IT201800005182A1

IT201800005182A1 - siRNA contro la variante C1858T del gene PTPN22

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Publication number: IT201800005182A1
Application number: IT102018000005182A
Authority: IT
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2019-11-09
Also published as: EP3790973A1; US20210238607A1; WO2019215772A1

Description

RNA breve interferente della variante C1858T del gene

PTPN22

La presente invenzione riguarda RNA breve interferente della variante C1858T del gene PTPN22. In particolare, la presente invenzione riguarda un RNA breve interferente, rappresentato da doppiette (duplex) di RNA breve interferente (siRNA) della variante C1858T PTPN22, e i loro impieghi in campo medico nella prevenzione e trattamento delle malattie autoimmuni.

Le malattie autoimmuni sono un gruppo eterogeneo di malattie che colpiscono vari organi o sistemi, la cui incidenza è in aumento nel mondo. Esse derivano da una complessa interazione di fattori poligenetici ed ambientali fortemente influenzata da eventi posttraslazionali e post-trascrizionali e mutazioni somatiche. Con l’avvento degli studi di collegamento genomico ampio, di associazione di geni candidati e di associazione estesa all’intero genoma, in aggiunta all’HLA, diversi polimorfismi nucleotidici singoli (SNPs) furono scoperti alla base della patogenesi della autoimmunità [riportato (rip) in Gianchecchi E, Palombi M Fierabracci A, Autoimmun Rev 2013; 12, 717-25]. Studi sperimentali dimostrano che l’autoimmunità deriva dallo sfuggire delle cellule T autoreattive antigenespecifiche nella periferia dal timo in età perinatale. Questo è causato dal fallimento nella promiscua espressione timica di antigeni organo-specifici nello stesso organo. Tra i componenti cellulari partecipanti, le cellule T aiutanti (Th), che sono sfuggite ai meccanismi di tolleranza del ”self”, promuovono l’infiammazione e forniscono aiuto alle cellule B autoreattive mediato da citochine proinfiammatorie. La attivazione, espansione e successiva differenziazione delle cellule B mature in plasma cellule che producono autoanticorpi ulteriormente contribuisce al danno tissutale. Le cellule Th, quando incontrano l’antigene del se stesso o crossreattivo, si attivano, espandono e differenziano in sottotipi Th1, Th2, cellule T regolatorie (Treg) e cellule Tr1. Le cellule Th1 e Th2 secernono due differenti vie di citochine reciprocamente inibitorie. Le cellule Th1 secernono interleuchina 2 (IL-2) ed interferone gamma (IFN-ɣ), mentre le cellule Th2 secernono interleuchina 4 (IL-4), interleuchina 5 (IL-5) ed interleuchina 10 (IL-10).

E’ noto che il diabete mellito insulino-dipendente (diabete di Tipo 1, DT1) (Atkinson 2014) e la malattia autoimmune tiroidea (MAT), che comprende la malattia di Graves e la tiroidite di Hashimoto (HT) (McLachlan 2014) sono malattie organo-specifiche mediate dalla cellula T, con infiltrazione T cellulare che porta a disfunzione dell’organo bersaglio, ossia l’isola pancreatica nel DT1 e la tiroide nella MAT. La loro associazione è nota come sindrome polighiandolare autoimmune di Tipo 3 variante (SPA3v) (Hughes 2016). In aggiunta alla presenza di anticorpi contro la cellula dell’isola (Antic) (ICA), o Antic verso la decarbossilasi dell’acido glutammico (GADA), verso il secondo antigene dell’isola (Antic anti IA-2) e verso l’insulina (IAA), fino al 20% dei pazienti con DT1 hanno anticorpi circolanti contro la tiroide (AAT) con il 50% di questi che progrediscono verso la MAT clinica. Il DT1 è il terzo più comune disordine metabolico nel mondo dopo l’obesità e le malattie tiroidee. Studi epidemiologici recenti stimano che la incidenza della autoimmunità e, in particolare del DT1, è aumentata nei passati 30-40 anni nel mondo in bambini al di sotto dei 15 anni di età (0.1/100.000 in Cina e 40.9/100.000 in Finlandia); l’incremento annuale medio è 2.8% nel mondo e 3.2% in Europa (Harron 2011). Clinicamente, il DT1 si presenta con correlate conseguenze metaboliche, vascolari e neuropatiche e, sin dall’esordio di malattia, se non è prontamente trattato con insulina, possono insorgere manifestazioni cliniche severe come chetoacidosi, coma potenziale e morte. Nella tiroidite di Hashimoto (HT), il trattamento con L-T4 (levo tiroxina) è anche somministrato per evitare i sintomi metabolici aggiuntivi di ipotiroidismo che può portare a disfunzione cardiaca, coma mixedematoso e, soprattutto nell’infanzia, ritardo di crescita e mentale. Se l’unico trattamento attuale delle malattie autoimmuni endocrine è la somministrazione sostitutiva dell’ormone deficitario, soprattutto nel caso del DT1, il trattamento con insulina somministrata in multiple iniezioni giornaliere non riprodurrà mai il ritmo circadiano fisiologico della molecola. Il trattamento sempre solleva il paziente da un certo rischio di morte ma non cura la malattia autoimmune. Un significativo avanzamento rispetto allo stato dell’arte è pertanto l’effetto che qualsiasi trattamento immunoterapeutico può avere nel bloccare i meccanismi patogenetici immunologici, preservando pertanto le residue cellule producenti ormone. Questo potrebbe comportare un significativo miglioramento del trattamento. In particolare, riguardo al trattamento insulinico, la strategia immunoterapeutica associata può aiutare a migliorare la stabilità del decorso metabolico della malattia evitando la tipica ‘instabilità’ che richiede aggiustamenti della somministrazione giornaliera di insulina e monitoraggio continuo del glucosio, di conseguenza prevenendo o riducendo le complicazioni a lungo termine.

Diversi approcci immunoterapeutici sono stati sperimentati nel DT1. Comunque, la maggior parte degli studi clinici sia usando terapie antigene-specifiche, bersagli sui linfociti T e B, approcci antiinfiammatori, citochine o cellule staminali sono falliti nel raggiungere la indipendenza da insulina nei pazienti con DT1. Inoltre qualora i risultati degli studi di Fase I e II erano promettenti, studi estesi randomizzati controllati non hanno raggiunto gli obiettivi primari (Woittiez 2015). La ragione può essere dovuta al contributo di fattori ambientali, dosaggio, tempo/durata del trattamento ma anche la eterogeneità di malattia dal momento che diverse variazioni geniche sono presenti sia nella MAT che nel DT1 (Wiebolt 2010) e potrebbero influenzare la loro eziopatogenesi. Al riguardo diversi studi di immunogenetica sulla suscettibilità al DT1 hanno stabilito un ruolo rilevante dei geni sia del sistema maggiore di istocompatibilità (MHC) come anche di geni non-MHC, tra i quali il secondo comprende INS-VNTR, CTLA-4, SUMO-4 e PTPN22 (Bottini 2004, rip in Gianchecchi 2013).

Sulla base di quanto sopra, è evidente la necessità di fornire nuovi metodi terapeutici e composti per il trattamento delle malattie autoimmuni che consentano di superare gli svantaggi delle terapie note.

Al riguardo, è noto che la mutazione C1858T di PTPN22 (gene della proteina tirosinofosfatasica N22) che cambia il residuo aminoacidico in posizione 620 da Arg ® a Trp (W) (R620W) nella proteina tirosino fosfatasica linfoide Lyp (rip in Gianchecchi 2013, Perri 2017), ha un potenziale ruolo patofisiologico.

R620W è fortemente associata con il DT1 nell’uomo aumentando il rischio di sviluppare la malattia di 2-4 volte (rip in Perri 2017). E’ anche noto che, in aggiunta al DT1 e alla SPA3v, la variante di PTPN22 è stata anche riscontrata in associazione con malattie neurologiche come la miastenia grave (Vandiedonck 2006) e la sclerosi multipla (Sadovnick 2012). Inoltre, per quanto riguarda condizioni autoimmuni non-organo specifiche, lo stesso polimorfismo era stato trovato associato con il lupus eritematoso sistemico (SLE) (Orozco 2005), la granulomatosi di Wegener (Jagello 2005) e la artrite reumatoide (RA) (Hinks 2005) nella popolazione Caucasica. In particolare, per quanto riguarda la RA, l’associazione con la variante genica PTPN22 era la più forte tra i geni non-HLA, seconda solo a MHC. La correlazione tra la variante R620W e l’esordio di RA (Lee 2009) e T1D non è riportata nelle popolazioni Asiatiche. L’allele è anche stato trovato in associazione con la sclerosi sistemica, in particolare nei pazienti positivi agli anticorpi antitopoisomerasi 1 (Topo1) e anti-centromero (ACA) (rip in Gourh 2006).

Nell’approfondire i meccanismi, Lyp è un regolatore negativo del segnale del recettore antigenico della cellula T (TCR) agendo in interazione con la chinasi Src C-terminale (CSK). L’effetto della variante Lyp è ancora dibattuto in letteratura. Molti studi sono a favore di un modello ‘guadagno di funzione’ dal momento che la fosfatasi variante causa una regolazione più potente dell’attivazione della cellula T (Vang 2005) con la paradossale riduzione dell’attivazione della cellula T. I linfociti T periferici di pazienti con DT1 sono di fatto iporesponsivi alla stimolazione in vitro con anticorpi monoclonali (mAbs) contro CD3 (anti-CD3) (Vang 2005). La variante Lyp potrebbe produrre sottili difetti di segnale TCR e influenzare l’instaurarsi della tolleranza immunologica a livello del timo in età prenatale e l’evasione dei linfociti T autoreattivi, attraverso la selezione positiva di cellule T autoimmuni altrimenti selezionate negativamente. Inoltre alterata omeostasi delle cellule B e risposta mediata dal recettore Toll-Like (TLR) 9 sono state osservate in pazienti diabetici portatori della variante allelica C1858T di PTPN22 (rip in (Gianchecchi 2013, Gianchecchi 2014)), confermando la sua influenza sulle risposte immunitarie sia innate che adattative. Inoltre, modelli animali forniscono prova che la variante altera la tolleranza della cellula B enfatizzando i programmi che agiscono su BCR (recettore della cellula B) e su corecettori attraverso lo sviluppo della cellula B (Metzel 2017). Nel topo i macrofagi 620Arg>Trp sono più attivi nella stimolazione della cellula T con aumentata fagocitosi, più alta espressione delle molecole MHC di classe II (MHCII) che presentano l’antigene e ligandi di coattivazione B7 (Li 2017). Recenti studi hanno evidenziato l’effetto della variante sulle cellule T regolatorie (Treg). Al riguardo Maine et al (2012) (Maine 2012) hanno dimostrato in topi con eliminazione genica (knockout) alterazioni delle Treg periferiche aumentando la loro selezione timica. Altri studi (Wu 2014, Zheng 2013) riportano inoltre un modello ‘guadagno di funzione’ della selezione delle Treg sebbene la eliminazione di PTPN22 di fatto abbia causato ridotto segnale tramite TCR. Complessivamente, possibili effetti su sottogruppi di cellule T diversi dalle Treg o effetti addizionali sul sistema immunitario devono essere considerati (Sharp 2015). Inoltre, nel modello ‘guadagno di funzione’, un aumento nell’attività della cellula T potrebbe accadere attraverso la perdita della tolleranza a se stesso (self) delle cellule T periferiche. Il modello ‘perdita di funzione’ implica che una degradazione di Lyp sia associata con iper responsività di linfociti e cellule dendritiche (rip in Perri 2017). Nell’ultimo modello, putativamente la perdita della tolleranza a se stesso (self) si verifica precocemente nella vita della cellula T per essere successivamente attivata da autoantigeni (Sharp 2015). Qualunque modello sia adottato a supporto dell’effetto patogenico della variante questo rimane un bersaglio valido per un trattamento ‘su misura’ attraverso la sua sotto-modulazione/eliminazione in pazienti con DT1 e APS3v poiché ripristinerebbe comunque l’effetto netto dell’allele normale.

E’ noto che sebbene alcuni soggetti con diabete di tipo 1 perdano completamente la funzione della cellula β subito dopo la diagnosi, altri conservano una funzione parziale nella patologia a lungo termine (Scholin 2004). Questo suggerisce che nel DT1, il naturale corso della distruzione della cellula β può variare considerevolmente; comunque, la variabilità genetica può influenzare le caratteristiche della patologia e il corso della patologia. Indagini di metanalisi vengono in supporto al fatto che nella popolazione Caucasica la variante PTPN22 è un notevole fattore di rischio per DT1 con i maschi più suscettibili alla patologia rispetto alle femmine. Inoltre, la variante è significativamente associata con il DT1 anche in una popolazione a ridotta prevalenza. La variante non solo conferisce predisposizione per DT1 soprattutto in popolazioni Europee e Americane ma può anche rappresentare un fattore prognostico. L’impatto della mutazione C1858T PTPN22 nella variabilità della patologia è stata valutata studiando la sua associazione con l’età di esordio, i livelli di autoanticorpi, la funzione residua della cellula β e il controllo metabolico nei pazienti.

Andersen et al (2013) enfatizza una correlazione tra la presenza della variante con un esordio più precoce di malattia, o un più rapido declino della riserva della cellula β dopo l’attacco autoimmune iniziale. Specialmente nelle pazienti di sesso femminile la variante C1858T era associata con un più precoce esordio della patologia (Nielsen 2007) e un’aumentata frequenza di anticorpi anti GAD (GADA) e tireoglobulina (Tg) (Mainardi-Novo 2013). A tal proposito, aumentati livelli di GADA sono stati trovati in pazienti con una più lunga durata della patologia (Petrone 2008) o una persistenza di GADA a lungo termine (Chelala 2007) o con una positività alla GAD nei pazienti con DT1 (Maziarz 2010). Ulteriori studi suggeriscono che la variante può influenzare la progressione da diabete preclinico a diabete in fase clinica negli individui con anticorpi circolanti contro la cellula dell’isola (Hermann 2006). Inoltre, l’allele variante è correlato con un controllo metabolico peggiore nel diabete a lungo termine (Petrone 2008). I livelli di peptide-c e di HbA1C a digiuno sono significativamente più elevati in portatori della variante che negli omozigoti per C1858 dalla diagnosi fino a 12 mesi di terapia insulinica intensiva, indipendentemente dall’età di esordio, sesso e gruppi di rischio HLA. La tendenza dei livelli di peptide-c e HbA1C nel periodo di 12 mesi non ha differito significativamente tra i portatori e i non-portatori della variante e la dose di insulina era simile. Questo ha portato a ipotizzare che i portatori della variante sperimentavano un danno delle cellule beta più distruttivo e mantenevano livelli di peptide-c significativamente più bassi rispetto agli omozigoti C1858 entro il primo anno. Nello studio di Nielsen et al (2011) livelli più alti di proinsulina erano anche riportati oltre 12 mesi con nessun effetto sui livelli di peptide-c dopo stimolo mentre un rapporto proinsulina/peptide-c più alto e nessuna differenza nella HbA1c aggiustata per dose di insulina. Tuttavia, la variante potrebbe influenzare l’interazione dei meccanismi dell’autoimmunità e lo sviluppo di risposte metaboliche compensatorie nel tempo (Blasetti 2017). Alla luce di quanto precede inibitori non competitivi ad alta affinità selettivi per Lyp erano stati progettati e mostravano attività nelle cellule T primarie (Stanford 2011, Vang 2011, He 2013) come approccio potenzialmente prezioso nell’autoimmunità. Le sfide in corso sono la selettività e la permeabilità cellulare di questi inibitori. In aggiunta, questi composti inibiscono totalmente la proteina Lyp e di conseguenza possono influenzare anche le funzioni desiderate della proteina non-variante (wild type).

In questo contesto, è stata recentemente dimostrata la possibilità di ridurre l’espressione del gene PTPN22 non-variante (wild type) nella linea cellulare linfoblastoide T umana Jurkat e nelle cellule mononucleate del sangue periferico di individui sani tramite somministrazione di doppiette di siRNA originali mediante formulazioni liposomiali (Perri 2017). Le formulazioni liposomiali erano già state utilizzate in studi clinici, per la loro minima tossicità e i loro profili di degradabilità (Opanasopit 2011, Liu 2015, Watt 2012, Dutta 2016, Joly 2011, Kudoh 2011, Petre 2007, Andreakos 2009). Specificamente, liposomi cationici composti da lipide naturale dimiristoil-sn-glicelo-fosfatidilcolina (DMPC) e un tensioattivo gemini cationico sintetico (2S,3S-2,3-dimetossi-1,4-bis (N-esadecil_N,N-dimetilammonio)-butano dibromide (1) o 2R,3S-2,3-dimetossi-1,4-bis (N-esadecil-N,N-dimetilammonio)-butano dibromide (2) (Bello 2006, Bombelli 2010, Bombelli 2005, Bombelli 2005BIS) erano stati impiegati per somministrare lipoplessi contro il gene PTPN22 non-variante nelle cellule T Jurkat e nei linfociti umani del sangue periferico di soggetti normali (Perri 2017).

L’effetto biologico della riduzione di PTPN22 era stato confermato in saggi funzionali (Perii 2017). La analisi di microscopia confocale ha mostrato che i lipoplessi erano rilevati sia in PBMC CD3+ che CD3-. Di conseguenza questo dimostra che le formulazioni liposomiali sono adeguate per trasfettare sia linfociti B che T. E’ stato osservato che colture di cellule T Jurkat o PBMC da donatori sani (Perri 2017) persino PBMC da pazienti con DT1 crioconservati dopo trasfezione con lipoplessi non rivelavano segni di tossicità come valutato da morfologia cellulare, viabilità, quantità e qualità dei pellets cellulari e quantificazione della concentrazione dell’estratto proteico al termine della procedura sperimentale. Tuttavia, siRNA verso PTPN22 non variante (wild type) non può essere usato in terapia, dato che silenzia il gene PTPN22 non-variante inibendo le sue funzioni benefiche.

In questo contesto, la presente invenzione fornisce una specifica sottoregolazione del bersaglio usando un nuovo filamento antisenso, complementare all’mRNA del gene della variante PTPN22, che ripristina l’attività netta dell’allele normale e la normale attività regolatoria di Lyp.

Più specificatamente, in accordo con la presente invenzione, è stata fornita una nuova doppietta di RNA interferente breve della variante C1858T PTPN22 (siRNA) che è in grado di sottoregolare specificatamente l’allele della variante PTPN22 senza silenziare l’allele PTPN22 non-variante (wild type). Di conseguenza, il siRNA della presente invenzione può essere usato vantaggiosamente nella prevenzione e nella terapia delle malattie autoimmuni che sono caratterizzate dalla variante PTPN22 senza compromettere le funzioni desiderate del gene nonvariante. In aggiunta, in accordo con la presente invenzione, la somministrazione del siRNA a PBMC di pazienti con diabete di tipo 1 è stata ottimizzata usando trasportatori liposomiali.

In particolare, la stabilità conformazionale, la dimensione e la polidisperisione di siRNA nei lipoplessi erano misurate tramite spettroscopia CD e DLS. L’internalizzazione dei lipoplessi e la valutazione della tossicità è stata valutata tramite microscopia confocale e analisi di citometria a flusso.

I PBMC sono stati efficientemente trasfettati da lipoplessi stabili e su misura. La morfologia dei PBMC non è stata influenzata. L’incorporazione dei lipoplessi è stata visualizzata in immunotipi del sangue periferico sia CD3+ che CD3- senza segni di tossicità, danno o apoptosi.

L’effetto della doppietta di siRNA sull’espressione di Lyp era stato valutato tramite PCR Real Time quantitativa. Il trattamento con complessi Liposoma/siRNA rivelava un significativo decremento nell’mRNA della variante PTPN22 bersaglio mediante Real-Time PCR quantitativa in un totale di 13 di 16 pazienti eterozigoti (approssimatamente 81.2% dei campioni analizzati) mentre non c’è stato nessuno effetto su i pazienti non-varianti (wild type) come atteso. E’ interessante notare che i risultati sono stati confermati dalla analisi con entrambi le sonde che individuano il contenuto di mRNA di PTPN22 bersaglio o unicamente di mRNA della variante T1858.

Saggi funzionali attraverso il coinvolgimento della via di segnalazione di TCR sono stati allestiti per valutare conseguenze biologiche della sottomodulazione della variante PTPN22, come conseguenza del ripristino dell’effetto netto dell’allele non-variante. Una ridotta produzione di IL-2 nei linfociti T primari da PBMC di pazienti eterozigoti per DT1 è stata osservata, rispetto a quelli di pazienti diabetici nonvarianti (wild type) a seguito del coinvolgimento del recettore della cellula T (TCR) (Figura 7). Negli esperimenti descritti nell’Esempio 1, il trattamento con lipoplessi in dosi di siRNA che vanno da 60 a 100pmols ha ripristinato negli eterozigoti, rispetto a pazienti diabetici non-varianti, i livelli di secrezione di IL-2 a seguito di stimolazione dei PBMC con anti-CD3/CD28 per 20 ore (Figura 8). Questo è stato verificato anche usando Lipo/siRNA 100pmols in un tempo prolungato di stimolazione anti- CD3/CD28 che è ideale per studiare l’immunomodulazione (Perri 2017).

I risultati dello studio mostrano che l’inibizione selettiva dell’allele variante di PTPN22 usando lipoplessi di doppiette siRNA può essere usata nel trattamento delle patologie autoimmuni.

Come menzionato prima, la variante PTPN22 era stata anche trovata associata con altre patologie, è quindi plausibile che i lipoplessi mirando alla variante PTPN22 possano trovare un’applicazione estesa in numerose condizioni autoimmuni. Per trattamento personalizzato, la funzionalizzazione dei lipoplessi con anticorpi monoclonali generati contro immunotipi peculiari ad esempio anticorpo anti-CD20 per mirare a linfociti B, soprattutto coinvolti in alcune malattie autoimmuni non-organo specifiche ad esempio. LES, può in aggiunta essere richiesta risparmiando nel contempo cellule regolatorie B tolerogeniche (Breg).

Pertanto, è oggetto della presente invenzione una doppietta di RNA breve interferente (siRNA) avente come bersaglio il polimorfismo a singolo nucleotide C1858T di PTPN22, detto RNA breve interferente comprendendo o essendo consistente nella sequenza 5’-AUGAUUCAGGUGUCCAUAC-3’ (SEQ ID NO:2) e nella sua sequenza complementare 5’-GUAUGGACACCUGAAUCAU-3’ (SEQ ID NO:1). SEQ ID NO:1 e 2 della doppietta di RNA breve interferente secondo la presente invenzione possono avere un dinucleotide al terminale 3’ in cui detto dinucleotide è scelto dal gruppo consistente in dTdT, dAdA, dGdG e dCdC. Il dinucleotide è aggiunto per aumentare la stabilità.

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, la doppietta di RNA breve interferente può essere somministrata tramite un trasportatore. Il trasportatore può essere un liposoma, come un liposoma cationico, un nano trasportatore, come nanoparticelle lipidiche-solide, o un liposoma PEGhilato. Le nanoparticelle solide-lipidiche sono sintetizzate tramite dispersione di liquido in acqua o soluzione acquosa di tensioattivo. Queste combinano i benefici dei liposomi e delle nano particelle polimeriche per la loro alta stabilità in ambiente fisiologico. I liposomi PEGhilati sono liposomi “occulti” che eludono il rilevamento e la distruzione da parte di fagociti in virtù dei loro mantelli di molecole di PEG (glicole polietilenico) idratate. Il loro scopo è duplice: (1) incrementare la biodisponibilità dei farmaci o integratori superando il tratto digestivo, e (2) minimizzare qualsiasi potenziale tossicità o effetti collaterali di questi agenti rimanendo in circolo per un lungo tempo e rilasciando il loro carico lentamente. Come tali, sono veicolati passivamente a tumori e tessuti infiammati, dove vengono preferenzialmente assorbiti a causa dell’ aumentata permeabilità dei capillari che nutrono quei tessuti.

Secondo alcune forme di realizzazione della presente invenzione, il liposoma cationico può comprendere o consistere in dimiristoil-sn-glicerofosfatidilcolina (DMPC) in combinazione con 2R,3S-2,3-dimetossi-1,4-bis (N-esadecil-N,N-dimetilammonio)-butano dibromuro, o in combinazione con 2S,3S-2,3-dimetossi-1,4-bis (N-esadecil-N,N-dimetilammonio)-butano dibromuro.

Secondo la presente invenzione, il trasportatore può essere funzionalizzato con anticorpi monoclonali approvati dall’FDA contro i linfociti T, come otelixizumab anti-CD3 (Tolerx e GlaxoSmithKline), teplizumab (Macrogenics) o contro i linfociti B, come ad esempio anticorpi anti-CD20 come Rituximab (Mabthera®) che ha come bersaglio i linfociti B.

La presente invenzione concerne anche una composizione farmaceutica comprendente o consistente in una doppietta di RNA breve interferente come definita sopra in associazione con uno o più eccipienti e/o adiuvanti.

Un ulteriore oggetto della presente invenzione è la doppietta di RNA breve interferente come definita sopra o la composizione farmaceutica come definita sopra, per l’uso come medicamento.

In aggiunta la presente invenzione riguarda la doppietta di RNA breve interferente come definita sopra o la composizione farmaceutica come definita sopra, per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento delle malattie autoimmuni. In particolare, la doppietta di RNA breve interferente o la composizione farmaceutica secondo la presente invenzione può essere usata nella prevenzione e/o nel trattamento delle malattie autoimmuni in una popolazione di soggetti portatori del polimorfismo a singolo nucleotide C1858T di PTPN22.

Le patologie autoimmuni possono essere scelte dal gruppo che consiste in diabete mellito insulinodipendente (T1D), patologia autoimmune della tiroide (PAT) (ossia malattia di Graves e tiroidite di Hashimoto (HT)), miastenia grave, sclerosi multipla, lupus eritematoso sistemico (LES), granulomatosi di Wegener, artrite reumatoide, artrite idiopatica giovanile, celiachia, vitiligine, sindrome di Sjögren, insufficienza surrenalica primaria, alopecia areata, arterite a cellule giganti, polimiosite.

La presente invenzione è descritta in modo illustrativo, ma non limitativo, in accordo con la forma preferita di realizzazione, con particolare riferimento ai disegni allegati, in cui:

Figura 1. Analisi di microscopia confocale dell’internalizzazione di Lipo/siRNA in PBMC di diabetici. (A) Le immagini mostrate rivelano la presenza di lipoplessi (siRNA/punti rossi e frecce bianche) all’interno di cellule CD3+ (bianco) e (B) CD3- nei PBMC di pazienti con DT1 già dopo 4 ore e mezza di trattamento (100 pmols). WGA (verde) è usato per colorare la membrana cellulare e i nuclei delle cellule sono controcolorati con il colorante Hoechst (blu). Barra: 20µm. (C) Le ricostruzioni Z confocali mostrano la presenza dei lipoplessi (punti rossi) nel citoplasma delle cellule CD3+. Barra: 10µ. (D) L’istogramma mostra l’analisi della percentuale delle cellule siRNA+ (cellule rodamina+) tra cellule nonvarianti (WT) e eterozigoti per C1858T di PTPN22 (ET) CD3+ e (E) CD3-.

Figura 2. Internalizzazione di Lipo/siRNA in PBMC di diabetici. Immagini rappresentative che mostrano la morfologia cellulare rispetto alla membrana cellulare (WGA/verde) e ai nuclei cellulari (Hoechst/blu). La positività a CD3 è mostrata in bianco. Le cellule trasfettate sono siRNA+ (punti rossi). Barra:20µm.

Figura 3. Valutazione della tossicità di Lipo/siRNA su PBMC di diabetici. La analisi di citometria a flusso dei PBMC da pazienti diabetici nonvarianti (wild type) per PTPN22 e eterozigoti per C1858T PTPN22 trattati per 4 ore e mezza con lipoplessi rodamina-coniugati (100 pmols). L’istogramma rivela sia la percentuale di linfociti trasfettati (cellule rodamina+) che la relativa percentuale di cellule morte (cellule rodamina+DAPI+) tra le cellule trasfettate.

Figura 4. Analisi complessiva dell’efficacia di Lipo/siRNA su mRNA bersaglio. (A) L’istogramma riguarda la analisi dell’mRNA bersaglio che deriva da 16 pazienti eterozigoti per C1858T PTPN22 che comprendono 3 non-responsivi a 48 ore e (B) 72 ore dall’inizio dei trattamenti indicati. * indica la analisi di varianza con valore p=0.0126 a 48 ore e valore p=0.0401 a 72 ore.

Figura 5. Valutazione dell’efficacia di Lipo/siRNA su mRNA bersaglio. (A) L’istogramma mostra una riduzione significativa nell’mRNA di PTPN22 bersaglio analizzato tramite rtq-PCR dopo trattamento dei PBMC di diabetici con le dosi indicate di lipoplessi per 48 ore. (B) Un’ inibizione simile è stata ottenuta dopo 72 ore. Il test statistico è stato eseguito analizzando 13 pazienti eterozigoti per C1858T PTPN22 responsivi. *** indica un valore di P=0.003 nella analisi della varianza a una via per i dati corrispondenti alle 48 ore e di P=0.002 per i dati delle 72 ore. (C) L’istogramma relativo ai 6 pazienti non-varianti per PTPN22 mostra nessuno effetto sui livelli di mRNA bersaglio a 48 ore di trattamento. (D) Nessun effetto è stato osservato allo stesso modo dopo 72 ore.

Figura 6. Evidenza per la specificità di Lipo/siRNA verso l’mRNA C1858T di PTPN22. (A) L’analisi rtq-PCR dell’mRNA da PBMC di diabetici non-varianti per PTPN22 usando due differenti gruppi di sonde per riconoscere l’intero gene bersaglio PTPN22 o l’mRNA di PTPN22 T1858. (B) L’analisi Rtq-PCR dell’mRNA da PBMC eterozigoti per C1858T PTPN22 trattati con lipoplessi alla dose indicata per 72 ore, con gli stessi due gruppi di sonde come sopra descritti. Gli elettroferogrammi mostrano entrambi gli alleli C1858 e T1858 nei prodotti della rtq-PCR da PBMC non trattati (RPMI) quando si usano sonde che rivelano l’intero mRNA bersaglio, mentre il solo SNP T1858 è mostrato quando si usa il gruppo di sonde variante specifiche. (C) L’istogramma mostra la rilevazione dell’mRNA bersaglio di ciascun gruppo di sonde in un singolo esperimento rappresentativo. Le sonde usate sono indicate nella leggenda dell’istogramma.

Figura 7. Risposta differenziale alla stimolazione del TCR nei PBMC di diabetici. L’istogramma mostra i livelli divergenti di secrezione di IL-2 nei supernatanti di PBMC di diabetici tra pazienti eterozigoti (ET) per C1858T di PTPN22 e non-varianti (WT) dopo attivazione con biglie anti-CD3/CD28 con un rapporto biglia/cellula di 1:1, 1:3.3, 1:10 per 20 ore. La quantità di IL-2 saggiata dallo specifico saggio ELISA è stata normalizzata rispetto al totale contenuto proteico di ciascun campione. Per il confronto nonvariante (WT) vs ET ** indica valore nel saggio t non appaiato di P = 0.0014 per il rapporto biglia/cellula 1:1 e valore P = 0.0086 per il rapporto biglia/cellula 1:10, * indica valore P del saggio t non appaiato = 0.0115 per il rapporto biglia/cellula 1:3.3.

Figura 8. Rilevazione di IL-2 in supernatanti di colture di PBMC trasfettati e poi stimolati con anti-CD3/CD28. L’istogramma illustra l’incremento della secrezione di IL-2 a 20 ore di attivazione anti-CD3/CD28 (rapporto biglia/cellula 1:10) in colture di supernatanti di PBMC di diabetici ET per C1858T PTPN22 che sono stati precedentemente trasfettati per tutta la notte con lipoplessi alle dosi indicate. Lo stesso significativo incremento nei livelli di IL-2 non era stato osservato nei PBMC non-varianti (WT) di diabetici analogamente trattati. * indica un valore di P in analisi di varianza ad una via =0.0491 per i PBMC ET. La quantità di IL-2 veniva normalizzata rispetto al contenuto proteico totale di ciascun campione (stimata mediante kit di saggio proteico colorimetrico PierceTM Thermo Scientific BCA (Rockford, IL)).

Figura 9. Rilevazione di IL-2 in colture di supernatanti di PBMC sotto stimolazione anti-CD3/CD28 sub ottimale. L’istogramma illustra l’incremento della secrezione di IL-2 dopo 5 giorni di attivazione anti-CD3/CD28 (rapporto biglia/cellula 1:50) di PBMC di diabetici ET per C1858T PTPN22 a seguito di trasfezione per tutta la notte con lipoplessi alle dosi indicate. Lo stesso significativo incremento nei livelli di IL-2 non è stato osservato nei PBMC di diabetici nonvarianti (WT). * indica un valore P di analisi di varianza ad una via = 0.0173 per i PBMC ET. La quantità di IL-2 veniva normalizzata rispetto al contenuto proteico totale di ciascun campione.

ESEMPIO 1: Studio della somministrazione di RNA breve interferente della presente invenzione per mezzo di liposomi cationici in PBMC di pazienti con diabete di tipo 1 e della sotto-regolazione della variante genica PTPN22 nei linfociti T.

Metodi

Preparazione e caratterizzazione delle formulazioni di liposoma

Il tensioattivo gemini 2R,3S-2,3-dimetossi-1,4-bi(N-esadecil¬-N,N-dimetilammonio)-butano dibromide, 2, è stato preparato come precedentemente riportato (Bello 2006; Seebach 1977; Aleandri 2012, Perri 2017).

Per la preparazione delle formulazioni di liposoma e lipoplesso e della soluzione siRNA di stoccaggio, è stata usata una soluzione tampone fresca di 5 mM HEPES e 0.1 mM EDTA, a pH 7.4 (Sigma-Aldrich, Compagnia Chimica (Co.), St Louis, MO).

I liposomi composti da DMPC (purezza>99%, Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL)) e 2 in percentuale molare 50/50 sono stati preparati seguendo la precedente procedura descritta (Hope 1992). Un strato sottile di DMPC (3.0 µmol) e 2 (3.0 µmol) è stato preparato sulla parete interna di una fiasca a fondo sferico mediante evaporazione di una soluzione di CHCl3 contenente le adeguate quantità del componente. Lo strato sottile è stato poi asciugato per 7 ore sotto vuoto spinto, e 3.0 ml di soluzione tampone sono state aggiunte per avere una dispersione finale 1.0 mM in DMPC e 1.0 mM in 2 (Perri 2017). La soluzione è stata miscelata con vortice, congelata-scongelata sei volte da azoto liquido a 313 K, e infine estrusa (10 volte) attraverso una membrana di policarbonato 10 nm (Whatman Nucleopore, Toronto, ON, Canada). Le estrusioni sono state realizzate a 40°C, sopra la temperatura di transizione del DMPC (24.2°C), su 10 ml di un estrusore (Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada). Per la preparazione dei lipoplessi (DMPC/2/siRNA o Lipo/siRNA), sono stati aggiunti adeguati volumi di soluzione siRNA di stoccaggio (0.1 mM in tampone) a una soluzione diluita di liposoma per avere le concentrazioni finali: [siRNA]= 1.3µM, [DMPC]= 50 µM, [2]= 50 µM, corrispondenti a un rapporto di carica /-= 2.

I campioni per il microscopio confocale sono stati preparati seguendo la stessa procedura descritta sopra, aggiungendo una sonda fluorescente (1,2-dimiristoil-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-(sulfonile lissamina rodamina B)- sale d’ammonio, Avanti Polar Lipids) alla soluzione lipidica, durante la fase di preparazione del film. La sonda fluorescente è stata usata in una percentuale 0.1 mol rispetto al DMPC. I campioni sono stati analizzati mediante spettroscopia a dicroismo circolare (CD) e dispersione della luce dinamica (DLS) a differenti tempi dopo la preparazione (9, 24, 48, 72 ore) (Perri 2017).

Spettroscopia a dicroismo circolare

Gli spettri CD sono stati registrati su uno spettro polarimetro Jasco J-715 dotato di un dispositivo Peltier per il controllo della temperatura, usando cuvette di quarzo con profondità di 0.5 cm. Le misurazioni sono state effettuate in un intervallo di spettro di 330/220 nm a 25°C. Gli spettri CD sono la media di 16 scansioni ottenute con una velocità di lettura strumentale a scansione di 100nm/min, tempo di risposta di 1 secondo (s) e risoluzione di 1nm (Perri 2017).

Diffusione dinamica della luce (DLS)

Le misurazioni DLS sono state ottenute con uno strumento goniometro Brookhaven Corp.BI-200SM dotato di un correlatore digitale BI-900AT usando un laser a stato solido (125 mW, ʎ= 532nm). Salvo diversa indicazione, le misurazioni della luce diffusa sono state effettuate ad un angolo di diffusione θ di 90°. Le misurazioni sono state eseguite a 25°C (Perri 2017) e la temperatura è stata controllata con un’accuratezza di 0.1°C. Ogni esperimento (di durata compresa nell’intervallo di 5-20 minuti) è stato ripetuto due o più volte. L’algoritmo CONTIN è stato usato per misurare i dati.

Disegno dei siRNA

Originariamente le sequenze siRNA sono state disegnate specificatamente per la mirata variante genica C1858T PTPN22.

Queste sono state generate usando un algoritmo per il design di siRNA di licenza di Rosetta Inpharmatics (Sigma-Aldrich Chemical Co., http//www.sigmaaldrich.com/life-science/functionalgenomics-and-rnai/siRNA/learning-center/mission-supreg0/siRNA-design-choosing.html).

Da una lista di doppiette siRNA senso/antisenso (s/a) che differiscono nell’affinità all’mRNA mirato (Tabella 1), generate senza alcuna modificazione dello scheletro, è stata scelta la sequenza specifica con più alta affinità per il bersaglio per gli esperimenti seguenti, ossia sequenza siRNA (SNP_T senso 5’-GUAUGGACACCUGAAUCAU-3’ (SEQ ID NO: 1) con dTdT al 3’ terminale; SNP_T antisenso 5’-AUGAUUCAGGUGUCCAUAC-3’ (SEQ ID NO: 2) con dTdT al 3’ terminale, Sigma Chemical Co.). dTdT veniva aggiunto per aumentare la stabilità. Alternative per ciascuna delle sottocitate sequenze possono essere dAdA, dGdG e dCdC. La Tabella 1 mostra il disegno del duplex siRNAs SNP_T (senso e antisenso) contro la variante allelica T1858 PTPN22.

Tabella 1

Silenziamento della variante genica C1858T PTPN22 in PBMC umani. Studio di popolazione.

Lo studio sulla popolazione comprendeva 22 pazienti con DT! Di lunga durata che sono stati reclutati dal Dipartimento di Endocrinologia all’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù (OPBG). Del numero totale di pazienti con malattia di lunga durata, 16 erano portatori del polimorfismo C1858T PTPN22 in eterozigosi e 6 non portatori.

Tutti i pazienti reclutati non erano imparentati. Tutti i soggetti sono stati introdotti nella ricerca dopo aver ottenuto il consenso informato scritto. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale (CEI) dell’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, che regolamenta l’uso di campioni umani per gli studi sperimentali (N° 1385). Il consenso informato per i bambini è stato ottenuto dal parente più prossimo. Il consenso e’ stato scritto per i bambini. Il consenso dei partecipanti è stato registrato utilizzando un sistema di inventario cartaceo. Il CEI ha approvato la procedura di consenso.

Rilevazione della variante C1858T nel gene di PTPN22

La analisi molecolare del polimorfismo C1858T (R620W) del gene di predisposizione all’autoimmunità PTPN22 è stata valutata nel DNA dei pazienti e dei controlli usando un metodo PCR (reazione a catena della polimerasi) di restrizione XcmI della lunghezza del frammento del polimorfismo (Bottini 2004, Gianchecchi 2013).

Preparazione delle cellule

Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) venivano separate tramite Ficoll-Hypaque (Histopaque, Sigma-Aldrich Chemical Co.) da campioni di sangue venoso in eparina sodica (5-10 ml) di pazienti reclutati con DT1. Successivamente, PBMC venivano congelati in azoto liquido in accordo con i protocolli standard (Gianchecchi 2014).

Protocollo per la trasfezione di liposoma personalizzato

PBMC di diabetici venivano scongelati, lavati in mezzo RPMI 1640 completo (EuroClone, Pero (Milan), Italy) integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS, GE Healyhcare Life Sciences, UT, USA) e L-glutammina (2mM) (Euroclone). PBMC venivano poi piastrati alla concentrazione di 1.5 x 10⁶ cellule per pozzetto in piastre da 48 pozzetti (Flacon, Corning, NY, USA) in un volume finale di 250 µl di mezzo RPMI 1640 senza FBS integrato con L-glutammina (2 mM) e trattato con differenti dosi di complessi Lipo/siRNA (20, 60, 80, 100, pmols di RNA). Dopo trasfezione di una notte, le cellule venivano lavate tramite centrifugazione a 1200 rpm per 5 minuti, piastrate di nuovo in piastre da 48 pozzetti con fondo piatto in mezzo RPMI completo in un volume finale di 250 µl e incubate a 37°C in una atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 per ulteriori 24 e 48 ore corrispondenti a un tempo di trasfezione finale rispettivamente di 48 e 72 ore.

Estrazione di RNA e analisi quantitativa in PCR tempo reale (Real Time)

L’RNA totale da PBMC trattati e non trattati veniva isolato con TRIzol Reagent (Invitrogen, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA; USA) seguendo le istruzioni della casa produttrice. Dopo la retro trascrizione in vitro (500 ng) tramite kit di trascrizione inversa a cDNA ad Alta Capacità (Applied Biosystems, Foster City; CA), la Real-Time PCR quantitativa (rtq-PCR) veniva realizzata utilizzando il sistema di Real-Time veloce 7900HT (Applied Biosystems) e la miscela principale di PCR Power SYBR Green (Applied Biosystems) con le seguenti sonde:

(i) GAPDH (gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi) (umano)

Diretto (fwd): 5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’ (SEQ ID NO:21)

Inverso (rev): 5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’ (SEQ ID NO:22)

(ii) PTPN22 (umano)

Diretto: 5’- GCTGTACTAGCAACTGCTCC-3’ (SEQ ID NO: 23);

Inverso: 5’- CCAGCTTCCTCAACCACAAT-3’ (SEQ ID NO: 24); (iii) PTPN22T1858 (umano)

Diretto: 5’- CAGCTGTACTAGCAACT-3’ (SEQ ID NO: 25);

Inverso: 5’- AGGTGTCCATACAGGAA-3’ (SEQ ID NO: 26);

Per le analisi, i livelli di mRNA, normalizzati verso GAPDH, venivano calcolati come segue:

= 2- ΔΔCt,

dove ΔCt = Ct (PTPN22 o PTPN22T1858) – Ct (GAPDH).

I prodotti Rtq-PCR venivano purificati tramite un Kit per pulizia di Gel e PCR (Gel and PCR clean up, Qiagen, Hilden, Germany) seguendo le istruzioni della casa produttrice e successivamente analizzati usando il Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems).

Analisi di microscopia confocale

PBMC da pazienti diabetici non-varianti (wild type) ed eterozigoti per la variante venivano piastrati a 1.5 x 10⁶ cellule per pozzetto in piastre da 48 pozzetti (Falcon) in un volume finale di 250 µl di mezzo RPMI 1640 (Euroclone) senza FBS, addizionato con L-glutammina (2mM) (Euroclone) e trattato con complessi Lipo/siRNA marcati con rodamina (100 pmols di siRNA) per 4 ore e mezza. Al termine del periodo di incubazione, le cellule venivano recuperate, lavate in PBS, e fissate con paraformaldeide al 4% (Sigma-Aldrich Chemical Co.). Sospensioni di cellule fissate venivano distribuite goccia a goccia sui vetrini da microscopio carichi positivamente (Super Frost plus, Menzel-Glaser, Germania) e asciugate a 37°C. Dopo la reidratazione in PBS, la permeabilizzazione cellulare veniva ottenuta incubando i vetrini da microscopio con 0.1% PBS-Triton X-100 (Sigma-Aldrich Co.) per 5 minuti. Successivamente, veniva eseguito un bloccaggio di 30 minuti con BSA (albumina sierica di bovino, Sigma-Aldrich Co.) al 5% e le cellule venivano colorate con anticorpo primario di topo anti-umano CD3 (Clone UCHT1 BD Biosciences, San Jose, CA, 1:30, incubate per 1 ora a temperatura ambiente (TA)) seguito da anticorpo secondario (Ab) di capra anti-topo coniugato con Cy-5 (Invitrogen, 1:100, incubato per 1 ora a TA). Infine, per controcolorare la membrana plasmatica e i nuclei, venivano usati rispettivamente WGA coniugato a Oregon Green1488 (Invitrogen, 1:200) e Hoechst 33342 (Invitrogen, 1 µg/ml). La analisi al confocale veniva eseguita con un microscopio confocale Olympus Fluoview FV1000 dotato di software FV10-ASW versione 2.0, Multi Ar (458±488 e 515 nm), 2x He/Ne (543 e 633 nm), e laser a diodi 405-nm, usando un obiettivo 60x (1.40 NA ad olio). Sezioni ottiche singole venivano acquisite con un formato di modalità di scansione di 1024x1024 pixels, con velocità di campionamento di 40 ms/pixel (dimensione del pixel 0.2 mm), e ricostruzioni Z di sezioni ottiche singole seriali venivano effettuate con un ingrandimento elettronico a 2.5. La separazione dei fluorocromi veniva ottenuta mediante acquisizione di una raccolta automatica e sequenziale di immagini multi-canale, allo scopo di ridurre la reattività spettrale crociata tra i canali (Perri 2017).

Saggio di tossicità

La valutazione della tossicità dei lipoplessi veniva saggiata tramite monitoraggio della morfologia cellulare, della viabilità, della quantità e della qualità delle raccolte cellulari e la quantificazione della concentrazione dell’estratto proteico al termine della procedura sperimentale. I PBMC di diabetici venivano piastrati alla concentrazione di 1.5 x 10⁶ cellule per pozzetto in piastre da 48 pozzetti (Falcon) in un volume finale di 250 µl di mezzo RPMI 1640 (Euroclone) senza FBS addizionato con L-glutammina (2mM) (Euroclone) e trattato con differenti dosi di complessi Lipo/siRNA marcati con rodamina (20, 60, 80, 100 pmol di siRNA) per 4 ore e mezza. Successivamente le cellule venivano raccolte con mezzo completo, centrifugato a 1200 rpm per 5 minuti, lavate una volta in PBS e risospese in PBS al 2% di FBS. Per rilevare e quantificare le cellule morte il colorante fluorescente blu DAPI (4’,6-diamidina-2’-fenilindolo diidrocloruro, Invitrogen) non permeante alla cellula veniva aggiunto alla concentrazione finale di 0.2 µM, 5 minuti prima dell’analisi delle cellule tramite citofluorimetro BD LSR Fortessa X-20 (BD, Sunnyvale, CA). Il DAPI entra specificatamente solo nelle cellule morte quando si usa su cellule vive. 20,000 eventi venivano acquisisti e i dati analizzati mediante software BD FACSDiva 8.0 (BD Biosciences). La valutazione veniva eseguita su determinazioni biologiche almeno in triplicato.

Saggi funzionali

Veniva realizzato un saggio funzionale per verificare gli effetti dei lipoplessi sull’attivazione T cellulare tramite valutazione della concentrazione di interleuchina 2 (IL-2) nei supernatanti dei PBMC dei pazienti transfettati per tutta la notte con differenti dosi di complessi Lipo/siRNA (complessi Lipo/siRNA con 60, 80 e 100 pmols di siRNA) poi trattati con biglie Dynabeads attivatrici di T umane CD3/CD28 (Invitrogen). Dopo transfezione, le cellule venivano lavate tramite centrifugazione, piastrate a 2.5x 105 per pozzetto in piastre a fondo piatto da 96 pozzetti in mezzo RPMI completo, poi attivate con le biglie anti-CD3/CD28 indicate a differenti rapporti biglie/cellule. Le cellule venivano successivamente incubate a 37° in un’ atmosfera umidificata contenente CO2 al 5% per 20 ore. In un’ aggiuntiva condizione sperimentale per studiare specificatamente l’immunomodulazione, le cellule venivano stimolate con un rapporto sottoottimale biglia/cellula di 1:50 protratto per 5 giorni (Perri 2007). Al termine del periodo di incubazione, i supernatanti e le cellule venivano raccolti e separati tramite centrifugazione a 1200 rpm per 5 minuti. La concentrazione di IL-2 nei supernatanti veniva valutata per mezzo del kit di rilevamento in ELISA per IL-12 umana (Mabtech, Nacka strand, Sweden) seguendo le istruzioni della casa produttrice. Le piastre venivano poi lette a 405 nm mediante spettrofotometro per micropiastre Bench-mark Plus (Bio-Rad, CA). La valutazione veniva eseguita con determinazioni biologiche almeno in triplicato.

Analisi statistiche

Le differenze tra cellule siRNA+CD3+ e siRNA+CD3-, tra PBMC di diabetici non-varianti e eterozigoti, rappresentanti l’efficienza di trasfezione specifica della popolazione, venivano valutate statisticamente usando il t test non appaiato. La analisi veniva eseguita da due indipendenti osservatori valutando un totale di 600 cellule (MP, SP). Un risultante valore P < 0.05 veniva considerato statisticamente significativo. Per gli esperimenti di efficacia del Lipo/siRNA, valutati con rtq-PCR e saggio ELISA di IL-2, le differenze tra ogni condizione da saggiare e la condizione di controllo venivano stimate per significatività statistica con analisi di varianza ANOVA ad una via e saggio di comparazione multipla Bonferroni. Per analizzare la differenza di produzione di IL-2 nei saggi funzionali tra PBMC di diabetici stimolati non-varianti ed eterozigoti per C1858T PTPN22 veniva utilizzato il saggio t non-appaiato. Lo studio statistico veniva svolto analizzando determinazioni biologiche multiple con la versione numero 5 del programma GraphPad Prism (San Diego, CA).

Risultati

Valutazione della dimensione e della polidispersione dei liposomi e lipoplessi mediante misurazioni DLS

Esperimenti DLS sulla formulazione di liposomi DMPC/2 e su lipoplessi (DMPC/2/siRNA o Lipo/siRNA) venivano svolti come precedentemente riportato (Perri 2017). Le indagini sulla formulazione dei liposomi confermavano ciò che è stato già descritto: la formulazione liposomiale di DMPC/2 mostrava una ristretta popolazione singola centrata a circa 40 nm dopo 9 ore dalla estrusione, mentre, dopo 72 ore dalla preparazione, i liposomi DMPC/2 aumentavano significativamente di dimensioni (Perri 2017).

I lipoplessi composti dal siRNA contro la variante PTPN22 con i liposomi di DMPC/2 mostravano un comportamento simile a quello osservato per i lipoplessi di siRNA non-variante (wild type)(Perri 2017). Infatti, anche in questo caso le dimensioni dei lipoplessi non sembravano fortemente influenzate dalla presenza dei siRNA, aggirandosi intorno ai 70 nm di diametro. In aggiunta, i lipoplessi DMPC/2/siRNA non cambiavano considerevolmente con il tempo, aumentando leggermente fino a circa 90 nm, suggerendo che i lipoplessi sono piuttosto stabili.

Indagini CD sulla stabilità conformazionale dei siRNA nei lipoplessi

Le indagini CD dei lipoplessi composti dal siRNA contro la variante PTPN22 con i liposomi di DMPC/2 venivano eseguite seguendo lo stesso approccio precedentemente descritto per i siRNA non-varianti (Perry 2017). Anche in questo caso, lo spettro CD di siRNA nei lipoplessi (DMPC/2/siRNA o Lipo/siRNA), misurato a tempi diversi dopo la loro preparazione, assomiglia a quello del siRNA libero in soluzione tampone, essendo le bande dei lipoplessi meno intense di quelle del siRNA libero. Queste osservazioni indicano che l’associazione tra liposomi e siRNA non ha un effetto significativo sulla stabilità conformazionale dei siRNA disegnati contro la variante PTPN22. Inoltre, l’assenza di variazioni marcate nello spettro CD in un periodo superiore alle 72 ore è una conferma indiretta della stabilità dei lipoplessi.

I lipoplessi Lipo/siRNA SNP_T sono effettivamente internalizzati nei PBMC di diabetici L’internalizzazione dei complessi Lipo/siRNA coniugati con rodamina (100 pmols di siRNA) è stata visualizzata nei PBMC di diabetici in seguito ad un’incubazione di 4 ore e mezza (Fig. 1, A e B; puntini rossi/frecce bianche indicano i lipoplessi; WGA verde e Hoechst blu indicano rispettivamente membrana e nuclei). L’analisi delle proiezioni degli assi X e Y delle ricostruzioni Z delle sezioni ottiche singole confocali (Figure 1, C) permettono una chiara rilevazione dei lipoplessi al di sotto della membrana cellulare. La presenza della fluorescenza della rodamina all’interno delle cellule indica ulteriormente l’efficacia di questo sistema di somministrazione nell’internalizzazione di molecole di siRNA nei PBMC di diabetici, come precedentemente osservato per le cellule T Jurkat e per i PBMC di donatori sani (Perri 2017). Questo risultato è stato riportato in PBMC di diabetici non-varianti e eterozigoti per C1858T PTPN22 (Figura 1, D e E).

L’internalizzazione è stata specificatamente confermata in entrambi i linfociti T CD3+ (bianco) e CD3- (Figura 1, A, B e C). Da notare che non è stata osservata nessuna differenza statisticamente significativa circa l’efficacia di internalizzazione dei lipoplessi tra le cellule CD3+ (Figura 1, D) o CD3-(Figura 1, E) quando vengono analizzati PBMC di diabetici non-varianti versus (vs) quelli di eterozigoti per C1858T PTPN22 (Figura 1, D e E).

I lipoplessi Lipo/siRNA SNP_T non sono tossici per i PBMC di diabetici

I PBMC trattati con lipoplessi marcati con rodamina (20, 60, 80 e 100 pmols di siRNA) non hanno mostrato segni di tossicità durante il periodo di coltura come accertato mediante la qualità e quantità delle raccolte cellulari e la quantificazione della concentrazione dell’estratto proteico al termine della procedura sperimentale.

I PBMC dei diabetici trattati con differenti dosi di lipoplessi rodamina-coniugati per 4 ore e mezza hanno mantenuto una corretta morfologia sia della membrana cellulare (verde) che dei nuclei (blu) come rilevato dalla microscopia confocale (Figura 2). Questi compartimenti cellulari non hanno mostrato rispettivamente segni di danno o di apoptosi (Figura 2).

Nell’analisi di citometria a flusso, i PBMC di diabetici hanno mostrato un’alta percentuale di cellule rodamina+ implicando una rilevante efficacia di trasfezione e internalizzazione e, allo stesso tempo, hanno manifestato una bassa percentuale di cellule morte (cellule rodamina+DAPI+) (Figura 3) indicative di una bassa tossicità dei lipoplessi a questo specifico tempo della procedura sperimentale.

Il trattamento con lipoplessi Lipo/siRNA SNP_T riduce lo mRNA di PTPN22

L’mRNA ottenuto da PBMC derivati dai 16 pazienti eterozigoti C1858T PTPN22 e dai 6 pazienti PTPN22 nonvarianti veniva analizzato tramite rtq-PCR dopo aver trattato le cellule con differenti dosi di lipoplessi (20, 60, 80 e 100 pmols di siRNA) per 48 e 72 ore. Entrambi i punti temporali del trattamento con i lipoplessi hanno portato ad una riduzione dei livelli di mRNA PTPN22 bersaglio in 13 dei 16 pazienti eterozigoti (Figura 5; Figura 4), mentre non ha avuto effetti su i livelli di mRNA nei pazienti non-varianti (Figura 5). Questi risultati indicano la valida efficacia dei lipoplessi sotto studio nel ridurre in modo specifico l’mRNA della variante T1858 di PTPN22. Per accertare la specificità dei lipoplessi nei confronti della variante, è stato progettato un secondo gruppo di sonde atte a rilevare solamente l’mRNA della variante T1858. Queste sonde sono state prima validate tramite esecuzione di rtq-PCR su PBMC derivati da pazienti non-varianti per PTPN22 usando entrambi i gruppi di sonde, quello nuovo specifico e il primo in grado di riconoscere tutto l’mRNA del gene bersaglio. Il risultato di questa validazione mostrava l’incapacità del gruppo specifico di rilevare l’mRNA non-variante (wild type) di PTPN22 dove non è presente il polimorfismo nucleotidico singolo (SNP) C1585T (Figura 6, A). Successivamente, queste sonde sono state testate sull’mRNA di PBMC di diabetici eterozigoti per C1858T PTPN22 trattati come descritto sopra per 72 ore. In questo specifico esperimento, le nuove sonde rivelavano chiaramente la presenza di mRNA della variante e mostravano la sua riduzione in seguito a trattamento con lipoplessi (Figura 6, B e C).

Efficacia dei lipoplessi Lipo/siRNA SNP_T sull’attività biologica di Lyp

La variante Lyp R620W associata con la malattia autoimmune è una forma dell’enzima con guadagno di funzione (Vang 2005; Lin 2016), intendendo che una più potente attività fosfatasica della proteina è realmente presente. Dati dalla letteratura (Vang 2005) che mostrano una diminuita secrezione di IL-2 da parte dei PBMC eterozigoti per C1858T di PTPN22 comparati con i PBMC non-varianti per PTPN22 dopo stimolazione con biglie anti-CD3/CD28 venivano confermati nei pazienti con DT1 (Figura 7). Questa risposta significativamente diversa al coinvolgimento del TCR veniva osservata in tutte le condizioni di attivazione utilizzate (rapporto biglia/cellula 1:1; 1:3,3; 1:10) (Figura 7).

Dopo coinvolgimento del TCR, un’aumentata concentrazione di IL-2 in seguito a trattamento con lipoplessi rispetto alle cellule non trattate (RPMI) veniva osservata nei PBMC dei pazienti con DT1 eterozigoti per C1858T PTPN22 rispetto ai PBMC di diabetici con PTPN22 non-variante (Figura 8). Lo stesso risultato è stato ottenuto e con maggiore evidenza usando una condizione sottoottimale per stimolazione con biglie anti CD3/CD28 (Figura 9). Questa osservazione implica che l’effetto del “guadagno di funzione” di Lyp R620W sulla via di segnale del TCR (Vang 2005) può essere recuperato in seguito a trattamento con lipoplessi. Come conseguenza finale, questo modo di agire potrebbe ripristinare il normale funzionamento regolatorio di Lyp.

Bibliografia

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Claims

RIVENDICAZIONI 1) Doppietta di RNA breve interferente avente come bersaglio il polimorfismo a singolo nucleotide PTPN22 C1858T, detto RNA breve interferente comprendendo o essendo consistente nella sequenza 5'-AUGAUUCAGGUGUCCAUAC-3' (SEQ ID NO:2) e nella sua sequenza complementare 5'-GUAUGGACACCUGAAUCAU-3' (SEQ ID NO:1).
2) Doppietta di RNA breve interferente secondo la rivendicazione 1, dove SEQ ID NO:1 e 2 hanno un dinucleotide al 3' terminale, in cui detto dinucleotide è scelto dal gruppo consistente in dTdT, dAdA, dGdG e dCdC.
3) Doppietta di RNA breve interferente secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui detto RNA breve interferente è veicolato tramite un trasportatore.
4) Doppietta di RNA breve interferente secondo la rivendicazione 3, in cui il trasportatore è un liposoma, come ad esempio un liposoma cationico, un nanotrasportatore, come ad esempio nanoparticelle solide-lipidiche, o un liposoma PEGhilato.
5) Doppietta di RNA breve interferente secondo la rivendicazione 4, in cui detti liposomi cationici comprendono o consistono in dimiristoil-sn-glicerofosfatidilcolina (DMPC) in combinazione con 2R,3S-2,3-dimetossi-1,4-bis (N-esadecil-N,N-dimetilammonio)-butano dibromuro, o in combinazione con 2S,3S-2,3dimetossi-1,4-bis (N-esadecil-N,N-dimetilammonio)-butano dibromuro.
6) Doppietta di RNA breve interferente secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 3-5, in cui detto trasportatore è funzionalizzato con anticorpi monoclonali contro i linfociti T, come ad esempio otelixizumab anti-CD3, teplizumab, o contro linfociti B, come ad esempio anticorpo anti-CD20 come ad esempio Rituximab.
7) Composizione farmaceutica comprendente o consistente in una doppietta di RNA breve interferente come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in associazione con uno o più eccipienti e/o adiuvanti.
8) Doppietta di RNA breve interferente come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 o composizione farmaceutica come definita nella rivendicazione 7, per l’uso come medicamento.
9) Doppietta di RNA breve interferente come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 o composizione farmaceutica come definita nella rivendicazione 7, per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento delle patologie autoimmuni.
10) Doppietta di RNA breve interferente come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 o composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 7, per l’uso secondo la rivendicazione 9, in una popolazione di soggetti portatori del polimorfismo a singolo nucleotide PTPN22 C1858T.
11) Doppietta di RNA come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 o composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 7, per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9-10, in cui le patologie autoimmuni sono scelte dal gruppo consistente in diabete mellito insulina-dipendente (T1D), patologia autoimmune della tiroide (ATD) , come ad esempio la malattia di Graves o tiroidite di Hashimoto (HT), miastenia grave, sclerosi multipla, lupus eritematoso sistemico (LES), granulomatosi di Wegener, artrite reumatoide, artrite idiopatica giovanile, malattia celiaca, vitiligine, sindrome di Sjӧgren, insufficienza surrenalica primaria, alopecia areata, arterite a cellule giganti, polimiosite.