CN116479041A

CN116479041A - 一种基因构建体以及产生多谱系造血干祖细胞的方法

Info

Publication number: CN116479041A
Application number: CN202210044106.6A
Authority: CN
Inventors: 王金勇; 吴冰燕; 张梦云; 张琪; 彭欢
Original assignee: Beijing Institute Of Stem Cell And Regenerative Medicine
Current assignee: Beijing Institute Of Stem Cell And Regenerative Medicine
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-07-25

Abstract

本申请公开了一种基因构建体，其包含RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因。还公开一种用于RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的串联共表达的载体，以及表达该载体的核酸。还公开一种宿主细胞，其包含串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因。还公开一种利用前述基因构建体产生多谱系造血干祖细胞的方法，以及该方法产生的多谱系造血干祖细胞和血液细胞。还公开一种药物组合物及其应用，所述药物组合物包括前述基因构建体、前述载体、前述宿主细胞、前述造血干祖细胞或如前述血液细胞。本申请在单细胞水平上寻找合适的基因构建体，使得在单细胞精度上可以诱导多能干细胞定向分化为造血祖细胞，并在体内实现多谱系造血重建。

Description

一种基因构建体以及产生多谱系造血干祖细胞的方法

技术领域

本申请涉及医药生物工程技术领域。具体地，本申请涉及一种基因构建体以及产生多谱系造血干祖细胞的方法。

背景技术

造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSC)是建立并维持血液系统与免疫系统的成体干细胞，具有自我更新的能力以及分化成淋系、髓系、红系等多种血液谱系的发育潜能。造血干细胞具有调节体内平衡、免疫功能、抗微生物、抗炎症等生物学功能。目前临床上主要通过异基因造血干细胞移植实现造血功能重建，用于治疗白血病和免疫系统紊乱等血液疾病。尽管造血干移植可用于治疗临床上的多种疾病，但由于缺乏及时的HLA匹配供体以及异源性移植易导致移植物抗宿主病(GVHD)阻碍了异基因造血干移植在临床中的应用。因此，从患者来源的细胞中从头生成造血细胞种子(也称造血祖细胞)，移植后重建免疫系统以及多谱系造血，一直是全世界研究的热点和难点。

目前研究领域中初步发现一些转录因子组合可以实现部分谱系的重建或短期的造血重建，但是这些因子组合都是由不同转录因子组成，且研究方法大多是利用病毒作为递呈系统，多个慢病毒基因同时转导进一个细胞的概率非常低，无法再确保后续实现移植的iHPC在遗传学上是来源于均一的转录因子组合，因此目前造血干祖细胞谱系命运的决定机制仍未明确。

迄今为止，再生手段实现临床造血转化的研究仍没有实质性突破，说明已有的技术尚未成熟，还需要进一步研究。

现有研究发现细胞身份是由转录因子控制的基因调控网络所定义的，少数调控因子的异位表达往往足以调控或改写许多细胞类型的命运。比如RUNX1基因是十分关键的造血调控转录因子，其在内皮生血转化、原始造血、永久造血以及淋巴细胞生成中起着重要的作用。HOXA9基因在HSC的增强与维持、内皮生血转化以及促进淋系生成方面起着重要作用。已有研究表明单独在多能干细胞中过表达RUNX1无法生成造血祖细胞，当RUNX1和HOXA9同时在内皮造血转化(EHT)阶段和小鼠体外分化造血成熟阶段的瞬时表达可以促进EHT阶段的发展，移植后可以实现T谱系免疫重建，但没有实现长期的多谱系造血(Guo,R.,Hu,F.,Weng,Q.et al.Guiding T lymphopoiesis from pluripotent stem cells by definedtranscription factors.Cell Res 30,21–33(2020).)。以上研究说明过表达RUNX1和HOXA9的多能干细胞在体外诱导出造血祖细胞后，将其移植到小鼠体内后可以实现T谱系免疫重建但无法实现多谱系造血重建，可能是缺乏了某些HSC特异性转录因子。

多能干细胞(pluripotent stem cells，PSCs)是一类具有无限增殖潜能、分化形成不同谱系细胞组织、易于进行基因修饰的细胞。通过将外源基因导入PSCs并进一步诱导分化用以研究转录因子在造血发育中的作用是领域内常用的研究手段。实现细胞诱导分化的途径有多种，目前体外诱导多能干细胞分化常用的方法有单层贴壁细胞诱导法、基质细胞共培养法与拟胚体诱导法(EB法)等。但单层细胞培养因不能完全模拟多细胞相互作用的体内环境、细胞趋向单一化，从而无法探讨多细胞间的相互关系。另外，有研究报道可在体外通过将多能干细胞与基质细胞共培养的方式依次诱导出造血前体细胞，B祖细胞或者T细胞，比如将小鼠或人类造血干细胞/祖细胞(HSPCs)与表达Notch配体的基质细胞系共培养，如OP9-DL1/DL4或基于3D的MS5-hDLL1，可以在体外产生T细胞，但是体外诱导产生的T细胞移植后面临严重的免疫缺陷，并且表现出内在的胸腺归巢能力缺陷(Mohtashami,M.etal.Direct comparison of Dll1-and Dll4-mediated Notch activation levels showsdifferential lymphomyeloid lineage commitment outcomes.J.Immunol.185,867–876(2010).)。以上研究说明体外诱导过程不能完全模拟多细胞相互作用的体内微环境，会导致再生的细胞存在功能缺陷。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本申请将HSC特异性转录因子HLF和/或HOXA7引入RUNX1-HOXA9体系中，旨在提供一种基因构建体以及利用所述基因构建体将多能干细胞定向分化为具备多谱系造血潜能细胞的方法，实现得在单细胞精度上诱导多能干细胞定向分化为造血祖细胞，并在体内实现多谱系造血重建。

本申请的具体技术方案如下：

本申请提供一种基因构建体，其包含RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因。

本申请还提供一种载体，其包含RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的基因序列，所述载体用于RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的串联共表达。

本申请还提供一种表达如前所述载体的核酸。

本申请还提供一种宿主细胞，其包含串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因；

优选地，所述RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因通过编码连接肽的核苷酸序列进行串联连接，优选所述连接肽为2A肽，优选所述2A肽包含T2A、P2A、E2A或F2A中的任意一种或两种以上；

优选地，所述宿主细胞包含串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因、HLF基因和HOXA7基因，其中所述RUNX1基因和HOXA9基因之间采用编码P2A的核苷酸序列进行连接，所述HOXA9基因和HLF基因之间采用编码P2A的核苷酸序列进行连接，所述HLF基因和HOXA7基因之间采用编码E2A的核苷酸序列进行连接；

优选地，所述宿主细胞是多能干细胞；

优选地，通过将串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因整合到哺乳动物多能干细胞基因组的安全位点处，以得到所述多能干细胞；

优选地，所述整合的方法包括同源重组、CRISPR/Cas9、TALEN、转染或病毒感染中的任意一种或两种以上，优选为同源重组；

优选地，所述安全位点为Rosa26位点、AAVS1位点、CCR5位点、HPRT位点、H11位点、Col1a1位点或TIGRE位点，优选为Rosa26位点。

本申请还提供一种产生多谱系造血干祖细胞的方法，其包括以下步骤：

基因编辑：将串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因整合到哺乳动物多能干细胞基因组的安全位点上，得到整合有RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的多能干细胞；

体外分化：将所述整合有RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的多能干细胞定向分化为生血内皮细胞；

共培养：将所述生血内皮细胞与哺乳动物骨髓基质细胞采用诱导培养基进行共培养，得到造血祖细胞；

体内分化：将所述造血祖细胞移植到哺乳动物中，体内发育为多谱系造血干祖细胞，所述多谱系造血干祖细胞包括B谱系祖细胞和髓系祖细胞，或者包括T谱系祖细胞、B谱系祖细胞和髓系祖细胞；

优选地，所述多谱系造血干祖细胞在体内进一步分化为：B细胞和髓系细胞；或者进一步分化为：T细胞、B细胞和髓系细胞。

优选地，所述整合方法包括同源重组、CRISPR/Cas9、TALEN、转染或病毒感染中的任意一种或两种以上，优选为同源重组；

优选地，将串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的cDNA序列串联表达于同一载体并整合到哺乳动物多能干细胞基因组的安全位点处；

优选地，依次采用D0培养基、D2.5培养基、D6培养基培养所述整合有RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的多能干细胞，以得到所述生血内皮细胞；

优选地，所述D0培养基由基础分化培养基加入骨形态发生蛋白4制得，D0培养基中包含3～8ng/mL骨形态发生蛋白4；

优选地，所述D2.5培养基由基础分化培养基加入骨形态发生蛋白4和血管内皮生长因子制得，D2.5培养基中包含3～8ng/mL骨形态发生蛋白4和3～8ng/mL血管内皮生长因子；

优选地，所述D6培养基由基础分化培养基加入白介素3、白介素6、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体和强力霉素制得，D6培养基中包含10～30ng/mL白介素3、10～30ng/mL白介素6、10～30ng/mL干细胞因子、10～30ng/mLFMS样酪氨酸激酶3配体和1～2μg/mL强力霉素；

优选地，所述基础分化培养基为包含10v％～20v％胎牛血清、180～220μg/mL铁饱和转铁蛋白、4×10^-4～5×10^-4M硫代甘油、1～5mM GlutaMAX添加剂和30～70μg/mL抗坏血酸的IMDM培养基。

优选地，所述骨髓基质细胞选自OP9-DL1细胞、OP9细胞或MS5细胞中的任意一种或两种或三种，优选为OP9-DL1细胞；

优选地，所述诱导培养基中含有强力霉素；

优选地，所述诱导培养基为含有1～2μg/mL强力霉素、10～30ng/mL白介素3、10～30ng/mL干细胞因子、10～30ng/mLFMS样酪氨酸激酶3配体、10v％～20v％胎牛血清、180～220μg/mL铁饱和转铁蛋白、4×10^-4～5×10^-4M硫代甘油、1～5mM GlutaMAX添加剂和30～70μg/mL抗坏血酸的α-MEM培养基或IMDM培养基。

优选地，所述B细胞包括B220+B细胞和/或CD19+B细胞；

优选地，所述B细胞包括pro-B细胞、pre-B细胞、B1细胞、B2细胞中的任意一种或两种以上；

优选地，所述B1细胞包括B1a细胞和/或B1b细胞；

优选地，所述B2细胞为滤泡B细胞和/或边缘区B细胞；

优选地，所述T细胞包括CD3+、CD4+和CD8+中的任意一种或两种以上；进一步优选所述T细胞包括TCRβ细胞和/或TCRγδ细胞。

本申请还提供一种由前述任一种方法制备得到的造血干祖细胞，其包括B谱系祖细胞和髓系祖细胞，或者包括T谱系祖细胞、B谱系祖细胞和髓系祖细胞。

本申请还提供一种由前述任一种方法制备得到的血液细胞，其包括B细胞和髓系细胞，或者包括T细胞、B细胞和髓系细胞。

本申请还提供一种药物组合物，其包括以下任意一种或两种以上：如前所述的基因构建体、如前所述的载体、如前所述的宿主细胞、如前所述的造血干祖细胞、如前所述的血液细胞。

本申请还提供一种如前所述的药物组合物在制备增强B细胞免疫响应药物或者T细胞免疫响应药物中、在制备预防和/或治疗B细胞或T细胞免疫缺陷的药物中、在制备预防和治疗血液疾病的药物中或在制备抗感染和治疗肿瘤的药物中的应用。

发明的效果

(1)本申请利用多能干细胞自我更新以及克隆化无限繁殖的优势，通过精确的基因编辑将目的基因RUNX1、HOXA9以及HLF和/或HOXA7定点敲入多能干细胞，成功构建了诱导性共表达外源基因RUNX1、HOXA9以及HLF和/或HOXA7的多能干细胞系，所述多能干细胞定向分化为多谱系造血祖细胞，并发育为B细胞和髓系细胞，或者发育为T细胞、B细胞和髓系细胞，实现得在单细胞精度上诱导多能干细胞定向分化为造血祖细胞，并在体内实现多谱系造血重建；

(2)本申请的产生多谱系造血干祖细胞的方法能够保证多能干细胞遗传背景的均一性，并且可以在时空上控制目的基因的表达；

(3)本申请的血液细胞不仅功能正常，而且没有致瘤风险，可以用于制备增强免疫效应、预防和/或治疗免疫缺陷以及治疗肿瘤的药物；

(4)本申请利用多能干细胞采用定向分化体系和共培养方法效率高，可重复性高，更利于临床转化。

附图说明

图1A为定点敲入多能干细胞Rosa26位点的可诱导表达系统示意图，所述表达系统通过同源重组方法将Runx1、Hoxa9、Hlf和Hoxa7串联敲入多能干细胞Rosa26位点，通过强力霉素(Dox)诱导基因表达。

图1B为通过潮霉素B抗性筛选获得的Runx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞荧光图(标尺100μm)。

图1C为使用强力霉素处理24小时后Runx1、Hoxa9、Hlf和Hoxa7的相对表达水平。

图2A为诱导iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞定向分化为生血内皮细胞示意图。

图2B为诱导iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞定向分化至第11天的EB拟胚体细胞分化形态图(标尺200μm)。

图2C为采用流式分选策略(CD31+、CD41+、CD45-、c-Kit+、CD201+)分选诱导生血内皮细胞的流式结果图。

图3A为诱导生血内皮细胞与OP9-DL1细胞共培养6天后显微镜下观察的造血祖细胞鹅卵石样形成区域的光场图(标尺200μm)。

图3B为诱导生血内皮细胞与OP9-DL1细胞共培养10天后造血祖细胞(Lin-c-Kit+Sca1+)免疫表型的流式检测结果图。

图4A为诱导生血内皮细胞与OP9-DL1细胞系进行共培养后收获造血祖细胞移植到CD45.1+NOD/SCID免疫缺陷小鼠中。

图4B为移植16周后，流式细胞术分析多能干细胞来源的CD19+B细胞、CD3+CD4+CD8+T细胞和CD11b+髓系细胞在受体小鼠的外周血、骨髓和脾脏中的谱系分布。

图5A为基因组水平确定血液细胞来源的示意图。

图5B为16周后牺牲受体小鼠，分选多能干细胞来源的T细胞、B细胞和髓系细胞。

图5C为多能干细胞来源的血液细胞基因组的PCR结果。

图5D为多能干细胞来源的血液细胞基因组的测序鉴定(以B细胞来源基因组测序结果为代表)。

图6A为受体鼠移植7.5天后，骨髓中多能干细胞来源的共同淋巴祖细胞(CLP)，多能祖细胞(MPP)以及B谱系祖细胞(pre/pro B)的流式分析结果图。

图6B为受体鼠移植6周后，骨髓中多能干细胞来源的共同淋巴祖细胞(CLP)。

图6C为受体鼠移植6周后，骨髓中多能干细胞来源的髓系祖细胞(MP)。

图6D为受体鼠移植6周后，骨髓中多能干细胞来源的B谱系祖细胞(pre/pro B)。

图7A为iRunx1-Hoxa9-Hlf mES细胞系构建示意图。

图7B为移植后第4周、第6周和第8周iRunx1-Hoxa9-Hlf多能干细胞来源的细胞在受体鼠外周血中的流式检测结果。

图8A为iRunx1-Hoxa9-Hoxa7 mES细胞系构建示意图。

图8B为移植后第4周、第6周和第8周iRunx1-Hoxa9-Hoxa7多能干细胞来源的供体细胞在受体鼠外周血中的流式检测结果。

具体实施方式

下面对本申请做以详细说明。虽然显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

第一方面，本申请提供一种基因构建体，其包含RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因。

术语“基因”是指包含转录区域的DNA片段，该区域被转录成细胞中的RNA分子(例如mRNA)，并与合适的调控区域(例如启动子)可操作地连接。基因通常将包含几个可操作地连接的片段，例如启动子，5’末端，编码区和3’末端。

术语“基因构建体”具有其通常的和普通的含义，如本领域技术人员鉴于本公开内容的所理解的。“基因构建体”也可以称为“表达盒”或“表达构建体”，是指基因或一组基因，包括编码目的蛋白质的基因，该基因与控制其表达的启动子可操作地连接。本申请的基因构建体可以使用本领域技术人员已知的任何克隆和/或重组DNA技术制备。

本申请中，所述RUNX1基因可以为多种来源，如人源或鼠源，其中，小鼠来源的Runx1基因可以是ENSMUSG00000022952，人源来源的RUNX1基因可以是ENSG00000159216。

本申请中，所述HOXA9基因可以为多种来源，如人源或鼠源，其中，小鼠来源的Hoxa9基因可以是ENSMUSG00000038227，人源来源的HOXA9基因可以是ENSG00000078399。

本申请中，所述HLF基因可以分为多种来源，如人源或鼠源，其中小鼠来源的Hlf基因可以是ENSMUSG00000003949，人源来源的HLF基因可以是ENSG00000108924。

本申请中，所述HOXA7基因可以为多种来源，如人源或鼠源，其中小鼠来源的Hoxa7基因可以是ENSMUSG00000038236，人源来源的HOXA7基因可以是ENSG00000122592。

可以将本申请所述的基因构建体置于载体中。因此，第二方面，本申请提供一种载体，其包含RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的基因序列，所述载体用于RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的串联共表达。

术语“载体”用于描述可以被工程化以含有可以在宿主细胞中扩增的克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸；包含一个或多个游离末端，没有游离末端(例如环状)的核酸；包含DNA，RNA或两者的核酸；以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以插入额外DNA片段的环状双链DNA环，例如通过标准分子克隆技术。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的那些基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。重组表达载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本申请的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于用于表达的、可以与待表达的核酸序列可操作地连接的宿主细胞来选择。

如本文所使用的，术语“表达”包括变体产生所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

第三方面，本申请提供一种表达如第二方面所述载体的核酸。

术语“核酸”可以包括包含天然和/或非天然存在的核苷酸和碱基的那些，例如包括具有骨架修饰的那些，所述核酸指的是核苷酸的聚合物，核苷酸的此类聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。核苷酸序列指的是构成核酸的线性序列。在一些情况下，核酸含有cDNA。在一些情况下，出于克隆到载体的目的，可以将序列设计为含有末端限制性位点序列。在一些情况下，核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得。

第四方面，本申请提供一种宿主细胞，其包含串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因。

术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，其易受本申请的基因构建体或载体的转化、转染、转导等。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，其由于复制过程发生的突变与亲本细胞不完全相同。宿主细胞可以是在本申请的造血细胞再生过程中有用的任何细胞。

在本申请的具体实施方式中，本发明的宿主细胞是指在原始的宿主细胞中导入了串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的宿主细胞。

在一个具体实施方式中，所述RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因通过编码连接肽的核苷酸序列进行串联连接。本申请对各基因的串联顺序没有限制，例如可为RUNX1-linker-HOXA9-linker-HLF、RUNX1-linker-HLF-linker-HOXA9、HOXA9-linker-RUNX1-linker-HLF、HOXA9-linker-HLF-linker-RUNX1、HLF-linker-HOXA9-linker-RUNX1、HLF-linker-RUNX1-linker-HOXA9、RUNX1-linker-HOXA9-linker-HOXA7、RUNX1-linker-HOXA7-linker-HOXA9、HOXA9-linker-RUNX1-linker-HOXA7、HOXA9-linker-HOXA7-linker-RUNX1、HOXA7-linker-HOXA9-linker-RUNX1、HOXA7-linker-RUNX1-linker-HOXA9、RUNX1-linker-HOXA9-linker-HLF-linker-HOXA7、RUNX1-linker-HOXA9-linker-HOXA7-linker-HLF、RUNX1-linker-HLF-linker-HOXA9-linker-HOXA7、RUNX1-linker-HLF-linker-HOXA7-linker-HOXA9、RUNX1-linker-HOXA7-linker-HLF-linker-HOXA9、RUNX1-linker-HOXA7-linker-HOXA9-linker-HLF、HOXA9-linker-HLF-linker-HOXA7-linker-RUNX1、HOXA9-linker-HOXA7-linker-HLF-linker-RUNX1、HLF-linker-HOXA9-linker-HOXA7-linker-RUNX1、HLF-linker-HOXA7-linker-HOXA9-linker-RUNX1、HOXA7-linker-HLF-linker-HOXA9-linker-RUNX1、HOXA7-linker-HOXA9-linker-HLF-linker-RUNX1、HOXA9-linker-RUNX1-linker-HLF-linker-HOXA7、HOXA9-linker-RUNX1-linker-HOXA7-linker-HLF、HLF-linker-RUNX1-linker-HOXA9-linker-HOXA7、HLF-linker-RUNX1-linker-HOXA7-linker-HOXA9、HOXA7-linker-RUNX1-linker-HLF-linker-HOXA9、HOXA7-linker-RUNX1-linker-HOXA9-linker-HLF、HOXA9-linker-HLF-linker-RUNX1-linker-HOXA7、HOXA9-linker-HOXA7-linker-RUNX1-linker-HLF、HLF-linker-HOXA9-linker-RUNX1-linker-HOXA7、HLF-linker-HOXA7-linker-RUNX1-linker-HOXA9、HOXA7-linker-HLF-linker-RUNX1-linker-HOXA9、HOXA7-linker-HOXA9-linker-RUNX1-linker-HLF，其中linker表示编码连接肽的核苷酸序列，各位置的linker可以相同也可以不同。

在一个具体实施方式中，所述连接肽为2A肽，2A肽连接上下游基因的表达平衡性好，从而使得基因的连接顺序先后对表达水平的影响不大，改变基因先后顺序仍能够取得相近的效果；优选所述2A肽包含T2A、P2A、E2A或F2A中的任意一种或两种以上。

术语“多肽”“肽”“蛋白”“蛋白质”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白质，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链。

在一个优选的实施方式中，所述宿主细胞包含串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因、HLF基因和HOXA7基因，其中所述RUNX1基因和HOXA9基因之间采用编码P2A的核苷酸序列进行连接，所述HOXA9基因和HLF基因之间采用编码P2A的核苷酸序列进行连接，所述HLF基因和HOXA7基因之间采用编码E2A的核苷酸序列进行连接。

在一个具体实施方式中，本申请的宿主细胞是多能干细胞，即导入了串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因、HLF基因和HOXA7基因的多能干细胞。

在本申请中，用于导入了串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因、HLF基因和HOXA7基因的初始多能干细胞可以是胚胎干细胞，还可以是iPSC(诱导性多能干细胞)，即包括了天然胚胎多能干细胞、改造过的胚胎多能干细胞(例如，安全位点经过改造的多能干细胞)以及iPSC诱导性多能干细胞。

本领域技术人员通常可以理解本发明中所称的胚胎多能干细胞与诱导性多能干细胞区别在于胚胎干细胞是天然发育来源的多能干细胞，诱导性多能干细胞是由哺乳动物成体细胞经转入转录因子等手段脱分化形成的多能干细胞。

在一个具体实施方式中，通过将串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因整合到哺乳动物多能干细胞基因组的安全位点处，以得到所述多能干细胞。

在一个具体实施方式中，所述整合的方法包括同源重组、CRISPR/Cas9、TALEN、转染或病毒感染中的任意一种或两种以上，优选为同源重组；所述安全位点为Rosa26位点、AAVS1位点、CCR5位点、HPRT位点、H11位点、Col1a1位点或TIGRE位点，优选为Rosa26位点。

第五方面，本申请提供一种产生多谱系造血干祖细胞的方法，包括以下步骤：

体外分化：将所述整合有RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的多能干细胞的定向分化为生血内皮细胞；

体内分化：将所述造血祖细胞移植到哺乳动物中，体内发育为多谱系造血干祖细胞，所述多谱系造血干祖细胞包括B谱系祖细胞和髓系祖细胞，或者包括T谱系祖细胞、B谱系祖细胞和髓系祖细胞。

术语“生血内皮细胞”是指类似于胚胎造血干细胞前体细胞表型、但不等同于造血干细胞前体细胞的细胞。

在一个具体实施方式中，所述多谱系造血干祖细胞在体内进一步分化为：B细胞和髓系细胞；或者进一步分化为：T细胞、B细胞和髓系细胞。

本申请的方法操作简便、效率较高，能够产生多谱系造血干祖细胞。

在一个具体实施方式中，整合有RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的多能干细胞为在原始多能干细胞安全位点插入基因，经过筛选，鉴定RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因表达后得到的多能干细胞。在一个具体实施方式中，所述原始多能干细胞可以是安全位点经过改造的多能干细胞。

在一个具体实施方式中，所述整合方法包括同源重组、CRISPR/Cas9、TALEN、转染或病毒感染中的任意一种或两种以上；

在一个优选的实施方式中，所述整合方法为同源重组，将串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的cDNA序列串联表达于同一载体并整合到哺乳动物多能干细胞基因组的安全位点处，可以得到稳定表达RUNX1、HOXA9以及HLF和/或HOXA7的宿主细胞，所述安全位点为Rosa26位点、AAVS1位点、CCR5位点、HPRT位点、H11位点、Col1a1位点或TIGRE位点，优选为Rosa26位点。

在一个具体实施方式中，为实现时空上条件性控制基因的表达，将RUNX1、HOXA9以及HLF和/或HOXA7的cDNA序列串联表达于同一载体并带上条件性可控基因表达的系统，一起整合到哺乳动物多能干细胞基因组的安全位点处，可以得到稳定表达RUNX1、HOXA9以及HLF和/或HOXA7的宿主细胞；为了便于追踪诱导细胞的造血发育途径，本申请在将编码荧光蛋白的报告基因添加到哺乳动物多能干细胞基因组的安全位点。

在一个具体实施方式中，所述条件性可控基因表达的系统包括基于四环素的TetTag系统和基于他莫昔芬诱导诱导性调控的CreERT系统，优选为基于四环素的TetTag系统；所述编码荧光蛋白地报告基因包括EGFP、RFP、YFP或TdTomato中的任意一种，优选为EGFP。

在一个具体实施方式中，在基因编辑步骤后，体外分化步骤前，还包括对整合有外源基因RUNX1、HOXA9以及HLF和/或HOXA7的多能干细胞系(也可称为宿主细胞)进行抗性克隆化筛选，优选采用潮霉素B进行抗性克隆化筛选。可以得到稳定表达RUNX1、HOXA9以及HLF和/或HOXA7的宿主细胞。并在强力霉素(Dox)处理24h后鉴定RUNX1、HOXA9以及HLF和/或HOXA7的相对表达水平，以验证成功构建了能够条件性诱导目的基因表达的多能干细胞系。

在一个具体实施方式中，依次采用D0培养基、D2.5培养基、D6培养基培养所述整合有RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的多能干细胞，以得到所述生血内皮细胞。

在一个具体实施方式中，所述D0培养基由基础分化培养基加入骨形态发生蛋白4制得，D0培养基中包含3～8ng/mL骨形态发生蛋白4，例如可包含3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL的骨形态发生蛋白4。

在一个具体实施方式中，所述D2.5培养基由基础分化培养基加入骨形态发生蛋白4和血管内皮生长因子制得，D2.5培养基中包含3～8ng/mL骨形态发生蛋白4和3～8ng/mL血管内皮生长因子；例如可包含3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL骨形态发生蛋白4；例如可包含3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL血管内皮生长因子。

在一个具体实施方式中，所述D6培养基由基础分化培养基加入白介素3、白介素6、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体(hFl3L)和强力霉素制得，D6培养基中包含10～30ng/mL白介素3、10～30ng/mL白介素6、10～30ng/mL干细胞因子、10～30ng/mLFMS样酪氨酸激酶3配体和1～2μg/mL强力霉素；例如可包含10ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、22ng/mL、25ng/mL或30ng/mL，优选为20ng/mL白介素3；例如可包含10ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、22ng/mL、25ng/mL或30ng/mL，优选为20ng/mL白介素6；例如可包含10ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、22ng/mL、25ng/mL或30ng/mL，优选为20ng/mL干细胞因子；例如可包含10ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、22ng/mL、25ng/mL或30ng/mL，优选为20ng/mLFMS样酪氨酸激酶3配体；例如可包含1μg/mL、1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.5μg/mL、1.6μg/mL、1.8μg/mL或2μg/mL，优选为1μg/mL强力霉素。

在一个具体实施方式中，所述基础分化培养基为包含10v％～20v％胎牛血清、180～220μg/mL铁饱和转铁蛋白、4×10^-4～5×10^-4M硫代甘油、1～5mM GlutaMAX添加剂和30～70μg/mL抗坏血酸的IMDM培养基；例如可包含10v％、12v％、14v％、16v％、18v％或20v％，优选为15v％胎牛血清；例如可包含180μg/mL、190μg/mL、210μg/mL或220μg/mL，优选为200μg/mL铁饱和转铁蛋白；例如可包含4×10^-4M、4.2×10^-4M、4.4×10^-4M、4.8×10^-4M或5×10^-4M，优选为4.5×10^-4M硫代甘油；例如可包含1mM、1.4mM、1.8mM、2.2mM、2.4mM、2.6mM、2.8mM、3mM、3.2mM、3.4mM、3.6mM、3.8mM、4mM、4.2mM、4.4mM、4.6mM、4.8mM或5mM，优选为2mMGlutaMAXTM-I添加剂；例如可包含30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL或70μg/mL，优选为50μg/mL抗坏血酸。

本申请的α-MEM培养基是最低必需培养基(MEM)的改良培养基，含有非必需氨基酸、丙酮酸钠、硫辛酸、维生素B12、生物素和抗坏血酸。

在一个具体实施方式中，α-MEM培养基，其来源为：Gibco，货号为：12571063。

本申请的IMDM培养基是指Iscove’s Modified Dulbecco Medium，IMDM培养基是在DMEM培养基的基础上添加了硒、HEPES、丙酮酸钠以及额外的氨基酸和维生素，并用硝酸钾代替了硝酸铁，营养非常丰富，非常适合于快速增殖和高密度细胞培养。

在一个具体实施方式中，IMDM培养基，其来源为：Gibco，货号为：12440053。

本申请通过改变培养基中的添加物质，设计优化了定向造血分化体系，诱导多能干细胞造血分化为诱导生血内皮细胞，所述诱导生血内皮细胞通过进一步与哺乳动物骨髓基质细胞共培养，得到多谱系种子细胞。

在一个具体实施方式中，所述诱导培养基中含有强力霉素，所述骨髓基质细胞选自OP9-DL1细胞、OP9细胞或MS5细胞中的任意一种或两种或三种，优选为OP9-DL1细胞。

在一个具体实施方式中，所述诱导培养基为含有1～2μg/mL强力霉素、10～30ng/mL白介素3、10～30ng/mL干细胞因子、10～30ng/mLFMS样酪氨酸激酶3配体、10v％～20v％胎牛血清、180～220μg/mL铁饱和转铁蛋白、4×10^-4～5×10^-4M硫代甘油、1～5mM GlutaMAX添加剂和30～70μg/mL抗坏血酸的α-MEM培养基或IMDM培养基；例如含有1μg/mL、1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.5μg/mL、1.6μg/mL、1.8μg/mL或2μg/mL，优选为1μg/mL强力霉素；例如含有10ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、22ng/mL、25ng/mL或30ng/mL，优选为20ng/mL白介素3；例如含有10ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、22ng/mL、25ng/mL或30ng/mL，优选为20ng/mL干细胞因子；例如含有10ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、22ng/mL、25ng/mL或30ng/mL，优选为20ng/mLFMS样酪氨酸激酶3配体；例如含有10v％、12v％、14v％、16v％、18v％或20v％，优选为15v％胎牛血清；例如含有180μg/mL、190μg/mL、210μg/mL或220μg/mL，优选为200μg/mL铁饱和转铁蛋白；例如含有4×10^-4M、4.2×10^-4M、4.4×10^-4M、4.8×10^-4M或5×10^-4M，优选为4.5×10^-4M硫代甘油；例如含有1mM、1.4mM、1.8mM、2.2mM、2.4mM、2.6mM、2.8mM、3mM、3.2mM、3.4mM、3.6mM、3.8mM、4mM、4.2mM、4.4mM、4.6mM、4.8mM或5mM，优选为2mMGlutaMAXTM-I添加剂；例如含有30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL或70μg/mL，优选为50μg/mL抗坏血酸。

在一个具体实施方式中，所述B细胞包括B220+B细胞和/或CD19+B细胞。

在一个具体实施方式中，所述B细胞包括pro-B细胞、pre-B细胞、B1细胞、B2细胞中的任意一种或两种以上；

在一个具体实施方式中，所述B1细胞包括B1a细胞和/或B1b细胞；

在一个具体实施方式中，所述B2细胞为滤泡B细胞和/或边缘区B细胞；

在一个具体实施方式中，所述T细胞包括CD3+、CD4+和CD8+中的任意一种或两种以上；进一步优选所述T细胞包括TCRβ细胞和/或TCRγδ细胞。

在一个具体实施方式中，体内发育的T谱系祖细胞在体内分化为T细胞，体内发育的髓系祖细胞在体内分化为髓系(Myeloid)细胞。

在一个具体实施方式中，将所述造血祖细胞按照1.5×10⁷～15×10⁷个/kg移植到哺乳动物中。

第六方面，本申请提供一种由第五方面所述的方法制备得到的造血干祖细胞，其包括B谱系祖细胞和髓系祖细胞，或者包括T谱系祖细胞、B谱系祖细胞和髓系祖细胞。

第七方面，本申请提供一种由第五方面所述的方法制备得到的血液细胞，其包括B细胞和髓系细胞，或者包括T细胞、B细胞和髓系细胞。

第八方面，本申请提供一种药物组合物，其包括以下任意一种或两种以上：如第一方面所述的基因构建体、如第二方面所述的载体、如第三方面所述宿主细胞、如第五方面所述的造血干祖细胞、如第六方面所述的血液细胞。

本申请的药物组合物还包括药学上可接受的一种或多种载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂或填充剂如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素(如乙基纤维素、微晶纤维素)、糖胶、果胶、聚丙烯酸酯和/或磷酸氢钙、硫酸钙，润滑剂如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、金属硬脂酸盐、胶体二氧化硅、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠和/或聚乙二醇，粘合剂如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或羟丙基纤维素，崩解剂如淀粉(如马铃薯淀粉或淀粉钠)、乙醇酸盐(酯)、琼脂、褐藻酸或其钠盐、或起泡混合物，湿润剂如月桂基硫酸钠和/或吸收剂、着色剂、芳香剂和甜味剂。可以将本申请的药物组合物及它们生理学上可接受的盐及溶剂化物进行配制，用于通过任何合适的途径给药，包括吸入给药、局部给药、经鼻给药、经口给药、肠胃外给药或直肠给药。

药物组合物可以被配制成任何的给药类型，例如，利用注射器或其它装置的皮内注射、皮下注射、静脉内注射、腹膜内注射、胸膜内注射、膀胱内注射、冠状动脉内或肿瘤内注射、口服给药、直肠给药。

第九方面，本申请提供一种如第八方面所述的药物组合物在制备抗感染和治疗肿瘤的药物中的应用。

第十方面，本申请提供一种如第八方面所述的药物组合物在制备增强B细胞免疫响应药物或者T细胞免疫响应药物中的应用。

第十一方面，本申请提供一种如第八方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗B细胞或T细胞免疫缺陷的药物中的应用。

第十二方面，本申请提供一种如第八方面所述的药物组合物在制备预防和治疗血液疾病的药物中的应用。所述血液疾病例如可为白血病、再生障碍性贫血、地中海贫血的药物等。

RUNX1基因是十分关键的造血调控转录因子，其在内皮生血转化、原始造血、永久造血以及淋巴细胞生成中起着重要的作用。HOXA9基因在HSC的增强与维持、内皮生血转化以及促进淋系生成方面起着重要作用。过表达Runx1和Hoxa9的多能干细胞在体外诱导出造血祖细胞后，将其移植到小鼠体内后可以实现T谱系免疫重建但无法实现多谱系造血重建。HLF在几乎所有免疫表型造血干细胞中表达，也在多能祖细胞和普通髓系祖细胞中表达，HOXA7基因是控制造血细胞增殖和分化的主基因，其差异表达与特定的谱系和造血化阶段密切相关。本申请将HSC特异性转录因子HLF和/或HOXA7引入RUNX1-HOXA9体系中，获得以下发现：Runx1，Hoxa9和Hlf协同作用可以有效地重建B细胞谱系，不能重建T细胞谱系，再生髓系细胞能在体内短暂维持；Runx1、Hoxa9和Hoxa7协同作用可以有效地重建B细胞谱系，不能重建T细胞谱系，再生髓系细胞能在体内短暂维持6周左右；Runx1、Hoxa9、Hlf和Hoxa7协同作用可以有效地重建T细胞谱系、B细胞谱系和髓系细胞，有效地重建了多谱系免疫造血，并且包含串联连接的Runx1、Hoxa9、Hlf和Hoxa7基因的多能干细胞来源的造血细胞的发育路径贴近天然造血细胞发育路径。

实施例

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例中所用的IMDM培养基的来源为：Gibco，货号为：12440053；α-MEM培养基的来源为：Gibco，货号为：12571063。

实施例1

本实施例通过电转化法结合基因同源重组在多能干细胞的Rosa26位点定点敲入可诱导表达序列，如图1A所示，敲入序列包含Runx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7串联序列和用于抗性筛选的潮霉素B抗性基因序列，其中Runx1的基因序列如SEQ ID No:1所示，p2a序列如SEQ ID No:2所示，Hoxa9序列如SEQ ID No:3所示，Hlf序列如SEQ ID No:4所示，E2a序列如SEQ ID No:5所示，Hoxa7序列如SEQ ID No:6所示。为了成功获得同源重组的多能干细胞，电转化20小时后加入含有潮霉素B(150μg/mL)的多能干细胞培养基，每天换液，其中所述多能干细胞培养基为含有15％v胎牛血清、1％v非必要氨基酸、2mM GlutaMAXTM-I添加剂、1mM丙酮酸钠、0.1mMβ-巯基乙醇、1μM非ATP竞争性MEK抑制剂、3μMGSK-3α/β抑制剂和1000U/mL白血病抑制因子的DMEM/高糖培养基。采用潮霉素B筛选10天后，在显微镜下挑取单个克隆至提前铺好MEF(小鼠胚胎层纤维细胞)细胞的12孔板中，每孔放入一个多能干细胞克隆，采用无潮霉素B的培养基进行培养。

待克隆团粘附在MEF细胞层中，每天换液，3天后采用0.25％胰酶消化克隆团，传代至12孔板中，细胞形态如图1B所示，克隆团处于对数生长期，边缘整齐透亮与MEF细胞层有明显分界，无分化发生。根据细胞状态和生长密度，进行传代、扩增和冻存。

加入含有Dox(1μg/mL)的多能干细胞培养基诱导基因条件性表达，Dox处理24小时后提取Runx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞总mRNA(未加Dox组作为对照组)，利用Q-PCR获得Runx1、Hoxa9、Hlf和Hoxa7的mRNA的表达水平，图1C表明，加入Dox可以诱导Runx1、Hoxa9、Hlf和Hoxa7的表达。

实施例2

为了诱导多能干细胞的造血分化，采用如图2A所示的定向造血分化体系。定向造血分化体系中各培养基的配方如下:

基础分化培养基：含有15v％胎牛血清、200μg/mL铁饱和转铁蛋白、4.5×10^-4M硫代甘油、2mM GlutaMAXTM-I添加剂、50μg/mL抗坏血酸的IMDM培养基；

D0培养基：由基础分化培养基加入骨形态发生蛋白4制得，含有5ng/mL骨形态发生蛋白4；

D2.5培养基：由基础分化培养基加入骨形态发生蛋白4和血管内皮生长因子制得，含有5ng/mL骨形态发生蛋白4和5ng/mL血管内皮生长因子；

D6培养基：由基础分化培养基加入白介素3、白介素6、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体和强力霉素制得，含有20ng/mL重组小鼠白介素3、20ng/mL重组小鼠白介素6、20ng/mL重组小鼠干细胞因子、20ng/mL重组人促血小板生成素、20ng/mLhFl3L和1μg/mL强力霉素。

诱导多能干细胞的造血分化的具体步骤如下：

提前40min在6孔板中铺1mL浓度为0.1％的明胶，待用。使用0.05％胰酶将多能干细胞消化为单细胞，离心后重悬多能干细胞。吸去0.1％明胶，将多能干细胞悬液转移到包被有明胶的孔中，培养箱中放置40min，以除去MEF细胞。

收集悬浮细胞，250g下离心5min，使用DPBS清洗一次。使用D0培养基重悬细胞并计数，调整细胞浓度至1×10⁵个/mL。将5～10mL细胞悬液加入到倾斜的10cm盘中，吸取20μL细胞悬液，加入到15cm培养皿中悬浮拟胚体(EB)，单个EB为20μL(约2000个细胞)。随后将培养皿倒置，并在培养皿底部放置一个10cm培养皿盖子，盖子中加入，5～6mL细胞培养用水。在37℃培养箱中培养2.5天。

用巴氏吸管将EB收集到离心管中，用DPBS清洗皿底，待EB自然沉降后小心吸去上清，也可在90g低速离心5min去上清，加入DPBS润洗一遍，再次沉降或离心去上清。用D2.5培养基重悬EB后，转移至低粘附的6孔板中，培养12小时观察EB是否有污染，隔天换液培养。

在定向分化第6天更换D6培养基培养，随后隔天换液。如图2B所示，在定向分化第11天；iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7分化组可见明显的造血簇；第11天的造血相关细胞群体为CD41+生血内皮细胞和CD45+生血内皮细胞。采用如图2C的分选策略进行流式细胞仪分选生血内皮细胞(CD31+CD41+CD45+c-Kit+CD201+)。

实施例3

为了验证从多能干细胞分化而来的生血内皮细胞具有胚胎造血干细胞前体细胞群的增殖能力，即在基质细胞上可以形成高扩增潜能的鹅卵石样形成区域的能力，发明人将生血内皮细胞与小鼠骨髓基质细胞共培养。共培养所用的诱导培养基为含有15v％DFBS、200μg/mL铁饱和转铁蛋白、4.5×10^-4M硫代甘油、2mM GlutaMAXTM-I添加剂、50μg/mL抗坏血酸、30ng/mLAFT024-mSCF条件性培养基、30ng/mLAFT024-mlL3条件性培养基、30ng/mLAFT024-FMS样酪氨酸激酶3配体条件性培养基和1μg/mL Dox的α-MEM培养基。

在定向分化的第11天，对定向诱导分化产生的生血内皮细胞进行分选。随后，采用的鹅卵石样区域形成实验(CAFC)检验多能干细胞分化而来的生血内皮细胞是否具有与胚胎来源的造血干细胞前体细胞相同的增殖能力。如图3A所示，将分选到的生血内皮细胞群体重铺到OP9-DL1基质细胞上观察其增殖能力，结果表明：iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞来源的生血内皮细胞具有很强的鹅卵石样区域形成能力，多能干细胞来源的生血内皮细胞在基质细胞OP9-DL1上形成高度均一的小、圆、亮的血液细胞。

生血内皮细胞与基质细胞OP9-DL1共培养10天后，为了检测具有很强的鹅卵石样区域形成能力的血液细胞是否具备造血祖细胞特性，采用如图3B的分析策略进行流式细胞仪分析造血祖细胞群(Lin-c-Kit+Sca1+)。

实施例4

为了在体内微环境验证多谱系免疫重建，发明人进一步设计了共培养后移植策略，如图4A所示，将生血内皮细胞在OP9-DL1基质细胞上使用如实施例3所示的诱导培养基利用Dox诱导10天后获得造血祖细胞，具体操作步骤为：

提前4天复苏OP9-DL1细胞系，根据细胞生长状态及时传代，避免细胞由于过度生长而老化。使用前一天传代，每孔重铺2万细胞(12孔板)，第二天使用；将多能干细胞来源的生血内皮细胞共培养后获得造血祖细胞通过眼静脉移植到8-12周龄的CD45.1 NOD/SCID小鼠中，小鼠移植之后，持续使用Dox(1mg/mL)水喂养，4周后借助流式细胞术检测外周血造血嵌合情况。

图4B表明，iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞来源的造血祖细胞群体按照3.3×10⁷cells/kg剂量移植到受体NOD/SCID小鼠外周血中，可以形成造血嵌合，明确多能干细胞来源的血液细胞在其他造血、淋巴组织中的表型为T细胞、B细胞和髓系细胞，有效地重建了多谱系免疫造血。

实施例5

为了从基因组水平上确认受体小鼠中CD45.2+GFP+造血细胞来源于iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞，设计引物进行PCR扩增及测序鉴定。如图5A所示，首先通过流式分选脾脏来源的CD45.2细胞，提取基因组，利用插入基因序列的特异性引物进行PCR鉴定。图5B显示多能干细胞来源的细胞在受体鼠脾脏中主要的免疫表型主要表现为CD19+B细胞，CD3/4/8+T细胞以及CD11b+髓系细胞。图5C和图5D显示，这些细胞基因组内有iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7质粒来源序列，证实CD45.2血液细胞(B细胞、T细胞和髓系细胞)来自于iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞。

实施例6

为了进一步鉴定小鼠体内多能干细胞来源免疫细胞的发育路径是否与天然造血细胞相类似，对骨髓中的细胞群体进行分析。从图6A中看到，移植7.5天后受体小鼠体内造血细胞正常发育，能够检测到LSK细胞，共同淋系祖细胞，多能祖细胞以及B祖细胞。图4B中外周血、骨髓和脾脏中的多能干细胞来源的T细胞，B细胞和髓系细胞也进一步揭示了iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞来源的造血细胞的细胞学机制。如图6B、6C和6D所示，移植6周后小鼠骨髓中仍存在iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞来源的各谱系祖细胞，证实iRunx1-p2a-Hoxa9-p2a-Hlf-E2a-Hoxa7多能干细胞来源的造血细胞能够有效地重构多谱系造血并且其发育路径贴近天然造血细胞发育路径。

实施例7

为了进一步探索多谱系再生的最优转录因子组合，在Runx1-Hoxa9基础上与Hlf进行组合。如图7A所示，参照实施例1的方法，构建并表征了能够被强力霉素控制过表达的Runx1-Hoxa9-Hlf诱导细胞系模型。Runx1-Hoxa9-Hlf多能干细胞来源的iHPC的移植实验显示(图7B)，Runx1，Hoxa9和Hlf协同作用可以有效地重建B细胞谱系，但不能重建T细胞谱系，再生髓系细胞只能在体内短暂维持。

实施例8

为了进一步探索多谱系再生的最优转录因子组合，在Runx1-Hoxa9基础上与Hoxa7进行组合。如图8A所示，参照实施例1的方法，构建并表征了能够被强力霉素控制过表达的Runx1-Hoxa9-Hoxa7诱导细胞系模型。Runx1-Hoxa9-Hoxa7多能干细胞来源的iHPC的移植实验显示(图8B)，Runx1、Hoxa9和Hoxa7协同作用可以有效地重建B细胞谱系，但不能重建T细胞谱系，再生髓系细胞只能在体内短暂维持6周左右。

综上所述，本发明将外源Runx1、Hoxa9、Hlf和Hoxa7共表达载体引入多能干细胞中，成功构建了诱导性共表达外源Runx1、Hoxa9、Hlf和Hoxa7的多能干细胞，所述多能干细胞定向分化为多谱系造血祖细胞，并将发育为B细胞，T细胞和髓系细胞。使用本发明的方法获得的多能干细胞来源的B细胞，T细胞和髓系细胞，不仅功能正常，而且没有致瘤风险，可以用于制备增强免疫效应、预防和/或治疗免疫缺陷以及治疗肿瘤的药物。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

序列表

SEQ ID No:1：

ATGCGTATCCCCGTAGATGCCAGCACGAGCCGCCGCTTCACGCCGCCTTCCACCGCGCTGAGCCCCGGCAAGATGAGCGAGGCGCTGCCGCTGGGCGCCCCGGATGGCGGCGCCGCCCTGGCCAGCAAGCTGAGGAGCGGCGACCGCAGCATGGTGGAGGTACTAGCTGACCACCCTGGCGAGCTAGTGCGCACCGACAGCCCCAACTTCCTCTGCTCCGTGCTACCCACTCACTGGCGCTGCAACAAGACCCTGCCCATCGCTTTCAAGGTGGTGGCACTGGGGGACGTCCCGGATGGCACTCTGGTCACCGTCATGGCAGGCAACGATGAAAACTACTCGGCAGAACTGAGAAATGCTACCGCGGCCATGAAGAACCAGGTAGCGAGATTCAACGACCTCAGGTTTGTCGGGCGGAGCGGTAGAGGCAAGAGCTTCACTCTGACCATCACCGTCTTTACAAATCCGCCACAAGTTGCCACCTACCATAGAGCCATCAAAATCACAGTGGACGGCCCCCGAGAACCCCGAAATGCCAGGCAGATCCAGCCATCCCCACCGTGGTCCTATGACCAGTCCTACCAGTACCTGGGATCCATCACCTCTTCCTCTGTCCACCCAGCGACACCCATTTCACCCGGCCGTGCCAGCGGCATGACCAGCCTCTCTGCAGAACTTTCCAGTCGACTCTCAACGGCTCCGGACCTGACCGCCTTCGGCGACCCACGCCAGTTCCCTACTCTGCCGTCCATCTCCGACCCGCGCATGCACTACCCAGGCGCCTTCACCTACTCGCCGCCCGTCACGTCGGGCATCGGCATCGGCATGTCAGCCATGAGCTCGGCCTCTCGCTACCACACCTACCTGCCGCCGCCCTACCCCGGCTCATCACAGGCGCAGGCCGGGCCCTTCCAGACCGGCTCGCCCTCCTACCATCTATACTACGGCGCCTCGGCCGGTTCCTACCAGTTCTCCATGGTGGGCGGAGAGAGATCGCCCCCGCGCATCCTGCCGCCCTGCACCAACGCATCCACCGGCGCCGCGCTGCTCAACCCCAGCCTCCCCAGCCAGAGCGACGTGGTGGAGACCGAGGGCAGCCATAGCAACTCGCCCACCAACATGCCCCCCGCGCGCCTGGAGGAGGCCGTGTGGCGGCCCTACTGA

SEQ ID No:2：

GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT

SEQ ID No:3：ATGGCCACCACCGGGGCCCTGGGCAACTACTATGTGGACTCCTTCCTGCTGGGCGCCGACGCTGCTGATGAGCTGGGTGCGGGACGCTACGCTCCAGGGACCCTGGGTCAACCCCCAAGGCAGGCGGCAGCTCTGGCCGAACACCCCGACTTCAGTCCTTGCAGCTTCCAGTCCAAGGCGGCGGTGTTTGGTGCCTCGTGGAACCCAGTGCACGCGGCGGGCGCCAATGCGGTGCCTGCTGCAGTGTATCATCACCACCACCACCCCTACGTGCATCCCCAGGCGCCCGTGGCGGCGGCGGCGCCGGACGGCAGGTATATGCGCTCCTGGCTGGAACCCACGCCCGGTGCGCTCTCCTTCGCGGGCTTACCCTCCAGCCGGCCTTATGGCATTAAACCTGAACCGCTCTCGGCCAGAAGGGGTGACTGTCCCACGCTTGACACTCACACTTTGTCCCTGACTGACTATGCTTGTGGTTCTCCTCCAGTTGATAGAGAAAAACAACCCAGCGAAGGCGCCTTCTCCGAAAACAATGCCGAGAATGAGAGCGGCGGAGACAAGCCCCCCATCGATCCCAATAACCCGGCTGCCAACTGGCTACATGCTCGCTCCACTCGGAAGAAGCGATGCCCCTACACAAAACACCAGACGCTGGAACTGGAGAAGGAGTTTCTGTTTAACATGTACCTCACACGGGACCGCAGGTACGAGGTGGCCCGGCTGCTCAACCTCACCGAAAGGCAGGTCAAGATCTGGTTCCAGAACCGCAGGATGAAAATGAAGAAAATCAACAAGGACCGAGCAAAAGACGAGTGA

SEQ ID No:4：

ATGGAGAAAATGTCCCGACAGCTCCCCTTGAACCCCACCTTTATCCCGCCTCCCTACGGCGTGCTCAGGTCCCTGCTGGAGAACCCGCTGAAGCTCCCCCTTCATCCTGAAGACGCATTTAGTAAAGAAAAAGACAAAGGAAAGAAGCTGGACGATGAGAGCAGCAGCCCGACCGTCCCCCAGTCCGCCTTCTTGGGACCCACCTTATGGGACAAAACCCTTCCCTATGACGGAGATACTTTCCAGCTGGAATACATGGACTTGGAGGAATTCCTGTCAGAGAATGGCATCCCCCCGAGTCCGTCGCAGCACGACCACAGCCCTCACCCCCCTGGCTTGCAACCAGCTTCCTCCACGGCGCCCTCGGTCATGGATCTCAGCAGCCGGGCCACAGCGCCCCTCCACCCGGGCATCCCGTCTCCGAACTGTATGCAGAGCCCCATCAGACCAGGCCAGCTGTTGCCAGCAAACCGCAATACACCGAGTCCCATTGACCCTGACACCATCCAGGTACCAGTCGGGTATGAACCAGACCCGGCAGACCTTGCCCTCTCCAGCATCCCGGGGCAGGAAATGTTTGACCCTCGCAAACGGAAGTTCTCTGAGGAAGAACTGAAGCCACAGCCCATGATTAAGAAAGCTCGCAAAGTCTTCATTCCCGATGATTTGAAGGATGACAAGTACTGGGCGAGGCGCAGAAAGAACAACATGGCGGCCAAGCGCTCCCGTGATGCCCGGCGGCTGAAGGAGAACCAGATCGCAATCCGGGCCTCATTCCTGGAGAAGGAGAACTCGGCCCTCCGCCAGGAGGTGGCTGATTTAAGGAAGGAGCTGGGCAAATGCAAGAACATACTTGCCAAGTACGAGGCCAGGCACGGGCCCCTGTAA

SEQ ID No:5：

CAATGTACTAACTACGCTTTGTTGAAACTCGCTGGCGATGTTGAAAGTAACCCCGGTCCT

SEQ ID No:6：

ATGAGTTCTTCGTATTATGTGAACGCGCTTTTTAGCAAATATACGGCGGGGGCTTCTCTCTTCCAAAATGCCGAGCCGACTTCTTGCTCCTTTGCACCCAACTCGCAGAGAAGCGGCTACGGGCCGGGCGCCGGCGCCTTCGCCTCCACTGTGCCGGGCTTATACAATGTCAACAGCCCCCTCTATCAGAGCCCCTTCGCGTCCGGCTATGGCCTGGGAGCCGACGCCTACAACCTGCCCTGCGCCTCCTACGACCAAAACATCCCCGGGCTCTGCAGTGACCTCGCCAAAGGCGCCTGCGACAAGGCGGACGAGGGCGTGCTTCACGGCCCGGCCGAAGCCAGTTTCCGCATCTACCCCTGGATGCGCAGTTCAGGACCCGACAGGAAGCGGGGACGCCAGACCTACACGCGCTACCAGACGCTGGAACTGGAGAAGGAATTCCATTTCAACCGCTACCTGACGCGGCGCCGCCGCATCGAGATCGCTCACGCGCTCTGCCTCACTGAGCGCCAGATCAAGATCTGGTTCCAGAATCGGCGCATGAAGTGGAAGAAAGAGCATAAAGATGAGAGCCAGGCTCCCACTGCAGCCCCGGAAGACGCGGTGCCCTCCGTTTCCACAGCTGCTGACAAGGCGGACGAGGAGGAAGAGGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAGGAAGAGGAGTAA

序列表

<110> 北京干细胞与再生医学研究院

<120> PE01956

<130> 一种基因构建体以及产生多谱系造血干祖细胞的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 1

atgcgtatcc ccgtagatgc cagcacgagc cgccgcttca cgccgccttc caccgcgctg 60

agccccggca agatgagcga ggcgctgccg ctgggcgccc cggatggcgg cgccgccctg 120

gccagcaagc tgaggagcgg cgaccgcagc atggtggagg tactagctga ccaccctggc 180

gagctagtgc gcaccgacag ccccaacttc ctctgctccg tgctacccac tcactggcgc 240

tgcaacaaga ccctgcccat cgctttcaag gtggtggcac tgggggacgt cccggatggc 300

actctggtca ccgtcatggc aggcaacgat gaaaactact cggcagaact gagaaatgct 360

accgcggcca tgaagaacca ggtagcgaga ttcaacgacc tcaggtttgt cgggcggagc 420

ggtagaggca agagcttcac tctgaccatc accgtcttta caaatccgcc acaagttgcc 480

acctaccata gagccatcaa aatcacagtg gacggccccc gagaaccccg aaatgccagg 540

cagatccagc catccccacc gtggtcctat gaccagtcct accagtacct gggatccatc 600

acctcttcct ctgtccaccc agcgacaccc atttcacccg gccgtgccag cggcatgacc 660

agcctctctg cagaactttc cagtcgactc tcaacggctc cggacctgac cgccttcggc 720

gacccacgcc agttccctac tctgccgtcc atctccgacc cgcgcatgca ctacccaggc 780

gccttcacct actcgccgcc cgtcacgtcg ggcatcggca tcggcatgtc agccatgagc 840

tcggcctctc gctaccacac ctacctgccg ccgccctacc ccggctcatc acaggcgcag 900

gccgggccct tccagaccgg ctcgccctcc taccatctat actacggcgc ctcggccggt 960

tcctaccagt tctccatggt gggcggagag agatcgcccc cgcgcatcct gccgccctgc 1020

accaacgcat ccaccggcgc cgcgctgctc aaccccagcc tccccagcca gagcgacgtg 1080

gtggagaccg agggcagcca tagcaactcg cccaccaaca tgccccccgc gcgcctggag 1140

gaggccgtgt ggcggcccta ctga 1164

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 2

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 3

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 3

atggccacca ccggggccct gggcaactac tatgtggact ccttcctgct gggcgccgac 60

gctgctgatg agctgggtgc gggacgctac gctccaggga ccctgggtca acccccaagg 120

caggcggcag ctctggccga acaccccgac ttcagtcctt gcagcttcca gtccaaggcg 180

gcggtgtttg gtgcctcgtg gaacccagtg cacgcggcgg gcgccaatgc ggtgcctgct 240

gcagtgtatc atcaccacca ccacccctac gtgcatcccc aggcgcccgt ggcggcggcg 300

gcgccggacg gcaggtatat gcgctcctgg ctggaaccca cgcccggtgc gctctccttc 360

gcgggcttac cctccagccg gccttatggc attaaacctg aaccgctctc ggccagaagg 420

ggtgactgtc ccacgcttga cactcacact ttgtccctga ctgactatgc ttgtggttct 480

cctccagttg atagagaaaa acaacccagc gaaggcgcct tctccgaaaa caatgccgag 540

aatgagagcg gcggagacaa gccccccatc gatcccaata acccggctgc caactggcta 600

catgctcgct ccactcggaa gaagcgatgc ccctacacaa aacaccagac gctggaactg 660

gagaaggagt ttctgtttaa catgtacctc acacgggacc gcaggtacga ggtggcccgg 720

ctgctcaacc tcaccgaaag gcaggtcaag atctggttcc agaaccgcag gatgaaaatg 780

aagaaaatca acaaggaccg agcaaaagac gagtga 816

<210> 4

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 4

atggagaaaa tgtcccgaca gctccccttg aaccccacct ttatcccgcc tccctacggc 60

gtgctcaggt ccctgctgga gaacccgctg aagctccccc ttcatcctga agacgcattt 120

agtaaagaaa aagacaaagg aaagaagctg gacgatgaga gcagcagccc gaccgtcccc 180

cagtccgcct tcttgggacc caccttatgg gacaaaaccc ttccctatga cggagatact 240

ttccagctgg aatacatgga cttggaggaa ttcctgtcag agaatggcat ccccccgagt 300

ccgtcgcagc acgaccacag ccctcacccc cctggcttgc aaccagcttc ctccacggcg 360

ccctcggtca tggatctcag cagccgggcc acagcgcccc tccacccggg catcccgtct 420

ccgaactgta tgcagagccc catcagacca ggccagctgt tgccagcaaa ccgcaataca 480

ccgagtccca ttgaccctga caccatccag gtaccagtcg ggtatgaacc agacccggca 540

gaccttgccc tctccagcat cccggggcag gaaatgtttg accctcgcaa acggaagttc 600

tctgaggaag aactgaagcc acagcccatg attaagaaag ctcgcaaagt cttcattccc 660

gatgatttga aggatgacaa gtactgggcg aggcgcagaa agaacaacat ggcggccaag 720

cgctcccgtg atgcccggcg gctgaaggag aaccagatcg caatccgggc ctcattcctg 780

gagaaggaga actcggccct ccgccaggag gtggctgatt taaggaagga gctgggcaaa 840

tgcaagaaca tacttgccaa gtacgaggcc aggcacgggc ccctgtaa 888

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 5

caatgtacta actacgcttt gttgaaactc gctggcgatg ttgaaagtaa ccccggtcct 60

<210> 6

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 6

atgagttctt cgtattatgt gaacgcgctt tttagcaaat atacggcggg ggcttctctc 60

ttccaaaatg ccgagccgac ttcttgctcc tttgcaccca actcgcagag aagcggctac 120

gggccgggcg ccggcgcctt cgcctccact gtgccgggct tatacaatgt caacagcccc 180

ctctatcaga gccccttcgc gtccggctat ggcctgggag ccgacgccta caacctgccc 240

tgcgcctcct acgaccaaaa catccccggg ctctgcagtg acctcgccaa aggcgcctgc 300

gacaaggcgg acgagggcgt gcttcacggc ccggccgaag ccagtttccg catctacccc 360

tggatgcgca gttcaggacc cgacaggaag cggggacgcc agacctacac gcgctaccag 420

acgctggaac tggagaagga attccatttc aaccgctacc tgacgcggcg ccgccgcatc 480

gagatcgctc acgcgctctg cctcactgag cgccagatca agatctggtt ccagaatcgg 540

cgcatgaagt ggaagaaaga gcataaagat gagagccagg ctcccactgc agccccggaa 600

gacgcggtgc cctccgtttc cacagctgct gacaaggcgg acgaggagga agaggaggaa 660

gaggaggaag aagaggagga agaggagtaa 690

Claims

1.一种基因构建体，其特征在于，其包含RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因。

2.一种载体，其特征在于，其包含RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的基因序列，所述载体用于RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的串联共表达。

3.一种表达如权利要求2所述载体的核酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，其包含串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因；

优选地，所述宿主细胞是多能干细胞；

5.一种产生多谱系造血干祖细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述整合方法包括同源重组、CRISPR/Cas9、TALEN、转染或病毒感染中的任意一种或两种以上，优选为同源重组；优选地，将串联连接的RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的cDNA序列串联表达于同一载体并整合到哺乳动物多能干细胞基因组的安全位点处；

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，依次采用D0培养基、D2.5培养基、D6培养基培养所述整合有RUNX1基因、HOXA9基因以及HLF基因和/或HOXA7基因的多能干细胞，以得到所述生血内皮细胞；

8.根据权利要求5～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述骨髓基质细胞选自OP9-DL1细胞、OP9细胞或MS5细胞中的任意一种或两种或三种，优选为OP9-DL1细胞；

优选地，所述诱导培养基中含有强力霉素；

9.根据权利要求5～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述B细胞包括B220+B细胞和/或CD19+B细胞；

优选地，所述B1细胞包括B1a细胞和/或B1b细胞；

优选地，所述B2细胞为滤泡B细胞和/或边缘区B细胞；

优选地，所述T细胞包括CD3+、CD4+和CD8+中的任意一种或两种以上；

优选地，所述T细胞包括TCRβ细胞和/或TCRγδ细胞。

10.一种由权利要求5～9中任一项所述的方法制备得到的造血干祖细胞，其包括B谱系祖细胞和髓系祖细胞，或者包括T谱系祖细胞、B谱系祖细胞和髓系祖细胞。

11.一种由权利要求5～9中任一项所述的方法制备得到的血液细胞，其包括B细胞和髓系细胞，或者包括T细胞、B细胞和髓系细胞。

12.一种药物组合物，其特征在于，其包括以下任意一种或两种以上：如权利要求1所述的基因构建体、如权利要求2所述的载体、如权利要求4所述宿主细胞、如权利要求10所述的造血干祖细胞、如权利要求11所述的血液细胞。

13.一种如权利要求12所述的药物组合物在制备增强B细胞免疫响应药物或者T细胞免疫响应药物中、在制备预防和/或治疗B细胞或T细胞免疫缺陷的药物中、在制备预防和治疗血液疾病的药物中或在制备抗感染和治疗肿瘤的药物中的应用。