KR20190057387A - 만능 줄기 세포를 hla 동형 접합 면역 세포로 직접 분화시키기 위한 방법 - Google Patents

만능 줄기 세포를 hla 동형 접합 면역 세포로 직접 분화시키기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

HLA 동형 접합 혈액 세포-유도된 만능 줄기 세포를 조혈 전구 세포로 효율적으로 시험관내에서 분화시키고, 상기 조혈 전구 세포를 각종 골수계 또는 림프계의 HLA 동형 접합 면역 세포, 특히, T 세포, NK 세포 및 수지상 세포로 추가로 분화시키기 위한 방법이 본 출원에 제공된다. 상기 만능 세포는 제한 조건하에 유지되고 분화될 수 있으며; 따라서, 마우스 피더 세포 또는 혈청의 사용은 조혈 전구 세포의 분화에 대한 특정 실시형태에서 요구되지 않는다.

Description

만능 줄기 세포를 HLA 동형 접합 면역 세포로 직접 분화시키기 위한 방법
본 출원은 2016년 10월 5일자로 출원된 미국 가특허원 62/404,470 및 2017년 4월 18일자로 출원된 미국 가특허원 62/486,895에 대한 이익을 주장하며, 이들의 전문은 본 출원에 참조로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈액 세포-유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 HLA 동형 접합 면역 세포를 생산하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
세포 치료 방법은 종양, 바이러스 및 박테리아 병원체에 대한 숙주 면역 반응을 증진시키기 위해서 개발되었다. 세포 치료 방법은 종종 T 세포의 생체외 활성화 및 확장을 수반한다. 이러한 유형의 치료의 예로는 종양 침윤 림프구 (TIL) 세포, 세포독성 T 세포, 확장된 종양 배농 림프절 세포 및 다양한 다른 림프구 제제의 사용이 포함된다. 조혈 줄기 세포 및 선조 세포의 상당한 의학적 잠재력으로 인해, 조혈 선조 세포를 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포로 분화시키기 위한 방법을 개선시키려는 실질적인 연구가 이루어져 왔다.
사람에서, 유도 만능 줄기 (iPS) 세포는 일반적으로 진피 섬유아세포로부터 생산된다. 그러나, 피부 생검을 위한 요건과 시험관내 여러 계대 배양을 위해 섬유아세포를 확장해야 하는 필요성 때문에, 이것은 환자-특이적인 줄기 세포를 생산하기 위한 다루기 힘든 공급원이다. 더욱이, 사람 체세포의 재프로그래밍을 위한 이전의 방법은 사람 대상체로부터 체세포를 직접 수득하거나 노동 집약적인 세포 배양 시스템에서 세포를 유지할 필요가 있기 때문에 불편하다. 따라서, 간단하고 편리하며 용이하게 접근할 수 있는 대체 공급원으로부터 만능 줄기 세포를 유도하는 방법을 개발할 필요성이 있다. 따라서, 혈액은 환자 또는 건강한 개체로부터 수집되거나, 예를 들어, 중앙 유닛으로부터 하나 이상의 원격 장소로 배포하기 위해 저장되거나 전달될 수 있기 때문에, 혈액 샘플은 이러한 공급원일 수 있다. 따라서, 혈액 세포로부터 iPS 세포를 재프로그래밍하고, 이어서 혈액 세포-유도된 iPS 세포를 T 세포, NK 세포, T/NK 세포 및 수지상 세포와 같은 면역 세포로 효율적으로 분화시키는 방법에 대한 명백한 필요성이 현재 존재한다.
발명의 요약
본 개시 내용의 제1 실시형태는, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 수득하고, 여기서, 상기 iPSC가 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군으로부터 재프로그래밍되고, 상기 iPSC를 조혈 전구 세포 (HPC)로 분화시키고, 면역 세포 분화를 촉진시키는 조건하에 상기 HPC를 배양하여 HLA 동형 접합 면역 세포를 생산하는 것을 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 iPSC는 통합된 외인성 바이러스 요소를 본질적으로 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포는 유전자 좌위 대립 유전자 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 중 1종 이상에 대해 동형 접합성이다. 특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포는 유전자 좌위 대립 유전자 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 중 2종에 대해 동형 접합성이다. 특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포는 HLA-A 및 HLA-B에 대해 동형 접합성이다. 하나의 특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C에 대해 동형 접합성이다.
특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 림프구 세포이다. 특정 양태에서, 상기 림프구 세포는 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포이다. 일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 골수 세포이다. 특정 양태에서, 상기 골수 세포는 수지상 세포이다.
일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군은 포유 동물이다. 특정 양태에서, 상기 혈액 세포의 개체군은 사람이다. 일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군은 외인성으로 적용된 G-CSF에 의해 동원되지 않았다. 특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군은 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군은 선조 혈액 세포, 말초 혈액 단핵 세포 또는 림프아구 세포로서 추가로 정의된다. 특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군은 말초 혈액, 제대 혈액 또는 림프구 조직으로부터 단리된다. 특정 양태에서, 상기 림프구 조직은 골수, 림프절 또는 태아 간을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군은 T 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체의 존재하에 배양된다. 특정 양태에서, 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 T 헬퍼 1 (TH1) 세포, T 헬퍼 2 (TH2) 세포, TH17 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 미경험 (naive) T 세포, 기억 T 세포 또는 감마 델타 T 세포이다.
특정 양태에서, 상기 재프로그래밍은 재프로그래밍 인자를 상기 혈액 세포의 개체군 내에 도입하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 재프로그래밍은 RNA, 단백질 또는 작은 분자를 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군 내에 도입하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 재프로그래밍 인자는 1종 이상의 발현 카세트에 의해 암호화된다. 특정 양태에서, 상기 재프로그래밍 인자는 Sox2, Oct4, cMyc, Klf4, Nanog, SV40 거대 T 항원 및 Lin28로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2종 이상의 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 재프로그래밍 인자는 Sox2, Oct4, cMyc, Klf4, Nanog, SV40 거대 T 항원 및 Lin28로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3, 4, 5 또는 6종의 유전자를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 1종 이상의 발현 카세트는 바이러스 벡터, 에피솜 벡터 및 트랜스포손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재프로그래밍 벡터에 포함된다. 일부 양태에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터로서 추가로 정의된다. 특정 양태에서, 상기 에피솜 벡터는 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 기반의 에피솜 벡터로서 추가로 정의된다. 일부 양태에서, 상기 재프로그래밍은 무피더 (feeder-free) 제한 조건하에 상기 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 HPC는 1개의 HPC 당 적어도 20개의 HLA 동형 접합 면역 세포, 예를 들어, 1개의 HPC 당 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 이상의 HLA 동형 접합 면역 세포로 분화한다. 특정 양태에서, 상기 HPC는 1개의 HPC 당 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200개 또는 그 이상의 NK 세포로 분화한다. 일부 양태에서, 상기 HPC는 1개의 HPC 당 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개 또는 그 이상의 T 세포로 분화한다.
특정 양태에서, 상기 iPSC를 HPC로 분화시키는 것은, 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 제1 제한 배지에서 상기 iPSC를 배양하는 단계, IL-3, Flt-3 리간드 및 GM-CSF를 포함하지 않거나 본질적으로 포함하지 않는 제2 제한 배지에서 상기 세포를 항온처리하는 단계, 복수의 상기 세포에서 분화를 확장시키거나 촉진시키기에 충분한 BMP-4, FGF-2 및 VEGF를 포함하는 제3 제한 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계, 및 복수의 상기 세포에서 분화를 확장시키거나 촉진시키기에 충분한 IL-3 및 Flt-3 리간드를 포함하는 제4 제한 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계의 순차적인 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 복수의 상기 만능 세포는 HPC로 분화된다. 일부 양태에서, 상기 제2 제한 배지는 블레비스타틴을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 제2 제한 배지는 GSK3 억제제를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021이다. 일부 양태에서, 상기 제2 제한 배지는 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 세포는 상기 제2 제한 배지에서 상기 세포를 항온처리하기 전에 개별화된다. 일부 양태에서, 상기 제2 제한 배지에서 상기 세포를 항온처리하고, 제3 제한 배지에서 상기 세포를 배양하고, 제4 제한 배지에서 상기 세포를 배양하는 것은 아민-코팅된 배양 플레이트를 사용하여 수행된다. 일부 양태에서, 상기 제2 제한 배지는 VEGF 및 FGF-2를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 제4 제한 배지는 IL-3, IL-6, SCF, TPO 및 BMP-4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 사이토카인을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제4 제한 배지는 헤파린을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 25% 미만의 산소, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 10% 또는 5% 미만의 산소의 대기압에서 상기 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 복수의 상기 만능 세포는 배상체 (EB)로부터 유래된다. 특정 양태에서, 상기 HPC는 CD34를 발현한다. 특정 양태에서, 상기 HPC는 CD43, CD34, CD31, CD41, CD235 및 CD45로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2종의 마커, 예를 들어, CD43와 CD34 둘 다를 발현한다.
일부 양태에서, 면역 세포 분화를 촉진시키는 조건은 림프구 분화를 촉진시키는 조건으로서 추가로 제한된다. 특정 양태에서, CD34 및 CD43을 발현하는 HPC는 림프구 분화를 촉진시키는 조건하에 배양된다. 일부 양태에서, 림프구 분화를 촉진시키기 위해 상기 세포를 배양하는 것은, 매트릭스 및 노치 리간드 (Notch ligand)로 코팅된 표면상의 제한 배지에서 HPC를 배양하고, 여기서, 상기 HPC는 CD34, CD43, CD7, DLL4, CD144 및 CD235로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 세포 표면 마커를 발현하고, 1종 이상의 사이토카인의 존재하에 상기 배양을 유지하여 림프구 세포를 생산하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 HPC는 CD144, CD34, CD45 및 CD7을 발현한다. 특정 양태에서, 상기 HPC는 CD144, CD34, CD45 및 CD7을 발현한다.
추가 양태에서, 림프구 분화를 위한 제1 단계는 1종 이상의 세포 표면 마커를 발현하는 HPC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 단리는 자성-활성화 세포 분류 (magnetic-activated cell sorting; MACS)를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 세포는 5% 미만의 산소의 대기압에서 배양된다. 특정 양태에서, 상기 세포는 약 5%의 산소의 대기압에서 배양된다. 일부 양태에서, 상기 제한 배지는 아스코르브산 및/또는 니코틴아미드를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 아스코르브산은 50 μM 내지 1 mM, 예를 들어, 90 μM 내지 100 μM의 농도로 존재한다. 일부 양태에서, 상기 니코틴아미드는 0.1 mM 내지 5 mM의 농도로 존재한다. 일부 양태에서, 상기 니코틴아미드는 니코틴산이다. 일부 양태에서, 상기 매트릭스는 세포외 매트릭스 단백질이다. 일부 양태에서, 상기 매트릭스는 레트로넥틴, 콜라겐, 라미닌 또는 피브로넥틴이다. 특정 양태에서, 상기 매트릭스는 레트로넥틴이다. 일부 양태에서, 상기 노치 리간드는 DLL4이다. 특정 양태에서, 상기 DLL4는 DLL4:Fc 키메라 단백질이다. 특정 양태에서, 상기 1종 이상의 사이토카인은 SCF, TPO, IL-7 및 Flt-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 제2 단계는 1주 내지 6주, 예를 들어, 2주 내지 4주이다. 일부 양태에서, 상기 림프구 세포는 CD8, CD7, CD45, CD5, CD4 및 CD3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 마커를 발현한다. 일부 양태에서, 상기 림프구 세포 중 5% 초과는 상기 마커 중 적어도 2종에 대해 양성이다. 특정 양태에서, 상기 림프구 세포 중 10% 초과는 상기 마커 중 적어도 2종에 대해 양성이다.
일부 양태에서, 면역 세포 분화를 촉진시키는 조건은 골수 분화를 촉진시키는 조건으로서 추가로 제한된다. 특정 양태에서, 골수 분화를 촉진시키는 조건하에 상기 HPC를 배양하는 것은, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드를 포함하는 제1 제한 배지에서 상기 HPC를 배양하여 골수 세포의 개체군을 생산하고, TPO, SCF 및 Flt-3 리간드를 본질적으로 포함하지 않는 제2 제한 배지에서 상기 세포를 항온처리하여 골수 세포의 농축 개체군을 생산하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제1 제한 배지는 IL-6 및 IL-3을 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 제2 제한 배지는 GM-CSF를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 제1 단계에서 생산된 상기 골수 세포의 개체군 중 적어도 50%는 CD45, CD43 및 CD31에 대해 양성이다. 일부 양태에서, CD45, CD43 및 CD31에 대해 양성인 골수 세포의 개체군은 CD34를 본질적으로 발현하지 않는다. 특정 양태에서, 상기 골수 세포의 농축 개체군 중 적어도 80%는 CD43+, CD45+, CD31+ 및 CD34-이다. 일부 양태에서, 상기 제2 단계는 5일 내지 10일 동안이다.
특정 양태에서, 상기 방법은 상기 골수 세포의 농축 개체군을 수지상 세포로 분화시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 골수 세포의 농축 개체군을 수지상 세포로 분화시키는 것은 GM-CSF, IL-4 및 TNFα를 포함하는 제한 배지에서 상기 골수 세포의 농축 개체군을 배양하여 수지상 세포를 생산하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 제한 배지는 지질단백질을 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 수지상 세포는 CD209, CD1a, HLA-DR, CD11c, CD14, CD83 및 CD86으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 마커를 발현한다. 특정 양태에서, 상기 수지상 세포는 CD12를 본질적으로 발현하지 않는다.
추가의 실시형태에서, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리가 제공되며, 여기서, 각 라이브러리 구성원은 HLA-유형에 따라 특성화된다. 일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 초 공여체 (super donor)로부터 수득된 혈액 샘플로부터 유래된다. 특정 양태에서, 상기 초 공여체는 사람이다. 일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 동종이계이다. 일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 자가이다. 특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 1종 이상의 HLA 클래스 I 유전자 및/또는 HLA 클래스 II 유전자에 대해 적어도 동형 접합성이다. 특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 유전자 좌위 대립 유전자 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 중 1종 이상에 대해 동형 접합성이다. 일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 유전자 좌위 대립 유전자 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 중 2종에 대해 동형 접합성이다. 일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 HLA-A 및 HLA-B에 대해 동형 접합성이다. 특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C에 대해 동형 접합성이다. 일부 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포의 개체군은 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포와 같은 림프구 세포이다. 특정 양태에서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포는 수지상 세포와 같은 골수 세포이다. 특정 양태에서, 각 라이브러리 구성원은 잠재적인 수용자와 HLA-일치된다. 일부 양태에서, 상기 라이브러리는 냉동 보존된 HLA 동형 접합 면역 세포를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 라이브러리는 적어도 15개의 라이브러리 구성원을 포함하고, 상기 구성원은 뚜렷한 HLA 1배체형을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 라이브러리는 적어도 30개의 라이브러리 구성원, 예를 들어, 적어도 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 이상의 라이브러리 구성원을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 사람 초 공여체로부터 수득된 복수의 혈액 샘플을 HLA-분류 (HLA-typing)하고, 복수의 상기 혈액 샘플로부터 유래된 세포를 iPSC로 재프로그래밍하고, 상기 iPSC를 HPC로 분화시키고, 면역 세포 분화를 촉진시키는 조건하에 상기 HPC를 배양하여 HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리를 생성하는 것을 포함하는, 상기 실시형태의 HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리를 생성하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상과 범위 내에서의 다양한 변경 및 변형이 상세한 설명으로부터 당해 분야의 통상의 기술자에게 자명하기 때문에, 본 발명의 바람직한 실시형태를 제시하는 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 예시로서만 제공된다는 것을 이해해야 한다.
하기의 도면들은 본 명세서의 일부를 구성하며, 본 발명의 특정 양태들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 출원에 제시된 실시형태에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면들 중 하나 이상을 참조하면 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a~1d: (도 1a) iPSC로부터 T 세포, NK 세포 및 NK/T 세포를 유도하는 무피더 방법의 개략도. iPSC는 3D 과정에 의해 림프구 및 골수 잠재력을 갖는 HPC로 분화되고, 이어서 7~10일째 선조는 2D 분화 과정을 거쳐 T 세포, NK 세포 및 NK/T 세포를 생산한다. (도 1b) iPSC로부터 수지상 세포를 유도하는 무피더 방법의 개략도. iPSC는 3D 과정에 의해 림프구 및 골수 잠재력을 갖는 HPC로 분화되고, 12일째 선조는 추가로 분화되어 골수 선조를 생산하고, 단계별 3D 분화 과정을 거쳐 수지상 세포를 생산한다.(도 1c) HPC가 분화 12일째에 다양한 혈액 세포-유도된 iPSC 세포주로부터 생산되었으며, 유세포 계측법에 의해 정량화된 CD43+/CD34+ 세포의 백분율이 도시되어 있다. (도 1d) 12일째 iPSC로부터의 HPC 생산 효율은 iPSC의 투입수 당 생산된 HPC의 절대수의 비율로서 도시되어 있다.
도 2: 7~10일째 HPC의 림프구 분화 동안 림프구 및 림프구-골수 개체군을 동정하는 유세포 계측법 산점도가 도시되어 있다. 프레 T 세포, NK 세포 및 NK/T 세포의 존재가 결정되었다.
도 3a~3d: (도 3a) 제대혈-유도된 iPSC, 바이러스 재프로그래밍된 T 세포 iPSC (TiPSC) 및 에피솜으로 재프로그래밍된 선조 혈액 세포 iPSC (01279.107.3908)를 비롯하여 바이러스 및 에피솜으로 재프로그래밍된 iPSC로부터 림프구 세포의 출현을 검출하기 위한 대표적인 염색 프로파일. CD5, CD7, CD45, CD3, CD56 및 CD8을 비롯한 다양한 마커의 표면 발현을 위해 세포를 염색하였다. 세포의 백분율은 FSC-SSC 및 림프구 산포 게이트하에 유세포 계측법으로 정량화되었다. (EB7= 7일째, EB8= 8일째, EB9= 9일째, EB10= 10일째 및 EB11= 11일째. (도 3b) TiPSC로부터 분화된 7~11일째 HPC (상단: 총 HPC; 하단: CD43+CD34+ HPC)는 림프구 세포로 추가로 분화되고, CD45, CD7 및 CD5의 표면 발현을 위해 염색되었다. 세포의 백분율은 FSC-SSC 및 림프구 산포 게이트하에 유세포 계측법으로 정량화되었다. (도 3c) TiPSC로부터 생산된 7~11일째 HPC (상단: 총 HPC; 하단: CD43+CD34+ HPC)는 저산소 조건하에 분화되고, CD56, CD8 및 CD3의 표면 발현을 위해 염색되었다. (도 3d) TiPSC로부터 림프구 세포를 생산하는 효율이 도시되어 있다 (좌측: 총 HPC; 우측: CD43+CD34+ HPC).
도 4: TiPSC로부터 분화된 7~11일째 HPC (예를 들어, 바이러스로 재프로그래밍된 TiPSC 1E 또는 에피솜으로 재프로그래밍된 01279.107.3902)는 7일부터 11일까지의 HPC 분화의 다양한 날에 CD43/CD34, CD34, Dll4, Dll4/CD144, CD31/CD144 및 CD235의 발현에 대해 분석하였다. 도시된 경우, 마커의 각 세트에 대해 양성인 세포의 백분율. CD43/CD34 발현은 좌측 컬럼, CD34는 우측 컬럼, DLL4/CD144는 하단 라인, CD31/CD144는 중간 라인 및 CD235는 상단 라인으로 도시된다.
도 5: HPC 분화 동안 림프구 선조를 검출하기 위한 자성 분류 전략의 개략도. 관심 대상 마커에는 CD31, CD34, CD144, CD43, CD45, CD7, CD235, FLK1 (KDR, VEGFR2, CD309로도 또한 알려짐) 및 DLL4가 포함된다. 분화 8일째에, 관심 대상 마커에 기초하여 세포를 여러 분획물로 분류한 다음, 림프구 분화 과정를 거쳤다.
도 6a~6b: (도 6a) 도 5의 자성 분류 전략으로부터의 세포의 양성 및 음성 분획물 각각에서의 CD3 양성 세포의 백분율은 대조군으로서 분류되지 않은 세포와 함께 도시되어 있다. (도 6b) HPC로부터 생산된 T 세포의 배수 농축은 대조군으로서 분류되지 않은 세포와 함께 도 5의 자성 분류 전략으로부터의 양성 및 음성 분획물에 대해 도시되어 있다.
도 7a~7b: (도 7a) TiPSC로부터의 림프구 분화 4주 후 도 5의 자성 분류로부터의 세포의 양성 분획물 각각에 대한 CD3 양성 세포의 백분율이 도시되어 있다. (도 7b) TiPSC 1E 세포로부터의 5주 분화의 FACS 플롯. 신생 림프구 세포의 발현에 대한 CD3 양성 세포의 유세포 분석은 CD7+, CD5+, CD3+, CD8+, CD56+ CD335+, CD161+, TCR αβ+ 및 TCR γδ-이다.
도 8a~8b: (도 8a) 양성과 음성 자성 분류된 분획물 둘 다의 16일째에 HPC로부터의 TiPC 림프구 분화 과정의 효율은 투입 HPC와 산출 림프구 세포의 비율로서 도시되어 있다. (도 8b) 양성 자성 분류 분획물로 시작한 4주 말기에 분화 과정의 누적 효율.
도 9a~9b: (도 9a) 분화 42일째에 iPSC 02179 (MeCP2 WT)로부터 유도된 수지상 세포의 표현형 분석. 골수 수지상 마커 CD205, CD209, HLA-DR, CD1a, CD1c, CD80, CD11c, CD80, CD86 및 CD83의 세포 표면 발현을 위해 세포를 염색하였다. (도 9b) 수지상 세포에서 발현된 다양한 세포 표면 마커의 발현을 정량화하기 위한 대표적인 FACS 플롯 히스토그램.
도 10: DQ TM 오발부민 (DQ-OVA, Invitrogen)을 PBS 중에 1 mg/ml로 용해시키고, 100 ug/ml의 iPSC 유도된 DC에 첨가하였다. 세포를 37℃ 또는 4℃에서 항온처리하고, FACS 완충액으로 2회 세척하고, Accuri 유세포 계측기에서 분석하였다. OVA의 특이적 흡수는 4℃에서의 비특이적 OVA 흡수와 비교하여 37℃에서 iPSC 유도된 DC에 의해 입증되었다.
도 11: hPCS의 무피더 및 무혈청 T 세포 및 NK 세포 분화를 나타내는 다이어그램. PSC는 9일 동안 응집체 형성, 중배엽 유도 및 HPC 분화의 연속 단계를 통해 현탁액 (3D) 배아체 (EB) 배양 중에서 CD34+ 조혈 선조 세포 (HPC)로 먼저 분화되었다. 직접 CD34 상자성 비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 MACS에 의해 CD34+ 세포를 단리하고, 2주 동안 T/NK 분화를 위해 DLL4+ 레트로넥틴 코팅된 플레이트에 옮겼다. T 세포는 IL2 단독으로 또는 다른 T 세포 성장 촉진 사이토카인 (IL7, IL15, IL21)과 조합하여 보충된 T-EM (ImmunoCult-XF T 세포 확장 배지 (Stem Cell Technologies)) 중에서 항-CD3 mAb (OKT3) + 레트로넥틴 코팅된 (둘 다 0.5 g/cm2) 플레이트 상에서 배양하여 2주 동안 추가로 확장될 수 있다. 약어: SFDM, 무혈청 분화 배지; TCDM, T 세포 분화 배지; TCEM, T 세포 확장 배지; MACS, 자성-활성화된 세포 분류.
도 12: T/NK 분화 배양물의 유세포 분석. T/NK 분화 조건에서 2주 후에 PSC (1C TiPSC)-유도된 CD34+ 세포는 낮은 FSC/SSC 파라미터 (좌측 점도표)에 의해 정의된 전형적인 림프구 세포 개체군을 생산한다. 이러한 림프구 개체군은 대부분 CD3+ T 및 CD56+CD3- NK 세포 (중간 점도표)를 포함한다. T 세포 개체군은 CD4+ 및 CD8+ 단일 및 이중 양성 세포뿐만 아니라 이중 음성 세포의 상당한 부분을 포함한다 (우측 점도표).
도 13: 분화 전체에 걸쳐 상이한 세포 개체군의 수율. 각각의 세포 유형의 수율은 다이어그램에 묘사된 세포 유도의 각 단계에서 투입 절대 세포수에 대한 산출의 비율로 표현된다. 예를 들어, 1.5 CD34+ 세포 수율은, 평균 1.5개의 (산출) CD34+ 세포가 1개의 (투입) PSC 세포로부터 유도될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 102 T 세포 수율은 102개의 (산출) T 세포가 1개의 (투입) CD34+ 세포로부터 유도될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 14: PSC-유도된 T 세포의 표현형. 4주 동안 분화 및 확장된 PSC-유도된 T 세포 (CD3+)는 TCR (또는 불변 V 24 NKT TCR이 아님) 및 전형적인 T 세포 마커 CD5, CD27, CD7을 발현한다. 이들은 또한 NK 관련 (CD161, CD94) 및 활성화 (CD69) 마커를 발현한다.
도 15: PSC-유도된 T 세포의 확장. 고정화 항-CD3 항체 (iCD3)는 PSC-유도된 T 세포 (막대 그래프)의 확장을 달성하기 위해 최소한으로 요구되며 충분하다. 가용성 자극 CD3 및 CD28 mAb (sCD3, sCD28)는 단독으로 또는 조합으로 (sCD3+sCD28) 또는 iCD3 (iCD3+sCD28)에 첨가되었을 때 효과적이지 않았다. 확장 배양에서 증식하는 T 세포는 불규칙한 모양의 림프아구의 특징적인 형태를 획득한다 (사진). 상대적으로 비균질의 투입 세포 개체군과 대조적으로, 2주의 T 세포 확장으로부터 수확된 세포는 본질적으로 순수한 CD3+ T 세포이며, 이 세포는 또한 CD56을 발현하고 CD8 발현을 획득한다 (유세포 계측법, 점도표).
도 16a-16h: (도 16a) 8일째 HPC 배양물의 대표적인 사진: HPC는 하부 내피 층으로부터 분리되어 나온다. (도 16b) 2D HPC 분화 과정의 개략도. (도 16c) 분화 7~10일째에 01279.107.3902 (MeCP2 KO) 세포주로부터의 HPC 생산. (도 16d) 분화 7~10일째에 TiPSC 1E 세포주로부터의 HPC 생산. 세포를 수확하고 CD43/CD34 세포의 백분율을 유세포 계측법으로 정량화하였다. (도 16e) iPSC로부터의 HPC 생산 효율. 본 과정의 효율은 iPSC의 투입수 당 생산된 HPC의 절대 수를 나누어 산출된다. (도 16f) 프레 T 세포 및 프레 NK 세포의 분석. iPSC 0.1 279.107.3902 (MeCP2 KO)로부터 생산된 HPC를 7~10일째에 수확하고 냉동 보존하였다. HPC를 해동시키고 레트로넥틴-DLL4 코팅된 플레이트 상에 25K/cm2의 밀도로 플레이팅하였다. 1% Glutamax, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 95 μM L-아스코르브산 2-포스페이트, 50 ng/mL의 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), Flt-3 리간드 (Flt-3) 및 IL-7을 함유하는 무혈청 제한 (Serum Free Defined: SFD) 배지에 세포를 넣고, 저산소 및 조건하에 림프구 분화를 자극하였다. 48 시간 마다 새로운 배지를 세포에 공급하고, 차가운 PBS를 사용하여 14일째에 수확하였다. CD4, CD7, CD5, CD56, CD8 및 CD3의 표면 발현을 위해 세포를 염색하였다. 세포 백분율은 림프구 산포 게이트하에 유세포 계측법으로 정량화하였다. T 세포, NK 세포 및 NK/T 세포의 존재를 정량화하였다. (도 16g) 프레 T 세포 및 프레 NK 세포의 분석. CD4, CD7, CD5, CD56, CD8 및 CD3의 표면 발현을 위해 세포를 염색하였다. 세포 백분율은 림프구 산포 게이트하에 유세포 계측법으로 정량화하였다. (도 16h) HPC로부터의 T 세포 생산 효율. 본 과정의 효율은 HPC (CD43/34+)의 투입수 당 생산된 T 세포 (CD3+)의 절대수를 나누어 산출된다.
도 17a~17c: (도 17a) E8 배지의 존재 및 저산소 조건하에 Matrigel 또는 비트로넥틴 상에서 무피더 성장에 적응된 iPSC를 이용하는 3D HPC 분화 과정의 개략도. HPC 분화의 제1 단계는 BMP-4, VEGF 및 FGF에 의해 4일 동안 구동되며, 분화의 제2 단계는 헤파린, SCF, TPO, Flt-3 리간드, IL-3 및 IL-6을 함유하는 배지에 세포를 넣음으로써 구동된다. (도 17b) 남성 iPSC 세포주 2.038에서 MeCP2 KO를 생산하여 9006 (01279.107.003902)을 만드는 공학적 전략. (도 17c) MeCP2 TALENS 및 Donor 플라스미드 p1553으로 형질감염된 01279 iPSC로부터 유도된 MeCP2 변이체 001, 002, 005 및 008의 아미노산 정렬의 묘사. 모든 변이체 (001, 002, 005 및 008)은 메틸 CpG 결합 도메인을 암호화하지 않는다.
도 18a~18c: HPC 분화 7~11일째에 수확되어 2.5×104/cm2의 밀도로 림프구 분화를 개시하기 위해 Ret-DLL4 코팅된 플레이트 상에 둔 프레 T 세포 및 프레 NK 세포 iPSC Tips 1E의 정량화. 저산소 조건 (도 18a) 및 정상 산소 조건 (도 18b)하에 유지된 01279 (MeCP2WT) 세포뿐만 아니라, 01279.107.3902 세포 (MeCP2K0) (도 18c)에서의 CD8+CD3+ (T 세포), CD56+/CD8+ (NK 세포) 및 CD56+/CD3+ (NK/T 세포)의 백분율을 결정하였다. (도 18a 및 도 18b) NK 세포는 최고 백분율의 양성 세포를 가지며, 다음으로 NK/T 세포 및 T 세포이다. (도 18c) 7일째부터 10일째까지, 상단부터 하단까지의 양성 세포의 백분율은 T 세포, NK/T 세포 및 NK 세포이다. 11일째에, 최고 백분율의 양성 세포는 NK 세포, 다음으로 NK/T 세포 및 T 세포이다.
도 19a~19c: 시험관내에서 생산된 림프구 세포를 동정하기 위한 게이팅 전략. (도 19a) 성인 사람 말초 혈액으로부터의 림프구의 일반적인 산포 프로파일. (도 19b) 분화 18일째에 림프구 세포의 산포 프로파일. FSC-SSC 게이트 및 림프구 게이트가 예시되어 있다. (도 19c) 요오드화 프로피디움을 사용하는 FSC-SSC 산포 및 림프구 산포 내의 게이팅 생세포.
도 20: 시험관내에서 생산된 림프구 세포를 동정하기 위한 게이팅 전략. 분화 18일째 림프구 세포의 산포 프로파일이 도시되어 있다. FSC-SSC 게이트 및 림프구 게이트가 예시되어 있다. 생세포는 요오드화 프로피디움을 사용하여 FSC-SSC 산포 및 림프구 산포 내에서 게이팅된 후, 유세포 계측법으로 CD7 및 CD5 양성 세포에 대해 염색하였다.
도 21a~21b: HPC 분화의 7~11일째에 수확되어 2.5×104/cm2의 밀도로 림프구 분화를 개시하기 위해 Ret-DLL4 코팅된 플레이트 상에 둔 NK (CD3-/CD56+) 세포의 정량화. 모든 라이브 FSC-SSC 게이트 (도 21a) 및 림프구 게이트 (도 21b)하에서의 이중 양성 CD56+/CD3-의 백분율은, MeCp2WT WT 및 MeCp2KO 상태를 함유하는 iPSC 클론에 대해 측정하였다.
도 22: PSC-유도된 T 세포의 1형 사이토카인 생산 프로파일. TiPSC (1C)-유도된 CD34+ 세포로부터 2주의 T/NK 분화 배양에서 생산된 T 세포를 T 세포 확장 배양물 (고정화 항-CD3 mAb, IL2 및 IL7)로 옮겼다. LEGENDplex 유세포 계측법 복합 사이토카인 검정 (CD8/NK 패널, BioLegend)을 사용하여 배양 상청액에서 사이토카인을 측정하였다. 상대적인 사이토카인 수준은 각각의 점도표 상 묘사되어 있다.
도 23a~23b: HLA 초 공여체 PSC의 T/NK 분화 잠재력. 전이유전자 무함유 에피솜 방법에 의해 유도된 HLA 초 공여체 PSC 주 H, K, L 및 O의 T/NK 분화 잠재력을 평가하고, 레트로바이러스에 의해 재프로그래밍된 고도의 T/NK 생산성 1C TiPSC와 비교하였다. (도 23a) 점도표는 9일째에 수확한 PSC 분화 배양물에서 CD34+ HPC의 비율을 도시한 것이다. 막대 그래프는 CD34+ HPC의 각각의 정량적인 수율을 나타낸다. (도 23b) HLA 초 공여체 PSC 주로부터 유래된 CD34+ HPC의 T/NK 분화는, 모든 시험된 HPC에서 비교적 높은 (1개의 투입 CD34+ HPC 당 100~200개의 T/NK) T/NK 림프구 생산 잠재력을 입증하였다.
특정 실시형태에서, 본 개시 내용은 체세포 (예를 들어, 혈액 세포)의 초기 개체군으로부터 재프로그래밍된 유도 만능 줄기 세포로부터 면역 세포를 생산하기 위한 고효율적인 방법을 제공함한다. 기존 방법에 의해 생산된 면역 세포는 T 세포, NK 세포, T/NK 세포 및 수지상 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 체세포의 초기 개체군은 T 세포를 포함한다. T 세포는 혈액 샘플과 같은 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있다.
특정 실시형태에서, 혈액 세포의 출발 개체군은 HLA 동형 접합 세포 (즉, MHC 클래스 I 및 II 유전자)를 포함한다. 따라서, iPSC는 본 출원에서 HLA 초 공여체로서 지칭되는 HLA 동형 접합 대상체로부터 분리된 세포로부터 생산될 수 있다.
혈액 세포의 개체군은 바이러스 또는 에피솜 벡터와 같은 재프로그래밍 인자의 도입에 의해 iPSC로 재프로그래밍될 수 있다. 이어서, 이들 혈액 세포 유도된 iPSC (예를 들어, T 세포 유도된 iPSC (TiPSC))는 조혈 전구 세포로 분화된다. 하나의 방법에서, 분화 과정는 WNT 활성화, 조혈 유도성 사이토카인에 의한 배양 및 CD34+ 세포 단리를 포함한다. 마지막으로, HPC는 이어서 림프구 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포 및 T/NK 세포) 및 골수 세포 (예를 들어, 수지상 세포)와 같은 면역 세포로 분화된다.
림프구 세포로의 분화는 무피더 매트릭스로서 레트로넥틴 및 DLL-4를 사용하여 이루어질 수 있다. T 세포 분화는 아스코르브산을 사용하여 효율성 및 성숙을 증가시킴으로써 뿐만 아니라, 저산소 조건하에 배양함으로써 추가로 농축될 수 있다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 림프구 잠재력에 대해 HPC 분화 동안 (예를 들어, 7~11일째) 최적 기간을 결정하였다. 림프구 잠재력을 갖는 이들 HPC는 CD34 및 CD43의 발현으로 동정할 수 있다. 또한, 림프구 잠재력이 증진된 HPC는 CD144, CD34, CD45 및 CD7 마커들 중 2종 이상에서 양성인 세포 분획물을 분류함으로써 단리할 수 있다. 일부 양태에서, 수지상 세포 유도를 위한 선조는 HPC 분화 16일쯤에 출현하는 공통 골수 선조이다.
혈액 세포-유도된 PSC로부터 생산된 림프구 세포는, 예를 들어, 사람 T 세포 발달을 연구하기 위해 유전자 추적 마커로서 또는 재분화 실험에서 이용될 수 있는 특성인 특징적인 T 세포 수용체 (TCR) 유전자 재배열을 보유하는 T 세포, NK 세포 및 T/NK 세포를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 특별한 이점은 분화된 T 세포에서 보유될 수 있는 T 세포 수용체의 V, D, J 유전자 분절의 재배열 및 감소에 있다. 이것은 T 세포-유도된 iPS 세포의 다양한 클론 개체군의 특이적인 특징 또는 "바코드"의 역할을 하며, 또한 V(D)J 재조합을 거치지 않는 만능 줄기 세포로부터 이들 iPS 세포를 분화시키는데 도움을 준다.
따라서, 본 개시 내용의 방법들은 안정한 생체내 이식, 화합물의 시험관내 스크리닝, 및 혈액학적 질환 및 손상의 메커니즘의 규명과 같은 광범위한 적용을 위해 T 세포, NK 세포, T/NK 세포 및 수지상 세포와 같은 HLA 동형 접합 면역 세포를 무제한 수로 제공할 수 있다.
I. 정의
특정 성분과 관련하여, 본 출원에서 사용되는 "본질적으로 없는"은, 해당 특정 성분이 조성물로 의도적으로 제형화되지 않았고/않았거나 오염물로서만 또는 미량으로만 존재하는 것을 본 출원에서 의미하는데 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 초래된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 특정 성분의 양을 표준 분석 방법으로 전혀 검출할 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본 출원의 명세서에서 사용되는 "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 출원의 청구항에서 사용되는 "한" 또는 "하나"라는 단어는, "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용될 때, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본 출원에서 사용되는 "또 다른"은 적어도 둘 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, "약"이라는 용어는 어떠한 값이 해당 값을 결정하는데 사용되는 장치, 방법에 대한 오차의 내재적 편차, 또는 해당 연구 대상체들 중에 존재하는 편차를 포함하고 있다는 것을 나타내는데 사용된다.
세포 또는 유기체에서의 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때의 "외인성"이라는 용어는, 인위적인 수단 또는 자연적인 수단에 의해 당해 세포 또는 유기체에 도입된 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하거나, 세포와 관련하여 상기 용어는, 단리되어 후속적으로 인위적인 수단 또는 자연적인 수단에 의해 다른 세포에 또는 유기체에 도입된 세포를 지칭한다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포로부터 유래할 수 있거나, 당해 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가의 카피(copy)일 수 있다. 외인성 세포는 상이한 유기체로부터 유래할 수 있거나, 동일한 유기체로부터 유래할 수 있다. 비제한적인 예로서, 외인성 핵산은, 자연 세포 내에 존재할 수 있는 곳과 상이한 염색체 위치에 존재하거나, 그렇지 않으면 자연에서 발견되는 상이한 핵산 서열에 의해 플랭킹 (flanking)되어 있는 것이다.
"발현 작제물" 또는 "발현 카세트"는 전사를 지시할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현 작제물은 1종 이상의 목적하는 세포 유형, 조직 또는 장기에서 유전자 발현을 지시하는 최소한 1종 이상의 전사 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 이들의 기능적 등가 구조물)를 포함한다. 추가의 요소들, 예를 들어, 전사 종결 신호도 또한 포함될 수 있다.
"벡터" 또는 "작제물" (종종 유전자 전달 시스템 또는 유전자 전달 "비히클"로 지칭됨)은 시험관내에서 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대 분자 또는 분자들의 복합체를 지칭한다.
일반 유형의 벡터인 "플라스미드"는 염색체 DNA와는 독자적으로 복제할 수 있는 염색체 DNA와 별개인 염색체외 DNA 분자이다. 특정한 경우에서, 이것은 환형 또는 이중-가닥이다.
"복제의 원점" ("ori") 또는 "복제 원점"은, 예를 들어, 림프영양성 헤르페스 바이러스에서, 세포 내의 플라스미드에 존재할 때, 연결된 서열을 플라스미드 내에 유지할 수 있는 DNA 서열 및/또는 DNA 합성이 개시되는 부위 또는 그 부근이다. 한 예로서, EBV (엡스타인-바 바이러스)에 대한 ori는 FR 서열 (30 bp 반복의 20개의 불완전한 카피), 바람직하게는 DS 서열을 포함하지만, EBV의 다른 부위는 EBNA-1에 결합하며, 예를 들어, Rep* 서열은 복제의 원점으로서 DS를 대체할 수 있다 (문헌 [Kirshmaier and Sugden, 1998]). 따라서, EBV의 복제 원점은 FR, DS 또는 Rep* 서열 또는 이들로부터 유도된 핵산 변형 또는 합성 조합을 통한 임의의 기능적 등가 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 개시 내용은 또한 문헌 [Lindner et al., 2008]에 구체적으로 기재되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 개별 요소의 삽입 또는 돌연변이에 의해 EBV의 유전자 조작된 복제 원점을 사용할 수 있다.
특정 단백질을 "암호화하는" "유전자", "폴리뉴클레오타이드", "암호화 영역", "서열", "분절", "단편" 또는 "전이유전자"는, 적절한 조절 서열의 제어하에 둘 때 시험관내에서 또는 생체내에서 전사되고 또한 임의로 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩타이드로 번역되는 핵산 분자이다. 암호화 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA의 형태로 존재하는 경우, 핵산 분자는 단일 가닥 (즉, 센스 가닥) 또는 이중 가닥일 수 있다. 코드 영역의 경계는 5' (아미노) 말단의 시작 코돈과 3' (카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 유전자는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 mRNA로부터의 cDNA, 원핵 생물 또는 진핵 생물의 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 전사 종결 서열은 일반적으로 유전자 서열에 대하여 3'에 위치할 것이다.
"제어 요소"라는 용어는 총체적으로 프로모터 영역, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 업스트림 조절 도메인, 복제의 원점, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 인핸서 및 스플라이스 접합 (splice junction) 등을 지칭하며, 이것은 총체적으로 수용 세포에서 암호화 서열의 복제, 전사, 전사후 프로세싱 및 번역을 제공한다. 선택된 암호화 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한, 이들 제어 요소 모두가 존재할 필요가 있는 것은 아니다.
"프로모터"라는 용어는 본 출원에서 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 영역을 지칭하는 통상적인 의미로 사용되고, 여기서, 조절 서열은 RNA 폴리머라아제에 결합하여 다운스트림 (3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유도된다. 이것은, RNA 폴리머라아제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합하여 핵산 서열의 특이적인 전사를 개시할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. "작동적으로 위치된", "작동적으로 연결된", "제어하에" 그리고 "전사 제어하에"라는 어구는, 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재하여 당해 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하는 것을 의미한다.
"인핸서"는, 프로모터에 근접하게 위치할 때 인핸서 도메인의 부재하에 프로모터로부터 수득되는 전사 활성에 비해 증가된 전사 활성을 부여하는 핵산 서열을 의미한다.
핵산 분자에 관하여 "작동가능하게 연결된" 또는 "공동-발현된"은, 2종 이상의 핵산 분자 (예를 들어, 전사되는 핵산 분자, 프로모터 및 인핸서 요소)가 핵산 분자의 전사를 허용하도록 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드에 관하여 "작동가능하게 연결된" 또는 "공동-발현된"은, 2종 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 분자가 융합체의 각 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분의 적어도 하나의 특성을 갖는 단일 폴리펩타이드 쇄, 즉, 융합 폴리펩타이드를 수득하도록 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 융합 폴리펩타이드는 바람직하게는 키메라이며, 즉, 이종 분자들로 구성된다.
"상동성"은 2종의 폴리뉴클레오타이드들 또는 2종의 폴리펩타이드들 사이의 동일성의 백분율을 지칭한다. 하나의 서열과 다른 서열 사이의 상응 (correspondence)은 당해 분야에 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상동성은 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개의 폴리펩타이드 분자들 사이의 서열 정보의 직접적인 비교에 의해 결정될 수 있다. 대안으로, 상동성은 상동성 영역들 사이의 안정한 듀플렉스 (duplex)의 형성을 촉진시키는 조건하의 폴리뉴클레오타이드의 하이브리드화, 이어서 단일 가닥-특이적인 뉴클레아제(들)에 의한 분해 및 분해된 단편의 크기 측정에 의해 결정될 수 있다. 2종의 DNA 또는 2종의 폴리펩타이드 서열은, 상기 방법을 이용하여 측정할 때, 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 약 95%가 상기 분자의 소정의 길이에 각각 일치하는 경우에 서로 "실질적으로 상동성"이다.
"세포"라는 용어는 본 출원에서 당해 분야에서 이의 가장 광범위한 의미로 사용되며, 다세포 유기체의 조직의 구조 단위이고, 외부로부터 이를 단리시키고, 자기-복제 능력을 갖고, 유전 정보 및 이를 발현하기 위한 메커니즘을 갖는 막 구조에 의해 둘러싸인 생체 (living body)를 지칭한다. 본 출원에서 사용되는 세포는 자연 발생적인 세포 또는 인위적으로 조작된 세포 (예를 들어, 융합 세포, 유전자 조작된 세포 등)일 수 있다.
"줄기 세포"라는 용어는 본 출원에서 적절한 조건하에 다양한 범위의 특화된 세포 유형으로 분화할 수 있을 뿐만 아니라, 적절한 다른 조건하에 자기 재생 및 본질적으로 미분화된 만능 상태로 남아 있을 수 있는 세포를 지칭한다. "줄기 세포"라는 용어는 또한 만능 세포, 다능성 세포, 전구 세포 및 선조 세포를 포괄한다. 예시적인 사람 줄기 세포는 골수 조직으로부터 수득된 조혈 또는 중간엽 줄기 세포, 배아 조직으로부터 수득된 배아 줄기 세포, 또는 태아의 생식기 조직으로부터 수득된 배아 생식 세포로부터 수득될 수 있다. 예시적인 만능 줄기 세포는 또한 만능성 (pluripotency)과 관련된 특정 전사 인자의 발현에 의해 이들을 만능 상태로 재프로그래밍하여 체세포로부터 생산될 수 있으며, 이들 세포는 "유도 만능 줄기 세포" 또는 "iPSC"로 호칭된다.
"배아 줄기 (ES) 세포"는 초기 단계의 배아, 예를 들어, 배반포 단계에서의 내부 세포 덩어리로부터 수득되거나, 인위적인 수단 (예를 들어, 핵 치환)에 의해 생성되어 생식 세포 (예를 들어, 정자 및 난자)를 비롯한 배아 또는 성체에서 임의의 분화된 세포 유형을 생산할 수 있는 미분화된 만능 세포이다.
"유도 만능 줄기 세포 (iPSC)"는 인자들 (본 출원에서는 재프로그래밍 인자로서 지칭함)의 조합을 발현시키거나 이들의 발현을 유도하여 체세포를 재프로그래밍함으로써 생산된 세포이다. iPSC 세포는 태아, 출산후, 신생아, 청소년 또는 성인 체세포를 이용하여 생산될 수 있다. 특정 실시형태에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자들로는, 예를 들어, Oct4 (종종 Oct 3/4로서 언급), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog 및 Lin28이 포함된다. 일부 실시형태에서, 체세포는 적어도 2종의 재프로그래밍 인자들, 적어도 3종의 재프로그래밍 인자들, 적어도 4종의 재프로그래밍 인자들 또는 적어도 5종의 재프로그래밍 인자들을 발현시켜 재프로그래밍되어 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍한다.
"조혈 선조 세포" 또는 "조혈 전구 세포"는 조혈 계통에 전념하지만 추가 조혈 분화를 가능하게 하는 세포를 지칭하며, 조혈 줄기 세포, 다능성 조혈 줄기 세포, 공통 골수 선조, 거대핵세포 선조, 적혈구 선조 및 림프구 선조를 포함할 수 있다. 조혈 줄기 세포 (HSC)는 골수계 (단핵구 및 대식 세포, 과립구 (중성구, 호염구, 호산구 및 비만 세포), 적혈구, 거대핵세포/혈소판, 수지상 세포) 및 림프계 (T 세포, B-세포, NK-세포)를 비롯한 혈액 세포 유형 모두를 생산하는 다능성 줄기 세포이다 (예를 들어, 문헌 [Doulatov et al., 2012; Notta et al., 2015] 참조). "다기능 림프구 선조" (multilymphoid progenitor: MLP)는 모든 림프계 (B 세포, T 세포 및 NK 세포)를 생산하지만 다른 (골수) 잠재성을 갖거나 가질 수 없는 임의의 선조를 기술하는 것으로 정의되며 (문헌 [Doulatov et al., 2010]), CD45RA+/CD10+/CD7-이다. 임의의 B, T 및 NK 선조는 MLP로서 지칭될 수 있다. "공통 골수 선조" (CMP)는 과립구, 단핵구, 거대핵세포 및 적혈구를 생산할 수 있는 CD45+/CD31+/CD43+/CD34- 세포의 발현에 의해 정의된 공통 골수 선조를 지칭한다. 조혈 선조 세포는 CD34를 발현할 수 있다. 조혈 선조 세포는 CD133을 공동-발현하며, CD38 발현에 대해 음성일 수 있다. 조혈 전구 세포는 CD34+ / CD45+ 조혈 전구 세포 및 CD34+ / CD45+ / CD43+ 조혈 전구 세포를 포함한다. CD34+ / CD43+ / CD45+ 조혈 전구 세포는 골수 선조에 매우 풍부할 수 있다. 조혈 세포로는 또한 다음을 비롯한 다양한 서브세트의 원시 조혈 세포가 포함된다: CD34-/CD133+/CD38- (원시 조혈 전구 세포), CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/-) (적혈구-거대핵세포 (erythro-megakaryopoietic)), lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(-) (다능성) 및 lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+) (골수-편중) 세포, CD133+/ALDH+ (알데하이드헤하이드로게아나제) (예를 들어, 문헌 [Hess et al. 2004; Christ et al., 2007]). 이들 원시 조혈 세포 유형 또는 조혈 전구 세포 중 어느 것이 본 출원에 기재된 iPS 세포로 전환될 수 있는 것으로 예상된다. 일부 양태에서, 세포는 비만 세포, 랑게르한스 세포, 파골세포, NK 세포, T 세포, CIK T 세포, 또는 T 세포, NK 세포, 및 B 세포의 다른 서브타입을 포함할 수 있다.
본 출원에 사용되는 "면역 세포(들)"라는 용어는, 면역계의 세포를 지칭하며, T 세포, NK 세포, T/NK 세포, 수지상 세포, 대식 세포, B 세포, 호중구, 적혈구, 단핵구, 호염구, 중성구, 비만 세포, 호산구 및 이들의 임의의 조합을 포함지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
T 세포의 "활성화제" 또는 T 세포를 활성화시킬 조건은, T 세포를 활성화시키는 자극제를 지칭하며, 항원 제시 세포 또는 다른 표면 상에 존재할 수 있는 항원; 특이성과 무관하게 다수의 T 세포 수용체 (TCR) 복합체에 결합하는 다클론 활성화제, 예를 들어, 렉틴, 예를 들어, 콘카나발린-A (Con-A) 및 피토헤마글루티닌 (PHA), 및 TCR 또는 CD3 단백질 상의 불변 프레임워크 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 제제; 및 상당한 수의 T 세포를 자극하는 초항원, 예를 들어, 장독소, 예를 들어, 포도상구균 장독소 (Staphyloccal enterotoxins)를 포함한다.
"T 림프구" 및 "T 세포"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 1종 이상의 MHC 분자 또는 1종 이상의 비-고전적 MHC 분자와 함께 항원 제시 세포 또는 매트릭스의 표면 상에 표시될 때, 항원을 인식할 수 있는 T 세포 항원 수용체 (TCR)를 발현하는 세포를 지칭한다.
"T 세포"라는 용어는 당해 분야에서 정의된 T 림프구를 지칭하며, 흉선세포, 미성숙 T 림프구, 성숙 T 림프구, 휴지기 T 림프구 또는 활성화된 T 림프구를 포함하는 것으로 의도된다. T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+CD8+ T 세포 또는 CD4-CD8- 세포일 수 있다. T 세포는 또한 T 헬퍼 세포, 예를 들어, T 헬퍼 1 (TH1) 또는 T 헬퍼 2 (TH2) 세포 또는 TH17 세포 뿐만 아니라, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 미경험 T 세포, 기억 T 세포 또는 감마 델타 T 세포일 수 있다 (문헌 [Wilson et al., 2009; Wynn, 2005; Ladi et al., 2006]). CD4와 같은 적어도 1종의 마커에 의해 서로 다른 T 세포는 본 출원에서 T 세포의 "서브세트"로서 지칭된다.
"CD4+ T 세포"는 이의 표면 상에 CD4를 발현하고 세포-매개된 면역 반응과 관련된 T 세포의 서브세트를 지칭한다. 이들은 IFN-감마, TNF-알파, IL-2, IL-4 및 IL-10과 같은 사이토카인의 분비를 포함할 수 있는 자극에 따른 분비 프로파일을 특징으로 한다. "CD4"는, 원래 T-림프구 상의 분화 항원으로서 정의될 뿐만 아니라 단핵구/대식 세포를 비롯한 다른 세포 상에서 발견되는 55-kD 당단백질이다. CD4 항원은 면역글로불린 초유전자 계열의 구성원이며, MHC (주요 조직적합성 복합체) 클래스 II-제한된 면역 반응에서 결합 인식 요소로서 관련되어 있다. T-림프구 상에서, 이들은 헬퍼/유도제 서브세트를 정의한다.
"CD8+ T 세포"는 이들 표면 상에 CD8을 발현하는 T 세포의 서브세트를 지칭하며, MHC 클래스 I-제한되고, 세포독성 T 세포로서 기능한다. "CD8" 분자는 흉선세포 상 및 세포독성 및 억제제 T-림프구 상에서 발견되는 분화 항원이다. CD8 항원은 면역글로불린 초유전자 계열의 구성원이며, 주요 조직적합성 복합체 클래스 I-제한된 상호작용에서 결합 인식 성분이다.
"만능 줄기 세포"는 1종 이상의 조직 또는 장기를 구성하는 모든 세포, 또는 바람직하게는 3개의 배엽층: 내배엽 (내부 위 내막, 위장관, 폐), 중배엽 (근육, 골, 혈액, 비뇨생식기) 또는 외배엽 (표피 조직 및 신경계) 중 어느 하나로 분화시키는 잠재력을 갖는 줄기 세포를 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "체세포"라는 용어는 난자, 정자 등과 같은 생식 세포 이외의 임의의 세포를 지칭하며, 이의 DNA를 다음 세대로 직접 전달하지 않는다. 전형적으로, 체세포는 제한된 만능성을 갖거나 만능성을 갖지 않는다. 본 출원에서 사용되는 체세포는 자연-발생적이거나 유전적으로 변형될 수 있다.
"프로그래밍"은, 세포가 생산할 수 있는 자손의 유형을 변경시키는 과정이다. 예를 들어, 세포는, 프로그래밍 없이 동일한 조건하에 형성될 수 있었던 것과 비교하여, 배양물에서 또는 생체내에서 적어도 하나의 새로운 세포 유형의 자손을 형성할 수 있도록 변경되었을 때 프로그래밍되었다. 이것은, 충분한 증식 후, 이러한 자손이 본질적으로 프로그래밍 전에 형성될 수 없으면, 새로운 세포 유형의 표현형 특징을 갖는 측정가능한 비율의 자손이 관찰되고; 그렇지 않으면 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 비율이 프로그래밍 전보다 더 측정가능하게 높다는 것을 의미한다. 이러한 과정은 분화, 탈분화 (dedifferentiation) 및 전환분화 (transdifferentiation)를 포함한다.
"분화"는, 덜 특화된 세포가 더 특화된 세포 유형으로 되는 과정이다. "탈분화"는, 부분 분화된 세포 또는 말기 분화된 세포가 만능성 또는 다능성과 같은 초기 발달 단계로 복귀하는 세포 과정이다. "전환분화"는 하나의 분화된 세포 유형을 또 다른 분화된 세포 유형으로 형질전환시키는 과정이다. 전형적으로, 프로그래밍에 의한 전환분화는 중간의 만능성 단계를 통과하는 세포의 부재시에 발생한다 - 즉, 상기 세포는 하나의 분화된 세포 유형으로부터 또 다른 분화된 세포 유형으로 직접 프로그래밍된다. 특정 조건하에, 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 자손의 비율은 증가하는 선호도 순으로 적어도 약 1%, 5%, 25% 또는 그 이상일 수 있다.
"재프로그래밍"은 재프로그래밍 없이 동일한 조건하에 갖는 것보다 적어도 하나의 신규한 세포 유형의 자손을 배양에서 또는 생체내에서 형성할 수 있는 측정가능하게 증가된 능력을 세포에게 부여하는 과정이다. 보다 특히, 재프로그래밍은 체세포에게 다능성 잠재력을 부여하는 과정이다. 이것은, 충분한 증식 후, 이러한 자손이 본질적으로 재프로그래밍 전에 형성될 수 없다면, 새로운 세포 유형의 표현형 특징을 갖는 측정가능한 비율의 자손이 관찰되고; 그렇지 않으면 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 비율이 재프로그래밍 전보다 더 측정가능하게 높다는 것을 의미한다. 특정 조건하에, 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 자손의 비율은 증가하는 선호도 순으로 적어도 약 1%, 5%, 25% 또는 그 이상일 수 있다.
"순방향 프로그래밍"이란 용어는, 만능성을 갖지 않는 분화된 체세포와는 대조적으로, 다능 또는 만능 세포에 대한 1종 이상의 특정 계통-결정 유전자 또는 유전자 산물의 공급에 의한 다능 또는 만능 세포의 프로그래밍을 지칭한다. 예를 들어, 순방향 프로그래밍은 ESC 또는 iPSC를 조혈 전구 세포 또는 다른 전구 세포로, 또는 조혈 세포 또는 다른 분화된 체세포로 프로그래밍하는 과정를 기술할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "대상체" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"라는 용어는, 포유 동물, 바람직하게는 세포 또는 조직 이식을 필요로 하는 임의의 연령의 사람, 즉, 남성 또는 여성을 지칭한다. 전형적으로, 대상체 (본 출원에서 수용자로서도 또한 지칭됨)는 장애, 또는 병리학적 또는 바람직하지 않은 병태, 상태 또는 증후군, 또는 세포 또는 조직 이식을 통한 치료를 잘 받아 들이는 육체적, 형태학적 또는 생리학적 이상으로 인해 세포 또는 조직 이식을 필요로 한다.
본 출원에 사용되는 유전자의 "파괴"는, 파괴의 부재하의 유전자 산물의 발현 수준과 비교하여, 세포에서 대상 유전자에 의해 암호화되는 1종 이상의 유전자 산물의 발현의 제거 또는 감소를 지칭한다. 예시적인 유전자 산물은 mRNA 및 유전자에 의해 암호화되는 단백질 산물을 포함한다. 일부 경우에서의 파괴는 일시적 또는 가역적이고, 다른 경우에서는 영구적이다. 일부 경우에서의 파괴는, 절단된 또는 비-기능적 산물이 생산될 수 있다는 사실에도 불구하고, 기능적 또는 전장 단백질 또는 mRNA를 생산한다. 본 출원의 일부 실시형태에서, 유전자 활성 또는 기능은, 발현과 대조적으로, 파괴된다. 유전자 파괴는 일반적으로 인위적인 방법에 의해, 즉, 화합물, 분자, 복합물 또는 조성물의 첨가 또는 도입에 의해, 및/또는 DNA 수준에서와 같은 유전자의 핵산 또는 유전자와 관련된 핵산의 파괴에 의해 유도된다. 유전자 과괴를 위한 예시적인 방법으로는 유전자 사일런싱, 녹다운, 녹아웃, 및/또는 유전자 파괴 기술, 예를 들어, 유전자 편집이 포함된다. 이의 예로는 일반적으로 발현의 일시적 감소를 초래하는 RNAi, siRNA, shRNA 및/또는 리보자임과 같은 안티센스 기술 뿐만 아니라, 예를 들어, 파쇄의 유도 및/또는 상동 재조합에 의해 표적화된 유전자 불활성화 또는 파괴를 초래하는 유전자 편집 기술이 포함된다. 이의 예로는 삽입, 돌연변이 및 결실이 포함된다. 파괴는 전형적으로 유전자에 의해 암호화되는 정상 또는 "야생형" 산물의 발현의 억제 및/또는 완전 부재를 초래한다. 예시적인 이러한 유전자 파괴는 전체 유전자의 결실을 비롯하여 유전자 또는 유전자 일부의 삽입, 프레임시프트 및 미스센스 돌연변이, 결실, 녹인, 녹아웃이다. 이러한 파괴는 암호화 영역에서, 예를 들어, 1종 이상의 엑손에서 일어날 수 있으며, 예를 들어, 정지 코돈의 삽입에 의해 전장 산물, 기능성 산물, 또는 임의의 산물의 생성 불능을 초래한다. 이러한 파괴는 또한 유전자의 전사를 방지하기 위해서 프로모터 또는 인핸서 또는 전사 활성화에 영향을 주는 다른 영역에서의 파괴에 의해 일어날 수 있다. 유전자 파괴에는 상동 재조합에 의한 표적화된 유전자 불활성화를 비롯하여 유전자 표적화가 포함된다.
"노치 리간드"는 조혈 줄기 세포와 같은 다수의 상이한 포유 동물 세포의 막에 존재하는 노치 수용체 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 단백질이다. 사람 세포에서 동정된 노치 수용체로는 노치-1, 노치-2, 노치-3 및 노치-4가 포함된다. 노치 리간드는 전형적으로 아미노 말단에서 세포외 표면 상의 3 내지 8개의 EGF-유사 반복 사이에 20 내지 22개의 아미노산을 포함하는 DSL 도메인 (D-델타, S-Serrate, 및 L-Lag2)을 갖는다 (문헌 [Furie and Furie, 1988], [Knust et al., 1987] 및 [Suzuki et al., 1987]).
"초 공여체"는 본 출원에서 특정 MHC 클래스 I 및 II 유전자에 대해 동형 접합성인 개체를 지칭한다. 이러한 동형 접합성 개체들은 초 공여체로서 기능할 수 있으며, 조직을 비롯한 이들의 세포 및 이들의 세포를포함하는 기타 물질들은 해당 1배체형에 대해 동형 접합성 또는 이형 접합성인 개체에 이식될 수 있다. 상기 초 공여체는 각각 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 좌위/유전자 좌위 대립 유전자에 대해 동형 접합성일 수 있다.
II. 체세포-유도된 iPSC
A. 체세포의 출발 개체군
본 발명의 실시형태는 iPSCs로 재프로그래밍된 체세포의 출발 개체군 (예를 들어, 혈액 세포 또는 피부 세포)에 관한 것이다. 혈액 세포의 개체군은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 혼합 개체군을 함유하는 전혈 또는 이의 부분, 비장 세포, 골수 세포, 종양 침윤 림프구, 백혈구성분채집술에 의해 수득된 세포, 생검 조직 및 림프절, 예를 들어, 종양으로부터 배농된 림프절을 포함할 수 있다. 적합한 공여체는 면역화된 공여체, 비-면역화된 (미경험) 공여체, 처리되거나 미처리된 공여체를 포함한다. "처리된" 공여체는 1종 이상의 생물학적 조절제에 노출된 것이다. "미처리된" 공여체는 1종 이상의 생물학적 조절제에 노출되어 않았다.
일부 양태에서, 혈액 세포의 개체군은 T 세포를 포함한다. T 세포는 T 세포의 정제된 개체군일 수 있거나, 그렇지 않으면 T 세포는 B 세포 및/또는 다른 말초 혈액 세포와 같은 상이한 유형의 세포를 갖는 개체군일 수 있다. T 세포는 CD4+ T 세포와 같은 T 세포의 서브세트의 정제된 개체군일 수 있거나, 이들은 T 세포의 상이한 서브세트를 포함하는 T 세포의 개체군일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, T 세포는 연장된 기간 동안 배양으로 유지된 T 세포 클론이다. T 세포 클론은 상이한 정도로 형질전환될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 배양으로 무기한 증식하는 T 세포 클론이다.
일부 양태에서, T 세포는 원발성 T 세포이다. "원발성 T 세포"라는 용어는, 연장된 시간 동안 배양으로 유지된 T 세포와는 대조적으로, 개체로부터 수득되는 T 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 원발성 T 세포는 특히 대상체로부터 수득된 말초 혈액 T 세포이다. 원발성 T 세포의 개체군은 T 세포의 대부분 하나의 서브세트로 구성될 수 있다. 대안으로, 원발성 T 세포의 개체군은 T 세포의 상이한 서브세트로 구성될 수 있다.
T 세포는 건강한 개체로부터, 또는 그렇지 않으면 병태를 갖는 감염된 개체로부터 사전 저장된 혈액 샘플로부터 유래할 수 있다. 병태는 감염성 질환, 예를 들어, 바이러스 감염, 세균 감염 또는 임의의 다른 미생물에 의한 감염으로부터 초래된 병태, 또는 과다증식성 질환, 예를 들어, 흑색종과 같은 암일 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 사람 면역결핍 바이러스 (HIV)로 감염된 개체로부터 유래한다. 또 다른 실시형태에서, T 세포는 자가면역 질환 또는 T 세포 병리가 있거나 이에 걸리기 쉬운 개체로부터 유래한다. T 세포는 사람 기원, 쥐과동물 기원 또는 임의의 다른 포유 동물 종의 것일 수 있다.
T 세포를 포함하는 세포 개체군의 수득 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 이러한 방법의 예는 실시예에 제시되어 있으며, 문헌 [Kim et al. (1992); Biswas et al. (1990); Biswas et al. (1991)]에 논의되어 있다.
일부 양태에서, 혈액 세포의 출발 개체군은 조혈 줄기 세포 (HSC)를 포함한다. HSC는 통상적으로 골수에 존재하지만, 혈액 내로 강제 유입될 수 있으며, 이동이라고 하는 과정은 말초 혈액에서 다수의 HSC를 수확하기 위해 임상적으로 사용된다. 선택된 1종의 이동제는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF)이다. 말초 혈액에서 순환하는 CD34+ 조혈 줄기 세포 또는 선조는, 비섭동 상태에서, 또는 G-CSF와 같은 조혈 성장 인자의 외부 투여에 따른 이동 후에 성분채집술 기술로 수집될 수 있다. 이동 후 수집된 줄기 또는 선조 세포의 수는 비섭동 상태에서 성분채집술 후에 수득된 것보다 더 많다. 일부 양태에서, 세포 개체군의 공급원은, 조혈 줄기 세포 또는 선조 세포가 풍부할 필요가 없기 때문에, 세포가 외인성으로 적용된 인자에 의해 이동되지 않은 대상체이다.
세포의 개체군으로부터 조혈 전구 세포의 수득 방법은 또한 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 조혈 전구 세포는 hSCF, hFLT3 및/또는 IL-3와 같은 다양한 사이토카인을 사용하여 확장될 수 있거나 (문헌 [Akkina et al., 1996]), CD34+ 세포는 MACS 또는 FACS를 사용하여 농축될 수 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, 음성 선택 기술은 또한 CD34+ 세포를 농축시키기 위해 사용될 수 있다.
본 출원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 세포의 개체군은, 사람 세포, 비-사람 영장류 세포, 설치류 세포 (예를 들어, 마우스 또는 래트), 소 세포, 양 세포, 돼지 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포 및 고양이 세포 또는 이들의 혼합물와 같은 포유 동물 세포일 수 있다. 비-사람 영장류 세포에는 히말라야 원숭이 (rhesus macaque) 세포가 포함된다. 세포는 동물, 예를 들어, 사람 환자로부터 수득될 수 있거나, 세포는 세포주로부터 수득될 수 있다. 세포가 동물로부터 수득되는 경우, 세포는, 예를 들어, 비분리된 세포 (즉, 혼합된 개체군)로서 사용될 수 있거나, 세포는, 예를 들어, 형질전환에 의해 배양에서 먼저 확립될 수 있거나, 세포는 예비 정제 방법을 거칠 수 있다. 예를 들어, 세포 개체군은 세포 표면 마커의 발현에 기초하여 양성 또는 음성 선택에 의해 조작되거나; 시험관내 또는 생체내에서 1종 이상의 항원으로 자극되거나; 시험관내 또는 생체내에서 1종 이상의 생물학적 조절제로 처리될 수 있거나; 이들 중 임의의 어느 것 또는 모두의 조합일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 세포 개체군은 비-T 세포 및/또는 특정 T 세포 서브세트의 고갈을 위한 음성 선택을 거친다. 음성 선택은 CD19 및 CD20과 같은 B 세포 마커, 단핵구 마커 CD14, NK 세포 마커 CD56을 비롯하여 다양한 분자의 세포 표면 발현에 기초하여 수행될 수 있다. 대안으로, 세포 개체군은 비-CD34+ 조혈 세포 및/또는 특정 조혈 세포 서브세트의 고갈을 위해 음성 선택을 거칠 수 있다. 음성 선택은, 예를 들어, MACS 또는 컬럼 분리를 통해 다른 세포 유형의 분리를 위해 사용될 수 있는 항체의 칵테일 (예를 들어, CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123, CD235a 및 CD41 (예를 들어, 거대핵세포 계통의 세포의 경우))과 같은 다양한 분자의 세포 표면 발현에 기초하여 수행될 수 있다.
대상체로부터 세포 샘플을 수득한 후 목적하는 세포 유형을 위해 이를 농축하는 것도 또한 가능하다. 예를 들어, PBMC 및/또는 CD34+ 조혈 세포는 본 출원에 기재된 혈액으로부터 단리될 수 있다. 향류 원심분리 (용출)를 사용하여 PBMC로부터 T 세포를 농축시킬 수 있다. 세포는 또한 목적하는 세포 유형의 세포 표면 상의 에피토프에 대한 항체 결합에 의한 단리 및/또는 활성화와 같은 다양한 기술을 사용하여 다른 세포로부터 단리될 수 있으며, 예를 들어, 일부 T 세포 단리 키트는 항체 컨쥬게이트된 비드를 사용하여 세포를 활성화시키고 이어서 동일 비드에 의한 컬럼 분리를 가능하도록 한다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 세포 표면 마커에 항체를 사용하여 수용체 체결에 의해 세포를 활성화하지 않고 특정 세포 유형에 대해 선택적으로 농축시키는 음성 선택을 포함한다.
골수 세포는 장골능선, 대퇴골, 경골, 척추, 늑골 또는 다른 골수강으로부터 수득될 수 있다. 골수는 환자로부터 채취되어 다양한 분리 및 세척 절차를 통해 단리될 수 있다. 골수 세포의 단리에 대한 공지된 절차는 다음 단계를 포함한다: a) 골수 현탁액을 3개의 분획으로 원심 분리하고 중간체 분획 또는 백혈구연층을 수집하는 단계; b) (a) 단계로부터 수득된 백혈구연층 분획을 분리 유체, 통상적으로 Ficoll (Pharmacia Fine Chemicals AB의 상표명) 중에서 1회 이상 원심분리하고, 골수 세포를 함유하는 중간체 분획을 수집하는 단계; 및 c) 재수혈가능한 골수 세포의 회수를 위해 (b) 단계로부터 수집된 분획을 세척하는 단계.
T 세포 농축된 세포의 개체군을 사용하는 것이 바람직한 경우, 이러한 세포의 개체군은 연속 유세포 분리기를 사용하여 백혈구성분채집술 및 기계적 성분채집술에 의해 혼합된 세포의 개체군으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 Ficoll-Hypaque™ 구배 분리, Percoll 구배 분리 또는 용출을 비롯한 임의의 공지된 방법에 의해 백혈구연층으로부터 단리될 수 있다.
특정 양태에서, T 세포는 T 세포 수용체에 결합하는 제제에 의해 활성화되어 T 세포 활성화를 위한 신호전달 캐스케이드를 촉발시킨다. 예를 들어, CD3 항체가 사용될 수 있다. 재프로그래밍을 위한 유효 수로의 T 세포 확장 및 증식 상태를 위해, IL-2와 같은 사이토카인도 또한 사용될 수 있다. 특정한 양태에서, 항-CD3과 항-CD28 둘 다는 T 세포 활성화를 위해 사용될 수 있으며, 여기서, 공동자극이 관련된다. 대체 양태에서, 항-CD3의 가교-결합이, 예를 들어, 플레이트 결합된 항-CD3에 적용될 수 있다. 가용성 항-CD3을 사용하여 PBMC 중의 T 세포를 활성화시키면, 가용성 항-CD3 항체는 PBMC 중의 APC에 결합하고, 이어서, APC는 T 세포에 대해 항체를 제시한다. 가용성 항-CD3 항체 단독을 정제된 T 세포의 개체군에서 사용하는 경우, 아네르기가 상기에서 언급된 이유로 인해 초래될 수 있다. 특정 실시형태는 항-CD3 (OKT3) 및 IL2의 존재하에 T 세포를 배양하는 것을 포함하는데, 이것은 고가의 다루기 힘든 비드 또는 플레이트-결합된 항체를 사용할 필요가 없기 때문에 유리하고 편리하며; OKT3 및 IL2를 첨가한 후, PBMC의 세포 환경은 T 세포 활성화시키는데 도움이 될 것이다. 이어서, T 세포는 우선 확장으로 인해 PBMC 배양에서 다른 세포 유형을 과밀화시킨다.
특정 양태에서, 혈액 세포의 출발 개체군은, 예를 들어, 림프아구성 세포주 (LCL)로부터 유래된 림프아구성 세포를 포함한다. LCL은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 엡스타인-바 바이러스 (EBV)에 의한 B 세포의 감염으로 생산된다 (문헌 [Frisan et al., Epstein-Barr Virus Protocols, Part III, 125-127, 2001]).
B. MHC 1배체형 일치
주요 조직적합성 복합체는 동종이계 장기 이식의 면역 거부의 주요 원인이다. 3개의 주요 클래스 I MHC 1배체형 (A, B 및 C)과 3개의 주요 MHC 클래스 II 1배체형 (DR, DP 및 Dq)이 존재한다. HLA 좌위는 매우 다형성이며, 6번 염색체 상에서 4 Mb에 걸쳐 분포되어 있다. 상기 영역 내 HLA 유전자의 1배체화 능력은 임상적으로 중요한데, 이는 이러한 영역이 자가면역 및 감염성 질환과 관련되어 있고 공여체와 수용자 간의 HLA 1배체형의 적합성은 이식의 임상적 결과에 영향을 미칠 수 있다. MHC 클래스 I에 해당하는 HLA는 세포 내부로부터 T-림프구에 펩타이드를 제시하고, MHC 클래스 II에 해당하는 HLA는 세포 외부로부터 T-림프구에 항원을 제시한다. 이식편과 숙주 간의 MHC 1배체형의 부적합성은 이식편에 대한 면역 반응을 촉발시켜 이의 거부를 초래한다. 따라서, 환자는 거부를 방지하기 위해 면역억제제로 처리될 수 있다. HLA-일치된 줄기 세포주는 면역 거부의 위험을 극복할 수 있다.
이식에서 HLA의 중요성 때문에, HLA 좌위는 일반적으로 유리한 공여체-수용자 쌍을 동정하기 위한 혈청학 및 PCR에 의해 분류된다. HLA 클래스 I 및 II 항원의 혈청학적 검출은 정제된 T 또는 B 림프구를 이용하는 보체 매개성 림프구독성 시험을 사용하여 달성될 수 있다. 이 절차는 HLA-A 및 -B 좌위를 일치하는데 주로 사용된다. 분자 기반의 조직 적합성 검사는 혈청학적 검사에 비해 더 정확한 경우가 많을 수 있다. PCR 생성물을 일련의 올리고뉴클레오타이드 프로브에 대해 시험하는 SSOP (서열 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브) 방법과 같은 저해상도 분자적 방법은, HLA 항원을 동정하는데 사용될 수 있으며, 현재 이러한 방법들은 클래스 II-HLA 분류에 사용되는 가장 흔한 방법이다. PCR 증폭을 위한 대립유전자 특이적인 프라이머를 이용하는 SSP (서열 특이적 프라이머) 방법과 같은 고해상도 기술은 특이적인 MHC 대립 유전자를 동정할 수 있다.
공여체와 수용자 간의 MHC 조직적합성은, 공여체 세포가 HLA 동형 접합성, 즉, 각 항원 제시 단백질에 대해 동일한 대립유전자를 함유하는 경우에 크게 증가한다. 대부분의 개체들은 MHC 클래스 I 및 II 유전자에 대해 이형 접합성이지만, 특정 개체들은 이러한 유전자들에 대해 동형 접합성이다. 이러한 동형 접합성 개체들은 초 공여체의 역할을 할 수 있으며, 이들의 세포로부터 생산된 이식편은 당해 1배체형에 대해 동형 접합성 또는 이형 접합성인 모든 개체에 이식될 수 있다. 더욱이, 동형 접합성 공여체 세포가 한 개체군에서 높은 빈도수로 발견되는 1배체형을 보유하는 경우, 이러한 세포들은 다수의 개체들을 위한 이식 요법에 적용할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서는 PSC가 치료하고자 하는 대상체, 또는 당해 환자와 동일하거나 실질적으로 동일한 HLA 유형을 갖는 또 다른 대상체로부터 생산될 수 있다. 하나의 경우에서, 공여체의 주요 HLA (예를 들어, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3개의 주요 좌위)는 수용자의 주요 HLA와 동일하다. 일부 경우에서, 체세포 공여체는 초 공여체일 수 있고, 이로 인해 MHC 동형 접합성 초 공여체로부터 유도된 iPSC는 HPC 및 이어서 T 세포와 같은 면역 세포를 생산하는데 사용될 수 있다. 따라서, 초 공여체로부터 유도된 면역 세포는 해당 1배체형에 대해 동형 접합성 또는 이형 접합성인 대상체에 이식될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 HLA-A 및 HLA-B와 같은 2개의 HLA 대립유전자에서 동형 접합성일 수 있다. 이와 같이, 초 공여체로부터 생산된 면역 세포는 다수의 잠재적인 수용자들과 잠재적으로 "일치"할 수 있는 면역 세포들을 생산하기 위해 본 출원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시 내용의 특정 실시형태는 HLA 동형 접합 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포 및 수지상 세포)의 저장소 (예를 들어, 라이브러리)를 제공한다. 대상체 라이브러리에서 제시되는 HLA 1배체형은 사람 개체군에서 발견되는 가장 흔한 HLA 1배체형, 예를 들어, 흔한 백인 HLA 1배체형, 아프리카계 조상의 개체에서 발견되는 흔한 HLA 1배체형, 흔한 아시아계 HLA 1배체형, 흔한 히스패닉계 HLA 1배체형, 흔한 북미 원주민 HLA 1배체형 등을 반영할 수 있다. 예를 들어, 단일의 풍부한 1배체형이 상당한 비율의 개체군에 존재할 수 있으므로, 단일HLA 동형 접합 세포주가 상당 비율의 환자에 대해 조직적합성 공여체의 역할을 할 수 있도록 한다. 라이브러리에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10~15, 15~20, 20~25, 25~30 또는 30종 초과의 HLA 동형 접합 세포가 포함된다. 대상체 라이브러리는 제1 HLA 1배체형에 대해 동형 접합인 제1 HLA 동형 접합 세포; 및 제2 HLA 1배체형에 대해 동형 접합인 적어도 제2 HLA 동형 접합 세포를 포함한다. 대상체 라이브러리는 단일 세포 유형을 포함할 수 있거나 2종 이상의 상이한 세포 유형을 포함할 수 있다. 대상체 라이브러리는, 예를 들어, HLA 1배체형에 관한 정보, 및 임의로 세포 표면 마커, 핵형 정보 등과 같은 추가 정보가 저장되어 검색될 수 있는 검색가능한 컴퓨터 데이터베이스에 의해 목록화될 수 있다.
본 출원에서 기재된 HLA 동형 접합 면역 세포는 세포 및/또는 조직의 이식을 포함하는 광범위한 임상 분야에 사용될 수 있다. HLA 동형 접합 면역 세포는 수용자와 HLA 적합성이므로, 면역억제 요법에 대한 필요성 없이 또는 적어도 면역억제 요법에 대한 필요성의 감소로 수용자 내로 도입될 수 있다. 표준 면역억제 약물 요법은 매월 수천 달러의 비용이 들며, 종종 생명을 위협하고 치료 비용이 많이 드는 감염 및 암을 비롯하여 바람직하지 못한 부작용을 초래할 수 있다. 따라서, 본 HLA 동형 접합 면역 세포는 현재 임상 적용을 위한 사람 세포의 사용을 제한하는 장애물 중 일부를 극복한다.
C. 재프로그래밍 인자
특정 실시형태에서, 체세포의 출발 개체군은 재프로그래밍 인자의 도입에 의해 iPS 세포로 재프로그래밍된다. iPS 세포의 생산은 유도를 위해 사용된 재프로그래밍 인자에 중요하다. 하기 인자 또는 이의 조합은 본 개시 내용에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 특정 양태에서, Sox 및 Oct (특히 Oct3/4)를 암호화하는 핵산은 재프로그래밍 벡터 내에 포함될 것이다. 예를 들어, 1종 이상의 재프로그래밍 벡터는 Sox2, Oct4, Nanog 및 임의로 Lin28을 암호화하는 발현 카세트, 또는 Sox2, Oct4, Klf4 및 임의로 c-Myc를 암호화하는 발현 카세트, 또는 Sox2, Oct4, 및 임의로 Esrrb를 암호화하는 발현 카세트, 또는 Sox2, Oct4, Nanog, Lin28, Klf4, c-Myc 및 임의로 SV40 거대 T 항원을 암호화하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 이들 재프로그래밍 인자를 암호화하는 핵산은 동일한 발현 카세트, 상이한 발현 카세트, 동일한 재프로그래밍 벡터 또는 상이한 재프로그래밍 벡터에 포함될 수 있다.
Oct4 및 Sox 유전자 계열의 특정 구성원 (Sox1, Sox2, Sox3 및 Sox15)은, 부재시에 유도를 불가능하게 하는 유도 과정에 관련된 중요한 전사 조절인자로서 동정되었다. 그러나, Klf 계열의 특정 구성원 (Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5), Myc 계열 (c-Myc, L-Myc 및 N-Myc), Nanog 및 Lin28을 포함하는 추가 유전자는, 유도 효율성을 증가시키기는 것으로 동정되었다.
Oct4 (Pou5f1)는 옥타머 계열("Oct") 전사 인자 중 하나이며, 만능성의 유지에 중요한 역할을 한다. 난할구 및 배아 줄기 세포와 같은 Oct4+ 세포에서 Oct4의 부재는, 자발적 영양막 분화를 유발하고, 이로 인해 Oct4의 존재는 배아 줄기 세포의 만능성 및 분화 잠재성을 초래한다. Oct4의 가까운 동족, 즉, Oct1 및 Oct6을 비롯한 "Oct" 계열에서 다양한 다른 유전자는, 유도를 도출하는데 실패하고, 이로 인해 유도 과정에 대한 Oct4의 배타성을 입증한다.
유전자의 Sox 계열은, 만능 줄기 세포에서 배타적으로 발현되는 Oct4와 대조적으로, 다능성 및 단능성 줄기 세포와 관련되지만, Oct4와 유사한 만능성 유지와 관련되어 있다. Sox2는 재프로그래밍 유도에 사용되는 초기 유전자인 반면, Sox 계열의 다른 유전자는 유도 과정에서도 기능하는 것으로 밝혀졌다. Sox1은 Sox2와 유사한 효율로 iPS 세포를 생산하며, 유전자 Sox3, Sox15 및 Sox18은 또한 감소된 효율이지만 iPS 세포를 생산한다.
배아 줄기 세포에서, Nanog는, Oct4 및 Sox2와 함께, 만능성을 촉진하는데 필수적이다. 따라서, 톰슨 등 (Thomson et al.)은 인자 중 하나로서 Nanog로 iPS 세포를 생산하는 것이 가능하다고 보고했지만, 야마나카 등 (Yamanaka et al.)은 Nanog가 유도에 필수적이지 않다고 보고하였을 때 놀라웠다.
Lin28은 분화 및 증식과 관련된 배아 줄기 세포 및 배아 암종 세포에서 발현된 mRNA 결합 단백질이다. 톰슨 등은 이것이 필수적이지는 않지만 iPS 생산에서 인자인 것을 입증하였다.
유전자의 Klf 계열의 Klf4는 초기에 문헌 [Yamanaka et al., 2007]에 의해 동정되었고, 문헌 [Jaenisch et al., 1988]에 의해 마우스 iPS 세포의 생산을 위한 인자로서 동정되었으며, 문헌 [Yamanaka et al., 2007]에 의해 사람 iPS 세포의 생산을 위한 인자로서 확인되었다. 그러나, 톰프슨 등 (Thompson et al.)은 Klf4가 사람 iPS 세포를 생산하는데 필수적이지 않고 사실상 사람 iPS 세포를 생산하는데 실패하였다고 보고하였다. Klf2 및 Klf4는 iPS 세포를 생산할 수 있는 인자인 것으로 밝혀졌으며, 관련된 유전자 Klf1 및 Klf5는 감소된 효율을 갖지만 또한 그러하였다.
유전자의 Myc 계열은 암에 관련된 원종양 유전자이다. 문헌 [Yamanaka et al., 2007] 및 [Jaenisch et al., 1988]은 c-Myc가 마우스 iPS 세포의 생산에 관련된 인자인 것을 입증하였으며, 문헌 [Yamanaka et al., 2007]은 c-Myc가 사람 iPS 세포의 생산에 관련된 인자인 것을 입증하였다. 그러나, 톰슨 등 및 야마나카 등은 c-Myc가 사람 iPS 세포의 생산에 필수적이지 않았다고 보고하였다. SV40 거대 항원을 사용하여, c-Myc가 발현될 때 일어날 수 있는 세포독성을 감소 또는 방지할 수 있다.
본 개시 내용에 사용되는 재프로그래밍 단백질은 대략 동일한 재프로그래밍 기능을 갖는 단백질 동족체에 의해 치환될 수 있다. 이들 동족체를 암호화하는 핵산도 또한 재프로그래밍을 위해 사용될 수 있다. 보존적 아미노산 치환에는, 예를 들어, 극성의 산성 아미노산으로서 아스파르트산-글루탐산; 극성의 염기성 아미노산으로서 라이신/아르기닌/히스티딘; 비극성 또는 소수성 아미노산으로서 류신/이소류신/메티오닌/발린/알라닌/글리신/프롤린; 극성 또는 비하전된 친수성 아미노산으로서 세린/트레오닌이 포함된다. 보존적 아미노산 치환에는 또한 측쇄에 기초한 그룹이 포함된다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 예를 들어, 류신의 이소류신 또는 발린으로의 대체, 아스파르테이트의 글루타메이트로의 대체, 트레오닌의 세린으로의 대체, 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 대체는 생산된 폴리펩타이드의 특성에 주요한 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능성 폴리펩타이드를 초래하는지 여부는 폴리펩타이드의 비활성을 검정하여 용이하게 측정할 수 있다.
D. 체세포의 재프로그래밍
일부 실시형태에서, 혈액 세포의 출발 개체군은, 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 공보 2014/0315304에 기재되어 있는 방법에 의해 iPSC로 재프로그래밍된다. 본 개시 내용의 특정한 양태에서, 재프로그래밍 인자는 통합 벡터 또는 에피솜 벡터와 같은 1종 이상의 벡터에 포함된 발현 카세트로부터 발현된다. 추가의 양태에서, 재프로그래밍 단백질은 단백질 형질도입에 의해 체세포 내로 직접 도입될 수 있다.
당해 분야의 통상의 기술자는 표준 재조합 기술 (예를 들어, 둘 다 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et al., 2001] 및 [Ausubel et al., 1996] 참조)을 통해 벡터를 작제할 준비가 잘 되어 있을 것이다. 벡터로는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체 (예를 들어, YAC), 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 (몰로니 쥐 백혈병 바이러스 벡터 (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등으로부터 유도), 렌티바이러스 벡터 (예를 들어, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등으로부터 유도), 이의 복제 컴피턴트, 복제 결여 및 무기력한 형태를 포함하는 아데노바이러스 (Ad) 벡터, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40 (SV-40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터, 하비 쥐 육종 바이러스 벡터, 쥐 유방 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
1. 바이러스 벡터
본 개시 내용의 특정 양태에서는 바이러스 벡터가 제공될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터의 생성에서, 비필수 유전자는 전형적으로 이종 (또는 비-천연) 단백질에 대한 유전자 또는 암호화 서열로 대체된다. 바이러스 벡터는 바이러스 서열을 이용하여 핵산 및 가능하게는 단백질을 세포 내로 도입하는 발현 작제물의 일종이다. 수용체-매개된 엔도사이토시스를 통해 세포를 감염시키거나 세포에 진입하고 숙주 세포 게놈 내로 통합되어 바이러스 유전자를 안정하게 효율적으로 발현시키는 특정 바이러스의 능력은, 이들 바이러스를 외래 핵산의 세포 (예를 들어, 포유 동물 세포)로의 전달를 위한 매력적인 후보자로 되도록 하였다. 본 개시 내용의 특정 양태의 핵산을 전달하는데 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 하기에 기재된다.
레트로바이러스는, 이들의 유전자를 숙주 게놈 내로 통합시키고 다량의 외래 유전 물질을 전달시키고 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시키고 특정 세포주에 패키징되는 능력으로 인하여, 유전자 전달 벡터로서의 가능성을 갖는다(문헌 [Miller, 1992]).
레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해서, 특정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈 내로 핵산을 삽입하여 복제 결함이 있는 바이러스를 생성한다. 비리온을 생성하기 위해서, gag, pol 및 env 유전자 - LTR 및 패키징 성분 무함유 - 를 함유하는 패키징 세포주를 작제한다(문헌 [Mann　et al.,　1983]). 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 특정 세포주 내로 (예를 들어, 칼슘 포스페이트 침전에 의해) 도입되는 경우, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사물을 바이러스 입자 내로 패키징되고, 이어서 배양 배지 내로 분비되도록 한다 (문헌 [Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann　et al.,　1983]). 이어서, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전달에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다 (문헌 [Paskind　et al.,　1975]).
렌티바이러스는, 공통 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env에 추가하여 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자들을 함유하는 복합적인 레트로바이러스이다. 렌티바이러스는 당해 분야에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Naldini et al., 1996], [Zufferey et al., 1997], [Blomer et al., 1997], 미국 특허 6,013,516 및 5,994,136 참조).
재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있으며, 생체내 및 생체외 유전자 전달과 핵산 서열의 발현 둘 다에 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스 - 여기서, 적합한 숙주 세포는 패키징 기능, 즉, gag, pol 및 env 뿐만 아니라 rev 및 tat를 갖는 2종 이상의 벡터로 형질감염된다 - 는 미국 특허 5,994,136 (본 출원에 참조로 포함)에 기재되어 있다.
2. 에피솜 벡터
본 개시 내용의 특정 양태에서는 플라스미드 기반 또는 리포솜 기반 염색체외성 (즉, 에피솜) 벡터의 용도도 도한 제공될 수 있다. 이러한 에피솜 벡터로는, 예를 들어, oriP 기반 벡터 및/또는 EBNA-1의 유도체를 암호화하는 벡터가 포함될 수 있다. 이들 벡터는, DNA의 큰 단편이 세포에 도입되어 염색체외에서 유지되고, 세포 주기 당 1회 복제되고, 효율적으로 딸 세포로 분할되고, 실질적으로 면역 반응을 유도하지 않도록 할 수 있다.
특히, oriP 기반 발현 벡터의 복제에 요구되는 유일한 바이러스 단백질인 EBNA-1은, 세포 면역 반응을 유도하지 않는데, 이는 MHC 클래스 I 분자 상의 이의 항원 제시에 요구되는 과정를 우회시키는 효율적인 메커니즘이 개발되었기 때문이다 (문헌 [Levitskaya et al., 1997]). 또한, EBNA-1은 트랜스로 작용하여 클로닝된 유전자의 발현을 증진킴으로써, 일부 세포주에서 클로닝된 유전자의 발현을 100배까지 유도할 수 있다 (문헌 [Langle-Rouault et al., 1998; Evans et al., 1997]). 마지막으로, 이러한 oriP 기반 발현 벡터의 제조는 저렴하다.
다른 염색체외성 벡터로는 다른 림프영양성 헤르페스 바이러스 기반 벡터를 포함한다. 림프영양성 헤르페스 바이러스는 림프아구 (예를 들어, 사람 B 림프아구) 내에서 복제되어 이의 자연적인 수명 주기의 일부에 대한 플라스미드가 되는 헤르페스 바이러스이다. 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)는 "림프구친화성" 헤르페스 바이러스는 아니다. 전형적인 림프구친화성 헤르페스 바이러스는, 이에 제한되지는 않지만 EBV, 카포시 육종 헤르페스 바이러스 (KSHV); 다람쥐원숭이 헤르페스 바이러스 (HS) 및 마렉병 바이러스 (MDV)를 포함한다. 효모 ARS, 아데노바이러스, SV40 또는 BPV와 같은 에피솜 기반 벡터의 다른 공급원도 고려된다.
당해 분야의 통상의 기술자는 표준 재조합 기술 (예를 들어, 둘 다 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Maniatis et al., 1988] 및 [Ausubel et al., 1994] 참조)을 통해 벡터를 작제할 준비가 잘 되어 있을 것이다.
벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나, 그렇지 않으면 표적화된 세포에 유익한 특성을 제공하는 다른 성분 또는 기능성을 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분으로는, 예를 들어, 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분 (세포-유형 또는 조직-특이적인 결합을 매개하는 성분 포함); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수 후 세포 내의 폴리뉴클레오타이드의 국소화에 영향을 미치는 성분 (예를 들어, 핵 국소화를 매개하는 제제); 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미치는 성분이 포함된다.
이러한 성분은 또한, 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하고 발현하는 세포를 검출하거나 선택하는데 사용될 수 있는 검출가능한 마커 및/또는 선택 마커와 같은 마커를 포함할 수 있다. 이러한 성분은 벡터의 자연적인 특징 (예를 들어, 결합 및 흡수를 매개하는 성분 또는 기능성을 갖는 특정 바이러스 벡터의 용도)으로서 제공될 수 있거나, 벡터는 이러한 기능성을 제공하도록 변형될 수 있다. 매우 다양한 이러한 벡터는 당해 분야에 공지되어 있으며, 일반적으로 입수가능하다. 벡터가 숙주 세포 내에 유지될 때, 벡터는 자율 구조로서 유사분열 동안 세포에 의해 안정하게 복제되거나, 숙주 세포의 게놈 내에 혼입되거나, 숙주 세포의 핵 또는 세포질 내에 유지될 수 있다.
3. 트랜스포손 기반 시스템
특정 양태에서, 프로그래밍 인자의 전달은 트랜스포손-트랜스포사아제 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들어, 트랜스포손-트랜스포사아제 시스템은 잘 공지되어 있는 Sleeping Beauty, Frog Prince 트랜스포손-트랜스포사아제 시스템 (후자의 설명의 경우, 예를 들어, 유럽 특허 1507865 참조) 또는 TTAA-특이적인 트랜스포손 PiggyBac 시스템일 수 있다.
트랜스포손은, 전위로 호칭되는 과정인, 단일 세포의 게놈 내의 상이한 위치로 이동할 수 있는 DNA의 서열이다. 당해 과정에서, 이들은 돌연변이를 일으키며 게놈 내의 DNA의 양을 변화시킬 수 있다. 트랜스포손은 또한 한동안 도약 유전자로도 호칭되었으며, 이동성 유전 요소의 예이다.
다양한 이동성 유전 요소들이 존재하고, 이들은 이들의 전위 메커니즘에 기초하여 분류될 수 있다. 클래스 I 이동성 유전 요소 또는 레트로트랜스포손은 우선 RNA로 전사된 후 역전사 효소에 의해 DNA로 역전사되고, 이어서 게놈 내의 또 다른 위치에 삽입됨으로써 스스로 카피한다. 클래스 II 이동성 유전 요소는 게놈 내에서 트랜스포사아제를 이용하여 한 위치에서 또 다른 위치로 "잘라 붙이기 (cut and paste)"한다.
특정 실시형태에서, 본 개시 내용에 제공된 작제물 (예를 들어, 다중 계통 작제물)은 PiggyBac 발현 시스템을 사용한다. PiggyBac (PB) DNA 트랜스포손은 "잘라 붙이기" 메커니즘을 통해 이동하고, 여기서, 트랜스포손 자체에 의해 암호화되는 트랜스포사아제 효소 (PB 트랜스포사아제)는 트랜스포손을 절제하여 게놈 내의 다른 부위에 재통합시킨다. PB 트랜스포사아제는 트랜스포손을 플랭킹하는 PB 역방위 말단 반복단위 (ITR: inverted terminal repeat)를 특이적으로 인식하고, 이것은 이들 서열에 결합하여 트랜스포손의 절제를 촉진시킨다. 이어서, PB는 상대적인 무작위 방식으로 게놈을 통해 TTAA 부위에 통합된다. 유전자 트랩 돌연변이의 생성 (또는 형질전환 동물을 생성하기 위해 적합화됨)을 위해, 트랜스포손은 하나의 플라스미드 상에 트랜스로 공급되며, 트랜스포사아제에 대한 결합 부위에 의해 플랭킹된 유전자 트랩을 포함하는 재조합 트랜스포손인 공여체 트랜스포손을 함유하는 플라스미드로 공동-형질감염된다. 트랜스포사아제는 플라스미드로부터의 트랜스포손 절제 및 게놈으로의 후속적 통합을 촉진시킬 것이다. 암호화 영역 내의 통합은 유전자 트랩 발현에 필요한 요소를 포착할 것이다. PB는 몇몇의 이상적인 특성을 갖는다: (1) 유전자 내에 우선적으로 삽입된다 (삽입의 50 내지 67%가 유전자에 도달한다). (2) 국부 호핑 (hopping)을 나타내지 않는다 (광범위한 게놈 커버리지). (3) 상승된 수준의 트랜스포사아제 효소가 전위를 감소시키는 과-생성 억제에 민감하지 않다. (4) 공여체 부위로부터 깨끗하게 절제되어 Sleeping Beauty와 달리 "발자국 (footprint)"을 남기지 않는다.
4. 조절 요소
본 개시 내용에서 유용한 재프로그래밍 벡터에 포함되는 발현 카세트는, 바람직하게는 (5'에서 3' 방향으로) 단백질-암호화 서열에 작동가능하게 연결되는 진핵 생물의 전사 프로모터, 개재 서열을 포함하는 스플라이스 신호 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다
a. 프로모터/인핸서
본 출원에서 제공되는 발현 작제물은 프로그래밍 유전자의 발현을 구동시키기 위한 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위를 위치시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이지만, 예를 들어, 포유 동물의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 유전자를 위한 프로모터 및 SV40 후기 유전자를 위한 프로모터와 같은 TATA 박스를 포함하지 않는 일부 프로모터에서는 개시 부위 위에 놓이는 별개의 요소 자체가 개시 장소를 고정시키는데 도움을 준다. 추가의 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 다수의 프로모터가 개시 부위의 다운스트림에도 기능 요소를 함유하는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 개시 부위의 업스트림의 30~110 bp 영역에 위치한다. 프로모터"의 제어하의" 암호화 서열을 가져오기 위해서, 선택된 프로모터의 "다운스트림" (즉, 3')에 전사 리딩 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단을 위치시킨다. "업스트림" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
프로모터 요소들 사이의 간격이 자주 유연하므로, 프로모터 기능은 요소가 서로에 대해 역방향이거나 이동될 때 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 간격은, 활성이 감소하기 시작하기 전에, 50 bp 간격으로 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용성 조절 서열을 나타내는 "인핸서"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는, 암호화 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치하는 5' 비암호화 서열을 단리함으로써 수득될 수 있기 때문에, 핵산 서열과 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로서 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 해당 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 대안으로, 특정 이점은 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 결합되지 않은 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어하에 암호화 핵산 분절을 위치시킴으로써 수득될 것이다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 이의 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 결합하지 않은 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "자연 발생"이 아닌 프로모터 또는 인핸서, 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제에서 가장 흔히 사용되는 프로모터로는 β-락타마아제 (페니실리나아제), 락토오스 및 트립토판 (trp) 프로모터 시스템이 포함된다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것에 추가하여, 서열들은 본 출원에 개시된 조성물과 관련하여 PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산될 수 있다 (각각 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 4,683,202 및 5,928,906 참조). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열도 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 소기관, 세포 유형, 조직, 장기 또는 유기체에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것은 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 통상의 기술자는 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 용도를 일반적으로 알고 있다 (예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et　al. 1989] 참조). 사용되는 프로모터는, 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생산에 유리한 바와 같이, 도입된 DNA 분절의 높은 수준의 발현을 지시하기 위한 적절한 조건하에 항시성 (constitutive), 조직-특이성, 유도성 및/또는 유용성일 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
추가로, 임의의 프로모터/인핸서 조합 (예를 들어, 진핵 생물의 프로모터 데이터 베이스 (EPDB)에 따름)은 발현을 구동시키기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 실시형태이다. 적절한 세균 폴리머라아제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전자 발현 작제물로서 제공되는 경우, 진핵 생물 세포는 특정 세균 프로모터로부터의 세포질 전사를 지원할 수 있다.
프로모터의 비제한적인 예로는 초기 또는 후기 바이러스 프로모터, 예를 들어, SV40 초기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 급초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 초기 프로모터; 진핵 세포 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터 (Ng, 1989; 문헌 [Quitsche et al., 1989]), GADPH 프로모터 (문헌 [Alexander et al., 1988], [Ercolani et al., 1988]), 메탈로티오네인 프로모터 (문헌 [Karin et al., 1989], [Richards et al., 1984]); 및 농축된 반응 요소 프로모터, 예를 들어, 환상 AMP 반응 요소 프로모터 (cre), 혈청 반응 요소 프로모터 (sre), 포르볼 에스테르 프로모터 (TPA) 및 최소 TATA 박스 근처의 반응 요소 프로모터 (tre)가 포함된다. 사람 성장 호르몬 프로모터 서열 (예를 들어, Genbank 수탁 번호 X05244의 뉴클레오티드 283~341에 기술된 사람 성장 호르몬 최소 프로모터) 또는 마우스 유선 종양 프로모터 (ATCC 카탈로그 번호 ATCC 45007로부터 입수가능)도 또한 사용가능하다.
조직-특이적인 전이유전자 발현, 특히, 프로그래밍으로부터 유도된 조혈 세포의 전구체 및 조혈 세포에서의 리포터 유전자 발현은 유도된 조혈 세포 및 전구체를 동정하는 방법으로서 바람직할 수 있다. 특이성과 활성 둘 다를 증가시키기 위해서, 시스-작용성 조절 요소의 사용이 고려되어 왔다. 예를 들어, 조혈 세포-특이적인 프로모터가 사용될 수 있다. 다수의 이러한 조혈 세포-특이적인 프로모터는 당해 분야에 공지되어 있다.
특정 양태에서, 본 개시 내용의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉, 프로모터의 활성을 증가시키는 핵산 서열 및 심지어 상대적으로 긴 거리 (표적 프로모터로부터 수 킬로베이스 (kilobase) 이하)에 걸쳐서도 시스로 및 이들의 배향에 관계없이 작용하는 잠재력을 갖는 핵산 서열에 관한 것이다. 그러나, 인핸서 기능은 주어진 프로모터와 매우 근접하게 기능할 수도 있으므로 이러한 긴 거리에 반드시 제한되는 것은 아니다.
다수의 조혈 세포 프로모터 및 인핸서 서열이 동정되었으며, 본 방법에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,556,954, 미국 공개특허 2002/0055144, 미국 공개특허 2009/0148425를 참조한다.
b. 개시 신호 및 연계 발현
특정 개시 신호는 또한 암호화 서열의 효율적인 번역을 위해 본 개시 내용의 방법에서 제공되는 발현 작제물에서 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 용이하게 이것을 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 목적하는 암호화 서열의 리딩 프레임과 "프레임 내에서" 존재해야 한다는 것은 잘 공지되어 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소를 포함시켜 증진될 수 있다.
특정 실시형태에서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소는 다중 유전자 또는 다시스트론성 메시지를 생성하는데 사용된다. IRES 요소는 5' 메틸화된 Cap 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다 (문헌 [Pelletier and Sonenberg, 1988]). 피코르나바이러스 계열의 2개의 구성원 (소아마비 및 뇌 심근염)으로부터의 IRES 요소 (문헌 [Pelletier and Sonenberg, 1988]) 뿐만 아니라 포유동물 메시지로부터의 IRES (문헌 [Macejak and Sarnow, 1991])도 기재되어 있다. IRES 요소는 이종 오픈 리딩 프레임과 연결될 수 있다. 다중 오픈 리딩 프레임들은 함께 전사될 수 있으며, 각각은 IRES에 의해 분리되어 다시스트론성 메세지를 생성한다. IRES 요소 때문에, 각각의 오픈 리딩 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근가능하다. 다중 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다 (각각 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,925,565 및 5,935,819호 참조).
추가로, 특정 2A 서열 요소는 본 개시 내용에서 제공되는 작제물에서 프로그래밍 유전자의 연계 발현 또는 공동 발현을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 절단 서열은 오픈 리딩 프레임들을 연결하여 단일 시스트론을 형성함으로써 유전자를 공동 발현시키는데 사용될 수 있다. 예시적인 절단 서열은 F2A (구제역 바이러스 2A) 또는 "2A-유사" 서열(예를 들어, 토세아 아시그나 바이러스 2A; T2A)이다 (문헌 [Minskaia and Ryan, 2013]). 특정 실시형태에서, F2A-절단 펩타이드는 다중 계통 작제물에서 유전자의 발현을 연계시키는데 사용된다.
c. 복제의 원점
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해, 이것은 하나 이상의 복제 기원 부위 (종종 "ori"라고 칭함), 예를 들어, 상기에서 기재된 바와 같은 EBV의 oriP 또는 프로그래밍에서 유사하거나 상승된 기능을 갖는 유전자 조작된 oriP에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있으며, 상기 핵산 서열은 복제가 개시되는 특정 핵산 서열이다. 대안으로, 상기에서 기기재된 바와 같은 다른 염색체외성 복제 바이러스 또는 자율 복제 서열 (ARS)의 복제 원점이 사용될 수 있다.
d. 선택 및 스크리닝 가능한 마커
특정 실시형태에서, 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시켜 시험관내에서 또는 생체내에서 동정될 수 있다. 이러한 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 허용하는 세포에 동정가능한 변화를 부여할 것이다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 허용하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 허용하는 것이고, 한편 음성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 방해하는 것이다. 양성 선택 마커의 한 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로, 약물 선택 마커의 함유는 형질전환체의 클로닝 및 동정을 보조하며, 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택 마커이다. 조건의 실행에 기초한 형질전환체의 식별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커에 추가하여, 비색 분석에 기초하는 GFP와 같은 스크리닝 가능한 마커를 포함하는 다른 유형의 마커도 또한 고려된다. 대안으로, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT)와 같은 음성 선택 마커로서 스크리닝 가능한 효소가 이용될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 또한 면역학적 마커를 가능하게는 FACS 분석과 함께 사용하는 방법을 알고 있을 것이다. 사용된 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선택 및 스크리닝 가능한 마커의 추가 예는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
본 개시 내용에 의해 조혈 전구 세포로 프로그래밍되는 만능 줄기 세포 내로의 DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 도입은, 본 출원에 기재된 바와 같이 또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이 세포의 형질전환용 핵산을 전달하기 위한 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예를 들어, 생체외 형질감염 (문헌 [Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989])에 의해; 미세 주사 (본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Harland and Weintraub, 1985], 미국 특허 5,789,215)을 비롯한 주사 (각각 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859)에 의해; 전기천공 (본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,384,253, 문헌 [Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984])에 의해; 인산 칼슘 침전 (문헌 [Graham and Van Der Eb, 1973], [Chen and Okayama, 1987], [Rippe　et　al.,　1990])에 의해; DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜 (문헌 [Gopal, 1985])의 이용에 의해; 직접적 초음파 부하 (문헌 [Fechheimer　et　al.,　1987])에 의해; 리포솜 매개된 형질감염 (문헌 [Nicolau and Sene, 1982], [Fraley　et　al.,　1979], [Nicolau　et　al.,　1987], [Wong　et　al., 1980], [Kaneda　et　al.,　1989], [Kato　et　al.,　1991]) 및 수용체-매개된 형질감염 (문헌 [Wu and Wu, 1987], [Wu and Wu, 1988])에 의해; 미세입자 투사법 (각각 본 출원에 참조로 포함되는 PCT 출원 WO 94/09699 및 WO 95/06128; 미국 특허 5,610,042; 5,322,783 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 및 5,538,880)에 의해; 실리콘 카바이드 섬유에 의한 교반 (각각 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Kaeppler　et　al.,　1990]; 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765)에 의해; 아그로박테리움-매개된 형질전환 (각각 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,591,616 및 5,563,055호)에 의해; 건조/억제-매개된 DNA 흡수 (문헌 [Potrykus　et　al.,　1985])에 의해 및 이러한 방법들의 임의의 조합에 의해서와 같은 DNA의 직접적 전달이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 기술의 적용을 통해, 예를 들어, 이들 소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)는 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
III. 면역 세포의 생산
A. HPC의 생산
본 개시 내용의 특정 실시형태는 체세포-유도된 iPSC의 HPC로의 분화에 관한 것이다. 체세포-유도된 iPSC는 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 8,372,642에 기재된 바와 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 HPC로 분화될 수 있다. 예를 들어, BMP-4, VEGF, Flt-3 리간드, IL-3 및 GM-CSF의 조합이 조혈 분화를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 분화용 PSC를 제조하기 위한 제1 배지, BMP-4, VEGF 및 FGF를 포함하는 제2 배지에 배양 세포 배양물을 연속적으로 노출시킨 후 Flt-3 리간드, SCF, TPO, IL-3 및 IL-6을 포함하는 제3 배지에서 배양시키면 만능 세포를 조혈 전구 세포 및 조혈 세포로 분화시킬 수 있다. 제2 제한 배지는 또한 헤파린을 포함할 수도 있다. 또한, BMP-4 및 VEGF를 함유하는 배지 중에 FGF-2 (50 ng/ml)를 포함시키면 만능 세포로부터 조혈 전구 세포를 생산하는 효율을 증진시킬 수 있다. 또한, 제1 제한 배지 중에 글리코겐 신타아제 키나아제 3 (GSK3) 억제제 (예를 들어, CHIR99021, BIO 및 SB-216763)를 포함시키면 HPC의 생산을 추가로 증진시킬 수 있다.
만능 세포의 조혈 전구 세포로의 분화는 제한 또는 비제한 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 제한 조건은 생산되는 세포를 사람 대상체에 투여하도록 의도되는 실시형태에서 일반적으로 바람직할 것이다. 조혈 줄기 세포는 제한 조건 (예를 들어, TeSR 배지 사용)하에 만능 줄기 세포로부터 유도될 수 있으며, 조혈 세포는 만능 세포로부터 유도된 배상체로부터 생산될 수 있다. 다른 실시형태에서, 만능 세포는 OP9 세포 또는 마우스 배아 섬유아세포 상에서 공동 배양된 후 분화될 수 있다.
만능 세포는 분화 과정의 일부로서 배상체 또는 응집체를 형성하도록 허용될 수 있다. 분화를 유도하기 위한 "배상체" (EB) 또는 성장하는 세포의 클러스터의 형성은 일반적으로 사람 만능 줄기 세포의 EB로의 시험관내 응집을 수반하며, 사람 만능 줄기 세포가 내배엽, 외배엽 및 중배엽를 나타내는 다수의 조직 유형으로 자발적이고 무작위적으로 분화하도록 허용한다. 따라서, 3차원 EB는 일부 분획의 조혈 세포 및 내피 세포를 생산하는데 사용될 수 있다.
EB는 하기의 프로토콜을 사용하여 형성될 수 있다. MatrigelTM 코팅된 플레이트 상에서 무피더 성장에 맞추어진 미분화된 iPSC는, 실온에서 약 8~10분 동안 0.5 M의 EDTA 처리를 사용하여 컨플루언시 (confluency)로 수확될 수 있다. 항온처리 후 EDT를 흡인시키고, ROCK 억제제 또는 블레비스타틴을 함유하는 SFD 배지 중에서 세포를 수거함으로써 EB를 형성시킬 수 있다. 상기 배지는 다음날 상이한 사이토카인 제형을 함유하는 EB1 분화 배지로 변경될 수 있다. 세포를 0.25~0.5 백만 개의 세포/ml의 밀도로 플레이팅하여 응집체 형성을 촉진시킨다.
응집체 형성을 촉진하기 위해, RA 보충 없이 0.05% N2 및 B-27, 200 mM의 1-글루타민, 0.05 mg/ml의 아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘 염 (Asc 2-P) (WAKO) 및 4.5×10-4 MTG로 보충된 25% 햄의 변형 F12 (Cellgro) 및 75% IMDM (Gibco)으로 이루어진 무혈청 분화 (SFD) 배지 중에서 밤새 항온처리하기 위해 세포들을 저부착 플레이트로 옮길 수 있다. 다음날, 세포들을 각 웰로부터 수거하여 원심분리시킬 수 있다. 이어서, 세포들을 분화의 처음 4일 동안 약 50 ng/ml의 골 형성 인자 (BMP-4), 약 50 ng/ml의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 50 ng/ml의 zb FGF로 보충된 SFD 기본 배지로 이루어진 "EB 분화 배지" 중에 재현탁시켰다. 세포들은 48 시간 간격으로 절반을 공급받는다. 분화 5일째에, 배지를 50 ng/ml의 줄기 세포 인자 (SCF), 약 50 ng/ml의 Flt-3 리간드 (Flt-3L), 50 ng/ml의 인터루킨-6 (IL-6), 50 ng/ml의 인터루킨-3 (IL-3), 50 ng/ml의 트롬보포이에틴 (TPO)으로 보충된 SFD 배지로 구성된 제2 배지로 대체한다. 상기 세포들은 새로운 분화 배지에 의해 48 시간 간격으로 절반을 공급받는다. 배지의 변경은 5분 동안 300 g로 분화 배양물의 회전 속도를 감속시키고, 상기 분화 배지의 부피의 절반을 흡인시키고, 이를 새로운 배지로 보충함으로써 수행된다. 특정 실시형태에서, EB 분화 배지는 약 BMP-4 (예를 들어, 약 50 ng/ml), VEGF (예를 들어, 약 50 ng/ml) 및 임의로 FGF-2 (예를 들어, 약 25~75 ng/ml 또는 약 50 ng/ml)를 포함할 수 있다. 상청액을 흡인시키고 새로운 분화 배지로 대체시킬 수 있다. 대안으로, 세포들은 새로운 배지로 2일 간격으로 절반을 공급받을 수 있다. 세포들을 분화 과정 동안 상이한 시점에서 수거할 수 있다.
조혈 전구 세포는 제한 배지를 사용하여 만능 줄기 세포로부터 배양될 수 있다. 제한 배지를 사용하여 만능 세포를 조혈 CD34+ 줄기 세포로 분화시키는 방법은, 예를 들어, 권리에 대한 포기 진술 없이 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 미국 출원 12/715,136호에 기재되어 있다. 이러한 방법들은 본 개시 내용과 함께 사용될 수 있을 것이다.
예를 들어, 제한 배지는 조혈 CD34+ 분화를 유도하는데 사용될 수 있다. 제한 배지는 성장 인자 BMP-4, VEGF, Flt-3 리간드, IL-3 및/또는 GMCSF를 함유할 수 있다. 만능 세포는 BMP-4, VEGF 및 임의로 FGF-2를 포함하는 제1 제한 배지 중에서 배양된 후, (Flt-3 리간드, IL-3 및 GMCSF) 또는 (Flt-3 리간드, IL-3, IL-6 및 TPO)를 포함하는 제2 배지 중에서 배양될 수 있다. 제1 및 제2 배지는 또한 SCF, IL-6, G-CSF, EPO, FGF-2 및/또는 TPO 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 실질적으로, 저산소 조건 (예를 들어, 20% 미만의 O2)은 조혈 또는 내피 분화를 추가로 촉진시킬 수 있다.
세포들은 기계적 또는 효소적 수단을 통해 (예를 들어, 트립신 또는 TrypLETM을 사용하여) 실질적으로 개별화될 수 있다. ROCK 억제제 (예를 들어, H1152 또는 Y-27632)도 또한 배지 중에 포함될 수 있다. 이러한 접근법들은, 예를 들어, 로봇 자동화를 사용하여 자동화될 수 있는 것으로 기대된다.
특정 실시형태에서, 실질적인 저산소 조건은 만능 세포의 조혈 선조 세포로의 분화를 촉진시키는데 사용될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자가 인식하고 있는 바와 같이, 약 20.8% 미만의 대기 산소 함량은 저산소인 것으로 간주될 것이다. 배양물 중 사람 세포는 주위 공기와 비교하여 산소 함량이 감소된 대기 조건에서 성장할 수 있다. 이러한 상대적인 저산소 상태는 배양 배지에 노출된 대기 산소를 감소시켜 달성될 수 있다. 배아 세포는 전형적으로 산소 감소 조건, 일반적으로 약 1% 내지 약 6%의 대기 산소 및 주위 수준의 이산화탄소 하에 생체내에서 발달한다. 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 저산소 조건은 특정 배아의 발달 조건의 양태를 모방할 수 있을 것으로 기대된다. 하기 실시예에서 나타나는 바와 같이, 저산소 조건은 특정 실시형태에서 사용되어 iPSC 또는 hESC와 같은 만능 세포가 조혈 전구 세포와 같은 보다 분화된 세포 유형으로 추가로 분화하는 것을 촉진시킬 수 있다.
하기 저산소 조건은 만능 세포의 조혈 선조 세포로의 분화를 촉진시키는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약 20% 미만, 약 19% 미만, 약 18% 미만, 약 17% 미만, 약 16% 미만, 약 15% 미만, 약 14% 미만, 약 13% 미만, 약 12% 미만, 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1%의 대기 산소 함량을 사용하여 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 저산소 대기는 약 5%의 산소 기체를 포함한다.
임의의 주어진 조혈 선조세포 확장에 사용되는 특정 배지와 무관하게, 사용되는 배지는 바람직하게는 약 0.1 ng/ml 내지 약 500 ng/mL, 보다 통상적으로는 10 ng/ml 내지 100 ng/ml의 농도의 1종 이상의 사이토카인으로 보충된다. 적절한 사이토카인으로는 c-kit 리간드 (KL) (스틸 인자 (StI), 비만 세포 성장 인자 (MGF) 및 줄기 세포 인자 (SCF)로도 또한 호칭됨), IL-6, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-1α, IL-11, MIP-1α, LIF, c-mpl 리간드/TPO 및 flk2/flk3 리간드 (Flt2L 또는 Flt-3L)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다 (문헌 [Nicola et al., 1979], [Golde et al., 1980], [Lusis, 1981], [Abboud et al., 1981], [Okabe, 1982], [Fauser et al., 1981]). 특히, 배양물은 SCF, Flt-3L 및 TPO 중 적어도 1종을 포함할 것이다. 보다 구체적으로는, 배양물은 SCF, Flt-3L 및 TPO를 포함할 것이다.
하나의 실시형태에서, 사이토카인은 배지 중에 함유되고, 배지 관류에 의해 보충된다. 대안으로, 생물반응기 시스템이 사용되는 경우, 사이토카인은 배지 관류를 하지 않고 별도의 유입구 포트를 통해 농축액으로서 별도로 첨가될 수 있다. 사이토카인이 관류하지 않고 첨가되는 경우, 이들은 전형적으로 생물반응기 내의 부피의 1/10 내지 1/100과 동일한 양의 10× 내지 100× 용액으로 첨가될 것이며, 새로운 사이토카인은 대략 2 내지 4일 간격으로 첨가된다. 또한, 새로운 농축 사이토카인도 또한 관류된 배지 중의 사이토카인에 추가하여 별도로 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, HPC는 파괴된 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2)를 나타내며, 골수 분화 또는 림프구 분화를 촉진시키는 조건하에 배양된다. 일부 양태에서, HPC는 본질적으로 메틸화된 DNA에 대한 결합이 없는 비기능성 MeCP2를 발현한다. 특정 양태에서, HPC는 MeCP2 DNA 결합 활성을 가져오기에 충분한 수준으로 MeCP2를 발현하지 않는다. 특정 양태에서, MeCP2는 MeCP2 유전자에서의 절단 또는 돌연변이로 인해 비기능성이다. 일부 양태에서, 파괴된 MeCP2를 나타내는 HPC의 수득은 HPC를 siRNA, shRNA, 또는 MeCP2의 소분자 억제제와 접촉시키는 것을 포함한다.
(i) 예시적인 3D 분화 방법
PSC를 HPC로 분화시키기 위한 예시적인 방법은 필수 8 (E8) 배지에서 Matrigel™-코팅된 또는 비트로넥틴-코팅된 6-웰 플레이트 상에서와 같은 무피더 조건하에 유지하는 것을 포함한다. 응집체는 FGF-2, VEGF, 블레비스타틴 및 GSK-3 억제제의 존재하에, 특히, < 80%의 컨플루언스 (confluence)와 같은 서브-컨플루언트 (sub-confluent)로 0.5~1 백만개의 세포/ml의 밀도로 PSC로부터 제조된다. 예를 들어, 세포들은 50 ng/ml의 FGF-2, 50 ng/ml의 VEGF, 2 μM CHIR99021 (GSK-3 억제제) 및 10 μM 블레비스타틴 (미오신-II 억제제)로 보충된 필수 3 (E3) 배지 (예를 들어, E8 배지의 8개의 성분들 중 3개만 함유: DMEM/F12 기본 배지, 아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘 및 나트륨 셀레나이트) 중에서 배양된다. 특히, 응집체 형성 및 후속 단계는 연속 교반하의 초-저부착 (ULA: ultra-low attachment) 플라스크 중에서 24 시간 배양 동안 수행될 수 있다.
형성된 세포 응집체 (즉, 배상체 - EB)는 추가로 조혈 중배엽 유도성 사이토킨 - 25 ng/ml의 BMP-4, 50 mg/ml의 VEGF 및 50 ng/ml의 FGF-2로 보충된 BMP-4, VEGF 및 FGF-2 함유 무혈청 분화 배지 (예를 들어, 50% IMDM, 50% Hams F12 배지, 100 μg/ml의 폴리비닐 알코올, 100 μg/ml의 재조합 사람 혈청 알부민, 1x 비필수 아미노산 보충물 (Invitrogen), 0.1x 화학적으로 규정된 지질 보충물 (Invitrogen), 125 μM 아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘, 0.25 μM 리놀레산, 미량 원소 보충물 A (0.3x), B (0.2x) 및 C (0.1x) (Corning), 5 mM 염화 나트륨, 100 μM 모노티오글리세롤, 20 μM 에탄올아민, 100 ng/ml의 헤파린 및 10 ng/ml의 IGF1)로 옮겼다. 2일째에 완전 배지 교환으로, 예를 들어, 4일 동안 배양을 계속하였다.
조혈 CD34+ 선조의 분화 및 확장을 지원하기 위해, 세포 응집체를 조혈 지원 사이토카인, 예를 들어, 50 ng/ml의 SCF, 20 mg/ml의 TPO, 10 ng/ml의 FLT3L, 20 ng/ml의 IL-3 및 25 ng/ml의 BMP-4로 보충된 무혈청 분화 배지 (상기와 같음)로 추가로 옮겼다. 2일째에 완전 배지 교환으로, 예를 들어, 4일 동안 배양을 계속하였다.
분화 과정, 예를 들어, 9일 후에 배양물을 수확하였다. 단일 세포 현탁액은, 예를 들어, Accutase에서 분화된 세포 응집체의 분해를 통해 수득된다. 이어서, 예를 들어, MACS에 의해 단리되는 단리된 CD34+ 세포를 T/NK 분화 배양물에 플레이팅하거나, 단리 후 1 시간 이내에 추후 사용을 위해 냉동 보존하였다.
(ii) 예시적인 2D 분화 방법
예시적인 대체 방법에서, HPC의 생산을 위해 PSC를 2D 분화 프로토콜에 적용시킨다. 우선, PSC는, 예를 들어, 필수 8 (E8) 배지 중에서 Matrigel™- 또는 비트로넥틴-코팅 상에서 무피더 조건하에, 예를 들어, 5~10 계대 배양 동안 저산소 조건에 순화시킨다. PSC를 개별화하고, 블레비스타틴 (예를 들어, 1~10 μM, 예를 들어, 5 μM)의 존재하에 PureCoat Amine-코팅된 6-웰 플레이트 (Corning Inc.)와 같은 아민-코팅된 플레이트 상에 플레이팅시킨다. 세포를 BMP-4, VEGF 및 bFGF의 존재하에 배양한다. 예를 들어, 배지는 75% IMDM (Invitrogen 12200-069) (글루타민 및 25 mM HEPES+P/S 함유), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티노산 무함유 1% B27 보충물 (Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml의 아스코르브산, 및 50 ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF로 보충된 4.5×10-4 M 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기본 배지일 수 있다.
조혈 분화의 유도는 BMP-4, VEGF 및 bFGF의 존재하에 배양함으로써 1일째에 개시된다. 예를 들어, 세포는 75% IMDM (Invitrogen 12200-069)(글루타민 및 25 mM HEPES+P/S 함유), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티노산 무함유 1% B27 보충물 (Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml의 아스코르브산, 및 50 ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF로 보충된 4.5×10-4 M 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기본 배지 중에서 배양된다. 2일째에, 배지를 흡인시키고, 세포를 추가의 48 시간 동안 새로운 EB1 배지 (예를 들어, 75% IMDM (Invitrogen 12200-069) (글루타민 및 25 mM HEPES+P/S), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티노산 무함유 1% B27 보충물 (Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml의 아스코르브산, 및 50 ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF로 보충된 4.5×10-4 M 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기본 배지)에 둔다.
5~10일째에, 배지를 흡인시키고, 세포를, 예를 들어, 다음 48 시간 동안 Flt-3 리간드, IL-3, IL-6, SCF, TPO 및 헤파린을 포함하는 배지에 둔다. 예를 들어, EB2 배지는 75% IMDM (Invitrogen 12200-069)(글루타민 및 25 mM HEPES+P/S 함유), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티노산 무함유 1% B27 보충물 (Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml의 아스코르브산, 및 각각 50 ng/ml의 Flt-3 리간드, IL-3, IL-6, SCF 및 TPO 및 5000 U/ml의 헤파린으로 보충된 4.5×10-4 M 모노티오글리세롤을 함유하는 새로운 SFD 기본 배지를 포함할 수 있다. TrypLE를 사용하여 분화 7, 8, 9, 10일째에 세포를 수확하고, HPC 마커 및 림프구 선조의 존재에 대해 염색하였다.
B. 림프구 세포 분화
이어서, 체세포-유도된 PSC로부터 분화되는 HPC는 T 세포, NK 세포 및 T/NK 세포를 비롯한 림프계 세포로 추가로 분화될 수 있다. 일부 양태에서, 분화 동안의 HPC는 림프구 세포로의 분화를 위해 7~12일째, 예를 들어, 8~11일째에 분리된다. 이 단계에서 HPC는 CD34 및 CD43의 발현에 의해 동정될 수 있다. 또한, 림프구 잠재성이 있는 HPC는, 11일째에 감소하는 낮은 수준에서 CD144, DLL4, CD7 및 CD235를 발현할 수 있는데, 이것은 이들 마커의 발현의 특정 한계 수준이 DLL4의 존재하에 세포를 림프구 분화쪽으로 프라이밍하는데 필요하다는 것을 시사한다.
일부 양태에서, 분화 과정의 7~11일째, 예를 들어, 7일째, 8일째, 9일째, 10일째 또는 10일째에 분리된 HPC는, T 세포 및 NK 세포와 같은 림프구 세포로 분화될 수 있다. 일부 양태에서, 림프구 선조에 대한 기원 시기는 HPC 분화 동안 혈액 내피 선조의 감소 및 적혈구 선조의 출현과 일치한다. 특정 양태에서, 9일째의 HPC는 T 세포를 생산하는데 있어서 효율이 증가될 수 있다. 림프구 분화가 가능한 HPC는 특정 마커들의 발현에 의해 분리 및/또는 동정될 수 있다. 예를 들어, CD34 및/또는 CD43의 표면 발현이 있는 세포들은 림프구 분화를 위해 선택될 수 있다. 림프구 선조를 검출하기 위한 추가의 마커들로는 DLL4, CD144, CD31, CD34, CD43lo, CD45lo/-, CD235, CD7, Flk-1, APNLR이 포함된다. 특정 양태에서, CD34/CD7, CD235/CD7, DLL4/CD34, DLL4/CD31, DLL4/CD144 또는 CD34/CD43lo 이중 양성 개체군의 존재를 사용하여 림프구 선조를 동정한다. HPC 상의 CD144 발현은 CD31, CD34 및 DLL4와 함께 공동 염색된다. HPC 상의 CD7 발현은 CD235, CD34 및 DLL4와 함께 공동 염색된다. 따라서, CD144 및 CD7을 공동 발현하는 HPC는, 혈액 내피 마커와 함께 막 결합 노치 리간드 (DLL4)를 발현하는 림프구 잠재성 포착 전구체들이 시험관내에서 완성된 조혈계를 생산할 수 있는 림프구 선조를 출현시키기 위한 표현형 특징 (phenotypic signature)을 만든다는 것을 입증한다. 특정 양태에서, HPC는 CD31, CD34, CD144, CD43, CD45, CD6, CD335, Flk-1 및 DLL4를 비롯한 표면 마커들의 분류에 의해 림프구 잠재성이 증진된 세포로 추가로 분류될 수 있다. 일부 양태에서, HPC의 CD114/CD34, CD144/CD45, CD144/CD7 및 CD144/CD34/CD45/CD7의 양성 분획물은 림프구 세포로 분화된다. 특정 양태에서, HPC의 CD144/CD7 양성 분획물은 림프구 세포로 분화된다.
HPC는 림프구 분화를 위해 무피더 제한 조건 중에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 레트로넥틴, 피브로넥틴 또는 RGD 펩타이드와 같은 1종 이상의 매트릭스 성분을 포함할 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 매트릭스 성분은 배아 줄기 세포의 성장을 위한 고체 지지체를 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포를 배지에 씨딩하기 전에, 매트릭스 성분을 배양 표면에 적용하여 배양 배지와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 세포를 무리들로 기계적으로 분리하거나 세포를 개별화하여 조혈 전구 세포로의 분화를 유도하기 전에, 세포를 피브로넥틴 또는 MatrigelTM로 코팅된 플레이트 상의 제한 배지 (예를 들어, TeSR 배지) 중에서 배양시킬 수 있다.
다양한 매트릭스 성분들을 사용하여 콜라겐 (예를 들어, 콜라겐 IV), 라미닌, 비트로넥틴, MatrigelTM, 젤라틴, 폴리라이신, 트롬보스폰딘 (예를 들어, TSP-1, -2, -3, -4 및/또는 -5) 및/또는 ProNectin-FTM를 비롯한 만능 세포를 배양시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포 생존능에 대한 역 효과의 가능성으로 인해, TeSR을 사용하여 사전에 배양된 세포와 함께 MatrigelTM, 콜라겐 IV 또는 라미닌만을 사용하는 것은 피할 수 있지만; 그럼에도, 이러한 조성물은 다른 매트릭스 성분들과 조합하여 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 매트릭스 성분들의 조합은 세포 성장과 세포 생존능을 촉진시키기 위한 추가의 혜택을 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 상기 매트릭스 성분들을 사용하여, 예를 들어, 조혈 분화 전에 세포를 배양시킬 수 있다.
림프구 분화를 위한 예시적인 무피더 매트릭스는 실시예 4에 개시되어 있다. 특정 양태에서, HPC의 림프구 분화에 사용하기 위한 DLL4:Fc 키메라 단백질 및 레트로넥틴 (피브로넥틴 단편 CH-296; Takara Shuzo, Japan)으로 비조직 배양-처리된 플레이트를 코팅시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 아스코르브산을 사용하여 림프구 분화를 증진시킬 수 있다. 제한 배지는 약 10 μM 내지 약 1 mM의 아스코르브산, 예를 들어, 약 50 μM 내지 약 100 μM, 예를 들어, 약 95 μM의 아스코르브산으로 보충될 수 있다. 아스코르브산은 아스코르브산 마그네슘 포스페이트와 같은 다양한 아스코르베이트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 니코틴아미드 (예를 들어, 니코틴산)를 사용하여, 예를 들어, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 림프구 분화를 증진시킬 수 있다.
일부 양태에서, HPC는 대상체에서 노치 리간드의 생산을 증가시키는 물질을 투여하여 노치 리간드의 내인성 활성을 변화시킴으로써 T 세포와 같은 림프구 세포로 분화된다. 본 방법은 또한 배지 중에서 세포를 배양시키는 것을 포함하며, 여기서, 상기 배지는 유효량의 노치 리간드, 및 IL-7, IL-15, SCF, Flt-3 및 IL-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 사이토카인을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 배지는 IL-6을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 노치 리간드는 DLL4:Fc 키메라와 같은 델타4 노치 리간드 (DLL4)이다.
노치 리간드는 T 세포 계통의 분화 및 증식을 촉진하고 유지하는 것이 선택된다. 노치 리간드는 사람 기원일 수 있거나, 설치류, 개, 고양이, 돼지, 양, 암소, 염소 및 영장류와 같은 포유 동물 종을 비롯한 다른 종으로부터 유래할 수도 있다. 노치 리간드의 구체적인 예로는 델타 계열이 포함된다. 델타 계열에는 델타-1 (Genbank 수탁 번호 AF003522, 호모 사피엔스), 델타-3 (Genbank 수탁 번호 AF084576, 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus)), 델타-유사 1 (Genbank 수탁 번호 NM_005618 및 NP_005609, 호모 사피엔스; Genbank 수탁 번호 X80903, I48324, 무스 무스쿨루스 (Mus musculus)), 델타-유사 3 (Genbank 수탁 번호 NM_053666, N_446118, 라투스 노르베기쿠스), 델타-4 (Genbank 수탁 번호 AF273454, BAB18580, 무스 무스쿨루스; Genbank 수탁 번호 AF279305, AAF81912, 호모 사피엔스) 및 델타-유사 4 (Genbank 수탁 번호 Q9NR61, AAF76427, AF253468, NM_019074, 호모 사피엔스; Genbank 수탁 번호 NM_019454, 무스 무스쿨루스)가 포함된다. 노치 리간드는 시판되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 제조되어 다양한 정도로 정제될 수 있다.
본 방법은 분화된 NK 세포를 생산하기에 충분한 시간 동안 상기에서 기재된 배양물 중에서 HPC 세포를 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 분화된 NK 세포는 T 세포와 함께 배양물 중에서 출현하지만, 상기 NK 세포는 6주 후에 증식을 중지할 수 있다. 일반적으로, NK 세포의 수의 증가 및/또는 이들의 분화 상태에 대한 결정은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 평가된다. 예를 들어, 배양된 세포는 항-CD56 및 항-CD3 항체로 세포들을 염색하여 NK 세포의 발달에 대해 유세포 계측법으로 모니터링할 수 있다. CD56+/CD3-인 세포들은 분화된 NK 세포들을 가리킨다.
C. 골수 분화
체세포-유도된 PSC로부터 생산된 HPC는, 예를 들어, 골수 분화 배지를 사용하여 골수 세포로 분화될 수 있다. 골수 분화 배지는 무혈청 또는 제한 배지일 수 있으며, 상기 배지는 SCF, EPO, TPO, 인슐린, 덱사메타손 또는 하이드로코르티손 및/또는 트랜스페린을 포함할 수 있다. 골수 세포는 수지상 세포, 대식 세포, 호중구, 단핵구, 호염구, 중성구, 비만 세포 및/또는 호산구일 수 있다. 특정 양태에서, 골수 세포는 수지상 세포이다. 예시적인 골수 분화 및 증식 배지는, 예를 들어, 표 4~6에 기재되어 있다.
하나의 예시적인 방법에서, HPC를 저부착 플레이트 내에서 SFEM (Stem Cell Technologies), 헤파린 (예를 들어, 1 내지 10 U/ml, 예를 들어, 5 U/ml, Sigma), TPO (예를 들어, 50 내지 150 ng/ml, 예를 들어, 100 ng/ml), 사람 재조합 SCF (예를 들어, 50 내지 150 ng/ml, 예를 들어, 100 ng/ml), FLT3L (예를 들어, 50 내지 150 ng/ml, 예를 들어, 100 ng/ml), IL-3 (예를 들어, 1 내지 20 ng/ml, 예를 들어, 10 ng/ml) 및 IL-6 (예를 들어, 1 내지 20 ng/ml, 예를 들어, 10 ng/ml)를 함유하는 배지로 옮긴다. 약 5~15일 후, 예를 들어, 8일 후에, 골수 세포를 GM-CSF (예를 들어, 25 내지 150 ng/ml, 예를 들어, 100 ng/ml)를 함유하는 SFEM 배지 중에서 확장시킨다. 마지막으로, 수지상 세포를 생산하기 위해 추가로 1~2주 동안 세포를 SFEM (Stem Cell Technologies), Excyte (예를 들어, 0.1% to 2%, 예를 들어, 1%), GM-CSF (25 내지 150 ng/ml, 예를 들어, 100 ng/ml), IL-4 (10 내지 30 ng/ml, 예를 들어, 20 ng/ml) 및 TNFα (0.5 내지 5 ng/ml, 예를 들어, 2.5 ng/ml)를 함유하는 배지 중에서 배양시킨다. 수지상 세포는 CD209+, CD1a+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+, CD83+ 및 CD86+로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 마커의 발현을 특징으로 할 수 있다. 이들 마커는 대부분 골수 DC를 염색시키지만, 형질세포양 DC (CD123+)를 염색시키지 않는다. 라이트 염색을 사이토스핀 샘플 상에서 수행하여 수지상 세포의 전형적인 형태를 확인할 수 있다.
D. 세포 배양
특정 실시형태에서, 실질적인 저산소 조건을 사용하여 HPC의 골수계 또는 림프계로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 약 20% 미만, 약 19% 미만, 약 18% 미만, 약 17% 미만, 약 16% 미만, 약 15% 미만, 약 14% 미만, 약 13% 미만, 약 12% 미만, 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1%의 대기 산소 함량을 사용하여 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 저산소 대기는 약 5%의 산소 기체를 포함한다.
본 출원에서 기재된 바와 같이, 1종 이상의 제한 배양 배지는 HPC의 골수계 또는 림프계로의 분화를 촉진시키는데 유리하게 사용될 수 있으며; 특히, 혈청 및 마우스 영양세포 층과 같은 동물성 산물의 제거는, 동물성 산물에 대한 세포의 노출과 관련된 위험을 감소시켜 사람 대상체에 보다 안전하게 투여될 수 있는 세포의 생산을 허용한다. 전통적인 줄기 세포 배양 개발은 줄기 세포를 다양한 세포 유형으로 분화시키기 위한 혈청 산물 및 마우스 영양세포 층에 의존하였기 때문에, 이러한 전통적인 절차들은 분화가 수행될 수 있는 스케일을 제한시키고, 생물학적 변이성과 오염 가능성을 증가시키며, 다른 방법으로 유용한 것으로 판명날 수 있는 번역 요법에서 ES 세포의 사용을 심각하게 방해하였다.
일반적으로, 본 개시 내용의 세포는 세포 성장을 지속시킬 수 있는 영양-풍부한 완충 용액인 배양 배지 중에서 배양된다. 본 출원에서 기재된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 조혈 전구 세포 및 조혈 세포로 단리, 확장 및 분화시키기에 적합한 배양 배지로는, 높은 글루코오스 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), DMEM/F-15, RPMI 1640, 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM) 및 Opti-MEM SFM (Invitrogen Inc.)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 화학적 제한 배지는 사람 혈청 알부민, 사람 ExCyte 지질단백질, 트랜스페린, 인슐린, 비타민, 필수 및 비필수 아미노산, 피루브산 나트륨, 글루타민으로 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM) (Gibco)와 같은 최소 필수 배지를 포함하며, 미토겐도 적합하다. 본 출원에서 사용되는 미토겐은 세포의 분열을 자극하는 제제를 말한다. 제제는, 세포가 세포 분열을 시작하여 유사분열을 촉발하도록 독려하는 화학물질, 일반적으로는 일부 형태의 단백질일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 미국 출원 08/464,599 및 국제공개공보 WO 96/39487에 기재된 바와 같은 무혈청 배지 및 미국 특허 5,486,359에 기재된 바와 같은 "완전 배지"는 본 출원에서 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 10% 소 태아 혈청 (FBS), 사람 자가 혈청, 사람 AB 혈청, 또는 헤파린 (2 U/ml)으로 보충된 혈소판 풍부 혈장이 보충된다.
면역 세포는 세포의 골수계 또는 림프계로의 분화를 촉진시키기에 충분한 인자들의 세포내 수준을 증가시키는 조건하에 배지 중에서 만능 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포를 배양시켜 생산될 수 있다. 배지는 또한 다양한 종류의 성장 인자와 같은 1종 이상의 조혈 세포 분화 및 성숙 제제를 함유할 수 있다. 이들 제제는, 세포가 보다 성숙한 표현형으로 되도록, 성숙한 세포의 생존을 우선적으로 촉진시키도록, 또는 이들 둘 다의 효과의 조합을 가지도록 세포를 유도하는데 도움을 줄 수 있다. 분화 및 성숙 제제로는 조혈 세포 계통의 세포 성장을 촉진시킬 수 있는 가용성 성장 인자들 (펩타이드 호르몬, 사이토카인, 리간드-수용체 복합체 및 기타 화합물)이 포함될 수 있다. 이러한 제제의 비제한적인 예로는 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), FLT-3 리간드 (FLT3L), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-9 (IL-9) 또는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF) 또는 이들의 이소형 또는 변이체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
IV. 면역 세포의 용도
특정 양태의 방법 및 조성물에 의해 제공되는 면역 세포는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 이들로는, 몇 가지 예를 들자면, 생체내 세포의 이식 또는 삽입; 시험관내 세포독성 화합물, 발암원, 돌연변이원 성장/조절 인자, 약제학적 화합물 등의 스크리닝; 혈액학적 질환 및 손상의 메커니즘의 규명; 약물 및/또는 성장 인자가 작동하는 메커니즘의 연구; 환자에서의 암의 진단 및 모니터링; 유전자 요법; 및 생물학적 활성 산물의 제조가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
A. 시험 화합물 스크리닝
본 개시 내용의 면역 세포는 본 출원에서 제공되는 림프구 세포의 특징에 영향을 미치는 인자 (예를 들어, 용매, 작은 분자 약물, 펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드) 또는 환경 조건 (예를 들어, 배양 조건 또는 조작)의 스크리닝에 사용될 수 있다.
본 개시 내용의 특정 스크리닝 용도는 약물 연구에서 약제학적 화합물의 시험에 관한 것이다. 독자들은 일반적으로 표준 교과서[In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997] 및 미국 특허 5,030,015를 참조한다. 특정 양태에서, 골수 및 림프구 세포는 단기간 배양에서 조혈 세포 및 전구체에 대해 이전에 수행되었던 바와 같은 표준 약물 스크리닝 및 독성 검정을 위한 시험 세포의 역할을 한다. 후보 약제학적 화합물에 대한 활성의 평가는 일반적으로 특정 양태에서 제공된 조혈 세포 또는 전구체를 후보 화합물과 배합하고, (미처리된 세포 또는 불활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여) 상기 화합물에 기여할 수 있는 세포의 형태, 마커 표현형 또는 대사 활성에서의 임의의 변화를 측정하고, 이어서 관찰된 변화와 상기 화합물의 효과의 상관관계를 보여주는 것을 포함한다. 상기 화합물은 조혈 세포 또는 전구체에 대한 약리학적 효과를 갖도록 설계되기 때문에, 또는 다른 경우에서 효과를 갖도록 설계된 화합물은 조혈 세포 또는 전구체에 대해 의도하지 않은 효과를 가질 수 있기 때문에, 스크리닝을 수행할 수 있다. 가능한 약물-약물 상호작용 효과를 검출하기 위해서는 2종 이상의 약물을 조합 (세포와 동시에 또는 연속적으로 배합)하여 시험할 수 있다.
B. 조혈 세포 치료요법
본 개시 내용은 또한 아마도 혈액학적 질환 또는 장애 또는 손상으로 인해 이러한 치료요법을 필요로 하는 대상체에게 기능의 정도를 회복시키기 위해 본 출원에서 제공되는 면역 세포의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 출원에서 개시된 방법에 의해 유도된 면역 세포는 혈색소병증, 빈혈 등과 같은 혈액학적 질환 및 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 세포는 화학요법과 같은 세포-억제성 요법에 의해 초래된 조혈 세포 결핍증의 치료에 유용할 수 있다.
치료학적 적용을 위해 본 출원에서 제공되는 세포의 적합성을 결정하기 위해서는 먼저 세포를 적합한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 하나의 관점에서, 세포는 생체내에서 이들의 표현형을 생존시키고 유지하는 능력에 대해 평가된다. 본 출원에서 제공되는 세포는 면역결핍 동물 (예를 들어, NOG 마우스, 또는 화학적으로 또는 방사선 조사에 의해 면역결핍된 동물)에게 추가의 관찰이 가능한 부위로, 예를 들어, 신피막 아래, 비장내, 간소엽내 또는 골수내로 투여된다. 조직은 수일 내지 수주 또는 그 이상의 기간 후에 수확되어 적혈구와 같은 출발 세포 유형이 여전히 존재하는지 여부에 관해 평가된다. 이것은 투여된 세포에 검출가능한 라벨 (예를 들어, 녹색 형광성 단백질 또는 β-갈락토시다아제)을 제공함으로써; 또는 투여된 사람 세포에 대해 특이적인 항시성 마커를 측정함으로써 수행될 수 있다. 본 출원에서 제공되는 세포가 설치류 모델에서 시험되고 있는 경우, 투여된 세포의 존재 및 표현형은 사람-특이적 항체를 사용하는 면역 조직 화학 또는 ELISA에 의해, 또는 사람 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 특이적인 증폭을 유발하는 프라이머 및 하이브리드화 조건을 이용하는 RT-PCR 분석에 의해 평가될 수 있다. mRNA 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 평가하는데 적합한 마커는 본 개시 내용의 다른 경우에서 제공된다.
본 개시 내용의 방법에 의해 제공되는 면역 세포는 혈액학적 장애 및 손상을 치료하는 이들의 능력에 대해 다양한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 겸상 적혈구 빈혈 마우스 모델 또는 T/B 세포-결핍성 Rag-2 녹아웃 마우스는, 본 출원에 개시된 골수 및 림프구 세포를 시험하는데 특히 유용한 동물 모델일 수 있다.
동물 모델에서 바람직한 기능적 특징 또는 효능을 입증하는 본 개시 내용의 특정 양태에서 제공되는 면역 세포는, 또한 이를 필요로 하는 사람 대상체에게 직접 투여하기에 적합할 수 있다. 지혈 목적을 위해서는 세포를 순환에 적절하게 접근할 수 있는 임의의 부위에 투여할 수 있다. 조혈 세포 또는 이의 전구체는 또한 손상 또는 질환이 있는 부위에 전달될 수 있다.
본 개시 내용의 특정 양태에서 제공되는 세포는 이를 필요로 하는 임의의 대상체의 치료요법에 사용될 수 있다. 이러한 치료요법에 적절할 수 있는 사람 병태로는 각종 빈혈 및 혈색소병증 뿐만 아니라 조혈 세포수 감소를 특징으로 하는 질환 (예를 들어, 골수이형성 증후군, 골수섬유증, 호중구 감소증, 무과립구증, 글란츠만 혈소판 무력증, 혈소판 감소증 및 후천성 면역 결핍 증후군)도 포함된다. 사람 치료요법의 경우, 투여량은 일반적으로 약 109 내지 1012개의 세포, 전형적으로는 약 5×109 내지 5×1010개의 세포이며, 대상체의 체중, 고통의 성질과 중증도 및 투여된 세포의 복제 능력에 따라 조정될 수 있다. 치료 방식 및 적절한 투여량을 결정하기 위한 궁극적인 책임은 관리 임상의에게 있다.
C. 상업적, 치료학적 및 연구 목적을 위한 배포
제조, 배포 및 사용할 목적으로, 본 개시 내용의 면역 세포는 전형적으로 수송 또는 보관을 용이하게 하기 위해 임의로 동결된 등장성 부형제 또는 배양 배지 중의 세포 배양물 또는 현탁액의 형태로 제공된다.
또한, 제조, 배포 또는 사용 동안 임의의 시점에 존재하는 세포의 세트 또는 조합을 포함하는 서로 다른 시약 시스템이 본 출원에서 제공된다. 세포의 세트는 본 개시 내용에 기재된 2종 이상의 세포 개체군의 임의의 조합을 포함하며, 미분화된 줄기 세포, 체세포-유도된 조혈 세포 또는 다른 분화된 세포 유형과 조합된 프로그래밍-유도된 세포 (조혈 계통 세포, 이의 전구체 및 아형)가 예시되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 세트의 세포 개체군은 때때로 동일한 게놈 또는 이의 유전적으로 변형된 형태를 공유한다. 상기 세트의 각 세포 유형은, 사업상 관계를 공유하는 동일한 단체 또는 상이한 단체들의 관리하에, 동일하거나 또는 상이한 시점에, 동일한 시설 내에서 또는 상이한 장소에서, 함께 또는 별도의 용기로 포장될 수 있다.
V. 실시예
하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시형태를 입증하기 위해 포함된다. 당해 분야의 통상의 기술자라면, 하기 실시예들에 개시되는 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술들을 나타내기 때문에, 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 당해 분야의 통상의 기술자라면, 본 개시 내용을 고려하여, 다수의 변화가 개시되는 특정 실시형태에서 이루어지고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 인식해야 한다.
실시예 1 - T 세포-유도된 PSC (TiPSC)의 생산
iPS 세포의 생산을 위해, 혈액 샘플로부터 T 세포를 단리시켜 iPSC로의 레트로바이러스 재프로그래밍 전에 활성화시켰다. 먼저, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 새롭게 제조된 AIM-V 배지 + pen/strep/글루타민 (AIV-V/ps/s/g 배지) (Invitrogen) + 300 IU/ml rhIL2 (Peprotech) 및 10 ng/ml의 가용성 항-CD3 항체 (OKT3 클론, eBiosciences) 및 항-CD28 항체 중에서 확장시켰다. 활성화 수일 후에, 지수적 성장을 CEDEX 세포 계수에 의해 확인하였다. 배양 3일 후에, 세포를 T 세포 표현형에 대해 검정하고, 이어서 재프로그래밍 인자들로 형질도입하였다.
이전에 기재된 바와 같이 레트로바이러스 벡터 Nanog RFP, Lin28 RFP, Oct4 eGFP 및 Sox2 eGFP를 작제하였다 (본 출원에 참조로 포함되는 미국 출원 61/088,054). 레트로바이러스 벡터 c-Myc RFP, Klf4 RFP, Oct4 eGFP 및 Sox2 eGFP를 유사하게 작제하였다.
CD3- 및 CD28-활성화된 말초 단핵구 세포를, 2% 사람 AB 혈청 및 10 ng/mL의 IL-2를 함유하는 AIM-V 배지를 포함하는 T 세포 배지 중에서 배양하였다. 6일째에, Amaxa U-014 프로그램을 사용하는 전기천공을 통해 T 세포를 6개의 재프로그래밍 인자들로 형질감염시켰다 (1~5×106 세포/형질감염, Amaxa T 세포 형질감염 용액). 형질감염 후 25일째까지, 세포를 웰 당 1개의 형질감염으로 6-웰 플레이트의 레트로넥틴 (0.3 μg/cm2)- 및 비트로넥틴 (0.2 μg/cm2)-코팅된 웰 상에서 배양시키고, 14일째에 시작하여 T 세포 배지로부터 E8 PSC 배지로 점진적으로 옮겼다.
활성화되어 확장하는 T 세포는 특징적인 세포 형태 및 클러스터링 거동을 나타냈다. 레트로바이러스 형질도입 효율의 검출은 초기 형질도입 72 시간 후에 GFP 및 RFP 발현에 의해 결정되었으며, 약 3주간에 걸쳐 전이유전자가 침묵화되어 hES 세포 표현형을 나타냈다. 잘 규정된 iPS 세포 콜로니는 23일째에 나타나기 시작했다. GFP 및 RFP 침묵화를 형광 현미경에 의해 확인하였으며, 피펫 팁을 사용하여 해부용 후드에서 콜로니를 채취하였다. 이어서, 콜로니 조각을 새로운 6-웰 플레이트에 옮겼다. 콜로니의 수를 계수하여 투입 플레이팅된 세포의 수로서 주어지는 재프로그래밍 효율을 평가하였다. 이 시점으로부터 클론 콜로니를 매일 공급하고, 수동으로 1회 초과로 계대 배양한 후 확장시켜 TiPSC 세포주를 생산하였다.
실시예 2 - 조혈 전구 세포 (HPC)로의 TiPSC 분화
실시예 1의 TiPSC를 포함하는 다양한 에피솜 및 바이러스로 재프로그래밍된 iPSC (표 1)를 HPC의 생산을 위한 3D 분화 프로토콜에 적용시켰다 (도 1). 먼저, iPSC를 필수 8 (E8) 배지 중의 Matrigel™- 또는 비트로넥틴-코팅된 초-저부착 (ULA) 플레이트상에서 무피더 조건하에 5~10회 계대 배양 동안 저산소 조건에 순화시켰다. 5 uM 블레비스타틴으로 보충된 무혈청 제한 (SFD) 배지의 존재하에 0.25~0.5백만개의 세포/ml의 밀도로 서브-컨플루언트 iPSC로부터 응집체를 제조하였다. 본 과정은 75% IMDM (Invitrogen 12200-069) (글루타민 및 25 mM HEPES+P/S 함유), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티노산 무함유 1% B27 보충물 (Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml의 아스코르브산 및 4.5×10-4 M 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기본 배지 중의 초-저부착 (ULA) 플레이트 또는 스피너 플라스크에서 수행하였다.
일단 EB가 형성되면, 처음 4일 동안 SFD 기본 배지를 50 ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 FGF-2로 보충하여 분화를 개시하였다. EB 분화 5일 째에, 배양물을 각각 50 ng/ml의 Flt-3 리간드, IL3, IL6, SCF 및 TPO 및 5000 유닛의 헤파린의 존재하에 두었다. 저산소 조건하에 분화 12~16일째까지 분화 과정 동안 2일 마다 사이토카인을 함유하는 새로운 분화 배지의 부피의 절반으로 EB 배양물을 보충하였다. 분화 과정 후 세포를 수확하고, 표현형을 유세포 계측법으로 평가하고, CFU 검정을 사용하여 기능적 능력을 평가하였다. 세포를 수확하고, CD43/CD34 세포의 백분율을 유세포 계측법에 의해 정량화하였다 (도 1b). iPS 세포의 투입수 당 생산된 HPC의 절대수를 나누어 과정의 효율을 산출하였다 (도 1c).
[표 1]
다중 iPSC 세포주를 이용한 과정 검증
Figure pct00001
유세포 계측 분석을 위해, 세포를 수집하여 배지로 1회 세척하였다. 37℃의 항온처리기에서 5~10분 동안 TrypLETM 또는 0.5% 트립신을 사용하여 세포 펠릿을 분해시킨 후 배지로 세척하고, 70 μm의 세포 스트레이너 (strainer)에 통과시켰다. 세포를 PBS-FBS 함유 FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 계수하여 세포 생존능을 추산하고, 형광 색소-접합된 단클론 항체로서 항-사람 CD43 (1G10), 항-사람 CD31 (WM-59), 항-사람 CD41 (HIP8); 항-사람 CD45 (HI30); 항-사람 CD34 (581, 8G12) (BD Biosciences San Jose, CA); 및 항-사람 CD235를 사용하여 염색하였다. 비생존 세포를 7-아미노액티노마이신 D (7-AAD, BD Biosciences)로 배제하였다. FACSCaliburTM 또는 Accuri 유세포 측정기 및 Cell Quest 소프트웨어 상에서 라이브 세포 분석을 수행하였다.
클론원성 조혈 선조 검정 (CFU 검정)을 위해, TryplE 또는 0.5% 트립신/EDTA를 사용하여 EB를 단일 세포 현탁액 중에 분산시켰다. 생존 세포를 정량화하고, 플레이팅하고 (50,000~300,000개의 세포/mL), 줄기 세포 인자 (SCF) 50 ng/mL, 에리트로포이에틴 (EPO) 3 U/mL, 과립구-대식 세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 10 ng/mL, 인터루킨-3 (IL-3) 10 ng/mL을 함유하는 사람 메틸셀룰로오스 완전 배지 (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 조혈 CFC에 대해 습식 챔버에서 검정하였다. 14일 후, 콜로니를 이의 형태에 따라 점수를 매기고, 플레이팅된 105개의 세포 당 콜로니를 정량화하였다.
실시예 3 - 조혈 전구 세포 (HPC)로의 변형된 iPSC 분화
응집체 현탁 (3D) 배양을 통해 1C T 세포-유도된 iPSC (TiPSC, 레트로바이러스 재프로그래밍에 의해 유도)를 CD34+ 조혈 선조로 분화시켰다. 1C 세포를 필수 8 (E8) 배지 중의 Matrigel™- 또는 비트로넥틴-코팅된 6-웰 플레이트 상에서 무피더 조건하에 유지하였다. 응집체를, 50 ng/ml FGF-2, 50 ng/ml의 VEGF, 2 μM CHIR99021 (GSK-3 억제제) 및 10 μM 블레비스타틴 (미오신-II 억제제)로 보충된 필수 3 (E3) 배지 (E8 배지의 8개의 성분들 중 3개만을 함유: DMEM/F12 기본 배지, 아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘 및 나트륨 셀레나이트) 중에서 0.5~1백만개의 세포/ml의 밀도로 서브-컨플루언트 1C 세포 (< 80% 컨플루언스)로부터 제조하였다. 록커 플랫폼 (rocker platform) 상에서 15 rpm의 연속 교반하에 ULA 플라스크에서 24 시간 배양 동안 응집체 형성을 수행하였다 (모든 후속 배양 단계 포함).
형성된 세포 응집체 (즉, 배상체 - EB)를, 조혈 중배엽 유도 사이토킨 - 25 ng/ml의 BMP-4, 50 mg/ml의 VEGF 및 50 ng/ml의 FGF-2로 보충된 무혈청 분화 배지 (50% IMDM, 50% Hams F12 배지, 100 μg/ml의 폴리비닐 알코올, 100 μg/ml 재조합 사람 혈청 알부민, 1x 비-필수 아미노산 보충물 (Invitrogen), 0.1x 화학적으로 규정된 지질 보충물 (Invitrogen), 125 μM 아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘, 0.25 μM 리놀레산, 미량 원소 보충물 A (0.3x), B (0.2x) 및 C (0.1x) (Corning), 5 mM 염화 나트륨, 100 μM 모노티오글리세롤, 20 μM 에탄올아민, 100 ng/ml의 헤파린 및 10 ng/ml의 IGF1)로 추가로 옮겼다. 2일째에 완전 배지 교환으로 4일 동안 배양을 계속하였다.
조혈 CD34+ 선조의 분화 및 확장을 지원하기 위해, 세포 응집체를 조혈 지원 사이토카인 - 50 ng/ml의 SCF, 20 mg/ml의 TPO, 10 ng/ml의 FLT3L, 20 ng/ml의 IL-3 및 25 ng/ml의 BMP-4로 보충된 무혈청 분화 배지 (상기와 같음)로 추가로 옮겼다. 2일째에 완전 배지 교환으로 4일 동안 배양을 계속하였다.
배양물을 분화 과정 7~9일째 동안 수확하였다. 37℃에서 15~20분 동안 Accutase (또는 Accumax) 용액 중에서의 분화된 세포 응집체의 분해를 통해 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 세포를 MACS 완충액 (5 mg/ml의 BSA 및 1mM EDTA를 함유하는 PBS) 중에서 세척하고, 70 μM의 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 4℃에서 30분 동안 직접 CD34 상자성 마이크로비드 (Myltenyi Biotec)로 라벨링하였다. MS 또는 LS 자성 컬럼, 적절한 자석 및 제조업자 (Myltenyi Biotech)로부터의 권고사항에 따른 표준 분리 절차를 이용하여 CD34+ 세포를 단리하였다. 단리된 CD34+ 세포를 T/NK 분화 배양물에 플레이팅하거나, 단리 후 1 시간 이내에 추후 사용을 위해 냉동 보존하였다.
실시예 4 - HPC의 림프구 분화
실시예 2 및 실시예 3의 HPC의 림프구 분화를 위한 파라미터를 결정하기 위해, 세포주를 T 세포 및 NK 세포 분화를 위한 배양 조건에 적용시켰다. 먼저, 간질 (stroma) 의존성 프로토콜에서 시험된 T 세포 분화에 대해 여러 변수를 시험하였다. 상이한 세포주로부터의 12일째 HPC를, OP9 골수 간질 세포 및 MS5 쥐 골수 간질 세포를 포함하는 간질 세포주에 대한 T 세포 잠재성에 대해 시험하였다. 20% FBS, 10 ng/mL의 SCF, 5 ng/mL의 Flt-3 및 5 ng/mL의 IL-7을 함유하는 αMEM 배지 중에서 세포를 배양하였다. 세포를 주 당 3회 절반-배지 변화에 의해 새롭게 하였다. T 세포의 존재에 대한 세포의 분석에 의해, 세포는 골수 세포를 생산하는 경향을 가지며 CD3+ 세포의 존재는 검출될 수 없는 것으로 나타났다. 또한, 간질 공동 배양은 저산소 조건하에 불충분하게 수행되었다.
[표 2]
림프구 분화를 위한 매트릭스의 선택. 레트로넥틴-DLL4 상에 플레이팅된 세포는 프레 T 세포 (CD5+/CD7+ 세포)의 존재를 나타냈다.
Figure pct00002
[표 3]
저산소 상태는 T 세포 분화를 선호한다. 저산소 조건하에 분화하는 세포는 T 세포 및 NK 세포의 존재를 나타냈다.
Figure pct00003
따라서, 무피더 T 세포 분화 프로토콜을 개발하였다. HPC를 약 5,000 내지 약 25,000개의 세포/cm2의 세포 밀도로 0.5 μg/cm2의 레트로넥틴 및 노치 DLL4로 코팅된 미처리된 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅하였다. 1% Glutamax, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 95 μM 아스코르브산 (WAKO labs) 및 50 ng/mL의 IL-7, SCF, Flt-3 및 TPO (Peprotech)로 보충된 StemSpan 무혈청 확장 배지 II (SFEM; StemCell Technologies) 배지 중에서 HPC를 배양하였다. 배지를 48 시간 마다 보충하였으며, 2주째에 세포를 새로운 리간드 코팅된 플레이트 상에 분할하였다. 또한, 2 내지 3주 사이에 세포를 세포 표면 마커 CD5 및 CD7에 의해 프레 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 4주째에, 세포를 세포 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8에 의해 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 6~8주째에, 세포를 세포 표면 마커 CD4, CD8, CD3, CD94 및 CD56을 이용하여 T 세포 및 NK 세포의 존재에 대해 분석하였다.
T 세포 분화에 대한 이의 효과에 대해 시험된 파라미터들 중 하나는 배양 플레이트 상의 매트릭스 코팅의 선택이었다. 플레이팅 후 3주째에, 노치 DLL4와 제대혈의 다양한 매트릭스 조합을 사용하여 무혈청 조건하에 프레 T 세포의 출현을 분석하여 비교를 수행하였다. 본 결과는 레트로넥틴과 DLL4의 조합이 비트로넥틴 또는 테나신과의 조합 보다 제대혈 세포를 프레 T 세포로 분화시키는데 보다 효과적이었다는 것을 나타냈다 (표 2).
놀랍게도, 저산소 조건은 무피더 T 세포 분화를 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 저산소 상태는 정상 산소 조건하에 분화된 세포와 비교하여 CD8에 대해 양성인 세포의 백분율을 증가시키고 CD4에 대해 양성인 세포의 백분율을 감소시키는 것으로 관찰되었다 (표 3).
실시예 2에 기재된 HPC 분화의 5일째, 7일째, 9일째 및 11일째에 다양한 세포주를 수확하여, 혈액 세포-유도된 iPSC를 림프계로 분화시키는 효율을 분석하였다. HPC 세포를 해동시키고, 레트로넥빈 및 DLL4 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포에 2일 마다 새로운 배지를 공급하고, HPC 세포를 해동한 후 2주째에 프레 T 세포 마커, 4주째에 T 세포 마커 및 6주째에 T 세포 및 NK 세포 마커에 대해 분석하였다. T 세포, NK 세포 및 NK/T 세포의 존재에 대한 CD7, CD8, CD56 (도 3a), CD45, CD7, CD5 (도 3b), 및 CD56, CD8, CD3 (도 3c)의 표면 발현을 위해 세포를 염색하였다. TiPSC 및 에피솜으로 재프로그래밍된 3908 세포는 7~11일째에 림프구 잠재성이 증가한 것으로 관찰되었다 (도 3a).
표면 마커가 림프구 분화의 효율을 증가시키는데 사용될 수 있는지를 결정하기 위해, CD43/CD34, CD34, DLL4, CD31/CD144,및 CD235의 분석을 TiPSC 1E 세포주와 에피솜성 3902 세포주 둘다에 대해 수행하였다 (도 4). DLL4의 발현 및 CD235의 수준은 분화 11일째에 감소하며, 분화 일수에 따라 CD34 발현은 감소하고 CD43 발현은 증가하는 것으로 밝혀졌다. 림프구 세포는 분화 11일째에 부재하기 때문에, 이것은 이들 마커의 발현의 특정 한계 수준이 DLL4의 존재하에 림프구 분화쪽으로 세포를 프라이밍하는데 필수적이라는 것을 시사한다.
HPC 분화 동안 림프구 선조의 추가의 분석을 표면 마커 CD31, CD34, CD144, CD43, CD45, CD6, CD335, Flk-1 및 DLL4의 자성 분류에 의해 수행하였다. 8일째 HPC를 CD114/CD34, CD144/CD45, CD144/CD7 및 CD144/CD34/CD45/CD7 양성 및 음성 분획물 뿐만 아니라 미분류 대조군으로 분류하였다 (도 5). 이어서, 이들 분획물을 림프구 분화 과정에 적용하고, 16일째에 CD3+ 세포의 존재에 대해 분석하였다 (도 6a). 양성 분획물 각각은, 음성 분획물 및 미분류 대조군과 비교하여, 현저하게 증가된 림프구 잠재성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 이것은 양성 분획물 자성 분류로부터의 T 세포 생산의 배수 농축 증가에 의해 추가로 뒷받침되었다 (도 6b). 양성 분획물을 추가로 2주 동안 새로운 Ret-DLL4 표면 상에 다시 플레이팅하였다.
림프구 분화 4주째에, 8일째 CD144+/CD7+ 및 CD144+/CD45+ HPC는, 도 7a에서 CD3 양성 세포의 백분율에 의해 나타낸 바와 같이, 시험관내 T 세포의 생산을 유지하였다. CD3 세포는 CD335 양성, CD161 양성 및 불변 T 세포 수용체 (6B11) 음성이었다. 따라서, 후기 상태의 배양물은 NK/T 세포 표현형이 출현한다. 또한, CD144+/CD7+ HPC는, 16일째에 T 세포의 산출에 대한 HPC의 투입의 비율에 의해 측정된 바와 같이, T 세포를 생산하는데 효율이 증가한 것으로 나타났다. 그러나, 4주의 종료시 과정의 누적 효율은 CD144/CD34/Cd45/CD7 양성 분획물에 대해 최고인 것으로 나타났다.
추가의 연구에서, TiPSC-유도된 T 세포를 기능성에 대해 분석하였다. TiPSC (1C)-유도된 CD34+ 세포로부터 2주째의 T/NK 분화 배양에서 생산된 T 세포를 T 세포 확장 배양물 (고정화 항-CD3 mAb, IL-2 및 IL-7)로 옮겼다. 말초 혈액 T 세포를 병행 배양으로 확장하였다. 확장 2주 후 T 세포를 수확하고, 세척하고, 계수하고, 106/ml 농도로 조정하고, 활성화된 사이토카인 생산을 위한 고정화 항-CD3 mAb (T 세포 + 항-CD3)에 대해 배양 중에 36 시간 재자극시키거나, 자발성/항시성 사이토카인 생산을 위한 항-CD3 mAb 없이 (T 세포) 배양하였다. LEGENDplex 유세포 계측법 복합 사이토카인 검정 (CD8/NK 패널, BioLegend)을 사용하여 배양 상청액에서 사이토카인을 측정하였다. 상대적인 사이토카인 수준은 도 22에서 각각의 점도표 상에 묘사되어 있다. 동일한 배양 조건에서 2 주간 확장된 말초 혈액과 PSC-유도된 T 세포 둘 다는 높은 수준의 IL-2, IFNγ 및 TNF 생산을 특징으로 하는 상당히 유사한 1형 사이토카인 분비 프로파일을 전개시켰다. 확장된 T 세포의 세포독성은 또한 활성화된 그랜자임 B 분비에 의해 밝혀졌다. 따라서, TiPSC-유도된 T 세포는, 1형 사이토카인 분비 프로파일에 의해 관찰되는 바와 같이, 원발성 T 세포와 유사한 기능성을 나타낸다.
실시예 5 - HPC의 골수 분화
사람 수지상 세포 (DC)의 상대적 순수 개체군의 생산을 위해 실시예 2 및 3의 CD34+ HPC를 골수 분화에 적용시켰다. 전체 과정 동안 세포를 저부착 조직 배양 플레이트 또는 플라스크 상에서 배양하였다. 세포를 0.5~1×106 세포/mL의 밀도로, 50 ng/mL의 Flt-3 리간드 (Flt-3L), 50 ng/mL의 줄기 세포 인자 (SCF), 50 ng/mL의 트롬보포에이틴 (TPO), 50 ng/mL의 인터루킨-3 (IL-3) 및 50 ng/mL의 인터루킨-6 (IL-6)을 함유하는 무혈청 배지 중에 재현탁시켰다.
골수 분화를 개시하기 위해, 세포를 골수 선조 배지 중에 0.25~0.5백만개의 세포/mL의 밀도로 씨딩하고 (표 4), 약 2주 동안 확장시켰다. 세포를 4일째 및 8일째에 생존능 및 CD34+/CD45+/CD43+의 발현에 대해 모니터링하였다. CD34+ 개체군은 감소하는 것으로 관찰되었으며, 배양물 내의 CD45+/CD43+/CD31+ 개체군이 출현하였다. 본 단계에서 배양물의 표현형은 주로 CD43+/CD45+/CD31+/CD34Lo이었다.
[표 4]
골수 선조 배지
Figure pct00004
* StemSpan™ SFEM (Stem Cell Technologies, 카탈로그 번호 09650), Stem Pro 34 (Invitrogen, 카탈로그 번호 10639-011) 또는 Stemline II (Sigma, 카탈로그 번호 S0192)는 무혈청 배지로서 사용될 수 있다.
세포가 CD43+/CD45+/CD31+/CD34- 세포 표면 마커의 50% 초과 발현을 나타내는 경우, 세포를 8일 동안 골수 확장 배지 (표 5)에 두었다. 세포에 격일로 새로운 배지를 공급하였다. 8일의 종료시, 배양된 세포는 80~90% CD43+/CD45+/CD31+/CD34-를 나타내는 골수 세포의 농축된 개체군을 나타냈다. 본 골수 확장 단계의 종료시에, 세포수, 생존능 및 순도를 측정하였다.
[표 5]
골수 확장 배지
Figure pct00005
* StemSpan™ SFEM (Stem Cell Technologies, 카탈로그 번호 09650), Stem Pro 34 (Invitrogen, 카탈로그 번호 10639-011) 또는 Stemline II (Sigma, 카탈로그 번호 S0192)는 무혈청 배지로서 사용될 수 있다.
마지막으로, 배양 16일의 종료시에, 배양물을 수지상 세포 강화 배지에 두었다 (표 6). 세포 밀도를 0.5~1백만개의 세포/mL로 유지하고, 세포에 회전 단계 없이 4일 마다 새로운 배지를 공급하였다. 본 분화 단계에서는 어떠한 증식도 거의 관찰되지 않았다. 대신에, 세포는 저부착 플레이트에 들러 붙고 크기가 증가하는 것으로 관찰되었다. 1주의 종료시에, 샘플을 수확하고, 유세포 계측법에 의해 CD209+, CD1a+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+, CD83+ 및 CD86+의 존재에 대해 시험하였다 (도 9~10). 이들 마커는 대부분 골수 DC를 염색시키지만, 형질세포양 DC (CD123+)를 염색시키지 않는다. 세포를 수지상 세포 강화 배지에 유지시키고, 다양한 시점에서 분석하여 수율 및 순도를 정량화하였다. 수지상 세포의 전형적인 형태를 확인하기 위해 라이트 염색을 사이토스핀 샘플에 대해 수행하였다.
[표 6]
수지상 세포 강화 배지
Figure pct00006
실시예 6 - PSC 분화 및 T 세포 확장의 방법
CD34+ 림프구 조혈 선조로의 PSC 분화: 응집체 현탁 (3D) 배양을 통해 1C T 세포-유도된 iPSC (TiPSC, 레트로바이러스 재프로그래밍에 의해 유도)를 CD34+ 조혈 선조로 분화시켰다. 1C 세포를 필수 8 (E8) 배지 중의 Matrigel™- 또는 비트로넥틴-코팅된 6-웰 플레이트 상에서 무피더 조건하에 유지하였다. 응집체를, 50 ng/ml FGF-2, 50 ng/ml의 VEGF, 2 μM CHIR99021 (GSK-3 억제제) 및 10 μM 블레비스타틴 (미오신-II 억제제)로 보충된 필수 3 (E3) 배지 (E8 배지의 8개의 성분들 중 3개만을 함유: DMEM/F12 기본 배지, 아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘 및 나트륨 셀레나이트) 중에서 0.5~1백만개의 세포/ml의 밀도로 서브-컨플루언트 1C 세포 (< 80% 컨플루언스)로부터 제조하였다. 록커 플랫폼 상에서 15rpm의 연속 교반하에 초-저부착 (ULA) 플라스크에서 24시간 배양 동안 응집체 형성을 수행하였다 (모든 후속적 배양 단계 포함).
형성된 세포 응집체 (배상체 - EB)를, 조혈 중배엽 유도성 사이토카인 - 25 ng/ml의 BMP-4, 50 mg/ml의 VEGF 및 50 ng/ml의 FGF-2로 보충된 무혈청 분화 배지 (50% IMDM, 50% Hams F12 배지, 100 μg/ml의 폴리비닐 알코올, 100 μg/ml의 재조합 사람 혈청 알부민 1x 비필수 아미노산 보충물 (Invitrogen), 0.1x 화학적으로 규정된 지질 보충물 (Invitrogen), 125 μM 아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘, 0.25 μM 리놀레산, 미량 원소 보충물 A (0.3x), B (0.2x) 및 C (0.1x) (Corning), 5 mM 염화 나트륨, 100 μM 모노티오글리세롤, 20 μM 에탄올아민, 100 ng/ml의 헤파린 및 10 ng/ml의 IGF1)로 추가로 옮겼다. 2일째에 완전 배지 교환으로 4일 동안 배양을 계속하였다.
조혈 CD34+ 선조의 분화 및 확장을 지원하기 위해, 세포 응집체를 조혈 지원 사이토카인 - 50 ng/ml의 SCF, 20 mg/ml의 TPO, 10 ng/ml의 FLT3L, 20 ng/ml의 IL-3 및 25 ng/ml의 BMP-4로 보충된 무혈청 분화 배지 (상기와 같음)로 추가로 옮겼다. 2일째에 완전 배지 교환으로 4일 동안 배양을 계속하였다.
1+4+4일(총 9일) 분화 과정 후 배양물을 수확하였다. 37℃에서 15~20분 동안 Accutase (또는 Accumax) 용액 중에서의 분화된 세포 응집체의 분해를 통해 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 세포를 MACS 완충액 (5 mg/ml의 BSA 및 1 mM EDTA를 함유하는 PBS) 중에서 세척하고, 70 μM의 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 4℃에서 30분 동안 직접 CD34 상자성 마이크로비드 (Myltenyi Biotec)로 라벨링하였다. MS 또는 LS 자성 컬럼, 적절한 자석 및 제조업자 (Myltenyi Biotech)로부터의 권고사항에 따른 표준 분리 절차를 이용하여 CD34+ 세포를 단리하였다. 단리된 CD34+ 세포를 T/NK 분화 배양물에 플레이팅하거나, 단리 후 1 시간 이내에 추후 사용을 위해 냉동 보존하였다.
T/NK 분화 배양: T/NK 분화를 위해, PBS 중에 희석된 노치 리간드 hDLL4-Fc 키메라 단백질 및 레트로넥틴으로 (각각 0.5 μg/cm2으로) 비조직 배양-처리된 플라스틱 플레이트를 코팅하였다. 세포 플레이팅 전에, 코팅 용액을 흡인시키고, 플레이트를 세포 배양 기본 배지 (DMEM/F12 또는 기타)로 1회 세척하고, StemSpan SFEM (Stem Cell Technologies), GlumaMax (1/100), PenStrep (1/200), 아스코르브산 마그네슘 포스페이트 (250 μM), 니코틴아미드 (2 mM) 및 사이토카인 SCF, TPO, FLT3L 및 IL-7 (각각 50 ng/ml)로 이루어진 0.25 ml/cm2의 T 세포 분화 배지 (TCDM)로 충전하였다. 단리된 PSC-유도된 CD34+ 세포를 5000개의 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하고, 저산소 (5% O2) CO2 항온처리기 내에서 3일째 및 6일째에 새로운 TCDM 배양 부피를 첨가하고 이후 3일 마다 배양 부피의 절반을 교환하면서 2주 동안 배양하였다. 비부착성 세포를 온화하게 재현탁시켜 수집한 후, PBS-EDTA (0.5 mM)로 10~15분 처리하여 부착성 세포를 탈착함으로써 세포 전체를 수확하였다.
T 세포 확장 배양: T 세포 확장을 위해, PBS 중에 희석된 항-CD3 mAb (클론 OKT3) 및 레트로넥틴 (각각 0.5 μg/cm2)으로 조직 배양 플라스틱 플레이트를 코팅하였다. 세포 플레이팅 전에, 코팅 용액을 흡인시키고, 플레이트를 세포 배양 기본 배지 (DMEM/F12 또는 기타)로 2회 세척하고, ImmunoCult XF 배지(Stem Cell Technologies), GlumaMax (1/100), PenStrep (1/200) 및 사이토카인 IL-2 및 IL-7 (각각 10 ng/ml)로 이루어진 0.2 ml/cm2의 T 세포 확장 배지 (TCEM)으로 충전하였다. IL-15 및/또는 IL-21을 또한 첨가하여 확장을 개선시킬 수 있었다. T/NK 분화 배양물로부터 수확된 세포를 20000개의 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하고, 저산소 (5% O2) CO2 항온처리기 내에서 3일째에 새로운 TCEM 배양 부피를 첨가하고 이후 3일 마다 배양 부피의 절반을 교환하면서 2주 동안 배양하였다. 비부착성 세포를 온화하게 재현탁시켜 수집함으로써 확장된 T 세포를 수확하였다.
실시예 7 - HPC의 생산을 위한 2D 프로토콜
01279.107.3902 MeCP2 녹아웃 및 TiPSC 1E 세포를 HPC의 생산을 위한 2D 분화 프로토콜에 적용시켰다 (도 16). 먼저, iPSC를 필수 8 (E8) 배지 중의 Matrigel™- 또는 비트로넥틴-코팅 상에서 무피더 조건하에 5~10회의 계대 배양 동안 저산소 조건에 순화시켰다. iPSC를 개별화하고, 5 uM 블레비스타틴으로 보충된 무혈청 제한 (SFD) 배지의 존재하에 PureCoat 아민-코팅된 6-웰 플레이트 (Corning Inc.) 상에 25000/cm2의 밀도로 플레이팅하였다. SFD 기본 배지는 75% IMDM (Invitrogen 12200-069) (글루타민 및 25 mM HEPES+P/S 함유), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티노산 무함유 1% B27 보충물 (Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml의 아스코르브산, 및 50 ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF로 보충된 4.5×10-4 M 모노티오글리세롤을 함유하였다.
75% IMDM (Invitrogen 12200-069) (글루타민 및 25 mM HEPES+P/S 포함), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티노산 무함유 1% B27 보충물 (Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml의 아스코르브산 및 50 ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF로 보충된 4.5×10-4 M 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기본 배지에서 배양함으로써 1일째에 조혈 분화의 유도를 개시하였다. 2일째에, 배지를 흡인시키고, 추가로 48 시간 동안 세포를 새로운 EB1 배지 (75% IMDM (Invitrogen 12200-069) (글루타민 및 25 mM HEPES+P/S 함유), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티노산 무함유 1% B27 보충물 (Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml의 아스코르브산, 및 50 ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF로 보충된 4.5×10-4 M 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기본 배지)에 두었다.
5~10일째에, 배지를 흡인시키고, 다음 48시간 동안 세포를 EB2 배지에 두었다. EB2 배지는 75% IMDM (Invitrogen 12200-069) (글루타민 및 25 mM HEPES+P/S 함유), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티노산 무함유 1% B27 보충물 (Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml의 아스코르브산, 및 각각 50 ng/ml의 Flt-3 리간드, IL-3, IL-6, SCF 및 TPO 및 5000 U/ml의 헤파린으로 보충된 4.5×10-4 M 모노티오글리세롤을 함유하는 새로운 SFD 기본 배지를 포함하였다. TrypLE을 이용하여 분화 7일째, 8일째, 9일째, 10일째에 세포를 수확하고, HPC 마커 및 림프구 선조의 존재를 위해 염색하였다.
T 세포 분화를 위해, 0.5 μg/cm2의 레트로넥틴 및 노치 DLL4로 코팅된 미처리된 조직 배양 플레이트 상에 HPC를 약 5,000 내지 약 25,000개의 세포/cm2의 세포 밀도로 플레이팅하였다. HPC를, 1% Glutamax, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 95 μM 아스코르브산 (WAKO labs) 뿐만 아니라 50 ng/mL의 IL-7, SCF, Flt-3 및 TPO (Peprotech)로 보충된 StemSpan 무혈청 확장 배지 II (SFEM; StemCell Technologies) 배지 또는 SFD 중에서 배양하였다. 배지를 48시간마다 보충하고, 2주째에 세포를 새로운 리간드 코팅된 플레이트에 비효소적으로 분할하였다. 또한, 2 내지 3주 사이에 세포를 세포 표면 마커 CD5 및 CD7에 의해 프레 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 4주째에, 세포를 세포 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8에 의해 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 6~8주째에, 세포를 세포 표면 마커 CD4, CD8, CD3, CD94 및 CD56을 이용하여 T 세포 및 NK 세포의 존재에 대해 분석하였다.
실시예 8 - 림프구 분화에 대한 MeCP2 파괴의 효과
조혈 분화 과정에서 MeCP2의 역할을 결정하기 위해, MeCP2 녹아웃 iPSC 세포주를 생산하였다. MeCP2를 녹아웃하도록 수컷 야생형 (WT) 01279 iPSC 세포주를 조작하여 MyCell® 01279.107.3902 세포주를 생산하였다. TAL 뉴클레아제를 이용하여, MeCP2 TALEN의 형질감염에 의해 MeCP2의 메틸 CpG 결합 도메인 (도 17b) 전에 일련의 정지 코돈을 삽입하고, 정지 코돈 삽입물을 함유하는 공여체 플라스미드에는 역 배향으로 LoxP 플랭킹된 PGKp-퓨로마이신-SV40pA를 삽입하였다. MeCP2 TALEN 및 야생형 EBNA1을 발현하는 공여체 플라스미드 p1553으로 0.1279 iPSC를 형질감염시켰다.
퓨로마이신 선택을 위해 삽입에 대해 양성인 세포를 선택하고, 이어서 콜로니를 채취하여 통합 PCR에 의해 스크리닝하였다. 스크리닝된 콜로니 중에서, 96%는 2회의 PCR 스크리닝 반응에 의해 삽입에 대해 양성이었다. 클론들 중 14개를 확장시켜 계대 배양 3에서 스크리닝하였으며, 클론들 중 8개는 백본 (backbone) 플라스미드의 통합에 대해 음성인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 나머지 클론들 중 3개를 삽입물을 통해 서열분석하였으며, 2개는 다클론인 것으로 밝혀졌다. 하나의 단클론 세포주 0.1279.107.302를 선택하고, 추가의 연구를 위해 완전히 특성화하였다. 추가의 클론을 또한 수득하였으며, 정확하게 조작된 것으로 특성화하였다. MeCP2 변이체 001, 002, 005 및 008의 아미노산 정렬은 도 17c에 도시되어 있다. 변이체 008은 메틸 CpG 결합 도메인을 암호화하지 않는다.
실시예 1의 01279.107.3902 MeCP2 녹아웃 세포 및 WT 01279 세포를 HPC의 생산을 위한 3D 분화 프로토콜에 적용시켰다 (도 17a). 먼저, iPSC를 필수 8 (E8) 배지 중의 Matrigel™- 또는 비트로넥틴-코팅 상에서 무피더 조건하에 5~10회의 계대 배양 동안 저산소 조건에 순화시켰다. 5 uM 블레비스타틴으로 보충된 무혈청 제한 (SFD) 배지의 존재하에 0.25~0.5백만개의 세포/ml의 밀도로 서브-컨플루언트 iPSC로부터 응집체를 제조하였다. 75% IMDM (Invitrogen 12200-069) (글루타민 및 25mM HEPES+P/S), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티노산 무함유 1% B27 보충물 (Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml의 아스코르브산, GlutaMAX, Pen/Strep 및 4.5×10-4 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기본 배지 중의 초-저부착 (ULA) 플레이트 또는 스피너 플라스크에서 본 과정을 수행하였다.
일단 EB가 형성되면, 처음 4일 동안 SFD 기본 배지를 50 ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF로 보충하여 분화를 개시하였다. 5일째에, EB 배양물을 각각 50 ng/ml의 Flt-3 리간드, IL-3, IL-6, SCF, 헤파린 및 TPO의 존재 하에 두었다. 저산소 조건하에 분화 12~16일째까지 분화 과정 동안 2일 마다 사이토카인을 함유하는 새로운 분화 배지의 부피의 절반으로 EB 배양물을 보충하였다.
림프구 분화를 위해, 0.5 μg/cm2의 레트로넥틴 및 노치 DLL4로 코팅된 미처리된 조직 배양 플레이트 상에 HPC를 약 5,000 내지 약 25,000개의 세포/cm2의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 1% Glutamax, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 95 μM 아스코르브산 (WAKO labs) 뿐만 아니라 50 ng/mL의 IL-7, SCF, Flt-3 및 TPO (Peprotech)로 보충된 StemSpan 무혈청 확장 배지 II (SFEM; StemCell Technologies) 배지 중에서 HPC를 배양하였다. 배지를 48시간마다 보충하고, 2주째에 세포를 새로운 리간드 코팅된 플레이트에 비효소적으로 분할하였다. 또한, 2 내지 3주 사이에 세포를 세포 표면 마커 CD5 및 CD7에 의해 프레 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 4주째에, 세포를 세포 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8에 의해 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 6~8주째에, 세포를 세포 표면 마커 CD4, CD8, CD3, CD94 및 CD56을 이용하여 T 세포 및 NK 세포의 존재에 대해 분석하였다.
HPC 분화의 5일째, 7일째, 9일째 및 11일째에 01279.107.3902, 01279.107.3905, 01279.107.3906, 01279.107.3907 및 01279.107.3908 클론을 수확하여 림프계로의 분화시 MeCP2 녹아웃 클론의 효율을 분석하였다. 이전에 기재된 시점에서 냉동 보존된 HPC 세포를 해동시켜, 레트로넥틴 및 DLL4 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포에 2일마다 새로운 배지를 공급하고, HPC 세포를 해동시킨 후 4주째에 프레 T 세포 마커에 대해 (도 18a, 도 18b), 4주째에 T 세포 및 NK 세포 마커에 대해 분석하였다. 프레 T 세포 마커의 분석에서, 야생형 01279.107.0904 세포를 제외한 모든 세포에 대해 프레 T 세포의 존재를 CD5+CD7+, CD7+CD45+ 및 CD5+CD45로서 동정하였다. CD45, CD7 및 CD5 (도 19) 및 CD56, CD8 및 CD3 (도 20)의 표면 발현을 위해 세포를 염색하였으며, T 세포, NK 세포 및 NK/T 세포의 존재를 정량화하였다.
세포의 투입수는 공지되어 있기 때문에, T 세포 (CD3+/CD8+), NK 세포 (CD3-/CD56+) 및 NK/T 세포 (CD3+/CD56+)의 절대수를 측정하였다. 세포 유형 (T, NK 또는 NK/T)의 절대수/총 세포의 투입수의 비율에 의해 또는 세포 유형의 절대수/HPC의 투입수의 비율에 의해 본 과정의 효율을 산출한다. T 세포 (CD3+/CD8+)의 백분율 (도 17) 및 NK 세포 (CD3-/CD56+)의 백분율 (도 21)을 FSC-SSC 게이트 및 림프구 산포 게이트하에 유세포 계측법에 의해 정량화하였다. 출현하는 NK/T (CD3+/CD56+), (CD3+/CD8+), NK/T (CD3+/CD56+) 및 NK(CD3-/CD56+) 세포의 양도 또한 측정하였다. 추가의 분석에 의해, CD235/CD7, CD144+/Dll4+ 및 Flk-1+/CD34+의 발현은 분화 11일째에 감소하는 것으로 나타났다. 림프구 세포는 분화 11일째에 부재하기 때문에, 이것은 이들 마커의 발현의 특정 한계 수준이 DLL4의 존재하에 림프구 분화쪽으로 세포를 프라이밍하는데 필수적이라는 것을 시사할 수 있다.
T 세포 마커의 분석에 의해, MeCP2 WT 세포주가 아닌 MeCP2 KO 세포주는 림프구 분화에 대한 잠재성을 갖는 것으로 나타났다. MeCP2 WT 세포로부터의 9일째 HPC 선조는 본질적으로 CD3+CD8+ T 세포를 갖지 않았은 반면, 시험된 다른 HPC 선조는 CD3+CD8+ T 세포의 개체군으로 분화하였다. 따라서, MeCP2의 메틸 결합 도메인의 녹아웃은 T 세포 및 NK 세포를 생산하는 HPC 선조의 잠재성을 증진시켰다.
실시예 9 - HLA 초 공여체 세포주의 분화
상기에서 논의된 바와 같이, 공여체와 수용자 사이의 MHC 조직적합성은, 공여체 세포가 HLA 동형 접합성, 즉, 각 항원 제시 단백질에 대해 동일한 대립 유전자를 함유하는 경우, 현저하게 증가한다. 대부분의 개체들은 MHC 클래스 I 및 II 유전자에 대해 이형접합성이지만, 어떤 개체들은 이러한 유전자들에 대해 동형 접합성이다. 이러한 동형 접합성 개체들은 초 공여체의 역할을 할 수 있으며, 이들의 세포로부터 생산된 이식편은 당해 1배체형에 대해 동형 접합성 또는 이형 접합성인 모든 개체에 이식될 수 있다.
따라서, HLA 초 공여체 PSC 세포주의 T/NK 분화 잠재성을 결정하였다. 전이유전자 무함유 에피솜 방법을 사용하여 PBMC로부터 유도된 HLA 초 공여체 PSC 세포주 H, K, L 및 O의 T/NK 분화 잠재성을 평가하고, 레트로바이러스에 의해 재프로그래밍된 고도의 T/NK 생산성 1C TiPSC (예를 들어, 실시예 1~4에 기재)와 비교하였다. CD34+ T/NK 림프구 조혈 선조 세포 (HPC)로의 PSC 분화를 위해 확립된 프로토콜을 사용하여, 4개의 HLA 초 공여체 PSC 세포주 중 3개 (H, K 및 O)를 1C TiPSC 효율에 필적하게 CD34+ HPC로 분화시켰다 (도 23a). HLA 초 공여체 PSC 세포주로부터 유래된 CD34+ HPC의 T/NK 분화는 모든 시험된 HPC에서 비교적 높은 T/NK 림프구 잠재력 (1개의 투입 CD34+ HPC 당 100~200개의 T/NK)을 입증하였지만, 대부분 T 세포를 생산한 1C HPC와는 대조적으로, HLA 초 공여체 HPC는 T 세포보다 더 많은 NK 세포를 생산하였다. 그러나, 이러한 경향에도 불구하고, 시험된 4개의 HLA 초 공여체 PSC 세포주 중에서, 비교적 효율적인 T 세포 생산성 H 세포주를 확인하였다 (> 30 T/HPC) (도 23a).
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본 출원에서 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 개시 내용을 고려하여 과도한 실험없이 만들어지고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시형태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본 출원에 기재된 방법들, 이들의 단계들 또는 이들의 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 한 화학적 및 생리학적으로 관련되어 있는 특정 제제가 본 출원에서 기재된 제제를 대체할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
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Figure pct00007
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<110> CELLULAR DYNAMICS INTERNATIONAL, INC. <120> METHODS FOR DIRECTED DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS TO HLA HOMOZYGOUS IMMUNE CELLS <130> CDIN.P0073WO2 <140> PCT/US2017/055369 <141> 2017-10-05 <150> US 62/404,470 <151> 2016-10-05 <150> US 62/486,895 <151> 2017-04-18 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 489 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (50)..(52) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Met Val Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln 1 5 10 15 Asp Leu Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys 20 25 30 Lys Asp Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro 35 40 45 Ser Xaa Xaa Xaa Ala His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys 50 55 60 Ala Glu Thr Ser Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala 65 70 75 80 Ser Ala Ser Pro Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro 85 90 95 Met Tyr Asp Asp Pro Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys 100 105 110 Gln Arg Lys Ser Gly Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile 115 120 125 Asn Pro Gln Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr 130 135 140 Phe Glu Lys Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe 145 150 155 160 Thr Val Thr Gly Arg Gly Ser Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro 165 170 175 Lys Lys Pro Lys Ser Pro Lys Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly 180 185 190 Arg Pro Lys Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu 195 200 205 Gly Val Gln Val Lys Arg Val Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu 210 215 220 Val Lys Met Pro Phe Gln Thr Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ala Thr Thr Ser Thr Gln Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg 245 250 255 Lys Arg Lys Ala Glu Ala Asp Pro Gln Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly 260 265 270 Arg Lys Pro Gly Ser Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys 275 280 285 Lys Ala Val Lys Glu Ser Ser Ile Arg Ser Val Gln Glu Thr Val Leu 290 295 300 Pro Ile Lys Lys Arg Lys Thr Arg Glu Thr Val Ser Ile Glu 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Claims (95)

  1. 하기 단계를 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법:
    (a) 유도 만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC)를 수득하는 단계로서, 상기 iPSC가 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군으로부터 재프로그래밍되는 단계;
    (b) 상기 iPSC를 조혈 전구 세포 (hematopoietic precursor cell: HPC)로 분화시키는 단계; 및
    (c) 면역 세포 분화를 촉진시키는 조건하에 상기 HPC를 배양하여 HLA 동형 접합 면역 세포를 생산하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포가 유전자 좌위 대립 유전자 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 중 1종 이상에 대해 동형 접합성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포가 유전자 좌위 대립 유전자 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 중 2종에 대해 동형 접합성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포가 HLA-A 및 HLA-B에 대해 동형 접합성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포가 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C에 대해 동형 접합성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 림프구 세포인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 림프구 세포가 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 골수 세포인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 골수 세포가 수지상 세포인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군이 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군이 선조 혈액 세포, 말초 혈액 단핵 세포 또는 림프아구 세포로서 추가로 정의되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군이 사람인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군이 말초 혈액, 제대 혈액 또는 림프구 조직으로부터 단리되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 림프구 조직이 골수, 림프절 또는 태아 간을 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군이 T 세포를 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 T 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, T 헬퍼 1 (TH1) 세포, T 헬퍼 2 (TH2) 세포, TH17 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 미경험 (naive) T 세포, 기억 T 세포 또는 감마 델타 T 세포인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍이 재프로그래밍 인자를 상기 HLA 동형 접합 혈액 세포의 개체군 내에 도입하는 것을 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 재프로그래밍 인자가 바이러스 벡터, 에피솜 벡터 및 트랜스포손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재프로그래밍 벡터에 포함된 1종 이상의 발현 카세트에 의해 암호화되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터로서 추가로 정의되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 에피솜 벡터가 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus: EBV) 기반의 에피솜 벡터로서 추가로 정의되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍이 무피더 (feeder-free) 제한 조건하에 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 iPSC가 통합된 외인성 바이러스 요소를 본질적으로 포함하지 않는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 HPC가 1개의 HPC 당 적어도 20개의 HLA 동형 접합 면역 세포로 분화되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 HPC가 1개의 HPC 당 적어도 50개의 HLA 동형 접합 면역 세포로 분화되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 HPC가 1개의 HSC 당 적어도 100개의 HLA 동형 접합 면역 세포로 분화되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 iPSC를 HPC로 분화시키는 단계가 하기의 순차적인 단계를 포함하고, 복수의 상기 PSC가 HPC로 분화되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법:
    (a) 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 제1 제한 배지에서 상기 iPSC를 배양하는 단계;
    (b) IL-3, Flt-3 리간드 및 GM-CSF를 포함하지 않거나 본질적으로 포함하지 않는 제2 제한 배지에서 상기 세포를 항온처리하는 단계;
    (c) 복수의 상기 세포에서 분화를 확장시키거나 촉진시키기에 충분한 BMP-4, FGF-2 및 VEGF를 포함하는 제3 제한 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
    (d) 복수의 상기 세포에서 분화를 확장시키거나 촉진시키기에 충분한 IL-3 및 Flt-3 리간드를 포함하는 제4 제한 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계.
  27. 제26항에 있어서, 상기 제2 제한 배지가 블레비스타틴 및/또는 락 억제제 (Rock inhibitor)를 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제2 제한 배지가 GSK3 억제제를 추가로 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 제2 제한 배지가 BMP-4, VEGF 및 FGF-2를 추가로 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 세포가 (b) 단계 이전에 개별화되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  32. 제31항에 있어서, (b) 내지 (d) 단계가 아민-코팅된 배양 플레이트를 사용하여 수행되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  33. 제27항에 있어서, 상기 제2 제한 배지가 VEGF 및 FGF-2를 추가로 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  34. 제26항에 있어서, 상기 제4 제한 배지가 IL-3, IL-6, SCF, TPO 및 BMP-4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 사이토카인을 추가로 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  35. 제26항에 있어서, 상기 제4 제한 배지가 헤파린을 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  36. 제26항에 있어서, 상기 방법이 5% 미만의 산소의 대기압에서 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  37. 제26항에 있어서, 상기 HPC가 CD34를 발현하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  38. 제26항에 있어서, 상기 HPC가 CD43, CD34, CD31, CD41, CD235 및 CD45로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2종의 마커를 발현하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  39. 제1항에 있어서, 면역 세포 분화를 촉진시키는 조건이 림프구 분화를 촉진시키는 조건으로서 추가로 제한되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  40. 제39항에 있어서, CD34 및 CD43을 발현하는 HPC가 림프구 분화를 촉진시키는 조건하에 배양되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  41. 제1항에 있어서, 림프구 분화를 촉진시키기 위해 상기 세포를 배양하는 단계가 하기 단계를 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법:
    (i) 매트릭스 및 노치 리간드 (Notch ligand)로 코팅된 표면상의 제한 배지에서 HPC를 배양하는 단계로서, 상기 HPC가 CD34, CD43, CD7, DLL4, CD144 및 CD235로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 세포 표면 마커를 발현하는 단계; 및
    (ii) 1종 이상의 사이토카인의 존재하에 상기 배양을 유지하여 림프구 세포를 생산하는 단계.
  42. 제41항에 있어서, 상기 매트릭스가 세포외 매트릭스 단백질인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 HPC가 CD144, CD34, CD45 및/또는 CD7을 발현하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  44. 제41항에 있어서, (i) 단계가 1종 이상의 세포 표면 마커를 발현하는 HPC를 단리하는 것을 추가로 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  45. 제44항에 있어서, 단리가 자성-활성화 세포 분류 (magnetic-activated cell sorting: MACS)를 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  46. 제41항에 있어서, 상기 세포가 5% 미만의 산소의 대기압에서 배양되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  47. 제41항에 있어서, 상기 제한 배지가 아스코르브산 및/또는 니코틴아미드를 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 아스코르브산이 50 μM 내지 1 mM의 농도로 존재하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 아스코르브산이 90 μM 내지 100 μM의 농도로 존재하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 니코틴아미드가 0.1 mM 내지 5 mM의 농도로 존재하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  51. 제41항에 있어서, 상기 매트릭스가 레트로넥틴인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  52. 제41항에 있어서, 상기 노치 리간드가 DLL4인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 DLL4가 DLL4:Fc 키메라 단백질인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  54. 제41항에 있어서, 상기 1종 이상의 사이토카인이 SCF, TPO, IL-7 및 Flt-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  55. 제41항에 있어서, (ii) 단계가 1주 내지 6주인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  56. 제41항에 있어서, (ii) 단계가 2주 내지 4주인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  57. 제41항에 있어서, 상기 림프구 세포가 CD8, CD7, CD45, CD5, CD4 및 CD3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 마커를 발현하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 림프구 세포 중 5% 초과가 상기 마커 중 적어도 2종에 대해 양성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 림프구 세포 중 10% 초과가 상기 마커 중 적어도 2종에 대해 양성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  60. 제57항에 있어서, 상기 림프구 세포가 T 세포 및/또는 NK 세포인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 T 세포가 IL-2, IL-4, IL-10, IL-6, IL-17A 및 TNF를 생산하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 T 세포가 그랜자임 A, 그랜자임 B, 퍼포린, 그라눌리신, IFNγ, sFas 및 sFasL을 생산하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  63. 제1항에 있어서, 면역 세포 분화를 촉진시키는 조건이 골수 분화를 촉진시키는 조건으로서 추가로 제한되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  64. 제63항에 있어서, 골수 분화를 촉진시키는 조건하에 상기 HPC를 배양하는 단계가 하기 단계를 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법:
    (i) TPO, SCF 및 Flt-3 리간드를 포함하는 제1 제한 배지에서 상기 HPC를 배양하여 골수 세포의 개체군을 생산하는 단계; 및
    (ii) TPO, SCF 및 Flt-3 리간드를 본질적으로 포함하지 않는 제2 제한 배지에서 상기 세포를 항온처리하여 골수 세포의 농축 개체군을 생산하는 단계.
  65. 제64항에 있어서, 상기 제1 제한 배지가 IL-6 및 IL-3을 추가로 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 제2 제한 배지가 GM-CSF를 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  67. 제64항에 있어서, (i) 단계에서 생산된 상기 골수 세포의 개체군 중 적어도 50%가 CD45, CD43 및 CD31에 대해 양성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  68. 제67항에 있어서, CD45, CD43 및 CD31에 대해 양성인 골수 세포의 개체군이 CD34를 본질적으로 발현하지 않는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  69. 제64항에 있어서, 상기 골수 세포의 농축 개체군 중 적어도 80%가 CD43+, CD45+, CD31+ 및 CD34-인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  70. 제64항에 있어서, (ii) 단계가 5일 내지 10일 동안인, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  71. 제64항에 있어서, 상기 골수 세포의 농축 개체군을 수지상 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 골수 세포의 농축 개체군을 수지상 세포로 분화시키는 단계가 GM-CSF, IL-4 및 TNFα를 포함하는 제한 배지에서 상기 골수 세포의 농축 개체군을 배양하여 수지상 세포를 생산하는 것을 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 제한 배지가 지질단백질을 추가로 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 수지상 세포가 CD209, CD1a, HLA-DR, CD11c, CD14, CD83 및 CD86으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 마커를 발현하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  75. 제72항에 있어서, 상기 수지상 세포가 CD12를 본질적으로 발현하지 않는, HLA 동형 접합 면역 세포의 생산 방법.
  76. HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리로서, 각 라이브러리 구성원이 HLA-유형에 따라 특성화되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  77. 제76항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 초 공여체 (super donor)로부터 수득된 혈액 샘플로부터 유래되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  78. 제77항에 있어서, 상기 초 공여체가 사람인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  79. 제76항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 동종이계인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  80. 제76항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 자가인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  81. 제76항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 1종 이상의 HLA 클래스 I 유전자 및/또는 HLA 클래스 II 유전자에 대해 적어도 동형 접합성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  82. 제76항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 유전자 좌위 대립 유전자 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 중 1종 이상에 대해 동형 접합성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  83. 제82항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 유전자 좌위 대립 유전자 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 중 2종에 대해 동형 접합성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  84. 제83항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 HLA-A 및 HLA-B에 대해 동형 접합성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  85. 제82항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C에 대해 동형 접합성인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  86. 제76항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 림프구 세포인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  87. 제86항에 있어서, 상기 림프구 세포가 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  88. 제76항에 있어서, 상기 HLA 동형 접합 면역 세포가 골수 세포인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  89. 제88항에 있어서, 상기 골수 세포가 수지상 세포인, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  90. 제76항에 있어서, 각 라이브러리 구성원이 잠재적인 수용자와 HLA-일치되는, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  91. 제76항에 있어서, 상기 라이브러리가 냉동 보존된 HLA 동형 접합 면역 세포를 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  92. 제76항에 있어서, 상기 라이브러리가 적어도 15개의 라이브러리 구성원을 포함하고, 상기 구성원이 뚜렷한 HLA 1배체형을 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  93. 제92항에 있어서, 상기 라이브러리가 적어도 30개의 라이브러리 구성원을 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  94. 제92항에 있어서, 상기 라이브러리가 적어도 50개의 라이브러리 구성원을 포함하는, HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리.
  95. 하기 단계를 포함하는, 제76항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리를 생성하는 방법:
    (a) 사람 초 공여체로부터 수득된 복수의 혈액 샘플을 HLA-분류 (HLA-typing)하는 단계;
    (b) 복수의 상기 혈액 샘플로부터 유래된 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 단계;
    (c) 상기 iPSC를 HPC로 분화시키는 단계; 및
    (d) 면역 세포 분화를 촉진시키는 조건하에 상기 HPC를 배양하여 HLA 동형 접합 면역 세포의 라이브러리를 생성하는 단계.

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