CN114324126B - 一种改变早期b细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改变早期B细胞分化的方法。狼疮小鼠和患者的早期B细胞(ProB)(B220⁺IgM^‑CD43⁺c‑Kit⁺)的比例和数量均显著降低，并且其中双阴性B细胞(CD27^‑IgD^‑)比例升高。本发明通过siRNA干扰狼疮小鼠造血干细胞(HSC)的Ptpn22的表达后，狼疮小鼠的HSC分化为ProB细胞的比例显著升高，且其中的双阴性B细胞比例降低。通过慢病毒介导的正常B6小鼠HSC过表达Ptpn22后，HSC分化为ProB细胞的比例显著降低，且其中的双阴性B细胞比例升高。本发明通过纠正狼疮早期B细胞分化的异常，可作为狼疮治疗的潜在技术。

Description

一种改变早期B细胞分化的方法

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种改变早期B细胞分化的方法。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)属于自身免疫类疾病，主要特点是免疫耐受缺失和大量自身抗体的产生，并造成多个器官系统的损伤，常发生于20～40岁女性。大量研究显示遗传、内分泌、感染、免疫异常和一些环境因素与SLE的发病有关，但发病机制尚未完全清楚。考虑到自身抗体在狼疮发病中的重要作用，提示SLE患者B细胞异常激活和分化是发病的重要环节。

ProB细胞为早期B细胞，它功能上可以分为自身免疫相关和非自身免疫相关两大类。其中双阴性B细胞(DoubleNegativeBcell，DNBcell)，即同时缺乏IgD和记忆细胞标志物CD27的一群细胞，被认为属于自身免疫相关B细胞，双阴性B细胞在SLE中具有致病作用。研究发现SLE患者体内有一群CD11c和T-bet的高表达的B细胞，被称为DN2细胞，是年龄相关性B细胞(ABCs)的前体细胞，该细胞能够促进SLE患者双阴性B细胞的扩增。

Ptpn22为蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22，是SLE的易感基因，在自身免疫病发病中具有重要作用。Ptpn22主要在造血细胞中表达，位于1p染色体13.3–13.1上，编码淋巴细胞一种特异性的细胞内磷酸酶(Lyp)，它的N端为核定位信号(NLS)，其后是一个保守的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)结构域，位于PTP结构域之后的结构域为抑制磷酸酶活性的抑制结构域，除了四个富含脯氨酸的结构域外，但是C末端保守程度相对较低。Ptpn22可以调节TCR信号通路和BCR信号通路，但目前其对早期B细胞分化的调控作用仍不清楚。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种改变早期B细胞分化的方法，为SLE的治疗提供一种新的思路。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种改变早期B细胞分化的方法，包括以下步骤：

(1)制备小鼠骨髓单细胞悬液，在超净台内用PBS冲出小鼠骨髓细胞，用200目筛网过滤，经红细胞裂解后制成单细胞悬液；

(2)将步骤(1)的骨髓单细胞悬液用Sca-1⁺磁珠分选试剂盒(Stemcell公司)分选出HSC细胞；

(3)将步骤(2)分选出的HSC细胞接种于96孔板，每孔添加200μl含细胞因子IL7、SCF、Flt3L的siRNA干扰专用培养基，实验组加入Ptpn22 siRNA试剂，对照组加入对照siRNA试剂，放入培养箱，37℃培养3天；

(4)将步骤(2)分选出的HSC细胞接种于96孔板，每孔添加200μl含细胞因子IL7、SCF、Flt3L的IMDM培养基，实验组加入Ptpn22慢病毒，对照组加入对照慢病毒，放入培养箱，37℃培养3天；

(5)3天后收集步骤(3)和步骤(4)96孔板中细胞，分别用抗B220、IgM、CD43、c-kit、IgD、CD27流式抗体标记proB细胞和双阴性B细胞，用流式细胞仪检测proB细胞占总骨髓细胞的比例以及双阴性B细胞占proB细胞的比例，监测早期B细胞分化情况。

进一步地，所述步骤(1)中小鼠为雌性MRL/lpr狼疮鼠、Pristane诱导狼疮鼠、R848狼疮鼠和凋亡细胞狼疮鼠；在对照试验中，除了Pristane诱导狼疮鼠的对照鼠是Balb/c小鼠，其余均为B6小鼠。

进一步地，所述步骤(3)和步骤(4)中HSC细胞接种的接种密度为1*10^5个/孔。

进一步地，所述步骤(3)和步骤(4)中细胞因子包含5～20ng/ml IL7、10～40ng/mlSCF、40～120ng/ml Flt3L。

进一步地，所述步骤(3)siRNA干扰专用培养基和步骤(4)中的IMDM培养基中还包括2.0mM的L-谷氨酰胺。

进一步地，所述步骤(3)中Ptpn22 siRNA试剂用siRNA干扰专用培养基按1:100体积比进行稀释。

进一步地，所述步骤(4)中Ptpn22慢病毒用IMDM培养基按1:20体积比进行稀释。Ptpn22慢病毒的质粒构建方法为：小鼠Ptpn22基因的CDS序列(NM_008979)，经密码子优化后，合成并克隆至慢病毒载体plvx-IRES-zsGreen中，测序鉴定。

进一步地，所述步骤(5)中流式抗体用流式缓冲液按体积比1:200进行稀释，所述流式缓冲液为含1％(体积)FBS的PBS溶液。

进一步地，所述步骤(5)中proB细胞流式抗体标记为B220⁺IgM^-CD43⁺c-kit⁺。

进一步地，所述步骤(5)中双阴性B细胞流式抗体标记为CD27^-IgD^-。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供的一种改变早期B细胞分化的方法，克服了现有技术的不足，通过改变狼疮小鼠的proB细胞中Ptpn22的表达影响B细胞的早期分化，利用该方法对SLE中双阴性B细胞产生影响，从而影响自身抗体的产生。由于狼疮小鼠模型的B细胞分化异常是致病的关键阶段，与人类SLE发病机理类似，故可应用这种改变早期B细胞分化的方法，不仅可以用于对proB细胞及SLE的基础研究，也可以作为良好的免疫治疗靶点，为SLE的治疗提供一种新的思路。

附图说明

图1为MRL/lpr狼疮小鼠骨髓中早期B细胞proB细胞的比例及绝对数(A为比例；B为绝对数)；

图2为Pristane诱导狼疮小鼠骨髓中早期B细胞proB细胞的比例；

图3为R848诱导狼疮小鼠骨髓中早期B细胞proB细胞的比例；

图4为凋亡细胞诱导狼疮小鼠骨髓中早期B细胞proB细胞的比例；

图5为MRL/lpr和Pristane诱导狼疮小鼠proB细胞中Ptpn22的表达(A为MRL/lpr狼疮小鼠，B为Pristane狼疮小鼠)；

图6为沉默MRL/lpr狼疮小鼠的Ptpn22后proB细胞及其中双阴性B细胞的比例(A为proB细胞的比例，B为双阴性B细胞的比例)；

图7为过表达B6小鼠的Ptpn22后proB细胞及其中双阴性B细胞的比例(A为proB细胞的比例，B为双阴性B细胞的比例)；

图8为SLE患者骨髓中早期B细胞proB细胞的比例，其中，A为正常对照骨髓早期B细胞proB的流式圈门，B为SLE患者早期B细胞proB的流式圈门；C为正常对照与SLE患者骨髓中早期B细胞proB的比例比较。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

小鼠骨髓细胞制备

1.所用设备，材料，试剂

超净工作台、离心机、高压蒸汽灭菌锅、离心管、吸管、流式抗体、流式细胞仪。

2.实验步骤

(1)用颈椎脱臼法处死雌性MRL/lpr狼疮鼠、Pristane诱导狼疮鼠、R848诱导狼疮鼠和凋亡细胞诱导狼疮鼠与其同周龄的对照小鼠。

(2)取小鼠股骨，用剪刀剪去股骨两端，用1ml注射器吸入PBS冲出骨髓。

(3)200目筛网过滤，1800rpm/min，离心5min。

(4)弃上清，加入2ml红细胞裂解液，混匀，室温静置3min，再加入PBS补齐至10ml，1800rpm/min，离心5min。

(5)弃上清，加入10mlPBS重悬，用细胞计数仪计数。

(6)标记proB细胞，加入抗小鼠B220-BV510(1:200稀释)、抗小鼠IgM-PE/Cyanine7(1:200稀释)、抗小鼠CD43-FITC(1:200稀释)、抗小鼠c-kit-BV421(1:200稀释)抗体，避光4℃孵育30min。

(7)每管加入2mlPBS，1800rpm/min，离心5min弃上清。

(8)每管用200μlPBS重悬，流式细胞分选仪检测总proB的比例以及绝对数并且分选出proB细胞。

MRL/lpr狼疮鼠骨髓中早期B细胞proB细胞的比例及绝对数如图1所示，Pristane狼疮鼠、R848狼疮鼠、凋亡细胞狼疮鼠中早期B细胞proB细胞的比例如图2-4所示。

实施例2

分选小鼠骨髓HSC细胞

1.所有设备，材料，试剂

超净工作台、离心机、高压蒸汽灭菌锅、离心管、吸管、磁力架、Sca-1⁺磁珠分选试剂盒(Stemcell公司)。

2.实验步骤

(1)将实施例1制备骨髓细胞1800rpm/min,离心5min，用0.1ml磁珠buffer重悬细胞于无菌流式管中。

(2)加入Sca-1⁺磁珠分选试剂盒内的Labeling Reagent 50μl/ml于样品中。混匀，常温避光15min。

(3)再加入Sca-1⁺磁珠分选试剂盒内Selection Cocktail 70μl/ml于样品中。混匀，常温避光15min。

(4)将Sca-1⁺磁珠分选试剂盒内Rapid Spheres涡旋混匀。加入50μl/ml于步骤(3)得到样品中。混匀，常温避光10min。

(5)用磁珠buffer补齐至2ml，将流式管放到磁力架上静置5min，弃去上清。

(6)重复(5)3-4次，将细胞离心1800rpm/min，5min，即为HSC细胞，用PBS重悬后用计数板计数。

实施例3

qRT-PCR检测狼疮小鼠proB细胞中Ptpn22的表达

1.所有设备，材料，试剂

PCR仪、单细胞序列特异性扩增试剂盒(诺唯赞公司)、SYBR Green Master Mix(High ROX Premixed)(诺唯赞公司)、PCR板。

2.实验步骤

(1)用诺唯赞Single Cell Sequence Specific Amplification试剂盒进行细胞序列特异性扩增。将不同待测基因的扩增引物进行混合，制作成Assay Pool(各引物的终浓度为0.1μM)。

(2)在Nuclease-free离心管中配置如下表1RT-PreAmp Master Mix。

表1 RT-PreAmp Master Mix

试剂	体积
		2×Reaction	2.5μl
0.1uMAssayPool	0.5μl
		RT/Taqenzyme	0.1μl
NucleasefreeddH2O	1.9μl
		total	5.0μl

(3)冰上放置待用，加入实施例1制备的1000个MRL/lpr和Pristane狼疮小鼠proB细胞，盖紧管盖，立即置于-80℃冰箱2min，3000rpm离心2min，立即放入PCR仪进行如表2反应：

表2单细胞序列特异性扩增体系

(4)反应结束后，每管加入20μlNucleasefreeddH₂O(1:5稀释)，涡旋混匀，3000rpm离心2min。

(5)冰上融化SYBR Green Real-time PCR Master Mix PCR试剂，以下操作都在冰上进行。

(6)反应体系：PCR反应体系总体积10μl，按表3配置PCR反应液。使用ABI公司StepOnePlus实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR反应，各基因每个样本做2个复孔。

表3 qRT-PCR反应体系

(7)反应条件：第一步(预变性)：95℃5分钟；第二步：变性、退火及延伸，依次是95℃5秒，60℃30秒，设置40个循环；第三步：熔解曲线。每个样本设置2个复孔，扩增结束后导出原始数据及表格。

(8)结果分析：计算各样本循环阈值(cycle threshold，Ct)平均值，确认扩增曲线、熔解曲线正确，复孔的CV值不大于10％，以GAPDH作为内参，将目的基因Ct值减去GAPDHCt值作为△Ct值。计算标准化后的2^-△△Ct值，表示为目的基因mRNA的相对表达含量。

MRL/lpr和Pristane狼疮小鼠proB细胞中Ptpn22的表达如图5所示。

实施例4

沉默Ptpn22的实验

1.所有设备，材料，试剂

超净工作台、离心机、高压蒸汽灭菌锅、离心管、吸管、96孔板、siRNA干扰专用培养基、流式抗体、流式细胞仪。

2.实验步骤

(1)用加入10ng/ml IL7、40ng/ml SCF、80ng/ml Flt3L的siRNA干扰专用培养基重悬实施例2得到的MRL/lpr狼疮小鼠的HSC细胞。

(2)将一个样本均分为两个孔种于96孔U底细胞培养板，每孔200μl培养基。其中一组为沉默组，加入2μl Ptpn22 siRNA试剂。另一组为对照组，加入对照siRNA。

(3)放入培养箱，37℃培养3天。

(4)1800rpm/min，5min，4℃离心，弃上清。

(5)标proB细胞，加入小鼠anti-B220-BV510(1:200稀释)、anti-IgM-PE/Cyanine7(1:200稀释)、anti-CD43-FITC(1:200稀释)、anti-c-kit-BV421(1:200稀释)、anti-IgD-BV711(1:200稀释)、anti-CD27-BV650(1:200稀释)。抗体用PBS稀释，每管加入稀释后的抗体200μl，避光4℃孵育30min。

(6)每管加入2mlPBS，1800r/min，离心5min弃上清。

(7)每管用200μlPBS重悬，流式细胞仪检测总proB的比例以及双阴性B细胞占proB比值。

沉默MRL/lpr狼疮小鼠的Ptpn22后proB细胞及其中双阴性B细胞的比例如图6所示。

实施例5

过表达Ptpn22的实验

1.所有设备，材料，试剂

超净工作台、离心机、高压蒸汽灭菌锅、离心管、吸管、96孔板、IMDM培养基、流式抗体、流式细胞仪。

2.实验步骤

(1)用加入10ng/ml IL7、40ng/ml SCF、80ng/ml Flt3L的IMDM培养基重悬实施例2得到的B6小鼠HSC细胞。

(2)将一个样本均分为两个孔种于96孔U底细胞培养板，每孔200μl培养基。其中一组为过表达组，加入10μl Ptpn22慢病毒。另一组为对照组，不作处理。

(3)放入孵箱培养3天。

(4)1800rpm/min，5min，4℃离心，弃上清。

(5)标记proB细胞，加入小鼠anti-B220-BV510(1:200稀释)、anti-IgM-PE/Cyanine7(1:200稀释)、anti-CD43-FITC(1:200稀释)、anti-c-kit-BV421(1:200稀释)、anti-IgD-BV711(1:200稀释)、anti-CD27-BV650(1:200稀释)。抗体用PBS稀释，每管加入稀释后的抗体200μl，避光4℃孵育30min。

(6)每管加入2mlPBS，1800rpm/min，离心5min弃上清。

(7)每管用200μlPBS重悬，流式细胞仪检测总proB的比例以及双阴性B细胞占proB比值。

过表达B6小鼠的Ptpn22后proB细胞及其中双阴性B细胞的比例如图7所示。

实施例6

人骨髓早期B细胞检测的实验

1.所用设备，材料，试剂

超净工作台、离心机、高压蒸汽灭菌锅、离心管、吸管、流式抗体、流式细胞仪。

2.实验步骤

(1)将骨髓标本转移到15ml离心管中，2000rpm，离心8min。

(2)最上层吸出至T25细胞培养瓶内，加入5ml DMEM/F12培养基，放入培养箱内培养。

(3)骨髓上清按1ml分装到1.5EP管内。

(4)加入10倍体积的红细胞裂解液，室温放置5min，2000rpm，离心5min。

(5)弃上清，沉淀用40ml PBS重悬，如果有絮状沉淀，过400目滤网。

(6)1800rpm，离心5min，弃上清，如果红细胞仍较多，再加20ml红细胞裂解液，室温放置5min后，加20ml PBS。

(7)1800rpm，离心5min，弃上清，10ml PBS重悬，取10μl计数。

(8)标记proB细胞，加入抗人anti-CD19-(1:200稀释)、anti-CD34(1:200稀释)、anti-CD10(1:100稀释)、anti-IgM-(1:200稀释)。抗体用PBS稀释，每管加入稀释后的抗体200μl，避光4℃孵育30min。

(9)每管加入2mlPBS，1800r/min，离心5min弃上清。

(10)每管用200μl PBS重悬，流式细胞仪检测总proB的比例，CD34+IgM-CD19+的细胞为proB细胞。

SLE患者骨髓中早期B细胞proB细胞的比例如图8所示。

本发明运用多种狼疮小鼠模型进行研究，发现狼疮小鼠中早期B细胞和Ptpn22的基因表达均存在异常。在MRL/lpr狼疮小鼠、Pristane诱导狼疮小鼠、R848诱导狼疮小鼠和凋亡细胞诱导的狼疮小鼠模型中运用流式检测了早期B细胞的比例和绝对数，均发现狼疮小鼠proB细胞的比例和绝对数均显著降低。同样的，在SLE患者骨髓中，早期B细胞proB的比例也显著降低。运用RT-qPCR检测MRL/lpr狼疮小鼠和Pristane诱导狼疮小鼠proB细胞中Ptpn22基因的表达，发现狼疮小鼠中Ptpn22的表达均升高。沉默Ptpn22后，狼疮小鼠中的proB细胞升高，而双阴性B细胞占proB的比例降低；过表达Ptpn22后，B6小鼠中的proB细胞表达降低，而双阴性B细胞占proB的比例升高。揭示SLE中Ptpn22可以促进其中双阴性B细胞的产生，提示Ptpn22具有通过改变早期B细胞分化，是治疗SLE的潜在靶点之一。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种改变ProB细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备正常B6或狼疮小鼠骨髓单细胞悬液；

（2）将步骤（1）的骨髓单细胞悬液用Sca-1⁺磁珠分选试剂盒分选出HSC细胞；

（3）将步骤（2）分选出的狼疮小鼠HSC细胞接种于96孔板，每孔添加200μl含细胞因子IL7、SCF、Flt3L的siRNA干扰专用培养基，加入Ptpn22 siRNA试剂，放入培养箱，37℃培养3天；

（4）将步骤（2）分选出的正常B6小鼠HSC细胞接种于96孔板，每孔添加200μl含细胞因子IL7、SCF、Flt3L的IMDM培养基，加入Ptpn22慢病毒，放入培养箱，37℃培养3天；

（5）3天后收集步骤（3）和步骤（4）96孔板中细胞，分别用抗B220、IgM、CD43、c-kit、IgD、CD27流式抗体标记proB细胞和双阴性B细胞，用流式细胞仪检测proB细胞占总骨髓细胞的比例以及双阴性B细胞占proB细胞的比例；

所述步骤（1）中狼疮小鼠包括雌性MRL/lpr狼疮鼠、Pristane诱导狼疮鼠、R848诱导狼疮鼠和凋亡细胞诱导的狼疮鼠；

所述步骤（3）和步骤（4）中细胞因子包含5~20ng/ml IL7、10~40ng/ml SCF、40~120ng/ml Flt3L；

所述步骤（5）中proB细胞流式抗体标记为B220⁺IgM^-CD43⁺c-kit⁺；

所述步骤（5）中双阴性B细胞流式抗体标记为CD27^-IgD^-。

2.根据权利要求1所述的一种改变ProB细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中HSC细胞接种的接种密度为1×10⁵个/孔。

3.根据权利要求1所述的一种改变ProB细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤（3）和（4）中的siRNA干扰专用培养基和IMDM培养基中还包括2.0mM的L-谷氨酰胺。

4.根据权利要求1所述的一种改变ProB细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤（3）中Ptpn22 siRNA试剂用siRNA干扰专用培养基按1:100体积比进行稀释。

5.根据权利要求1所述的一种改变ProB细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤（4）中Ptpn22慢病毒用IMDM培养基按1:20体积比进行稀释。

6.根据权利要求1所述的一种改变ProB细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤（5）中流式抗体用流式缓冲液按体积比1:200进行稀释，所述流式缓冲液为含体积比1%FBS的PBS溶液。