CN112807427A - 一种抗-cxcl10抗体在制备用于治疗受试者中的炎性疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及至少一种抗‑CXCL10抗体在制备用于治疗受试者中的炎性疾病的用途，以及一种抗炎试剂在制造治疗受试者中的炎性疾病的药物中的用途，此外还涉及一种药物组合物，所述组合物包含：一种或者多种抗‑CXCL10抗体；和药学可接受的载体。

Description

一种抗-CXCL10抗体在制备用于治疗受试者中的炎性疾病的 用途

本申请是对发明创造名称为“用于抑制炎症的抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和抗-CXCR5试剂”，国际申请号为“PCT/US2012/044464”，中国国家阶段申请号为“201280075412.0”，申请日为“2012年6月27日”的申请提出的分案申请。上述申请的全文被援引纳入本文。

技术领域

本申请主要涉及用于抑制炎症的方法和组合物。更具体地说，本申请涉及用于预防和治疗炎性疾病的抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和抗-CXCR5试剂和/或其他抗炎试剂的用途。

背景技术

尽管近来在与炎症过程相关的研究中取得进展，但是用于治疗慢性炎性疾病的疗法仍然还有很多没有弄清楚。这可能是因为在宿主中引发并且维持炎症状态的因子有很多并且是复杂的。目前治疗具有与它们相关的缺点，包括免疫系统的抑制可能导致宿主更容易受到细菌、病毒和寄生虫感染。例如，使用类固醇是慢性炎症治疗的一种传统方法。这种治疗可能导致保护性免疫的抑制和体重的变化。生物技术中的进展已经促进了具有很少副作用的靶向生物制品的发展。为了改善炎性疾病治疗，需要发展改变和控制由先天性和适应性免疫系统两者的细胞生成的因子的技术。

宿主细胞具有与配体关联的表面受体以转导信号并且调节宿主细胞活性。施用抗TNF-α抗体或者可溶性TNF-α受体已经显示抑制炎性疾病。不幸的是，与这种治疗相关联的副作用可能会通过没有充分了解的机制导致感染(例如肺结核)和其他不良反应的风险增加。类似的，针对膜结合分子如 CD40的抗体治疗具有抑制炎症和移植物-宿主病的特性。虽然一直在研究用于预防炎性疾病的其他靶向宿主细胞治疗，但是仍然没有将阻止所有炎性疾病的已知单独表面或分泌因子。因此，需要开发采用新鉴定的特异性宿主细胞靶标的治疗。

在进入粘膜之后不久，各种不同的病原体或毒素激活巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞、潘氏和隐窝细胞以及上皮细胞。趋化因子是耐受水解的、促进新血管形成或内皮细胞生长抑制、诱导细胞骨架重排、使淋巴细胞激活或者失活以及通过与G蛋白偶联受体相互作用而介导趋药性的小的细胞因子样蛋白的超级家族。趋化因子可以介导表达它们的受体的宿主细胞的迁移和生长。负责趋化因子的这些功能的细胞机制一般是但是不是全部是Ca²⁺流依赖性的并且是百日咳毒素敏感的。然而，趋化因子介导事件的准确机制仍未清楚。

发明内容

本发明涉及用于治疗或预防炎性疾病或病症的方法和组合物。在一个实施方式中，所述方法包括向经诊断患有炎性疾病或病症的受试者施用有效量的抗炎试剂的步骤，所述抗炎试剂(1)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、 CXCR3和/或CXCR5的表达，或(2)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、 CXCR3和/或CXCR5中任一个之间的相互作用，或(3)抑制CXCL9、CXCL10、 CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的生物活性。

在另一个实施方式中，所述方法包括向经诊断患有炎性疾病或病症的受试者施用治疗有效量的抗-CXCL9抗体、抗-CXCL10抗体、抗-CXCL11抗体、抗-CXCL13抗体、抗-CXCR3抗体、抗-CXCR5抗体、或它们的组合的步骤。

在一个实施方式中，所述试剂或抗体以约10μg/kg体重/天至约10 mg/kg体重/天的剂量施用。

所述试剂可以包含抗体、抗体片段、短干扰RNA(siRNA)、适体、合成抗体(synbody)、结合试剂、肽、适体-siRNA嵌合体、单链反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸(triplex forming oligonucleotide)、核酶、外部引导序列、或试剂编码表达载体。

在另一个方面，一种用于增强抗炎治疗的效果的方法包括向正在接受或已经接受抗炎治疗的受试者施用有效量的抗炎试剂，所述抗炎试剂(1)抑制 CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的表达，或(2)抑制CXCR3与CXCL9、CXCL10或CXCL11之间的相互作用和CXCR5和CXCL13之间的相互作用，或(3)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5 的生物活性，其中，所述试剂包含抗体、抗体片段、短干扰RNA(siRNA)、适体、合成抗体(synbody)、结合试剂、肽、适体-siRNA嵌合体、单链反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸、核酶、外部引导序列、或试剂编码表达载体。

在一个实施方式中，所述受试者正在接受抗炎治疗。在另一个实施方式中，所述受试者已经接受抗炎治疗，并且已经对抗炎试剂显示出抗炎药物耐性。

在又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述组合物包含抗炎试剂和药学可接受的载体，所述抗炎试剂能够(1)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、 CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的表达，或(2)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、 CXCL13、CXCR3和/或CXCR5中任一个之间的相互作用，或(3)抑制CXCL9、 CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的生物活性，其中，所述抗炎试剂是抗体、抗体片段、短干扰RNA(siRNA)、适体、合成抗体、结合试剂、肽、适体-siRNA嵌合体、单链反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸、核酶、外部引导序列、或试剂编码表达载体。

一种用于治疗受试者中的炎性症状或疾病的方法，所述方法包括：

向需要所述治疗的受试者施用治疗有效量的至少一种抗体，所述至少一种抗体选自由抗-CXCL9抗体、抗-CXCL10抗体、抗-CXCL11抗体、抗-CXCL13 抗体、抗-CXCR3抗体和抗-CXCR5抗体组成的组，

其中，所述抗体以约10μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天的剂量范围施用。

根据一个优选的实施方式，所述炎性疾病选自由如下疾病组成的组：过敏性反应、脓毒性休克、骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、哮喘、变态反应、动脉粥样硬化、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病、青少年型糖尿病、移植物排斥反应、炎性肠病、克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎、间质性膀胱炎、多发性硬化症、重症肌无力、格雷夫氏症、桥本氏甲状腺炎、肺炎、前列腺炎、银屑病、肾炎、肺炎、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎鼻炎、脊柱关节病、硬皮病、系统性红斑狼疮和甲状腺炎。

根据一个优选的实施方式，所述炎性疾病是选自由克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎和间质性膀胱炎组成的组中的炎性肠病。

根据一个优选的实施方式，所述至少一种抗体结合次级试剂施用。

根据一个优选的实施方式，所述次级试剂选自由抗炎抗体、短干扰 RNA(siRNA)、趋化因子和趋化因子受体结合试剂、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸、核酶、外部引导序列、试剂编码表达载体和小分子抗炎化合物组成的组。

根据一个优选的实施方式，所述次级试剂包含抗细胞因子、趋化因子或它们的受体的抗体。

根据一个优选的实施方式，所述次级试剂包含或编码抑制CXCL9、 CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR或CXCR3表达的siRNA。

根据一个优选的实施方式，所述次级试剂包含小分子抗炎化合物。

根据一个优选的实施方式，所述小分子抗炎化合物是镇痛剂或非甾体抗炎药(NSAID)。

根据一个优选的实施方式，所述受试者被诊断为患有导致CXCL9、 CXCL10、CXCL11和/或CXCR3表达升高的炎性疾病。

根据一个优选的实施方式，所述抗-CXCL9抗体、抗-CXCL10抗体、抗 -CXCL11抗体、抗-CXCL13抗体、抗-CXCR3抗体或抗-CXCR5抗体以0.1pM 至1μM范围内的kd值分别结合CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3 或CXCR5。

一种用于治疗或预防受试者中的炎性症状的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用有效量的抗炎试剂，所述抗炎试剂(1)抑制CXCL9、 CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的表达，或(2)抑制CXCR3与 CXCL9、CXCL10或CXCL11之间的相互作用和/或CXCR5和CXCL13之间的相互作用，或(3)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的生物活性。

根据一个优选的实施方式，所述抗炎试剂包含特异性地结合CXCL9、 CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3或CXCR5的一种抗体。

根据一个优选的实施方式，所述抗炎试剂包含特异性地结合CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3或CXCR5的多种抗体。

根据一个优选的实施方式，所述试剂包含或编码抑制CXCL9、CXCL10、 CXCL11、CXCL13、CXCR3或CXCR5表达的siRNA。

根据一个优选的实施方式，所述抗炎试剂与次级抗炎试剂联合施用。

根据一个优选的实施方式，所述次级抗炎试剂是小分子抗炎化合物。

一种用于增强抗炎治疗的效果的方法，所述方法包括：

向正在接受抗炎治疗的受试者施用有效量的一种或多种抗体，所述一种或者多种抗体选自由抗-CXCL9抗体、抗-CXCL10抗体、抗-CXCL11抗体、抗 -CXCL13抗体、抗-CXCR3抗体和抗-CXCR5抗体组成的组。

根据一个优选的实施方式，所述受试者已经显示出对抗炎试剂的抗性。

一种药物组合物，所述组合物包含：

一种或者多种抗体，所述一种或者多种抗体选自由抗-CXCL9抗体、抗 -CXCL10抗体、抗-CXCL11抗体、抗-CXCL13抗体、抗-CXCR3抗体和抗-CXCR5 抗体组成的组；和

药学可接受的载体。

根据一个优选的实施方式，所述药物组合物进一步包含小分子抗炎化合物。

根据一个优选的实施方式，所述抗-CXCL9抗体、抗-CXCL10抗体、抗 -CXCL11抗体、抗-CXCL13抗体、抗-CXCR3抗体或抗-CXCR5抗体以0.01pM 至1M范围内的kd值分别结合CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3或 CXCR5。

附图说明

图1显示了IFN-γ，IP-10，MIG，I-TAC和CXCR3 mRNA在小鼠结肠炎过程中的表达。

图2显示了通过过继性转移而接受CD45RB^HI或CXCR3⁺CD4⁺T细胞的TCR βxδ^-/-小鼠中的IBD的组织学分析。

图3显示了IL-10^-/-小鼠的结肠炎的发展和SAA水平。大于200μg/ml 的SAA浓度与第0周无症状性结肠炎的发作相关联。

图4显示了IL-10^-/-小鼠的体重变化。

图5显示了血清IL-6和SAA水平与小鼠结肠炎的关联。

图6显示了IL-10^-/-小鼠中的总的粪便和血清Ab(抗体)水平。

图7显示了患有IBD的IL-10^-/-小鼠中的血清IL-12，IFN-γ，IL-2，TNF-α， IL-1α和IL-1β水平。

图8显示了由IL-10^-/-小鼠所呈现的结肠炎的组织学特性。

图9显示了抗-CXCL10抗体消除了严重结肠炎。

图10显示了粘膜组织在严重结肠炎过程中的Th1细胞因子、CXCL10和 CXCR3 mRNA表达。

图11显示了严重结肠炎进展过程中血清中的Th1和炎性细胞因子水平。

图12显示了抗-CXCL10抗体对结肠炎病理学的影响。

图13显示了CD患者的结肠中的CXCL9、CXCL10、CXCL11和TNF-α的组织学和免疫荧光定位。

图14显示了自发性结肠炎过程中IL-10^-/-小鼠中的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种(M.avium subsp.paratuberculosis(MAP))特异性血清Ab反应。

图15显示了使用M.avium亚种副结核杆菌(MAP)挑战的IL-10^-/-小鼠中的组织学特性。

图16显示了MAP挑战之后IL-10^-/-小鼠的体重变化

图17显示了MAP挑战之后IL-10^-/-小鼠的血清细胞因子水平。

图18显示了来自IL-10^-/-小鼠的CD4⁺T细胞的抗-肽#25Ag(来自MPT59) 诱导的增殖和IL-2生成。

图19显示了IBD患者中的血清CXCR3配体和分枝杆菌特异性Ab反应。

图20显示了分枝杆菌挑战后IL-10^-/-小鼠和IBD患者中的SAA水平变化。

图21显示了使用分枝杆菌挑战的IL-10^-/-小鼠的肠组织学特性。

图22显示了IC患者中的血清CXCL9、CXCL10和CXCL11浓度。

图23显示了CYP诱导膀胱炎之后的组织学变化。

图24显示了CYP处理的小鼠中的CXCR3、CXCL9、CXCL10和CXCL11 mRNA 表达。

图25显示了活动性CD过程中的上调的CXCL10表达。

图26显示了活动性CD过程中CXCL11和CXCL9的上调表达。

图27显示了CD患者中的血清淀粉样蛋白A(SAA)和IL-6的上调的血清浓度。

图28显示了CD过程中血清IL-12p40和IFN-γ水平相关。

图29显示了活动性CD过程中炎性细胞因子水平。

图30显示了正常和具有高血清CXCR3配体浓度的CD患者中的结肠炎的组织学特性。

图31显示了通过组织学检查得到的正常和CD患者的结肠中的CXCR3配体和TNFα表达。

具体实施方式

提供如下详细说明以使本领域技术人员能够实施和使用本发明。为了解释目的，给出具体术语以充分地理解本发明。但是，本领域技术人员应当清楚的是，实施本发明不需要这些具体细节。具体申请的描述仅仅作为代表实施例提供。没有将本发明限于所示实施方式的目的，本发明应当根据本文所公开的原理和特征赋予尽可能宽的范围。

除非另有说明，否则结合本发明使用的科学和技术术语将具有本领域技术人员通常理解的意思。此外，除非上下文需要，否则单数形式的术语应当包括多个，并且复数形式的术语应当包括单数形式。

定义

本文使用的如下术语将具有如下含义：

本文使用的术语“治疗”是指减轻或消除障碍和或其伴随的症状的方法。本文使用的术语“预防”是指阻碍受试者获得障碍和/或其伴随的症状的方法。在某些实施方式中，术语“预防”是指降低获得获得障碍和/或其伴随的症状的风险的方法。

本文使用的术语“抗炎活性”或“抗炎反应”是指在细胞变化中表现出的炎症的减轻或预防，如增殖、激活和基因表达等。炎症的减轻可以包括例如减少炎性细胞因子、趋化因子、细胞因子/趋化因子受体的分泌或表达；粘附分子、蛋白酶、和/或免疫球蛋白；减少细胞的趋化性或迁移；降低单核细胞的血液浓度和/或其在炎症部位的局部累积；增加免疫细胞的凋亡；抑制II类MHC呈递；减少自体反应细胞的数量；提高免疫耐性；减少自体反应细胞存活；和它们的组合等。

本文使用的术语“抗炎试剂”是指这样的生物试剂，该生物试剂在结合至蛋白后降低或预防炎性活性或结合至编码炎性蛋白产物的核酸后降低或阻断与所述炎性蛋白产物对应的mRNA或蛋白的表达。抗炎试剂将区别于将在下文中进一步描述的抗炎小分子化合物。例示性的抗炎试剂包括抗体、抗体片段、短干扰RNA(siRNA)、适体、合成抗体(synbody)、结合试剂、肽、适体-siRNA嵌合体、单链反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸、核酶、外部引导序列、和试剂编码表达载体等。

本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特异性地与抗原结合(免疫反应)的抗原结合位点或抗原决定基结合域的分子。本文使用的术语“抗体”以最宽含义使用，并且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示出对目标抗原的特异性结合。“特异性结合”或者“与……免疫反应”是指抗体与希望的抗原的一种或者多种抗原决定簇反应并且没有与其他多肽反应(即，结合)或者以低得多的亲和性与其他多肽结合。术语“抗体”也包括包含全长抗体的一部分的抗体片段，一般是其抗原结合区或可变区。

术语“抗炎抗体”是指抗体或抗体片段试剂。

本文使用的术语“单克隆抗体”是指从具有基本同源的抗体的群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变之外，组成所述群体的各个抗体是相同的。本文的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体以及这种抗体的片段，只要它们显示出所希望的生物活性，在这种嵌合抗体中，重链和/或轻链中的一部分与衍生自特定物种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的其他部分与衍生自另一种物种或者属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源。

“人源化”形式的非人类抗体是包含衍生自非人类免疫球蛋白的少量序列的嵌合抗体。人源化抗体大多数是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高度可变区的残基被来自非人类物种(供体抗体)的具有所期望的特异性、亲和性和/或能力的高度可变区的残基所取代，所述非人类物种例如为小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物。制备人源化和其他嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。

“双特异性抗体”是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。

“异源偶联抗体”的使用也处在本发明的范围内。异源偶联抗体由两种共价结合的抗体组成。已提出这种抗体将免疫系统细胞靶向不需要的细胞。可以想到的是，所述抗体能够使用合成蛋白化学中已知的方法，包括涉及使用交联试剂的那些方法体外制备。作为替代方式，它们可以通过本领域技术人员已知的重组DNA技术使两种抗体或者其片段融合来制备。

本文使用的术语“核酸”是指由至少两个并且优先由十个或者更多个通过骨架结构连接的碱基组成的聚脱氧核糖核酸(DNA或其类似物)或聚核糖核酸(RNA或其类似物)。在DNA中，常见的碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)，而在RNA中，常见的碱基是A、G、C和尿嘧啶(U，代替T)，不过核酸可以包括碱基类似物(例如，肌苷)和非碱基位置(即，在一个或多个位置缺少核苷酸的磷酸二酯骨架)。例示性的核酸包括DNA和RNA 的单链(ss)、双链(ds)、或三链的多核苷酸或寡核苷酸。

术语“多核苷酸”是指包含多于10核苷的核酸。

术语“寡核苷酸”是指含有约15个至约100个核苷的单链核酸。

本文使用的术语“启动子”将在其最宽的背景中使用，并且包括来自基因组基因的转录调控元件(TRE)或由其得到的嵌合TRE，包括用于正确的转录起始的TATA盒或启动子元件，带有或者没有额外的TRE(即，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)，所述额外的TRE响应于发育和/或外部刺激以及反式作用调控蛋白或核酸调控可与之连接的基因的激活或抑制。启动子可以具有组成型活性，或者其可以以发育调控模式在一种或者多种组织或细胞类型中具有活性。启动子可以包含基因组片段或者其可以包含一种或者多种组合在一起的TRE的嵌合体。

在药学意义上，在本发明的上下文中，抗炎抗体、试剂或小分子抑制剂或它们的组合的“治疗有效量”是指有效地预防或治疗障碍的量，所述抗炎试剂或它们的组合对所述障碍的治疗是有效的。“障碍”或“疾病”是将受益于使用所述抗体、试剂或小分子抑制剂进行的治疗的任何炎性病症。

术语“炎性肠病”或者“IBD”是指导致肠道发生炎症的一类疾病，一般表现为包括腹部绞痛和疼痛、腹泻、体重损失和肠道出血等症状。IBD的主要形式是溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏症。

术语“溃疡性结肠炎”或“UC”是大肠和直肠的以出血性腹泻为特征的一种慢性阵发性炎性疾病。溃疡性结肠炎的特征是结肠粘膜的慢性炎症，并且可以根据位置分类如下：直肠炎只涉及直肠，“直肠乙状结肠炎”影响直肠和乙状结肠，“左侧结肠炎”包括大肠的整个左侧，“全结肠炎”使整个结肠发炎。

术语“克罗恩氏症”，也称为“局限性肠炎”，是可能影响胃肠道任何部分但是一般在回肠(小肠和大肠相遇的区域)的一种慢性自体免疫性疾病。克罗恩氏症与溃疡性结肠炎相反，其特征是贯穿肠壁的所有层延伸并且影响肠系膜以及局部淋巴结的慢性炎症。不管涉及的是小肠还是结肠，基本病理学过程是相同的。

溃疡性结肠炎和克罗恩氏症在超过90％的病例中在临床学、内窥镜学、病理学和血清学上是彼此不同的；其余被认为是不确定IBD。

术语“粘膜组织”是指发现其中有粘膜细胞的任何组织，这种组织诸如包括如胃肠道组织(例如胃、小肠、大肠、直肠)、泌尿生殖组织(例如阴道组织、阴茎组织、尿道)、鼻喉组织(例如鼻组织、喉组织)、嘴(口腔组织) 之类的组织，仅举几例。其他粘膜组织是已知的并且可以由本领域技术人员容易地加以鉴定。

本文使用的术语“抑制”是一个相对的术语，试剂抑制了反应或病症，如果所述反应或病症在施用所述试剂之后在数量上变小的话，或者如果在施用所述试剂之后所述反应或病症相对于参照试剂变小的话。类似地，术语“预防”不一定是指试剂完全消除了反应或病症，只要消除了所述反应或病症的至少一个特征即可。因此，降低或预防炎性反应的组合物能够消除但是不一定完全消除这种反应，只要所述反应可测量地变小，例如所述反应的减少为没有所述试剂的情况下的反应或者为与参照试剂的比较中的反应的至少约50％，如变小了至少约70％、或约80％、或甚至约90％(即，变小到10％以下)。

术语“增加的水平”是指高于在相关领域中一般限定的或者使用的正常或对照水平的水平。例如，组织中免疫染色的增加的水平是将被本领域技术人员认为高于对照组织中的免疫染色的水平的免疫染色的水平。

本文使用的术语“生物样品”是指生物来源的材料，所述材料可以是体液或身体产品例如血液、血浆、尿液、唾液、脑脊液、粪便(stool)、汗液或呼气。生物样品可包括组织样品、细胞样品或它们的组合。

范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个实施方式包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，使用先行词“约”表示数值为近似值时，应当理解的是，该特定值形成另一个实施方式。还应当理解的是，每个范围的端点不仅在与另一个端点的关系上是重要的，而且也独立于另一个端点。

还应当理解的是，本文公开有很多数值，并且每个数值在本文中除了数值本身之外，还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“约10”。还应当理解的是，当一个数值被公开为“小于或者等于”该数值时，也公开了“大于或者等于该数值”以及数值之间的可能范围，如本领域技术人员适当地理解的那样。例如，如果公开了数值“10”，也公开了“小于或者等于”10以及“大于或者等于10”。

使用抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3或CXCR5的表达或活性的抗炎试剂抑制炎症的方法

CXCL9、CXCL10和CXCL11趋化因子是CXCR3趋化因子受体的配体。CXCL13 趋化因子是CXCR5趋化因子受体的配体。这些趋化因子配体及其受体中的每一个在包括炎性肠病在内的各种炎性疾病中都局部上调并且发挥作用。另外，CXCL9、-CXCL10、CXCL11和CXCL13趋化因子在体内和体外都增强炎症。 CXCR3和CXCR3是G蛋白偶联受体(GPCR)的趋化因子受体家族的成员。CXCR3 与CXCL9、CXCL10和CXCL11的相互作用和/或CXCR5与CXCL13的相互作用激活炎症。

本申请的一个方面涉及使用试剂抑制炎症的方法，所述试剂抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11 CXCL13、CXCR3或CXCR5的表达或活性。“激活”包括例如转录、翻译、胞内易位、分泌、信号转导、通过激酶进行的磷酸化、通过蛋白酶进行的切割、与其他蛋白的嗜同性和嗜异性结合和泛素化等。

在一些实施方式中，用于治疗或预防受试者中的炎性疾病的方法包括向经诊断患有炎性疾病的受试者施用有效量的抗炎试剂，所述抗炎试剂：(1) 抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的表达，或(2) 抑制CXCR3与CXCL9、CXCL10和CXCL11中任一个之间的相互作用或者CXCR5 和CXCL13之间的相互作用，或(3)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、 CXCR3和/或CXCR5的生物活性。

在某些实施方式中，将治疗有效量的抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和/或抗-CXCR5抗体中的至少一种作为单独的抗炎试剂施用于需要的受试者。在其他一些实施方式中，将治疗有效量的抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和/或抗-CXCR5抗体中的至少一种作为主要抗炎试剂结合之前、同时或之后使用治疗有效量的次级抗炎试剂对需要的受试者进行的治疗而施用于该受试者。

抗炎试剂是能够减轻或预防炎症的生物试剂。例示性的抗炎试剂包括抗炎抗体、短干扰RNA(siRNA)、CXCL9结合试剂、CXCL10结合试剂、CXCL11 结合试剂、CXCL13结合试剂、CXCR5结合试剂和CXCR3结合试剂、反义寡核苷酸、核酶、三链形成寡核苷酸、外部引导序列、试剂编码表达载体和小分子抗炎化合物。

在一个优选的实施方式中，所述方法包括向经诊断患有炎性疾病的受试者施用治疗有效量的抗-CXCL9抗体、抗-CXCL10抗体、抗-CXCL11抗体、抗 -CXCR3抗体、抗-CXCL13抗体、抗-CXCR5抗体或它们的组合，使得炎症减轻。

例示性的炎性疾病或病症包括但不限于过敏性反应、脓毒性休克、骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性、哮喘、变态反应(例如药物、昆虫、植物、食物)、动脉粥样硬化、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病(diabetes mellitus)、青少年型糖尿病、移植物排斥反应、炎性肠病如克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎(enteritis)和间质性膀胱炎；多发性硬化症、重症肌无力(myasthemia gravis)、格雷夫氏症、桥本氏甲状腺炎、肺炎、前列腺炎、银屑病、肾炎、肺炎、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎鼻炎、脊柱关节病、硬皮病、系统性红斑狼疮和甲状腺炎。在一个优选的实施方式中，所述炎性疾病是选自由克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎和间质性膀胱炎(包括药物诱导的膀胱炎和自发性膀胱炎)组成的组中的炎性肠病。

在一些实施方式中，所述受试者被诊断为患有导致上升的CXCL9、 CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5表达的炎性疾病。在其他一些实施方式中，所述治疗方法进一步包括如下步骤：确定CXCL9、CXCL10、 CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR53表达的水平在来自所述受试者的组织中是否升高，并且如果升高的话，向所述受试者施用治疗有效量的抗炎试剂，所述抗炎试剂：(1)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5 的表达，或(2)抑制CXCR3与CXCL9、CXCL10或CXCL11中的任一个之间的相互作用或者CXCR5和CXCL13之间的相互作用，或(3)抑制CXCL9、CXCL10、 CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的生物活性。

在一些实施方式中，治疗有效量的抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和/或抗-CXCR5抗炎试剂增加一种或多种另外的治疗有效的试剂或小分子试剂在抑制炎症中的有效性。在一个更具体的实施方式中，治疗有效量的抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3 和/或抗-CXCR5抗炎试剂降低了抑制炎症所需的所述一种或多种另外的治疗有效试剂或小分子试剂的量。

在一个具体的实施方式中，使用抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗 -CXCL13、抗-CXCR5和/或抗-CXCR3抗炎试剂对受试者进行的治疗结合之前、同时或之后使用治疗有效量的抗趋化因子、细胞因子、它们的受体、或它们的衍生物(包括可溶性受体等)的至少一种次级试剂对所述受试者进行的治疗进行。

在一个实施方式中，用于增强抗炎疗法的效果的方法包括向正在接受或已经接受抗炎治疗的受试者施用有效量的抗炎试剂，所述抗炎试剂(1)抑制 CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的表达，或(2)抑制 CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5中的任一个之间的相互作用，或(3)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5 的生物活性，其中，所述试剂包含抗体、抗体片段、短干扰RNA(siRNA)、适体、合成抗体、结合试剂、肽、适体-siRNA嵌合体、单链反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸、核酶、外部引导序列、或试剂编码表达载体。

在一个具体的实施方式中，所述受试者正在接受抗炎治疗。在另一个实施方式中，所述受试者已经接受抗炎治疗，但是已经对抗炎试剂显示出抗炎药物耐性。

在一个优选的实施方式中，向所述受试者施用有效量的抗-CXCL9抗体、抗-CXCL10抗体、抗-CXCL11抗体、抗-CXCL13抗体、抗-CXCR3抗体、抗-CXCR5 抗体、或它们的组合。

抗炎试剂可以包括CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5 活性和/或表达的任何抑制剂。例示性的抗炎试剂包括抗体、短干扰 RNA(siRNA)、适体-siRNA嵌合体、单链反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸、核酶、外部引导序列、试剂编码表达载体以及它们的组合。

抗炎抗体

抗炎抗体可以是抗趋化因子抗体、抗趋化因子受体抗体、抗细胞因子抗体、抗细胞因子受体抗体、抗炎肽抗体或它们的组合(例如双特异性抗体)。

本申请的一种优选的抗炎抗体是这样的抗体，其结合至人类CXCL9、 CXCL10、CXCL11或CXCL13并且优选(部分地或全部地)阻断CXCL9、CXCL10、 CXCL11或CXCL13结合和/或激活CXCR3或CXCR5受体的能力。本发明的另一个优选的抗体是这样的抗体，其结合至人类CXCR3或CXCR5并且优选(部分地或全部地)阻断携带所述受体的细胞如上皮细胞、内皮细胞、淋巴样细胞结合至CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL13的能力和/或被CXCL9、CXCL10、CXCL11和/或CXCL13激活的能力。

在一个实施方式中，所述抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和/或抗-CXCR5抗体是单克隆抗体。在另一个实施方式中，所述抗 -CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和/或抗-CXCR5抗体是人源化抗体。在另一个实施方式中，所述抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗 -CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和/或抗-CXCR5抗体是抗体片段。在又一个实施方式中，所述抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3 和/或抗-CXCR5抗体是人源化抗体片段。

在其他一些实施方式中，所述抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗 -CXCL13、抗-CXCR3或抗-CXCR5抗体以如下kd值分别结合至CXCL9、CXCL10、 CXCL11、CXCL13、CXCR3或CXCR5：0.01pM至10μM、0.01pM至1μM、0.01 pM至100nM、0.01pM至10nM、0.01pM至1nM、0.1pM至10μM、0.1pM 至1μM、0.1pM至100nM、0.1pM至10nM、0.1pM至1nM、1pM至10μM、 1pM至1μM、1pM至100nM、1pM至10nM、1pM至1nM、10pM至10μM、 10pM至1μM、10pM至100nM、10pM至10nM、10pM至1nM、100pM 至10μM、100pM至1μM和100pM至100nM。在一些其他的实施方式中，所述抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3或抗-CXCR5 抗体以大于100nM的kd值结合至非目标蛋白。在某些实施方式中，所述抗 -CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3或抗-CXCR5抗体以 0.01pM至100nM或0.01pM至10nM的kd值分别结合至目标蛋白(即，CXCL9、 CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3或CXCR5)，并且以大于100nM的kd值结合至非目标蛋白。

抗炎抗体可以以适合于中和(neutralize)CXCL9、CXCL10、CXCL11、 CXCL13、CXCR3和/或CXCR5活性的任何形式施用。例示性的抗体或抗体衍生片段可以包括由如下物质组成的组中的任何成员：IgG、抗体可变区；分离的CDR区；单链Fv分子(scFv)，其包含VH和VL域，所述VH和VL域通过肽接头连接从而允许这两个域之间的联合以形成抗原结合位点；双特异性 scFv二聚体；微抗体(minibody)，其包含连接至CH3域的scFv；双抗体(dAb) 片段；单链dAb片段，其由VH活VL域组成；Fab片段，其由VL、VH、CL和 CH1域组成；Fab'片段，其不同于Fab片段之处在于在重链CH1域的羧基末端处增加有若干个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸； Fab'-SH片段，其是恒定域的半胱氨酸残基带有自由巯基的Fab'片段；F(ab')₂，其是包含两个连接的Fab片段的二价片段；Fd片段，其由VH和CH1 域组成；和它们的衍生物；以及保留抗原结合功能的任何其他抗体片段。Fv、 scFv或双抗体分子可以通过引入连接VH和VL域的二硫键桥来稳定化。当使用抗体衍生片段时，其中任何或所有的靶向域和/或Fc区可以使用对于本领域技术人员来说是已知的技术来“人源化”。在一些实施方式中，对抗炎抗体进行修饰以移除Fc区域。

在一些具体的实施方式中，抗-CXCR3抗体或其抗体片段偶联至或融合至第二抗体或抗体结合片段以增强其与携带有CXCR3受体的目标细胞的结合。

另外，抗炎试剂可以偶联至一种或者多种次级抗炎试剂如抗原小分子以提供另外水平的抗炎活性。

短干扰RNA(siRNA)

siRNA是一种双链RNA，其能够被改造成诱导与上述趋化因子、细胞因子或其受体中的任一个相对应的mRNA的序列特异性的转录后基因沉默。

siRNA利用RNA干扰(RNAi)的机理来实现使被靶向的趋化因子、细胞因子或受体的基因的基因表达“沉默”的目的。“沉默”最初在将双链 RNA(dsRNA)转染到细胞中的情况下观察到。在进入其中之后，发现dsRNA被 RNase III样的酶Dicer切割成长度为21至23个核苷酸并且在它们的3'端含有两个核苷酸突出序列的双链小干扰RNA(siRNA)。在ATP依赖步骤中， siRNA结合成多亚基RNAi诱导沉默复合物(RISC)，该复合物提供用于互补 mRNA序列的AGO2介导切割的信号，这然后导致其随后被细胞外切酶降解。

在一个实施方式中，所述抗炎试剂包含合成的siRNA。合成产生的siRNA 在结构上模拟在细胞中一般由酶Dicer加工的siRNA类型。合成产生的siRNA 可以将已知增强siRNA稳定性和功能性的任何化学修饰引入到RNA结构中。例如，在一些情况中，siRNA可以合成为锁核酸(LNA)修饰siRNA。LNA是含有连接核糖的2’-氧和4’碳的亚甲基桥的核酸类似物。双环结构锁定LNA 分子的3’-内构象的呋喃糖环，由此在结构上模拟标准的RNA单体。

在其他一些实施方式中，抗炎试剂可以包含被改造成转录小双链发卡样 RNA(shRNA)的表达载体，所述小双链发卡样RNA在细胞内被加工为被靶向的 siRNA。所述shRNA可以使用试剂盒如Ambion’s

siRNA构建试剂盒、Imgenex’s GENESUPPRESSOR^TM构建试剂盒、和Invitrogen’s BLOCK-IT^TM可诱导RNAi质粒和慢病毒载体克隆到适当的表达载体中。

合成的siRNA和shRNA可以使用已知的算法设计并且使用常规的 DNA/RNA合成仪合成。各种不同的趋化因子、细胞因子和受体靶向的siRNA 可以从Origen(Rockville,MD)商购获得。

CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、CXCL13-、CXCR3-和CXCR5结合试剂

在一些实施方式中，抗炎试剂是CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、CXCL13-、 CXCR3-或CXCR5结合试剂。所述结合试剂可以包含能够特异性地直接结合或间接结合CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3或CXCR5以抑制CXCR3 和CXCL9、CXCL10或CXCL11之间的相互作用和/或激活或者CXCR5和CXCL13 之间的相互作用和/或激活，或者抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3 和/或CXCR5的生物活性(这与减轻或预防炎性反应相关联)的任何非抗体蛋白、肽或合成结合分子，如适体或合成抗体。

所述CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5结合试剂可以采用用于生成高亲和性结合配体的任何常规方法包括SELEX、噬菌体展示和其他方法(包括本领域技术人员已知的组合化学和/或高通量方法)来产生。

适体是核酸形式的抗体，其包含能够形成特定的三维结构的一类寡核苷酸，所述三维结构对广泛的各种细胞表面分子、蛋白和/或大分子结构显示出高亲和力结合。适体一般通过选择方法来体外鉴定，有时称为配体的指数富集系统进化(Systematic Evolutionof Ligands by EXponential enrichment)或“SELEX”。SELEX一般从非常大的随机多核苷酸池开始，所述随机多核苷酸池一般缩减至每分子靶标一个适体配体。通常，适体是长度为15至50个碱基的小核酸分子，其折叠成规定的二级和三级结构，例如茎 -环或G四分体。

适体可以通过化学方式连接或偶联至上述核酸抑制剂以形成被靶向的核酸抑制剂，例如适体-siRNA嵌合体。适体-siRNA嵌合体含有连接至siRNA 的适体形式的靶向部分。当使用适体-siRNA嵌合体时，优选使用细胞内在化适体。当结合至特异性细胞表面分子后，适体能够促进到细胞内的所述核酸抑制剂发挥作用的位置的内在化。在一个实施方式中，所述适体和所述siRNA 都包含RNA。所述适体和所述siRNA可以包含任何的核苷酸修饰，如本文进一步描述的那样。优选的是，所述适体包含特异性地旨在结合表达趋化因子、细胞因子和/或受体目标基因的细胞如淋巴样细胞、上皮细胞和/或内皮细胞的靶向部分。

合成抗体是从由一系列针对结合感兴趣的目标蛋白进行筛查的随机肽组成的文库中产生的合成抗体。合成抗体在US 2011/0143953和Diehnelt 等,PLoS One,5(5)：e10728(2010)中有描述。

包括适体和合成抗体在内的CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、CXCL13-、 CXCR3-、CXCR5结合试剂能够被改造成以10^-10至10^-12M的Kd非常紧密地结合目标分子。在一些实施方式中，CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、CXCL13-、 CXCR3-或CXCR5结合试剂以小于10^-6、小于10^-8、小于10^-9、小于10^-10、或小于10^-12M的Kd结合目标分子。

反义寡核苷酸

在另一个实施方式中，抗炎抑制试剂可以包含能够抑制CXCL9、CXCL10、 CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的表达的反义寡核苷酸或多核苷酸。所述反义寡核苷酸或多核苷酸可以包含DNA骨架、RNA骨架或其化学衍生物。在一个实施方式中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸包含为降解而靶向的单链反义寡核苷酸或多核苷酸。在一些优选的实施方式中，所述抗炎抑制试剂包含与CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCR3或CXCR5 mRNA序列互补的单链反义寡核苷酸。所述单链反义寡核苷酸或多核苷酸可以通过合成产生或者可以从适当的表达载体表达。所述反义核酸被设计成通过互补地结合至mRNA 有义链来进行结合以促进RNase H活性，这将导致mRNA的降解。优选的是，对所述反义寡核苷酸进行化学或结构修饰以促进核酶稳定性和/或升高的结合。

在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸被修饰成产生带有非常规的化学或骨架增加或取代的寡核苷酸，包括但不限于肽核酸(PAN)、锁核酸(LNA)、吗啉骨架核酸、甲基磷酸酯、双重稳定茋或芘基帽、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和磷酸三酯等。举例来说，修饰的寡核苷酸可以引入如下物质或者或使用如下物质取代一种或者多种天然存在的核苷酸；类似物；引入例如没有电荷的连接部分(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或有电荷的连接部分(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核苷酸间 (internucleotide)修饰；引入嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)或烷基化剂和/或修饰的连接部分 (例如α芳香核酸等)的修饰。

在一些实施方式中，单链寡核苷酸被内部修饰成在其骨架中包括至少一个中性电荷。例如，所述寡核苷酸可以包括与目标特异性序列互补的甲基磷酸酯骨架或肽核酸(PNA)。这些修饰已经被发现预防或减少解旋酶介导的解旋。使用没有电荷的探针可以通过减轻经典杂交中负电荷核酸链的排斥来进一步增加与样品中的多核苷酸靶标的杂交速度。

PNA寡核苷酸是没有电荷的核酸类似物，其磷酸三酯骨架已经被多酰胺代替，这使得PNA是具有由酰胺连接部分结合在一起的2-氨基乙基甘氨酸单元的聚合物。PNA使用与标准肽合成相同的Boc或Fmoc化学方法合成。碱基 (腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)由亚甲基羧基连接部分连接到骨架上。因此，PNA是非环的、非手性的和中性的。PNA的其他性能是增加的特异性和熔融温度(与核酸相比)、能够形成三螺旋的能力、在酸性pH中的稳定性、没有被细胞酶如核酶、聚合酶等识别的性能。

含有甲基磷酸酯的寡核苷酸是含有取代非结合磷酰基氧之一的甲基的中性DNA类似物。带有甲基磷酸酯连接部分的寡核苷酸首先被报道通过反义翻译阻断来抑制蛋白的合成。

在一些实施方式中，寡核苷酸中的磷酸酯骨架可以含有硫代磷酸酯连接部分或氨基磷酸酯。这种寡核苷酸连接部分的组合也处在本发明的范围内。

在其他一些实施方式中，所述寡核苷酸可以含有通过磷酸二酯核苷酸间连接部分结合的修饰糖的骨架。修饰的糖可以包括呋喃糖类似物，包括但不限于2-脱氧核糖呋喃苷、α-D-阿拉伯糖呋喃苷(arabinofuranoside)、α-2'-脱氧核糖呋喃苷和2',3'-二脱氧-3'-氨基核糖呋喃苷。在一些替代的实施方式中，2-脱氧-β-D-呋喃核糖基可以被其他的糖例如β-D-呋喃核糖所代替。另外，可以存在β-D-呋喃核糖，其中核糖部分的2-OH被C1-6烷基所烷基化(2-(O--C1-6烷基)核糖)或被C2-6链烯基所烷基化(2-(O--C2-6 链烯基)核糖)，或者被氟基取代(2-氟核糖)。

形成寡聚体的有关糖包括如上所述在锁核酸(LNA)中使用的那些糖。例示性的LNA寡核苷酸包括带有2'-O-4'-C亚甲基桥的修饰双环单体单元，如在美国专利No.6,268,490中描述的那些，在此通过参引方式将该专利的公开内容引入本文。

化学修饰的寡核苷酸还可以包括单独的或任何组合的2'-位糖修饰、5- 位嘧啶修饰(例如5-(N-苄基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷、5-(N-异丁基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷、5-(N-[2-(1H-吲哚-3基)乙基]羧酰胺)-2'-脱氧尿苷、 5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]羧酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟基丙基)]羧酰胺)-2'-脱氧尿苷)、 8-位嘌呤修饰、在环外胺的修饰、4-硫尿苷的取代、5-溴-或5-碘-尿嘧啶的取代、甲基化、不常见碱基配对组合，如异碱基异胞苷和异鸟苷等。

核酶

核酶是能够催化分子内或分子间化学反应的核酸分子。因此核酶是具有催化性的核酸。优选的是，核酶催化分子间反应。催化基于在天然系统中发现的核酶如锤头状核酶、发卡状核酶和四膜虫核酶的核酸酶或核酸聚合酶类反应的核酶有很多不同的类型。还有很多在天然系统中没有发现但是已经被重新改造成催化特定的反应的核酶。优选的核酶切割RNA或DNA底物，更优选的是切割RNA底物如CXCL9、CXCL10、CXCL11,CXCL13、CXCR3或CXCR5mRNA。核酶通常通过识别并结合目标底物然后进行切割来切割核酸底物。这种识别一般大部分都基于经典的或非经典的碱基对的相互作用。这种性能使得核酶是核酸的目标特异性切割的特别好的候选物，因为目标底物的识别是基于目标底物序列。

三链形成寡核苷酸(TOF)

三链形成寡核苷酸(TFO)是能够与双链和/或单链核酸包括CXCL9、 CXCL10、CXCL11,CXCL13、CXCR3或CXCR5基因组DNA区或它们的对应mRNA 相互作用的分子。当TFO与目标区域相互作用时，形成称为三链(triplex) 的结构，其中有依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对而形成复合物的三链DNA。TFO能够以高的亲和力和特异性结合目标区域。在一些优选的实施方式中，所述三链形成寡核苷酸以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的Kd结合目标分子。用于本发明的例示性的TFO包括PNA、LNA和LNA修饰PNA如 Zorro-LNA。

外部引导序列(EGS)

外部引导序列(EGS)是结合目标核酸分子从而形成复合物的分子，并且这种复合物被切割目标分子的RNase P所识别。EGS可以被设计成特异性地靶向所选择的mRNA分子。RNAse P帮助在细胞内加工转运RNA(tRNA)。细菌 RNAse P可以被募集而通过使用导致目标RNA：EGS复合物以模拟天然rRNA 底物的EGS来切割几乎是任何的RNA序列。类似地，真核生物EGS/RNAse P 定向切割RNA可以被用来切割真核生物细胞内所希望的标靶。

试剂编码表达载体

在一个实施方式中，用于治疗或预防受试者中的炎性疾病的方法包括向经诊断患有炎性疾病的受试者施用有效量的表达抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13试剂、抗-CXCR3试剂和/或抗-CXCR5试剂的表达载体。在一个具体的实施方式中，所述方法包括向经诊断患有炎性疾病的受试者施用有效量的表达抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3 和/或抗-CXCR5抗体的表达载体。在另一个实施方式中，所述方法包括向经诊断患有炎性疾病的受试者施用有效量的表达抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗 -CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和/或抗-CXCR5 siRNA的表达载体。所述表达载体可以是能够递送并表达编码抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗 -CXCL13、抗-CXCR5和/或抗-CXCR3试剂，包括抗体、siRNA、反义寡核苷酸和多核苷酸等的任何表达载体。

本文使用的术语“表达载体”包括能够指导核酸表达的任何核酸。表达载体可以使用两个主要的递送方案来递送到细胞：使用病毒载体的基于病毒的递送系统和使用例如质粒载体的基于非病毒的递送系统。这种方法在本领域中是已知的并且容易适用于供本文描述的组合物和方法使用。在某些情况中，这些方法可以被用来通过使用载体固有的或被改造到载体中的靶向特征来靶向某些疾病和细胞群体。

递送至细胞的核酸含有一种或者多种转录调控元件，包括启动子和/或增强子，用于指导siRNA的表达。启动子包含用于从对于转录起始位点相对固定的位置启动转录的DNA序列。启动子含有RNA聚合酶和转录因子之间的基本相互作用所需的TRE元件，并且可以结合其他上游元件和应答元件进行操作。优选的启动子是能够指导感兴趣的目标细胞中的表达的那些启动子。所述启动子可以包括组成型启动子(例如HCMV、SV40、伸长因子-1α(EF-1α)) 或在感兴趣的特定细胞类型中显示出优先表达的那些启动子。增强子通常是指远离转录起始位点发挥作用并且可以是转录单元的5’或3’的DNA序列。而且，增强子可以位于内含子内以及编码序列内。它们一般具有10至300bp 的长度，并且它们顺式发挥作用。增强子发挥增加和/或调控附近启动子的转录的作用。

所述启动子和/或增强子可以被光或特异性化学诱导试剂特异性地激活。在一些实施方式中，可以使用通过施用例如四环素或地塞米松来调控的可诱导表达系统。在其他一些实施方式中，可以通过暴露于辐射包括伽马辐射和外部光束放射性治疗(externalbeam radiotherapy，EBRT)或烷基化化学治疗药物来增强基因表达。

可以将细胞或组织特异性转录调控元件(TRE)引入到表达载体中以允许对所希望的细胞类型进行转录靶向表达。表达载体一般含有用于转录终止的序列，并且可以额外地含有积极影响mRNA稳定性的一种或者多种元件。表达载体可以进一步包括位于邻近蛋白编码区之间的内部核糖体进入位点 (internal ribosome entry site，ERES)以便于在被感染或转染的细胞中从共同的mRNA表达两个或更多个蛋白。另外，所述表达载体可以进一步包括编码标记物产物的核酸序列。这种标记物产物可以被用来确定基因是否已经被递送到细胞并且是否正在被表达。优选的标记物基因是大肠杆菌LacZ基因，该基因编码β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白(GFP)。

基于病毒的表达载体。在一些实施方式中，所述抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和/或抗-CXCR5-抗体或siRNA编码序列(或 shRNA)从病毒衍生的表达载体递送。例示性的病毒表达载体可以包括或者衍生自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、 HIV病毒、慢病毒、逆转录病毒、辛德毕斯病毒和其他RNA病毒等。优选的是共同具有这些病毒的特性使得它们适合于用作载体的任何病毒家族。逆转录病毒包括小鼠Moloney白血病病毒(MMLV)、HIV病毒和其他慢病毒载体。腺病毒载体是相对稳定的，并且容易操作，具有高的效价，并且可以以气雾剂制剂递送，而且可以转染非分裂细胞。痘病毒载体是大型的并且具有若干个用于插入基因的位点，它们是热稳定的，并且可以在室温下保存。病毒递送系统通常利用已经去除了一种或多种基因并且带有外源基因和/或基因/ 启动子盒被插入到病毒基因组中以代替所去除了的病毒DNA的病毒载体。被去除基因的必要功能可以由已经被改造成反式表达早期基因的基因产物的细胞系来提供。

非病毒表达载体。在其他一些实施方式中，使用非病毒递送系统通过利用脂质制剂来递送质粒载体或其他具有生物活性的非核酸试剂，所述脂质制剂包含例如脂质体如阳离子型脂质体(例如DOTMA、DOPE、DC-胆固醇)和阴离子型脂质体。如果需要的话，脂质体可以进一步被偶联到一种或者多种蛋白或肽以便于靶向特定的细胞。包含化合物和阳离子型脂质体的组合物可以被施用至传入到目标器官的血液或可以被吸入到呼吸道以靶向呼吸道的细胞。而且，抗炎试剂可以作为微胶囊或纳米颗粒的组分施用，所述微胶囊或纳米颗粒能够使用本文描述的靶向部分而被靶向到感兴趣的细胞类型或能够被设计成按照预定的释放或给药速率缓慢释放一种或者多种抗炎试剂。

在其他一些实施方式中，核酸可以通过电穿孔进行体内递送，电穿孔的技术可以从Genetronics,Inc.(San Diego,CA)获得以及可以利用 SONOPORATION机(ImaRxPharmaceutical Corp.,Tucson,AZ)。

核酸可以为溶液或悬浮液(例如引入到微颗粒、脂质体或细胞中)。这些可以通过抗体、受体或受体配体而被靶向到特定的细胞类型。媒介物如“鞘液(stealth)”和其他抗体偶联脂质体(包括靶向感兴趣的细胞的脂质介导药物)、通过细胞特异性配体介导靶向DNA的受体、或靶向例如淋巴样细胞、上皮细胞或内皮细胞的病毒载体。一般来说，受体参与胞吞作用途径，不管是组成型的还是配体诱导的。这些受体聚集在网格蛋白包被的凹陷(pit)中，通过网格蛋白包被的囊泡进入细胞，穿过酸化的其中保存有受体的内涵体中，然后循环到细胞表面而胞内保存，或者在溶酶体中降解。内在化途径具有多种不同的作用，例如营养物摄入、被激活的蛋白的去除、大分子的清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的脱离和降解以及受体水平调控。很多受体都遵循不止一个的胞内途径，这取决于细胞的类型、受体的浓度、配体的类型、配体配价和配体浓度。

次级抗炎试剂

在一些实施方式中，将治疗有效量的至少一种抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11和/或抗-CXCR3抗体结合次级抗炎试剂施用于需要的受试者。所述次级抗炎试剂可以在施用所述一种或多种抗体之前、同时或之后给予。优选的是，所述次级抗炎试剂抗趋化因子、细胞因子、它们的受体或它们的组合。

所述次级抗炎试剂可以包含抗炎抗体、小干扰RNA(siRNA)、趋化因子和趋化因子受体结合试剂、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸、核酶、外部引导序列、试剂编码表达载体或抗炎小分子化合物。在一些实施方式中，所述次级抗炎试剂包含抗CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5 上的决定簇的另外抗炎抗体。在其他一些实施方式中，所述次级抗炎试剂包含抗次级趋化因子、细胞因子或它们的受体的抗体或试剂。

在一些实施方式中，所述次级抗炎试剂是抗趋化因子、细胞因子或它们的受体的抗炎试剂。分别来自于NIH-NCBI GenBank的根据本发明被靶向的例示性的趋化因子或趋化因子受体包括蛋白和cDNA序列描述在表1中。

表1

在一些实施方式中，所述次级抗炎试剂特异性地结合至细胞因子或细胞因子受体。例示性的细胞因子或细胞因子受体靶标和/或它们的具有反应性的抑制性产物包括但不限于干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ；肿瘤坏死因子(TNF)-α例如(英夫利昔单抗(infliximab，

)，阿达木单抗 (adalimumab，

)，D2E7(BASF Pharma)和

(Celltech))；可溶性形式的TNF受体(依那西普(etanercept，

)；CD20，包括利妥昔单抗(rituximab，

)，人源化2H7，2F2(Hu-Max-CD20)，人类CD20抗体(Genmab)和人源化A20抗体(Immunomedics)；TNF-β；白介素-2(IL-2)，包括达利珠单抗(daclizumab)；IL-2受体，白介素-4(IL-4)和IL-4受体；白介素-6(IL-6)和IL-6受体；白介素-1(IL-1)受体，包括IL-1受体试剂，如阿那白滞素(anakinra，

)；LFA-1，包括抗-CD11a、抗-CD18抗体和含有LFA-3结合域的可溶性肽；抗-L3T4抗体；白介素-1β(IL-1β)；白介素-8(IL-8)；干扰素-γ(IFN-γ)；血管内皮生长因子(VEGF)；白血病抑制因子(LIF)；单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)；RANTES；白介素-10(IL-10)；白介素-12(IL-12)；基质金属蛋白酶2(MMP2)；IP-10；巨噬细胞炎症蛋白 1α(MIP1α)；巨噬细胞炎症蛋白1β(MIP1β)；pan-T，包括抗-CD3或抗 -CD4/CD4a抗体；BAFF(zTNF4,BLyS)和BAFF受体，BR3；用于MHC抗原和 MHC片段的抗个体基因型抗体(anti-idiotypic antibody)；CD40受体和抗 -CD40配体(CD154)；CTLA4-Ig；T-细胞受体抗体如T10B9；异源性抗-淋巴细胞球蛋白；链激酶；转化生长因子-β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA 或DNA；苯丁酸氮芥；脱氧精胍菌素；T-细胞受体；和T-细胞受体片段。

抗炎小分子化合物。能够用作次级抗炎试剂的例示性的小分子抗炎试剂包括但不限于从如下物质组成的组中选择的小分子化合物或药物：镇痛药如阿司匹林或

(对乙酰氨基酚(Acetaminophen))；2-氨基-6-芳基-5- 取代嘧啶；非甾类抗炎药物(NSAID)如阿西美辛、瓜氨托美丁、阿扎丙宗(azapropazone)、贝诺酯、苯恶洛芬(benoxaprofen)、盐酸苄达明、溴芬诺 (bromfenal)、丁苯羟酸、异丁苯丁酸(butibufen)、卡洛芬、塞来昔布、水杨酸胆碱、双氯芬酸安乃静(diclofenac dipyone)、屈恶昔康(droxicam)、依托度酸、依托芬那酯、依托考昔、联苯乙酸、芬替酸、氟喹氨苯酯、布洛芬、吲哚布洛芬、伊索昔康、氯诺昔康、氯索洛芬、李克飞龙(licoferone)、非普地醇(fepradinol)、水杨酸镁、甲氯芬那酸、美洛昔康、莫尼氟酯、尼氟灭酸、尼美舒利、奥沙普秦(oxaprozen)、普酮洛芬、三唑拉克(priazolac)、吡咯布洛芬、异丙安替比林、普罗喹宗、罗非昔布、萨拉拉克(salalate)水杨酸钠、硫代水杨酸钠、舒洛芬、替尼达普、噻洛芬酸、水杨酸三乙醇胺、佐美酸、阿氯芬酸(aclofenac)、阿洛普令(aloxiprin)、萘普生、阿普辛 (aproxen)、阿司匹林、二氟尼柳、非诺洛芬、吲哚美辛、甲芬那酸、吡罗昔康、苯基丁氮酮、水杨酰胺、水杨酸、苏灵大、替斯氧苏林酸 (desoxysulindac)、替诺昔康、曲马多、酮洛酸、氯尼辛、芬布芬、苄达明盐酸盐、甲氯芬那酸、氟芬那酸、或托美丁；更昔洛韦；糖皮质激素如皮质醇和醛固酮；抗炎试剂如环氧合酶抑制剂；5-脂肪氧合酶抑制剂；白三烯受体试剂；嘌呤试剂如硫唑嘌呤和霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷基化试剂如环磷酰胺；溴麦角隐亭(bromocryptine)；达那唑；氨苯砜；戊二醛；环孢霉素；6巯基嘌呤；皮质类固醇，包括口服糖皮质激素或糖皮质激素类似物，例如泼尼松；甲基强的松龙，包括

和甲基强的松龙琥珀酸钠、去炎松、和倍他米松、地塞米松；氨基水杨酸盐；硫唑嘌呤、钙调磷酸酶抑制剂如环孢霉素、他克莫司(FK-506)和西罗莫司(雷帕霉素)； RS-61443(霉酚酸酯)；二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨蝶呤(口服或皮下)；抗疟疾试剂如氯喹和羟基氯喹；柳氮磺胺吡啶；来氟米特(leflunomide)；柳氮磺胺吡啶(AZULFIDINE)；羟基氯喹(PLAQUENIL)；米托蒽醌

Immunex公司)、干扰素β-1a(

Ares-Sorono Group)、干扰素β-1b(

BerlexLaboratories,Inc.)；醋酸格拉替雷 (

TevaPharmaceuticals)；抗生素如

(甲硝哒唑)或

(环丙沙星(Ciprofloxacin))；以及它们的组合和衍生物。

在一些实施方式中，所述初级抗炎试剂和次级抗炎试剂抗相同的趋化因子/趋化因子受体。在其他一些实施方式中，所述初级抗压缩机和所述次级抗炎试剂抗不同的趋化因子/趋化因子受体。表2描述了炎性疾病和某些趋化因子和趋化因子受体之间的关联。

表2

抗炎试剂的施用

可以使用已知的方法如静脉内施用而将所述抗炎试剂施用于所述受试者，例如作为大药丸(bolus)或者通过在一段时间内连续输注而施用，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用。在某些实施方式中，所述抗炎试剂可以直接施用于发炎组织。例如，在炎性肠病的情况中，可以使粘膜组织与所述抗炎试剂直接接触。对于皮肤炎性疾病例如银屑病，可以使皮肤组织与霜剂、洗剂或膏剂的所述抗炎试剂直接接触。对于哮喘，可以通过液体或粉末吸入剂的吸入使肺组织例如支气管肺泡组织接触。所述抗炎试剂还可以放在固体支持物上例如海绵或纱布以用于抗目标趋化因子而施用于受影响的组织。

本申请的所述抗炎试剂可以在一般药学可接受的载体中施用。可接受的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水和在盐水中的葡萄糖。固体支持物、脂质体、纳米颗粒、微颗粒、纳米球或微球也可以被用作用于施用抗炎试剂的载体。

适当的剂量(“治疗有效量”)的抗炎试剂将依赖于例如待治疗的病症、病症的严重程度和病程、施用的方式、抗体或试剂的施用用于预防目的还是用于治疗目的、特定试剂的生物利用度、先前的治疗、患者的年龄和体重、患者的临床史和对抗体的反应、使用的抗炎试剂的类型、主治医生的判断等。所述抗炎试剂适合一次或在一系列治疗过程中施用于患者，并且可以在诊断开始的任何时间施用于患者。所述抗炎试剂可以作为单独的治疗施用，或者结合可用于治疗正在讨论的病症的其他药物或治疗施用。

作为一般的提议，所施用的所述抗炎试剂(例如抗体和/或抗炎小分子化合物)的治疗有效量将为约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，不管是一次施用还是多次施用。在一些具体的实施方式中，每种抗炎试剂的施用范围为：约1ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约1ng/kg 体重/天至约10μg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/ 天、约1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约 10ng/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约10ng/kg 体重/天至约10mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约10 μg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/ 天、约100ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约1μg/kg 体重/天、约1μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/ 天至约10mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1 μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约10μg/kg 体重/天、约10μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天至约100mg/kg 体重/天、约1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。

在其他一些实施方式中，所述抗炎试剂(例如抗体和/或抗炎小分子化合物)以每三天500μg至20g的剂量施用，或者以每三天25mg/kg体重的剂量施用。

在其他一些实施方式中，每种抗炎试剂以约10ng至约100ng/单次施用、约10ng至约1μg/单次施用、约10ng至约10μg/单次施用、约10 ng至约100μg/单次施用、约10ng至约1mg/单次施用、约10ng至约 10mg/单次施用、约10ng至约100mg/单次施用、约10ng至约1000mg/ 注射、约10ng至约10,000mg/单次施用、约100ng至约1μg/单次施用、约100ng至约10μg/单次施用、约100ng至约100μg/单次施用、约100 ng至约1mg/单次施用、约100ng至约10mg/单次施用、约100ng至约 100mg/单次施用、约100ng至约1000mg/注射、约100ng至约10,000mg/ 单次施用、约1μg至约10μg/单次施用、约1μg至约100μg/单次施用、约1μg至约1mg/单次施用、约1μg至约10mg/单次施用、约1μg 至约100mg/单次施用、约1μg至约1000mg/注射、约1μg至约10,000 mg/单次施用、约10μg至约100μg/单次施用、约10μg至约1mg/单次施用、约10μg至约10mg/单次施用、约10μg至约100mg/单次施用、约10μg至约1000mg/注射、约10μg至约10,000mg/单次施用、约100 μg至约1mg/单次施用、约100μg至约10mg/单次施用、约100μg至约100mg/单次施用、约100μg至约1000mg/注射、约100μg至约10,000 mg/单次施用、约1mg至约10mg/单次施用、约1mg至约100mg/单次施用、约1mg至约1000mg/注射、约1mg至约10,000mg/单次施用、约10mg 至约100mg/单次施用、约10mg至约1000mg/注射、约10mg至约10,000 mg/单次施用、约100mg至约1000mg/注射、约100mg至约10,000mg/单次施用和约1000mg至约10,000mg/单次施用。包含在PBM纳米颗粒中的化学治疗试剂可以每天施用，或者每2、3、4、5、6和7天施用，或者每1、2、 3或4周施用。

在其他一些具体的实施方式中，所述抗炎试剂的量以如下剂量施用：约0.0006mg/天、0.001mg/天、0.003mg/天、0.006mg/天、0.01mg/天、 0.03mg/天、0.06mg/天、0.1mg/天、0.3mg/天、0.6mg/天、1mg/天、 3mg/天、6mg/天、10mg/天、30mg/天、60mg/天、100mg/天、300mg/ 天、600mg/天、1000mg/天、2000mg/天、5000mg/天或10,000mg/天。如所预期的那样，所述剂量将取决于病症、患者的大小、年龄和状态。

剂量可以在能够部分地模拟慢性溃疡性结肠炎的若干种动物模型中进行测试。使用最广泛的模型是2,4,6-三硝基苯磺酸 (2,4,6-trinitrobenesulfonic acid)/乙醇(TNBS)诱导的结肠炎模型，该模型诱导结肠中的慢性炎症和溃疡。当TNBS通过结肠内滴注法(installation) 被导入到易感小鼠的结肠中时，其诱导结肠粘膜中的T细胞介导的免疫反应，在这种情况中导致大规模的粘膜炎症，该炎症的特征是T细胞和巨噬细胞在大肠的整个肠壁中的密集浸润。而且，这种组织学表现伴随有渐进性体重损失(消耗)、出血性腹泻、直肠脱垂和大肠壁增厚的临床表现。

另一种结肠炎模型使用葡聚糖硫酸钠(DSS)，其诱导显现为出血性腹泻、体重损失、结肠缩短和粘膜溃疡(带有嗜中性粒细胞浸润)的急性结肠炎。DSS 诱导的结肠炎的组织学特征是炎性细胞浸润到固有层(lamina propria)，并伴随淋巴增生、病灶性隐窝损伤和上皮溃疡。这些变化被认为是因为DSS对上皮的毒性作用以及固有层细胞的胞吞作用和TNF-α和IFN-γ的产生而发展。尽管其具有相同的用途，但是关于DSS与人类疾病的相关性的机理的若干问题仍未解决。DSS被认为是T细胞模型是因为其在诸如SCID小鼠等T细胞缺陷动物中观察到。

本申请的所述抗炎试剂的施用可以在用于改善胃肠道疾病的TNBS或DSS 模型中进行评价。CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5据信在炎性肠病(包括结肠炎)的炎症反应中发挥作用，并且通过施用本申请的所述抗炎试剂来中和CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5活性能够为包括IBD在内的胃肠道炎性疾病提供潜在的治疗方法。

如表2中所示，引起炎性疾病的具体趋化因子随疾病的不同而不同。它们在个体之间也存在差异。因此，当治疗个体时，鉴定患者组织中增加的具体趋化因子是明智的。通过使患者组织样品暴露于抗每一种趋化因子的具体抗体并且评价抗体/趋化因子结合的量，可以评价每一种趋化因子的表达水平，从而能够针对给定的炎性疾病确定施用抗体的适当类型和量。

所述抗体可以酌情或按指示作为大药丸或通过连续输注而以单剂量施用，或者采用大药丸或通过连续输注而以多剂量施用。多剂量可以例如每天多次施用、每天一次、每2、3、4、5、6或7天、每周、每2、3、4、5或6 周或每月施用。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术容易地监测这种治疗的过程。

用于治疗或预防炎性疾病的组合物和试剂盒

本申请的另一个方面涉及用于治疗或预防炎性疾病的组合物和试剂盒。在一个实施方式中，所述组合物包含抗炎试剂和药学可接受的载体，所述抗炎试剂能够(1)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR5和/或CXCR3 的表达，或(2)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR5和/或CXCR3 中的任一个之间的相互作用，或(3)抑制CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、 CXCR5和/或CXCR3的生物活性，其中，所述试剂是抗体、抗体片段、短干扰RNA(siRNA)、适体、合成抗体、结合试剂、肽、适体-siRNA嵌合体、单链反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸、核酶、外部引导序列或试剂编码表达载体。

本发明的所述组合物可以包含单种类型的抗CXCL9、CXCL10、CXCL11、 CXCL13、CXCR5和CXCR3中的任一个的抗体，或者两种或多种抗相同趋化因子或趋化因子受体、不同的趋化因子或趋化因子受体、或它们的如上所述的组合的抗体。所述组合物还可以含有治疗有效量的如上所述的其他抗炎试剂。

本文使用的术语“药学可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何的和所有的溶剂、增溶剂、填充剂、稳定剂、粘合剂、吸附剂、基料、缓冲试剂、润滑剂、控释媒介物、稀释剂、乳化试剂、润湿剂、润滑剂、分散介质、包覆物(coating)、抗细菌试剂或抗真菌试剂、等渗和吸收延迟试剂等。这样的介质和试剂用于药学活性物质的用途在本领域中是已知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的情况之外，它们在组合物中的用途都是考虑的。还可以将补充试剂引入到所述组合物中。在某些实施方式中，药学可接受的载体包含血清白蛋白。

本发明的药物组合物被配制成与其预期使用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外例如鞘内、动脉内、静脉内、真皮内、皮下、口服、透皮(局部) 和透粘膜施用。

在肠胃外、真皮内或皮下应用中使用的溶液或悬浮液包括如下组分：注射用水等无菌稀释剂、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌试剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如醋酸盐、柠檬酸或磷酸盐和用于调节渗透压的试剂如氯化钠或右旋糖。可以使用酸或碱来调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装安瓿、一次性注射器或多剂量或由玻璃或塑料制得的多剂量瓶中。

适合用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(在水可溶的情况下) 或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适当的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany, NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有的情况中，可注射组合物应当是无菌的并且应当具有容易从注射器排出的程度的流动性。其在制造和保存条件下必须是稳定的，并且必须进行抗微生物如细菌和真菌的污染作用的保护。所述载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如乙二醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)和它们的适当的混合物。通过使用诸如卵磷脂等包覆物、在分散的情况下保持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。预防微生物的作用可以通过各种抗细菌试剂和抗真菌试剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞等来实现。在很多情况中，优选将等渗试剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠包括在所述组合物中。可以通过在所述组合物中包括延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。

可以通过以需要的量将活性化合物(例如神经调节蛋白)并且根据需要和如上所列举的一种组分或多种组分的组合一起加入到适当的溶剂中然后过滤除菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散液通过将活性化合物加入到包含基本分散介质和所需要的来自上文所列举的那些物质的其他组分的无菌媒介物中来制备。对于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冻干法，所述方法获得活性组分加上来自其之前无菌过滤溶液的任何额外的需要组分的粉末。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。它们被包封在明胶胶囊中或者被压成片剂。对于口服治疗施用的目的，可以将活性化合物和赋形剂一起加入并且以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可以使用作为漱口液使用的流体载体来制备，其中流体载体中的化合物口服使用并且地甩掉(swish)和吐出或咽下。药学相容性粘合试剂和/或辅料可以被包括作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊和锭剂等可以包含如下任意的组分或具有类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如海藻酸、羟基乙酸淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或斯泰特(Sterte)；助流剂如胶体二氧化硅；增甜剂如蔗糖或糖精；或增味剂如薄荷、水杨酸甲酯、橙色调味剂。

对于通过吸入进行的施用，可以从包含适当推进剂如气体如二氧化碳的加压容器或分配器或者雾化器以气溶胶形式递送所述化合物。

全身施用还可以通过透粘膜或透皮方式进行。对于透粘膜或透皮施用，在制剂中使用适合于待透过的阻挡层的渗透剂。这些渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于透粘膜施用的去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用喷鼻剂或栓剂来完成。对于透皮施用，药物组合物可以被配制成本领域中通常已知的软膏(ointment)、油膏(salve)、凝胶或霜剂(cream)。

在某些实施方式中，将所述药物组合物配制用于缓释或控释活性组分。可以使用生物降解性、生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸。对于本领域技术人员来说是清楚用于制备这些制剂的方法的。材料还可以通过商购从例如Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.获得。脂质体悬浮液(包括被靶向带有抗病毒抗原的单克隆抗体的受感染细胞的脂质体)也可以用作药学可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备。

将口服或肠胃外组合物配制成用于施用容易和剂量一致的剂量单元形式是特别有利的。本文使用的剂量单元形式包括适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散的单元；每个单元包含经计算与所需的药学载体联合产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。针对本发明的剂量单元形式的规格受限于并且直接依赖于活性化合物的独特性质和要实现的具体治疗效果以及配制用于个体治疗的这种活性化合物的领域中固有的限制。

这种化合物的毒性和治疗功效可以通过标准的药学程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如用于确定LD50(致使50％的群体死亡的剂量)和ED50(在50％的群体中有治疗效果的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数并且其可以被表示为比率LD50/ED50。显示出大的治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用显示出毒副作用的化合物，但是应当注意设计将这些化合物靶向受影响组织的部位的递送系统以使对未受影响的细胞的可能伤害最小化，由此降低副作用。

从细胞培养物分析和动物研究中获得的数据可以在制定用于人类的剂量范围中使用。所述化合物的剂量优选处在包括没有或者几乎没有毒性的 ED50在内的循环浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型和所采用的施用途径在这个范围内变化。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，可以根据细胞培养物分析初步估算治疗有效的剂量。剂量可以在动物模型中制定以获得包括IC50(即，受检化合物的实现症状的最大抑制半数的浓度)在内的循环血浆浓度范围，如在细胞培养物所确定的那样。可以使用这种信息来更加准确地确定人类中可用的剂量。可以将药物组合物和用于施用的说明书一起包括在容器、包装或分配器中。

本发明通过如下实施例进一步进行说明，所述实施例不应被解释为是限制性的。在整个本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及图和表的内容都通过参引方式引入本文。

实施例1：趋化因子及其受体在炎性疾病中的上调

材料和方法

引物设计。CXCL9、CXCL10、CXCL11，CCRL1，CCRL2，CCR5，CCL1，CCL2， CCL3，CCL4，CCL4L1，CCL5，CCL7，CCL8，CCL14-1，CCL14-2，CCL14-3， CCL15-1，CCL15-2，CCL16，CCL19，CCL23-1，CCL23-2，CCL24，CCL26，CCR6， CCL20和CCL25，CCL25-1，CCL25-2的信使RNA序列从NIH-NCBI基因数据库获得(表1)。使用BeaconJ 2.0计算机程序设计引物。使用计算机程序Primer PremierJ和MIT Primer 3对引物进行热力学分析。将所得的引物组与整个人类基因组进行比较以确认特异性。

实时PCR分析。将淋巴细胞或炎性组织培养在RMPI-1640中，所述 RMPI-1640含有10％胎牛血清、2％人类血清，补充有非必需氨基酸L-谷氨酸盐和丙酮酸钠(完全培养基)。另外，从临床分离物(Clinomics Biosciences，Frederick，Md.和UAB TissueProcurement，Birmingham，Ala.)中获得初级炎性和正常配对的匹配组织。信使RNA(mRNA)根据制造商的程序使用 TriReagent(Molecular Research Center，Cincinnati，Ohio)从10⁶个细胞获得。通过使用10U/μl无RNase(RNA酶)的DNase(DNA酶)(Invitrogen， SanDiego，Calif.)在37℃处理15分钟而从这些样品中除去潜在的基因组 DNA污染物。然后沉淀RNA并且重悬在RNA Secure(Ambion，Austin，Tex.) 中。通过使用Taqman7逆转录试剂(AppliedBiosystems，Foster City，Calif.) 根据制造商程序逆转录约2μg的总RNA来生成cDNA。然后，使用SYBR7 Green PCR master混合试剂(Applied Biosystems)根据制造商程序利用对CXCL9、 CXCL10、CXCL11，CCRL1，CCRL2，CCR5，CCL1，CCL2，CCL3，CCL4，CCL4L1，CCL5，CCL7，CCL8，CCL14-1，CCL14-2，CCL14-3，CCL15-1，CCL15-2，CCL16， CCL19，CCL23-1，CCL23-2，CCL24，CCL26，CCR6，CCL20和CCL25，CCL25-1， CCL25-2具有特异性的人类cDNA引物扩增cDNA。使用BioRad Icycler和软件(Hercules，Calif.)通过实时PCR分析评价这些靶标的mRNA的拷贝水平。

抗血清制备。从趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCRL1、CCRL2、CCR5、 CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL14-1、CCL14-2、 CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL19、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、 CCL26、CCR6、CCL20以及CCL25、CCL25-1、CCL25-2(表1)合成(Sigma Genosys， The Woodlands，Tex.)具有15个氨基的肽，并且将所述肽偶联至鸡蛋溶菌酶(Pierce,Rockford,Ill.)中，以产生用于为制备抗血清或生成单克隆抗体而进行的随后免疫的抗原。采用显色鲎变形细胞裂解物分析 (chromogenic Limulusamebocyte lysate assay，Cape Cod，Inc.，Falmouth， Miss.)对趋化因子肽偶联物的内毒素水平进行定量，并且显示为小于5 EU/mg。使用100μg的作为免疫原的抗原和完全弗氏佐剂Ribi Adjuvant 体系(RAS)一起用于第一次免疫，终体积为1.0ml。这种混合物以100ml等分试样皮下施用于兔子背部的两个部位，并且以400ml肌肉内施用在每条后腿的肌肉中。三至四周后，除了非完全弗氏佐剂外，让兔子接受100μg 抗原进行随后的3次免疫。当抗体效价达到1：1,000,000时收集抗血清。随后，使正常或抗血清热失活并且以1：50稀释在PBS中。

单克隆抗体制备。从趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCRL1、CCRL2、 CCR5、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL14-1、 CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL19、CCL23-1、CCL23-2、 CCL24、CCL26、CCR6、CCL20以及CCL25、CCL25-1、CCL25-2(序列1至序列30)合成(Sigma Genosys)具有15个氨基的肽，并且将所述肽偶联至鸡蛋溶菌酶(Pierce)中，以产生用于为制备抗血清或生成单克隆抗体而进行的随后免疫的抗原@。采用显色鲎变形细胞溶解产物分析(chromogenic Limulus amebocyte lysate assay，Cape Cod，Inc.，Falmouth，Miss.)对趋化因子肽偶联物的内毒素水平进行定量，并且显示为小于5EU/mg。使用100μg 的作为免疫原的抗原和完全弗氏佐剂Ribi Adjuvant体系(RAS)一起用于第一次免疫，终体积为200μl。这种混合物以100μl等分试样皮下施用于兔子、小鼠或免疫球蛋白人源化小鼠的背部的两个部位。两周后，除了非完全弗氏佐剂之外，使动物接受100μg抗原的而进行随后的3次免疫。收集血清并且当抗-CXCL9、-CXCL10、-CXCL11、-CCRL1、-CCRL2、-CCR5、-CCL1、 -CCL2、-CCL3、-CCL4、-CCL4L1、-CCL5、-CCL7、-CCL8、-CCL14-1、-CCL14-2、 -CCL14-3、-CCL15-1、-CCL15-2、-CCL16、-CCL19、-CCL23-1、-CCL23-2、 -CCL24、-CCL26、-CCR6、-CCL20以及-CCL25、-CCL25-1、-CCL25-2抗体的效价达到1：2,000,000时处死宿主，并分离脾细胞用于生成杂交瘤。

将来自免疫宿主的脾和淋巴结的B细胞与永生骨髓瘤细胞系(例如YB2/0) 融合。接着在杂交瘤克隆的选择性培养条件(即，HAT-补充培养基)和限制稀释方法之后分离杂交瘤。使用ELISA选择产生具有所需特异性的抗体的细胞。使用常用的分子生物学技术对来自正常大鼠或小鼠的杂交瘤进行人源化。克隆高度亲和和丰富的杂交瘤之后，从腹水或培养物上清液分离抗体，将抗体调节至1：2,000,000的效价，并以1：50稀释在PBS中。

抗血清或单克隆抗体处理。每三天使用腹膜内注射200μl的对每一种趋化因子具有特异性的抗血清或单克隆抗体来治疗自然或当处理时患上炎性疾病的敲除或转基因小鼠(8至12周龄，Charles River Laboratory， Wilmington，Mass.)。然后监测宿主的炎性疾病状态的疾病进程 (progression)或消退。

通过ELISA进行的细胞因子分析。按照制造商说明书(E-Biosciences， SanDiego，Calif.)通过ELISA确定IL-2、-IL-6、-TNF-α、和-IFN-γ的血清水平。使用处在0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.5)的100μl的相应捕获抗体将板包被，并在N/O于4℃温育。抽吸并用洗涤缓冲液洗涤后，在RT使用分析稀释液将孔包被1小时。添加样品和标准物并在RT温育2小时。接着，添加100μl的检测抗体溶液并温育1小时。添加100μl抗生物素蛋白-HRP溶液并温育30分钟。然后，添加100μl的四甲基联苯胺(TMB)底物溶液并使其反应20分钟。添加50μl的终止溶液并在450nm读板。细胞因子ELISA分析对于每次分析都能够检测大于15pg/ml。

通过多重细胞因子ELISA进行的细胞因子分析。还采用由BioRad提供的Beadlyte小鼠多细胞因子检测体系试剂盒按照制造商说明书确定血清中的T辅助细胞衍生的细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α。使用100μl的bio-plex分析缓冲液冲洗过滤底板并使用Millipore Multiscreen Separation Vacuum Manifold System(Bedford，Mass.)去除， Hg设置在5。向孔中添加处在分析缓冲液中的IL-1α、IL-1β、IL-2；IL-12、IFN-γ、TNF-α珠。接着，添加50μl血清或标准物溶液并在密封板之后，在使用Lab-LineInstrument Titer Plate Shaker(Melrose，Ill.)持续振荡(设置为3档)的情况下在RT将板温育30分钟。如前所述，洗涤过滤底板两次，并在300x g离心30秒。然后每个孔中添加50μl的抗小鼠IL-1α、 IL-1β、IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α抗体-生物素报告子溶液，然后再持续振荡的同时温育30分钟，之后在300x g离心30秒。和以前一样，使用 100μl的bio-plex分析缓冲液洗板3次。接着，向每个孔中添加50μl 链霉亲和素-藻红素溶液并在持续振荡的情况下在RT温育10分钟。添加125 μl的bio-plex分析缓冲液并使用Luminexl仪器(Austin，Tex.)测量 Beadlyte读数。收集所得数据并使用Bio-plexl软件(Bio-Rad)计算。细胞因子Beadlyte分析能够检测大于5pg/ml的每种分析物。

血清淀粉样蛋白A(BAA)ELISA。使用由Biosource International， (Camarillo，Calif.)提供的试剂盒通过ELISA测定SAA水平。简而言之，使用50μl的SAA特异性单克隆抗体溶液包被微量滴定带(micro-titer strip)以捕获SAA。向孔中添加血清样品和标准物并在RT温育2小时。在分析缓冲液中洗涤之后，添加HRP偶联的抗-SAA单克隆抗体溶液并在37℃温育1小时。洗涤之后，添加100μl四甲基联苯胺(TMB)底物溶液并在RT温育15分钟之后终止反应。添加终止溶液之后，在450nm读板。

组织学和病理学打分。切制6μm的固定组织切片，并使用苏木精和曙红染色以进行光显微检查。肠损伤是多病灶的并且严重度不同，考虑病变的数量以及它们的严重度而对肠的所有切片进行评级。根据如下标准打分(0至 4)：(0级)正常组织没有变化。(1级)1或数个多病灶单核细胞浸润，极小畸形并且没有损耗粘液。(2级)病变往往涉及更多的粘膜并且在由单核细胞构成的固有层中病变具有若干个病灶但还是轻度的炎性细胞浸润，轻度畸形，偶有上皮细胞腐蚀，在粘膜下没有发现炎症。(3级)病变涉及大面积的粘膜或并且比2级的频度更高，其中炎性是中度的，并且一般涉及皮下粘膜以及中度上皮细胞畸形，带有单核细胞和嗜中性粒细胞的混合物。(4级)病变一般涉及大部分的切片，并且比3级的病变更加严重。另外，4级炎症更加严重并且包括单核细胞和嗜中性粒细胞；上皮细胞畸形被标记为伸长的腺体中的上皮细胞聚集。这些分数的总和提供了每只小鼠的炎性疾病总分数。疾病分数可以从0(在任何片段(segemnt)中都没有变化至最大的12(带有4级病变的片段)。

数据分析。SigmaStat 2000(Chicago，Ill.)软件被用来分析和确认数据的统计显著性。数据随后使用双因素非配对检验通过Student's t检验进行分析。在这种分析中，将受处理的样品与未处理对照进行比较。显著性水平设定为p<0.05。

结果

分子靶标的半定量化RT-PCR鉴定。使用CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、 CCRL1-、CCRL2-、CCR5-、CCL1-、CCL2-、CCL3-、CCL4-、CCL4L1-、CCL5-、 CCL7-、CCL8-、CCL14-1-、CCL14-2-、CCL14-3-、CCL15-1-、CCL15-2-、CCL16-、 CCL19-、CCL23-1-、CCL23-2-、CCL24-、CCL26-、CCR6-、CCL20-以及CCL25-、 CCL25-1-、CCL25-2特异性引物组获得的RT-PCR产物没有与其他基因靶标交叉反应，因为排除了与宿主序列退火的引物。所使用的引物产生不同大小的扩增子产物，相对的多态性导致CCL4与CCL4L1、CCL14-1、CCL14-2与 CCL14-3、CCL15-1与CCL15-2、CCL23-1与CCL23-2以及CCL25、CCL25-1与 CCL25-2。为此，来自显示出过敏性反应、关节炎(例如类风湿性关节炎、银屑病性关节炎)、哮喘、变态反应(例如药物、昆虫、植物、食物)、动脉粥样硬化、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病(例如mellitus型、青少年型糖尿病)、移植物排斥反应、炎性肠病(如克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎)、多发性硬化症、重症肌无力、肺炎、银屑病、肾炎、鼻炎、脊椎关节病、硬皮病、系统性红斑狼疮或甲状腺炎的受试者的组织的RT-PCR分析显示， CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCRL1、CCRL2、CCR5、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、 CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、 CCL16、CCL19、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL26、CCR6、CCL20以及CCL25、 CCL25-1、CCL25-2被炎性宿主细胞差异表达。

体内炎性疾病抑制。使患有过敏性反应、脓毒性休克、关节炎(例如类风湿性关节炎、银屑病性关节炎)、哮喘、变态反应(例如药物、昆虫、植物、食物)、动脉粥样硬化、支气管炎、慢性阻塞性肺病、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病(例如mellitus型、青少年型糖尿病)、移植物排斥反应、格雷夫氏症、桥本氏甲状腺炎、炎性肠病(如克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎)、间质性膀胱炎、多发性硬化症、重症肌无力、银屑病、肾炎、鼻炎、脊椎关节病、硬皮病、系统性红斑狼疮或甲状腺炎的哺乳动物患上的相关的炎性疾病。如通过组织学打分和比较IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、淀粉样蛋白A的处理前和处理后血清水平所确定的那样，抗-CXCL9、CXCL10、 CXCL11、CCRL1、CCRL2、CCR5、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、 CCL7、CCL8、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL19、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL26、CCR6、CCL20或CCL25、CCL25-1、CCL25-2 的抗体对炎性疾病的进程和消退具有不同的影响。如通过组织学打分和比较 IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、淀粉样蛋白A的处理前和处理后血清水平所确定的那样，抗-CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCRL1、CCRL2、 CCR5、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL19、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL26、CCR6、CCL20或CCL25、CCL25-1、CCL25-2抗体有效地导致炎性疾病的消退并阻碍进程。

如前文所指出的那样，在本发明的方法中使用的趋化因子是已知的。它们的蛋白序列的登录号在表1中确认。

如表中所示，炎性疾病引起的特定的趋化因子随疾病的不同而不同。它们在个体之间也不同。因此，当治疗个体时，鉴定在患者组织中上升的具体趋化因子是明智的。使用抗每一种趋化因子所产生的抗体并且将来自于患者的组织样品暴露于特定的抗体，然后评价抗体/趋化因子结合的量，可以评价每一种趋化因子的表达水平，并且可以向患者施用将结合过量的趋化因子的特定抗体。这种针对炎性疾病的定制治疗方法是新颖的，并且是本发明特别有价值的方面。

实施例2：IFN-γ、CXCL10、MIG、I-TAC、CXCR3在鼠科动物结肠炎中的mRNA表达

图1显示了鼠科动物结肠炎过程中IFN-γ、CXCL10、MIG、I-TAC和CXCR3 的mRNA表达。从具有C57BL/6背景的笼子圈养的IL-10^-/-小鼠移除层流障碍 (Laminar flowbarrier)以自然患上结肠炎。处死后，在结肠炎发作之前(无菌条件，空白矩形柱)和患上结肠炎之后(填充矩形柱)从小鼠的结肠或肠系膜淋巴结分离总RNA。在能够检测大于20拷贝的转录cDNA的RT-PCT分析之后确定IFN-γ、IP-10、MIG、I-TAC和CXCR3 mRNA表达水平。在图1中，转录本的Log₁₀拷贝相对于18S rRNA的真实拷贝表示。

如图1所示，在患有结肠炎的IL-10^-/-小鼠的发炎结肠中观察到CXCR3 和CXCL10表达的显著上升。而且，在患有结肠炎的IL-10^-/-小鼠的肠系膜淋巴结中观察到CXCL10表达的显著上升。

实施例3：通过继承性转移接受CD45RB^HI或CXCR3⁺CD4⁺T细胞的TCRβxδ^-/-小鼠中的 IBD的组织学分析

图2显示了通过继承性转移接受CD45RB^HI或CXCR3⁺CD4⁺T细胞的TCRβ xδ^-/-小鼠中的IBD的组织学分析。接受来自正常C57BL/6小鼠的CD45RB^Lo-(图 A)、CD45RB^Hi-(图B)或CXCR3⁺-CD4⁺T细胞(图C)的TCRβxδ^-/-小鼠中的肠炎的60倍放大图。使用苏木精-曙红染色6μm石蜡切片，肠的横切切片展示壁厚度、粘膜层的增大、隐窝变形和白血球浸润的差异。

这个分析显示，均由CD45RB群体构成的CXCR3⁺CD4⁺T细胞在TCRβxδ^-/-小鼠(图C)中诱导了结肠炎的诱导作用

实施例4：IL-10^-/-小鼠中的SAA水平和结肠炎的发展

图3显示了IL-10^-/-小鼠中的血清淀粉样蛋白(SAA)水平和结肠炎的发展。大于200μg/ml的SAA浓度与第0周时无症状结肠炎的发作相关联。小鼠每三天接受200μl的初免(pre-immune)(空白圆圈)或抗-小鼠CXCL10(填充圆圈)Ab溶液。每两周收集血清，并且所提供的数据是平均SAA浓度± SEM。

图3中的结果显示，使用抗-小鼠CXCL10抗体阻断CXCL10抑制了与IBD 相关联的升高的SAA水平。

实施例5：IL-10^-/-小鼠的体重变化

图4显示了IL-10^-/-小鼠的体重变化。通过监测第0周时初始体重的变化来观察与鼠科动物CD相关联的消耗症。IL-10^-/-小鼠每三天接受200μl 的初免(空白圆圈)或抗-小鼠CXCL10(填充圆圈)Ab溶液。每两周记录体重，并且以百分比表示相对于初始体重的变化：第0周时的体重减去第1，3，5， 7，9或11周时的体重再除以第0周时的体重。

图4中的结果显示，使用抗-小鼠CXCL10抗体阻断CXCL10抑制了与IBD 相关联的体重损失。

实施例6：血清IL-6和SAA水平与鼠科动物结肠炎的关联

图5显示了血清IL-6和SAA水平与鼠科动物结肠炎的关联。IL-10^-/-小鼠每三天接受200μl的初免(空白柱)或抗-小鼠CXCL10(填充柱)Ab溶液。通过ELISA测定第11周时SAA和血清IL-6的水平。数据提供为平均SAA或 IL-6浓度±SEM。

图5的结果显示，使用抗-小鼠CXCL10抗体阻断CXCL10显著地降低了 SAA和IL-6血清浓度(与对照小鼠相比)。该结果进一步说明使用SAA水平作为这种CD鼠科动物模型从急性(即无症状)转向慢性结肠炎的指示的效用。

实施例7：IL-10^-/-小鼠中的总粪便和血清Ab水平

图6显示了IL-10^-/-小鼠中的总粪便和血清Ab水平。具有5只IL-10-/- 小鼠的多个组每三天接受200μl的初免(空白矩形柱)或抗-小鼠IP-10-(填充矩形柱)Ab溶液。数据提供为总Ig Ab(ng/ml)的平均浓度±SEM。在第11周时收集粪便提取物中的总IgA和IgG Ab或血清中的IgM，IgG1，IgG2a， IgG2b和IgG3 Ab并通过ELISA测定水平。星号表示两组之间具有统计学显著性差异，即，p<0.05(*)。

测定总粪便IgG和IgA水平以确定CD过程中肠Ab的变化的相关性。如图6所示，粪便提取物中的IgA Ab水平相对稳定。在接受IP-10Ab溶液的 IL-10^-/-小鼠中观察到粪便IgGAb的显著下降(图6)。这些结果显示，阻断 IP-10减弱了CD过程中鼠科动物从肠系膜的外周到内腔的IgG Ab的分泌。另外，比较对照小鼠和使用抗-CXCL10 Ab处理的那些小鼠的血清之间的总 IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgM抗体水平。对照和CXCL10 Ab-处理小鼠具有类似的IgM，IgG1，IgG2b和IgG3 Ab水平。然而，与使用抗CXCL10 Ab 处理小鼠相比，患有活动性结肠炎的小鼠的总血清IgG2a水平显著较高(图 6)。该结果显示，阻断CXCL10减弱了CD过程中总IgG2a水平和IgG Ab的分泌，这与所预测的CD过程中Th1>>Th2细胞因子水平的不平衡是吻合的。

实施例8：患有IBD的IL-10^-/-小鼠的血清IL-12、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-1α和IL-1 β水平

图7显示了患有IBD的IL-10^-/-小鼠的血清IL-12、IFN-γ、IL-2、TNF-α、 IL-1α和IL-1β水平。IL-10^-/-小鼠每三天接受200μl初免-(空白矩形柱)或抗-小鼠IP-10-(填充矩形柱)Ab溶液。通过ELISA测定第11周时血清细胞因子水平。数据提供为平均细胞因子浓度±SEM(ng/ml)。

对照组显示与IP-10Ab处理的小鼠相比中度较高的血清IL-12p40水平(图7)。相反，抗-CXCL10 Ab治疗显著地降低了IL-10^-/-小鼠中的IFN-γ水平，以及IL-2的水平、TNF-α、IL-1α和IL-1β水平。IBD过程中IL-2、 IL-12、TNF-α、IL-1α和IL-1β的过量产生已经得到很好地证明。CXCL10 阻断显著降低了血清IL-2、TNF-α、IL-1α和IL-1β水平(图7)，这与抗 -CXCL10 Ab处理显著降低患有活动性结肠炎的宿主的炎症状态相吻合。

实施例9：IL-10^-/-小鼠所呈现的结肠炎的组织学特性

图8显示了IL-10^-/-小鼠所呈现的结肠炎的组织学特性。小鼠每三天接受200μl的初免-(C或D)或抗-小鼠IP-10-(A或B)Ab溶液的变化。在第 11周处死后，将肠固定，并切制6μm的切片并染色。以40X(A和C)或200X(B 和D)的放大视图显微检查切片。

所观察到的病理学变化包括上行结肠和横行结肠的固有层中的小的多病灶浸润。这些浸润由淋巴细胞和偶然的少量嗜中性粒细胞组成。上皮细胞在IP-10抑制组中没有过度增大。在对照小鼠中还存在多核的增大的上皮细胞和伸长的腺细胞。然而，在对照组中结肠炎进程更加快速，如大肠尤其是结肠中所有区域的多病灶病变所示。这些结果显示结肠炎中的显著改善与 CXCL10阻断有关。

实施例10：抗-CXCL10抗体消除了严重结肠炎

图9显示，抗-CXCL10抗体消除了严重结肠炎。从IL-10^-/-小鼠开始具有结肠炎症状(即，当小鼠失去了它们的约10％至15％的初始体重并且达到峰值 SAA水平)后第14周开始每三天接受200μl对照Ab(空白圆圈)或抗-小鼠 CXCL10 Ab(填充圆圈)，并且持续到小鼠在第26周被处死为止。每周记录 IL-10^-/-小鼠的SAA水平±SEM和体重，相对于初始体重的变化表示为结肠炎发作前(第-2周)的体重减去随后周数的体重再除以结肠炎发作前的体重的百分比(±SEM)。数据表示为包括每组5只小鼠的三个独立实验的平均值。星号指示在抗-CXCL10 Ab-和对照Ab-处理组之间具有统计学显著差异(p< 0.01)。

IL-10^-/-小鼠中的慢性结肠炎与SAA水平的升高(>300μg/mL)一致(FIG 9A)，并且与小鼠体重与它们的初始体重相比下降10％至15％一致(图9B)。患有慢性结肠炎的小鼠中的CXCL10阻断减轻了的体重损失(与使用对照Ab处理的患有慢性结肠炎的IL-10^-/-小鼠所经历的体重损失相比)。

实施例11：严重结肠炎过程中粘膜组织中的Th1细胞因子、CXCL10和CXCR3 mRNA表 达

图10显示了严重结肠炎过程中粘膜组织中的Th1细胞因子、CXCL10和 CXCR3 mRNA表达。患上慢性结肠炎之后，小鼠在有症状结肠炎发作(即，当小鼠已经失去它们的约15％初始体重时)之后第14周开始，每三天接受200μl 的对照Ab(实心柱(solid bar))或抗-CXCL10 Ab(斜纹柱(hashed bar))或正常WT小鼠(空白柱(open bar))。处死小鼠之后，从使用对照Ab、野生型或抗CXCL10 Ab处理的小鼠的结肠和肠系膜淋巴结(MLN)分离总RNA。通过能够检测大于20个拷贝的转录cDNA的RT-PCR分析来确定IFN-γ、CXCL10、TNF-α、 IL-12p40和CXCR3 mRNA表达的水平。在图10中，转录本的Log₁₀拷贝相对于18S rRNA的真实拷贝±SEM表示。数据表示为包括每组5只小鼠的三个独立实验的平均值。星号指示在抗-CXCL10和对照Ab-处理组之间具有统计学显著差异(p<0.01)。

如图10所示，与使用抗-CXCL10 Ab处理的小鼠相比，患有慢性结肠炎的IL-10^-/-小鼠的MLN和结肠中发现TNF-α和IL-12p40 mRNA表达显著上升。与使用抗-CXCL10 Ab处理的小鼠相比，使用对照Ab处理的IL-10^-/-小鼠在慢性结肠炎过程中结肠和MLN的CXCL10 mRNA表达也显著提高。与对照Ab处理相比，抗-CXCL10 Ab处理之后患有严重结肠炎的小鼠的MLN中的IFN-γ水平降低；然而，在两组的结肠中，这种Th1相关的细胞因子低于可检测水平。在CXCL10抑制之后，患有结肠炎的IL-10^-/-小鼠的结肠中的CXCR3 mRNA 表达显著降低，但是其在MLN中的水平与对照Ab处理的小鼠相比在相同处理过程中没有减少。

实施例12：严重结肠炎进程中血清中的Th1和炎性细胞因子水平

图11显示了严重结肠炎进程中血清中的Th1和炎性细胞因子水平。 IL-10^-/-小鼠在有症状结肠炎发作之后第14周开始，每三天接受200μl的对照Ab(空白圆圈)或抗-CXCL10Ab(填充圆圈)，连续接受到第26周。在处死之前，通过能够检测大于10pg/ml的IL-12p40、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-1α和IL-1β的ELISA来测定第26周时血清细胞因子的水平。数据表示为平均浓度±SEM。星号指示在两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.01(*)。实验组由5只小鼠组成，并且实验重复三次。数据表示为三个独立实验的平均值。

和图10中的RT-PCR分析一致，抗-CXCL10 Ab处理降低了患有慢性结肠炎的IL-10^-/-小鼠中的IFN-γ和IL-12p40血清水平(图11)。与对照Ab处理小鼠相比，患有慢性结肠炎的IL-10^-/-小鼠在CXCL10阻断之后的血清IL-2、TNF-α、IL-1α和IL-1β水平也下降。这些数据显示，CXCL10阻断导致患有慢性结肠炎的IL-10^-/-小鼠的SAA、IL-6、IL-12p40、IFN-γ、IL-2、TNF-α、 IL-1α和IL-1β血清水平降低。

实施例13：抗-CXCL10抗体对结肠炎病理学的影响

图12显示了抗-CXCL10抗体对结肠炎病理学的影响。来自患有慢性结肠炎的如前所述使用对照Ab(图A和B)或抗-CXCL10 Ab处理(图C至D)的 IL-10^-/-小鼠的结肠的组织病理学。通过光学显微术检查切片。实验组由5只小鼠组成，并且重复3次。

接受抗-CXCL10 Ab的小鼠显示肠炎中的显著减轻。在慢性结肠炎过程中的肠中观察到白细胞浸润的升高(图12A)和腺结构的变形(图12B)。抗 -CXCL10 Ab降低了淋巴细胞浸润，并且部分地恢复了腺细胞和杯状细胞结构 (图12C)，这同样与肠隐窝的伸长一致(图12D)。另外，患有严重结肠炎的接受对照Ab的IL-10^-/-小鼠的平均组织学得分显著高于使用抗-CXCL10 Ab 处理的小鼠的得分(数据未示出)。类似的，通过组织学分析确定，SAA水平与结肠炎的严重度相关。病理学变化包括对照Ab处理的IL-10^-/-小鼠的结肠的LP中的白细胞浸润，CXCL10阻断后这些浸润的数量降低。总而言之，这些结果显示与慢性结肠炎相关的特征性肠炎在CXCL10阻断后有显著的改善。

实施例14：在CD患者的结肠中的CXCL9、CXCL10、CXCL11和TNF-α的组织学和免疫荧 光定位

图13显示了在CD患者的结肠中的CXCL9、CXCL10、CXCL11和TNF-α的组织学和免疫荧光定位。对CD患者和正常对照的肠中的结肠变化的组织病理学进行固定，并且切制6μm的切片，并且使用苏木精和曙红或者抗- CXCL9、CXCL10、CXCL11或TNF-α抗体染色。以130X的放大视图检查切片。发炎的结肠展示出正常和CD患者之间在粘膜壁厚度、隐窝畸形、白细胞浸润和腺伸长中的差异。

对照样品的结肠病理学显示在多个部位处的过度生长的上皮细胞层，具有少数炎性浸润和CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCR3的低表达(图13)。相反，血清CXCL9、CXCL10和CXCL11水平高的CD患者在结肠中还表达显著水平的>> CXCL9的CXCL11，CXCL110具有适度的提高。

实施例15：自发性结肠炎过程中IL-10^-/-小鼠的MAP特异性血清Ab反应

图14显示了自发性结肠炎过程中IL-10^-/-小鼠的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种(MAP)特异性血清Ab反应。所提供的数据为来自独立实验的MAP- 特异性IgG亚类的平均值+SD浓度(ng/ml)。星号(*)指示与对照相比具有统计学显著性差异，即p<0.01。小鼠实验组由15只小鼠组成。分析重复3 次。

图14显示，常规圈养的患有自发性结肠炎的小鼠中的MAP-特异性IgG2a Ab反应显著高于在无菌条件下圈养的没有患病的类似对照小鼠。这与之前描述的在结肠炎过程中细胞因子水平的不平衡(Th1>Th2)是一致的，说明有与结肠炎的进程有关的偏Th1的体液反应。

实施例16：使用MAP挑战的IL-10^-/-小鼠的组织学特性

图15显示了使用MAP挑战的IL-10^-/-小鼠的组织学特性。挑战之后第14 周，将来自通过强饲法接受单剂量的200μl对照媒介物(只有乳脂 (cream))、在乳脂中的10⁴CFU的活MAP、或在乳脂中的10⁴CFU的热灭活 MAP并且持此之外在无菌条件下保持的IL-10^-/-小鼠的结肠的组织病理学固定，切制6μm的切片并使用苏木精和曙红染色。在各组中发现轻度(空白三角)和重度(填充三角)细胞浸润(即，活的MAP>>热灭活的MAP>对照)。在活的MAP挑战的小鼠中，细胞浸润聚集一般与病灶病变和隐窝长度降低的过度生长上皮细胞有关，。通过光学显微术检查切片(40X放大率)。实验组由 15只小鼠组成。显示代表性样品。

图15显示，使用活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠的肠组织显示出由淋巴细胞和偶有的多形核细胞组成的细胞浸润水平增加。接受活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种的小鼠中的结肠炎进程更加快速，如由它们的大肠的所有区域的多病灶或者细胞浸润聚集所示。另外，使用活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠的上皮细胞过度生长，肠隐窝长度降低，并且粘膜和粘膜下层也都存在伸长的腺细胞。

实施例17：MAP挑战后的IL-10^-/-小鼠的体重变化

图16显示了MAP挑战后的IL-10^-/-小鼠的体重变化。通过监测结肠炎进程过程中的体重来观测与鼠科动物结肠炎有关的消耗病。具有B6背景的IL-10^-/-小鼠接受单剂量的200μl正常对照(乳脂，空白圆圈)、在乳脂中的 10⁴CFUs的活的MAP(填充圆圈)或在乳脂中的经过巴氏消毒的10⁴CFUs的 MAP(三角形)，除此之外在无菌条件下保持。每两周记录IL-10^-/-小鼠的初始体重的百分比。所提供的数据为3个独立实验的平均值+SD。星号(*)指示与对照相比具有统计学显著性差异，即p<0.01。实验组由15只小鼠组成，并且分析重复3次。

图16显示，使用副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠并且除此之外放在无菌的条件下的小鼠失去更多的体重，并且经历更高的SAA水平 (与以热灭活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的类似小鼠或给予对照媒介物的类似小鼠相比)。暴露于热灭活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种的小鼠与暴露于活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种的那些小鼠相比体重损失较少，但是在SAA水平上仅具有小幅上升。这些结果显示，与对照组相比，使用活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠显示出快速的与 SAA水平升高和体重下降相关的结肠炎进程(与对照组相比)。

实施例18：MAP挑战后的IL-10^-/-小鼠中的血清细胞因子水平

图17显示了MAP挑战后的IL-10^-/-小鼠中的血清细胞因子水平。具有B6 背景的IL-10^-/-小鼠通过强饲法接受单剂量的200μl对照媒介物(即，乳脂)、在乳脂中的10⁴CFUs的活的MAP或在乳脂中的热灭活的10⁴CFU的MAP，除此之外在无菌条件下保持。通过ELISA确定挑战后14周血清TNF-α和IFN-γ以及CXCL9、CXCL10和CXCL11的水平，所述ELISA能够检测大于10pg/ml TNF-α、IFN-γ或CXCR3配体。所提供的数据为平均TNF-α、IFN-γ和CXCR3 配体浓度+SD(ng/ml)。星号(*)指示与对照相比具有统计学显著性差异，即p<0.01。实验组由15只小鼠组成。分析重复3次。

副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战之后，使用活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的IL-10^-/-小鼠的血清中的IFN-γ和TNF-α水平显著(约 6倍)高于对照小鼠；暴露于热灭活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种的小鼠的TNF-α和IFN-γ反应比对照的那些小鼠高约2倍，但是这些差异没有显著性(图17)。CXCL10和CXCL11的血清水平在使用活的或热灭活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠与对照组中的那些小鼠相比显著上升，但是CXCL9的血清水平没有显著上升。这些结果显示，暴露于副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种增加了系统性IFN-γ、TNF-α、CXCL10和CXCL11的产生。

实施例19：通过来自IL-10^-/-小鼠的CD4⁺T细胞导致抗-肽#25Ag(来自MPT59)-诱导 增殖和IL-2产生

图18显示通过来自IL-10^-/-小鼠的CD4⁺T细胞导致的抗-肽#25Ag(来自 MPT59)-诱导增殖和IL-2产生。具有B6背景的IL-10^-/-小鼠接受单剂量的200 μl的对照媒介物(空白柱，仅有乳脂)、在乳脂中的10⁴CFU的活的MAP(斜纹柱)或在乳脂中的热灭活的10⁴CFU的MAP(填充柱)，除此之外在无菌条件下保持。将衍生自小鼠的MLN和PP的CD4⁺淋巴细胞纯化并且采用γ-辐射APC(10⁶细胞/ml)以5×10⁶细胞/ml的密度和肽#25(1μg/ml)一起培养3天。通过ELISA测定培养物上清液中存在的细胞因子。通过BrdU引入测量增殖。所提供的数据为一式四份培养物的增殖反应的平均OD₄₅₀或平均IL-2分泌(pg/ml) ±SD。星号(*)指示与对照相比具有统计学显著性差异，即p<0.01。实验组由15只小鼠组成并且实验重复3次。

图18显示，来自之前使用活的或热灭活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠的MLN和PP的肽25-刺激CD4⁺T细胞与单独的乳脂挑战的小鼠的类似CD4⁺T细胞相比在BrdU引入中显示出显著的上升。这些结果表明，暴露于副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种之后的Ag重复刺激增强了CD4⁺T 细胞的增殖。

实施例20：IBD患者中的血清CXCR3配体和分支杆菌特异性Ab反应

图19显示IBD患者中的血清CXCR3配体和分支杆菌特异性Ab反应。分离来自62CD和88UC女性患者和32个正常健康女性供体(没有经历任何治疗)的血清并评价CXCR3配体(即CXCL9、CXCL10和CXCL11)和分支杆菌特异性IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 Ab的存在。通过能够检测大于10pg/ml的这些配体的ELISA来测定这些水平。所提供的数据为浓度±SEM。星号指示健康供体和IBD患者之间具有统计学显著性差异，即p<0.01。

虽然总IgG1，IgG2，IgG3和IgG4亚类Ab在IBD患者的血清中显著高于健康供体(数据未示出)，但是IBD患者的IgG体液反应的曲线也显示分支杆菌特异性IgG1和IgG2 Ab升高(图19)。CD患者中的这些反应显著高于UC 患者或正常健康供体。在这些样品中的CXCR3配体与健康供体相比也升高了。这些结果表明，IBD患者具有较高的CXCL9、CXCL10和CXCL11水平和分支杆菌特异性IgG1和IgG2 Ab反应。而且，这些发现与之前显示在常规圈养条件下的IL-10^-/-小鼠中的自发性结肠炎过程中的分支杆菌特异性IgG2a和 CXCR3配体的水平较高的发现相关。

实施例21：分支杆菌挑战后IBD患者和IL-10^-/-小鼠中的SAA水平的变化

图20显示分支杆菌挑战后IBD患者和IL-10^-/-小鼠中的SAA水平的变化。具有B6背景的IL-10^-/-小鼠接受200μl的单独乳脂乳(cream milk)(空白圆圈，对照)、含有10⁴CFUs的活的(填充圆圈)或热灭活(填充三角形)的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌(M.aviumparatuberculosis)的乳脂乳。通过ELISA 测量分支杆菌增强的结肠炎过程中以及IBD患者和健康供体的SAA水平。实验组由5只小鼠组成，并且实验重复3次。所提供的数据为SAA的平均值±SD浓度。星号(*)指示对照和分支杆菌处理组或健康供体和IBD患者之间具有统计学显著性差异，即p<0.01。

图20中的结果显示，使用活的分支杆菌挑战，除此之外在没有特异性病原体的条件下的小鼠当与使用热灭活的分支杆菌挑战的类似小鼠或对照小鼠相比时SAA水平经历了显著的上升。

实施例22：使用分支杆菌挑战的IL-10^-/-小鼠的肠组织学特性

图21显示了使用分支杆菌(Mycobacteria)挑战的IL-10^-/-小鼠的肠组织学特性。具有B6背景的IL-10^-/-小鼠接受200μl的单独乳脂乳(空白圆圈，对照)、含有10⁴CFU的活的(填充圆圈)或热灭活(填充三角形)的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌的乳脂乳。处死之后，将肠固定，切制6μm的切片，并使用苏木精和曙红染色。通过光学显微术检查切片。实验组由5只小鼠组成，并且实验重复3次。

使用分支杆菌挑战的肠组织显示在由淋巴细胞和偶有的多形核细胞组成的白细胞浸润的增加较高，并且在活的与热灭活的分支杆菌挑战组中的淋巴小结的频度较高(图21)。而且，与对照小鼠相比，在接受活的分支杆菌的小鼠中，结肠炎恶化更快，如大肠的多病灶病变和白细胞浸润的聚集所示。

实施例23：IC患者中的血清CXCL9、CXCL10和CXCL11浓度

图22显示了IC患者中的血清CXCL9、CXCL10和CXCL11浓度。图A：将来自IC患者(n＝32)和正常健康供体(n＝16)的血清分离并且通过能够检测大于10pg/ml的每种CXCR3配体的ELISA来评价CXCR3配体的存在。所提供的数据为IC患者和正常健康供体的平均CXCL9、CXCL10和CXCL11浓度± SEM。星号(＊)指示在健康供体和IC患者之间具有统计学显著性差异，即p< 0.01。图B：在CYP挑战之前两天施用对照或抗-CXCL10 Ab溶液，此后每两天施用对照或抗-CXCL10 Ab溶液。施用CYP五天后，通过ELISA测定CXCL9、 CXCL10和CXCL11的血清水平。所提供的数据为每组的平均浓度±SEM。星号(＊)指示未受影响的组和CYP诱导组之间具有统计学显著性(p<0.01)差异。三角形指示对照Ab处理和抗-CXCL10 Ab处理组(施用CYP)之间具有统计学显著性(p<0.01)差异。

如图22A所示，IC患者中的CXCL9和CXCL10的血清水平显著高于不受影响的健康供体的水平。特别是，对于IC患者和健康供体之间的血清水平差异，CXCL9(p<0.001)最大，CXCL10(p<0.01)和CXCL11(p>0.1)次之。这些CXCR3配体水平也与每个个体患者的病理学报告所示的疾病严重度相关 (尽管没有统计学显著性)(数据未示出)。而且，这些患者显示组织损伤的多病理学特征，这些组织损伤一般包括尿道上皮剥蚀、粘膜水肿和/或白细胞浸润。

小鼠中CYP诱导的膀胱炎导致CXCL10>>CXCL9的血清水平的实质性增加 (当与不受影响的对照的水平相比时)(图22B)。在采用IC患者中的CXCR3配体水平进行确认时，鼠科动物CXCL11水平在采用CYP诱导的组中没有显著变化。总之，患有CYP诱导膀胱炎的小鼠比不受影响的对照表达较高的血清 CXCL10>CXCL9，而IC患者显示出比不受影响的个体高的CXCL9>CXCL10血清水平。

实施例24：CYP诱导膀胱炎之后的组织学变化

图23显示了CYP诱导膀胱炎之后的组织学变化。在CYP处理之前两天施加对照或抗-小鼠CXCL10 Ab溶液，此后每两天施加。施加CYP五天后，将小鼠的膀胱固定，并切制6μm的切片，使用苏木精和曙红染色。这些切片在10X和100X的放大视图中进行显微检查。图A和C显示来自对照Ab处理小鼠的放大切片，而图B和D显示来自给予CYP以展示发炎膀胱的抗 -CXCL10 Ab处理的小鼠的类似切片，并且表征粘膜壁厚度、粘膜层增大、白细胞浸润和腺伸长中的差异。

给予CYP的对照Ab处理小鼠显示膀胱炎的病理学迹象(即，膀胱发炎，不连续的尿道上皮(uroepitheium)。然而，使用抗-CXCL10 Ab处理的受影响小鼠显示膀胱炎的减缓，如膀胱白细胞浸润的降低所示(图23)。对照Ab和抗-CXCL10 Ab-处理小鼠(患有CYP诱导膀胱炎)的组织学差异被认为是显著的，并且显示CXCL10阻断显著地减缓了CYP诱导的膀胱炎。

实施例25：CYP处理小鼠中的CXCR3、-9、-10和-11mRNA表达

图24显示了CYP处理小鼠中的CXCR3、-9、-10和-11mRNA表达。在CYP处理之前两天施用对照或抗小鼠CXCL10 Ab溶液，之后每两天施用。施用CYP之后5天，从小鼠的脾、回肠淋巴结或膀胱分离总RNA。图A：进行 CXCR3、CXCL9、CXCL10或CXCL11 mRNA表达的RT-PCR分析。图B：进行IFN-γ、 IL-12p40或TNF-αmRNA表达的RT-PCR分析。转录本的Log₁₀拷贝±SEM 相对于18S rRNA的真实拷贝表示。星号(＊)指示不受影响的组和CYP诱导组之间具有统计学显著性(p<0.01)差异。三角形指示对照Ab和抗-CXCL10 Ab 处理组(施加CYP)之间具有统计学显著性(p<0.01)差异。

如图24所示，小鼠中的CYP诱导的膀胱炎导致膀胱白细胞的CXCL10、 CXCL11和CXCR3 mRNA的表达有实质性的增加以及回肠淋巴结淋巴细胞的 CXCL9和CXCR3转录本的表达有适度增加(与正常未处理小鼠相比)。相反，来自CYP处理的小鼠的脾细胞中的这些IFN-γ和细胞核因子κB((NFκB) 可诱导的趋化因子和CXCR3 mRNA的表达与来自对照小鼠的类似细胞相比显著地降低。抗-CXCL10 Ab处理显著地降低了回肠淋巴结白细胞的CXCL9和CXCR3 mRNA的表达，并且减少了膀胱白细胞的CXCL9、CXCL10、CXCL11和 CXCR3 mRNA的产生。

为了研究CYP诱导的膀胱炎过程中Th1和炎性细胞因子表达中的局部和外周变化，通过定量RT-PCR分析测量从脾、回肠淋巴结和膀胱分离的由白细胞表达的IFN-γ、IL-12p40和TNF-αmRNA的水平。接受对照Ab的CYP 诱导小鼠显示脾细胞表达的IFN-γ、IL-12p40和TNF-αmRNA有实质性地降低；然而，这种处理显著地提高了膀胱白细胞表达的细胞因子(与不受影响的小鼠相比)(图24)。患有CYP诱导的膀胱炎的小鼠显示回肠淋巴结淋巴细胞表达的IFN-γmRNA增加(与来自不受影响的小鼠的类似细胞相比)。然而，来自患有膀胱炎的小鼠的膀胱淋巴细胞表达的IFN-γ、IL-12p40和 TNF-αmRNA在抗-CXCL10 Ab处理后与来自使用对照Ab处理的CYP诱导小鼠的类似细胞相比有显著的降低。

实施例26：活动性克罗恩氏症(CD)过程中血清CXCL10浓度

图25显示了活动性CD过程中CXCL10的上调表达。将来自CD患者(n＝120) 和正常健康供体(n＝30)(不经处理)的血清分离并评价CXCL10的存在。通过能够检测大于20pg/ml的CXCL10的ELISA分析确定CXCL10的水平。所提供的数据为CD患者和健康供体中的平均CXCL10浓度±SEM。星号指示两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.05(*)。

图25中的结果显示，CD患者与健康供体相比显示出致轻素和CXCL10有显著的上升。

实施例27：活动性克罗恩氏症过程中的血清CXCL11和CXCL9浓度

图26显示了活动性克罗恩氏症过程中CXCL11和CXCL9的上调表达。将来自CD患者(n＝120)和正常健康供体(n＝30)(不经处理)的血清分离并评价CXCL11 和CXCL9的存在。通过能够检测大于20pg/ml的每一种Th1细胞因子的ELISA 确定血清CXCL11和CXCL9的水平。所提供的数据为CD患者和健康供体中的平均CXCL11(图26A)和CXCL9(图26B)浓度±SEM。星号指示两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.05(*)。

图26中的结果显示，CD患者与健康供体相比显示出致轻素以及CXCL11 和CXCL9有显著的上升。

实施例28：活动性克罗恩氏症过程中血清淀粉样蛋白A(SAA)和IL-6的浓度

图27显示了CD患者中血清淀粉样蛋白A(SAA)和IL-6的上调血清浓度。将来自CD患者(n＝120)和正常健康供体(n＝30)(不经处理)的血清分离并评价 SAA和IL-6水平的存在。通过能够检测大于20pg/ml的SAA和IL-6浓度的ELISA确定血清SAA和IL-6的水平。所提供的数据为CD患者和健康供体中的平均SAA(图27A)和IL-6(图27B)浓度±SEM。星号指示两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.05(*)。这个数据与和CD的严重度对应的升高的 SAA和血清IL-6水平是一致的。

图27中的结果显示，CD患者与健康供体相比显示出SAA和IL-6有显著的上升。

实施例29：活动性克罗恩氏症过程中血清IL-12p40和IFN-γ水平相关

图28显示了CD过程中血清IL-12p40和IFN-γ水平相关。将来自CD患者(n＝120)和正常健康供体(n＝30)(不经处理)的血清分离并评价IL-12p40和 IFN-γ的存在。通过能够检测大于20pg/ml的每种细胞因子的ELISA确定血清IL-12p40和IFN-γ的水平。所提供的数据为来自CD患者和健康供体的血清中的平均IL-12p40(图28A)和IFN-γ(图28B)浓度±SEM。星号指示两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.05(*)。

图28中的结果显示，CD患者与健康供体相比显示出IL-12p40和IFN-γ有显著的上升。

实施例30：活动性克罗恩氏症过程中炎性细胞因子水平

图29显示了活动性CD过程中炎性细胞因子水平。将来自CD患者(n＝120) 和正常健康供体(n＝30)(不经处理)的血清分离并评价TNF-α和IL-1β的存在。通过能够检测大于20pg/ml的每种细胞因子的ELISA确定血清TNF-α和IL-1β的水平。所提供的数据为来自CD患者和健康供体的血清的平均 TNF-α(图29A)和IL-1β(图29B)浓度±SEM。星号指示两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.05(*)。

图29中的结果显示，CD患者与健康供体相比显示出TNF-α和IL-1β有显著的上升。

实施例31：正常和CD患者的结肠炎的组织学特性

图30显示了正常和CD患者(具有高血清CXCR3配体浓度)中的结肠炎的组织学特性。将来自正常健康供体和CD患者的结肠活组织检查的组织病理学固定，切制6μm的切片，并用苏木精和曙红染色。通过显微术检查切片。

图30显示，CD患者中的结肠展示正常和CD患者之间在隐窝畸形、白细胞浸润、腺伸长/过度生长和水肿上的差异。

实施例32：CD患者的结肠中的CXCL9、CXCL10、CXCL11和TNFα表达

图31显示了通过组织病理学检查正常和CD患者的结肠中的CXCR3配体和TNFα表达。将来自正常和CD患者的结肠冷冻、固定、切制6μm的切片，并且对CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-和TNFα-阳性细胞进行荧光染色。通过荧光共聚焦显微镜检查切片。

图31显示，来自CD患者的结肠显示与正常对照患者相比白细胞浸润有增加。这些显微照片进一步证实正常对照患者的结肠中CXCR3配体和TNFα表达的降低的免疫反应活性染色。

以上说明是为了教导本领域技术人员如何实施本发明的目的，并不是为了详细描述本发明的本领域技术人员在阅读上述说明后将会清楚的所有那些显而易见的改进和变化。然而，拟将所有这些显而易见的改进和变化包括在本发明的由所附权利要求限定的范围内。所述权利要求拟将覆盖有效地符合预期目的任意顺序的组分和步骤，除非上下文有明确的相反说明。在说明书中所引用的所有参考文献通过参引方式将其所有内容引入本文。

Claims (21)

1.至少一种抗-CXCL10抗体在制备用于治疗受试者中的炎性疾病的用途，所述炎性疾病选自由如下疾病组成的组：过敏性反应、脓毒性休克、骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、哮喘、变态反应、动脉粥样硬化、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病、青少年型糖尿病、移植物排斥反应、炎性肠病、肠炎、间质性膀胱炎、多发性硬化症、重症肌无力、格雷夫氏症、桥本氏甲状腺炎、肺炎、前列腺炎、银屑病、肾炎、肺炎、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎鼻炎、脊柱关节病、硬皮病、系统性红斑狼疮和甲状腺炎。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述至少一种抗体结合次级试剂施用。

3.如权利要求2所述的用途，其中，所述次级试剂选自由抗炎抗体、短干扰RNA(siRNA)、趋化因子和趋化因子受体结合试剂、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸、核酶、外部引导序列、试剂编码表达载体和小分子抗炎化合物组成的组。

4.如权利要求3所述的用途，其中，所述次级试剂包含抗细胞因子、趋化因子或它们的受体的抗体。

5.如权利要求3所述的用途，其中，所述次级试剂包含或编码抑制CXCL10表达的siRNA。

6.如权利要求3所述的用途，其中，所述次级试剂包含小分子抗炎化合物。

7.如权利要求6所述的用途，其中，所述小分子抗炎化合物是镇痛剂或非甾体抗炎药(NSAID)。

8.如权利要求1所述的方法，其中，所述受试者被诊断为患有导致CXCL10表达升高的炎性疾病。

9.如权利要求1所述的用途，其中，所述至少一种抗-CXCL10抗体以0.1pM至1μM范围内的kd值结合CXCL10。

10.如权利要求1所述的用途，其中，所述至少一种抗-CXCL10抗体以约10μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天的剂量范围施用。

11.抗炎试剂在制造治疗受试者中的炎性疾病的药物中的用途，所述抗炎试剂(1)抑制CXCL10的表达，或(2)抑制CXCL10与CXCR3、CXCL9或CXCL11中任一个之间的相互作用，或(3)抑制CXCL10的生物活性，

所述炎性疾病选自由如下疾病组成的组：过敏性反应、脓毒性休克、骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、哮喘、变态反应、动脉粥样硬化、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病、青少年型糖尿病、移植物排斥反应、炎性肠病、肠炎、间质性膀胱炎、多发性硬化症、重症肌无力、格雷夫氏症、桥本氏甲状腺炎、肺炎、前列腺炎、银屑病、肾炎、肺炎、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎鼻炎、脊柱关节病、硬皮病、系统性红斑狼疮和甲状腺炎。

12.如权利要求11所述的用途，其中，所述抗炎试剂包含特异性地结合CXCL10的一种抗体。

13.如权利要求11所述的用途，其中，所述抗炎试剂包含特异性地结合CXCL10的多种抗体。

14.如权利要求11所述的用途，其中，所述试剂包含或编码抑制CXCL10表达的siRNA。

15.如权利要求11所述的用途，其中，所述抗炎试剂与次级抗炎试剂联合施用。

16.如权利要求15所述的用途，其中，所述次级抗炎试剂是小分子抗炎化合物。

17.有效量的一种或多种抗-CXCL10抗体在制造增强抗炎治疗效果的药物中的用途。

18.如权利要求17所述的用途，其中，所述受试者已经显示出对抗炎试剂的抗性。

19.一种药物组合物，所述组合物包含：

一种或者多种抗-CXCL10抗体；和

药学可接受的载体。

20.如权利要求19所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含小分子抗炎化合物。

21.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述抗-CXCL10抗体以0.01pM至1M范围内的kd值结合CXCL10。

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