CN117417959A - 再生髓系细胞的方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及再生髓系细胞的方法及用途。本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有编码Runx1和Hoxa10基因的核苷酸序列，用于实现Runx1和Hoxa10两个基因的串联共表达。本发明中，将Runx1和Hoxa10的cDNA序列串联表达于同一载体，并整合入哺乳动物多能干细胞基因组中，可以得到稳定表达Runx1和Hoxa10的宿主细胞，操作简便、效率较高，得到的宿主细胞具有分化为粒/单核/巨噬髓系细胞的能力。

Description

再生髓系细胞的方法及用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及再生髓系细胞的方法及用途，更具体地涉及表达载体、宿主细胞、再生髓系细胞的方法、髓系细胞、细胞产品以及制备细胞产品中的用途。
背景技术
单核/巨噬细胞具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等重要作用，是机体重要的免疫细胞，也是很多药物的潜在靶点。而传统的从骨髓或外周血中获得巨噬细胞的方法不仅浪费时间，并且产量也很低。粒细胞是机体抵御微生物病原体的第一线，在血液的非特异性细胞免疫系统中起着趋化、吞噬和杀菌的重要作用。在白血病患者或干细胞移植病人的治疗过程中，化疗或放疗会引起粒细胞的减少，从而导致严重的细菌和真菌感染。因此，粒细胞的输注多用于临床上预防或治疗由化疗和放疗引起的感染，及预防骨髓移植后的感染。然而，粒/单核/巨噬髓系细胞输注到体内仅有短暂的生命周期，而且供体细胞来源的有限性仍然是实施中性粒细胞输血治疗的一个重大障碍。目前临床上在化疗后，多用注射G-CSF的升白针来恢复白细胞避免感染，然而升白针无法治疗辐射损伤的病人，且副作用明显。因此，再生可移植的有功能的粒/单核/巨噬髓系细胞具有重要的临床治疗意义。
多能干细胞具有无限来源的特点，随着制备病人体细胞来源的诱导型多能干细胞技术的日臻成熟，通过诱导多能干细胞向粒/单核/巨噬细胞分化成为获得无限来源粒/单核/巨噬细胞的关键技术路径。目前再生粒细胞或单核/巨噬细胞的研究较少，而且再生细胞的功能一般都是通过体外吞噬、因子释放和趋化作用来进行验证，即便利用动物模型也少有研究，应用于临床治疗则更为遥远。而且文献报道中的诱导分化技术没有第三方重复，产量也有待提高，需要技术改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种表达载体，所述表达载体用于实现Runx1和Hoxa10两个基因的串联共表达，在遗传学水平上实现单个胚胎干细胞分辨率上能够均一地定向诱导分化产生可移植的造血祖细胞，并实现粒/单核/巨噬细胞再生。
为此，本发明第一方面提供一种表达载体。根据本发明的一些实施方案，所述表达载体包括编码Runx1和Hoxa10基因的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，所述编码Runx1和Hoxa10基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
SEQ ID NO:1
ATGCGTATCCCCGTAGATGCCAGCACGAGCCGCCGCTTCACGCCGCCTTCCACCGCGCTGAGCCCCGGCAAGATGAGCGAGGCGCTGCCGCTGGGCGCCCCGGATGGCGGCGCCGCCCTGGCCAGCAAGCTGAGGAGCGGCGACCGCAGCATGGTGGAGGTACTAGCTGACCACCCTGGCGAGCTAGTGCGCACCGACAGCCCCAACTTCCTCTGCTCCGTGCTACCCACTCACTGGCGCTGCAACAAGACCCTGCCCATCGCTTTCAAGGTGGTGGCACTGGGGGACGTCCCGGATGGCACTCTGGTCACCGTCATGGCAGGCAACGATGAAAACTACTCGGCAGAACTGAGAAATGCTACCGCGGCCATGAAGAACCAGGTAGCGAGATTCAACGACCTCAGGTTTGTCGGGCGGAGCGGTAGAGGCAAGAGCTTCACTCTGACCATCACCGTCTTTACAAATCCGCCACAAGTTGCCACCTACCATAGAGCCATCAAAATCACAGTGGACGGCCCCCGAGAACCCCGAAATGCCAGGCAGATCCAGCCATCCCCACCGTGGTCCTATGACCAGTCCTACCAGTACCTGGGATCCATCACCTCTTCCTCTGTCCACCCAGCGACACCCATTTCACCCGGCCGTGCCAGCGGCATGACCAGCCTCTCTGCAGAACTTTCCAGTCGACTCTCAACGGCTCCGGACCTGACCGCCTTCGGCGACCCACGCCAGTTCCCTACTCTGCCGTCCATCTCCGACCCGCGCATGCACTACCCAGGCGCCTTCACCTACTCGCCGCCCGTCACGTCGGGCATCGGCATCGGCATGTCAGCCATGAGCTCGGCCTCTCGCTACCACACCTACCTGCCGCCGCCCTACCCCGGCTCATCACAGGCGCAGGCCGGGCCCTTCCAGACCGGCTCGCCCTCCTACCATCTATACTACGGCGCCTCGGCCGGTTCCTACCAGTTCTCCATGGTGGGCGGAGAGAGATCGCCCCCGCGCATCCTGCCGCCCTGCACCAACGCATCCACCGGCGCCGCGCTGCTCAACCCCAGCCTCCCCAGCCAGAGCGACGTGGTGGAGACCGAGGGCAGCCATAGCAACTCGCCCACCAACATGCCCCCCGCGCGCCTGGAGGAGGCCGTGTGGCGGCCCTACGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTCAGCCAGAAAGGGCTATCTGCTCCCTTCGCCAAATTATCCCACAACAATGTCATGCTCGGAGAGCCCTGCCGCGAACTCCTTTTTGGTCGACTCGCTCATCAGCTCAGGCAGAGGCGAGGCTGGTGTTGGTGGCGGTAGCGCGGGGGGCGGTGGAGGTGGCTACTACGCCCACGGTGGGGTCTACCTGCCGCCTGCCAGCGACCTGCCCTACGGGCTGCAAAGCTGCGGGCTCTTCCCCGCGCTGGGCAGCAAGCGTAATGAAGCGCCGTCGCCCGGAGGCGGTGGCGGTGGTGGCAGCGGGGGCCTGGGTCCTGGGACGCATGGCTACGCGCCCGCGCCCCTAGACCTGTGGCTGGACGCGCCCCGCTCCTGCCGGATGGAGCCGCCCGACGGGCCGCCGCCACCGCAGCCACAACCCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCGCCGCCGCCCCCGCCGCAGCCACCTCAACCCCAGCCACAGGCCACTTCGTGTTCTTTTGCGCAGAACATCAAAGAAGAGAGCTCCTACTGCCTCTACGATGCTGCGGACAAATGCCCCAAGGGCTCGGCCGCCGCTGATCTGGCCCCTTTCCCGCGGGGCCCGCCGCCCGACGGCTGCGCCCTGGGCGCCTCCAGCGGAGTGCCAGTACCCGGCTACTTCCGCCTGTCGCAGGCCTACGGCACGGCCAAGGGCTTCGGCAGTGGCGGCGGCGGCACGCAGCAGCTCGCTAGTCCCTTTCCTGCGCAGCCCCCGGGGCGCGGTTTCGACCCGCCGCCCGCACTGGCCTCTGGCTCGACCGAGGCAGCCGGGAAGGAGCGAGTCCTAGACTCCACGCCACCACCCACTCTGGTTTGCACCGGTGGCGGCGGCTCGCAGGGCGACGAGGAGGCACACGCGTCATCCTCGGCGGCTGAGGAGCTGTCTCCAGCCCCTTCAGAAAACAGTAAAGCTTCGCCGGAGAAGGACTCCCTGGGCAGTTCCAAAGGCGAAAATGCAGCCAACTGGCTCACAGCAAAGAGCGGCCGGAAGAAACGCTGCCCTTACACGAAGCACCAGACGCTGGAGCTGGAGAAGGAGTTTCTATTCAACATGTACCTTACTCGAGAGCGGCGCCTAGAGATCAGCCGTAGCGTCCACCTCACGGACAGACAAGTGAAAATCTGGTTTCAGAATCGCAGGATGAAACTGAAGAAAATGAACCGAGAAAACCGAATCCGGGAGCTCACAGCCAACTTTAATTTTTCCTGA
本发明第二方面提供一种宿主细胞。根据本发明的一些实施方案，所述宿主细胞包括第一方面所述的表达载体。
本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有编码Runx1和Hoxa10基因的核苷酸序列，用于实现Runx1和Hoxa10两个基因的串联共表达。本发明中，将Runx1和Hoxa10的cDNA序列串联表达于同一载体，并整合入哺乳动物多能干细胞基因组中，可以得到稳定表达Runx1和Hoxa10的宿主细胞，操作简便、效率较高，得到的宿主细胞具有分化为粒/单核/巨噬髓系细胞的能力。
根据本发明的一些实施方案，所述宿主细胞为多能干细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述多能干细胞为哺乳动物胚胎干细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述多能干细胞为未经过体内发育的受精14天以内的胚胎干细胞。
根据本发明的一些实施方案，在所述宿主细胞中，编码Runx1和Hoxa10基因的表达元件插入到宿主细胞的不会对基因组功能产生影响的位点处。
本发明在单细胞水平上寻找到了合适的因子组合Runx1+Hoxa10，从而在遗传学水平上实现单个胚胎干细胞分辨率上能够均一地定向诱导分化产生可移植的造血祖细胞，并实现粒/单核/巨噬细胞再生，从而明确了实现粒/单核/巨噬髓系细胞再生的一种转录因子组合，以及一种快速产生粒/单核/巨噬髓系细胞的方法。
本发明第三方面提供一种再生髓系细胞的方法。根据本发明的一些实施方案，所述方法包括：
(1)将第二方面所述的宿主细胞诱导分化为生血内皮细胞；
(2)将所述生血内皮细胞与基质细胞共培养，获得诱导型造血祖细胞；
(3)将所述诱导型造血祖细胞移植到哺乳动物体内培养，从所述哺乳动物的骨髓、脾脏或外周血中分离获得髓系细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述髓系细胞包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述基质细胞包括选自OP9-DL1细胞、OP9细胞或MS5细胞中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案，所述哺乳动物为啮齿目动物，如大鼠或小鼠。
本发明第四方面提供一种髓系细胞。根据本发明的一些实施方案，所述髓系细胞通过第三方面所述的再生髓系细胞的方法制备获得。
本发明第五方面提供一种细胞产品。根据本发明的一些实施方案，所述细胞产品包括第四方面所述的髓系细胞。
本发明第六方面提供第一方面所述的表达载体、第二方面所述的宿主细胞、第四方面所述的髓系细胞在制备细胞产品中的用途。
本发明的技术方案的有益效果：
(1)本发明利用干细胞自我更新以及克隆化无限繁殖的优势，通过精确的基因编辑将目的基因Runx1+Hoxa10定点敲入，保证多能干细胞遗传背景的均一性，并且可以在时空上控制目的基因的表达；
(2)本发明通过同源重组定点将目的基因整合到多能干细胞基因组中，无需逆转录病毒载体的策略，因此也就避免了使用逆转录病毒载体所带来的基因插入、整合、突变等问题，安全性更高；
(3)本发明利用多能干细胞采用定向分化体系和共培养方法效率高，可重复性高，更利于临床转化。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了实施例1中构建的Donor-iR10表达载体图谱；
图2显示了实施例1中Runx1-P2A-Hoxa10 mESC(iR10 mESC)打靶策略图；
图3显示了实施例1中iR10 mESC细胞株基因组中Runx1和Hoxa10插入基因的PCR测序结果；
图4显示了实施例1中荧光定量PCR(qPCR)鉴定iR10 mESC细胞株Runx1和Hoxa10的表达；
图5显示了实施例2中iR10 mESC体外诱导分化中EB分化不同时间点形态图；
图6显示了实施例2中iR10 mESC多能干细胞定向诱导分化iHECs细胞day 11流式分选图；
图7显示了实施例3中R10 iHECs在OP9-DL1共培养过程不同时间点细胞状态；
图8显示了实施例3中诱导iRunx1-p2a-Hoxa10多能干细胞定向分化为造血祖细胞示意图；
图9显示了实施例4中Rag1-/-受体鼠外周血中再生的髓系细胞流式免疫表型分析；
图10显示了实施例4中Rag1-/-受体鼠外周血中再生的髓系细胞比例统计图；
图11显示了实施例4中体内再生髓系细胞的基因组PCR鉴定结果；
图12显示了实施例4中再生髓系细胞基因组中Runx1和Hoxa10插入基因的测序结果；
图13显示了实施例5中骨髓和脾脏再生髓系细胞流式分析结果；
图14显示了实施例5中受体鼠外周血中嗜碱性粒细胞/嗜酸性粒细胞/中性粒细胞和单核细胞的检测结果；
图15显示了实施例5中受体鼠骨髓和脾脏中再生的粒细胞、单核细胞和巨噬细胞流式分析结果；
图16显示了实施例6中iR10 mESC来源iHPCs移植后对致死辐照损伤动物的挽救。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，1989(下文称为“Sambrook”)。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
迄今，针对多能干细胞来源的粒/单核/巨噬细胞再生研究较少，且大部分都是利用细胞因子、与饲养层细胞共培养和形成EB等方法来诱导粒/单核/巨噬髓系细胞再生。而且很多诱导分化技术没有第三方重复，产量也有待提高，需要技术改进。还有通过先将多能干细胞诱导为造血干祖细胞，再分化为包括髓系细胞在内的多谱系细胞再生的方法。这些再生髓系的方法是通过造血干细胞移植，造血干细胞移植后会长期存在，可能出现生理性的兼容问题。本发明产生的髓系细胞在体内短期存在，移植后约6周消失，不会影响宿主，降低了成瘤风险，解决了生理兼容的问题。
细胞身份是由转录因子控制的基因调控网络所定义的，少数调控因子的异位表达往往足以调控或改变细胞命运。发明人认为存在着特定转录因子协同作用，能够激活控制造血细胞分化和发育特性的基因调控网络。因此发明人从ESC定向分化到血液细胞的基础上，引用基因编辑的方法把特定转录因子组合导入细胞系，借助体内移植手段作为检验的金标准来建立再生粒/单核/巨噬细胞的方法。
多能干细胞(pluripotent stem cells，PSCs)是一类具有无限增殖潜能、分化形成不同谱系细胞组织、易于进行基因修饰的细胞。通过将外源基因导入PSCs并进一步诱导分化用以研究转录因子在造血发育中的作用是领域内常用的研究手段。发明人发现，Runx1和Hoxa10对早期胚胎发育和髓系生成起着关键性的作用：Runx1对于生血内皮细胞的EHT过程非常重要，而EHT是产生HSC必须经历的过程，在多能干细胞中诱导表达Runx1可促进EHT的过程，产生生血内皮细胞。转录因子Hoxa10是直接参与造血发育的调控因子，与髓系生成的很多功能相关，包括祖细胞的扩增及获得吞噬功能等；HOXA10在髓系、红系、巨核前体细胞和细胞系中表达，对这些细胞的分化发育起着重要调控作用；在小鼠造血细胞中过表达Hoxa10影响髓系和淋系分化，导致髓系增生并最终进展为急性髓系白血病(AML)。上述转录因子都在造血生成和谱系发育方面发挥着不可或缺的作用，因此发明人构建了可诱导表达转录因子Runx1+Hoxa10的打靶干细胞系，探索可以诱导多能干细胞定向分化为可移植的造血干祖细胞的方法，并实现体内粒/单核/巨噬细胞再生。
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种表达载体，包括编码Runx1和Hoxa10基因的核苷酸序列。
编码Runx1和Hoxa10基因的核苷酸序列可以通过P2A相连，插入质粒的克隆位点处。
所述编码Runx1和Hoxa10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1
ATGCGTATCCCCGTAGATGCCAGCACGAGCCGCCGCTTCACGCCGCCTTCCACCGCGCTGAGCCCCGGCAAGATGAGCGAGGCGCTGCCGCTGGGCGCCCCGGATGGCGGCGCCGCCCTGGCCAGCAAGCTGAGGAGCGGCGACCGCAGCATGGTGGAGGTACTAGCTGACCACCCTGGCGAGCTAGTGCGCACCGACAGCCCCAACTTCCTCTGCTCCGTGCTACCCACTCACTGGCGCTGCAACAAGACCCTGCCCATCGCTTTCAAGGTGGTGGCACTGGGGGACGTCCCGGATGGCACTCTGGTCACCGTCATGGCAGGCAACGATGAAAACTACTCGGCAGAACTGAGAAATGCTACCGCGGCCATGAAGAACCAGGTAGCGAGATTCAACGACCTCAGGTTTGTCGGGCGGAGCGGTAGAGGCAAGAGCTTCACTCTGACCATCACCGTCTTTACAAATCCGCCACAAGTTGCCACCTACCATAGAGCCATCAAAATCACAGTGGACGGCCCCCGAGAACCCCGAAATGCCAGGCAGATCCAGCCATCCCCACCGTGGTCCTATGACCAGTCCTACCAGTACCTGGGATCCATCACCTCTTCCTCTGTCCACCCAGCGACACCCATTTCACCCGGCCGTGCCAGCGGCATGACCAGCCTCTCTGCAGAACTTTCCAGTCGACTCTCAACGGCTCCGGACCTGACCGCCTTCGGCGACCCACGCCAGTTCCCTACTCTGCCGTCCATCTCCGACCCGCGCATGCACTACCCAGGCGCCTTCACCTACTCGCCGCCCGTCACGTCGGGCATCGGCATCGGCATGTCAGCCATGAGCTCGGCCTCTCGCTACCACACCTACCTGCCGCCGCCCTACCCCGGCTCATCACAGGCGCAGGCCGGGCCCTTCCAGACCGGCTCGCCCTCCTACCATCTATACTACGGCGCCTCGGCCGGTTCCTACCAGTTCTCCATGGTGGGCGGAGAGAGATCGCCCCCGCGCATCCTGCCGCCCTGCACCAACGCATCCACCGGCGCCGCGCTGCTCAACCCCAGCCTCCCCAGCCAGAGCGACGTGGTGGAGACCGAGGGCAGCCATAGCAACTCGCCCACCAACATGCCCCCCGCGCGCCTGGAGGAGGCCGTGTGGCGGCCCTACGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTCAGCCAGAAAGGGCTATCTGCTCCCTTCGCCAAATTATCCCACAACAATGTCATGCTCGGAGAGCCCTGCCGCGAACTCCTTTTTGGTCGACTCGCTCATCAGCTCAGGCAGAGGCGAGGCTGGTGTTGGTGGCGGTAGCGCGGGGGGCGGTGGAGGTGGCTACTACGCCCACGGTGGGGTCTACCTGCCGCCTGCCAGCGACCTGCCCTACGGGCTGCAAAGCTGCGGGCTCTTCCCCGCGCTGGGCAGCAAGCGTAATGAAGCGCCGTCGCCCGGAGGCGGTGGCGGTGGTGGCAGCGGGGGCCTGGGTCCTGGGACGCATGGCTACGCGCCCGCGCCCCTAGACCTGTGGCTGGACGCGCCCCGCTCCTGCCGGATGGAGCCGCCCGACGGGCCGCCGCCACCGCAGCCACAACCCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCGCCGCCGCCCCCGCCGCAGCCACCTCAACCCCAGCCACAGGCCACTTCGTGTTCTTTTGCGCAGAACATCAAAGAAGAGAGCTCCTACTGCCTCTACGATGCTGCGGACAAATGCCCCAAGGGCTCGGCCGCCGCTGATCTGGCCCCTTTCCCGCGGGGCCCGCCGCCCGACGGCTGCGCCCTGGGCGCCTCCAGCGGAGTGCCAGTACCCGGCTACTTCCGCCTGTCGCAGGCCTACGGCACGGCCAAGGGCTTCGGCAGTGGCGGCGGCGGCACGCAGCAGCTCGCTAGTCCCTTTCCTGCGCAGCCCCCGGGGCGCGGTTTCGACCCGCCGCCCGCACTGGCCTCTGGCTCGACCGAGGCAGCCGGGAAGGAGCGAGTCCTAGACTCCACGCCACCACCCACTCTGGTTTGCACCGGTGGCGGCGGCTCGCAGGGCGACGAGGAGGCACACGCGTCATCCTCGGCGGCTGAGGAGCTGTCTCCAGCCCCTTCAGAAAACAGTAAAGCTTCGCCGGAGAAGGACTCCCTGGGCAGTTCCAAAGGCGAAAATGCAGCCAACTGGCTCACAGCAAAGAGCGGCCGGAAGAAACGCTGCCCTTACACGAAGCACCAGACGCTGGAGCTGGAGAAGGAGTTTCTATTCAACATGTACCTTACTCGAGAGCGGCGCCTAGAGATCAGCCGTAGCGTCCACCTCACGGACAGACAAGTGAAAATCTGGTTTCAGAATCGCAGGATGAAACTGAAGAAAATGAACCGAGAAAACCGAATCCGGGAGCTCACAGCCAACTTTAATTTTTCCTGA
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种宿主细胞，包括前面所述的表达载体。
根据本发明一个具体的实施方案，所述宿主细胞为多能干细胞。
根据本发明一个具体的实施方案，所述多能干细胞为哺乳动物胚胎干细胞。
根据本发明一个具体的实施方案，所述多能干细胞为未经过体内发育的受精14天以内的胚胎干细胞。
根据本发明一个具体的实施方案，编码Runx1和Hoxa10基因的表达元件插入到宿主细胞的不会对基因组功能产生影响的位点处。不会对基因组功能产生影响的位点处例如小鼠的Rosa26位点。
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种再生髓系细胞的方法，包括：
(1)将前面所述的宿主细胞诱导分化为生血内皮细胞；
(2)将所述生血内皮细胞与基质细胞共培养，获得诱导型造血祖细胞；
(3)将所述诱导型造血祖细胞移植到哺乳动物体内培养，从所述哺乳动物的骨髓、脾脏或外周血中分离获得髓系细胞。
根据本发明一个具体的实施方案，所述髓系细胞包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞。
根据本发明一个具体的实施方案，所述基质细胞包括选自OP9-DL1细胞、OP9细胞或MS5细胞中的至少之一。本发明提供的再生髓系细胞的方法中基质细胞的种类并没有特别的限制，并不限于上述提及的具体的基质细胞类型，也可以是本领域已知的与生血内皮细胞共培养能够获得诱导型造血祖细胞的任意一种基质细胞类型。
根据本发明一个具体的实施方案，所述哺乳动物为啮齿目动物，如大鼠或小鼠。
需要说明的是，关于上述方法中，步骤(1)-(3)中所用的培养基并没有严格的限制，只要能够实现各步骤分化目的的所有培养基类型，都包含在本发明的保护范围之内。
需要说明的是，除了本发明提供方法之外，也可以用其他方式将Runx1和Hoxa10基因组合转导到任何哺乳动物的多能干细胞，包括人源在内的各类哺乳动物来源的胚胎干细胞和诱导型多能干细胞。Runx1和Hoxa10转录因子组合用Tet-on和其他任何诱导系统，或者不添加诱导元件进行持续表达。Runx1和Hoxa10基因打靶位点不限于Rosa26、Hipp11或Col1a1等其他位点，除此之外，添加GFP/RFP/Td-tomato/BFP等任意一个报告基因或不带报告基因皆可。
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种多能干细胞定向分化具备粒/单核/巨噬细胞发育潜能的造血祖细胞的方法。本发明通过采用基因修饰的多能干细胞，在造血内皮向造血转化的阶段协同表达Runx1和Hoxa10在体外诱导分化高效获得造血祖细胞种子，移植后可以在体内快速再生粒/单核/巨噬细胞，是一种高效迅速的粒/单核/巨噬髓系细胞再生的方法，该方法重建的免疫系统安全，未见致瘤性风险。
临床上由于病人的大剂量化疗或者放疗，通常会导致髓系细胞减少尤其是中性粒细胞减少而大面积感染，继而引发一系列并发症影响生存。另外骨髓移植后的患者，由于粒/单核细胞恢复较慢，也易引起严重的感染，甚至死亡。本发明将为化疗、放疗、骨髓移植的患者提供新来源的粒/单核/巨噬细胞，重建粒/单核/巨噬等髓系细胞，预防感染。
下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1构建Runx1-Hoxa10打靶干细胞系
在已打靶C57BL/6mESC(CD45.2)细胞系中进行同源重组，敲入Runx1-P2A-Hoxa10表达元件。构建Runx1-Hoxa10打靶干细胞系，步骤如下：
1)提前12h复苏MEF(mouse embryonic fibroblasts，小鼠成纤维细胞)到六孔板，提前三到四天复苏待打靶的mESC(Mouse embryonic stem cells，小鼠胚胎干细胞)，传代一次后可用于打靶。待其传代后的细胞汇合度到70％-80％左右，可准备电转；
2)电转前的质粒需要线性化(含有Runx1-P2A-Hoxa10表达元件的电转前质粒的图谱如图1所示)，以增加重组几率。电转一般需要质粒2-4μg，所以需要根据需要量对应确定线性化质粒量，
配制如下酶切线性化体系：反应体系：100μL，10×FD buffer：10μL，Sca I：5μL，质粒：10-15μg；dd H2O：补至100μL，
混匀后离心，放于37℃水浴锅孵育6h；65℃孵育10min，终止酶切反应；
3)用DNA纯化试剂盒从酶切反应液纯化DNA，纯化后的DNA保存于-20℃冰箱待用；
4)弃去mESC培养基(表1中的BDM培养基，下同)上清，用0.5mL DPBS洗涤mESC细胞，弃去DPBS，加入0.5mL 0.05％胰酶在37℃细胞培养箱消化3-5min。加入适量mESC培养基终止胰酶消化作用，用1mL移液器将细胞吹散成单细胞悬液，然后转移到15mL离心管，250g离心5min，弃上清。用适量mESC培养基重悬细胞沉淀，再将其重铺到明胶包被的培养皿中，于37℃细胞培养箱放置30-40min，等待较大的基质细胞MEF完全贴壁而同时mESC仍处于悬浮状态时，即可将上层悬浮细胞转移到15mL离心管，250g离心5min，弃上清。用DPBS重悬后，取1.2×106细胞准备电转；
5)加入82μL mESC cell nucleofector solution和18μL mESC cell supplementnucleofection solution用移液器混匀(Lonza，货号#:VPH-1001)，然后用此混合液重悬已弃去上清的细胞沉淀，接着转移到1.5mL EP管，加入需要量(2-20μg)的线性化质粒，混匀后转移到电转杯中，尽量不要有气泡。选择电转程序，将电转杯按照朝向放到卡槽，点击确定后运行。听到响声后主界面显示OK，即表明电转完成，可取出电转杯。随即加入100-200μL常温MEF培养基，弃去MEF培养基上清，加入适量mESC培养基，然后迅速用专用小巴氏吸管将电转杯液体转移到MEF中，轻轻摇晃混匀，然后放于37℃，5％ CO2细胞培养箱；
6)培养24h后，换上带有潮霉素抗性(100～200mg/mL)的培养基进行筛选(筛选持续7-10天，每天换液)，7-10天后显微镜下挑取单克隆，期间每天观察细胞生长状态；
7)在挑取克隆前，至少提前12小时准备好铺有MEF细胞的孔板。首先用吸引器弃掉MEF培养孔上清，然后用移液枪向每孔加入带有P/S双抗(青霉素和链霉素)的1mL mESC培养基，准备挑取克隆待用；
8)准备酒精灯，点燃酒精灯开始挑取克隆，用100uL移液枪在显微镜下选取轮廓清晰，视野明亮的克隆，将其做好标记分别转移到已经加过mESC培养基的培养孔中，转移后再在显微镜下观察确认是否挑取成功。克隆挑取完毕，将细胞放到37℃，5％ CO2培养箱培养，次日后观察；
9)克隆鉴定：将接近长满的mESC分别传代到2孔0.1％明胶包被的12孔板中。传代后12h，观察细胞状态和生长情况，传代后24h，更换上含有1～2ug/mL的dox(doxycycline，强力霉素)的mESC培养基，另外一孔细胞正常换液(即培养基不含有dox)。待加入dox 24h后，可用0.05％胰酶消化收集细胞提取基因组和RNA，用PCR鉴定细胞基因组中外源基因的定点插入，利用qPCR进行mRNA表达鉴定。
发明人前期构建了一株已打靶C57BL/6mESC(CD45.2)细胞系，该细胞系Rosa26位点插入一个受Dox诱导表达的rtTA元件和TRE元件以及潮霉素(Hygro B)抗性筛选标记。在此细胞系基础上，发明人通过同源重组的方式，敲入Runx1-P2A-Hoxa10表达元件。电转24h后用含有潮霉素抗性的培养基筛选(潮霉素使用浓度150g/ml)，10天左右后形成单克隆，用移液枪在显微镜下挑取形态规则和边缘光滑并且外观明亮的单克隆到提前铺有MEF的12孔板中培养，待mESC克隆长到大小适中时分别传代到铺有0.1％明胶的12孔板(用于PCR鉴定)和铺有MEF的12孔板(用于扩繁)。用PCR验证了Runx1和Hoxa10基因确实插入到mESC细胞系中(图2)。此外，为了显示和追踪供体来源细胞移植到受体鼠体内的发育情况，又以鉴定过的同时高表达Runx1和Hoxa10的阳性细胞株为基础，在Hipp11位点敲入EGFP绿色荧光标记，Donor载体带有嘌呤霉素抗性，用于筛选EGFP表达克隆细胞株。添加嘌呤霉素持续培养7天左右，在荧光显微镜下挑取出绿色荧光的单克隆到铺有MEF培养孔扩繁，将阳性克隆命名为iR10-EGFP mESC(以下简称iR10 mESC)。图2展示了首先在mESC的Rosa 26位点敲入诱导表达Runx1-P2A-Hoxa10元件(线性化质粒)，经潮霉素筛选和qPCR表达鉴定获得阳性克隆。在此基础上在Hipp11位点敲入EGFP表达元件，经嘌呤霉素筛选后挑选出表达绿色荧光的克隆扩繁，即可得到iR10-EGFP mESC细胞。图3显示了提取iR10 mESC基因组，以跨越P2A的Runx1-P2A-Hoxa10正反向引物进行PCR，将PCR所得目的片段切胶回收，所得产物送公司测序后，Snapgene软件分析所得测序结果。图3的PCR测序结果证明打靶的mESC细胞株正确插入目的基因Runx1和Hoxa10。图4显示了iR10 mESC细胞株在添加强力霉素Doxycycline(Dox，1g/ml)培养基中培养24h以诱导Runx1和Hoxa10的表达。随后提取iR10 mESC的RNA，反转为cDNA后qPCR检测Runx1和Hoxa10的表达量，qPCR投入cDNA模板量20ng。结果表明Dox诱导iR10 mESC细胞24h后，qPCR检测到Runx1和Hoxa10的表达明显上调。
实施例2获得诱导的生血内皮细胞
获得诱导的生血内皮细胞的具体步骤包括：
1)复苏iRunx1-P2A-Hoxa10 mESC(简称iR10 mESC)到提前一天准备好的MEF中，每天换液，待其克隆大小适中时可用于下游分化实验；
2)Day 0，至少提前半小时铺0.1％明胶到六孔板中，待用；
3)用1mL DPBS洗涤，弃去DPBS，加入0.5mL 0.5％胰酶在37℃培养箱消化3-5min；
4)加入1mL mESC完全培养基终止消化，并用1mL移液枪吹打成单细胞悬液后转移到15mL离心管，250g，5min，室温离心；
5)用mESC培养基重悬细胞沉淀，并将其铺于提前铺有明胶的孔板中，37℃培养箱放置30-40min；
6)显微镜下观察到大多数较大的MEF细胞已经贴壁，而同时mESC细胞处于悬浮状态，此时将上述细胞悬液转移到15mL离心管，再用1mL DPBS洗涤培养皿底部，一起转移到离心管，250g，5min，室温离心，弃上清；
7)加入5mL DPBS重悬沉淀，洗涤，250g，5min，室温离心，弃上清；
8)用4mL补充有BMP4(3～8ng/mL)的BDM培养基(表1)重悬细胞沉淀，计数，按照1×105个/mL密度悬EBs，每滴20μL；
9)Day 2.5，将培养皿盖子倒置，用5-10mL DPBS加到EB球上，接着用巴氏吸管轻轻将皿盖贴附的EB吹下来，进而转移到50mL离心管中，90g，5min室温离心，弃上清；
10)用进一步分化培养基(BDM添加BMP4和VEGF，使用浓度3～8ng/mL)重悬EB球，用巴氏吸管将EB铺到含有0.1％明胶的六孔板中，显微镜下观察EB形态；
11)待EB分化到day 6，需换成添加mIL3/mIL6/mSCF/hFlt3L(10～30ng/mL)的新BDM培养基，同时添加强力霉素(1～2μg/mL)启动目的基因表达，此分化培养过程持续到day11，隔天加液；
12)Day 11分选iR10生血内皮细胞(induced hemogenic endothelial cells，iHECs)，iHEC表面标记分子：CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201hi；
分选的表面标记分子有anti-mouse CD31-PE-Cy7，anti-mouse CD201-PE，anti-mouse c-Kit-APC-Cy7，anti-mouse CD45-Percp-Cy5.5，anti-mouse CD41-APC
表1 BDM培养基成分
组分 终浓度
IMDM
胎牛血清 10％
GlutaMAX 30μg/mL
抗坏血酸(1000×，50mg/mL) 50μg/mL
硫代甘油 4×10-4M
转铁蛋白(10mg/mL) 180μg/mL
本实施例采用经典的悬滴法形成EB来起始mESC分化。自悬EB开始记为day 0，用添加有BMP4的BDM培养基将iR10 mESC以10万个/毫升的密度重悬，然后在15cm培养皿顶部进行悬滴(2000个细胞/滴)。在day 2.5时，收集EB球，显微镜下观察到是圆形、中间略致密的球。用添加BMP4和VEGF的BDM培养基重悬后进行培养。Day 3.5发现EB球的外围已经长出内皮样结构，day 4.5时内皮样结构增多，day 5.5时，在内皮结构和核心处之间会出现环状结构(图5)。图5展示了Day 2.5将EBs收集后，种到提前半小时铺有0.1％明胶的六孔板培养孔里，然后在显微镜下观察EB球形态并拍照。另外分别在分化的day 3.5、day 4.5、day 5.5、day 9和day 11对分化细胞进行拍照观察。标尺，200μm。
在day 6时加入Dox诱导启动基因Runx1和Hoxa10的表达，同时更换培养基为添加有促进造血细胞发育的细胞因子mIL-3/mIL-6/mSCF/hFlt3L到BDM培养基进行培养。day 9开始有生血内皮样细胞出现，再培养两天后即day 11出现大量生血内皮样细胞，并伴随有血液细胞的产生(图5)。为了纯化iHECs以便进行后续造血祖细胞的诱导，将CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201hi作为iHEC的表面标记进行分选(图6)。图6显示了在EBs分化第11天，消化收集细胞进行流式染色，通过流式仪分选iHECs。iHECs细胞表面标记为CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201hi。分选的iHECs细胞用500μL EM培养基收集。
实施例3将诱导的生血内皮细胞与基质细胞共培养
iR10 iHECs与基质细胞OP9-DL1共培养获得诱导造血祖细胞(iHPCs)的步骤如下：
1)提前4天左右(Day 7)复苏OP9-DL1细胞(基质细胞)，每天换液；
2)Day 10，分选前一天将OP9-DL1传代，并按照12孔板的细胞密度2万个/孔铺细胞，若使用24孔板，则细胞密度应减半，种完细胞后摇匀放于37℃，5％ CO2培养箱培养；
3)Day 11，将分选到的iHECs进行细胞计数，然后种到提前铺好的OP9-DL1上，12孔板种1000个iHECs/孔；
4)首先混匀分选到的细胞，然后显微镜下计数，然后4℃，500g，5min离心，弃上清；
5)根据细胞量确定种植细胞的孔数，用合适体积EM培养基(表2)重悬离心后的细胞沉淀，接着弃去OP9-DL1的上清，用移液枪将细胞悬液均匀加入各个孔中，放于37℃，5％CO2培养箱培养；
6)每隔一天换液，共培养12天后生成诱导型造血祖细胞(induced Hematopoieticprogenitor cells，iHPCs)，即可进行移植。
表2 EM培养基成分
组成 终浓度
IMDM
GlutaMAX 30μg/mL
抗坏血酸 50μg/mL
硫代甘油 4×10-4M
转铁蛋白(10mg/mL) 180μg/mL
c.m AFT024-mIL-3 10ng/mL
c.m AFT024-mSCF 10ng/mL
c.m AFT024-hFlt3L 10ng/mL
强力霉素 1μg/mL
为了进一步促进iHECs向造血祖细胞分化，将分选的iR10 mESC来源的iHECs种到OP9-DL1单层细胞上进行共培养。OP9-DL1细胞提前一天以20000个/孔的密度铺到12孔培养皿中。分选后的iHECs以1000个/孔种在OP9-DL1基质细胞上，并定时对细胞进行观察并拍照记录细胞生长状态。图7展示了day 11分选的iHECs种到基质细胞OP9-DL1单层上，然后每天定时观察记录R10 iHECs细胞状态，分别在day 15，day 17，day 19，day 23对细胞进行显微镜拍照，标尺，200μm。发现共培养到第四天即day 15时候，细胞明显变多，逐渐形成集落；而后day 17时有大量集落出现，共培养到day 19时，iHPCs数量大概占孔面积的80％，共培养到day 23，诱导生成的细胞已经长满整孔(图7)。图8展示了诱导iRunx1-p2a-Hoxa10多能干细胞定向分化为造血祖细胞示意图。
实施例4细胞移植
iR10 mESC来源iHPCs移植Rag1-/-小鼠能够再生髓系细胞，移植Rag1-/-小鼠过程如下：
1)提前一周向待移植小鼠饲喂加有多西环素(1mg/mL)和复方新诺明的饮水；
2)Day 23，辐照Rag1-/-小鼠，辐照剂量3.5Gy，1Gy/min，辐照后4h后进行移植；
3)将共培养的细胞上清转移到提前装好70μm滤网的50mL离心管中，然后向培养孔加入适量DPBS进行洗涤，将洗涤液转入离心管中；
4)然后加入300μL消化酶TryplETM Express，在37℃细胞培养箱消化8-10min；
5)加入适量DPBS或培养基终止消化，然后用1mL移液枪轻轻吹打成单细胞悬液，将吹打后的单细胞悬液转移到装置有70μm滤网的离心管中，转移后再用1mL DPBS洗涤培养板底部，将洗涤液一起转移到滤网上滤过，最后DPBS冲洗滤网。4℃，500g，5min离心；
6)离心后弃上清，用适量DPBS重悬细胞沉淀，并且取适量细胞计数，按照每只小鼠移植(1～15)×106计算移植细胞的数量，再4℃，500g，5min离心；
7)弃上清后所得沉淀用2％ FBS+DPBS重悬(每只移植小鼠用300μL重悬)，并通过35μm蓝盖流式管过滤，包好封口膜，置于冰上待用；
8)用阿弗丁通过腹腔注射的方式麻醉辐照过的小鼠；
9)通过眼静脉注射的方式将iHPCs移植到受体鼠体内，3×106个细胞/只；
10)移植后定时观察小鼠状态，每两天换一次加有复方新诺明的饮水，两周后更换正常饮水。
将体外诱导的iHPCs通过眼静脉移植到经亚致死剂量照射的Rag1-/-受体鼠体内。受体鼠在辐照前一周就饲喂添加复方新诺明和强力霉素(Doxycycline，dox，1mg/ml)的饮用水，使小鼠提前适应后续饮水环境。移植后三周，采集受体鼠外周血检测iHPCs移植后的体内发育情况。图9显示了Rag1-/-受体鼠外周血中再生的髓系细胞流式免疫表型分析，图中结果通过以下方法获得：收集共培养12天(分化第day23)后的iHPCs(3×106/只)通过眼静脉移植到亚致死剂量(3.5Gy)辐照过的Rag1-/-受体鼠中。采集移植3周后受体鼠的外周血，裂红后进行流式染色，再于Fortessa x20上机分析。移植细胞为与OP9-DL1共培养12天(day23)的iHPCs(EGFP+)。图中为3只受体鼠的代表性流式分析图。检测指标包括：B细胞(CD19+)、T细胞(CD3/4/8+)、NK细胞(NK1.1+)、粒细胞(CD11b+Gr1+)和单核-巨噬细胞(CD11b+Gr1-)。流式分析结果显示，受体鼠外周血中可检测到诱导再生的髓系细胞(EGFP+CD11b+)，其中主要是CD11b+Gr1+粒细胞(比例>80％)(图9)。
此外，还统计了五次独立移植实验中，iR10 mESC来源的髓系细胞在受体鼠中的贡献率，图10进行了Rag1-/-受体鼠外周血中再生的髓系细胞(CD11b+)比例统计，每次实验有5只受体鼠。比例统计图用ggplot2(R package)做出。结果表明iR10 mESC经过体外诱导和体内发育后确实能够再生髓系细胞，且该诱导过程可稳定重复。为了证实再生的髓系细胞来源于插入Runx1和Hoxa10的mESC细胞，采集受体鼠外周血，流式染色后在Arial3分选供体来源的髓系细胞(EGFP+CD11b+)。提取分选细胞的基因组，然后进行PCR鉴定。图11展示了体内再生髓系细胞的基因组PCR鉴定，图中，从受体鼠外周血分选再生髓系细胞(EGFP+CD19-CD3-CD11b+)进行基因组PCR，PC(Positive control，阳性对照)是带有目的基因Runx1和Hoxa10的质粒，NC(negative control，阴性对照)是野生型小鼠尾巴提取的基因组DNA。前向引物设计在Runx1上，后向引物设计在Hoxa10上，并跨过P2A，目的产物条带大小是1000bp。S是分选的外周血中再生的髓系细胞(400个细胞)所提取基因组DNA，使用诺唯赞1-1000单细胞基因组提取试剂盒提取基因组DNA，所得产物稀释10倍后用于PCR模板，模板量200ng。H2O是作为本体系的空白对照。PCR鉴定结果表明在1000bp左右的位置有目的基因条带。图12展示了再生髓系细胞基因组中Runx1和Hoxa10插入基因的测序结果，其中，将PCR所得产物进行DNA测序。比对结果证明插入了目的基因Runx1和Hoxa10，测序结果由Snap gene软件比对。结果表明，基因组PCR产物的测序结果与目的序列一致。
综上，iR10 iHPCs在体内分化产生了髓系细胞，且该再生髓系细胞确实来源于打靶的iR10 mESC细胞。
实施例5探究再生的髓系细胞在体内的发育和分布情况
为了研究再生的髓系细胞在体内的发育和分布情况，在移植5周后分离受体鼠的骨髓和脾脏组织，制成单细胞悬液，染色后进行流式检测。图13显示了骨髓和脾脏再生髓系细胞流式分析结果，图中结果通过以下方法获得：收集共培养12天(分化第day23)后的iHPCs(3×106/只)通过眼静脉移植到亚致死剂量(3.5Gy)辐照过的Rag1-/-受体鼠中。采集移植3周后受体鼠的外周血，裂红后进行流式染色，再于Fortessa x20上机分析。移植细胞为与OP9-DL1共培养12天(day 23)的iHPCs(EGFP+)。图中为3只受体鼠的代表性流式分析图。检测指标包括：B细胞(CD19+)、T细胞(CD3/4/8+)、NK细胞(NK1.1+)、粒细胞(CD11b+Gr1+)和单核-巨噬细胞(CD11b+Gr1-)。图13结果显示，在骨髓和脾脏中也检测到再生的髓系细胞(EGFP+CD11b+)。具体而言，骨髓细胞中EGFP+细胞比例为1.1％，其中90％以上为CD11b+髓系细胞，由77.4％CD11b+Gr1+粒细胞和18.5％的CD11b+Gr1-单核-巨噬细胞组成；脾脏细胞中EGFP+细胞占总细胞的0.6％，其中有71.5％的髓系细胞，由51％的粒细胞和20.5％的单核-巨噬细胞组成；另有少量B细胞(CD19+，17％)和T细胞(CD3+，3.6％)。此外，在骨髓和脾脏中均能检测到少量NK细胞(NK1.1+，1.5％和3.7％)。这说明iR10 mESC诱导的iHPCs成功植入受体鼠中，且具有高效产生髓系细胞的能力。
为了研究R10 iHPCs在体内再生髓系细胞的具体类型，采集移植五周后受体鼠的外周血并进行流式分析。图14展示了移植后第5周对Rag1-/-受体小鼠外周血进行流式分析结果，其中，嗜碱性粒细胞(Basophil)：CD11b+FceRIα+；嗜酸性粒细胞(Eosinophil)：CD11b+SiglecF+；中性粒细胞(Neutrophils)：CD11b+Ly6G+；Ly6Clow单核细胞：CD11b+CD115+Ly6Clow；Ly6Chi单核细胞：CD11b+CD115+Ly6Chi。图14结果显示，外周血中的再生髓系细胞主要是中性粒细胞(EGFP+CD11b+Ly6G+)，在EGFP+细胞中比例高达70％，明显高于野生型小鼠中性粒细胞的比例(33.7％)；同时嗜酸性粒细胞(EGFP+SiglecF+)比例占EGFP+细胞的21％，而野生型对照是34％。另外也检测到少量的单核细胞，包括Ly6Clow和Ly6Chi两类单核细胞。其中Ly6Chi单核细胞是促进炎症反应和抗微生物感染作用，Ly6Clow单核细胞是在血流中起循环和监视作用。
为了研究各造血组织中iHPCs再生髓系细胞的具体类型，在移植后第三周牺牲受体鼠，分离骨髓和脾脏，制成单细胞悬液，染色后进行流式分析。图15为移植3周后，Rag1-/-受体鼠骨髓、脾脏和外周血中的粒细胞、单核细胞和巨噬细胞流式分析结果，单核细胞：CD11b+Gr1-F4/80-；粒细胞：CD11b+Gr1+，巨噬细胞：CD11b+F4/80+。结果显示，在骨髓和脾脏中均检测到再生的粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。其中骨髓细胞里粒细胞在EGFP+细胞比例为33.1％，单核细胞比例占CD11b+Gr1-细胞群的72.7％，巨噬细胞比例占CD11b+Gr1-细胞群的17.6％。脾脏中粒细胞占EGFP+细胞的13.3％；同时也存在再生的单核细胞(70.9％)和巨噬细胞(16.9％)。以上结果说明受体鼠骨髓和脾脏中均再生了髓系细胞，主要类型为粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。
实施例6 iR10 mESC来源iHPCs移植后救活致死辐照损伤动物
将体外诱导的iHPCs移植到致死剂量照射的WT受体鼠体内，验证再生的粒/单核/巨噬髓系细胞是否能够挽救辐照损伤的动物。受体鼠在辐照前一周就饲喂添加复方新诺明和强力霉素(Doxycycline，dox，1mg/ml)的饮用水，使小鼠提前适应后续饮水环境。随后按每只107个iHPCs通过眼静脉注射到受体鼠内，每天观察受体鼠状态并记录死亡小鼠的日期。图16结果显示未移植的受体鼠因辐射损伤均在2周内死亡，而移植了具有粒/单核/巨噬髓系分化能力的iHPC的受体鼠大部分都活了下来。说明再生的细胞具备正常生理功能，能够挽救辐射损伤的受体鼠。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种表达载体，其特征在于，包括编码Runx1和Hoxa10基因的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述编码Runx1和Hoxa10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求1或2所述的表达载体。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为多能干细胞；
任选地，所述多能干细胞为哺乳动物胚胎干细胞；
任选地，所述多能干细胞为未经过体内发育的受精14天以内的胚胎干细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，在所述宿主细胞中，编码Runx1和Hoxa10基因的表达元件插入到宿主细胞的不会对基因组功能产生影响的位点处。
6.一种再生髓系细胞的方法，其特征在于，包括：
(1)将权利要求3-5中任一项所述的宿主细胞诱导分化为生血内皮细胞；
(2)将所述生血内皮细胞与基质细胞共培养，获得诱导型造血祖细胞；
(3)将所述诱导型造血祖细胞移植到哺乳动物体内培养，从所述哺乳动物的骨髓、脾脏或外周血中分离获得髓系细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述髓系细胞包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞；
任选地，所述基质细胞包括选自OP9-DL1细胞、OP9细胞或MS5细胞中的至少之一；
任选地，所述哺乳动物为啮齿目动物。
8.一种髓系细胞，其特征在于，所述髓系细胞通过权利要求6或7所述的再生髓系细胞的方法制备获得。
9.一种细胞产品，其特征在于，所述细胞产品包括权利要求8所述的髓系细胞。
10.权利要求1或2所述的表达载体、权利要求3-5中任一项所述的宿主细胞、权利要求8所述的髓系细胞在制备细胞产品中的用途。
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