CN116396940A - 造血干祖细胞及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,具体涉及造血干祖细胞及其制备方法和用途。更具体而言,本发明涉及共表达转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10的多能干细胞,由所述多能干细胞体外产生造血干祖细胞的方法以及所产生的造血干祖细胞,所述造血干祖细胞在移植进体内后能实现多谱系造血的重建。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及造血干祖细胞及其制备方法和用途。更具体而言,本发明涉及共表达转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10的多能干细胞,由所述多能干细胞体外产生造血干祖细胞的方法以及所产生的造血干祖细胞,所述造血干祖细胞在移植进体内后能实现多谱系造血的重建。
发明背景
目前造血干细胞移植主要来源于自体移植和HLA相合的异体移植,有限的来源限制了造血干细胞移植的广泛应用。因此找到一种可替代的来源用于造血干细胞移植不失为一种好的策略。
多能干细胞(pluripotent stem cell,PSC)作为一种可以无限增殖而且具有分化成为其他细胞类型的细胞,被广泛用于研究。利用转录因子介导的细胞命运转换可以诱导PSC在体内实现短期或者长期的造血谱系重建。转录因子在造血细胞命运决定过程中发挥着重要作用,有的时候单个转录因子就可以实现细胞谱系的转换,也有的需要多个转录因子的组合在一起才决定细胞的谱系转换。转录因子RUNX1在内皮造血转换(endothelial-to-hematopoietic transition,EHT)过程发挥重要作用。转录因子HOXA9在造血干细胞扩增和向淋系分化的过程中发挥作用。RUNX1和HOXA9的组合可以实现体内T谱系再生(PMID:31729468)。目前已经有一些研究利用不同的转录因子组合可以实现体内短期或者长期的多谱系造血重建。例如,RUNX1、ERG、LCOR、HOXA5和HOXA9五个转录因子的组合可以诱导人的PSC实现体内多谱系再生(PMID:28514439)。FOSB、GFI1、RUNX1和SPI1可以促进人的PSC在体外再生人的多能祖细胞(MPP),移植受体鼠之后在体内产生多谱系(PMID:25030167)。
这些研究对造血干细胞的移植来说提供了重要的理论基础,但是仍然存在很多问题:(1)这些能够体内产生多谱系的转录因子组合都是不同的,还没有一组公认的转录因子组合可以实现体内多谱系再生;(2)目前能够实现体内多谱系重建的方法大多数是利用病毒转导系统,比如是慢病毒、逆转录病毒等,这些病毒转导的基因都是随机插入宿主细胞的基因组中,具有不稳定性,不能确定之后用于移植的造血干祖细胞是否单个细胞都表达所有的转录因子组合,无法在遗传学上实现均一的转录因子组合用于PSC的诱导分化过程;(3)迄今为止,没有再生的造血干细胞移植在临床上的应用,说明已有的技术还未成熟,需要进一步研究;(4)再生造血干祖细胞谱系命运决定机制不明确。
本领域仍然需要找到特定转录因子组合,其能够稳定、高效地将PSC体外诱导分化产生可移植的造血干祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC),所述造血干祖细胞移植之后能够在体内稳定再生多谱系。
发明简述
在一方面,本发明提供一种用于产生造血干祖细胞的多能干细胞,其能够表达或共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10,例如,所述用于产生造血干祖细胞的多能干细胞包含
i)包含转录因子RUNX1的编码核酸序列的表达构建体,
ii)包含转录因子HOXA9的编码核酸序列的表达构建体,和
iii)包含转录因子HOXA10的编码核酸序列的表达构建体,
由此所述多能干细胞能够共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10。
在一个实施方案中,所述多能干细胞不过表达除Runx1、Hoxa9和Hoxa10之外的其他转录因子,或其不包含除RUNX1、HOXA9和HOXA10之外的其他外源的转录因子的编码核酸序列。
在一个实施方案中,所述多能干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。
在一个实施方案中,转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10来自哺乳动物,例如来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人,优选来自人。
在一个实施方案中,转录因子RUNX1包含选自SEQ ID NO:1-4和8-10的氨基酸序列;转录因子HOXA9包含选自SEQ ID NO:5-6和11的氨基酸序列;转录因子HOXA10包含选自SEQ ID NO:7和12的氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列和HOXA10的编码核酸序列全部置于同一表达构建体。
在一个实施方案中,RUNX1、HOXA9和HOXA10的编码核苷酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)序列或自裂解肽的编码核苷酸序列相互连接。
在一个实施方案中,所述自裂解肽选自P2A、E2A、F2A和T2A,优选P2A。
在一个实施方案中,所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列、HOXA10的编码核酸序列与表达调控元件可操作地连接。
在一个实施方案中,所述表达调控元件包括启动子,例如诱导型启动子,例如强力霉素诱导型启动子。
在一个实施方案中,所述表达构建体还包括用于筛选包含所述表达构建体的多能干细胞的筛选标记,例如抗性标记、营养缺陷型标记或荧光标记,优选地,所述筛选标记是潮霉素抗性标记或嘌呤霉素抗性标记。
在一个实施方案中,所述转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10的表达构建体被稳定地整合进所述多能干细胞的基因组。
在一个实施方案中,所述表达构建体被靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点,例如安全位点,优选Rosa26位点或Hipp11位点。
在一个实施方案中,表达构建体通过同源重组例如序列特异性核酸酶介导的同源重组靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点。
在一方面,本发明提供一种产生造血干祖细胞的方法,包括:
(a)提供本发明的多能干细胞;和
(b)在使得转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10表达(例如共表达,优选共过表达)的条件下培养所述多能干细胞,从而产生造血干祖细胞。
在一个实施方案中,所述步骤(b)包括
(b1)使所述多能干细胞定向分化成生血内皮细胞;和
(b2)使所述生血内皮细胞与基质细胞共培养,由此生成造血干祖细胞。
在一个实施方案中,所述步骤(b1)包括:
在第一培养基中使所述多能干细胞形成拟胚体(EB)并培养第一时间段;
在第二培养基培养EB第二时间段;
在第三培养基培养EB第三时间段;和
任选地,收获生成的生血内皮细胞。
在一个实施方案中,其中
所述第一时间段为1-5天,可选的大约2-3天;
所述第二时间段2-7天,可选的大约3-4天;和/或
所述第三时间段为2-10天,可选的大约4-6天。
在一个实施方案中,在第一培养基中通过悬滴法使所述多能干细胞形成拟胚体(EB)。
在一个实施方案中,所述第一培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、抗坏血酸和骨形态发生蛋白4的IMDM培养基,
优选地,所述第一培养基为含有大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约30-80μg/ml抗坏血酸和大约2-10ng/mL骨形态发生蛋白4的IMDM培养基,
更优选地,所述第一培养基为含有大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约50μg/mL抗坏血酸和大约5ng/mL骨形态发生蛋白4的IMDM培养基。
在一个实施方案中,所述第二培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、抗坏血酸、骨形态发生蛋白4和血管内皮生长因子的IMDM培养基;
优选地,所述第二培养基为含有大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约30-80μg/ml抗坏血酸、大约2-10ng/mL骨形态发生蛋白4和大约2-15ng/mL血管内皮生长因子的IMDM培养基;
更优选地,所述第二培养基为含有大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约50μg/mL抗坏血酸、大约5ng/mL骨形态发生蛋白4和大约5ng/mL血管内皮生长因子的IMDM培养基。
在一个实施方案中,所述第三培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、抗坏血酸、白介素3、白介素6、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体,以及任选地含有强力霉素的IMDM培养基;
优选地,所述第三培养基为含有大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约30-80μg/ml抗坏血酸、大约10-50ng/ml白介素3、大约10-50ng/ml白介素6、大约10-50ng/ml干细胞因子、大约10-50ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体,以及任选地含有大约0.5-3μg/mL强力霉素的IMDM培养基;
更优选地,所述第三培养基为含有大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约50μg/mL抗坏血酸、大约20ng/mL白介素3、大约20ng/mL白介素6、大约20ng/mL干细胞因子、大约20ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体,以及任选地含有大约1μg/mL强力霉素的IMDM培养基。
在一个实施方案中,收获生成的具有CD31+CD41+c-Kit+CD201+免疫表型的生血内皮细胞,优选地,通过流式细胞术分选收获所述生血内皮细胞。
在一个实施方案中,所述步骤(b2)中的基质细胞选自OP9-DL1细胞、OP9细胞、MS5细胞或它们的任意组合,优选地,所述基质细胞是OP9-DL1细胞。
在一个实施方案中,所述步骤(b2)中,使步骤(b1)获得的生血内皮细胞与基质细胞在第四培养基中共培养第四时间段。
在一个实施方案中,所述第四时间段为大约7-10天,例如10天。
在一个实施方案中,所述第四培养基为含有白介素3、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和抗坏血酸,以及任选地含有强力霉素的α-MEM培养基或IMDM培养基;
优选地,所述第四培养基为含有大约10-50ng/mL白介素3、大约10-50ng/mL干细胞因子、大约10-50ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体、大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和大约30-80μg/mL抗坏血酸,以及任选地含有大约0.5-3μg/mL强力霉素的α-MEM培养基或IMDM培养基;
更优选地,所述第四培养基为含有大约20ng/mL白介素3、大约20ng/mL干细胞因子、大约20ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体、大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和大约50μg/mL抗坏血酸,以及任选地含有大约1μg/mL强力霉素的α-MEM培养基或IMDM培养基。
在一方面,本发明提供一种造血干祖细胞,其通过本发明的方法制备。
在一个实施方案中,所述造血干祖细胞具有免疫表型Lin-c-Kit+Sca1+。
在一个实施方案中,所述造血干祖细胞能够(例如在植入受体对象后)分化成髓样谱系和淋巴样谱系。
在一个实施方案中,所述造血干祖细胞能够(例如在植入受体对象后)分化成选自单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板和树突细胞之中的一种、两种、三种、四种或更多种或全部的细胞类型。
在一个实施方案中,所述造血干祖细胞能够(例如在植入受体对象后)分化成T细胞、B细胞、和/或NK细胞。
在一个实施方案中,所述造血干祖细胞能够(例如在植入受体对象后)分化成B1-a、B1-b、FO B和/或MZ B亚型的B细胞。
在一个实施方案中,所述造血干祖细胞在植入受体对象后,能够实现长期多谱系造血重建,例如,所述造血干祖细胞在植入受体对象后,能够在至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、甚至至少6个月或更长的时间段实现多谱系造血重建。
在一个实施方案中,所述对象是哺乳动物,例如小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人,优选是人。
在一方面,本发明提供一种药物组合物,其包含有效量的本发明的造血干祖细胞以及药学上可接受的载剂。
在一方面,本发明提供一种在对象体内多谱系造血重建的方法,所述方法包括给有需要的对象施用有效量的本发明的造血干祖细胞或本发明的药物组合物。
在一方面,本发明提供一种用于在对象中治疗造血功能缺陷相关疾病的方法,所述方法包括给有需要的对象施用有效量的本发明的造血干祖细胞或本发明的药物组合物。
在一方面,本发明提供一种用于在对象中治疗造血功能缺陷相关疾病的试剂或试剂盒,所述试剂或试剂盒可用来给有需要的对象施用有效量的本发明的造血干祖细胞或本发明的药物组合物。
在一方面,本发明提供本发明的造血干祖细胞或本发明的药物组合物在制备用于在对象体内多谱系造血重建或用于在对象中治疗造血功能缺陷相关疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中,所述造血功能缺陷相关疾病选自淋巴瘤(如非何杰金淋巴瘤),骨髓瘤(如多发性骨髓瘤),白血病(如急性髓细胞性白血病(AML)和急性成淋巴细胞性白血病(ALL)),贫血(如遗传性贫血、镰状细胞性贫血、地中海贫血、再生障碍性贫血),放射损伤,自身免疫性失调(系统性红斑狼疮、系统性硬化病),遗传代谢性疾病(如粘多糖病、肾上腺脑白质营养不良、慢性肉芽肿)。
附图简述
图1.定点敲入多能干细胞Rosa26位点的可诱导表达系统示意图。
图2.通过潮霉素B抗性筛选获得的iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞明场图(左)以及荧光图(右)(标尺100μm)。
图3.使用强力霉素处理24小时后Runx1、Hoxa9以及Hoxa10的相对表达水平。
图4.Runx1、Hoxa9和Hoxa10的多能干细胞的细胞基因组PCR及测序鉴定。
图5.诱导iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞定向分化为诱导生血内皮(iHEC)的拟胚体定向诱导分化体系示意图。
图6.诱导iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞定向分化至第11天的EB拟胚体细胞分化形态图(标尺200μm)。
图7.采用流式分选策略(CD31+CD41+c-Kit+CD201+)分选诱导生血内皮的流式结果图。
图8.诱导生血内皮细胞与基质细胞共培养10天的造血细胞图(标尺200μm)。
图9.iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞来源的生血内皮细胞与基质细胞共培养10天产生的造血细胞的免疫表型的流式检测图LSK(Lin-c-Kit+Sca1+)。
图10.流式细胞术检测移植后6周PB、BM和SP中再生的髓系细胞、B细胞和T细胞的结果图。
图11.流式细胞术检测移植后8周PB中再生的NK细胞的结果图。
图12.分选移植后12周PB中的再生髓系细胞、B细胞和T细胞做基因组测序的流程图。
图13.移植后12周分选再生髓系细胞、T细胞和B细胞的流式分选策略图。
图14.移植后12周外周血中再生的髓系细胞、T细胞和B细胞的基因组PCR及测序结果图。
图15.流式细胞术检测移植后24周外周血中的再生髓系细胞、T细胞和B细胞的结果图。
图16.UMAP图显示移植后16周外周血中存在再生的髓系细胞、T细胞、B细胞、红细胞和血小板。
图17.UMAP图显示移植后16周外周血中存在再生的髓系细胞、T细胞、B细胞、红细胞和血小板的基因表达谱。
图18.Violin图显示移植后16周受体小鼠外周血中所选表面标记物的表达谱。
图19.Dot plot(点图)显示所标记基因的平均表达。
图20.流式细胞术检测移植后6周骨髓中MP的结果图。
图21.流式细胞术检测移植后6周骨髓中proB的结果图。
图22.流式细胞术检测移植后6周骨髓中CLP的结果图。
图23.流式细胞术检测移植后16周外周血中的髓系细胞亚型的结果图。
图24.流式细胞术检测移植后16周骨髓中的髓系细胞亚型的结果图。
图25.流式细胞术检测移植后16周脾脏中的髓系细胞亚型的结果图。
图26.流式细胞术检测移植后16周脾脏中的树突状细胞的结果图。
图27.再生的B细胞亚型分析结果图。
图28.再生的T细胞的激活状态分析图。
发明详述
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如,本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知,并且在如下文献中有更全面的描述:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold SpringHarbor,1989(下文称为“Sambrook”)。
如本文所用,术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合,应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如,“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如,“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时,所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成,或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸,但仍然具有本发明所述的活性。此外,本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留,但不实质影响多肽的功能。因此,本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时,尽管其可能不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸,然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列,相应地,其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子;反之亦然。
在一方面,本发明提供一种用于产生造血干祖细胞的多能干细胞,其能够表达或共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10。
在一些实施方案中,所述多能干细胞是经修饰的多能干细胞。如本文所用,“过表达”指的是在相同或相似条件下,基因或蛋白在经修饰的细胞中表达量高于(或显著高于)相应的未经修饰的细胞。
如本文所用,多能干细胞是能够在体外长期增殖同时保留分化成多种甚至所有细胞类型(包括本文所述的造血干祖细胞)的潜能的干细胞。
在一些实施方案中,所述用于产生造血干祖细胞的多能干细胞包含
i)包含转录因子RUNX1的编码核酸序列的表达构建体,
ii)包含转录因子HOXA9的编码核酸序列的表达构建体,和
iii)包含转录因子HOXA10的编码序列的表达构建体,
由此所述多能干细胞能够共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10。
在一些实施方案中,本发明的多能干细胞不过表达除Runx1、Hoxa9和Hoxa10之外的其他转录因子。在一些实施方案中,本发明的多能干细胞不包含除Runx1、Hoxa9和Hoxa10之外的其他外源的(导入的)转录因子的编码核酸序列。
在另一方面,本发明提供一种产生用于产生造血干祖细胞的多能干细胞的方法,其包含将
i)包含转录因子RUNX1的编码核酸序列的表达构建体,
ii)包含转录因子HOXA9的编码核酸序列的表达构建体,和
iii)包含转录因子HOXA10的编码核酸序列的表达构建体,
导入多能干细胞,由此使得所述多能干细胞能够共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10。
在一些实施方案中,本发明的方法不包含向多能干细胞导入除RUNX1、HOXA9和HOXA10之外的其他的转录因子的编码核酸序列。
在另一方面,本发明提供一种产生用于产生造血干祖细胞的多能干细胞的方法,其包含通过修饰编码所述RUNX1、HOXA9和HOXA10的内源基因(例如修饰其内源基因中的表达调控区如启动子区)来增加所述转录因子在多能干细胞中的表达。
如本文所用,针对序列而言的“外源”意指来自外来物种的序列,或者如果来自相同物种,则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
本文所述的多能干细胞可以是来自哺乳动物,例如是小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人的多能干细胞。优选地,本文所述的多能干细胞是人多能干细胞。本文所述的多能干细胞包括但不限于胚胎干细胞(ESC)或诱导性多能干细胞(iPSC)。优选地,本文所述的多能干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。
本文所述的胚胎干细胞(ESC),其来源可以是人或非人动物。对于人胚胎干细胞(ESC)仅限于利用未经过体内发育的受精14天以内的人胚胎分离获取的干细胞。
本文所述的iPSC可以来源于任何细胞类型。例如,起始细胞类型可以是角质形成细胞、成纤维细胞、造血细胞、间充质细胞、肝细胞或胃细胞。iPSC的诱导对细胞分化的程度或收集细胞的对象的年龄没有限制;甚至未分化的祖细胞(包括成体干细胞)和最终分化的成熟细胞可以用作本文的iPSC的来源。本领域技术人员可以容易地施用本领域已知的方法产生诱导的多能干细胞。例如,可以使用重编程因子用于从体细胞产生多能干细胞。然而,也可能使用小分子化合物从体细胞诱导多能干细胞。或者,可以通过重编程因子和小分子化合物的组合从体细胞诱导多能干细胞。
转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10可以来自哺乳动物,例如来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人,优选来自人。转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10还涵盖这些转录因子的天然变体或工程化改造的功能性变体。
示例性的小鼠Runx1氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:1-4之一所示的氨基酸序列。示例性的小鼠Hoxa9氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:5-6之一所示的氨基酸序列。示例性的小鼠Hoxa10氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。示例性的人RUNX1氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:8-10之一所示的氨基酸序列。示例性的人HOXA9氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。示例性的人HOXA10氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸”可互换使用并且是单链或双链RNA或DNA聚合物,任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代:“A”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应RNA或DNA),“C”表示胞苷或脱氧胞苷,“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷,“U”表示尿苷,“T”表示脱氧胸苷,“R”表示嘌呤(A或G),“Y”表示嘧啶(C或T),“K”表示G或T,“H”表示A或C或T,“D”表示A、T或G,“I”表示肌苷,并且“N”表示任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、和“蛋白”在本发明中可互换使用,指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”还可包括修饰形式,包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
如本发明所用,“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如,核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体,或者,在一些实施方式中,可以是能够翻译的RNA(如mRNA),例如是体外转录生成的RNA。表达构建体也可以指已经整合在生物体基因组中的表达盒,只要其能够实现感兴趣的核苷酸序列的表达。
本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列,或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的表达调控序列和感兴趣的核苷酸序列。
“表达调控序列”和“表达调控元件”可互换使用,指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列),并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案中,启动子是能够控制细胞中基因转录的启动子,无论其是否来源于所述细胞。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或诱导型启动子。“组成型启动子”指一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用,并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达,而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。“诱导型启动子”响应内源性或外源性刺激(环境、激素、化学信号等)而选择性表达可操纵连接的DNA序列。
如本文中所用,术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于,启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如,编码序列或开放读码框)连接,使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
在本发明各方面的一些实施方案中,所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列、HOXA10的编码核酸序列中的至少两种或全部三种置于同一表达构建体,例如,上述i)包含转录因子RUNX1的编码核酸序列的表达构建体,ii)包含转录因子HOXA9的编码核酸序列的表达构建体,和iii)包含转录因子HOXA10的编码序列的表达构建体可以是同一构建体。在本发明各方面的一些实施方案中,所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列和HOXA10的编码核酸序列也分别置于不同表达构建体。
在本发明各方面的一些实施方案中,所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列、HOXA10的编码核酸序列与表达调控元件可操作地连接。在一些实施方案中,所述表达调控元件包括启动子。
通过同一表达构建体表达不同蛋白的方法是本领域已知的。例如,可以在同一表达构建体中将不同的蛋白置于不同的转录调控元件(例如不同启动子)的控制下。或者,可以将不同的蛋白通过自裂解肽(例如2A肽,包括但不限于P2A、E2A、F2A和T2A等)融合,然后置于相同转录调控元件(例如相同启动子)的控制下,使得在翻译时或翻译后通过自裂解肽的自裂解产生分开的不同蛋白。又或者,可以在不同蛋白的编码核酸序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES)。
在本发明各方面的一些实施方案中,RUNX1、HOXA9和HOXA10的编码核苷酸序列置于同一表达构建体,通过内部核糖体进入位点(IRES)序列或“自裂解肽”的编码核苷酸序列相互连接,并由同一表达调控元件如同一启动子控制表达。
如本文所用“自裂解肽”意指可以在细胞内实现自剪切的肽。例如,所述自裂解肽可以包含蛋白酶识别位点,从而被细胞内的蛋白酶识别并特异性切割。或者,所述自裂解肽可以是2A多肽。2A多肽是一类来自病毒的短肽,其自切割发生在翻译期间。当用2A多肽连接两种不同目的蛋白在同一读码框表达时,几乎以1:1的比例生成两种目的蛋白。常用的2A多肽可以是来自猪捷申病毒(porcine techovirus-1)的P2A、来自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的T2A、马甲型鼻病毒(equine rhinitis A virus)的E2A和来自口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)的F2A。其中P2A的切割效率最高,因此是优选的。本领域也已知多种这些2A多肽的功能性变体,这些变体也可以用于本发明。
在本发明各方面的一些实施方案中,所述启动子是诱导型启动子。在使用诱导型启动子的情况下,可以仅在有需要的情况下诱导转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10在所述细胞中的表达。示例性的诱导型启动子包括但不限于四环素诱导型启动子和强力霉素诱导型启动子。在一些具体实施方案中,所述诱导型启动子是强力霉素诱导型启动子。强力霉素诱导型启动子允许通过使细胞与强力霉素接触(例如在细胞培养基中添加一定浓度的强力霉素)而诱导所述转录因子的表达。
在本发明各方面的一些实施方案中,所述表达构建体还包括用于筛选包含所述表达构建体的多能干细胞的筛选标记。所述筛选标记包括但不限于抗性(例如潮霉素抗性、嘌呤霉素抗性)标记、营养缺陷型标记或荧光标记。
在本发明各方面的一些实施方案中,所述表达构建体通过本领域已知的核酸递送方法导入所述多能干细胞中。所述核酸递送方法包括但不限于脂质体介导的转染、受体介导的转染、电穿孔、磷酸钙沉淀法、显微注射等方法。
在本发明各方面的一些实施方案中,所述转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10的表达构建体(如表达盒)被稳定地整合进所述多能干细胞的基因组。在一些实施方案中,所述表达构建体被靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点,例如安全位点。所述安全位点包括但不限于Rosa26位点或Hipp11位点。如本文所用,“安全位点”指的是在该位点整合进外源序列后,该整合本身(不包括外源序列的作用)并不会给细胞或生物体带来实质的不利影响。
在本发明各方面的一些实施方案中,所述表达构建体通过同源重组靶向整合进所述多能干细胞基因组中的特定位点。在本发明各方面的一些实施方案中,所述表达构建体通过序列特异性核酸酶介导的同源重组靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点。
合适的序列特异性核酸酶包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR核酸酶。合适的CRISPR核酸酶例如可以选自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Cas9、Csn2、Cas4、Cpf1(Cas12a)、C2c1、C2c3或C2c2蛋白,或这些核酸酶的功能性变体。
通过同源重组或序列特异性核酸酶介导的同源重组将外源序列靶向整合进细胞基因组的技术是本领域已知的且在本领域技术人员的能力范围内。
在另一方面,本发明提供了本发明的多能干细胞在产生造血干祖细胞中的用途。
在另一方面,本发明提供一种产生造血干祖细胞的方法,包括:
(a)提供本发明的或通过本发明的方法产生的用于产生造血干祖细胞的多能干细胞;和
(b)在使得转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10表达(例如共表达,优选共过表达)的条件下培养所述多能干细胞,从而产生造血干祖细胞。
在一些实施方案中,所述步骤(b)包括(b1)使所述多能干细胞定向分化成生血内皮细胞;和(b2)使所述生血内皮细胞与基质细胞共培养,由此生成造血干祖细胞。
在一些实施方案中,所述步骤(b1)包括:
在第一培养基中使所述多能干细胞形成拟胚体(EB)并培养第一时间段;
在第二培养基培养EB第二时间段;
在第三培养基培养EB第三时间段;和
任选地,收获生成的生血内皮细胞。
在一些实施方案中,所述第一时间段为1-5天,例如大约2-3天。在一些实施方案中,所述第二时间段为2-7天,例如大约3-4天。在一些实施方案中,所述第三时间段为2-10天,例如大约4-6天。
在一些实施方案中,在第一培养基中通过悬滴法使所述多能干细胞形成拟胚体(EB)。
在一些实施方案中,所述培养在大约37摄氏度下进行。在一些实施方案中,在各个时间段内,每两天更换一次相应的新鲜培养基。
在一些实施方案中,所述第一培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)、抗坏血酸和骨形态发生蛋白4的IMDM培养基(例如,购自Gibco/Procell的IMDM培养基)。
在一些实施方案中,所述第一培养基为含有大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)、大约30-80μg/ml抗坏血酸和大约2-10ng/mL骨形态发生蛋白4的IMDM培养基(例如,购自Gibco/Procell的IMDM培养基)。
在一些实施方案中,所述第一培养基为含有大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)、大约50μg/mL抗坏血酸和大约5ng/mL骨形态发生蛋白4的IMDM培养基(例如,购自Gibco/Procell的IMDM培养基)。
在一些实施方案中,所述第二培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)、抗坏血酸、骨形态发生蛋白4和血管内皮生长因子的IMDM培养基(例如,购自Gibco/Procell的IMDM培养基)。
在一些实施方案中,所述第二培养基为含有大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)、大约30-80μg/ml抗坏血酸、大约2-10ng/mL骨形态发生蛋白4和大约2-15ng/mL血管内皮生长因子的IMDM培养基(例如,购自Gibco/Procell的IMDM培养基)。
在一些实施方案中,所述第二培养基为含有大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)、大约50μg/mL抗坏血酸、大约5ng/mL骨形态发生蛋白4和大约5ng/mL血管内皮生长因子的IMDM培养基(例如,购自Gibco/Procell的IMDM培养基)。
在一些实施方案中,所述第三培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)、抗坏血酸、白介素3(例如重组小鼠白介素3)、白介素6(例如重组小鼠白介素6)、干细胞因子(例如重组小鼠干细胞因子)、FMS样酪氨酸激酶3配体的IMDM培养基(例如,购自Gibco/Procell的IMDM培养基)。任选地,所述第三培养基还含有强力霉素。
在一些实施方案中,所述第三培养基为含有大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)、大约30-80μg/ml抗坏血酸、大约10-50ng/ml白介素3(例如重组小鼠白介素3)、大约10-50ng/ml白介素6(例如重组小鼠白介素6)、大约10-50ng/ml干细胞因子(例如重组小鼠干细胞因子)、大约10-50ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体的IMDM培养基(例如,购自Gibco/Procell的IMDM培养基)。任选地,所述第三培养基还含有大约0.5-3μg/mL强力霉素。
在一些实施方案中,所述第三培养基为含有大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)、大约50μg/mL抗坏血酸、大约20ng/mL白介素3、大约20ng/mL白介素6、大约20ng/mL干细胞因子、大约20ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体的IMDM培养基(例如,购自Gibco/Procell的IMDM培养基)。任选地,所述第三培养基还含有大约1μg/mL强力霉素。
在一些实施方案中,收获生成的具有CD31+CD41+c-Kit+CD201+免疫表型的生血内皮细胞。在一些实施方案中,通过流式细胞术分选收获所述生血内皮细胞。
在一些实施方案中,所述步骤(b2)中的基质细胞可以是OP9-DL1细胞、OP9细胞、MS5细胞或它们的任意组合。在一些具体实施方案中,所述基质细胞是OP9-DL1细胞。
在一些实施方案中,所述步骤(b2)中,使步骤(b1)获得的生血内皮细胞与基质细胞在第四培养基中共培养第四时间段。
在一些实施方案中,所述第四时间段为大约7-10天,例如10天。
在一些实施方案中,所述第四培养基为含有白介素3、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)和抗坏血酸的α-MEM培养基(例如,购自Gibco的α-MEM培养基)或IMDM培养基(例如,购自Gibco/Procell的IMDM培养基)。任选地,所述第四培养基还含有强力霉素。
在一些实施方案中,所述第四培养基为含有大约10-50ng/mL白介素3、大约10-50ng/mL干细胞因子、大约10-50ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体、大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)和大约30-80μg/mL抗坏血酸的α-MEM培养基(例如,购自Gibco的α-MEM培养基)。任选地,所述第四培养基还含有大约0.5-3μg/mL强力霉素。
在一些实施方案中,所述第四培养基为含有大约20ng/mL白介素3、大约20ng/mL干细胞因子、大约20ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体、大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,购自Gibco的GlutaMAXTM-I添加剂)和大约50μg/mL抗坏血酸的α-MEM培养基(例如,购自Gibco的α-MEM培养基)。任选地,所述第四培养基还含有大约1μg/mL强力霉素。
在一些实施方案中,步骤(b2)还包括收获生成的具有Lin-c-Kit+Sca1+免疫表型的造血干祖细胞。在一些实施方案中,通过流式细胞术分选收获所述造血干祖细胞。
在另一方面,本发明还提供用于制备造血干祖细胞的试剂盒,其至少包含本文所述的表达构建体和/或培养基。在一些实施方案中,所述试剂盒用于通过本发明的方法制备造血干祖细胞。
在另一方面,本发明提供了通过本发明的方法制备的造血干祖细胞。在一些实施方案中,所述造血干祖细胞具有免疫表型Lin-c-Kit+Sca1+。本发明的造血干祖细胞由本发明的多能干细胞诱导而来,因此,在一些实施方案中,所述造血干祖细胞包含i)包含转录因子RUNX1的编码核酸序列的表达构建体,ii)包含转录因子HOXA9的编码核酸序列的表达构建体,和iii)包含转录因子HOXA10的编码序列的表达构建体。在一些实施方案中,本发明的造血干祖细胞不包含RUNX1、HOXA9和HOXA10之外的其他外源的(导入的)转录因子的编码核酸序列。在另一些实施方案中,本发明的造血干祖细胞在编码所述RUNX1、HOXA9和HOXA10的内源基因(例如修饰其内源基因中的表达调控区如启动子区)中包含增加所述转录因子在多能干细胞中的表达的修饰。
在一些实施方案中,所述造血干祖细胞能够(例如在植入受体对象后)分化成髓样谱系和/或淋巴样谱系。在一些实施方案中,所述造血干祖细胞能够(例如在植入受体对象后)分化成髓样谱系和淋巴样谱系。在一些实施方案中,在植入所述造血干祖细胞后的受体对象中能够同时检测出衍生自所述造血干祖细胞的髓样谱系和淋巴样谱系细胞。
在一些实施方案中,所述造血干祖细胞(例如在植入受体后)能够分化成单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板和/或树突细胞。在一些实施方案中,所述造血干祖细胞(例如在植入受体后)能够分化成选自单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板和树突细胞中的1种、2种、3种、4种或更多种甚至全部的细胞类型。在一些实施方案中,在植入所述造血干祖细胞后的受体对象中能够同时检测出衍生自所述造血干祖细胞的选自单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板和树突细胞中的1种、2种、3种、4种或更多种甚至全部的细胞类型。
在一些实施方案中,所述造血干祖细胞(例如在植入受体对象后)能够分化成T细胞(包括T细胞、效应T细胞和/或记忆T细胞)、B细胞(包括B1-a、B1-b、FO B和/或MZ B亚型)和/或NK细胞。在一些实施方案中,在植入所述造血干祖细胞后的受体对象中能够同时检测出衍生自所述造血干祖细胞的T细胞(包括/>T细胞、效应T细胞和/或记忆T细胞)、B细胞(包括B1-a、B1-b、FO B和/或MZ B亚型)和/或NK细胞。在一些实施方案中,在植入所述造血干祖细胞后的受体对象中能够同时检测出衍生自所述造血干祖细胞的/>T细胞、效应T细胞和/或记忆T细胞。在一些实施方案中,在植入所述造血干祖细胞后的受体对象中能够同时检测出衍生自所述造血干祖细胞的B1-a、B1-b、FO B和/或MZ B亚型的B细胞。
在一些实施方案中,所述造血干祖细胞在植入受体对象后,能够实现长期多谱系造血重建。在一些实施方案中,所述造血干祖细胞在植入受体后,能够在至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、甚至至少6个月或更长的时间段实现多谱系造血重建。
“多谱系造血重建”是本领域已知术语,其指的是在体内造血功能受损或被摧毁后,通过移植造血干祖细胞,实现包括B谱系、T谱系以及髓系在内的多种谱系造血和免疫功能的恢复(重建)。
本文所述“对象”包括哺乳动物,例如使小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人,优选是人。
在另一方面,本发明提供一种药物组合物,其包含有效量的本发明的造血干祖细胞以及药学上可接受的载剂。
本文使用的“药学上可接受的载剂”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地,该载剂适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。
在另一方面,本发明提供了一种在对象体内多谱系造血重建的方法,所述方法包括给有需要的对象施用有效量的本发明的造血干祖细胞或本发明的药物组合物。在一些实施方案中,所述对象的造血功能受损。在一些实施方案中,所述对象患有造血功能缺陷相关疾病。
在另一方面,本发明提供了一种用于在对象中治疗造血功能缺陷相关疾病的方法,所述方法包括给有需要的对象施用有效量的本发明的造血干祖细胞或本发明的药物组合物。
本文上下文所述“造血功能缺陷相关疾病”包括可通过造血干细胞移植治疗的相关疾病,其可以是本身导致造血功能缺陷的疾病,或者可以是由于疾病之前的治疗(如放疗或化疗)导致造血功能缺陷的疾病。所述疾病可以是血液恶性肿瘤、遗传性血液疾病、自身免疫性疾病、遗传代谢病和实体瘤。“造血功能缺陷相关疾病”包括但不限于淋巴瘤(如非何杰金淋巴瘤),骨髓瘤(如多发性骨髓瘤),白血病(如急性髓细胞性白血病(AML)和急性成淋巴细胞性白血病(ALL)),贫血(如遗传性贫血、镰状细胞性贫血、地中海贫血、再生障碍性贫血),放射损伤,自身免疫性失调(系统性红斑狼疮、系统性硬化病),遗传代谢性疾病(如粘多糖病、肾上腺脑白质营养不良、慢性肉芽肿)等。
根据治疗的疾病不同,本发明的造血干祖细胞可以源自自体细胞或异体细胞。
在另一方面,本发明还提供了本发明的造血干祖细胞或本发明的药物组合物在制备用于在对象体内多谱系造血重建或用于在对象中治疗造血功能缺陷相关疾病的药物中的用途。
如本文所用,“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或“有效量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或细胞的量。因此,其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。在一些实施方案中,所述“有效量”是指能在对象体内实现多谱系造血重建的本发明的造血干祖细胞的量。
在一些实施方案中,所述造血干祖细胞的有效量为约103至约109个甚至更多个细胞/剂,例如至少约103、至少约104、至少约105、至少约106、至少约107、至少约108、至少约109个细胞/剂。在一些实施方案中,根据对象体重确定细胞的施用量,约103至约109个甚至更多个细胞/kg体重/剂,例如至少约103、至少约104、至少约105、至少约106、至少约107、至少约108、至少约109个细胞/kg体重/剂。
实际应用中,本发明药物组合物中细胞的剂量水平可能改变,以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应,而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素,包括应用的本发明特定组合物的活性,给药途径,给药时间,应用的特定化合物的排泄速率,治疗的持续时间,与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料,接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史,以及医学领域中公知的类似因素。
根据本发明的细胞或组合物的施用可以以任何方便的方式进行,包括通过注射、输注、植入或移植。本文所述的细胞或组合物施用可以通过静脉内、淋巴内、皮内、髓内、肌内或腹膜内施用。在一个实施方案中,本发明的细胞或组合物优选通过静脉内注射施用。
实施例
本申请以下实施例仅为了更好阐述本发明,并不意在限制本发明的范围。
实施例1.制备表达Runx1、Hoxa9和Hoxa10的表达载体以及基因编辑的多能干细胞系
本实施例是通过电转化方法结合同源重组、CRISPR/Cas9在多能干细胞的Rosa26位点敲入可诱导表达的Runx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10序列和用于抗性筛选的潮霉素B序列,在Hipp 11位点敲入GFP元件作为报告基因和用于抗性筛选的嘌呤霉素序列,如图1所示。实施例中,Runx1氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示;Hoxa9氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;Hoxa10氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。进行电转化20小时后加入含有潮霉素B(150ug/mL)的多能干细胞培养基,每天换液。采用潮霉素B筛选约10天后,在显微镜下挑取单个克隆至提前铺好的基质细胞MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)中,每孔放入一个多能干细胞克隆,采用无潮霉素的多能干细胞培养基进行培养。
待克隆团粘附在MEF细胞层中,每天换液,3天后采用0.25%胰酶消化克隆团,传代至12孔板中,细胞形态如图2所示,克隆团处于对数生长期,边缘整齐透亮与MEF细胞层有明显分界,无分化发生。根据细胞状态和生长密度,进行传代、扩增和冻存。
提取Dox处理24小时后的Runx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞总mRNA(未加Dox组作为对照组),利用RT-PCR检测Runx1、Hoxa9和Hoxa10的mRNA的表达水平。如图3所示,加入Dox可以诱导Runx1、Hoxa9和Hoxa10的表达。
将Runx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞用胰酶消化之后收集细胞提取基因组,利用基因组PCR的方法检测Runx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10元件的正确插入。结果如图4所示。
实施例2.诱导表达Runx1、Hoxa9和Hoxa10的多能干细胞向诱导生血内皮细胞(hematopoietic endothelial cell)分化
为了诱导多能干细胞的造血分化,采用如图5所示的定向造血分化体系。定向造血分化体系中各培养基的配方为:
基础分化培养基BDM:含有15v%胎牛血清、200ug/mL铁饱和转铁蛋白、0.45mM硫代甘油、2mM GlutaMAXTM-I添加剂、50μg/mL抗坏血酸的IMDM培养基;
Day0培养基:含有5ng/mL骨形态发生蛋白4的基础分化培养基;
Day2.5培养基:含有5ng/mL骨形态发生蛋白4和5ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基;
Day6培养基:含有20ng/mL重组小鼠白介素3、20ng/mL重组小鼠白介素6、20ng/mL重组小鼠干细胞因子、20ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体和1μg/mL强力霉素的基础分化培养基。
具体步骤为:
提前40min在6孔板中铺1.5mL浓度为0.1%的明胶(gelatin),待用。使用0.05%胰酶将多能干细胞消化为单细胞,离心后重悬多能干细胞。吸去0.1%gelatin,将多能干细胞悬液转移到包被有gelatin的孔中,培养箱中放置40min,以除去MEF细胞。
收集悬浮细胞,250g离心5min,使用DPBS清洗一次。使用Day0培养基重悬细胞并计数,调整细胞浓度至1x105个/mL。将5-10mL细胞悬液加入到倾斜的10cm盘中,吸取20ul细胞悬液,加入到15cm培养皿中悬浮拟胚体(EB),单个EB为20μL(约2000个细胞)。随后将培养皿倒置,并在培养皿底部放置一个10cm培养皿盖子,盖子中加入,5-6ml细胞培养用水。在37℃培养箱中培养2.5天。
用巴氏吸管将EB收集到离心管中,用DPBS清洗皿底,待EB自然沉降后小心吸去上清,亦可在90g低速离心5min去上清,加入DPBS润洗一遍,再次沉降或离心去上清。用Day2.5培养基重悬EB后,转移至低粘附的6孔板中,培养12小时观察EB是否有污染,隔天换液培养。
在定向分化第6天更换Day6培养基培养,随后隔天换液。如图6所示,在定向分化第11天,iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10分化组可见明显的造血簇;第11天的造血相关细胞群体为CD41+造血前体细胞和CD45+血液细胞。采用如图7的分选策略进行流式细胞仪分选造血干细胞前体细胞(CD31+CD41+CD45+c-Kit+CD201+)。
实施例3.分选的诱导生血内皮细胞与OP9-DL1基质细胞共培养
为了进一步从诱导生血内皮诱导分化得到造血干祖细胞(iHSPC),本实施例中将分选获得的诱导生血内皮与OP9-DL1基质细胞进行共培养。
具体步骤如下:
(1)提前4天复苏OP9-DL1细胞,根据细胞生长状态及时传代,避免细胞由于过度生长而老化;
(2)使用前一天传代,每孔重铺2万细胞(12孔板),第二天使用;使用的共培养培养基为Day11培养基,是含有20ng/mL重组小鼠白介素3、20ng/mL重组小鼠干细胞因子、20ng/mL人FMS样酪氨酸激酶3配体、1μg/mL Dox、15v%胎牛血清、200μg/mL铁饱和转铁蛋白、0.45mM硫代甘油、2mM GlutaMAXTM-I添加剂和50μg/mL抗坏血酸的α-MEM培养基;在共培养10天的时候,可以看到在基质细胞OP9-Dl1上形成了高度均一的小的、圆圆亮亮的造血细胞,如图8所示。同时利用流式细胞术检测这些细胞的免疫表型,发现这些生成的造血细胞呈现出造血干祖细胞的免疫表型,如图9所示。
实施例4.iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞来源的造血干祖细胞移植受体鼠内再生多谱系
为了利用体内微环境再生多谱系血液细胞,将体外共培养10天获得的造血干祖细胞通过眼静脉移植到8~12周龄的C57BL/6小鼠中,进行体内多谱系再生。流式检测表明iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞来源的诱导生血内皮经过共培养后获得的造血干祖细胞可以在受体C56BL/6小鼠各种造血组织以及器官中形成造血嵌合。
流式分析移植后6周的受体鼠,结果显示在外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(SP)中可以检测到再生的髓系细胞、B细胞和T细胞,结果如图10所示。
移植后8周,在受体鼠外周血中可以检测到多能干细胞来源的NK细胞,结果如图11所示。
在移植后12周,通过分选外周血中再生的髓系细胞、T细胞和B细胞来提取基因组,如图12和图13所示。基因组PCR证明再生的这些细胞来源于iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞,结果如图14所示。
还发现来源于iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞的造血干祖细胞可以在体内重建再生髓系细胞、B细胞和T细胞长达6个月,结果如图15所示。
实施例5.再生的多谱系细胞的单细胞转录组分析
为了在单细胞水平验证再生的多个谱系细胞,分选了移植后16周的外周血中的供体来源的细胞(GFP+CD45.2+)做了10X测序。测序结果证明在单细胞水平,移植后16周在外周血中存在再生的髓系细胞、T细胞、B细胞、血细胞和红细胞,结果如图16、图17、图18、图19所示。
实施例6.受体鼠骨髓中再生的上游祖细胞分析
为了进一步探索移植后供体来源的上游祖细胞,采用流式细胞术分析了移植后6周骨髓中的髓系祖细胞(MP)、proB细胞和共同淋系祖细胞(CLP),发现在骨髓中确实存在供体来源的上游的祖细胞,可以往下分化产生下游的成熟细胞,结果如图20、图21、图22所示。
实施例7.再生的髓系细胞在不同组织中的亚型分析
为了进一步研究再生的髓系细胞,采用流式细胞术分析了PB、BM和SP中的髓系细胞亚型。
如图23所示,将iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞来源的造血干祖细胞移植受体鼠之后,在移植后16周,在外周血(PB)检测到了供体来源的中性粒细胞(Neu)、嗜酸性粒细胞(Eos)、嗜碱性粒细胞(Bas)和单核细胞(Mono)。
如图24所示,将iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞来源的造血干祖细胞移植受体鼠之后,在移植后16周在骨髓中检测到了供体来源的粒细胞(Gra)、单核细胞(Mono)和巨噬细胞(Mac)。
如图25所示,将iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞来源的造血干祖细胞移植受体鼠之后,在移植后16周在脾脏中检测到了供体来源的粒细胞(Gra)、单核细胞(Mono)和巨噬细胞(Mac)。
如图26所示,将iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hoxa10多能干细胞来源的造血干祖细胞移植受体鼠之后,移植后16周在脾脏中检测到了供体来源的树突状细胞(DC)。
实施例8.再生的B细胞在不同组织的亚型分析
为了进一步分析再生的B细胞的亚型,采用流式细胞术分析了脾脏和淋巴结(LN)中的B细胞亚型。发现再生的B细胞存在B1-a、B1-b、FO B、MZ B亚型,结果如图27所示。
实施例9.再生的T细胞的生理能力分析
为了进一步分析再生的T细胞,采用流式细胞术分析了脾脏中的T细胞的激活状态。发现再生的T细胞存在T细胞(Lin-CD4+CD44-CD62L+或Lin-CD8+CD44-CD62L+),效应T细胞(Lin-CD4+CD44+CD62L-或Lin-CD8+CD44+CD62L-)和记忆T细胞(Lin-CD4+CD44+CD62L+或Lin-CD8+CD44+CD62L+),结果如图28所示。
示例性序列:
Claims (26)
1.一种用于产生造血干祖细胞的多能干细胞,其能够表达或共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10,
例如,所述用于产生造血干祖细胞的多能干细胞包含
i)包含转录因子RUNX1的编码核酸序列的表达构建体,
ii)包含转录因子HOXA9的编码核酸序列的表达构建体,和
iii)包含转录因子HOXA10的编码核酸序列的表达构建体,
由此所述多能干细胞能够共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10。
2.权利要求1的多能干细胞,其不过表达除Runx1、Hoxa9和Hoxa10之外的其他转录因子,或其不包含除RUNX1、HOXA9和HOXA10之外的其他外源的转录因子的编码核酸序列。
3.权利要求1或2的多能干细胞,其是诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。
4.权利要求1-3中任一项的多能干细胞,其中转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10来自哺乳动物,例如来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人,优选来自人;
优选地,其中转录因子RUNX1包含选自SEQ ID NO:1-4和8-10的氨基酸序列;转录因子HOXA9包含选自SEQ ID NO:5-6和11的氨基酸序列;转录因子HOXA10包含选自SEQ ID NO:7和12的氨基酸序列;
优选地,其中所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列和HOXA10的编码核酸序列全部置于同一表达构建体;
优选地,其中RUNX1、HOXA9和HOXA10的编码核苷酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)序列或自裂解肽的编码核苷酸序列相互连接;
优选地,其中所述自裂解肽选自P2A、E2A、F2A和T2A,优选P2A;
优选地,其中所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列、HOXA10的编码核酸序列与表达调控元件可操作地连接;
优选地,其中所述表达调控元件包括启动子,例如诱导型启动子,例如强力霉素诱导型启动子;
优选地,其中所述表达构建体还包括用于筛选包含所述表达构建体的多能干细胞的筛选标记,例如抗性标记、营养缺陷型标记或荧光标记,优选地,所述筛选标记是潮霉素抗性标记或嘌呤霉素抗性标记;
优选地,其中所述转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10的表达构建体被稳定地整合进所述多能干细胞的基因组;
优选地,其中所述表达构建体被靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点,例如安全位点,优选Rosa26位点或Hipp11位点;
优选地,其中表达构建体通过同源重组例如序列特异性核酸酶介导的同源重组靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点。
5.一种产生造血干祖细胞的方法,包括:
(a)提供权利要求1-4中任一项的多能干细胞;和
(b)在使得转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10表达(例如共表达,优选共过表达)的条件下培养所述多能干细胞,从而产生造血干祖细胞。
6.权利要求5的方法,其中所述步骤(b)包括
(b1)使所述多能干细胞定向分化成生血内皮细胞;和
(b2)使所述生血内皮细胞与基质细胞共培养,由此生成造血干祖细胞。
7.权利要求6的方法,其中所述步骤(b1)包括:
在第一培养基中使所述多能干细胞形成拟胚体(EB)并培养第一时间段;
在第二培养基培养EB第二时间段;
在第三培养基培养EB第三时间段;和
任选地,收获生成的生血内皮细胞。
8.权利要求7的方法,其中
所述第一时间段为1-5天,可选的大约2-3天;
所述第二时间段2-7天,可选的大约3-4天;和/或
所述第三时间段为2-10天,可选的大约4-6天。
9.权利要求7或8的方法,其中在第一培养基中通过悬滴法使所述多能干细胞形成拟胚体(EB)。
10.权利要求7-9中任一项的方法,其中所述第一培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、抗坏血酸和骨形态发生蛋白4的IMDM培养基,
优选地,所述第一培养基为含有大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约30-80μg/ml抗坏血酸和大约2-10ng/mL骨形态发生蛋白4的IMDM培养基,
更优选地,所述第一培养基为含有大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约50μg/mL抗坏血酸和大约5ng/mL骨形态发生蛋白4的IMDM培养基。
11.权利要求7-10中任一项的方法,其中所述第二培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、抗坏血酸、骨形态发生蛋白4和血管内皮生长因子的IMDM培养基;
优选地,所述第二培养基为含有大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约30-80μg/ml抗坏血酸、大约2-10ng/mL骨形态发生蛋白4和大约2-15ng/mL血管内皮生长因子的IMDM培养基;
更优选地,所述第二培养基为含有大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约50μg/mL抗坏血酸、大约5ng/mL骨形态发生蛋白4和大约5ng/mL血管内皮生长因子的IMDM培养基。
12.权利要求7-11中任一项的方法,其中所述第三培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、抗坏血酸、白介素3、白介素6、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体,以及任选地含有强力霉素的IMDM培养基;
优选地,所述第三培养基为含有大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约30-80μg/ml抗坏血酸、大约10-50ng/ml白介素3、大约10-50ng/ml白介素6、大约10-50ng/ml干细胞因子、大约10-50ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体,以及任选地含有大约0.5-3μg/mL强力霉素的IMDM培养基;
更优选地,所述第三培养基为含有大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、大约50μg/mL抗坏血酸、大约20ng/mL白介素3、大约20ng/mL白介素6、大约20ng/mL干细胞因子、大约20ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体,以及任选地含有大约1μg/mL强力霉素的IMDM培养基。
13.权利要求7-12中任一项的方法,收获生成的具有CD31+CD41+c-Kit+CD201+免疫表型的生血内皮细胞,优选地,通过流式细胞术分选收获所述生血内皮细胞。
14.权利要求7-13中任一项的方法,所述步骤(b2)中的基质细胞选自OP9-DL1细胞、OP9细胞、MS5细胞或它们的任意组合,优选地,所述基质细胞是OP9-DL1细胞。
15.权利要求7-14中任一项的方法,其中所述步骤(b2)中,使步骤(b1)获得的生血内皮细胞与基质细胞在第四培养基中共培养第四时间段;
优选地,所述第四时间段为大约7-10天,例如10天。
16.权利要求15的方法,其中所述第四培养基为含有白介素3、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和抗坏血酸,以及任选地含有强力霉素的α-MEM培养基或IMDM培养基;
优选地,所述第四培养基为含有大约10-50ng/mL白介素3、大约10-50ng/mL干细胞因子、大约10-50ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体、大约10-25v%胎牛血清、大约170-250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2-0.8mM硫代甘油、大约1-5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和大约30-80μg/mL抗坏血酸,以及任选地含有大约0.5-3μg/mL强力霉素的α-MEM培养基或IMDM培养基;
更优选地,所述第四培养基为含有大约20ng/mL白介素3、大约20ng/mL干细胞因子、大约20ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体、大约15v%胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和大约50μg/mL抗坏血酸,以及任选地含有大约1μg/mL强力霉素的α-MEM培养基或IMDM培养基。
17.一种造血干祖细胞,其通过权利要求5-16中任一项方法制备。
18.权利要求17的造血干祖细胞,其具有免疫表型Lin-c-Kit+Sca1+。
20.权利要求17-19中任一项的造血干祖细胞,所述造血干祖细胞在植入受体对象后,能够实现长期多谱系造血重建,例如,所述造血干祖细胞在植入受体对象后,能够在至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、甚至至少6个月或更长的时间段实现多谱系造血重建。
21.权利要求20的造血干祖细胞,所述对象是哺乳动物,例如小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人,优选是人。
22.一种药物组合物,其包含有效量的权利要求17-21中任一项的造血干祖细胞以及药学上可接受的载剂。
23.一种在对象体内多谱系造血重建的方法,所述方法包括给有需要的对象施用有效量的17-21中任一项的造血干祖细胞或权利要求22的药物组合物。
24.一种用于在对象中治疗造血功能缺陷相关疾病的方法,所述方法包括给有需要的对象施用有效量的有效量的权利要求17-21中任一项的造血干祖细胞或权利要求22的药物组合物。
25.权利要求17-21中任一项的造血干祖细胞或权利要求22的药物组合物在制备用于在对象体内多谱系造血重建或用于在对象中治疗造血功能缺陷相关疾病的药物中的用途。
26.权利要求24的方法或权利要求25的用途,其中所述造血功能缺陷相关疾病选自淋巴瘤(如非何杰金淋巴瘤),骨髓瘤(如多发性骨髓瘤),白血病(如急性髓细胞性白血病(AML)和急性成淋巴细胞性白血病(ALL)),贫血(如遗传性贫血、镰状细胞性贫血、地中海贫血、再生障碍性贫血),放射损伤,自身免疫性失调(系统性红斑狼疮、系统性硬化病),遗传代谢性疾病(如粘多糖病、肾上腺脑白质营养不良、慢性肉芽肿)。
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CN116574672B (zh) * | 2023-07-11 | 2023-10-20 | 北京北启生物医药有限公司 | 一种诱导化学诱导多能干细胞向生血内皮细胞分化的培养基及方法 |
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