CN107429231A - 调节sh2b3以改善来自干细胞和/或祖细胞的红细胞的产生 - Google Patents

调节sh2b3以改善来自干细胞和/或祖细胞的红细胞的产生 Download PDF

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Abstract

本文公开了从干细胞和/或祖细胞群产生红细胞(RBC)的方法。在至少一种干细胞或祖细胞中，SH2B3蛋白活性降低，SH2B3mRNA水平降低，和/或SH2B3蛋白水平降低。与使用相同干细胞和/或祖细胞群但无SH2B3抑制或破坏的方法相比，本文提供的方法允许产生具有增加的数量和/或质量的RBC。本文还提供了使用本文所述方法产生的RBC的使用方法。

Description

调节SH2B3以改善来自干细胞和/或祖细胞的红细胞的产生
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)要求于2014年11月24日提交的美国临时专利申请序列号62/083,439的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在由国家卫生研究院颁发的授权号R01DK103794和R21HL120791的政府支持下作出的。政府对本发明有一定的权利。
技术领域
本发明涉及来自干细胞和/或祖细胞的红细胞的产生。
背景技术
红细胞(RBC)的输注通常用于许多临床和外科应用。根据美国血库协会，每年在美国输注2900万个单位的血液成分。该程序挽救了许多生命。随着医疗进展和人口老龄化，对这种输注的需求不断增加。
捐血是RBC的主要来源。然而，无法保证捐血的数量和/或质量。使用造血干细胞和多能(pluripotent)干细胞源来离体产生红细胞(RBC)是作为可能的输血替代物的主要目标领域。在临床试验中，离体产生的RBC已成功输入接受者，证明了该方法的有效性(Giarratana等人，Blood，2011)。
关于使用干细胞作为细胞替代疗法的来源有显著的意义(Fox等人，2014)。来自造血干细胞和祖细胞(HSPC)的体外分化红细胞(RBC)已经在临床试验中成功地输入接受者(Giarratana等人，2011；Migliaccio等人，2012)，并且使用包括人胚胎干细胞(hESC)和诱导的PSC(iPSC)的多能干细胞(PSC)的类似方法正在研究中(Kobari等人，2012；Slukvin，2013；Sturgeon等人，2013)。然而，利用这些干细胞源用于RBC生产受限于完全成熟细胞的低产量，使得该过程成本高且效率低(Migliaccio等人，2012；Rousseau等人，2014)。克服这些主要局限性能够增强管理血液供应的能力(Williamson和Devine，2013)。因此，存在于RBC离体生产中的主要局限性是产生足够量的用于治疗目的的RBC的能力。通常只能以成本有效的方式生产一单位的一小部分。
因此，本领域对于从干细胞和/或祖细胞离体产生RBC的改进方法的需要仍未满足。
发明内容
本发明部分地基于以下发现：干细胞和/或祖细胞群中SH2B3基因的抑制可以增加从干细胞和/或祖细胞群分化的红细胞(RBC)的数量和质量。特别地，发明人已经使用shRNA或CRISPR/Cas9敲低SH2B3表达证明了，造血干细胞和祖细胞(HSPC)可以分化成成熟的RBC，如由CD235a标志物的增加和CD71表面标志物的降低所示的。因此，发明人已经发现SH2B3的抑制可用于从干细胞和/或祖细胞群离体产生RBC。
因此，一方面，本发明提供一种从干细胞和/或祖细胞群离体产生红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：(i)抑制干细胞和/或祖细胞群中的SH2B3；(ii)培养所述干细胞和/或祖细胞群足以诱导至少一种干细胞或祖细胞分化为RBC的时间；和(iii)收集红细胞群。
在一些实施方案中，抑制SH2B3降低SH2B3蛋白水平、SH2B3 mRNA水平、SH2B3蛋白活性或其组合。
在一些实施方案中，抑制SH2B3包括使干细胞和/或祖细胞群与基因组编辑剂接触，用于从至少一种干细胞或祖细胞靶向切除SH2B3基因。
在一些实施方案中，抑制SH2B3包括使干细胞和/或祖细胞群与SH2B3的拮抗剂接触。
在一方面，本发明提供一种诱导干细胞和/或祖细胞群分化成红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：(i)将干细胞和/或祖细胞群与SH2B3的拮抗剂接触，并培养干细胞和/或祖细胞群足以诱导至少一种干细胞或祖细胞分化为RBC的时间，其中所述SH2B3的拮抗剂降低SH2B3蛋白的活性或降低SH2B3 mRNA或蛋白水平；和(ii)收集红细胞群。
在一方面，本发明提供一种诱导干细胞和/或祖细胞群分化成红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：(i)将干细胞和/或祖细胞群与基因组编辑剂接触并培养干细胞和/或祖细胞群足以诱导至少一种干细胞或祖细胞分化为RBC的时间，其中所述基因组编辑剂从至少一种干细胞或祖细胞中切除SH2B3基因；和(ii)收集红细胞群。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述基因组编辑剂选自由锌指核酸酶(ZFN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)组成的组。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述基因组编辑剂存在于载体中。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述SH2B3的拮抗剂选自由无机分子、有机分子、核酸、核酸类似物或衍生物、肽、肽模拟物、蛋白质、抗体或其抗原结合片段、及其组合组成的组。
在前述任一方面的一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂特异性结合SH2B3蛋白的SH2结构域、PH结构域或SH2和PH结构域两者。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述SH2B3的拮抗剂是抑制SH2B3表达的RNAi试剂。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述RNAi试剂是与SH2B3 mRNA杂交的siRNA、shRNA、dsRNA。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述干细胞和/或祖细胞群选自由造血干细胞、造血祖细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞及其组合组成的组。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述方法增加来自干细胞和/或祖细胞群的RBC的扩增。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述方法提高RBC的质量。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述干细胞和/或祖细胞群是哺乳动物来源的。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述干细胞和/或祖细胞群是人源的。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述RBC通过白细胞过滤或流式细胞分选来分离。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述干细胞和/或祖细胞群从供体受试者获得。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述干细胞和/或祖细胞群来自所述供体受试者的外周血单个核细胞、脐带血、骨髓、脐带组织或G-CSF动员外周血。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述方法还包括向有需要的受试者施用RBC群，其中所述RBC由从所述供体受试者获得的干细胞和/或祖细胞群产生。
在前述任一方面的一些实施方案中，所述干细胞群是iPSC。
本发明的另一方面涉及根据本文所述的方法生产的RBC群。
本发明的另一方面涉及一种包含RBC群和干细胞和/或祖细胞群的混合物，其中所述RBC根据本文所述的方法生产。
本发明的另一方面涉及一种血库，其包含根据本文所述的方法生产的RBC群。
本发明的另一方面涉及一种细胞培养基，其包含干细胞和/或祖细胞群、从至少一种干细胞或祖细胞分化的至少一种RBC和SH2B3的拮抗剂。
本发明的另一方面涉及一种向受试者施用RBC群的方法，其包括向所述受试者施用有效量的RBC，其中所述RBC已经与有效量的SH2B3的拮抗剂离体或体外接触，其中所述SH2B3的拮抗剂降低SH2B3蛋白的活性或降低SH2B3 mRNA或蛋白水平。
本发明的另一方面涉及一种向受试者施用RBC群的方法，其包括向所述受试者施用有效量的RBC，其中所述RBC由已经与有效量的基因组编辑剂离体或体外接触的干细胞和/或祖细胞群产生，其中所述基因组编辑剂从至少一种干细胞或祖细胞中切除SH2B3基因。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个有色附图。含彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在索取并支付必要的费用之后由专利局提供。
图1A-1C显示三阶段培养系统，以允许来自脐带血和成体(骨髓和动员的外周血)来源的CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)的同步分化。图1A示出了说明使用抑制SH2B3将人CD34+HSPC分化成成熟RBC的方法的简化方案。图1B示出在用sh83(SEQ ID NO：1)和sh84(SEQ ID NO：2)SH2B3 shRNA感染后8天显示SH2B3蛋白水平的蛋白质印迹，其显示sh83和sh84 shRNA有效降低培养物中SH2B3蛋白的水平。图1C显示了在指定的分化日的May-Grünwald-Giemsa染色的SH2B3-KD(sh83和/或sh84 SH2B3 shRNA处理的)细胞的代表性细胞离心图像。
图2显示使用表型表面标志物CD71和CD235a评估进行分化的细胞，与对照相比，其以相当正常的方式进行分化。
图3A-3B显示细胞更有效地分化，变成具有降低的SH2B3水平的成熟RBC。图3A显示了与对照相比，sh83和/或sh84 shRNA处理的细胞的CD235a表面标志物表达的代表性直方图。图3B显示了与对照相比，sh83和/或sh84 shRNA处理的细胞的CD71表面标志物表达的代表性图。在前期阶段，与shLuc对照相比，在SH2B3敲低(sh83和sh84 SH2B3 shRNA)培养物中更多的细胞获得CD235a并失去CD71。
图4显示代表性的流式细胞术图，其显示在分化第18天用CD235a和Hoechst 33342染色的细胞，并且图4显示在培养的晚期(第16-18天)，更多的细胞经历去核(示于框中)，这是典型的成熟的红细胞。数字表示在所述门(gate)±SD内CD235a+/Hoechst 33342-细胞(指示去核的RBC)的平均百分比。
图5显示了在指定的分化日，May-Grünwald-Giemsa染色的对照和SH2B3-KD(sh83和sh84 SH2B3 shRNA处理的)细胞的代表性细胞离心图像。结果表明，细胞在形态学水平的成熟速度更快，获得了更多的血红蛋白，降低了SH2B3水平。左上图中显示了比例尺。
图6显示对照或SH2B3 KD外周血动员的CD34+HSPC的平均扩增，其显示除了更强的红系分化之外，SH2B3-KD细胞(使用sh83和sh84 SH2B3 shRNA)扩增超过对照。示出的值是平均值±平均值的标准误差(n＝3次独立实验，代表>3次使用不同供体的实验)。
图7显示在造血干细胞中具有SH2B3抑制的红系细胞的改进的扩增。图7显示了对于对照样品和来自成体动员的外周血的SH2B3 KD(sh83和sh84 shRNA处理的)样品观察到的去核RBC(CD235a+/Hoechst 33342-)的平均产量，表明当计算去核的红细胞的产量时，SH2B3水平降低的总体产量增加3-5倍。通过双尾学生t检验进行比较(n＝3次独立实验；*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001)。
图8A-8C显示在造血干细胞中具有SH2B3抑制的红系细胞的改进的扩增。图8A显示了对于对照细胞和SH2B3-KD成体HSPC衍生的红系细胞观察到的荧光膜染料PKH的信号降低。显示了通过流式细胞术测定的第9天与第5天比较的PKH信号比。值是平均值±标准偏差，并且相对于对照进行标准化。比较采用双尾学生t检验(n＝3；**P<0.01；***P<0.001)。图8B显示了基于在培养的第5天和第9天之间观察到的成体HPSC衍生的红系细胞的PKH信号降低的细胞分裂的绝对数。值表示平均值±标准偏差。用双尾学生t检验进行比较(n＝3；*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001)。图8C示出了计算PKH信号降低和细胞分裂的算法。
图9示出了显示源自外周血动员的CD34+细胞的成熟RBC的第18天的曙红-5-马来酰亚胺信号的代表性直方图，其显示细胞具有与对照细胞相似的曙红-5-马来酰亚胺荧光水平，表明它们与对照细胞类似地成熟。
图10是贴壁分化的示意图。CRISPR/Cas9用于产生SH2B3敲除(KO)人胚胎干细胞(hESC)系。分离等基因对照。诱导这些细胞进行造血分化。如图的底部所示，一旦使用该方法获得了造血祖细胞，然后将它们分化为红系细胞谱系。
图11显示SH2B3 KO hESC分化与对照一样好或优于对照。SH2B3KO(使用CRISPR/Cas9系统产生)和等基因对照用红系表面表型标志物CD71和CD235a染色来显示。
图12A-12B显示在造血干细胞和多能干细胞中具有SH2B3抑制的红系细胞的改进的扩增。图12A和12B显示源自两个独立的等基因hESC克隆对的HPC的红系细胞扩增；与野生型等基因对照(WT)相比，SH2B3敲除BB5系(KO BB5)(图12A)和SH2B3敲除DB3(KO DB3)(图12B)显示，用CRISPR/Cas9进行SH2B3KO的细胞的扩增程度比对照大得多。因此，与它们各自的等基因对照(分别为WT BB5和WT DB3)相比，用CRISPR/Cas9进行的SH2B3 KO使用不同的KO克隆(例如，KO BB5和KO DB3克隆)显示出一致的增加的扩增。以50,000个细胞开始的总细胞数在各个时间点显示为平均值±SD。通过双尾学生t检验进行比较(n＝3；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)。
图13A-13C显示原代HSPC中的SH2B3的体外抑制作用。图13A显示了将人CD34+HSPC分化成成熟RBC的简化方案。图13B显示对照(用对照shLuc处理的细胞的Luc-KD)和SH2B3-KD样品(n＝3个独立样品，用于shLuc、sh83 shRNA和sh84 shRNA)的平均基因表达值的散点图。显示了决定系数(r)。图13C显示了比较SH2B3-KD样品与对照中基因相对表达的基因组富集分析的富集曲线。示出了显示通过比较早期红系祖细胞与更分化细胞而衍生的红系分化特征的富集图(使用改编的Kolmogorov-Smirnov统计检验，p<0.0001)。
图14A-14E显示在造血干细胞和多能干细胞中具有SH2B3抑制的红系细胞的改进的扩增。图14A显示了对于对照样品和源自脐带血HSPC的SH2B3KD(sh83和sh84 shRNA)样品观察到的去核RBC(CD235a+/Hoechst 33342-)的平均产量。示出的值为平均值±SD，并相对于对照进行标准化。通过双尾学生t检验进行比较(n＝3次独立实验；*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001)。图14B显示了对于对照样品和使用包括CD34+扩增阶段的更有效的分化方案从成体动员的外周血祖细胞获得的SH2B3KD样品观察到的去核RBC(CD235a+/Hoechst33342-)的平均产量。通过双尾学生t检验进行比较(n＝4；***p<0.001)。图14C显示了将hESC分化为RBC的简化示意图。hESC在连续的细胞因子组合中培养以诱导在第8天左右释放到培养基中的专能(multipotent)造血祖细胞(HPC)的产生。收集HPC并进一步在具有EPO和SCF的培养基中培养以支持红系分化。图14D显示在HPC选择之后的培养的指定天数，May-Grünwald-Giemsa染色的对照和SH2B3-KO成红细胞的代表性细胞分离(cytospin)图像。图14E显示了代表性的流式细胞术图，其描绘了源自SH2B3-KO和等基因WT hESC的成红细胞上CD71和CD235a的表达。
图15A-15E显示SH2B3抑制后，来自HSPC的红系细胞的表征(与图14有关)。图15A显示了指定EPO浓度所观察到的成体HSPC的相对扩增。直到第18天，将红系扩增计算为总细胞扩增，其根据通过流式细胞术分析在第18天观察到的CD235a阳性细胞的百分比进行校正。所示值为平均值±标准差，并相对于在1U/mL(n＝3/浓度)下观察到的扩增进行标准化。图15B显示了柱状图，其显示在成体HSPC的红系分化的指定日，膜联蛋白V+凋亡或死亡对照和SH2B3-KD样品的频率。值显示平均百分比±标准偏差。进行双尾学生t检验(n＝3，n.s.＝非显著性)。图15C示出在细胞因子饥饿和用EPO和SCF刺激后，用对照(shLuc)或SH2B3(sh84)shRNA转导的人TF-1红细胞系中的磷酸化STAT5(pSTAT5)和磷酸化KIT Y568(pKIT Y568)的活化的蛋白质印迹。在细胞因子饥饿之前，在嘌呤霉素中选择细胞48小时。pKIT Y568可以由血清饥饿细胞完全消除，表明单独用血清的基线刺激。STAT5活化仅发生在特定细胞因子受体如EPO受体的下游。图15D显示经历过夜细胞因子饥饿或用EPO刺激2小时后的TF-1红系细胞中具有SH2B3抑制的EPO应答基因CISH和PIM1的表达。值表示平均值±标准偏差。用双尾学生t检验进行比较(n＝3；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。图15E显示在所示变化的EPO和SCF浓度下用CD235a阳性细胞校正的成体HSPC的相对扩增。使用在三阶段系统中分化前涉及扩增步骤的方法中讨论的更有效的分化方案进行培养，其中EPO和SCF浓度在各个阶段都有差异。示出的值是平均值±平均值的标准误差。用双尾学生t检验进行比较(n＝3；**P<0.01；***P<0.001)。
图16A-16H显示了来自SH2B3敲低的HSPC和多能干细胞的红系细胞的表征(图16A-16H与图14A-14E相关)。图16A显示了代表性的直方图，其示出成体CD34+细胞衍生的成熟RBC在第18天的Rh血抗原表达。图16B显示了在指定时间点对于对照和从成体CD34+细胞产生的SH2B3-KD成熟RBC观察到的丙酮酸激酶活性。示出的值是平均值±标准偏差(n＝2次独立实验)。图16C显示考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶，其示出成体RBC衍生的RBC血影的主要膜蛋白条带。图16D显示在培养物中产生的RBC的溶血产物中成熟血红蛋白亚型的血红蛋白高效液相色谱分析。HbF和HbA2的峰在色谱图中被相应的峰上方的标签遮住了。图16E是示出用于靶向与前间区序列邻近基序(PAM)相邻的所述SH2B3 DNA序列以通过SH2B3基因的外显子3中的Cas9蛋白引起双链断裂(DSB)的单向导RNA(gRNA)的示意性说明。图16F显示了CRISPR/Cas9靶向的hESC的序列。PAM序列以加粗突出显示，并且预测的切割位点是PAM上游的三个碱基。显示了一个纯合克隆DB3和携带SH2B3移码突变的两个复合杂合克隆BB5和BF4的等位基因序列。注意示出了有义DNA序列。图16G显示了具有SH2B3-KO和等基因对照的hESC衍生的HPC的细胞扩增结果。在本实验开始分化后9天收集HPC。总细胞数显示为不同时间点的平均值±标准偏差。在培养的每个指定日，用双尾学生t检验进行比较(n＝3；NS＝非显著性；*P<0.05；**P<0.01)。图16H显示在HPC分化的第10天，在hESC衍生的红系细胞(具有SH2B3 KO或WT等位基因)中的球蛋白基因表达，如通过定量RT-PCR测量的。相对于β-肌动蛋白的表达以log 10标度显示(n＝3/组)。
具体实施方式
本发明涉及从如干细胞和/或祖细胞等来源产生具有增加的数量和质量的红细胞(RBC)的方法、系统和组合物以及试剂盒。特别地，本文将SH2B3鉴定为由这些来源产生RBC的重要负调节剂。也就是说，发明人已经发现SH2B3抑制由干细胞和/或祖细胞产生RBC。如本文所证明的，发明人已经发现使用基因编辑方法(例如，使用CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)从源干细胞或祖细胞的基因组中降低SH2B3蛋白水平和/或mRNA水平和/或去除SH2B3基因使得以增加的数量和质量从这些源生成RBC。
因此，本发明涉及在方法、组合物和试剂盒中抑制SH2B3，从而产生并提高由干细胞和/或祖细胞产生的RBC的产量，例如作为标准输注的替代产品。因此，本发明的多个方面和实施方案涉及抑制干细胞和/或祖细胞中的SH2B3用于RBC生产的方法和组合物及其使用方法。以前在WO2013/019857中报道了AhR、Prox1和/或SH2B3的抑制增加了专能造血细胞(MHC)的扩增。然而，与本发明相比，WO2013/019857并未描述MHC分化为RBC或RBC的收集。因此WO2013/019857没有描述也未表明干细胞和/或祖细胞中SH2B3的抑制可以增加从这些细胞分化的RBC的数量和/或质量。
一方面，本发明提供一种从干细胞和/或祖细胞群离体产生红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：(i)抑制干细胞和/或祖细胞群中的SH2B3；(ii)培养干细胞和/或祖细胞群足以诱导至少一种干细胞或祖细胞分化为RBC的时间；和(iii)收集红细胞群。
本文描述了减少细胞或哺乳动物中SH2B3 mRNA或蛋白质表达的组合物和方法。还描述了用于促进从干细胞和/或祖细胞的离体的RBC产生和/或扩增的组合物和方法，从而允许增加患者可用的输血和/或血库的RBC数量，并且增加相同移植材料的功效和/或潜能。在一些实施方案中，与未用SH2B3的抑制剂处理或不具有SH2B3基因敲除(即，使用如本文所公开的基因编辑程序)的干细胞和/或祖细胞相比，所述组合物和方法允许提高干细胞和/或祖细胞离体产生RBC的产量。在一些实施方案中，所述组合物和方法允许提高从具有血型O-(O，Rh-)的供体受试者获得的干细胞和/或祖细胞的RBC产量，从而允许增加来自普通供体受试者RBC的无限量供应。还考虑了施用这种iRNA组合物以增强RBC的体内扩增。
定义
除非另有说明或隐含于上下文中，以下术语和短语包括以下提供的含义。除非另有明确说明，或从上下文显而易见，否则以下术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域获得的含义。提供定义以帮助描述特定实施方案，并且不旨在限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅受权利要求的限制。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括多项，复数术语应包括单数。
如本文所用，术语“SH2B3”是指SH2B3蛋白或编码SH2B3蛋白的核酸，这取决于具体上下文。SH2B3(也称为SH2B适配子蛋白3或Lnk；NCBI基因ID：10019)是细胞内适配子蛋白家族的成员。智人(homo sapiens)的SH2B3的mRNA已知具有至少两种同种型(NCBI登录号：NM_005475，NM_001291424)。SH2B3主要在淋巴细胞和造血前体细胞中表达并调节早期淋巴造血(lymphohematopoiesis)。
如本文所用，术语“离体”是指从生物体(例如哺乳动物)获得的生物细胞在生物体外培养的情况或状况。
本文所用的术语“干细胞”是指能够增殖并产生更多祖细胞的未分化细胞，所述祖细胞具有产生大量母细胞的能力，而这些母细胞又可产生分化的或可分化的子细胞。可以诱导子细胞本身增殖并产生随后分化为一种或多种成熟细胞类型的后代，同时还保留具有亲本发育潜能的一种或多种细胞。
细胞分化是通常通过多次细胞分裂发生的复杂过程。分化细胞可以衍生自其本身源自专能细胞等的专能细胞。尽管这些专能细胞中的每一种都可以被认为是干细胞，但每种细胞类型各自可以产生的范围可能变化很大。一些分化细胞也具有产生更大发育潜能的细胞的能力。这种能力可以是天然的或者可以在用各种因素处理时人为诱导的。在许多生物学实例中，干细胞也是“专能的”，因为它们可以产生多于一种不同细胞类型的后代，但这不是“干细胞干性(stem-ness)”所必需的。自我更新是干细胞定义的另一个典型部分，这在本文中是必不可少的。理论上，自我更新可以通过两种主要机制来实现。干细胞可能不对称地分裂，一个子代保留干细胞的状态，另一子代表达一些明显的其他特定功能和表型。或者，群体中的一些干细胞可以对称地分裂成两个干细胞，从而在群体中整体维持一些干细胞，而群体中的其它细胞仅产生分化的后代。形式上，以干细胞开始的细胞可能朝更加分化的表型发展，但是然后“反向”并且重新表达较低分化的表型，即干细胞或干细胞样表型，常常被本领域普通技术人员称为“去分化”或“重编程”或“逆分化”的术语。
术语“祖细胞”或“前体”细胞在本文中可互换使用，并且是指具有相对于可通过分化产生的细胞更原始(即，沿着发育途径比完全分化细胞更早的阶段)的细胞表型的细胞。通常，祖细胞也具有显著或非常高的增殖潜能。祖细胞可以产生多种不同的分化细胞类型或单个分化细胞类型，取决于发育途径和细胞发育和分化的环境。
本文所用的术语“多能”是指具有这样的能力的细胞：在不同条件下分化为多于一种分化细胞类型，并且优选分化为所有三个胚细胞层特有的细胞类型。多能细胞的特征主要在于使用例如裸鼠畸胎瘤形成测定法所测定的分化成多于一种细胞类型，优选分化成所有三个胚层的能力。多能性也通过胚胎干(ES)细胞标志物的表达来证明，尽管优选的多能性测试是证明分化成三个胚层的每一个的细胞的能力。应当注意，简单培养此类细胞本身不会使它们成为多能的。重编程的多能细胞(例如本文所定义的术语，诱导多能干(iPS)细胞)相对于原代细胞亲本还具有延长传代的能力而不丧失生长潜能的特征，所述原代细胞亲本通常具有培养中仅有限次分裂的能力。
术语“胚胎干细胞”或“ES细胞”可互换使用以指胚胎囊胚的内细胞团的多能干细胞(参见美国专利No.5,843,780、6,200,806)。此类细胞可以类似地从源自体细胞核转移的囊胚的内细胞团获得(参见例如美国专利No.5,945,577、5,994,619、6,235,970)。胚胎干细胞的区别特征定义胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有胚胎干细胞的一个或多个独特特征，使得该细胞可以与其他细胞区分开，则该细胞具有胚胎干细胞的表型。示例性区分胚胎干细胞的特征包括但不限于基因表达谱、增殖能力、分化能力、核型和对特定培养条件的响应等。
本文所用的术语“造血干细胞”或“HSC”是指可以分化成淋系、红系或髓系细胞系的祖细胞或增殖为干细胞群而没有开始进一步分化的多能干细胞或专能干细胞或淋系或髓系(衍生自骨髓)干细胞。HSC可以从骨髓、外周血、脐带血或胚胎干细胞中分离。HSC可以形成细胞如红血球(红细胞)、血小板、粒细胞(如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)、巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞。HSC能够在细胞分裂后自我更新或保持为干细胞。HSC也能够分化或者开始成为成熟的造血细胞的途径。HSC也可以调节其迁移或移动，或者可以通过凋亡或程序性细胞死亡来调节。
本文所用的术语“造血祖细胞”或“HPC”是指已经分化为这样的发育阶段的原始造血细胞，即当细胞进一步暴露于适当的细胞因子或一组细胞因子时，它们将进一步沿着造血细胞系分化。与HSC相比，造血祖细胞只能有限的自我更新。如本文所用的“造血祖细胞”还包括衍生自造血祖细胞分化，并且是成熟分化造血细胞的直接前体的“前体细胞”。本文所用的术语“造血祖细胞”包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)、巨核细胞集落形成细胞(Mk-CFC)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)、B细胞集落形成细胞(B-CFC)和T细胞集落形成细胞(T-CFC)。“前体细胞”包括但不限于红系集落形成单位细胞(CFU-E)、粒细胞集落形成细胞(G-CFC)、嗜碱性细胞集落形成细胞(CFC-Bas)、嗜酸性细胞集落形成细胞(CFC-Eo)和巨噬细胞集落形成细胞(M-CFC)细胞。
本文所用的术语“造血干细胞和祖细胞”或“HSPC”是指造血干细胞和造血祖细胞的混合物。
如本文所用，术语“扩增”(“expanding”)和“扩增”(“expansion”)是指基本上无分化的细胞生长，即细胞群增加但没有伴随这种增加的分化。
在细胞个体发育的背景下，形容词“分化的”(“differentiated”)或“分化”(“differentiating”)是一个相对的术语，其中“分化的细胞”是与正在进行比较的细胞相比，已进一步进展到发育途径下游的细胞。因此，干细胞可以分化成谱系受限的前体细胞(如造血干细胞)，其又可以分化成途径进一步下游的其它类型的前体细胞(例如胸腺细胞或T淋巴细胞前体)，然后到终末期分化细胞，其在某种组织类型中起特征性作用，并且可能或可能不保留进一步增殖的能力。
本文所述的术语“细胞培养基”(本文中也称为“培养基”(“culture medium”或“medium”)是含有维持细胞活力和支持增殖的营养物的、用于培养细胞的介质。细胞培养基可以以适当的组合包含以下任何一种：盐，缓冲液，氨基酸，葡萄糖或其他糖，抗生素，血清或血清替代物，以及其他组分如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。
术语“增加的”、“增加”、“增强”或“扩增”在本文中一般都意指细胞(例如，干细胞、祖细胞或RBC)的数量或细胞的质量以统计学显著量增加；为了避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”、“扩增的”、“扩增”或“增强”是指与参考水平相比增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或多达并包括100％，或者与对照或参考水平相比增加至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍增加，至少约25倍增加，至少约50倍增加，至少约100倍增加，或100倍以上的任何增加。本文使用对照样品或对照水平来描述从具有例如正常或未破坏的SH2B3基因功能的相同生物来源获得的干细胞和/或祖细胞群。
术语“降低”、“减少的”、“减少”、“降低”或“抑制”在本文中通常用于表示以统计学显著量减少。然而，为了避免疑问，“减少的”、“减少”或“降低”或“抑制”通常意指与参考水平相比降低至少约5％-10％，例如至少降低约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％降低(即，与参考样品相比不存在水平)，或与参考水平相比在10-100％之间的任何降低。
术语“统计学显著的”或“显著地”是指统计学显著性，通常意指两个标准偏差(2SD)以上的差异。
如本文所用，术语“显著的”或“显著地”应犹如由术语“统计学”修饰般解释。
如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸序列”是指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的任何分子，优选聚合物分子。核酸可以是单链的或双链的。单链核酸可以是变性双链DNA的一个核酸链。或者，其可以是不衍生自任何双链DNA的单链核酸。在一些实施方案中，核酸可以是DNA。在一些实施方案中，核酸可以是RNA。合适的核酸分子是DNA，包括基因组DNA或cDNA。其他合适的核酸分子是RNA，包括mRNA。
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用以表示通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，所述氨基酸包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物，而不管其大小或功能如何。“蛋白质”和“多肽”通常在提及相对较大的多肽时使用，而术语“肽”通常在提及小的多肽时使用，但本领域中这些术语的使用重叠。当提及基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、前述的同系物、直系同源物、旁系同源物、片段和其他等同物、变体、片段和类似物。
如本文所用，“抗体”是指IgG，IgM，IgA，IgD或IgE分子或其抗原特异性抗体片段(包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单结构域抗体、封闭构象多特异性抗体、二硫键连接的scfv、双抗体)，无论是衍生自天然产生抗体的任何物种，还是通过重组DNA技术产生的；无论是从血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌中分离的。
如本文所述，“抗原”是由包含抗体试剂的互补决定区(CDR)的结合位点结合的分子。通常，抗原由抗体配体结合，并且能够在体内提高抗体应答。抗原可以是多肽、蛋白质、核酸或其它分子或其部分。术语“抗原决定簇”是指由抗原结合分子识别的，更具体地是由所述分子的抗原结合位点识别的抗原上的表位。
如本文所用，术语“抗体试剂”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列并且特异性结合给定抗原的多肽。抗体试剂可包括抗体或包含抗体的抗原结合结构域的多肽。在一些实施方案中，抗体试剂可以包括单克隆抗体或包含单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(本文缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文简写为VL)。在另一个实例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖抗体的抗原结合片段(例如单链抗体，Fab和sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv和结构域抗体(dAb)片段(参见，例如Wildt等人，EurJ.Immunol.1996；26(3):629-39；其全部内容通过引用并入本文))以及完整的抗体。抗体可以具有IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及亚型及其组合)的结构特征。抗体可以来自任何来源，包括小鼠、兔、猪、大鼠和灵长类动物(人和非人灵长类)和灵长类化的抗体。抗体还包括半抗体、人源化抗体和嵌合抗体等。
VH和VL区域可以进一步细分为称为“互补决定区”(“CDR”)的高变区，其间散布有称为“框架区”(“FR”)的更保守的区域。框架区和CDR的范围已被精确定义(参见Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五次编辑，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242，和Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；其全部内容通过引用并入本文)。每个VH和VL通常由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
本文中可互换使用的术语“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”用于指保留特异性结合感兴趣的靶标的能力的全长抗体的一个或多个片段。全长抗体的术语“抗原结合片段”中涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341:544-546；其通过引用并入本文其全部)，其由VH或VL结构域组成；和(vi)保留特异性抗原结合功能的分离的互补决定区(CDR)。
如本文所使用的，术语“特异性结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的化学相互作用，其中第一实体以比其结合非靶标的第三实体更高的特异性和亲和力结合第二靶标实体。在一些实施方案中，特异性结合可以指第一实体对于第二靶标实体的亲和力，其对于第二靶标实体的亲和力比对于第三非靶标实体的亲和力高至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更大。对于给定靶标特异的试剂是在所用测定条件下表现出对该靶标的特异性结合的试剂。在某些实施方案中，特异性结合由约≤10-8M、≤10- 9M、≤10-10M或更低的解离常数表示。
如本文所用，“表达水平”是指存在于细胞或样品中的给定基因编码的mRNA分子和/或多肽分子的数目。表达水平相对于参考水平可以增加或减少。
如本文所用，术语“iRNA试剂”或“RNAi试剂”是指含有如本文定义的术语RNA的试剂，其通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径介导RNA转录物的靶向切割。在一个实施方案中，本文所述的iRNA抑制干细胞或祖细胞，例如HSC或哺乳动物中SH2B3/Lnk的表达。
如本文所用，“靶序列”是指在基因转录期间形成的信使RNA(mRNA)分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工的产物的mRNA。序列的目标部分将至少足够长以用作iRNA试剂的特异性结合位点和/或作为该部分处或附近的iRNA定向切割的底物。例如，靶序列通常为9-36个核苷酸长，例如15-30个核苷酸长，包括其间的所有子区间。作为非限制性实例，靶序列可以是15-30个核苷酸，15-26个核苷酸，15-23个核苷酸，15-22个核苷酸，15-21个核苷酸，15-20个核苷酸，15-19个核苷酸，15-18个核苷酸，15-17个核苷酸，18-30个核苷酸，18-26个核苷酸，18-23个核苷酸，18-22个核苷酸，18-21个核苷酸，18-20个核苷酸，19-30个核苷酸，19-26个核苷酸，19-23个核苷酸，19-22个核苷酸，19-21个核苷酸，19-20个核苷酸，20-30个核苷酸，20-26个核苷酸，20-25个核苷酸，20-24个核苷酸，20-23个核苷酸，20-22个核苷酸，20-21个核苷酸，21-30个核苷酸，21-26个核苷酸，21-25个核苷酸，21-24个核苷酸，21-23个核苷酸或21-22个核苷酸。
如本文所用，术语“包含序列的链”是指包括由使用标准核苷酸命名法称谓的序列描述的核苷酸链的寡核苷酸。
如本文所用，除非另有说明，如本领域技术人员将理解的，术语“互补”当用于描述与第二核苷酸序列有关的第一核苷酸序列时，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定条件下杂交并形成双链结构的能力。这些条件例如可以是严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl，40mM PIPES pH6.4，1mM EDTA，50℃或70℃，12-16小时，然后洗涤。可以应用其他条件，例如生物体内可遇到的生理相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用来确定最适合于两条序列的互补性试验的一组条件。
iRNA内的、例如本文所述的dsRNA内的互补序列，包括在一个或两个核苷酸序列的全长上、包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。这样的序列在本文中可以被称为相对于彼此“完全互补”。然而，本文中在第一序列相对于第二序列称为“基本上互补”的情况下，两条序列可以是完全互补的，或者它们可以在多至30个碱基对的双链杂交时形成一个或多个，但通常不超过5、4、3或2个错配碱基对，同时保留在与其最终应用(例如，通过RISC途径抑制基因表达)最相关的条件下杂交的能力。然而，将两个寡核苷酸设计为在杂交时形成一个或多个单链突出端时，在互补决定方面，不应认为这样的突出端是错配的。例如，包含长度为21个核苷酸的寡核苷酸和长度为23个核苷酸的另一个寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，出于本文描述的目的，也可称为“完全互补”。
本文所用的“互补”序列还可以包括或完全由非沃森-克里克碱基对和/或由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对形成，只要就它们的杂交能力得到满足而言符合上述要求即可。这种非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U Wobble或Hoogstein碱基配对。
本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以用于dsRNA的有义链和反义链之间、或iRNA试剂的反义链与靶序列之间的碱基匹配，这将可以从使用它们的上下文中理解。
如本文所用，与信使RNA(mRNA)“的至少一部分基本上互补”的多核苷酸是指与感兴趣的mRNA(例如，编码SH2B3的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果多核苷酸序列与所述mRNA的非间断部分基本上互补，则该多核苷酸与mRNA的至少一部分互补。
本文所用的术语“双链RNA”或“dsRNA”是指包含具有杂交双链区的RNA分子或分子复合物的iRNA，所述杂交双链区包含两个反向平行且基本上互补的核酸链，其将称为相对于靶RNA具有“有义”和“反义”取向。双链区可以是允许通过RISC途径特异性降解所需靶RNA的任何长度，但通常长度范围为9至36个碱基对，例如15-30个碱基对。考虑9和36个碱基对之间的双链体，该双链体可以是该范围内的任何长度，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个，以及其间的任何子区间，包括但不限于15-30个碱基对，15-26个碱基对，15-23个碱基对，15-22个碱基对，15-21个碱基对，15-20个碱基对，15-19个碱基对，15-18个碱基对，15-17个碱基对，18-30个碱基对碱基对，18-26碱基对，18-23碱基对，18-22碱基对，18-21碱基对，18-20碱基对，19-30碱基对，19-26碱基对，19-23碱基对，19-22个碱基对，19-21个碱基对，19-20个碱基对，20-30个碱基对，20-26个碱基对，20-25个碱基对，20-24个碱基对，20-23个碱基对，20个-22个碱基对，20-21个碱基对，21-30个碱基对，21-26个碱基对，21-25个碱基对，21-24个碱基对，21-23个碱基对或21-22个碱基对。通过用Dicer和类似的酶处理而在细胞中产生的dsRNA通常在19-22个碱基对长的范围内。dsDNA的双链区的一条链包含与靶RNA的区域基本上互补的序列。形成双链结构的两条链可以来自具有至少一个自身互补区域的单个RNA分子，或者可以由两个以上的单独的RNA分子形成。当双链区域由单个分子的两条链形成时，该分子可以具有由形成双链结构的一条链的3'端和相应另一链的5'末端之间的单链核苷酸链(在本文中称为“发夹环”)分隔的双链区。发夹环可以包含至少一个未配对核苷酸；在一些实施方案中，发夹环可以包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多的未配对核苷酸。在dsRNA的两个基本上互补的链由单独的RNA分子组成的情况下，那些分子不需要，但可共价连接。在两条链通过除发夹环以外的方式共价连接的情况下，连接结构被称为“连接子”。术语“siRNA”在本文中也用于指如上所述的dsRNA。
本领域技术人员将认识到，术语“RNA分子”或“核糖核酸分子”不仅涵盖在自然界中表达或发现的RNA分子，还涵盖本文所述的包括一种或多种核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物的RNA类似物和衍生物或如本领域已知的RNA类似物或衍生物。严格来说，“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖，“核糖核苷酸”是具有一个、两个或三个磷酸酯部分的核糖核苷。然而，如本文所用，术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”可以被认为是等同的。RNA可以在核碱基结构或核糖-磷酸骨架结构中被修饰，例如如下文所述。然而，包含核糖核苷类似物或衍生物的分子必须保持形成双链的能力。作为非限制性实例，RNA分子还可以包括至少一种修饰的核糖核苷，包括但不限于2'-O-甲基修饰的核苷、包含5'硫代磷酸酯基的核苷、与胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基连接的末端核苷、锁核苷、脱碱基核苷、2'-脱氧-2'-氟修饰核苷、2'-氨基修饰核苷、2'-烷基修饰核苷、吗啉代核苷、氨基磷酸酯或包含非天然碱基的核苷、或其任何组合。或者，RNA分子可包含至少两个修饰的核糖核苷，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个，上至dsRNA分子的整个长度。RNA分子中这些多个修饰的核糖核苷中各自的修饰不必相同。在一个实施方案中，预期用于本文所述方法和组合物的修饰的RNA是具有形成所需双链结构的能力并且经由RISC途径允许或介导靶RNA的特异性降解的肽核酸(PNA)。
一方面，修饰的核糖核苷包括脱氧核糖核苷。在这种情况下，iRNA试剂可以包含一个或多个脱氧核苷，包括例如脱氧核苷突出端、或dsRNA双链部分内的一个或多个脱氧核苷。然而，不言而喻，在任何情况下术语“iRNA”都不包括双链DNA分子。
一方面，RNA干扰剂包括与靶RNA序列相互作用以引导靶RNA的切割的单链RNA。不希望被理论束缚，引入植物和无脊椎动物细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解成siRNA(Sharp等人，Genes Dev.2001,15:485)。Dicer，核糖核酸酶III类酶将dsRNA加工成具有特征性的两个碱基的3'突出端的19-23个碱基对的短干扰RNA(Bernstein等人，(2001)Nature 409:363)。然后将siRNA掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一个或多个解旋酶解开siRNA双链，使互补反义链能够引导靶识别(Nykanen等人，(2001)Cell107:309)。在结合到适当的靶mRNA后，RISC内的一个或多个内切核酸酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等人，(2001)Genes Dev.15：188)。因此，一方面，本文所述的技术涉及促进形成RISC复合物以实现靶基因沉默的单链RNA。
如本文所用，术语“核苷酸突出端”是指从iRNA的双链结构(例如dsRNA)突出的至少一个未配对核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3'端延伸超过另一条链的5'末端时，则存在核苷酸突出端，反之亦然。dsRNA可以包含至少一个核苷酸的突出端；或者突出端可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包含包括脱氧核苷酸/核苷的核苷酸/核苷类似物，或由其组成。突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义或有义链的5'端、3'端或两个末端。
在一个实施方案中，dsRNA的反义链在3'端和/或5'端具有1-10个核苷酸突出端。在一个实施方案中，dsRNA的有义链在3'端和/或5'端具有1-10个核苷酸突出端。在另一个实施方案中，突出端中的一个或多个核苷酸被硫代磷酸核苷(a nucleosidethiophosphate)替代。
本文中关于dsRNA或dsDNA使用的术语“钝的(blunt)”或“钝端的(blunt ended)”意指在dsRNA或dsDNA分子的给定末端没有未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即没有核苷酸突出端。dsRNA或dsDNA的一端或两端可以是钝的。当dsRNA或dsDNA的两端都是钝的时，dsRNA或dsDNA被认为是钝端的。为了清楚，“钝端的”dsRNA或dsDNA是两端都钝的dsRNA或dsDNA，即在分子的任一端都没有核苷酸突出端。这种分子通常在整个长度上都是双链的。相反，“粘性末端”是指具有至少1个或更多(通常2-5个或更多个)核苷酸突出端的dsDNA或dsRNA分子。
术语“反义链”或“引导链”是指iRNA的链，例如dsRNA，其包括与靶序列基本上互补的区域。如本文所用，术语“互补区域”是指反义链上与本文所述的序列如靶序列基本上互补的区域。在互补区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可能在分子的内部或末端区域。通常，最可容忍的错配位于末端区域，例如5'和/或3'末端的5个、4个、3个或2个核苷酸。
本文所用的术语“有义链”或“乘客链(passenger strand)”是指包括与反义链(该术语如本文所述)的区域基本上互补的区域的iRNA链。
如本文所用，在一个实施方案中，术语“SNALP”是指稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP代表包被减少的水性内部的脂质的囊泡，所述内部包含例如iRNA或由其转录iRNA的质粒等核酸。SNALP描述于例如美国专利申请公开20060240093、20070135372和国际申请WO2009082817中。将这些申请通过引用整体并入本文。“SNALP”制剂的实例在本文其他地方描述。
如本文所用，短语“抑制…的表达”是指与未处理细胞中的SH2B3的表达相比，在SH2B3抑制剂(例如，本文所述的iRNA组合物)处理的细胞中，编码SH2B3的基因的基因表达至少部分减少。
本说明书中的术语“沉默”、“抑制…的表达(inhibit the expression of)”、“下调…的表达”、“抑制…的表达(suppress the expression of)”等等是指至少部分抑制编码SH2B3的基因的表达，如下所呈现的：可从其中编码SH2B3的基因被转录并且已被处理过的第一细胞或第一细胞群中分离或在其中检测到的编码SH2B3的mRNA的量的减少，这样以来，相比于与第一细胞或第一细胞群基本上相同但还未经处理的第二细胞或第二细胞群(对照细胞)，SH2B3的表达被抑制。抑制程度通常表示为：
或者，抑制程度可以根据功能上与基因表达相关的参数(例如由基因编码的蛋白质的量或显示某种表型的细胞的数量)的减少来给出。原则上，基因沉默可以在组成型表达或通过基因工程表达的任何细胞中进行，并可以通过任何合适的测定来确定。然而，当需要参考以确定给定的iRNA(或基因编辑程序)是否一定程度地抑制编码SH2B3的基因的表达并因而被本文所述的技术所包含时，在以下实施例中提供的测定应作为这类参考。
例如，在某些情况下，通过施用本文所表征的iRNA，SH2B3的表达抑制至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施方案中，通过施用本文所表征的iRNA或基因编辑程序(即，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)将细胞中编码SH2B3的基因抑制至少约60％、70％或80％或大于80％。在一些实施方案中，通过施用如本文所述的iRNA(或基因编辑程序)，编码SH2B3的基因抑制至少约85％、90％、95％、98％、99％或更多。
如本领域技术人员所理解的那样，当提及iRNA时，“引入细胞”意指促进或影响摄取或吸收至细胞中。iRNA的吸收或摄取可以通过未受协助的(unaided)扩散性的或主动的细胞过程或者通过辅助性试剂或设备进行。该术语的含义不限于体外细胞；iRNA也可以“引入细胞”，其中细胞是活的生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞将包括递送到生物体。例如，对于体内递送，可以将iRNA注射到组织部位或全身施用。体内递送也可以通过β-葡聚糖递送系统，例如美国专利No.5,032,401和5,607,677以及美国公开No.2005/0281781中记载的那些，其全部内容通过引用并入本文。体外引入细胞包括本领域已知的方法，例如电穿孔和脂质体转染。其它方法记载在下文中或是本领域已知的。
术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如可以从其获得用于本文所述方法的细胞(即，供体受试者)和/或用本文所述的细胞对其提供治疗(包括预防性治疗)(即受体受试者)的人。对于特定于特定动物(例如人类受试者)的那些病况或疾病状态的治疗，术语受试者是指该特定动物。本文可互换使用的“非人动物”和“非人哺乳动物”包括哺乳动物如大鼠、小鼠、兔、羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物。术语“受试者”还包括任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼。然而，有利地，受试者是哺乳动物如人，或其它哺乳动物例如驯养的哺乳动物如狗、猫、马等，或生产哺乳动物如牛、羊、猪等。
如本文所用，术语“施用”是指通过方法或途径将本文所公开的化合物置于受试者中，所述方法或途径导致试剂在期望部位至少部分递送。包含本文所公开的化合物的药物组合物可以通过导致受试者有效治疗的任何适当途径来施用。所述施用可以是全身性的或局部的。
如本文所用，术语“有效量”当用于描述SH2B3的拮抗剂时，是指足以降低SH2B3蛋白的活性或将SH2B3 mRNA或蛋白水平降低至少10％的量，例如至少10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％。
细胞生物学和分子生物学常用术语的定义可见于“The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy”第19版，由Merck Research Laboratories出版，2006(ISBN0-911910-19-0)；Benjamin Lewin，Genes X，由Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10:0763766321)；Kendrew等人(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)和Current Protocols in Protein Sciences 2009,Wiley Intersciences,Coligan等人编辑。
除非另有说明，本发明使用标准方法进行，如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4次编辑),Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,USA(2012)；Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1995)；或Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152,S.L.Berger和A.R.Kimmel编辑，Academic Press Inc.,San Diego,USA(1987)；Current Protocols in Protein Science(CPPS)(John E.Coligan等人编辑，John Wiley and Sons,Inc.)，Current Protocols inCell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等人编辑，John Wiley and Sons,Inc.)，和Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique by R.Ian Freshney,出版商：Wiley-Liss；第5次编辑(2005)，Animal Cell Culture Methods(Methods in CellBiology,Vol.57,编者Jennie P.Mather和David Barnes，Academic Press，第1次编辑，1998)中所述，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”用于提及对于实施方案是有用的组合物、方法及其相应组分，但是可以包括未指定的元素，无论是否有用。
如本文所用，术语“基本上由...组成”是指给定实施方案所需的那些元素。该术语允许存在不会实质上影响本发明的该实施方案的基本的和新的或功能性的特征的元素。
除了在操作实施例中，或在另有说明的情况下，表示本文使用的成分或反应条件的数量的所有数字应被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。当与百分比相关地使用时，术语“约”可意指所提及的值的±1％。例如，约100意指从99到101。
虽然在本公开的实施或试验中可以使用与本文所述类似或等同的方法和材料，但适用的方法和材料将在下文描述。术语“包含”意指“包括”。缩写“e.g.”来自拉丁语exempligratia，并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”同义。
多能干细胞和祖细胞
在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞群可以是造血干细胞、造血祖细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞或其组合。
在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞群是哺乳动物来源的。在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞群是人源的。
在一些实施方案中，可以从自体供体获得干细胞和/或祖细胞。也就是说，干细胞或祖细胞的供体也将是源自这类干细胞和/或祖细胞的RBC的受体。在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞可以从同种异体供体例如需要输血的受试者的同胞、父母或其他亲属获得。可以受益于自体和/或同种异体捐赠的患者的实例是本领域公知的，包括但不限于患有自身免疫疾病、血液病或病症、免疫疾病或病症、或其他相关疾病或病况的患者。RBC相容性是本领域公知的，并且总结在表1中。
表1.红细胞相容性表
在一些实施方案中，干细胞群是造血干细胞群。本领域已知HSC可以包括或可以不包括CD34+细胞。CD34+细胞是表达CD34细胞表面标志物的未成熟细胞。CD34+细胞被认为包括具有干细胞特性的细胞亚群。HSC包括多能干细胞、专能干细胞(例如，淋巴干细胞)和/或致力于特定造血谱系的干细胞。致力于特定造血谱系的干细胞可以是T细胞谱系、B细胞谱系、树突状细胞谱系、朗格汉斯细胞谱系和/或淋巴组织特异性巨噬细胞谱系。此外，HSC还指长期HSC(LT-HSC)和短期HSC(ST-HSC)。长期干细胞通常包括对移植后的多谱系植入的长期(超过三个月)贡献。短期干细胞通常是持续短于三个月的和/或不是多谱系的任何干细胞。例如，LT-HSC和ST-HSC基于它们的细胞表面标志物表达来区分。LT-HSC是CD34-、SCA-1+、Thyl.l+/lo、C-kit+、Un-、CD135-、Slamfl/CD150+，而ST-HSC是CD34+、SCA-1+、Thyl.l+/lo、C-kit+、lin-、CD135-、Slamfl/CD150+、Mac-1(CDlIb)lo(Handbook of StemCells.Lanza,R.P.等人(编辑)Elsevier Academic Press Burlington,MA(2004))。此外，ST-HSC比LT-HSC更少静止(即更活跃)和更多增殖。LT-HSC具有无限制的自我更新(即，它们在整个成年期生存)，而ST-HSC具有有限的自我更新(即，它们仅在有限的时间段内存活)。这些HSC中的任何一种可以有利地用于本文所述的任何方法中。
在一些实施方案中，所包括的用于本文所公开的方法、组合物和试剂盒的造血干细胞(HSC)包括能够分化以产生造血谱系的所有细胞的原始细胞。在一些实施方案中，所包括的用于本文所公开的方法和组合物中的HSC还更一般性地包括具有自我更新能力和分化成更成熟的血细胞的能力的未成熟血细胞，所述更成熟的血细胞包括粒细胞(例如前髓细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)，红细胞(例如网织红细胞、红细胞)，凝血细胞(例如原巨核细胞、血小板生成型原巨核细胞，血小板)和/或单核细胞(例如，单核细胞，巨噬细胞)。在发育期间，造血的部位从胎肝转移到骨髓，而骨髓在整个成年期仍然是造血的部位。
在一些实施方案中，干细胞或祖细胞是从O型血型的供体受试者获得的，因此是通用供体。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞是从O阴性(O-)血型(即，O型，Rh因子阴性)的供体受试者获得的，因此是通用供体。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞或HSC获自AB型血型的受试者，并且是通用血浆供体。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞是从与受体受试者的种族背景相同的受试者获得的。
表2：示出不同种族背景下不同血型的分布情况。
血型 高加索人 非裔美国人 西班牙裔 亚裔
O+ 37％ 47％ 53％ 39％
O- 8％ 4％ 4％ 1％
A+ 33％ 24％ 29％ 27％
A- 7％ 2％ 2％ 0.5％
B+ 9％ 18％ 9％ 25％
HSC可以从血液产品中获得。血液产品包括从身体或包含造血来源细胞的身体器官获得的产品。这些来源包括未分级骨髓、外周血单个核细胞、脐带血、脐带组织、外周血(例如，G-CSF动员外周血)、肝、胸腺、淋巴和脾。所有上述粗制或未分级的血液产品可以以多种方式富集具有造血干细胞特征的细胞。例如，通过它们表达的细胞表面分子来选择较成熟的分化细胞。任选地，通过选择CD34+细胞分级血液产品。CD34+细胞包括能够自我更新和具有多能性的细胞亚群。这种选择使用例如市售的磁性抗CD34珠(Dynal，Lake Success，NY)完成。未分级的血液产品任选地直接从供体获得或从冷冻保储存库中恢复。
HSC扩增的来源还包括主动脉-性腺-中肾(AGM)衍生的细胞、胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSC)。胚胎干细胞是本领域公知的，并且可以从商业或学术来源获得(Thomson等人，282Sci.1145-47(1998))。iPSC是通过诱导某些基因的“强制”表达，从非多能干细胞、通常是成体体细胞人工衍生的多能干细胞类型(Baker,Nature Rep.Stem Cells(Dec.6,2007)；Vogel&Holden,23Sci.1224-25(2007))。ESC、AGM和iPSC可以从动物或人类来源获得。AGM干细胞是诞生于主动脉内并定植于胎肝的细胞。
在一些实施方案中，干细胞群是iPSC群。术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”或“iPS细胞”是指将分化细胞(例如体细胞)的分化状态重编程为多能细胞的细胞。诱导多能干细胞a)可以自我更新，并且b)可以分化以产生生物体中的所有类型的细胞。iPS细胞具有ES细胞样形态，生长为具有大的核-细胞质比例、清晰的边界和突出的核仁的扁平集落。此外，iPS细胞表达本领域普通技术人员已知的一种或多种关键多能性标志物，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、T AI60、TRA I81、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT和zfp42。IPS细胞可以通过以下产生：向细胞提供“重编程因子”，即作用于细胞以改变转录的生物活性因子的一种或多种如混合物，从而将细胞重编程为多能性。生成和表征iPS细胞的方法的实例可见于例如申请US20090047263、US20090068742、US20090191 159、US20090227032、US20090246875和US20090304646，将其各自的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，干细胞群是核转移干细胞(NT-ESC)或人NT-ESC(hNT-ESC)的群。通过体细胞核转移(SCNT)产生多能干细胞的方法是本领域公知的，并且包括美国专利5,843,780和6,200,806中公开的方法，并且从由体细胞核转移衍生的囊胚的内细胞团获得ESC的方法记载于美国专利5,945,577；5,994,619；6,235,970，其全部内容通过引用并入本文。此外，提高SCNT的效力的方法公开在2015年9月15日提交的国际申请PCT/US15/50178中，其全部内容通过引用并入本文。胚胎干细胞的区别特征定义了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有胚胎干细胞的一个或多个独特特征，使得该细胞可以与其他细胞区分开，则该细胞具有胚胎干细胞的表型。区分胚胎干细胞的示例特征包括但不限于基因表达谱、增殖能力、分化能力、核型、对特定培养条件的响应等。
在优选实施方案中，本文所述的公开内容不涉及可能导致承受对人或动物没有任何实质医疗益处的痛苦的克隆人类的方法、用于修饰人类的种系遗传同一性的方法、用于工业或商业目的的人类胚胎的使用或用于修饰动物遗传同一性的方法，以及由这些方法产生的动物。
在一些实施方案中，祖细胞群是造血祖细胞群。造血祖细胞可以从各种来源获得，所述来源包括例如骨髓、外周血和脐带血。造血祖细胞也可以从祖细胞供体的外周血中获得。在从外周血收集细胞之前，供体可用细胞因子如粒细胞集落刺激因子进行处理，以促进细胞从骨髓迁移到血液隔室。可以通过静脉内管收集细胞并过滤以分离用于移植的白细胞。获得的白细胞群(即，干细胞、祖细胞和不同成熟度的白细胞的混合物)可作为异质混合物移植，或者可使用本领域技术人员已知的细胞表面标志物进一步分离造血祖细胞。
如本文所用的术语造血祖细胞能够分化成造血谱系的一种或多种成熟细胞类型，但不能长期自我更新。因此，造血祖细胞可以恢复和维持造血三到四个月(Marshak，D.R.等人(2001).Stem cell biology,Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring HarborLaboratory Press)，并且在个体造血祖细胞移植后立即恢复期间是重要的。能用于移植的造血祖细胞可从各种来源获得，包括例如骨髓、外周血和脐带血。
骨髓可以通过用针刺入骨头并用注射器去除骨髓细胞(这里称为“骨髓穿刺液”)获得。造血祖细胞可以通过使用特异于造血祖细胞的表面标志物在移植前从骨髓穿刺液中分离出来，或者将全骨髓移植到用本文所述的方法处理的个体中。
造血祖细胞和/或异质造血祖细胞群也可以从人脐带和/或胎盘血中分离。这类血液可以通过本领域已知的几种方法收集。例如，因为脐带血是HSPC的丰富来源(参见Nakahata&Ogawa,70J.Clin.Invest.1324-28(1982)；Prindull等人，67Acta.Paediatr.Scand.413-16(1978)；Tchernia等人，97(3)J.Lab.Clin.Med.322-31(1981))，新生儿血液的优良来源是脐带和胎盘。在低温保存之前，新生儿血液可以通过从脐带直接引流和/或通过在根处和扩张的静脉处从输送的胎盘进行针吸来获得。参见例如美国专利No.7,160,714；No.5,114,672；No.5,004,681；美国专利申请系列No.10/076,180，公开号20030032179。实际上，脐带血干细胞已经用于患有恶性和非恶性疾病的儿童在清髓性放化疗剂量治疗后的造血作用重建。Sirchia&Rebulla,84Haematologica 738-47(1999)。另见Laughlin 27Bone Marrow Transplant.1-6(2001)；美国专利6,852,534。另外，据报道，脐带血中的干细胞和祖细胞在培养时似乎具有比成体骨髓中的那些更强的增殖能力。Salahuddin等人，58Blood 931-38(1981)；Cappellini等人，57Brit.J.Haematol.61-70(1984)。
或者，可以使用通过超声(Daffos等人，153Am.J.Obstet.Gynecol.655-60(1985)；Daffos等人，146Am.J.Obstet.Gynecol.985-87(1983),通过胎盘穿刺术(Valenti,115Am.J.Obstet.Gynecol.851-53(1973)；Cao等人，19J.Med.Genet.81-87(1982))、通过胎儿镜检查(Rodeck,in Prenatal Diagnosis,(Rodeck&Nicolaides，编辑，Royal Collegeof Obstetricians&Gynaecologists,London,1984))引导的针头从胎盘根部的胎儿循环中取出胎儿血液并进行冷冻保存。实际上，除了脐带血和胎盘以外，绒毛膜绒毛和羊水也是多能胎儿干细胞的来源(参见WO 2003 042405)。
已知各种试剂盒和收集装置用于收集、处理和储存脐带血。参见例如美国专利No.7,147,626；No.7,131,958。收集应在无菌条件下进行，血液可用抗凝剂处理。这类抗凝剂包括例如柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖，酸性柠檬酸盐-右旋糖，Alsever溶液(Alsever&Ainslie,41N.Y.St.J.Med.126-35(1941)、DeGowin溶液(DeGowin等人，114JAMA 850-55(1940))、Edglugate-Mg(Smith等人，38J.Thorac.Cardiovasc.Surg.573-85(1959))、Rous-Turner溶液(Rous&Turner,23J.Exp.Med.219-37(1916))、其他葡萄糖混合物、肝素或二羟香豆素乙酸乙酯。参见Hum,Storage of Blood 26-160(Acad.Press,NY,1968)。
各种方法在本领域中已知或在本文中描述，并且可用于富集所收集的脐带血用于HSPC。这些包括但不限于单独或组合的平衡密度离心、单位重力速度沉降(velocitysedimentation at unit gravity)、免疫玫瑰花环试验(rosetting)和免疫粘附、对流离心淘析、T淋巴细胞消耗和荧光激活细胞分选。参见例如美国专利No.5,004,681。
在一些实施方案中，HSPC可从低温(crypgenically)制备的血液获得。在一些实施方案中，可以通过加入低温保护剂如DMSO(Lovelock&Bishop,183Nature 1394-95(1959)；Ashwood-Smith 190Nature 1204-05(1961))，甘油，聚维酮(Rinfret,85Ann.N.Y.Acad.Sci.576-94(1960))，聚乙二醇(Sloviter&Ravdin,196Nature 899-900(1962))，白蛋白、右旋糖、蔗糖、乙二醇、内消旋赤藓糖醇、D-核糖醇、D-甘露糖醇(Rowe,3(1)Cryobiology 12-18(1966))，D-山梨糖醇、内消旋肌醇、D-乳糖、氯化胆碱(Bender等人，15J.Appl.Physiol.520-24(1960))，氨基酸(Phan&Bender,20Exp.Cell Res.651-54(1960))，甲醇，乙酰胺，甘油单乙酸酯(Lovelock,56Biochem.J.265-70(1954))，和无机盐(Phan&Bender,104Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(1960))制备收集的血液用于低温储存。加入血浆(例如，至浓度为20％-25％)可以增加DMSO的保护作用。
收集的血液应以受控的速率冷却用于低温储存。不同的低温保护剂和不同的细胞类型具有不同的最佳冷却速率。参见例如Rapatz,5Cryobiology 18-25(1968),Rowe&Rinfret,20Blood 636-37(1962)；Rowe,3Cryobiology 12-18(1966)；Lewis等人，7Transfusion 17-32(1967)；Mazur,168Science 939-49(1970)。HSPC来源的操作，低温保存和长期储存的注意事项和程序是本领域已知的。参见例如美国专利No.4,199,022；美国专利No.3,753,357；美国专利No.4,559,298；美国专利No.5,004,681。还有各种用于储存血液的装置和相关方案。美国专利No.6,226,997；美国专利No.7,179,643。
解冻和重建用于HSPC的血液的注意事项是本领域已知的。美国专利No.7,179,643；美国专利No.5,004,681。血液也可以经处理以防止聚结(参见Spitzer,45Cancer3075-85(1980)；Stiff等人，20Cryobiology 17-24(1983))，并除去有毒的低温保护剂(美国专利No.5,004,681)。
从血源中分离干细胞和/或祖细胞的方法是本领域已知的，这里不再赘述。例如，造血干细胞可以使用本领域技术人员已知的方法、利用结合造血干细胞表面抗原如CD34的市售抗体来分离。
通常，如本文所述的细胞可以在本领域可获得和公知的培养基中维持和扩增。这类培养基包括但不限于Dulbecco's改良的Eagle's,F-12KTM.,EAGLE'S MINIMUM ESSENTIALMEDIUMTM(DMEM)，DMEM F12Medium.RTM.，和Serum-FreeTM,RPMI-1640MediumTM,Iscove's改良的Dulbecco's MediumTM(IMDM)。用于造血细胞培养和扩增的许多培养基也可用作低葡萄糖制剂，其中含有或不含有丙酮酸钠。
本文还考虑用哺乳动物血清补充细胞培养基。血清通常包含生存和扩增所必需的细胞因子和组分。血清的实例包括胎牛血清(FBS)、牛血清(BS)、小牛血清(CS)、胎小牛血清(FCS)、新生小牛血清(NCS)、山羊血清(GS)、马血清(HS)、人血清、鸡血清、猪血清、绵羊血清、兔血清、血清替代物和牛胚胎液。要理解的是，如果认为有必要使补体级联的组分失活，则血清可以在55-65摄氏度热灭活。
另外的补充剂也可有利地用于向细胞提供必需的微量元素以获得最佳生长和扩增。这种补充剂包括例如胰岛素、转铁蛋白、硒钠及其组合。这些组分可以包括在盐溶液中，包括但不限于(HBSS)、EARLE'S SALTTM、Hanks平衡盐溶液、抗氧化剂补充剂、MCDB-201TM、溶液盐水(PBS)、抗坏血酸和抗坏血酸-2-磷酸盐，以及其他氨基酸。许多细胞培养基已经含有氨基酸，然而，一些在培养细胞之前需要补充。这些氨基酸包括但不限于L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-半胱氨酸，L-胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-缬氨酸。确定这些补充剂的适当浓度在本领域技术人员的技能之内。
激素也可有利地用于本文所述的细胞培养基中，包括但不限于D-醛固酮、二乙基己烯雌酚(DES)、地塞米松、β-雌二醇、氢化可的松、胰岛素、催乳素、孕酮、生长抑素/人生长激素(HGH)、促甲状腺素、甲状腺素和L-甲状腺原氨酸。
根据细胞的类型和分化细胞的命运，脂质和脂质载体也可用于补充细胞培养基。这样的脂质和载体可以包括但不限于胆固醇、与白蛋白缀合的亚油酸、环糊精、与白蛋白缀合的亚油酸和油酸、非缀合亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸-油酸-花生四烯酸和与白蛋白未缀合和缀合的油酸，等等。
HSPC可以在低血清或无血清培养基中培养。用于培养细胞的无血清培养基记载于例如美国专利No.7,015,037。许多细胞已经在无血清或低血清培养基中生长。例如，培养基可以补充有一种或多种生长因子。通常使用的生长因子包括但不限于骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子和表皮生长因子、干细胞因子、促血小板生成素、Flt3配体和1'-3。参见例如美国专利No.7,169,610；7,109,032；7,037,721；6,617,161；6,617,159；6,372,210；6,224,860；6,037,174；5,908,782；5,766,951；5,397,706；和4,657,866；所有这些都通过引用并入本文用于教导在无血清培养基中生长细胞。
培养中的细胞可以保持悬浮或附着于固体支持物，例如细胞外基质组分。干细胞通常需要促使它们附着于固体支持物的额外因子，例如I型和II型胶原、硫酸软骨素、纤连蛋白、“超纤连蛋白”和纤连蛋白样聚合物、明胶、聚-D和聚-L-赖氨酸、血小板反应蛋白和玻连蛋白。HSPC也可以在低附着瓶中培养，例如但不限于Corning低附着板。
在一个实施方案中，通过使造血细胞群与包含如本文所述的至少一种SH2B3抑制剂(即，SH2B3iRNA或基因编辑系统)的组合物接触来离体处理造血干细胞和/或祖细胞，从而将其分化为RBC，收集RBC并随后移植到需要其的个体。SH2B3抑制剂的有效浓度可以由本领域技术人员确定，例如通过在适当的体外测定或其它合适的系统中进行连续稀释并试验效力。用于处理造血干细胞和/或祖细胞的浓度范围实例包括但不限于约1纳摩尔至约10毫摩尔；约1mM至约5mM；约1nM至约500nM；约500nM至约1,000nM；约1nM至约1,000nM；约1uM至约1,000uM；1uM至约500uM；约1uM至约100uM；约1uM至约10uM。在一个实施方案中，该范围为约5uM至约500uM。
HSPC可以处理多种时间。合适的时间可由本领域技术人员确定。例如，细胞可以处理数分钟，例如5分钟、10分钟、15分钟、30分钟等，或处理数小时，例如1小时、2小时、3小时、4小时，最多24小时或甚至几天。在一个实施方案中，将细胞处理2小时，然后更换为不具有包含本文所述的至少一种iRNA的组合物的培养基。
一旦在培养物中建立，如本文所述为增强HSPC群而经处理的细胞和/或未处理的细胞可以新鲜或冷冻使用，并使用例如含有40％FCS和10％DMSO的DMEM作为冷冻原液储存。制备用于培养细胞的冷冻原液的其它方法对于本领域技术人员而言也是可利用的。
此外，使用本文所公开的方法和组合物获得的RBC可以通过本文所述的方法扩增，并且可以随后使用本领域已知的用于RBC低温保存的技术进行低温保存。因此，使用低温保存，可以维持RBC，使得一旦确定受试者需要输血，则RBC可以解冻并移植到受试者中。
抑制SH2B3的方法
SH2B3的抑制可导致SH2B3蛋白水平降低、SH2B3 mRNA水平降低、SH2B3蛋白活性降低或其组合。SH2B3的抑制可以使用本领域已知的各种方法进行，包括但不限于基因组编辑、基因沉默、正常SH2B3蛋白活性的破坏及其组合。
在一些实施方案中，在细胞扩增和/或富集之前，可以在干细胞和/或祖细胞中抑制SH2B3。在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞在SH2B3抑制之前扩增和/或富集。
在一些实施方案中，SH2B3的抑制包括将干细胞和/或祖细胞群与基因组编辑剂接触，用于从至少一种干细胞靶向切除SH2B3基因。如本文所用，术语“基因组编辑剂”是指可以修饰生物体基因组中的核苷酸序列的化合物或组合物。在一些实施方案中，基因组编辑剂可以从靶基因组中切除特定的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因组编辑剂可以破坏特定核苷酸序列的功能，例如通过断裂序列中的一个或多个键。基因组编辑可以通过诸如核酸酶介导的诱变、化学诱变、放射诱变或大范围核酸酶介导的诱变等过程来实现。
在一些实施方案中，所述基因组编辑剂包含DNA结合元件和核酸酶，其中所述DNA结合元件将所述核酸酶定位到靶位点，然后由所述核酸酶切割。
在一些实施方案中，基因组编辑剂是CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR/Cas9，其在美国专利8,697,359和美国申请2015/0291966中公开，其全部内容通过引用并入本文。在可选的实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR/Cpf1，如Zetsche等人，2015；Cell 163(3)；759-777“Cpf1Is a Single RNA-GuidedEndonuclease of a Class 2CRISPR-Cas System”所公开的，其全部内容通过引用并入本文。CRISPR/Cas是一种基于可用于基因组工程化的细菌系统的工程化核酸酶系统。它是基于多种细菌和古菌的适应性免疫反应的一部分。当病毒或质粒侵入细菌时，侵入者DNA的片段通过“免疫”反应转化为CRISPR RNA(crRNA)。然后该crRNA通过部分互补区域与另一种类型的称为tracrRNA的RNA相关联，以将Cas9或Cpf1核酸酶引导至与称为“前间区序列(protospacer)”的靶DNA中的crRNA同源的区域。Cas9在由crRNA转录本中包含的20个核苷酸引导序列规定的位点处切割DNA，以在双链断裂(DSB)处产生钝端。Cas9需要crRNA和tracrRNA来进行位点特异性DNA识别和切割。该系统现在被设计成使得可以将crRNA和tracrRNA组合成一个分子(“单引导RNA”)，并且单引导RNA的crRNA等同部分可以设计成引导Cas9核酸酶靶向任何所需的序列(参见Jinek等人(2012)Science 337,p.816-821，Jinek等人(2013),eLife 2:e00471，和David Segal,(2013)eLife 2:e00563)。在可选实施方案中，使用CRISPR/Cpf1系统，其中Cpf1在基因编辑复合物中仅需要一个RNA模板，并切割DNA，导致远离5'-富T的PAM的5nt交错切口，产生粘性末端(而不是使用Cas9时的钝端)。在一些实施方案中，替代基因可以用于代替SH2B3基因，例如标记基因，或者在一些实施方案中是可操作地连接到诱导型启动子的细胞死亡基因，从而允许用药物修饰的(即，SH2B3基因缺失)细胞的特异性可诱导的细胞死亡，以打开来自诱导型启动子的表达，如果有必要在它们移植到受试者中后消除这类修饰的细胞。因此，CRISPR/Cas(cas9或cpf1)系统可以设计成在基因组中的所需靶标处产生双链断裂(即，钝端(即，使用cas9))或粘性末端(即，使用cpf1))，并且双链断裂的修复可以通过使用修复抑制剂来影响，所述修复抑制剂致使易错修复的增加。
至少有三种类型的CRISPR/Cas系统，它们都包含RNA和Cas蛋白。I型和III型都具有处理pre-crRNA的Cas内切核酸酶，当完全加工成crRNA时，组装能够切割与crRNA互补的核酸的多重-Cas蛋白复合物。II型CRISPR(以Cas9为例)是最有特色的系统之一。Cas9蛋白具有至少两个核酸酶结构域：一个核酸酶结构域与HNH内切核酸酶相似，另一个类似于Ruv内切核酸酶结构域。HNV型结构域似乎负责切割与crRNA互补的DNA链，而Ruv结构域切割非互补链。
在一些实施方案中，Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白的“功能衍生物”。如本文所用，天然序列多肽的“功能衍生物”是具有与天然序列多肽相同的定性生物学特性的化合物。“功能衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，条件是它们具有与相应天然序列多肽共同的生物活性。本文考虑的生物活性是功能衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”包括多肽的氨基酸序列变体，其共价修饰物和融合物。
如本文所用，“Cas多肽”包括全长Cas多肽，Cas多肽的酶活性片段和Cas多肽或其片段的酶活性衍生物。Cas多肽或其片段的合适衍生物包括但不限于：Cas蛋白或其片段的突变体、融合物、共价修饰物。
Cas蛋白和Cas多肽可以从细胞获得或化学合成获得或通过这两种方法的组合获得。所述细胞可以是天然产生Cas蛋白的细胞，或天然产生Cas蛋白并被遗传工程化以产生更高表达水平的内源性Cas蛋白或从外源导入的核酸产生Cas蛋白(该核酸编码与内源性Cas相同或不同的Cas)的细胞。所述细胞可以是不天然产生Cas蛋白但被遗传工程化以产生Cas蛋白的细胞。
CRISPR/Cas系统也可用于抑制基因表达。Lei等人((2013)Cell 152(5):1173-1183)已经显示，当与引导RNA共表达时，缺乏内切核酸酶活性的催化死亡Cas9产生可以特异性干扰转录延伸、RNA聚合酶结合或转录因子结合的DNA识别复合物。这种称为CRISPR干扰(CRISPRi)的系统可以有效抑制靶基因的表达。
另外，已经开发了Cas蛋白，其在其切割结构域中包含突变，使得它们不能诱导DSB，并且相反地在靶DNA中引入切口。特别地，Cas核酸酶包含两个核酸酶结构域，即HNH和RuvC样，用于分别切割靶DNA的正义和反义链。Cas核酸酶因此可以工程化为使得只有一个核酸酶结构域是功能性的，从而产生Cas切口酶。
Cas9相关的CRISPR/Cas系统包含两个RNA非编码组分：tracrRNA和包含由相同直接重复(DR)间隔的核酸酶引导序列(间区序列)的pre-crRNA阵列。要使用CRISPR/Cas系统完成基因组编辑，这些RNA的两个功能必须存在(参见Cong等，(2013)Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143)。在一些实施方案中，tracrRNA和pre-crRNA通过单独的表达构建体或作为单独的RNA供应。在其他实施方案中，构建嵌合RNA，其中工程化的成熟的crRNA(赋予靶特异性)与tracrRNA融合(提供与Cas9的相互作用)以产生嵌合的cr-RNA-tracrRNA杂交体(也称为单引导RNA)。
Cpf1系统与CRISPR/Cas9系统相关，尽管Cpf1蛋白与Cas9非常不同，但在一些细菌中与CRISPR一同存在。Cpf1和Cas9的作用不同，在于Cas9需要两个RNA分子来切割DNA；Cpf1只需要一个。蛋白质也在不同的地方切割DNA，为研究人员提供了选择编辑位点的更多选择。Cpf1也以不同的方式切割DNA。Cas9在同一位置切割DNA分子中的两条链，留下“钝”端。相比之下，Cpf1产生的一条链比另一条长，产生“粘性”端，减少异常/随机DNA插入切割位点的机会，并且还可以更好地控制DNA插入Cpf1切割位点。由Cas9所留下的切口往往会通过将两端粘合在一起来进行修复，这可能会导致错误。相比之下，Cpf1粘结末端切割允许更准确和频繁的插入。
在一些实施方案中，基因组编辑剂是ZFN。ZFN通常包含锌指DNA结合蛋白和DNA切割结构域。如本文所用，“锌指DNA结合蛋白”或“锌指DNA结合结构域”是蛋白质，或较大蛋白质内的结构域，其以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA，所述锌指是结合结构域内的氨基酸序列区域，其结构通过配位锌离子而稳定。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白(ZFP)。锌指结合结构域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列。工程化锌指蛋白的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的锌指蛋白是自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要来自合理标准。设计的合理标准包括应用替代规则和计算机化算法，用于在储存现有ZFP设计和结合数据的信息的数据库中处理信息。
在一些实施方案中，基因组编辑剂是TALEN。如本文所用，术语“转录激活因子样效应物核酸酶”或“TAL效应物核酸酶”或“TALEN”是指通过将TAL效应子DNA结合结构域融合到DNA切割结构域而产生的一类人工限制性内切核酸酶。在一些实施方案中，TALEN是可以在没有来自另一TALEN的帮助下切割双链DNA的单体TALEN。术语“TALEN”还用于指设计为一起工作以在同一位点切割DNA的一对TALEN中的一个或两个成员。一起工作的TALEN可以被称为左TALEN和右TALEN，其参考了DNA的偏手性(handedness)。
在一些实施方案中，可以使用基因组编辑剂的组合。
在一些实施方案中，可将CRISPR/Cas、TALEN或ZFN分子(例如肽和/或肽/核酸复合物)引入细胞，例如培养的干细胞或祖细胞，使得CRISPR/Cas、TALEN或ZFN分子瞬时存在，并且在该细胞的后代中将不可检测到。在一些实施方案中，可以将编码CRISPR/Cas、TALEN或ZFN分子的核酸(例如编码肽/核酸复合物的部分的肽和/或多个核酸)引入细胞，例如培养的干细胞或祖细胞，使得核酸瞬时存在于细胞中，并且编码CRISPR/Cas、TALEN或ZFN分子的核酸以及CRISPR/Cas、TALEN或ZFN分子本身在该细胞的后代中将不可检测到。在一些实施方案中，可以将编码CRISPR/Cas、TALEN或ZFN分子的核酸(例如编码肽/核酸复合物的部分的肽和/或多个核酸)引入细胞，例如，培养的干细胞或祖细胞，使得核酸保持在细胞中(例如并入基因组中)并且编码CRISPR/Cas、TALEN或ZFN分子的核酸和/或CRISPR/Cas、TALEN的核酸或ZFN分子在该细胞的后代中将是可检测的。
可以通过任何合适的方式将基因组编辑剂递送至靶细胞。在一些实施方案中，基因组编辑剂(例如，CRISPR/Cas、TALEN或ZFN)是蛋白质并可以通过用于将蛋白质递送到细胞中的任何合适的方式递送，例如电穿孔、声孔作用(sonoporation)、显微注射、脂质体递送和基于纳米材料的递送。
基因组编辑剂也可以由核苷酸序列编码。在一些实施方案中，可以使用本领域普通技术人员已知的载体递送基因组编辑剂。可用于本发明的病毒载体系统包括但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，例如天花(orthopox)如痘苗病毒载体，或禽痘(avipox)如金丝雀痘或鸡痘病毒；(j)辅助病毒依赖性腺病毒或无肠腺病毒；(k)慢病毒载体；(l)腺病毒载体；和(m)疱疹病毒载体。另见美国专利第6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824，将其各自的内容通过引用整体并入本文。复制缺陷病毒也可以是有利的。
在一些实施方案中，可以使用质粒表达载体。质粒表达载体包括但不限于pcDNA3.1、pET载体pGEX载体(GE Life Sciences)和pMAL载体(NewEngland labs.Inc.)用于在大肠杆菌宿主细胞BL21、BL21(DE3)和AD494(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)和Origami(DE3)(中蛋白质表达；基于强CMV启动子的pcDNA3.1(InvitrogenTMInc.)和pCIneo载体(Promega)用于在哺乳动物细胞系如CHO、COS、HEK-293、Jurkat和MCF-7中的表达；复制缺陷型腺病毒载体pAdeno X、pAd5F35、pLP-Adeno-X-CMV载体 pAd/CMV/V5-DEST、pAd-DEST载体(InvitrogenTMInc.)用于在哺乳动物细胞中进行腺病毒介导的基因转移和表达；pLNCX2、pLXSN和pLAPSN逆转录病毒载体以供与来自Clontech的Retro-XTM系统一起用于在哺乳动物细胞中进行逆转录病毒介导的基因转移和表达；pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(INVITROGENTMInc.)用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达；腺病毒相关病毒表达载体如pAAV-MCS和pAAV-IRES-hrGFP用于在哺乳动物细胞中进行腺相关病毒介导的基因转移和表达。
载体可以并入或可以不并入细胞基因组。如果需要，构建体可以包括用于转染的病毒序列。或者，可以将构建体并入能够进行附加型复制(episomal replication)的载体，例如EPV和EBV载体。
当将一种或多种ZFP、TALEN、CRISPR/Cas分子引入细胞时，ZFP、TALEN、CRISPR/Cas分子可以在相同的载体上或不同的载体上携带。当使用多个载体时，每个载体可以包含编码一种或多种ZFP、TALEN、CRISPR/Cas分子的序列。
也可以使用基于非病毒的递送方法将编码工程化的ZFP、CRISPR/Cas分子和/或TALEN的核酸引入细胞(例如干细胞和/或祖细胞)中。核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、声孔作用、脂质转染、显微注射、基因枪法、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质-核酸缀合物、裸DNA、mRNA、人工病毒粒子和药物增强的DNA摄取。
另外的示例性核酸递送系统包括由Biosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Md.)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,Mass.)和Copernicus Therapeutics Inc,(参见例如美国专利No.6,008,336)提供的那些。脂质转染记载于例如美国专利No.5,049,386、美国专利No.4,946,787；和美国专利No.4,897,355，并且脂质转染试剂是商业销售的(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。适用于多核苷酸有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024的那些。
关于基因组编辑技术的更多细节可见于例如Takashi Yamamoto(Springer，2015)的“Targeted Genome Editing Using Site-Specific Nucleases:ZFNs,TALENs,and theCRISPR/Cas9System”中，其内容通过引用整体并入本文用于教导基因组编辑。
SH2B3的拮抗剂
在一些实施方案中，SH2B3的抑制包括使干细胞和/或祖细胞群与SH2B3的拮抗剂接触。如本文所用，术语“SH2B3的拮抗剂”是指降低SH2B3的水平和/或活性的任何试剂。术语“SH2B3的拮抗剂”是指使SH2B3的表达和/或活性降低至少10％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的试剂。SH2B3的拮抗剂的实例包括但不限于无机分子、有机分子、核酸、核酸类似物或衍生物、肽、拟肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段，及其组合。
在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂是本文中也称为核酸试剂的核酸或核酸类似物或其衍生物。如本领域技术人员将理解的，单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸还包括所描绘的单链的互补链。
不限于此，核酸试剂可以是单链或双链的。单链核酸试剂可以具有双链区域，例如其中存在内部自身互补性，并且双链核酸试剂可以具有单链区域。核酸可以是任何期望的长度。在具体实施方案中，核酸的长度可以在约10至100个核苷酸长的范围内。在各种相关实施方案中，核酸试剂(单链、双链和三链)的长度可以为约10至约50个核苷酸，约20至约50个核苷酸，约15至约30个核苷酸，约20至约30个核苷酸。在一些实施方案中，核酸试剂的长度为约9至约39个核苷酸。在一些其它实施方案中，核酸试剂的长度至少为30个核苷酸。
核酸试剂可以包含本领域已知的修饰核苷。修饰可以改变例如核酸试剂的稳定性、溶解度或核酸试剂与改变活性的细胞或细胞外组分的相互作用。在某些情况下，可能需要修饰双链核酸试剂的一条或两条链。在某些情况下，两条链将包括不同的修饰。在其他情况下，多个不同的修饰可以包括在每个链上。给定链上的各种修饰可以彼此不同，并且也可以不同于另一条链上的各种修饰。例如，一条链可以具有修饰，并且不同的链可以具有不同的修饰。在其他情况下，一条链可以具有两个或更多个不同的修饰，另一条链可以包括与第一链上的至少两个修饰不同的修饰。
在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂是有效诱导RNA干扰的单链和双链核酸试剂，本文称为siRNA、RNAi试剂或iRNA试剂。适用于在SH2B3中诱导RNA干扰的iRNA试剂公开在例如WO2013/019857中，其内容通过引用整体并入本文。
SH2B3的RNAi抑制剂
在一个实施方案中，iRNA试剂包括用于在细胞(例如人干细胞和/或祖细胞群中的细胞)中抑制编码SH2B3的基因的表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其中dsRNA包括具有互补区域的反义链，其与编码SH2B3的基因的表达中形成的mRNA的至少一部分互补，并且其中互补区域的长度为30个核苷酸或更短，通常为19-24个核苷酸长，并且其中dsRNA在与表达基因SH2B3的细胞接触时或引入所述细胞时抑制至少10％的基因表达，如通过例如PCR或基于支链DNA(bDNA)的方法、或通过基于蛋白质的方法如通过免疫测定或蛋白质印迹所测定的。细胞培养物中SH2B3的表达可以通过以下进行测定：例如借助bDNA或TaqMan测定来测量SH2B3 mRNA水平，或通过例如免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹或流式细胞技术测量蛋白水平。
在一些实施方案中，iRNA试剂是反义寡核苷酸。本领域技术人员清楚，单链寡核苷酸可以与互补靶序列杂交，并阻止翻译装置(machinery)接近靶RNA转录物，从而阻止蛋白质合成。单链寡核苷酸也可以与互补RNA杂交，并且RNA靶可以随后用诸如RNase H等酶切割，从而阻止靶RNA的翻译。替代地或附加地，单链寡核苷酸可以通过RISC介导的靶序列的裂解来调节靶序列的表达，即单链寡核苷酸用作单链RNAi试剂。本文所用的“单链RNAi试剂”是由单一分子构成的RNAi试剂。单链RNAi试剂可以包括通过链内配对形成的双链区，例如其可以是或包括发夹或锅柄(pan-handle)结构。
在一些实施方案中，iRNA试剂是小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)，其是产生可用于通过RNA干扰(RNAi)沉默靶基因表达的紧密发夹环的RNA序列。
不希望受理论束缚，SH2B3已知别名SH2B适配子蛋白3或Lnk；NCBI Gene ID：10019)是细胞内适配子蛋白家族的成员。已知智人的SH2B3的mRNA具有至少两种同种型(NCBI登录号：NM_005475.5(转录物变体1)和NM_001291424(转录物变体2))。由转录物变体1编码的SH2B3具有NP_005466.1(SEQ ID NO：51)的氨基酸序列，其如下：
MNGPALQPSSPSSAPSASPAAAPRGWSEFCELHAVAAARELARQYWLFAREHPQHAPLRAELVSLQFTDLFQRYFCREVRDGRAPGRDYRDTGRGPPAKAEASPEPGPGPAAPGLPKARSSEELAPPRPPGPCSFQHFRRSLRHIFRRRSAGELPAAHTAAAPGTPGEAAETPARPGLAKKFLPWSLAREPPPEALKEAVLRYSLADEASMDSGARWQRGRLALRRAPGPDGPDRVLELFDPPKSSRPKLQAACSSIQEVRWCTRLEMPDNLYTFVLKVKDRTDIIFEVGDEQQLNSWMAELSECTGRGLESTEAEMHIPSALEPSTSSSPRGSTDSLNQGASPGGLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVKAAQLVQLQGPDAHGVFLVRQSETRRGEYVLTFNFQGIAKHLRLSLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLHHFQRSPIPLECGAACDVRLSSYVVVVSQPPGSCNTVLFPFSLPHWDSESLPHWGSELGLPHLSSSGCPRGLSPEGLPGRSSPPEQIFHLVPSPEELANSLQHLEHEPVNRARDSDYEMDSSSRSHLRAIDNQYTPL(SEQ ID NO:51).
SH2B3基因的抑制可为根据本领域技术人员公知的方法基因沉默RNAi分子。例如，特异性靶向人SH2B3(GenBank No：NM_005475.5或NM_001291424)的基因沉默siRNA寡核苷酸双链可以容易地用于敲低SH2B3表达。可使用siRNA成功靶向SH2B3 mRNA；并且基于靶mRNA的已知序列，本领域技术人员可以容易地制备其它siRNA分子。为了避免疑问，人SH2B3的序列例如提供于GenBank登录号NM_005475.5(SEQ ID NO：52)。因此，为了避免任何疑问，本领域普通技术人员可以对NM_001005735.1(SEQ ID NO：52)的核酸序列设计核酸抑制剂，如RNAi(RNA沉默)试剂，SEQ ID NO：52序列如下：
在一些实施方案中，靶向SH2B3的shRNA具有如下核苷酸序列：CCGGCCTGACAACCTTTACACCTTTCTCGAGAAAGGTGTAAAGGTTGTCAGGTTTTGG(SEQ ID NO：1)或其至少10个、至少15个、至少20个、或至少25个连续核苷酸的片段。
在一些实施方案中，用于靶向SH2B3的shRNA具有如下核苷酸序列：CCGGGCCTGACAACCTTTACACCTTCTCGAGAAGGTGTAAAGGTTGTCAGGCTTTTTG(SEQ ID NO：2)或其至少10个、至少15个、至少20个、或至少25个连续核苷酸的片段。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的多核苷酸或其至少10个、至少15个、至少20个、或至少25个连续核苷酸的片段可组合用于靶向SH2B3。
在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂是miRNA(也称为“miR”)。已显示靶向SH2B3的miR包括但不限于：miR-153、miR-9、miR-181、miR-101、miR-384/384-3p、miR-124/506、miR-320/320abcd、miR-138、miR-421、miR-320/320abcd、miR-30a/30a-5p/30b/30b-5p/30cde/384-5p、miR-134、miR-488、miR-300、miR-148/152、miR-202/202-3p、miR-30a/30a-5p/30b/30b-5p/30cde/384-5p、miR-384/384-3p、miR-138、miR-33/33ab、miR-125/351、miR-326/330/330-5p、miR-326/330/330-5p、miR-23ab、miR-144、miR-448，和let-7/98。
通常，递送核酸分子的任何方法可以适于与本文所述的核酸试剂一起使用。
将RNA干扰剂(例如siRNA)或含有RNA干扰剂的载体递送至靶细胞例如干细胞和/或祖细胞用于摄取的方法包括注射含有RNA干扰剂如siRNA的组合物，或者使细胞与包含RNA干扰剂如siRNA的组合物直接接触。在另一个实施方案中，RNA干扰剂如siRNA可以通过例如流体动力学注射或导管插入直接注入任何血管，例如静脉、动脉、小静脉或小动脉。施用可以通过单次注射或两次或更多次注射。RNA干扰剂在药学上可接受的载体中递送。可以同时使用一种或多种RNA干扰剂。在一个实施方案中，用RNA干扰靶向特异性细胞，限制潜在的副作用。该方法可以使用例如包含细胞靶向部分和RNA干扰结合部分的复合物或融合分子，其用于将RNA干扰有效地递送到细胞中。例如，抗体-鱼精蛋白融合蛋白当与siRNA混合时结合siRNA并选择性地将siRNA递送到表达抗体识别的抗原的细胞中，导致仅在表达抗原的那些细胞中沉默基因表达。siRNA或RNA干扰诱导分子结合部分是蛋白质或蛋白质的核酸结合结构域或片段，并且结合部分与靶向部分的一部分融合。靶向部分的位置可以在构建体的羧基末端或氨基末端或在融合蛋白的中间。病毒介导的递送机制也可用来将siRNA体外和体内递送至细胞，如Xia,H等人(2002)Nat Biotechnol 20(10):1006)所述。shRNA的质粒或病毒介导的递送机制也可用来将shRNA体外和体内递送至细胞，如Rubinson,D.A.等人((2003)Nat.Genet.33:401-406)和Stewart,S.A.等人((2003)RNA 9:493-501)所述。RNA干扰剂，例如siRNA或shRNA，可以与表现以下一种或多种活性的组分一起引入：增强细胞对RNA干扰剂如siRNA的摄取，抑制单链的退火，稳定单链，或以其他方式促进递送至靶细胞并增加靶基因如SH2B3的抑制。特定RNA干扰剂的剂量将是实现RNA干扰例如特定靶基因的翻译后基因沉默(PTGS)所需的量，从而导致靶基因表达的抑制或由靶基因编码的蛋白质的活性或水平的抑制。
寡核苷酸修饰
在一些实施方案中，用于本文所公开的本发明各方面的抑制SH2B3的RNAi试剂可包括寡核苷酸修饰。未修饰的寡核苷酸在一些应用中可能不是最佳的，例如，未修饰的寡核苷酸可能易于被例如细胞核酸酶降解。然而，对寡核苷酸的一个或多个亚单位的化学修饰可以赋予改进的性质，例如可以使寡核苷酸对核酸酶更加稳定。典型的寡核苷酸修饰可以包括以下一个或多个：(i)改变，例如替代，磷酸二酯糖间键(phosphodiester intersugarlinkage)中的一个或两个非连接的磷酸氧和/或一个或多个连接的磷酸氧；(ii)改变，例如替代，核糖糖的成分，例如核糖糖上的2'羟基；(iii)用“脱磷酸”连接子批量替代磷酸酯部分；(iv)用非天然碱基修饰或替代天然存在的碱基；(v)核糖-磷酸骨架的替代或修饰，例如肽核酸(PNA)；(vi)寡核苷酸的3'端或5'端的修饰，例如，末端磷酸基团的去除、修饰或替代，或部分的缀合，例如配体缀合至寡核苷酸的3'或5'端；和(vii)糖的修饰，例如六元环。
在本文中使用的术语替代、修饰和改变等并不暗含任何方法限制，例如修饰并不意味着必须从参考或天然存在的核糖核酸开始并对其修饰以产生修饰的核糖核酸，而是修饰简单地表示与天然存在的分子的差异。如下所述，可以将修饰例如本文所述的那些提供为非对称修饰。
本文描述的修饰可以是唯一的修饰或者在多个核苷酸上包括的唯一类型的修饰，或者修饰可以与本文所述的一个或多个其它修饰组合。本文所述的修饰也可以组合到寡核苷酸上，例如寡核苷酸的不同核苷酸具有本文所述的不同修饰。
本文描述了抑制SH2B3表达的iRNA试剂。在一个实施方案中，iRNA试剂包括用于在离体细胞中抑制SH2B3表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，例如在从血液或UCB中获得的离体HSPC中，其中dsRNA包括具有互补区域的反义链，所述互补区域与SH2B3的表达中形成的mRNA的至少一部分互补，并且其中互补区域的长度为30个核苷酸或更短，通常为19-24个核苷酸长，并且其中dsRNA在与表达编码SH2B3的基因的细胞接触时或引入所述细胞时抑制至少10％的所述基因的表达，如通过例如PCR或基于支链DNA(bDNA)的方法、或通过基于蛋白质的方法如通过免疫测定或蛋白质印迹所测定的。细胞培养物(如HSPC)中SH2B3的表达可以通过以下进行测定：例如借助bDNA或TaqMan测定来测量SH2B3 mRNA水平，或通过例如免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹或流式细胞技术测量蛋白水平。
dsRNA包括在其中dsRNA将被使用的条件下互补以形成双链结构的两条RNA链。dsRNA的一条链(反义链)包括与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区域。靶序列可以衍生自本文所公开的SH2B3 mRNA的序列，例如SEQ ID NO：52。另一条链(有义链)包括与反义链互补的区域，使得当在合适条件下组合时，两条链杂交并形成双链结构。通常，双链结构的长度在15和30个碱基对之间(包括端值)，更通常在18和25个碱基对之间(包括端值)，更通常在19和24个碱基对之间(包括端值)和最通常在19和21个碱基对之间，包括端值。类似地，与靶序列互补的区域的长度在15和30个核苷酸之间(包括端值)，更通常在18和25个核苷酸之间(包括端值)，更通常在19和24个核苷酸之间(包括端值)，并且最通常地在19和21个核苷酸之间，包括端值。在一些实施方案中，dsRNA的长度在15和20个核苷酸之间，包括端值，并且在其它实施方案中，dsRNA的长度在25和30个核苷酸之间，包括端值。如普通技术人员将认识到的，靶向裂解的RNA的靶向区域最常是较大的RNA分子(通常是mRNA分子)的一部分。在相关的情况下，mRNA靶标的“部分”是足够长度的mRNA靶标的连续序列，使其作为用于RNAi指导的裂解的底物(即通过RISC途径裂解)。具有短至9个碱基对的双链体的dsRNA在某些情况下可以介导RNAi指导的RNA裂解。通常，靶标长度至少为15个核苷酸，优选长度为15-30个核苷酸。
本领域技术人员还将认识到双链区是dsRNA的主要功能部分，例如9至36、例如15-30个碱基对的双链区。因此，在一个实施方案中，在其被加工成例如靶向期望的RNA以进行裂解的15-30个碱基对的功能性双链的范围内，具有大于30个碱基对的双链区的RNA分子或RNA分子复合物是dsRNA。因此，普通技术人员将认识到，在一个实施方案中，miRNA是dsRNA。在另一个实施方案中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施方案中，用于靶向SH2B3表达的iRNA试剂不是通过在靶细胞中裂解较大的dsRNA而产生的。
如本文所述的dsRNA可进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端。dsRNA可以通过如下文进一步讨论的本领域已知的标准方法例如通过使用自动化DNA合成仪合成，例如自动化DNA合成仪可从例如Biosearch,Applied Biosystems,Inc.获得。在一个实施方案中，编码SH2B3的基因是人类基因。在另一个实施方案中，编码SH2B3的基因是小鼠或大鼠基因。
一方面，dsRNA将包括至少两个核苷酸序列，正义和反义序列，其中有义链是SEQID NO：52。在这方面，两条序列之一与两条序列中的另一条序列互补，其中一条序列与SH2B3 mRNA的序列基本上互补。如本文其它地方所描述的和如本领域已知的，也可以包含dsRNA的互补序列作为单个核酸分子的自身互补区域，而不是在单独的寡核苷酸上。
本领域技术人员清楚地知道具有20至23个、特别是21个碱基对的双链结构的dsRNA已被誉为在诱导RNA干扰方面特别有效(Elbashir等人，EMBO 2001,20:6877-6888)。然而，其他人已经发现更短或更长的RNA双链结构也是有效的。在上述实施方案中，凭借由表2-7中提供的序列标识符鉴定的寡核苷酸序列的性质，本文所述的dsRNA可以包括至少一条长度最小为21nt的链。可以合理地预期，与上述dsRNA相比，具有表2-7的序列之一的、一端或两端仅减少几个核苷酸的较短的双链也可以类似地有效。因此，根据本文所述的技术，预期dsRNA具有来自SEQ ID NO：1或2的序列之一的至少15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的部分序列，并且与包括全序列的dsRNA相比其抑制编码SH2B3的基因的表达的能力不同，这种不同不超过5、10、15、20、25或30％的抑制。
虽然靶序列长度通常为15-30个核苷酸，但是在该范围内的、用于指导任何给定靶RNA的裂解的特定序列的适合性存在广泛的变化。本文中提出的各种软件包和指南为任何给定基因靶标的最佳靶序列的鉴定提供了指导，但也可以采用经验方法，其中给定大小(作为非限制性实例，为21个核苷酸)的“窗口(window)”或“遮蔽(mask)”字面上或比喻意上(包括，例如生物信息学)放置在靶RNA序列上以鉴定可用作靶序列的大小范围内的序列。通过在初始靶序列位置的上游或下游将序列“窗口”逐步移动一个核苷酸，可以鉴定下一个潜在靶序列，直到为所选择的任何给定目标大小鉴定完整的可能序列集。该方法与鉴定执行最佳的那些序列的所鉴定的序列(使用本文所述或本领域已知的测定法)的系统合成和试验联合，可以鉴定当用iRNA试剂靶向时介导最佳抑制靶基因表达的那些RNA序列。因此，虽然例如通过表2-7中的序列标识符鉴定的序列表示有效的靶序列，但是预期可以通过在给定序列的上游或下游逐步“使窗口步移”一个核苷酸来实现抑制效率的进一步优化，从而鉴定具有相同或更好的抑制特征的序列。
此外，预期对于由序列标识符NO：1或2标识的任何序列，可以进一步优化，其能够通过系统地添加或去除核苷酸以产生更长或更短的序列并试验那些序列和通过从该点向靶RNA的上游或下游步移较长或较短大小的窗口而产生的序列。再次，将本方法与本领域已知的或本文所述的抑制测定中基于这些靶序列的iRNA的有效性试验联合以产生新的候选靶标，可以导致抑制效率的进一步提高。此外，这样优化的序列可以通过例如本文所述或如本领域已知的修饰的核苷酸(突出部分的添加或改变或如本领域已知的和/或本文中所讨论的其他修饰)的引入来调整，以进一步优化作为表达抑制剂的分子(例如增加血清稳定性或循环半衰期，增加热稳定性，增强跨膜递送，靶向特定位置或细胞类型，增加与沉默途径的酶的相互作用，增加从核内体的释放等)。
本文所述的iRNA可以包含与靶序列的一个或多个错配。在一个实施方案中，本文所述的iRNA包含不超过3个错配。如果iRNA的反义链含有与靶序列的错配，则优选错配区域不位于互补区域的中心。如果iRNA的反义链含有与靶序列的错配，优选错配限制在距互补区域的5'或3'端的最后5个核苷酸之内。例如，对于与编码SH2B3的基因的区域互补的23个核苷酸的iRNA试剂RNA链，所述RNA链通常在中心13个核苷酸内不含任何错配。本文描述的方法或本领域已知的方法可用于确定含有靶序列错配的iRNA是否有效抑制SH2B3的表达。考虑具有错配的iRNA在抑制SH2B3表达方面的效力是重要的，特别是如果已知与SH2B3基因具有互补性的特定区域在群体内具有多态性序列变异。
在一个实施方案中，dsRNA的至少一端具有1至4个、通常1或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA相对于它们的钝端对应物具有出乎意料的优异的抑制性质。在另一个实施方案中，iRNA如dsRNA的RNA经化学修饰以增强稳定性或其它有益特征。本文描述的技术中的特征核酸可以通过本领域公认的方法合成和/或修饰，例如"Current protocols in nucleic acid chemistry,"Beaucage,S.L.等人(编者),JohnWiley&Sons,Inc.,New York,N.Y.,USA中描述的那些，其内容通过引用并入本文。修饰包括例如(a)末端修饰，例如5'端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)，(b)碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的拍档集(anexpanded repertoire of parteners)碱基配对的碱基替代，碱基的去除(脱碱基核苷酸)，或缀合的碱基，(c)糖基修饰(例如在2'位置或4'位置)或糖基替代，以及(d)骨架修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代。用于本文所述实施方案的RNA化合物的具体实例包括但不限于含有修饰的骨架或不含天然核苷间键的RNA。具有修饰骨架的RNA尤其包括骨架中不具有磷原子的那些。为了本说明书的目的，并且如本领域有时提及的，在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰的RNA也可以被认为是寡核苷酸。在具体实施方案中，修饰的RNA将在其核苷间骨架中具有磷原子。
修饰的RNA骨架包括例如硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基膦酸酯和其它烷基膦酸酯包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯，次膦酸酯，氨基磷酸酯(phosphoramidate)包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯，硫羰氨基磷酸酯，硫羰烷基膦酸酯，硫羰烷基磷酸三酯，具有正常3'-5'键的硼烷基磷酸酯(boranophosphate)，这些的2'-5'连接类似物，以及具有相反极性的那些，其中核苷单元的相邻对为3'-5'与5'-3'或2'-5'与5'-2'连接的。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
教导上述含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利RE39464，将其各自的内容通过引用并入本文。
不包含磷原子的修饰的RNA骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架的那些；和具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他骨架。
教导上述寡核苷酸制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，将其各自通过引用并入本文。
在其它实施方案中，合适的RNA模拟物适合考虑用于iRNA中，其中核苷酸单元的糖基和核苷间键即骨架被新的基团替代。保持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。已经显示具有优异杂交性质的一种此类寡聚化合物，即RNA模拟物称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖基骨架被含酰胺的骨架、特别是氨基乙基甘氨酸骨架所替代。核碱基保留并直接或间接地结合到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。教导PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082；5,714,331；和5,719,262，将其各自通过引用并入本文。PNA化合物的进一步教导可见于例如Nielsen等人，Science,1991,254,1497-1500。
磷酸基团的修饰：可以通过用不同的取代基替代一个氧来修饰糖间键中的磷酸基。这种对RNA的磷酸糖间键修饰的一个结果可以是增加寡核苷酸对溶核破坏的抗性。修饰的磷酸基团的实例包括硫代磷酸酯，硒代磷酸酯(phosphoroselenate)，硼烷基磷酸酯，硼烷基磷酸酯酯，氢膦酸酯，氨基磷酸酯，烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在一些实施方案中，糖间键中的非桥键磷酸氧原子之一可被以下任何一种替代：S，Se，BR3(R是氢、烷基、芳基)，C(即烷基、芳基等)，H，NR2(R是氢、任选取代的烷基、芳基)或OR(R是任选取代的烷基或芳基)。未修饰的磷酸基团中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子团之一替代非桥键氧之一使得磷原子变为手性；换句话说，以这种方式修饰的磷酸基团中的磷原子是立体中心。立体磷原子可以具有“R”构型(本文为Rp)或“S”构型(本文为Sp)。
二硫代磷酸酯具有由硫替代的两个非桥键氧。二硫代磷酸酯中的磷中心是非手性的，其排除寡核苷酸非对映异构体的形成。因此，虽然不希望受理论束缚，但是可期望去除手性中心的对两个非桥键氧的修饰，例如，二硫代磷酸酯形成，这是因为它们不能产生非对映异构体混合物。因此，非桥键氧可以独立地为O，S，Se，B，C，H，N或OR(R是烷基或芳基)中的任何一个。
也可以通过用氮(桥键的氨基磷酸酯)、硫(桥键的硫代磷酸酯)和碳(桥键的亚甲基膦酸酯)替代桥键氧(即将磷酸酯连接到核苷的氧)来修饰磷酸酯连接子。替代可以在连接氧中的任一个或两个连接氧上发生。当桥键氧是核苷的3'-氧时，优选用碳取代。当桥键氧是核苷的5'-氧时，优选用氮取代。
其中至少一个连接到磷酸酯的氧已经被替代或磷酸基团被非磷基团替代的修饰的磷酸酯键也被称为“非磷酸二酯糖间键”或“非磷酸二酯连接子”。
磷酸基团的替代：磷酸基团可以由不含磷的连接体代替，例如，脱磷基连接子。脱磷基连接子在本文中也称为非磷酸二酯连接子。虽然不希望被理论束缚，但认为由于带电的磷酸二酯基团是溶核降解中的反应中心，所以将其用中性结构模拟物替代应赋予增强的核酸酶稳定性。同样，虽然不希望受理论束缚，但是在一些实施方案中，可期望引入其中带电的磷酸基团被中性部分替代的改变。
可替代磷酸基团的部分的实例包括但不限于酰胺(例如酰胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5')和酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(＝O)-5'))，羟基氨基，硅氧烷(二烷基硅氧烷)，甲酰胺，碳酸酯，羧甲基，氨基甲酸酯，羧酸酯，硫醚，环氧乙烷连接子，硫化物，磺酸酯，磺酰胺，磺酸酯酯，硫代甲缩醛(3'-S-CH2-O-5')，甲缩醛(3'-O-CH2-O-5')，肟，亚甲基亚氨基，亚甲基羰基氨基，亚甲基甲基亚氨基(MMI,3'-CH2-N(CH3)-O-C5')，亚甲基肼基、亚甲基二甲基肼基、亚甲基氧基甲基亚氨基、醚(C3'-O-C5')、硫醚(C3'-S-C5')，硫代乙酰氨基(C3’-N(H)-C(＝O)-CH2-S-C5’,C3’-O-P(O)-O-SS-C5’,C3’-CH2-NH-NH-C5’,3'-NHP(O)(OCH3)-O-5'和3'-NHP(O)(OCH3)-O-5’，和含有混合的N、O、S和CH2组分部分的非离子键。参见例如Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编辑.ACS Symposium Series 580，第3和4章,(pp.40-65)。优选的实施方案包括亚甲基甲基亚氨基(MMI)，亚甲基羰基氨基，酰胺，氨基甲酸酯和环氧乙烷连接子。
本领域技术人员清楚地知晓，在某些情况下，非桥键氧的替代可以导致由相邻的2'-OH增强的糖间键的裂解，因此在许多情况下，非桥键氧的修饰需要2'-OH的修饰，例如，不参与邻近的糖间键的裂解的修饰，例如阿拉伯糖、2'-O-烷基、2'-F、LNA和ENA。
优选的非磷酸二酯糖间键包括硫代磷酸酯，具有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的对映异构体过量的Sp异构体的硫代磷酸酯，具有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多对映异构体过量的Rp异构体的硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，烷基膦酸酯(例如甲基膦酸酯)，硒代磷酸酯，氨基磷酸酯(例如N-烷基氨基磷酸酯)和硼烷膦酸酯。
磷酸核糖骨架的替代：还可以构建模拟寡核苷酸的支架，其中磷酸连接子和核糖糖被核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物代替。虽然不希望被理论束缚，但认为重复带电骨架的缺失减弱了对识别聚阴离子的蛋白质(例如核酸酶)的结合。同样，虽然不希望受理论束缚，但是可期望在一些实施方案中引入其中碱基被中性替代骨架连系的改变。实例包括吗啉代，环丁基，吡咯烷，肽核酸(PNA)，氨基乙基甘氨酰PNA(aegPNA)和主链延伸的吡咯烷PNA(bepPNA)核苷代替物。在一些实施方案中，寡核苷酸是肽核酸，例如寡核苷酸的核糖磷酸骨架完全被肽核酸(PNA)替代。
糖基修饰：寡核苷酸可以包括核酸的全部或部分糖基的修饰。例如，可以用许多不同的“氧”或“脱氧”取代基修饰2'位(H，DNA；或OH，RNA)。虽然不受理论束缚，但由于2'-羟基不再被去质子化形成2'-醇盐离子，预期稳定性增强。2'-醇盐可以通过分子内亲核攻击连接子磷原子来催化降解。同样，虽然不希望受理论束缚，但可期望一些实施方案引入其中不可能在2'位形成醇盐的改变。
“氧”-2'羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，如R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖基)；聚乙二醇(PEG)，O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，n＝1-50；其中2'位氧通过(CH2)n(其中n＝1-4)与同一核糖糖的4'碳相连的“锁”核酸(LNA)，优选n为1(LNA)或2(ENA)；O-AMINE或O-(CH2)nAMINE(n＝1-10,AMINE＝NH2；烷基氨基，二烷基氨基，杂环基，芳基氨基，二芳基氨基，杂芳基氨基，二杂芳基氨基，乙二胺或聚氨基)；和O-CH2CH2(NCH2CH2NMe2)2。
“脱氧”修饰的实例包括卤素(例如氟)；氨基(例如NH2；烷基氨基，二烷基氨基，杂环基，芳基氨基，二芳基氨基，杂芳基氨基，二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2；烷基氨基，二烷基氨基，杂环基，芳基氨基，二芳基氨基，杂芳基氨基或二杂芳基氨基)；-NHC(O)R(R＝烷基，环烷基，芳基，芳烷基，杂芳基或糖基)；氰基；巯基；烷基硫代烷基；硫代烷氧基；硫代烷基；烷基；环烷基；芳基；烯基和炔基，其可任选被例如氨基官能团取代。
糖基也可以含有一个或多个具有与核糖中相应的碳相反的立体化学构型的碳。因此，寡核苷酸可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖基的核苷酸。类似地，2'位的修饰可以存在于阿拉伯糖构型中。术语“阿拉伯糖构型”是指以与2'-OH在阿拉伯糖中相同的构型将取代基置于核糖的C2'上。
核苷酸可以在糖基上的1'位具有α连接，例如α-核苷。单体也可以在4'位具有相反的构型，例如C5'和H4'或取代它们的取代基彼此互换。当C5'和H4'或取代它们的取代基彼此互换时，认为糖在4'位被修饰。
寡核苷酸还可以包括脱碱基糖，即在C-1'处缺乏核碱基或在C1'处具有代替核碱基的其它化学基团的单体。参见例如美国专利No.5,998,203，其内容全部并入本文。这些脱碱基还可以进一步在一个或多个构成型糖原子处含有修饰。寡核苷酸还可以含有一种或多种作为L异构体的糖，例如L-核苷。对糖基的修饰还可以包括用硫、任选取代的氮或CH2基团取代4'-O。在一些实施方案中，C1'和核碱基之间的连接是α构型。
寡核苷酸修饰还可以包括无环核苷酸，其中不存在核糖碳之间的C-C键(例如C1'-C2'，C2'-C3'，C3'-C4'，C4'-O4'，C1'-O4')和/或核糖碳或氧至少之一(例如，C1'，C2'，C3'，C4'或O4')独立地或组合地从核苷酸中缺失。在一些实施方案中，无环核苷酸是其中B是修饰或未修饰的核碱基，R1和R2独立地是H、卤素、OR3或烷基；并且R3是H，烷基，环烷基，芳基，芳烷基，杂芳基或糖基)。
优选的糖修饰是2'-O-Me(2'-O-甲基)，2'-O-MOE(2'-O-甲氧基乙基)，2'-F,2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2'-O-NMA)，2'-S-甲基,2'-O-CH2-(4'-C)(LNA)，2'-O-CH2CH2-(4'-C)(ENA)，2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)，2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)，2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)和2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)。
应当理解，当特定核苷酸通过其2'-位连接到下一个核苷酸时，本文所述的糖基修饰可以位于该特定核苷酸的糖基的3'-位，例如，该核苷酸通过其2'位置连接。在3'位的修饰可以存在于木糖构型中。术语“木糖构型”是指与以与3'-OH在木糖中相同的构型将取代基置于核糖的C3'上。
与C4'和/或C1'连接的氢可以被直链或支链的任选取代的烷基，任选取代的烯基，任选取代的炔基替代，其中烷基、烯基和炔基的主链可含有以下中的一个或多个：O、S、S(O)、SO2、N(R’)、C(O)、N(R’)C(O)O、OC(O)N(R’)、CH(R’)、含磷键、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环或任选取代的环烷基，其中R'是氢、卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、环基或杂环基，其各自可被任选取代。在一些实施方案中，与5'末端核苷酸的C4'连接的氢被替代。
在一些实施方案中，C4'和C5'一起形成任选取代的杂环，优选包含至少一个-PX(Y)-，其中X为H、OH、OM、SH、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基氨基或任选取代的二烷基氨基，其中M每次出现时独立地为总电荷为+1的碱金属(alki metal)或过渡金属；并且Y是O、S或NR'，其中R'是氢、任选取代的脂族基。优选地，该修饰在寡核苷酸的5'末端。
核碱基修饰：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶是核酸中最常见的碱基(或核碱基)。这些碱基可以被修饰或替代以提供具有改进性质的寡核苷酸。例如，核酸酶抗性寡核苷酸可以用这些碱基或合成和天然核碱基(例如，肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟苷(isoguanisine)或杀结核菌素(tubercidine))和上述修饰的任何一种来制备。或者，可以使用任何上述碱基和“通用碱基”的取代或修饰的类似物。当天然碱基被非天然和/或通用碱基替代时，该核苷酸在本文中被认为包含修饰的核碱基和/或核碱基修饰。修饰的核碱基和/或核碱基修饰还包括天然的、非天然的和通用的碱基，其包含缀合的部分，例如本文所述的配体。用于与核碱基缀合的优选缀合物部分包括阳离子氨基，其可以通过合适的烷基、烯基或具有酰胺键的连接子与核碱基缀合。
寡核苷酸还可以包括核碱基(本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟苷、杀结核菌素、2-(卤代)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2-(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2-(氨基丙基)腺嘌呤、2-(甲硫基)-N6-(异戊烯基)腺嘌呤、6-(烷基)腺嘌呤、6-(甲基)腺嘌呤、7-(脱氮)腺嘌呤、8-(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8-(炔基)腺嘌呤、8-(氨基)腺嘌呤、8-(卤代)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8-(硫代烷基)腺嘌呤、8-(硫醇基)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6-(甲基)腺嘌呤、N6,N6-(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2-(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6-(甲基)鸟嘌呤、7-(烷基)鸟嘌呤、7-(甲基)鸟嘌呤、7-(脱氮)鸟嘌呤、8-(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8-(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8-(卤代)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8-(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(硫醇基)鸟嘌呤、N-(甲基)鸟嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3-(脱氮)-5-(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3-(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5-(卤代)胞嘧啶、5-(甲基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、N4-(乙酰基)胞嘧啶、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-2,4-(二硫代)尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5-(氨基烯丙基)尿嘧啶、5-(氨基烷基)尿嘧啶、5-(胍基烷基)尿嘧啶(5-(guanidiniumalkyl)uracil)、5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤代)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-(甲氧基羰基甲基)2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(三氟甲基)尿嘧啶、6-(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3-(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2-(硫代)假尿嘧啶、4-(硫代)假尿嘧啶、2,4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-取代的假尿嘧啶、1-取代的2(硫代)-假尿嘧啶、1-取代的4-(硫代)假尿嘧啶、1-取代的2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-(氨基羰基亚乙基)-假尿嘧啶、1-(氨基碳基亚乙基)-2-(硫代)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基亚乙基)-4-(硫代)假尿嘧啶、1-(氨基羰基亚乙基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基亚乙基)假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基-羰基亚乙基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基亚乙基)-4-(硫代)假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基亚乙基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)吩噻嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(胍基烷基-羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、杀结核菌素、异鸟苷、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-氮杂-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异卡波苯乙烯基(isocarbostyrilyl)、5-(甲基)异卡波苯乙烯基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异卡波苯乙烯基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异卡波苯乙烯基、7-(丙炔基)异卡波苯乙烯基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2-(氨基)嘌呤、2,6-二(二氨基)嘌呤、5-取代嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、O6-取代的嘌呤、取代的1,2,4-三唑、吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对位取代-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻位取代-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻位取代-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基，或其任何O-烷基化或N-烷基化衍生物。或者，可以使用任何上述碱基和“通用碱基”的取代或修饰的类似物。
如本文所用，通用核碱基是可以与所有四种天然存在的核碱基碱基配对的任何修饰的核碱基，而基本上不影响熔解行为，细胞内酶的识别或寡核苷酸双链的活性。一些典型的通用核碱基包括但不限于2,4-二氟甲苯、硝基吡咯基、硝基吲哚基、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、4-氟-6-甲基苯并咪唑(methylbenzimidazle)、4-甲基苯并咪唑、3-甲基异卡波苯乙烯基、5-甲基异卡波苯乙烯基、3-甲基-7-丙炔基异卡波苯乙烯基、7-氮杂吲哚基、6-甲基-7-氮杂吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异卡波苯乙烯基、7-丙炔基异卡波苯乙烯基、丙炔基-7-氮杂吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基(methylinolyl)、4,6-二甲基吲哚基(dimethylindolyl)、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基(tetracenyl)、并五苯基(pentacenyl)及其结构衍生物(参见例如Loakes，2001，Nucleic Acids Research，29,2437-2447)。
进一步的核碱基包括美国专利No.3,687,808中公开的那些；2009年3月26日提交的国际申请PCT/US09/038425中公开的那些；Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.,编，John Wiley&Sons,1990中公开的那些；English等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613中公开的那些；Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijin,P.Ed.Wiley-VCH,2008中公开的那些；Sanghvi,Y.S.,，第15章，dsRNAResearch and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编,CRC Press,1993中公开的那些。所有上述内容通过引用并入本文。
末端修饰：寡核苷酸的体内应用可由于核酸酶在血清和/或血液中的存在而受到限制。因此，在某些情况下，优选改变寡核苷酸的3',5'或两端以使寡核苷酸对外切核酸酶具有抗性。在一些实施方案中，寡核苷酸包含3'(3'帽)、5'(5'帽)或两端的帽结构。在一些实施方案中，寡核苷酸包含3'-帽。在另一个实施方案中，寡核苷酸包含5'-帽。还在另一个实施方案中，寡核苷酸包含3'帽和5'帽。应当理解，当寡核苷酸包含3'帽和5'帽时，这样的帽可以是相同的或它们可以是不同的。
如本文所用，“帽结构”是指已经并入寡核苷酸的任一末端的化学修饰。参见例如美国专利第5,998,203号和国际专利公开WO03/70918，其内容全部并入本文。
示例性的5'-帽包括但不限于配体，5'-5'-反向核苷酸、5'-5'反向脱碱基核苷酸残基、2'-5'连接、5'-氨基、5'-氨基-烷基磷酸酯、5'-己基磷酸酯、5'-氨基己基磷酸酯、桥键和/或非桥键的5'-氨基磷酸酯、桥键和/或非桥键的5'-硫代磷酸酯和/或5'-二硫代磷酸酯、桥键或非桥键的5'-甲基膦酸酯、端部两个核苷酸之间的非磷酸二酯糖间键、4',5'-亚甲基核苷酸、I-(β-D-赤式呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的核碱基核苷酸、二硫代磷酸酯键、苏-戊呋喃糖基(threo-pentofuranosyl)核苷酸、无环核苷酸、无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5-二羟基戊基核苷酸、5'-巯基核苷酸和5'-1,4-丁二醇磷酸酯。
3'帽的例子包括但不限于配体，3'-3'-反向核苷酸、3'-3'反向脱碱基核苷酸残基、3'-2'-反向核苷酸部分、3'-2'-反向脱碱基部分、2'-5'连接、3'-氨基、3'-氨基-烷基磷酸酯、3'-己基磷酸酯、3'-氨基己基磷酸酯、桥键和/或非桥键的3'-氨基磷酸酯、桥键和/或非桥键的3'-硫代磷酸酯和/或3'-二硫代磷酸酯、桥键或非桥键的3'-甲基膦酸酯、端部两个核苷酸之间的非磷酸二酯糖间键、I-(β-D-赤式呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的核碱基核苷酸、二硫代磷酸酯键、苏-戊呋喃糖基核苷酸、无环核苷酸、无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5-二羟基戊基核苷酸和3'-1,4-丁二醇磷酸酯。更多细节参见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49,1925，其通过引用并入本文。
适用于本发明的其他3'和/或5'帽描述于2009年7月7日提交的美国临时申请No.61/223,665中，其内容通过引用整体并入本文。
寡核苷酸的3'端和/或5'端也可以与其他功能分子实体缀合，例如标记部分，例如荧光团(如芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)或保护基团(基于例如硫、硅、硼或酯)。功能分子实体可以通过磷酸基团和/或连接子连接到糖基上。连接子的末端原子可连接至或替代磷酸基团的连接原子或糖基的C-3'或C-5'O、N、S或C基团。或者，连接子可连接至或替代核苷酸替代物(例如PNA)的末端原子。
用于调节活性的末端修饰包括用磷酸或磷酸类似物修饰5'末端。例如，在一些实施方案中，寡核苷酸的5'端可被磷酸化或在5'末端包括磷酰基类似物。5'-磷酸修饰可以包括与RISC介导的基因沉默相容的修饰。5'-末端的修饰也可用于刺激或抑制受试者的免疫系统。在一些实施方案中，寡核苷酸的5'端包含修饰其中W、X和Y各自独立地选自O、OR(R为氢、烷基、芳基)、S、Se、BR3(R为氢、烷基、芳基)、BH3 -、C(即烷基、芳基等)、H、NR2(R为氢、烷基、芳基)或OR(R为氢、烷基或芳基)；A和Z在每次出现时各自独立地为不存在、O、S、CH2、NR(R为氢、烷基、芳基)或任选取代的亚烷基、其中亚烷基的主链可在内部和/或末端包含O、S、SS和NR(R是氢、烷基、芳基)；并且n为0-2。在一些实施方案中，n为1或2。应当理解，A替代连接至糖基的5'碳的氧。
在一些实施方案中，5'-末端核苷酸的C5'上的一个或两个氢可被卤素例如F替代。
示例性的5'-修饰包括但不限于5'-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5')；5'-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-三单磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-硫代单磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5')；5'-二硫代单磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5')，5'-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5')；5'-α-硫代三磷酸酯；5'-β-硫代三磷酸酯；5'-γ-硫代三磷酸酯；5'-氨基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5'、(HO)(NH2)(O)P-O-5')。其它5'-修饰包括5'-烷基膦酸酯(R(OH)(O)PO-5'，R＝烷基、例如甲基、乙基、异丙基、丙基等)、5'-烷基醚膦酸酯(R(OH)(O)PO-5'、R＝烷基醚、例如甲氧基甲基(CH2OMe)、乙氧基甲基等)。其他示例性的5'-修饰包括其中Z是至少一次任选取代的烷基，例如((HO)2(X)P-O[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5',((HO)2(X)P-O[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5',((HO)2(X)P-[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'；二烷基末端磷酸酯和磷酸酯模拟物：HO[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5',H2N[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5',H[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5',Me2N[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5',HO[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5',H2N[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5',H[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5',Me2N[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'，其中a和b各自独立地为1-10。其他实施方案包括氧和/或硫被BH3、BH3 -和/或Se替代。
末端修饰也可用于监测分布，并且在这种情况下，待添加的优选基团包括荧光团，例如荧光素或Alexa染料，例如Alexa 488。末端修饰也可用于增强摄取，对此有用的修饰包括靶向配体。末端修饰也可用于将寡核苷酸交联至另一部分；对此有用的修饰包括丝裂霉素C、补骨脂素及其衍生物。
配体：各种各样的实体，例如配体可以与本文所述的寡核苷酸偶联。配体可以包括天然存在的分子，或重组或合成分子。示例性配体包括但不限于聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG，例如PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、聚磷嗪(polyphosphazine)、聚乙烯亚胺、阳离子基团、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、拟肽多胺、树状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐、促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白、糖基化聚氨基酸、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、适配体、去唾液酸糖蛋白、透明质酸、前胶原、免疫球蛋白(例如抗体)、胰岛素、转铁蛋白、白蛋白、糖-白蛋白缀合物、插入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(例如TPPC4、德克萨卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切核酸酶(例如EDTA)、亲脂性分子(例如类固醇、胆汁酸、胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽(例如α螺旋肽、两亲性肽、RGD肽、细胞渗透肽、内分解/融合肽)、烷化剂、磷酸酯基、氨基、巯基、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如萘普生、阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+配合物)、二硝基苯基、HRP、AP、抗体、激素和激素受体、凝集素、碳水化合物、多价碳水化合物、维生素(如维生素A、维生素E、维生素K、维生素B，例如叶酸、B12、核黄素、生物素和吡哆醛)、维生素辅因子、脂多糖、p38MAP激酶的激活剂、NF-κB的激活剂、泰克松(taxon)、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、jasplakinolide、红海海绵蛋白(latrunculin)A、鬼笔环肽、swinholideA、茚满酮(indanocine)、myoservin、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-1β、γ干扰素、天然或重组低密度脂蛋白(LDL)、天然或重组高密度脂蛋白(HDL)和细胞渗透剂(例如，螺旋细胞渗透剂)。
肽和肽模拟物配体包括具有天然存在或修饰的肽的那些，例如D或L肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽；一个或多个酰胺(即肽)键被一个或多个脲、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰脲键替代的肽；或环肽。肽模拟物(本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽类似的限定的三维结构的分子。肽或肽模拟配体可以是约5-50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
示例性的两亲性肽包括但不限于：天蚕素(cecropin)、lycotoxin、paradaxin、buforin、CPF、铃蟾抗菌样肽(BLP)、导管素(cathelicidin)、ceratotoxins、S.clava肽、盲鳗肠道抗菌肽(HFIAP)、爪蟾抗菌肽(magainine)、brevinin-2、dermaseptin、蜂毒素、pleurocidin、H2A肽、非洲爪蟾肽、esculentinis-1和caerin。
如本文所用，术语“内体溶解性(endosomolytic)配体”是指具有内体溶解性的分子。内体溶解性配体促进本发明组合物或其组分从细胞内的隔室如核内体、溶酶体、内质网(ER)、高尔基体、微管、过氧化物酶体或其他囊泡体溶解和/或转运到细胞的细胞质。一些示例性的内体溶解性配体包括但不限于咪唑、聚或低聚咪唑、直链或支链聚乙烯亚胺(PEI)、直链和支链多胺例如精胺、阳离子直链和支链多胺、聚羧酸盐、聚阳离子、掩蔽的寡聚或多聚阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚缩酮、原酸酯、具有掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的直链或支链聚合物、具有掩蔽或未掩蔽阳离子或阴离子电荷的树枝状聚合物、聚阴离子肽、聚阴离子肽模拟物、pH敏感肽、天然和合成的融合脂质、天然和合成的阳离子脂质。
示例性的内体溶解性/融合肽包括但不限于，
SEQ ID NO:16,AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC(GALA)；
SEQ ID NO:17,AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC(EALA)；
SEQ ID NO:18,ALEALAEALEALAEA；
SEQ ID NO:19,GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG(INF-7)；
SEQ ID NO:20,GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG(Inf HA-2)；
SEQ ID NO:21,GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGCGLFEAIEGFIENGWEGMID GWYGC(diINF-7)；
SEQ ID NO:22,GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGCGLFEAIEGFIENGWEGMIDGGC(diINF-3)；
SEQ ID NO:23,GLFGALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAGGSC(GLF)；
SEQ ID NO:24,GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAAGGSC(GALA-INF3)；
SEQ ID NO:25,GLF EAI EGFI ENGW EGnI DG K GLF EAI EGFI ENGW EGnI DG(INF-5,n为正亮氨酸)；
SEQ ID NO:26,LFEALLELLESLWELLLEA(JTS-1)；
SEQ ID NO:27,GLFKALLKLLKSLWKLLLKA(ppTG1)；
SEQ ID NO:28,GLFRALLRLLRSLWRLLLRA(ppTG20)；
SEQ ID NO:29,WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(KALA)；
SEQ ID NO:30,GLFFEAIAEFIEGGWEGLIEGC(HA)；
SEQ ID NO:31,GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(蜂毒肽)；
SEQ ID NO:32,H5WYG；和
SEQ ID NO:33,CHK6HC.
不希望受理论束缚，融合脂质与膜融合并因此使膜不稳定。融合脂质通常具有小头基团和不饱和酰基链。示例性融合脂质包括但不限于1,2-二油酰-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，磷脂酰乙醇胺(POPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇(Di-Lin)，N-甲基(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲胺(DLIN-k-DMA)和N-甲基-2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环-4-基)乙胺。
适用于本发明的具有内体溶解活性的合成聚合物描述于美国专利申请公开号2009/0048410；2009/0023890；2008/0287630；2008/0287628；2008/0281044；2008/0281041；2008/0269450；2007/0105804；2007/0036865；和2004/0198687，其内容通过引用整体并入本文。
示例性细胞渗透肽包括但不限于，
SEQ ID NO:34,RQIKIWFQNRRMKWKK(penetratin)；
SEQ ID NO:35,GRKKRRQRRRPPQC(Tat片段48-60)；
SEQ ID NO:36,GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV(基于信号序列的肽)；
SEQ ID NO:37,LLIILRRRIRKQAHAHSK(PVEC)；
SEQ ID NO:38,GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(transportan)；
SEQ ID NO:39,KLALKLALKALKAALKLA(两亲性模型肽)；
SEQ ID NO:40,RRRRRRRRR(Arg9)；
SEQ ID NO:41,KFFKFFKFFK(细菌细胞壁渗透肽)；
SEQ ID NO:42,LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(LL-37)；
SEQ ID NO:43,SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR(天蚕素P1)；
SEQ ID NO:44,ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(α-防御素)
SEQ ID NO:45,DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK(β-防御素)；
SEQ ID NO:46,RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFPGKR-NH2(PR-39)；
SEQ ID NO:47,ILPWKWPWWPWRR-NH2(indolicidin)；
SEQ ID NO:48,AAVALLPAVLLALLAP(RFGF)；
SEQ ID NO:49,AALLPVLLAAP(RFGF类似物)；和
SEQ ID NO:50,RKCRIVVIRVCR(bactenecin).
示例性的阳离子基团包括但不限于衍生自例如O-AMINE(AMINE＝NH2；烷基氨基，二烷基氨基，杂环基，芳基氨基，二芳基氨基，杂芳基氨基或二杂芳基氨基，乙二胺，聚氨基)的质子化氨基；氨基烷氧基，例如O(CH2)nAMINE，(例如AMINE＝NH2；烷基氨基，二烷基氨基，杂环基，芳基氨基，二芳基氨基，杂芳基氨基或二杂芳基氨基，乙二胺，聚氨基)；氨基(例如NH2；烷基氨基，二烷基氨基，杂环基，芳基氨基，二芳基氨基，杂芳基氨基，二杂芳基氨基或氨基酸)；和NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-胺(AMINE＝NH2；烷基氨基，二烷基氨基，杂环基，芳基氨基，二芳基氨基，杂芳基氨基或二杂芳基氨基)。
如本文所用，术语“靶向配体”是指为所选择的靶标，例如细胞，细胞类型，组织，器官，身体区域或隔室(例如细胞、组织或器官隔室)提供增强的亲和力的任何分子。一些示例性靶向配体包括但不限于抗体，抗原，叶酸，受体配体，碳水化合物，适配体，整联蛋白受体配体，趋化因子受体配体，转铁蛋白，生物素，5-羟色胺受体配体，PSMA，内皮素，GCPII，生长抑素，LDL和HDL配体。
基于碳水化合物的靶向配体包括但不限于D-半乳糖，多价半乳糖，N-乙酰基-D-半乳糖(GalNAc)，多价GalNAc，例如GalNAc2和GalNAc3；D-甘露糖，多价甘露糖，多价乳糖，N-乙酰基-半乳糖胺，N-乙酰基-葡糖胺，多价岩藻糖，糖基化聚氨基酸和凝集素。术语多价表示存在多于一个单糖单元。此类单糖亚单元可以通过糖苷键彼此连接或连接到支架分子上。
适用于本发明的许多叶酸和叶酸类似物作为配体记载在美国专利2,816,110；51410,104；5,552545；6,335,434和7,128,893，其内容通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“PK调节配体”和“PK调节剂”是指可以调节寡核苷酸的药代动力学的分子。一些示例性的PK调节剂包括但不限于亲脂性分子，胆汁酸，甾醇，磷脂类似物，肽，蛋白质结合剂，维生素，脂肪酸，吩噁嗪，阿司匹林，萘普生，布洛芬，舒洛芬，酮洛芬，(S)-(+)-普拉洛芬，卡洛芬，PEG，生物素和转甲状腺素蛋白结合配体(例如四碘甲腺乙酸，2,4,6-三碘苯酚和氟芬那酸)。还已知包含许多硫代磷酸酯糖间键的寡核苷酸与血清蛋白结合，因此短链寡核苷酸如包含约5至30个核苷酸(例如5至25个核苷酸，优选5至20个核苷酸，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)且在骨架中包含多个硫代磷酸酯键的寡核苷酸也可作为配体(例如作为PK调节配体)适用于本发明。PK调节寡核苷酸可以包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，PK调节寡核苷酸中的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯键。此外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适配体也可作为PK调节配体适用于本发明。与血清组分(例如血清蛋白)的结合可以由白蛋白结合测定法来预测，例如Oravcova等人，Journal of Chromatography B(1996),677:1-27中所述的那些。
当存在两个或多个配体时，配体可以所有都具有相同的性质，所有都具有不同的性质，或者一些配体具有相同的性质而另一些具有不同的性质。例如，配体可以具有靶向性，具有内体溶解活性或具有PK调节性。在优选的实施方案中，所有配体具有不同的性质。
配体可以在各个位置如3'端、5'端和/或内部位置与寡核苷酸偶联。当存在两个或多个配体时，配体可以在寡核苷酸的相对端。在优选的实施方案中，配体通过介于中间的系锁(tether)/连接子与寡核苷酸连接。当将单体掺入生长链时，配体或系锁配体(tetheredligand)可以存在于所述单体上。在一些实施方案中，在“前体”单体已经掺入生长链中之后，配体可以通过偶联掺入所述“前体”单体。例如，具有例如氨基封端的系锁(即，不具有相关配体)的单体，例如单体-连接子-NH2可以掺入生长的寡核苷酸链中。在随后的操作中，即在将前体单体掺入到链中之后，具有亲电子基团如五氟苯酯或醛基的配体可以随后通过将配体的亲电子基团与前体单体的系锁的末端亲核基团偶联来连接到前体单体。
在另一个实例中，可以掺入具有适合参与点击化学(Click Chemistry)反应的化学基团的单体，例如叠氮化物或炔终止的系锁/连接子。在随后的操作中，即在将前体单体掺入链中之后，具有互补的化学基团如炔或叠氮化物的配体，可以通过将炔和叠氮化物偶联在一起而连接到前体单体上。
对于双链寡核苷酸，配体可以连接到一条或两条链上。
在一些实施方案中，配体可以缀合至核酸分子的核碱基、糖基部分或核苷间键。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可以在包括内环和外环原子的任何位置发生。在一些实施方案中，嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位连接至缀合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合也可以发生在任何位置。在一些实施方案中，嘧啶核碱基的2-、5-和6-位可以被缀合物部分取代。当配体与核碱基缀合时，优选的位置是不干扰杂交、即不干扰碱基配对所需的氢键相互作用的位置。
与核苷的糖基部分的缀合可以发生在任何碳原子处。可以连接到缀合物部分的糖基部分的实例碳原子包括2'、3'和5'碳原子。1'位也可以连接到缀合物部分，例如在脱碱基残基中。核苷间键也可以带有缀合物部分。对于含磷键(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和氨基磷酸酯等)，缀合物部分可以直接连接到磷原子或与磷原子结合的O、N或S原子。对于含胺或酰胺的核苷间键(例如PNA)，缀合物部分可以连接到胺或酰胺的氮原子或相邻的碳原子。
制备低聚化合物的缀合物有许多方法。通常，低聚化合物通过使低聚化合物上的反应性基团(例如OH、SH、胺、羧基和醛等)与缀合物部分上的反应性基团接触而连接到缀合物部分。在一些实施方案中，一个反应性基团是亲电子的，另一个是亲核的。
例如，亲电子基团可以是含羰基的官能团，亲核基团可以是胺或硫醇。用和不用连接基团缀合核酸和相关寡聚化合物的方法在文献中有很好的描述，例如Manoharan的Antisense Research and Applications,Crooke和LeBleu编,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993，第17章，其通过引用整体并入本文。
教导寡核苷酸缀合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,149,782；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,672,662；5,688,941；5,714,166；6,153,737；6,172,208；6,300,319；6,335,434；6,335,437；6,395,437；6,444,806；6,486,308；6,525,031；6,528,631；6,559,279；所有这些专利的全部内容通过引用并入本文。
配体载体：在一些实施方案中，配体例如内体溶解性配体、靶向配体或其他配体与单体连接，然后其在化学合成期间掺入生长的寡核苷酸链中。这些单体在本文中也称为载体单体。载体单体是环状基团或无环基团；优选地，环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]-二氧杂环戊烷、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘；优选地，无环基团选自丝氨醇主链或二乙醇胺主链。在一些实施方案中，环状载体单体基于吡咯烷基，例如4-羟基脯氨酸或其衍生物。
适用于本发明的示例性配体和配体缀合的单体描述于美国专利申请：2004年8月10日提交的10/916,185；2004年9月21日提交的10/946,873；2004年11月9日提交的10/985,426；2007年8月3日提交的10/833,934；2005年4月27日提交的11/115,989；2005年4月29日提交的11/119,533；2005年8月4日提交的11/197,753；2007年11月21日提交的11/944,227；2008年12月4日提交的12/328,528；和2008年12月4日提交的12/328,537的内容，通过引用将其全部内容并入本文用于所有目的。适用于本发明的配体和配体缀合的单体也描述于国际申请：2004年1月21日提交的PCT/US04/001461；2004年4月5日提交的PCT/US04/010586；2005年4月9日提交的PCT/US04/011255；2005年4月27日提交的PCT/US05/014472；2005年4月29日提交的PCT/US05/015305；2005年8月4日提交的PCT/US05/027722；2008年4月23日提交的PCT/US08/061289；2008年7月30日提交的PCT/US08/071576；2008年12月4日提交的PCT/US08/085574和2009年4月10日提交的PCT/US09/40274的内容，通过引用将其全部内容并入本文用于所有目的。
连接子：在一些实施方案中，寡核苷酸和其它组分(例如，配体或携带配体的单体)之间的共价键可以由连接子介导。该连接子可以是可裂解的连接子或不可裂解的连接子，这取决于应用。如本文所用，“可裂解的连接子”是指能够在各种条件下裂解的连接子。适于裂解的条件可包括但不限于pH、UV照射、酶活性、温度、水解、消除和取代反应、氧化还原反应和连接的热力学性质。在一些实施方案中，可裂解的连接子可以在运输至所需靶标之后用于释放寡核苷酸。缀合或偶联相互作用的预期性质或所需的生物学效应将决定连接子基团的选择。
如本文所用，术语“连接子”是指连接化合物的两个部分的有机部分。连接子通常包括直接键，或原子如氧或硫，单元如NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链，例如取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R1)2、C(O)、可裂解连接基团、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基中断或终止；其中R1是氢、酰基、脂族或取代的脂族。
在一些实施方案中，连接子是支链连接子。支链连接子的分支点可以是至少三价的、但可以是四价、五价或六价原子，或呈现这种多化合价的基团。在一些实施方案中，分支点是-N、-N(Q)-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-C(O)N(Q)-C、-OC(O)N(Q)-C、-N(Q)C(O)-C或-N(Q)C(O)O-C；其中Q每次出现时独立地为H或任选取代的烷基。在一些实施方案中，分支点是甘油或其衍生物。
可裂解的连接基团：可裂解的连接基团是在细胞外足够稳定但是在进入靶细胞时被裂解以释放由连接子保持在一起的两个部分的连接基团。在优选的实施方案中，可裂解连接基团在靶细胞中或在第一参考条件(其可例如被选择为模拟或表示细胞内条件)下裂解的速率比在受试者的血液或血清中，或在第二参考条件(其可例如被选择为模拟或表示在血液或血清中的条件)下快至少10倍或更多，优选至少100倍。
可裂解的连接基团对裂解剂(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)敏感。通常，裂解剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或水平或活性更高。这种降解剂的实例包括：选择用于特定底物或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化酶或还原酶或还原剂例如硫醇，其可以通过还原作用降解可由氧化还原裂解的连接基团；酯酶；酰胺酶；核内体或可产生酸性环境的试剂，例如导致pH值为5以下的那些；可通过充当一般的酸来水解或降解酸可裂解的连接基团的酶，肽酶(可以是底物特异性的)和蛋白酶以及磷酸酶。
连接子可以包括可被特定酶裂解的可裂解的连接基团。掺入连接子中的可裂解的连接基团的类型可以取决于待靶向的细胞。例如，靶向肝的配体可以通过包含酯基的连接子与阳离子脂质连接。肝细胞富含酯酶，因此连接子在肝细胞中比在不富含酯酶的细胞类型中更加有效地裂解。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型如肝细胞和滑膜细胞时，可以使用含有肽键的连接子。
在一些实施方案中，可裂解的连接基团在细胞中(或在选择成模拟细胞内条件的体外条件下)的裂解比在血液或血清(或在选择成模拟细胞外条件的体外条件下)中快至少1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、10、25、50或100倍。在一些实施方案中，可裂解的连接基团在血液(或选择成模拟细胞外条件的体外条件)中的裂解比在细胞(或在选择成模拟细胞内条件的体外条件下)中少90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％。
示例性可裂解的连接基团包括但不限于氧化还原可裂解的连接基团(例如，-S-S-和-C(R)2-S-S-，其中R是H或C1-C6烷基，并且至少一个R是C1-C6烷基，如CH3或CH2CH3)；基于磷酸酯的可裂解的连接基团(例如-O-P(O)(OR)-O-、-O-P(S)(OR)-O-、-O-P(S)(SR)-O-、-S-P(O)(OR)-O-、-O-P(O)(OR)-S-、-S-P(O)(OR)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(OR)-O-、-O-P(O)(R)-O-、-O-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-O-、-S-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-S-、-O-P(S)(R)-S-、.-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-和-O-P(S)(H)-S-，其中R为任选取代的直链或支链C1-C10烷基)；酸可裂解的连接基团(例如腙、酯和氨基酸的酯，-C＝NN-和-OC(O)-)；基于酯的可裂解的连接基团(例如-C(O)O-)；基于肽的可裂解的连接基团(例如，由细胞中的酶如肽酶和蛋白酶裂解的连接基团，例如-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团)。基于肽的可裂解的连接基团包含两个以上的氨基酸。在一些实施方案中，基于肽的可裂解键包含作为细胞中发现的肽酶或蛋白酶的底物的氨基酸序列。
在一些实施方案中，酸可裂解的连接基团可在pH为约6.5以下(例如约6.5、6.0、5.5、5.0，或更低)的酸性环境中裂解，或通过可以作为广义酸的试剂如酶裂解。
一般参考文献：寡核苷酸修饰的一般参考文献如下。在一些实施方案中，抑制SH2B3的RNAi试剂和根据本发明使用的寡核苷酸可以用固相合成来合成，参见例如“Oligonucleotide synthesis,a practical approach”,编辑M.J.Gait,IRL Press,1984；“Oligonucleotides and Analogues,A Practical Approach”,编辑F.Eckstein,IRLPress,1991(特别是第1章,Modern machine-aided methods ofoligodeoxyribonucleotide synthesis，第2章，Oligoribonucleotide synthesis，第3章，2'-O-Methyloligoribonucleotides:synthesis and applications，第4章，Phosphorothioate oligonucleotides，第5章，Synthesis of oligonucleotidephosphorodithioates，第6章，Synthesis of oligo-2'-deoxyribonucleosidemethylphosphonates，和第7章，Oligodeoxynucleotides containing modified bases)。其他特别有用的合成方法、试剂、阻断基团和反应条件描述于Martin,P.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Beaucage,S.L.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,1992,48,2223-2311；和Beaucage,S.L.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,1993,49,6123-6194，或其中所参考的参考文献。WO 00/44895、WO01/75164或WO02/44321中描述的修饰可以用于本文。本文列出的所有出版物、专利和公开的专利申请的公开内容通过引用并入。
磷酸基团修饰的参考文献：亚膦酸酯寡核苷酸的制备描述于美国专利5,508,270。烷基膦酸酯寡核苷酸的制备描述于美国专利4,469,863。亚磷酰胺寡核苷酸的制备描述于美国专利5,256,775或美国专利5,366,878。磷酸三酯寡核苷酸的制备描述于美国专利5,023,243。硼烷磷酸酯寡核苷酸的制备描述于美国专利5,130,302和5,177,198。3'-脱氧-3'-氨基氨基磷酸酯寡核苷酸的制备描述于美国专利5,476,925。3'-脱氧-3'-亚甲基膦酸酯寡核苷酸描述于An,H等人，J.Org.Chem.2001,66,2789-2801。硫桥键核苷酸的制备描述于Sproat等人，Nucleosides Nucleotides 1988,7,651和Crosstick等人，TetrahedronLett.1989,30,4693。
磷酸基团替代的参考文献：亚甲基甲基亚氨基连接的寡核苷，本文中也称为MMI连接的寡核苷；亚甲基二甲基肼连接的寡核苷，本文中也称为MDH连接的寡核苷，和亚甲基羰基氨基连接的寡核苷，也称为酰胺-3-连接的寡核苷，和亚甲基氨基羰基连接的寡核苷在本文中也被称为酰胺-4连接的寡核苷，以及具有例如交替的MMI和PO或PS键的混合的糖间连接的化合物可以如美国专利5,378,825、5,386,023、5,489,677和国际申请PCT/US92/04294和PCT/US92/04305(分别公开为WO 92/20822和WO92/20823)中记载的制备。甲缩醛和硫代甲缩醛连接的寡核苷酸可以如美国专利5,264,562和5,264,564中记载的制备。环氧乙烷连接的寡核苷酸可以如美国专利5,223,618中记载的制备。硅氧烷替代物记载于Cormier,J.F.等人，Nucleic Acids Res.1988,16,4583。碳酸酯替代物记载于Tittensor,J.R.J.Chem.Soc.C 1971,1933。羧甲基替代物记载于Edge,M.D.等人，J.Chem.Soc.PerkinTrans.1 1972,1991。氨基甲酸酯替代物记载于Stirchak,E.P.Nucleic Acids Res.1989,17,6129。
磷酸-核糖骨架的替代的参考文献：环丁基糖基替代化合物可以如美国专利5,359,044中记载的制备。吡咯烷糖基替代物可以如美国专利5,519,134中记载的制备。吗啉代糖基替代物可以如美国专利5,142,047和5,235,033以及其他相关专利的公开内容中记载的制备。肽核酸(PNA)本身是已知的，并且可以根据Peptide Nucleic Acids(PNA):Synthesis,Properties and Potential Applications,Bioorganic&MedicinalChemistry,1996,4,5-23中提及的多种方法的任一种制备。它们也可以根据美国专利5,539,083来制备。
糖基修饰的参考文献：针对2'修饰的修饰可见于Verma,S.等人，Annu.Rev.Biochem.1998,67,99-134和其中所有参考文献。具体的对核糖的修饰可见于下列文献：2'-fluoro(Kawasaki等人，J.Med.Chem.,1993,36,831-841)，2'-MOE(Martin,P.Helv.Chim.Acta 1996,79,1930-1938)，“LNA”(Wengel,J.Acc.Chem.Res.1999,32,301-310)。
核碱基修饰的参考文献：教导制备某些上述修饰的核碱基以及其它修饰的核碱基的代表性的美国专利包括但不限于上述美国专利3,687,808，以及美国专利4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,457,191；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，其各自的全部内容通过引用并入本文。
末端修饰的参考文献：末端修饰记载于Manoharan,M.等人，Antisense andNucleic Acid Drug Development 12,103-128(2002)及其中的参考文献。
修饰在寡核苷酸内的放置(例如，放置在抑制SH2B3的RNAi试剂内)
作为寡核苷酸，例如抑制SH2B3的RNAi试剂可以是亚单位或单体的聚合物，本文所述的许多修饰可以发生在寡核苷酸内重复的位置，例如核碱基、糖基、磷酸部分或磷酸部分的非桥键氧的修饰。不需要对给定的寡核苷酸中的所有位置进行均匀地修饰，实际上可以将多于一种的上述修饰掺入单个寡核苷酸中，或甚至掺入寡核苷酸内的单个核苷处。
在某些情况下，修饰将发生在寡核苷酸中的所有受试位置(subject position)，但在许多情况下，实际上在大多数情况下不会发生。作为实例，修饰可以在3'或5'末端位置发生，可发生在内部区域中，可发生在3'、5'或两个末端区域，例如，位于寡核苷酸的末端核苷酸或最后2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的位置。在一些实施方案中，末端核苷酸不包含修饰。
在一些实施方案中，寡核苷酸的至少一个末端的末端核苷酸或最后2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸都包括至少一个修饰。在一些实施方案中，修饰是相同的。在一些实施方案中，寡核苷酸两端的末端核苷酸或最后2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸都包含至少一个修饰。应当理解，寡核苷酸一端的修饰类型和修饰核苷酸的数目不依赖于寡核苷酸另一端的修饰类型和修饰核苷酸的数目。
当寡核苷酸是双链或部分双链时，修饰可以在双链区域、单链区域或双链和单链区域中发生。在一些实施方案中，本文所述的修饰不发生在与靶裂解位点区域对应的区域中。例如，在非桥键氧位置的硫代磷酸酯修饰可以发生在一个或两个末端，可以发生在末端区域中，例如在链的末端核苷酸或最后2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的位置，或可以发生在双链和单链区域，特别是在末端。
一些修饰可以优选地包含在特定位置的寡核苷酸上，例如在链的内部位置，或寡核苷酸的5'或3'端上。对寡核苷酸进行修饰的优选位置可以赋予寡核苷酸优选的性质。例如，特定修饰的优选位置可以赋予对内切核酸酶或外切核酸酶活性增加的抗性。
抑制SH2B3及其模拟物的RNAi试剂的制备。
在一些实施方案中，如本文所述的抑制SH2B3的RNAi试剂可以使用溶液相或固相有机合成或通过本领域已知的方法酶促制备。有机合成提供了可以容易地制备包含非天然或修饰的核苷酸的寡核苷酸链的优点。用于本领域已知的这种合成的任何其它方法可以额外地或替代地使用。还已知使用类似的技术制备其它寡核苷酸，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和烷基化衍生物。本发明的双链寡核苷酸化合物可以使用两步法制备。首先，分别制备双链分子的单个链。然后，将组成链退火。
微小RNA也参与宿主中病原体的调节。例如，参见Jopling,C.L.等人，Science(2005)vol.309,pp 1577-1581。
不管合成方法如何，寡核苷酸可以在适于配制的溶液(例如，水溶液和/或有机溶液)中制备。例如，可以将寡核苷酸制剂沉淀并重溶在纯的双蒸水中，并冻干。然后将干燥的寡核苷酸重悬在适合于预期配制方法的溶液中。
关于特定修饰的寡核苷酸的合成的教导可见于以下美国专利或未决的专利申请：美国专利5,138,045和5,218,105，涉及多胺缀合的寡核苷酸；美国专利5,212,295，涉及制备具有手性磷键的寡核苷酸的单体；美国专利5,378,825和5,541,307，涉及具有修饰骨架的寡核苷酸；美国专利5,386,023，涉及骨架修饰的寡核苷酸及其通过还原偶联的制备；美国专利5,457,191，涉及基于3-脱氮嘌呤环体系的修饰的核碱基及其合成方法；美国专利5,459,255，涉及基于N-2取代嘌呤的修饰的核碱基；美国专利5,521,302，涉及制备具有手性磷键的寡核苷酸的方法；美国专利5,539,082，涉及肽核酸；美国专利5,554,746，涉及具有β-内酰胺骨架的寡核苷酸；美国专利5,571,902，涉及合成寡核苷酸的方法和材料；美国专利5,578,718，涉及具有烷硫基的核苷，其中这些基团可以用作与核苷的多种位置中任意位置连接的其它部分的连接子；美国专利5,587,361和5,599,797，涉及具有高手性纯度的硫代磷酸酯键的寡核苷酸；美国专利5,506,351，涉及制备2'-O-烷基鸟苷和相关化合物(包括2,6-二氨基嘌呤化合物)的方法；美国专利5,587,469，涉及具有N-2取代嘌呤的寡核苷酸；美国专利5,587,470，涉及具有3-脱氮嘌呤的寡核苷酸；美国专利5,223,168和5,608,046，均涉及缀合的4'-脱甲基核苷类似物；美国专利5,602,240和5,610,289，涉及骨架修饰的寡核苷酸类似物；和美国专利6,262,241和5,459,255，尤其涉及合成2'-氟-寡核苷酸的方法。
此外，在一些实施方案中，可以通过本领域普通技术人员公知的各种技术在体外重组产生或合成抑制SH2B3的RNAi试剂。
抑制SH2B3的RNAi试剂可以通过制备其重组版本(即，通过使用基因工程技术来产生重组核酸，然后其可以通过本领域普通技术人员公知的技术分离或纯化)来获得。该方法包括在合适的培养基中生长宿主细胞的培养物，并从细胞或细胞生长的培养物中纯化抑制SH2B3的RNAi试剂。例如，所述方法包括制备抑制SH2B3的RNAi试剂的方法，其中，含有合适的包含编码抑制SH2B3的RNAi试剂的核酸的表达载体的宿主细胞在允许编码的RNAi试剂表达的条件下培养。RNAi可以从培养物、从培养基或从由宿主细胞制备的裂解液中回收，并进一步纯化。宿主细胞可以是高等真核宿主细胞，例如哺乳动物细胞，低等真核宿主细胞如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞。将含有编码RNAi试剂的核酸的载体引入宿主细胞可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔来进行(Davis,L.等人，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。这类方法是可用的，例如，其中RNAi试剂是miRNA等。
任何宿主/载体系统可用于表达一种或多种抑制SH2B3的RNAi试剂。这些包括但不限于真核宿主如HeLa细胞和酵母，以及原核宿主如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。抑制SH2B3的RNAi试剂，例如抑制SH2B3的miRNA受适当启动子的控制。用于原核和真核宿主的合适的克隆和表达载体由Sambrook等人在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989)中描述。在优选的实施方案中，抑制SH2B3的RNAi试剂如miRNA在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达系统的实例包括C127、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肾293细胞、人表皮A43 1细胞、人Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、其他转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、源自原代组织的体外培养的细胞株、原代外植体、HeLa细胞、小鼠L细胞、BILK、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。
哺乳动物表达载体将包含复制起点、合适的启动子、聚腺苷酸化位点、转录终止序列和5'侧翼非转录序列。衍生自SV40病毒基因组的DNA序列，例如，SV40源、早期启动子、增强子、剪接子和聚腺苷酸化位点可用于提供所需的非转录遗传元件。潜在合适的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevsiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，禾谷镰孢菌属(Klayveromyces)菌株，假丝酵母属(Candida)或能够表达抑制SH2B3的RNAi试剂例如miRNA的任何酵母菌株。潜在合适的细菌菌株包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或能够表达抑制SH2B3的RNAi试剂如miRNA的任何细菌菌株。
在另一种方法中，分离编码抑制SH2B3的RNAi试剂如miRNA的基因组DNA，该基因组DNA在哺乳动物表达系统中表达，并且根据需要将RNA进行纯化和修饰用于向患者施用。在一些实施方案中，抑制SH2B3的RNAi试剂(其为miRNA)是前miRNA的形式，其可以根据需要进行修饰(即为了增加稳定性或细胞摄取)。
了解抑制SH2B3的RNAi试剂(例如shRNA或miRNA)的DNA序列允许修饰细胞以允许或增加内源miRNA的表达。细胞可以(例如，通过同源重组)进行修饰以通过用异源启动子的全部或部分整体或部分地替代天然存在的启动子来提供增加的miRNA表达，使得细胞以高水平表达抑制SH2B3的RNAi试剂如miRNA。插入异源启动子，使得其可操作地连接到所需的抑制SH2B3的RNAi试剂如miRNA的编码序列。参见例如Transcaryotic Therapies,Inc.的PCT国际公开WO 94/12650，Cell Genesys,Inc.的PCT国际公开WO 92/20808和AppliedResearch Systems的PCT国际公开WO 91/09955。细胞也可工程化为在诱导型调控元件控制下表达包含抑制SH2B3的RNAi试剂的内源基因，在这种情况下内源基因的调控序列可通过同源重组替代。基因活化技术记载于Chappel的美国专利5,272,071；Sherwin等人的美国专利5,578,461；Selden等人的PCT/US92/09627(WO93/09222)和Skoultchi等人的PCT/US90/06436(WO91/06667)。抑制SH2B3的RNAi试剂可以通过在适于表达抑制SH2B3的RNAi试剂的培养条件下培养转化的宿主细胞来制备。然后所得表达的、抑制SH2B3的RNAi试剂可以使用已知的纯化方法，例如凝胶过滤和离子交换色谱，从所述培养物(即来自培养基或细胞提取物)纯化。抑制SH2B3的RNAi试剂(例如miR)的纯化还可以包括含有将结合蛋白质的试剂的亲和柱；经过诸如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、肝素-toyopearlTM或Cibacrom蓝3GASepharoseTM的亲和性树脂的一个或多个柱步骤；涉及使用诸如苯基醚、丁基醚或丙基醚等树脂进行疏水作用色谱的一个或多个步骤；免疫亲和色谱或互补cDNA亲和色谱。
抑制SH2B3的RNAi试剂也可表达为转基因动物的产物，所述转基因动物的特征在于体细胞或生殖细胞含有编码抑制SH2B3的RNAi试剂的核苷酸序列。包含编码抑制SH2B3的RNAi试剂的DNA和适当调节元件的载体可以使用同源重组(Capecchi，Science t 244：1288-1292(1989))插入动物的生殖细胞系中，使得它们表达抑制SH2B3的RNAi试剂。使用如Robinson等人的美国专利5,489,743和Ontario Cancer Institute的PCT公开WO 94/28122中所述的方法制备转基因动物，优选非人哺乳动物。在一些实施方案中，可以从如上所述从转基因动物分离的细胞或组织中分离出抑制SH2B3的RNAi试剂。
在一种方法中，抑制SH2B3的RNAi试剂可以通过本领域技术人员已知的任何合成方法例如通过化学合成核酸来合成获得。然后合成的、抑制SH2B3的RNAi试剂可以通过本领域已知的任何方法纯化。核酸的化学合成方法包括但不限于使用磷酸三酯、磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术的体外化学合成，或通过脱氧核苷H-膦酸酯中间体(参见Bhongle的美国专利5,705,629)。
在某些情况下，例如，当需要增加的核酸酶稳定性时，可以优选具有核酸类似物和/或修饰的核苷间键的核酸。含有修饰的核苷间键的核酸也可以使用本领域公知的试剂和方法合成。例如，合成含有膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲氧基乙基氨基磷酸酯、甲缩醛、硫代甲缩醛、二异丙基甲硅烷基、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、二亚甲基硫化物(-CH2-S-CH2)，二亚甲基亚砜(-CH2-SO-CH2))、二亚甲基砜(-CH2-SO2-CH2)，2'-O-烷基和2'-脱氧-2'-氟'硫代磷酸酯核苷间键是本领域公知的(参见Uhlmann等人，1990,Chem.Rev.90:543-584；Schneider等人，1990,Tetrahedron Lett.31:335和其中引用的参考文献)。Cook等人的美国专利5,614,617和5,223,618，Acevedo等人的5,714,606，Cook等人的5,378,825，Buhr等人的5,672,697和5,466,786，Cook等人的5,777,092，De Mesmacker等人的5,602,240，Cook等人的5,610,289和Wang的5,858,988也描述了用于增强核酸酶稳定性和细胞摄取的核酸类似物。
在一些实施方案中，抑制SH2B3的RNAi试剂可以包括锁核苷酸，例如美国专利8,642,751中所公开的，其全部内容通过引用并入本文。本文所公开的抑制SH2B3的RNAi试剂的基序的其它化学修饰公开于美国申请US 2012/0148664和US 2014/0066491，其全部内容通过引用并入本文。在替代实施方案中，本文所公开的抑制SH2B3的RNAi试剂可以包含碱基修饰的寡核苷酸，例如国际申请WO 2012061810和WO 2012061810中所公开的，其全部内容通过引用并入本文。
寡核苷酸制剂：
配制的寡核苷酸组合物可以呈现多种状态。在一些实例中，组合物可以是至少部分结晶的、均匀结晶的和/或无水的(例如，小于80、50、30、20或10％的水)。在另一个实例中，寡核苷酸处于水相中，例如在包含水的溶液中。
水相或结晶组合物可以例如掺入递送载体，例如脂质体(特别是水相)或颗粒(例如，可适用于结晶组合物的微粒)。通常，寡核苷酸组合物以与预期施用方法相容的方式配制。
在具体实施方案中，组合物通过以下方法中的至少一种制备：喷雾干燥，冻干，真空干燥，蒸发，流化床干燥或这些技术的组合；或脂质超声处理(sonication with alipid)，冷冻干燥，冷凝和其它自组装。
寡核苷酸制剂可以与另一种试剂如另一种治疗剂或稳定寡核苷酸的试剂如与寡核苷酸复合形成寡核苷酸-蛋白质复合物的蛋白质组合配制。还有其它试剂包括螯合剂如EDTA(例如以去除二价阳离子如Mg2+)，盐，DNAse抑制剂，RNA酶抑制剂(例如广泛特异性的RNA酶抑制剂如RNAsin)等。
在一些实施方案中，寡核苷酸制剂包括至少第二治疗剂(例如除RNA或DNA以外的试剂)。可以用寡核苷酸制剂配制的示例性治疗剂包括但不限于：Harrison’s Principlesof Internal Medicine,第17版,2008,McGraw-Hill N.Y.,NY；Physicians DeskReference,第63版,2008,Thomson Reuters,N.Y.,N.Y.；Goodman&Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics,第11版,2005,McGraw-Hill N.Y.,NY；UnitedStates Pharmacopeia,The National Formulary,USP-32NF-27,2008,U.S.Pharmacopeia,Rockville,MD中发现的那些，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，第二治疗剂是抗高血压药或抗高血压剂。
示例性寡核苷酸制剂
脂质体：本发明的寡核苷酸(例如抑制SH2B3的RNAi试剂)可以配制在脂质体中。如本文所用，脂质体是具有含脂膜包封水性内部的结构。脂质体可以具有一种或多种脂质膜。在一些实施方案中，脂质体具有小于约100nm的平均直径。更优选的实施方案提供具有约30-70nm，最优选约40-60nm的平均直径的脂质体。寡层大脂囊和多层脂囊具有多个通常为同心的膜层，并且通常大于100nm。具有几个非同心膜的脂质体，即包含在较大脂囊内的几个较小脂囊泡，称为多泡脂囊(multivesicular vesicle)。
脂质体可以进一步包含一种或多种另外的脂质和/或其它成分，例如甾醇，如胆固醇。另外的脂质可以包括在脂质体组合物中用于各种目的，例如防止脂质氧化，稳定双层，减少形成期间的聚集或将配体连接到脂质体表面。可存在许多另外的脂质和/或其它组分中的任何一种，包括两亲性，中性，阳离子，阴离子脂质和可编程融合脂质。这样的脂质和/或组分可以单独或组合使用。脂质体的一种或多种组分可以包含配体，例如靶向配体。
脂质体组合物可以通过本领域已知的多种方法制备。参见例如美国专利4,235,871；4,737,323；4,897,355和5,171,678；公开的国际申请WO 96/14057和WO 96/37194；Felgner,P.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA(1987)8:7413-7417,Bangham等人，M.Mol.Biol.(1965)23:238,Olson等人，Biochim.Biophys.Acta(1979)557:9,Szoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1978)75:4194,Mayhew等人Biochim.Biophys.Acta(1984)775:169,Kim等人，Biochim.Biophys.Acta(1983)728:339，和Fukunaga等人，Endocrinol.(1984)115:757。
胶束和其它膜制剂：在一些实施方案中，本文所公开的寡核苷酸(例如，抑制SH2B3的RNAi试剂)可以制备并配制成胶束。如本文所用，“胶束”是特定类型的分子组装体，其中两亲性分子以球形结构排列，使得分子上的所有疏水部分朝向内，使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水的，则存在相反的配置。
在一些实施方案中，制剂包含由本发明的寡核苷酸形成的胶束和至少一种两亲性载体，其中优选胶束具有小于约100nm的平均直径。更优选的实施方案提供具有小于约50nm的平均直径的胶束，甚至更优选的实施方案提供具有小于约30nm，或甚至小于约20nm的平均直径的胶束。
可以通过将寡核苷酸组合物的水溶液、碱金属C8至C22烷基硫酸盐和两亲性载体混合来制备胶束制剂。可以在加入碱金属烷基硫酸盐的同时或加入后加入两亲性载体。胶束将在所述成分的基本上任何种类的混合下形成，但剧烈混合提供更小尺寸的胶束。
乳剂：在一些实施方案中，本文所公开的寡核苷酸(例如抑制SH2B3的RNAi试剂)可以制备并配制成乳剂。如本文所用，“乳剂”是一种液体以液滴形式分散在另一种液体中的异质体系。乳剂通常是两相体系，包括彼此紧密混合和分散的两个不混溶的液相。如乳剂型软膏类和乳霜的情况，乳剂的两相中的任一相可以是半固体或固体。寡核苷酸可以以水相、油相或其本身作为单独相的溶液存在。
在一些实施方案中，将组合物配制成微乳剂。如本文所用，“微乳剂”是指水、油和两亲物的系统，其是单一光学各向同性和热力学稳定的液体溶液。微乳剂还包括通过表面活性分子的界面膜稳定的两种不混溶液体的热力学稳定的各向同性透明分散体。
乳剂制剂通过皮肤、口服和肠胃外途径的应用及其制备方法已经在文献中进行了综述，例如参见Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,卷1,p.199；Rosoff,in PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,卷1,p.245；和Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger andBanker(编),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,卷1,p.335，其内容通过引用整体并入本文。
脂质颗粒：在一些实施方案中，本文所公开的寡核苷酸(例如，抑制SH2B3的RNAi试剂)可以制备并配制为脂质颗粒，例如配制的脂质颗粒(FLiP)包含(a)本发明的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸已经与亲脂体缀合，和(b)至少一种脂质组分，例如乳剂、脂质体、分离的脂蛋白、重构的脂蛋白或磷脂，缀合的寡核苷酸已经与之聚合、混合或结合。寡核苷酸对脂质组分的化学计量可以为1:1。或者，化学计量可以是1：许多，许多：1或许多：许多，其中许多是2或更多。
FLiP可以包含三酰基甘油、磷脂、甘油和通过亲脂性连接分子与寡核苷酸聚合、混合或结合的一种或几种脂质结合蛋白。令人惊奇的是，已经发现，由于所述一种或几种脂质结合蛋白与上述脂质组合，FLiP显示对肝、肠、肾、类固醇生成器官，心脏，肺和/或肌肉组织的亲和力。因此，这些FLiP可以用作寡核苷酸到这些组织的载体。例如，脂质缀合的寡核苷酸如胆固醇缀合的寡核苷酸，结合至HDL和LDL脂蛋白颗粒，其在结合到它们各自的受体时介导细胞摄取，从而将寡核苷酸定向递送入肝、肠、肾和类固醇生成器官，参见Wolfrum等人，Nature Biotech.(2007),25:1145-1157。
FLiP可以是包含15-25％三酰甘油、约0.5-2％磷脂和1-3％甘油以及一种或几种脂质结合蛋白的脂质颗粒。FLiP可以是具有约15-25％三酰甘油、约1-2％磷脂、约2-3％甘油以及一种或几种脂质结合蛋白的脂质颗粒。在一些实施方案中，脂质颗粒包含约20％的三酰甘油，约1.2％的磷脂和约2.25％的甘油，以及一种或几种脂质结合蛋白。
FLiP的另一种合适的脂质组分是脂蛋白，例如分离的脂蛋白或更优选重构的脂蛋白。示例性脂蛋白包括乳糜微粒，VLDL(极低密度脂蛋白)，IDL(中等密度脂蛋白)，LDL(低密度脂蛋白)和HDL(高密度脂蛋白)。生产重构脂蛋白的方法是本领域已知的，例如参见A.Jones,Experimental Lung Res.6,255-270(1984)，美国专利4,643,988和5128318，PCT公布WO87/02062，加拿大专利2,138,925。生产重构脂蛋白，特别是载脂蛋白A-I、A-II、A-IV、apoC和apoE的其他方法已记载于A.Jonas,Methods in Enzymology 128,553-582(1986)和G.Franceschini等人，J.Biol.Chem.,260(30),16321-25(1985)。
一种用于FLiP的优选的脂质组分是Intralipid。是人用第一种安全脂肪乳剂的商标名称。20％(20％静脉注射脂肪乳剂)由20％大豆油、1.2％蛋黄磷脂、2.25％甘油和注射用水组成。进一步地，在本发明中其它合适的油如红花油可用于产生FLiP的脂质组分。
FLiP的尺寸范围可为约20-50nm或约30-50nm，例如约35nm或约40nm。在一些实施方案中，FLiP具有至少约100nm的粒径。可选地，FLiP可在约100-150nm之间，例如约110nm，约120nm，约130nm或约140nm，无论是基于脂质体还是乳剂的特征。多个FLiP也可以一起聚合并递送，因此尺寸可以大于100nm。
制备脂质颗粒的方法包括以下步骤：(a)将脂质组分与可被化学修饰的一种或多种亲脂体(例如胆固醇)缀合的寡核苷酸混合；和(b)分级该混合物。在一些实施方案中，该方法包括选择粒径为30-50nm、优选尺寸约40nm的级分的附加步骤。
适用于本发明的一些示例性脂质颗粒制剂记载于2009年3月26日提交的美国专利申请12/412,206，其内容通过引用整体并入本文。
酵母细胞壁颗粒：在一些实施方案中，如本文所公开的寡核苷酸(例如，抑制SH2B3的RNAi试剂)配制在酵母细胞壁颗粒(“YCWP”)中。酵母细胞壁颗粒包括提取的酵母细胞壁外部和核心，所述核心包含有效载荷(payload)(例如寡核苷酸)。颗粒外部包括酵母葡聚糖(例如β葡聚糖，β-1,3-葡聚糖，β-1,6-葡聚糖)，酵母甘露聚糖或其组合。酵母细胞壁颗粒通常为直径约1-4μm的球形颗粒。
酵母细胞壁颗粒的制备是本领域已知的，并且记载于例如美国专利4,992,540；5082936；5028703；5032401；5322841；5401727；5504079；5607677；5741495；5,830,463；5968811；6444448；和6,476,003，美国专利申请公开2003/0216346和2004/0014715，和国际申请公开WO 2002/12348，其内容通过引用整体并入本文。用于药物递送的酵母细胞样颗粒的应用记载于例如美国专利5,032,401；5607677；5741495；和5,830,463和美国专利公开2005/0281781和2008/0044438，其内容通过引用整体并入本文。美国专利申请公开2009/0226528，其内容通过引用并入本文，描述了含有用于将寡核苷酸递送至细胞的酵母细胞壁颗粒的核酸制剂。
用于寡核苷酸的另外的示例性制剂描述于美国专利4,897,355；4394448；4,235,871；4231877；4,224,179；4753788；4673567；4247411；4814270；5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868；5,795,587；5922859；和6,077,663，国际申请2007年9月21日提交的PCT/US07/079203；2007年10月3日提交的PCT/US07/080331；美国专利申请2008年5月28日提交的12/123,922；美国专利公开2006/0240093和2007/0135372和美国临时申请2008年1月2日提交的61/018,616；2008年3月26日提交的61/039,748；2008年4月15日提交的61/045,228；2008年4月22日提交的61/047,087；2008年5月21日提交的61/051,528；和61/113,179(2008年11月10日提交)，其内容通过引用整体并入本文。Behr(1994)BioconjugateChem.5:382-389，和Lewis等人(1996)PNAS93:3176-3181)，还描述了适用于本发明的寡核苷酸的制剂，其内容通过引用整体并入本文。
SH2B3的小分子抑制剂
SH2B3蛋白具有SH2结构域和PH结构域，其中的任一个或两者可以是肽和小分子抑制剂开发用靶标。参见Kraskouskaya等人，Chem Soc Rev.2013Apr21；42(8):3337-70。在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂特异性结合SH2B3蛋白的SH2结构域。在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂特异性结合SH2B3蛋白的PH结构域。在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂特异性结合SH2B3蛋白的SH2和PH结构域。
在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂是小分子。如本文所用，术语“小分子”是指分子量小于约5kD的天然或合成分子，分子量小于约5kD、小于约2kD或小于约1kD的有机或无机化合物。
在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂可以具有小于50μM的IC50，例如，SH2B3的拮抗剂可以具有约50μM至约5nM或小于5nM的IC50。例如，在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂具有约50μM至约25μM、约25μM至约10μM、约10μM至约5μM、约5μM至约1μM、约1μM至约500nM、约500nM至约400nM、约400nM至约300nM、约300nM至约250nM、约250nM至约200nM、约200nM约150nM、约150nM至约100nM、约100nM至约50nM、约50nM至约30nM、约30nM至约25nM、约25nM至约20nM、约20nM至约15nM、约15nM至约10nM、约10nM至约5nM或小于约5nM的IC50。
在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂可以是抗SH2B3抗体分子或其抗原结合片段。合适的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、人源化、重组、单链、Fab、Fab'、Fsc、Rv和F(ab')2片段。在一些实施方案中，中和抗体可用作抗SH2B3抗体。抗体容易通过用抗原免疫在动物如兔子或小鼠中产生。免疫小鼠特别用于提供用于制造杂交瘤的B细胞来源，其又被培养以产生大量的单克隆抗体。通常，从人获得的抗体分子可以分类为免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD之一，其分子中存在的重链的性质彼此不同。某些类别也有亚类，例如IgG1、IgG2等。此外，在人类中，轻链可以是κ链或λ链。本文提及的抗体包括提及人类抗体物质的所有这些类别、亚类和类型。
抗体为广泛的靶抗原和半抗原提供高结合亲合力和独特的特异性。用于实施本文所公开的方法的单克隆抗体包括全部抗体及其片段，并根据常规技术例如杂交瘤合成、重组DNA技术和蛋白质合成产生。
SH2B3多肽或其部分或片段可以用作抗原，并还可用作免疫原以产生免疫特异性结合抗原的抗体，使用标准技术进行多克隆和单克隆抗体制备。优选地，抗原肽包含至少10个氨基酸残基，或至少15个氨基酸残基，或至少20个氨基酸残基，或至少30个氨基酸残基。
有用的单克隆抗体和片段可以源自任何物种(包括人类)，或可以形成为采用来自多于一种物种的序列的嵌合蛋白。人单克隆抗体或“人源化”鼠抗体也可以根据本发明使用。例如，鼠单克隆抗体可以通过将编码鼠Fv区(即含有抗原结合位点)的核苷酸序列或其互补决定区与编码人恒定结构域区和Fc区的核苷酸序列进行遗传重组来“人源化”。人源化靶向部分被认为降低宿主受体中抗体或多肽的免疫反应性，允许以类似于欧洲专利申请0,411,893A2公开的方式增加半衰期和降低不良免疫反应的可能性。鼠单克隆抗体应优选以人源化形式使用。抗原结合活性由位于抗体的可变部分(Fv)的轻链和重链上(三个各自)的六个互补决定区(CDR)的氨基酸的序列和构象决定。由通过短肽间隔序列连接的轻链的可变区(VL)和重链的可变区(VH)组成的25kDa单链Fv(scFv)分子是使抗体剂的大小最小化的一个选择。ScFv提供了另外的选择，用于制备和筛选大量不同的抗体片段，以鉴定特异性结合的那些。已经开发了在包含scFv的基因的丝状噬菌体表面上展示scFv分子的技术。具有广泛范围或抗原特异性的scFv分子可以存在于scFv噬菌体库的单个大型贮池中。
嵌合抗体是以源自不同动物物种的两个或更多个片段或部分为特征的免疫球蛋白分子。通常，嵌合抗体的可变区源自非人哺乳动物抗体如鼠单克隆抗体，免疫球蛋白恒定区源自人免疫球蛋白分子。优选地，两个区域和组合如常规确定地具有低免疫原性。
抗SH2B3抗体可通过诸如Thermo Scientific、Sigma Aldrich、Atlas Antibodies和R&D Systems等供应商商购获得。
培养干细胞和/或祖细胞的方法是本领域公知的。通常，本文所述的细胞可以在本领域可获得和公知的培养基中培养。此类培养基包括但不限于Dulbecco's改良的Eagle's、Eagle's Minimum Essential(DMEM)、DMEM和RPMI-Iscove's Modified Dulbecco's(IMDM)。用于培养和扩增干细胞和/或祖细胞的许多培养基也可用作含有或不含丙酮酸钠的低葡萄糖制剂。
本文还考虑用哺乳动物血清补充细胞培养基。血清通常包含生存和扩增所必需的细胞因子和组分。血清的实例包括胎牛血清(FBS)、牛血清(BS)、小牛血清(CS)、胎小牛血清(FCS)、新生小牛血清(NCS)、山羊血清(GS)、马血清(HS)、人血清(例如，人AB血清)、鸡血清、猪血清、绵羊血清、兔血清、血清替代物和牛胚胎液。要理解的是，如果认为有必要使补体级联的组分失活，则血清可以在55-65摄氏度热灭活。还可以使用血浆如人AB血浆。
生长因子可以添加到细胞培养基中。造血生长因子包括但不限于任何或所有白介素(IL-1至IL-16)、干扰素(IFN-α、β和γ)、促红细胞生成素(EPO)、干细胞因子(SCF)、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、肿瘤生长因子β、肿瘤坏死因子α、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、鳍状酪氨酸激酶-3配体(Flt3-配体)、以及EGF(表皮生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、LIF(白血病抑制因子)。还可以使用促血小板生成素(TPO)或MGDF(巨核细胞生长衍生因子)。许多这些生长因子是可商购的。最常用的生长因子混合物包括G-CSF、GM-CSF、SCF、IL-1、IL-3和IL-6。大多数使用的生长因子混合物是通过重组DNA技术产生的，并经不同程度地纯化。通过标准生物化学技术从肿瘤细胞系的培养基中纯化一些生长因子。广泛使用的生长因子是通过重组技术产生的，并表现出GM-CSF和IL-3活性的PIXY 321。
培养物中使用的生长因子的量取决于因子制剂的活性和所用生长因子的组合。通常，浓度范围为0.5至500ng/mL。每个生长因子的最佳浓度必须针对个体培养条件确定，这是因为一些生长因子与其他生长因子协同作用。
另外的补充剂也可有利地用于向细胞提供必需的微量元素以获得最佳生长和扩增。这样的补充剂包括例如胰岛素、转铁蛋白、肝素、硒钠及其组合。这些组分可以包括在盐溶液中，包括但不限于(HBSS)、Earle'sHanks平衡盐溶液、抗氧化剂补充剂、溶液盐水(PBS)，抗坏血酸和抗坏血酸-2-磷酸盐，以及额外的氨基酸。许多细胞培养基已经含有氨基酸，然而，一些需要在培养细胞之前补充。这类氨基酸包括但不限于L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-半胱氨酸，L-胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-缬氨酸。确定这些补充剂的适当浓度是本领域技术人员的技能之一。
激素也可有利地用于本文所述的细胞培养物中，包括但不限于D-醛固酮、二乙基己烯雌酚(DES)、地塞米松、β-雌二醇、氢化可的松、胰岛素、催乳素、孕酮、生长抑素/人生长激素(HGH)、促甲状腺素、甲状腺素和L-甲状腺原氨酸。
根据细胞的类型和分化细胞的命运，脂质和脂质载体也可用于补充细胞培养基。这样的脂质和载体可以包括但不限于胆固醇、与白蛋白缀合的亚油酸、环糊精、与白蛋白缀合的亚油酸和油酸，非缀合亚油酸等。
本文所述的方法也考虑使用饲养细胞层。饲养细胞用于支持挑剔的培养细胞如干细胞的生长。饲养细胞是已经被γ-照射以抑制细胞分裂但允许活性代谢的正常细胞。在培养中，饲养层用作其他细胞的基底灭活层并提供细胞因子而本身没有进一步生长或分裂(Lim,J.W.和Bodnar,A.,2002)。典型饲养层细胞的实例包括人二倍体肺细胞、小鼠胚胎成纤维细胞和瑞士小鼠胚胎成纤维细胞，但可以是能够提供有利于允许干细胞和/或祖细胞的最佳生长、活力和扩增的细胞组分和因子的任何有丝分裂后细胞。在许多情况下，由于白血病抑制因子(LIF)具有抗分化特性，饲养细胞层不需要保持干细胞和/或祖细胞处于未分化、增殖状态。因此，可以使用含LIF的补充剂来维持细胞处于未分化状态。
细胞可以在低血清或无血清培养基中培养。用于培养细胞的无血清培养基记载于例如美国专利7,015,037。许多细胞已经在无血清或低血清培养基中生长。例如，培养基可以补充有一种或多种生长因子。常用的生长因子包括但不限于骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和表皮生长因子、干细胞因子、促血小板生成素、Flt3配体和Γ-3。参见例如美国专利7,169,610；7109032；7037721；6617161；6617159；6372210；6224860；6037174；5908782；5766951；5397706；和4,657,866；所有这些都通过引用并入本文用于教导在无血清培养基中培养细胞。
培养物中的细胞可以保持悬浮或附着于固体支持物，例如细胞外基质组分。干细胞和/或祖细胞通常需要促使它们附着于固体支持物的额外因子，例如I型和II型胶原、硫酸软骨素、纤连蛋白、“超纤连蛋白”和纤连蛋白样聚合物、明胶、聚-D和聚-L-赖氨酸、血小板反应蛋白和玻连蛋白。干细胞和/或祖细胞也可以在低附着瓶中培养，例如但不限于Corning低附着板。
在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞可以在多阶段(例如三阶段)培养系统中培养，其中生长因子的组成在细胞生长和分化过程中变化。例如，可以在在细胞生长和分化的早期使用IL-3、SCF和EPO，在中间阶段使用SCF和EPO，最后阶段使用EPO。
在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞在至少1.0单位/ml EPO、至少1.2单位/mlEPO、至少1.4单位/ml EPO、至少1.6单位/ml EPO、至少1.8单位/ml EPO、至少2.0单位/mlEPO、至少2.2单位/ml EPO、至少2.4单位/ml EPO、至少2.6单位/ml EPO、至少2.8单位/mlEPO、至少3.0单位/ml EPO、至少3.2单位/ml EPO、至少3.4单位/ml EPO、至少3.6单位/mlEPO、至少3.8单位/ml EPO或至少4.0单位/ml EPO的存在下培养。
在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞在至少1ng/ml IL-3、至少2ng/ml IL-3、至少3ng/ml IL-3、至少4ng/ml IL-3、至少5ng/ml IL-3、至少6ng/ml IL-3、至少7ng/mlIL-3、至少8ng/ml IL-3、至少9ng/ml IL-3、至少10ng/ml IL-3、至少11ng/ml IL-3、至少12ng/ml IL-3、至少13ng/ml IL-3、至少14ng/ml IL-3、至少15ng/ml IL-3、至少16ng/mlIL-3、至少17ng/ml IL-3、至少18ng/ml IL-3、至少19ng/ml IL-3、至少20ng/ml IL-3、至少21ng/ml IL-3、至少22ng/ml IL-3、至少23ng/ml IL-3、至少24ng/ml IL-3或至少25ng/mlIL-3的存在下培养。
在一些实施方案中，干细胞和/或祖细胞在至少1ng/ml SCF、至少2ng/ml SCF、至少3ng/ml SCF、至少4ng/ml SCF、至少5ng/ml SCF、至少6ng/ml SCF、至少7ng/ml SCF、至少8ng/ml SCF、至少9ng/ml SCF、至少10ng/ml SCF、至少15ng/ml SCF、至少20ng/ml SCF、至少25ng/ml SCF、至少30ng/ml SCF、至少35ng/ml SCF、至少40ng/ml SCF、至少45ng/mlSCF、至少50ng/ml SCF、至少55ng/ml SCF、至少60ng/ml SCF、至少65ng/ml SCF、至少70ng/ml SCF、至少75ng/ml SCF、至少80ng/ml SCF、至少85ng/ml SCF、至少90ng/ml SCF、至少95ng/ml SCF、至少100ng/ml SCF、至少150ng/ml SCF、至少200ng/ml SCF、至少250ng/mlSCF、至少300ng/ml SCF、至少350ng/ml SCF、至少400ng/ml SCF、至少450ng/ml SCF或至少500ng/ml SCF的存在下培养。
在一些实施方案中，HSC在IL-3、SCF、EPO、人AB血浆、人AB血清、转铁蛋白、肝素和胰岛素的存在下培养。
用于生产RBC的干细胞用细胞培养基公开于例如US20140255369和US8206979中，其各自的内容通过引用整体并入本文。
包含RBC的组合物
在一些实施方案中，本文所述的方法与使用相同的干细胞和/或祖细胞群但没有任何SH2B3抑制的方法相比，可以将RBC的数量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、或至少500％。
在一些实施方案中，本文所述的方法与使用相同的干细胞和/或祖细胞群但没有任何SH2B3抑制的方法相比，可以将红细胞的质量提高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、或至少500％。当去核的RBC的百分比增加、具有适当的成熟标志物的RBC的频率增加、血红蛋白合成(hemoglobinization)提高或其组合时，红细胞的质量被认为是提高的。成熟标志物包括CD235a(血型糖蛋白A)、恒河猴抗原、CD44以及在成熟红细胞上表达的各种其他血型的表面表达。
在一些实施方案中，本文所述的方法与使用相同的干细胞和/或祖细胞群但没有任何SH2B3抑制的方法相比，将RBC的成熟率提高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、或至少500％。
在一些实施方案中，本文所公开的方法包括将HSPC与SH2B3的拮抗剂接触预定的时间段。在一些实施方案中，本文所公开的方法包括使HSPC与SH2B3的拮抗剂接触至少约2小时、或至少约4小时、或至少约8小时、或至少约10小时、或至少约12小时、或12-24小时之间、或24-32小时之间、或32-48小时之间、或1-2天之间、或3-4天之间、或长于4天的预定的时间段。
在一些实施方案中，接触发生在第1阶段(第1-7天)分化前或期间的预先选择的时间段内，也就是说在包含肝素、全铁转铁蛋白(holo-transferrin)、促红细胞生成素(Epo)、干细胞因子(SCF)和IL-3)和至少一种SH2B3的拮抗剂的存在下。在一些实施方案中，接触发生在第1阶段(第1-7天)分化之前或期间，也就是说在包含肝素、全铁转铁蛋白、促红细胞生成素(Epo)、干细胞因子(SCF)和IL-3)和至少一种SH2B3的拮抗剂的存在下。
在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂在第2阶段(第7天-第12天)分化前或期间与HSPC接触预先选择的时间段，也就是说在包含肝素、全铁转铁蛋白、促红细胞生成素(Epo)和干细胞因子(SCF))和至少一种SH2B3的存在下。在一些实施方案中，SH2B3的拮抗剂在第3阶段(第12天-第18天)分化前或期间与HSPC接触预先选择的时间段，也就是说在包含肝素、全铁转铁蛋白和促红细胞生成素(Epo))和至少一种SH2B3的拮抗剂的存在下。
在一些实施方案中，成熟RBC群在7至21天内产生。在一些实施方案中，成熟RBC群在7至18天内产生。在一些实施方案中，成熟RBC群在7至16天内产生。在一些实施方案中，成熟RBC群在7至14天内产生。在一些实施方案中，成熟RBC群在7至12天内产生。在一些实施方案中，成熟RBC群在小于7天内产生。
在一些实施方案中，本文所公开的方法和组合物包含通过本文所公开的方法产生的RBC。在一些实施方案中，本发明包括RBC与它们所衍生自的多能干细胞或祖细胞(即HSPC)组合的混合物，并且在一些实施方案中，所述混合物包含小于约25％、或小于约20％、或小于约15％、或小于约13％、或小于约12％、或小于约11％、或小于约10％、或小于约9％、或小于约8％、或小于约7％、或小于约6％、或小于约5％、或小于约4％、或小于约3％、或小于约2％、或小于约1％的在混合物的总细胞群中的干细胞和/或祖细胞。
在一些实施方案中，RBC是混合物细胞群中的大多数细胞类型。例如，所述方法产生本文所述的细胞群，或本文所述的混合物包含至少约99％、或至少约98％、或至少约97％、或至少约96％、或至少约95％、或至少约94％、或至少约93％、或至少约92％、或至少约91％、或至少约90％、或至少约89％、或至少约87％、或至少约86％、或至少约85％、或至少约84％、或至少约83％、或至少约82％、或至少约81％、或至少约80％、或至少约79％、或至少约78％、或至少约77％、或至少约76％、或至少约75％、或至少约74％、或至少约73％、或至少约72％、或至少约71％、或至少约70％、或至少约69％、或至少约68％、或至少约67％、或至少约65％、或至少约64％、或至少约63％、或至少约62％、或至少约61％、或至少约60％、或至少约59％、或至少约58％、或至少约57％、或至少约56％、或至少约55％、或至少约50％的RBC。在一些实施方案中，使用本文所公开的方法产生的混合物或培养物或细胞群中的RBC的百分比计算，不考虑用于维持培养物的饲养细胞或其它细胞。
使用本文所述的方法和组合物产生的RBC可以储存在血库中。在一些实施方案中，RBC存在于低温保存介质或储存介质中。在一些实施方案中，RBC在+4℃或更冷、例如-20℃下储存在合适的储存介质中。血库可以提供大量可用的红细胞，其可用于各种治疗以及研究应用。储存的RBC可以例如用作未来出于健康原因需要输血时例如当受试者需要进行手术和/或需要在以后输血(例如，进行骨髓移植等)时的RBC来源。在一些实施方案中，RBC可以存入血库用于运动目的，例如在运动事件之前用于输血。储存的RBC也可以用作自体使用的细胞来源，例如用于供体的未来治疗。在一些实施方案中，储存的RBC还可以用作供体亲属的未来治疗的细胞来源。储存的RBC还可以在供体授权时用作由具有匹配血型的其他个体临床使用的细胞来源。血型相容性示于表1中。此外，本文所述的方法和组合物可用于生产用于稀有血型例如Duffy阴性血的RBC。本文描述的方法和组合物可用于为在其生命期间改变血型的受试者(例如，A型血并接受O型骨髓移植的受试者)产生RBC。
RBC的储存条件是本领域公知的。储存的包装红细胞的常规血液储存是42天或6周。长期储存RBC的方法是本领域公知的，并且描述于美国专利4,585,735、4,675,185、4,943,287、5,789,151、6,150,085、8,071,282、8,968,992，美国专利申请2012/0329036、2001/0049089、2014/0091047、2015/0190309、2014/0086892，其全部内容通过引用并入本文。
本发明的另一方面涉及包含使用本文所公开的方法产生的RBC和至少一种如本文所公开的SH2B3抑制剂的细胞培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含RBC和至少一种SH2B3拮抗剂。在一些实施方案中，SH2B3是siRNA剂。在一些实施方案中，组合物包括包含第1阶段(第1-7天)分化用培养基(包含肝素、全铁转铁蛋白、促红细胞生成素(Epo)、干细胞因子(SCF)和IL-3))，以及至少一种SH2B3拮抗剂的培养基。在一些实施方案中，组合物包括包含第2阶段(第7天-第12天)分化用培养基(包含肝素、全铁转铁蛋白、促红细胞生成素(Epo)和干细胞因子(SCF))，以及至少一种SH2B3的培养基。在一些实施方案中，组合物包括包含第3阶段(第12天-第18天)分化用培养基(包含肝素、全铁转铁蛋白和促红细胞生成素(Epo))，以及至少一种SH2B3拮抗剂的培养基。
RBC收集
RBC可以使用本领域已知的方法分离。例如，RBC可以通过白细胞过滤或流式细胞分选来分离。在一些实施方案中，RBC可以基于CD235a标志物的阳性选择和CD71标志物的阴性选择来收集。
在一些实施方案中，RBC使用白细胞过滤分离。在白细胞过滤中，几乎所有有核细胞通过使用过滤器去除，因此可以获得基本上纯的RBC群。白细胞过滤是大规模RBC分离的有效方法。
治疗用途
根据本文所述的任何方法制备的RBC可用于多种治疗应用。对出于各种原因和病症需要这类治疗的患者使用RBC输血是本领域公知的，并且方法是标准的医学实践。本文所述和/或根据本公开的方法产生的RBC可以用于使用与目前用于输血的相同方法和条件来治疗患者。
在某些实施方案中，本公开涉及通过向患有以红细胞缺陷为特征的病症的受试者施用本公开的或根据本公开的任意方法制备的红细胞群来治疗、预防或诊断以红细胞缺陷为特征的疾病或病症的方法。
如本文所用，“红细胞缺陷”是指红细胞数量比具有正常红细胞数量的受试者的红细胞数量低约20％至约900％的受试者；或者红细胞数量比具有正常红细胞数量的受试者的红细胞数量低约10倍至约1,000倍的受试者。
以红细胞缺陷为特征的病症可包括但不限于贫血(例如先天性贫血、再生障碍性贫血、恶性贫血、缺铁性贫血、镰状细胞性贫血、球状红细胞增多症、溶血性贫血、血浆铜蓝蛋白缺乏症(Aceruloplasminemia)、腺苷脱氨酶活性增加、腺苷酸激酶缺陷、醛缩酶缺陷、α-地中海贫血-性状或运载体、转铁蛋白缺乏症、常染色体显性遗传性铁粒幼细胞性贫血、常染色体隐性的铁粒幼细胞性贫血、β-地中海贫血-性状或运载体、β-地中海贫血症重型(和中间)、具有血小板减少症的CDA(GATA I突变)、复合杂合性镰状病症、先天性棘红细胞增多症、先天性红细胞生成异常性贫血I型、先天性红细胞生成异常性贫血II型、先天性红细胞生成异常性贫血III型、δβ地中海贫血、Diamond-Blackfan贫血、DMT1缺陷性贫血、家族性发育不良性贫血、Fanconi贫血、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶缺陷症、GLRX5相关铁粒幼细胞性贫血、葡萄糖磷酸异构酶缺陷、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷、谷胱甘肽还原酶缺陷、谷胱甘肽合成酶缺陷、血红蛋白C病、血红蛋白D病、血红蛋白E病、血红蛋白H病、血红蛋白Lepore、伴有贫血的血红蛋白M病、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性持续性胎儿血红蛋白、遗传性球形红细胞增多症、遗传性口形红细胞增多症、己糖激酶缺陷、胎儿水肿、Imerslund-Grasbeck综合征、铁难治性缺铁性贫血、Kearns-Sayre综合征、卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺陷、线粒体肌病铁粒幼细胞性贫血、地中海贫血、先天性红细胞生成异常性贫血、伴有畸形的全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿、Pearson综合征、磷酸果糖激酶缺陷、磷酸甘油酸激酶缺陷、嘧啶5核苷酸酶缺陷、丙酮酸激酶缺陷、镰状细胞性贫血、镰状细胞性状、与共济失调相关的铁粒幼细胞性贫血、SLC25A38相关的铁粒幼细胞性贫血、硫胺素反应性巨幼细胞性贫血、磷酸丙糖异构酶缺陷、不稳定型血红蛋白、Wolfram综合征和X连锁铁粒幼细胞性贫血)、戈谢氏病(Gaucher's disease)、溶血、嗜中性白细胞减少症、血小板减少症、粒细胞减少症、血友病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡样淋巴瘤、扩散型大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、前B型急性淋巴细胞性白血病、前T型急性淋巴细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、难治性白血病或其组合。
在一些实施方案中，以红血细胞缺陷为特征的的病症(部分或全部)由化学疗法、化学暴露、放射疗法和/或放射暴露中的一种或多种产生。在一些实施方案中，通过本公开的任何方法产生的红细胞群与化学疗法和/或放射疗法或一种或多种感兴趣的蛋白质共同施用。
在一些实施方案中，本公开的和/或根据本公开的任何方法产生的红细胞群施用于或输入有需要的例如患有失血的受试者。失血可能是由于例如内部或外部流血、出血、事故、创伤或手术等引起的。
用本发明的一个或多个红细胞群进行治疗也可用于与出血相关的一些感染性疾病，例如但不限于与病毒性出血热有关的RNA病毒家族(沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、丝状病毒科和黄病毒科)。病毒性出血热的实例包括但不限于拉沙热(Lassa fever)、埃博拉病毒、马尔堡病(Marburg)、裂谷热(Rift Valley fever)、登革热和黄热病。
在需要直接输血的实施方案中，本文所述和/或根据本公开的任何方法制备的大量红细胞施于个体。在其他实施方案中，所产生的红细胞群的持续输注施于个体。
为了治疗某些疾病、病症和/或病况，施用适于用于本公开的一种或多种感兴趣的蛋白质的递送系统的红细胞是有用的。可以使用使红细胞适于本领域已知和本文所公开的蛋白质的递送系统的任何方法。受益于用公开的感兴趣的蛋白质治疗的本领域已知的和本文所公开的任何疾病、病症和/或病况可以用本公开的方法治疗，包括但不限于需要造血生长因子的受试者、急性炎性病况、细胞因子风暴病况、与细胞因子风暴相关的临床症状、癌症、血管失调(例如冻伤、癌症相关血管收缩或风湿性关节等)、急性心肌梗塞、产科分娩期间的用途、急性和/或持续性偏头痛、需要免疫力增强的受试者、具有凝血高风险的受试者、肺栓塞风险升高的受试者、心血管疾病、免疫疾病和/或病症、和自身免疫性疾病和/或病症。
用于本文所述方法的对受试者施用RBC的示例性模式包括但不限于注射。“注射”包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑内脊柱和胸骨内注射和输注。术语“肠胃外给药”和“肠胃外地给药”是指除了肠内和局部给药以外的通常通过注射的给药方式，包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、皮下注射、关节内、子囊、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内(intracerebro spinal)和胸骨内注射和输注。
试剂盒
本文还提供了使用SH2B3抑制剂从干细胞和/或祖细胞产生RBC群的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：(a)包含SH2B3拮抗剂的第一容器；(b)包含来自干细胞或祖细胞的RBC的第1阶段(第1天-第7天)成熟所需生长因子的第二容器，所述生长因子包括：肝素、全铁转铁蛋白、促红细胞生成素(Epo)、干细胞因子(SCF)和IL-3；(c)含有来自干细胞的RBC的第2阶段(第7天-第12天)成熟所必需的生长因子的第三容器，所述生长因子包括：肝素、全铁转铁蛋白、促红细胞生成素(Epo)和干细胞因子(SCF)；(d)包含来自干细胞或祖细胞的RBC的第3阶段(第12天-第18天)成熟所需的生长因子的第四容器，肝素、全铁转铁蛋白和促红细胞生成素(Epo)。
在一些实施方案中，第一、第二或第三或第四容器中的各个组分可以是粉末形式，例如冻干粉末。粉末可以在使用时重构。在一些实施方案中，第一、第二或第三容器中的各个组分可以是液体形式。
在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含一种或多种基础细胞培养基(例如粉末形式或液体形式)的容器。粉末可以在使用时在水溶液(例如水)中重构。细胞培养基础培养基的实例包括但不限于：IMDM、最低必需培养基(MEM)、Eagle's培养基、Dulbecco's改良的Eagle培养基(DMEM)、Dulbecco's改良的Eagle培养基：营养混合物F-12(DMEM F12)、F-10营养混合物、Ham's F-10营养混合物、Ham's F12营养混合物、培养基199、RPMI、RPMI 1640、还原血清培养基、基础培养基(BME)、DMEM/F12(1:1)等，及其组合。在一些实施方案中，试剂盒还包含血清，例如人AB血浆、人AB血清。在一些实施方案中，试剂盒包含抗生素，例如青霉素和/或链霉素。
在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含多能干细胞或其它干细胞如包括CD34+细胞的造血细胞的一个或多个小瓶。
在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含细胞培养装置。细胞培养装置的实例包括但不限于小室(transwell)、微孔(microwell)、微流体装置、生物反应器、培养板或其任何组合。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含微流体装置。在一些实施方案中，微流体装置可以是芯片仿真人体器官(organ-on-a-chip)装置。例如，在一个实施方案中，所述芯片仿真人体器官装置可以是如国际专利申请WO 2015/138034和WO2015/138032和/或美国专利US 8,647,861中所描述的装置，其各自的内容通过引用整体并入本文。第一通道和第二通道可以基本相等的(例如，在10％以内或在5％以内或更低的)高度或不同高度。在一些实施方案中，第一通道与第二通道的高度比范围可为约2:1至约10:1。在一些实施方案中，第一通道与第二通道的高度比可为约5:1。
在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含一个或多个容器，每个容器含有特异性结合多能性标志物或rbc标志物的可检测标记。
在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包括使用试剂盒以执行根据本文所公开的方法从多能干细胞或祖细胞产生rbc的说明书。
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制仅由权利要求书限定的本发明的范围。
如本文和权利要求书中所使用的，单数形式包括复数引用，反之亦然，除非上下文另有明确说明。除了在操作例中，或者另有说明，表示本文使用的成分或反应条件的量的所有数字应被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。
在本发明的一些实施方案中，可以在任何下述编号的段落中定义：
1、一种从干细胞和/或祖细胞群离体产生红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：
(iv)抑制干细胞和/或祖细胞群中的SH2B3；
(v)培养干细胞和/或祖细胞群以足以诱导至少一种干细胞或祖细胞分化为RBC的时间；和
(vi)收集红细胞群。
2、根据第1段所述的方法，其中所述抑制降低SH2B3蛋白水平、SH2B3mRNA水平、SH2B3蛋白活性或其组合。
3、根据第1或2段所述的方法，其中所述抑制包括使干细胞和/或祖细胞群与基因组编辑剂接触，用于从至少一种干细胞或祖细胞靶向切除SH2B3基因。
4、根据第3段所述的方法，其中所述基因组编辑剂选自由锌指核酸酶(ZFN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)组成的组。
5、根据第3或4段所述的方法，其中所述基因组编辑剂存在于载体中。
6、根据第1或2段所述的方法，其中所述抑制包括使干细胞和/或祖细胞群与SH2B3的拮抗剂接触。
7、根据第6段所述的方法，其中所述SH2B3的拮抗剂选自由无机分子、有机分子、核酸、核酸类似物或衍生物、肽、肽模拟物、蛋白质、抗体或其抗原结合片段、及其组合组成的组。
8、根据第6或7段所述的方法，其中SH2B3的拮抗剂特异性结合SH2B3蛋白的SH2结构域、PH结构域或SH2和PH结构域两者。
9、根据第6-8段中任一项所述的方法，其中所述SH2B3的拮抗剂是抑制SH2B3表达的RNAi试剂。
10、根据第9段所述的方法，其中所述RNAi试剂是与SH2B3 mRNA杂交的siRNA、shRNA、dsRNA。
11、根据第1-10段中任一项所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群选自由造血干细胞、造血祖细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞及其组合组成的组。
12、根据第1-11段中任一项所述的方法，其中所述方法增加来自干细胞和/或祖细胞群的RBC的扩增。
13、根据第1-12段中任一项所述的方法，其中所述方法提高RBC的质量。
14、根据第1-13段中任一项所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群是哺乳动物来源的。
15、根据第14段所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群是人源的。
16、根据第1-15段中任一项所述的方法，其中所述RBC通过白细胞过滤或流式细胞分选来分离。
17、根据第1-16段中任一项所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群从供体受试者获得。
18、根据第17段所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群来自所述供体受试者的外周血单个核细胞、脐带血、骨髓、脐带组织或G-CSF动员外周血。
19、根据第17或18段所述的方法，其还包括向有需要的受试者施用RBC群，其中所述RBC由从所述供体受试者获得的干细胞和/或祖细胞群产生。
20、根据第19段所述的方法，其中所述干细胞群是iPSC。
21、根据第1-19段中任一项所述的方法生产的RBC群。
22、一种包含RBC群和干细胞和/或祖细胞群的混合物，其中所述RBC根据第1-19段中任一项所述的方法生产。
23、一种血库，其包含根据第21段所述的RBC群。
24、根据第23段所述的血库，其中制备多个RBC群用于低温储存。
25、一种细胞培养基，其包含干细胞和/或祖细胞群、从至少一种干细胞或祖细胞分化的至少一种RBC和SH2B3的拮抗剂。
26、一种诱导干细胞和/或祖细胞群分化成红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：
(i)将干细胞和/或祖细胞群与SH2B3的拮抗剂接触，并培养干细胞和/或祖细胞群以足以诱导至少一种干细胞或祖细胞分化为RBC的时间，其中所述SH2B3的拮抗剂降低SH2B3蛋白的活性或降低SH2B3 mRNA或蛋白水平；和
(ii)收集红细胞群。
27、一种诱导干细胞和/或祖细胞群分化成红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：
(i)将干细胞和/或祖细胞群与基因组编辑剂接触并培养干细胞和/或祖细胞群以足以诱导至少一种干细胞或祖细胞分化为RBC的时间，其中所述基因组编辑剂从至少一种干细胞或祖细胞中切除SH2B3基因；和
(ii)收集红细胞群。
28、一种向受试者施用RBC群的方法，其包括向所述受试者施用有效量的RBC，其中所述RBC已经与有效量的SH2B3的拮抗剂离体或体外接触，其中所述SH2B3的拮抗剂降低SH2B3蛋白的活性或降低SH2B3 mRNA或蛋白水平。
29、一种向受试者施用RBC群的方法，其包括向所述受试者施用有效量的RBC，其中所述RBC由已经与有效量的基因组编辑剂离体或体外接触的干细胞和/或祖细胞群产生，其中所述基因组编辑剂从至少一种干细胞或祖细胞中切除SH2B3基因。
30、一种细胞培养基，其包含：干细胞和/或祖细胞群，以及至少一种SH2B3的拮抗剂，其中所述细胞培养基选自：
a.包含肝素、全铁转铁蛋白、促红细胞生成素(Epo)、干细胞因子(SCF)和IL-3)的第1阶段(第1-7天)分化培养基；或
b.包含肝素、全铁转铁蛋白、促红细胞生成素(Epo)和干细胞因子(SCF))的第2阶段(第7天-第12天)分化培养基；或
c.包含肝素、全铁转铁蛋白和促红细胞生成素(Epo)的第3阶段(第12天-第18天)分化培养基。
31、根据第30段所述的培养基，其还包含由干细胞和/或祖细胞分化的至少一种RBC。
32、一种细胞培养基，其包含：至少一种RBC和至少一种SH2B3的拮抗剂，其中所述细胞培养基选自：
a.包含肝素、全铁转铁蛋白、促红细胞生成素(Epo)、干细胞因子(SCF)和IL-3)的第1阶段(1-7天)分化培养基；或
b.包含肝素、全铁转铁蛋白、促红细胞生成素(Epo)和干细胞因子(SCF))的第2阶段(第7天-第12天)分化培养基；或
c.包含肝素、全铁转铁蛋白和促红细胞生成素(Epo)的第3阶段(第12天-第18天)分化培养基。
33、根据第1-19段中任一项所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群是从O型血型的人受试者获得的。
34、根据第33段所述的方法，其中所述人受试者具有O-型(O型、Rh-)血型。
虽然在本发明的实施或试验中可以使用任何已知的方法、装置和材料，但是这里描述了就这方面而言的方法、装置和材料。
尽管已经在本文中详细记述和描述了优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神的情况下可以进行各种修改、添加、替代等，因此认为这些实施方案在所附权利要求中限定的本发明的范围内。此外，在尚未指出的程度上，本领域普通技术人员将会理解，本文描述和示出的各种实施方案中的任一者可以进一步修改以包括本文所公开的任何其它实施方案中所示的特征。
所有专利和其他出版物；包括文献参考，已发行专利，已公布的专利申请和共同未决的专利申请；贯穿本申请引用的是通过引用明确地并入本文以用于描述和公开例如可以结合本文所述的技术使用的这些出版物中描述的方法。这些出版物的公开内容仅供在本申请的申请日之前提供。这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权凭借先前的发明或出于任何其他原因而无法提前公开此类披露。关于这些文件的内容的日期或表示的所有声明都是基于申请人可用的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
本公开的实施方案的描述并不旨在是穷尽性的或将公开限制为所公开的精确形式。虽然为了说明的目的在本文中描述了本公开的具体实施方案和示例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内的各种等同修改是可能的。例如，虽然以给定顺序呈现方法步骤或功能，但替代实施例方案可以以不同的顺序执行功能，或者可以基本同时地执行功能。本文提供的本公开的教导可以适用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方案可以组合以提供其他实施方案。如果需要，可以修改本公开的方面以使用上述参考文献和应用的组合物、功能和概念来提供本公开的另外的实施方案。
任何前述实施方案的具体元件可以在其他实施方案中组合或替代元件。此外，虽然已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且并不是所有实施方案都必须表现出这样的优点才落入本公开的范围内。
实施例
以下实施例说明本发明的一些实施方案和方面。对于相关领域的技术人员显而易见的是，可以在不改变本发明的精神或范围的情况下执行各种修改、添加、替代等，并且这些修改和变化包括在如所附权利要求定义的本发明的范围内。本文描述的技术通过以下实施例进一步说明，其不以任何方式解释为进一步限制。
材料和方法
293T细胞培养和慢病毒生产
将293T细胞以30％-90％的融合保持在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中。为进行慢病毒生产，使用Fugene 6试剂(Roche)根据制造商的方案，用下述构建体连同VSV-G包膜和pdΔ8.9包装载体转染293T细胞。第二天将培养基更换为第1阶段原代细胞培养基(不含EPO、IL-3和SCF)，转染后48小时收集病毒上清液并以45微米过滤。将TF-1人类红系细胞在补充有用于维持的10％FBS和2ng/ml GM-CSF以及1％青霉素/链霉素的RPMI培养基中培养。为进行细胞因子饥饿，除去所有细胞因子，并将细胞在仅FBS中维持过夜。在时间0加入EPO和SCF，然后收集后续时间点用于分析。
原代CD34+细胞的分离和来源。
在用Ficoll密度梯度法进行单个核细胞纯化后，来自G-CSF动员的外周血、骨髓或脐带血的CD34+细胞使用Ultrapure Microbead Kit(Miltenyi Biotech)根据制造商的方案通过阳性磁性选择来纯化。如下所述，通过用PE缀合的抗人CD34抗体(8012-0349，eBioscience)进行纯化后流式细胞术评估，达到至少95％的纯度。
原代细胞培养和慢病毒感染
使用三阶段培养方案将细胞分化成成熟的RBC。在第1阶段(第0-7天)，在补充有2％人AB血浆、3％人AB血清、1％青霉素/链霉素、3IU/mL肝素，10μg/mL胰岛素，200μg/mL全铁转铁蛋白、1IU促红细胞生成素(Epo)、10ng/mL干细胞因子(SCF)和1ng/mL IL-3的IMDM中，以105-106个细胞/毫升(mL)的密度培养细胞。在第2阶段(第7-12天)，从培养基中省略IL-3。在第3阶段(第12-18天)，细胞以106个细胞每毫升的密度培养，从培养基中省略IL-3和SCF，并且全铁转铁蛋白浓度增加至1mg/mL。细胞在37℃和5％CO2下培养。为进行慢病毒感染，在第1天将培养基更换成病毒上清液连同8μg/mL聚凝胺和EPO、IL-3和SCF，并在室温下以2000rpm离心90分钟。感染12小时后，将细胞置于1μg/mL嘌呤霉素中36-48小时。
作为替代方法，本发明人还通过在红系分化起始和开始第1阶段培养之前加入持续总共5天的扩增阶段开发了上述的红系培养方法的改编版。最近的研究已表明，这种方法可以导致红系细胞的显著扩增，并可以改善成熟的RBC生产(Lee等人，2015)。与所报道的结果相似，本发明人发现，作为我们的标准三阶段培养方法，这允许增加的扩增和同等的分化。在扩增期间，>85％的细胞保留CD34+。如前所述，扩增介质由StemSpan II无血清扩增培养基(Stem Cell Technologies)和由FLT3L、IL-3、IL-6和SCF(Stem Cell Technologies)构成的1X CC100细胞因子混合物组成(Sankaran等人，2011；Sankaran等人，2008)。培养基每2-3天更换一次，细胞维持在105-106个细胞/毫升(mL)之间的密度。如上所述，在该扩增期的第2天进行慢病毒感染并进行选择。
蛋白质印迹
在培养的第9天收获1-2×106个细胞，将其在PBS中洗涤两次，重悬于RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％SDS、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠)并在原钒酸钠、蛋白酶抑制剂混合物和PMSF的存在下在冰上裂解30分钟，期间进行间歇性混合。通过离心除去细胞碎片后，将上清液转移到新管中，蛋白质浓度混以加载染料并在95℃下孵育5分钟来确定。使用预制凝胶(BioRad)和1％Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液进行SDS-PAGE分析。将蛋白质转移到在Tris/甘氨酸中的10％甲醇中的硝酸纤维素膜上。将膜用补充有3％BSA的TBS-T封闭1小时，并在室温下与一级抗体孵育1小时或在4℃下孵育过夜。在TBS-T中洗涤四次10分钟后，将膜与二级抗体在室温下孵育1小时。在TBS-T中洗涤另外40分钟并在ECL-底物(BioRad)中孵育5分钟后，通过暴露于经处理的膜的科学成像薄膜来可视化蛋白质。将LNK/SH2B3绵羊多克隆抗体(AF5888，R&D Systems)和GAPDH小鼠单克隆抗体(6C5，sc-32233，Santa Cruz)作为一级试剂，将山羊抗小鼠(170-5047，BIORAD)和驴抗绵羊(713-035-147，Jackson Immuno Research)HRP-偶联抗体作为二级试剂。为进行所示蛋白质印迹，通常在培养的第9天收获细胞。
流式细胞术
收集细胞，并在FACS缓冲液(PBS+3％BSA)中以300×g洗涤两次5分钟。为进行分化分析，将细胞随后用在FACS缓冲液中1:20稀释下的以下抗体在冰上染色10-15分钟：APC缀合的抗人CD235a(17-9987，eBioscience)、FITC缀合的抗人CD71(11-0719，eBioscience)、PE缀合的抗人CD41a(12-0419，eBioscience)和PE缀合的抗人CD11b(12-0118，eBioscience)。在此处，细胞另外用1μg/mL Hoechst 33342(Life Technologies)染色，并在室温下孵育20分钟。通过用FACS缓冲液洗涤两次来除去未结合的抗体，然后将沉淀物以1:20稀释重悬于补充有碘化丙啶(PI)染色剂(100-6990，eBioscience)的FACS缓冲液中，并转移到FACS管中用于随后FACS Canto II或LSR II(BD Bioscience)流式细胞仪上的分析。使用Flow Joe(Tristar)和FACS Diva(BD Bioscience)软件包分析细胞，从分析中圈门选出PI阳性细胞、细胞碎片和聚集体。
May-Grünwald-Giemsa染色
收获约50,000-200,000个细胞，以300×g洗涤一次5分钟，重悬于200μL的FACS缓冲液中，并用Shandon 4(Thermo Scientific)细胞离心机以300rpm、4分钟旋转到聚-L-赖氨酸涂布的显微镜载玻片上。当明显干燥的载玻片转移到May-Grünwald溶液(Sigma-Aldrich)中5分钟时，在H2O中冲洗4次每次30秒，并转移至Giemsa溶液(Sigma-Aldrich)15分钟。如上所述洗涤载玻片，并在干燥后装上盖玻片，在第二天进行检查。所有显示的图像都以AxioVision软件(Zeiss)以100倍放大倍率进行拍摄。
构建体
使用靶向SH2B3的shRNA构建体，其具有以下序列：sh83(CCGGCCTGACAACCTTTACACCTTTCTCGAGAAAGGTGTAAAGGTTGTCAGGTTTTTG)(SEQ ID NO:1)和sh84(CCGGGCCTGACAACCTTTACACCTTCTCGAGAAGGTGTAAAGGTTGTCAGGCTTTTTG)(SEQ ID NO:2)。两种构建体都在pLKO.1-puro慢病毒载体中。慢病毒载体pLKO-GFP和pLKO.1-puro萤光素酶(the RNAi consortium of the BroadInstitute of MIT and Harvard)作为对照。
细胞分裂分析
在分化的第5天，根据制造商的方案，用PKH26(PKH26GL，Sigma Aldrich)标记相等数量的SH2B3-KD和对照细胞。简言之，将细胞以IMDM(无血清添加)洗涤，并重悬于稀释剂C中。在染色之前即刻，制备4×10-6M PKH染料溶液，并以等体积快速加入细胞悬浮液中。孵育5分钟后，通过加入人AB血清终止染色反应，并通过在没有EPO、SCF或IL-3的第1阶段培养基中洗涤3次来除去未结合的染料。标记后即刻以及在分化的第7天和第9天在Canto 2(BDBioscience)流式细胞仪上获得PKH26的平均荧光强度(MFI)。细胞分裂数x如前述估算(Sankaran等，2012)：x＝(log((MFI 0h)/(MFI yh)))/(log2))。
曙红-5-马来酰亚胺(EMA)-结合试验
收获2-4×106个细胞，用PBS洗涤，随后用King等人(2000年)最近描述的用曙红-5-马来酰亚胺(Life Technologies)进行标记。简言之，将沉淀的成熟RBC重悬于25uL的0.5mg/mL EMA中，并伴随仔细的间歇混合在黑暗中孵育1小时。通过在PBS+3％BSA中洗涤3次来除去未结合的染料，然后将细胞与APC-缀合的抗人CD235a(eBioscience)以1:20稀释在室温下孵育另外10分钟。在去除如上所述的未结合的抗体后，将沉淀重悬于FACS缓冲液中并在Canto 2(BD Bioscience)流式细胞仪上分析样品，在PE通道中在564-606nm检测EMA的发射。
Advia
在分化第17天收获约5×107个细胞，将其离心并重悬于300μL PBS中，并在Advia2120i(Siemens Healthcare)上进行分析。
基因表达分析
对于SH2B3KD(sh83和sh84)和对照样品(shLuc)的成红细胞(分化的第7天)进行微阵列(GeneChip Human Gene 2.0STArrays，Affymetrix)。使用R 3.2(Carvalho和Irizarry，2010)中的oligo包的RMA算法处理和归一化原始文件。使用limma(Ritchie等人，2015)进行差异表达分析。热图显示在SH2B3KD中以大于0.5的log2倍变化和0.001的p值阈值显著上调的基因的标准化表达值(Z-分数)。由于每组有n＝3个样品，除了使用基因集置换代替样品置换以外，通过比较组合的SH2B3KD与标准选项的对照样品进行基因集富集分析(GSEA)，(Subramanian等人，2005)。我们通过鉴定与集落形成单位红系细胞(CD71+/CD235a-)相比，在中间成红细胞(CD71+/CD235a+)中表达显著更高的前200个基因，得出了红系分化特征基因集(Merryweather-Clarke等人，2011)。所有数据已存入GeneExpression omnibus(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，登录号为GSE67219。
人ESC中的CRISPR/Cas9基因组编辑
为进行人胚胎干细胞系(hESC；HUES9)中的SH2B3敲除，将共同表达具有CAG启动子的密码子优化的化脓性链球菌Cas9和EGFP的质粒和表达含人U6启动子的向导RNA(gRNA)的质粒共转染。为了靶向SH2B3，使用以下前间区序列和前间区序列邻近基序(PAM)：5'-GCTCCAGCATCCAGGAGGTC-CGG-3'(SEQ ID NO：4)
或者，使用gRNA：5'-GTGTGCACCACCGGACCTCCTGG-3'(SEQ ID NO：3)
在Geltrex基质包被的组织培养板上在补充有青霉素/链霉素的mTeSR1中初始培养hESC。使用Accutase在ROCKi存在下将细胞解离，随后在单个比色皿中用25μg各质粒电穿孔1000万个单细胞。将细胞再铺板，48-72小时后用accutase处理，收集并重悬于PBS中。通过FACS(FACSAria II，BD Bioscience)分选EGFP表达细胞，并以15,000个细胞/板接种在生长培养基中并使其恢复7-10天。之后，人工挑选单个集落并在96孔板的孔中单独再铺板，生长另外7天接近汇合，并进行accutase处理以产生冷冻原液。采用PCR筛选来鉴定SH2B3中具有复合杂合或纯合的移码缺失的集落。线BB5、DB3和BF4具有纯合或复合杂合的移码突变，产生SH2B3敲除并用于分化分析。本发明人使用具有完整野生型SH2B3等位基因的等基因系BA3、BA6和BB1作为分化分析的对照。
hES细胞的维持和红系分化
将hESC在含有0.75-1.0×106个小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的六孔组织培养板中，在每天更换的含有补充有20％KSR、100μL非必需氨基酸溶液、50U/mL青霉素、50g/mL链霉素、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.075碳酸氢钠和0.1mMβ-巯基苯酚的DMEM的HES培养基中，在37℃和5％CO2下以90％的最大汇合度维持。对于传代，用TrypLE处理细胞，用培养基冲洗并加入10μM ROCKi后，为防止凋亡集落被刮成小块，抽吸细胞并在混合后在含有MEF的平板上，以在HES培养基中1/7的总稀释倍数再铺板。对于MEF耗尽，如上所述收获hESC，并在37℃、5％CO2、5％O2和90％N2下，在含有5ng/ml bFGF和10μM ROCKi的HES培养基中以1-1.5×105每毫升的密度再铺板在Matrigel涂布的培养皿上。每24h通过更换为不含ROCKi的新鲜培养基饲养细胞。在MEF耗尽后2-3天达到约70％的汇合后，依据表3描述的顺序培养基和细胞因子变化，通过在日常饲养方式下培养细胞来引发向造血祖细胞(HPC)的分化。细胞在37℃、5％CO2、5％O2和90％N2下保持在Matrigel涂布的培养皿中8-9天，直到出现明亮的圆形松散贴附的HPC，通过小心地去除上清液来收集。随后取出一等份试样的细胞，如下所述进行流式细胞术以评估CD41a和CD235a双重阳性专能HPC的存在。为了进一步分化成原始成红细胞，将HPC以335Xg旋转，重悬于含有补充有50μg/ml抗坏血酸、0.45mM MTG、50ng/ml SCF和2单位/ml EPO的SFD的红系扩增培养基(EEM)中。每1-2天更换一次培养基。用血细胞计数器仔细计数细胞，并在指定的时间点通过流式细胞术进行分析。
表3显示培养基和补充剂的PSC分化为HPC的时间表
天 培养基* BMP4*** VEGF Wnt3a BFGF SCF Flt3L IL-6
0-1 RPMI 5 50 25
2 RPMI 5 50 20
3 SP34 5 50 20
4-5 SP34 15 5
6 IMDM** 50 50 50 5
7-9 IMDM** 50 50 50 5 10
*全部补充有2mM谷氨酰胺、50μg/mL抗坏血酸和4*10-4单硫代甘油
**补充有0.5％N2、1％B27，不含维生素A和0.05％BSA
***细胞因子浓度为ng/mL
统计分析
所有成对比较通过不配对双尾学生t检验进行评估。如果P值低于0.05，则结果被认为是显著的。
实施例1
专能和多能干细胞是细胞和组织替代疗法的潜在来源。例如，干细胞衍生的红细胞(RBC)是捐血的潜在替代方案，但产量和质量仍然是一个挑战。在这里，本发明人证明，应用人类群体遗传研究的洞察可以增强干细胞的RBC产生。本发明人发现SH2B3基因编码细胞因子信号传导的负调节因子，并且该基因的天然存在的功能丧失变体增加体内RBC计数。原代人造血干细胞和祖细胞中SH2B3的靶向抑制增强体外来源的RBC的成熟和总产量。此外，本发明人证明，通过人多能干细胞中CRISPR/Cas9基因组编辑的SH2B3的失活允许增强的红系细胞扩增与保留的分化。因此，发明人已经证明，可以使用基因组编辑方法来改进再生医学的细胞和组织生产。
关于使用干细胞作为细胞替代疗法的来源，有显著的意义(Fox等，2014)。来自造血干细胞和祖细胞(HSPC)的体外分化红细胞(RBC)已经在临床试验中成功地输给接受者(Giarratana等人，2011；Migliaccio等人，2012)并且使用包括人胚胎干细胞(hESCs)和诱导的PSC(iPSC)的多能干细胞(PSC)的类似方法正在研究中(Kobari等人，2012；Slukvin，2013；Sturgeon等人，2013)。然而，利用这些干细胞来源进行RBC生产受限于完全成熟细胞的低产量，使得该过程成本高且效率低(Migliaccio等人，2012；Rousseau等人，2014)。克服这些主要局限性可能会增强管理血液供应的能力(Williamson和Devine，2013)。
许多持续的努力集中在优化培养方法以改善各种干细胞来源的RBC生产(Huang等，2015；Rousseau等，2014)。一种补充方法是调查是否可以操纵调节体内RBC产生的人类基因以在体外增强这一过程。最近RBC性状的全基因组关联研究(GWAS)和随后的精细定位确定了导致R262W置换的、与血红蛋白水平和RBC体内计数显著相关的SH2B3基因(rs3184504)中常见的编码单核苷酸多态性(SNP)(van der Harst等人，2012)。SH2B3是负调节造血细胞的细胞因子信号传导的含SH2和PH结构域的蛋白质。具有SH2B3无效突变的小鼠具有正常的血红蛋白和RBC计数，表明人特异性的RBC产生(红细胞生成)功能(Bersenev等人，2008；Velazquez等人，2002)。与增加的RBC计数和血红蛋白水平相关的rs3184504变体被认为是亚效等位基因(McMullin等人，2011；van der Harst等人，2012)。与这种可能性一致的是，罕见的功能丧失(LoF)SH2B3等位基因与RBC计数和血红蛋白水平的较大升高(红细胞增多症)相关(Lasho等人，2010；Spolverini等人，2013)。为了将该观察结果扩展到基于群体的队列(cohort)，本发明人检测了一组4,678个个体，将其进行全外显子测序，并在具有罕见的推定的SH2B3的破坏性错义(damaging missense)或LoF变体的个体中观察到较高的血红蛋白/血细胞比容值(数据未显示)。
本发明人接下来试验了SH2B3的抑制是否可以在体外增强红细胞产生。本发明人使用慢病毒载体在被诱导进行红系分化的成体CD34+HSPC中表达靶向SH2B3的短发夹RNA(shRNA)(图13A和1B)。尽管如通过细胞表面表型(CD71的损失，以及CD235a的获取)确定的红系成熟发生较早(图3A和3B，但具有sh83(SEQ ID NO：1)和sh84(SEQ ID NO：2)shRNA的SH2B3敲除(例如功能丧失或LoF)的培养物与对照类似地分化。有趣的是，本发明人发现SH2B3敲除成红细胞中的去核增加了1.6至2倍(图4)。这些观察通过分析细胞形态来证实，细胞形态分析证明了改善的成熟、更好的血红蛋白合成和更大的去核(图5)。来自SH2B3敲除培养物的成红细胞的基因表达分析显示与对照(图13C)具有全局相似的特征，伴有与末端红系成熟相关的基因的表达增强(图13D)。本发明人在去核数日后将培养物维持培养，且与SH2B3敲除培养物相比在对照中并未观察到任何成熟改善。
由于具有SH2B3敲除的细胞似乎更容易进行红系分化，本发明人评估其可能损害RBC产量的增殖潜能是否被抑制。令人惊讶的是，与对照相比，具有SH2B3敲除的成体HSPC扩增到显著更大的程度(图7和图6)。扩展的总体增加发生在分化过程的多个阶段，表明SH2B3抑制在不同的分化阶段增强了多种信号传导途径(图6)。观察到的效果不是由于次优细胞因子浓度，这是因为细胞在它们表现出最大扩增的促红细胞生成素(EPO)和其他细胞因子浓度中培养(图15A)(Abkowitz等人，1991)。总体而言，成熟RBC的产量通过抑制SH2B3扩大3至5倍(图7)。本发明人在CD34+脐带血HSPC中进行类似的SH2B3敲低，已知CD34+脐带血HSPC与成体HSPC相比在红系分化期间显示出超过10倍的更大扩增(Giarratana等人，2011；Migliaccio等人，2012；Rousseau等人，2014年)。在这些培养物中，SH2B3敲除使去核的RBC产量进一步提高2至4倍(图14A)。此外，本发明人还利用最近描述的将成体CD34+HSPC引入祖细胞扩增步骤的培养方法(Lee等人，2015；Ludwig等人，2014；Sankaran等人，2011)的改编。在这种情况下，本发明人发现RBC的扩增和总产量的增加甚至更大，达5-7倍(图14B)，表明SH2B3抑制增强来自HSPC的RBC产生的普遍适用性。
实施例2
本发明人接下来评估了抑制SH2B3能够增强红系分化和扩增的机制。通过膜联蛋白V染色评估的凋亡细胞的级分在成体HSPC中不受SH2B3抑制的改变(图15B)。SH2B3敲除的细胞在检测的4天分化周期内经历0.5-1个额外的细胞分裂(图8A，8B)(Sankaran等人，2012)。SH2B3负调控参与红细胞生成的多种细胞表面信号传导受体(包括EPO、KIT和整联蛋白受体)下游的信号传导(Gery和Koeffler，2013；McMullin等人，2011)。因此，通过SH2B3抑制来增强STAT5和KIT受体的磷酸化和早期EPO应答基因的表达(图15C和图15D)(Moraga等人，2015)。本发明人通过限制HSPC分化培养物中两种细胞因子的浓度，证实EPO和KIT/SCF通路对于SH2B3抑制时所观察到的增强的重要性(图15E)。SH2B3抑制允许类似于基线对照的红系扩增，伴有EPO或SCF的水平降低，突出了SH2B3在原代红系细胞的两种途径中的作用。因此，通过增强EPO和KIT信号传导途径，SH2B3敲除或抑制似乎促进红系扩增和成熟。
实施例3
由于本发明人发现，通过SH2B3敲除或抑制，来自人HSPC的红系细胞的产生似乎增加，本发明人检测了体外产生的RBC是否与对照相比发生了改变。RBC的平均体积在由对照和SH2B3敲除培养物产生的那些RBC之间是类似的(对照中平均值为108.7，相比而言，在sh83(SEQ ID NO：1)和sh84(SEQ ID NO：2)SH2B3 shRNA中为110.1和104.7毫微微升(femtoliter))。这些值在人类成年人中发现的网织红细胞(未成熟RBC，相当于培养物中产生的那些)的103-126毫微微升的正常范围内(d'Onofrio等人，1995)。此外，SH2B3 shRNA敲除改善了血红蛋白合成，在sh83和sh84处理的细胞中平均血红蛋白含量分别为27和26.7皮克(pg)，相比之下，对照组为25.4(人成体网织红细胞通常具有25.9-30.6pg的浓度；d'Onofrio等人，1995)。RBC膜的病症，如遗传性球状红细胞增多症，通过染料曙红-5-马来酰亚胺(EMA)的结合变化来临床诊断(Perrotta等人，2008)。本发明人发现，在SH2B3 LoF RBC和对照之间，EMA染色是相当的，表明RBC细胞骨架的正常形成(图9)。另外，包括Rh血型(图16A)和CD44的RBC抗原的表面表达和细胞质丙酮酸激酶的活性在SH2B3LoF RBC和对照之间是相似的(图16B)。来自SH2B3敲除和对照细胞的RBC血影显示相同的蛋白质模式，为正常的RBC成熟提供独立的量度(图16C)。本发明人还发现正常血红蛋白亚单位存在于RBC中，其中SH2B3 shRNA的敲除导致胎儿血红蛋白(HbF)产生的少量增加，这与在红细胞生成早期加速下观察到的HbF的已知增加一致(图16D)(Sankaran和Orkin，2013)。总体而言，这些结果表明，尽管分化和扩增显著改善，但是RBC的生理学在源自SH2B3敲除HSPC的细胞中没有受到损害。
总体而言，本发明人已经证明降低SH2B3表达可以改善用于输血目的的RBC的体外生产。虽然病毒介导的到原代CD34+HSPC的shRNA递送可能无法大规模实施，但应该可以在可用于RBC生产的自我更新的细胞系中破坏SH2B3基因(Rousseau等人，2014)。尽管近期的进展是有希望的(Hirose等人，2013；Huang等人，2014；Kurita等人，2013)，但没有永生化的人类细胞系允许一致的分化成成熟的RBC。然而，PSC可以容易地用已建立的方案分化成红系谱系(Huang等人，2015；Kobari等人，2012；Mills等人，2014；Slukvin,2013；Sturgeon等人，2014)(图16E)。
实施例4
在本文中，本发明人还使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑将在SH2B3或完整WT等位基因中含有纯合的移码缺失的等基因hESC系进行工程化(图16E和16F)(Ding等人，2013a，2013b；Gupta和Musunuru，2014；Veres等人，2014)。在体外分化hESC以产生具有红系、巨核细胞和骨髓潜能的专能造血祖细胞(HPC)(Kennedy等人，2012；Mills等人，2014；Sturgeon等人，2013)(图14E)。在分化的WT和SH2B3敲除的hESC之间没有观察到专能CD41a+/CD235a+HPC的产量的差异(Mills等人，2014)。然而，在研究的多个独立的等基因hESC系中，SH2B3的损失增强了红系细胞产生达超过3倍(图12A，图12B和图16G)。
重要的是，成熟的WT和SH2B3敲除成红细胞表现出类似的形态、红系细胞表面标志物的表达和球蛋白基因表达模式(图13D，图15E和图16H)。虽然PSC红系分化方案继续进行细化，但尚未针对RBC制造进行优化，并且主要产生最早的造血波，相当于由卵黄囊发育产生的那些(Kobari等人，2012；Slukvin，2013；Sturgeon等人，2014)，目前的研究结果表明SH2B3的稳定扰动可以允许改善红系分化和扩增。
据估计，使用现行体外分化方案，由HSPC生产一个单位的RBC将花费8,000至15,000美元，而正常的供体来源单位的成本则低于该量的十分之一(Migliaccio等人，2012；Rousseau等人2014)。虽然培养方法的改进和诸如生物反应器等系统的使用对于改进该过程可能是非常有价值的，但为刺激红细胞生成的干细胞源的内在改变应进一步优化该过程。据我们所知，这尚未经过试验。
这里，本发明人证明通过扰乱SH2B3基因，例如抑制SH2B3功能可用于改善干细胞来源的造血祖细胞扩增和分化成红系谱系的能力。重要的是，本发明人在本文中证明，通过抑制SH3B3的扩增和分化的改善超过了通常由简单地优化这些培养物中的细胞因子浓度来实现的最大扩增，这说明靶向内在调控途径的补充益处。由SH2B3抑制产生的产量增加允许以估计低于当前方法的五分之一的成本并以较少的起始干细胞从HSPC产生RBC。因此，单个RBC单位估计需要2500万CD34HSPC，并且SH2B3的扰动应将所需的起始细胞数量减少至500万(Migliaccio等人，2012)。随着技术的进步，可以进一步改善该过程的成本和效率。重要的是，本发明人的发现表明，SH2B3的抑制改善了来自多种人类干细胞来源的红系分化，而不管使用的分化方法如何，并且该过程可用于治疗目的，并且有助于对供血的不断增长的需求(Williamson和Devine，2013)。
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说明书和实施例中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。
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Claims (29)

1.一种从干细胞和/或祖细胞群离体产生红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：
(iv)抑制干细胞和/或祖细胞群中的SH2B3；
(v)培养干细胞和/或祖细胞群以足以诱导至少一种干细胞或祖细胞分化为RBC的时间；和
(vi)收集红细胞群。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制降低SH2B3蛋白水平、SH2B3 mRNA水平、SH2B3蛋白活性或其组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抑制包括使干细胞和/或祖细胞群与基因组编辑剂接触，用于从至少一种干细胞或祖细胞靶向切除SH2B3基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因组编辑剂选自由锌指核酸酶(ZFN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)组成的组。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述基因组编辑剂存在于载体中。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抑制包括使干细胞和/或祖细胞群与SH2B3的拮抗剂接触。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述SH2B3的拮抗剂选自由无机分子、有机分子、核酸、核酸类似物或衍生物、肽、肽模拟物、蛋白质、抗体或其抗原结合片段、及其组合组成的组。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中SH2B3的拮抗剂特异性结合SH2B3蛋白的SH2结构域、PH结构域或SH2和PH结构域两者。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述SH2B3的拮抗剂是抑制SH2B3表达的RNAi试剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述RNAi试剂是与SH2B3 mRNA杂交的miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群选自由造血干细胞、造血祖细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞及其组合组成的组。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述方法增加来自干细胞和/或祖细胞群的RBC的扩增。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法提高RBC的质量。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群是哺乳动物来源的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群是人源的。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述RBC通过白细胞过滤或流式细胞分选来分离。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群从供体受试者获得。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞群来自所述供体受试者的外周血单个核细胞、脐带血、骨髓、脐带组织或G-CSF动员外周血。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其还包括向有需要的受试者施用RBC群，其中所述RBC由从所述供体受试者获得的干细胞和/或祖细胞群产生。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述干细胞群是iPSC。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的方法产生的RBC群。
22.一种包含RBC群和干细胞和/或祖细胞群的混合物，其中所述RBC根据权利要求1-19中任一项所述的方法产生。
23.一种血库，其包含根据权利要求21所述的RBC群。
24.根据权利要求23所述的血库，其中制备多个RBC群用于低温储存。
25.一种细胞培养基，其包含干细胞和/或祖细胞群、从至少一种干细胞或祖细胞分化的至少一种RBC、和SH2B3的拮抗剂。
26.一种诱导干细胞和/或祖细胞群分化成红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：
(iii)将干细胞和/或祖细胞群与SH2B3的拮抗剂接触，并培养干细胞和/或祖细胞群以足以诱导至少一种干细胞或祖细胞分化为RBC的时间，其中所述SH2B3的拮抗剂降低SH2B3蛋白的活性或降低SH2B3 mRNA或蛋白水平；和
(iv)收集红细胞群。
27.一种诱导干细胞和/或祖细胞群分化成红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：
(iii)将干细胞和/或祖细胞群与基因组编辑剂接触并培养干细胞和/或祖细胞群以足以诱导至少一种干细胞或祖细胞分化为RBC的时间，其中所述基因组编辑剂从至少一种干细胞或祖细胞中切除SH2B3基因；和
(iv)收集红细胞群。
28.一种向受试者施用RBC群的方法，其包括向所述受试者施用有效量的RBC，其中所述RBC已经与有效量的SH2B3的拮抗剂离体或体外接触，其中所述SH2B3的拮抗剂降低SH2B3蛋白的活性或降低SH2B3 mRNA或蛋白水平。
29.一种向受试者施用RBC群的方法，其包括向所述受试者施用有效量的RBC，其中所述RBC由已经与有效量的基因组编辑剂离体或体外接触的干细胞和/或祖细胞群产生，其中所述基因组编辑剂从至少一种干细胞或祖细胞中切除SH2B3基因。
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