CN112143697A - 一种促进胚胎干细胞增殖和分化的方法 - Google Patents

一种促进胚胎干细胞增殖和分化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种改进的诱导胚胎干细胞生产红细胞的方法，所述方法通过优化培养和诱导步骤，特别是加入诱导肽以及miRNA之后，使得诱导得到的红细胞的生理特性与正常红细胞接近，通过小鼠模型验证了所述红细胞的生物学功能，证明了本发明诱导分化得到的红细胞可以用于商业化应用，具有较好的应用价值。

Description

一种促进胚胎干细胞增殖和分化的方法
技术领域
本发明涉及制药领域，更具体的涉及一种促进胚胎干细胞增殖和分化的方法。
背景技术
据WHO统计，每年全世界输血达9000万次以上。目前红细胞和其他血液制品主要来源于志愿者外周血捐献，但世界上仍有73个国家的献血率不能满足一个国家的最基本血液需求。全世界每年有数百万需要输血的患者因不能及时获得安全血液而死亡。另外，由志愿者捐献的血液制品存在着一些不安全因素，其中首推通过血液途径传播的病原微生物及其代谢产物的污染，因此安全用血仍是全球性问题。据估计全世界每年因输入不安全血液而导致的乙型和丙型肝炎病毒感染新发病例为上千万例。在二十世纪八十年代中以及九十年代初期，因不安全输血导致艾滋病毒感染的比率高达10％。此外，稀有血型的供者缺乏问题给输血带来新的挑战。
多能干细胞包括胚胎干细胞(ESC)和近年兴起的诱导性多能干细胞在体外可以无限制复制和扩增，并且理论上在特定条件下可以定向分化为人体所有的组织细胞，为人类再生医学和细胞替代治疗提供了永不枯竭的无需供者的细胞来源。
多能干细胞向红细胞诱导分化是一个持续诱导，逐步成熟的过程，包括中胚层的诱导、造血内皮转换、造血系的定向，再到红系祖细胞形成，最后是红细胞分化和成熟。目前以多能干细胞诱导为红细胞主要有两个途径，即与基质细胞共培养法和拟胚体(EB)形成法。拟胚体法是指在特定的诱导条件下，多能干细胞在悬浮培养条件下聚集分化形成的由三个胚层细胞组成的立体结构，这其中也包括造血细胞，在EB形成过程中，添加特定的细胞因子可促进多能干细胞向中胚层分化，提高相应造血干细胞的比例。基质细胞共培养法是将造血微环境来源细胞与多能干细胞共培养，为多能干细胞向造血干细胞和红细胞分化成熟提供多种促进因子。二者均模拟体内造血发生过程，首先获得源于多能干细胞的造血干细胞，再将造血干细胞进一步诱导分化，最终得到较成熟的红细胞。
干细胞诱导成红细胞是指以胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)或造血干细胞(HSC)为材料，在体外经过一系列诱导分化，使其产生红细胞的过程。 1993年Keller等首次从ESC中分离出红细胞集落；随后他们开始尝试在含有促红细胞生成素和细胞因子的培养基中人工造血。2010年起，iPSC作为遗传性红细胞生成障碍性血液病的治疗手段开始在临床上逐渐发挥作用；由于iPSC能够有效避免ESC使用时的伦理问题，并且在生成效率和体外培养成本等方面具明显的优越性，iPSC体外培养生成红细胞已经成为大多数研究中的主要干细胞来源。同样，HSC用于诱导生成红细胞的研究也在进行中，由粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员外周血(peripheral blood，PB)或脐带血(umbilical-cord blood，UCB)2种不同途径获得的HSC在多项研究中被证明能够最终诱导分化为成熟红细胞。1993年,Wiles实验室通过EB分化实验得到了成熟的小鼠红细胞。在ESC分化培养后的8天得到的EB加入细胞因子促红细胞生成素 (erythropoietin,EPO)和KL(Kit-Ligand)继续培养10到14天得到了大部分红细胞的克隆。1997-1999年,Lindern和Wessely等陆续报道了人工合成的类糖皮质激素地塞米松(dexamethasone)在红细胞前体细胞的自我更新过程中发挥重要作用。2004年,Beug实验室通过三步法将EB分化得到的红细胞前体细胞扩增到107倍。
红细胞生成是受多因素调节的个体分化发育的重要生理过程。迄今，微小R NA的发现和功能研究证实miRNA可通过多种形式调控基因表达，在红细胞生成过程中扮演重要角色，与红系生成分化相关。研究表明上调miR-451可体外诱导小鼠胚胎干细胞红细胞分化成熟，无需细胞因子的刺激作用即可促进人红细胞生成增多。miR-4732-3p抑制SMAD2/4依赖性TGF-β信号传导，从而促进红细胞分化过程中的细胞增殖。
近年来体外多能干细胞向造血系定向分化的研究取得了很大的进展，但结果都表明诱导分化来的红细胞效率以及功能都还有很大的改进空间。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种改进的诱导胚胎干细胞生产红细胞的方法。
本发明一方面提供的生产方法中可以高浓度的获得红细胞，另外一方面所述红细胞具有较高的脱核率。
本发明所述的胚胎干细胞是商业化的细胞系，即HES3.1细胞，货号：ml-cs-0242，上海酶联生物科技有限公司。
本发明另外一方面，提供一种胚胎干细胞诱导生成红细胞的方法。
进一步的，所述方法包为取对数增长期的hES细胞，清洗，消化后，添加ES 细胞培养液，反复吹打皿底，细胞脱落并分散成大小均匀的小细胞片，接种于种好MEF细胞的培养皿中，培养，待生长形成EBs后，将EBs移入离心管中离心，弃去上清，用培养液重悬细胞EBs。将细胞置于细胞培养箱中培养。将培养4d 天的EBs接种于胎肝基质细胞饲养层上进行诱导培养4天。用Stemline II造血培养基重悬细胞，取细胞悬液与造血培养基震荡混匀。随后，将液体接种到低吸附细胞培养皿中，培养5d，在细胞培养皿内添加Stemline II造血培养液，孵育3d，添加与培养皿内添加等体积的Stemline II造血培养液，继续放置在培养箱内3d。将培养皿内的液体转移至低吸附细胞培养皿，并加入与培养皿内液体等体积的含有50ng/mL的SCF，3unit/mL的EPO的Stemline II造血培养基的培养液，置于培养箱内孵育5d。随后加入1/2培养皿内液体体积的 Stemline II造血培养基的培养液。每3d更换一次，共更换2次。随后加入培养皿内液体5倍体积的IMDM培养基,离心收集细胞。用IMDM培养基润洗细胞2次，并用含0.5％BSA的IMDM重悬细胞，将其接入组织培养瓶中过夜培养。收集组织培养瓶内的细胞，用Stemline II造血培养基的培养液重悬细胞，保持一定的细胞密度，每2d换液一次，换2次后，收集培养皿内的细胞，用培养基培养液重悬细胞，放入细胞培养箱中继续诱导即可获得相应的诱导红细胞。
本发明进一步的，提供了所述方法诱导的红细胞在制备用于治疗贫血的产品中的用途。
所述贫血可以是先天性贫血，也可是创伤性失血。
进一步的，本发明提供了一种药物组合物，所述组合物中含有所述方法诱导获得的红细胞以及药学上可接受的载体。
本发明还提供了向有此需要的患者提供红细胞的方法。在一些实施方式中，这些方法包括将包含通过本发明的方法制备的血细胞的组合物输送至患者的循环系统内。
本发明还提供了治疗有此需要的患者中红细胞减少症的方法。在一些实施方式中，这些方法包括将包含通过本发明的方法制备的红细胞的组合物输送至患者的循环系统内。在一些实施方式中，该红细胞减少症是由至少一种以下情况所导致的：红细胞生成减少、红细胞破坏增加和药物。在一些实施方式中，该红细胞由商业化的胚胎干细胞分化。
有益效果
本发明提供了一种改进的诱导胚胎干细胞生产红细胞的方法，所述方法通过优化培养和诱导步骤，特别是加入诱导肽以及miRNA之后，使得诱导得到的红细胞的生理特性与正常红细胞接近，通过小鼠模型验证了所述红细胞的生物学功能，证明了本发明诱导分化得到的红细胞可以用于商业化应用，具有较好的应用价值。
附图说明
图1细胞脱核检测结果图
具体实施方式
为了更进一步的说明本发明的目的、技术方案和优点，我们结合以下具体实施例来阐述本发明，这些实施例仅为了更好的说明本发明专利，而不用于限制本发明范围。基于本发明中的实施例，本领域的技术人员在没有做出创造性的情况下所得到的其他所有实施方式均属于本发明所保护的范围。
实施例1hES细胞诱导生产红细胞
(1)取对数增长期的hES细胞(HES3.1细胞，货号：ml-cs-0242，上海酶联生物科技有限公司)，弃培养液，用EBSS液洗一遍，加入4mlEBSS 液和1ml浓度5mg/ml的IV型胶原酶，37℃消化10min左右，镜下见细胞集落间边界清晰，集落内部细胞松解开，弃消化液用EBSS洗一遍，添加ES细胞培养液，反复吹打皿底，细胞脱落并分散成大小均匀的小细胞片，以1：8比例接种于种好MEF细胞的培养皿中，置于37℃、含6％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待生长形成EBs后，将EBs移入离心管中200rmp/min离心4min，弃去上清，用培养液重悬细胞EBs(培养液组成为20％终浓度的SR、青霉素 100IU/ml、链霉素100ug/ml、L-谷氨酰胺2mM、NEAA终浓度0.01％、bFGF 4ng/ml、 10ng/ml BMP4、20mg/ml IL-3、10ng/mL SCF)。将细胞置于细胞培养箱中培养。将培养4d天的EBs接种于胎肝基质细胞饲养层上进行诱导培养4天，培养基为 (20％终浓度的SR、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml、L-谷氨酰胺2mM、NEAA 终浓度0.01％、bFGF 4ng/ml、10ng/ml BMP4、20mg/ml IL-3、10ng/mL SCF、5 ng/mL hVEGF，10ng/mL hBMP4，100ng/mL hSCF,20ng/mL hIL-6,2U/mL hEPO, 40ng/mL hIL-3，10ng/mLIL-11和10ng/mL Flt3-L，50ng/mL的诱导肽 YEDPKSPRRHNQVPSMVT)。将诱导4天后的细胞群消化，使用si PORT Neo FX转染试剂将miR-705转染所述细胞，收集阳性细胞并用StemlineII造血培养基重悬细胞，取2×104个细胞悬液与3mL含有50ug/mL的VEGF，25ug/mL的Flt3ligand，8ug/mL的bFGF，1％的青霉素和1％的链霉素Stemline II造血培养基震荡混匀。随后，将液体接种到低吸附细胞培养皿中，培养在37℃，5％CO2 的培养箱中培养5d，在细胞培养皿内添加2mL培养基组成为50ug/mL的VEGF， 25ug/mL的Flt3ligand，8ug/mL的bFGF，1％的青霉素和1％的链霉素的Stemline II造血培养液，此时需注意不能搅动培养液中细胞克隆，将细胞放入培养箱中孵育3d，添加与培养皿内添加等体积的组成为3units/mL的EPO，50ug/mL的 VEGF，25ug/mL的Flt3ligand，8ug/mL的bFGF，1％的青霉素和1％的链霉素的 Stemline II造血培养液，继续放置在培养箱内3d。将培养皿内的液体转移至低吸附细胞培养皿，并加入与培养皿内液体等体积的含有50ng/mL的SCF，3 unit/mL的EPO的Stemline II造血培养基的培养液，置于培养箱内孵育5d。随后加入1/2培养皿内液体体积的组成为0.5％的MC，50ng/mL的SCF，3unit/mL 的EPO的Stemline II造血培养基的培养液。每3d更换一次，共更换2次。随后加入培养皿内液体5倍体积的IMDM培养基,离心收集细胞。用IMDM培养基润洗细胞2次，并用含0.5％BSA的IMDM重悬细胞，将其接入组织培养瓶中过夜培养。收集组织培养瓶内的细胞，用含有50ng/mL的SCF，3unit/mL 的EPO的Stemline II造血培养基的培养液重悬细胞，保持细胞密度在2×106cells/mL，每2d换液一次，换2次后，收集培养皿内的细胞，用含有3 unit/mL EPO的StemProTM-34培养基培养液重悬细胞，放入细胞培养箱中继续诱导5d即可获得相应的诱导红细胞。
实施例2对照试验的hES细胞诱导生产红细胞
(1)取对数增长期的hES细胞(HES3.1细胞，货号：ml-cs-0242，上海酶联生物科技有限公司)，弃培养液，用EBSS液洗一遍，加入4mlEBSS液和1ml浓度5mg/ml的IV型胶原酶，37℃消化10min左右，镜下见细胞集落间边界清晰，集落内部细胞松解开，弃消化液用EBSS洗一遍，添加ES细胞培养液，反复吹打皿底，细胞脱落并分散成大小均匀的小细胞片，以1：8比例接种于种好MEF细胞的培养皿中，置于37℃、含6％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待生长形成EBs后，将EBs移入离心管中200rmp/min离心4min，弃去上清，用培养液重悬细胞EBs(培养液组成为20％终浓度的SR、青霉素 100IU/ml、链霉素100ug/ml、L-谷氨酰胺2mM、NEAA终浓度0.01％、bFGF 4ng/ml、 10ng/ml BMP4、20mg/ml IL-3、10ng/mL SCF)。将细胞置于细胞培养箱中培养。将培养4d天的EBs接种于胎肝基质细胞饲养层上进行诱导培养4天，培养基为 (20％终浓度的SR、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml，L-谷氨酰胺2mM，NEAA 终浓度0.01％，bFGF 4ng/ml，10ng/ml BMP4，20mg/ml IL-3，10ng/mL SCF，5ng/mL hVEGF，10ng/mL hBMP4，100ng/mL hSCF,20ng/mL hIL-6,2U/mL hEPO,40ng/mL hIL-3，10ng/mLIL-11和10ng/mL Flt3-L)。用Stemline II造血培养基重悬细胞，取1.5×105个细胞悬液与3mL含有50ug/mL的VEGF，25ug/mL的 Flt3ligand，8ug/mL的bFGF，1％的青霉素和1％的链霉素Stemline II造血培养基震荡混匀。随后，将液体接种到低吸附细胞培养皿中，培养在37℃，5％CO2 的培养箱中培养5d，在细胞培养皿内添加2mL培养基组成为50ug/mL的VEGF，25ug/mL的Flt3ligand，8ug/mL的bFGF，1％的青霉素和1％的链霉素的Stemline II造血培养液，此时需注意不能搅动培养液中细胞克隆，将细胞放入培养箱中孵育3d，添加与培养皿内添加等体积的组成为3units/mL的EPO，50ug/mL的 VEGF，25ug/mL的Flt3ligand，8ug/mL的bFGF，1％的青霉素和1％的链霉素的 Stemline II造血培养液，继续放置在培养箱内3d。将培养皿内的液体转移至低吸附细胞培养皿，并加入与培养皿内液体等体积的含有50ng/mL的SCF，3 unit/mL的EPO的Stemline II造血培养基的培养液，置于培养箱内孵育5d。随后加入1/2培养皿内液体体积的组成为0.5％的MC，50ng/mL的SCF，3unit/mL 的EPO的Stemline II造血培养基的培养液。每3d更换一次，共更换2次。随后加入培养皿内液体5倍体积的IMDM培养基,离心收集细胞。用IMDM培养基润洗细胞2次，并用含0.5％BSA的IMDM重悬细胞，将其接入组织培养瓶中过夜培养。收集组织培养瓶内的细胞，用含有50ng/mL的SCF，3unit/mL 的EPO的Stemline II造血培养基的培养液重悬细胞，保持细胞密度在2×106cells/mL，每2d换液一次，换2次后，收集培养皿内的细胞，用含有3 unit/mL EPO的StemProTM-34培养基培养液重悬细胞，放入细胞培养箱中继续诱导5d即可获得相应的诱导红细胞。
实施例3红细胞性能检测
选取实施例1和实施例2制备的红细胞用qRT-PCR检测诱导红细胞中 globin的表达。检测结果如表1所示。
表1红细胞中globin的表达情况汇总表
Figure RE-GDA0002761287510000071
β-globin的占比表现了红细胞的成熟程度，从表1的结果可以看出，诱导的红细胞中，实施例1中的成熟的β-globin表达量占总体的29.3％，较对照例的22.2％有显著的提高。
实施例4细胞脱核检测
Syto16是一种核酸染料，能够透过完整的细胞膜将细胞核染上颜色。为了解分化后的红细胞脱核情况，通过流式细胞仪检测Syto16阳性细胞比例来判定红细胞脱核情况，结果如图1所示。实施例1和实施例2的脱核率分别为 (99.43±2.10)％，(94.31±1.12)％，表明实施例1的方法使用相应的miRNA诱导后能够促进细胞的红细胞分化。
实施例5红细胞结构和功能分析
取培养结束时得到的红细胞，利用红细胞计数仪测定平均细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)和平均血红蛋白浓度(MCHC)。红细胞悬浮于4％聚乙烯吡咯烷酮溶液中，然后逐渐增加溶液的渗透压(从60到450mosm)，记录其激光衍射模式，根据其检测值可得到变形指数(DI)。通过分光光度法测定红细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶的水平。结果如表2所示。
表2细胞特性结果
Figure RE-GDA0002761287510000081
从表2的结果可以看出，培养得到的红细胞的平均细胞体积(MCV)为107± 3fl(正常红细胞为80-100fl)，说明得到的红细胞体积稍大。平均血红蛋白含量(MCH)为31.7±1.3pg(正常值为27-31pg)，比正常的红细胞水平稍高。红细胞的最大变形指数(DImax)为0.4，接近正常红细胞水平。葡萄糖6磷酸脱氢酶的含量为37±4U/g Hb，丙酮酸激酶的含量为75±5U/g Hb，说明这些细胞与年轻红细胞的特性一致，能够还原谷胱甘肽，维持ATP的水平，避免2， 3-二磷酸甘油酸(2，3-diphosphogly cerate，2，3-DPG)积聚，而2，3-DPG的积聚会降低血红蛋白的配基亲和力。
实施例6大鼠缺铁性贫血模型的建立及实验
将Wistar大鼠适应性饲养1周，采用随机分组的方法抽取其中15只作为正常组，其余大鼠采用放血加低铁饲料喂养的方法复制IDA模型。给予大鼠低铁饲料，饮用去离子水，并每隔3d剪尾放血1次，每次放血0.8mL，观察大鼠的皮毛、饮食及体质量变化，每周称重记录体质量。造模第4周后尾尖取血，采用试剂盒测定血样中的血红蛋白(Hb)含量，以Hb＜100g/L作为IDA模型复制成功的标准。制备得到贫血模型。
将模型复制成功的大鼠采用随机数字表法分为模型组，阳性对照组，实验组。正常组给予正常饲料，饮用自来水；阳性对照组灌胃力蛮能20mg/kg(10mL /kg)；阳性对照组每日灌胃给药1次，连续给药20d；正常组正常饲喂；模型组不给药，正常饲养；实验组分别静脉给予实施例1和实施例2的红细胞按照 5*1010/只,每5d重复给药1次，共给药3次。20d后，抽血检测血液指标，结果如下表3所示。
表3细胞特性结果
Figure RE-GDA0002761287510000091
结果显示:与正常组比较，模型组大鼠外周血Hb含量、红细胞(RBC)计数及红细胞压积(HCT)均明显降低，血小板(PLT)计数明显升高，差异均有统计意义(P＜0.05)；与模型组比较，阳性对照组及实验组大鼠外周血Hb含量、 RBC计数明显增高，差异均有统计意义(P＜0.05)，提示实施例1制备的红细胞对IDA有良好的治疗作用。
以上结果说明胚胎干细胞经过体外高效扩增和定向分化为红细胞后可在动物体内存活一段时间,并可用于治疗贫血症状。

Claims (6)

1.一种诱导胚胎干细胞生成红细胞的方法，其特在于所述方法包括以下步骤：
取对数增长期的HES3.1细胞，弃培养液，用EBSS液洗一遍，加入4mlEBSS液和1ml浓度5mg/ml的IV型胶原酶，37℃消化10min，镜下见细胞集落间边界清晰，集落内部细胞松解开，弃消化液用EBSS洗一遍，添加ES细胞培养液，反复吹打皿底，细胞脱落并分散成大小均匀的小细胞片，以1：8比例接种于种好MEF细胞的培养皿中，置于37℃、含6％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待生长形成EBs后，将EBs移入离心管中200rmp/min离心4min，弃去上清，用培养液重悬细胞EBs，培养液组成为20％终浓度的SR、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml、L-谷氨酰胺2mM、NEAA终浓度0.01％、bFGF 4ng/ml、10ng/ml BMP4、20mg/ml IL-3、10ng/mLSCF；将细胞置于细胞培养箱中培养。将培养4d天的EBs接种于胎肝基质细胞饲养层上进行诱导培养4天，培养基为20％终浓度的SR、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml，L-谷氨酰胺2mM，NEAA终浓度0.01％，bFGF 4ng/ml，10ng/ml BMP4，20mg/ml IL-3，10ng/mL SCF，5ng/mLhVEGF，10ng/mL hBMP4，100ng/mL hSCF,20ng/mL hIL-6,2U/mL hEPO,40ng/mLhIL-3，10ng/mL IL-11和10ng/mL Flt3-L，50ng/mL的诱导肽YEDPKSPRRHNQVPSMVT；将诱导4天后的细胞群消化，使用si PORT Neo FX转染试剂将miR-705转染所述细胞，收集阳性细胞用Stemline II造血培养基重悬细胞，取1.5×105个细胞悬液与3mL含有50ug/mL的VEGF，25ug/mL的Flt3ligand，8ug/mL的bFGF，1％的青霉素和1％的链霉素Stemline II造血培养基震荡混匀；随后，将液体接种到低吸附细胞培养皿中，培养在37℃，5％CO2的培养箱中培养5d，在细胞培养皿内添加2mL培养基组成为50ug/mL的VEGF，25ug/mL的Flt3ligand，8ug/mL的bFGF，1％的青霉素和1％的链霉素的StemlineII造血培养液，此时需注意不能搅动培养液中细胞克隆，将细胞放入培养箱中孵育3d，添加与培养皿内添加等体积的组成为3units/mL的EPO，50ug/mL的VEGF，25ug/mL的Flt3ligand，8ug/mL的bFGF，1％的青霉素和1％的链霉素的StemlineII造血培养液，继续放置在培养箱内3d。将培养皿内的液体转移至低吸附细胞培养皿，并加入与培养皿内液体等体积的含有50ng/mL的SCF，3 unit/mL的EPO的Stemline II造血培养基的培养液，置于培养箱内孵育5d；随后加入1/2培养皿内液体体积的组成为0.5％的MC，50ng/mL的SCF，3unit/mL的EPO的Stemline II造血培养基的培养液；每3d更换一次，共更换2次。随后加入培养皿内液体5倍体积的IMDM培养基,离心收集细胞。用IMDM培养基润洗细胞2次，并用含0.5％BSA的IMDM重悬细胞，将其接入组织培养瓶中过夜培养。收集组织培养瓶内的细胞，用含有50ng/mL的SCF，3unit/mL的EPO的Stemline II造血培养基的培养液重悬细胞，保持细胞密度在2×106cells/mL，每2d换液一次，换2次后，收集培养皿内的细胞，用含有3unit/mL EPO的StemProTM-34培养基培养液重悬细胞，放入细胞培养箱中继续诱导5d即获得相应的诱导红细胞。
2.根据权利要求1所述方法制备得到的红细胞。
3.权利要求1所述方法诱导获得的红细胞在制备用于治疗贫血的产品中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述贫血可以是先天性贫血，也可是创伤性失血。
5.一种药物组合物，所述组合物中含有权利要求1所述方法诱导获得的红细胞以及药学上可接受的载体。
6.权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗贫血的产品中的用途。
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