KR20140019303A

KR20140019303A - 루푸스의 치료 또는 예방을 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20140019303A
Application number: KR1020137016437A
Authority: KR
Inventors: 주안 리버; 니콜라스 찰스
Original assignee: 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 시크리터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼스 서비시스
Priority date: 2010-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2014-02-14
Also published as: JP5850943B2; AU2010364324B2; AU2010364324A1; JP2014505020A; US9657292B2; WO2012071042A1; US20140127199A1; KR101813482B1; CA2818712C; CA2818712A1

Abstract

본 발명은 자기 반응성 IgE 및/또는 호염기구를 억제하거나 감소시키는 작용제를 포함하는 조성물, 및 루푸스, 루푸스 신염, 및 루푸스-관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 상기 조성물의 관련된 사용 방법을 특징으로 한다.

Description

루푸스의 치료 또는 예방을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING OR PREVENTING LUPUS}

하기에 개시하는 바와 같이, 본 발명은 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된, 및 다른 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방에 유용한 조성물 및 방법을 특징으로 한다.

연방정부 지원 연구 하에서 수행된 발명에 대한 권리의 진술

본 출원을 지지하는 연구는 미국을 대표하는 보건사회복지부 장관에 의해 수행되었다. 상기 정부는 본 발명에 일정한 권리는 갖는다.

발명의 배경

전신 홍반성 루푸스(SLE)는 다양한 기관에 영향을 미치는 복합 질병이며 신장 손상(루푸스 신염)이 심할 경우 사망에 이를 수도 있다. 루푸스 신염은 사구체에 침착된 IgM-, IgG- 및 IaA-함유 면역 복합체를 특징으로 한다. 이들 면역 복합체는 핵 성분(항핵 항체(ANA)) 또는 핵산(예를 들어 이중 가닥 DNA(dsDNA))에 대해 특이성을 갖는 자가항체에 의해 형성된다.

루푸스 및 생성되는 신염의 치료를 위한 현행 방법은 부적합하며, 루푸스 및/또는 루푸스 신염의 개선된 치료 또는 예방 방법이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 자가반응성 IgE, IgE 수용체의 생산 또는 생물 활성을 감소시키고, 호염기구 활성화를 감소시키고/시키거나 호염기구를 고갈시킴으로써 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된 질환, 및 다른 자가면역 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 정의되는 조성물 및 물품들은 하기에 제공되는 실시예와 관련하여 단리되었거나 달리 제조되었다.

하나의 태양에서, 본 발명은 일반적으로 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된, 및/또는 다른 자가면역 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게서 상기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 상기 환자에게서 IgE 또는 IgE 수용체의 발현 또는 생물 활성을 감소시키기에 유효한 양의 작용제를 상기 환자에게 투여함을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 일반적으로 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된, 및/또는 다른 자가면역 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게서 상기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 상기 환자에게서 호염기구의 수 또는 활성을 감소시키거나 호염기구 활성화를 감소시키기에 유효한 양의 작용제를 상기 환자에게 투여함을 포함한다.

더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된, 및/또는 다른 자가면역 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 유효량의 오말리주맵을 투여함을 포함하는, 상기 환자에게서 상기 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 특징으로 한다.

추가의 태양에서, 본 발명은 비스테로이드성 소염 약물(NSAID), 하이드록시클로로퀸, 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드, 아즈티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 벨리뮤맵, 데하이드로에피안드로스테론, 및 리툭시맵으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 추가의 별도의 작용제와 함께 치료 유효량의 항-IgE 요법(예를 들어 오말리주맵 또는 다른 투여된 작용제)을 함유하는 루푸스 신염의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 특징으로 한다.

추가의 태양에서, 본 발명은 호염기구를 억제하거나 호염기구의 수를 감소시키는 치료 유효량의 작용제를 함유하는 루푸스 신염의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 특징으로 한다.

더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 루푸스, 루푸스 신염 및 루푸스-관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 키트를 특징으로 하며, 상기 키트는 IgE의 발현 또는 생물 활성을 감소시키는 유효량의 작용제 및 본 발명에 개시된 방법들 중 임의의 방법에 따라 루푸스, 루푸스 신염, 및 루푸스-관련된 질환을 치료하기 위한 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물 및 키트의 바람직한 치료제는 오말리주맵이다.

여기에서 기술된 본 발명의 상기 태양들 중 어느 하나 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 상기 작용제는 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 소 화합물이다. 또 다른 실시태양에서 상기 폴리펩타이드는 IgE, IgE 수용체와 선택적으로 결합하거나 IgE의 생산을 조절하는 항체 또는 그의 단편이다. 추가의 실시태양에서 상기 항체 단편은 Fab 또는 단일쇄 V 영역 단편(scFv)이다. 더욱 또 다른 실시태양에서 상기 핵산 분자는 IgE 발현을 감소시키는 siRNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 또는 shRNA이다. 추가적인 실시태양에서 상기 소 분자 화합물은 Syk 키나제 억제제이다. 다른 실시태양에서 상기 Syk 키나제 억제제는 포스타마티니브이다. 추가의 실시태양에서 상기 소 분자 화합물은 IgE 생산 또는 호염기구 활성화를 조절한다. 더욱 다른 실시태양에서 상기 작용제는 IgE 생산을 길항하는 미소RNA를 조절한다. 또 다른 실시태양에서 상기 방법은 자가반응성 IgE의 수준을 감소시키고/시키거나 순환하는 면역 복합체의 수준을 감소시킨다. 추가적인 실시태양에서 상기 방법은 호염기구 활성화를 감소시킨다. 추가의 실시태양에서 상기 방법은 상기 환자에게서 CD203c 발현, CD62L, 및 HLA-DR 중 하나 이상의 수준을 감소시킨다.

다른 바람직한 실시태양에서, 상기 투여되는 작용제는 오말리주맵이다. 몇몇 태양에서, 오말리주맵의 유효 투여량은 용량당 약 75 ㎎ 내지 500 ㎎이다. 또 다른 실시태양에서, 오말리주맵을 용량당 약 150 내지 400 ㎎으로 매 1, 2, 3 또는 4 주 이상마다 투여한다.

추가의 실시태양에서, 상기 환자는 루푸스 또는 루푸스 신염을 갖거나 또는 발병하는 성향이 있는 것으로서 확인되며, 상기 치료제를 상기와 같이 확인된 환자에게 투여한다. 더욱 또 다른 실시태양에서 상기 환자는 상승된 IgE 수준을 갖는다. 추가의 실시태양에서 상기 작용제는 단클론 항-IgE 항체이다. 본 발명의 더욱 추가의 실시태양에서 상기 단클론 항-IgE는 인간화된 단클론 항체이다. 추가의 실시태양에서 상기 단클론 항-IgE 항체는 오말리주맵이다. 더욱 추가의 실시태양에서 상기 방법은 상기 환자에게 비스테로이드성 소염 약물(NSAID), 하이드록시클로로퀸, 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드, 아즈티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 벨리뮤맵, 데하이드로에피안드로스테론, 및 리툭시맵으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 작용제를 투여함을 또한 포함한다. 다른 실시태양에서 상기 루푸스 신염은 확산 증식성 루푸스 신염 또는 막성 루푸스 신염이다. 또 다른 실시태양에서 상기 자가면역 질환은 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염, 항인지질 증후군, 근염 및 강피증으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 추가의 실시태양에서 상기 항-IgE 요법은 단클론 항-IgE 항체를 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서 상기 항-IgE 치료제는 항체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서 상기 항-IgE 치료제는 단클론 항체를 포함한다. 다른 실시태양에서 상기 항-IgE 치료제는 오말리주맵이다.

본 발명은 자가반응성 IgE 생산을 억제하거나, 자가반응성 항체에 의한 호염기구 활성을 감소시키거나, 또는 바람직하지 못한 호염기구 활성을 달리 억제함으로써 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된 질환, 및 다른 자가면역 질환을 예방하거나 치료하는데 유용하다.

도 1A 내지 1D는 호염기구-의존성 T_H2 기울임(skewing)이 나이든 Lyn ^-/- 마우스의 현저한 특징임을 보인다. 도 1A는 나이든(30 주) WT 및 Lyn ^-/- 마우스로부터의 고갈되지 않은(Baso+) 또는 호염기구-고갈된(Baso-) 말초 혈액 세포에 대한 유식 세포측정 분석 그래프이다. 나타낸 데이터는 그룹당 3 마리 이상의 동물들에 대한 표본이다. 데이터를 CD11b⁺ 백혈구 상에서 수집하였다. 도 1B 내지 1D에서 WT 및 Lyn ^-/- 마우스로부터 비장세포를 수확하고, 10 μM 모넨신과 함께 배양하고, 형광 항-CD4 항체로 표지하고, 세포 내 IL-4 및 IFN-γ를 염색하였다. 도 1B는 WT 및 Lyn ^-/- 마우스로부터의 고갈되지 않은(Baso+) 또는 호염기구-고갈된(Baso-) CD4⁺ 세포에 대한 전형적인 유식 세포측정 분석이다(도 1A에 도시된 바와 같은). 도 1c는 CD4⁺IL-4⁺ T 세포에 대해 도 1B에서와 같은 모든 개별적인 실험들을 편집한 그래프이다. 도 1D는 CD4⁺IFN-γ⁺ T 세포에 대해 도 1B에서와 같은 모든 개별적인 실험들을 편집한 그래프이다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던트 t 검정에 의하였다; ^*: p<0.05; ^**: p<0.01; NS: 유의수준 아님.
도 2A 내지 2C는 Lyn ^-/- 마우스 중의 혈액 B 세포의 비율이 IgE, IL-4 및 비만 세포와 독립적임을 보인다. 도 2A 내지 2C에서, 상기 백혈구의 B 세포(B220⁺IgM⁺) 비율을 지시된 유전자 형에서 4 개의 별도의 연령 그룹에서 유식 세포측정에 의해 측정하였다. 연령 그룹 1: 5 내지 10 주된 것(평균 = 7.5 주); 연령 그룹 2: 12 내지 14 주된 것(평균 = 13 주); 연령 그룹 3: 17 내지 20 주된 것(평균 = 18.5 주); 연령 그룹 4: 35 내지 40 주된 것(평균 = 37.5 주). 도 2A는 그룹 및 유전자형에 따라, Igh7 ^+/+ Lyn ^+/+ 및 Igh7 ^-/- Lyn ^-/- 에 대해, n=12; WT에 대해, n=10 및 Lyn ^-/- n=12를 나타내는 그래프이다. WT 및 Lyn ^-/- 마우스는 C57BL/6 배경에 대한 것이었다. 도 2B는 그룹 및 유전자형에 따라, Il -4 ^+/+ Lyn ^+/+ 및 Il -4 ^-/- Lyn ^-/- 에 대해, n=12; WT에 대해, n=10 및 Lyn ^-/- n=12를 나타내는 그래프이다. 도 2C는 Kit^W-sh/W-sh 및 Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh Lyn ^-/- 에 대해, 그룹 1: 유전자형에 따라 n=9, 그룹 2: 유전자형에 따라 n=3; 그룹 3: 유전자형에 따라 n=11, 그룹 4: 유전자형에 따라 n=10; WT에 대해, n=10 및 Lyn ^-/- n=12를 나타내는 그래프이다. 데이터를 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 통계학적 분석을 변량의 2원 ANOVA 검정을 사용하여 수행하였다. 나타낸 p 값은 유전자형 인자 p 값이다.
도 3A 내지 3C는 Lyn 결핍 마우스에서 비장 B 세포의 비율이 IgE, IL-4 및 비만 세포와 독립적임을 보인다. 도 3A 내지 3C에서, 비장세포의 B 세포(B220⁺IgM⁺) 비율을 도 2A 내지 2C에 개시된 바와 같이 지시된 유전자형에서 4 개의 별도의 연령 그룹에서 유식 세포측정에 의해 측정하였다. 데이터를 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 통계학적 분석을 변량의 2원 ANOVA 검정을 사용하여 수행하였다. 나타낸 p 값은 유전자형 인자 p 값이다.
도 4A 내지 4F는 Lyn 결핍 마우스에서 골수 B 세포 비율 표현형이 IgE, IL-4 및 비만 세포와 독립적임을 보인다. 도 4A, 4C 및 4E에서, 골수세포의 전체 B 세포(B220⁺IgM⁺) 비율을 도 2에 개시된 바와 같이 지시된 유전자형에서 4 개의 별도의 연령 그룹에서 유식 세포측정에 의해 측정하였다. 도 4B, 4D 및 4F에서, BM 세포의 재순환하는 B1 세포(B220^hiIgM^int) 비율을 동일한 그룹에서 측정하였다. 데이터를 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 통계학적 분석을 변량의 2원 ANOVA 검정을 사용하여 수행하였다. 나타낸 p 값은 유전자형 인자 p 값이다.
도 5A 내지 5F는 연구된 마우스에서 상이한 면역글로불린 아이소타입의 혈청 수준을 나타낸다. 본 연구에 사용된 모든 유전자형에서 순환하는 IgM(도 5A), IgE(도 5B), IgA(도 5C), IgG1(도 5D), IgG2a(도 5E) 및 IgG2b(도 5F)의 ELISA에 의한 혈청 정량분석. WT, n=35; Lyn ^-/- n=35; Igh7 ^+/+ Lyn ^+/+ , n=43; Igh7 ^-/- Lyn ^-/- n=41; Igh7 ^-/- , n=3; Il -4 ^+/+ Lyn ^+/+ , n=41; Il -4 ^-/- Lyn ^-/- , n=42; IL4 ^-/- , n=4; Kit^W ^- ^sh ^/W-sh, n=18 및 Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh Lyn ^-/- , n=18. 도시된 데이터는 평균±s.e.m이다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던트 t 검정에 의하였다; ^*: p<0.05; ^**: p<0.01; ^***: p<0.001.
도 6A 내지 6F는 Lyn 결핍 마우스에서 CD11b⁺ 세포의 비종 및 비장 비율이 IgE, IL-4 및 비만 세포와 독립적임을 보인다. 도 6A, 6C 및 6E에서, 전체 비장 중량을 도 2에 개시된 바와 같이 지시된 유전자형에서 4 개의 별도의 연령 그룹으로부터의 비장에 대해 측정하였다. 도 6B, 6D 및 6F에서, 동일한 그룹으로부터의 비장 중 CD11b⁺ 세포의 비율을 유식세포측정에 의해 측정하였다. 데이터를 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 통계학적 분석을 변량의 2원 ANOVA 검정을 사용하여 수행하였다. 나타낸 p 값은 유전자형 인자 p 값이다.
도 7A 내지 7G는 Lyn 결핍 마우스의 비만 세포(그러나 호염기구 표현형은 아님)가 IgE에는 의존성이나, 상기 둘다는 IL-4 독립적임을 보인다. 도 7A, 7C 및 7E에서, 복막 중 비만 세포(FcεRIα⁺CD117⁺)의 비율을 도 2에 개시된 바와 같이 지시된 유전자형에 대해 4 개의 별도의 연령 그룹에서 복막 세척 후에 유식 세포측정에 의해 측정하였다. 도 7B, 7D, 7F, 및 7G에서, 전체 백혈구 집단 중 호염기구(FcεRIα⁺CD49b⁺CD11b⁺CD117^-)의 비율을 동일한 그룹에서 유식 세포측정에 의해 측정하였다. (도 7A 및 7B) Igh7 ^+/+ Lyn ^+/+ 및 Igh7 ^-/- Lyn ^-/- 에 대해, 그룹 및 표현형에 따라, n=12; WT에 대해, n=10 및 Lyn ^-/- , n=12. (도 7C 및 7D) Il -4 ^+/+ Lyn ^+/+ 및 Il -4 ^-/- Lyn ^-/- 에 대해, 그룹 및 표현형에 따라, n=12; WT에 대해, n=10 및 Lyn ^-/- , n=12. (도 7E 및 7F) 그룹 1: WT n=8 및 Lyn ^-/- , n=11, 그룹 2: WT n=14 및 Lyn ^-/- , n=9, 그룹 3: WT n=14 및 Lyn ^-/- , n=11, 그룹 4: WT n=10 및 Lyn ^-/- , n=12. (도 7G) Kit^W ^-sh/W-sh 및 Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh Lyn ^-/- 에 대해, 그룹 1: 유전자형에 따라 n=9, 그룹 2: 유전자형에 따라 n=3, 그룹 3: 유전자형에 따라 n=11, 그룹 4: 유전자형에 따라 n=10; WT에 대해 n=10 및 Lyn ^-/- n=12. 데이터를 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 통계학적 분석을 변량의 2원 ANOVA 검정을 사용하여 수행하였다. 나타낸 p 값은 유전자형 인자 p 값이다.
도 8A 내지 8D는 Lyn ^-/- 마우스에서 루프스-형 신염이 IL-4 및 IgE 의존적임을 보인다. 도 8A는 지시된 유전자형의 나이든 마우스(40 주 이상)로부터의 H&E 염색된 조직학적 신장 절편으로부터 획득한 사구체신염 점수를 나타낸다. 데이터는 평균±s.e.m.으로서 나타낸다. (WT 및 Lyn ^-/- 에 대해: n=8; WT 및 lgh7 ^-/- ; Lyn ^-/- 에 대해: n=6; WT 및 Il -4 ^-/- ; Lyn ^-/- 에 대해: n=5; Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh 및 Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh; Lyn ^-/- 에 대해: n=11). 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던트 t 검정에 의하였다; ^***: p<0.001; NS, 유의수준 아님. 도 8B는 지시된 유전자형의 나이든 마우스(40 주된 것)의 H&E 염색된 조직학적 신장 절편에서 전형적인 사구체의 현미경 사진 패널이다. 스케일 바, 50 ㎛. 도 8C는 마우스 IgG에 대한 플루오레세인-접합된 항체로 염색 후 지시된 유전자형의 나이든 마우스(40 주) 중의 사구체 IgG 침착물의 면역형광 검출의 현미경 사진 패널이다. 스케일 바, 50 ㎛. 도 8D는 그룹당 지시된 유전자형의 최소 15 마리의 나이든 마우스(40 주)의 소변에서 측정된 ACR의 그래프이다. 데이터는 평균±s.e.m이다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던트 t 검정에 의하였다; ^***: p<0.001.
도 9는 Lyn ^-/- 마우스에서 루프스-형 사구체신염이 IL-4 및 IgE 의존적이나 비만 세포 독립적임을 보인다. H&E 염색된, 지시된 유전자형의 40 주된 마우스로부터의 전형적인 조직학적 신장 절편. 원래 배율 x 10. 상기 절편을 사용하여 도 8에 개시된 바와 같은 사구체신염 점수를 확립시켰다(원래 배율 x 40으로 나타낸다). 스케일 바, 500 ㎛.
도 10A 내지 10C는 Lyn 결핍 마우스에서 사구체 면역 복합체 침착이 IgE 및 IL-4 의존적이나, 비만 세포는 독립적임을 보인다. 도 10A 내지 10C에서, 지시된 유전자형의 40 주된 마우스로부터의 신장을 방법에 개시된 바와 같이 처리하였다. 지시된 항원에 대해 발생한 플루오레세인-접합된 항체에 의한 면역형광 염색을 수행하였다(도 10A, IgM; 도 10B, IgA; 도 10C, 보체 성분 3(C3)). 나타낸 사진은 유전자형에 따른 5 마리 이상의 상이한 40 주된 마우스에 대해 획득된 유전자형에 따른 100 개 이상의 사구체에 대한 표본이다. 원래 배율 x 40. 스케일 바, 50 ㎛.
도 11A 내지 11F는 IgE, 호염기구, 및 IL-4가 Lyn ^-/- 마우스에서 자가항체 생산을 조절하며 호염기구는 신장 사이토킨 환경을 변경시킴을 보인다. 도 11A는 지시된 유전자형의 나이든 마우스(40 주)의 혈청 중 dsDNA-특이성 IgG의 정량분석 그래프이다. 데이터는 평균±s.e.m이다(그룹당 15 마리 마우스 이상). 도 11B는 도 11A에서 연구된 마우스에서 ANA-특이성 IgG의 정량분석 그래프이다. 도 11C는 호염기구-고갈 항체 MAR-1(-) 또는 아이소타입 대조군(+)의 주입 전(D0) 및 주입 후 6일째(D6)의 지시된 유전자형의 나이든 마우스(32 주)의 혈청 중 ANA-특이성 IgG 자가항체의 정량분석 그래프이다. 데이터는 평균±s.e.m이다(WT: n=3; Lyn ^-/- (+): n=4; Lyn ^-/- (-): n=5). 도 11D는 지시된 유전자형의 마우스(20주된 것)의 혈청에 대한, 도 11C에서와 동일한 정량분석의 그래프이다. 데이터는 평균±s.e.m이다(각각의 그룹에 대해, n=3). 도 11E는 호염기구 고갈(-) 또는 아이소타입 주입(+) 후 6일째에 마우스에서 유식 세포측정에 의해 측정된 비장 CD138⁺CD19⁺ 혈장 세포의 비율의 플롯이다. 사이토킨 양을 전체 단백질 함량 단일(도 11A, 11B, 11E 및 11F) 또는 대응표본(도 11C 및 11D) 스튜던츠 t 검정에 대해 표준화하였다; ^*: p<0.05; ^**: p<0.01; ^***: p<0.001.
도 12A 내지 12D는 호염기구-고갈이 Lyn ^-/- 마우스의 신장에서 염증전 사이토킨 환경을 감소시킴을 보인다. 도 12A 내지 12D는 방법에 개시된 바와 같이 호염기구 고갈(MAR-1 주입, 호염기구-) 또는 비-고갈(아이소타입 주입, 호염기구+) 후 6일째에 40 주된 WT 및 Lyn ^-/- 마우스로부터의 신장 균질물 중의 지시된 사이토킨의 ELISA 정량분석 그래프이다. 사이토킨 양을 각 균질물의 전체 단백질 함량에 대해 표준화하였다. 데이터를 평균±s.e.m으로 나타낸다(WT 및 Lyn ^-/- , 그룹당 n=4 이상). 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던츠 t 검정에 의하였다; NS: 유의수준이 아님, ^*: p<0.05.
도 13A 내지 13D는 자가 반응성 IgE 및 IgE-순환 면역 복합체(CIC)가 나이든 Lyn ^-/- 마우스의 혈청 중에 존재함을 보인다. 도 13A는 반정량적인 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 지시된 유전자형의 나이든 마우스(40 주)의 혈청 중 dsDNA-특이적 IgE의 정량분석 플롯이다. 데이터를 평균±s.e.m으로 나타내고(그룹 당 10 마리 초과의 마우스), 각각의 WT 대조군에 대해 표준화하고 임의의 단위로 나타낸다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던트 t 검정에 의하였다; ^*P<0.05; ^***P<0.001. 도 13B에서, lgh7 ^-/- ; Lyn ^-/- 및 Il -4 ^-/- ; Lyn ^-/- 나이든 마우스(>30 주)의 혈청 샘플로부터 IgE-CIC 및 IgG-CIC가 감소된다. 웨스턴 블럿을 마우스 IgE에 대한 항체 또는 마우스 IgG에 대한 항체로 탐침하였다. 유전자형당 10 마리 이상의 마우스 중 하나의 표본을 나타낸다. 도 13C는 보체 인자 1q(Clq)-코팅된 플레이트 상의 유전자형당 10 마리 이상의 나이든 마우스로부터 반정량적인 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, CIC(IgA, IgM 및 IgG)의 혈청 수준의 그래프이다. 데이터를 평균±s.e.m으로 나타내고, WT 마우스에서의 수준에 대해 표준화하고 임의의 단위로 보고한다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던트 t 검정에 의하였다; ^*P<0.05; ^**P<0.01; ^***P<0.001. 도 13D는 지시된 자극, PMA+이오노마이신, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(20 nM) + 이오노마이신(400 nM)에 위해 유발된 (골수-유도된) 호염기구로부터의 IL-4 생산의 플롯이다. IL-4의 세포 내 염색에 의해 검출된 평균 형광 강도(MFI)를 비자극(-) 대조군의 반응에 대해 표준화하고 임의의 단위로 나타내었다. 데이터를 평균±s.e.m으로 나타낸다(3 개의 독립적인 실험에 대한 조건당 n=6). 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던츠 t 검정에 의하였다; ^*P<0.05; ^**P<0.01.
도 14A 내지 14E는 루푸스 성향의 Lyn ^-/- 마우스가 IgE, IgG 및 IgA의 순환하는 면역 복합체를 함유함을 보인다. 도 14A는 5 마리의 상이한 45 주된 WT 및 Lyn ^-/- 마우스(각각의 유전자형에 대해 1 내지 5 마리)의 혈청으로부터의 PEG₆₀₀₀ 침전된 순환하는 면역 복합체(CIC)의 웨스턴 블럿 분석이다. 도 14A 상부 패널: 래트 항-마우스 IgE 면역블럿(IgE-CIC). 도 14A 중간 패널: 전체 IgE의 수준과 IgE-CIC 침전된 양(상부 패널) 간에 상관성이 없음을 보이는 상기 동일한 마우스에서의 전체 혈청 IgE의 ELISA 정량분석. 도 14A 하부 패널: NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 상부 패널에서 나타낸 것과 유사한 면역블럿의 농도계 분석. 도 14B는 염소 항-마우스 IgG에 대한 IgG-CIC(상부 패널), 전체 IgG ELISA(중간 패널) 및 IgG-CIC의 농도계 분석(하부 패널)에 대해서 도 14A에서와 동일하다. 도 14C는 염소 항-마우스 IgA에 대한 IgA-CIC(상부 패널), 전체 IgA ELISA(중간 패널) 및 IgA-CIC의 농도계 분석(하부 패널)에 대해서 도 14A에서와 동일하다. 도 14D 및 14E는, 도 14A 및 14B에서 나타낸 전형적인 것들을 도 14A 내지 14C에서와 같이 농도계에 의해 정량분석한 것과 같이 IgE-CIC 도 14D 및 IgG-CIC 도 14E에 대해 정량분석된 면역블럿의 플롯이다. 모든 유전자형들을 분석하였다. 데이터를 평균±s.e.m으로 나타낸다(WT 및 Lyn ^-/- , 그룹당 n=10, 모든 다른 유전자형, 그룹당 n=5). 제공된 데이터는 5 개 이상의 독립적인 실험들의 표본이다.
도 15A 내지 15D는 IgE-IC(그러나 IgG-IC는 아님)가 호염기구에 의해 사이토킨 생산을 유도함을 보인다. 도 15A & 15B는 WT 및 Lyn ^-/- 마우스에서 골수 유도된 호염기구(BMBa)에 의한 IL-4 생산의 전형적인 유식 세포측정 분석이다. 세포를 지시된 자극으로 4 시간 동안 자극하고 최종 2 시간의 자극 동안 10 μM 모넨신과 함께 배양하였다. 이어서 세포를 마우스 호염기구 마커(CD49b, FcεRIα 및 CD11b)에 대해 세포 외 염색하고 IL-4 생산에 대해 세포 내 염색하였다. 모든 이러한 결과들에 대한 편집을 도 13D에 나타낸다. 도 15C는 도 15A 및 15B에서와 동일한 프로토콜을 사용하지만 세포를 IL-12p40 생산에 대해 세포 외 염색하였다. 색칠된 것: 아이소타입 대조군, 점선: IgE+Ag 자극된 BMBa, 검은색 실선: PMA/이오노마이신 자극된 BMBa, 회색 실선: PMA/이오노마이신 자극 후 IL-12p40을 생산하는 BM 세포 집단 CD49b^-FcεRIα^-(비-호염기구, 비-비만세포). 도 15D는 도 15C에서와 같지만 세포를 IFN-γ 생산에 대해 세포 내 염색하였다. 도 15C 및 15D에서 시험된(도 15A&15B에서와 같이) 자극 중 어느 것도 호염기구가 IL-12p40 또는 IFN-γ를 생산하게 하지 못하였다.
도 16A 내지 16G는 나이든 Lyn ^-/- 마우스로부터의 호염기구가 CD62L 발현을 상향조절하며, 2차 림프구 조직으로 회귀시키고 막 BAFF 및 MHC II를 발현함을 보인다. 도 16A는 아이소타입 대조군(회색으로 색칠된 것)에 비해 나이든(40 주) WT(회색 점선) 및 Lyn ^-/- 마우스(검은색 선)에서의 혈액 호염기구 CD62L 발현에 대힌 전형적인 유식 세포측정 분석이다. 도 16B는 지시된 유전자형의 나이든 마우스로부터의 도 16A에서와 같이 수행된 모든 실험으로부터 모은 데이터이다. 혈액 호염기구 상에서의 CD62L 발현의 평균 형광 강도(MFI)를 상응하는 WT 대조군에 대해 표준화하고 임의의 단위로 평균±s.e.m으로 나타낸다(WT 및 Lyn ^-/- : n=4 및 n=7; WT 및 lgh7 ^-/- ; Lyn ^-/- : n=3; WT 및 Il -4 ^-/- ; Lyn ^-/- : n=3; Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh 및 Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh Lyn ^-/- : n=4 및 n=7). 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던츠 t 검정에 의하였다; ^*P<0.05. 도 16C 내지 16E는 전체 세포 수에 대해 지시된 마우스 계통의 림프절(경부 및 서혜부) 도 16C, 비장 도 16D, 및 혈액 16E에서의 호염기구(FcεRI⁺CD11b⁺CD49b⁺ 세포로서 정의됨)의 유식 세포측정 분석이다. 도 16F 및 16G는 아이소타입 대조군(회색으로 색칠됨)에 비해 Lyn ^-/- 마우스(검은선)의 림프절에서의 호염기구 막 BAFF(도 16F) 또는 MHC II(I-A/I-E)(도 16G) 발현의 전형적인 유식 세포측정 분석이다.
도 17은 MHC II 발현이 Lyn ^-/- 마우스로부터의 비장 호염기구 상에서 증가함을 보인다. 비장 호염기구 MHC II 발현(I-A/I-E)의 전형적인 유식 세포측정 분석. 호염기구를 아이소타입 대조군(회색으로 색칠됨)에 비해 나이든(40 주) WT(좌측 패널, 검은선) 및 Lyn ^-/- 마우스(우측 패널, 검은선)에서 FcεRI⁺CD117^-CD49b⁺ 세포로서 정의되었다.
도 18A 내지 18D는 dsDNA-특이성 IgE 및 IgE-특이성 IgG가 인간 SLE 질병 활성 및 루푸스 신염과 관련됨을 보인다. 도 18A는 건강한 대조군(n=37), 비활동성 SLE(SLEDAI = 0)를 갖는 개인(n=13), 순한 질병(SLEDAI = 2.0 내지 ≤4.0)을 갖는 개인(n=15) 및 활동성 질병(SLEDAI > 4)을 갖는 개인으로부터의 혈청에서, ELISA에 의해 측정된 바와 같은 전체 CIC를 나타낸다. 데이터를 평균±s.e.m으로 나타낸다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던츠 t 검정에 의하였다; ^*P<0.05; ^**P<0.01; ^***P<0.001. 도 18B는 반정량적인 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 dsDNA-특이성 IgE 수준의 그래프이다. dsDNA-코팅된 플레이트를 건강한 대조군 및 SLE를 갖는 환자(도 18A에서와 동일한 집단)로부터의 혈청과 함께 배양하였다. 데이터는 평균±s.e.m이고(도 18A에서와 동일한 n) 건강한 대조군에 대해 표준화되었다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던츠 t 검정에 의하였다; ^*P<0.05; ^***P<0.001. 도 18C는 인간 IgE-코팅된 플레이트 상에서 건강한 대조군 및 SLE를 갖는 개인으로부터의 혈청을 배양함으로써 측정된 바와 같은 IgE-특이성 IgG 수준의 플롯이다. IgE-특이성 IgG를 인간 IgG에 대한 항체(Fcγ 특이성)로 검출하였다. 데이터는 평균±s.e.m이고(도 18A에서와 동일한 n) 건강한 대조군에 대해 표준화되었다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던츠 t 검정에 의하였다; ^**P<0.01. 도 18D는 활동성 신염(있음, n=8)이거나 또는 아닌(없음, n=34) 경우를 기준으로 분류된 SLE를 갖는 환자의 혈청 중 dsDNA-특이성 IgE이다. 데이터는 평균±s.e.m이다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던츠 t 검정에 의하였다.
도 19A 내지 19C는 SLE 환자에서의 전체 IgE 수준 및 dsDNA 면역글로불린 하위부류를 나타낸다. 도 19A는 ELISA에 의한, 건강한 대조군(n=27) 및 SLE 환자(n=33)에서의 전체 혈청 IgE 수준의 정량분석에 대한 플롯이다. 도 19B는 도 19A에서와 동일한 측정이나, 비활동성/보통/활동성 SLE 환자(도 18A에 개시된 바와 같은 (n=9/13/11)) 대 건강한 대조군(n=27)에 대한 그의 관계를 나타낸다. 나타낸 데이터는 평균±s.e.m이다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던츠 t 검정에 의하였다; NS: 유의수준이 아님, ^*: p<0.05. (c) IgG 항-dsDNA 하위부류 및 IgE 항-dsDNA를 반-정량적인 ELISA에 의해 측정하였다. dsDNA 코팅된 플레이트를 건강한 대조군(n=5) 및 SLE 환자(n=43)로부터의 혈청과 함께 배양하고 자가반응성 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgE를 상응하는 특이성 항-인간 Fc 부분 HRP-접합된 것으로 검출하였다. 도시된 데이터를 건강한 대조군에 대해 표준화하고 평균±s.e.m으로 나타낸다.
도 20A 내지 20F는 SLE를 갖는 개인의 호염기구가 활성이고, CD62L 및 HLA-DR을 상향조절하고, 2차 림프구 기관으로 회귀함을 보인다. 도 20A는 대조군(n=41)에 비해 도 18A에 대한 범례에서 정의된 바와 같이 비활동성, 순한, 또는 활동성 SLE((각각 n=13, n=15 및 n=15))를 갖는 환자들로부터의 질병 강도에 대한 활성화된 혈액 호염기구(CD203c 발현)의 수준에 대한 유식 세포측정 분석 그래프이다. 데이터는 대조군에 대해 표준화되고 임의의 단위로 나타낸 CD203c 평균 형광 강도(MFI)의 비이다. 도 20B는 도 20A에서와 같은 환자 그룹에서 혈액 호염기구에 대한 CD62L 발현(MFI)의 유식 세포측정 분석 플롯이다. 데이터를 20A에서와 같이 표준화하고 임의의 단위(AU)로 평균±s.e.m으로 나타낸다(건강한 대조군: n=13; SLE 환자: 비활동성/순함/활동성 n=4/6/6). 도 20D는 유식 세포측정에 의해 측정된 바와 같은 혈액 호염기구의 무명수의 플롯이다(건강한 대조군: n=41; 비활동성 SLE: n=13; 보통 SLE: n=15; 활동성 SLE: n=15). 데이터는 평균±s.e.m이다. 도 20A 내지 20D에서, 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던츠 t 검정에 의하였다; ^*P<0.05; ^**P<0.01; ^***P<0.001. 도 20E 및 20F는 건강한(정상) 대조군 또는 SLE를 갖는 환자(n=2)의 림프절(도 20E) 또는 비장(도 20F) 중의 호염기구의 면역조직화학(2D7 단클론 항체에 대한)의 현미경사진이다. 호염기구가 오직 SLE를 갖는 개인의 림프절 배중심의 B 세포 대역에서 발견되었다(도 20E). 건강한(정상) 대조군 또는 SLE를 갖는 개인으로부터의 비장 생검은 SLE를 갖는 환자(그러나 정상 대조군은 아님)의 배중심에서의 호염기구의 국소화를 나타낸다(도 20F). 유사한 결과를 제 2 호염기구-특이성 항체(BB1)에 의해 획득하였다(데이터 도시 안 됨). 원래 배율 x 20. 스케일 바, 200 ㎛. 삽입물은 보다 큰 상의 상자안 영역을 나타낸다. 원래 배율 x 40. 스케일 바, 25 ㎛.
도 21A 내지 21D는 혈액 호염기구 수 및 HLA-DR 발현에 대한 면역억제 치료 효과를 나타낸다. 도 21A는 말초 혈액 호염기구 수가 면역억제 치료(IST)(15 ㎎/일 초과의 프레드니손 및/또는 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸로서 정의됨)를 받은 환자에서 현저하게 더 낮음을 보인다. 도 21B 및 21D는 낮은 용량(≤7.5 ㎎/일) 또는 중간 내지 고 용량(>7.5 ㎎/일)의 프레드니손을 받은 환자들 가운데 말초 호염기구(도 21B) 또는 HLA-DR 발현 호염기구(도 21D)의 수에 대한 차이는 없었음을 보인다. 도 21C는 IST가 있고 없는 환자 간의 HLA-DR⁺ 호염기구의 비율에 있어서 차이가 없었음을 보인다. 나타낸 데이터는 평균±s.e.m이다. 통계학적 분석은 양방 단일 스튜던츠 t 검정에 의하였다.
도 22는 SLE 환자의 인구 통계적 특징을 나타내는 표이다.
도 23은 사용된 상업적으로 입수할 수 있는 항체들의 표이다.

정의

"오말리주맵"은 인간 면역글로불린 E(IgE)에 선택적으로 결합하는 재조합 DNA-유도된 인간화된 IgG 단클론 항체를 의미한다. 본 발명에서 지칭되는 바와 같은 오말리주맵은 또한 상표명 엑솔에어(Xolair)로 나타내는 항체 임상제를 가리킨다.

"항-IgE 요법"이란 용어는 본 발명에서 그의 통상적인 의미로 사용되며 IgE의 발현 및/또는 작용을 억제 또는 차단하거나 또는 인간을 포함한 영장류와 같은 환자에서 IgE를 제거하거나 IgE의 반감기를 감소시키는 치료 섭생을 포함한다.

"자가반응성 또는 자기-반응성 IgE"는 숙주 중에 존재하는 에피토프에 대한 IgE 면역글로불린을 의미한다. IgE 또는 자가반응성 IgE의 측정 방법은 ELISA, 루미넥스(Luminex), 또는 공지된 항원, 예를 들어 dsDNA, ANA, La, Ro, Sm, 인지질 등에 대한 자가반응성 IgE의 측정을 허용하는 다른 플랫폼들을 포함한다.

"호염기구 활성화"는 IgE에 대한 Fc 수용체("FcεR")에 결합하는 IgE를 호염기구의 탈과립에 이르게 하는 과정을 의미한다. 호염기구 활성화, 수, 또는 활성의 측정 방법은 비제한적으로 호염기구의 표면상에서의 CD203c 발현의 측정을 포함한다.

"루푸스" 또는 "전신 홍반성 루푸스(SLE)"란 용어는 본 발명에서 그의 통상적인 의미로 사용되며 자가항체, 발진, 구강 궤양, 장막염, 신경 질환, 저 혈구수, 관절 통증 및 부기의 존재를 특징으로 하는 자가면역 질환을 포함한다. 진단에 사용되는 시험은 항체 시험(예를 들어 항핵 항체(ANA) 패널, 항-이중 가닥(ds) DNA, 항인지질 항체, 항-스미스 항체); 낮은 백혈구, 헤모글로빈 또는 혈소판을 나타내는 CBC; 늑막염 또는 심낭염을 나타내는 흉부 x-선; 신장 생검; 소변 중 혈액, 원주 또는 단백질을 보이는 요검사를 포함한다.

"루푸스 신염"은 전신 홍반성 루푸스(SLE)에 의해 야기된 신장의 염증을 특징으로 하는 질환을 의미한다.

"루푸스-관련된 질환"은 자기-반응성 IgE 및 호염기구 활성화를 특징으로 하는 임의의 병적인 상태를 의미한다. 상기와 같은 질환은 비제한적으로 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염, 항인지질 증후군, 근염, 강피증 등을 포함한다.

"포스타마티니브"는 IgG Fc 수용체 신호전달을 차단하는 경구 이용 가능한 Syk 키나제 억제제를 의미한다. 포스타마티니브는 하기의 화학식을 갖는다:

"작용제"는 임의의 소 분자 화학 화합물, 항체, 핵산 분자, 또는 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 의미한다.

"개선하다"는 질병의 발생 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 완화, 정지 또는 안정화시킴을 의미한다.

"변경"은 본 발명에 개시된 바와 같은 공지된 표준 기법들에 의해 측정된 바와 같은 유전자 또는 폴리펩타이드의 발현 수준 또는 활성의 변화(증가 또는 감소)를 의미한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 변경은 발현 수준의 10% 변화, 바람직하게는 발현 수준의 25% 변화, 보다 바람직하게는 40% 변화, 및 가장 바람직하게는 50% 이상의 변화를 포함한다.

"동족체"는 동일하지는 않지만 유사한 작용적 또는 구조적 특징을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 동족체는 상응하는 천연 폴리펩타이드의 생물 활성을 유지하지만, 동시에 천연 폴리펩타이드에 비해 상기 동족체의 작용을 향상시키는 몇몇 생화학적 변형을 갖는다. 상기와 같은 생화학적 변형은 상기 동족체의 프로테아제 내성, 막 투과성, 또는 반감기를, 변경 없이, 예를 들어 리간드 결합 없이 증가시킬 수 있다. 동족체는 비천연 아미노산을 포함할 수도 있다.

본 명세에서, "포함하다", "포함하는", "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 상기 용어들로 여겨지는 의미를 가지며, "포함하다", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "로 필수적으로 이루어지는" 또는 "필수적으로 이루어지다"는 마찬가지로 미국 특허법에서 상기 용어들로 여겨지는 의미를 가지며, 상기 용어는 오픈-엔드로, 인용되는 것의 기본적인 또는 신규의 특징들이 상기 인용되는 것보다 더 많은 존재에 의해 변화되는 것이 아닌 한, 상기 인용된 것보다 더 많은 존재를 허용하나, 종래 기술 실시태양들은 제외한다.

"검출한다"는 검출하고자 하는 분석물질의 존재, 부재 또는 양을 확인함을 지칭한다.

"검출 가능한 표지"는 관심 분자에 결합 시 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단을 통해 상기 관심 분자를 검출 가능하게 하는 조성물을 의미한다. 예를 들어 유용한 표지는 방사성 동위원소, 자기 비드, 금속 비드, 콜로이드성 입자, 형광 염료, 전자-고밀도 시약, 효소(예를 들어 ELISA에 통상적으로 사용되는 바와 같은), 비오틴, 디곡시제닌, 또는 합텐을 포함한다.

"질병"은 세포, 조직 또는 기관의 정상적인 작용을 손상시키거나 방해하는 임의의 상태 또는 장애를 의미한다. 질병의 예로는 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염 항인지질 증후군, 근염, 강피증 등이 있다.

"유효량"은 치료되지 않은 환자에 대해 질병의 증상들을 개선시키는데 필요한 양을 의미한다. 질병의 치료학적 치료를 위해 본 발명을 실시하는데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 및 일반적인 건강에 따라 변한다. 최종적으로, 주치의 또는 수의사가 적합한 양 및 투여량 섭생을 결정할 것이다. 상기와 같은 양을 "유효"량이라 칭한다.

본 발명은 본 발명에 기술된 방법에 의해 특성화된 질환의 치료에 고도로 특이적인 약물의 개발에 유용한 다수의 표적을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 환자에게 사용하기에 안전한 요법을 확인하는데 용이한 수단을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 다량의 처리량, 높은 감도, 및 낮은 복잡성으로, 본 발명에 개시된 질병에 대한 효과에 대해 임의의 수의 화합물들을 실질적으로 분석하기 위한 수단을 제공한다.

"단편"은 폴리펩타이드 또는 핵산 분자의 일부를 의미한다. 상기 부분은 바람직하게는 기준 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 전체 길이의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상을 차지한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 함유할 수도 있다.

"하이브리드화"는 상보적인 핵염기들 사이의, 와트슨-크리크, 후그스틴 또는 역전된 후그스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합을 의미한다. 예를 들어, 아데닌과 티민은 수소 결합의 형성을 통해 짝을 이루는 상보적인 핵염기들이다.

"억제성 핵산"은 포유동물 세포에 투여 시 표적 유전자의 발현을 감소시키는(예를 들어 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 심지어 90 내지 100%까지) 이중 가닥 RNA, siRNA, shRNA, 또는 안티센스 RNA 또는 이들의 일부, 또는 이들의 유사물질을 의미한다. 전형적으로, 핵산 억제제는 표적 핵산 분자 또는 그의 이종상동체(ortholog)의 적어도 일부를 포함하거나, 또는 표적 핵산 분자의 상보성 가닥의 적어도 일부를 포함한다. 예를 들어 억제성 핵산 분자는 본 발명에 기술된 핵산들 중 임의의 핵산 또는 전체 핵산의 적어도 일부를 포함한다.

"단리된 폴리뉴클레오타이드"는 본 발명의 핵산이 유도된 유기체의 천연 게놈 중에서 유전자에 인접한, 상기 유전자가 없는 핵산(예를 들어 DNA)을 의미한다. 따라서 상기 용어는 예를 들어 벡터 내에; 자체 복제성 플라스미드 또는 바이러스 내에; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내에 통합되거나; 또는 다른 서열들과 독립적인 별도의 분자(예를 들어 cDNA 또는 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 생성된 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 상기 용어는 DNA 분자로 전사되는 RNA 분자뿐만 아니라 추가적인 하이브리드 유전자 암호화 폴리펩타이드 서열의 부분인 재조합 DNA를 포함한다.

"단리된 폴리펩타이드"는 자연히 동반되는 성분들과 분리된 본 발명의 폴리펩타이드를 의미한다. 전형적으로, 상기 폴리펩타이드는 자연히 결합되는 단백질 및 천연 유기 분자가 60 중량% 이상 없을 때 단리된다. 바람직하게는, 상기 제제는 중량 기준으로, 본 발명 폴리펩타이드의 75% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 99% 이상이다. 본 발명의 단리된 폴리펩타이드를 예를 들어 천연 공급원으로부터의 추출에 의해서, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해서, 또는 상기 단백질을 화학적으로 합성함으로써 수득할 수 있다. 순도를 임의의 적합한 방법, 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해서, 또는 HPLC 분석에 의해서 측정할 수 있다.

"마커"는 질병 또는 질환과 관련된 발현 수준 또는 활성의 변경을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "작용제를 수득함"에서와 같이 "수득함"은 상기 작용제를 합성함, 구입함, 또는 달리 획득함을 포함한다.

"프라이머 세트"는 예를 들어 PCR에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 세트를 의미한다. 프라이머 세트는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600 이상의 프라이머로 이루어질 것이다.

"감소하다"는 10%, 25%, 50%, 75% 또는 100% 이상의 음의 변경을 의미한다.

"기준"은 표준 또는 대조용 조건을 의미한다.

"기준 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로서 사용되는 한정된 서열이다. 기준 서열은 명시된 서열의 부분집합 또는 전체일 수 있다; 예를 들어 완전 길이 cDNA 또는 유전자 서열의 구획, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열. 폴리펩타이드의 경우, 기준 폴리펩타이드 서열의 길이는 일반적으로 약 16 아미노산 이상, 바람직하게는 약 20 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 약 25 아미노산 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 35 아미노산, 약 50 아미노산, 또는 약 100 아미노산일 것이다. 핵산의 경우, 기준 핵산 서열의 길이는 일반적으로 약 50 뉴클레오타이드 이상, 바람직하게는 약 60 뉴클레오타이드 이상, 보다 바람직하게는 약 75 뉴클레오타이드 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 100 뉴클레오타이드 이상 또는 약 300 뉴클레오타이드 이상 또는 그 부근 또는 그 사이의 임의의 정수일 것이다.

"siRNA"는 이중 가닥 RNA를 의미한다. 임의로, siRNA는 길이가 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 뉴클레오타이드이며 그의 3' 단부에 2 개의 염기 돌출부를 갖는다. 상기 dsRNA를 개별적인 세포 또는 완전체 동물에 도입시킬 수 있다; 예를 들어 상기를 혈류를 통해 전신으로 도입시킬 수 있다. 상기와 같은 siRNA를 사용하여 mRNA 수준 또는 프로모터 활성을 하향조절한다.

"특이적으로 결합하다"는 본 발명의 폴리펩타이드를 인식하고 이에 결합하지만, 본 발명의 폴리펩타이드를 천연으로 포함하는 샘플, 예를 들어 생물 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않고 결합하지 않는 화합물 또는 항체를 의미한다.

본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 상기와 같은 핵산 분자는 내생적인 핵산 분자와 100% 일치할 필요는 없지만 전형적으로는 상당한 일치성을 나타낼 것이다. 내생적인 서열에 대해 "실질적인 일치성"을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로는 이중 가닥 핵산 분자의 하나 이상의 가닥과 하이브리드화할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 상기와 같은 핵산 분자는 내생적인 핵산 서열과 100% 일치할 필요는 없지만 전형적으로는 실질적인 일치성을 나타낼 것이다. 내생적인 서열에 대해 "실질적인 일치성"을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 핵산 분자의 하나 이상의 가닥과 하이브리드화할 수 있다. "하이브리드화하다"는 다양한 엄격성의 조건 하에서 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열들(예를 들어 본 발명에 개시된 유전자) 사이에서 이중 가닥 분자 또는 그의 일부를 형성하도록 짝을 이루는 것을 의미한다(예를 들어 문헌[Wahl, G.M. and S.L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152:399]; [Kimmel, A.R.(1987) Methods Enzymol. 152:507]을 참조하시오.

예를 들어, 엄격한 염 농도는 통상적으로 약 750 mM 미만의 NaCl 및 75 mM 삼나트륨 시트레이트, 바람직하게는 약 500 mM 미만의 NaCl 및 50 mM 삼나트륨 시트레이트, 및 보다 바람직하게는 약 250 mM 미만의 NaCl 및 25 mM 삼나트륨 시트레이트일 것이다. 낮은 엄격성 하이브리드화를 유기 용매, 예를 들어 폼아미드의 부재 하에서 획득할 수 있는 반면, 높은 엄격성 하이브리드화는 약 35% 이상의 폼아미드, 및 보다 바람직하게는 약 50% 이상의 폼아미드의 존재 하에서 획득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 통상적으로 약 30 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 약 37 ℃ 이상, 및 가장 바람직하게는 약 42 ℃ 이상의 온도를 포함할 것이다. 다양한 추가적인 매개변수들, 예를 들어 하이브리드화 시간, 세제, 예를 들어 나트륨 도데실 설페이트(SDS)의 농도, 및 담체 DNA의 포함 또는 제외는 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 다양한 수준의 엄격성은 이들 다양한 조건들을 필요에 따라 조합함으로써 수행된다. 바람직한 실시태양에서, 하이브리드화는 750 mM NaCl, 75 mM 삼나트륨 시트레이트 및 1% SDS 중에서 30 ℃에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 실시태양에서, 하이브리드화는 500 mM NaCl, 50 mM 삼나트륨 시트레이트, 1% SDS, 35% 폼아미드 및 100 .mu.g/㎖ 변성된 연어 정자 DNA(ssDNA) 중에서 37 ℃에서 일어날 것이다. 가장 바람직한 실시태양에서, 하이브리드화는 250 mM NaCl, 25 mM 삼나트륨 시트레이트, 1% SDS, 50% 폼아미드, 및 200 ㎍/㎖ ssDNA 중에서 42 ℃에서 일어날 것이다. 이들 조건에 대한 유용한 변동은 당해 분야의 숙련가들에게 쉽게 자명할 것이다.

대부분의 용도에 대해서, 하이브리드화에 이은 세척 단계가 또한 엄격성에 있어서 다양할 것이다. 세척 엄격성 조건은 염 농도 및 온도에 의해서 한정될 수 있다. 상기에서와 같이, 세척 엄격성은 염 농도를 감소시키거나 또는 온도를 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에 엄격한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM 미만 NaCl 및 3 mM 삼나트륨 시트레이트, 및 가장 바람직하게는 약 15 mM 미만 NaCl 및 1.5 mM 삼나트륨 시트레이트일 것이다. 세척 단계에 대한 엄격한 온도 조건은 통상적으로 약 25 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 약 42 ℃ 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 68 ℃ 이상의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 실시태양에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 삼나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS 중에서 25 ℃에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 실시태양에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 삼나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS 중에서 42 ℃에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 실시태양에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 삼나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS 중에서 68 ℃에서 일어날 것이다. 이들 조건에 대한 추가적인 변동은 당해 분야의 숙련가들에게 쉽게 자명할 것이다. 하이브리드화 기법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Benton and Davis, Science 196:180, 1977]; [Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001]; [Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 개시되어 있다.

"실질적으로 일치하는"은 기준 아미노산 서열(예를 들어 본 발명에 개시된 아미노산 서열들 중 어느 하나) 또는 핵산 서열(예를 들어 본 발명에 개시된 핵산 서열 중 어느 하나)에 50% 이상의 일치성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는 상기와 같은 서열은 비교에 사용된 서열에 대해 아미노산 수준 또는 핵산 수준이 60% 이상, 보다 바람직하게는 80% 또는 85%, 및 보다 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 99% 일치한다.

서열 일치성을 전형적으로는 서열 분석 소프트웨어(예를 들어 제네틱스(Genetics) 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지, 위스콘신 대학 생물공학 센터, 미국 위스콘신 주 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 소재, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정한다. 상기와 같은 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 대한 상동성 정도를 지정함으로써 일치하거나 유사한 서열들을 찾아낸다. 보존적 치환은 전형적으로 하기의 그룹들 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 아이소류신, 류신; 아스파트산, 글루탐산, 아스파라진, 글루타민; 세린, 쓰레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 타이로신. 일치성의 정도를 측정하기 위한 예시적인 접근법에서, BLAST 프로그램을 사용할 수 있으며, 이때 확률 점수는 e^-3 내지 e^-100이고 이는 밀접하게 관련된 서열을 가리킨다.

"환자"는 포유동물, 예를 들어 비제한적으로 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들어 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 의미한다.

본 발명에 제공된 범위는 상기 범위 내의 모든 값들에 대한 속기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 그룹으로부터의 임의의 수, 수들의 조합, 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "치료하다", "치료하는", "치료" 등의 용어는 질환 및/또는 상기 질환과 관련된 증상들을 감소시키거나 개선시킴을 지칭한다. 배제하는 것은 아니지만, 질환 또는 상태를 치료함은 상기 질환, 상태 또는 상기와 관련된 증상들이 완전히 제거될 것을 요하는 것은 아님을 알 것이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 구체적으로 진술되거나 문맥상 명백하지 않는 한, "또는"은 포함되는 것으로 이해된다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 구체적으로 진술되거나 문맥상 명백하지 않는 한, "하나의" 및 "상기"라는 용어들은 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 구체적으로 진술되거나 문맥상 명백하지 않는 한, "약"이라는 용어는 당해 분야에서 통상적으로 허용되는 범위 이내로서, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 이내로서 이해된다. 약은 진술된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내인 것으로서 이해된다. 문맥상 달리 명백하지 않는 한, 본 발명에 제공된 모든 수치들은 약이라는 용어에 의해 변형된다.

본 발명의 변수에 대한 임의의 정의에서 화학 그룹들의 목록에 대한 인용은 임의의 단일 그룹 또는 나열된 그룹들의 조합으로서 상기 변수의 정의를 포함한다. 본 발명의 변수 또는 태양에 대한 실시태양의 인용은 임의의 단일 실시태양 또는 임의의 다른 실시태양 또는 그의 부분들과의 조합으로서 상기 실시태양을 포함한다.

본 발명에 제공된 임의의 조성물 또는 방법을 본 발명에 제공된 다른 조성물 및 방법 중 임의의 것 중 하나 이상과 병용할 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된 질환, 및 다른 자가면역 질환의 치료에 유용한 조성물 및 방법을 특징으로 한다.

본 발명은 적어도 부분적으로, 자가반응성 IgE에 의한 호염기구의 활성화가 Src 계 단백질 타이로신 키나제 Lyn이 결여된 마우스(Lyn ^-/- 마우스)에서 상기 호염기구의 림프절로의 귀환, T 헬퍼 유형 2(T_H2) 세포 분화의 촉진 및 루푸스-형 신염을 유발하는 자기-반응성 항체 생산의 촉진을 야기한다는 발견을 기본으로 한다. SLE가 있는 개인은 또한 증가된 질병 활성 및 활동성 루푸스 신염과 관련된 매개변수들인, 상승된 혈청 IgE, 자기-반응성 IgE, 및 CD62 리간드(CD62L) 및 주 조직적합성 복합체(MHC) 부류 II 분자 인간 백혈구 항원-DR(HLA-DR)을 발현하는 활성화된 호염기구를 가졌다. 호염기구는 또한 SLE가 있는 환자의 림프절 및 비장 중에 존재하였다. 이러한 결과는 호염기구 및 IgE 자가항체가 루푸스 신염에 이르게 하는 자가항체 생산을 증폭시킴을 가리킨다. 따라서, 본 발명은 자가반응성 IgE 생산을 억제하거나, 자가반응성 항체에 의한 호염기구 활성을 감소시키거나, 또는 바람직하지 못한 호염기구 활성을 달리 억제함으로써 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된 질환, 및 다른 자가면역 질환을 예방하거나 치료하는데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.

전신 홍반성 루푸스( SLE )

SLE는 다양한 기관에 영향을 미치는 복합 질병이며 신장 손상(루푸스 신염)이 심하면 사망할 수도 있다(Rahman, A. & Isenberg, D.A., (2008) N. Engl. J. Med. 358, 929-939; Moser, K.L. et al., (2009) Genes Immun. 10, 373, 379). 루푸스 신염은 사구체 중에 침착된 IgM-, IgG- 및 IgA-함유 면역 복합체를 특징으로 한다. 이들 면역 복합체는 핵 성분(항핵 항체(ANA)) 또는 핵산(예를 들어 이중 가닥 DNA(dsDNA))에 대한 특이성을 갖는 자가항체에 의해 형성된다. SLE에서 T_H1, T_H17 및 조절성 T 세포의 역할에 대한 상당한 증거들이 존재하지만((Masutani, K. et al. (2001) Arthritis Rheum. 44, 2097-2106; Balomenos, D. et al., (1998) J. Clin. Invest. 101, 364-371; Peng, S.L. et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5545-5550; Zeng, D. et al., (2003) J. Clin. Invest. 112, 1211-1222; Nalbandian, A. et al. (2009) Clin. Exp. Immunol. 157, 209-215; Pernis, A.B., (2009) J. Intern. Med. 265, 644-652; Valencia, X. et al. (2007) J. Immunol. 178, 2579-2588; Zhao, X.F. et al. (2010) Mol. Biol. Rep. 37, 81-85), 여러 연구들은 가능한 T_H2 기여를 제시한다(Akahoshi, M. et al. (1999) Arthritis Rheum. 42, 1644-1648; Heine, G. et al. (2002) Nephrol. Dial. Transplant. 17, 1790-1794; Shimizu, S. et al. (2005) J. Immunol. 175, 7185-7192). SLE가 강한 체액 반응을 갖는 질병이라면(Tiller, T. et al.(1007) Immunity 26, 205-213; Tsuiji, M. et al.(2006) J. Exp. Med. 203, 393-400), 임의의 관련된 증가된 아토피 또는 알러지 없이 상기 SLE를 갖는 일부 사람들의 혈청 중 IgE 농도의 증가 및 자가반응성 IgE의 존재가 보고되었기 때문에(Atta, A.M. et al.(2004) Braz. J. Med. Biol. Res. 37, 1497-1501), SLE가 T_H2 성분을 가질 수도 있음은 타당한 것으로 보인다.

Lyn ^-/- 마우스가 초기에 강하고 구성적인 T_H2 기울임을 나타내고 T_H2 투여에 대해 악화된 반응을 나타내는 것으로 앞서 보고되었다(Odom, S. et al.(2004) J. Exp. Med. 199, 1491-1502; Charles, N. et al.(2009) Immunity 30, 533-543; Beavitt, S.J. et al.(2005) J. Immunol. 175, 1867-1875). 말기에, Lyn ^-/- 마우스는 인간 SLE의 특징들 중 일부를 모방하는 자가면역 질병을 나타낸다(Hibbs, M.L. et al.(1995) Cell 83, 301-311; Nishizumi, H. et al.(1995) Immunity 3, 549-560; Yu, C.C. et al.(2001) Curr. Biol. 11, 34-38). Lyn ^-/- 마우스는 dsDNA 및 ANA에 대한 순환하는 자가항체를 갖는다. 이들 마우스에서 순환하는 면역 복합체(CIC)의 사구체 침착은 신장 손상을 발생시키고 최종적으로 사망케한다. 현저하게, 유럽-미국 인구에서, SLE와 LYN의 유전적 관련이 최근에 보고되었다(Lu, R. et al.(2009) Genes Immun. 10, 397-403). 또한, SLE가 있는 일부 개인으로부터의 B 세포는 감소된 수준의 Lyn 키나제를 발현한다(Liossis, S.N. et al.(2001) J. Investig. Med. 49, 157-165). 따라서, Lyn ^-/- 마우스는 루푸스-형 신염의 발생에 대한 T_H2 환경의 영향을 연구하기에 타당한 모델을 제공한다.

본 연구는 Lyn ^-/- 마우스의 T_H2 기울임이 말기 루푸스-형 신염의 발생에 작용하는지의 여부 및 유사한 특징들이 SLE가 있는 사람들에게서 보이는지의 여부에 대한 문제를 다룬다. 하기에 보다 상세히 보고되는 바와 같이, 상기 T_H2 표현형은 Lyn ^-/- 마우스에서 루푸스-형 신염의 발생에 작용하고 또한 인간 SLE에서 루푸스 신염과 관련된다. 따라서, 호염기구 및 자기-반응성 IgE는 자가항체-매개된 신장 질병의 발생에 핵심 성분들이다. 중요하게는, 자가반응성 IgE의 감소는 감소된 루푸스 신염과 관련되었으며, 자가반응성 IgE의 부재 하에서, 자가항체의 생산은 크게 감소되었고, 마우스는 정상적인 신장 기능을 나타내었다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 루푸스, 루푸스 신염, 다른 루푸스-관련된 질환, 및 다른 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 항-IgE 작용제(예를 들어 항생제, 예를 들어 오말리주맵(엑솔에어))의 사용 방법을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 루푸스, 루푸스 신염, 또는 루푸스-관련된 질환을 갖는 환자에게서 호염기구를 고갈시킴으로써 루푸스, 루푸스 신염 및 다른 루푸스-관련된 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

오말리주맵 및 다른 항체

IgE 길항물질로서 작용하는 항체(예를 들어 항체 rhuMAb-E25 오말리주맵(문헌[Finn et al., 2003 J Allergy Clin Immuno 111(2):278-284; Corren et al., 2003 J Allergy Clin Immuno 111(1):87-90; Busse and Neaville, 2001 Curr Opin Allergy Clin Immuno 1(1):105-108; Tang and Powell, 2001, Eur J Pediatr 160(12):696-704] 참조)이 본 발명의 방법에 특히 유용하다. 하나의 실시태양에서, 자가반응성 IgE에 선택적으로 결합하는 항체가 본 발명의 방법에 유용하다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 루푸스, 루푸스 신염, 다른 루푸스-관련된 질환 및 다른 자가면역 질환의 치료를 위한 오말리주맵의 사용 방법을 제공한다.

오말리주맵은 유리 IgE 농도를 감소시키고 호염기구 상의 IgE 수용체의 하향조절을 촉진하는 단클론 항-IgE 항체이다. 오말리주맵은 고-친화성 IgE 수용체 FcεRI에 대한 IgE의 결합을 억제한다. IgE는 비만 세포로부터 히스타민 및 다른 염증 매개체의 방출을 유발함으로써 알러지성 질병에 한 역할을 한다. 오말리주맵은 순환하는 IgE에 결합하고 IgE가 그의 고-친화성 비만 세포 수용체에 결합하는 것을 방지함으로써 이를 중화시킨다. 입체 장애에 의해, 오말리주맵은 또한 저 친화성 비만 세포 수용체에 대한 결합을 방지한다. 오말리주맵 및 오말리주맵의 투여 방법은 에를 들어 미국 특허 제 6,267,958 호 및 하기의 발행물들에 개시되어 있다: Finn et al. J Allergy Clin Immunol. 2003; 111:278-284; Holgate et al., Curr Med Res Opin. 2001; 17:233-240; Johansson et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 2002;89:132-138, 이들은 각각 본 발명에 참고로 인용된다. 오말리주맵을 전형적으로는 피하로 투여한다. 투여량은 용량당 75 내지 500 ㎎이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 용량은 용량당 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 375, 400, 450 또는 500 ㎎이다. 오말리주맵의 용량을 주당 1회 이상 투여하거나 또는 덜 빈번히 투여할 수도 있다. 예를 들어 상기 언급한 투여량 중 임의의 투여량을 매 1주, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주 또는 10 주마다 1 회 투여할 수도 있다. 몇몇 실시태양에서, 오말리주맵을 매 4주마다 용량당 150 ㎎ 또는 300 ㎎, 또는 매 2주마다 225 ㎎, 300 ㎎ 또는 375 ㎎으로 투여한다.

본 발명에 유용한 다른 항체는 IgE 신호전달, 호염기구 활성화 또는 호염기구 수를 조절하는 것들이다. 하나의 실시태양에서, IL-5 수용체에 대한 항체를 사용하여 호염기구를 감소시키거나 고갈시킬 수 있다. 항체의 제조 방법은 면역학 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "항체"란 용어는 완전한 항체분자뿐만 아니라 면역원-결합 능력을 유지하는 항체 분자의 단편들을 의미한다. 상기와 같은 단편들은 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 시험관 내 및 생체 내 모두에서 정식으로 사용된다. 따라서, 본 발명에 사용된 바와 같이, "항체"란 용어는 완전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라 널리 공지된 활성 단편 F(ab')₂ 및 Fab를 의미한다. 완전한 항체의 Fc 단편이 결여된 F(ab')₂ 및 Fab 단편은 순환으로부터 보다 신속하게 제거되며 완전한 항체의 덜 비-특이적인 조직 결합을 가질 수도 있다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325(1983)). 본 발명의 항체는 전체 고유 항체, 이중특이성 항체; 키메릭 항체; Fab, Fab', 단일쇄 V 영역 단편(scFv), 융합 폴리펩타이드, 및 독특한 항체를 포함한다.

독특한 항체는 비제한적으로 나노항체, 선형 항체(Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995), 단일 도메인 항체, 단일쇄 항체, 및 다중 원자가를 갖는 항체(예를 들어 다이아바디, 트라이바디, 테트라바디 및 펜타바디)를 포함한다. 나노바디는 경쇄의 부재 하에서 완전히 작용성으로 진화된 천연 중쇄 항체의 최소 단편이다. 나노바디는 단일 쇄 Fv 단편의 크기의 단지 절반이지만 통상적인 항체의 친화성 및 특이성을 갖는다. 상기 독특한 구조의 결과는, 상기 구조의 최대의 안정성 및 인간 항체 프레임워크와의 큰 정도의 상동성과 함께, 나노바디가, 통상적인 항체가 접근할 수 없는 치료 표적과 결합할 수 있다는 것이다. 다중 원자가를 갖는 재조합 항체 단편은 암세포에 대한 높은 결합능 및 독특한 표적화 특이성을 제공한다. 이러한 다량체성 scFv(예를 들어 다이아바디, 테트라바디)는, 약 60 내지 100 kDa 크기의 작은 분자가 보다 빠른 혈액 제거 및 신속한 조직 흡수를 제공하기 때문에 모 항체에 비해 개선을 제공한다. 문헌[Power et al., 종양 진단 및 치료에 대한 재조합 다량체성 항체 단편의 생성. Methods Mol Biol, 207, 335-50, 2003]; 및 [Wu et al., 신속한 종양 표적화 및 영상화를 위한 항-발암성 배아 항원(CEA) 다이아바디. Tumor Targeting, 4, 47-58, 1999]을 참조하시오.

다양한 제조 기법 및 독특한 항체들이 개시되었다. 류신 지퍼를 사용하여 생산된 이중특이성 항체가 문헌에 개시되어 있다(Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553, 1992). 다이아바디 기술이 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993]에 개시되어 있다. 단일 쇄 Fv(scFv) 이량체의 사용에 의한 이중특이성 항체 단편의 제조를 위한 또 다른 전략이 문헌[Gruber et al, J. Immunol. 152:5368, 1994]에 개시되어 있다. 삼중특이성 항체가 문헌[Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991]에 개시되어 있다. 단일 쇄 Fv 폴리펩타이드 항체는 문헌[Huston et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988]에 개시된 바와 같이 직접 결합되거나 펩타이드-암호화 링커에 의해 결합된 V_H- 및 V_L-암호화 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는 공유 결합된 VH::VL 이종이량체를 포함한다. 또한 미국 특허 제 5,091,513, 5,132,405 및 4,956,778 호; 및 미국 특허 공보 제 20050196754 및 20050196754 호를 참조하시오.

하나의 실시태양에서, 자기-반응성 IgE와 결합하는 항체는 단클론성이다. 한편으로, 상기 항-IgE 항체는 다클론 항체이다. 다클론 항체의 제조 및 용도는 또한 숙련가에게 공지되어 있다. 본 발명은 또한 하이브리드 항체를 포함하며, 여기에서 중쇄 및 경쇄의 한쌍은 제 1 항체로부터 수득되는 반면, 중쇄 및 경쇄의 다른 쌍은 상이한 제 2 항체로부터 수득된다. 상기와 같은 하이브리드를 또한 인간화된 중쇄 및 경쇄를 사용하여 형성시킬 수도 있다. 상기와 같은 항체를 종종 "키메릭" 항체라 칭한다.

일반적으로, 완전한 항체는 "Fc" 및 "Fab" 영역을 함유한다고 한다. 상기 Fc 영역은 보체 활성화에 관여하며 항원 결합에는 관여하지 않는다. 상기 Fc의 영역이 효소에 의해 절단되었거나 또는 상기 Fc의 영역 없이 생산된 항체("F(ab')₂" 단편으로 표시함)는 상기 완전한 항체의 2 개의 항원 결합 부위를 모두 유지한다. 유사하게, 상기 Fc 영역이 효소에 의해 절단되었거나 상기 Fc 영역 없이 생산된 항체("Fab" 단편으로 표시함)는 상기 완전한 항체의 항원 결합 부위 중 하나를 유지한다. Fab 단편은 공유적으로 결합된 항체 경쇄 및 항체 중쇄의 일부("Fd"로 나타냄)로 이루어진다. 상기 Fd 단편은 항체 특이성의 주요 결정인자이다(단일 Fd 단편은 항체 특이성의 변경 없이 10 개 이하의 상이한 경쇄와 결합할 수 있다). 단리된 Fd 단편은 면역원성 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 유지한다.

항체를 면역원으로서 용해성 폴리펩타이드, 또는 그의 면역원성 단편을 사용하여 당해 분야에 공지된 방법들 중 어느 하나에 의해 제조할 수 있다. 항체를 수득하는 한 가지 방법은 적합한 숙주 동물을 면역원으로 면역시키고 다클론 또는 단클론 항체 생산에 대한 표준 과정을 수행하는 것이다. 상기 면역원은 세포 표면상에 상기 면역원의 제공을 촉진할 것이다. 적합한 숙주의 면역을 다수의 방식으로 수행할 수 있다. 인간 IgE 또는 그의 면역원성 단편을 암호화하는 핵산 서열을 숙주의 면역 세포에 의해 흡수되는 전달 비히클 중에서 상기 숙주에게 제공할 수 있다. 차례로 상기 세포는 인간 IgE를 발현할 것이고 이에 의해 상기 숙주에서 면역원 반응이 발생할 것이다. 한편으로, 인간 IgE 또는 그의 면역원성 단편을 암호화하는 핵산 서열을 시험관 내에서 세포에서 발현시킨 다음 상기 인간 IgE를 단리하고 상기 IgE를 항체를 발생시키는 적합한 숙주에게 투여할 수 있다.

한편으로, 자기-반응성 IgE에 대한 항체를 경우에 따라 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유도할 수 있다. 박테리오파지는 세균 내에서 감염 및 번식할 수 있으며, 상기 세균을 인간 항체 유전자와 결합 시 인간 항체 단백질을 나타내도록 가공할 수 있다. 파지 디스플레이는 상기 파지가 그의 표면상에 인간 항체 단백질을 '나타내도록' 하는 과정이다. 인간 항체 유전자 라이브러리로부터의 유전자를 파지 집단에 삽입한다. 각각의 파지는 상이한 항체에 대한 유전자들을 운반하고 따라서 그의 표면상에 상이한 항체를 나타낸다.

이어서 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조된 항체를 상기 숙주로부터 정제할 수 있다. 항체 정제 방법은 염 침전(예를 들어 암모늄 설페이트에 이한), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어 바람직하게는 중성 pH에서 실행되고 이온 강도를 증가시키는 단계 구배로 용출되는 양이온 또는 음이온 교환 컬럼 상에서), 젤 여과 크로마토그래피(젤 여과 HPLC 포함), 및 친화성 수지, 예를 들어 단백질 A, 단백질 G, 하이드록시아파타이트, 및 항-면역글로불린 상에서의 크로마토그래피를 포함할 수 있다.

항체를 편의상 상기 항체를 발현하도록 가공된 하이브리도마 세포로부터 생산할 수 있다. 하이브리도마의 제조 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 하이브리도마 세포를 적합한 배지에서 배양할 수 있으며, 폐 배지를 항체 공급원으로서 사용할 수 있다. 차례로 관심 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 수득할 수 있으며, 이어서 상기 항체를 합성에 의해 또는 상기 DNA 서열로부터 재조합적으로 생산할 수 있다. 다량의 항체를 생산하기 위해서, 일반적으로는 복수액을 수득하는 것이 보다 편리하다. 복수를 생성시키는 방법은 일반적으로 하이브리도마 세포를 면역학적으로 순수한 조직적합성 또는 면역허용성 포유동물, 특히 마우스에게 주입함을 포함한다. 상기 포유동물을 적합한 조성물(예를 들어 프리스탄)의 선행 투여에 의해 복수 생산에 준비시킬 수도 있다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 단클론 항체(Mab)를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 "인간화"시킬 수 있다. "인간화된" 항체는 서열 중 적어도 일부가 그의 초기 형태로부터 변경되어 보다 인간 면역글로불린처럼 된 항체이다. 항체의 인간화 기법은 비-인간 동물(예를 들어 쥐) 항체를 생성시키는 경우 특히 유용하다. 쥐 항체의 인간화 방법의 예가 미국 특허 제 4,816,567, 5,530,101, 5,225,539, 5,585,089, 5,693,762 및 5,859,205 호에 제공되어 있다.

억제성 핵산

억제상 핵산 분자는 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된 질환, 및 다른 자가면역 질환의 치료를 위해 IgE의 발현 또는 활성을 억제하거나 또는 호염기구 활성을 감소시키는 올리고뉴클레오타이드이다. 상기와 같은 올리고뉴클레오타이드는 IgE를 암호화하는 핵산 분자(예를 들어 안티센스 분자, siRNA, shRNA)뿐만 아니라 IgE 폴리펩타이드에 직접 결합하여 그의 생물 활성을 조절하는 핵산 분자(예를 들어 앱타머)와 결합하는 단일 및 이중 가닥 핵산 분자(예를 들어 DNA, RNA, 및 그의 동족체)를 포함한다.

리보자임

본 발명의 안티센스 IgE 서열을 표적화하는 촉매성 RNA 분자 또는 리보자임을 사용하여 IgE 핵산 분자의 발현을 생체 내에서 억제할 수 있다. 안티센스 RNA 내에 리보자임 서열의 포함은 상기 RNA 상에 RNA-절단 활성을 부여하여, 상기 구조물의 활성을 증가시킨다. RNA-특이성 리보자임의 설계 및 용도는 문헌[Haseloff et al., Nature 334:585-591, 1988] 및 미국 특허 출원 공보 제 2003/0003469 A1 호에 개시되어 있으며, 이들은 각각 본 발명에 참고로 인용된다. 따라서, 본 발명은 또한 결합 가지에 8 내지 19 개의 연속적인 핵염기를 갖는 안티센스 RNA를 포함하는 촉매성 RNA 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 촉매성 핵산 분자는 헤머헤드 또는 헤어핀 동기로 형성된다. 상기와 같은 헤머헤드 동기의 예는 문헌[Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992]에 개시되어 있다. 헤어핀 동기의 예는 1989년 9월 20일자로 출원된, 함펠(Hampel) 등의 "특이성 RNA 서열을 절단하기 위한 RNA 촉매"(1988년 9월 20일자로 출원된 미국 일련번호 제 07/247,100 호의 일부 연속 출원이다), 문헌[Hampel and Tritz, Biochemistry, 28:4929, 1989] 및 [Hampel et al., Nucleic Acids Research, 18:299, 1990]에 의해 개시된다. 이들 특이성 동기들은 본 발명을 제한하지 않으며 당해 분야의 숙련가들은, 본 발명의 효소 핵산 분자에서 중요한 것은 표적 유전자 RNA 영역 중 하나 이상에 상보성인 특이성 기질 결합 부위를 갖는 것이며 상기 분자에 RNA 절단 활성을 부여하는 상기 기질 결합 부위 내 또는 그 주변에 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것임을 알 것이다.

작은 헤어핀 RNA는 선택적인 3'UU-돌출부를 갖는 줄기-고리 구조로 이루어진다. 변화가 있을 수도 있지만, 줄기는 21 내지 31 bp(바람직하게는 25 내지 29 bp)의 범위일 수 있고 고리는 4 내지 30 bp(바람직하게는 4 내지 23 bp)의 범위일 수 있다. 세포 내 shRNA의 발현을 위해서, 폴리머라제 III H1-RNA 또는 U6 프로모터, 상기 줄기-고리화된 RNA 삽입물에 대한 클로닝 부위, 및 4-5-티미딘 전사 종결 신호를 함유하는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 상기 폴리머라제 III 프로모터는 일반적으로 잘-한정된 개시 및 정지 부위를 가지며, 이들의 전사물은 폴리(A) 꼬리가 없다. 이들 프로모터에 대한 종결 신호는 폴리티미딘 트랙에 의해 한정되며, 상기 전사물은 전형적으로는 두 번째 유리딘 다음에 절단된다. 상기 위치에서의 절단은 상기 발현된 shRNA에서 3'UU 돌출부를 생성시키며, 이는 합성 siRNA의 3' 돌출부와 유사하다. 포유동물 세포에서 상기 shRNA를 발현하기 위한 추가적인 방법은 상기 인용된 참고문헌들에 개시되어 있다.

siRNA

짧은 21 내지 25 뉴클레오타이드 이중 가닥 RNA는 유전자 발현의 하향 조절에 유효하다(Zamore et al., Cell 101:25-33; Elbashir et al., Nature 411:494-498, 2001)(본 발명에 참고로 인용된다). 포유동물에서 sirNA 접근법의 치료 유효성은 맥카프레이(McCaffrey) 등에 의해 생체 내에서 입증되었다(Nature 418:38-39.2002).

표적 유전자의 서열이 제공되었으면, siRNA를 상기 유전자를 불활성화하도록 설계할 수도 있다. 상기와 같은 siRNA는 예를 들어 병든 조직에 직접 투여되거나 또는 전신적으로 투여될 수도 있다. 팔(Parl) 유전자의 핵산 서열을 사용하여 작은 간섭 RNA(siRNA)를 설계할 수 있다. 상기 21 내지 25 뉴클레오타이드 siRNA를, 예를 들어 루푸스 치료를 위한 치료제로서 사용할 수도 있다.

본 발명의 억제성 핵산 분자를 IgE 발현의 RNA 간섭(RNAi)-매개된 녹-다운을 위한 이중 가닥 RNA로서 사용할 수도 있다. 하나의 실시태양에서, IgE 발현은 B 세포에서 감소된다. RNAi는 특정한 관심 단백질의 세포 발현을 감소시키기 위한 방법이다(문헌[Tuschl, Chembiochem 2:239-245, 2001; Sharp, Genes & Devel. 15:485-490, 2000; Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genet. Devel. 12:225-232, 2002; 및 Hannon, Nature 418:244-251, 2002]에 고찰되어 있다). dsRNA의 형질감염에 의해서 또는 플라스미드-기재 발현 시스템을 사용하는 siRNA의 발현을 통해 세포 내로 siRNA를 도입시키는 것이 포유동물 세포에서 기능상실 표현형을 생성시키는데 점점 더 많이 사용되고 있는 중이다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 핵염기 올리고머의 8 내지 19 개의 연속적인 핵염기를 포함하는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자를 제조한다. 상기 dsRNA는 중복된 2 개의 별도의 RAN 가닥 또는 자기-중복된 단일 RNA 가닥(작은 헤어핀(sh)RNA)일 수 있다. 전형적으로, dsRNA는 약 21 또는 22 염기쌍이나, 경우에 따라 더 짧거나 더 길 수도 있다(약 29 개 이하의 핵염기). dsRNA를 표준 기법(예를 들어 화학 합성 또는 시험관 내 전사)을 사용하여 제조할 수 있다. 키트를 예를 들어 앰비온(Ambion)(미국 텍사스 오스틴 소재) 및 에피센터(Epicentre)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 입수할 수 있다. 포유동물 세포에서 dsRNA를 발현하는 방법은 문헌[Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002. Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002; Sui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al. Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; and Lee et al. Nature Biotechnol. 20:500-505 2002]에 개시되어 있으며, 이들은 각각 본 발명에 참고로 인용된다.

작은 헤어핀 RNA는 임의의 3'UU-돌출부를 갖는 줄기-고리 구조로 이루어진다. 변화가 있을 수도 있지만, 줄기는 21 내지 31 bp(바람직하게는 25 내지 29 bp)의 범위일 수 있고 고리는 4 내지 30 bp(바람직하게는 4 내지 23 bp)의 범위일 수 있다. 세포 내 shRNA의 발현을 위해서, 폴리머라제 III H1-RNA 또는 U6 프로모터, 상기 줄기-고리화된 RNA 삽입물에 대한 클로닝 부위, 및 4-5-티미딘 전사 종결 신호를 함유하는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 상기 폴리머라제 III 프로모터는 일반적으로 잘-한정된 개시 및 정지 부위를 가지며, 이들의 전사물은 폴리(A) 꼬리가 없다. 이들 프로모터에 대한 종결 신호는 폴리티미딘 트랙에 의해 한정되며, 상기 전사물은 전형적으로는 두 번째 유리딘 다음에 절단된다. 상기 위치에서의 절단은 상기 발현된 shRNA에서 3'UU 돌출부를 생성시키며, 이는 합성 siRNA의 3' 돌출부와 유사하다. 포유동물 세포에서 상기 shRNA를 발현하기 위한 추가적인 방법은 상기 인용된 참고문헌들에 개시되어 있다.

핵염기 올리고머의 전달

노출된 억제성 핵산 분자 또는 그의 동족체는 포유동물 세포 내로 들어가 관심 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 핵염기 올리고머를 세포로 전달하는 것을 돕는 제형을 사용하는 것이 바람직할 수 있다(예를 들어 미국 특허 제 5,656,611, 5,753,613, 5,785,992, 6,120,798, 6,221,959, 6,346,613 및 6,353,055 호(이들은 각각 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오).

폴리뉴클레오타이드 요법

본 발명은 또한 IgE 신호전달을 차단하는 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터의 전달 방법을 제공한다. IgE 단백질, 변체 또는 그의 단편을 표적화하는 억제성 핵산 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 요법은 루푸스를 치료하기 위한 하나의 치료학적 접근법이다. 환자에게서 상기와 같은 단백질의 발현은 IgE의 선택적인 제거를 촉진하는 것으로 기대된다. 상기와 같은 핵산 분자를 루푸스를 갖는 환자의 세포로 전달할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 벡터는 FcεR의 세포 외 단편을 포함하는 용해성 폴리펩타이드를 암호화한다. 상기 핵산 분자를 치료학적으로 유효한 수준의 상기 억제성 핵산 분자가 생산될 수 있도록 흡수될 수 있는 형태로 환자의 세포로 전달할 수 있다.

IgE를 표적화하는 억제성 핵산 분자를 암호화하는 발현 벡터를 전체적인 발현을 위해서 투여하거나 또는 선택된 조직의 형질도입을 위해 사용할 수도 있다. 형질도입 바이러스(예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스) 벡터를, 특히 높은 감염 효율 및 안정한 통합 및 발현으로 인해 체세포 유전자 요법에 사용할 수 있다(예를 들어 문헌[Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini et al, Science 272:263-267, 1996; 및 Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997]을 참조하시오). 예를 들어 항-IgE 단백질, 그의 변체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 레트로바이러스 벡터 내로 클로닝하고 그의 내생 프로모터로부터, 레트로바이러스 긴 종결 반복부로부터, 또는 관심 유형의 표적 세포에 특이적인 프로모터로부터 발현을 구동할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터는 예를 들어 우두 바이러스, 소 파필로마 바이러스, 또는 헤르페스 바이러스, 예를 들어 엡스타인-바 바이러스를 포함한다(또한 예를 들어 문헌[Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993; and Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995]의 벡터들을 참조하시오). 레트로바이러스 벡터는 특히 잘 개발되어 있으며 임상 환경에서 사용되어 왔다(Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson et al., 미국 특허 제 5,399,346 호). 가장 바람직하게는, 바이러스 벡터가 항-IgE 폴리뉴클레오타이드를 전신적으로 투여하는데 사용된다.

비-바이러스성 접근법을 또한 루푸스의 억제가 필요한 환자의 세포에 치료제를 도입하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 핵산을 리포펙션의 존재 하에서 투여함으로써((Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983), 아시알로오로소뮤코이드-폴리리신 접합에 의해서(Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al, Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989), 또는 수술 조건 하에서 미세주입에 의해서(Wolff et al., Science 247:1465, 1990) 상기 핵산 분자를 세포에 도입시킬 수 있다. 바람직하게는 상기 핵산을 리포솜 및 프로타민과 함께 투여한다.

유전자 전달을 또한 시험관 내에서 형질감염을 수반하는 비-바이러스성 수단을 사용하여 성취할 수 있다. 상기와 같은 방법은 칼슘 포스페이트, DEAE 덱스트란, 일렉트로포레이션, 및 원형질체 융합의 사용을 포함한다. 리포솜이 또한 세포 내로의 DNA의 전달에 잠재적으로 이로울 수 있다. 정상적인 유전자의 환자의 병든 조직 내로의 이식을 또한, 정상 핵산을 생체 외에서 배양 가능한 세포(예를 들어 동종 또는 이종 1차 세포 또는 그의 자손) 내로 옮기고, 그 후에 상기 세포(또는 그의 자손)를 표적 조직 내로 주입함으로써 수행할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 치료 방법에 사용하기 위한 cDNA 발현을 임의의 적합한 프로모터(예를 들어 인간 거대세포바이러스(CMC), 유인원 바이러스 40(SV40), 또는 메탈로티오네인 프로모터)로부터 지시하고 임의의 적합한 포유동물 조절 요소에 의해 조절할 수 있다. 예를 들어, 경우에 따라, 특정한 세포 유형에서 유전자 발현을 우선적으로 지시하는 것으로 공지된 인헨서를 사용하여 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기 사용되는 인헨서는 비제한적으로 조직- 또는 세포-특이성 인헨서로서 특성화되는 것들을 포함할 수 있다. 한편으로, 게놈 클론을 치료 구조물로서 사용하는 경우, 조절은 동족 조절 서열에 의해서, 또는 경우에 따라, 상술한 프로모터 또는 조절 요소 중 어느 하나를 포함한 이종 공급원으로부터 유도된 조절 서열에 의해서 매개될 수 있다. 본 발명에 포함되는 또 다른 치료학적 접근법은 재조합 치료제, 예를 들어 재조합 항-IgE 단백질, 그의 변체 또는 단편을 잠재적인 또는 실제 질병-감염된 조직의 부위에 직접 또는 전신적으로(예를 들어 임의의 통상적인 재조합 단백질 투여 기법에 의해) 투여함을 포함한다. 상기 투여되는 단백질의 투여량은 개별적인 환자의 크기 및 건강을 포함한 다수의 인자들에 따라 변한다. 임의의 특정 환자의 경우, 특정한 투여량 섭생을 개별적인 필요성 및 상기 조성물 투여를 관리하거나 투여하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간에 따라 조절해야 한다.

IgE 또는 호염기구 활성을 억제하는 작용제의 선별

하기 본 발명에서 보고되는 바와 같이, IgE 및 호염기구 활성은 루푸스, 루푸스 신염, 다른 루푸스-관련된 질환, 및 다른 자가면역 질환과 관련된다. 증가된 자기-반응성 IgE 및 호염기구 활성을 갖는 환자가 루푸스 신염을 나타낼 위험이 있는 경우, 호염기구의 수 또는 활성을 선택적으로 감소시키거나 IgE를 억제하는 작용제가 루푸스, 루푸스 신염, 다른 루푸스-관련된 질환, 및 다른 자가면역 질환의 치료에 유용하다. 경우에 따라, IgE 및/또는 호염기구의 발현 또는 생물 활성을 감소시키는 작용제를 순환하는 면역 복합체(CIC)의 선택적인 감소를 증대시키는 효능에 대해 시험한다. 일례로, 후보 화합물을 호염기구(예를 들어 IgE)를 활성화하는 작용제의 첨가 전, 첨가와 동시에 또는 첨가에 이어서 세포(예를 들어 호염기구)의 배양 배지에 가한다. 이어서 상기 호염기구의 활성화 또는 탈과립을 표준 방법(예를 들어 CD26 리간드 발현의 측정)을 사용하여 측정한다. 상기 후보 작용제의 존재 하에서 측정된 호염기구 활성화 수준을 상기 후보 작용제를 받지 않은 상응하는 대조용 배양물에서 측정된 수준과 비교한다. 한편으로, 호염기구에 결합하는 IgE를 차단하는 상기 작용제의 능력을 측정한다. 또 다른 실시태양에서, 시험관 내 분석을 사용하여, 수용체에 대한 IgE 결합을 조절하거나 억제하는 화합물 또는 작용제에 대한 선별에서 수용체에 대한 IgE 결합을 측정할 수 있다. 호염기구 활성화를 억제하거나, IgE 수용체 결합을 차단하거나, 또는 호염기구에 대한 IgE 결합을 감소시키는 화합물은 본 발명에서 유용한 것으로 확인되며; 상기와 같은 후보 화합물을 예를 들어 루푸스와 관련된 질병 또는 질환을 예방, 지연, 개선, 안정화 또는 치료하기 위한 치료제로서 사용할 수 있다.

상기 방법(또는 임의의 다른 적합한 방법)에 의해 단리된 작용제를 경우에 따라 추가로 정제할 수도 있다(예를 들어 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해). 또한, 상기와 같은 후보 작용제를 동물 모델에서 IgE 결합 또는 호염기구 활성화를 조절하는 능력에 대해 시험할 수도 있다. 다른 실시태양에서, 상기 작용제의 활성을, IgE 또는 CIC의 감소를 확인함으로써 측정한다. 상기 접근법에 의해 단리된 작용제를 예를 들어 환자에게서 루푸스를 치료하거나 예방하기 위한 치료제로서 사용할 수 있다.

후보 작용제는 유기 분자, 펩타이드, 펩타이드 유사물질, 폴리펩타이드 및 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에 나열된 각각의 서열들을 또한 루푸스의 치료를 위한 치료 화합물의 발견 및 개발에 사용할 수도 있다. 암호화된 단백질을, 발현 시, 약물 선별을 위한 표적으로서 사용할 수 있다. 또한, 상기 암호화된 단백질 또는 샤인 달가노의 아미노 말단 영역을 암호화하는 DNA 서열 또는 각 mRNA의 다른 번역 촉진 서열을 사용하여 관심 암호화 서열의 발현을 촉진하는 서열을 제작할 수 있다. 상기와 같은 서열을 표준 기법(상기 문헌[Ausubel et al.])에 의해 단리할 수 있다. 본 발명의 소 분자들은 바람직하게는 2,000 달톤 이하, 보다 바람직하게는 300 내지 1,000 달톤, 및 가장 바람직하게는 400 내지 700 달톤의 분자량을 갖는다. 이들 작은 분자들은 유기 분자가 바람직하다.

본 발명은 또한 상술한 선별 분석에 의해 확인된 신규의 작용제를 포함한다. 임의로, 상기와 같은 작용제는 루푸스의 치료 또는 예방을 위한 화합물의 효능을 측정하기에 적합한 하나 이상의 동물 모델에서 특성화된다. 바람직하게는, 동물 모델에서의 특성화를 또한 상기와 같은 화합물의 독성, 부작용, 또는 상기 화합물에 의한 치료 작용의 기전을 측정하는데 사용할 수 있다. 더욱 또한, 상술한 선별 분석들 중 어느 하나에서 확인된 신규의 작용제를 환자의 루푸스 치료에 사용할 수도 있다. 상기와 같은 작용제는 단독으로 또는 당해 분야에 공지된 다른 통상적인 요법들과 함께 유용하다.

시험 작용제 및 추출물

일반적으로, 호염기구 활성 및/또는 IgE 결합을 조절할 수 있는 작용제가 천연 산물 또는 합성(또는 반-합성) 추출물 모두의 큰 라이브러리 또는 화학적 라이브러리로부터 또는 폴리펩타이드 또는 핵산 라이브러리로부터, 당해 분야에 공지된 방법에 따라 확인된다. 약물 발견 및 개발 분야의 숙련가들은 시험 추출물 또는 작용제의 정확한 공급원이 본 발명의 선별 과정(들)에 중요하지 않음을 알 것이다. 선별에 사용되는 작용제는 공지된 작용제(예를 들어 다른 질병 또는 질환에 사용되는 공지된 치료제(예를 들어 오말리주맵))를 포함할 수도 있다. 한편으로, 실질적으로 임의의 수의 미지의 화학적 추출물 또는 작용제를 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 선별할 수 있다. 상기와 같은 추출물 또는 작용제의 예는 비제한적으로 식물-, 진균-, 원핵생물- 또는 동물-기재 추출물, 발효 브로쓰, 및 합성 작용제뿐만 아니라 기존 작용제들의 변형을 포함한다.

다수의 방법들을 또한 임의의 수의 화학적 작용제, 예를 들어 비제한적으로 사카라이드-, 지질-, 펩타이드- 및 핵산-기재 작용제의 무작위 또는 지시된 합성(예를 들어 반-합성 또는 총 합성)의 발생에 이용할 수 있다. 합성 화합물 라이브러리를 브랜든 어쏘시에이츠(Brandon Associates)(Merrimack, N.H.) 및 알드리치 케미칼(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 한편으로, 후보 작용제로서 사용되는 화학적 작용제를 표준 합성 기법 및 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지된 방법을 사용하여 쉽게 입수할 수 있는 출발 물질로부터 합성할 수 있다. 본 발명에 개시된 방법에 의해 확인된 작용제의 합성에 유용한 합성 화학 형질전환 및 보호 그룹 방법(보호 및 탈보호)이 당해 분야에 공지되어 있으며 상기는 예를 들어 문헌[R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)] 및 그의 후속 판들에 개시된 바와 같은 것들을 포함한다.

한편으로, 세균, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 작용제의 라이브러리를 다수의 공급원들, 예를 들어 바이오틱스(Biotics)(영국 서섹스 소재), 제노바(Xenova)(영국 슬라우 소재), 하버 브랜치 오셔노그래픽 인스티튜트(Harbor Branch Oceanographic Institute)(미국 플로리다주 포트 피어스 소재), 및 파마마르 유에스에이(PharmaMar, U.S.A.)(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 또한, 천연 및 합성 생산된 라이브러리들을 경우에 따라 당해 분야에 공지된 방법들에 따라, 예를 들어 표준 추출 및 분별화 방법에 의해 생성시킨다. 분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예를 당해 분야에서, 예를 들어 문헌[DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909, 1993; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994; Cho et al., Science 261:1303, 1993; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061, 1994; and Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233, 1994]에서 찾을 수 있다. 더욱 또한, 경우에 따라, 임의의 라이브러리 또는 화합물을 표준 화학적, 물리적 또는 생화학적 방법을 사용하여 쉽게 변형시킨다.

작용제들의 라이브러리를 용액 중에(예를 들어 문헌[Houghten, Biotechniques 13:412-421, 1992]) 또는 비드(Lam, Nature 354:82-84, 1991), 칩(Fodor, Nature 364:555-556, 1993), 세균(Ladner, 미국 특허 제 5,223,409 호), 포자(Ladner 미국 특허 제 5,223,409 호), 플라스미드(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869, 1992), 또는 파지(Scott and Smith, Science 249:386-390, 1990; Devlin, Science 249:404-406, 1990; Cwirla et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991; 상기 Ladner) 상에 제공할 수도 있다. 또한, 약물 발견 및 개발 분야의 숙련가들은 활성이 이미 공지된 물질들의 복제물 또는 반복물의 탈복제(예를 들어 분류학상 탈복제, 생물학적 탈복제, 및 화학적 탈복제, 또는 이들의 임의의 조합) 또는 제거를 위한 방법을 가능하면 언제든지 사용해야 함을 쉽게 이해한다.

관심 조 추출물을 확인하는 경우, 관찰된 효과에 기여하는 화학적 구성성분들을 단리하기 위해서 양의 리드 추출물의 추가적인 분별화가 필요하다. 따라서, 상기 추출, 분별화, 및 정제 공정의 목표는 루푸스와 관련된 유전자의 전사 활성을 변경시키는 조 추출물 내 화학적 존재의 조심스러운 특성화 및 확인이다. 상기와 같은 이종 추출물의 분별화 및 정제 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라, 루푸스의 치료를 위한 치료제로서 유용한 것으로 입증된 작용제들을 당해 분야에 공지된 방법에 따라 화학적으로 변형시킨다.

포스타마티니브 및 다른 약학적 치료제

IgE 길항물질로서 작용하는 작용제들(예를 들어 소 분자 Syk 키나제 억제제 포스타마티니브)이 본 발명의 방법에 특히 유용하다. 본 발명은 루푸스의 치료를 위해, 상기 나타낸 선별에서 확인된 작용제를 포함하여, 자기-반응성 IgE 및/또는 호염기구의 발현 또는 활성을 감소시키는 작용제를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 IgE 합성 또는 분비를 억제하거나 조절하는 약학적 작용제를 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 의학적 가치를 갖는 것으로 발견된 화학적 존재는 예를 들어 합리적인 약물 설계에 의해, 기존 작용제의 구조적 변형에 대한 정보로서 또는 약물로서 유용하다. 또 다른 실시태양에서, Syk 키나제의 소 분자 억제제는 호염기구 활성을 조절하거나 호염기구 수를 감소시키는데 유용하다. 포스타마티니브는 청구된 방법에 유용한 Syk 키나제 억제제의 예이다.

치료학적 사용을 위해서, 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 확인된 조성물 또는 작용제를 전신으로 투여할 수도 있다, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 담체 중에서 제형화할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 예를 들어 환자에게 상기 약물의 연속적이고, 지속적인 수준을 제공하는 피하, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 또는 피 내 주입을 포함한다. 인간 환자 또는 다른 동물의 치료를, 생리학적으로 허용 가능한 담체 중의 치료 유효량의 루푸스 치료제를 사용하여 수행할 것이다. 적합한 담체 및 그의 제형들이 예를 들어 문헌[E.W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences]에 개시되어 있다. 투여되는 치료제의 양은 투여 방식, 환자의 연령 및 체중, 및 루푸스의 임상적 증상에 따라 변한다. 일반적으로 양은 루푸스 치료에 사용되는 다른 작용제에 대해 사용되는 것들의 범위일 것이나, 몇몇 경우에 상기 화합물의 증가된 특이성으로 인해 더 낮은 양이 필요할 것이다. 화합물을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 진단 방법에 의해서, 또는 루푸스와 관련된 유전자의 전사 활성화를 측정하는 임의의 분석을 사용하여 측정된 바와 같이 루프스의 임상 또는 생리학적 증상을 억제하는 투여량으로 투여한다.

약학 조성물의 제형화

루푸스의 치료를 위한 본 발명의 작용제 또는 그의 동족체는, 다른 성분들과 함께 루푸스 또는 그의 증상의 개선, 감소 또는 안정화에 유효한 치료제의 농도를 생성시키는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 작용제의 투여는 호염기구에 대한 자기-반응성 IgE의 결합을 감소시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 작용제를 루푸스와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위해 환자에게 투여한다.

상기와 같은 작용제의 투여 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명은 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의한 작용제의 치료학적 투여를 제공한다. 상기 화합물은 임의의 적합한 담체 물질 중에 임의의 적합한 양으로 함유될 수 있으며 일반적으로 상기 조성물의 전체 중량의 1 내지 95 중량%의 양으로 존재한다. 상기 조성물을 비경구(예를 들어 피하, 정맥 내, 근육 내, 또는 복강 내) 투여 경로에 적합한 투여형으로 제공할 수 있다. 상기 약학 조성물을 통상적인 약학적 관행에 따라 제형화할 수 있다(예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York]). 적합한 제형은 경구 투여용 형태, 데포 제형, 패치에 의해 전달하기 위한 제형, 국소적으로 또는 경피적으로 전달되는 반고체 투여형을 포함한다.

본 발명에 따른 약학 조성물을 투여 시 실질적으로 바로 또는 투여 후 임의의 소정의 시간 또는 기간에 활성 화합물을 방출하도록 제형화할 수 있다. 상기 후자 유형의 조성물은 일반적으로 조절된 방출 제형으로서 공지되어 있으며, 이는 (i) 연장된 기간에 걸쳐 체 내에 실질적으로 일정한 농도의 상기 약물을 생성시키는 제형; (ii) 소정의 지체 시간 후에 연장된 기간에 걸쳐 체 내에 실질적으로 일정한 농도의 상기 약물을 생성시키는 제형; (iii) 활성 물질의 혈장 수준의 변동과 관련된 바람직하지 못한 부작용을 최소화하는 동시에 체 내에서 비교적 일정하고 유효한 수준을 유지시킴으로써 소정의 기간 동안 작용을 지속하는 제형(톱니 동역학 패턴); (iv) 예를 들어 중추 신경계 또는 뇌척수액에 인접하거나 또는 상기 중에 조절된 방출 조성물의 공간적 배치에 의해 작용을 국소화하는 제형; (v) 용량이 예를 들어 1주 또는 2주마다 1회 투여되도록, 편리한 투여를 허용하는 제형; 및 (vi) 루푸스에서 작용이 교란되는 특정한 세포 유형(예를 들어 호염기구)에 치료제를 전달하기 위해 담체 또는 화학적 유도체를 사용함으로써 루푸스를 표적화하는 제형을 포함한다. 일부 용도의 경우, 조절된 방출 제형은 혈장 수준을 치료 수준으로 지속시키는 당일 동안 빈번한 투여의 필요성을 제거한다.

방출 속도가 문제 화합물의 대사 속도를 능가하는 조절된 방출을 획득하기 위해 임의의 다수의 전략들이 추구될 수 있다. 일례로, 조절된 방출은 다양한 제형 매개변수 및 성분, 예를 들어 다양한 유형의 조절된 방출 조성물 및 코팅제의 적합한 선택에 의해 획득된다. 따라서, 상기 치료제를 적합한 부형제와 함께, 투여 시 조절된 방식으로 상기 치료제를 방출하는 약학 조성물로 제형화한다. 예로서 단일 또는 다중 단위 정제 또는 캡슐 조성물, 오일 용액, 현탁액, 유화액, 미세캡슐, 미소구, 분자 복합체, 나노입자, 패치 및 리포솜이 있다.

비경구 조성물

상기 약학 조성물을 주사, 주입 또는 이식(피하, 정맥 내, 근육 내, 복강 내 등)에 의해 투여형, 제형으로, 또는 통상적인 무독성의 약학적으로 허용 가능한 담체 및 보조제를 함유하는 적합한 전달 장치 또는 이식물을 통해 비경구로 투여할 수 있다. 상기와 같은 조성물의 제형 및 제제는 약학 제형 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 제형은 상기 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy]에서 찾을 수 있다. 비경구용 조성물을 단위 투여형으로(예를 들어 단일 용량 앰풀로) 또는 수회 용량을 함유하고 적합한 보존제가 첨가될 수도 있는(하기 참조) 바이알 중에서 제공할 수도 있다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 주입 장치, 또는 이식용 전달 장치의 형태 중에 존재하거나, 또는 사용 전에 물 또는 또 다른 적합한 비히클로 재조성되는 건조 분말로서 제공될 수도 있다. 활성 치료제(들)와 별개로, 상기 조성물은 적합한 비경구적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수도 있다. 상기 활성 치료제(들)를 조절된 방출을 위해 미소구, 미세캡슐, 나노입자, 리포솜 등에 혼입시킬 수도 있다. 더욱 또한, 상기 조성물은 현탁제, 용해제, 안정제, pH-조절제, 긴장성 조절제, 및/또는 분산제를 포함할 수도 있다.

상기 가리킨 바와 같이, 본 발명에 따른 약학 조성물은 멸균 주사에 적합한 형태로 존재할 수 있다. 상기와 같은 조성물을 제조하기 위해서, 적합한 활성 치료제(들)를 비경구적으로 허용 가능한 액체 비히클 중에 용해시키거나 현탁시킨다.

조절된 방출용 비경구 조성물

조절된 방출용 비경구 조성물은 현탁액, 미소구, 미세캡슐, 자기 미소구, 오일 용액, 오일 현탁액 또는 유화액의 형태로 존재할 수 있다. 한편으로, 상기 활성 약물을 생체적합성 담체, 리포솜, 나노입자, 이식물, 또는 주입 장치에 혼입시킬 수도 있다. 미소구 및/또는 미세캡슐의 제조에 사용하기 위한 물질은 예를 들어 생분해성/생부식성 중합체, 예를 들어 폴리갈락틴, 폴리-(아이소부틸 시아노아크릴레이트), 폴리(2-하이드록시에틸-L-글루타민) 및 폴리(락트산)이다. 조절된 방출용 비경구 제형을 제형화할 때 사용될 수 있는 생체적합성 담체는 탄수화물(예를 들어 덱스트란), 단백질(예를 들어 알부민), 지단백질, 또는 항체이다. 이식물에 사용하기 위한 물질은 비-생분해성(예를 들어 폴리다이메틸 실록산) 또는 생분해성(예를 들어 폴리(카프로락톤), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 또는 폴리(오쏘 에스터) 또는 이들의 조합일 수 있다.

경구용 고체 투여형

경구용 제형은 무독성의 약학적으로 허용 가능한 부형제와의 혼합물 중에 활성 성분(들)을 함유하는 정제를 포함한다. 상기와 같은 제형은 숙련가에게 공지되어 있다. 부형제는 예를 들어 불활성 희석제 또는 충전제(예를 들어 슈크로스, 솔비톨, 당, 만니톨, 미정질 셀룰로스, 감자 전분을 포함한 전분, 탄산 칼슘, 염화 나트륨, 락토오스, 인산 칼슘, 황산 칼슘, 또는 인산 나트륨); 과립화제 및 붕해제(예를 들어 미정질 셀룰로스를 포함한 셀룰로스 유도체, 감자 전분을 포함한 전분, 크로스카멜로스 나트륨, 알기네이트, 또는 알긴산); 결합제(예를 들어 슈크로스, 글루코스, 솔비톨, 아카시아, 알긴산, 알긴산 나트륨, 젤라틴, 전분, 예비젤라틴화된 전분, 미정질 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 또는 폴리에틸렌 글리콜); 및 윤활제, 활주제, 및 접착방지제(예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 수소화된 식물성 오일, 또는 활석)일 수 있다. 다른 약학적으로 허용 가능한 부형제는 착색제, 풍미제, 가소제, 희석제, 완충제 등일 수 있다.

상기 정제를 코팅하지 않거나, 또는 임의로 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시키고 연장된 기간 동안 지속적인 작용을 제공하기 위해서 공지된 기법에 의해서 코팅할 수도 있다. 상기 코팅제는 소정의 패턴으로(예를 들어 조절된 방출 제형을 성취하기 위해서) 활성 약물을 방출하기에 적합하거나, 또는 위를 통과한 후까지 상기 활성 약물을 방출하지 않기에 적합할 수도 있다(장용 코팅). 상기 코팅제는 당 코팅제, 필름 코팅제(예를 들어 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 메틸 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 아크릴레이트 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 폴리비닐피롤리돈을 기본으로 함), 또는 장용 코팅제(예를 들어 메트아크릴산 공중합체, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 쉘락 및/또는 에틸셀룰로스를 기본으로 함)일 수 있다. 더욱 또한, 시간 지연 물질, 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트를 사용할 수도 있다.

고체 정제 조성물은 상기 조성물을 불필요한 화학적 변화(예를 들어 활성 루푸스 치료 물질의 방출 전에 화학적 분해)로부터 보호하기에 적합한 코팅제를 포함할 수도 있다. 상기 코팅제를 상기 문헌[Encyclopedia of Pharmaceutical Technology]에 개시된 바와 유사한 방식으로 상기 고체 투여형 상에 적용할 수도 있다.

2 개 이상의 활성 루프스 치료제들을 정제 중에서 함께 혼합하거나, 또는 분배할 수도 있다. 일례로, 첫 번째 활성 치료제를 상기 정제의 내부에 함유시키고, 두 번째 활성 치료제를 외부에 두어, 상기 두 번째 활성 치료제의 상당 부분이 상기 첫 번째 치료제의 방출 전에 방출되도록 한다.

경구용 제형을 또한 츄잉정으로서, 또는 경질 젤라틴 캡슐(여기에서 상기 활성 성분은 불활성 고체 희석제(예를 들어 감자 전분, 락토오스, 미정질 셀룰로스, 탄산 칼슘, 인산 칼슘 또는 카올린)와 혼합된다)로서, 또는 연질 젤라틴 캡슐(여기에서 상기 활성 성분은 물 또는 오일 매질, 예를 들어 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된다)로서 제공될 수 있다. 분말 및 과립을 상기 정제 및 캡슐 하에서 언급한 성분들을 사용하여, 예를 들어 믹서, 유동층 장치 또는 분무 건조 장비를 사용하여 통상적인 방식으로 제조할 수도 있다.

조절된 방출용 경구 투여형

경구용의 조절된 방출 조성물을, 활성 물질의 용해 및/또는 확산을 조절함으로써 상기 활성 루푸스 치료제를 방출하도록 제작할 수 있다. 용해 또는 확산 조절된 방출을 작용제의 정제, 캡슐, 펠릿 또는 과립 제형의 적합한 코팅에 의해, 또는 적합한 기질 내에 상기 화합물을 혼입시킴으로써 성취할 수 있다. 조절된 방출 코팅제는 상기 언급한 코팅 물질들 중 하나 이상 및/또는 예를 들어 쉘락, 밀납, 글리코왁스, 피마자 왁스, 카나우바 왁스, 스테아릴 알콜, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 다이스테아레이트, 글리세롤 팔미토스테아레이트, 에틸셀룰로스, 아크릴 수지, dl-폴리락트산, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 아세테이트, 비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌, 폴리메트아크릴레이트, 메틸메트아크릴레이트, 2-하이드록시메트아크릴레이트, 메트아크릴레이트 하이드로젤, 1,3 부틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 메트아크릴레이트, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 조절된 방출 기질 제형에서, 상기 기질 물질은 또한 예를 들어 수화된 메틸셀룰로스, 카나우바 왁스 및 스테아릴 알콜, 카보폴 934, 실리콘, 글리세릴 트라이스테아레이트, 메틸 아크릴레이트-메틸 메트아크릴레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 및/또는 할로겐화된 플루오로카본을 포함할 수 있다.

하나 이상의 치료제를 함유하는 조절된 방출 조성물이 또한 부유 정제 또는 캡슐(즉 경구 투여 시 일정 기간 동안 위 내용물의 상부에 부유하는 정제 또는 캡슐)의 형태로 존재할 수도 있다. 상기 화합물(들)의 부유 정제 제형을, 상기 화합물(들)과 부형제 및 20 내지 75% w/w의 하이드로콜로이드, 예를 들어 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스와의 혼합물을 과립화함으로써 제조할 수 있다. 이어서 상기 수득된 과립을 정제로 압착시킬 수 있다. 위액과 접촉 시, 상기 정제는 그의 표면 둘레에 실질적으로 수-불침투성 젤 차단층을 형성한다. 상기 젤 차단층은 1 미만의 밀도를 유지하는데 참여하여, 상기 정제가 상기 위액 중에 부유한 채로 남아있게 한다.

투여량

숙련가는 상기 투여량을 동물 모델에 비해 인간을 위해 변형시키는 것이 당해 분야에 통상적임을 인지하기 때문에, 인체 투여량을 처음에, 마우스에서 사용된 화합물의 양으로부터 외삽하여 결정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 투여량은 약 1 ㎎ 화합물/체중 ㎏ 내지 약 500 ㎎ 화합물/체중 ㎏; 또는 약 5 ㎎/체중 ㎏ 내지 약 4000 ㎎/체중 ㎏ 또는 약 10 ㎎/체중 ㎏ 내지 약 3000 ㎎/체중 ㎏; 또는 약 50 ㎎/체중 ㎏ 내지 약 2000 ㎎/체중 ㎏; 또는 약 100 ㎎/체중 ㎏ 내지 약 1000 ㎎/체중 ㎏; 또는 약 150 ㎎/체중 ㎏ 내지 약 500 ㎎/체중 ㎏으로 변할 수 있을 것으로 생각된다. 다른 실시태양에서, 상기 용량은 약 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ㎎/체중 ㎏일 수 있다. 다른 실시태양에서, 더 높은 용량을 사용할 수도 있으며, 상기와 같은 용량은 약 5 화합물 ㎎/체중 ㎏ 내지 약 20 화합물 ㎎/체중 ㎏의 범위일 수도 있을 것으로 생각된다. 다른 실시태양에서, 상기 용량은 약 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 ㎎/체중 ㎏일 수 있다. 물론, 상기 투여량을 초기 임상 시험의 결과 및 특정 환자의 필요에 따라, 상기와 같은 치료 프로토콜에서 통상적으로 수행되는 바와 같이, 상향 또는 하향 조절할 수 있다.

치료 방법

본 발명은 자가반응성 IgE를 억제 또는 감소시키거나 또는 호염기구의 수 또는 활성을 감소시킴으로써 루푸스, 루푸스 신염, 다른 루푸스-관련된 질환, 및 다른 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자(예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간)에게 본 발명에 개시된 방법에 의해 자가반응성 IgE를 억제 또는 감소시키거나 또는 호염기구의 수 또는 활성을 감소시키는 화합물을 포함하는 치료 유효량의 약학 조성물을 투여함을 포함한다. 따라서, 하나의 실시태양은 루푸스를 앓고 있거나 루푸스에 민감한 환자의 치료 방법이다. 상기 방법은 상기 환자에게 상기 질병이 치료되도록 하는 조건 하에서, 치료량 또는 상기 질병 또는 그의 증상을 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 환자(상기와 같은 치료가 필요한 것으로서 확인된 환자 포함)에게 상기와 같은 효과를 생성시키기에 유효한 양의 본 발명에 개시된 화합물, 또는 본 발명에 개시된 조성물을 투여함을 포함한다. 상기와 같은 치료가 필요한 환자의 확인은 환자 또는 주치의의 판단 하에 있을 수 있으며 주관적(예를 들어 소견) 또는 객관적(예를 들어 시험 또는 진단 방법에 의해 측정할 수 있는)일 수 있다.

예방학적 치료를 포함한, 본 발명의 치료 방법은 일반적으로 상기 치료가 필요한 포유동물, 특히 인간을 포함한 환자(예를 들어 동물, 인간)에게 치료 유효량의 본 발명의 작용제, 예를 들어 본 발명 제법의 화합물을 투여함을 포함한다. 상기와 같은 치료는 루푸스 또는 그의 증상을 앓고 있거나, 이를 갖고 있거나, 이에 민감하거나, 또는 이의 위험이 있는 환자, 특히 인간에게 적합하게 투여될 것이다. "위험이 있는" 환자의 결정은 진단 시험 또는 환자 또는 의료인의 소견에 의한 임의의 객관적 또는 주관적 결정(예를 들어 유전자 시험, 효소 또는 단백질 마커, 마커(본 발명에 정의된 바와 같은), 가족력 등)에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 작용제를 또한 전사 활성이 관련될 수도 있는 임의의 다른 질환의 치료에 사용할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은 치료 진행을 모니터하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 루푸스와 관련된 질환 또는 그의 증상을 앓고 있거나 이에 민감한 환자에게서 진단 마커(마커)(예를 들어 본 발명의 화합물, 단백질 또는 그의 지시자 등에 의해 조절되는 본 발명에 기술된 임의의 표적)의 수준을 측정하는 단계 또는 진단 측정(예를 들어 선별, 분석)을 포함하며, 여기에서 상기 환자에게 상기 질병 또는 그의 증상을 치료하기에 충분한 치료량의 본 발명의 화합물이 투여되었다. 상기 방법에서 측정된 마커의 수준을 건강한 정상 대조군 또는 환자의 질병 상태가 확립된 다른 병든 환자에서의 마커의 기지의 수준과 비교할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 환자에서 마커의 두 번째 수준을 상기 첫 번째 수준의 측정보다 나중의 시점에서 측정하며, 상기 두 수준을 비교하여 상기 질병의 과정 또는 상기 요법의 효능을 모니터한다. 몇몇 바람직한 실시태양에서, 상기 환자에서 마커의 치료전 수준을 본 발명에 따른 치료를 시작하기 전에 측정한다; 이어서 상기 마커의 치료전 수준을 치료 개시 후 상기 환자의 마커 수준과 비교하여 상기 치료의 효능을 측정할 수 있다.

키트

본 발명은 루푸스, 루푸스 신염, 다른 루푸스-관련된 질환, 및 다른 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 키트를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 키트는 단위 투여형의 유효량의 본 발명의 작용제(예를 들어 오말리주맵)를 함유하는 치료학적 또는 예방학적 조성물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 치료학적 또는 예방학적 화합물을 함유하는 멸균 용기를 포함하며; 상기와 같은 용기는 상자, 앰풀, 병, 바이알, 튜브, 주머니, 파우치, 발포팩, 또는 당해 분야에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 상기와 같은 용기를 플라스틱, 유리, 적층된 종이, 금속 호일, 또는 약제의 유지에 적합한 다른 물질로 제조할 수 있다.

경우에 따라 본 발명의 작용제를 루푸스가 있거나 발병할 위험이 있는 환자에게 상기 작용제를 투여하기 위한 설명서와 함께 제공한다. 상기 설명서는 일반적으로 루푸스의 치료 또는 예방을 위한 상기 조성물의 용도에 대한 정보를 포함할 것이다. 다른 실시태양에서, 상기 설명서는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 상기 화합물의 설명서; 루푸스 또는 그의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여량 스케줄 및 투여; 주의사항; 경고; 적응증; 반대-적응증; 남용 정보; 부작용; 동물 약물학; 임상 연구; 및/또는 참고문헌. 상기 설명서는 상기 용기(존재하는 경우)에 직접 인쇄되거나, 또는 상기 용기에 적용된 표지로서, 또는 상기 용기와 함께 또는 상기 용기 내에 공급된 별도의 시트, 팸플릿, 카드 또는 폴더로서 있을 수 있다.

복합 요법

임의로, 치료 또는 예방 효능을 갖는 작용제를 루푸스의 치료를 위한 임의의 다른 표준 요법과 함께 투여할 수도 있으며; 상기와 같은 방법은 숙련가에게 공지되어 있고 문헌[E.W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences]에 개시되어 있다. 경우에 따라, 본 발명의 작용제를 단독으로 또는 루푸스 치료에 유용한 통상적인 치료제와 함께 투여할 수 있다. 루푸스의 치료에 유용한 치료제는 비제한적으로 비스테로이드성 소염 약물(NSAID), 하이드록시클로로퀸, 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드, 아즈티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 벨리뮤맵, 데하이드로에피안드로스테론, 리툭시맵 등을 포함한다.

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법들을 사용하며, 이들 기법은 숙련가의 이해 범위 내에 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌, 예를 들어 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991)]에 충분히 설명되어 있다. 이들 기법을 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 생산에 적용할 수 있으며, 그 자체로서 본 발명을 수행하고 실시하는데 고려할 수 있다. 특정 실시태양에 특히 유용한 기법들을 하기의 섹션에서 논의할 것이다.

하기의 실시예들을, 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 본 발명의 분석, 선별 및 치료 방법을 수행하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 나타내며, 이들 실시예는 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 범위를 제한하고자 하지 않는다.

실시예

실시예 1: 루푸스 관련된 신염은 IgE 및 IL -4에 의존성이나, 비만 세포에는 의존성이 아니다.

선행 연구(Charles, N. et al.(2009) Immunity 30, 533-543)와 일관되게, 호염기구-의존성 T_H2 기울임은 SLE-형 질병을 나타내는 나이든 Lyn ^-/- 마우스에 여전히 존재하였다(도 1). 상기 SLE-형 표현형의 발생에서 상기 T_H2 환경의 역할을 연구하기 위해서, IgE 및 Lyn(lgh -7 ^-/- ; Lyn ^-/- ) 모두, IL-4 및 Lyn(Il4 ^-/- ;Lyn ^-/- ) 모두, 또는 비만 세포 및 Lyn(Kit ^W ^- ^sh ^/W- ^sh ;Lyn ^-/- ) 모두가 결핍된 마우스(Charles, N. et al.(2009) Immunity 30, 533-543)를 사용하였다. lgh -7 ^-/- ; Lyn ^-/- ; Il4 ^-/- ;Lyn ^-/- ; 및 Kit ^W-sh/W-sh ;Lyn ^-/- 마우스는 Lyn ^-/- 마우스에 필적하는 말초 B 세포 결함을 나타내었으며 혈청 중 높은 IgM 및 IgA 농도를 보였고(도 2 내지 6), 이는 IL-4 및 IgE가 상기 이상에 관련되지 않음을 가리켰다. lgh -7 ^-/- ; Lyn ^-/- 및 Il4 ^-/- ;Lyn ^-/- 마우스 중의 IgE 및 IgG의 수준은 Igh -7 및 Il4 단일-결핍 마우스에 대해 보고된 표현형과 유사한 경향을 보였으며(Kopf, M. et al.(1993) Nature 362, 245-248; Oettgen, H.C. et al.(1994) Nature 370, 367-370) Lyn ^-/- 마우스 중의 수준과 상이하였다(도 5). IgE는 또한 앞서 보고된(Odom, S. et al.(2004) J. Exp. Med. 199, 1491-1502), Lyn ^-/- 마우스에서 나타난 비만 세포 수의 증가에 기여하였으며(도 7), 이는 비만 세포 생존에 있어서 IgE의 역할과 일치한다(Asai, K. et al.(2001) Immunity 14, 791-800; Kalesnikoff, J. et al.(2001) Immunity 14, 801-811). 대조적으로, Lyn ^-/- 마우스에서 앞서 개시된 호염기구 증가증은 IL-4 및 IgE 모두와 독립적이었다(Charles, N. et al.(2009) Immunity 30, 533-543)(도 7).

Lyn ^-/- 및 Kit ^W ^- ^sh ^/W- ^sh ;Lyn ^-/- 마우스와 달리, lgh -7 ^-/- ; Lyn ^-/- 및 Il4 ^-/- ;Lyn ^-/- 마우스는 사구체신염을 나타내지 않았다(도 8a, 8b 및 9). IgG(도 8c), IgM, IgA 및 보체 인자 3(C3)을 함유하는 순환하는 면역 복합체(CIC)의 사구체 침착(도 10a, 10b 및 10c)은 lgh -7 ^-/- ; Lyn ^-/- 및 Il4 ^-/- ;Lyn ^-/- 마우스에서 현저학 감소되었지만, Kit ^W-sh/W-sh ;Lyn ^-/- 마우스의 신장에서는 Lyn ^-/- 마우스에 필적하는 수준으로 여전히 존재하였다(도 8c, 10a, 10b 및 10c). 신장 기능(소변 중 알부민 대 크레아티닌 비(ACR)에 의해 측정된 바와 같이)은 lgh -7 ^-/- ; Lyn ^-/- 및 Il4 ^-/- ;Lyn ^-/- 마우스에서 보호된 반면, ACR은 Kit ^W ^- ^sh ^/W- ^sh ;Lyn ^-/- 및 Lyn ^-/- 마우스 모두에서 유사한 정도로 상승하였다(도 8d). 이러한 발견은 Lyn ^-/- 마우스에서 관찰된 루푸스-형 신염이 IgE 및 IL-4에 대해 의존성이나 비만 세포와는 무관함을 보인다.

실시예 2: 호염기구는 Lyn ^-/- 마우스에서 자가반응성 혈장 세포를 지지한다.

나이든 Lyn ^-/- 마우스는 dsDNA 및 핵 항원에 대한 다량의 자가항체를 생산하며(도 11a & 11b), 이는 신장에서 보이는 손상을 유발한다(Seshan, S.V. & Jennette, J.C. (2009) Arch. Pathol. Lab. Med. 133, 233-248; Sinico, R.A. et al. (2009) Ann. NY Acad. Sci. 1173, 47-51). lgh -7 ^-/- ; Lyn ^-/- 및 Il4 ^-/- ;Lyn ^-/- 마우스에서 신장 기능의 회복이 자가항체 생산의 동반된 감소와 관련되었는지 및 Lyn ^-/- 및 Kit ^W ^- ^sh ^/W- ^sh ;Lyn ^-/- 마우스에 비해 항-dsDNA 및 ANA의 2배 감소가 발견되었는지의 여부를 조사하였다(도 11a & 11b). 나이든 Lyn ^-/- 마우스(>32 주) 또는 보다 어린 Kit ^W-sh/W-sh ;Lyn ^-/- 마우스(약 20 주)에서 호염기구의 고갈은 ANA 자가항체의 양을 현저하게 감소시켰다(도 11c & 11d). 호염기구의 상실은 또한 비장 중 혈장 세포의 비율을 감소시켰으며(도 11e) 신장에서 염증 전 환경을 감소시켰다(도 11f & 12). 집합적으로, 상기 발견들은 호염기구가 신장에서 혈장 세포를 지지하고 IL-4 및 IgE-의존적인 방식으로 자가항체의 생산을 증폭시키며, 이는 Lyn ^-/- 마우스에서 신장 질병을 유도함을 보인다.

실시예 3: Lyn ^-/- 마우스는 호염기구-활성화 자기-반응성 IgE 를 생산한다.

상기 SLE-형 표현형은 IgE에 의존하며, 따라서 자기 반응성 IgE가 상기 마우스의 순환에서 발견될 수 있는지와, 이들이 FcεRI-함유 호염기구를 활성화시키는지를 조사하였다. Lyn^-/- 및 Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh;Lyn^-/- 마우스로부터의 혈청은 야생형(WT) 대응물에 비해 높은 수준의 dsDNA-특이성 IgE(도 13a) 및 ANA-특이성 IgE를 가졌다. 자기-반응성 IgE의 양은 Il4^-/-;Lyn^-/- 마우스에서 감소되었고, 예상된 대로, 자기 반응성 IgE는 Igh-7^-/-;Lyn^-/- 마우스에서 검출되지 않았다(도 13a). CIC를 앞서 개시한 바와 같이 정제하였으며(Toran, E.J. & Lee, C.M.(1995) J. Natl. Med. Assoc. 87,693-699) IgE-함유 CIC(IgE-CIC)가 Lyn^-/- 및 Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh;Lyn^-/- 마우스로부터의 모든 혈청에서 다양한 양으로 발견된 반면(도 13b, 14a 및 14d), Il4^-/-;Lyn^-/- 및 Igh-7^-/-;Lyn^-/- 마우스의 혈청은 IgE-CIC가 본질적으로 없었다(도 13b & 14d). IgG-함유(도 13b) 및 IgM(도 10) 및 IgA-함유 CIC는 마우스의 모든 돌연변이 계통에서 관찰되었지만, 상기 Il4^-/-;Lyn^-/- 및 Igh-7^-/-;Lyn^-/- 마우스에서 이들 CIC의 현저한 감소가 관찰되었고, 이는 상기 마우스에서 발견된 감소된 양의 자가항체가 또한 관찰된 것과 상관있었다(도 13c, 14b, 14c & 14e).

IgE 또는 IgG 면역 복합체가 호염기구 IL-4 생산을 자극할 수 있는지의 여부를 조사하였다. IgE 면역 복합체는 호염기구에 의해 IL-4 생산을 유도할 수 있었던 반면, IgG 면역 복합체는 호염기구 IL-4 생산을 자극하지 못했다(도 13d, 15a & 15b). 더욱이, Lyn^-/- 마우스로부터의 호염기구는 그의 WT 대응물에 비해 IgE 면역 복합체에 대해 증가된 감도를 보였다(도 13d & 15a). 현저하게는, 시험된 자극들 모두(포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 + 이오노마이신, 다이나이트로페닐-특이성 IgE + 다이나이트로페닐-HAS(항원), IgE 면역 복합체 및 IgG 면역 복합체) WT 또는 Lyn^-/- 마우스로부터의 호염기구에 의한 IL-12 p40 또는 인터페론-γ(IFN-γ) 생산을 유도하지 못했다(도 15c & 15d). 이러한 발견은 IgE 면역 복합체(Lyn^-/- 마우스에서 순환하는 IgE-CIC로서 존재함)의 존재가 호염기구 활성화 및 선택적인 T_H2 사이토킨 발현을 도출할 수 있음을 설명한다.

실시예 4: Lyn ^-/- 호염기구는 면역조절 분자를 발현한다.

호염기구가 Lyn^-/- 마우스의 2차 림프구 조직으로 회귀할 수 있는지의 여부(이때 상기는 B 및 T 세포 반응에 영향을 미칠 수도 있다)를 조사하였다. Lyn^-/- 마우스로부터의 순환하는 호염기구는 CD62L(L-셀렉틴)(도 16a)(이는 백혈구의 2차 림프구 조직으로의 회귀를 허용한다)의 증가된 발현을 나타내었다. Lyn 결핍과 관련하여, IL-4 또는 IgE의 부재(Il4^-/-;Lyn^-/- 및 Igh-7^-/-;Lyn^-/- 마우스)(그러나 비만 세포는 아님(Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh;Lyn^-/- 마우스))는 순환하는 호염기구 상의 CD62L의 발현을 억제하였다(도 16b). Lyn^-/- 마우스는 림프절(경부 및 서혜부) 및 비장 모두에서 높은 수의 호염기구를 가졌다(도 16c & 16d). 상기 림프절에서, 호염기구의 비율은, IL-4 또는 IgE가 또한 부재하는 경우(Il4^-/-;Lyn^-/- 및 Igh-7^-/-;Lyn^-/- 마우스), 그러나 비만 세포는 부재하지 않는 경우(Kit^W ^- ^sh ^/W- ^sh;Lyn^-/- 마우스) 현저하게 감소되었다(도 16c). 상기 비장에서 호염기구 수의 약간의 감소가 관찰되었지만, 상기 림프절에서와 같이 현저하지는 않았다(도 16d).

Lyn의 부재 하에서 나타난 호염기구 증가증으로 인해, 연구된 계통들 중 어느 하나에 대한 순환하는 호염기구의 비율의 현저한 차이는 없었다(도 16e). 또한 림프절-거주 호염기구는 TNF 계열(BAFF)(이는 상기 세포 상에서 발현된 BAFF 수용체의 낮은 양에 의해 설명되지 않았다)에 속하는 막-관련된 B 세포 활성화 인자를 발현하였으며(도 16f), 이는 B 세포 생존 및 분화에 영향을 미치는 림프절-거주 호염기구의 잠재성을 설명한다. 더욱이, Lyn^-/- 마우스로부터의 림프절(도 16g) 및 비장(도 17) 거주 호염기구는 모두 높은 MHC II 발현을 나타내었다. 이러한 발견은 Lyn^-/- 호염기구가 CD62L 발현을 상향조절하고 림프절 및 비장으로 회귀함을 가리키며, 이때 MHC II(Perrigoue, J.G. et al.(2009) Natl. Immunol. 10, 697-705; Sokol, C.L. et al.(2009) Nat. Immunol. 10, 713-720; Yoshimoto, T. et al.(2009) Nat. Immunol. 10, 706-712), BAFF 또는 이들 모두는 T 및 B 세포와의 연통을 허용할 수도 있다.

실시예 5: 자기-반응성 IgE 는 SLE 및 루푸스 신염과 관련된다.

SLE를 갖는 환자들의 코호트는 앞서 SLE 환자들에 대해 개시된 특징인 전통적인 보완 경로(도 18a)를 활성화할 수 있는 다량의 Clq-반응성 CIC를 가졌다(Moser, K.L. et al.,(2009) Genes Immunol. 10, 373-379; Sinico, R.A. et al.(2009) Ann. NY Acad. Sci. 1173, 47-51). 질병 활성에 대해 분석 시(SLE 질병 활성 지수(SLEDAI) 점수를 기준으로)((2004) Arthritis Rheum. 50, 3418-3426) Clq-반응성 CIC는 순한(1.0 내지 4.0의 SLEDAI 점수) 및 활동성 질병(>4.0의 SLEDAI 점수)에서 강하게 상승하였다. SLE 환자는 또한 dsDNA를 인식하는 자기-반응성 IgE를 가졌으며, 상기 IgE의 수준은 증가된 질병 활성과 관련되었다(도 18b).

IgE에 대한 IgG가 또한 SLE 환자의 혈청에서 존재하였으며, 활동성 질병의 환자에 현저하게 상승된 수준을 가졌다(도 18c). 높은 수준의 dsDNA-특이성 IgE는 활동성 루프스 신염과 관련되었다(도 18d). 더욱이, SLE 환자는 높은 총 IgE 수준을 가졌으며, 이는 질병 활성과 관련되었고 적당한 내지 강한 IgG1, IgG3 및 IgE 자가항체 반응을 나타내었다(도 19a, 19b, & 19c). 따라서, SLE가 있는 개인은 T_H1- 및 T_H2-반응과 관련된 자가항체, 및 증가된 질병 활성 및 활동성 신염과 관련된 IgE에 특이적인 자기-반응성 IgE 및 IgG를 갖는다.

실시예 6: SLE 호염기구는 HLA - DR 을 발현하며 림프구 조직으로 회귀한다.

SLE가 있는 개인에서 호염기구의 활성화 상태를 조사하기 위해서, 마커 CD203c의 발현을, 상기가 활성화된 호염기구에서 상향조절되므로, 측정하였다(Hauswirth, A.W. wt al.(2002) J. Allergy Clin. Immunol. 110, 102-109). SLE가 있는 모든 환자는 건강한 대조군에 비해 높은 CD203c 발현을 나타내었으며, 이는 상기 환자의 호염기구가 활성화됨을 가리킨다(도 20a). CD62L(도 20b) 및 HLA-DR(도 20c)의 발현이 또한 SLE 호염기구 상에서 상승하였으며 이는 증가된 질병 활성과 관련되었다.

순환 시 호염기구의 무명수는 SLE 환자에서 감소하였다(도 20d). 상기 감소는 면역억제성 치료와 관련되었지만(도 21), 면역억제 치료는 호염기구의 활성화 상태에 대해 영향을 미치지 않았다(HLA-DR의 존재에 의해 지시된 바와 같이). 중요하게, 호염기구는 SLE를 갖는 시험된 2 명의 환자의 림프절 및 비장에서 발견되었지만, SLE가 없는 대조용 환자에서는 발견되지 않았다(도 20e & 20f). 상기 발견은 SLE가 있는 개인에서의 호염기구가 활성화되고, 2차 림프구 기관으로 회귀하며 항원 제공에 적합한 분자를 발현함을 암시한다. 이는 SLE가 있는 개인에서 자기 반응성 IgE의 존재와 관련된다.

SLE는 오랫동안 B 세포 질병으로 간주되었지만, B 세포 부류 전환을 촉진하는 자기 반응성 T 세포(Singh, R.R. et al.(1995) J. Clin. Invest. 96, 2990-2996) 및 다른 세포 유형, 예를 들어 수지상 세포 및 대식세포(Kyttaris, V.C. et al.(2005) Curr. Rheumatol. Rep. 7, 469-475; Holmdahl, R. et al.(1991) Autoimmunity 8, 271-280)가 또한 상기 질병에, 예를 들어 B 세포 생존 및 분화에 영향을 미치는 인자들, 예를 들어 BAFF 및 증식-유도 리간드(APRIL)의 분비를 통해 상기 질병에 연루되었다(Levesque, M.C.(2009) Clin. Exp. Immunol. 157, 198-208). 호염기구는 SLE에서 자기 반응성 항체의 생산에 기여하는 것으로 밝혀졌다. Lyn ^-/- 마우스에서 상기 발견은 호염기구의 고갈 또는 IL-4 또는 IgE의 부재가 자가항체 생산의 현저한 감소를 야기하고 신장 기능을 보존함을 보인다. 이는 호염기구 없이 상기 자가항체의 수준이 신장 질병을 유발하기에는 불충분함을 입증하였다. 따라서, 호염기구는 B 세포 허용성의 기존의 손실을 증폭시키는 작용을 한다.

호염기구는 오랫동안 알러지와 관련되어 왔다(Schroeder, J.T. & MacGlashan, D.W. (1997) J. Allergy Clin. Immunol. 99, 429-433; Mukai, K. et al. (2005) Immunity 23, 191-202). 그러나, 면역성에 있어서 호염기구의 역할은 불명확한 채로 있다. 호염기구가 생체 내에서 T_H2 세포 분화를 유도하고(Charles, N. et al. (2009) Immunity 30, 533?543; Sokol, C.L. et al. (2008) Nat. Immunol. 9, 310-318), 체액 기억 반응을 증폭시키고(Denzel, A. et al. (2008) Nat. Immunol. 9, 733-742), MHC II를 통해 항원을 제공할 수 있다는(Perrigoue, J.G. et al. (2009) Nat. Immunol. 10, 697-705; Yoshimoto, T. et al. (2009) Nat. Immunol. 10, 706-712; Sokol, C.L. et al. (2008) Nat. Immunol. 9, 310-318) 최근의 발견들은 T_H2 면역성의 조절에 있어서 상기 세포 유형의 역할의 증거를 제공한다. Lyn ^-/- 마우스 모델에서, T_H2 기울임은 호염기구 중의 Lyn 키나제의 부재에 의해 구동되며, 이는 상기 세포에서 GATA-3의 상향조절 및 생체 내 IL-4의 증대된 생산을 생성시킨다(Charles, N. et al.(2009) Immunity 30, 533-543). 인간에서, SLE 환자의 호염기구 중의 Lyn의 양에 대한 예비 분석은 건강한 대조군에 배히 상당한 차이를 밝혀내지 못했다. 그러나, 특히 유럽 혈통의 집단에서 SLE에서 Lyn 키나제의 역할에 대한 증거가 증가하고 있다(Lu, R. et al. (2009) Genes Immun. 10, 397-403; Liossis, S.N. et al. (2001) J. Investig. Med. 49, 157-165).

중요한 것은 Lyn ^-/- 마우스에서 루푸스형 신염을 유발하는 자가항체의 생산에 호염기구가 기여한다는 발견이다. 상기 세포의 활성화는 Lyn ^-/- 마우스의 림프절 및 SLAE 환자에서 CD62L 발현의 증대 및 그의 축적을 유발하였다. 마우스 및 인간 호염기구 상에서 MHC II 발현이 증가하였으며, 마우스에서 막-결합된 BAFF의 발현이 관찰되었고 이는 세포 표면 상에서 IgD의 관여 후 인간 호염기구에서 개시된 것과 유사하다(Chen, K. et al. (2009) Nat. Immunol. 10, 889-898). Lyn ^-/- 마우스에서 호염기구의 고갈은 비장 혈장 세포의 수를 감소시켰으며 자가항체 생산을 억제하였고 이는 루푸스 신염을 구동한다(Seshan, S.V. & Jennette, J.C. (2009) Arch. Pathol. Lab. Med. 133, 233-248; Sinico, R.A. et al. (2009) Ann. NY Acad. Sci. 1173, 47-51). 호염기구의 고갈은 또한 Lyn ^-/- 마우스의 신장에서 IL-1β, IL-4, IL-6, IL-13 및 IFN-γ의 생산을 감소시켰다. 따라서, 신장에서 염증전 환경의 감소는 호염기구 불활성화 또는 고갈로부터의 가능한 치료학적 이점을 암시한다.

이러한 발견은 IgE 면역 복합체가 호염기구를 활성화할 수 있고 작용성 CIC를 형성하는(lgh-7 유전자좌의 고갈에 의해서 또는 IL-4 생산을 제거함으로써) 자기 반응성 IgE의 제거가 신장 질병을 예방함을 보인다. 이러한 IgE-CIC는 또한 Lyn ^-/- 마우스 및 SLE를 갖는 인간 환자 모두에서 루푸스 신염과 관련되었다. 순환하는 IgE 수준을 기존의 알러지 방지 약물인 오말리주맵에 의해 감소시킬 수 있기 때문에, 순환하는 IgE 수준을 낮추고 호염기구 상에서의 FcεRI 발현을 감소시키는 IgE-특이성 항체(Lin, H. et al.(2004) J. Allergy Clin. Immunol. 113, 297-302)인 상기 약물은 상승된 IgE 수준을 갖는 SLE 환자에게 치료학적 이점일 수 있다. SLE가 있는 개인에서 증가된 수준의 dsDNA-특이성 IgE와 증가된 질병 활성 및 활동성 루푸스 신염과의 관련은 증가된 T_H2 반응과 신염의 발생 간의 연계를 주장하지만, T_H1 매개된 반응이 또한 상기 집단에서 발견됨은 분명하다. 증가된 순환하는 IgG1 및 IgG3 자가항체의 존재는 강한 T_H1 성분을 가리킨다. 이는 상기 T_H2 반응의 직접적인 조절이 IL-4 및 IL-13 수용체 길항물질의 사용을 통해(Burmeister Getz et al.(2009) J. Clin. Pharmacol. 49, 1025-1036) 치료 전략으로서 T_H1(또는 가능하게는 T_H17) 표현형을 향해 이동함으로써 원치않는 질병 악화 효과를 가질 수 있음을 입증한다. 그럼에도 불구하고, IgE-CIC는 Lyn ^-/- 마우스의 신장에서 발견되지 않았으며, 이는 상기 CIC가 신장 병인 자체에는 기여하지 않지만 대신에 호염기구 활성화에 한 역할을 담당하는 것으로 보인다. 따라서, IgE 또는 호염기구 고갈의 전략은 상기 T_H1-T_H2 균형의 변경과 관련된 합병증을 피할 수 있다.

SLE를 T_H2 성분을 갖는 질병으로서 바라보는 것은 논의의 여지가 있다. SLE에서 T_H1 및 가능하게는 T_H17 세포의 연루(Akahoshi, M. et al. (1999) Arthritis Rheum. 42, 1644-1648; Heine, G. et al. (2002) Nephrol. Dial. Transplant. 17, 1790-1794; De Carli, M. et al. (1994) Autoimmunity 18, 301-308; Kono, D.H. et al. (2000) Immunol. 164, 38-42; Peng, S.L. et al. (1997) J. Clin. Invest. 99, 1936-1946)뿐만 아니라 조절성 T 세포 활성의 변경 또는 상실(Valencia, X. et al. (2007) J. Immunol. 178, 2579-2588; Lee, H.Y. et al. (2008) Rheumatology (Oxford) 47, 789-794)에 대한 상당한 증거가 존재한다. 자발적인 유전자 돌연변이 또는 변경이 루푸스형 질병을 유발하는 일부 마우스 모델, 예를 들어 BXSB 및 MRL-Fas^lpr 마우스는 T_H1 사이토킨 IFN-γ-의존성 질병을 나타낸다. 이러한 배경을 가진 마우스에서 IFN-γ를 암호화하는 유전자의 결실은 질병을 제거하는 것으로 나타났다((Balomenos, D. et al., (1998) J. Clin. Invest. 101, 364-371; Kono, D.H. et al. (2000) Immunol. 164, 38-42). SLE가 있는 인간은 T_H1 및 T_H2 반응을 모두 나타내었으며, IgG-CIC 및 IgE-CIC는 모두 증가된 질병 활성과 관련되었다. 다수의 연구들이 T_H1과 T_H2 세포 반응간의 균형이 루푸스 신염의 표현형을 결정할 수도 있음을 제시하였다(Masutani, K. et al. (2001) Arthritis Rheum. 44, 2097-2106; Akahoshi, M. et al. (1999) Arthritis Rheum. 42, 1644-1648; Heine, G. et al. (2002) Nephrol. Dial. Transplant. 17, 1790-1794; Shimizu, S. et al. (2005) J. Immunol. 175, 7185-7192; De Carli, M. et al. (1994) Autoimmunity 18, 301-308). 강한 T_H1 반응은 확산 증식성 루푸스 신염과 관련되는 것으로 나타난 반면, 우세한 T_H2 반응은 막성 루푸스 신염과 관련되었다(Masutani, K. et al. (2001) Arthritis Rheum. 44, 2097-2106; Akahoshi, M. et al. (1999) Arthritis Rheum. 42, 1644-1648; Heine, G. et al. (2002) Nephrol. Dial. Transplant. 17, 1790-1794; Shimizu, S. et al. (2005) J. Immunol. 175, 7185-7192; De Carli, M. et al. (1994) Autoimmunity 18, 301-308). 이러한 관찰은 T_H1 및 T_H2 반응이 모두 루푸스 신염에 기여할 수 있지만, 상기 질병은 하나 또는 다른 반응의 우세에 따라 상이하게 나타날 수도 있음을 주장한다.

이러한 발견은 호염기구 및 T_H2 환경이 자가항체의 생산에 영향을 미치고 Lyn 결핍과 관련하여, 호염기구의 고갈 또는 lgh-7 또는 Il4 유전자의 고갈이 상기 자기 반응성 항체의 순환 수준의 감소를 야기함을 보인다. SLE가 있는 개인에서, 자기 반응성 IgE는 활동성 질병 및 활동성 루푸스와 관련되었다. 이들의 호염기구는 활성이며 상기가 T 및 B 세포 작용에 영향을 미칠 수도 있는 2 명의 시험된 개인의 2차 림프구 조직에서 상기 호염기구가 발견되었다. 따라서, 이러한 발견은 자기 반응성 IgE의 순환 수준의 감소 또는 호염기구 활성의 꺽임이 루푸스 신염에서 치료학적 이점을 가질 수 있음을 입증한다.

상기 실시예들에 개시된 결과는 하기의 방법 및 물질을 사용하여 획득되었다.

마우스

본 연구에 사용된 모든 마우스는 앞서 개시되었다(Charles, N. et al.(2009) Immunity 30, 533-543). 달리 나타내지 않는 한, 마우스는 32 내지 40 주 되었고 그룹 비교를 위해 연령-합치되었다. 마우스를 특정한 병원체 부재 조건 하에서 유지시키고 NIH 지침 및 NIAMS-승인된 동물 연구안 A007-03-01에 따라 사용하였다.

인간 환자

샘플을 SLE의 장기적인 자연 병력 연구에 참여한 성인 환자들로부터 수집하였다. 상기 연구는 NIAMS의 기관 감사 위원회에 의해 승인되었다. 모든 환자는 SLE에 대한 미국 대학의 류마티스학 분류 기준을 충족하였다(Hochberg, M.C.(1997) Arthritis Rheum. 40, 1725; Tan, E.M. et al.(1982) Arthritis Rheum. 25, 1271-1277). 환자 특징 및 루푸스 활성 득점 시스템을 도 22에 나타낸다. 대조용 샘플을 건강한 혈액 공여자로부터 수득하였다. 모든 환자에게 서면 동의서를 제공하였다.

항체 및 유식 세포측정

다이나이트로페닐-특이성 마우스 IgE를 앞서 개시된 바와 같이 생산하였다(Liu, F.T. et al.(1980) J. Immunol. 124, 2728-2737). 모든 다른 항체들은 상업적인 공급원으로부터 획득되었으며 도 23에 개시되어 있다. 유식 세포측정 획득을 앞서 개시한 바와 같이 FACSCalibur 기계(BD Biosciences)로 수행하였다(Charles, N. et al.(2009) Immunity 30, 533-543). 데이터 분석을 플로우조(Flowjo) 소프트웨어(Treestar)로 수행하였다.

비장 T 세포의 생체 내 호염기구 고갈 및 생체 외 분석.

비장 T 세포(CD4⁺)의 생체 내 호염기구 고갈 및 생체 외 분석은 앞서 개시되었다(Charles, N. et al.(2009) Immunity 30, 533-543).

사구체신염, 순환하는 면역 복합체의 사구체 침착 및 신장 기능의 분석.

나이든(약 40 주된) 마우스를 죽이고, 신장을 제거하였다. 하나의 신장을 10% 완충된 포르말린(Sigma)으로 고정시키고, 파라핀에 묻고, 절단하고 H&E(American Histolabs)로 염색하였다. 다른 신장을 최적의 절단 온도 배지 중의 비닐 금형에 넣고 상기 샘플을 액체 질소에서 동결시켰다. 4-마이크로미터-두께의 동결된 조각을 저온 아세톤에 고정시키고, 1% BSA를 함유하는 PBS에서 차단시키고, 특정한 플루오레세인-접합된 항체 또는 아이소타입 대조군으로 동일한 완충액 중에서 염색하였다(사용된 항체에 대해 도 23 참조).

신장 기능의 평가를 위해서 알부민/크레아티닌 비(ACR)를 측정하였다. 유전자형당 10 마리 이상의 나이든 마우스로부터 소변을 채취하고 알부민 농도를 마우스 알부민 ELISA(Bethyl laboratories)에 의해 측정하였다. 크레아티닌 분석(R&D systems)을 사용하여 소변 크레아티닌 농도를 측정하였다. 결과를 크레아티닌 ㎎당 알부민 ㎍의 ACR로서 나타낸다.

자가항체, 순환하는 면역 복합체의 측정 및 순환하는 면역 복합체의 침전.

dsDNA에 특이성인 마우스 IgG, 마우스 ANA-특이성 IgG 및 마우스 CIC((Clq) IgG, IgA 및 IgM) ELISA 키트를 알파 다이아그노스틱(Alpha Diagnostic)으로부터 수득하였다. 인간 순환 면역 복합체용 ELISA 키트(Clq-코팅된 플레이트)를 ALPCO로부터, 인간 IgE용 ELISA 키트를 맙바이오테크(Mabbiotech)로부터 수득하였다. 모든 상업적인 ELISA를 제조사의 설명에 따라 수행하였다. 인간 및 마우스 dsDNA-특이성 IgE 및 dsDNA-특이성 IgG 하위부류를 모두 측정하기 위해서, dsDNA-코팅된 플레이트(Calbiotech)를 10% FCS(Invitrogen)를 함유하는 PBS 중의 일련의 혈청 희석액과 함께 배양하였다. 상응하는 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 2차 항체를 사용하였다(도 23). 450 ㎚에서의 광학 밀도를 테트라메틸벤지딘 기질 배양(Invitrogen) 후에 측정하였다. 나타낸 데이터는 200 희석 플레이트 중 하나로부터였다(이에 의해 최상의 신호 대 소음비가 획득되었다). 동일한 접근법을 사용하여 환자 및 건강한 대조군의 순환하는 IgE-특이성 IgG의 양을 측정하였으며, 이때 PBS 중의 2 ㎍㎖^-1로 인간 IgE(Abbiotec)로 코팅된 플레이트를 사용하였다.

CIC를 앞서 개시한 바와 같이 나이든 마우스의 혈청으로부터 침전시켰다(Toran, E.J. & Lee, C.M.(1995) J. Natl. Med. Assoc. 87, 693-699). 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석한 다음 지시된 항체로 웨스턴 블럿팅을 수행하였다(도 23). 리코 오디세이 시스템(LiCor Odyssey System)을 사용하여 신호를 검출하였다.

호염기구 배양, 호염기구 검출 및 인터류킨-4 생산의 측정.

골수-유래된 배양된 호염기구는 앞서 개시되었다(Charles, N. et al.(2009) Immunity 30, 533-543). 배양 9일째에, 세포를 세척하고, 오직 IL-3(Peprotech)만을 함유하는 배지에서 ㎖당 100만 세포로 재현탁시키고 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 세포를 동일한 배지에서 500만 세포/㎖로 재현탁하고 도 3에 나타낸 바와 같이 자극하였다. IgE 및 항원 자극을 위해서, 세포를 30 분 동안 1 ㎍㎖^-1의 다이나이트로페닐-특이성 IgE로 감작시키고, 세척하고 이어서 20 ng ㎖^-1의 다이나이트로페닐-HSA(Sigma)로 자극하였다. IgE-면역 복합체 및 IgG-면역 복합체 자극을 위해서, IgE- 또는 IgG-함유 면역 복합체를, 37 ℃에서 30 분간 1:2 비의 IgE 및 항체 대 마우스 IgE 또는 IgG1 및 항체 대 마우스 IgG1을 배양함으로써 제조하였다(도 23 참조). 이어서 지시된 농도의 면역 복합체(도 3)를 37 ℃에서 4 시간 동안 상기 세포에 가하였다. 상기 배양 종료 2 시간 전에, 10 μM 모넨신(Sigma)을 상기 세포에 가하였다. 세포 내 염색을 앞서 개시한 바와 같이 수행하였다(Charles, N. et al.(2009) Immunity 30, 533-543).

호염기구 검출을 위한 면역조직화학을 앞서 개시한 바와 같이 수행하였다(Kepley, C.L. et al. (1995) J. Immunol. 154, 6548-6555; McEuen, A.R. et al. (1999) Lab. Invest. 79, 27-38).

통계학적 분석

2 개 집단 간의 비교를 위해서, 달리 명시되지 않는 한 단일 양방 스튜던츠 t 검증을 수행하였다. 3 개 이상의 집단을 비교한 경우, 일원 분산분석 검증을 먼저 수행하고, 유의수준에 도달하면(P<0.05), 달리 나타내지 않는 한 단일 양방 스튜던츠 t 검증을 각각의 비교된 집단 간에 수행하였다. 통계학적 분석을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.01 소프트웨어로 수행하였다.

마우스 혈액

마우스를 NIH 지침에 따라 CO₂로 안락사시켰다. 사망 직후, 25G 바늘을 사용하여 심장 천공을 수행하고 최소 500 ㎕의 혈액을 헤파린 처리된 튜브에 회수하였다. 이어서 혈액 샘플을 4 ℃에서 700 x g로 20 분간 원심분리시켜 혈장을 수득하였다. 상기 혈장을 추가의 분석을 위해 -20 ℃에서 유지시켰다. 상기 수확된 혈액 세포를 실온에서 3 분간 5 ㎖의 ACK 용해 완충액(150 mM NH₄Cl, 12 mM NaHCO₃, 1 mM EDTA, pH 7.4)에 재현탁시키고, 이어서 4 ℃에서 5 분간 추가로 배양하였다. 후속으로, 10 ㎖의 PBS를 가하고 샘플을 500 x g에서 5 분간 원심분리시켰다. 적혈구가 여전히 존재하면, 세포를 4 ℃에서 5 분간 ACK 용해 완충액에서 추가로 배양하고 상기 개략된 단계를 적혈구가 존재하지 않을 때까지 반복하였다. 남은 백혈구를 FACS 완충액(PBS/1% BSA/0.05% NaN₃)에 재현탁시켰다. 호염기구를 CD49b⁺FcεRIα⁺CD11b⁺CD117^-로서 확인하였다. B 세포는 B220⁺IgM⁺으로서 확인되었다.

골수

양쪽 대퇴골을 수확하고 골수를 30G 바늘이 구비된 FACS 완충제 3 ㎖을 함유하는 주사기를 사용하여 플러싱시켰다. 회수된 세포를 원심분리하고 적혈구를 얼음 상에서 3 분간 3 ㎖의 ACK 용해 완충액에 용해시켰다. 후속으로, 10 ㎖의 PBS를 가하고 상기 샘플을 원심분리시켰다(500 x g, 5 분). 이어서 세포를 FACS 분석을 위해 염색하였다. 호염기구 및 총 B 세포를 상기와 같이 확인하였다. 골수 중에서 재순환하는 B 세포를 B220^hiIgM⁺로서 정의하였다(중간 평균 형광 강도가 상기 IgM⁺ 집단에서 보인다).

비장

비장을 수확하고 비종의 치수로서 칭량하였다. 이어서 상기 비장을 족집게를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 균질화하였다. 상기 세포 현탁액을 원심분리시키고(500 x g, 5 분), 적혈구를 얼음 상에서 5 분간 5 ㎖의 ACK 용해 완충액에 용해시켰다. PBS(20 ㎖)를 가하고 상기 샘플을 다시 원심분리시켰다(500 x g, 5 분). 이어서 세포를 FACS 완충액(10 ㎖)에 재현탁하고 40 ㎛ 기공 직경 세포 스트레이너(BD Biosciences) 상에서 여과하였다. 1 ㎖의 상기 세포 현탁액을 지시된 바와 같이 FACS 염색에 사용하였다. 호염기구 및 B 세포를 상기와 같이 확인하였다. 상기 비장 중의 CD11b⁺ 세포의 퍼센트에 대해서, 상기 CD11b^hi 집단을 걸러내었다.

복막

비만 세포인 복막 비반 세포의 비율을 앞서 개시한 바와 같이 측정하였다(Hibbs, M.L. et al.(1995) Cell 83, 301-311).

인간 혈액 샘플

혈액을 EDTA-코팅된 튜브에 수확하였다. 4 ㎖의 혈액을 사용하여 혈장 샘플을 수확하였다. 이를 위해서, 혈액을 4 ℃에서 20 분간 600 x g에서 원심분리시켰다. 이어서 혈장 상을 수확하고, 샘플을 추가의 분석시까지 -20 ℃에서 유지시켰다. 호염기구 분석을 위해서 10 ㎖의 전혈을 20 ㎖의 ACK 용해 완충액에 가하고 실온에서 5 분 및 얼음 상에서 5 분 더 배양하였다. 30 ㎖의 PBS를 가하고, 세포를 원심분리시켰다(500 x g, 5 분). 상기 단계를 더 이상 적혈구가 보이지 않을 때까지 3 회 반복하였다. 이어서 세포를 10 ㎖(원래 부피)의 FACS 완충액(PBS/1% BSA/0.05% NaN₃)에 재현탁시켰다. ㎖당 백혈구의 수 및 생육력을 바이셀(ViCell) 세포 카운터(Beckman and Coulter)로 평가하였다. 생육력은 항상 90% 이상이었다. 이어서 세포를 지시된 표면 마커에 의한 세포 외 염색을 위해 처리하였다. 호염기구 무명수에 대해서, 호염기구를 FcεRIα⁺CD203c⁺CD123c⁺CD11b⁺ 세포로서 확인하였다. HLA-DR 발현 분석을 위해서, 호염기구를 FcεRIα⁺CD203c⁺CD11b⁺ 로서 확인하였다. CD62L 발현 분석을 위해서, 호염기구를 FcεRIα⁺CD203c⁺CD123c⁺ 로서 확인하였다.

마우스에서 사구체 병리학적 특징에 대한 조직학적 분석

염증, 증식, 반월 형성, 및 괴사를 포함한 사구체 병리학적 특징에 대한 조직학적 분석. 유전자형당 10 마리 이상의 나이든 마우스의 최소 30 개의 사구체를 기록하였다. 각각의 사구체에 대해서, 1 내지 5의 점수(1, 정상; 2, 보통; 3, 심함; 4, 반월 형성과 함께 심함, 및 5, 괴사)를 사용하였다. 각각의 개별적인 마우스로부터의 점수를 더하고 평균하여 사구체신염 점수를 제공하였다. 모든 병리학적 평가를 맹검 방식으로 수행하였다.

마우스 신장에서 사이토킨 함량의 평가

평가를 위해서, 신장을 프로테아제 억제제(Roche)를 함유하는 PBS 800 ㎕ 중에 균질화하고 10,000 x g에서 20 분간 원심분리하였다. 전체 단백질 함량을 측정하고(Dc 단백질 분석, BioRad) IL-4(BD Bioscience), IL-13, IL-6, IL-1β, CCL2 및 IFNγ(eBioscience)를 제조사의 설명에 따라 ELISA에 의해 측정하였다.

환자의 루푸스 및 신염 활성 평가

루푸스 활성을 SELENA-SLEDAI(홍반성 루푸스 국립 평가에서 에스트로젠의 안전성 전신 홍반성 루푸스 질병 활성 지수) 점수에 의해 평가하였다³⁵. 상기 SLEDAI 점수를 근거로, 루푸스 활성을 비활동성(0), 순함(1.0-4.0) 및 활동성(>4)으로서 분류하였다. 활동성 푸루스 신염을 활성 소변 침전물의 존재 및 >1의 요단백 크레아티닌 비 또는 증식성 루푸스 신염에 대한 면역억제 치료에 의해 정의하였다.

효소-결합된 면역흡수 분석

상이한 면역글로불린 아이소타입 분석을 위해서, 항-마우스 IgM, IgA, IgG₁, IgG_2a, IgG_2b 및 IgE ELISA 키트를 베틸 레보라토리즈(Bethyl Laboratories)로부터 구입하였다.

다른 실시태양

상기 설명으로부터, 본 발명에 개시된 발명을 다양한 용도 및 조건에 채용되도록 상기 발명에 대해 변화 및 변형을 수행할 수 있음은 자명할 것이다. 상기와 같은 실시태양은 또한 하기 청구의 범위 내에 있다.

본 발명의 변수의 임의의 정의에서 요소들의 목록의 인용은 상기 변수의 임의의 단일 요소 또는 나열된 요소들의 조합(또는 하위조합)으로서의 정의를 포함한다. 본 발명의 실시태양의 인용은 임의의 단일 실시태양 또는 임의의 다른 실시태양 또는 이의 부분과의 조합으로서 상기 실시태양을 포함한다.

본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공보는 각각의 독립적인 특허 및 공보가 구체적으로 및 개별적으로 참고로 인용되는 것으로 가리키는 바와 동일한 정도로 본 발명에 참고로 인용된다.

Claims

루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된, 또는 다른 자가면역 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 상기 환자의 IgE 또는 IgE 수용체의 발현 또는 생물 활성을 감소시키는 유효량의 작용제를 투여함을 포함하는, 상기 환자에게서 상기 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1 항에 있어서,
작용제가 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 소 화합물인 방법.
제 2 항에 있어서,
투여되는 폴리펩타이드가 IgE, IgE 수용체와 선택적으로 결합하거나 IgE의 생산을 조절하는 항체 또는 그의 단편인 방법.
제 3 항에 있어서,
항체 단편이 Fab 또는 단일 쇄 V 영역 단편(scFv)인 방법.
제 2 항에 있어서,
IgE 발현을 감소시키는 siRNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드 또는 shRNA인 핵산 분자를 투여하는 방법.
제 2 항에 있어서,
Syk 키나제 억제제인 소 분자 화합물을 투여하는 방법.
제 6 항에 있어서,
Syk 키나제 억제제가 포스타마티니브인 방법.
제 2 항에 있어서,
IgE 생산 또는 호염기구 활성화를 조절하는 소 분자 화합물을 투여하는 방법.
제 1 항에 있어서,
작용제가 IgE 생산을 길항하는 미세RNA를 조절하는 방법.
제 1 항에 있어서,
자가반응성 IgE의 수준을 감소시키고/시키거나 순환하는 면역 복합체의 수준을 감소시키는 방법.
제 1 항에 있어서,
호염기구 활성화를 감소시키는 방법.
제 1 항에 있어서,
작용제가 항체인 방법.
제 1 항에 있어서,
투여되는 작용제가 오말리주맵인 방법.
루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된, 또는 다른 자가면역 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 상기 환자의 호염기구의 수 또는 활성을 감소시키거나 호염기구 활성화를 감소시키는 유효량의 작용제를 투여함을 포함하는, 상기 환자에게서 상기 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
제 14 항에 있어서,
환자에게서 CD203c 발현, CD62L, 및 HLA-DR 중 하나 이상의 수준을 감소시키는 방법.
투여되는 작용제가 오말리주맵인 방법.
루푸스, 루푸스 신염, 루푸스-관련된, 또는 다른 자가면역 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 유효량의 오말리주맵을 투여함을 포함하는, 상기 환자에게서 상기 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
제 17 항에 있어서,
유효량이 용량당 약 75 ㎎ 내지 500 ㎎인 방법.
제 17 항에 있어서,
오말리주맵을 용량당 약 150 ㎎ 내지 400 ㎎으로 매 1, 2, 3 또는 4 주마다 투여하는 방법.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
환자를 루푸스 또는 루푸스 신염이 있거나 또는 발병할 소인이 있는 것으로서 확인하고 작용제를 상기 확인된 환자에게 투여하는 방법.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
환자가 상승된 IgE 수준을 갖는 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
작용제가 단클론 항-IgE 항체인 방법.
제 22 항에 있어서,
단클론 항-IgE가 인간화된 단클론 항체인 방법.
제 23 항에 있어서,
단클론 항-IgE 항체가 오말리주맵인 방법.
제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
환자에게 비스테로이드성 소염 약물(NSAID), 하이드록시클로로퀸, 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드, 아즈티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 벨리뮤맵, 데하이드로에피안드로스테론, 및 리툭시맵으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 작용제를 투여함을 또한 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
루푸스 신염이 확산 증식성 루푸스 신염 또는 막성 루푸스 신염인 방법.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
자가면역 질환이 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염, 항인지질 증후군, 근염 및 강피증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제 27 항에 있어서,
환자가 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염, 항인지질 증후군, 근염 또는 강피증을 앓고 있거나 또는 이에 민감한 것으로서 확인되고, 작용제를 상기 확인된 환자에게 투여하는 방법.
비스테로이드성 소염 약물(NSAID), 하이드록시클로로퀸, 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드, 아즈티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 벨리뮤맵, 데하이드로에피안드로스테론, 및 리툭시맵으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 작용제와 함께 치료 유효량의 항-IgE 요법을 포함하는 루푸스 신염의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
제 29 항에 있어서,
항-IgE 요법이 단클론 항-IgE 항체를 포함하는 약학 조성물.
호염기구를 억제하거나 상기 호염기구의 수를 감소시키는 치료 유효량의 작용제를 포함하는 루푸스 신염의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
작용제가 오말리주맵인 약학 조성물.
루푸스, 루푸스 신염, 또는 루푸스-관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 키트로, IgE의 발현 또는 생물 활성을 감소시키는 유효량의 작용제, 및 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 방법에 따른 루푸스, 루푸스 신염, 및 루푸스-관련된 질환의 치료를 위한 상기 키트의 사용 설명서를 포함하는 키트.
제 33 항에 있어서,
항-IgE 치료제가 항체를 포함하는 키트.
제 33 항에 있어서,
항-IgE 치료제가 단클론 항체를 포함하는 키트.
제 33 항에 있어서,
항-IgE 치료제가 오말리주맵인 키트.