的转录水平的柱状图和基因组浏览。也见表7。
图5A至5E与图1相关，并显示具有异染色质特征的人类体细胞中的RRR(重编对抗区域)。图5A显示箱型图，其比较位于人类纤维原细胞(Nhlf)中FRR、PRR和RRR处的6个组蛋白修饰的平均ChlP-seq信号。图5B和5C显示箱型图，其比较不同体细胞类型中FRR、PRR和RRR内H3K9me3-ChIP-seq(图5B)和DNasel-seq(图5C)的平均强度。ChlP-seq数据集和DNasel-seq数据集是从ENCODE项目(ENCODE Project Consortium，2011)获得的。注意，与FRR和PRR相比，RRR中的H3K9me3强度相当丰富；而与FRR和PRR相比，RRR中的Dnasel-seq强度被相当贫乏。***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05。图5D显示比较外显子序列的平均百分比的箱型图，该百分比表示人类基因组的FRR、PRR和RRR中的蛋白编码基因的密度。***p＜0.001，*p＜0.05。图5E显示箱型图，其比较FRR、PRR和RRR内重复序列的平均百分比。***p＜0.001，*p＜0.05，ns：不显着。
图6A至6F与图1相关并显示，人类NTK-ESC展现正常的多能性。图6A显示NTK-ESC和源自IVF的对照ESC的代表性免疫组化染色图像。ESC克隆体使用抗SOX2抗体、抗SSEA4抗体和DAPI染色。比例尺为100μm。图6B是对照ESC和NTK-ESC的不同生物学复本的RNA-seq再现性的散点评估。图6C显示比较对照ESC与NTK-ESC之间全局基因表达模式的散点图。差异化表达的基因(FC＞3.0)显示为黑点。注意，每一成对比较的相关性极高(r＝0.95至0.99)。图6D显示在体外自发分化2周的免疫组化染色的拟胚体(EB)的代表性图像。使用抗TUJl、抗BRACHYURY或抗AFP抗体与DAPI一起染色EB。比例尺为100μm。图6E显示，在转移后12周，源自NTK-ESC#6的畸胎瘤的代表性组织学图像。比例尺为100μm。图6F显示，在转移后12周，源自NTK7细胞系和NTK8细胞系的畸胎瘤的代表性组织学图像。
图7A至7C与图3相关并显示，人类NTK-ESC含有源自细胞核供体的基因组和源自卵母细胞供体的线粒体。图7A显示细胞遗传G显带分析的代表性图像，其显示具有预期的NTK-ESC系NTK7和NTK8性染色体组合物的正常核型。图7B显示使用16 STR标记物的核DNA基因分型。注意，NTK-ESC NTK7和NTK8的所有STR标记物分别完美地匹配原始核供体纤维原细胞DFB-6和DFB-8的标记物。图7C显示代表性单核苷酸多态性(SNP)位点的线粒体DNA基因分型。NTK-ESC的线粒体排他性地源自供体卵母细胞。图7C揭露分别作为SEQ ID NO：60至SEQID NO：65的rsl 116907(m.8468 C＞T)序列，以出现先后为序；以及分别作为SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：70的rsl 116904(m.8027 G＞A)序列，以出现先后为序。
具体实施方式
尽管其在基础科学和治疗性用途两方面潜力巨大，通过体细胞核转移(SCNT)克隆人类体细胞的效率仍极低，导致发育至囊胚的效率差，且处于扩展囊胚阶段的细胞数较小。这些不足也令从克隆的人类SCNT胚胎建立人类ES细胞罕有成功。该克隆的人类胚胎的不胜任很大程度上是由于不完全的细胞核重编及/或该供体人类细胞核内的表观遗传屏障。
本发明基于下述发现：组蛋白H3-赖氨酸9的三甲基化(H3K9me3)出现在该人类供体细胞的细胞核的重编对抗区域(RRR)中，且是防止通过SCNT进行有效人类体细胞核重编的表观遗传屏障。如本文中揭露，发明人已经演示了两种改善人类SCNT效能的途径，首先通过使用KDM4去甲基化酶家族成员如KDM4A或KDM4D的外源性表达或增加的表达(如，过表达)，来促进该供体细胞核遗传物质的H3K9me3的去甲基化，及/或通过抑制组蛋白甲基转移酶如SUV39h1及/或SUV39h2来抑制H3K9me3的甲基化。一些具体例中，向杂交人类卵母细胞(如，包含来自激活之前的人类供体体细胞的核遗传物质的去核人类卵母细胞)及/或人类SCNT胚胎注射增加KDM4A及/或KDM4D(如，编码人类KDM4A蛋白或该KDM4A蛋白功能性片段的mRNA及/或编码人类KDM4D蛋白或该KDM4D蛋白功能性片段的mRNA)表达的试剂。一些具体例中，该试剂是编码人类KDM4A或KDM4D蛋白、或其同源物、或人类KDM4家族组蛋白去甲基化酶的另一成员的mRNA。
一些具体例中，向供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞(如，包含融合或激活前的供体遗传物质的去核人类卵母细胞)或人类SCNT胚胎(即，该供体细胞核与该去核卵母细胞融合后)注射编码KDM4家族成员、或mRNA或核酸或核酸类似物(包括修饰mRNA(亦称mod-RNA))的mRNA。一些具体例中，向供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞、或人类SCNT注射编码人类KDM4A蛋白或该KDM4A蛋白的功能性片段的mRNA及/或编码人类KDM4D蛋白或该KDM4D蛋白功能性片段的mRNA。一些具体例中，若注射hSCNT，则其可在激活后的任意阶段进行，如，在5hpa、或10至12hpa、或20至28hpa、1细胞阶段、2细胞阶段或4细胞阶段的hSCNT胚胎。
据此，本发明涉及方法、组合物及试剂盒，其包含H3K9me3组蛋白去甲基化酶激活因子如人类KDM4/JMJD2家族的激活剂、及/或H3K9me3甲基转移酶抑制剂如人类SUV39h1或人类SUV39h2或人类SETDB 1的抑制剂，以移除人类细胞核遗传物质中(如，人类供体基因组中)的表观遗传屏障，从而增加成功人类SCNT的效率，包括hSCNT胚胎发育至囊胚阶段及其以后的效率。
据此，本发明的多个方面涉及方法、组合物和试剂盒，其指向通过减少H3K9me3甲基化而增加人类SCNT的效率，该减少通过下述进行：(i)表达能将H3K9me3去甲基化的组蛋白去甲基化酶，如，KDM4家族组蛋白去甲基化酶的成员，例如但不限于，JMJD2A/KDM4A或JMJD2B/KDM4B、或JMJD2C/KDM4C或JMJD2D/KDM4D或JMJD2E/KDM4E；及/或(ii)抑制牵涉入H3K9me3的甲基化的组蛋白甲基转移酶，如，抑制人类SUV39h1、人类SUV39h2或人类SETDB 1的任意一种或组合。一些具体例中，增加人类KDM4家族组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂，增加KDM4E(JMJD2E)、KDM4D(JMJD2D)、KDM4C(JMJD2C)、KDM4B(JMJD2B)或KDM4A(JMJD2A)的表达或活性。
另一方面涉及使用本文中揭露的方法和组合物生产的人类SCNT胚胎，在发育为一个或多个卵裂球中的用途，该卵裂球可移除或进行活检及/或用来生成人类ES细胞(即，人类NT-ESC)。使用本文中揭露的方法生成的NT-hESC可用于多种目的，如，用于再生治疗及/或基于细胞的治疗、用于检验、以及用于疾病模型中(如，若该hNT-ESC是患者特异性的hNT-ESC，则该hSCNT胚胎是使用来自具有特定突变或SNP及/或具有罹患特定疾病倾向的人类供体受试者的基因组细胞核供体所生成的)。该hNT-ESC亦可用于检验中，如，药物筛选检验，包括但不限于，个性化药物筛选及/或疾病特异性药物筛选。使用本文中揭露的方法和组合物生成的hNT-ESC可冷冻保存，且可储存在人类NT-ESC银行中。
定义
方便起见，通篇申请(包括说明书、实施例、和所附权利要求书)中采用的某些术语收集于此。除非另有定义，本文中使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员一般理解的相同的意义。
短语“体细胞核转移”或“SCNT”一般也指代为治疗性或声之形克隆，是体细胞借以与去核卵母细胞融合的过程。体细胞的细胞核提供遗传信息，而卵母细胞提供胚胎发育所必需的营养物质和其它产生能量的材料。一旦融合已经出现，该细胞即为多能性的，且最终发育为囊胚，此时，内细胞团被单离。
本文中，术语“核转移”指的是一种基因操作技术，该技术允许通过人工组合去核卵母细胞与细胞核遗传物质或体细胞的细胞核而获取完全相同的特征和质量。一些具体例中，该核转移过程是，将来自供体体细胞的细胞核或细胞核遗传物质转移如去核的卵细胞或卵母细胞(其细胞核/原核已经被移除的卵细胞或卵母细胞)中。该供体细胞核可来自体细胞。
术语“核遗传物质”指的是在细胞核中发现的结构及/或分子，其包含编码该个体相关信息的多核苷酸(如，DNA)。核遗传物质包括染色体和核染色质。术语也指代通过细胞分裂如亲本细胞分裂为子代细胞而产生的核遗传物质(如，染色体)。核遗传物质并不包括线粒体DNA。
术语“SCNT胚胎”指的是已经与体细胞的细胞核或核遗传物质融合的去核卵母细胞的细胞、或其多能后代。SCNT胚胎可发育为囊胚，并在植入后发育为活体后代。SCNT胚胎可以是1细胞胚胎、2细胞胚胎、4细胞胚胎、或变成囊胚之前任何阶段的胚胎。
术语“亲本胚胎”用来指代自其移除或活检单一卵裂球的SCNT胚胎。活检后，剩余的亲本胚胎(亲本胚胎减去活检的卵裂球)可与该卵裂球一起培养，以帮助促进该卵裂球的增殖。随后，剩余的有活力的亲本SCNT胚胎可长期冷冻或永久储存或用于未来用途。或者，有活力的亲本胚胎可用来创造妊娠。
术语“供体人类细胞”或“供体人类体细胞”指的是被转移至作为核接受体或接纳体的接纳体卵母细胞中的体细胞或人类细胞的细胞核。
术语“体细胞”指的是一种植物细胞或动物细胞，该细胞不是生殖细胞或生殖细胞前体。一些具体例中，分化细胞不是胚细胞。体细胞与多能细胞或全能细胞不相关。一些具体例中，体细胞是“非胚胎性体细胞”，其意为不存在于胚胎中或不能从胚胎中获得且无法由此细胞在体外增殖造成的体细胞。一些具体例中，体细胞是“成年体细胞”，其意为存在于胚胎或胎儿以外的生物中或从该生物获得或可由此细胞在体外培养造成的细胞。
本文中，术语“分化细胞”指的是在分化为体细胞世系或已经终末分化的过程中的任何细胞。例如，胚胎细胞可分化为衬在肠内的上皮细胞。例如，可从胎儿或新生活体动物单离该分化细胞。
在细胞个体发生学的情形下，形容词“分化的”、或“分化”是相对项，其意为，与其正在进行比较的细胞相比，“分化的细胞”已经进一步行进至发育途径的下游。因此，干细胞可分化为世系限定的前体细胞(如中胚层干细胞)，其依次可分化为处于该途径内下游处的其它类型的前体细胞(如心肌细胞前体)，随后分化为末期分化细胞，其在某些组织类型中扮演特征角色，且可保持或不保持进一步增殖的能力。
本文中，术语“卵母细胞”指的是已经到达成熟中期II的成熟卵母细胞。卵母细胞也用来揭示牵涉入生殖的雌配子或胚细胞，且一般被称为卵。成熟的卵具有一套母系染色体(在人类灵长类中为23、X)，且在中期II停止。
“杂交卵母细胞”指的是去核的卵母细胞，其具有来自第一人类卵母细胞(称为“接纳体”)的细胞质，但不具有该接纳体卵母细胞的核遗传物质；其具有来自被称为“供体”的另一人类细胞的核遗传物质。一些具体例中，该杂交卵母细胞还可包含线粒体DNA(mtDNA)，其并非来自该接纳体卵母细胞，而是来自供体细胞(其可以是与该核遗传物质相同的供体细胞、或来自不同的供体如来自供体卵母细胞)。
本文中，术语“去核卵母细胞”指的是其细胞核已经被移除的人类卵母细胞。
本文中，术语“去核”指的是一种过程，借由该过程，细胞的核材料被移除，仅留下细胞质。当应用于卵时，去核指的是移除未被核膜环绕的母系染色体。术语“去核卵母细胞”指的是其核材料或细胞核被移除的卵母细胞。
本文中，“接纳体人类卵母细胞”指的是，在移除其原始细胞核后接受来自人类细胞核供体的细胞核的人类卵母细胞。
本文中，术语“融合”指的是细胞核供体系统与接纳体卵母细胞的脂质膜的组合。例如，该脂质膜可以是细胞的浆膜或核膜。当将细胞核供体细胞与接纳体卵母细胞彼此相邻放置时或当将细胞核供体细胞置于接纳体卵母细胞的卵周隙时，若向细胞核供体细胞与接纳体卵母细胞之间施加电刺激，则可出现融合。
本文中，术语“激活”指的是在核转移之前、之中或之后刺激细胞分裂。优选地，在本发明中，其意为在核转移之后刺激细胞分裂。
本文中，术语“活体后代”意为可在子宫内存活的动物。其优选为可存活1秒、1分钟、1天、1周、1个月、6个月或超过1年的动物。该动物可能不需要用于存活的子宫内环境。
术语“产前”指的是存在或出现于出生之前。同样，术语“产后”指的是存在或出现于出生之后。
本文中，术语“囊胚”指的是植入胎盘哺乳动物前的约30至150个细胞的胚胎(对于鼠，受精后约3天；对于人类，受精后约5天)。囊胚阶段跟随桑椹胚阶段，且可同期其独特的形貌予以区别。囊胚由以细胞层(滋养外胚层)、充以流体的腔(卵裂腔或囊胚腔)、及内部的细胞簇(内细胞团、或ICM)构成的球组成。如果将囊胚植入子宫，则由未分化细胞组成的ICM导致将会变为胎儿的物质。如果在培养物中生长这些相同的ICM细胞，这些细胞形成胚胎干细胞系。植入时，鼠囊胚由约70滋养层细胞和30 ICM细胞构成。
本文中，术语“囊胚泡”指的是胚胎发育的早期阶段，其由被称为卵裂腔的封闭充以流体的腔的细胞中空球组成。术语囊胚泡有时与囊胚可互换地使用。
术语“卵裂球”通篇使用，指的是从植入前胚胎获得的至少一个卵裂球(如，1、2、3、4个等)。术语“两个或更多个卵裂球的簇”与“源自卵裂球的产物”可互换使用，指的是在卵裂球的体外培养过程中生成的细胞。例如，从SCNT胚胎获得卵裂球并初步培养后，其通常分裂至少一次，以产生两个或更多个卵裂球的簇(亦称为源自卵裂球的产物)。该簇可进一步与胚胎细胞或胎儿细胞一起培养。最后，该源自卵裂球的产物将继续分裂。从这些结构中，ES细胞、全能干(TS)细胞、及部分分化的细胞类型将在该培养方法进程过程中发育。
本文中，术语“细胞核”指的是细胞的核，其通过去核从细胞获得，由细胞质的窄边缘和浆膜环绕。
本文中，术语“细胞结对”指的是在融合及/或激活之前的去核卵母细胞与体细胞核或胎儿细胞核。
本文中，术语“裂解模式”指的是非常早期的胚胎中细胞分裂的模式；每一物种的生物显示可在显微镜下观察的特征裂解模式。违背该特征模式，一般表明胚胎是不正常的，因此，裂解模式用作胚胎的植入前筛选准则。
本文中，术语“克隆体”指的是DNA分子、细胞、组织、器官、或整个植物或动物、或具有与另一生物相同的核基因组的生物的确切遗传复制品。
本文中，术语“克隆的(或克隆)”指的是基因操作技术，其用来制备具有与另一个体单元完全相同的成套基因的新个体单元。本发明中，本文中的术语“克隆的”指的是细胞、胚胎细胞、胎儿细胞、及/或动物细胞，其具有与另一细胞、胚胎细胞、胎儿细胞、分化细胞、及/或动物细胞的核DNA序列基本相似或完全相同的核DNA序列。术语“基本相似”和“完全相同”揭示于本文中。克隆的SCNT胚胎可能由一种核转移造成，或者，克隆的SCNT胚胎可能由包括至少一个再克隆步骤的克隆过程造成。
本文中，术语“转基因生物”指的是一种生物，其已经通过实验转移来自另一生物的遗传物质，因此，宿主的染色体组合物中获得被转移的基因特质。
本文中，术语“胚胎拆分”指的是将早期胚胎单离为两个或更多个具有完全相同的基因构成的胚胎，本质上创造完全相同的双胞胎或多胞胎(三胞胎、四胞胎等)。
本文中，术语“桑椹胚”指的是受精后3至4天的植入前胚胎，该桑椹胚是由12至32个细胞(卵裂球)构成的固体团。在8细胞阶段后，植入前胚胎的细胞开始彼此更紧密粘合，变为“紧实的”。所得胚胎类似于桑椹，称为桑椹胚(拉丁语中桑属＝桑椹)。
术语“胚胎干细胞”(ES细胞)指的是源自囊胚或桑椹胚的内细胞团的多能细胞，其已经连续发育为细胞系。ES细胞可能源自使用精子或DNA、核转移如SCNT、单性生殖等对卵细胞进行的受精。术语“人类胚胎干细胞”(hES细胞)指的是人类ES细胞。术语“ntESC”指的是从SCNT胚胎生产的囊胚或桑椹胚的内细胞团获得的胚胎干细胞。“hNT-ESC”指的是从人类SCNT胚胎生产的囊胚或桑椹胚的内细胞团获得的胚胎干细胞。ESC的生成揭露于美国专利US 5,843,780、US 6,200,806中，而从源自体细胞核转移的囊胚的内细胞团获得的ESC揭示于美国专利US 5,945,577、US 5,994,619、US 6,235,970中，这些专利通过引用而以其整体并入本文。胚胎干细胞的区别特征定义胚胎干细胞表型。据此，若细胞具备胚胎干细胞的一个或多个独特的特征并因此可与其它细胞区别，则该细胞具有胚胎干细胞的表型。例示性的区别胚胎干细胞特征包括而不限于，基因表达谱、增殖能力、分化你能来、核型、对特定培养条件的应答能力等。
本文中，术语“多能的”指的是一种细胞，其具有在不同的条件下分化为超过一种不同的分化细胞类型的能力，且优选具有分化为全部三层胚细胞层的细胞类型特征的能力。多能细胞的首要特征为，使用例如裸鼠畸胎瘤形成检验，分化为超过一种细胞类型，优选全部三层胚层的能力。此类细胞包括hES细胞、源自人类胚胎的细胞(hEDC)、源自人类SCNT胚胎的干细胞和源自成年人的干细胞。多能干细胞可经基因修饰(geneticallymodified)或不经基因修饰。经基因修饰的细胞可包括标记物，如荧光蛋白，以促进其鉴别。多能性也由胚胎干(ES)细胞标记物的表达证实，但优选的多能性测试为证明分化为三层胚层每一层的细胞的能力。应注意，简单地培养此类细胞就其自身而言并不能令他们称为多能细胞。重编的多能细胞(如，其术语定义于本文中的iPS细胞)还具有下述特征：相对于通常在培养物中仅具有有限数目的分裂的初代细胞亲本，重编的多能细胞具有扩展通路而不损失生长潜力的能力。
本文中，关于SCNT胚胎的术语“全能的”指的是可发育为活体出生动物的SCNT胚胎。
本文中，术语“iPS细胞”和“诱导多能干细胞”可互换使用，且指代通过例如诱导一种或多种基因的强制表达而自非多能细胞人工导出(如，诱导或通过完全逆转)的多能干细胞。该非多能细胞典型为成年人体细胞。
本文中，术语“重编”指的是一种过程，其改变或逆转分化状态的体细胞，因此，细胞核的发育时钟被复位；例如，复位发育状态的成年人分化细胞核，因此，其可携带早期胚胎细胞核的遗传程序，作出胚胎发育所需的所有蛋白质。一些具体例中，供体人类细胞在通过SCNT重编之前进行终末分化。如本文中揭露，重编涵盖分化状态的体细胞至多能或全能细胞的完全逆。重编通常包括对在细胞分化过程中随着受精卵发育为成体而出现的核酸修饰(如，甲基化)、染色质凝聚、表观遗传变异、基因组印迹等的至少一部分的改变如逆转。在体细胞核转移(SCNT)中，接纳体卵母细胞的细胞质的群组分被认为在重编体细胞核以实现胚胎核的功能中扮演重要角色。
本文中，关于SCNT胚胎的术语“培养”指的是牵涉将胚胎在培养基中放置的实验室过程。SCNT胚胎可在培养基中放置适宜的时间，以令该SCNT胚胎保持静态但在该培养基中具备功能，或令该SCNT胚胎在培养基中生长。适用于培养胚胎的培养基是该领域技术人员所熟知的。见，如，First等人在1993年5月25日提交的题为《牛胚胎的体外培养(In vitroCulture of Bovine Embryos)》美国专利US 5,213,979和Rosenkrans，Jr.等人在1992年3月17日递交的题为《牛胚胎培养基(Bovine Embryo Medium)》的美国专利US 5,096,822，其通过引用而以其包括全部附图、表格和图式的整体并入本文。
术语“培养基”可与“适当介质”可互换使用，且指的是允许细胞增殖的任何介质。该适当介质不需要促进最大增殖，仅促进可测量的细胞增殖。一些具体例中，该培养基将细胞维持在多能或全能状态。
本文中，如本文中揭露的关于SCNT胚胎的术语“植入”指的是将本文中揭示的SCNT胚胎放入代孕雌性动物体内。这一技术是该领域技术人员所周知的。见，如，Seidel和Elsden，1997年，奶牛胚胎移植(Embryo Transfer in Dairy Cattle)，W.D.Hoard&Sons，Co.，Hoards Dairyman。可令胚胎在子宫内发育，或者，可在分娩前将胎儿从子宫环境中移除。
本文中，术语“试剂”意为任何化合物或物质，例如但不限于，小分子、核酸、多核苷酸、肽、药物、离子等。“试剂”可以是任何化学品、整体或部分，包括而不限于，合成的和天然出现的蛋白质整体和非蛋白质整体。一些具体例中，试剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适配体、核酸的寡聚体、氨基酸、或碳水化合物，包括而不限于，蛋白质、寡核苷酸、酶性核酸、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适配体、及其修饰和组合等。某些具体例中，试剂是具有化学部分的小分子。例如，包括化学部分的未取代或取代的烷基、芳基、或杂环基部分，包括大环内酯类、莱普霉素类(leptomycins)和相关的天然产物或其类似物。化合物可已知具有所希望的活性及/或性质，或可选自多种化合物的库。
本文中，术语“接触”(即，将人类供体细胞、人类接纳体卵母细胞、杂交卵母细胞、或人类SCNT胚胎与试剂接触)意图包括将该试剂试剂和该人类细胞、人类卵母细胞、杂交卵母细胞或hSCNT胚胎一起在体外孵化(如，将该试剂试剂加至该供体人类细胞、人类卵母细胞、杂交卵母细胞或hSCNT胚胎在培养基中或容器中孵化)。一些具体例中，术语“接触”并不意图包括在体外将细胞暴露于本文中揭露的试剂，而该暴露可在受试者体内天然出现(即，可能作为天然生理过程的结果而出现的暴露)。将人类体细胞、人类卵母细胞、杂交卵母细胞或hSCNT胚胎与试剂接触的步骤可以任何适当方式实施。例如，可在贴壁培养或悬浮培养中处理人类体细胞、人类卵母细胞、杂交卵母细胞或hSCNT胚胎。应理解，人类体细胞、人类卵母细胞、杂交卵母细胞或hSCNT胚胎可如本文中揭露的与试剂接触，亦可同步或随后接触另一试剂如生长因子或其它分化试剂或缓解，以稳定该细胞或进一步分化该细胞。同样，人类体细胞、人类卵母细胞、杂交卵母细胞或hSCNT胚胎可与本文中揭露的试剂(如，KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子或mRNA)接触，随后与本文中揭露的第二剂(如，H3K9甲基转移酶抑制剂)接触，或反之亦然。一些具体例中，人类体细胞、人类卵母细胞、杂交卵母细胞或hSCNT胚胎如本文中揭露的接触剂或如本文中揭露的接触第二剂，且该接触时暂时隔离的。一些具体例中，人类供体细胞、人类体细胞、人类卵母细胞、杂交卵母细胞或hSCNT胚胎如本文中揭露的基本上同时与一种或多种剂接触(如，基本上同时与KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子(如，KDM4D mRNA)和H3K9甲基转移酶抑制剂接触)。
术语“外源性”指的是以除其天然来源或水平以外的方式存在于细胞或生物体内的物质。例如，术语“外源性核酸”或“外源性蛋白”指的是，已经通过牵涉人工进入生物学系统如细胞或生物体而引入的核酸或蛋白质，其中，正常情况下，该生物学系统中没有发现该核酸或蛋白质，或者，正常情况下，所引入的核酸或蛋白以较低的量被发现。如果一种物质被引入继承该物质的细胞或细胞始祖中，则认为该物质是外源性的。与之相反，术语“内源性”指的是生物学系统或细胞当时原生的物质。例如，“外源性KDM4A”指的是，引入正常情况下没有发现或以其当时被引入细胞或生物体的水平表达的KDM4A mRNA或cDNA。
术语“表达”指的是牵涉合适地生产RNA和蛋白质的细胞过程，例如，转录、转译、折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从通过转译从基因转录的mRNA而获得的基因和多核苷酸转录的RNA。
术语“线粒体DNA”与“mtDNA”可互换使用，且指的是线粒体的DNA，线粒体是一种位于细胞的细胞质内而非细胞核(其中，全部其它染色体均位于此)内的结构。在体内，所有的mtDNA均继承自母体。在每一线粒体中，存在mtDNA基因组的2至10个拷贝。mtDNA是双链的环状分子。相对于细胞核内的染色体，mtDNA非常小且仅包括有限数目的基因，如那些编码线粒体呼吸链复合体中大量亚单元的基因和用于某些核糖体RNA和转移RNA的基因。细胞包括源自细胞质地基于线粒体的连续复制的mtDNA，在纺锤转移的情形下，其是基于接纳体细胞质的。
术语“线粒体疾病”指的是影响线粒体功能及/或由线粒体DNA造成的疾病和病变。mtDNA被排他性地自母系继承。通常，这些疾病是由于氧化磷酸化的病变。线粒体疾病一般由线粒体基因中的致病性突变造成。该突变通常是异质的，因此存在正常DNA与突变DNA的混合物，其水平在不同组织中可变。但是，一些突变是同质的，故它们存在于100％的mtDNA中。后代中点突变的异质性百分比与母体的突变百分比相关。存在种群遗传瓶颈效应，该效应在卵母细胞的发育过程中出现。
“遗传修饰的”或“工程化的”细胞指的是一种细胞，且已经通过牵涉人工(或词细胞的后裔已经继承至少部分的该核酸)的过程将外源性核酸引入该细胞内。例如，该核酸可含有对于该细胞为外源性的序列，其可含有原生序列(即，天然见于该细胞内的序列)但以非天然出现的排列方式呈现(如，编码区域，其链接至来自不同基因的启动子)，或是原生序列的变异版本等。将细胞核转移至细胞内的过程可通过任何适当技术实现。适当的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔、和使用病毒载体的转导或感染。一些具体例中，多核苷酸或其部分被整合入该细胞的基因组内。该核酸可随后已经被从该基因组移除或切除，条件是，该移除或切除在该细胞内导致可检测的相对于未修饰但在其它方面等效的细胞的改变。
术语“同一性”指的是两个或更多个核酸或多肽的序列相同的程度。可通过对准感兴趣的序列与第二序列；确定评估窗内如感兴趣的序列长度上，处于同一残基对侧的允许引入缝隙以最大化同一性的残基(核苷酸或氨基酸)数；除以落入该窗内的该感兴趣的序列或该第二序列(无论哪个更长)的残基总数；再乘以100，从而计算出两个序列的同一性百分比。当计算实现特定的同一性百分比所需的同一残基的数目时，将分数四舍五入至最接近的整数。可使用该领域已知的多种计算机程序计算同一性百分比。例如，计算机程序如BLAST2、BLASTN、BLASTP、Gapped BLAST等生成感兴趣的序列间的对准并提供同一性百分比。将如Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993中所述修饰的Karlin和Altschul的算法(Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：22264-2268，1990)并入Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(Altschul，et al，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)中。为了获得用于比较目的的有隙对准，使用Gapped BLAST，如Altschul等人所揭示(Altschul，et al.Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各程序的缺省参数。可使用APAM250或BLOSUM62矩阵。用于上述BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information(NCBI))公开获得。可自网址为www.ncbi.nlm.nih.gov的网站获取这些程序。具体的具体例中，使用具有NCBI提供的缺省参数的BLAST2计算同一性百分比。一些具体例中，核酸或氨基酸序列与另一核酸或氨基酸序列的序列一致性为至少80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％或至少约99％。
本文中，在核酸或多肽的情形中，术语“单离的”或“部分纯化的”指的是，核酸或多肽与至少一种其它组分(如，核酸或多肽)单离，其中，该至少一种其它组分在其天然来源中被发现与该核酸或多肽同时存在，及/或当被细胞表达或在分泌多肽的情形下被细胞分泌时，该至少一种其它组分将会与该核酸或多肽同时存在。化学合成的核酸或多肽或使用体外转录/转译合成的核酸或多肽被认为是“单离的”。“单离的细胞”是，已经从最初发现该细胞或作为该细胞后裔的生物体移除的细胞。视情况，该细胞已经例如在其它细胞的存在下在体外培养。视情况，该细胞后来被引入第二生物体内或再次引入该细胞自其单离(或作为该细胞后裔)的生物体内。
本文中，关于细胞的单离的群体的术语“单离的群体”指的是细胞的群体，其已经从混合的或异源的细胞群体中移除并分隔。一些具体例中，与该细胞自其单离或自其富集的异源群体相比，单离的群体是基本上纯的细胞群体。
关于特定细胞群体的术语“基本上纯的”指的是，关于构成总细胞群体的细胞，纯度为至少约75％、优选至少约85％、更优选至少约90％、且最优选至少约95％的细胞群体。而且，关于定形内胚层细胞的群体，术语“基本上纯的”或“实质上纯的”指的是，非定形内胚层细胞或如本文中术语定义的其后裔细胞的含量少于约20％、更优选少于约15％、10％、8％、7％、最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％、或低于1％的细胞群体。一些具体例中，本发明涵盖扩展定形内胚层细胞群体的方法，其中，该定形内胚层细胞的扩展群体是基本上纯的定形内胚层细胞群体。同样，关于源自SCNT的干细胞或多能干细胞的“基本上纯的”或“实质上纯的”群体指的是，非干细胞或如本文中术语定义的其后裔细胞的含量少于约20％、更优选少于约15％、10％、8％、7％、最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％、或低于1％的细胞群体。
本文中，术语“富集”或“富集的”可互换使用，且意为一种类型的细胞的产率(分数)比在开始培养或制备中的细胞类型的分数增加至少10％。
本文中，术语“更新”或“自更新”或“增殖”可互换使用，用来指代干细胞在长时间内及/或多个月至几年内通过分裂为相同的非特化细胞类型而更新自身的能力。一些情形下，增殖指的是细胞通过重复单个细胞分裂为完全相同的子代细胞的过程而实现的扩展。
本文中，术语“世系”揭示具有共同祖先的细胞或具有共同发育命运的细胞。在细胞为内胚层起源或为“内胚层世系”的语境中，这一术语意为该细胞源自内胚层细胞且可沿着内胚层世系限制途径分化，如导致定形内胚层细胞的一个或多个发育世系途径，该定形内胚层细胞依次可分化为肝细胞、胸腺、胰腺、肺和肠。
本文中，术语“异种的”指的是源自不同物种的细胞。
本文中，术语“标记物”用来揭示细胞的特征及/或表型。标记物可用于对包含感兴趣的特征的细胞的选择。标记物将随着具体的细胞而变。标记物是特有的，而无论特定细胞类型的细胞或该细胞类型所表达的分子的形貌、功能或生化(酶学)特征。此类标记物优选为蛋白质，更优选具备用于抗体或该领域中可获得的其它结合分子的表位。但是，标记物可由细胞中发现的任何分子组成，包括但不限于，蛋白质(肽和多肽)、脂质、多糖、核酸和类固醇。形貌特征或特性的实例包括但不限于，形状、大小、以及细胞核与细胞质的比。功能性特征或特性的实例包括但不限于，粘附至特定底物的能力、合并或排除特定染料的能力、在特定条件下迁移的能力、以及沿着特定世系分化的能力。标记物可通过该领域技术人员可获得的任何方法检测。标记物亦可为不存在形貌特征或不存在蛋白质、脂质等。标记物可以是多肽存在和不存在的一组独特的特征和其它形貌特征。
术语“调节”以其在该领域中的用途一贯地使用，即，意为造成或促使感兴趣的过程、途径、或现象的定性或定量改变、变异、或修饰。没有限制，此改变可以是过程、途径、或现象的不同组分或分支的增加、降低、或改变。“调节子”是造成或促使感兴趣的过程、途径、或现象的定性或定量改变、变异、或修饰的试剂。
本文中，术语“RNA干扰”或“RNAi”以其在该领域中的用途一贯地使用，指的是双链RNA(dsRNA)借以触发序列特异性降解或与该dsRNA链互补的相应mRNA的转译阻抑的现象。应了解，dsRNA链与mRNA之间的互补性无需为100％，而仅需要足以介导对基因表达的抑制(也指代为“静默”或“敲除”)。例如，互补性程度应如此，以致该链可(i)引导RNA诱导静默复合体(RISC)中mRNA的裂解；或(ii)造成对mRNA的转译阻抑。某些具体例中，该RNA的双链部分的长度小于约30个核苷酸，如，长度为17至29个核苷酸之间。在哺乳动物细胞中，可通过将适宜的双链核酸引入该细胞内，或在细胞内表达核酸，随后对该细胞进行细胞内加工以在其内部获得dsRNA，从而实现RNAi。本文中，能介导RNAi的核酸称为“RNAi剂”。例示性的能介导RNAi的核酸为短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)、和microRNA前体。这些术语是周知的，且在本文中以其在该领域中的意义一贯地使用。siRNA典型包含两条独立的核酸链，该两条核酸链彼此杂交以形成双螺旋体。它们可在体外合成，如使用标准核酸合成技术合成。它们可包含各种各样的修饰核苷、核苷类似物，且可包含经化学或生物学修饰的碱基、经修饰的骨架等。可使用该领域公认的可用于RNAi的任何修饰。一些修饰导致增加的稳定性、细胞摄取、效价等。某些具体例中，该siRNA包含长度为约19个核苷酸的双螺旋体，以及一个或两个长度为1至5个核苷酸的3′悬垂，该悬垂可由脱氧核糖核苷酸构成。shRNA包含单个核酸链，该核酸链含有两个由主要为非自互补的区域分隔的互补部分。该互补部分杂交以形成双工结构，且该非自互补区域形成连接该双螺旋体一条链的3′端与另一条链的5′端的环圈。shRNA进行细胞内加工，以生成siRNA。
术语“可选择的标记物”指的是基因、RNA、或蛋白质，当该标记物被表达时，赋予细胞以可选择的表型，如对细胞毒性剂或细胞抑制剂的抗性(如，抗生素抗性)、营养的原养型、或特定蛋白质的表达，其可用作区别表达蛋白质的细胞与不表达蛋白质的细胞的基础。其表达可轻易检测的蛋白质，如荧光蛋白或发光蛋白或作用于底物以生产有色的、荧光的、或发光物质的酶(“可检测的标记物”)，构成可选择的标记物的子集。链接至产自于在多能细胞中选择性或排他性地正常表达的基因的表达控制元件的可选择标记物的存在，令鉴别和选择已经重编为多能状态的体细胞成为可能。可使用各种可选择的标记物基因，如新霉素抗性基因(neo)、嘌呤霉素抗性基因(puro)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶(ada)、嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(PAC)、潮霉素抗性基因(hyg)、多药抗性基因(mdr)、胸苷激酶(TK)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、和hisD基因。可检测的标记物包括绿色荧光蛋白(GFP)；蓝色、青色、黄色、红色、橙色和蓝绿色荧光蛋白；以及这些荧光蛋白的任意变体。亦可使用发光蛋白如荧光素酶(如，萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶)。对该领域技术人员显而易见，本文中，术语“可选择的标记物”可指代基因或指代基因的表达产物如编码的蛋白质。
术语“小分子”指的是具有多个碳-碳键且分子量小于1500道尔顿的有机化合物。这些化合物典型包含一个或多个介导与蛋白质的结构性相互作用如氢键键结的官能团，且典型至少包括氨基、羰基、羟基或羧基，且在一些具体例中，包含至少两个化学官能团。该小分子剂可包含由一个或多个化学官能团及/或杂原子取代的环状碳环或杂环结构及/或芳香族或多环芳香族结构。
本文中，术语“多肽”指的是氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。肽是相对短的多肽，长度典型为约2至60个氨基酸之间。本文中使用的多肽典型含有氨基酸，如蛋白质中最常见的20种L-氨基酸。但是，可使用该领域中已知的其它氨基酸及/或氨基酸类似物。多肽中的一个或多个氨基酸可经修饰，例如，通过加入化整体如碳水化合物基团、磷酸酯基团、脂肪酸基团、接合用的链接基、功能化等修饰。具有与之共价或非共价关联的非多肽部分的多肽，仍被认为是“多肽”。例示性的修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可从天然来源纯化，使用重组DNA技术生产，通过化学手段如传统的固相肽合成方法合成，等等。本文中，术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可指代多肽材料本身，及/或指代生化表征多肽的序列信息(即，作为氨基酸名称缩写而使用的连续的字母或三字母的密码子)。除非另做说明，本文中呈现的多肽序列为N端至C端呈现。
关于多肽或核酸序列的术语“变体”可能是，如，与全长度多肽或核酸序列的序列一致性为至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％的多肽或核酸序列。一些具体例中，变体可以是全长度多肽或核酸序列的片段。一些具体例中，变体可以是天然出现的剪接变体。例如，Suv39h1(Gene ID：6839)具有两个非此即彼的剪接变体，变体1生产Suv39h1亚型1蛋白(长转录本且编码较长的亚型)且对应于mRNA NM_001282166.1和蛋白NP_001269095.1，而变体2生产Suv39h1亚型2，与变体1相比，变体2在5′UTR方面不同，缺少5′编码区域，且在交替起始密码子处启动转录。所编码的Suv39h1亚型(2)蛋白较短，且具有与亚型1截然不同的N端。用于Suv39h1亚型2的mRNA是NM_003173.3，其编码对应于NP_003164.1的亚型2蛋白。变体可以是多肽或核酸序列，其与长度为全长度多肽或全长度核酸序列的至少50％的片段的序列一致性为至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％，其中，该片段的长度为具有感兴趣的活性的全长度野生型多肽或核酸序列的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％。例如，KDM4d的变体具有将SCNT效率增加至与KDM4d多肽或KDM4d核酸序列相同或相似程度的能力。
本文中，术语“功能性片段”或“生物学活性片段”可互换使用，指的是一种多肽，其具有尺寸上小于其作为片段所来自的多肽的氨基酸序列，其中，该功能性片段多肽的生物作用是其作为片段所来自的多肽的至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％或超过100％，例如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。功能性片段多肽可具有额外的功能，该额外的功能可包括降低的抗原性、增加的DNA结合(如在转录因子中)、或改变的RNA结合(如在调整RNA稳定性或降解中)。一些具体例中，该生物学活性片段与其作为片段所来自的多肽基本上同源。未受限于理论，KDM4A的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子的功能性片段的例示性实例包含SEQ ID NO：9的片段(如，其中，该片段的长度为SEQ ID NO：9的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同的方法且在相同的条件下，该功能性片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：9的氨基酸的KDM4A多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％或超过100％，例如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。一些具体例中，SEQ ID NO：9的生物学活性片段缺少位于SEQ ID NO：9的C端或N端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。一些具体例中，SEQ ID NO：9的生物学活性片段缺少位于SEQ ID NO：9的C端和N端两端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。一些具体例中，可使用SEQ ID NO：12的KDM4D的生物学活性片段，例如，SEQ IDNO：12的包含SEQ ID NO：12的氨基酸1至424的生物学活性片段，如Antony等人，自然(Nature)，2013年中所揭露。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ IDNO：12的氨基酸1至424(如，对应于SEQ ID NO：13的片段)。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段也缺少位于SEQ ID NO：12的氨基酸1至424的C端和N端两端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：12的氨基酸1至424，其亦缺少位于SEQ ID NO：12的氨基酸1至424的C端和N端两端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。
本文中，关于核酸序列的术语“功能性片段”或“生物学活性片段”指的是一种核酸序列，其在尺寸上小于其作为片段所来自的核酸序列，其中，该核酸序列的生物作用是其作为生物学活性片段所来自的多肽的至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％或超过100％，例如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。未受限于理论，KDM4A的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子的核酸序列的例示性实例包含SEQ ID NO：1的片段(如，其中，该片段的长度为SEQ ID NO：1的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同的方法且在相同的条件下，该核酸序列增加SCNT效率的能力是SEQ ID NO：1的KDM4A核酸序列的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％或超过100％，例如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。
应用于单离的细胞的术语“处理”、“处置”等，包括令细胞经历各种进程或条件或对该细胞实施各种操作或过程。当应用于受试者时，该术语指的是向个体提供医疗或外科关注、护理、或管理。该个体通常为患病中(苦于疾病或其它受到医疗/外科关注的状况)或受伤、或处于相对于群体平均成员增加的患病风险下且需要此关注、护理、或管理。本文中，“个体”与“受试者”可互换使用。在本发明的任何具体例中，该“个体”可以是人，如，苦于细胞疗法所使用的疾病或处于该疾病风险下的人(“指示的”)。
本文中，关于发情周期的术语“同步的”或“同时的”指的是，该领域技术人员周知的辅助生殖技术。这些技术完全揭示于先前段落中引用的参考文献中。典型地，使用雌性激素和孕酮激素令该雌性动物的发情周期与胚胎的发育周期同步。本文中，术语“发育周期”指的是本发明的胚胎和该胚胎内每一细胞分裂之间存在的时期。这一时期对于胚胎是可预测的，且可与接纳体动物的发情周期同步。
本文中，短语核DNA序列的术语“基本上类似”指的是两个几乎完全相同的核DNA序列。该两个序列的区别为核DNA复制过程中正常出现的复制错误差异。基本相似的DNA序列的一致性优选大于97％，更优选大于98％，且最优选大于99％。通过下述测量一致性：两个序列中一致残基的数目除以残基的总数，并将结果乘以100。因此，完全一样的相同序列的两个拷贝的一致性为100％，而保守程度较低且具有删除、加入、或替代的序列具有较低程度的一致性。该领域技术人员将认识到，几种计算机程序可用来实施序列比对并确定序列一致性。
术语“降低”、“减少”、“减轻”或“下降”或“抑制”全部用于本文中，通常意为下降统计学显着的量。然而，为避免疑问，“降低”、“减少”、“减轻”或“下降”或“抑制”意为，与参考水平相比，降低至少10％，例如，降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或高达且包括100％的下降(即，与参考样品相比的缺失水平)、或与参考水平相比介于10％至100％之间的下降。
术语“增加的”/“增加”或“提升”或“激活”全部用于本文中，通常意为增加统计学显着的量；为避免任何疑问，术语“增加的”/“增加”或“提升”或“激活”意为，与参考水平相比，增加至少10％，例如，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或高达且包括100％的增加或与参考水平相比介于10％至100％之间的增加、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加、或与参考水平相比介于2倍至10倍或更多倍之间的增加。
术语“统计学显着”或“显着”指的是统计学显着性，且通常意为比该标记物的正常浓度低两个标准偏差(2SD)或更低。术语指的是存在差异的统计学证据。它被定义为，当虚无假设是实际上的真实时，做出决定以拒绝该虚无假设的概率。该决定一般使用p值做出。
本文中，术语“包含”是关于组合物、方法及其各自成分而使用的，对于本发明而言是必要的，但存在包含未具化元件的可能性而无论该元件必要与否。
本文中，术语“主要由...构成”指的是给定具体例所需要的元件。该术语许可不在材料上影响本发明该具体例的新颖或功能特征的额外元件的存在。
术语“由...构成”指的是本文中揭示的组合物、方法、及其各自组分，该术语排除在该具体例的说明中未列举的任何元件。
如本说明书和所附权利要求书中所使用，除非明确排除，单数形式“一(a，an)”和“该(the)”包括复数参考项。因此，例如，关于“本方法”包括一种或多种方法、及/或本文中揭示的及/或该领域技术人员阅读本公开等等时显而易见的类型。
应理解，前述详细说明书和后文实施例仅做例示用，且不应视为对本发明范畴的限制。可作出对于该领域技术人员为显而易见的对所揭露具体例的多种改变和修饰，而不悖离本发明的精神和范畴。再者，所鉴别的全部专利、专利申请、和出版物通过引用明显地并入本文而用于揭示和揭露的目的，例如，这些出版物中揭示的方法可与本发明关联使用。这些出版物的内容中，仅在本申请提交日期之前的内容被提供使用。就这一点而言，什么都不应视为承认发明人没有凭借先前发明或任何其它原因而有提早日期的资格。所有关于日期的声明或关于这些文档内容的陈述都基于申请人可获得的信息，且不构成任何对日期或正向文档内容的正确性的承认。
KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子
一方面，本发明提供增加人类SCNT效率的方法，该方法包含：令供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞(如，包含融合或激活前的供体遗传物质的去核人类卵母细胞)或人类SCNT胚胎(即，该供体细胞核与去核卵母细胞融合后)的细胞核或细胞质，与抑制组蛋白甲基化，特别是抑制H3K9甲基化，特别是抑制H3H9me3三甲基化的试剂接触。一些具体例中，该试剂是KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子。
一些具体例中，可用于本文中揭示的方法、组合物和试剂盒中的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子是增加编码KDM4家族组蛋白去甲基化酶的基因的表达、或增加人类KDM4家族组蛋白去甲基化酶的活性的试剂，例如，人类KDM4A、人类KDM4B、人类KDM4C或人类KDM4D。一些具体例中，该试剂增加KDM4D(JMJD2D)或KDM4A(JMJD2A)的表达或活性。
一些具体例中，可用于本文中揭示的方法、组合物和试剂盒的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子是编码KDM4A多肽、或KDM4A多肽、或其变体或生物学活性片段的核酸剂。本文中，该人类KDM4A核苷酸序列对应于基因银行(Genbank)保藏号NM_014663.2，且指的是SEQID NO：1。KDM4A也称为赖氨酸(K)特异性去甲基化酶4A、JMJD2、JMJD2A、“含2的jumonji域”、或“含2A的jumonji域”。该人类KDM4A蛋白质对应于基因银行保藏号NP_055478.2(SEQ IDNO：9)。据此，KDM4A的蛋白序列如下：
一些具体例中，该试剂包含人类KDM4A(SEQ ID NO：1)的核酸序列，或是与其序列的一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)的其生物学活性片段或同源物或变体，该试剂将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：1相应序列的程度。一些具体例中，该组合物包含对应于SEQ IDNO：1的人类KDM4A核酸序列或其生物学活性片段，其将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：1的核酸序列的程度。
一些具体例中，在本文中揭露的方法中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自编码任何人类KDM4A多肽的核酸剂、或编码人类KDM4A多肽的任何变体或生物学活性片段的核酸剂。一些具体例中，在本文中揭露的方法中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自人类KDM4A多肽、或该人类KDM4A多肽的变体或生物学活性片段。本发明中涵盖，该领域技术人员可鉴别人类KDM4A多肽的适宜的人类同源物、及编码该人类同源物的用于本文中揭露的方法和组合物中的核酸。
一些具体例中，可用于本文中揭示的方法、组合物和试剂盒中的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子是编码该KDM4B多肽、或KDM4B多肽、或其变体或生物学活性片段的核酸剂。本文中，该人类KDM4B核酸对应于基因银行保藏号NM_015015.2，且指的是本文中揭露的SEQID NO：2。KDM4B也称为赖氨酸(K)特异性去甲基化酶4B、JMJD2B或“含2B的jumonji域”、KIAA0876、TDRD 14B、或“含14B的tudor域”。该人类KDM4B蛋白质对应于基因银行保藏号NP055830.1(SEQ ID NO：10)。据此，KDM4B的蛋白序列如下：
一些具体例中，该试剂人类KDM4B的核酸序列(SEQ ID NO：2)，或是与其序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)的其生物学活性片段或同源物或变体，该试剂将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：2相应序列的程度。一些具体例中，该组合物包含对应于SEQ ID NO：2的人类KDM4B核酸序列、或其生物学活性片段，其将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：2的核酸序列的程度。
一些具体例中，在本文中揭露的方法中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自编码任何人类KDM4B多肽的核酸剂、或编码人类KDM4B多肽的变体或生物学活性片段的核酸剂。一些具体例中，在本文中揭露的方法中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自任何人类KDM4B多肽、或该人类KDM4B多肽的变体或生物学活性片段。本发明中涵盖，该领域技术人员可鉴别人类KDM4B多肽的适宜的人类同源物、及编码该人类同源物的用于本文中揭露的方法和组合物中的核酸。
一些具体例中，可用于本发明的方法、组合物和试剂盒中的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子是编码KDM4C多肽、或KDM4C多肽、或其变体或生物学活性片段的核酸剂。本文中，该人类KDM4C核酸序列对应于基因银行保藏号NM_015061.3(SEQ ID NO：3)，如本文中所揭露。KDM4C也称为赖氨酸(K)特异性去甲基化酶C、JMJD2C或“含2C的jumonji域”、GASC1、KIAA0780、TDRD 14C或“含14C的tudor域”。该人类KDM4C蛋白质对应于基因银行保藏号NP_055876.2(SEQ ID NO：11)。据此，KDM4C的蛋白序列如下：
一些具体例中，该试剂包含人类KDM4C的核酸序列(SEQ ID NO：3)，或是与其序列的一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)的其生物学活性片段或同源物或变体，该试剂将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：3相应序列的程度。一些具体例中，该组合物包含对应于SEQ IDNO：3的人类KDM4C核酸序列、或其生物学活性片段，其将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：3的核酸序列的程度。
一些具体例中，在本文中揭露的方法中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自编码任何人类KDM4C多肽的核酸剂、或编码人类KDM4C多肽的变体或生物学活性片段的核酸剂。一些具体例中，在本文中揭露的方法中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自任何人类KDM4C多肽、或该人类KDM4C多肽的变体或生物学活性片段。本发明中涵盖，该领域技术人员可鉴别人类KDM4C多肽的适宜的人类同源物、及编码该人类同源物的用于本文中揭露的方法和组合物中的核酸。
一些具体例中，可用于本发明的方法、组合物和试剂盒中的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子是编码KDM4D多肽、或KDM4D多肽、或其变体或生物学活性片段的核酸剂。本文中，该人类KDM4D核酸序列对应于基因银行保藏号NM_018039.2，且指的是本文中揭露的SEQID NO：4。KDM4D也称为赖氨酸(K)特异性去甲基化酶4D、FLJ10251、JMJD2D或“含2D的jumonji域”。该人类KDM4D蛋白对应于基因银行保藏号NP_060509.2(SEQ ID NO：12)。据此，KDM4D的蛋白序列如下：
一些具体例中，该试剂包含人类KDM4D的核酸序列(SEQ ID NO：4)，或是与其序列的一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)的其生物学活性片段或同源物或变体，该试剂将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：4相应序列的程度。一些具体例中，该组合物包含对应于SEQ IDNO：4的人类KDM4D核酸序列、或其生物学活性片段，将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：4的核酸序列的程度。
一些具体例中，该接触供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞(如，包含融合或激活前的供体遗传物质的去核人类卵母细胞)或人类SCNT胚胎(即，该供体细胞核与去核卵母细胞融合后)的试剂，增加SEQ ID NO：9的人类KDM4A蛋白、或SEQ ID NO：10的人类KDM4B蛋白、或SEQ ID NO：11的人类KDM2C蛋白、或SEQ ID NO：12的人类KDM4D蛋白的表达，及/或包含对应于SEQ ID NO：1的人类KDM4A核酸序列、对应于SEQ ID NO：2的人类KDM4B核酸序列、对应于SEQ ID NO：3的人类KDM4C核酸序列、对应于SEQ ID NO：4的人类KDM4D核酸序列、对应于SEQ ID NO：45的人类KDM4E核酸序列、或SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQID NO：45的生物学活性片段的任何一种或组合，其将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45的程度(如，增加至少约110％、或至少约120％、或至少约130％、或至少约140％、或至少约150％、或超过150％)。
一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：12的氨基酸1至424，如Antony等人，自然(Nature)，2013年中所揭示。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：12的氨基酸1至424，其亦缺少位于SEQ ID NO：12的氨基酸1至424的C端、或N端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ IDNO：12的氨基酸1至424，其亦缺少位于SEQ ID NO：12的氨基酸1至424的C端和N端两端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：64，其中，SEQ IDNO：13的蛋白序列包含：
一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：13的氨基酸，其亦缺少位于SEQ ID NO：13的C端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：13的氨基酸，其亦缺少位于SEQ ID NO：13的N端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。
一些具体例中，在本文中揭示的方法、组合物和试剂盒中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自编码任何人类KDM4D多肽的核酸剂、或编码人类KDM4D多肽的变体或生物学活性片段的核酸剂。一些具体例中，在本文中揭露的方法中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自任何人类KDM4D多肽、或该人类KDM4D多肽的变体或生物学活性片段。本发明中涵盖，该领域技术人员可鉴别人类KDM4D多肽的适宜的人类同源物、及编码该人类同源物的用于本文中揭露的方法和组合物中的核酸。
一些具体例中，可用于本发明的方法、组合物和试剂盒中的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子是编码KDM4E多肽、或KDM4E多肽、或其变体或生物学活性片段的核酸剂。本文中，该人类KDM4E核酸对应于基因银行保藏号NM_001161630.1，且指的是本文中揭露的SEQID NO：45。KDM4E也称为赖氨酸(K)特异性去甲基化酶4E、JMJD2E或“含2E的jumonji域”、KDM4DL、或“赖氨酸(K)特异性去甲基化酶4D样”。该人类KDM4E对应于基因银行保藏号NP001155102.1(SEQ ID NO：46)。据此，人类KDM4E的蛋白序列如下：
一些具体例中，该试剂包含人类KDM4E的核酸序列(SEQ ID NO：45)，或是与其序列的一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)的其生物学活性片段或同源物或变体，该试剂将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：45相应序列的程度。一些具体例中，该组合物包含对应于SEQID NO：45的人类KDM4E核酸序列、或其生物学活性片段，将人类SCNT的效率增加至类似于或超过SEQ ID NO：45的核酸序列的程度。
一些具体例中，在本文中揭露的方法中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自编码任何人类KDM4E多肽的核酸剂、或编码人类KDM4E多肽的变体或生物学活性片段的核酸剂。一些具体例中，在本文中揭露的方法中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自任何人类KDM4E多肽、或该人类KDM4E多肽的变体或生物学活性片段。本发明中涵盖，该领域技术人员可鉴别人类KDM4E多肽的适宜的人类同源物、及编码该人类同源物的用于本文中揭露的方法和组合物中的核酸。
如一些具体例中所用，在本文中揭露的方法中使用的组蛋白去甲基化酶激活因子选自AOF(LSD1)、AOF1(LSD2)、FBXL11(JHDM1A)、Fbx110(JHDM1B)、FBXL19(JHDM1C)、KIAA1718(JHDM1D)、PHF2(JHDM1E)、PHF8(JHDM1F)、JMJD1A(JHDM2A)、JMJD1B(JHDM2B)、JMJD1C(JHDM2C)、KDM4A(JMJD2A；JHDM3A)、KDM4B(JMJD2B；JHDM3B)、KDM4C(JMJD2C；JHDM3C)，KDM4D(JMJD2D；JHDM3D)、KDM4E(JMJD2E)、RBP2(JARID1A)、PLU1(J ARID IB)、SMCX(JARID1C)、SMCY(J ARID ID)、Jumonji(JARID2)、UTX(UTX)、UTY(UTY)、JMJD3(JMJD3)、JMJD4(JMJD4)、JMJD5(JMJD5)、JMJD6(JMJD6)、JMJD7(JMJD7)、JMJD8(JMJD8)组成的群组中的任一种。此类组蛋白去甲基化酶激活因子揭示于美国专利申请US 2011/0139145中，该申请通过引用而以其整体并入本文。
一些具体例中，KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子是多肽变体、或编码与全长度多肽的一致性为至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％的多肽变体的核酸序列、或SEQ IDNO：9至SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：46的或由对应于SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：45的任一核酸序列编码的任何人类KDM4多肽(人类KDM4A至KDM4E)的多肽片段。
一些具体例中，KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子是多肽变体；或编码多肽变体且与该全长度多肽的一致性为至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％的变体的核酸序列；或SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：46的KDM4多肽(人类KDM4A至KDM4E)的多肽片段。一些具体例中，KDM4组蛋白去甲基化酶是SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：46(人类KDM4A至KDM4E)的至少20个接续氨基酸的片段；或其长度为野生型多肽的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％的人类KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D或KDM4E的片段；或其具有感兴趣的活性的域，如分别与SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：46(人类KDM4A至KDM4E)的蛋白质的效率相比，将SCNT效率增加至少80％或更高。
一些具体例中，人类KDM4A的生物学活性片段包含SEQ ID NO：9的片段(如，其中，该片段的长度为SEQ ID NO：9的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同方法且在相同条件下，该片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：9的氨基酸的KDM4A多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％、或超过100％如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。
一些具体例中，人类KDM4B的生物学活性片段包含SEQ ID NO：10的片段(如，其中，该片段的长度为SEQ ID NO：10的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同方法且在相同条件下，该片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：10的氨基酸的KDM4B多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％、或超过100％如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。
一些具体例中，人类KDM4C的生物学活性片段包含SEQ ID NO：11的片段(如，其中，该片段的长度为SEQ ID NO：11的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同方法且在相同条件下，该片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：11的氨基酸的KDM4C多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％、或超过100％如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。
一些具体例中，人类KDM4D的生物学活性片段包含SEQ ID NO：12的片段(如，其中，该片段的长度为SEQ ID NO：12的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同方法且在相同条件下，该片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：12的氨基酸的KDM4D多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％、或超过100％如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQID NO：12的氨基酸1至424，如Antony等人，自然(Nature)，2013年中所揭露。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：12的氨基酸1至424，其亦缺少位于SEQ IDNO：12的氨基酸1至424的C端或N端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含EQ ID NO：12的氨基酸1至424，其亦缺少位于SEQ ID NO：12的氨基酸1至424的C端和N端两端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个、或至少50至100个氨基酸。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：13，其中，SEQ ID NO：13的蛋白序列包含：
一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：13的氨基酸，其亦缺少位于SEQ ID NO：13的C端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个氨基酸。一些具体例中，SEQ ID NO：12的生物学活性片段包含SEQ ID NO：13的氨基酸，其亦缺少位于SEQ ID NO：13的N端的至少1个、或至少2个、或至少2至10个、或至少10至20个、或至少20至50个氨基酸。
一些具体例中，人类KDM4E的生物学活性片段包含SEQ ID NO：46的片段(如，其中，该片段的长度为SEQ ID NO：46的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同方法且在相同条件下，该片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：46的氨基酸的KDM4E多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％、或超过100％如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。
一些具体例中，人类KDM4A的生物学活性变体包含SEQ ID NO：9的变体，其与SEQID NO：9的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)(如，其中，该变体与SEQ ID NO：9的一致性为至少85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同方法且在相同条件下，该片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：9的氨基酸的KDM4A多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％、或超过100％如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。
一些具体例中，人类KDM4B的生物学活性变体包含SEQ ID NO：10的变体，其与SEQID NO：10的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)(如，其中，该变体与SEQ ID NO：10的一致性为至少85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同方法且在相同条件下，该片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：10的氨基酸的KDM4B多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％、或超过100％如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。
一些具体例中，人类KDM4C的生物学活性变体包含SEQ ID NO：11的变体，其与SEQID NO：11的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)(如，其中，该变体与SEQ ID NO：11的一致性为至少85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同方法且在相同条件下，该片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：11的氨基酸的KDM4C多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％、或超过100％如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。
一些具体例中，人类KDM4D的生物学活性变体包含SEQ ID NO：12的变体，其与SEQID NO：12的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)(如，其中，该变体与SEQ ID NO：12的一致性为至少85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同方法且在相同条件下，该片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：12的氨基酸的KDM4D多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％、或超过100％如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。
一些具体例中，人类KDM4E的生物学活性变体包含SEQ ID NO：46的变体，其与SEQID NO：46的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)(如，其中，该变体与SEQ ID NO：46的一致性为至少85％、90％、95％、98％、或99％)，使用相同方法且在相同条件下，该片段增加SCNT效率的能力是包含SEQ ID NO：46的氨基酸的KDM4E多肽的约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％、或超过100％如1.5倍、2倍、3倍、4倍或超过4倍。
一些具体例中，可用于本文中揭露的方法、组合物和试剂盒的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子是对应于SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45的核酸剂、或编码对应于SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：46或功能性片段的蛋白质的核酸剂、或其生物学活性变体或片段，如美国专利申请US2012/03228640中揭露的RNA或修饰RNA(modRNA)。一些具体例中，KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45、或核酸变体的任一种的核酸剂，其中，该核酸变体与SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：45的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)。一些具体例中，KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子包含核酸，该核酸是SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45任一种的至少20个接续氨基酸的片段，如，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45的至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个核酸的片段。一些具体例中，作为可用于该方法、组合物和试剂盒中的核酸剂的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子，被载体如病毒载体表达。
在备选的具体例中，所涵盖的用于本文中的KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子是对应于序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45的合成修饰RNA(modRNA)、或编码对应于EQ ID NO：9至SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：46的蛋白质或其功能性片段的合成修饰RNA(modRNA)。合成修饰RNA(modRNA)揭示于美国专利申请US2012/03228640、US2009/0286852和US2013/0111615以及美国专利US 8,278,036、US 8,691,966、US 8,748,089、US 8,835,108中，这些专利申请和专利通过引用而以其整体并入本文中。一些具体例中，该合成修饰RNA分子并不在载体中表达，且该合成修饰RNA分子可以是无修饰的合成修饰RNA分子。一些具体例中，组合物可包含至少一种存在于脂质复合体中的合成修饰RNA分子。
一些具体例中，该合成修饰RNA分子包含至少两个修饰核苷酸，例如，至少两个修饰核苷酸选自下列所组成的群组：5-甲基胞苷(5mC)、N6-甲基腺苷(m6A)、3，2′-O-二甲基尿苷(m4U)、2-硫代尿苷(s2U)、2′-氟尿苷、假尿苷、2′-O-甲基尿苷(Um)、2′-脱氧尿苷(2′-dU)、4-硫代尿苷(s4U)、5-甲基尿苷(m5U)、2′-O-甲基腺苷(m6A)、N6，2′-O-二甲基腺苷(m6Am)、N6，N6，2′-O-三甲基腺苷(m62Am)、2′-O-甲基胞苷(Cm)、7-甲基鸟苷(m7G)、2′-O-甲基鸟苷(Gm)、N2，7-二甲基鸟苷(m2，7G)、N2，N2，7-三甲基鸟苷(m2，2，7G)、及肌苷(I)。一些具体例中，该合成修饰RNA分子进一步包含5′封帽，如5′封帽类似物，如5′二鸟苷封帽。一些具体例中，在本文中揭露的方法和组合物中使用的合成修饰RNA分子不包含5′三磷酸酯。一些具体例中，在本文中揭露的方法和组合物中使用的合成修饰RNA分子进一步包含聚(A)尾部、Kozak序列、3′未转译区域、5′未转译区域、或其任意组合，以及，在一些具体例中，该合成修饰RNA分子可视需要使用碱性磷酸酶处理。
H3K9甲基转移酶抑制剂
一方面，本发明提供增加人类SCNT效率的方法，该方法包含：令该供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞(如，包含融合或激活之前的供体遗传物质的去核人类卵母细胞)的细胞核或细胞质或人类SCNT胚胎(即，该供体细胞核与去核卵母细胞融合后)与抑制人类细胞核遗传物质中组蛋白甲基化，特别是抑制H3K9甲基化，特别是抑制H3H9me3三甲基化作用的试剂接触。本发明的某些具体例中，该试剂抑制组蛋白甲基转移酶活性。本发明的某些具体例中，该试剂抑制人类组蛋白甲基转移酶的表达。本发明的某些具体例中，该抑制剂是人类H3K9甲基转移酶的抑制剂。如本文中探讨，发明人已经发现，对H3K9甲基转移酶蛋白的抑制可用来增加人类SCNT的效率。一些具体例中，H3K9甲基转移酶抑制剂是蛋白抑制剂，而且在一些具体例中，该抑制剂是任何抑制H3K9甲基转移酶蛋白质功能或H3K9甲基转移酶自其基因表达的试剂。
本发明的某些具体例中，该试剂抑制人类组蛋白甲基转移酶SUV39h1蛋白的表达或功能。SUV39h1具有两种选择性剪接的变体(变体1和变体2)，其分别产生SUV39h1亚型1蛋白和SUV39h1亚型2蛋白。一些具体例中，在本文中揭露的方法、试剂盒和组合物中使用的试剂抑制SUV39h1的变体1的mRNA(SEQ ID NO：47)或变体2的mRNA(SEQ ID NO：14)。一些具体例中，在本文中揭露的方法、试剂盒和组合物中使用的试剂抑制SUV39h1蛋白的亚型1(SEQID NO：48)或亚型2(SEQ ID NO：5)的功能。
本发明的某些具体例中，该试剂抑制人类组蛋白甲基转移酶SUV39h2蛋白。本发明的某些具体例中，该试剂人类组蛋白甲基转移酶SUV39h2蛋白的表达或功能。SUV39h2具有五种选择性剪接的变体(变体1至5)，其产生SUV39h2的四种亚型(变体2和变体3均编码亚型2)。一些具体例中，在本文中揭露的方法、试剂盒和组合物中使用的试剂抑制SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53(hSUV39h2变体1至5)的任一种或多种mRNA的转译。一些具体例中，在本文中揭露的方法、试剂盒和组合物中使用的试剂抑制对应于SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：57的hSuv39h2亚型1至4的功能。
本发明的某些具体例中，该试剂是人类组蛋白甲基转移酶EHMT1的抑制剂。本发明的某些具体例中，该试剂抑制人类组蛋白甲基转移酶SETDB1。某些具体例中，至少两种H3K9甲基转移酶(如，H3K9甲基转移酶2、3、4等)被抑制。本发明的某些具体例中，SUV39h1和SUV39h2两者均被相同的试剂(如，SUV39h1/2抑制剂)抑制，或被2种或更多种独立的试剂抑制。本发明的某些具体例中，该试剂是RNAi剂，如，抑制H3K9甲基转移酶、人类SUV39h1、人类SUV39h2、或人类SETDB1中的任何一种或多种的表达的siRNA或shRNA。
本文中，术语“SUV39h1”或“H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1”具有该领域中的通常意义，且指的是将组蛋白H3的Lys-9甲基化的组蛋白甲基转移酶“彩斑3至9同族体1(果蝇属)的抑制基因”(Aagaard L，Laible G，Selenko P，Schmid M，Dorn R，Schotta G，Kuhfittig S，Wolf A，Lebersorger A，Singh P B，Reuter G，Jenuwein T(June 1999)。“果蝇(Drosophila)PEV修饰剂的功能性哺乳动物同源体Su(var)3至9编码与异染色质组分M31复合的着丝粒相关蛋白”，EMBO J18(7)：1923-38)。所述组蛋白甲基转移酶也称为MG44、KMT1A、SUV39H、组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶SUV39H1、H3-K9-HMTase 1、OTTHUMP00000024298、Su(var)3-9同族体1、赖氨酸N-甲基转移酶1A、组蛋白H3-K9甲基转移酶1、位置效应彩斑3至9同族体、组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶、或H3赖氨酸9特异性1。术语涵盖SUV39h1的全部直系同源如SU(VAR)3至9，且包括编码SUV39h1亚型1和SUV39h1亚型2的变体1和变体2。如表8中所总结，且不欲受限于理论，Suv39h1(基因ID：6839)具有两种选择性剪接的变体，变体1产生Suv39h1亚型1蛋白(长转录本且编码较长的亚型)且对应于mRNANM_001282166.1(SEQ ID NO：47)，以及蛋白NP_001269095.1(SEQ ID NO：48)。Suv39h1的变体2编码亚型2，其与变体1的区别在于5′UTR，变体2缺少5′编码区域的部分，且在交替起始密码子处启动转译。与亚型1蛋白相比，变体2编码的Suv39h1亚型2蛋白更短且具有与亚型1蛋白截然不同的N端。用于Suv39h1亚型2的mRNA是NM_003173.3(SEQ ID NO：14)，其编码对应于NP_003164.1(SEQ ID NO：5)的亚型2蛋白。
本文中，术语“SUV39h2”或“H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h2”具有该领域中的通常意义，且指的是将组蛋白H3的Lys-9甲基化的组蛋白甲基转移酶“彩斑3至9同族体1(果蝇属)的抑制基因”。所述组蛋白甲基转移酶也称为KMT1B、FLJ23414、H3-K9-HMTase 2、组蛋白H3-K9甲基转移酶2、赖氨酸N-甲基转移酶1B、su(var)3至9同族体2。术语涵盖所有直系同源(Suv39h2基因在黑猩猩、猕猴、狗、牛、鼠、大鼠、鸡和青蛙体内是保守的)，以及表8中揭露的SUV39h2的选择性剪接的变体。不欲受限于理论，表8列举了五种选择性剪接的人类Suv39h2(基因ID：79723)变体，它们是：变体1编码Suv39h2亚型1蛋白(长转录本且编码较长的亚型)；变体2和变体3两者均编码Suv39h2亚型2；变体4编码Suv39h2亚型3；而变体5编码Sub39h2亚型4。对于用于Suv39h2变体的mRNA及其相对应蛋白的序列标识符显示在表8中。
表8.hSUVh1和hSUVh2变体的序列的总结
根据本发明，该人类SUV39h1的抑制剂选自H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1蛋白功能的抑制剂或H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h基因表达的抑制剂所组成的群组。
术语“H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1的抑制剂”指的是，具有抑制组蛋白H3的Lys-9通过H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1进行的甲基化的能力的任何化合物(天然或非天然)。术语“H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h2的抑制剂”指的是，具有抑制组蛋白H3的Lys-9通过H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h2进行的甲基化的能力的任何化合物(天然或或其他的。
可使用多种方法测定化合物的抑制活性，如Greiner D.Et al.Nat ChemBiol.2005 August；1(3)：143-5或Eskeland，R.et al.Biochemistry 43，3740-3749(2004)中揭示的方法，其通过引用而以其整体并入本文。
一些具体例中，对H3K9甲基转移酶的抑制是通过剂进行的。可使用任何剂，例如但不限于，核酸、核酸类似物、肽、噬菌体、噬菌粒、多肽、模拟肽、核糖体、适配体、抗体、小或大的有机或无机分子、或其任意组合。
一些具体例中，H3K9甲基转移酶的抑制剂选自下列所组成的群组：RNAi剂、siRNA剂、shRNA、寡核苷酸、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf 1中和抗体或抗体片段、适配体、小分子、蛋白质、肽、小分子、avidimir、avimir、及其功能性片段或衍生物等。经由CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统敲除SUV39h1及/或SUV39h2的可商购序列可从Origene(产品编号KN202428和KN317005)和Santa Cruz Biotechnology(产品偏好：sc-401717)获得，且可在本文中揭露的方法和组合物中使用。
可用于本文中揭露的方法中的试剂亦可抑制基因表达(即，阻抑及/或压制该基因的表达)。该领域中，此类剂被指代为“基因静默剂”，且为该领域技术人员所周知。实例包括但不限于用于RNA、DNA或核酸类似物的核酸序列，可以是单链或双链，且可选自包含编码感兴趣的蛋白质的核酸、寡核苷酸、核酸、核酸类似物的群组，例如但不限于，肽核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)、锁定的核酸(LNA)、及其衍生物等。核酸剂亦可包括，例如但不限于，编码作为转录抑制因子而起作用的蛋白的核酸序列、反义分子、核糖体、小的抑制性核酸序列，例如但不限于，RNAi、shRNAi、siRNA、micro RNAi(miRNA)、反义寡核苷酸等。
一些具体例中，在本发明的所有方面，与供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞(如，包含融合或激活之前的供体遗传物质的去核人类卵母细胞)或人类SCNT胚胎(即，该供体细胞核与去核卵母细胞融合后)接触的试剂是H3K9甲基转移酶的抑制剂，例如但不限于，人类SUV39h1、人类SUV39h2或人类SETDB1中任一种的抑制剂。一些具体例中，人类SUV39h1、人类SUV39h2或人类SETDB1的抑制剂的至少一种或任意组合可用于该方法中，以增加人类SCNT的效率。一些具体例中，SUV39h1、SUV39h2或SETDB1的抑制剂抑制人类SUV39h1、人类SUV39h2或人类SETDB 1核酸序列(如，SEQ ID NO：14至SEQ ID NO：16、或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51至SEQ ID NO：53)的表达、或人类SUV39h1蛋白(SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：48)、人类SUV39h2(SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：54至SEQ IDNO：57)或人类SETDB1蛋白(SEQ ID NO：17)的活性。
在本发明的语境中，与其它分子相比，H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1/2的抑制剂对于H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1/2具有较佳选择性。“选择性”意为，该抑制剂的亲和性比对其它组蛋白甲基转移酶的选择性高至少10倍，优选25倍，更优选100倍，再优选500倍。
典型地，H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1及/或SUV39h2的抑制剂是有机小分子。术语“有机小分子”指的是，尺寸小与药学中通常使用的那些有机分子相当的分子。术语不包括生物大分子(如，蛋白质、核酸等)。优选的有机小分子的尺寸范围最大约5000Da，更优选最大为2000Da，且最优选最大为1000Da。
特定的具体例中，H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1的抑制剂是毛壳素(CAS28097-03-2)，如Greiner D，Bonaldi T，Eskeland R，Roemer E，Imhof A.Identificationof a specific inhibitor of the histone methyltransferase SU(VAR)3-9.Nat ChemBiol.2005 August；1(3)：143-5.Epub 2005 Jul.17；Weber，H.P.，et al，The molecularstructure and absolute configuration of chaetocin.Acta Cryst，B28，2945-2951(1972)；Udagawa，S.，et al.，The production of chaetoglobosins，sterigmatocystin，O-methylsterigmatocystin，and chaetocin by Chaetomium spp.and relatedfungi.Can.J.microbiol.，25，170-177(1979)；Gardiner，D.M.，et al.，Theepipolythiodioxopiperazine(ETP)class of fungal toxins：distribution，mode ofaction，functions and biosynthesis.Microbiol.，151，1021-1032(2005)中所揭示。例如，毛壳素可自SigmaAldrich购得。
另一具体例中，H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1的抑制剂是适配体。适配体是一类分子，在分子识别方面，其可作为抗体的替代品。适配体是寡核苷酸或寡肽序列，具有以高亲和性和高特异性识别几乎任何类别靶标分子的能力。此类配体可通过随机序列库的指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponentialenrichment(SELEX))单离，如Tuerk C.and Gold L.，1990中所揭示。该随机序列库通过DNA的组合化学合成获得。该库中，每一成员均为独特序列的最终经化学修饰的线性寡聚物。这类分子的可能的修饰、用途和优点已经在Jayasena S.D.，1999中回顾。肽适配体由通过平台蛋白如通过两种杂交方法选自组合库的大肠杆菌硫氧还蛋白A显示的构象受约束的抗体可获得区域组成(Colas et al.，1996)。
用于本发明中的表达抑制剂可以是基于反义寡核苷酸构建体的。反义寡核苷酸，包括反义RNA分子和反义DNA分子，将通过与之结合而发挥作用以直接阻断H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1或HP1αmRNA的转译，因此防止蛋白转译或增加mRNA降解，从而降低H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1或HP1α的水平，并因此降低细胞内的活性。例如，可通过传统的磷酸二酯技术合成至少约15个碱基且与编码H3K9-组蛋白甲基转移酶SUV39h1的mRNA转录本序列的独特区域互补的反义寡核苷酸，并通过例如静脉注射或输注施予。使用反义技术的方法来特异性抑制该领域周知的序列已知的基因的基因表达(例如，见美国专利US 6,566,135、US 6,566,131、US 6,365,354、US 6,410,323、US 6,107,091、US 6,046,321、及US5,981,732)。SUV39h1的抑制剂揭露于通过引用而以其整体并入本文的美国专利申请US2015/0038496中。经鉴别，该小分子——青霉素钠(Veticillin)，是人类SUV39h1和人类SUV39h2两者的选择性抑制剂(即，抑制SUV39h1/2)，如通过引用而以其整体并入本文的美国专利申请US 2014/0161785中所揭露，且可用于本文中揭示的方法、组合物和试剂盒中。
SUV39h2的抑制剂及其鉴别方法揭露于通过引用而以其整体并入本文的美国专利申请US2014/0094387。
H3K9甲基转移酶的RNAi抑制剂
一些具体例中，该H3K9甲基转移酶抑制剂是RNAi剂，如，siRNA或shRNA分子。人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1、和人类PRDM2的RNAi剂是该领域中周知的。一些具体例中，H3K9甲基转移酶的抑制剂是RNAi剂。一些具体例中，RNAi剂完全或部分地杂交至位于人类SUV39h1核酸序列(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：47)、人类SUV39h2蛋白(SEQID NO：15、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53)或人类SETDB1蛋白(SEQ ID NO：16)中任一者的核苷酸区域内的靶标序列，如本文中揭露。
一些具体例中，RNAi剂抑制人类SUV39h1蛋白(SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：48)、人类SUV39h2蛋白(SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：57)或人类SETDB1蛋白(SEQ IDNO：17)中任一种的表达，如本文中揭露。
对H3K9甲基转移酶基因的抑制可通过基因静默RNAi分子根据该领域技术人员周知的方法进行。一些具体例中，该H3K9甲基转移酶抑制剂是RNAi剂，是选自表2的任何一种siRNA剂或其组合。
例如，基因静默siRNA寡核苷酸双螺旋体以位于对应于对应变体2的NM_003173.3(SEQ ID NO：14)、或对应于变体1的NM_001282166.1(SEQ ID NO：47)的人类SUV39h1内的区域为靶标，可容易地用来敲除人类SUV39h1表达。使用siRNA，可成功地以SUV39h1 mRNA为靶标；而其它siRNA分子可由该领域技术人员基于该靶标mRNA的已知序列而容易地制备。为避免疑问，人类SUV39h1的序列提供为，例如，基因银行保藏号NM_003173.3(SEQ ID NO：14)(编码亚型1的变体2)或NM_001282166.1(SEQ ID NO：47)(变体1，编码亚型1)。该领域技术人员可选择待使用的RNAi剂，该RNAi剂抑制编码人类SUV39h1蛋白(SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：48)的mRNA的表达、或抑制任何其它哺乳动物SUV39h1蛋白的表达。
为避免疑问，人类SUV39h1 cDNA的序列提供为，例如，对应于变体2的基因银行保藏号NM_003173.3(SEQ ID NO：14)、或对应于变体1的基因银行保藏号NM_001282166.1(SEQID NO：47)，且可用来设计抑制人类SUV39h1 mRNA表达的基因静默RNAi调节子，该调节子可作为H3K9甲基转移酶抑制剂用于本文中揭露的方法和组合物中。一些具体例中，人类SUV39h1的抑制剂是siRNA剂，例如，包含GAAACGAGUCCGUAUUGAAtt(SEQ ID NO：7)或UUCAAUACGGACUCGUUUCtt(SEQ ID NO：8)的至少一种或两种及其具有至少80％序列一致性的片段或衍生物的siRNA剂。
本文中，术语“SUV39h1蛋白”指的是如本文中揭露的SEQ ID NO：5(亚型2)或SEQID NO：48(亚型1)的氨基酸序列及其同源体，其内部包括对功能结构不造成负面影响的保守替换、加入、删除。一些具体例中，该SUV39h1蛋白由用于人类SUV39h1转录本(SEQ ID NO：14)变体2(编码Suv39h1亚型2蛋白)的核酸序列编码，该核酸序列如下：
一些具体例中，该SUV39h1蛋白由用于人类SUV39h1转录本(SEQ ID NO：47)变体1(编码Suv39h1亚型1蛋白)的核酸序列编码，该核酸序列如下：
一些具体例中，该试剂包含将人类SUV39h1 mRNA(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：47)抑制或减少至少50％(与不存在SUV39h1抑制剂下相比)的核酸抑制剂。
一些具体例中，该试剂包含抑制或降低人类SUV39h1蛋白(SEQ ID NO：5(亚型2)或SEQ ID NO：48(亚型1)的水平或功能的核酸抑制剂。一些具体例中，该试剂包含抑制或降低人类SUV39h2蛋白(即，SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：57中任何一种)的水平或功能的核酸抑制剂。
一些具体例中，人类SUV39h1的siRNA抑制剂是SEQ ID NO：8或其至少10个接续核苷酸的片段，或与SEQ ID NO：8的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)的核酸序列。一些具体例中，siRNA或其它核酸抑制剂完全或部分地杂交至SEQ ID NO：7的靶标序列。
一些具体例中，鼠SUV39h2的siRNA抑制剂是SEQ ID NO：19或其至少10个接续核苷酸的片段，或与SEQ ID NO：19的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)的核酸序列。一些具体例中，siRNA或其它核酸抑制剂完全或部分地杂交至SEQ ID NO：18的靶标序列。
一些具体例中，人类SUV39h1的siRNA抑制剂是SEQ ID NO：21或其至少10个接续核苷酸的片段，或与SEQ ID NO：21的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)的核酸序列。一些具体例中，siRNA或其它核酸抑制剂完全或部分地杂交至SEQ ID NO：20的靶标序列。
一些具体例中，siRNA或其它核酸抑制剂完全或部分地杂交至位于人类SUV39h2的SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53(hSUV39h2变体1至5)中任何一种的核苷酸区域内的靶标序列。
对H3K9甲基转移酶基因的抑制可通过基因静默RNAi分子根据该领域技术人员所周知的方法进行。对人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1、及人类PRDM2的抑制是该领域中周知的。一些具体例中，该H3K9甲基转移酶抑制剂是RNAi剂，是选自表2的任何一种siRNA剂或其组合。
一些具体例中，SUV39H1可通过hsa-mir-98-5p(MIRT027407)、hsa-mir-615-3p(MIRT040438)、hsa-mir-331-3p(MIRT043442)或与其序列一致性为至少85％的miR被设为靶标并被抑制。可商购的抑制人类细胞中SUV39h1及/或SUV39h2的siRNA、RNAi和shRNA产品可从Origene、Qiagen和Santa Cruz Biotechnology获得，且可由该领域技术人员使用。
例如，结合至且部分或完全杂交至位于人类SUV39H2变体1至5(SEQ ID NO：15、SEQID NO：9、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53)任何一个中的核酸序列的基因静默siRNA寡核苷酸，可容易地用来敲除SUV39h2表达。SUV39h2 mRNA可使用siRNA被成功地设为靶标；且其它siRNA分子可由该领域技术人员基于该靶标mRNA的已知序列而容易地制备。为避免疑问，人类SUV39h2变体的序列显示于表8中。为避免疑问，人类SUV39h2变体cDNA的序列提供为，例如，基因银行保藏：NM_024670.3(SEQ ID NO：15)、NM 001193425.1(SEQ IDNO：51)、NM 001193426.1(SEQ ID NO：52)、NM OO1 193427.1(SEQ ID NO：53)，且可用来设计基因静默RNAi调节子，该调节子抑制人类SUV39h2 mRNA表达，可作为H3K9甲基转移抑制剂用于本文中揭露的方法和组合物中。一些具体例中，SUV39h2的抑制剂是siRNA剂，例如，siRNA可包含下述序列的至少一个或两个：GCUCACAUGUAAAUCGAUUtt(SEQ ID NO：18)或AAUCGAUUUACAUGUGAGCtt(SEQ ID NO：19)，及其序列一致性为至少80％的片段或衍生物。一些具体例中，SUV39h2的抑制剂是至少结合至GCUCACAUGUAAAUCGAUUtt(SEQ ID NO：18)的靶标序列的siRNA剂。一些具体例中，SUV39h2的抑制剂是包含AAUCGAUUUACAUGUGAGCtt(SEQID NO：19)的一部分的至少5个接续核苷酸或其序列一致性为至少80％的片段或衍生物的siRNA剂。
本文中，术语“SUV39H2蛋白”指的是本文中揭露的SEQ ID NO：54(亚型1)、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：53(亚型2)、SEQ ID NO：56(亚型3)或SEQ ID NO：57(亚型4)中任何一个及其同源体的氨基酸，其内部包括不对功能结构造成负面影响的保守替换、加入、删除。
hSUV39h2变体核酸序列及其相对应蛋白的保藏号显示于表8中。例如，该SUV39h2亚型2蛋白由人类SUV39H2变体3转录本的核酸序列(SEQ ID NO：15)编码，该核酸序列如下：
一些具体例中，该试剂抑制人类SUV39h2的SEQ ID NOS：15、SEQ ID NOS：49、SEQID NOS：51、SEQ ID NOS：52、和SEQ ID NOS：53(hSUV39h2变体1至5)中任何一个的mRNA表达。一些具体例中，该领域技术人员可选择待使用的RNAi剂，该RNAi剂抑制编码SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：57中一个或多个的人类SUV39h2蛋白的mRNA的表达。
其它用于抑制人类SUV39H1和SUV39H2的例示性siRNA序列揭露于美国专利申请US2012/0034192中，该申请通过引用而以其整体并入本文。
表2.抑制H3K9甲基转移酶的例示性siRNA序列：
为避免疑问，人类SETDB1 cDNA的序列提供为，例如，基因银行保藏号：NM_001145415.1(SEQ ID NO：16)，且可由该领域技术人员用来设计基因静默RNAi调节子，该调节子抑制人类SETDB1 mRNA表达，可作为H3K9甲基转移抑制剂用于本文中揭露的方法和组合物中。
为避免疑问，人类EHMT1 cDNA的序列提供为，例如，基因银行保藏号：NM_024757.4(SEQ ID NO：42)，且可由该领域技术人员用来设计基因静默RNAi调节子，该调节子抑制人类EHMT1 mRNA表达，可作为H3K9甲基转移抑制剂用于本文中揭露的方法和组合物中。
为避免疑问，人类PRDM2 cDNA的序列提供为，例如，基因银行保藏号：NM_012231.4(SEQ ID NO：43)，且可由该领域技术人员用来设计基因静默RNAi调节子，该调节子抑制人类PRDM2 mRNA表达，可作为H3K9甲基转移抑制剂用于本文中揭露的方法和组合物中。
一些具体例中，H3K9甲基转移酶的抑制剂选自下列所组成的群组：RNAi剂、siRNA剂、shRNA、寡核苷酸、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1中和抗体或抗体片段、适配体、小分子、蛋白、肽、小分子、avidimir、及其功能片段或衍生物等。一些具体例中，该H3K9甲基转移酶抑制剂是RNAi剂，如，siRNA或shRNA分子。一些具体例中，该试剂包含减少人类SUV39H1蛋白(SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：48)或SUV29h1 mRNA(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：47)或人类SUV39H2蛋白(SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：57)或SUV39h2 mRNA(SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53)的蛋白表达的核酸抑制剂。一些具体例中，人类SUV39h1的siRNA抑制剂是SEQ ID NO：8或其具有至少10个接续核苷酸的片段，或与SEQ ID NO：8的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％序列一致性)的核酸序列。一些具体例中，siRNA或其它核酸抑制剂完全或部分地杂交至SUV39H1的SEQ ID NO：7的靶标序列。一些具体例中，人类SUV39H2的siRNA抑制剂包含SEQ ID NO：19或其具有至少10个接续核苷酸的片段，或与SEQ ID NO：19的序列一致性为至少80％(或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％)的核酸序列。一些具体例中，siRNA或其它核酸抑制剂完全或部分地杂交至SUV39h2的SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：15的靶标序列。
上述方面的其它具体例中，H3K9甲基转移酶抑制剂抑制下述选自下列所组成组的任何一种组蛋白甲基转移酶：SUV39H1、SUV39H2、G9A(EHMT2)、EHMT1、ESET(SETDB 1)、SETDB2、MLL、MLL2、MLL3、SETD2、NSD1、SMYD2、DOT1L、SETD8、SUV420H1、SUV420H2、EZH2、SETD7、PRDM2、PRMT1、PRMT2、PRMT3、PRMT4、PRMT5、PRMT6、PRMT7、PRMT8、PRMT9、PRMT10、PRMT11、CARM1。
一些具体例中，抑制H3K9甲基转移酶如抑制人类SUV39H1、人类SUV39H2或人类SETDB1的试剂是核酸。H3K9甲基转移酶如SUV39H1、SUV39H2或SETDB1的核酸抑制剂包括，例如但不限于，RNA干扰诱导(RNAi)分子，例如但不限于，siRNA、dsRNA、stRNA、shRNA及其修饰版本，其中，该RNA干扰(RNAi)分子令来自人类SUV39H1、人类SUV39H2及/或人类SETDB1基因中任一基因的基因表达静默。
据此，一些具体例中，H3K9甲基转移酶的抑制剂，如，人类SUV39H1、人类SUV39H2或人类SETDB1的抑制剂，可通过该领域技术人员周知的任何“基因静默”方法抑制。一些具体例中，H3K9甲基转移酶的核酸抑制剂，如，人类SUV39H1、人类SUV39H2或人类SETDB1的抑制剂，是反义寡核酸、或核酸类似物，例如但不限于，DNA、RNA、肽-核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)、或锁定的核酸(LNA)等。在备选的具体例中，该核酸是DNA或RNA、以及核酸类似物，例如PNA、pcPNA和LNA。核酸可以是单链的或双链的，且可选自由编码感兴趣的蛋白质的核酸、寡核苷酸、PNA等组成的群组。此类核酸序列包括，例如但不限于，编码作为转录抑制因子而起作用的蛋白的核酸序列、反义分子、核糖体、小的抑制性核酸序列，例如但不限于，RNAi、shRNAi、siRNA、micro RNAi(mRNAi)、反义寡核苷酸等。
一些具体例中，单链RNA(ssRNA)，一种内源性地见于真核细胞内的RNA形式，可用来形成RNAi分子。细胞ssRNA分子包括信使RNA(及信使RNA祖前体)、小细胞RNA、小细胞核RNA、转运RNA、和核糖体RNA。双链RNA(dsRNA)诱导尺寸依赖的免疫应答，因此，大于30bp的dsRNA激活干扰素应答，而较短的dsRNA注入该细胞的位于切丁酶下游的内源性RNA干扰机构中。
RNA干扰(RNAi)提供强有力的抑制所选择靶标多肽表达的途径。RNAi使用以编码该用于选择性降解的靶标多肽的信使RNA为靶标的小干扰RNA(siRNA)双螺旋体。对基因表达的siRNA依赖的转录后静默牵涉在由该siRNA引导的位点切割该靶标信使RNA分子。
RNA干扰(RNAi)是一种进化上保守的过程，借由该过程，与靶标基因完全相同或高度类似的RNA序列的表达或诱导造成序列特异性降解或从该靶标基因转录的信使RNA(mRNA)的特异性的转录后基因静默(PTGS)(见，Coburn，G.and Cullen，B.(2002)J.ofVirology 76(18)：9225)，从而抑制该靶标基因的表达。一种具体例中，该RNA是双链RNA(dsRNA)。这一过程已经在植物细胞、无脊椎动物细胞和哺乳动物细胞中揭示。事实上，RNAi由该dsRNA特异性核酸内切酶——切丁酶——启动，该切丁酶促进长dsRNA进行性裂解为名为siRNA的双链片段。siRNA被并入识别并裂解靶标mRNA的蛋白质复合体(名为“RNA诱导静默复合体”或“RISC”)中。RNAi亦可通过诱导核酸分子如合成的siRNA或RNA干扰剂启动，以抑制或静默靶标基因的表达。本文中，“对靶标基因表达的抑制”包括，与没有已经诱导RNA干扰的情形相比，该靶标基因或该靶标基因编码的蛋白质的表达或蛋白活性或水平的任何下降。较之于靶标基因的表达或由未被RNA干扰剂作为靶标的靶标基因编码的蛋白的活性或表达，该下降可以是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％或更多。
“短干扰RNA(siRNA)”，本文中也称为“小干扰RNA”，被定义为例如通过RNAi起抑制靶标基因表达功能的试剂。siRNA可经化学合成，可通过体外转录生产，或可在宿主细胞内生产。一种具体例中，siRNA是长度为约15至约40个核苷酸的双链RNA(dsRNA)分子，其长度优选约15至约28个核苷酸，更优选约19至约25个核苷酸，且更优选长度为19、20、21、22、或23个核苷酸，且可在每一链上含有其长度为约0、1、2、3、4、或5个核苷酸的3′及/或5′悬垂。该悬垂的长度在两条链之间是独立的，即，一条链上的悬垂的长度与第二条链上的悬垂的长度没有关联。优选该siRNA能通过靶标信使RNA(mRNA)的降解或特异性的转录后基因静默(PTGS)促进RNA干扰。
siRNA也包括小发夹(亦称茎环)RNA(shRNA)。一种具体例中，这些shRNA由短的(如，约19至约25个核苷酸)反义链、其后跟随约5至约9个核苷酸的核苷酸环圈、以及类似的正义链构成。或者，该正义链可领先于该核苷酸茎环结构，且该反义链可跟随。这些shRNA可包含在质粒、逆转录病毒、及慢病毒中，且可例如pol III U6启动子、或其它启动子表达(见，如，Stewart，et al.(2003)RNA Apr 9(4)：493-501，通过引用而以其整体并入本文)。
RNA干扰剂的靶标基因或序列可以是细胞基因或基因组序列，如SUV39h1、SUV39h2或SETDB1基因序列的H3K9甲基转移酶基因序列。siRNA可基本上与该靶标基因或基因组序列、或其片段同源。如本语境中所使用，术语“同源”定义为与靶标mRNA、或其片段基本上完全一致、足够互补、或相似，以影响对该靶标的RNA干扰。除了原生RNA分子外，适用于抑制或干扰靶标序列表达的RNA包括RNA衍生物和类似物。优选该siRNA与其靶标序列完全一致。
该siRNA优选仅以一个序列为靶标。可通过例如表达谱来筛选每一RNA干扰剂如siRNA的潜在脱靶效应。此类方法是该领域技术人员已知的，且揭示于例如Jackson et al，Nature Biotechnology 6：635-637，2003中。除了表达谱外，还可筛选序列库中潜在靶标序列的类似序列，以鉴别可能具有脱靶效应的潜在序列。例如，根据Jackson et al.(Id.)，15个或可能少至11个接续核苷酸的序列一致性足以引导对非靶标转录本的静默。因此，最初可筛选被使用通过任何已知序列比对方法如BLAST进行的序列一致性分析认定为避免潜在脱靶静默的siRNA。
siRNA分子不需要限制为那些仅含有RNA的分子，而是例如可进一步涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸，还包括其中核糖分子被另一糖分子或实施相似功能的分子替代的分子。此外，可使用位于核苷酸残基之间的非天然链接基，如硫代磷酸酯链接基。例如，含有D-阿拉伯呋喃糖基结构来替代RNA中天然出现的D-核糖核苷的siRNA可用于根据本发明的RNAi分子中(美国专利US 5,177,196)。其它实例包括，在核苷酸的糖与杂环基质间含有O-链接基的RNA分子，其赋予类似于含有2′-O-甲基核糖、阿拉伯糖、特别是D-阿拉伯糖的寡核苷酸的寡核苷酸分子以核酸酶抗性和紧密互补链结合(美国专利US 5,177,196)。
该RNA链可使用报告基团的反应性官能团如荧光团衍生。特别有用的衍生物是在RNA的一端或多端修饰，典型在正义链的3′端修饰。例如，位于3′端的2′-羟基可使用多种基团容易地且选择性地衍生。
其它有用的RNA衍生物并入具有修饰的碳水化合物部分如2′-O-烷基化的残基或2′-O-甲基核糖基衍生物及2′-O-氟核糖基衍生物的核苷酸。该RNA碱基亦可经修饰。可使用可用于抑制或干扰靶标序列的表达的任何修饰碱基。例如，可合并卤化的碱基如5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶。该碱基亦可经烷基化，例如，可并入7-甲基鸟苷以替代鸟苷残基。亦可合并获得成功抑制的非天然碱基。
最优选的siRNA修饰包括2′-去氧-2′-氟尿嘧啶或锁定的核酸(LNA)核苷酸和含有磷酸二酯或可变数目的硫代磷酸酯链接基的RNA双螺旋体。此类修饰时该领域技术人员已知的，且揭示于例如Braasch et al.，Biochemistry，42：7967-7975，2003中。大多数可用的对siRNA分子的修饰可使用被构建用于反义寡核苷酸技术的化学方法引入。优选该修饰牵涉最小的2′-O-甲基修饰，优选不包括此修饰。修饰还优选排除对siRNA的游离5′-羟基的修饰。
具有共价附接至它们的3′-末端或5′末端、或两者的各种“尾部”的siRNA和miRNA分子也是该领域中已知的，且可用来稳定化使用本发明方法递送的siRNA和miRNA分子。通常来说，附接至该RNA分子的3’或5′端的插入基团、各种报告基团和亲脂性基团是该领域中周知的，且可根据本发明的方法使用。可在文章中发现，可根据本发明使用的适用于制备修饰RNA分子的3′-胆固醇或3′-吖啶修饰的寡核苷酸的合成说明，该文章例如：Gamper，H.B.，Reed，M.W.，Cox，T.，Virosco，J.S.，Adams，A.D.，Gall，A.，Scholler，J.K.，and Meyer，R.B.(1993)Facile Preparation and Exonuclease Stability of 3′-ModifiedOligodeoxynucleotides.Nucleic Acids Res.21 145-150；和Reed，M.W.，Adams，A.D.，Nelson，J.S.，and Meyer，R.B.，Jr.(1991)Acridine and Cholesterol-DerivatizedSolid Supports for Improved Synthesis of 3′-ModifiedOligonucleotides.Bioconjugate Chem.2 217-225(1993)。
其它可用于以H3K9甲基转移酶如SUV39h1、SUV39h2或SETDB1基因为靶标的siRNA可容易地设计并测试。据此，可用于本文中揭示方法的siRNA包括长度为约15至约40个或约15至约28个核苷酸的siRNA分子，该siRNA分子与该特异性H3K9甲基转移酶基因如SUV39h1、SUV39h2或SETDB1基因同源。一些具体例中，H3K9甲基转移酶靶向剂，如，SUV39h1、SUV39h2或SETDB1靶向siRNA分子的长度为约25至约29个核苷酸。一些具体例中，H3K9甲基转移酶革巴向siRNA，如，SUV39h1、SUV39h2或SETDB1革巴向siRNA分子的长度为约27、28、29、或30个核苷酸。一些具体例中，H3K9甲基转移酶靶向RNAi，如，SUV39h1、SUV39h2或SETDB1靶向siRNA分子亦可包含3′羟基。一些具体例中，H3K9甲基转移酶靶向siRNA，如，SUV39h1、SUV39h2或SETDB1靶向siRNA分子可以是单链的或双链的；此类分子可以是钝端的或包含悬垂端(如，5′、3′)。特定具体例中，该RNA分子可以是双链的，且是或钝端的或包含悬垂端。
一种具体例中，以H3K9甲基转移酶如SUV39h1、SUV39h2或SETDB1为靶向的RNA分子的至少一条链具有长度为约0至约6个核苷酸(如，嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸)的3′悬垂。其它具体例中，该3′悬垂的长度为约1至约5个核苷酸，约1至约3个核苷酸，以及约2至约4个核苷酸。一种具体例中，以人类SUV39h1/2、SETDB1、EHMT1或PRDM2为靶向的RNA分子是双链的：一条链具有3′悬垂，另一条链可以是钝端的或具有悬垂。在H3K9甲基转移酶如SUV39h1、SUV39h2、SETDB1、EHMT1或PRDM2 RNAi剂为双链且两条链均包含悬垂的具体例中，每一条链上悬垂的长度可以相同或不同。特定具体例中，本发明的RNA包含约19、20、21、或22个配对的核苷酸，且在该RNA的两个3′端均具有长度为约1至约3个特别是约2个核苷酸的悬垂。一种具体例中，该3′悬垂可被稳定化对抗降解。优选具体例中，该RNA通过包括嘌呤核苷酸如腺苷或鸟苷核苷酸而得以稳定化。或者，以修饰类似物替代嘧啶核苷酸，如，以2′-脱氧胸苷替代尿苷2核苷酸3′悬垂，是可容忍的且并不影响RNAi的效率。2′-羟基的缺席显着提升该悬垂在组织培养基中对核酸酶的抗性。
如本文中揭露，H3K9甲基转移酶SUV39h1、SUV39h2和SETDB1的siRNA已经被成功地用来增加鼠SCNT的效率。一些具体例中，若H3K9甲基转移酶的基因静默RNAi，如抑制人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2的表达/令其基因静默的RNAi剂，是不能商购的，以抑制人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2或PRDM2为靶向的基因静默RNAi剂，可由该领域技术人员且根据本文中揭露的方法生产。一些具体例中，对人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2 mRNA及/或蛋白质的表达及/或敲除的评估可使用该领域技术人员已知的可商购的试剂盒确定。其它的可由该领域技术人员基于靶标mRNA的已知序列而容易地制备。
一些具体例中，H3K9甲基转移酶的抑制剂是基因静默RNAi剂，其下调或降低人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2中任何一种或多种的mRNA水平，且可以是25-nt发夹序列。一些具体例中，H3K9甲基转移酶抑制剂是基因静默RNAi，例如，人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2中任何一种或多种的shRNA序列。
一种具体例中，在本文中揭示的方法中使用的RNA干扰剂在不使用载体的静脉注射如水流动力学注射后，被体内细胞主动摄取，例示性说明RNA干扰剂如在本发明方法中使用的siRNA的体内递送中有效。
其它用于递送RNA干扰剂如在本发明方法中使用的siRNA或shRNA的策略，亦可采用例如通过载体如治疗或病毒载体如慢病毒载体递送。此类载体可如例如Xiao-Feng Qinet al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，100：183-188中揭示的使用。其它递送方法包括，使用碱性肽通过将RNA干扰剂与碱性肽如TAT肽的片段接合或混合，再与阳离子脂质体混合或配制于颗粒中，实现RNA干扰剂如本发明的siRNA或shRNA的递送。
注意，dsRNA如siRNA或shRNA可使用诱导型载体如四环素诱导型载体递送。可使用在例如Wang et al.Proc.Natl.Acad.Sci.100：5103-5106中揭示的使用pTet-On载体(BDBiosciences Clontech，Palo Alto，CA)的方法。一些具体例中，载体可以是质粒载体、病毒载体、或任何其它被调整用于外来序列插入和将其引入真核细胞内的适当载体。该载体可以是能引导激动剂或拮抗剂核酸分子的DNA序列转录为RNA的表达载体。病毒表达载体可选自包含下列的群组：例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、E-B病毒载体、牛乳头状瘤病毒载体、基于腺病毒和腺相关病毒的载体、或上述任何病毒的杂交病毒载体。一种具体例中，该载体是游离基因的载体。适当游离基因的载体的使用，提供了在受试者体内以高拷贝数的拮抗剂核酸分子加上染色体DNA，从而消除潜在的染色体整合效应。
可用于本文中揭露方法中的RNA干扰分子和核酸抑制剂，可使用任何已知技术生产，该技术如直接化学合成、通过暴露至组合切丁酶蛋白或果蝇胚胎裂解物而加工较长的双链RNA、通过体外系统从S2细胞递送、使用噬菌体RNA聚合酶、RNA依赖性RNA聚合酶、和基于DNA的载体。使用细胞裂解物或体外加工，可进一步牵涉该短siRNA从该裂解物等中的后续单离，该短siRNA是例如约21至23个核苷酸的siRNA。化学合成一般通过下述进行：制作两个单链RNA寡聚物，之后将该两个单链寡聚物退火为双链RNA。其它实例包括WO 99/32619和WO 01/68836中揭露的方法，其教导siRNA的化学合成和酶促合成。此外，可获取大量用于设计和制造具体siRNA的商业服务(见，如，QIAGEN Inc.，Valencia，CA和AMBION Inc.，Austin，TX)。
术语“antimir”、“microRNA抑制剂”或“miR抑制剂”是同义词，且指的是干扰具体miRNA活性的寡核苷酸。抑制剂可采取多种构型，包括单链、双链(RNA/RNA或RNA/DNA双螺旋体)、及发夹设计，通常，microRNA抑制剂包含与待作为靶标的miRNA的成熟链(或多条链)互补或部分互补的一个或多个序列或序列的部分，此外，该miRNA抑制剂亦可包含位于该序列的5′和3′的额外序列，该额外序列是该成熟miRNA的相反补体。该额外序列可以是与作为成熟miRNA来源的pri-miRNA中该成熟miRNA相邻的序列的相反补体，或该额外序列可以是任意序列(具有A、G、C、U、或dT的混合物)。一些具体例中，该额外序列的一个或两个是能形成发夹的任意序列。因此，一些具体例中，作为该miRNA相反补体的序列通过发夹结构护翼于5′侧及3′侧。当MicroRNA抑制剂为双链时，其可包括相反链上核苷酸之间的错配。
一些具体例中，该试剂是蛋白质或多肽或RNAi剂，其抑制人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2中任何一种或组合的表达。此类具体例中，可修饰细胞(如，通过同源重组)以提供增加的此剂的表达，例如，通过使用全部或部分异种启动子完整或部分地替换天然出现的启动子，因此，该细胞表达人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2的抑制剂，例如，蛋白质或RNAi剂(如，基因静默-RNAi剂)。典型地，以令异种启动子可操作地链接至所希望的编码该试剂的核酸的方式，插入该异种启动子。见，例如，Transkaryotic Therapies的PCT国际公开WO 94/12650、CellGenesys，Inc.的PCT国际公开WO 92/20808、和Applied Research Systems的PCT国际公开WO 91/09955。细胞也可将工程化，以在诱导型调节元件的控制下表达包含该抑制剂的内源基因，在这种情况下，该内源基因的调节序列可通过同源重组替换。基因激活技术揭示于Chappel的美国专利US 5,272,071、Sherwin等人的美国专利US 5,578,461、Selden等人的国际专利PCT/US92/09627(W093/09222)、和Skoultchi等人的PCT/US90/06436(W091/06667)中。该试剂可通过在适用于表达该miRNA的培养条件下培养转换的宿主细胞而制备。随后，可使用已知纯化过程如凝胶过滤和离子交换色谱将所得被表达的试剂从该培养物(即，从培养基或细胞提取物)纯化。人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2的肽或核酸剂抑制剂的纯化，还可包括含有将会结合至该蛋白质的试剂的亲和柱；一个或多个在此类亲和树脂如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、HEPARIN-TOYOPEARLTM或Cibacrom蓝3GA琼脂糖凝胶上进行的柱步骤；一个或多个牵涉使用此类树脂如苯基醚树脂、丁基醚树脂、或丙基醚树脂的疏水相互作用色谱；免疫亲和色谱；或互补cDNA亲和色谱。
一种具体例中，人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2的核酸抑制剂(如，基因静默RNAi剂)可通过合成获得，例如，通过该领域技术人员已知的任何合成方法化学合成核酸而获得。随后，H3K9甲基转移酶如人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2的合成的核酸抑制剂可通过该领域已知的任何方法纯化。核酸的化学合成方法包括但不限于，使用磷酸三酯、磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术、或经由脱氧核苷酸H-膦酸酯中间体的的体外化学合成(见，Bhongle的美国专利US 5,705,629)。
一些情形中，例如，若所希望的是核酸抑制剂的核酸酶稳定性增加，则可使用具有核酸类似物及/或修饰的核苷酸间链接基的核酸。含有修饰的核苷酸间链接基的核酸亦可使用该领域中周知的试剂和方法合成。例如，合成含有磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代林旋转、亚磷酰胺、甲氧基乙基亚磷酰胺、甲缩醛、硫代甲缩醛、二异丙基硅基、乙酰胺、氨基甲酸酯、二亚甲基硫醚(-CH2-S-CH2)、二亚甲基亚砜(-CH2-SO-CH2)、二亚甲基砜(-CH2-SO2-CH2)、2′-O-烷基、和2′-脱氧-2′-氟硫代磷酸酯类核苷酸间链接基的核酸的方法，是该领域中周知的(见，Uhlmann et al，1990，Chem.Rev.90：543-584；Schneider et al.，1990，TetrahedronLett.31：335和本文中引用的参考文献)。Cook等人的美国专利US 5,614,617和US 5,223,618、Acevedo等人的US 5,714,606、Cook等人的US 5,378,825、Buhr等人的US 5,672,697和US 5,466,786、Cook等人的US 5,777,092、De Mesmacker等人的US 5,602,240、Cook等人的US 5,610,289、和Wang的US 5,858,988也揭示了用于提升核酸酶稳定性和细胞摄取的核酸类似物。
合成的siRNA分子，包括shRNA分子，亦可容易地使用大量该领域技术人员已知的技术获得。例如，该siRNA分子可使用该领域中已知的方法化学合成或重组生产，如使用经适宜保护的核糖核苷酸亚磷酰胺和传统的DNA/RNA合成器(见，如，Elbashir，S.M.et al.(2001)Nature 411：494-498；Elbashir，S.M.，W.Lendeckel and T.Tuschl(2001)Genes&Development 15：188-200；Harborth，J.et al.(2001)J.Cell Science 114：4557-4565；Masters，J.R.et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 98：8012-8017；和Tuschl，T.etal.(1999)Genes&Development 13：3191-3197)。或者，可获取若干商业RNA合成供应商，包括但不限于，Proligo(Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，USA)、Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，USA)、Glen Research(Sterling，VA，USA)、ChemGenes(Ashland，MA，USA)、和Cruachem(Glasgow，UK)。如此，siRNA分子不是非常难以合成，且可以适用于RNAi的质量轻易地提供。此外，dsRNA可作为被编码的茎环结构而被质粒载体、逆转录病毒和慢病毒表达(Paddison，P.J.et al.(2002)GenesDev.16：948-958；McManus，M.T.et al.(2002)RNA 8：842-850；Paul，CP.et al.(2002)Nat.Biotechnol.20：505-508；Miyagishi，M.et al.(2002)Nat.Biotechnol.20：497-500；Sui，G.et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 99：5515-5520；Brummelkamp，T.et al.(2002)Cancer Cell 2：243；Lee，N.S.，et al.(2002)Nat.Biotechnol.20：500-505；Yu，J.Y.，et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 99：6047-6052；Zeng，Y.，et al.(2002)Mol.Cell 9：1327-1333；Rubinson，D.A.，et al.(2003)Nat.Genet.33：401-406；Stewart，S.A.，et al.(2003)RNA 9：493-501)。这些载体通常具有位于dsRNA上游的polIII启动子，且可独立表达正义和反义RNA链，及/或将正义和反义RNA链表达为发夹结构。在细胞内，切丁酶将该短发夹RNA(shRNA)处理为有效的siRNA。
一些具体例中，H3K9甲基转移酶的抑制剂是基因静默siRNA分子，其以人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2中的任何一种基因为靶标，而在特定具体例中，以人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB 1、人类EHMT1或人类PRDM2的从该起始密码子下游的约25至50个核苷酸、约50至75个核苷酸、或约75至100个核苷酸开始的编码RNA序列为靶标。一种设计本发明的siRNA分子的方法牵涉鉴别29核苷酸序列基序AA(N29)TT(其中，N可以是任何核苷酸)(SEQ ID NO：50)，以及选择具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％G/C含量的采样数。该序列的“TT”部分视情况而定。或者，如果没有发现此序列，则可使用基序NA(N21)扩展该检索，其中，N可以是任何核苷酸。这种情况下，正义siRNA的3′端可转化为TT，从而允许生成关于正义和反义3′悬垂的序列组合物的对称双螺旋体。随后，该反义siRNA分子可合成为该23核苷酸序列基序的核苷酸位置1至21的补体。对于确保形成具有近乎相等的正义和反义靶标RNA裂解siRNP的小干扰核糖核蛋白颗粒(siRNP)，使用合成的3′TT悬垂具有优势(前文Elbashir et al.(2001)和前文Elbashir et al.2001)。对序列数据库的分析，包括但不限于NCBI、BLAST、Derwent和GenSeq以及可常规的寡合成软件如亦可用来在EST库中选择siRNA序列，以确保仅一个基因被作为靶标。
可用于本文中揭示的方法中的siRNA包括长度为约15至约40个或约15至约28个核苷酸的siRNA分子，其与任一种H3K9甲基转移酶如人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2同源。人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1或人类PRDM2为的靶向siRNA分子的长度优选约19至约25个核苷酸。该靶向siRNA分子的长度更优选约19、20、21、或22个核苷酸。该靶向siRNA分子亦可包含3′-羟基。该靶向siRNA分子可以是单链的或双链的；此类分子可以是钝端的或包含悬垂端(如，5′端、3′端)。具体具体例中，该RNA分子是双链的，且或是钝端的或包含悬垂端。
一种具体例中，H3K9甲基转移酶RNAi靶向RNA分子的至少一条链具有长度为约0至约6个核苷酸(如，嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸)的3′悬垂。其它具体例中，该3′悬垂的长度为约1至约5个核苷酸、约1至约3个核苷酸、及约2至约4个核苷酸。一种具体例中，该靶向RNA分子是双链的：一条链具有3′悬垂，另一条链可以是钝端的或具有悬垂。在该靶向RNA分子为双链且两条链均包含悬垂的具体例中，每一条链上悬垂的长度可以相同或不同。特定具体例中，本发明的RNA包含约19、20、21、或22个配对的核苷酸，且在该RNA的两个3′端均具有长度为约1至约3个特别是约2个核苷酸的悬垂。一种具体例中，该3′悬垂可被稳定化对抗降解。优选具体例中，通过包括嘌呤核苷酸如腺苷或鸟苷核苷酸而得以稳定化。或者，以修饰类似物替代嘧啶核苷酸，如，以2′-脱氧胸苷替代尿苷2核苷酸3′悬垂，是可容忍的且并不影响RNAi的效率。2′-羟基的缺席显着提升该悬垂在组织培养基中对核酸酶的抗性。
寡核苷酸修饰
在一些应用中，未修饰的寡核苷酸可能不太理想，如，未修饰的寡核苷酸可被证实其被细胞核酸酶降解。核酸酶可水解核酸的磷酸二酯键。但是，对寡核苷酸的一个或多个亚单元进行化学修饰，可赋予其以改善的性质，且例如可使寡核苷酸对于核酸酶更为稳定。
修饰核酸和修饰核苷酸替代品可包括下述的一种或多种：(i)对该磷酸二酯类骨架链接基中一个或两个非链接磷酸酯氧及/或一个或多个链接磷酸酯氧的改变如替换；(ii)对核糖架构如核糖上2′-羟基的改变如替换；(iii)以“脱磷”链接基对磷酸酯部分的整体替换；(iv)以非天然碱基对天然出现的碱基的修饰或替换；(v)核糖-磷酸骨架的替换或修饰；(vi)对寡核苷酸3′端或5′端的修饰如移除，对末端磷酸酯基或对部分如荧光标记部分至寡核苷酸3′或5′端的接合的修饰或替换；以及(vii)对糖(如，6元环)的修饰。
本语境中使用的术语替换、修饰、改变等并不意味任何过程限制，如，修饰并不意味着必需从参考或天然出现的核糖核酸开始并修饰，以产生修饰的核糖核酸，而宁可说是简单地修饰，表面其不同于天然出现的分子。
由于寡核苷酸是亚单元或单体的聚合物，本文中揭示的修饰大多可出现在寡核苷酸内重复的位置，如，对核酸碱基、糖、磷酸酯部分、或磷酸酯部分的非桥接氧的修饰。不需要给定寡核苷酸的所有位置被均匀地修饰，事实上，超过一种前述修饰可并入单个寡核苷酸中或甚至并入寡核苷酸内的单个核苷酸中。
一些情况下，该修饰将出现在寡核苷酸的所有受试位置，但多数情况下，事实上在大多数情况下，并非如此。举例而言，修饰可出现在3′或5′末端位置，可仅出现在内部区域，可仅出现在末端区域，如，出现在末端核苷酸位置或寡核苷酸的最后2、3、4、5、或10个核苷酸处。修饰可出现在双链区域中、单链区域中、或两个区域中。修饰可仅出现在寡核苷酸的双链区域内，或可仅出现在寡核苷酸的单链区域内。如，位于非桥接氧位置的硫代磷酸酯修饰可仅出现在一端或两端，可仅出现在末端区域内，如，出现在链的末端核苷酸位置或链的最后2、3、4、5、或10个核苷酸处，或可出现在双链区域和单链区域内，特别是末端。5′端或两端可磷酸化。
本文中揭示的修饰可以是唯一性修饰、或包括在多个核苷酸上的唯一类型的修饰，或修饰可与本文中揭示的一种或多种其它修饰组合。本文中揭示的修饰亦可组合在寡核苷酸上，如寡核苷酸中不同的核苷酸具有不同的本文中揭示的修饰。
一些具体例中，例如，特别优选提升稳定性、在悬垂中包括特定的核酸碱基、或在单链悬垂如5′或3′悬垂或两者中包括修饰核苷酸或核苷酸替代物。如，所希望的可能是在悬垂中包括嘌呤核苷酸。一些具体例中，3′或5′悬垂中的全部或一些碱基将被修饰，如，具有本文中揭示的修饰。修饰可包括，如，使用位于核糖2′-OH基团上的修饰；如，使用脱氧核糖核苷酸如脱氧胸苷而非核糖核苷酸；以及磷酸酯中的修饰，如，硫代硫酸酯修饰。悬垂不需要与靶标序列同源。
对寡核苷酸的特异性修饰
磷酸酯基
磷酸酯基是带负电的基团。该电荷在两个非桥接氧原子上均等分布。但是，磷酸酯基可通过以不同取代基替换一个氧而被修饰。对RNA磷酸酯骨架的这一修饰的一个结果为，可能增加该寡核糖核苷酸对溶核酸分解的抗性。因此，尽管不欲受缚于理论，一些具体例中，可能所希望的是引入导致不带电的链接基或具有不对称电荷分布的链接基的改变。
修饰磷酸根的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼磷酸、硼磷酸酯、磷酸氢酯、磷酰胺、烷基或芳基磷酸酯、和磷酸三酯。某些具体例中，磷酸酯骨架部分中的一个非桥接磷酸酯氧分子可由下述的任何一个替代：S、Se、BR3(R是氢、烷基、芳基)、C(即，烷基、芳基等)、H、NR2(R是氢、烷基、芳基)、或OR(R是烷基或芳基)。未修饰的磷酸酯基中的磷原子是非手性的。但是，以上述源自或原子组中的一个替代非桥接氧中的一个，使得该磷原子为手性；换言之，以这种方式修饰的磷酸酯基中的磷原子是立体中心。该立体中心磷原子可具有或“R”构型(本文中记为Rp)或“S”构型(本文中记为Sp)。
二硫代磷酸酯具有两个被硫替代的非桥接氧原子。二硫代磷酸酯中的磷中心是非手性的，其妨碍寡核糖核苷酸非对映体的形成。因此，尽管不欲受缚于理论，在不能产生非对映体混合物方面，消除手性中心的对两个非桥接氧的修饰如形成二硫代磷酸酯，可能是所希望的。因此，该非桥接氧可能独立为S、Se、B、C、H、N、或OR(R是烷基或芳基)中的任何一种。
该磷酸酯链接基亦可通过以氮(桥接的磷酰胺)、硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基磷酸酯)替换桥接氧(即，将该磷酸酯链接至核苷酸的氧)而被修饰。该替换可出现在一个或两个链接氧处。当该桥接氧是核苷酸的3′-氧时，优选以碳替换。当该桥接氧是核苷酸的5′-氧时，优选以氮替换。
磷酸酯基的替换
该磷酸酯基可替换为不含磷的连接体。尽管不欲受缚于理论，据信，由于带电的磷酸二酯基是溶核酸降解的反应中心，将其替换为中性结构模拟物应赋予提升的核酸酶稳定性。再一次，尽管不欲受缚于理论，一些具体例中，可能希望引入其带电磷酸酯基被替换为中性部分的改变。
可替换该磷酸酯基的部分的实例包括甲基磷酸酯、羟基胺基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、乙撑氧链接基、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚胺基、亚甲基甲基亚胺基、亚甲基肼撑、亚甲基二甲基肼撑、及亚甲基氧甲基亚胺基。优选的替换包括亚甲基羰基胺基和亚甲基甲基亚胺基。
其中至少一个链接至该磷酸酯的氧已经被替换或该磷酸酯已经被非磷基团替换的修饰磷酸酯链接基，也指代为“非磷酸二酯骨架链接基”。
核糖磷酸酯骨架的替换
亦可构建寡核苷酸模拟支架，其中，该磷酸酯链接基和核糖被替换为抗核酸酶的核苷酸或核苷酸替代物。尽管不欲受缚于理论，据信，重复带电的骨架的缺失减少了其与识别聚阴离子的蛋白(如，核酸酶)的结合。再一次，尽管不欲受缚于理论，一些具体例中，可能希望引入其碱基被中性替代物骨架链接的改变。实例包括N-吗啉基、环丁基、吡咯烷、和肽核酸(PNA)核苷酸替代物。优选的替代物是PNA替代物。
糖修饰
寡核苷酸可包括对核酸的全部或部分糖基团的修饰。如，2′-羟基(OH)可由大量不同的“氧”或“脱氧”取代基修饰或替换。尽管不欲受缚于理论，由于羟基可能不再被去质子化以形成2′-烷氧离子，因此预期稳定性提升。2′-烷氧化物可通过对链接基磷原子的分子内亲核攻击而催化降解。再一次，尽管不欲受缚于理论，一些具体例中，可能希望引入不可能在2′位置形成烷氧化物的改变。
“氧”-2′-羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，如，R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁定的”核酸(LNA)，其中，2′-羟基通过例如亚甲基桥连接至相同核糖的4′碳；O-AMINE(AMINE＝NH2、烷基胺基、二烷基胺基、杂环基、芳基胺基、二芳基胺基、杂芳基胺基、或二杂芳基胺基、乙二胺、多胺基)和胺基烷氧基，O(CH2)nAMINE(如，AMINE＝NH2、烷基胺基、二烷基胺基、杂环基、芳基胺基、二芳基胺基、杂芳基胺基、或二杂芳基胺基、乙二胺、多胺基)。值得注意的是，仅含有甲氧基乙基(MOE)(OCH2CH2OCH3，PEG衍生物)的寡核苷酸展示与那些具有强健硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸相当的核酸酶稳定性。
“脱氧”修饰包括氢(即，脱氧核糖，其尤其于部分双链的RNA的悬垂部分相关联)；卤素(如，氟)；胺基(如，NH2、烷基胺基、二烷基胺基、杂环基、芳基胺基、二芳基胺基、杂芳基胺基、二杂芳基胺基、或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2、烷基胺基、二烷基胺基、杂环基、芳基胺基、二芳基胺基、杂芳基胺基、二杂芳基胺基、或二杂芳基胺基)；-NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；氰基；巯基；烷基-硫-烷基；硫代烷氧基；硫代烷基；以及可视情况经例如氨基官能度取代的烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基。
该糖基团亦可含有一个或多个具有与核糖中相应的碳相反的立体化学构型的碳。因此，寡核苷酸可包括含有例如阿拉伯糖作为该糖基团的核苷酸。该单体可具有位于糖上1’位置处的α链接，如，α-核苷酸。寡核苷酸亦可包括“无碱基”的糖，且缺失位于C-1’的核酸碱基。这些无碱基的糖亦可进一步含有位于一个或多个构建糖的原子处的修饰。寡核苷酸亦可含有一个或多个L型的糖，如L-核苷酸。
优选的取代基为2′-O-Me(2′-O-甲基)、2′-O-MOE(2′-O-甲氧基乙基)、2′-F、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-氧代乙基](2′-O-NMA)、2′-S-甲基、2′-O-CH2-(4′-C)(LNA)、2′-O-CH2CH2-(4′-C)(EN A)、2′-O-氨基丙基(2′-O-AP)、2′-O-二甲基胺基乙基(2′-O-DMAOE)、2′-O-二甲基胺基丙基(2′-O-DMAP)和2′-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2′-O-DMAEOE)。
末端修饰
寡核苷酸的3-终末(3′)和5-终末(5′)端可经修饰。此类修饰可以位于该分子的3′端、5′端或两端。它们可包括对整体末端磷酸酯的修饰或替换，或对该磷酸酯基团的一个或多个原子的修饰或替换。如，寡核苷酸的3′端和5′端可接合至其它功能性分子整体，如标记部分如荧光团(如，芘、TAMRA、荧光素、Cy3染料或Cy5染料)或保护基(如，基于硫、硅、硼或酯的保护基)。该功能性分子整体可通过磷酸酯基及/或链接基附接至糖。该链接基的末端源自可连接至或替换该磷酸酯基的链接原子或该糖的C-3′或C-5′的O、N、S或C基团。或者，该链接基可连接至或替换核苷酸替代物(如，PNA)的末端原子。
当链接基/磷酸酯-功能性分子整体-链接基/磷酸酯阵列被置于dsRNA的两条链之间时，这一阵列可取代发夹型RNA剂中的发夹RNA环圈。
可用于调节活性的末端修饰包括，以磷酸酯或磷酸酯类似物修饰5′端。如，在优选具体例中，dsRNA的反义链经5′-磷酰化，或包括位于5′终末端的磷酰基类似物。5′-磷酸酯修饰包括可与RISC介导的基因静默相容的那些修饰。位于5′-终端的修饰亦可用于刺激或抑制受试者的免疫系统。适当的修饰包括：5′-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5′)；5′-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-腺苷帽(Appp)，以及任何经修饰或未经修饰的核苷酸帽结构(N-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5′)；5′-二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5′)；5′-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5′)；氧/硫替换的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯(如，5′-α-硫代磷酸酯、5′-β-硫代三磷酸酯、5′-γ-硫代三磷酸酯等)、5′-磷酰胺((HO)2(O)P-NH-5′、(HO)(NH2)(O)P-O-5′)、5′-烷基磷酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，如，RP(OH)(O)-O-5′-、(OH)2(O)P-5′-CH2-))、5′-烷基醚磷酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基甲基等，如，RP(OH)(O)-O-5′-)的任何其它组合。其它具体例包括以BH3、BH3-及/或Se替换氧/硫。
末端修饰亦可用于监控分别，而在这种情况下，优选的待加入的基团包括荧光团如荧光素或染料如488。末端修饰亦可用于提升摄取，对于这一目标的可用修饰包括胆固醇。末端修饰亦可用于将RNA剂交联至另一部分；可用于这一目标的修饰包括丝裂霉素C。
核酸碱基
腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是RNA中发现的最常见的碱基。这些碱基可经修饰或替换，以提供具有改善性质的RNA。例如，可使用这些碱基或合成的和天然的核酸碱基(如，肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、isoguanisine、或tubercidine)及上述任一种修饰制备抗核酸酶的寡核糖核苷酸。或者，可采用上述任何碱基的经取代或修饰的类似物以及“通用碱基”。实例包括：2-(卤)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2-(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2-(胺基丙基)腺嘌呤、2-(甲硫基)、N6-(异戊烯基)腺嘌呤、6-(烷基)腺嘌呤、6-(甲基)腺嘌呤、7-(去氮)腺嘌呤、8-(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8-(炔基)腺嘌呤、8-(氨基)腺嘌呤、8-(卤)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8-(硫代烷基)腺嘌呤、8-(巯基)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6-(甲基)腺嘌呤、N6，N6-(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2-(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6-(甲基)鸟嘌呤、7-(烷基)鸟嘌呤、7-(甲基)鸟嘌呤、7-(去氮)鸟嘌呤、8-(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8-(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8-(卤)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8-(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(巯基)鸟嘌呤、N-(甲基)鸟嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3-(去氮)-5-(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3-(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5-(卤)胞嘧啶、5-(甲基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、N4-(乙酰基)胞嘧啶、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基胺基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基胺基甲基)-4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2，4-(二硫代)尿嘧啶、5-(甲基胺基甲基)-2，4-(二硫代)尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基胺基)尿嘧啶、5-(氨基烯丙基)尿嘧啶、5-(氨基烷基)尿嘧啶、5-(胍烷基)尿嘧啶、5-(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基胺基烷基)尿嘧啶、5-(二甲基胺基烷基)尿嘧啶、5-(卤)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(三氟甲基)尿嘧啶、6-(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3-(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2-(硫代)假尿嘧啶、4-(硫代)假尿嘧啶、2，4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1-取代的假尿嘧啶、1-取代的2-(硫代)-假尿嘧啶、1取代的4-(硫代)假尿嘧啶、1-取代的2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1-(氨基烷基胺基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(氨基烷基胺基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1-(氨基烷基胺基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1-(氨基烷基胺基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩恶嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩恶嗪-1-基、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩恶嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩恶嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩恶嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩恶嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩恶嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩恶嗪-1-基、7-(胍烷基-羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、1，3，5-(三氮杂)-2，6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、tubercidine、isoguanisine、肌苷基(inosinyl)、2-氮杂-肌苷基、7-去氮-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异喹诺酮基、5-(甲基)异喹诺酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并哌嗪基、异喹诺酮基、7-(丙炔基)异喹诺酮基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2，4，5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4，6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、茋基、并四苯基、并五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2-(氨基)嘌呤、2，6-(二氨基)嘌呤、5-取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、O6-取代的嘌呤、取代的1，2，4-三唑、或其任何O-烷基化或N-烷基化的衍生物。
其它嘌呤和嘧啶包括在通过引入而并入本文的美国专利US 3,687,808中揭露的那些，在Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pages 858-859，Kroschwitz，J.I.，ed.John Wiley&Sons，1990中揭示的那些，以及在Englisch et al.，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613中揭示的那些。
阳离子基团
对寡核苷酸的修饰亦可包括一个或多个阳离子基团附接至糖、碱基、及/或磷酸酯或修饰磷酸酯骨架部分的磷原子。阳离子基团可附接至能取代在天然的非通用或通用碱基上的任何原子。优选的位置是不干扰杂交的位置，即不干扰碱基配对所需氢键相互作用的位置。阳离子基团可例如通过糖的C2′位置或环状或非环状替代物的类似位置被附接。阳离子基团可包括，如，去质子化的胺基，源自例如，O-AMINE(AMINE＝NH2、烷基胺基、二烷基胺基、杂环基、芳基胺基、二芳基胺基、杂芳基胺基、或二杂芳基胺基、乙二胺、多胺基)；氨基烷氧基，如，O(CH2)nAMINE(如，AMINE＝NH2、烷基胺基、二烷基胺基、杂环基、芳基胺基、二芳基胺基、杂芳基胺基、或二杂芳基胺基、乙二胺、多胺基)；胺基(如，NH2、烷基胺基、二烷基胺基、杂环基、芳基胺基、二芳基胺基、杂芳基胺基、二杂芳基胺基、或氨基酸)；或NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2、烷基胺基、二烷基胺基、杂环基、芳基胺基、二芳基胺基、杂芳基胺基、或二杂芳基胺基)。
寡核苷酸内的配置
一些修饰可优选包括在寡核苷酸的特定位置上，如，链的内部位置、或在寡核苷酸的5′或3′端。修饰在寡核苷酸上的优选定位可赋予该试剂以优选的性质。例如，特定修饰的优选定位可赋予最优的基因静默性质、或增加对核酸内切酶或核酸外切酶活性的抗性。
寡核苷酸的一个或多个核苷酸可具有2′-5′链接。寡核苷酸的一个或多个核苷酸可具有反向链接，如3′-3′链接、5′-5′链接、2′-2′链接或2′-3′链接。
寡核苷酸可包含至少一个5′-嘧啶-嘌呤-3′(5′-PyPu-3′)二核苷酸，其中，嘧啶以独立选自2′-O-Me(2′-O-甲基)、2′-O-MOE(2′-O-甲氧基乙基)、2′-F、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-氧代乙基](2′-O-NMA)、2′-S-甲基、2′-O-CH2-(4′-C)(LNA)和2′-O-CH2CH2-(4′-C)(ENA)所组成组的修饰予以修饰。
一种具体例中，在该寡核苷酸的所有出现的序列基序5′-嘧啶-嘌呤-3′(5′-PyPu-3′)二核苷酸中，大多数5′-嘧啶被选自2’-O-Me(2′-O-甲基)、2′-O-MOE(2′-O-甲氧基乙基)、2′-F、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-氧代乙基](2′-O-NMA)、2′-S-甲基、2′-O-CH2-(4′-C)(LNA)和2′-O-CH2CH2-(4′-C)(ENA)的修饰所修饰。
双链寡核苷酸可包括至少一个5′-尿苷-腺嘌呤-3′(5′-UA-3′)二核苷酸，其中，该尿苷是2′-修饰的核苷酸；或5′-尿苷-鸟嘌呤-3′(5′-UG-3′)二核苷酸，其中，该5′-尿苷是2′-修饰的核苷酸；或末端5′-胞苷-腺嘌呤-3′(5′-CA-3′)二核苷酸，其中，该5′-胞苷是2′-修饰的核苷酸；或末端5′-尿苷-尿苷-3′(5′-UU-3′)二核苷酸，其中，该5′-尿苷是2′-修饰的核苷酸；或末端5′-胞苷-胞苷-3′(5′-CC-3′)二核苷酸，其中，该5′-胞苷是2′-修饰的核苷酸；或末端5′-胞苷-尿苷-3′(5′-CU-3′)二核苷酸，其中，该5′-胞苷是2′-修饰的核苷酸；或末端5′-尿苷-胞苷-3′(5′-UC-3′)二核苷酸，其中，该5′-尿苷是2′-修饰的核苷酸。包括这些修饰的双链寡核苷酸在对抗核酸内切酶活性方面尤其稳定。
一般参考文献
根据本发明使用的寡核糖核苷酸和寡核糖核苷可使用固相合成方法合成，见，例如《寡核苷酸合成实用方法》(Oligonucleotide synthesis，a practical approach，Ed.M.J.Gait，IRL Press，1984)；《寡核苷酸及类似物实用方法》(Oligonucleotides andAnalogues，A Practical Approach，Ed.F.Eckstein，IRL Press，1991(尤其是第1章《寡脱氧核糖核苷酸合成的现代机器辅助方法》、第2章《寡核糖核苷酸合成》、第3章《2′-O-甲基寡核糖核苷酸：合成及应用》、第4章《硫代磷酸酯寡核苷酸》、第5章《寡核苷酸二硫代磷酸酯的合成》、第6章《寡-2′-脱氧核糖核苷甲基磷酸酯的合成》、及第7章《含有修饰碱基的寡脱氧核苷酸》)。其它尤其可用的合成过程、试剂、阻断基团和反应条件揭示于Martin，P.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504；Beaucage，S.L.and Iyer，R.P.，Tetrahedron，1992，48，2223-2311；以及Beaucage，S.L.and Iyer，R.P.，Tetrahedron，1993，49，6123-6194；或其所引用的参考文献中。本文中，可使用WO00/44895、WO01/75164、或WO02/44321中揭示的修饰。本文中列举的所有出版物、专利和公开专利申请的揭露内容通过引用而并入本文。
磷酸酯基参考文献
膦酸酯寡核糖核苷酸的制备揭示于美国专利US 5,508,270中。烷基磷酸酯寡核糖核苷酸的制备揭示于美国专利US 4,469,863中。磷酰胺寡核糖核苷酸的制备揭示于美国专利US 5,256,775或US 5,366,878中。磷酸三酯寡核糖核苷酸的制备揭示于美国专利US 5,023,243中。硼磷酸酯寡核糖核苷酸的制备揭示于美国专利US 5,130,302和US 5,177,198中。3′-脱氧-3′-氨基磷酰胺寡核糖核苷酸的制备揭示于美国专利US 5,476,925中。3′-脱氧-3′-亚甲基磷酸酯寡核糖核苷酸的制备揭示于An，H，et al.J.Org.Chem.2001，66，2789-2801中。硫桥核苷酸的制备揭示于Sproat et al.Nucleosides Nucleotides 1988，7，651和Crosstick et al.Tetrahedron Lett.1989，30，4693中。
糖基团参考文献
对2′-修饰的修饰可见于Verma，S.et al.Annu.Rev.Biochem.1998，67，99-134及其所引用的全部参考文献中。对核糖的具体修饰可见于下述参考文献：2′-氟(Kawasakiet.al.，J.Med.Chem.，1993，36，831-841)；2′-MOE(Martin，P.Helv.Chim.Acta 1996，79，1930-1938)；“UNA”(Wengel，J.Acc.Chem.Res.1999，32，301-310)。
磷酸酯基替换的参考文献
本文中，亚甲基甲基亚胺基链接的寡核糖核苷亦称MMI链接的寡核糖核苷；亚甲基二甲基肼基链接的寡核糖核苷亦称MDH链接的寡核糖核苷；亚甲基羰基胺基链接的寡核苷亦称酰胺-3链接的寡核糖核苷；以及，亚甲基胺基羰基链接的寡核苷亦称酰胺-4链接的寡核糖核苷；以及，具有例如交替的MMI和PO或PS链接的骨架化合物可如美国专利US 5,378,825、US 5,386,023、US 5,489,677和公开的PCT申请PCT/US92/04294和PCT/US92/04305(分别作为WO 92/20822和WO 92/20823予以公开)中所揭示的制备。甲缩醛和硫代甲缩醛链接的寡核糖核苷可如美国专利US 5,264,562和US 5,264,564中所揭示的制备。乙撑氧链接的寡核糖核苷可如美国专利US 5,223,618中所揭示的制备。硅氧烷替换揭示于Cormier，J.F.et al.Nucleic Acids Res.1988，16，458中。碳酸酯替换揭示于Tittensor，J.R.J.Chem.Soc.C 1971，1933中。羧甲基替换揭示于Edge，M.D.et al.J.Chem.Soc.PerkinTrans.11972，1991中。氨基甲酸酯替换揭示于Stirchak，E.P.Nucleic Acids Res.1989，17，6129中。
磷酸酯-核糖骨架替换的参考文献
环丁基糖替代化合物可如美国专利US 5,359,044中揭示的制备。吡咯烷糖替代物可如美国专利US 5,519,134中揭示的制备。吗啉基糖替代物可如美国专利US 5,142,047和US 5,235,033及其它相关专利公开中揭示的制备。肽核酸(PNA)本身是已知的，且可根据《肽核酸(PNA)：合成、性质和潜在应用》(Peptide Nucleic Acids(PNA)：Synthesis，Properties and Potential Applications，Bioorganic&Medicinal Chemistry，1996，4，5-23)中提出的多种过程中的任何过程制备。它们亦可根据美国专利US 5,539,083制备，该专利通过引用而以其整体并入本文。
末端修饰参考文献
末端修饰揭示于Manoharan，M.et al.Antisense and Nucleic Acid DrugDevelopment 12，103-128(2002)及其参考文献中。
核酸碱基参考文献
N-2取代的嘌呤核苷亚酰胺可如美国专利US 5,459,255中揭示的制备。3-去氮嘌呤核苷亚酰胺可如美国专利US 5,457,191中揭示的制备。5，6-取代的嘧啶核苷亚酰胺可如美国专利US 5,614,617中揭示的制备。5-丙炔基嘧啶核苷亚酰胺可如美国专利US 5,484,908中揭示的制备。其它参考文献揭露于上文关于碱基修饰的段落中。
寡核苷酸生产
本发明的寡核苷酸化合物可使用溶液相或固相有机合成方法制备。有机合成具有下述优势：可容易地制备包含非天然或修饰核苷酸的寡核苷酸链。可额外或替代地使用该领域中已知的用于此合成的任何其它手段。使用类似技术合成其它寡核苷酸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和烷基化衍生物是已知的。本发明的双链寡核苷酸化合物可使用两步过程制备。首先，分别制备该双链分子的个体链。随后，将该作为组分的链退火。
无论何种合成方法，该寡核苷酸可在适于配制的溶液(如，水性溶液及/或有机溶液)中制备。例如，寡核苷酸制剂可沉淀并溶解在纯的双蒸馏水中，再冻干。随后，干燥的寡核苷酸可再次悬浮于适用于预期配制过程的溶液中。
关于特定修饰的寡核苷酸的合成的教导可在下述美国专利或待审专利申请中找到：US 5,138,045和US 5,218,105，关于多胺接合的寡核苷酸；US 5,212,295，关于用于制备具有手性磷链接的寡核苷酸的单体；US 5,378,825和US 5,541,307，关于具有修饰骨架的寡核苷酸；US 5,386,023，关于骨架修饰的核苷酸及其通过还原性偶合进行的制备；US5,457,191，关于基于3-去氮嘌呤系统的修饰的核酸碱基及其合成方法；US 5,459,255，关于基于N-2取代的嘌呤的修饰核酸碱基；US 5,521,302，关于制备具有手性磷链接的寡核苷酸的过程；US 5,539,082，关于肽核酸；US 5,554,746，关于具有β-内酰胺骨架的寡核苷酸；US 5,571,902，关于合成寡核苷酸的方法和材料；US 5,578,718，关于具有烷硫基的核苷酸，其中，此类基团可作为链接基用于附接在该核苷多个位置中任意位置的其它部分；US5,587,361和US 5,599,797，关于具有高手性纯度的硫代磷酸酯链接的寡核苷酸；US 5,506,351，关于制备2′-O-烷基鸟苷及相关化合物，包括2，6-二氨基嘌呤化合物的过程；US5,587,469，关于具有N-2取代的嘌呤的寡核苷酸；US 5,587,470，关于具有3-去氮嘌呤的寡核苷酸；US 5,223，168和US 5,608,046，均关于接合的4′-去甲基核苷类似物；US 5,602,240和US 5,610,289，关于骨架修饰的寡核苷酸类似物；以及US 6,262,241和US 5,459,255，尤其关于合成2′-氟-寡核苷酸的方法。
RNA干扰剂的递送
将RNAi剂如siRNA或含有RNAi剂的载体递送至靶标细胞(如，基底细胞、或肺部及/或呼吸系统的细胞、或其它所希望的靶标细胞)的方法，是该领域技术人员所周知的。一些具体例中，作为H3K9甲基转移酶抑制剂的RNAi剂(如，基因静默-RNAi剂)，如抑制人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2中任何一种的RNAi剂，可经由气溶胶手段施予至受试者，例如，使用喷雾器等。备选的具体例中，作为H3K9甲基转移酶抑制剂的RNAi剂(如，基因静默-RNAi剂)，如抑制人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2中任何一种的RNAi剂的施予可包括，例如(i)注射含有RNA干扰剂如siRNA的组合物、或(ii)令细胞(如，供体人类细胞、接纳体卵母细胞、或SCNT胚胎)直接与包含RNAi剂如siRNA的组合物接触。
一些具体例中，该细胞、卵母细胞或胚胎的施予可通过单次注射或通过两次或多次注射进行。一些具体例中，RNAi剂在药学可接受的载剂中被递送。可同步使用一种或多种RNAi剂，如H3K9甲基转移酶如SUV39h1、SUV39h2、SETDB1、EHMT1及/或PRDM2的一种或多种基因静默RNAi剂抑制剂可一起施予。该RNA干扰剂，如抑制人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2中任何一种的siRNA可单独递送，或与其它RNA干扰剂如siRNA如被导向其它细胞基因的siRNA组合递送。
一些具体例中，特异性细胞是RNA干扰的靶标，限制了由RNA干扰的非特异性靶向性造成的RNA干扰的潜在副作用。该方法可使用，例如复合物或融合分子，其包含细胞靶向部分和用于将RNAi有效递送至细胞内的RNA干扰结合部分。例如，当与siRNA混合时，抗体-鱼精蛋白融合蛋白结合siRNA并选择性地将该siRNA递送至表达由该抗体识别的抗原的细胞内，仅令那些表达由该抗体鉴别的抗原的细胞中的基因表达静默。
一些具体例中，siRNA或RNAi结合部分是蛋白质的蛋白或核酸结合域或片段，且该结合部分是融合至该靶向部分的一部分。该靶向部分的定位可在该构建体的羧基端或氨基端或在该融合蛋白的中部。
一些具体例中，亦可采用病毒介导的递送机制来在体外将siRNA如人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的siRNA(如，基因静默RNAi剂)抑制剂递送至细胞内，如Xia，H.et al.(2002)Nat Biotechnol 20(10)：1006)中所揭示。shRNA的质粒或病毒介导的递送机制亦可用来将shRNA在体外和体内递送至细胞内，如Rubinson，D.A.，et al.((2003)Nat.Genet.33：401-406)和Stewart，S.A.，et al.((2003)RNA 9：493-501)中所揭示。或者，其它具体例中，亦可经由单独使用RNAi剂抑制剂或表达该RNAi剂的病毒载体培养该细胞、卵母细胞或SCNT胚胎，将RNAi剂如H3K9甲基转移酶如SUV39h1、SUV39h2、SETDB1、EHMT1及/或PRDM2的基因静默-RNAi剂抑制剂引入细胞内。
通常，任何递送核酸分子的方法可调适以用于RNAi干扰分子(见，如，AkhtarS.and Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144；WO94/02595，两篇文献通过引用以其整体并入本文)。
RNA干扰分子可通过化学接合至亲脂性基团如胆固醇而修饰，以增强细胞摄取并防止降解。一种备选的具体例中，可使用药物递送系统如纳米颗粒、树形分子、聚合物、脂质体、或阳离子递送系统递送该RNAi分子。带正电荷的阳离子递送系统促进RNA干扰分子(带负电荷)的结合，还增强在带负电荷的细胞膜处的相互作用，以允许该细胞对siRNA的有效摄取。阳离子脂质、树形分子、或聚合物或可被接合至RNA干扰分子、或被诱导以形成包裹RNAi分子的囊泡或胶束(见，如，Kim SH.，et al(2008)Journal ofControlled Release129(2)：107-116)。当全身性施予时，囊泡或胶束的形成进一步防止该RNAi分子的降解。制作并施予阳离子-RNAi复合物的方法完全处于该领域技术人员的能力之内(见，如，Sorensen，DR.，et al(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma，UN.，et al(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold，AS et al(2007)J.Hypertens.25：197-205，这些文献通过引用以其整体并入本文)。
特定RNAi剂的试剂量将是，影响RNA干扰如人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的基因静默，从而导致人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的基因表达水平降低及各自蛋白表达水平的后续下降所必需的量。
还已知，RNAi分子不必与其靶标序列完美匹配。但优选该siRNA的反义(向导)链的5′和中部与人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2基因中任一种的核酸序列完美互补。
据此，如本文中所揭露，发挥人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的基因静默-RNAi剂抑制剂功能的RNAi分子是，例如但不限于，未稀少地和修饰的双链(ds)RNA分子，包括短时序调节RNA(stRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、microRNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)(见，如，Baulcombe，Science 297：2002-2003，2002)。该dsRNA分子，如siRNA，亦可含有3′悬垂，优选3′UU或3′TT悬垂。一种具体例中，本发明的siRNA分子不包括包含大于约30至40个碱基、约40至50个碱基、约50个碱基或更多碱基的ssRNA的RNA分子。一种具体例中，本发明的siRNA分子在其长度的超过约25％、超过约50％、超过约60％、超过约70％、超过约80％、超过约90％上为双链。
一些具体例中，人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的基因静默RNAi核酸抑制剂是任何结合人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2并抑制其表达的试剂，其中，各甲基转移酶基因的表达被抑制。
本发明的另一具体例中，人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的抑制剂可以是催化性核酸构建体，例如核糖酶，其能裂解RNA转录本并因此防止野生型蛋白的产生。凭借与位于核糖酶催化位点侧翼的靶标互补的序列的两个区域，核糖酶被特定序列设为靶标并被该特定序列退火。结合后，该核糖酶以位点特异性方式裂解该靶标。设计和测试特异性识别并裂解本文中揭示的基因产物序列的核糖酶，如裂解H3K9甲基转移酶如人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2，是该领域技术人员周知的技术(例如，Lleber and Strauss，(1995)Mol Cell Biol 15：540.551，其揭露内容通过引用并入本文)。
H3K9甲基转移酶的蛋白质和肽抑制剂
一些具体例中，H3K9甲基转移酶抑制剂是任何一种H3K9甲基转移酶如人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的蛋白及/或肽抑制剂，例如但不限于，人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的突变蛋白、治疗性蛋白和重组蛋白，以及显性阴性抑制剂(如，H3K9甲基转移酶的非功能性蛋白质、或H3K9甲基转移酶的非功能性配体，其结合至H3K9甲基转移酶并与后者竞争)。蛋白和肽抑制剂亦可包括，例如，突变蛋白、基因修饰蛋白蛋白、肽、合成肽、重组蛋白、嵌合蛋白、抗体、人源化蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、修饰蛋白及其片段。
本文中，可作为H3K9甲基转移酶如人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2基因表达及/或人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2蛋白功能的抑制剂的试剂可以是任意类型的整体，例如但不限于，化学品、核酸序列、核酸类似物、蛋白质、肽或其片段。一些具体例中，该试剂是化学品、整体或部分，包括而不限于，合成的和天然出现的非蛋白整体。某些具体例中，该试剂是具有化学部分的小分子。
备选的具体例中，可用于本文中揭露方法中的试剂是抑制H3K9甲基转移酶如人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的基因表达或功能的蛋白及/或肽或其片段。此类剂包括，例如但不限于，蛋白变体、突变蛋白、治疗性蛋白、截短的蛋白和蛋白片段。蛋白剂亦可选自包含突变蛋白、基因工程化蛋白、肽、合成肽、重组蛋白、嵌合蛋白、抗体、中间抗体(midibodies)、微小抗体(minibodies)、三链抗体(triabodies)、人源化蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、修饰蛋白及其片段的群组。
或者，可作为人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的抑制剂用于本文中揭露方法中的试剂可以是化学品、小分子、大分子或整体或部分，包括而不限于，合成的和天然出现的非蛋白整体。某些具体例中，该试剂是具有如本文中揭露的化学部分的小分子。
一些具体例中，在本文中揭露的方法和组合物中使用的H3K9甲基转移酶抑制剂是H3K9甲基转移酶的显性阴性变体，例如，人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2的截短的非功能性变体，或包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：48和SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：57的任何氨基酸的接续氨基酸片段的显性阴性蛋白，如，SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：57的至少约50、或至少约60、或至少约70、或至少约80、或至少约90、或超过90个氨基酸的片段。一些具体例中，H3K9甲基转移酶蛋白如人类SUV39h1、人类SUV39h2、人类SETDB1、人类EHMT1及/或人类PRDM2蛋白的显性阴性抑制剂是H3K9甲基转移酶蛋白的可溶性胞外域。
蛋白抑制剂，如DBC 1(删除的乳腺癌1(Deleted Breast Cancer 1))基因的基因产物或蛋白质，结合至SUV39H1催化域并抑制其在体外和体内将组蛋白H3甲基化的能力(Luet al.，Inhibition of SUV39H1 Methyltransferase Activity by DBC 1，JBC，2009，284；10361-10366)，且可用于本文中揭露的方法和组合物中。
抗体
一些具体例中，可用于本发明方法中的H3K9甲基转移酶抑制剂包括，例如，抗体，包括单克隆抗体、嵌合人源化抗体、重组抗体、及其抗原结合片段。一些具体例中，中和抗体可用作H3K9甲基转移酶抑制剂。通过使用抗原进行的免疫，抗体可轻易出现在动物体内。免疫鼠尤其可用于提供制造杂交瘤的B细胞来源，该细胞随后被培养以产生大量的单克隆抗体。人类SUV39h1及/或SUV39h2的可商购的抗体抑制剂可用于本发明中，例如，可从SantaCruz biotechnology等购得。
本发明的一种具体例中，本文中鉴别的基因产物的抑制剂可以是抗体分子或抗体分子的表位结合部分等。抗体提供对大量靶标抗原和半抗原的高结合活性和独特的特异性。可用于本发明实践的单克隆抗体包括全抗体及其片段，且根据传统技术如杂交瘤合成、重组DNA技术和蛋白质合成技术生成。
可用的单克隆抗体和片段可源自任何物种(包括人类)，或可形成未采用来自超过一个物种的序列的嵌合蛋白。人类单克隆抗体或“人源化”鼠抗体亦根据本发明而使用。例如，鼠单克隆抗体可通过将编码鼠Fv区域(即，含有抗原结合位点)或其互补决定区域的核苷酸序列与编码人类恒定域区域和Fc区域的核苷酸序列进行基因重组而“人源化”。人源化的靶向部分被识别，以降低宿主接纳体内该抗体或多肽的免疫反应性，令半衰期增加且可能的逆免疫反应降低，增加和降低的方式与欧洲专利EP 0,411,893 A2中揭露的方式相似。鼠单克隆抗体应优选以人源化形式采用。通过位于抗体可变部分(Fv)的轻链和重链上的6个(每条链上3个)互补决定区域(CDR)的氨基酸序列和氨基酸构造，确定抗原结合活性。由轻链的可变区(VL)与重链的可变区(VH)经由短的肽间隔序列连接在一起而组成的25-kDa单链Fv(scFv)分子，是迄今为止研发的最小的抗体片段。已经研发技术以将scFv分子显示在含有用于scFv的基因的丝状噬菌体的表面上。具有广泛抗原特异性的scFv分子可存在于scFv-噬菌体库的一个大池中。可用于本发明方法中的高亲和性单克隆抗体及其嵌合衍生物的一些实例揭示于欧洲专利申请EP 186,833、PCT专利申请WO 92/16553、和美国专利US6,090,923中。
嵌合抗体是一种免疫球蛋白分子，其中具有源自不同动物物种的两个或更多个节段或部分。通常，嵌合抗体的可变区源自非人类哺乳动物抗体如鼠单克隆抗体，而免疫球蛋白恒定区则源自人类免疫球蛋白分子。优选两区及组合均具有常规测定的低免疫原性。
scFv分子的一个限制是它们与靶标抗原的单价相互作用。最容易的改善scFv至其靶标抗原的结合的方法之一，是通过创建多聚体而增加其功能亲和性。完全相同的scFv分子形成双链抗体、三链抗体和四链抗体的联合，可包含大量完全相同的Fv模块。这些试剂因此是多价但单特异性的。两个不同且各自包含源自不同亲本Ig的VH域和VL域的scFv分子的联合，将会形成完全功能性双特异性双链抗体。双特异性scFv的独特应用是，经由两个(相邻的)表面表位将两个位点同步结合在相同的靶标分子上。这些试剂获得显着优于单一scFv或Fab片段的亲和力。已经工程化获得大量基于scFv的多价结构，包括，例如，迷你抗体、嵌合迷你抗体、微抗体、(scFv)2、双链抗体和三链抗体。这些分子跨越一定范围的价态(2至4个结合位点)、大小(50至120kDa)、灵活性及生产的容易性。当VH域与VL域通过至少12个残基的多肽链接基连接在一起时，单链Fv抗体片段(scFv)是单体占主导地位的。单体scFv在所有条件下均具有长度为12及25个氨基酸的链接基，因此是热力学稳定的。非共价双链抗体和三链抗体分子易于工程化，且通过缩短连接单一scFv分子的可变重链与可变轻链的肽链接基而产生。通过提供高度灵活性的两亲性螺旋而连接scFv二聚体，且可修饰该微型抗体结构以创建含有经由双螺旋连接的两个迷你抗体(4个scFv分子)的二聚性双特异性(DiBi)微型抗体。基因融合的或二硫键键结的scFv二聚体提供中等程度的灵活性，且通过简单的克隆技术加入C端Gly4Cys(SEQ ID NO：44)序列而生成。scFv-CH3迷你抗体由两个或直接(LD迷你抗体)或经由非常灵活的铰链区(Flex迷你抗体)与IgG CH3域连接在一起的scFv分子构成。这些二价构建体的分子量大约为80kDa，因此他们能有效结合至抗原。Flex迷你抗体在鼠体内展现令人印象深刻的肿瘤局部化。可通过不同scFv分子的联合形成双特异性和三特异性多聚体。当Fab或单链Fv抗体片段(scFv)复合为二聚体、三聚体或更大的聚集体时，可达到增加的功能亲和性。与单价scFv和Fab片段相比，多价scFv的最重要的优点是增益与靶标抗原的功能性结合亲和性(亲和力)。高亲和力需要scFv多聚体能同步结合至独立的靶标抗原。与scFv单体相比，scFv双链抗体功能亲和性的增益是显着的，且首先见于解离率的下降，这是与两个或更多靶标抗原的多结合及当一个Fv解离时即再次结合的结果。当此类scFv分子联合入多聚体时，它们可设计为具有对单一靶标抗原的高亲和力或具有对不同靶标抗原的多特异性。与抗原的多结合依赖于Fv模块的正确对准和取向。对于多价scFv靶标中的全亲和力，抗原结合位点必需指向相同的方向。若多结合在空间上是不可能的，则在功能亲和性上的表观增益有可能是由于再结合增加的效应，这依赖于扩散率和抗原浓度。与改善其形状的部分接合的抗体一为本发明所预期。例如，与增加其体内半衰期的PEG接合的抗体可用于本发明。通过令编码来自原生动物或免一动物或患者的B淋巴细胞的编码可变抗体片段的基因进行PCR扩增，制备免疫谱。Combinations of oligo使用对免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因家族为特异性的寡核苷酸的组合。免疫球蛋白生殖细胞系基因可用来制备半合成的抗体谱，其中，可变片段的互补决定区域通过使用简并引物的PCR进行扩增。这些单罐库(single-pot libraries)具有下述优势：对抗大量抗原的抗体片段可从一个单库中单离。可使用噬菌体展示技术来增加抗体片段的亲和性，且可通过随机的、基于密码子的或定点诱变，通过将个体域的链与那些来自原生体的片段的链混排，或通过使用细菌增变基因株，从已经存在的抗体片段制备新的库。
或者，SCID-hu鼠，例如，Genpharm研发的模型，可用来产生抗体或其片段。一种具体例中，设想一种利用多价相互作用效应创建的名为五链抗体(peptabody)的新型亲和力结合分子。短的肽配体经由半刚性交接区与软骨寡聚性基质蛋白的卷曲螺旋组装域融合，导致一种五聚体多价结合分子。本发明的优选具体例中，可使用双特异性抗体，例如，通过抗配体抗体(Ab)与指向特异性靶标的Ab的化学链接产生的双特异性抗体，配体及/或嵌合抑制剂可瞄准组织或肿瘤特异性靶标。为了避免化学接合体的该限制，抗体的分子接合体可用于产生指向位于细胞表面分子处的配体及/或嵌合抑制剂的重组双特异性单链Ab。或者，可施予两种或更多种附接至靶向部分的活性剂及/或抑制剂，其中，每一接合包括靶向部分，例如，不同的抗体。每一抗体可与不同的靶标位点表位(与相同或不同的靶标位点抗原相关联)反应。附接有该试剂的不同抗体在所希望的靶标位点叠加蓄积。可采用基于抗体的或基于非抗体的靶向部分来将配体或抑制剂递送至靶标位点。优选地，用于未经调节的或与抗原相关联疾病的天然结合剂用于这一目的。
小分子
上述段落中陈述的所有申请均通过引用而并入本文。一些具体例中，该领域技术人员可使用其它剂作为H3K9甲基转移酶抑制剂，例如，抗体、诱饵抗体、或RNAi在本文中揭露的用于增加SCNT效率的方法、化合物和试剂盒中有效。
一些具体例中，可用于本文中揭示的方法、组合物和试剂盒中的H3K9甲基转移酶抑制剂是胶霉毒素或相关的环多硫二氧哌嗪类(epipolythiodioxopiperazines)、或BIX-01294(二氮杂卓-喹唑啉-胺衍生物)，如Takahashi等人，2012，J.抗生素(Antibiotics)65，263-265或Shaabam等人，化学和生物学，第14卷，第3期，2007年3月，第242-244页(Chemistry&Biology，Volume 14，Issue 3，March 2007，Pages 242-244)中所揭示，两篇文献通过引用而并入本文。BIX-01294具有下述化学结构：
喹唑啉，亦称为UNC0638，也抑制G9a，且可用于本文中揭露的方法和组合物中。UNC0638具有下述结构：
SUV39h1的小分子抑制剂揭露于通过引用而以其整体并入本文的美国专利申请US2015/0038496中。该小分子，轮枝孢菌素(verticillin)A，被鉴别为SUV39h1和SUV39h2的选择性抑制剂(即，抑制SUV39h1/2)，如通过引用而以其整体并入本文的美国专利申请US2014/0161785中所揭露，且可用于本文中揭示的方法、组合物和试剂盒中。
SUV39h1的其它小分子抑制剂包括毛壳素(化学名：(3S，3′S，5aR，5aR，10bR，10′bR，11aS，11’aS)-2，2′，3，3′，5a，5′a，6，6′-八氢-3，3′-双(羟基甲基)-2，2′-二甲基-[10b，10′b(11H，11′H)-bi3，11a-环二硫-11aH-吡嗪并[1′，2′：1，5]吡咯并[2，3-6]吲哚]-1，1′，4，4′-四酮)(见，Bernhard et al.，FEBS Letts，2011，585(22)；3549-3554)，其具有下述化学结构可其它用于本文揭露的方法和组合物中。
化合物A-366(亦称CHEMBL3109630)(PubChem CID：76285486)，已经被发现是也称为G9a的EHMT2(常染色质组蛋白甲基转移酶2)的潜在抑制剂，其IC50为3.3nM，且选择性比其它21种甲基转移酶高1000倍(见，Sweis et al.，Discovery and development of potentand selective inhibitors of histone methyltransferase G9a.ACS medical ChemLetts，2014；5(2)；205-209)，且可用于本文揭露的方法和组合物中。小分子A-366具有下述结构：
3-去氮腺苷类似物A(DZNep)(CAS No：102052-95-9)导致SETDB1H3K9me3 HMTase的减少，并导致H3K27me3水平和H3K9me3水平的下降(Lee et al，Biochem Biophys ResComm，2013，438(4)，647-652)，且可用于本文揭露的方法和组合物中。DZNp具有下式：
HMTase抑制剂IV，UNC0638(可从Calbiochem获得)最低限度地抑制SUV39h2(IC50＞10μM)(见，Vedadi，M.，et al.2011.Nat.Chem.Biol.7，566；和Liu，F.，etal.2011.J.Med.Chem.54，6139)，且可用于本文揭露的方法和组合物中。该HMTase抑制剂IV也称：2-环己基-N-(1-异丙基哌啶-4-基)-6-甲氧基-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹唑啉-4-胺、DNA甲基转移酶抑制剂III、DNA MTase抑制剂III、EHMT1/GLP抑制剂II、EHMT2/G9a抑制剂IV，且具有下述化学式：
SCNT
本发明的目标一致为提供增加人类SCNT效率并从人类SCNT胚胎产生人类NT-ESC的手段。所揭露的方法可用于克隆哺乳动物、获得全能或多能细胞、或重编人类细胞。
接纳体人类卵母细胞
某些具体例中，用于本发明的方法、试剂盒和组合物中的接纳体人类卵母细胞可以来自健康的人类供体。一些具体例中，冷冻保存的卵母细胞被用作接纳体卵母细胞细胞。某些具体例中，接纳体卵母细胞是人类。卵母细胞的冷冻保存和解冻是该领域技术人员已知的(见，Tucker et al，Curr Opin Obstet Gynecol.1995 June，7(3)：188-92)。一些具体例中，该人类接纳体卵母细胞获自志愿的人类女性供体，例如，卵细胞供体，如，用于IVF临床的卵细胞供体。一些具体例中，该卵母细胞获自已经进行卵巢刺激或卵巢过度刺激(即，促排卵或超促排卵)人类女性受试者。超促排卵的方法是该领域中周知的，例如，如通过引用而以其整体并入本文中的美国专利US 8,173,592和国际专利申请WO2000/059542中所揭露。
一些具体例中，接纳体人类卵母细胞是去核卵母细胞。对供体卵母细胞的去核可通过已知方法进行，如通过引用并入本文的美国专利US 4,994,384中所揭示。例如，中期II(MII)卵母细胞或置于视情况含有7.5mg/ml细胞松弛素B的HECM中进行即时去核，或可置于适当介质例如CR1aa加上10％发情期牛血清中并在稍后去核。去核亦可使用微量吸移管移除极体和邻近的细胞质而通过显微手术实施。随后筛选该细胞，以鉴别它们中被成功去核的那些细胞。这一筛选可通过使用1mg/mL 33342 Hoechst染料在HECM中染色该细胞，随后在进行短于10秒的紫外辐射下观察该细胞而实施。随后，可将已经被成功去核的细胞置于适当的培养基中。
一些具体例中，可使用非侵入性的卵母细胞去核途径，例如，与来自两栖动物的卵母细胞去核过程相似，使用紫外光辐射作为常规过程(Gurdon Q.J.Microsc.Soc.101 299-311(1960))。一些具体例中，人类卵母细胞的卵母细胞去核可使用DNA特异性荧光团进行，并将鼠卵母细胞在紫外光下曝露超过30秒，以降低该细胞的发育潜能(Tsunoda ei al.，J.Reprod.Fertil.82 173(1988))。
一些具体例中，去核的人类卵母细胞已经经历了“诱导去核”，指的是通过减数分裂纺锤体的微管的去稳定作用(如，解聚作用)扰乱减数分裂纺锤体，从而将卵母细胞去核(见，通过引用而以其整体并入本文的美国专利申请US 2006/0015950)。该微管的去稳定作用防止染色单体被单离(如，防止成功的有丝分裂)，并诱导卵母细胞基因组(如，核染色质)在减数分裂成熟过程中不均与地隔离(如，偏斜)，借此，卵母细胞中几乎所有的内源性染色质集中在第二极体内。
一些具体例中，卵母细胞聚氨酯来自于健康的女性，如，健康的人类女性卵母细胞供体。一些具体例中，在本文中揭示的方法、组合物和试剂盒中使用的人类卵母细胞是从生殖医学诊所获得的过量的卵母细胞，该卵母细胞不再为IVF过程所需。一些具体例中，在本文中揭示的方法、组合物和试剂盒中使用的人类卵母细胞的质量差或次优，由于它们的质量差，它们不可能在体外被精子成功受精(如，人类卵母细胞的质量可能极差，将可能无法成功进行IVF过程)。一些具体例中，基于其质量选择在本文中揭示的方法、组合物和试剂盒中使用的人类卵母细胞，且在一些具体例中，选择与其不可能在体外(如，IVF过程中)被精子成功受精的低质量卵母细胞。一些具体例中，选择可能在体外(如，IVF过程中)被精子成功受精的中高质量的卵母细胞。一些具体例中，该人类卵母细胞由绝经后的人类女性捐赠，选择预计不可能成功进行体外受精者并用于本文中揭示的方法、组合物和试剂盒中。
一些具体例中，为了绕开对人类卵母细胞供体的需要，已经揭露了跨物种SCNT，其中，非人类卵母细胞已经被报导用于人类供体体细胞的核重编(Chung et al，Cloning andStem Cells 11，1-11(2009))。据此，一些具体例中，供体卵母细胞来自非人灵长类、或牛卵母细胞、或任何其它非人类哺乳动物物种，其可以是从人类供体体细胞的细胞核或核遗传物质的接纳体卵母细胞。
一些具体例中，当人类被刺激以产生卵母细胞(如激素刺激)且这些卵母细胞被收获时，所收集的卵母细胞可能处于不同时期。一些人类卵母细胞处于中期I(MI)，而其它卵母细胞处于中期II(MII)。这些情况下，可培养处于中期I(MI)的人类卵母细胞，直至它们达到中期II，随后用于去核以用作接纳体卵母细胞。视情况，将已经培养达到中期II的人类卵母细胞与当收获用于潜在宿主细胞池的已经处于中期II的卵母细胞合并。其它情况下，仅将所收获的处于中期II的人类卵母细胞用于去核。这些人类卵母细胞的任何细胞可冷冻进行进一步应用。因此，该供体及/或接纳体卵母细胞可在使用之前冷冻保存。
据此，一些具体例中，该接纳体人类卵母细胞从自其获得供体人类体细胞的不同受试者或个体获得。一些具体例中，该接纳体人类卵母细胞从将源自hNT-ESC的hSCNT胚胎植入其中的相同受试者获得。例如，患者特异性hNT-ESC可从hSCNT胚胎获得，其中，来自该患者-供体人类体细胞的核遗传物质被注射入接纳体人类卵母细胞中。
一些具体例中，该卵母细胞从未罹患线粒体疾病的雌性受试者获得。一些具体例中，该卵母细胞从罹患线粒体疾病的雌性受试者获得。继承线粒体DNA(mtDNA)缺陷的线粒体疾病是该领域技术人员所周知的。
一种具体例中，该接纳体人类卵母细胞来自不具有线粒体DNA突变如同胞质或异胞质线粒体疾病的受试者。这可通过例如基因检验如通过评价线粒体DNA而确定，或可通过临床评估确定。该核遗传物质如染色体可从罹患线粒体DNA疾病如同胞质或异胞质线粒体疾病的受试者如人类受试者的供体卵母细胞单离。
一些具体例中，该线粒体疾病与不孕症相关。与不孕症相关的线粒体疾病的实例包括Leber遗传性视神经病变变、肌阵挛性癫痫、或卡恩斯-赛尔综合征(Kearns-SayreSyndrome)。因此，一些实例中，接纳体灵长类卵母细胞来自未罹患Leber遗传性视神经病变变、肌阵挛性癫痫、或卡恩斯-赛尔综合征的受试者。
其它实例中，包括染色体的核遗传物质来自灵长类供体人类卵母细胞，其中，该灵长类受试者罹患Leber遗传性视神经病变变、肌阵挛性癫痫、神经病变、共济失调和色素性视网膜病变综合征、母体遗传性Leigh综合征(MILS)、伴有红色撕裂状纤维的肌阵挛性癫痫(MERRF)、伴有乳酸酸中毒和脑血管意外发病的线粒体脑-肌肉病变综合征(MELAS)、伴有耳聋的母体遗传性糖尿病、线粒体脑肌病、慢性进行性眼外肌麻痹、Pearson骨髓-胰腺综合征、尿崩症、糖尿病、视神经萎缩和耳聋(DIDMOAD)、慢性进行性眼外肌麻痹或卡恩斯-赛尔综合征。因此，该接纳体人类卵母细胞从未罹患下述疾病的受试者单离：线粒体疾病，如Leber遗传性视神经病变变、肌阵挛性癫痫、神经病变、共济失调和色素性视网膜病变综合征、母体遗传性Leigh综合征(MILS)、伴有红色撕裂状纤维的肌阵挛性癫痫(MERRF)、伴有乳酸酸中毒和脑血管意外发病的线粒体脑-肌肉病变综合征(MELAS)、伴有耳聋的母体遗传性糖尿病、线粒体脑肌病、慢性进行性眼外肌麻痹、Pearson骨髓-胰腺综合征、尿崩症、糖尿病、视神经萎缩和耳聋(DIDMOAD)、慢性进行性眼外肌麻痹和卡恩斯-赛尔综合征。
Leber遗传性视神经病变变(LHON)或Leber视神经萎缩是视网膜神经节细胞(RGC)及其轴突的线粒体遗传性(母亲遗传给所有后代)变性，其导致中央视觉的急性或亚急性丧失；这主要影响年轻的成年雄性。但是，LHON仅通过母亲传播，因为它主要是由于线粒体(而不是核)基因组中的突变造成且仅有卵细胞贡献胚胎的线粒体。LHON通常是由于三种致病性线粒体DNA(mtDNA)点突变之一造成的。这些突变分别位于线粒体中氧化磷酸化链的复合物I的ND4、ND1和ND6子单元基因中，是在核苷酸位置11778处的G突变为A、核苷酸位置3460处的G突变为A、以及核苷酸位置14484处的T突变为C。临床上，存在急性发作的视觉丧失，首先一只眼的视觉丧失，随后几周至几个月内，另一只眼的视觉丧失。一般在成年早期发作，但在8至60年龄范围内的发作均由报导。这一症状典型进展为非常严重的视神经萎缩和视敏度的永久性下降。
Leigh氏病，亦称亚急性坏死性脑脊髓病(SNEM)，是影响中枢神经系统的罕见的神经代谢障碍。它是一种遗传性病变，一般影响年龄在三个月至两岁之间的婴儿，但在极少数情况下，也影响青少年和成人。在该疾病的情形中，线粒体DNA(mtDNA)或核DNA(基因SURF和一些COX组装因子)中的突变造成运动技巧的退化，并最终导致死亡。该疾病最著名的一点是其令个体控制运动的能力退化。随着其快速进展，最早的迹象可以是极差的吮吸能力以及头部控制和运动技巧的丧失。其它症状包括食欲不振、呕吐、易怒、连续哭泣(婴儿)、和痉挛。后期迹象还可能是乳酸酸中毒的发作，可能导致呼吸功能和肾功能受损。一些儿童可能存在发育能力丧失或发育衰退，且一般存在不能茁壮成长的案例。随着疾病在成人体内的进展，它也可造成全身无力、肾衰竭、和心脏问题。症状发作后的预期寿命往往不足一年，但在疾病急性爆发后仅存活若干天的病例和存活期超过一年的病例均有报导。
神经病变、共济失调、和色素性视网膜炎(NARP)是造成主要影响神经系统的多种迹象和症状的状况。从儿童或成年早期开始，大部分罹患NARP的人经历手臂或腿的麻痹、刺痛、或疼痛(感觉神经病变)；肌肉无力；以及平衡和协调性的问题(共济失调)。很多受影响的个体还具有由于位于眼后部的光敏感组织(视网膜)改变造成的视觉丧失。一些情况下，该视觉丧失是被称为色素性视网膜炎的病症造成的结果。这一眼疾造成视网膜的感光细胞逐步衰退。神经病变、共济失调、和色素性视网膜炎是与线粒体DNA，尤其是MT-ATP6基因中的突变有关。
肌肉神经胃肠道脑病或MNGIE是典型出现在10岁至50岁之间的另一种线粒体疾病。MNGIE是多系统疾病，造成上睑下垂、进行性眼外肌麻痹、胃肠道运动障碍(一般为假型梗阻)、弥散性脑白质病、瘦的身体体质、周围神经病变、和肌病。
一些具体例中，如果该雌性受试者具有线粒体DNA(mtDNA)缺陷或在mtDNA中存在突变，则可出现线粒体转移，因此，具有健康线粒体和野生型mtDNA的卵细胞质可经由细胞质转移而引入接纳体卵母细胞中，亦称卵细胞质转移，以导致异胞质卵母细胞(见：Sterneckert et al，Nat Reviews Genetics，Genetics 15，625-639(2014)和Ma ei al.，2015；Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease，Nature 524，234-238)。用于细胞质转移的方法是周知的，如在通过引用而以其整体并入本文中的美国专利申请US 2004/0268422中所揭示的。随后，这一异胞质卵母细胞可经去核，并作为接纳体卵母细胞接受注射来自该供体体细胞的核遗传物质。据此，一些具体例中，所得SCNT胚胎可源自3个独立的个体；即，含有来自该供体体细胞的核遗传物质、来自该接纳体卵母细胞的细胞质、以及来自第三个体或供体受试者的野生型或突变mtDNA。
供体人类细胞
本文中揭露的方法、试剂盒和组合物包含供体人类细胞，从该供体人类细胞采集(收获)细胞核并将该细胞核注射入去核的人类卵母细胞内，以生成人类SCNT胚胎。一些具体例中，该供体人类细胞是终末分化体细胞。一些具体例中，该供体人类细胞不是胚胎干细胞或成人干细胞或iPS细胞。一些具体例中，该供体体细胞从男性人类受试者如XY受试者获得。备选的具体例中，该供体体细胞从女性人类受试者如XX受试者获得。一些具体例中，该人类体细胞的供体从XXY人类受试者获得。
可用于本发明的人类供体体细胞包括，举例而言，上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角化细胞、造血细胞、生黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B淋巴细胞和T淋巴细胞)、其它免疫细胞、红细胞、巨噬细胞、生黑色素细胞、单核细胞、单细胞核细胞、成纤维细胞、心肌细胞、卵丘细胞和其它肌肉细胞等。一些具体例中，用于核转移的人类体细胞可从不同器官如皮肤、肺、胰腺、肝、胃、肠、心、生殖器官、膀胱、肾、尿道和其它泌尿器官等获得。这些仅是适当的人类供体细胞的一些实例。适当的供体细胞，即可用于本发明受试者中的细胞，可从身体的任何细胞或器官获得。这包括所有体细胞，且在一些具体例中还包括生殖细胞如原始生殖细胞、精细胞。一些具体例中，该人类供体细胞或来自该人类供体细胞细胞核(即，核遗传物质)正在主动分裂，即，非静止期细胞，其已经被报导提升克隆效力。此类供体体细胞包括处于G1、G2、S或M细胞期的那些细胞。或者，可使用静止期细胞。一些具体例中，此类人类供体细胞将处于G1细胞周期。某些具体例中，本申请的人类供体及/或接纳体细胞并不经历2细胞阻断。
一些具体例中，人类供体体细胞的核遗传物质(即，细胞核)从卵丘细胞、Sertoli细胞获得，或从胚胎成纤维细胞或成人成纤维细胞获得。
一些具体例中，该核遗传物质经基因修饰，如，以纠正基因突变或畸形或引入基因修饰，例如，研究基因修饰在疾病模型如从人类SCNT胚胎获得的NT-ESC中的效应。此类具体例中，该NT-ESC是患者特异性NT-ESC，其可用来进行治疗性克隆及/或研究特定疾病，其中，患者罹患特定疾病或具有发展该特定疾病的倾向。一些具体例中，该人类供体细胞的核遗传物质经基因修饰，以例如将所希望的特征引入该供体体细胞中。用来基因修饰体细胞的方法为该领域技术人员所周知，且可用于本文中揭露的方法和组合物中。
一些具体例中，根据美国专利申请US 2004/0025193中揭露的方法选择人类供体体细胞，该专利申请通过引用而以其整体并入本文，且揭露了将所希望的转基因引入人类供体体细胞并在获取用于注射入接纳体卵母细胞的细胞核之前选择具有转基因的人类体细胞。
某些具体例中，人类供体细胞核(如，来自该供体体细胞的核遗传物质)可被标记。细胞可使用编码早期可视化蛋白如绿色荧光蛋白(Y ang，M.，et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：1206-1211)、或其衍生物的转基因进行基因修饰，或使用从萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因(Flue)(Sweeney，T.J.，et al.1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：12044-12049)构建的转基因进行基因修饰，或使用从海肾(Renilla reniformis)荧光素酶(Rluc)(Bhaumik，S.，and Ghambhir，S.S.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：377-382)构建的转基因进行基因修饰。
引入该供体体细胞的核遗传物质的一个或多个转基因在构成上可使用“看家基因”启动子表达，因此，该转基因被以高水平表达在很多或全部细胞中，或该转基因可使用组织特异性及/或具体发育阶段特异性基因启动子表达，因此，仅已经处于特定生态位并发育为具体组织或细胞类型的具体细胞世系或细胞表达该转基因并将其可视化(如果该转基因是报告基因)。其它包括转基因或标记试剂包括但不限于，荧光标记的大分子，包括荧光蛋白类似物和生物传感器；荧光大分子嵌合体，包括使用绿色荧光蛋白及其突变体形成的那些；与牵涉入生理学应答的细胞抗原反应的荧光标记的一次抗体或二次抗体；荧光着色剂；染料；及其它小分子。标记的来自镶嵌囊胚的细胞可通过例如流式细胞仪分类，以单离所克隆的群体。
一些具体例中，人类供体体细胞可来自健康的人类供体如健康人、或具有现有医学病症(如，帕金森症(PD)、ALS、阿尔兹海默症、亨廷顿症、类风湿性关节炎(RA)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病、肥胖、心脏疾病、囊胞性纤维状、自体免疫性疾病(如，MS、狼疮)、神经变性疾病、患有遗传性或后天性疾病的任何受试者)的供体、或需要进行再生治疗及/或干细胞转移以治疗现有、或先存、或正在发展的病症或疾病的任何受试者。例如，一些具体例中，供体人类体细胞从受试者获得，该受试者未来将会作为源自SCNT的人类ES细胞(NT-ESC)的接纳体，从而允许患者特异性hES细胞的自体转移。据此，一些具体例中，该方法和组合物允许生产患者特异性同基因胚胎干细胞系(即，同基因hNT-ESC系)。
据此，本文中揭示的方法、组合物和试剂盒令人能够获得患者特异性人类干细胞系，通过将人类卵母细胞系功能性地去核，并令其与来自从人类患者供体采集的体细胞的核遗传物质融合，从而生成可用来生成患者特异性NT-ESC的hSCNT。一些具体例中，本文中涵盖通过施予该患者特异性hNT-ESC至患者而进行治疗的方法，其中，在一些具体例中，该患者是该人类体细胞的供体，该人类体细胞的核遗传物质被收获用于SCNT过程。
一些具体例中，使用本文中揭露的H3K9甲基转移酶抑制剂如人类SUV39h1、人类SUV39h2或人类SETDB1的任一抑制剂，根据本文中揭露的方法处理人类供体体细胞或细胞核(即，核遗传物质)。某些具体例中，供体人类细胞或细胞核在核转移前未经预处理，且根据本文中揭露的方法，使用H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理杂交卵母细胞或hSCNT胚胎。某些具体例中，在核转移或采集用于注射入去核的接纳体卵母细胞内的遗传物质(或细胞核)之前，供体细胞或细胞核未使用精胺、鱼精蛋白、或腐胺进行预处理。
令该供体体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞或人类SCNT与降低H3K9me3甲基化的试剂接触
一些具体例中，使用H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理或接触人类供体体细胞。一些具体例中，使用H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理或接触该供体人类细胞的细胞核(或核遗传物质)。一些具体例中，使用本文中揭露的H3K9甲基转移酶抑制剂如人类SUV39h1、人类SUV39h2及/或人类SETDB1中任意一种或组合的抑制剂处理或接触该供体人类细胞的细胞质及/或细胞核。一些具体例中，该接触时将H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子显微注射入该供体人类体细胞的细胞质及/或细胞核内。
一些具体例中，在移除用于转移至去核人类供体卵母细胞内的细胞核之前，该供体体细胞与人类SUV39h1及/或人类SUV39h2、或两者(SUV39h1/2)的抑制剂接触至少约24小时、或至少约48小时、或至少约3天、或至少约4天、或超过4天。一些具体例中，SUV39h1及/或SUV39h2、或两者(SUV39h1/2)的抑制剂是siRNA，且在移除用于转移至去核人类供体卵母细胞内的细胞核之前，SUV39h1及/或SUV39h2、或两者(SUV39h1/2)的表达出现至少12小时、或至少24小时或更长的时间段。一些具体例中，在移除用于转移至去核人类供体卵母细胞内的细胞核之前，对SUV39h1及/或SUV39h2、或两者(SUV39h1/2)的抑制在该供体体细胞内出现例如至少约24小时、或至少约48小时、或至少约3天、或至少约4天、或超过4天。一些具体例中，在移除细胞核之前的时间段内，通过siRNA抑制SUV39h1及/或SUV39h2、或两者(SUV39h1/2)的表达，且该抑制出现至少12小时、或至少24小时或更久。
一些具体例中，使用H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理或接触人类卵母细胞。一些具体例中，人类卵母细胞是使用H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理或接触的去核卵母细胞，如，通过直接注射入该去核卵母细胞的细胞质内进行该处理或接触。一些具体例中，使用KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理或接触人类卵母细胞或去核人类卵母细胞，该激活因子为，例如但不限于，激活KDM4家族的组蛋白去甲基化酶成员如人类KDM4A、人类KDM4B、人类KDM4C、人类KDM4D或人类KDM4E中任一种或组合的试剂。一些具体例中，该去核的卵母细胞未被注射或接受供体核遗传物质。
备选的具体例中，将在核转移前(即，开始注射供体核遗传物质之前)约40小时的时间框内，以H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理接纳体人类卵母细胞。该接触可出现在核转移前约40小时，或更优选出现在核转移前约12或24小时的时间框内，且最优选出现在核转移前约4至9小时的时间框内。一些具体例中，当接纳体人类卵母细胞时杂交卵母细胞(即，包含来自该供体体细胞的核遗传物质，但尚未被激活)时，该接纳体卵母细胞与H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子接触。该接触可出现在核转移后约40小时，或更优选出现在核转移后约1至4小时、或4至12小时的时间框内或24小时内的任何时间，且最优选出现在核转移后约1至4小时或4至9小时的时间框内但在融合或激活之前。
可在将从人类供体体细胞获得的核遗传物质进行核转移之前、之中或之后，使用H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理接纳体人类卵母细胞。通常，在核转移后5小时内或在激活或融合后5小时内(如，5hpa；激活后5小时)，处理该接纳体人类卵母细胞。一些具体例中，激活(或融合)在将来自该供体体细胞的遗传物质注射入去核卵母细胞后1至2小时或2至4小时内出现，而在这种情形中，SCNT胚胎与H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子接触。
一些具体例中，以H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理人类SCNT胚胎。人类SCNT胚胎通过下述生成：将来自供体体细胞的细胞核(如，核遗传物质)注射入去核的接纳体卵母细胞内，以形成“杂交卵母细胞”，激活(或融合)该杂交卵母细胞以生成SCNT胚胎。一些具体例中，使用H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理该杂交卵母细胞(如，包含激活之前的供体核遗传物质的去核卵母细胞)，如本文中所揭露。
在使用接纳体卵母细胞的细胞质激活(亦称融合)供体核遗传物质后，生成SCNT胚胎。一些具体例中，如本文中所揭露，已经使用H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理或接触来自人类供体细胞及/或去核卵母细胞的细胞质或细胞核中的一者或两者。一些具体例中，由于杂交卵母细胞已经处理及/或hSCNT胚胎已经处理，供体细胞及/或去核卵母细胞无一已经使用H3K9甲基转移酶抑制剂及/或KDM4组蛋白去甲基化酶激活因子处理。
一些具体例中，增加人类体细胞核转移(hSCNT)效率，包含令人类SCNT胚胎，如至少5hpa、或10至12hpa之间(即，处于1细胞阶段)、或处于约20hpa(即，早期2细胞阶段)或20至28hpa之间(即，2细胞阶段)的人类SCNT配体，与(i)KDM4家族的组蛋白去甲基化酶及/或(ii)H3K9甲基转移酶抑制剂中的至少一种接触。一些具体例中，KDM4基因如KDM4A的外源性表达出现在处于5hpa、10至12hpa之间(即，处于1细胞阶段)、约20hpa(即，早期2细胞阶段)或20至28hpa之间(即，2细胞阶段)中任意阶段的SCNT胚胎中。一些具体例中，若该hSCNT胚胎与抑制H3K9me3的试剂如增加KDM4基因如KDM4A(如，KDM4A mRNA或mod-RNA)的外源性表达的试剂接触，则该SCNT胚胎的每一细胞(如，2细胞胚胎或4细胞胚胎的每一细胞)均被注射KDM4A激活剂或过表达剂。一些具体例中，KDM4基因如KDM4A的外源性表达出现在处于5hpa、10至12hpa之间(即，处于1细胞阶段)、约20hpa(即，早期2细胞阶段)、或20至28hpa之间(即，2细胞阶段)、或更晚(如，处于4细胞阶段)中任意阶段的人类SCNT胚胎中。一些具体例中，若该人类SCNT胚胎与抑制H3K9me3的试剂如增加KDM4基因如KDM4A(如，KDM4A mRNA或mod-RNA)的外源性表达的试剂接触，则该SCNT胚胎的每一细胞(如，2细胞胚胎或4细胞胚胎的每一细胞)均被注射KDM4d激活剂或过表达剂。
细胞核转移方法
本发明的一个目的为提供更有效地克隆人类体细胞的手段。所揭露的方法和组合物可用于治疗性克隆人类，如，用于获得人类多能干细胞(PSC)和人类全能细胞(TSC)，以及用于重编人类体细胞。
细胞核转移技术或核转移技术是文献中可知的。尤其见，Campbell et al，Theriogenology，43：181(1995)；Collas et al，Mol.Report Dev.，38：264-267(1994)；Keefer et al，Biol.Reprod.，50：935-939(1994)；Sims et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：6143-6147(1993)；WO 94/26884；WO 94/24274；以及WO 90/03432，上述文献通过引用而以其整体并入本文。另外，美国专利US 4,944,384和US 5,057,420揭示了用于牛的核转移过程。还见，Cibelli et al，Science，Vol.280：1256-1258(1998)。
可通过显微注射装置将共同细胞核转移至接纳体受精胚胎内。某些具体例中，最小限度的细胞质与细胞核一起被转移。与通过细胞输注途径相比，当使用显微注射时，可实现最小限度的细胞质的转移。一种具体例中，该显微注射装置包括压电单元。典型地，该压电单元可操作地附接至针，以令该针振动。但是，可令该针振动的该压电单元的任何配置均包括在本发明范畴内。某些情况下，该压电单元可辅助该针穿入目标物。某些具体例中，该压电单元可用来将最小限度的细胞质与该细胞核一起转移。可使用任何适用于此模板的压电单元。某些具体例中，压电单元是压电显微操纵器PMM150(PrimeTech，日本)。
一些具体例中，该方法包括将该供体细胞核与去核卵母细胞融合的步骤。使用该领域中已知的大量技术实施细胞质与细胞核的融合，该技术包括聚乙二醇(见Pontecorvo的《Polyethylene Glycol(PEG)in the Production of Mammalian Somatic CellHybrids》，Cytogenet Cell Genet.16(1-5)：399-400(1976))、细胞核的直接注射、仙台病毒介导的融合(见美国专利US 4,664,097和Graham Wistar Inst.Symp.Monogr.9 19(1969))、或该领域中已知的其它技术如电融合。细胞的电融合牵涉将细胞带至非常靠近彼此，并将它们曝露于交流电场中。在适宜的条件下，细胞被推挤在一起且存在细胞膜的融合，随后形成融合细胞或杂交细胞。细胞的电融合及实施细胞电融合的装置揭示在例如美国专利US 4,441,972、US 4,578,168和US 5,283,194；国际专利申请PCT/AU92/00473[作为WO 1993/05166公开]、Pohl的《双向电泳》(Dielectrophoresis，Cambridge UniversityPress，1978)和Zimmerman et al.，Biochimica et BioplzysicaActa 641：160-165，1981中。
SCNT的方法、以及使用接纳体卵母细胞的细胞质激活(即，融合)供体核遗传物质的方法揭露于美国专利申请US 2004/0148648中，该申请通过引用而以其整体并入本文。
卵母细胞采集
可如先前揭示者令卵母细胞供体同步化并超数排卵(Gavin W.G.，1996)，并令该供体以48小时的间隔与切除输精管的雄性交配。采集后，在使用以2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素(各自为10,000I.U./ml)补充的10％FBS平衡的M199中培养卵母细胞。核转移亦可使用可能已经在体内或体外成熟的卵母细胞。体内成熟的卵母细胞如上述者获得，而体外成熟的卵母细胞在发育至具体细胞阶段后，再收获它们用于核转移。
细胞质制备和去核
典型地，丢弃附接有卵丘细胞的卵母细胞。将没有卵丘的卵母细胞分为两组：休止的中期-II方案(一个极体)和末期-II方案(没有清晰可见的极体或存在部分挤出的第二极体)。首先，将休止的中期-II方案中的卵母细胞去核。通过在M199/10％FBS中培养2至4小时制备被分配到激活的末期-II方案的卵母细胞。这一时期后，将所有被激活的卵母细胞(存在部分被挤出的第二极体)分为培养诱导组、钙激活的末期-II卵母细胞组(分裂末期-II-Ca)和去核组。在培养过程中未被激活的卵母细胞接着在含有7％乙醇的M199/10％FBS中孵化5分钟，随后在具有10％FBS的M199中再培养3小时以到达末期-II(末期-II-EtOH方案)。在去核之前，所有卵母细胞均使用细胞松弛素-B处理15至30分钟。通过使用玻璃吸管吸出第一极体及环绕该极体的邻近细胞质(约30％的细胞质)以移除中期板，将中期-II阶段的卵母细胞去核。通过移除该第一极体和周围的含有部分挤出的第二集团的细胞质(10至30％的细胞质)，将末期-II-Ca和末期-II-EtOH卵母细胞去核。去核后，立即重建所有的卵母细胞。
细胞核转移和重建
在与卵母细胞去核所使用的相同的介质中实施供体细胞注射。使用玻璃吸管将一个供体细胞置于透明带与卵质膜之间。该细胞-卵母细胞偶联体在M199中孵化30至60分钟，之后进行电融合和激活过程。将重建的卵母细胞在融合缓冲液(300mM甘露醇、0.05mMCaCl2、0.1mM MgSO4、1mM K2HPO4、0.1mM谷胱甘肽、0.1mg/ml BSA)中平衡2分钟。在室温下，在具有以融合介质填充的塑造成“融合载片”(500μm缝隙；BTX-Genetronics，San Diego，Calif.)的2个不锈钢电极的腔内，实施电融合和激活。
使用融合载片实施融合(如，激活)。该融合载片放置在融合皿内，且该融合皿被足量的融合缓冲液淹没，以覆盖该融合载片的电极。将偶联体从培养孵化器中移除，并通过融合缓冲液洗涤。使用立体显微镜，将偶联体放置在该电极之间且与两个电极等距，并令细胞核/细胞质接合点平行于该电极。应注意，施加至该偶联体以促进激活和融合的电压范围可以是1.0kV/cm至10.0kV/cm。但优选初始单次同步融合和激活电脉冲的电压范围是2.0至3.0kV/cm，最优选2.5kV/cm，优选持续时间为至少20微秒。使用BTX ECM 2001电细胞操纵器将这一电压施加至细胞偶联体。微脉冲的持续时间可从10微秒至80微秒变化。该过程后，典型将被处理的偶联体转移至一滴新鲜的融合缓冲液中。经融合处理的偶联体以平衡的SOF/FBS洗涤，随后转移至平衡的具有或不具有细胞松弛素-B的SOF/FBS中。如果使用细胞松弛素-B，则其浓度可从1至15μg/ml变化，最优选为5μg/ml。该偶联体在37至39℃在含有约5％CO2的潮湿空气腔内孵化。应注意，在本公开中提供的任何方案中，均可使用甘露醇替代细胞松弛素-B(具有Ca+2和BSA的HEPES-缓冲甘露醇(0.3mm)系培养基)。从融合后10至90分钟开始，最优选从融合后30分钟开始，确定细胞核/细胞质融合的实际存在，以确定用于后续转移或用于另一核转移周期的转基因胚胎的发育。
在以环己酰亚胺处理后，使用以平衡的SOF介质彻底洗涤，该SOF介质以至少0.1％、优选至少0.7％、优选0.8％的牛血清白蛋白加上100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素补充(SOF/BSA)。将偶联体转移至平衡的SOF/BSA，在37至39℃，在含有约6％O2、5％CO2、余量为氮气的潮湿模块化孵化腔中孵化24至48小时。将具有适宜发育龄的核转移(在24至48小时为1细胞，最多8细胞)转移至替代的同步化接纳体内。
细胞核转移胚胎培养和转移入接纳体
SCNT胚胎的培养
已经建议，通过hSCNT获得的胚胎可能受益于或甚至需要不同于一般培养胚胎所使用者的体内培养条件(至少在体内)。在牛胚胎的常规增殖中，重建的胚胎(一次多个)已经在绵羊输卵管内培养了5至6天(如Willadsen在《哺乳动物卵转移》(Mammalian EggTransfer(Adams，E.E.，ed.)185 CRC Press，Boca Raton，Fla.(1982))中所揭示)。某些具体例中，SCNT胚胎在转移前可包埋在保护性介质如琼脂内，随后，在从临时接纳体回收后，从琼脂内取出。该保护性琼脂或其它介质的功能为两重：首先，其通过将透明带一起容纳而担当用于SCNT胚胎的结构辅助；其次，其充当接纳体免疫系统细胞的屏障。尽管这一途径增加形成囊胚的胚胎比例，但存在大量胚胎可能丢失的缺点。一些具体例中，hSCNT胚胎可在单层饲养细胞上，如50μl液滴的原代山羊输卵管上皮细胞上共同培养。胚胎培养可在具有5％CO2的潮湿的39℃孵化器内维持48小时，之后将hSCNT胚胎用于采集代表hNT-ESC生成的卵裂球。
应用
获得全能细胞(TPC)
SCNT实验显示，来自成人分化体细胞的细胞核可重编为全能状态。据此，使用本文中揭露的方法生成的hSCNT胚胎可在适当的体外培养基中培养，以生成全能干细胞或胚胎干细胞、或干细胞样细胞和细胞集落。适用于培养和突变胚胎的培养基是该领域中周知的。可用于牛胚胎培养和维持的已知培养基的实例包括，Ham F-10+10％胎牛血清(FCS)、组织培养基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、台氏(Tyrode)白蛋白-乳酸盐-丙酮酸盐(TALP)、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)、伊格尔氏(Eagle)培养基和Whitten培养基。最常用于卵母细胞采集和突变的一种培养基是TCM-199，以及1至20％血清补充，该血清补充包括胎牛血清、新生儿血清、发情期牛血清、羔羊血清或牛血清。优选的维持介质包括，具有Earl盐、10％胎牛血清、0.2Ma丙酮酸盐和50ug/ml硫酸庆大霉素的TCM-199。上述任何介质亦可牵涉于各种细胞类型如粒层细胞、输卵管细胞、BRL细胞和子宫细胞和STO细胞共同培养。
特别地，在胚胎植入前和植入期间，子宫内膜的人类上皮细胞分泌白血病抑制因子(LIF)。因此，一些具体例中，包含将LIF加至培养基中，以提升hSCNT衍生的胚胎的体外反应。将LIF用于胚胎细胞或干细胞样细胞的培养，已经揭示于通过引用而并入本文的美国专利US 5,712,156中。
另一维持介质揭示在通过引用而并入本文的Rosenkrans，Jr.等人的美国专利US5,096,822中。这一名为CR1的胚胎培养基，含有支持胚胎所必需的营养物质。CR1含有其量为1.0mM至10mM，优选1.0mM至5.0mM的L-乳酸半钙盐。L-乳酸半钙盐是其上合并有半钙盐的L-乳酸盐。另外，适用于在培养中维持人类胚胎干细胞的培养基在Thomson等人，科學(Science)，282：1145-1147(1998)和Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，92：7844-7848(1995)中探讨。
一些具体例中，该饲养细胞将包含鼠胚胎成纤维细胞。一般适当的成纤维细胞饲养细胞层的手段揭示在例如下文中，且处于该领域技术人员的技能范围内。
从囊胚阶段的人类SCNT胚胎(或其等效物)获得人类ES细胞(如，人类NT-ESC或hNT-ESC)的方法是该领域中周知的。此类技术可用于从人类SCNT胚胎获取人类ES细胞(如，hNT-ESC)，其中，与未经KDM4去甲基化酶家族成员及/或组蛋白甲基转移酶SUV39h1/SUV39h2的抑制剂处理的hSCNT相比，被用来生成hNT-ESC的hSCNT胚胎在从人类体细胞供体细胞捐赠的核遗传物质中的H3K9me3水平下降。此外，或作为替代，hNT-ESC可从处于早期发育阶段的克隆人类SCNT胚胎获取。某些具体例中，从使用本文中揭示的方法、组合物和试剂盒生成的人类SCNT胚胎生成的卵裂球，可使用玻璃吸管抽离以获得全能细胞。一些具体例中，抽离可在0.25％胰蛋白酶的存在下出现(Collas and Robl，43 BIOL.REPROD.877-84，1992；Stice and Robl，39 BIOL.REPROD.657-664，1988；Kanka et al.，43MOL.REPROD.DEV.135-44，1996)。
某些具体例中，从hSCNT胚胎所得的囊胚、或囊胚样簇可用来获得胚胎干细胞系，如核转移ESC(ntESC)细胞系。此类细胞系可例如根据通过引用而以其整体并入本文的Thomson等人，科學(Science)，282：1 145-1 147(1998)和Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，92：7544-7848(1995)报导的培养方法获得。
多能胚胎干细胞亦可从取自hSCNT胚胎的单一卵裂球生成，而干扰胚胎正常发育至出生。见2004年11约4日提交的US 60/624,827、2005年3月14日提交的60/662,489、2005年6月3日提交的60/687,158、2005年10月3日提交的60/723,066、2005年10月14日提交的60/726,775、2005年11月4日提交的11/267,555、2005年11月4日提交的PCT申请PCT/US05/39776，其揭露内容通过引用而以其整体并入本文；也见Chung等人，自然(Nature)，Oct.16，2005(印刷前电子出版)和Chung等人，自然(Nature)V.439，pp.216-219(2006)，其各自揭露内容通过引用而以其整体并入本文)。这种情况下，hSCNT胚胎未被摧毁用于生成多能干细胞。
本发明的一方面，该方法包含在研究和治疗中使用从hSCNT胚胎获得的细胞。此类人类多能干细胞(PSC)或全能干细胞(TSC)可分化为身体内的任何细胞，包括而不限于，皮肤细胞、软骨细胞、骨骼细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肾细胞、肝细胞、血液细胞和成血细胞、血管前体细胞和血管上皮细胞、胰腺β细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、视网膜细胞、内耳滤泡细胞、肠细胞、肺细胞。
本发明的另一具体例中，hSCNT胚胎、或囊胚、或从hSCNT胚胎获得的多能或全能细胞(如，NT-ESC)，可曝露于一种或多种分化诱导剂，以获得其它治疗上可用的细胞，如视网膜色素上皮细胞、造血前体细胞和成血管细胞瘤祖细胞，以及外胚层、中胚层和内胚层的多种其它细胞类型。此类诱导剂包括但不限于：细胞因子，如白介素-αA、干扰素-αA/D、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-γ-诱导蛋白-10、白介素-1-17、角化细胞生长因子、瘦素、白血病抑制因子、巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞免疫蛋白-1α、巨噬细胞免疫蛋白-1β、巨噬细胞免疫蛋白-2、巨噬细胞免疫蛋白-3α、巨噬细胞免疫蛋白-3β、单核细胞趋化蛋白1至3、6kine、激活素A、双调蛋白、血管生成素、B-内皮细胞生长因子、β-动物纤维素、脑源性神经营养因子、C10、心肌营养蛋白-1、睫状神经营养因子、细胞因子诱导嗜中性粒细胞化学引诱物-1、嗜酸细胞活化趋化因子、表皮生长因子、表皮嗜中性粒细胞激活肽-78、红细胞生成素、雌激素受体-α、雌激素受体-β、成纤维细胞生长因子(酸性和碱性)、肝素、FLT-3/FLK-2配体、胶质细胞源性神经营养因子、Gly-His-Lys、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、GRO-α/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC-1、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、调蛋白-α、胰岛素、胰岛素生长因子结合蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白-1、胰岛素样生长一周内、胰岛素样生长因子II、神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、抑癌蛋白M、胎盘生长因子、多效生长因子、RANTES、干细胞因子、基质细胞源性因子1B、促血小板生成素、转化生长因子-α、转化生长因子-β1、转化生长因子-β2、转化生长因子-β3、转化生长因子-β4、转化生长因子-β5、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、血管内皮生长因子、成骨蛋白；改变激素表达的酶和激素拮抗剂，如17B-雌二醇、促肾上腺皮质素、肾上腺髓质素、α-促黑素细胞素、绒膜促性腺素、皮质甾类结合球蛋白、皮质脂酮、地塞米松、雌三醇、促卵泡素、胃泌素1、胰高血糖素、促性腺素、L-3，3′，5′-三碘甲腺原氨酸、黄体化激素、L-甲状腺素、褪黑素、MZ-4、催产素、甲状旁腺素、PEC-60、脑垂体生长激素、黄体酮、催乳素、分泌素、性激素结核球蛋白、促甲状腺素、促甲状腺素释放因子、甲状腺素结合球蛋白、抗利尿激素；细胞外基质成分，如纤连蛋白、纤连蛋白的蛋白水解片段、层粘连蛋白、腱生蛋白、血小板反应蛋白；蛋白聚糖，如聚蛋白多糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸软骨素蛋白聚糖、多配体聚糖(syndecan)。其它诱导剂包括来自指定组织的细胞或细胞组分，该指定组织用来向源自本发明重编细胞的细胞提供诱导信号。此类诱导细胞可源自人类、非人哺乳动物类、或鸟类，如无特定病原(SPF)的胚胎细胞或成人细胞。
卵裂球培养
一种具体例中，hSCNT胚胎可用来生成卵裂球，且在与目前胚胎转移前基因诊断(PGD)中使用的那些技术相关的体外技术中，用来从通过本文中揭露方法生成的hSCNT胚胎单离单个卵裂球，而不摧毁该hSCNT胚胎或显着改变其生存能力。如本文中所述，可从取自本文中揭示hSCNT胚胎单个卵裂球生成多能人类胚胎干(hES)细胞和细胞系，而不干扰该胚胎正常发育至出生。
治疗性克隆
Wilmut等人在克隆绵羊“多莉”中的发现(Wilmut，et al，Nature 385，810(1997)，连同Thomson等人在获取hESC中的发现(Thomson et al，Science 282，1145(1998))，已经激起了对基于构建患者特异性hESC的再生细胞转移的极大热情，其中，该患者特异性hESC源自从患者自身细胞核生成的hSCNT胚胎或hSCNT工程化细胞团块。这一以通过自体转移来避免免疫排异的策略，可能是对于hSCNT的最强临床原理阐述。出于同样原因，复杂疾病特异性SCNT-hESC衍生物可加速疾病机制的发现。对于细胞转移，以个体鼠自身的源自SCNTmESC对鼠SCID和PD模型进行的革新性处理令人鼓舞(Rideout et al，Cell 109，17(2002)；Barberi，Nat.Biotechnol.21，1200(2003))。最后，创建具有广泛组织相容性的源自SCNT干细胞库将减少对持续供应新卵母细胞的需求。
本发明的某些具体例中，为了展现治疗性用途，从hSCNT胚胎获得的多能或全能细胞(如，hNT-ESC)可视情况经分化，并被引入该细胞正常存在于其内部的组织中。例如，可将从hSCNT配体获得的多能或全能细胞引入该组织内。某些其它具体例中，可将从hSCNT配体获得的多能或全能细胞全身性引入，或将其引入与希望治疗性用途的部位有一定距离的位置。一些具体例中，从hSCNT配体获得的多能或全能细胞可在与所希望部位有一定距离的位置起作用或可与所希望的部位紧邻。
本发明的某些具体例中，克隆的细胞、从hSCNT配体获得的多能或全能细胞可用于诱导其它多能干细胞的分化。源自单细胞的能在体外繁殖并同时维持胚胎模式基因表达的细胞群体的生成，可用于诱导其它多能干细胞的分化。细胞-细胞诱导是常用的引导早期胚胎中分化的手段。在胚胎发育过程中，很多潜在地可用于医疗的细胞类型受到诱导信号的影响，包括脊髓神经元、心细胞、胰腺β细胞、和永久性造血细胞。源自单细胞的你能在体外繁殖并同时维持胚胎模式基因表达的细胞群体，可在多种体外、卵内、或体内培养条件下培养，以诱导其它多能干细胞分化变为所希望的细胞或组织类型。
从hSCNT配体获得的多能或全能细胞(如，ntESC)可用来获得任何所希望的分化细胞类型。此类分化人类细胞的治疗性用法是空前的。例如，人类造血干细胞可用于需要进行骨髓转移的医疗处理中。此类过程用来治疗多种疾病如晚期癌症如卵巢癌和白血病，以及危害免疫系统的疾病如AIDS。造血干细胞可通过例如下述获得：根据本文中揭露的方法，令从人类癌症或AIDS患者获得的供体成年终末分化体细胞如上皮细胞淋巴细胞与接纳体去核人类卵母细胞融合，从而获得hSCNT胚胎，该hSCNT配体随后可用来获得如上文揭示的患者特异性多能或全能细胞或干细胞样细胞，并在有利于分化的条件下培养此类细胞，直至获得造血干细胞。该造血细胞可用于对包括癌症和AIDS的疾病的治疗。如本文中探讨，可根据本文中揭露的方法，以KDM4组蛋白二甲基酶激活因子及/或H3K9甲基转移酶抑制剂处理该人类成年供体细胞、或接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞或hSCNT胚胎。
或者，该供体人类细胞可以是来自患有神经障碍的人类患者的成年体细胞，且所生成的hSCNT胚胎可用来生产患者特异性的或疾病特异性的多能或全能细胞，该多能或全能细胞可在分化条件下培养以产生神经细胞系。此类NT-ESC可用于治疗性克隆中以治疗神经障碍，或用于神经障碍和神经退行性病变的疾病模型中。此类hNT-ESC可通过该领域技术人员一般所知的方法沿着神经元世系定向分化。可通过基于细胞的疗法和此类人类神经细胞的转移治疗的具体疾病包括，举例而言，帕金森症、阿尔兹海默症、ALS、MS和大脑性麻痹等。在帕金森症(PD)的具体情形中，已经证明，所转移的胎脑神经细胞做到与周围细胞的适宜连接，并产生多巴胺。这可导致帕金森症症状的长期逆转。据此，一些具体例中，沿着神经世系分化的患者特异性NT-ESC可用于治疗PD患者的方法中，其中，该NT-ESC从hSCNT胚胎获得，且该hSCNT胚胎通过将来自罹患PD的受试者体细胞的核遗传物质与已经使用KDM4兴奋剂或mRNA及/或SUV39h1及/或SUV39h2的抑制剂处理的去核人类卵母细胞融合而创建。
一些具体例中，从hSCNT胚胎获得的多能或全能细胞(如，NT-ESC)可分化为具有皮肤产前模式基因表达的细胞，该皮肤产前模式基因表达是高度弹性蛋白的或能再生而不造成疤痕的形成。哺乳动物胎儿皮肤的皮肤成纤维细胞，尤其是在与外皮受益于高弹性水平处相对应的部位，如环绕关节的区域的皮肤成纤维细胞，是从头合成弹性原纤维的工作很多年而不翻转的复杂架构的原因。此外，早期胚胎皮肤能再生而不形成疤痕。来自从SCNT胚胎获得的多能或全能细胞的胚胎发育中这一点的细胞，可用于促进皮肤的无疤痕再生，包括形成正常的弹性蛋白架构。这尤其可用于治疗人类正常老龄化或光化性皮肤损伤所造成的症状，在这些肇因中，可能存在深刻的皮肤弹性组织离解，导致老龄化外观，包括皮肤松垂和皱纹。
为了允许在NT-ESC沿着不同世系分化之后对所分化的细胞进行特异性选择，一些具体例中，供体人类体细胞可使用经由可诱导启动子表达的可选标记物转染，从而当分化被诱导时，准许对特定细胞世系的选择或富集。例如，CD34-neo可用于选择造血细胞，Pw1-neo用于肌肉细胞，Mash-1-neo用于交感神经元，Mal-neo用于脑外皮灰质的人类CNS神经元等。
本发明的重大优势为，通过增加hSCNT的效率，其提供基本上无限制供应的同基因或同源的人类ES细胞，特别是并非诱导多能干细胞的多能ES细胞(如，不是iPSC)。由于此类NT-ESC并非部分多能且并不具有引导它们重编的重编因子的病毒转基因或受迫表达，因此它们具有优于iPSC的优势，且适用于转移。
一些具体例中，从hSCNT生成的hNT-ESC是从hSCNT胚胎获得的患者特异性多能细胞，其中，该供体人类细胞从待使用该多能干细胞或其分化子代治疗的受试者获得。因此，将排除与当前转移方法相关的重大问题，即，可能因为宿主抗转移物或转移物抗宿主排异而出现的转移组织的排异。传统上，通过施予抗排异药物如环孢菌素来防止或降低排异。但是，此类药物具有显着的副作用如免疫抑制和致癌性且非常昂贵。本发明应消除或至少极大降低对抗排异药物如环孢菌素、imulan、FK-506、糖皮质激素、雷帕霉素、及其衍生物的需求。
可通过同基因细胞疗法治疗的其它疾病和病症包括，举例而言，包括但不限于，脊髓损伤、多发性硬化(MS)、肌肉萎缩症、糖尿病、肝病如血胆脂醇过多、心脏病、软骨替换、糖尿病、烧伤、脚溃疡、胃肠疾病、血管疾病、肾病、泌尿道疾病、及老龄相关疾病，包括老年性黄斑变性(AMD)和类似病症。
人类NT-ESC如人类多能干细胞(PSC)和人类全能干细胞(TSC)的用途
本文中揭示的提高hSCNT效率的方法和组合物具有许多重要的用途，这些用途将促进干细胞研究和发育生物学领域的发展。例如，hSCNT胚胎可用来生产hES细胞、hES细胞系、人类全能干(TS)细胞和细胞系，且自其分化的细胞可用来研究基础发育生物学以及具体疾病，且可治疗性地用于治疗众多疾病和病症。此外，这些hNT-ESC可用于筛选检验中，以鉴别可用来调节这些细胞的生长、分化、存活、或迁移的因子和条件。被鉴别的试剂可用来在体外和体内调节细胞行为，且可形成细胞疗法或无细胞疗法的基础。
多能容纳胚胎干细胞的单离及SCNT在哺乳动物体内的突破，在实施人类SCNT以生成研究中所使用的未分化细胞的潜在无限制来源方面的可能性提高，且在组织修复和转移医学中具有潜在应用。
这一概念，有时称为“治疗性克隆”，指的是将体细胞的细胞核转移入去核供体卵母细胞(Lanza，et al，Nature Med.5，975(1999))。理论上，通过令所有体细胞基因静默并激活胚胎细胞，该卵母细胞的细胞质将重编所转移的细胞核。ES细胞(即，ntESC)从克隆的胚胎植入前阶段胚胎的内细胞团(ICM)单离。当用于治疗性环境时，这些细胞可携带患者的核基因组；因此，提议在引导细胞分化后，转移该细胞以治疗退行性病变如糖尿病、骨关节炎和帕金森症等而不造成免疫排斥。先前的报导已经揭示了牛ES样细胞(Cibelli et al，Nature Biotechnol.16，642(1998))和来自克隆囊胚的ICM的鼠ES细胞(Munsie et al.，Curro Biol 10，989(2000)；Kawase，et al.，Genesis 28，156(2000)；Wakayama et al.，Science 292，740(2001))的生成，以及克隆人类胚胎发育为8细胞至10细胞阶段和囊胚(Cibelli et al.，Regen.Med.26，25(2001)；Shu，et al.，Fertil.Steril.78，S286(2002))。这里，本发明可用来从通过本文中揭露的方法生成的SCNT工程化细胞团块生成患者特异性人类ES细胞。本文中，此类从SCNT生成的ES细胞被称为“ntESC”，且可包括患者特异性同基因胚胎干细胞系。
用于生产人类hESC系的本技术采用额外的IVF临床胚胎，且并未产出患者特异性ES细胞。患者特异性的、免疫匹配的hESC预期在疾病和发育的研究中具有极大的生物医学重要性，并促进治疗性干细胞转移方法的发展。据此，本发明可用来从hSCNT构建hESC系，其中，从来自其细胞核已经被插入所捐赠去核卵母细胞内的知情供体的人类供体皮肤细胞、人类供体卵丘细胞、或其它人类供体体细胞生成该hSCNT。这些源自hSCNT的hESC系将在不含动物蛋白的培养基上生长。
每一源自SCNT的hESC(即，hNT-ESC)的主要组织相容性复合体同一性可与患者自身比较，以显示免疫相容性，而免疫相容性对于最终的转移很重要。通过生成这些源自SCNT的hESC(即，hNT-ESC)，将作出对遗传稳定性和表观遗传稳定性的评估。
多种人类损伤和疾病导致单细胞类型中的缺陷。如果缺陷细胞可替换为适宜的干细胞、祖细胞、或在体外分化的细胞，且如果所转移的细胞的免疫排斥可避免，则在临床中可能在细胞水平上治疗疾病和损伤(Thomson et al，Science 282，1145(1998))。通过从人类SCNT胚胎或SCNT工程化细胞团生成hESC，在其中该体细胞的细胞核来自个体患者，即在核(但不是线粒体DNA(mtDNA))基因组与供体细胞一致的情形中，如果将这些细胞用于人类治疗，则免疫排斥的可能性可以避免(Jaenisch，N.Engl.Med.351，2787(2004)；Drukker，Benvenisty，Trends Biotechnol.22，136(2004))。近年来，已经成功地通过转移源自NT囊胚的自体同源分化的鼠胚胎干细胞(mESCs)治疗重症综合性免疫缺陷(SCID)和帕金森症(PD)的鼠模型(Barberi et al.，Nat.Biotechnol.21，1200(2003))，这一过程也称为“治疗性克隆”。
从使用本文中揭露的方法生成的人类SCNT胚胎或SCNT工程化细胞团生成hESC，可评估其对hESC多能标记物的表达，该标记物包括碱性磷酸酶(AP)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、SSEA-3、肿瘤排异抗原I-81(Tra-I-81)、Tra-I-60、和八聚物-4(Oct-4)。使用人类短串联重复序列探针进行的DNA指纹识别，亦可用来以高确定性显示，每一起源于人类体细胞各供体的NT-hESC系，且这些细胞系不是去核失败和后续单性生殖激活的结果。干细胞由它们自我更新以及从全部三层胚胎胚层：外胚层、中胚层和内胚层分化为体细胞的能力予以定义。将在畸胎瘤形成和胚胎体(EB)形成方面，通过将IM注射入适宜的动物模型中而分析分化。
总之，本发明的增加hSCNT效率的方法提供了目前用于获得ES细胞的方法的替代。但是，不同于目前所使用的途径，hSCNT可用来生成与供体组织可组织相容的ES细胞系。照此，通过本文中揭露的方法生产的hSCNT胚胎可提供一个机会，以在未来研发与需要此治疗的患者可组织相容的细胞疗法。
一些具体例中，本文中揭露的方法、系统、试剂盒和装置可通过服务提供商实施，例如，当研究者可能请求服务提供商提供已经使用本文中揭露的方法在该服务提供商经营的实验室中生成的hSCNT胚胎、或源自该hSCNT胚胎的多能干细胞、或全能干细胞时。这一具体例中，在获得供体人类体细胞后，服务提供商可实施本文中揭露的方法，以生成hSCNT胚胎或源自hSCNT胚胎的囊胚，或从此hSCNT胚胎生成hNT-ESC，随后，该服务提供商可向研究者提供该hSCNT胚胎或源自该SCNT胚胎的囊胚或来自该hSCNT胚胎的hNT-ESC。一些具体例中，研究者可经由任何手段入经由邮件、快递等将该供体人类体细胞样品送至服务提供商处，或者，该服务提供商可提供服务，以从研究者手中收集供体人类体细胞样品并将其运输至该服务提供商的实验室。一些具体例中，研究者可存放供体人类体细胞样品，以被在该服务提供商实验室所在地用于hSCNT方法中。在备选的具体例中，该服务提供商提供到访服务，此时，服务提供商派遣人员至研究者的实验室，还向研究者实验室提供用于实施该hSCNT方法的试剂盒、设备和试剂以及本文中揭露的研究者希望的/优选的供体人类体细胞(如，患者特异性体细胞)的发明系统。此服务可用于治疗性克隆，如用于从来自hSCNT胚胎的囊胚获得hNT-ESC及/或多能干细胞，如，用于获得用于转移入需要进行再生细胞或组织治疗的受试者体内的患者特异性多能干细胞。
本文中还提供治疗性组合物，该组合物由已经自NT-ESC获得(产生)且配置为适用于施予至人类形式的可转移细胞组成。一种具体例中，转移的接纳体是作为该供体体细胞来源的人类供体。一些具体例中，该治疗性组合物包括源自本文提供的hNT-ESC的多能细胞、世系特异性干细胞、以及部分或完全分化的细胞。
通过将有效量的可转移细胞的一种或多种制剂施予至有此需要的个体，源自hSCNT的hNT-ESC细胞制剂令提供细胞至个体的方法可行。该细胞将匹配至主要组织相容性复合体(MHC)的一个或多个基因座。一种具体例中，在每一MHC基因座均存在完全匹配。一种具体例中，通过将来自感兴趣个体的体细胞的细胞核转译至来自第二个体的去核宿主细胞(如，卵母细胞)中，制作源自hSCNT的hNT-ESC细胞。随后，可如上文所述培养源自hSCNT的hNT-ESC细胞，以产生多能干细胞和多潜能干细胞(MPSC)。随后，治疗有效量的多潜能细胞可用于感兴趣的受试者体内。一种具体例中，使用本文中提供的教导，如通过SCNT，生成与被治疗个体在一个或多个MHC基因组匹配的细胞。优选具体例中，在不含血清的培养基中培养该细胞。另一优选具体例中，该细胞未经使用异基因细胞(如，非人类成纤维细胞，如鼠胚胎成纤维细胞)培养。
提供治疗疾病的方法，该方法包含将源自hSCNT的hNT-ESC细胞转移入苦于以体细胞损害或退化为特征的疾病的人类体内。此类细胞可以是多潜能细胞或任何其它类型的可转移细胞。
源自本文中揭示的hSCNT的hNT-ESC可用于生成所希望细胞类型的细胞。一些具体例中，源自hSCNT的hNT-ESC被用来获取间叶细胞、神经细胞、及/或造血干细胞。其它具体例中，源自hSCNT的hNT-ESC被用来生成细胞，包括但不限于，胰腺细胞、肝细胞、骨骼细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌腱细胞、软骨细胞和肌肉细胞、及其祖细胞。因此，可将源自hSCNT的可转移hNT-ESC细胞施予至需要一种或多种细胞类型的个体，以治疗疾病、病变、或病症。可治疗或预防的疾病、病变、或病症的实例包括，神经学、内分泌、结构、骨骼、血管、泌尿、消化、外皮、血液、免疫、自体免疫、炎症、肾、膀胱、心血管、癌症、循环系统、造血、新陈代谢、生殖和肌肉疾病、病变和病症。一些具体例中，使用源自hNT-ESC的造血干细胞来治疗癌症，其中，该hNT-ESC源自hSCNT。一些具体例中，这些细胞被用于重建性应用，如用于修复或替换组织或器官。
源自本文中揭示的hSCNT的hNT-ESC可用来生成多潜能干细胞或可转移的细胞。一个实例中，可转移的细胞是间叶干细胞。间叶干细胞导致非常大量的截然不同的组织(Caplan，J.Orth.Res 641-650，1991)。也已经从骨髓中单离出了能分化为骨、肌肉、肌腱、脂肪组织、基底细胞和软骨的间叶干细胞(Caplan，J.Orth.Res.641-650，1991)。美国专利US 5,226,914揭示一种从骨髓中单离间叶干细胞的例示性方法。其它实例中，可生成上皮祖细胞或角化细胞，用于治疗皮肤病和肠道内壁的病症(Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A：229，1980)。该细胞还可用来产生肝脏前体细胞(见，PCT公开WO 94/08598)或肾脏前体细胞(见，Karp et al.，Dev.Biol.91：5286-5290，1994)。该细胞亦可用来产生内耳前体细胞(见，Li et al.，TRENDS Mol.Med.10：309，2004)。
源自hNT-ESC且该hNT-ESC源自hSCNT的可转移细胞还可以是神经元细胞。施予至受试者的细胞悬液如神经元细胞悬液的体积，将依据植入部位、治疗目标和溶液中的细胞量而变。典型地，施予至受试者的细胞将是治疗有效量的细胞。例如，在对帕金森症的治疗中，转移治疗有效量的细胞典型将产生与该病变相关的症状如僵直、失去活动能力和步态病变的量及/或严重性的下降。一个实例中，重症帕金森症患者需要每一转移位点存活至少约100,000个多巴胺细胞，以具有自转移获得的实质性有益效果。通常，由于脑组织转移的细胞存活率低(5％至10％)，至少施予100万个细胞，如转移约100万至约400万个多巴胺能神经元。一种具体例中，将细胞施予至受试者脑部。细胞可植入脑实质内的含有脑脊液的空间如蛛网膜下腔或脑室内，或可植入外神经系。因此，一个实例中，细胞被转移至受试者体内不在中枢神经系统或周围神经系统范围之内的部位，如腹腔神经节或坐骨神经。另一具体例中，细胞被转移入包括硬脑膜之内的全部结构的中枢神经系统中。通常，可使用具有18至21号针的无菌注射器完成神经元细胞的注射。尽管针的确切尺寸将取决于待治疗的物种，但对于任何物种，该针的直径不应大于1mm。该领域技术人员通晓将细胞施予至受试者脑部的技术。
通常，将治疗有效量的源自hSCNT的hNT-ESC施予至个体。该细胞可在药学载剂中施予。所使用的药学可接受的载剂是传统载剂。例如，《雷明顿药物科学》(Remington′sPharmaceutical Sciences，by E.W.Martin，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，15thEdition(1975))揭示了适用于本文中所揭露细胞的药学递送的组合物和剂型。通常，载剂的特性将取决于所采用的特定施予模式。例如，肠道外剂型一般包含可注射流体，该可注射流体包括药学和生理学可接受的流体如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒介。对于固体组合物(如，粉末、丸剂、片剂、或胶囊剂)，可包括传统的无毒固体载剂，例如，药物级别的甘露糖、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。待施予的药物组合物除了含有生物学中性的载剂之外，含可含有少量的无毒佐剂，如润湿剂或乳化剂、防腐剂、和pH缓冲剂等，例如，醋酸钠或失水山梨醇单月桂酸酯。
该个体可以是任何感兴趣的受试者。适当的受试者包括那些将得益于增殖源自干细胞或前体细胞的细胞的受试者。一种具体例中，该个体需要增殖神经元前体细胞及/或神经胶质前体细胞。例如，该个体可患有神经退行性病变或已经发生过局部缺血性事件如中风。神经退行性病变的具体的、非限制性实例是：阿尔兹海默症、泛酸盐激酶相关的神经退行性疾病、帕金森症、亨廷顿症(Dexter et al.，Brain 114：1953-1975，1991)、HIV脑炳(Miszkziel et al.，Magnetic Res.Imag.15：1113-1119，1997)、以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症。适当的个体还包括那些老龄受试者，如年龄为至少约65岁、至少约70岁、至少约75岁、至少约80岁、或至少约85岁的受试者。其它实例中，该个体可具有脊髓损伤、Batten氏症或脊柱裂。进一步的实例中，该个体可患有听力丧失，如耳聋的受试者或可能需要增殖来自内耳的干细胞以防止听力丧失的受试者。
一些具体例中，源自使用本文中所揭露方法产生的hSCNT的hNT-ESC能对生殖细胞系作出贡献。因此，来自感兴趣受试者的体细胞可用来产生ES细胞，该ES细胞后来可分化为卵母细胞或精子。随后，这些卵母细胞或精子可用于受精，令不孕不育的受试者生育与该受试者遗传相关的孩子。这一方法可用于患有线粒体疾病的女性受试者，其中，患有该疾病的女性是该方法中人类供体体细胞的来源，从而令从hSCNT产生NT-ESC称为可能，该NT-ESC可分化为卵母细胞，而该卵母细胞可用于通过不具有mtDNA缺陷的女性生育孩子。此外，源自ES细胞的卵细胞可用于研究中。例如，这些卵细胞可接着用来制作源自人类SCNT的ES细胞。这些卵母细胞的可用性可减少所捐赠的人类卵细胞在研究中的使用。
源自hSCNT的hNT-ESC亦可用来生成额外的胚胎细胞，如用于细胞培养中的滋养外胚层。一种具体例中，将自体同源细胞(如，滋养外胚层)用作饲养细胞，可能有助于生成干细胞，该干细胞反过来具有分化为分化的器官特异性细胞的能力。其它具体例中，自体同源饲养细胞的使用可用以避免外来污染，并因此令FDA更容易批准在其上培养的分化细胞用于治疗性目的，其中，该自体同源饲养细胞是通过以生成此饲养层组分的方式培养全能干细胞而获得的。
通过本文中揭露的方法产生的细胞，如源自hSCNT的hNT-ESC，还用于测试感兴趣的试剂，如确定一种剂是否影响分化或细胞增殖。例如，将源自hSCNT的hNT-ESC与该试剂接触，并在存在和不存在该试剂的条件下评估该细胞分化或增殖的能力。因此，通过本文中揭示的方法产生的源自hSCNT的hNT-ESC，亦可用于筛选药学剂，以选择影响具体人类细胞类型的试剂，如影响神经元细胞的试剂。通过本文中揭露的方法产生的源自hSCNT的hNT-ESC亦可用来筛选剂，以选择那些影响分化的试剂。测试化合物可以是任何感兴趣的化合物，包括化学化合物、小分子、多肽或其它生物学剂(例如，抗体或细胞因子)。在若干实例中，筛选一组潜在的试剂，如筛选一组细胞因子或生长因子。
制备可被测试所希望的活性的分子组合库的方法，是该领域中已知的且包括，例如，制作肽的噬菌体展示库的方法，其中，该肽可为约束肽(见，例如，US 5,622,699；US 5,206,347；Scott and Smith，Science 249：386-390，1992；Markland et al.，Gene 109：13-19，1991)；肽厍(US 5,264,563)；模拟肽库(Blondelle et al.，Trends Anal Chem.14：83-92，1995)；核酸库(O′Connell et al.，Proc.Natl Acad.Set.，USA 93：5883-5887，1996；Tuerk and Gold，Science 249：505-510，1990；Gold et al.，Ann.Rev.Biochem.64：763-797，1995)；寡糖厍(Y ork et al.，Carb.Res.285：99-128，1996；Liang et al.，Science274：1520-1522，1996；Ding et al.，Adv.Expt.Med.Biol.376：261-269，1995)；脂蛋白库(de Kruif et al.，FEBSLett.3 99：23 2-23 6，1996)；糖蛋白或糖脂质库(Karaoglu etal.，J.Cell Biol.130.567-577，1995)；或含有例如药物或其它药学剂的化学品库(Gordonet al.，J.Med.Chem.37.1385-1401，1994；Ecker and Crooke，BioTechnology 13：351-360，1995)。多核苷酸尤其可作为能够改变多能或全能细胞的功能的试剂，因为具有对于包括细胞多肽在内的细胞靶标的结合特异性的核酸分子是天然存在的，还因为具有此特异性的合成分子可容易地制备并鉴别(见，例如，US 5,750,342)。
一种具体例中，对于高通量格式，可将通过本文中揭露的方法产生的源自hSCNT的hNT-ESC或MPSC引入多孔板的孔中或载玻片或微芯片中，并令其与所测试的试剂接触。通常，将该细胞组织为阵列，尤其是可读取的阵列，因此，机器人技术可方便地用于操纵该细胞和溶液以及用于监控该细胞，尤其是关于待检查的功能。使用高通量跟上的一个优势为，可平行检查大量的测试剂，且若需要，亦可在与测试条件完全一致的条件下进行对照反应。照此，本文中揭露的方法提供筛选一种、几种或大量测试剂的手段，以鉴别可改变源自hSCNT的hNT-ESC功能的试剂，例如，诱导hNT-ESC分化为所希望的细胞类型的试剂、或例如通过维持调节分子的高水平表达而防止自发性分化的试剂。
令hNT-ESC与测试化合物接触，接触程度足以令该化合物与该细胞相互作用。当化合物结合离散的受体时，该细胞被接触的时间足以令该试剂结合其受体。一些具体例中，使用测试化合物孵化该细胞，孵化时间的量足以影响基底的磷酸化作用。一些具体例中，在37℃，在含有5％CO2的湿润气氛中，以测试化合物对hNT-ESC进行体外处理。以测试化合物处理后，以不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤细胞，且如所揭示的提取总蛋白(Haldar et al.，CellDeath Diff 1：109-115，1994；Haldar et al，Nature 342：195-198，1989；Haldar et al.，Cancer Res.54：2095-2097，1994)。其它具体例中，使用测试化合物的连续稀释。
组合物和试剂盒
本发明的另一方面涉及从通过本文中揭露的方法生产的SCNT获得的hNT-ESC群体。一些具体例中，该hNT-ESC是人类ntESC，例如，患者特异性hNT-ESC、及/或患者特异性同基因hNT-ESC。一些具体例中，该hNT-ESC存在于培养基中，如将该hNT-ESC维持在全能或多能状态的培养基。一些具体例中，该培养基是适用于冷冻保存的介质。一些具体例中，hNT-ESC躯体被冷冻保存。冷冻保存可用来，例如，储存hNT-ESC以备将来用于诸如治疗性用途或其它用途如研究用途。可扩增该hNT-ESC，且可使用所扩增的hNT-ESC的一部分，而另一部分可冷冻保存。扩增和保存hNT-ESC的能力产生可观的灵活性，例如，生产多种患者特异性人类hNT-ESC以及选择供体体细胞用于SCNT过程。例如，可扩增来自组织相容性供体的细胞，并用于超过一个接纳体。可通过组织银行提供hNT-ESC的冷冻保存。hNT-ESC可与组织相容性数据一起冷冻保存。使用本文中揭露的方法产生的hNT-ESC可根据常规过程冷冻保存。例如，可在“冷冻”介质中进行约100万至1000万个细胞的冷冻保存，该介质可包括适当的增殖介质、10％BSA和7.5％二甲基亚砜。将hNT-ESC离心。将生长介质抽出，并替换为冷冻培养基。hNT-ESC作为球体而再次悬浮。通过例如放置在-80℃的容器内而将细胞缓慢冷冻。通过在37℃域中涡旋来解冻冷冻的hNT-ESC，将其再次悬浮于新鲜的干细胞培养基中，并令其如上文所揭示的生长。
一些具体例中，从SCNT胚胎生成hNT-ESC，而该SCNT胚胎是通过将来自供体体细胞的核遗传物质注射入接纳体卵母细胞的细胞质中而生成的，其中，该接纳体卵母细胞包含来自第三供体受试者的mtDNA。
本发明还涉及通过本文中揭露的方法产生的hSCNT胚胎。一些具体例中，该hSCNT胚胎是人类胚胎。一些具体例中，该人类SCNT胚胎经基因修饰，如，在SCNT过程之前(即，采集供体细胞核并与接纳体卵母细胞的细胞质融合之前)，供体细胞核的遗传物质中的至少一个转基因被修饰(如，引入或删除或改变)。一些具体例中，该hSCNT胚胎包含来自该人类供体体细胞的核DNA、来自该人类接纳体卵母细胞的细胞质、以及来自第三人类供体受试者的mtDNA。
本发明的另一方面涉及一种组合物，其包含：人类SCNT胚胎或其囊胚、或接纳体人类卵母细胞(有核或去核)中的至少一种；以及(i)增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂、或(ii)抑制H3K9甲基转移酶的试剂中的至少一种。
另一具体例中，本发明提供用于实践本发明方法的试剂盒。本发明的另一方面涉及一种试剂盒，包括一个或多个包含(i)增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂及/或抑制H3K9甲基转移酶的试剂，以及(ii)人类卵母细胞的容器。该试剂盒可视情况包含用于该接纳体卵母细胞及/或SCNT胚胎的培养基，以及一种或多种使用接纳体卵母细胞的细胞质来激活(如，融合)供体核遗传物质的试剂。一些具体例中，该人类卵母细胞是去核卵母细胞。一些具体例中，该人类卵母细胞未去核。一些具体例中，该人类卵母细胞经冷冻及/或存在于冷冻保存冷冻介质中。一些具体例中，该人类卵母细胞是从罹患线粒体疾病或具有mtDNA突变或畸形的供体女性受试者获得的。一些具体例中，该卵母细胞从并未罹患线粒体疾病或并不具有mtDNA突变的供体女性受试者获得的。一些具体例中，该卵母细胞包含来自第三受试者的mtDNA。
该试剂盒亦可视情况包括适宜的系统(如，不透明的容器)或稳定剂(如，抗氧化剂)，以防止增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂及/或抑制H3K9甲基转移酶的试剂在光或其它不利条件下退化。
该试剂盒可视情况包括含有实施hSCNT过程(如，将卵母细胞去核、及/或将该供体体细胞的核遗传物质注射入接纳体卵母细胞、及/或融合/激活、及/或培养hSCNT胚胎)的指南(即，方案)的说明材料，以及令供体体细胞及/或接纳体卵母细胞、及/或hSCNT胚胎中的至少一种与增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂及/或抑制H3K9甲基转移酶的试剂接触的使用说明。
为了更完全地理解本文中揭示的发明，提出下述详细说明。
本发明可定义为下述编号段落的任何段落：
1.一种增加人类体细胞核转移(hSCNT)效率的方法，包含：令杂交卵母细胞与增加组蛋白去甲基化酶KDM4家族成员表达的试剂接触，其中，该杂交卵母细胞是包含人类体细胞遗传物质的去核人类卵母细胞。
2.如段落1所述的方法，其中，该接触出现在该杂交卵母细胞的激活或融合之后，但在人类受精卵基因组激活(ZGA)开始之前。
3.一种增加人类体细胞核转移(SCNT)效率的方法，该方法包含下述至少一项：
(i)令供体人类体细胞或接纳体人类卵母细胞与至少一种降低该供体人类体细胞或该接纳体人类卵母细胞中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该接纳体人类卵母细胞是有核的或去核的卵母细胞；若该接纳体人类卵母细胞是有核的，将该人类卵母细胞去核；将来自该供体人类体细胞的细胞核转移至该去核的卵母细胞中，以形成杂交卵母细胞；以及，激活该杂交卵母细胞以形成人类SCNT胚胎；或
(ii)令杂交卵母细胞与至少一种降低该杂交卵母细胞中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，杂交卵母细胞是包含人类体细胞遗传物质的去核人类卵母细胞；以及，激活该杂交卵母细胞，以形成人类SCNT胚胎；或
(iii)令激活后的人类SCNT胚胎与至少一种降低人类SCNT胚胎中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该SCNT胚胎是从去核的人类卵母细胞与人类体细胞遗传物质的融合生成的；
其中，降低在该供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞或该人类SCNT胚胎中任何一种中的H3K9me3甲基化增加了该SCNT的效率。
4.一种生产人类细胞核转移胚胎干细胞(hNT-ESC)的方法，该方法包含：
a.下述至少一项：(i)令供体人类体细胞或接纳体人类卵母细胞与至少一种降低该供体人类体细胞或该接纳体人类卵母细胞中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该接纳体人类卵母细胞是有核的或去核的卵母细胞；若该接纳体人类卵母细胞是有核的，将该人类卵母细胞去核；将来自该供体人类体细胞的细胞核转移至该去核的卵母细胞中，以形成杂交卵母细胞；以及，激活该杂交卵母细胞以形成人类SCNT胚胎；或
(ii)令杂交卵母细胞与至少一种降低该杂交卵母细胞中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，杂交卵母细胞是包含人类体细胞遗传物质的去核人类卵母细胞；以及，激活该杂交卵母细胞，以形成人类SCNT胚胎；或
(iii)令激活后的人类SCNT胚胎与至少一种降低人类SCNT胚胎中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该SCNT胚胎是从去核的人类卵母细胞与人类体细胞遗传物质的融合而生成的；
b.将该SCNT胚胎孵化足够的时间以形成囊胚；从该囊胚中收集至少一个卵裂球；以及培养该至少一个卵裂球以形成至少一个人类NT-ESC。
5.一种生产人类体细胞核转移(SCNT)胚胎的方法，包含：
令供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞或人类体细胞核转移(SCNT)胚胎中的至少一者与至少一种降低该供体人类体细胞、该接纳体人类卵母细胞或该人类SCNT胚胎中的H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该接纳体人类卵母细胞是有核的或去核的卵母细胞；若该接纳体人类卵母细胞是有核的，将该人类卵母细胞去核；
将来自该供体人类体细胞的细胞核转移至该去核的卵母细胞中，以形成杂交卵母细胞；
激活该杂交卵母细胞；以及
将该杂交卵母细胞孵化足够的时间，以形成人类SCNT胚胎。
6.如段落2至5任一段落所述的方法，其中，该降低H3K9me3甲基化的试剂是增加人类KDM4家族的组蛋白去甲基化酶成员的表达的试剂。
7.如段落6所述的方法，其中，该试剂增加人类KDM4(JMJD2)家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性。
8.如段落1至7任一段落所述的方法，其中，该试剂增加下述至少一种酶的表达或活性：KDM4A(JMJD2A)、KDM4B(JMJD2B)、KDM4C(JMJD2C)、KDM4D(JMJD4D)或KDM4E(JMJD2E)。
9.如段落1至8任一段落所述的方法，其中，该试剂增加KDM4A(JMJD2A)的表达或活性。
10.如段落1至8任一段落所述的方法，其中，该试剂包含对应于SEQ ID NO：1至SEQID NO：4或SEQ ID NO：45的核酸序列或其生物学活性片段，其将SCNT的效率增加至与SEQID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45的对应序列相比较下相似或更高的程度。
11.如段落16所述的方法，其中，该试剂包含对应于SEQ ID NO：1的核酸序列或其生物学活性片段，其将SCNT效率增加至与SEQ ID NO：1的核酸序列相比较下相似或更高的程度。
12.如段落1至8任一段落所述的方法，其中，该试剂是H3K9甲基转移酶的抑制剂。
13.如段落12所述的方法，其中，该H3K9甲基转移酶是SUV39h1或SUV39h2。
14.如段落12所述的方法，其中，该H3K9甲基转移酶是SETDB1。
15.如段落12所述的方法，其中，SUV39h1、SUV39h2和SETDB1中的两种或更多种酶被抑制。
16.如段落12所述的方法，其中，该抑制H3K9甲基转移酶的试剂选自RNAi剂、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1寡核苷酸、中和抗体或抗体片段、适配体、小分子、肽抑制剂、蛋白抑制剂、avidimir、及其功能性片段或衍生物组成的群组。
17.如段落16所述的方法，其中，该RNAi剂是siRNA或shRNA分子。
18.如段落1至17任一段落所述的方法，其中，该试剂包含核酸抑制剂以抑制SEQID NO：14至SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53的表达。
19.如段落17所述的方法，其中，该RNAi剂杂交至SEQ ID NO：14至SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53的至少一部分。
20.如段落17所述的方法，其中，该RNAi剂包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8、SEQID NO：18或SEQ ID NO：19或其至少10个连贯核酸的片段的任意个或组合，或是具有与SEQID NO：7或SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的一致性为至少80％的序列的同源物。
21.如段落1至20任一段落所述的方法，其中，该接纳体人类卵母细胞是去核的人类卵母细胞。
22.如段落1至20任一段落所述的方法，其中，该人类SCNT胚胎是选自1细胞阶段SCNT胚胎、激活后5小时(5hpa)的SCNT胚胎、激活后10至12小时(10-12hpa)之间的SCNT胚胎、激活后20至28小时(20-28hpa)之间的SCNT胚胎、2细胞阶段SCNT胚胎的任何胚胎。
23.如段落1至22任一段落所述的方法，其中，该试剂在细胞核转移之前接触接纳体卵母细胞或去核的人类卵母细胞。
24.如段落1至22任一段落所述的方法，其中，该试剂在SCNT胚胎处于1细胞阶段之前、或在激活后约5小时、或当该SCNT胚胎处于1细胞阶段时接触该SCNT胚胎。
25.如段落1至22任一段落所述的方法，其中，该试剂在激活后5小时(5hpa)、或激活后12小时(12hpa)、或激活后20小时(20hpa)、或当该SCNT胚胎处于2细胞阶段时、或在5hpa与28hpa之间的任何时间，接触该人类SCNT胚胎。
26.如段落1至22任一段落所述的方法，其中，令接纳体人类卵母细胞或杂交卵母细胞或人类SCNT胚胎与该试剂接触的步骤，包含将该试剂注射入该接纳体人类卵母细胞或杂交卵母细胞或人类SCNT胚胎的细胞核或细胞质内。
27.如段落1至26任一段落所述的方法，其中，该试剂增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性。
28.如段落1至22任一段落所述的方法，其中，该试剂在移除用于注射入去核的人类卵母细胞内的细胞核之前，接触该供体人类体细胞的细胞质或细胞核。
29.如段落28所述的方法，其中，在将该供体人类体细胞的细胞核注射入去核的人类卵母细胞内之前，令该供体人类体细胞与该试剂接触至少24小时或至少1天。
30.如段落28所述的方法，其中，在将该供体人类体细胞的细胞核注射入去核的人类卵母细胞内之前，该试剂与该供体人类体细胞接触至少24小时、或至少48小时、或至少3天。
31.如段落28至30任一段落所述的方法，其中，该试剂抑制H3K9甲基转移酶。
32.如段落28至30任一段落所述的方法，其中，该H3K9甲基转移酶是SUV39h1或SUV39h2、或SUV39h1及SUV39h2(SUV39h1/2)。
33.如段落1至32任一段落所述的方法，其中，该供体人类体细胞是终末分化体细胞。
34.如段落1至33任一段落所述的方法，其中，该供体人类体细胞不是胚胎干细胞、或诱导多能干(iPS)细胞、或胎儿细胞、或胚细胞。
35.如段落1至34任一段落所述的方法，其中，该供体人类体细胞选自卵丘细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌肉细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胎儿细胞、胎盘细胞、及成年细胞组成的群组。
36.如段落1至35任一段落所述的方法，其中，该供体人类体细胞是成纤维细胞或卵丘细胞。
37.如段落1至36任一段落所述的方法，其中，该试剂接触该供体人类体细胞的细胞核，以从该供体人类体细胞移除该细胞核，并将该细胞核用于注射入去核的接纳体人类卵母细胞中。
38.如段落1至37任一段落所述的方法，其中，该方法造成hSCNT发育囊胚的效率比不存在降低H3K9me3甲基化的试剂的情况下实施的hSCNT增加至少10％。
39.如段落1至38任一段落所述的方法，其中，该方法造成hSCNT发育囊胚的效率比不存在降低H3K9me3甲基化的试剂的情况下实施的hSCNT增加10％至20％。
40.如段落1至39任一段落所述的方法，其中，该方法造成hSCNT发育囊胚的效率比不存在降低H3K9me3甲基化的试剂的情况下实施的hSCNT增加超过20％。
41.如段落38至40任一段落所述的方法，其中，该SCNT效率的增加是人类SCNT胚胎至囊胚阶段的发育的增加。
42.如段落38至40任一段落所述的方法，其中，该SCNT效率的增加是源自人类SCNT胚胎的胚胎干细胞(hNT-ESC)衍生物的增加。
43.如段落1至42任一段落所述的方法，其中，该供体人类体细胞是转基因供体人类细胞。
44.如段落5所述的方法，进一步包含体外培养该人类SCNT胚胎，以形成人类囊胚。
45.如段落44所述的方法，其中，该人类SCNT胚胎是至少4细胞的人类SCNT胚胎。
46.如段落44所述的方法，其中，该人类SCNT胚胎是至少4细胞的SCNT胚胎。
47.如段落44所述的方法，进一步包含从来自人类囊胚的内细胞团单离细胞；以及培养来自未分化状态的内细胞团的该细胞，以形成人类胚胎干(ES)细胞。
48.如段落1至48任一段落所述的方法，其中，该供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞或人类SCNT胚胎的任一种或多种已经被冷冻并解冻。
49.一种源自人类SCNT胚胎的胚胎干细胞(hNT-ESC)群体，是使用如段落1至48任一段落所述的方法生产的。
50.如段落49所述的hNT-ESC群体，其中，该hNT-ESC是基因修饰的hNT-ESC。
51.如段落49所述的hNT-ESC群体，其中，该hNT-ESC是多能干细胞或全能干细胞。
52.如段落49所述的hNT-ESC群体，其中，该hNT-ESC存在于培养基中。
53.如段落52所述的hNT-ESC群体，其中，该培养基将该hNT-ESC维持在多能或全能状态。
54.如段落52所述的hNT-ESC群体，其中，该培养基是适用于该hNT-ESC的冷冻和冷冻保存的介质。
55.如段落54所述的hNT-ESC群体，其中，该hNT-ESC被冷冻或冷冻保存。
56.一种人类SCNT胚胎，是通过如段落1至55任一段落所述的方法生产的。
57.如段落56所述的人类SCNT胚胎，其中，该人类SCNT胚胎是经基因修饰的。
58.如段落56所述的人类SCNT胚胎，其中，该人类SCNT胚胎包含并非来自该接纳体人类卵母细胞的线粒体DNA(mtDNA)。
59.如段落56所述的人类SCNT胚胎，其中，该人类SCNT胚胎存在于培养基中。
60.如段落59所述的人类SCNT胚胎，其中，该培养基是适用于该人类SCNT的冷冻和冷冻保存的介质。
61.如段落60所述的人类SCNT胚胎，其中，该人类胚胎被冷冻或冷冻保存。
62.一种组合物，包括人类SCNT胚胎、接纳体人类卵母细胞、人类杂交卵母细胞或囊胚的至少一种，以及下列至少一项：
a.增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂；或
b.抑制H3K9甲基转移酶的试剂。
63.如段落62所述的组合物，其中，该增加KDM4(JMJD2)家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂增加KDM4A(JMJD2A)、KDM4B(JMJD2B)、KDM4C(JMJD2C)、KDM4D(JMJD2D)或KDM4E(JMJD2E)中至少一种酶的表达或活性。
64.如段落63所述的组合物，其中，该试剂增加KDM4D(JMJD2D)或KDM4A(JMJD2A)的表达或活性。
65.如段落64所述的组合物，其中，该试剂包含对应于SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45的核酸序列或其生物学活性片段，其将人类SCNT的效率增加至与SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45的对应序列相比较下相似或更高的程度。
66.如段落64所述的组合物，其中，该试剂包含对应于SEQ ID NO：1的核酸序列或其生物学活性片段，其将SCNT效率增加至与SEQ ID NO：1的核酸序列相比较下相似或更高的程度。
67.如段落62所述的组合物，其中，该H3K9甲基转移酶的抑制剂抑制SUV39h1、SUV39h2、或SETDB1中的至少一种酶或其任意组合。
68.如段落62所述的组合物，其中，该人类SCNT胚胎是处于1细胞阶段、2细胞阶段或4细胞阶段的人类SCNT胚胎。
69.如段落62所述的组合物，其中，该接纳体人类卵母细胞是去核的接纳体人类卵母细胞。
70.如段落62所述的组合物，其中，该人类SCNT胚胎是从注射终末分化人类体细胞的细胞核生产的，或其中，该囊胚是从通过将终末分化人类体细胞的细胞核注射入去核的人类卵母细胞内而生产的人类SCNT胚胎发育的。
71.一种试剂盒，包含：(i)增加人类KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂，及/或抑制H3K9甲基转移酶的试剂；以及(ii)人类卵母细胞。
72.如段落92所述的组合物，其中，该人类卵母细胞是去核的卵母细胞。
73.如段落92所述的组合物，其中，该人类卵母细胞是非人类卵母细胞。
除非另做定义，本文中使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解者相同的意义。尽管可将与本文中揭示者类似或等效的方法和材料用于本发明中或对本发明的测试中，但适当的方法和材料揭示如下。该材料、方法和实施例仅做例示性说明，而非试图限制。
本文中提及的所有出版物、专利、专利公开和申请、以及其它文献均通过引用而以其整体并入本文。
综上，本发明提供从早期胚胎的单个卵裂球获取ES细胞、ES细胞系、和分化的细胞类型而无需摧毁该胚胎的方法。该方法的多个特征在下文中详述。上文和下文中详述的本发明的多个方面和具体例的所有组合全部在预期之中。
[实施例]
本文中呈递的实施例涉及，通过(i)增加人类KDM4家族的组蛋白去甲基化酶成员如KDM4A的表达或活性及/或(ii)抑制人类甲基转移酶hSUV39h1或hSUV39h2中的任何一种酶，降低或移除人类SCNT胚胎中及/或人类体细胞的人类供体细胞核中的H3K9me3，从而增加人类SCNT效率的方法和组合物。纵观本申请，参考了多篇出版物。为了更完整地揭示本发明所属领域的状态，所有出版物及这些出版物中所引用的参考文献通过引用而以其整体并入本文。下述实施例并非意图限制本发明权利要求的范畴，而是意图例示性说明某些具体例。该领域技术人员所知的对该例示性方法的任何变更均应落入本发明的范畴内。
实验过程
人类SCNT过程和KDM4A mRNA注射
在配备Poloscope的倒置显微镜(Cambridge Research&Instrumentation)下，将具有截然不同的第一极体的所有MII阶段人类卵母细胞去核。在咖啡因(1.25mM)的存在下完成该去核以及核供体细胞融合。对于去核，将卵母细胞在GlobalHTF培养基中使用含有0.5μg/ml细胞松弛素B和咖啡因(1.25mM)的Hepes(Life Global)中预孵化5分钟。随后，使用压电致动器(Primetech，日本)移除该纺锤状复合体。将再次悬浮在含有HVJ-E提取物(Cosmo Bio，USA)的液滴中的真皮成纤维细胞插入该去核卵母细胞的卵周隙内。将重建的卵母细胞保持在含有咖啡因(1.25mM)的操纵介质中，直至细胞融合被证实，随后，将该重建的卵母细胞转移至Global介质10％SPS中，孵化1至1.5小时，之后激活。通过如先前所述(Tachibana et al.，2013)，在.0.25M d-山梨醇缓冲液和6-DMAP(2mM，4hr)中施加电脉冲(2X 50μβDC脉冲，2.7kV/cm)而完成激活。将激活的胚胎转移至以曲古抑菌素A(TSA，10nM，Sigma)补充的Global 10％SPS介质中，停留12小时，随后将该胚胎转移至不具有TSA的Global 10％FBS中，并在具有6％CO2/5％O2/89％N2气氛的孵化器中于37℃孵化长达7天。在第3天改变培养基。
对于mRNA注射，将激活的SCNT胚胎洗涤，并在Global 10％SPS中培养1小时，之后进行KDM4A mRNA注射。在激活后5小时，在Hepes-HTF 10％SPS介质中，使用先前揭示的压电致动器(Matoba et al.，2014)将大约10pl的KDM4A mRNA注射入SCNT胚胎。供体细胞制备、mRNA制备、RNA-seq和其它过程的更多细节可在补充实验过程中发现。
人类重编对抗区域的鉴别
使用滑动窗(大小为20kb，步长为10kb)来评估4细胞和8细胞人类胎的全基因组表达水平。对于各窗，使用标准化RPM(每百万个独特映射读数中的读数)定量。使用严格策略(在8细胞IVF胚胎中，FC＞5，RPM＞5)鉴别8细胞IVF胚胎中相对于4细胞IVF胚胎的显着激活区域，并合并重叠区域。基于其在人类SCNT和IVF 8细胞胚胎中的表达差异，将这些激活区域归类为三组。
鼠
通过C57BL/6J雌性与DBA/2J雄性杂交来生产B6D2F1/J(BDF1)鼠，并将所得鼠用于采集在SCNT中使用的卵母细胞和体细胞核供体。所有动物实验均获得哈佛医学院实验动物管理及使用委员会批准。
人类KDM4A mRNA的体外转录
如先前所揭示的实施体外转录(Matoba et al.，2014)。简而言之，将全长度人类KDM4A/JHDM3A cDNA克隆入在克隆位点的3′端含有poly(A)83的pcDNA3.1质粒。使用PrimeSTAR诱变试剂盒(TAKARA#R045A)生成催化缺陷性突变体形式的KDM4A(H188A)。使用mMESSAGE mMACHINE T7超级试剂盒(Life technologies#AM1345)合成。将所合成的mRNA溶解于不含核酸酶的水中。通过NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies)测量mRNA的浓度。将mRNA的等量小样在-80℃储存备用。
鼠SCNT和KDM4A mRNA注射
如先前所揭示的完成鼠的体细胞核转移(Matoba et al.，2014)。简而言之，接纳体MII卵母细胞和供体卵丘细胞两者均采集自成年BDF1雌性鼠，通过注射7.5IU的孕马血清促性腺激素(PMSG；Millipore#367222)和7.5IU的人类绒膜促性腺激素(hCG；Millipore#230734)进行超数排卵，从而完成采集。注射hCG后15至17小时，从输卵管采集卵丘-卵母细胞复合体(COC)，使用含有300U/ml牛睾丸透明质酸酶(Calbiochem#385931)的Hepes缓冲单质钾优化培养基(KSOM)短暂处理，以获得离解的MII卵母细胞和卵丘细胞。在含有7.5jig/ml细胞松弛素B(Calbiochem#250233)的Hepes缓冲KSOM培养基中，使用压电驱动的显微操纵器(Primetech#PMM-150FU)将所单离的MII卵母细胞去核。将共同卵丘细胞的细胞核注射入该去核的卵母细胞内。在KSOM中孵化1小时后，通过在含有2.5mM SrCl2和5jig/ml细胞松弛素B的无钙KSOM中孵化而激活重建的SCNT卵母细胞，随后在KSOM中使用细胞松弛素B再培养4小时。在启动SrCl2处理5小时后(激活后小时数，hpa)，洗涤激活的SCNT胚胎，在具有5％CO2的湿润气氛下在37.8℃的KSOM中培养。在5至6hpa，使用压电驱动的显微操纵器将约10pl水(对照)、1500ng/μl野生型或突变型(H188A)人类KDM4A mRNA注射入该SCNT胚胎中。通过学生t测试来分析胚胎植入前的发育率。
人类卵母细胞的制备
人类卵母细胞实验(CHA001)策略获得CHA再生医学研究所(CHARMI)干细胞研究监管(SCRO)委员会和伦理审查委员会(Pearl Institutional Review Board(PIRB))两者的批准。最初的卵母细胞供体招募基于如先前所揭示的网络广告而实施(Chung et al.，2014)。所有供体均为自愿参与，且基于其生殖、医疗和生理健康根据美国生殖医学学会(ASRM)的指导方针筛查。根据ASRM制定的指导方针，对于卵母细胞供体的时间、努力、工资损失、路费、不便、以及其它与捐赠过程相关的开销予以经济补偿。
如先前所揭示完成卵巢刺激(Chung et al，2014)。简而言之，使用人类重组促卵泡激素(rFSH，225-300IU，Merck)与人类绝经期促性腺激素(Menopur 75IU，Ferring)的组合，与GnRH拮抗剂(醋酸加尼瑞克(Ganirelix acetate)，Merck)抑制一起刺激卵巢9至11天。当1个或2个卵泡直径达到18mm时，使用亮丙瑞林(Lupron)4mg模拟LH高峰。所有药物均通过皮下注射施予。在注射亮丙瑞林大约36小时后，实施经阴道的卵母细胞采集术。在采卵后1至2小时内，使用5080IU/ml透明质酸酶(Sigma-Aldrich)剥蚀所采集的COC。随后，将经处理的COC保持在以10％血清蛋白补充剂(SPS；Cooper Surgical)补充的Global介质(IVFOnline)中备用。
捐赠的人类IVF胚胎
用于本研究的IVF胚胎从患者获得，该患者已经在标准IVF过程后得到所希望数目的孩子，且剩余胚胎已经冷藏保存若干年(2至6年)。通过签署知情同意书，所有供体自愿捐赠其胚胎(多细胞裂解阶段)用于研究。用于研究的胚胎捐赠程序受到CHA江南医学中心IRB的批准。
人类供体的体细胞制备和表征
为了制备人类核供体体细胞，在局部麻醉下活检切下小片腹部皮肤(0.5cm x0.3cm)，在以抗生素/抗真菌溶液(抗-抗IX，Invitrogen)补充的PBS中洗涤3次，以移除任何可能的污染物。本研究中的所有体细胞供体均为AMD患者(AMD亚型：中央网状脉络膜萎缩症)。DFB-6来自52岁年长女性。DFB-7来自42岁年长女性。DFB-8来自59岁年长男性。
体细胞核供体细胞制备过程与先前揭示的(Chung et al.，2014)大体相同。简而言之，将皮肤外植体机械切碎，使用胶原酶(I型，200unit/ml，Worthington-biochem)在以10μg/ml青霉素-链霉素补充的DMEM中处理，以令该皮肤组织离解。孵化过夜后，收集离解的细胞，在37℃和5％CO2气氛下，种植于含有DMEM(Invitrogen，具有10％FBS、1％非必需氨基酸和10μg/mL青霉素-链霉素)溶液的60mm培养皿内。一旦细胞达到80％融汇，将最初成果的1/2冷藏保存，剩余细胞传代若干次，将来自每一次传代的细胞冷藏保存。接着，在SCNT之前，解冻冷冻的细胞，在4孔板(Nunc)中培养，直至它们达到融汇。随后，将该细胞在血清饥饿DMEM(0.5％FBS)中培养2至3天，以令该细胞在使用之前同调。
来自KDM4A辅助的SCNT囊胚的人类NTK-ESC的衍生
所有扩展囊胚全部使用酸台氏溶液处理以移除透明带，随后，在以敲去血清替代物(10％SR，Invitrogen)、FBS(10％Hyclone)、bFGF(30ng/ml)、人类LIF(2000单位/ml，Sigma-Aldrich)和ROCK抑制剂(1uM，Sigma-Aldrich)补充的敲去DMEM中，将整个囊胚(未移除滋养外胚层)置于有丝分裂灭活的鼠成纤维细胞(MEFs，Global Stem Inc.)上。在接下来的3天中不改变该衍生介质，随后，如先前所述(Chung et al，2008)，每天均将1/2的介质替换为不含ROCK抑制剂的新鲜介质。传代3次后，FBS的量减少至2％，经其替换为SR。传代5次后，在以FGF(8ng/ml，Invitrogen)、SR(18％，Invitrogen)、和FBS(2％Hyclone)补充的DMEM/F12中培养该ES细胞。传代10次后，将该ES细胞保持在以FGF(8ng/ml)和20％SR补充的DMEM/F 12中。
用于ZGA分析的8细胞人类胚胎的制备
使用一位健康女性(#64)捐赠的卵母细胞和来自AMD患者(DFB-8)的皮肤成纤维细胞，生成用于ZGA分析的SCNT胚胎。当启动卵裂球比较时，培养SCNT胚胎和IVF胚胎直至晚期8细胞阶段，随后以酸台氏溶液简单地处理这些胚胎以移除透明带。为了制备该8细胞SCNT胚胎，使用来自一位卵母细胞供体的卵母细胞以及来自一位体细胞核供体的皮肤成纤维细胞。所有过程与“人类SCNT过程和KMD4A mRNA注射”部分中揭示的相同。仅在激活74小时后完全同步地达到完全8细胞阶段的胚胎被收集并用于这一实验中。
对于对照IVF胚胎的制备，解冻几个捐赠的早期8细胞阶段IVF胚胎，培养5至7小时以令他们达到晚期8细胞阶段，在进行处理。移除透明带后，将剥蚀的胚胎在PBS中洗涤3次，置于不含RNAse和DNAse的PCR管中，旋转减慢，并在液氮中急剧冷冻。随后，将他们保持在-80℃备用。作为对照，还准备了体细胞核供体的皮肤成纤维细胞。那些成纤维细胞在25cm2烧瓶中在DMEM 10％FBS中培养，且收集到大约10,000个细胞/供体，急剧冷冻，并在-80℃储存备用。
免疫组化染色
在室温，将鼠的1细胞SCNT胚胎、未分化的人类ESC集落或分化的拟胚体(EB)使用4％多聚甲醛(PFA)固定20分钟。以含有10mg/ml BSA的PBS(PBS/BSA)洗涤3次后，通过使用0.5％Triton-X 100孵化而令该固定样品透化15分钟。于室温在PBS/BSA中阻断1小时后，将这些样品在一次抗体的混合物中于4℃孵化过夜。所使用的一次抗体如下：抗-H3K9me3(Abeam，ab71604，1∶500)、抗-NANOG(Abeam，abl09250，1∶200)、抗-OCT-4(Santa Cruz，sc-8628，1∶100)、抗-TRA 160(Millipore，MAB4360，1∶100)、抗-SOX2(R&D，AF2018，1∶200)、抗-SSEA4(Millipore，MAB4304，1∶100)、抗-AFP(α-1-胎蛋白；Dako A0008，1∶100)、抗-BRACHYURY(Abeam ab20680，1∶100)、和TUJ1(B-微管蛋白；Covance PRB-435P，rabbit，1∶100)。洗涤三次后，样品使用二次抗体自室温孵化1小时，该二次抗体包括驴抗山羊TRITC(Jackson ImmunoRe search，705-026-147)、驴抗鼠488(Jackson ImmunoRe search，715-486-151)、驴抗山羊649(Jackson ImmunoResearch，705-496147)、驴抗兔TRITC(JacksonImmunoResearch，711026-152)。细胞使用DAPI(Vector Laboratories)共染色。
ESC的体外分化和畸胎瘤检验
对于体外分化检验，将ESC在低附着培养皿中在不具bFGF的ESC培养基中培养1周，直至他们形成拟胚体(EB)。之后，将EB转移至涂覆有人工基底膜(BD Biosciences)的4孔皿(Nunc)中，再培养1周。EB经洗涤、在含有1％BSA和0.1％Triton-X的PBS中阻断并透化后，使用一次抗体孵化过夜。EB以含有1％BSA的PBS洗涤3次后，使用二次抗体和DAPI染色1小时，并在荧光显微镜下观察。对于畸胎瘤检验，将大约1x105个未分化的NTK-ESC注射入NOD/SCID鼠的睾丸内。对于每一NTK-ESC系，使用至少3个动物。12周后，切除畸胎瘤并将其在PFA中固定，包埋如石蜡中，切片，随后如先前所揭示的在染色后进行组织结构分析(Chung etal，2014)。
染色体分析
通过如先前揭示的标准方案(Chung et al.，2014)实施对两个NTK-ESC系的染色体分析。中期扩展通过GTG(通过使用Giemsa的胰蛋白酶进行G-显带)-显带技术染色，并由两位细胞遗传学专家分析20个中期且进行染色体核型分析。符号由Ikaros染色体核型分析系统(MetaSystems，Germany)产生。
RNA测序分析
每一组中，将5个8细胞胚胎直接裂解，并用于使用SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒(Clontech)进行的cDNA合成中。对于MEF供体，将10ng总RNA用于使用SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒进行的cDNA合成中。扩增后，使用Covaris超声发生器M220将cDNA样品打碎至平均大小为150bp(Covaris)。根据制造商的说明书(New England Biolabs)，使用Illumina公司的NEBNext超级DNA库制备试剂盒并使用该被打碎的DNA制作具备不同条形码的测序库。对于hESC的每一次RNA-seq分析，将1μg总RNA用于mRNA纯化。使用Illumina(NewEngland Biolabs)的NEBNext超级定向RNA库制备试剂盒生成条码化的RNA-seq库。在HiSeq2500测序仪(Illumina)上实施单端50bp测序。使用Tophat2将测序读数映射至人类基因组(hg 19)。所有程序均在默认设置下实施(除非另做说明)。对于每一测序库，获得至少2200万唯一映射的读数，随后使用Cufflinks v2.0.2组合为由参考注释(Refseq基因模型)引导的文字记录。使用标准化FPKM(每百万映射片段中每千碱基外显子的片段数)将每一基因的表达水平定量。使用R(可在www.r-project.org/上获得)实施统计分析。使用独立的2组Wilcoxon秩和检验来，通过R中的wilcox.test函数来比较分布。使用默认参数的cor函数计算Pearson′s r系数。使用R中的heatmap.2函数(gplots软件包)完成对不同样品的全局基因表达模式的分层聚类分析。
对公开的ChIP-seq和DNA甲基化数据集的分析
为了实施图1和图5中的组蛋白修饰富集分析，发明人使用了下述公开的ChIP-seq和DNasel-seq数据集：Nhlf成纤维细胞(ENCODE/广义组蛋白项目)中的H3K9me3、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K27me3、H3K36me3、H3K27ac和H4K20mel ChIP-seq；Hsmm和K562细胞(ENCODE/广义组蛋白项目)中的H3K9me3ChIP-seq；Mcf7细胞(ENCODE/Sydh组蛋白项目)中的H3K9me3ChIP；IMR90、Hsmm、K562和Mcf7细胞(ENCODE/OpenChromDnase项目)中的Dnasel-seq。发明人还使用来自人类表观基因组计划(Roadmap Epigenomics project)的IMR90细胞的用于DNA甲基化分析(Roadmap Epigenomics et al.，2015)的全基因组亚硫酸氢盐序列数据集。IMR90中经处理的DNA甲基化数据从网址“egg2.wustl.edu/roadmap/web_portal/”下载。使用标准化FPKM定量ChIP-seq强度。测定被测序读数覆盖的基因组位置，并可视化为UCSC基因组浏览器中的自定义轨道。使用R中的wilcox.test函数，使用独立的2组Wilcoxon秩和检验来比较每一组之间的ChIP-seq分布。
实施例1
8细胞人类SCNT胚胎中重编对抗区域(RRR)的鉴别
不同于在2细胞阶段发生的鼠受精卵基因组激活(ZGA)，人类受精卵基因组激活(ZGA)发生在晚期4细胞至晚期8细胞阶段的过程中(Niakan et al.，2012)(图1A)。为了鉴别在正常人类IVF胚胎的ZGA过程中激活的基因组区域，发明人分析了公开的人类转移前胚胎RNA-测序(RNA-seq)数据集(Xue et al，2013)，并鉴别了大小为20至160kb范围内的707个基因组区域(表5)，其在8细胞阶段的激活至少5倍于4细胞阶段(图1B)。
为了确定ZGA是否在人类SCNT中适当地发生，发明人采集了从SCNT或IVF衍生的晚期8细胞阶段胚胎(5个/组)，并实施RNA-seq(图1A)。同时，发明人还实施了对供体皮肤成纤维细胞的RNA-seq(DFB-8，见方法)。对上文定义的707个基因组区域(图1B和表5)表明，与供体成纤维细胞中相比，SCNT胚胎中大多数ZGA区域被激活(图1C)。但是，激活水平与IVF胚胎中不相当(图1C)。707个基因组区域中，169个区域的激活水平与IVF胚胎中相当(FC＜＝2，IVF vs SCNT)，并因此遵循我们先前的定义命名为“完全重编区域”(FRR)(Matoba et al.，2014)。同样，与IVF胚胎相比，SCNT中有220个区域被部分激活(2＜FC＜＝5)，这些区域名为“部分重编区域”(PRR)。但是，剩余的318个区域(表6)未能在SCNT胚胎中成功完成激活(FC＞5)，名为“重编对抗区域”(RRR)。因此，比较性转录组分析令我们鉴别318个RRR，这些RRR具有对人类8细胞SCNT胚胎中转录重编的耐性。
表5.来自人类ZGA激活区域的转录本表达水平(与图1)相关联。*＝RNA-seq数据库，获得自Xue等人，2013年。
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*：RNA-seq数据库从Xue et al.，2013获得。
表6.来自人类重编对抗区域的转录本表达水平(与图1相关联)
RRR的异染色体特征在人类体细胞中得以保全
之后，发明人评估人类RRR是否拥有与鼠RRR相似的异染色质特征。对可公开获取的来自人类成纤维细胞的8种主要的组蛋白修饰的ChIP-seq数据集(Bernstein et al，2012；The Encode Consortium Project，2011)的分析显示，H3K9me3在人类RRR中特异性富集(图1D和图5A)。H3K9me3的富集是RRR所独有的，因为并未在FRR或PRR中观察到类似的富集(图1D和图5A)。类似的分析也显示了H3K9me3在K562红白血病细胞、Hsmm骨骼肌成肌细胞、和Mcf7乳腺癌细胞(图1E和5B)中RRR处的富集，表明H3K9me3在RRR中的富集是体细胞的共同特征。
之后，发明人使用ENCODE项目所生成的数据集，分析了4种不同的体细胞类型的DNaseI超敏性。该分析显示，在所分析的所有人类体细胞类型中，RRR对DNaseI的敏感性显着低于FRR和PRR(图1F和图5C)。与它们的异染色质特征一致，人类RRR的遗传性较之于FRR或PRR是相对差的(图5D)，且富集有特异性重复序列如LINE和LTR，但不富集SINE(图5E)。这些结果共同表明，RRR的异染色质特征、H3K9me3的富集和对DNaseI的可达性降低，是鼠体细胞和人类体细胞所共有的。
实施例2
人类KDM4A mRNA注射改善鼠SCNT胚胎的发育
发明人在已经建立人类RRR富含H3K9me3的概念后，评估移除H3K9me3能否帮助克服人类SCNT胚胎中的重编屏障。发明人先前使用鼠SCNT模型证明，可通过注射编码H3K9me3脱甲基酶KDM4d的mRNA而移除鼠H3K9me3屏障(Matoba et al.，2014)。在移动至人类SCNT模型内之前，假定具有H3K9me3去甲基化酶活性的KDM4家族的多个成员存在于鼠和人类体内(Klose et al，2006；Krishnan and Trievel，2013；Whetstine et al.，2006)，发明人不使用促进SCNT重编的KDM4D，而是评估是否可使用KDM4家族的其它成员如KDM4A。此外，发明人还评估了KDM4家族成员能否跨物种行使职能。
为了这一目的，发明人实施了下述SCNT：在发明人先前研究中的相同过程之后，使用成年雌性鼠的卵丘细胞作为核供体，并将其注射入激活后5小时(hpa)的人类KDM4A mRNA中(图2A)(Matoba et al，2014)。免疫组化染色显示，经注射野生型而非催化性突变体，人类KDM4A mRNA极大降低了鼠SCNT胚胎的细胞核中的H3K9me3水平(图1B)。重要的是，注射KDM4A mRNA极大增加了SCNT胚胎的发育潜力，它们中的90.3％发育至囊胚阶段，这与对照组中26％的囊胚形成率形成鲜明对比(图2C和图2D、表3)。这一极高的囊胚形成效率与在注射KDM4d的鼠SCNT胚胎中的88.6％囊胚形成率类似(Matoba et al，2014)。这些结果令人惊讶地表明，可通过KDM4家族脱甲基酶的任何成员移除重编障碍——体细胞基因组中的H3K9me3，只要该成员具有H3K9me3去甲基化酶活性即可。
表3.KDM4A辅助的鼠SCNT胚胎的植入前发育，与图2相关联
*P＜0.01，与注射水的对照物比较。
KDM4A mRNA注射显着增加人类SCNT胚胎的囊胚形成率
之后，发明人使用优化的SCNT条件，包括使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂——曲古抑菌素A(TSA)，评估了注射KDM4A mRNA还能否帮助克服人类SCNT中的重编障碍(Tachibanaet al.，2013)。考虑到KDM4A辅助SCNT的未来临床应用，发明人使用老年性黄斑变性(AMD)患者的皮肤成纤维细胞(Bressler et al.，1988)作为核供体。
为了再次确认KDM4A对人类SCNT的有益效果，发明人选择先前使用常规IVF过程的尝试中，其卵母细胞未成功发育为扩展囊胚的供体的卵母细胞(Chung et al，2014)。去核后，总计114个从四位卵母细胞供体采集的Mil卵母细胞被通过FfVJ-E融合至供体成纤维细胞。激活后，63个重建的SCNT卵母细胞被注射人类KDM4A mRNA，剩余的(51)用作非注射对照(图2E，表4)。发明人监控这些SCNT胚胎的发育过程，发现两组在形成2细胞胚胎中具有相似的裂解效率(对照：48/51＝94.1％；KDM4A：56/63＝88.9％)(表4)。正如预期，KDM4A mRNA注射并未显示任何对ZGA在8细胞阶段末期完成之前的SCNT胚胎发育率(68.8％vs 71.4％)的有益效果(图2F和表4)。然而，在桑椹胚阶段，该有益效果变得明显(16.7％vs 32.1％)(图2F和表4)。令人惊奇的是，在第6天，26.8％(15/56)的注射KDM4A的胚胎已经成功到达囊胚阶段，而仅4.2％(2/48)的对照胚胎到达囊胚阶段。在第7天，14.3％的注射KDM4A的胚胎发育至扩展囊胚阶段，而对照胚胎无一发育至这一阶段(图2F和2G)。重要的是，在所检查的4位供体中全部观察到了KDM4A的有益效果(图2H)。因此，发明人清楚地证明，KDM4A mRNA注射可改善人类SCNT胚胎的发育潜能，尤其是发育超出ZGA的发育潜能。
表4：KDM4A辅助人类SCNT胚胎的植入前发育，与图2相关联。
*所注射的人类KDM4A mRNA的浓度为1500ng/μl。对照胚胎是未注射的，blast：囊胚，ex-blast：扩张囊胚。
实施例3
源自注射KDM4A的SCNT囊胚的人类ESC的建立和表征
之后，发明人从注射KDM4A的SCNT囊胚获取核转移ESC(NT-ESC)。发明人从注射KDM4A的SCNT胚胎获得总计8个扩展囊胚(图3A和表4)。在移除透明带后，在位于传统ESC衍生介质的辐照鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上培养扩展囊胚。8个囊胚中的7个附着至MEF饲养细胞，并开始自然发展。传代5次后，发明人成功地获得4个稳定的NT-ESC系，分别指定为NTK(KDM4A辅助的NT)-ESC#6至#9(图3A，也名为CHA-NT#6至#9)。
免疫组化染色显示，OCT4、NANOG、SOX2、SSEA-4和TRA1-60全部以与通过IVF获取的对照人类ESC系类似的模式被表达(图3B、图6A和6B)。RNA-seq(图6C)表明，NTK-ESC以与对照ESC类似的水平表达多潜能标记物基因(图3C)。全局转录组的成对比较显示了NTK-ESC与对照ESC之间的高关联性(图3D和图6D)。转录组的分层聚类分析表明，NTK-ESC与对照ESC聚集在一起(图3E)。这些结果暗示，不能在分子水平上区别NTK-ESC与对照ESC。
发明人通过体外分化和体外畸胎瘤检验检查了NTK-ESC的分化能力。在体外培养2周后对拟胚体(EB)的免疫组化染色显示，NTK-ESC能有效地导致全部三层胚层细胞(图3F和图6E)。此外，该NTK-ESC在转移12周内形成含有全部三层胚层细胞的畸胎瘤(图3G和6F)。这些结果表明，该NTK-ESC是多能的。
人类染色体核型分析表明，这些NTK-ESC维持正常数目的染色体，且具有与核供体体细胞相同的预期性染色体对(对于NTK6/7，46、XX for；对于NTK8，46、XY；图3H和S3A)。短串联重复序列(STR)分析表明，处于横跨基因组处的全部16个重复序列标记物在供体体细胞与其衍生的NTK-ESC之间显示完美匹配(图3I和图7B)。线粒体DNA序列分析显示，NTK-ESC的两种SNP精确地匹配卵母细胞SNP供体SNP，但不匹配核供体SNP(图3J和图7C)。这些结果共同体现了我们的SCNT方法的可靠性，且表明，注射KDM4A mRNA改善了SCNT介导的ESC衍生而不破坏所建立的NTK-ESC的多能性或基因组稳定性。
KDM4A促进8细胞SCNT胚胎中RRR的ZGA
KDM4A mRNA注射显着改善ZGA后的hSCNT胚胎发育的事实表明，供体体细胞基因组中的H3K9me3确实作为人类SCNT胚胎中ZGA的屏障而起作用。为了确认何种程度的KDM4AmRNA注射能克服SCNT胚胎中的ZGA缺陷，发明人实施了进行或不进行KDM4A注射的8细胞SCNT胚胎的RNA-seq。比较性转录组分析表明，318个RRR中的多达50％(158个)通过KDM4AmRNA注射而得以明显上调(图4A，FC＞2)，表明清除H3K9me3可至少部分地促进SCNT胚胎中的ZGA。
为了鉴别可能有助于解释注射KDM4A的SCNT胚胎的发育改善的基因，发明人关注对所鉴别基因的分析。206个基因(表7)的表达通过KDM4A注射得以显着上调(FPKM＞5，FC＞2)。基因本体分析显示，这些基因被富集用于转录调节、核糖体生物合成和RNA加工(图4B)，暗示这些在重要发育机制的调节异常可能是SCNT胚胎发育停止的肇因。尽管该206个基因中的大多数在胚胎植入前发育中的功能目前仍未知，但已知它们中的两个——UBTFL1和THOC5(图4C)——为鼠的胚胎植入前正常发育所需(Wang et al.，2013；Yamada et al.，2009)。因此，这些基因的不完美激活是人类SCNT胚胎发育极差的至少部分原因。
表7：KDM4A应答ZGA基因的表达水平(与图4相关联)
实施例5
在数十年的尝试之后，近来最终获得了人类NT-ESC(Chung et al.，2014；Tachibana et al.，2013；Yamada et al.，2014)。这些进展主要是由于对SCNT获取条件的优化。但是，表观遗传重编中的造成人类SCNT胚胎发育停止的本征缺陷尚未被认定。本文中，发明人证明，体细胞基因组中的H3K9me3是人类SCNT重编的屏障。借由过表达H3K9me3脱甲基酶KDM4A而移除这一屏障，促进ZGA时的转录重编，从而令人类SCNT胚胎更有效地发育为一般囊胚，发明人自此成功地建立了多个AMD患者特异性NT-ESC系而不破坏基因组稳定性或多能性。因此，发明人证明了H3K9me3是通过SCNT重编人类体细胞时的一般重编屏障，但还建立了改善克隆效率的实用方法。
已经众所周知，不同人类卵母细胞供体之间，卵母细胞支持SCNT胚胎发育的能力不同。事实上，仅在使用一小组女性捐赠的高质量卵母细胞作为接纳体时，可获得人类NT-ESC(Chung et al.，2014；Tachibana et al，2013；Yamada et al.，2014)，但对卵母细胞质量的依赖性的原因仍是未知。一贯地，即使在已经被报导提升囊胚形成(Tachibana etal.，2013)的TSA的存在下，四位供体中仅一位(ID#58)的卵母细胞在不进行KDM4A mRNA注射下支持SCNT囊胚形成(图2H和表4)。相比之下，当注射KDM4A mRNA时，所测试的4位供体的卵母细胞全部支持囊胚形成，表示KDM4A可克服供体变化问题。无论KDM4A能否改善IVF胚胎发育仍待确定。
尽管通过注射KDM4A mRNA显着且一贯地改善了人类SCNT胚胎达到囊胚阶段的发育潜力，但改善程度不如鼠中剧烈(鼠的90％vs.人类的27％)。甚至在源自一次排卵的相同批次的卵母细胞之间，人类卵母细胞的物种差异及/或质量仍可能变化极大，即使通过IVF，它们之中仍仅有一部分具有支持发育至囊胚阶段的能力，其成功率在15％至60％之间变化(Shapiro et al.，2002；Stone et al，2014)。这与鼠IVF形成鲜明对比，在鼠IVF中，超过90％的胚胎可发育至囊胚阶段。因此，令人惊奇的是，即便是与鼠卵母细胞相比质量较低的人类卵母细胞，仍通过注射KDM4A改善了SCNT效率。用于该实验的一些人类卵母细胞可能会不支持即使通过IVF进行的囊胚形成。
除了证明KDM4A在改善人类SCNT效率和NT-ESC获取中的效能之外，另一重要发现是，KDM4A可促进人类SCNT重编。考虑到人类KDM4A可在鼠SCNT胚胎内行使职能以实现与KDM4d类似的效果，发明人已经证明，KDM4家族的所有成员均可用来促进hSCNT，只要它们拥有H3K9me3去甲基化酶活性即可。
总之，发明人在本文中已经演示了改善的KDM4辅助人类SCNT方法。使用这一方法，发明人已经从成年AMD患者细胞获取了人类囊胚，并随后建立了多个具有与供体患者完全一致的基因组的NT-ESC(NTK-ESC)。这提供了独特且重要的细胞来源，该细胞用于理解AMD以及用于AMD治疗的治疗性药物筛查。考虑到相同的策略可用于其它人类疾病的研究中，发明人已经证明了一种用于生成患者特异性NT-ESC的新方法，其将对人类治疗学产生普遍冲击。此外，由于hSCNT允许以接纳体卵母细胞线粒体替换体细胞线粒体，如本文中所证明(图3H至3J和图7)，本文中揭示的方法、组合物和试剂盒提供治疗线粒体DNA相关疾病的机会。事实上，近期的研究表明，可通过SCNT替代mtDNA而修正由mtDNA突变造成的代谢综合征表型(Ma et al.，2015)。因此，本文中揭露的KDM4辅助SCNT方法也可用于mtDNA替代疗法。
参考文献
本文中揭露的参考文献通过引用而以其整体并入本文。
Chung，Y.，Klimanskaya，I.，Becker，S.，Li，T.，Maserati，M.，Lu，S.J.，Zdravkovic，T.，Ilic，D.，Genbacev，O.，Fisher，S.，et al.(2008).Human Embryonic StemCell Lines Generated without Embryo Destruction.Cell Stem Cell 2，113-117.
Matoba，S.，Liu，Y.，Lu，F.，Iwabuchi，K.A.，Shen，L.，Inoue，A.，and Zhang，Y.(2014).Embryonic Development following Somatic Cell Nuclear Transfer Impededby Persisting Histone Methylation.Cell 159，884-895.
Bernstein，B.E.，Birney，E.，Dunham，I.，Green，E.D.，Gunter，C，and Snyder，M.(2012).An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.Nature489，57-74.
Chung，Y.G.，Eum，J.H.，Lee，J.E.，Shim，S.H.，Sepilian，V.，Hong，S.W.，Lee，Y.，Treff，N.R.，Choi，Y.H.，Kimbrel，E.a，et al.(2014).Human Somatic Cell NuclearTransfer Using Adult Cells.Cell Stem Cell 14，777-780.
French，A.J.，Adams，C.a，Anderson，L.S.，Kitchen，J.R.，Hughes，M.R.，andWood，S.H.(2008).Development of human cloned blastocysts following somaticcell nuclear transfer with adult fibroblasts.Stem Cells 26，485-493.
Gurdon，J.B.(1962).The developmental capacity of nuclei taken fromintestinal epithelium cells of feeding tadpoles.J.Embryol.Exp.Morphol.10，622-640.
Hochedlinger，K.，and Jaenisch，R.(2003).Nuclear transplantation，embryonic stem cells，and the potential for cell therapy.N.Engl.J.Med.349，275-286.
Klose，R.J.，Yamane，K.，Bae，Y.，Zhang，D.，Erdjument-Bromage，H.，Tempst，P.，Wong，J.，and Zhang，Y.(2006).The transcriptional repressor JHDM3A demethylatestrimethyl histone H3 lysine 9 and lysine 36.Nature 442，312-316。
Krishnan，S.，and Trievel，R.C.(2013).Structural and functional analysisof JMJD2D reveals molecular basis for site-specific demethylation among JMJD2demethylases.Structure 21，98-108.
Ma，H.，Folmes，C.D.L.，Wu，J.，Morey，R，Mora-Castilla，S.，Ocampo，A.，Ma，L.，Poulton，J.，Wang，X.，Ahmed，R.，et al.(2015).Metabolic rescue in pluripotentcells from patients with mtDNA disease.Nature.
Matoba，S.，Liu，Y.，Lu，F.，Iwabuchi，K.A.，Shen，L.，Inoue，A.，and Zhang，Y.(2014).Embryonic Development following Somatic Cell Nuclear Transfer Impededby Persisting Histone Methylation.Cell 159，884-895.
Niakan，K.K.，Han，J.，Pedersen，R.A.，Simon，C，and Pera，R.A.R.(2012).Humanpre-implantation embryo development.Development 841，829-841.
Noggle，S.，Fung，H.-L.，Gore，A.，Martinez，H.，Satriani，K.C.，Prosser，R，Oum，K.，Paull，D.，Druckenmiller，S.，Freeby，M.，et al.(2011).Human oocytes reprogramsomatic cells to a pluripotent state.Nature 478，70-75.
Rodriguez-Osorio，N.，Urrego，R.，Cibelli，J.B.，Eilertsen，K.，and Memili，E.(2012).Reprogramming mammalian somatic cells.Theriogenology 78，1869-1886.
Shapiro，B.S.，Richter，K.S.，Harris，D.C.，and Daneshmand，S.T.(2002).Implantation and pregnancy rates are higher for oocyte donor cycles afterblastocyst-stage embryo transfer.Fertil.Steril.77，1296-1297.
Simerly，C，Dominko，T.，Navara，C，Payne，C，Capuano，S.，Gosman，G.，Chong，K.，Takahashi，D.，Chace，C，Compton，D.，et al.(2003).Molecular correlates of primatenuclear transfer failures.Science(80-.).300，297.
Stone，B.a.，March，CM.，Ringler，G.E.，Baek，K.J.，and Marrs，R.P.(2014).Casting for determinants ofblastocyst yield and of rates ofimplantation andof pregnancy after blastocyst transfers.Fertil.Steril.102，1055-1064.
Tachibana，M.，Amato，P.，Sparman，M.，Gutierrez，N.M.，Tippner-Hedges，R.，Ma，H.，Kang，E.，Fulati，A.，Lee，H.-S.，Sritanaudomchai，H.，et al.(2013).Humanembryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer.Cell 153，1228-1238.
The Encode Consortium Project(2011).A user′s guide to theencyclopedia of DNA elements(ENCODE).PLoS Biol.9，e1001046.
Wakayama，T.，Tabar，V.，Rodriguez，I.，Perry，a C，Studer，L.，and Mombaerts，P.(2001).Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adultsomatic cells by nuclear transfer.Science 292，740-743.
Wang，L.，Miao，Y.L.，Zheng，X.，Lackford，B.，Zhou，B.，Han，L.，Yao，C，Ward，J.M.，Burkholder，A.，Lipchina，I.，et al.(2013).The THO complex regulatespluripotency gene mRNA export and controls embryonic stem cell self-renewaland somatic cell reprogramming.Cell Stem Cell 13，676-690.
Whetstine，J.R.，Nottke，A.，Lan，F.，Huarte，M.，Smolikov，S.，Chen，Z.，Spooner，E.，Li，E.，Zhang，G.，Colaiacovo，M.，et al.(2006).Reversal of histonelysine trimethylation by the JMJD2 family of histone demethylases.Cell 125，467-481.
Xue，Z.，Huang，K.，Cai，C，Cai，L.，Jiang，C，Feng，Y.，Liu，Z.，Zeng，Q.，Cheng，L.，Sun，Y.E.，et al.(2013).Genetic programs in human and mouse early embryosrevealed by single-cell RNA sequencing.Nature 500，593-597.
Yamada，M.，Hamatani，T.，Akutsu，H.，Chikazawa，N.，Kuji，N.，Yoshimura，Y.，andUmezawa，A.(2009).Involvement of a novel preimplantation-specific geneencoding the high mobility group box protein Hmgpi in early embryonicdevelopment.Hum.Mol.Genet.19，480-493.
Yamada，M.，Johannesson，B.，Sagi，I.，Burnett，L.C.，Kort，D.H.，Prosser，R.W.，Paull，D.，Nestor，M.W.，Freeby，M.，Greenberg，E.，et al.(2014).Human oocytesreprogram adult somatic huclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotentstem cells.Nature 510，533-536.
Yang，X.，Smith，S.L.，Tian，X.C.，Lewin，H.A.，Renard，J.，and Wakayama，T.(2007).Nuclear reprogramming of cloned embryos and its implications fortherapeutic cloning.Nat.Genet.39，295-302.
序列表
<110> 盛光医学基金会 儿童医学中心公司
<120> 通过移除组蛋白H3-赖氨酸三甲基化增加人类体细胞核转移(SCNT)效率，以及增加人类NT-ESC衍生物的方法和组合物
<130> 701039-085852-PCT
<140>
<141>
<150> 62/242,050
<151> 2015-10-15
<150> 62/239,318
<151> 2015-10-09
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4526
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
acggctgcgc agatgccgac tttagaggag gcggagtttc ggccttcgcc tgctggaaaa 60
gcagtaggat cggccagtgg cgacagcagg agctgagcct aagccctggc ggggctttgg 120
gctgtagatt cctgtctgac taaagggacc tcaaaaagga gggaaaatgg cttctgagtc 180
tgaaactctg aatcccagtg ctaggataat gaccttttat ccaactatgg aagagttccg 240
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caaggttgtt cctccaaaag agtggaagcc acgagcatcc tatgatgaca ttgatgattt 360
ggtcattcct gcccccattc aacagctggt gacggggcag tctggcctct ttactcagta 420
caacatacag aagaaagcca tgactgttcg agagttccgc aagatagcca atagcgataa 480
gtactgtacc ccacgctata gtgagtttga agagctcgag cggaaatact ggaaaaatct 540
tacattcaat cctccaatct atggtgcaga tgtgaatggt accctctatg aaaagcatgt 600
tgatgagtgg aatattggcc ggctgagaac aatcctggac ttggtggaaa aggagagtgg 660
gatcaccatt gagggtgtga acaccccata cctgtacttt ggcatgtgga agacatcctt 720
tgcttggcac actgaagaca tggacctcta cagcatcaac tacctgcact ttggagaacc 780
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<210> 4
<211> 1572
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
atggaaacta tgaagtctaa ggccaactgt gcccagaatc caaattgtaa cataatgata 60
tttcatccaa ccaaagaaga gtttaatgat tttgataaat atattgctta catggaatcc 120
caaggtgcac acagagctgg cttggctaag ataattccac ccaaagaatg gaaagccaga 180
gagacctatg ataatatcag tgaaatctta atagccactc ccctccagca ggtggcctct 240
gggcgggcag gggtgtttac tcaataccat aaaaaaaaga aagccatgac tgtgggggag 300
tatcgccatt tggcaaacag taaaaaatat cagactccac cacaccagaa tttcgaagat 360
ttggagcgaa aatactggaa gaaccgcatc tataattcac cgatttatgg tgctgacatc 420
agtggctcct tgtttgatga aaacactaaa caatggaatc ttgggcacct gggaacaatt 480
caggacctgc tggaaaagga atgtggggtt gtcatagaag gcgtcaatac accctacttg 540
tactttggca tgtggaaaac cacgtttgct tggcatacag aggacatgga cctttacagc 600
atcaactacc tgcaccttgg ggagcccaaa acttggtatg tggtgccccc agaacatggc 660
cagcgcctgg aacgcctggc cagggagctc ttcccaggca gttcccgggg ttgtggggcc 720
ttcctgcggc acaaggtggc cctcatctcg cctacagttc tcaaggaaaa tgggattccc 780
ttcaatcgca taactcagga ggctggagag ttcatggtga cctttcccta tggctaccat 840
gctggcttca accatggttt caactgcgca gaggccatca attttgccac tccgcgatgg 900
attgattatg gcaaaatggc ctcccagtgt agctgtgggg aggcaagggt gaccttttcc 960
atggatgcct tcgtgcgcat cctgcaacct gaacgctatg acctgtggaa acgtgggcaa 1020
gaccgggcag ttgtggacca catggagccc agggtaccag ccagccaaga gctgagcacc 1080
cagaaggaag tccagttacc caggagagca gcgctgggcc tgagacaact cccttcccac 1140
tgggcccggc attccccttg gcctatggct gcccgcagtg ggacacggtg ccacaccctt 1200
gtgtgctctt cactcccacg ccgatctgca gttagtggca ctgctacgca gccccgggct 1260
gctgctgtcc acagctctaa gaagcccagc tcaactccat catccacccc tggtccatct 1320
gcacagatta tccacccgtc aaatggcaga cgtggtcgtg gtcgccctcc tcagaaactg 1380
agagctcagg agctgaccct ccagactcca gccaagaggc ccctcttggc gggcacaaca 1440
tgcacagctt cgggcccaga acctgagccc ctacctgagg atggggcttt gatggacaag 1500
cctgtaccac tgagcccagg gctccagcat cctgtcaagg cttctgggtg cagctgggcc 1560
cctgtgccct aa 1572
<210> 5
<211> 412
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Ala Glu Asn Leu Lys Gly Cys Ser Val Cys Cys Lys Ser Ser Trp
1 5 10 15
Asn Gln Leu Gln Asp Leu Cys Arg Leu Ala Lys Leu Ser Cys Pro Ala
20 25 30
Leu Gly Ile Ser Lys Arg Asn Leu Tyr Asp Phe Glu Val Glu Tyr Leu
35 40 45
Cys Asp Tyr Lys Lys Ile Arg Glu Gln Glu Tyr Tyr Leu Val Lys Trp
50 55 60
Arg Gly Tyr Pro Asp Ser Glu Ser Thr Trp Glu Pro Arg Gln Asn Leu
65 70 75 80
Lys Cys Val Arg Ile Leu Lys Gln Phe His Lys Asp Leu Glu Arg Glu
85 90 95
Leu Leu Arg Arg His His Arg Ser Lys Thr Pro Arg His Leu Asp Pro
100 105 110
Ser Leu Ala Asn Tyr Leu Val Gln Lys Ala Lys Gln Arg Arg Ala Leu
115 120 125
Arg Arg Trp Glu Gln Glu Leu Asn Ala Lys Arg Ser His Leu Gly Arg
130 135 140
Ile Thr Val Glu Asn Glu Val Asp Leu Asp Gly Pro Pro Arg Ala Phe
145 150 155 160
Val Tyr Ile Asn Glu Tyr Arg Val Gly Glu Gly Ile Thr Leu Asn Gln
165 170 175
Val Ala Val Gly Cys Glu Cys Gln Asp Cys Leu Trp Ala Pro Thr Gly
180 185 190
Gly Cys Cys Pro Gly Ala Ser Leu His Lys Phe Ala Tyr Asn Asp Gln
195 200 205
Gly Gln Val Arg Leu Arg Ala Gly Leu Pro Ile Tyr Glu Cys Asn Ser
210 215 220
Arg Cys Arg Cys Gly Tyr Asp Cys Pro Asn Arg Val Val Gln Lys Gly
225 230 235 240
Ile Arg Tyr Asp Leu Cys Ile Phe Arg Thr Asp Asp Gly Arg Gly Trp
245 250 255
Gly Val Arg Thr Leu Glu Lys Ile Arg Lys Asn Ser Phe Val Met Glu
260 265 270
Tyr Val Gly Glu Ile Ile Thr Ser Glu Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln
275 280 285
Ile Tyr Asp Arg Gln Gly Ala Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Val
290 295 300
Glu Asp Val Tyr Thr Val Asp Ala Ala Tyr Tyr Gly Asn Ile Ser His
305 310 315 320
Phe Val Asn His Ser Cys Asp Pro Asn Leu Gln Val Tyr Asn Val Phe
325 330 335
Ile Asp Asn Leu Asp Glu Arg Leu Pro Arg Ile Ala Phe Phe Ala Thr
340 345 350
Arg Thr Ile Arg Ala Gly Glu Glu Leu Thr Phe Asp Tyr Asn Met Gln
355 360 365
Val Asp Pro Val Asp Met Glu Ser Thr Arg Met Asp Ser Asn Phe Gly
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Pro Gly Ser Pro Lys Lys Arg Val Arg Ile Glu Cys
385 390 395 400
Lys Cys Gly Thr Glu Ser Cys Arg Lys Tyr Leu Phe
405 410
<210> 6
<211> 350
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Glu Tyr Tyr Leu Val Lys Trp Lys Gly Trp Pro Asp Ser Thr Asn
1 5 10 15
Thr Trp Glu Pro Leu Gln Asn Leu Lys Cys Pro Leu Leu Leu Gln Gln
20 25 30
Phe Ser Asn Asp Lys His Asn Tyr Leu Ser Gln Val Lys Lys Gly Lys
35 40 45
Ala Ile Thr Pro Lys Asp Asn Asn Lys Thr Leu Lys Pro Ala Ile Ala
50 55 60
Glu Tyr Ile Val Lys Lys Ala Lys Gln Arg Ile Ala Leu Gln Arg Trp
65 70 75 80
Gln Asp Glu Leu Asn Arg Arg Lys Asn His Lys Gly Met Ile Phe Val
85 90 95
Glu Asn Thr Val Asp Leu Glu Gly Pro Pro Ser Asp Phe Tyr Tyr Ile
100 105 110
Asn Glu Tyr Lys Pro Ala Pro Gly Ile Ser Leu Val Asn Glu Ala Thr
115 120 125
Phe Gly Cys Ser Cys Thr Asp Cys Phe Phe Gln Lys Cys Cys Pro Ala
130 135 140
Glu Ala Gly Val Leu Leu Ala Tyr Asn Lys Asn Gln Gln Ile Lys Ile
145 150 155 160
Pro Pro Gly Thr Pro Ile Tyr Glu Cys Asn Ser Arg Cys Gln Cys Gly
165 170 175
Pro Asp Cys Pro Asn Arg Ile Val Gln Lys Gly Thr Gln Tyr Ser Leu
180 185 190
Cys Ile Phe Arg Thr Ser Asn Gly Arg Gly Trp Gly Val Lys Thr Leu
195 200 205
Val Lys Ile Lys Arg Met Ser Phe Val Met Glu Tyr Val Gly Glu Val
210 215 220
Ile Thr Ser Glu Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln Phe Tyr Asp Asn Lys
225 230 235 240
Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr
245 250 255
Val Asp Ala Ala Arg Tyr Gly Asn Val Ser His Phe Val Asn His Ser
260 265 270
Cys Asp Pro Asn Leu Gln Val Phe Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp
275 280 285
Thr Arg Leu Pro Arg Ile Ala Leu Phe Ser Thr Arg Thr Ile Asn Ala
290 295 300
Gly Glu Glu Leu Thr Phe Asp Tyr Gln Met Lys Gly Ser Gly Asp Ile
305 310 315 320
Ser Ser Asp Ser Ile Asp His Ser Pro Ala Lys Lys Arg Val Arg Thr
325 330 335
Val Cys Lys Cys Gly Ala Val Thr Cys Arg Gly Tyr Leu Asn
340 345 350
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 7
gaaacgaguc cguauugaat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 8
uucaauacgg acucguuuct t 21
<210> 9
<211> 1064
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Ala Ser Glu Ser Glu Thr Leu Asn Pro Ser Ala Arg Ile Met Thr
1 5 10 15
Phe Tyr Pro Thr Met Glu Glu Phe Arg Asn Phe Ser Arg Tyr Ile Ala
20 25 30
Tyr Ile Glu Ser Gln Gly Ala His Arg Ala Gly Leu Ala Lys Val Val
35 40 45
Pro Pro Lys Glu Trp Lys Pro Arg Ala Ser Tyr Asp Asp Ile Asp Asp
50 55 60
Leu Val Ile Pro Ala Pro Ile Gln Gln Leu Val Thr Gly Gln Ser Gly
65 70 75 80
Leu Phe Thr Gln Tyr Asn Ile Gln Lys Lys Ala Met Thr Val Arg Glu
85 90 95
Phe Arg Lys Ile Ala Asn Ser Asp Lys Tyr Cys Thr Pro Arg Tyr Ser
100 105 110
Glu Phe Glu Glu Leu Glu Arg Lys Tyr Trp Lys Asn Leu Thr Phe Asn
115 120 125
Pro Pro Ile Tyr Gly Ala Asp Val Asn Gly Thr Leu Tyr Glu Lys His
130 135 140
Val Asp Glu Trp Asn Ile Gly Arg Leu Arg Thr Ile Leu Asp Leu Val
145 150 155 160
Glu Lys Glu Ser Gly Ile Thr Ile Glu Gly Val Asn Thr Pro Tyr Leu
165 170 175
Tyr Phe Gly Met Trp Lys Thr Ser Phe Ala Trp His Thr Glu Asp Met
180 185 190
Asp Leu Tyr Ser Ile Asn Tyr Leu His Phe Gly Glu Pro Lys Ser Trp
195 200 205
Tyr Ser Val Pro Pro Glu His Gly Lys Arg Leu Glu Arg Leu Ala Lys
210 215 220
Gly Phe Phe Pro Gly Ser Ala Gln Ser Cys Glu Ala Phe Leu Arg His
225 230 235 240
Lys Met Thr Leu Ile Ser Pro Leu Met Leu Lys Lys Tyr Gly Ile Pro
245 250 255
Phe Asp Lys Val Thr Gln Glu Ala Gly Glu Phe Met Ile Thr Phe Pro
260 265 270
Tyr Gly Tyr His Ala Gly Phe Asn His Gly Phe Asn Cys Ala Glu Ser
275 280 285
Thr Asn Phe Ala Thr Arg Arg Trp Ile Glu Tyr Gly Lys Gln Ala Val
290 295 300
Leu Cys Ser Cys Arg Lys Asp Met Val Lys Ile Ser Met Asp Val Phe
305 310 315 320
Val Arg Lys Phe Gln Pro Glu Arg Tyr Lys Leu Trp Lys Ala Gly Lys
325 330 335
Asp Asn Thr Val Ile Asp His Thr Leu Pro Thr Pro Glu Ala Ala Glu
340 345 350
Phe Leu Lys Glu Ser Glu Leu Pro Pro Arg Ala Gly Asn Glu Glu Glu
355 360 365
Cys Pro Glu Glu Asp Met Glu Gly Val Glu Asp Gly Glu Glu Gly Asp
370 375 380
Leu Lys Thr Ser Leu Ala Lys His Arg Ile Gly Thr Lys Arg His Arg
385 390 395 400
Val Cys Leu Glu Ile Pro Gln Glu Val Ser Gln Ser Glu Leu Phe Pro
405 410 415
Lys Glu Asp Leu Ser Ser Glu Gln Tyr Glu Met Thr Glu Cys Pro Ala
420 425 430
Ala Leu Ala Pro Val Arg Pro Thr His Ser Ser Val Arg Gln Val Glu
435 440 445
Asp Gly Leu Thr Phe Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Thr Glu Val Lys Phe
450 455 460
Glu Glu Leu Lys Asn Val Lys Leu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu
465 470 475 480
Gln Ala Ala Ala Ala Leu Asp Leu Ser Val Asn Pro Ala Ser Val Gly
485 490 495
Gly Arg Leu Val Phe Ser Gly Ser Lys Lys Lys Ser Ser Ser Ser Leu
500 505 510
Gly Ser Gly Ser Ser Arg Asp Ser Ile Ser Ser Asp Ser Glu Thr Ser
515 520 525
Glu Pro Leu Ser Cys Arg Ala Gln Gly Gln Thr Gly Val Leu Thr Val
530 535 540
His Ser Tyr Ala Lys Gly Asp Gly Arg Val Thr Val Gly Glu Pro Cys
545 550 555 560
Thr Arg Lys Lys Gly Ser Ala Ala Arg Ser Phe Ser Glu Arg Glu Leu
565 570 575
Ala Glu Val Ala Asp Glu Tyr Met Phe Ser Leu Glu Glu Asn Lys Lys
580 585 590
Ser Lys Gly Arg Arg Gln Pro Leu Ser Lys Leu Pro Arg His His Pro
595 600 605
Leu Val Leu Gln Glu Cys Val Ser Asp Asp Glu Thr Ser Glu Gln Leu
610 615 620
Thr Pro Glu Glu Glu Ala Glu Glu Thr Glu Ala Trp Ala Lys Pro Leu
625 630 635 640
Ser Gln Leu Trp Gln Asn Arg Pro Pro Asn Phe Glu Ala Glu Lys Glu
645 650 655
Phe Asn Glu Thr Met Ala Gln Gln Ala Pro His Cys Ala Val Cys Met
660 665 670
Ile Phe Gln Thr Tyr His Gln Val Glu Phe Gly Gly Phe Asn Gln Asn
675 680 685
Cys Gly Asn Ala Ser Asp Leu Ala Pro Gln Lys Gln Arg Thr Lys Pro
690 695 700
Leu Ile Pro Glu Met Cys Phe Thr Ser Thr Gly Cys Ser Thr Asp Ile
705 710 715 720
Asn Leu Ser Thr Pro Tyr Leu Glu Glu Asp Gly Thr Ser Ile Leu Val
725 730 735
Ser Cys Lys Lys Cys Ser Val Arg Val His Ala Ser Cys Tyr Gly Val
740 745 750
Pro Pro Ala Lys Ala Ser Glu Asp Trp Met Cys Ser Arg Cys Ser Ala
755 760 765
Asn Ala Leu Glu Glu Asp Cys Cys Leu Cys Ser Leu Arg Gly Gly Ala
770 775 780
Leu Gln Arg Ala Asn Asp Asp Arg Trp Val His Val Ser Cys Ala Val
785 790 795 800
Ala Ile Leu Glu Ala Arg Phe Val Asn Ile Ala Glu Arg Ser Pro Val
805 810 815
Asp Val Ser Lys Ile Pro Leu Pro Arg Phe Lys Leu Lys Cys Ile Phe
820 825 830
Cys Lys Lys Arg Arg Lys Arg Thr Ala Gly Cys Cys Val Gln Cys Ser
835 840 845
His Gly Arg Cys Pro Thr Ala Phe His Val Ser Cys Ala Gln Ala Ala
850 855 860
Gly Val Met Met Gln Pro Asp Asp Trp Pro Phe Val Val Phe Ile Thr
865 870 875 880
Cys Phe Arg His Lys Ile Pro Asn Leu Glu Arg Ala Lys Gly Ala Leu
885 890 895
Gln Ser Ile Thr Ala Gly Gln Lys Val Ile Ser Lys His Lys Asn Gly
900 905 910
Arg Phe Tyr Gln Cys Glu Val Val Arg Leu Thr Thr Glu Thr Phe Tyr
915 920 925
Glu Val Asn Phe Asp Asp Gly Ser Phe Ser Asp Asn Leu Tyr Pro Glu
930 935 940
Asp Ile Val Ser Gln Asp Cys Leu Gln Phe Gly Pro Pro Ala Glu Gly
945 950 955 960
Glu Val Val Gln Val Arg Trp Thr Asp Gly Gln Val Tyr Gly Ala Lys
965 970 975
Phe Val Ala Ser His Pro Ile Gln Met Tyr Gln Val Glu Phe Glu Asp
980 985 990
Gly Ser Gln Leu Val Val Lys Arg Asp Asp Val Tyr Thr Leu Asp Glu
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Glu Leu Pro Lys Arg Val Lys Ser Arg Leu Ser Val Ala Ser Asp
1010 1015 1020
Met Arg Phe Asn Glu Ile Phe Thr Glu Lys Glu Val Lys Gln Glu
1025 1030 1035
Lys Lys Arg Gln Arg Val Ile Asn Ser Arg Tyr Arg Glu Asp Tyr
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<210> 10
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Gly Ser Glu Asp His Gly Ala Gln Asn Pro Ser Cys Lys Ile Met
1 5 10 15
Thr Phe Arg Pro Thr Met Glu Glu Phe Lys Asp Phe Asn Lys Tyr Val
20 25 30
Ala Tyr Ile Glu Ser Gln Gly Ala His Arg Ala Gly Leu Ala Lys Ile
35 40 45
Ile Pro Pro Lys Glu Trp Lys Pro Arg Gln Thr Tyr Asp Asp Ile Asp
50 55 60
Asp Val Val Ile Pro Ala Pro Ile Gln Gln Val Val Thr Gly Gln Ser
65 70 75 80
Gly Leu Phe Thr Gln Tyr Asn Ile Gln Lys Lys Ala Met Thr Val Gly
85 90 95
Glu Tyr Arg Arg Leu Ala Asn Ser Glu Lys Tyr Cys Thr Pro Arg His
100 105 110
Gln Asp Phe Asp Asp Leu Glu Arg Lys Tyr Trp Lys Asn Leu Thr Phe
115 120 125
Val Ser Pro Ile Tyr Gly Ala Asp Ile Ser Gly Ser Leu Tyr Asp Asp
130 135 140
Asp Val Ala Gln Trp Asn Ile Gly Ser Leu Arg Thr Ile Leu Asp Met
145 150 155 160
Val Glu Arg Glu Cys Gly Thr Ile Ile Glu Gly Val Asn Thr Pro Tyr
165 170 175
Leu Tyr Phe Gly Met Trp Lys Thr Thr Phe Ala Trp His Thr Glu Asp
180 185 190
Met Asp Leu Tyr Ser Ile Asn Tyr Leu His Phe Gly Glu Pro Lys Ser
195 200 205
Trp Tyr Ala Ile Pro Pro Glu His Gly Lys Arg Leu Glu Arg Leu Ala
210 215 220
Ile Gly Phe Phe Pro Gly Ser Ser Gln Gly Cys Asp Ala Phe Leu Arg
225 230 235 240
His Lys Met Thr Leu Ile Ser Pro Ile Ile Leu Lys Lys Tyr Gly Ile
245 250 255
Pro Phe Ser Arg Ile Thr Gln Glu Ala Gly Glu Phe Met Ile Thr Phe
260 265 270
Pro Tyr Gly Tyr His Ala Gly Phe Asn His Gly Phe Asn Cys Ala Glu
275 280 285
Ser Thr Asn Phe Ala Thr Leu Arg Trp Ile Asp Tyr Gly Lys Val Ala
290 295 300
Thr Gln Cys Thr Cys Arg Lys Asp Met Val Lys Ile Ser Met Asp Val
305 310 315 320
Phe Val Arg Ile Leu Gln Pro Glu Arg Tyr Glu Leu Trp Lys Gln Gly
325 330 335
Lys Asp Leu Thr Val Leu Asp His Thr Arg Pro Thr Ala Leu Thr Ser
340 345 350
Pro Glu Leu Ser Ser Trp Ser Ala Ser Arg Ala Ser Leu Lys Ala Lys
355 360 365
Leu Leu Arg Arg Ser His Arg Lys Arg Ser Gln Pro Lys Lys Pro Lys
370 375 380
Pro Glu Asp Pro Lys Phe Pro Gly Glu Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu
385 390 395 400
Leu Glu Glu Ala Gly Gly Ser Val Lys Glu Glu Ala Gly Pro Glu Val
405 410 415
Asp Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gln Pro Leu Pro His Gly Arg
420 425 430
Glu Ala Glu Gly Ala Glu Glu Asp Gly Arg Gly Lys Leu Arg Pro Thr
435 440 445
Lys Ala Lys Ser Glu Arg Lys Lys Lys Ser Phe Gly Leu Leu Pro Pro
450 455 460
Gln Leu Pro Pro Pro Pro Ala His Phe Pro Ser Glu Glu Ala Leu Trp
465 470 475 480
Leu Pro Ser Pro Leu Glu Pro Pro Val Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala
485 490 495
Met Glu Glu Ser Pro Leu Pro Ala Pro Leu Asn Val Val Pro Pro Glu
500 505 510
Val Pro Ser Glu Glu Leu Glu Ala Lys Pro Arg Pro Ile Ile Pro Met
515 520 525
Leu Tyr Val Val Pro Arg Pro Gly Lys Ala Ala Phe Asn Gln Glu His
530 535 540
Val Ser Cys Gln Gln Ala Phe Glu His Phe Ala Gln Lys Gly Pro Thr
545 550 555 560
Trp Lys Glu Pro Val Ser Pro Met Glu Leu Thr Gly Pro Glu Asp Gly
565 570 575
Ala Ala Ser Ser Gly Ala Gly Arg Met Glu Thr Lys Ala Arg Ala Gly
580 585 590
Glu Gly Gln Ala Pro Ser Thr Phe Ser Lys Leu Lys Met Glu Ile Lys
595 600 605
Lys Ser Arg Arg His Pro Leu Gly Arg Pro Pro Thr Arg Ser Pro Leu
610 615 620
Ser Val Val Lys Gln Glu Ala Ser Ser Asp Glu Glu Ala Ser Pro Phe
625 630 635 640
Ser Gly Glu Glu Asp Val Ser Asp Pro Asp Ala Leu Arg Pro Leu Leu
645 650 655
Ser Leu Gln Trp Lys Asn Arg Ala Ala Ser Phe Gln Ala Glu Arg Lys
660 665 670
Phe Asn Ala Ala Ala Ala Arg Thr Glu Pro Tyr Cys Ala Ile Cys Thr
675 680 685
Leu Phe Tyr Pro Tyr Cys Gln Ala Leu Gln Thr Glu Lys Glu Ala Pro
690 695 700
Ile Ala Ser Leu Gly Glu Gly Cys Pro Ala Thr Leu Pro Ser Lys Ser
705 710 715 720
Arg Gln Lys Thr Arg Pro Leu Ile Pro Glu Met Cys Phe Thr Ser Gly
725 730 735
Gly Glu Asn Thr Glu Pro Leu Pro Ala Asn Ser Tyr Ile Gly Asp Asp
740 745 750
Gly Thr Ser Pro Leu Ile Ala Cys Gly Lys Cys Cys Leu Gln Val His
755 760 765
Ala Ser Cys Tyr Gly Ile Arg Pro Glu Leu Val Asn Glu Gly Trp Thr
770 775 780
Cys Ser Arg Cys Ala Ala His Ala Trp Thr Ala Glu Cys Cys Leu Cys
785 790 795 800
Asn Leu Arg Gly Gly Ala Leu Gln Met Thr Thr Asp Arg Arg Trp Ile
805 810 815
His Val Ile Cys Ala Ile Ala Val Pro Glu Ala Arg Phe Leu Asn Val
820 825 830
Ile Glu Arg His Pro Val Asp Ile Ser Ala Ile Pro Glu Gln Arg Trp
835 840 845
Lys Leu Lys Cys Val Tyr Cys Arg Lys Arg Met Lys Lys Val Ser Gly
850 855 860
Ala Cys Ile Gln Cys Ser Tyr Glu His Cys Ser Thr Ser Phe His Val
865 870 875 880
Thr Cys Ala His Ala Ala Gly Val Leu Met Glu Pro Asp Asp Trp Pro
885 890 895
Tyr Val Val Ser Ile Thr Cys Leu Lys His Lys Ser Gly Gly His Ala
900 905 910
Val Gln Leu Leu Arg Ala Val Ser Leu Gly Gln Val Val Ile Thr Lys
915 920 925
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930 935 940
Gln Thr Cys Tyr Glu Val Asn Phe Asp Asp Gly Ser Tyr Ser Asp Asn
945 950 955 960
Leu Tyr Pro Glu Ser Ile Thr Ser Arg Asp Cys Val Gln Leu Gly Pro
965 970 975
Pro Ser Glu Gly Glu Leu Val Glu Leu Arg Trp Thr Asp Gly Asn Leu
980 985 990
Tyr Lys Ala Lys Phe Ile Ser Ser Val Thr Ser His Ile Tyr Gln Val
995 1000 1005
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1010 1015 1020
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Ser Leu Leu Gln Val Gln Gly Arg Pro Gly Ala Pro Phe
1085 1090 1095
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<211> 1056
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
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165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
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355 360 365
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370 375 380
Ala Asp Glu Glu Glu Glu Val Ser Asp Glu Val Asp Gly Ala Glu Val
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Glu Ala Ala Val Lys Leu Arg Asn Thr Glu Ala Ser Ser Glu Glu Glu
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Ser Ser Ala Ser Arg Met Gln Val Glu Gln Asn Leu Ser Asp His Ile
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Lys Leu Ser Gly Asn Ser Cys Leu Ser Thr Ser Val Thr Glu Asp Ile
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Ser Ser Glu Ala Asp Asp Ser Ile Pro Leu Ser Ser Gly Tyr Glu Lys
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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aaatttaaaa ggctgcagcg tgtgttgcaa gtcttcttgg aatcagctgc aggacctgtg 120
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atggcgtgga tatccagact cagagagcac ctgggagcca cggcagaatc tcaagtgtgt 300
gcgtatcctc aagcagttcc acaaggactt agaaagggag ctgctccggc ggcaccaccg 360
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gcagaggcgg gcgctccgtc gctgggagca ggagctcaat gccaagcgca gccatctggg 480
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ctcccgctgc cgctgcggct atgactgccc aaatcgtgtg gtacagaagg gtatccgata 780
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agggcctcgc ctgcctccac ctgcccccac ctgctcctac ctgctctacg ttcagggctg 1440
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ttgcacttac aaacccccac ccaccttcag aaatagtttt tcaacatcaa gactctctgt 1560
cgttgggatt catggcctat taaggaggtc caaggggtga gtcccaaccc agccccagaa 1620
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<210> 15
<211> 3093
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 16
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tgacacaacc cctccacccc aggtggccta cagcaaggaa cgtatcccgg gcaagggtgt 2340
tttcattaac acaggccctg aatttctggt tggctgtgac tgcaaggatg ggtgtcggga 2400
caagtccaag tgtgcctgcc atcaactaac tatccaggct acagcctgta ccccaggagg 2460
ccaaatcaac cctaactctg gctaccagta caagagacta gaagagtgtc tacccacagg 2520
ggtatatgag tgtaacaaac gctgcaaatg tgacccaaac atgtgcacaa accggttggt 2580
gcaacatgga ctacaagttc ggctacagct attcaagaca cagaacaagg gctggggtat 2640
ccgctgcttg gatgacattg ccaaaggctc ttttgtttgt atttatgcag gcaaaatcct 2700
gacagatgac tttgcagaca aggagggtct ggaaatgggt gatgagtact ttgcaaatct 2760
ggaccatatc gagagcgtgg agaacttcaa agaaggatat gagagtgatg ccccctgttc 2820
ctctgacagc agtggtgtag acttgaagga ccaggaagat ggcaacagcg gtacagagga 2880
ccctgaagag tccaatgatg atagctcaga tgataacttc tgtaaggatg aggacttcag 2940
caccagttca gtgtggcgga gctatgctac ccggaggcag acccggggcc agaaagagaa 3000
cggactctct gagacaactt ccaaggactc ccacccccca gatcttggac ccccacatat 3060
tcctgttcct ccctcaatcc ctgtaggtgg ctgcaatcca ccttcctccg aagagacacc 3120
caagaacaag gtggcctcat ggttgagctg caatagtgtc agtgaaggtg gttttgctga 3180
ctctgatagc cattcatcct tcaagactaa tgaaggtggg gagggccggg ctgggggaag 3240
ccgaatggag gctgagaagg cctccacctc aggactaggc atcaaggatg agggagacat 3300
caaacaggcc aagaaagagg acactgacga ccgaaacaag atgtcagtag ttactgaaag 3360
ctctcgaaat tacggttaca atccttctcc tgtgaagcct gaaggacttc gccgcccacc 3420
tagtaagact agtatgcatc aaagccgaag actcatggct tctgctcagt ccaaccctga 3480
tgatgtcctg acactgtcca gcagcacaga aagtgagggg gaaagtggga ccagccgaaa 3540
gcccactgct ggtcagactt cggctacagc ggttgacagt gatgatatcc agaccatatc 3600
ctctggctct gaaggggatg actttgagga caagaagaac atgactggtc caatgaagcg 3660
tcaagtggca gtaaaatcaa cccgaggctt tgctcttaaa tcaacccatg ggattgcaat 3720
taaatcaacc aacatggcct ctgtggacaa gggggagagc gcacctgttc gtaagaacac 3780
acgccaattc tatgatggcg aggagtcttg ctacatcatt gatgccaagc ttgaaggcaa 3840
cctgggccgc tacctcaacc acagttgcag ccccaacctg tttgtccaga atgtcttcgt 3900
ggatacccat gatcttcgct tcccctgggt ggccttcttt gccagcaaaa gaatccgggc 3960
tgggacagaa cttacttggg actacaacta cgaggtgggc agtgtggaag gcaaggagct 4020
actctgttgc tgtggggcca ttgaatgcag aggacgtctt ctttagagga cagccttctt 4080
cccaaccctt cttgaactgt cgtttcctca ggaactgggt cttcctgatt gttgaaccct 4140
gacccgaagt ctctgggcta gctactcccc ccagctccta gttgatagaa atgggggttc 4200
tggaccagat gatcccttcc aatgtggtgc tagcaggcag gatcccttct ccacctccaa 4260
aggccctaaa gggtggggag agatcaccac tctaacctcg gcctgacatc cctcccatcc 4320
catatttgtc caagtgttcc tgcttctaac agactttgtt cttagaatgg agcctgtgta 4380
tctactatct ccagtttgta ttatttcttg aaagtctttt aacaatatga taaaactaag 4440
attgtgaaa 4449
<210> 17
<211> 1291
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Met Ser Ser Leu Pro Gly Cys Ile Gly Leu Asp Ala Ala Thr Ala Thr
1 5 10 15
Val Glu Ser Glu Glu Ile Ala Glu Leu Gln Gln Ala Val Val Glu Glu
20 25 30
Leu Gly Ile Ser Met Glu Glu Leu Arg His Phe Ile Asp Glu Glu Leu
35 40 45
Glu Lys Met Asp Cys Val Gln Gln Arg Lys Lys Gln Leu Ala Glu Leu
50 55 60
Glu Thr Trp Val Ile Gln Lys Glu Ser Glu Val Ala His Val Asp Gln
65 70 75 80
Leu Phe Asp Asp Ala Ser Arg Ala Val Thr Asn Cys Glu Ser Leu Val
85 90 95
Lys Asp Phe Tyr Ser Lys Leu Gly Leu Gln Tyr Arg Asp Ser Ser Ser
100 105 110
Glu Asp Glu Ser Ser Arg Pro Thr Glu Ile Ile Glu Ile Pro Asp Glu
115 120 125
Asp Asp Asp Val Leu Ser Ile Asp Ser Gly Asp Ala Gly Ser Arg Thr
130 135 140
Pro Lys Asp Gln Lys Leu Arg Glu Ala Met Ala Ala Leu Arg Lys Ser
145 150 155 160
Ala Gln Asp Val Gln Lys Phe Met Asp Ala Val Asn Lys Lys Ser Ser
165 170 175
Ser Gln Asp Leu His Lys Gly Thr Leu Ser Gln Met Ser Gly Glu Leu
180 185 190
Ser Lys Asp Gly Asp Leu Ile Val Ser Met Arg Ile Leu Gly Lys Lys
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Trp His Lys Gly Thr Leu Ile Ala Ile Gln Thr Val
210 215 220
Gly Pro Gly Lys Lys Tyr Lys Val Lys Phe Asp Asn Lys Gly Lys Ser
225 230 235 240
Leu Leu Ser Gly Asn His Ile Ala Tyr Asp Tyr His Pro Pro Ala Asp
245 250 255
Lys Leu Tyr Val Gly Ser Arg Val Val Ala Lys Tyr Lys Asp Gly Asn
260 265 270
Gln Val Trp Leu Tyr Ala Gly Ile Val Ala Glu Thr Pro Asn Val Lys
275 280 285
Asn Lys Leu Arg Phe Leu Ile Phe Phe Asp Asp Gly Tyr Ala Ser Tyr
290 295 300
Val Thr Gln Ser Glu Leu Tyr Pro Ile Cys Arg Pro Leu Lys Lys Thr
305 310 315 320
Trp Glu Asp Ile Glu Asp Ile Ser Cys Arg Asp Phe Ile Glu Glu Tyr
325 330 335
Val Thr Ala Tyr Pro Asn Arg Pro Met Val Leu Leu Lys Ser Gly Gln
340 345 350
Leu Ile Lys Thr Glu Trp Glu Gly Thr Trp Trp Lys Ser Arg Val Glu
355 360 365
Glu Val Asp Gly Ser Leu Val Arg Ile Leu Phe Leu Asp Asp Lys Arg
370 375 380
Cys Glu Trp Ile Tyr Arg Gly Ser Thr Arg Leu Glu Pro Met Phe Ser
385 390 395 400
Met Lys Thr Ser Ser Ala Ser Ala Leu Glu Lys Lys Gln Gly Gln Leu
405 410 415
Arg Thr Arg Pro Asn Met Gly Ala Val Arg Ser Lys Gly Pro Val Val
420 425 430
Gln Tyr Thr Gln Asp Leu Thr Gly Thr Gly Thr Gln Phe Lys Pro Val
435 440 445
Glu Pro Pro Gln Pro Thr Ala Pro Pro Ala Pro Pro Phe Pro Pro Ala
450 455 460
Pro Pro Leu Ser Pro Gln Ala Gly Asp Ser Asp Leu Glu Ser Gln Leu
465 470 475 480
Ala Gln Ser Arg Lys Gln Val Ala Lys Lys Ser Thr Ser Phe Arg Pro
485 490 495
Gly Ser Val Gly Ser Gly His Ser Ser Pro Thr Ser Pro Ala Leu Ser
500 505 510
Glu Asn Val Ser Gly Gly Lys Pro Gly Ile Asn Gln Thr Tyr Arg Ser
515 520 525
Pro Leu Gly Ser Thr Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ser Ala Leu Pro Ala
530 535 540
Pro Pro Ala Pro Pro Val Phe His Gly Met Leu Glu Arg Ala Pro Ala
545 550 555 560
Glu Pro Ser Tyr Arg Ala Pro Met Glu Lys Leu Phe Tyr Leu Pro His
565 570 575
Val Cys Ser Tyr Thr Cys Leu Ser Arg Val Arg Pro Met Arg Asn Glu
580 585 590
Gln Tyr Arg Gly Lys Asn Pro Leu Leu Val Pro Leu Leu Tyr Asp Phe
595 600 605
Arg Arg Met Thr Ala Arg Arg Arg Val Asn Arg Lys Met Gly Phe His
610 615 620
Val Ile Tyr Lys Thr Pro Cys Gly Leu Cys Leu Arg Thr Met Gln Glu
625 630 635 640
Ile Glu Arg Tyr Leu Phe Glu Thr Gly Cys Asp Phe Leu Phe Leu Glu
645 650 655
Met Phe Cys Leu Asp Pro Tyr Val Leu Val Asp Arg Lys Phe Gln Pro
660 665 670
Tyr Lys Pro Phe Tyr Tyr Ile Leu Asp Ile Thr Tyr Gly Lys Glu Asp
675 680 685
Val Pro Leu Ser Cys Val Asn Glu Ile Asp Thr Thr Pro Pro Pro Gln
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Lys Glu Arg Ile Pro Gly Lys Gly Val Phe Ile Asn
705 710 715 720
Thr Gly Pro Glu Phe Leu Val Gly Cys Asp Cys Lys Asp Gly Cys Arg
725 730 735
Asp Lys Ser Lys Cys Ala Cys His Gln Leu Thr Ile Gln Ala Thr Ala
740 745 750
Cys Thr Pro Gly Gly Gln Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Gln Tyr Lys
755 760 765
Arg Leu Glu Glu Cys Leu Pro Thr Gly Val Tyr Glu Cys Asn Lys Arg
770 775 780
Cys Lys Cys Asp Pro Asn Met Cys Thr Asn Arg Leu Val Gln His Gly
785 790 795 800
Leu Gln Val Arg Leu Gln Leu Phe Lys Thr Gln Asn Lys Gly Trp Gly
805 810 815
Ile Arg Cys Leu Asp Asp Ile Ala Lys Gly Ser Phe Val Cys Ile Tyr
820 825 830
Ala Gly Lys Ile Leu Thr Asp Asp Phe Ala Asp Lys Glu Gly Leu Glu
835 840 845
Met Gly Asp Glu Tyr Phe Ala Asn Leu Asp His Ile Glu Ser Val Glu
850 855 860
Asn Phe Lys Glu Gly Tyr Glu Ser Asp Ala Pro Cys Ser Ser Asp Ser
865 870 875 880
Ser Gly Val Asp Leu Lys Asp Gln Glu Asp Gly Asn Ser Gly Thr Glu
885 890 895
Asp Pro Glu Glu Ser Asn Asp Asp Ser Ser Asp Asp Asn Phe Cys Lys
900 905 910
Asp Glu Asp Phe Ser Thr Ser Ser Val Trp Arg Ser Tyr Ala Thr Arg
915 920 925
Arg Gln Thr Arg Gly Gln Lys Glu Asn Gly Leu Ser Glu Thr Thr Ser
930 935 940
Lys Asp Ser His Pro Pro Asp Leu Gly Pro Pro His Ile Pro Val Pro
945 950 955 960
Pro Ser Ile Pro Val Gly Gly Cys Asn Pro Pro Ser Ser Glu Glu Thr
965 970 975
Pro Lys Asn Lys Val Ala Ser Trp Leu Ser Cys Asn Ser Val Ser Glu
980 985 990
Gly Gly Phe Ala Asp Ser Asp Ser His Ser Ser Phe Lys Thr Asn Glu
995 1000 1005
Gly Gly Glu Gly Arg Ala Gly Gly Ser Arg Met Glu Ala Glu Lys
1010 1015 1020
Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gly Ile Lys Asp Glu Gly Asp Ile Lys
1025 1030 1035
Gln Ala Lys Lys Glu Asp Thr Asp Asp Arg Asn Lys Met Ser Val
1040 1045 1050
Val Thr Glu Ser Ser Arg Asn Tyr Gly Tyr Asn Pro Ser Pro Val
1055 1060 1065
Lys Pro Glu Gly Leu Arg Arg Pro Pro Ser Lys Thr Ser Met His
1070 1075 1080
Gln Ser Arg Arg Leu Met Ala Ser Ala Gln Ser Asn Pro Asp Asp
1085 1090 1095
Val Leu Thr Leu Ser Ser Ser Thr Glu Ser Glu Gly Glu Ser Gly
1100 1105 1110
Thr Ser Arg Lys Pro Thr Ala Gly Gln Thr Ser Ala Thr Ala Val
1115 1120 1125
Asp Ser Asp Asp Ile Gln Thr Ile Ser Ser Gly Ser Glu Gly Asp
1130 1135 1140
Asp Phe Glu Asp Lys Lys Asn Met Thr Gly Pro Met Lys Arg Gln
1145 1150 1155
Val Ala Val Lys Ser Thr Arg Gly Phe Ala Leu Lys Ser Thr His
1160 1165 1170
Gly Ile Ala Ile Lys Ser Thr Asn Met Ala Ser Val Asp Lys Gly
1175 1180 1185
Glu Ser Ala Pro Val Arg Lys Asn Thr Arg Gln Phe Tyr Asp Gly
1190 1195 1200
Glu Glu Ser Cys Tyr Ile Ile Asp Ala Lys Leu Glu Gly Asn Leu
1205 1210 1215
Gly Arg Tyr Leu Asn His Ser Cys Ser Pro Asn Leu Phe Val Gln
1220 1225 1230
Asn Val Phe Val Asp Thr His Asp Leu Arg Phe Pro Trp Val Ala
1235 1240 1245
Phe Phe Ala Ser Lys Arg Ile Arg Ala Gly Thr Glu Leu Thr Trp
1250 1255 1260
Asp Tyr Asn Tyr Glu Val Gly Ser Val Glu Gly Lys Glu Leu Leu
1265 1270 1275
Cys Cys Cys Gly Ala Ile Glu Cys Arg Gly Arg Leu Leu
1280 1285 1290
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 18
gcucacaugu aaaucgauut t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 19
aaucgauuua caugugagct t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 20
gguguacaac guauucauat t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 21
uaugaauacg uuguacacct g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 22
gguccuuugu cuauaucaat t 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 23
uugauauaga caaaggacct t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 24
gcucacaugu aaaucgauut t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 25
aaucgauuua caugugagct t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 26
gugucgaugu ggaccugaat t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 27
uucaggucca caucgacacc t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 28
ggacuacagu aucaugacat t 21
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<400> 29
ugucaugaua cuguaguccc a 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 30
ggacgaugca ggagauagat t 21
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<400> 31
ucuaucuccu gcaucguccg a 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 32
ggaugggugu cgggauaaat t 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 33
uuuaucccga cacccaucct t 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 34
gcaccuuugu cugcgaauat t 21
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<400> 35
uauucgcaga caaaggugcc c 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 36
gaucaaaccu gcucggaaat t 21
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<400> 37
uuuccgagca gguuugaucc a 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 38
gaauuugccu ucuuaugcat t 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 39
ugcauaagaa ggcaaauuct t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸
<400> 40
gaggaauucu agucccguat t 21
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<400> 41
uacgggacua gaauuccuca a 21
<210> 42
<211> 5123
<212> DNA
<213> 智人
<400> 42
gcgcgggagg ggcggggcca cgctgcgggc ccgggccatg gccgccgccg atgccgaggc 60
agttccggcg aggggggagc ctcagcagga ttgctgtgtg aaaaccgagc tgctgggaga 120
agagacacct atggctgccg atgaaggctc agcagagaaa caggcaggag aggcccacat 180
ggctgcggac ggtgagacca atgggtcttg tgaaaacagc gatgccagca gtcatgcaaa 240
tgctgcaaag cacactcagg acagcgcaag ggtcaacccc caggatggca ccaacacact 300
aactcggata gcggaaaatg gggtttcaga aagagactca gaagcggcga agcaaaacca 360
cgtcactgcc gacgactttg tgcagacttc tgtcatcggc agcaacggat acatcttaaa 420
taagccggcc ctacaggcac agcccttgag gactaccagc actctggcct cttcgctgcc 480
tggccatgct gcaaaaaccc ttcctggagg ggctggcaaa ggcaggactc caagcgcttt 540
tccccagacg ccagccgccc caccagccac ccttggggag gggagtgctg acacagagga 600
caggaagctc ccggcccctg gcgccgacgt caaggtccac agggcacgca agaccatgcc 660
gaagtccgtc gtgggcctgc atgcagccag taaagatccc agagaagttc gagaagctag 720
agatcataag gaaccaaaag aggagatcaa caaaaacatt tctgactttg gacgacagca 780
gcttttaccc cccttcccat cccttcatca gtcgctacct cagaaccagt gctacatggc 840
caccacaaaa tcacagacag cttgcttgcc ttttgtttta gcagctgcag tatctcggaa 900
gaaaaaacga agaatgggaa cctatagcct ggttcctaag aaaaagacca aagtattaaa 960
acagaggacg gtgattgaga tgtttaagag cataactcat tccactgtgg gttccaaggg 1020
ggagaaggac ctgggcgcca gcagcctgca cgtgaatggg gagagcctgg agatggactc 1080
ggatgaggac gactcagagg agctcgagga ggacgacggc catggtgcag agcaggcggc 1140
cgcgttcccc acagaggaca gcaggacttc caaggagagc atgtcggagg ctgatcgcgc 1200
ccagaagatg gacggggagt ccgaggagga gcaggagtcc gtggacaccg gggaggagga 1260
ggaaggcggt gacgagtctg acctgagttc ggaatccagc attaagaaga aatttctcaa 1320
gaggaaagga aagaccgaca gtccctggat caagccagcc aggaaaagga ggcggagaag 1380
tagaaagaag cccagcggtg ccctcggttc tgagtcgtat aagtcatctg caggaagcgc 1440
tgagcagacg gcaccaggag acagcacagg gtacatggaa gtttctctgg actccctgga 1500
tctccgagtc aaaggaattc tgtcttcaca agcagaaggg ttggccaacg gtccagatgt 1560
gctggagaca gacggcctcc aggaagtgcc tctctgcagc tgccggatgg aaacaccgaa 1620
gagtcgagag atcaccacac tggccaacaa ccagtgcatg gctacagaga gcgtggacca 1680
tgaattgggc cggtgcacaa acagcgtggt caagtatgag ctgatgcgcc cctccaacaa 1740
ggccccgctc ctcgtgctgt gtgaagacca ccggggccgc atggtgaagc accagtgctg 1800
tcctggctgt ggctacttct gcacagcggg taattttatg gagtgtcagc ccgagagcag 1860
catctctcac cgtttccaca aagactgtgc ctctcgagtc aataacgcca gctattgtcc 1920
ccactgtggg gaggagagct ccaaggccaa agaggtgacg atagctaaag cagacaccac 1980
ctcgaccgtg acaccagtcc ccgggcagga gaagggctcg gccctggagg gcagggccga 2040
caccacaacg ggcagtgctg ccgggccacc actctcggag gacgacaagc tgcagggtgc 2100
agcctcccac gtgcccgagg gctttgatcc aacgggacct gctgggcttg ggaggccaac 2160
tcccggcctt tcccagggac cagggaagga aaccttggag agcgctctca tcgccctcga 2220
ctcggaaaaa cccaagaagc ttcgcttcca cccaaagcag ctgtacttct ccgccaggca 2280
aggggagctt cagaaggtgc tcctcatgct ggtggacgga attgacccca acttcaaaat 2340
ggagcaccag aataagcgct ctccactgca cgccgcggca gaggctggac acgtggacat 2400
ctgccacatg ctggttcagg cgggcgctaa tattgacacc tgctcagaag accagaggac 2460
cccgttgatg gaagcagccg aaaacaacca tctggaagca gtgaagtacc tcatcaaggc 2520
tggggccctg gtggatccca aggacgcaga gggctctacg tgtttgcacc tggctgccaa 2580
gaaaggccac tacgaagtgg tccagtacct gctttcaaat ggacagatgg acgtcaactg 2640
tcaggatgac ggaggctgga cacccatgat ctgggccaca gagtacaagc acgtggacct 2700
cgtgaagctg ctgctgtcca agggctctga catcaacatc cgagacaacg aggagaacat 2760
ttgcctgcac tgggcggcgt tctccggctg cgtggacata gccgagatcc tgctggctgc 2820
caagtgcgac ctccacgccg tgaacatcca cggagactcg ccactgcaca ttgccgcccg 2880
ggagaaccgc tacgactgtg tcgtcctctt tctttctcgg gattcagatg tcaccttaaa 2940
gaacaaggaa ggagagacgc ccctgcagtg tgcgagcctc aactctcagg tgtggagcgc 3000
tctgcagatg agcaaggctc tgcaggactc ggcccccgac aggcccagcc ccgtggagag 3060
gatagtgagc agggacatcg ctcgaggcta cgagcgcatc cccatcccct gtgtcaacgc 3120
cgtggacagc gagccatgcc ccagcaacta caagtacgtc tctcagaact gcgtgacgtc 3180
ccccatgaac atcgacagaa atatcactca tctgcagtac tgcgtgtgca tcgacgactg 3240
ctcctccagc aactgcatgt gcggccagct cagcatgcgc tgctggtacg acaaggatgg 3300
ccggctcctg ccagagttca acatggcgga gcctcccttg atcttcgaat gcaaccacgc 3360
gtgctcctgc tggaggaact gccgaaatcg cgtcgtacag aatggtctca gggcaaggct 3420
gcagctctac cggacgcggg acatgggctg gggcgtgcgg tccctgcagg acatcccacc 3480
aggcaccttt gtctgcgagt atgttgggga gctgatttca gactcagaag ccgacgttcg 3540
agaggaagat tcttacctct ttgatctcga caataaggac ggggaggttt actgcatcga 3600
cgcgcggttc tacgggaacg tcagccggtt catcaaccac cactgcgagc ccaacctggt 3660
gcccgtgcgc gtgttcatgg cccaccagga cctgcggttc ccccggatcg ccttcttcag 3720
cacccgcctg atcgaggccg gcgagcagct cgggtttgac tatggagagc gcttctggga 3780
catcaaaggc aagctcttca gctgccgctg cggctccccc aagtgccggc actcgagcgc 3840
ggccctggcc cagcgtcagg ccagcgcggc ccaggaggcc caggaggacg gcttgcccga 3900
caccagctcc gcggctgccg ccgaccccct atgagacgcc gccggccagc ggggcgctcg 3960
ggagccaggg accgccgcgt cgccgattag aggacgagga ggagagattc cgcacgcaac 4020
cgaaagggtc cttcggggct gcgccgccgg cttcctggag gggtcggagg tgaggctgca 4080
gcccctgcgg gcgggtgtgg atgcctccca gccaccttcc cagacctgcg gcctcaccgc 4140
gggcccagtg cccaggctgg agcgcacact ttggtccgcg cgccagagac gctgggagtc 4200
cgcactggca tcaccttctg agtttctgat gctgatttgt cgttgcgaag tttctcgttt 4260
cttcctctga cctccgaggt ccccgctgca ccacggggtt gctctgttct cctgtccggc 4320
ccagactctt ctgtgtggcg ccgccgaagc caccgttagc gcgagctgct ccgttcgccc 4380
tgcccacggc ctgcgtggct ggggccgagt cccaggggcc gcacggaggg cacagtctcc 4440
tgtcaggctc ggagaggtca ggagaccgac cccaccacta actttggaga aaatgtgggt 4500
ttgcttttta aaggaatcct atatctagtc ctatatatca aacctctaac tgacgtttct 4560
tttcgaggaa gtggcttggt gggtgcagcc cccgccggtt ccgttgacgc tggcaccttc 4620
tgttgatttt ttaagccaca tgctatgatg aataaactga tttattttct accattactg 4680
aacattagga caaacacaaa ataaaaaaca aaacacagac aacggtgctg attctggtgt 4740
ggtttctact caccacgtga aataaactat caactgtata aagagaacaa agtgatttta 4800
gaataaaatg caggaaaaac ttttttaaag atgttagtct tgtagcgtga ataaatttgc 4860
catcaccttt tgtgtggtgg cctggcaggt catatacttt tttttggcat ataccttttt 4920
aaagactgta attagtgcag taacagtggg gttttttttg tgcaactctt ctaaaaacat 4980
tcataatgca gtcatgttta tttttttctg ttaaaatgtt tttgacagtt ttaagagcag 5040
tcttttggct ctgaccattt cttgttctgt ttccaatgaa atcaataaaa aaaaagaagt 5100
actttaaaaa aaaaaaaaaa aaa 5123
<210> 43
<211> 7970
<212> DNA
<213> 智人
<400> 43
gtaaaagtga cattctaaat gttcctcact ctgcgaggct tattttttag ggactttgct 60
ataattctga aagacttagt tttacagtac atctgaaagt aggagttttc agaagtatgg 120
ctcttgggat aaatttagat tcttaattgt gaagctctgt taccacttgt tagaaggcag 180
gtcagctcac ctgcttgggg aggtaaatat atgaatgcac tctcgagtaa tttaatggag 240
ccctacctca atgtacagaa tgacagtatc acagatcaag aatggagtac gagtgatttt 300
cggctatggt gggggtaggt aggtcacttg tcccctgttg tctcttacta tttgtaaagt 360
gaagactatg attagtcttt ttgatcggga tggtttgaga tgaataaaga ataggcaggc 420
aatttggata ctttaggctt ttcaagaaca ttagtaacat tttttcttag atatttctcc 480
taatacaatg agtgttgtga aataacatgg cagttattgt tgagagaaaa gccttcccag 540
ttatgtattg agtccttagg cgttttgacc ttccctccac tcttacagaa cttggtggaa 600
ggggccacta tgttttctac ctccttccgt gcctttcaca aagccacatc ctgcaccgtc 660
tacccttctc tgtggatatt tttccgcttg gcaatttcct ttcctgaggc acccacttgg 720
gacatctgaa tctccatctc catgttgatg gcccgtttgt gcttggacgt gttcttccac 780
ttgagactga gggttcatgt aatcaaagaa gtttctttgt tgtgtgtatc tttacagaac 840
acaacaggaa ttgaaaatga atcagaacac tactgagcct gtggcggcca ccgagaccct 900
ggctgaggta cccgaacatg tgctgcgagg acttccggag gaagtgaggc ttttcccttc 960
tgctgttgac aagacccgga ttggtgtctg ggccactaaa ccaattttaa aaggcaaaaa 1020
atttgggcca tttgttggtg ataagaaaaa aagatctcag gttaagaata atgtatacat 1080
gtgggaggtg tattacccaa atttgggatg gatgtgcatt gatgccactg atccagagaa 1140
gggaaactgg ctgcgatatg tgaattgggc ttgctcagga gaagagcaaa atttattccc 1200
actggaaatc aacagagcca tttactataa aactttaaag ccaatcgcgc cgggcgagga 1260
gctcctggtc tggtacaatg gggaagacaa ccctgagata gcagctgcga ttgaggaaga 1320
gcgagccagc gcccggagca agcggagctc ccccaagagc cggaaaggga agaaaaaatc 1380
ccaggaaaat aaaaacaaag gaaacaaaat ccaagacata caactgaaga caagtgagcc 1440
agatttcacc tctgcaaata tgagagattc tgcagaaggt cctaaagaag acgaagagaa 1500
gccttcagcc tcagcacttg agcagccggc caccctccag gaggtggcca gtcaggaggt 1560
gcctccagaa ctagcaaccc ctgcccctgc ctgggagcca cagccagaac cagacgagcg 1620
attagaagcg gcagcttgtg aggtgaatga tttgggggaa gaggaggagg aggaagagga 1680
ggaggatgaa gaagaagaag aagatgatga tgatgatgag ttggaagacg agggggaaga 1740
agaagccagc atgccaaatg aaaattctgt gaaagagcca gaaatacggt gtgatgagaa 1800
gccagaagat ttattagagg aaccaaaaac aacttcagaa gaaactcttg aagactgctc 1860
agaggtaaca cctgccatgc aaatccccag aactaaagaa gaggccaatg gtgatgtatt 1920
tgaaacgttt atgtttccgt gtcaacattg tgaaaggaag tttacaacca aacaggggct 1980
tgagcgtcac atgcatatcc atatatccac cgtcaatcat gctttcaaat gcaagtactg 2040
tgggaaagcc tttggcacac agattaaccg gcggcgacat gagcggcgcc atgaagcagg 2100
gttaaagcgg aaacccagcc aaacactaca gccgtcagag gatctggctg atggcaaagc 2160
atctggagaa aacgttgctt caaaagatga ttcgagtcct cccagtcttg ggccagactg 2220
tctgatcatg aattcagaga aggcttccca agacacaata aattcttctg tcgtagaaga 2280
gaatggggaa gttaaagaac ttcatccgtg caaatattgt aaaaaggttt ttggaactca 2340
tactaatatg agacggcatc agcgtagagt tcacgaacgt catctgattc ccaaaggtgt 2400
acggcgaaaa ggaggccttg aagagcccca gcctccagca gaacaggccc aggccaccca 2460
gaacgtgtat gtaccaagca cagagccgga ggaggaaggg gaagcagatg atgtgtacat 2520
catggacatt tctagcaata tctctgaaaa cttaaattac tatattgatg gtaaaattca 2580
aactaataac aacactagta actgtgatgt gattgagatg gagtctgctt cggcagattt 2640
gtatggtata aattgtctgc tcactccagt tacagtggaa attactcaaa atataaagac 2700
cacacaggtc cctgtaacag aagatcttcc taaagagcct ttgggcagca caaatagtga 2760
ggccaagaag cggagaactg cgagcccacc tgcactgccc aaaattaagg ccgaaacaga 2820
ctctgacccc atggtcccct cttgctcttt aagtcttcct cttagcatat caacaacaga 2880
ggcagtgtct ttccacaaag agaaaagtgt ttatttgtca tcaaagctca aacaacttct 2940
tcaaacccaa gataaactaa ctcctgcagg gatttcagca actgaaatag ctaaattagg 3000
tcctgtttgt gtgtctgctc ctgcatcaat gttgcctgtg acctcaagta ggtttaagag 3060
gcggaccagc tctcctccca gttctccaca gcacagtcct gcccttcgag actttggaaa 3120
gccaagtgat gggaaagcag catggaccga tgccgggctg acttccaaaa aatccaaatt 3180
agaaagtcac agcgactcac cagcatggag tttgtctggg agagatgaga gagaaactgt 3240
gagccctcca tgctttgatg aatataaaat gtctaaagag tggacagcta gttctgcttt 3300
tagcagtgtg tgcaaccagc agccactgga tttatccagc ggtgtcaaac agaaggctga 3360
gggtacaggc aagactccag tccagtggga atctgtctta gatctcagtg tgcataaaaa 3420
gcattgtagt gactctgaag gcaaggaatt caaagaaagt cattcagtgc agcctacgtg 3480
tagtgctgta aagaaaagga aaccaaccac ctgcatgctg cagaaggttc ttctcaatga 3540
atataatggc atcgatttac ctgtagaaaa ccctgcagat gggaccagga gcccaagtcc 3600
ttgtaaatcc ctagaagctc agccagatcc tgacctcggt ccgggctctg gtttccctgc 3660
ccctactgtt gagtccacac ctgatgtttg tccttcatca cctgccctgc agacaccctc 3720
cctttcatcc ggtcagctgc ctcctctctt gatccccaca gatccctctt cccctccacc 3780
ctgtcccccg gtattaactg ttgccactcc gccccctccc ctccttccta ccgtacctct 3840
tccagccccc tcttccagtg catctccaca cccatgcccc tctccactct caaatgccac 3900
cgcacagtcc ccacttccaa ttctgtcccc aacagtgtcc ccctctccct ctcccattcc 3960
tcccgtggag cccctgatgt ctgccgcctc acccgggcct ccaacacttt cttcttcctc 4020
ctcttcatct tcctcctcct cttcgttttc ttcttcatct tcctcctctt ctccttctcc 4080
acctcctctc tccgcaatat catctgttgt ttcctctggt gataatctgg aggcttctct 4140
ccccatgata tctttcaaac aggaggaatt agagaatgaa ggtctgaaac ccagggaaga 4200
gccccagtct gctgctgaac aggatgttgt tgttcaggaa acattcaaca aaaactttgt 4260
ttgcaacgtc tgtgaatcac cttttctttc cattaaagat ctaaccaaac atttatctat 4320
tcatgctgaa gaatggccct tcaaatgtga attttgtgtg cagcttttta aggataaaac 4380
ggacttgtca gaacatcgct ttttgcttca tggagttggg aatatctttg tgtgttctgt 4440
ttgtaaaaaa gaatttgctt ttttgtgcaa tttgcagcag caccagcgag atctccaccc 4500
agataaggtg tgcacacatc acgagtttga aagcgggact ctgaggcccc agaactttac 4560
agatcccagc aaggcccatg tagagcatat gcagagcttg ccagaagatc ctttagaaac 4620
ttctaaagaa gaagaggagt taaatgattc ctctgaagag ctttacacga ctataaaaat 4680
aatggcttct ggaataaaga caaaagatcc agatgttcga ttgggcctca atcagcatta 4740
cccaagcttt aaaccacctc catttcagta ccatcaccgt aaccccatgg ggattggtgt 4800
gacagccaca aatttcacta cacacaatat tccacagact ttcactaccg ccattcgctg 4860
cacaaagtgt ggaaaaggtg tcgacaatat gccggagttg cacaaacata tcctggcttg 4920
tgcttctgca agtgacaaga agaggtacac gcctaagaaa aacccagtac cattaaaaca 4980
aactgtgcaa cccaaaaatg gcgtggtggt tttagataac tctgggaaaa atgccttccg 5040
acgaatggga cagcccaaaa ggcttaactt tagtgttgag ctcagcaaaa tgtcgtcgaa 5100
taagctcaaa ttaaatgcat tgaagaaaaa aaatcagcta gtacagaaag caattcttca 5160
gaaaaacaaa tctgcaaagc agaaggccga cttgaaaaat gcttgtgagt catcctctca 5220
catctgccct tactgtaatc gagagttcac ttacattgga agcctgaata aacacgccgc 5280
cttcagctgt cccaaaaaac ccctttctcc tcccaaaaaa aaagtttctc attcatctaa 5340
gaaaggtgga cactcatcac ctgcaagtag tgacaaaaac agtaacagca accaccgcag 5400
acggacagcg gatgcggaga ttaaaatgca aagcatgcag actccgttgg gcaagaccag 5460
agcccgcagc tcaggcccca cccaagtccc acttccctcc tcatccttca ggtccaagca 5520
gaacgtcaag tttgcagctt cggtgaaatc caaaaaacca agctcctcct ctttaaggaa 5580
ctccagcccg ataagaatgg ccaaaataac tcatgttgag gggaaaaaac ctaaagctgt 5640
ggccaagaat cattctgctc agctttccag caaaacatca cggagcctgc acgtgagggt 5700
acagaaaagc aaagctgttt tacaaagcaa atccaccttg gcgagtaaga aaagaacaga 5760
ccggttcaat ataaaatcta gagagcggag tggggggcca gtcacccgga gccttcagct 5820
ggcagctgct gctgacttga gtgagaacaa gagagaggac ggcagcgcca agcaggagct 5880
gaaggacttc agctacagcc tccgcttggc gtcccgatgc tctccaccag cggccccgta 5940
catcaccagg cagtatagga aggtcaaagc tccagctgca gcccagttcc agggaccatt 6000
cttcaaagag tagacactct ggctgctccc tgacagcacc tgaagtgacc tggaatcagt 6060
gaagccaaag ggactggcag tctgccctgc agggagtacc gacctatccc agttgtgtga 6120
ggctgcgaga gaaagggagt gcatgtgcgc gcgtgcatgt gtgcgtgcgt gtgtgttcac 6180
gtgttctcgt gcgggcgcgt gagtggtctt caaacgaggg tcccgatccc cggggcggca 6240
ggaagggggc cgactccacg ctgtcctttg ggatgatact tggatgcagc tcttgggacc 6300
gtgttctgca gcccagcctt cctgttgggg tggggcctct cctactatgc aatttttcaa 6360
gagctccttg accctgcttt ttgcttcttg agttgtcttt tgccattatg gggactttgg 6420
tttgacccag gggtcagcct taggaaggcc ttcaggagga ggccgagttc cccttcagta 6480
ccacccctct ctccccacct tccctctccc ggcaacatct ctgggaatca acagcatatt 6540
gacacgttgg agccgagcct gaacatgccc ctcggcccca gcacatggaa aacccccttc 6600
cttgcctaag gtgtctgagt ttctggctct tgaggcattt ccagacttga aattctcatc 6660
agtccattgc tcttgagtct ttgcagagaa cctcagatca ggtgcacctg ggagaaagac 6720
tttgtcccca cttacagatc tatctcctcc cttgggaagg gcagggaatg gggacggtgt 6780
atggagggga gggatctcct gcgcccttca ttgccacact tggtgggacc atgaacatct 6840
ttagtgtctg agcttctcaa attagctgca ataggaaaaa aacaaattgg gaaatgaaaa 6900
aaaaatggga agattaaaaa gcacaggggg aagaagaaga gatttcggag gccatcctgc 6960
caggggcgga cggggctgac tcctgctctc tggaggacgg tcagtccatg tctcggagaa 7020
acgggtgagc tgagcttggc gtttggaccc agttcagtga ggttcttggg ttttgtgcct 7080
ttggggcaga ccccaggcaa ggatgtctga gaccacttgg gcgctgtttt ctcagctcca 7140
atttcaagag tgagctatca aacccagagc ggaaggaggg agctctgatg agcacggttt 7200
gtcacacgat aaagggattt tttttttcag ggctactacg gttgatcttg caactctgta 7260
aatatgtatg tagacacttt taaaagcacg tatttatgtc cctgactgta aatgctccat 7320
ttttaaagtt ttataacttg tgttatttaa tgagtcagtc aatcggctgc agtatgggat 7380
ctgataagga tctaggagaa gggtctcatg cggaccctca catgggcaga aaaatggtgg 7440
tcattggccg acatcacagt tttcctgttt cccacccagc taaaaaccgt tgtttgcttt 7500
aaattttcat aaactggaat cctttcaccc gctcctacag ctaaccctca caagcatgaa 7560
gtgctgtggc tgttccttat cctaatgatg cgcttttgtc ccgtaaatgt taacactcat 7620
gaagcatacc ccggcctctc agttcttgag ggcctcccca ccgcagcagc aaggaaagct 7680
cacgaacccc aaacctggca agtcacctgc agcccatggt gagctctggg aagtgtggtt 7740
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ccagacggtc aggaaaactg ttccaatcat gaaaaggggg gatgattttg taaaagtggc 7860
atttcctggt cagtggtggt cttcaagacg acagctctgt atctgccatg tgaagagaat 7920
taacaataaa agtgtgaaga gcgattgtga ggaacaaaaa aaaaaaaaaa 7970
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 44
Gly Gly Gly Gly Cys
1 5
<210> 45
<211> 2339
<212> DNA
<213> 智人
<400> 45
ccaagcctga gaatcaggag aagcctcaca gtgacacccc caactgagga aactcacaga 60
gctgggacat actctacttc ttcagaaaaa agtatactga ctagagtgga gtccccctgg 120
ggagtcagaa agcctgtgaa agatctcact tgttcaaaag tccaagtgtg aattactgtc 180
tcacagataa accaaagtat tttgaaaaac aaaggggaga aaagaaatta ctccccagaa 240
ctctcaggca tctagaggac acccaagaac gtgggagtca gctgcttctt gtgtgcagcc 300
atgaagtctg tgcactccag tccccagaac acgagtcata ccatcatgac gttttaccca 360
accatggaag aatttgcaga tttcaacaca tatgttgctt acatggagtc ccaaggcgca 420
catcaagctg gccttgccaa ggtaattcca cccaaggaat ggaaagccag acagatgtat 480
gatgatatcg aagacatctt aatagccact cccctccagc aggtgacctc tgggcaggga 540
ggtgtgttta ctcaatacca taaaaagaag aaagccatga gggtggggca gtatcgccgc 600
ttggcaaaca gtaaaaaata tcagactccg ccacaccaga attttgcaga tttggagcaa 660
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cacaaagtgg ccctcatctc gcctacagtt ctcaaggaaa atgggattcc cttcaattgc 1080
atgactcagg aggctgggga gttcatggtg acctttccct atggctacca tgctggcttc 1140
aatcacggct tcaactgcgc agaagccatt aattttgcca ctccacgatg gattgattat 1200
ggcaaaatgg cctctcagtg tagctgtggg gagtcgacag tgaccttttc catggacccc 1260
tttgtgcgca ttgtgcaacc cgagagttat gagctctgga aacacaggca agacttggcc 1320
attgtggaac acacagagcc cagggttgca gaaagccaag agctgagcaa ctggagagat 1380
gatatagtac ttagaagagc tgctctgggc ctgaggcttc tcccaaacct cacagcccag 1440
tgtcccacac agcctgtgtc ctcagggcac tgttacaacc caaaaggctg tggcactgat 1500
gctgtgcctg gatccgcatt ccaaagctct gcatatcata cccagaccca gtcacttacc 1560
ctggggatgt cagccagggt tcttctccct tccactggaa gctggggttc tggtcgtggt 1620
cgtggtcgtg gtcaaggtca aggtcgaggt tgcagtcgtg gtcgtggtca tggttgttgt 1680
actcgagaac tggggactga ggagccaact gttcagcctg catccaagag gcgcctttta 1740
atgggtacaa ggagtagagc tcaaggccac aggcctcagc tcccgcttgc caatgatttg 1800
atgacaaatc tgtccctttg agtggtggcc ttcagcatct tgccaaggct tctggctgct 1860
gctgtgtccc tgatcttcaa ctcctggggc ccccactgga tcgtgatgaa accatgcacc 1920
ctggcctgtg cctgctatcc ctcaacagca ctactagtaa tctccctgat gttgtctgca 1980
tgactcctcc caatgtcatt gtgcctttga ttaagttttc cagggacact ggtggggact 2040
ggaactgatt aagttcacca gggacacttg cctggtgaac atgggcaagg ctgtagcaat 2100
ggaccacttt tacggctcta gggttctgac tccaactaag ttttccagaa tctcctgggc 2160
tcctgactca tctgctgggt ctaaagacac tgagtttagg gatattttcc tccaatacat 2220
gatcaatcct ctggatccac ggctatggaa tatggtgaca aatgtcagtg tctctcttat 2280
tccaacccca ggatcagaga agattcttta cctgcagtaa ctgacacatt tccaaggcc 2339
<210> 46
<211> 506
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Met Lys Ser Val His Ser Ser Pro Gln Asn Thr Ser His Thr Ile Met
1 5 10 15
Thr Phe Tyr Pro Thr Met Glu Glu Phe Ala Asp Phe Asn Thr Tyr Val
20 25 30
Ala Tyr Met Glu Ser Gln Gly Ala His Gln Ala Gly Leu Ala Lys Val
35 40 45
Ile Pro Pro Lys Glu Trp Lys Ala Arg Gln Met Tyr Asp Asp Ile Glu
50 55 60
Asp Ile Leu Ile Ala Thr Pro Leu Gln Gln Val Thr Ser Gly Gln Gly
65 70 75 80
Gly Val Phe Thr Gln Tyr His Lys Lys Lys Lys Ala Met Arg Val Gly
85 90 95
Gln Tyr Arg Arg Leu Ala Asn Ser Lys Lys Tyr Gln Thr Pro Pro His
100 105 110
Gln Asn Phe Ala Asp Leu Glu Gln Arg Tyr Trp Lys Ser His Pro Gly
115 120 125
Asn Pro Pro Ile Tyr Gly Ala Asp Ile Ser Gly Ser Leu Phe Glu Glu
130 135 140
Ser Thr Lys Gln Trp Asn Leu Gly His Leu Gly Thr Ile Leu Asp Leu
145 150 155 160
Leu Glu Gln Glu Cys Gly Val Val Ile Glu Gly Val Asn Thr Pro Tyr
165 170 175
Leu Tyr Phe Gly Met Trp Lys Thr Thr Phe Ala Trp His Thr Glu Asp
180 185 190
Met Asp Leu Tyr Ser Ile Asn Tyr Leu His Phe Gly Glu Pro Lys Thr
195 200 205
Trp Tyr Val Val Pro Pro Glu His Gly Gln His Leu Glu Arg Leu Ala
210 215 220
Arg Glu Leu Phe Pro Asp Ile Ser Arg Gly Cys Glu Ala Phe Leu Arg
225 230 235 240
His Lys Val Ala Leu Ile Ser Pro Thr Val Leu Lys Glu Asn Gly Ile
245 250 255
Pro Phe Asn Cys Met Thr Gln Glu Ala Gly Glu Phe Met Val Thr Phe
260 265 270
Pro Tyr Gly Tyr His Ala Gly Phe Asn His Gly Phe Asn Cys Ala Glu
275 280 285
Ala Ile Asn Phe Ala Thr Pro Arg Trp Ile Asp Tyr Gly Lys Met Ala
290 295 300
Ser Gln Cys Ser Cys Gly Glu Ser Thr Val Thr Phe Ser Met Asp Pro
305 310 315 320
Phe Val Arg Ile Val Gln Pro Glu Ser Tyr Glu Leu Trp Lys His Arg
325 330 335
Gln Asp Leu Ala Ile Val Glu His Thr Glu Pro Arg Val Ala Glu Ser
340 345 350
Gln Glu Leu Ser Asn Trp Arg Asp Asp Ile Val Leu Arg Arg Ala Ala
355 360 365
Leu Gly Leu Arg Leu Leu Pro Asn Leu Thr Ala Gln Cys Pro Thr Gln
370 375 380
Pro Val Ser Ser Gly His Cys Tyr Asn Pro Lys Gly Cys Gly Thr Asp
385 390 395 400
Ala Val Pro Gly Ser Ala Phe Gln Ser Ser Ala Tyr His Thr Gln Thr
405 410 415
Gln Ser Leu Thr Leu Gly Met Ser Ala Arg Val Leu Leu Pro Ser Thr
420 425 430
Gly Ser Trp Gly Ser Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gln Gly Gln Gly
435 440 445
Arg Gly Cys Ser Arg Gly Arg Gly His Gly Cys Cys Thr Arg Glu Leu
450 455 460
Gly Thr Glu Glu Pro Thr Val Gln Pro Ala Ser Lys Arg Arg Leu Leu
465 470 475 480
Met Gly Thr Arg Ser Arg Ala Gln Gly His Arg Pro Gln Leu Pro Leu
485 490 495
Ala Asn Asp Leu Met Thr Asn Leu Ser Leu
500 505
<210> 47
<211> 2999
<212> DNA
<213> 智人
<400> 47
gatcaactat ccacgctgct cgaatcacag catgctggag ggcctggctg ggtgctctga 60
ctgactgatc acctgacaga cggtgcggtc agtcggatgc tgagaatgac tgacgatgtg 120
atgaggggcg gattgaacga gtcacaggcc agctggccag gagcaaaatc ggcatagctg 180
tctgactcga tggctgtacg tggttacgga ctgtctgccc tgatagaatc tcagcttcaa 240
cgcatcagag gagactgact tgaccaatgg tggggatgag tcgcctgaga aatgacagac 300
tggctgaccc actgacaggc tgcagcgtgt gttgcaagtc ttcttggaat cagctgcagg 360
acctgtgccg cctggccaag ctctcctgcc ctgccctcgg tatctctaag aggaacctct 420
atgactttga agtcgagtac ctgtgcgatt acaagaagat ccgcgaacag gaatattacc 480
tggtgaaatg gcgtggatat ccagactcag agagcacctg ggagccacgg cagaatctca 540
agtgtgtgcg tatcctcaag cagttccaca aggacttaga aagggagctg ctccggcggc 600
accaccggtc aaagaccccc cggcacctgg acccaagctt ggccaactac ctggtgcaga 660
aggccaagca gaggcgggcg ctccgtcgct gggagcagga gctcaatgcc aagcgcagcc 720
atctgggacg catcactgta gagaatgagg tggacctgga cggccctccg cgggccttcg 780
tgtacatcaa tgagtaccgt gttggtgagg gcatcaccct caaccaggtg gctgtgggct 840
gcgagtgcca ggactgtctg tgggcaccca ctggaggctg ctgcccgggg gcgtcactgc 900
acaagtttgc ctacaatgac cagggccagg tgcggcttcg agccgggctg cccatctacg 960
agtgcaactc ccgctgccgc tgcggctatg actgcccaaa tcgtgtggta cagaagggta 1020
tccgatatga cctctgcatc ttccgcacgg atgatgggcg tggctggggc gtccgcaccc 1080
tggagaagat tcgcaagaac agcttcgtca tggagtacgt gggagagatc attacctcag 1140
aggaggcaga gcggcggggc cagatctacg accgtcaggg cgccacctac ctctttgacc 1200
tggactacgt ggaggacgtg tacaccgtgg atgccgccta ctatggcaac atctcccact 1260
ttgtcaacca cagttgtgac cccaacctgc aggtgtacaa cgtcttcata gacaaccttg 1320
acgagcggct gccccgcatc gctttctttg ccacaagaac catccgggca ggcgaggagc 1380
tcacctttga ttacaacatg caagtggacc ccgtggacat ggagagcacc cgcatggact 1440
ccaactttgg cctggctggg ctccctggct cccctaagaa gcgggtccgt attgaatgca 1500
agtgtgggac tgagtcctgc cgcaaatacc tcttctagcc cttagaagtc tgaggccaga 1560
ctgactgagg gggcctgaag ctacatgcac ctcccccact gctgccctcc tgtcgagaat 1620
gactgccagg gcctcgcctg cctccacctg cccccacctg ctcctacctg ctctacgttc 1680
agggctgtgg ccgtggtgag gaccgactcc aggagtcccc tttccctgtc ccagccccat 1740
ctgtgggttg cacttacaaa cccccaccca ccttcagaaa tagtttttca acatcaagac 1800
tctctgtcgt tgggattcat ggcctattaa ggaggtccaa ggggtgagtc ccaacccagc 1860
cccagaatat atttgttttt gcacctgctt ctgcctggag attgaggggt ctgctgcagg 1920
cctcctccct gctgccccaa aggtatgggg aagcaacccc agagcaggca gacatcagag 1980
gccagagtgc ctagcccgac atgaagctgg ttccccaacc acagaaactt tgtactagtg 2040
aaagaaaggg ggtccctggg ctacgggctg aggctggttt ctgctcgtgc ttacagtgct 2100
gggtagtgtt ggccctaaga gctgtagggt ctcttcttca gggctgcata tctgagaagt 2160
ggatgcccac atgccactgg aagggaagtg ggtgtccatg ggccactgag cagtgagagg 2220
aaggcagtgc agagctggcc agccctggag gtaggctggg accaagctct gccttcacag 2280
tgcagtgaag gtacctaggg ctcttgggag ctctgcggtt gctaggggcc ctgacctggg 2340
gtgtcatgac cgctgacacc actcagagct ggaaccaaga tctagatagt ccgtagatag 2400
cacttaggac aagaatgtgc attgatgggg tggtgatgag gtgccaggca ctgggtagag 2460
cacctggtcc acgtggattg tctcagggaa gccttgaaaa ccacggaggt ggatgccagg 2520
aaagggccca tgtggcagaa ggcaaagtac aggccaagaa ttgggggtgg gggagatggc 2580
ttccccacta tgggatgacg aggcgagagg gaagcccttg ctgcctgcca ttcccagacc 2640
ccagcccttt gtgctcaccc tggttccact ggtctcaaaa gtcacctgcc tacaaatgta 2700
caaaaggcga aggttctgat ggctgccttg ctccttgctc ccccaccccc tgtgaggact 2760
tctctaggaa gtccttcctg actacctgtg cccagagtgc ccctacatga gactgtatgc 2820
cctgctatca gatgccagat ctatgtgtct gtctgtgtgt ccatcccgcc ggccccccag 2880
actaacctcc aggcatggac tgaatctggt tctcctcttg tacacccctc aaccctatgc 2940
agcctggagt gggcatcaat aaaatgaact gtcgactgaa caaaaaaaaa aaaaaaaaa 2999
<210> 48
<211> 423
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Met Val Gly Met Ser Arg Leu Arg Asn Asp Arg Leu Ala Asp Pro Leu
1 5 10 15
Thr Gly Cys Ser Val Cys Cys Lys Ser Ser Trp Asn Gln Leu Gln Asp
20 25 30
Leu Cys Arg Leu Ala Lys Leu Ser Cys Pro Ala Leu Gly Ile Ser Lys
35 40 45
Arg Asn Leu Tyr Asp Phe Glu Val Glu Tyr Leu Cys Asp Tyr Lys Lys
50 55 60
Ile Arg Glu Gln Glu Tyr Tyr Leu Val Lys Trp Arg Gly Tyr Pro Asp
65 70 75 80
Ser Glu Ser Thr Trp Glu Pro Arg Gln Asn Leu Lys Cys Val Arg Ile
85 90 95
Leu Lys Gln Phe His Lys Asp Leu Glu Arg Glu Leu Leu Arg Arg His
100 105 110
His Arg Ser Lys Thr Pro Arg His Leu Asp Pro Ser Leu Ala Asn Tyr
115 120 125
Leu Val Gln Lys Ala Lys Gln Arg Arg Ala Leu Arg Arg Trp Glu Gln
130 135 140
Glu Leu Asn Ala Lys Arg Ser His Leu Gly Arg Ile Thr Val Glu Asn
145 150 155 160
Glu Val Asp Leu Asp Gly Pro Pro Arg Ala Phe Val Tyr Ile Asn Glu
165 170 175
Tyr Arg Val Gly Glu Gly Ile Thr Leu Asn Gln Val Ala Val Gly Cys
180 185 190
Glu Cys Gln Asp Cys Leu Trp Ala Pro Thr Gly Gly Cys Cys Pro Gly
195 200 205
Ala Ser Leu His Lys Phe Ala Tyr Asn Asp Gln Gly Gln Val Arg Leu
210 215 220
Arg Ala Gly Leu Pro Ile Tyr Glu Cys Asn Ser Arg Cys Arg Cys Gly
225 230 235 240
Tyr Asp Cys Pro Asn Arg Val Val Gln Lys Gly Ile Arg Tyr Asp Leu
245 250 255
Cys Ile Phe Arg Thr Asp Asp Gly Arg Gly Trp Gly Val Arg Thr Leu
260 265 270
Glu Lys Ile Arg Lys Asn Ser Phe Val Met Glu Tyr Val Gly Glu Ile
275 280 285
Ile Thr Ser Glu Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln Ile Tyr Asp Arg Gln
290 295 300
Gly Ala Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Val Glu Asp Val Tyr Thr
305 310 315 320
Val Asp Ala Ala Tyr Tyr Gly Asn Ile Ser His Phe Val Asn His Ser
325 330 335
Cys Asp Pro Asn Leu Gln Val Tyr Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp
340 345 350
Glu Arg Leu Pro Arg Ile Ala Phe Phe Ala Thr Arg Thr Ile Arg Ala
355 360 365
Gly Glu Glu Leu Thr Phe Asp Tyr Asn Met Gln Val Asp Pro Val Asp
370 375 380
Met Glu Ser Thr Arg Met Asp Ser Asn Phe Gly Leu Ala Gly Leu Pro
385 390 395 400
Gly Ser Pro Lys Lys Arg Val Arg Ile Glu Cys Lys Cys Gly Thr Glu
405 410 415
Ser Cys Arg Lys Tyr Leu Phe
420
<210> 49
<211> 3148
<212> DNA
<213> 智人
<400> 49
aacaagcccc ggcccccaag tcccgcgcgg gccggccagg ggcggggcgt cgggccagct 60
gagctatccc gtcagaccgc gccagtttga atgaaagctc tacaagatgg cggcggtcgg 120
ggccgaggcg cgaggagctt ggtgtgtgcc ttgcctagtt tcacttgata ctcttcagga 180
attatgtaga aaagaaaagc tcacatgtaa atcgattgga atcaccaaaa ggaatctaaa 240
caattatgag gtggaatact tgtgtgacta caaggtagta aaggatatgg aatattatct 300
tgtaaaatgg aaaggatggc cagattctac aaatacttgg gaacctttgc aaaatctgaa 360
gtgcccgtta ctgcttcagc aattctctaa tgacaagcat aattatttat ctcaggtaaa 420
gaaaggcaaa gcaataactc caaaagacaa taacaaaact ttgaaacctg ccattgctga 480
gtacattgtg aagaaggcta aacaaaggat agctctgcag agatggcaag atgaactcaa 540
cagaagaaag aatcataaag gaatgatatt tgttgaaaat actgttgatt tagagggccc 600
accttcagac ttctattaca ttaacgaata caaaccagct cctggaatca gcttagtcaa 660
tgaagctacc tttggttgtt catgcacaga ttgcttcttt caaaaatgtt gtcctgctga 720
agctggagtt cttttggctt ataataaaaa ccaacaaatt aaaatcccac ctggtactcc 780
catctatgaa tgcaactcaa ggtgtcagtg tggtcctgat tgtcccaata ggattgtaca 840
aaaaggcaca cagtattcgc tttgcatctt tcgaactagc aatggacgtg gctggggtgt 900
aaagaccctt gtgaagatta aaagaatgag ttttgtcatg gaatatgttg gagaggtaat 960
cacaagtgaa gaagctgaaa gacgaggaca gttctatgac aacaagggaa tcacgtatct 1020
ctttgatctg gactatgagt ctgatgaatt cacagtggat gcggctcgat acggcaatgt 1080
gtctcatttt gtgaatcaca gctgtgaccc aaatcttcag gtgttcaatg ttttcattga 1140
taacctcgat actcgtcttc cccgaatagc attgttttcc acaagaacca taaatgctgg 1200
agaagagctg acttttgatt atcaaatgaa aggttctgga gatatatctt cagattctat 1260
tgaccacagc ccagccaaaa agagggtcag aacagtatgt aaatgtggag ctgtgacttg 1320
cagaggttac ctcaactgaa ctttttcagg aaatagagct gatgattata atattttttt 1380
cctaatgtta acatttttaa aaatacatat ttgggactct tattatcaag gttctaccta 1440
tgttaattta caattcatgt ttcaagacat ttgccaaatg tattaccgat gcctctgaaa 1500
agggggtcac tgggtctcat agactgatat gaagtcgaca tatttatagt gcttagagac 1560
caaactaatg gaaggcagac tatttacagc ttagtatatg tgtacttaag tctatgtgaa 1620
cagagaaatg cctcccgtag tgtttgaaag cgttaagctg ataatgtaat taacaactgc 1680
tgagagatca aagattcaac ttgccataca cctcaaattc ggagaaacag ttaatttggg 1740
caaatctaca gttctgtttt tgctactcta ttgtcattcc tgtttaatac tcactgtact 1800
tgtatttgag acaaataggt gatactgaat tttatactgt tttctacttt tccattaaaa 1860
cattggcacc tcaatgataa agaaatttaa ggtataaaat taaatgtaaa aattaatttc 1920
agcttcattt cgtatttcga agcaatctag actgttgtga tgagtgtatg tctgaacctg 1980
taattcttaa aagacttctt aatcttctag aagaaaaatc tccgaagagc tctctctaga 2040
agtccaaaat ggctagccat tatgcttctt tgaaaggaca tgataatggg accaggatgg 2100
ttttttggag taccaagcaa ggggaatgga gcactttaag ggcgcctgtt agtaacatga 2160
attggaaatc tgtgtcgagt acctctgatc taaacggtaa aacaagctgc ctggagagca 2220
gctgtaccta acaatactgt aatgtacatt aacattacag cctctcaatt tcaggcaggt 2280
gtaacagttc ctttccacca gatttaatat ttttatactt cctgcaggtt cttcttaaaa 2340
agtaatctat atttttgaac tgatacttgt tttatacata aatttttttt agatgtgata 2400
aagctaaact tggccaaagt gtgtgcctga attattagac ctttttatta gtcaacctac 2460
gaagactaaa atagaatata ttagttttca agggagtggg aggcttccaa catagtattg 2520
aatctcagga aaaactattc tttcatgtct gattctgaga tttctaattg tgttgtgaaa 2580
atgataaatg cagcaaatct agctttcagt attcctaatt tttacctaag ctcattgctc 2640
caggctttga ttacctaaaa taagcttgga taaaattgaa ccaacttcaa gaatgcagca 2700
cttcttaatc tttagctctt tcttgggaga agctagactt tattcattat attgctatga 2760
caacttcact ctttcataat atataggata aattgtttac atgattggac cctcagattc 2820
tgttaaccaa aattgcagaa tggggggcca ggcctgtgtg gtggctcaca cctgtgatcc 2880
cagcactttg ggaggctgag gtaggaggat cacgtgaggt cgggagttca agaccagcct 2940
ggccatcatg gtgaaaccct gtctctactg aaaatacaaa aattagccgg gcgtggtggc 3000
acacgcctgt agtcccagct actcaggagg ctgaggcagg agaatcactt gaattcagga 3060
ggcggaggtt gcagtgagcc aagatcatac cactgcactg cagcctgagt gacacagtaa 3120
gactgtctcc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3148
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成寡核苷酸
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (3)..(31)
<223> a、c、t、g、未知或其它
<400> 50
aannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntt 33
<210> 51
<211> 3106
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
agtttgaatg aaagctctac aagatggcgg cggtcggggc cgaggcgcga ggaggtgagg 60
ctggagcgcg gccccctcgc cttccctgtt cccagcttgg tgtgtgcctt gcctagtttc 120
acttgatact cttcaggaat tatgtagaaa agaaaagctc acatgtaaat cgattggaat 180
caccaaaagg aatctaaaca attatgaggt ggaatacttg tgtgactaca aggtagtaaa 240
ggatatggaa tattatcttg taaaatggaa aggatggcca gattctacaa atacttggga 300
acctttgcaa aatctgaagt gcccgttact gcttcagcaa ttctctaatg acaagcataa 360
ttatttatct caggtaaaga aaggcaaagc aataactcca aaagacaata acaaaacttt 420
gaaacctgcc attgctgagt acattgtgaa gaaggctaaa caaaggatag ctctgcagag 480
atggcaagat gaactcaaca gaagaaagaa tcataaagga atgatatttg ttgaaaatac 540
tgttgattta gagggcccac cttcagactt ctattacatt aacgaataca aaccagctcc 600
tggaatcagc ttagtcaatg aagctacctt tggttgttca tgcacagatt gcttctttca 660
aaaatgttgt cctgctgaag ctggagttct tttggcttat aataaaaacc aacaaattaa 720
aatcccacct ggtactccca tctatgaatg caactcaagg tgtcagtgtg gtcctgattg 780
tcccaatagg attgtacaaa aaggcacaca gtattcgctt tgcatctttc gaactagcaa 840
tggacgtggc tggggtgtaa agacccttgt gaagattaaa agaatgagtt ttgtcatgga 900
atatgttgga gaggtaatca caagtgaaga agctgaaaga cgaggacagt tctatgacaa 960
caagggaatc acgtatctct ttgatctgga ctatgagtct gatgaattca cagtggatgc 1020
ggctcgatac ggcaatgtgt ctcattttgt gaatcacagc tgtgacccaa atcttcaggt 1080
gttcaatgtt ttcattgata acctcgatac tcgtcttccc cgaatagcat tgttttccac 1140
aagaaccata aatgctggag aagagctgac ttttgattat caaatgaaag gttctggaga 1200
tatatcttca gattctattg accacagccc agccaaaaag agggtcagaa cagtatgtaa 1260
atgtggagct gtgacttgca gaggttacct caactgaact ttttcaggaa atagagctga 1320
tgattataat atttttttcc taatgttaac atttttaaaa atacatattt gggactctta 1380
ttatcaaggt tctacctatg ttaatttaca attcatgttt caagacattt gccaaatgta 1440
ttaccgatgc ctctgaaaag ggggtcactg ggtctcatag actgatatga agtcgacata 1500
tttatagtgc ttagagacca aactaatgga aggcagacta tttacagctt agtatatgtg 1560
tacttaagtc tatgtgaaca gagaaatgcc tcccgtagtg tttgaaagcg ttaagctgat 1620
aatgtaatta acaactgctg agagatcaaa gattcaactt gccatacacc tcaaattcgg 1680
agaaacagtt aatttgggca aatctacagt tctgtttttg ctactctatt gtcattcctg 1740
tttaatactc actgtacttg tatttgagac aaataggtga tactgaattt tatactgttt 1800
tctacttttc cattaaaaca ttggcacctc aatgataaag aaatttaagg tataaaatta 1860
aatgtaaaaa ttaatttcag cttcatttcg tatttcgaag caatctagac tgttgtgatg 1920
agtgtatgtc tgaacctgta attcttaaaa gacttcttaa tcttctagaa gaaaaatctc 1980
cgaagagctc tctctagaag tccaaaatgg ctagccatta tgcttctttg aaaggacatg 2040
ataatgggac caggatggtt ttttggagta ccaagcaagg ggaatggagc actttaaggg 2100
cgcctgttag taacatgaat tggaaatctg tgtcgagtac ctctgatcta aacggtaaaa 2160
caagctgcct ggagagcagc tgtacctaac aatactgtaa tgtacattaa cattacagcc 2220
tctcaatttc aggcaggtgt aacagttcct ttccaccaga tttaatattt ttatacttcc 2280
tgcaggttct tcttaaaaag taatctatat ttttgaactg atacttgttt tatacataaa 2340
ttttttttag atgtgataaa gctaaacttg gccaaagtgt gtgcctgaat tattagacct 2400
ttttattagt caacctacga agactaaaat agaatatatt agttttcaag ggagtgggag 2460
gcttccaaca tagtattgaa tctcaggaaa aactattctt tcatgtctga ttctgagatt 2520
tctaattgtg ttgtgaaaat gataaatgca gcaaatctag ctttcagtat tcctaatttt 2580
tacctaagct cattgctcca ggctttgatt acctaaaata agcttggata aaattgaacc 2640
aacttcaaga atgcagcact tcttaatctt tagctctttc ttgggagaag ctagacttta 2700
ttcattatat tgctatgaca acttcactct ttcataatat ataggataaa ttgtttacat 2760
gattggaccc tcagattctg ttaaccaaaa ttgcagaatg gggggccagg cctgtgtggt 2820
ggctcacacc tgtgatccca gcactttggg aggctgaggt aggaggatca cgtgaggtcg 2880
ggagttcaag accagcctgg ccatcatggt gaaaccctgt ctctactgaa aatacaaaaa 2940
ttagccgggc gtggtggcac acgcctgtag tcccagctac tcaggaggct gaggcaggag 3000
aatcacttga attcaggagg cggaggttgc agtgagccaa gatcatacca ctgcactgca 3060
gcctgagtga cacagtaaga ctgtctccaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3106
<210> 52
<211> 2608
<212> DNA
<213> 智人
<400> 52
aacaagcccc ggcccccaag tcccgcgcgg gccggccagg ggcggggcgt cgggccagct 60
gagctatccc gtcagaccgc gccagtttga atgaaagctc tacaagatgg cggcggtcgg 120
ggccgaggcg cgaggagctt ggtgtgtgcc ttgcctagtt tcacttgata ctcttcagga 180
attatgtaga aaagaaaagc tcacatgtaa atcgattgga atcaccaaaa ggaatctaaa 240
caattatgag gtggaatact tgtgtgacta caaggtagta aaggatatgg aatattatct 300
tgtaaaatgg aaaggatggc cagattctac aaatacttgg gaacctttgc aaaatctgaa 360
gtgcccgtta ctgcttcagc aattctctaa tgacaagcat aattatttat ctcaggtaat 420
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ctttgatctg gactatgagt ctgatgaatt cacagtggat gcggctcgat acggcaatgt 540
gtctcatttt gtgaatcaca gctgtgaccc aaatcttcag gtgttcaatg ttttcattga 600
taacctcgat actcgtcttc cccgaatagc attgttttcc acaagaacca taaatgctgg 660
agaagagctg acttttgatt atcaaatgaa aggttctgga gatatatctt cagattctat 720
tgaccacagc ccagccaaaa agagggtcag aacagtatgt aaatgtggag ctgtgacttg 780
cagaggttac ctcaactgaa ctttttcagg aaatagagct gatgattata atattttttt 840
cctaatgtta acatttttaa aaatacatat ttgggactct tattatcaag gttctaccta 900
tgttaattta caattcatgt ttcaagacat ttgccaaatg tattaccgat gcctctgaaa 960
agggggtcac tgggtctcat agactgatat gaagtcgaca tatttatagt gcttagagac 1020
caaactaatg gaaggcagac tatttacagc ttagtatatg tgtacttaag tctatgtgaa 1080
cagagaaatg cctcccgtag tgtttgaaag cgttaagctg ataatgtaat taacaactgc 1140
tgagagatca aagattcaac ttgccataca cctcaaattc ggagaaacag ttaatttggg 1200
caaatctaca gttctgtttt tgctactcta ttgtcattcc tgtttaatac tcactgtact 1260
tgtatttgag acaaataggt gatactgaat tttatactgt tttctacttt tccattaaaa 1320
cattggcacc tcaatgataa agaaatttaa ggtataaaat taaatgtaaa aattaatttc 1380
agcttcattt cgtatttcga agcaatctag actgttgtga tgagtgtatg tctgaacctg 1440
taattcttaa aagacttctt aatcttctag aagaaaaatc tccgaagagc tctctctaga 1500
agtccaaaat ggctagccat tatgcttctt tgaaaggaca tgataatggg accaggatgg 1560
ttttttggag taccaagcaa ggggaatgga gcactttaag ggcgcctgtt agtaacatga 1620
attggaaatc tgtgtcgagt acctctgatc taaacggtaa aacaagctgc ctggagagca 1680
gctgtaccta acaatactgt aatgtacatt aacattacag cctctcaatt tcaggcaggt 1740
gtaacagttc ctttccacca gatttaatat ttttatactt cctgcaggtt cttcttaaaa 1800
agtaatctat atttttgaac tgatacttgt tttatacata aatttttttt agatgtgata 1860
aagctaaact tggccaaagt gtgtgcctga attattagac ctttttatta gtcaacctac 1920
gaagactaaa atagaatata ttagttttca agggagtggg aggcttccaa catagtattg 1980
aatctcagga aaaactattc tttcatgtct gattctgaga tttctaattg tgttgtgaaa 2040
atgataaatg cagcaaatct agctttcagt attcctaatt tttacctaag ctcattgctc 2100
caggctttga ttacctaaaa taagcttgga taaaattgaa ccaacttcaa gaatgcagca 2160
cttcttaatc tttagctctt tcttgggaga agctagactt tattcattat attgctatga 2220
caacttcact ctttcataat atataggata aattgtttac atgattggac cctcagattc 2280
tgttaaccaa aattgcagaa tggggggcca ggcctgtgtg gtggctcaca cctgtgatcc 2340
cagcactttg ggaggctgag gtaggaggat cacgtgaggt cgggagttca agaccagcct 2400
ggccatcatg gtgaaaccct gtctctactg aaaatacaaa aattagccgg gcgtggtggc 2460
acacgcctgt agtcccagct actcaggagg ctgaggcagg agaatcactt gaattcagga 2520
ggcggaggtt gcagtgagcc aagatcatac cactgcactg cagcctgagt gacacagtaa 2580
gactgtctcc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2608
<210> 53
<211> 2566
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
agtttgaatg aaagctctac aagatggcgg cggtcggggc cgaggcgcga ggaggtgagg 60
ctggagcgcg gccccctcgc cttccctgtt cccagcttgg tgtgtgcctt gcctagtttc 120
acttgatact cttcaggaat tatgtagaaa agaaaagctc acatgtaaat cgattggaat 180
caccaaaagg aatctaaaca attatgaggt ggaatacttg tgtgactaca aggtagtaaa 240
ggatatggaa tattatcttg taaaatggaa aggatggcca gattctacaa atacttggga 300
acctttgcaa aatctgaagt gcccgttact gcttcagcaa ttctctaatg acaagcataa 360
ttatttatct caggtaatca caagtgaaga agctgaaaga cgaggacagt tctatgacaa 420
caagggaatc acgtatctct ttgatctgga ctatgagtct gatgaattca cagtggatgc 480
ggctcgatac ggcaatgtgt ctcattttgt gaatcacagc tgtgacccaa atcttcaggt 540
gttcaatgtt ttcattgata acctcgatac tcgtcttccc cgaatagcat tgttttccac 600
aagaaccata aatgctggag aagagctgac ttttgattat caaatgaaag gttctggaga 660
tatatcttca gattctattg accacagccc agccaaaaag agggtcagaa cagtatgtaa 720
atgtggagct gtgacttgca gaggttacct caactgaact ttttcaggaa atagagctga 780
tgattataat atttttttcc taatgttaac atttttaaaa atacatattt gggactctta 840
ttatcaaggt tctacctatg ttaatttaca attcatgttt caagacattt gccaaatgta 900
ttaccgatgc ctctgaaaag ggggtcactg ggtctcatag actgatatga agtcgacata 960
tttatagtgc ttagagacca aactaatgga aggcagacta tttacagctt agtatatgtg 1020
tacttaagtc tatgtgaaca gagaaatgcc tcccgtagtg tttgaaagcg ttaagctgat 1080
aatgtaatta acaactgctg agagatcaaa gattcaactt gccatacacc tcaaattcgg 1140
agaaacagtt aatttgggca aatctacagt tctgtttttg ctactctatt gtcattcctg 1200
tttaatactc actgtacttg tatttgagac aaataggtga tactgaattt tatactgttt 1260
tctacttttc cattaaaaca ttggcacctc aatgataaag aaatttaagg tataaaatta 1320
aatgtaaaaa ttaatttcag cttcatttcg tatttcgaag caatctagac tgttgtgatg 1380
agtgtatgtc tgaacctgta attcttaaaa gacttcttaa tcttctagaa gaaaaatctc 1440
cgaagagctc tctctagaag tccaaaatgg ctagccatta tgcttctttg aaaggacatg 1500
ataatgggac caggatggtt ttttggagta ccaagcaagg ggaatggagc actttaaggg 1560
cgcctgttag taacatgaat tggaaatctg tgtcgagtac ctctgatcta aacggtaaaa 1620
caagctgcct ggagagcagc tgtacctaac aatactgtaa tgtacattaa cattacagcc 1680
tctcaatttc aggcaggtgt aacagttcct ttccaccaga tttaatattt ttatacttcc 1740
tgcaggttct tcttaaaaag taatctatat ttttgaactg atacttgttt tatacataaa 1800
ttttttttag atgtgataaa gctaaacttg gccaaagtgt gtgcctgaat tattagacct 1860
ttttattagt caacctacga agactaaaat agaatatatt agttttcaag ggagtgggag 1920
gcttccaaca tagtattgaa tctcaggaaa aactattctt tcatgtctga ttctgagatt 1980
tctaattgtg ttgtgaaaat gataaatgca gcaaatctag ctttcagtat tcctaatttt 2040
tacctaagct cattgctcca ggctttgatt acctaaaata agcttggata aaattgaacc 2100
aacttcaaga atgcagcact tcttaatctt tagctctttc ttgggagaag ctagacttta 2160
ttcattatat tgctatgaca acttcactct ttcataatat ataggataaa ttgtttacat 2220
gattggaccc tcagattctg ttaaccaaaa ttgcagaatg gggggccagg cctgtgtggt 2280
ggctcacacc tgtgatccca gcactttggg aggctgaggt aggaggatca cgtgaggtcg 2340
ggagttcaag accagcctgg ccatcatggt gaaaccctgt ctctactgaa aatacaaaaa 2400
ttagccgggc gtggtggcac acgcctgtag tcccagctac tcaggaggct gaggcaggag 2460
aatcacttga attcaggagg cggaggttgc agtgagccaa gatcatacca ctgcactgca 2520
gcctgagtga cacagtaaga ctgtctccaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2566
<210> 54
<211> 410
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Met Ala Ala Val Gly Ala Glu Ala Arg Gly Ala Trp Cys Val Pro Cys
1 5 10 15
Leu Val Ser Leu Asp Thr Leu Gln Glu Leu Cys Arg Lys Glu Lys Leu
20 25 30
Thr Cys Lys Ser Ile Gly Ile Thr Lys Arg Asn Leu Asn Asn Tyr Glu
35 40 45
Val Glu Tyr Leu Cys Asp Tyr Lys Val Val Lys Asp Met Glu Tyr Tyr
50 55 60
Leu Val Lys Trp Lys Gly Trp Pro Asp Ser Thr Asn Thr Trp Glu Pro
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Lys Cys Pro Leu Leu Leu Gln Gln Phe Ser Asn Asp
85 90 95
Lys His Asn Tyr Leu Ser Gln Val Lys Lys Gly Lys Ala Ile Thr Pro
100 105 110
Lys Asp Asn Asn Lys Thr Leu Lys Pro Ala Ile Ala Glu Tyr Ile Val
115 120 125
Lys Lys Ala Lys Gln Arg Ile Ala Leu Gln Arg Trp Gln Asp Glu Leu
130 135 140
Asn Arg Arg Lys Asn His Lys Gly Met Ile Phe Val Glu Asn Thr Val
145 150 155 160
Asp Leu Glu Gly Pro Pro Ser Asp Phe Tyr Tyr Ile Asn Glu Tyr Lys
165 170 175
Pro Ala Pro Gly Ile Ser Leu Val Asn Glu Ala Thr Phe Gly Cys Ser
180 185 190
Cys Thr Asp Cys Phe Phe Gln Lys Cys Cys Pro Ala Glu Ala Gly Val
195 200 205
Leu Leu Ala Tyr Asn Lys Asn Gln Gln Ile Lys Ile Pro Pro Gly Thr
210 215 220
Pro Ile Tyr Glu Cys Asn Ser Arg Cys Gln Cys Gly Pro Asp Cys Pro
225 230 235 240
Asn Arg Ile Val Gln Lys Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Cys Ile Phe Arg
245 250 255
Thr Ser Asn Gly Arg Gly Trp Gly Val Lys Thr Leu Val Lys Ile Lys
260 265 270
Arg Met Ser Phe Val Met Glu Tyr Val Gly Glu Val Ile Thr Ser Glu
275 280 285
Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln Phe Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr
290 295 300
Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala
305 310 315 320
Arg Tyr Gly Asn Val Ser His Phe Val Asn His Ser Cys Asp Pro Asn
325 330 335
Leu Gln Val Phe Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp Thr Arg Leu Pro
340 345 350
Arg Ile Ala Leu Phe Ser Thr Arg Thr Ile Asn Ala Gly Glu Glu Leu
355 360 365
Thr Phe Asp Tyr Gln Met Lys Gly Ser Gly Asp Ile Ser Ser Asp Ser
370 375 380
Ile Asp His Ser Pro Ala Lys Lys Arg Val Arg Thr Val Cys Lys Cys
385 390 395 400
Gly Ala Val Thr Cys Arg Gly Tyr Leu Asn
405 410
<210> 55
<211> 350
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Met Glu Tyr Tyr Leu Val Lys Trp Lys Gly Trp Pro Asp Ser Thr Asn
1 5 10 15
Thr Trp Glu Pro Leu Gln Asn Leu Lys Cys Pro Leu Leu Leu Gln Gln
20 25 30
Phe Ser Asn Asp Lys His Asn Tyr Leu Ser Gln Val Lys Lys Gly Lys
35 40 45
Ala Ile Thr Pro Lys Asp Asn Asn Lys Thr Leu Lys Pro Ala Ile Ala
50 55 60
Glu Tyr Ile Val Lys Lys Ala Lys Gln Arg Ile Ala Leu Gln Arg Trp
65 70 75 80
Gln Asp Glu Leu Asn Arg Arg Lys Asn His Lys Gly Met Ile Phe Val
85 90 95
Glu Asn Thr Val Asp Leu Glu Gly Pro Pro Ser Asp Phe Tyr Tyr Ile
100 105 110
Asn Glu Tyr Lys Pro Ala Pro Gly Ile Ser Leu Val Asn Glu Ala Thr
115 120 125
Phe Gly Cys Ser Cys Thr Asp Cys Phe Phe Gln Lys Cys Cys Pro Ala
130 135 140
Glu Ala Gly Val Leu Leu Ala Tyr Asn Lys Asn Gln Gln Ile Lys Ile
145 150 155 160
Pro Pro Gly Thr Pro Ile Tyr Glu Cys Asn Ser Arg Cys Gln Cys Gly
165 170 175
Pro Asp Cys Pro Asn Arg Ile Val Gln Lys Gly Thr Gln Tyr Ser Leu
180 185 190
Cys Ile Phe Arg Thr Ser Asn Gly Arg Gly Trp Gly Val Lys Thr Leu
195 200 205
Val Lys Ile Lys Arg Met Ser Phe Val Met Glu Tyr Val Gly Glu Val
210 215 220
Ile Thr Ser Glu Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln Phe Tyr Asp Asn Lys
225 230 235 240
Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr
245 250 255
Val Asp Ala Ala Arg Tyr Gly Asn Val Ser His Phe Val Asn His Ser
260 265 270
Cys Asp Pro Asn Leu Gln Val Phe Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp
275 280 285
Thr Arg Leu Pro Arg Ile Ala Leu Phe Ser Thr Arg Thr Ile Asn Ala
290 295 300
Gly Glu Glu Leu Thr Phe Asp Tyr Gln Met Lys Gly Ser Gly Asp Ile
305 310 315 320
Ser Ser Asp Ser Ile Asp His Ser Pro Ala Lys Lys Arg Val Arg Thr
325 330 335
Val Cys Lys Cys Gly Ala Val Thr Cys Arg Gly Tyr Leu Asn
340 345 350
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<211> 230
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Met Ala Ala Val Gly Ala Glu Ala Arg Gly Ala Trp Cys Val Pro Cys
1 5 10 15
Leu Val Ser Leu Asp Thr Leu Gln Glu Leu Cys Arg Lys Glu Lys Leu
20 25 30
Thr Cys Lys Ser Ile Gly Ile Thr Lys Arg Asn Leu Asn Asn Tyr Glu
35 40 45
Val Glu Tyr Leu Cys Asp Tyr Lys Val Val Lys Asp Met Glu Tyr Tyr
50 55 60
Leu Val Lys Trp Lys Gly Trp Pro Asp Ser Thr Asn Thr Trp Glu Pro
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Lys Cys Pro Leu Leu Leu Gln Gln Phe Ser Asn Asp
85 90 95
Lys His Asn Tyr Leu Ser Gln Val Ile Thr Ser Glu Glu Ala Glu Arg
100 105 110
Arg Gly Gln Phe Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Asp Leu
115 120 125
Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala Arg Tyr Gly Asn
130 135 140
Val Ser His Phe Val Asn His Ser Cys Asp Pro Asn Leu Gln Val Phe
145 150 155 160
Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp Thr Arg Leu Pro Arg Ile Ala Leu
165 170 175
Phe Ser Thr Arg Thr Ile Asn Ala Gly Glu Glu Leu Thr Phe Asp Tyr
180 185 190
Gln Met Lys Gly Ser Gly Asp Ile Ser Ser Asp Ser Ile Asp His Ser
195 200 205
Pro Ala Lys Lys Arg Val Arg Thr Val Cys Lys Cys Gly Ala Val Thr
210 215 220
Cys Arg Gly Tyr Leu Asn
225 230
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<211> 170
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Met Glu Tyr Tyr Leu Val Lys Trp Lys Gly Trp Pro Asp Ser Thr Asn
1 5 10 15
Thr Trp Glu Pro Leu Gln Asn Leu Lys Cys Pro Leu Leu Leu Gln Gln
20 25 30
Phe Ser Asn Asp Lys His Asn Tyr Leu Ser Gln Val Ile Thr Ser Glu
35 40 45
Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln Phe Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr
50 55 60
Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala
65 70 75 80
Arg Tyr Gly Asn Val Ser His Phe Val Asn His Ser Cys Asp Pro Asn
85 90 95
Leu Gln Val Phe Asn Val Phe Ile Asp Asn Leu Asp Thr Arg Leu Pro
100 105 110
Arg Ile Ala Leu Phe Ser Thr Arg Thr Ile Asn Ala Gly Glu Glu Leu
115 120 125
Thr Phe Asp Tyr Gln Met Lys Gly Ser Gly Asp Ile Ser Ser Asp Ser
130 135 140
Ile Asp His Ser Pro Ala Lys Lys Arg Val Arg Thr Val Cys Lys Cys
145 150 155 160
Gly Ala Val Thr Cys Arg Gly Tyr Leu Asn
165 170
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<400> 58
aaggattaga ctgaaccgaa ttggtatata gtt 33
<210> 59
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
aaggattaga ctgagctgaa ttggtatata gt 32
<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<400> 60
caaactacca cttacctccc tcaccaaagc cca 33
<210> 61
<211> 34
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
caaactacca cttacctccc tcaccaaagc ccat 34
<210> 62
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
caaactacca cctacctccc tcaccaaagc cca 33
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 63
attaatgcaa acaataccta acagacccac ag 32
<210> 64
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 64
attaatgcaa acaataccta acagacccac a 31
<210> 65
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
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<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<400> 66
gtactcccga ttgaaacccc cattcgtata ata 33
<210> 67
<211> 34
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
gtactcccga ttgaaacccc cattcgtata ataa 34
<210> 68
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<400> 68
gtactcccga ttgaagcccc cattcgtata ata 33
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<213> 智人
<400> 69
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<210> 70
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<400> 70
ctccctagga ggcctacccc cgctaaccgg ctt 33

Claims (73)

1.一种增加人类体细胞核转移(hSCNT)效率的方法，该方法包含：
令杂交卵母细胞与增加组蛋白去甲基化酶KDM4家族成员表达的试剂接触，其中，该杂交卵母细胞是包含人类体细胞遗传物质的去核人类卵母细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，该接触出现在该杂交卵母细胞的激活或融合之后，但在人类受精卵基因组激活(ZGA)开始之前。
3.一种增加人类体细胞核转移(SCNT)效率的方法，该方法包含下述至少一项：
(iv)令供体人类体细胞或接纳体人类卵母细胞与至少一种降低该供体人类体细胞或该接纳体人类卵母细胞中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该接纳体人类卵母细胞是有核的或去核的卵母细胞；若该接纳体人类卵母细胞是有核的，将该人类卵母细胞去核；将来自该供体人类体细胞的细胞核转移至该去核的卵母细胞中，以形成杂交卵母细胞；以及，激活该杂交卵母细胞以形成人类SCNT胚胎；或
(v)令杂交卵母细胞与至少一种降低该杂交卵母细胞中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，杂交卵母细胞是包含人类体细胞遗传物质的去核人类卵母细胞；以及，激活该杂交卵母细胞，以形成人类SCNT胚胎；或
(vi)令激活后的人类SCNT胚胎与至少一种降低人类SCNT胚胎中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该SCNT胚胎是从去核的人类卵母细胞与人类体细胞遗传物质的融合生成的；
其中，降低在该供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞、杂交卵母细胞或该人类SCNT胚胎中任何一种中的H3K9me3甲基化增加了该SCNT的效率。
4.一种生产人类细胞核转移胚胎干细胞(hNT-ESC)的方法，该方法包含：
a.下述至少一项：(i)令供体人类体细胞或接纳体人类卵母细胞与至少一种降低该供体人类体细胞或该接纳体人类卵母细胞中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该接纳体人类卵母细胞是有核的或去核的卵母细胞；若该接纳体人类卵母细胞是有核的，将该人类卵母细胞去核；将来自该供体人类体细胞的细胞核转移至该去核的卵母细胞中，以形成杂交卵母细胞；以及，激活该杂交卵母细胞以形成人类SCNT胚胎；或
(ii)令杂交卵母细胞与至少一种降低该杂交卵母细胞中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，杂交卵母细胞是包含人类体细胞遗传物质的去核人类卵母细胞；以及，激活该杂交卵母细胞，以形成人类SCNT胚胎；或
(iii)令激活后的人类SCNT胚胎与至少一种降低人类SCNT胚胎中H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该SCNT胚胎是从去核的人类卵母细胞与人类体细胞遗传物质的融合而生成的；
b.将该SCNT胚胎孵化足够的时间以形成囊胚；从该囊胚中收集至少一个卵裂球；以及培养该至少一个卵裂球以形成至少一个人类NT-ESC。
5.一种生产人类体细胞核转移(SCNT)胚胎的方法，包含：
令供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞或人类体细胞核转移(SCNT)胚胎中的至少一者与至少一种降低该供体人类体细胞、该接纳体人类卵母细胞或该人类SCNT胚胎中的H3K9me3甲基化的试剂接触，其中，该接纳体人类卵母细胞是有核的或去核的卵母细胞；若该接纳体人类卵母细胞是有核的，将该人类卵母细胞去核；
将来自该供体人类体细胞的细胞核转移至该去核的卵母细胞中，以形成杂交卵母细胞；
激活该杂交卵母细胞；以及
将该杂交卵母细胞孵化足够的时间，以形成人类SCNT胚胎。
6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其中，该降低H3K9me3甲基化的试剂是增加人类KDM4家族的组蛋白去甲基化酶成员的表达的试剂。
7.如权利要求6所述的方法，其中，该试剂增加人类KDM4
(JMJD2)家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，该试剂增加下述至少一种酶的表达或活性：KDM4A(JMJD2A)、KDM4B(JMJD2B)、KDM4C(JMJD2C)、KDM4D(JMJD4D)或KDM4E(JMJD2E)。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，该试剂增加KDM4A(JMJD2A)的表达或活性。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，该试剂包含对应于SEQ ID NO：1至SEQID NO：4或SEQ ID NO：45的核酸序列或其生物学活性片段，其将SCNT的效率增加至与SEQID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45的对应序列相比较下相似或更高的程度。
11.如权利要求6所述的方法，其中，该试剂包含对应于SEQ ID NO：1的核酸序列或其生物学活性片段，其将SCNT效率增加至与SEQ ID NO：1的核酸序列相比较下相似或更高的程度。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，该试剂是H3K9甲基转移酶的抑制剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中，该H3K9甲基转移酶是SUV39h1或SUV39h2。
14.如权利要求12所述的方法，其中，该H3K9甲基转移酶是SETDB1。
15.如权利要求12所述的方法，其中，SUV39h1、SUV39h2和SETDB1中的两种或更多种酶被抑制。
16.如权利要求12所述的方法，其中，该抑制H3K9甲基转移酶的试剂选自RNAi剂、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpfl寡核苷酸、中和抗体或抗体片段、适配体、小分子、肽抑制剂、蛋白抑制剂、avidimir、及其功能性片段或衍生物组成的群组。
17.如权利要求16所述的方法，其中，该RNAi剂是siRNA或shRNA分子。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，该试剂包含核酸抑制剂以抑制SEQID NO：14至SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53的表达。
19.如权利要求17所述的方法，其中，该RNAi剂杂交至SEQ ID NO：14至SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53的至少一部分。
20.如权利要求17所述的方法，其中，该RNAi剂包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8、SEQID NO：18或SEQ ID NO：19或其至少10个连贯核酸的片段的任意个或组合，或是具有与SEQID NO：7或SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的一致性为至少80％的序列的同源物。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，该接纳体人类卵母细胞是去核的人类卵母细胞。
22.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，该人类SCNT胚胎是选自1细胞阶段SCNT胚胎、激活后5小时(5hpa)的SCNT胚胎、激活后10至12小时(10-12hpa)之间的SCNT胚胎、激活后20至28小时(20-28hpa)之间的SCNT胚胎、2细胞阶段SCNT胚胎的任何胚胎。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，该试剂在细胞核转移之前接触接纳体卵母细胞或去核的人类卵母细胞。
24.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，该试剂在SCNT胚胎处于1细胞阶段之前、或在激活后约5小时、或当该SCNT胚胎处于1细胞阶段时接触该SCNT胚胎。
25.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，该试剂在激活后5小时(5hpa)、或激活后12小时(12hpa)、或激活后20小时(20hpa)、或当该SCNT胚胎处于2细胞阶段时、或在5hpa与28hpa之间的任何时间，接触该人类SCNT胚胎。
26.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，令接纳体人类卵母细胞或杂交卵母细胞或人类SCNT胚胎与该试剂接触的步骤，包含将该试剂注射入该接纳体人类卵母细胞或杂交卵母细胞或人类SCNT胚胎的细胞核或细胞质内。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，该试剂增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性。
28.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，该试剂在移除用于注射入去核的人类卵母细胞内的细胞核之前，接触该供体人类体细胞的细胞质或细胞核。
29.如权利要求28所述的方法，其中，在将该供体人类体细胞的细胞核注射入去核的人类卵母细胞内之前，令该供体人类体细胞与该试剂接触至少24小时或至少1天。
30.如权利要求28所述的方法，其中，在将该供体人类体细胞的细胞核注射入去核的人类卵母细胞内之前，该试剂与该供体人类体细胞接触至少24小时、或至少48小时、或至少3天。
31.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中，该试剂抑制H3K9甲基转移酶。
32.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中，该H3K9甲基转移酶是SUV39h1或SUV39h2、或SUV39h1及SUV39h2(SUV39h1/2)。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中，该供体人类体细胞是终末分化体细胞。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中，该供体人类体细胞不是胚胎干细胞、或诱导多能干(iPS)细胞、或胎儿细胞、或胚细胞。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中，该供体人类体细胞选自卵丘细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌肉细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胎儿细胞、胎盘细胞、及成年细胞组成的群组。
36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中，该供体人类体细胞是成纤维细胞或卵丘细胞。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中，该试剂接触该供体人类体细胞的细胞核，以从该供体人类体细胞移除该细胞核，并将该细胞核用于注射入去核的接纳体人类卵母细胞中。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中，该方法造成hSCNT发育囊胚的效率比不存在降低H3K9me3甲基化的试剂的情况下实施的hSCNT增加至少10％。
39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中，该方法造成hSCNT发育囊胚的效率比不存在降低H3K9me3甲基化的试剂的情况下实施的hSCNT增加10％至20％。
40.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中，该方法造成hSCNT发育囊胚的效率比不存在降低H3K9me3甲基化的试剂的情况下实施的hSCNT增加超过20％。
41.如权利要求38至40中任一项所述的方法，其中，该SCNT效率的增加是人类SCNT胚胎至囊胚阶段的发育的增加。
42.如权利要求38至40中任一项所述的方法，其中，该SCNT效率的增加是源自人类SCNT胚胎的胚胎干细胞(hNT-ESC)衍生物的增加。
43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中，该供体人类体细胞是基因修饰的供体人类细胞。
44.如权利要求5所述的方法，进一步包含体外培养该人类SCNT胚胎，以形成人类囊胚。
45.如权利要求44所述的方法，其中，该人类SCNT胚胎是至少4细胞的人类SCNT胚胎。
46.如权利要求44所述的方法，其中，该人类SCNT胚胎是至少4细胞的SCNT胚胎。
47.如权利要求44所述的方法，进一步包含从来自人类囊胚的内细胞团单离细胞；以及培养来自未分化状态的内细胞团的该细胞，以形成人类胚胎干(ES)细胞。
48.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中，该供体人类体细胞、接纳体人类卵母细胞或人类SCNT胚胎的任一种或多种已经被冷冻并解冻。
49.一种源自人类SCNT胚胎的胚胎干细胞(hNT-ESC)群体，是使用如权利要求1至48中任一项所述的方法生产的。
50.如权利要求49所述的hNT-ESC群体，其中，该hNT-ESC是基因修饰的hNT-ESC。
51.如权利要求49所述的hNT-ESC群体，其中，该hNT-ESC是多能干细胞或全能干细胞。
52.如权利要求49所述的hNT-ESC群体，其中，该hNT-ESC存在于培养基中。
53.如权利要求52所述的hNT-ESC群体，其中，该培养基将该hNT-ESC维持在多能或全能状态。
54.如权利要求52所述的hNT-ESC群体，其中，该培养基是适用于该hNT-ESC的冷冻和冷冻保存的介质。
55.如权利要求54所述的hNT-ESC群体，其中，该hNT-ESC被冷冻或冷冻保存。
56.一种人类SCNT胚胎，是通过如权利要求1至55任一项所述的方法生产的。
57.如权利要求56所述的人类SCNT胚胎，其中，该人类SCNT胚胎是经基因修饰的。
58.如权利要求56所述的人类SCNT胚胎，其中，该人类SCNT胚胎包含并非来自该接纳体人类卵母细胞的线粒体DNA(mtDNA)。
59.如权利要求56所述的人类SCNT胚胎，其中，该人类SCNT胚胎存在于培养基中。
60.如权利要求59所述的人类SCNT胚胎，其中，该培养基是适用于该人类SCNT的冷冻和冷冻保存的介质。
61.如权利要求60所述的人类SCNT胚胎，其中，该人类胚胎被冷冻或冷冻保存。
62.一种组合物，包括人类SCNT胚胎、接纳体人类卵母细胞、人类杂交卵母细胞或囊胚的至少一种，以及下列至少一项：
a.增加KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂；或
b.抑制H3K9甲基转移酶的试剂。
63.如权利要求62所述的组合物，其中，该增加KDM4(JMJD2)家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂增加KDM4A(JMJD2A)、KDM4B(JMJD2B)、KDM4C(JMJD2C)、KDM4D(JMJD2D)或KDM4E(JMJD2E)中至少一种酶的表达或活性。
64.如权利要求63所述的组合物，其中，该试剂增加KDM4D(JMJD2D)或KDM4A(JMJD2A)的表达或活性。
65.如权利要求64所述的组合物，其中，该试剂包含对应于SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45的核酸序列或其生物学活性片段，其将人类SCNT的效率增加至与SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：45的对应序列相比较下相似或更高的程度。
66.如权利要求64所述的组合物，其中，该试剂包含对应于SEQ ID NO：1的核酸序列或其生物学活性片段，其将SCNT效率增加至与SEQ ID NO：1的核酸序列相比较下相似或更高的程度。
67.如权利要求62所述的组合物，其中，该H3K9甲基转移酶的抑制剂抑制SUV39h1、SUV39h2、或SETDB1中的至少一种酶或其任意组合。
68.如权利要求62所述的组合物，其中，该人类SCNT胚胎是处于1细胞阶段、2细胞阶段或4细胞阶段的人类SCNT胚胎。
69.如权利要求62所述的组合物，其中，该接纳体人类卵母细胞是去核的接纳体人类卵母细胞。
70.如权利要求62所述的组合物，其中，该人类SCNT胚胎是从注射终末分化人类体细胞的细胞核生产的，或其中，该囊胚是从通过将终末分化人类体细胞的细胞核注射入去核的人类卵母细胞内而生产的人类SCNT胚胎发育的。
71.一种试剂盒，包含：(i)增加人类KDM4家族的组蛋白去甲基化酶的表达或活性的试剂，及/或抑制H3K9甲基转移酶的试剂；以及(ii)人类卵母细胞。
72.如权利要求92所述的试剂盒，其中，该人类卵母细胞是去核的卵母细胞。
73.如权利要求92所述的试剂盒，其中，该人类卵母细胞是非人类卵母细胞。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110607325A (zh) * 2019-09-19 2019-12-24 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法
CN113186152A (zh) * 2021-05-19 2021-07-30 南方医科大学 Dna甲基转移酶抑制剂在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用
CN113316457A (zh) * 2018-07-19 2021-08-27 儿童医疗中心有限公司 用于生成生理性x染色体失活的组合物和方法
CN114805357A (zh) * 2021-01-21 2022-07-29 四川大学 一种靶向setdb1-ttd的小分子抑制剂及其制药用途

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11390885B2 (en) 2014-09-15 2022-07-19 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions to increase somatic cell nuclear transfer (SCNT) efficiency by removing histone H3-lysine trimethylation
CN107299113A (zh) * 2017-06-12 2017-10-27 内蒙古大学 H3K27me3及其去甲基化酶KDM6A/B在小鼠核移植重构胚中的应用方法
CN108624621B (zh) * 2018-01-17 2019-04-12 中国科学院上海生命科学研究院 非人灵长类的体细胞克隆动物的制备方法
KR20190089782A (ko) * 2018-01-23 2019-07-31 차의과학대학교 산학협력단 멜라토닌을 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달의 효율을 향상시키는 방법
WO2019147025A1 (ko) * 2018-01-23 2019-08-01 차의과학대학교 산학협력단 Rad51 활성화제를 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달률을 향상시키는 방법
AU2019247490A1 (en) * 2018-04-06 2020-10-22 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
WO2020236985A1 (en) * 2019-05-21 2020-11-26 President And Fellows Of Harvard College Endocrine differentiation-inducing molecule
JP2023526328A (ja) * 2020-05-14 2023-06-21 エイアールアイズィー・プリシジョン・メディスン・インコーポレイテッド ｓｉＲＮＡを使用してＰＲＤＭ２／ＲＩＺタンパク質の発現を調節するがん治療
US11857551B1 (en) * 2020-07-10 2024-01-02 Ting Therapeutics Llc Methods for the prevention and treatment of hearing loss

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1483817A (zh) * 2002-09-18 2004-03-24 李建远 一种克隆无动物成分的人胚胎干细胞的方法
CN101535468A (zh) * 2005-10-21 2009-09-16 国际干细胞公司 单性生殖激活人类卵母细胞用于产生人类胚胎干细胞
US20140335619A1 (en) * 2013-05-13 2014-11-13 Oregon Health & Science University Human pluripotent stem cells produced by somatic cell nuclear transfer

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110172107A1 (en) * 2008-04-30 2011-07-14 Fox Chase Cancer Center Assay for identifying agents that modulate epigenetic silencing, and agents identified thereby
US20110136145A1 (en) * 2008-05-22 2011-06-09 The Johns Hopkins University Methods for promoting fusion and reprogramming of somatic cells
US20130189780A1 (en) * 2009-12-31 2013-07-25 Fate Therapeutics, Inc. Reprogramming compositions
JP6290931B2 (ja) * 2013-02-15 2018-03-07 ソン クヮン メデイカル ファウンデーション 体細胞核移植を利用する単為生殖幹細胞および患者特異的ヒト胚幹細胞の製造法
EP3004396B1 (en) * 2013-06-06 2019-10-16 The General Hospital Corporation Compositions for the treatment of cancer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1483817A (zh) * 2002-09-18 2004-03-24 李建远 一种克隆无动物成分的人胚胎干细胞的方法
CN101535468A (zh) * 2005-10-21 2009-09-16 国际干细胞公司 单性生殖激活人类卵母细胞用于产生人类胚胎干细胞
US20140335619A1 (en) * 2013-05-13 2014-11-13 Oregon Health & Science University Human pluripotent stem cells produced by somatic cell nuclear transfer

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOHNATHAN R.WHETSTINE ET AL.,: "Reversal of Histone Lysine Trimethylation by the JMJD2 Family of Histone Demethylases", 《CELL》 *
LARS HILLRINGHAUS ET AL.,: "Structural and Evolutionary Basis for the Dual Substrate Selectivity of Human KDM4 Histone Demethylase Family", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
NCBI: "Homo sapiens lysine (K)-specific demethylase 4A (KDM4A), mRNA"，NM_014663.2", 《GENBANK》 *
NCBI: "Homo sapiens lysine (K)-specific demethylase 4D (KDM4D), mRNA"，NM_018039.2", 《GENBANK》 *
NCBI: "Homo sapiens lysine (K)-specific demethylase 4E (KDM4E), mRNA"，NM_001161630.1", 《GENBANK》 *
SHOGO MATOBA ET AL.,: "Privileged Communication Embryonic Development Following Somatic Cell Nuclear Transfer Impeded by Persisting Histone Methylation", 《CELL》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113316457A (zh) * 2018-07-19 2021-08-27 儿童医疗中心有限公司 用于生成生理性x染色体失活的组合物和方法
CN110607325A (zh) * 2019-09-19 2019-12-24 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法
CN110607325B (zh) * 2019-09-19 2021-03-23 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法
CN114805357A (zh) * 2021-01-21 2022-07-29 四川大学 一种靶向setdb1-ttd的小分子抑制剂及其制药用途
CN114805357B (zh) * 2021-01-21 2023-12-19 四川大学 一种靶向setdb1-ttd的小分子抑制剂及其制药用途
CN113186152A (zh) * 2021-05-19 2021-07-30 南方医科大学 Dna甲基转移酶抑制剂在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用

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Publication number Publication date
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