CN105039319A

CN105039319A - 用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物和荧光定量免疫pcr试剂盒

Info

Publication number: CN105039319A
Application number: CN201510373561.0A
Authority: CN
Inventors: 丁先锋; 王青; 郭江峰; 盛清; 傅枭男; 洪祝平
Original assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU; Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority date: 2015-06-22
Filing date: 2015-06-22
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明公开了用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物和荧光定量免疫PCR试剂盒。该生物标记物为CCL2基因、CCR1基因、CXCL10基因、CXCL11基因和IL2RG基因中的至少一种。本发明的五个基因均在pCR组中高表达，其中，IL2RG基因在pCR组和NpCR组中存在极显著的表达差异(P<0.01)，其他四个基因在pCR组和NpCR组中存在显著的表达差异(P<0.05)，而提示这五个基因能够作为生物标记物，用来预测乳腺癌新辅助化疗疗效，避免新辅助化疗盲目性。

Description

用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物和荧光定量免疫PCR试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物和荧光定量免疫PCR试剂盒。

背景技术

乳腺癌新辅助化疗(neoadjuvantchemotherapy，NACT)又称术前化疗(primarychemotherapy)，指对非转移性肿瘤在局部治疗前进行的全身性、系统性的细胞毒性药物治疗。该化疗方法不仅用于晚期乳腺癌并且越来越多的在早期病理状态下使用。NACT对可手术治疗的乳腺癌患者有以下3点作用：(1)达到病理完全缓解(pathologiccompleteremission，pCR)患者的长期生存期明显提高。pCR是乳腺癌NACT的一个有效评估指标，国际专家委员会推荐pCR定义为：新辅助化疗后，在乳腺和腋窝淋巴结均无浸润性癌组织残留。而新辅助化疗后，只要原发肿块或/和转移病灶仍有浸润性癌组织残留即划分为非pCR(Non-pathologiccompleteremission,NpCR)组。(2)降低肿瘤分期，局部进展期乳腺癌经过新辅助化疗可以提高切除率和增加保乳机会。(3)术前药敏试验，防止耐药克隆的出现。

NACT的临床运用已有30多年的历史，近年来虽然取得了较大进步，但随着研究的深入也发现了亟待解决的问题和不足：约20％的乳腺癌患者对NACT不敏感，对于这部分患者来说，如果NACT不敏感而疗程过长可能会延误局部治疗的时机，正是这个原因使部分医师和患者在开展NACT时过分保守，pCR率低于10％。这就需要一种精确的疗效预测指标，用以在化疗前预测NACT的疗效，避免治疗的盲目性。对NACT疗效有预测作用的相关指标的研究有助于选择可能从NACT中获益的病人进行术前化疗，提高乳腺癌NACT的病理完全缓解率和长期生存率，同时避免对化疗无效的病人进行不必要的术前化疗，以免延误其最佳的治疗时机。NACT能在短期内获得乳腺癌对化疗方案敏感性的信息，这个特点决定了其在预测辅助化疗的疗效方面具有更高的效率。因此乳腺癌NACT疗效预测体系的构建将使我们在更短的时间内能够对更多新的化疗药物在乳腺癌辅助化疗中的疗效进行预测。

由于目前尚无公认的可以有效预测乳腺癌NACT疗效的单一指标，因此联合多种潜在的预测指标对乳腺癌NACT的疗效进行预测将有效提高预测的准确性。随着基因芯片技术的成熟发展，使得我们可以对样本中数千个不同基因的表达同时进行有效的分析，以获取大规模的基因表达信息。目前芯片技术已被应用于乳腺癌NACT的疗效预测。基因芯片可以在乳腺癌活体组织或细胞系中检测一些已知的乳腺癌生物标志基因表达变化。所以利用基因芯片技术可以获取治疗前乳腺癌活检标本的基因表达谱，然后与NACT后pCR的相关性进行单因素分析，筛选出与NACT疗效相关的基因，同时联合那些被认为在单一状态下预测价值较弱的基因，从而建立基因水平的多因素预测体系，对乳腺癌NACT的疗效进行有效判断。

目前已报道了多个与乳腺癌NACT疗效相关的基因芯片分析模型，其中最具代表性的是MDAnderson肿瘤中心的含30个基因表达谱的乳腺癌NACT多基因分析预测模型，对含蒽环类药物和紫杉醇类药物NACT后pCR的预测方面有很高的准确性，其敏感性和阴性预测值显著高于相关的临床预测因子(92％vs.61％)和(96％vs.86％)，预测可获得pCR的13例病人中有12例获得病理完全缓解，其预测价值可以与ER对内分泌治疗和Her2对Herceptin治疗的预测价值相媲美。在此基础上该中心正在进行一项随机化的Ⅲ期临床研究来进一步验证该多基因预测模型在乳腺癌NACT疗效预测中的价值。

然而，全基因组芯片用于筛选NACT相关的基因存在以下不足：芯片设计时，本身覆盖了全基因范围内的基因探针以及肿瘤标本本身有很大的异质性结果导致芯片数据较高的FDR(FalseDiscoveryRate)值而难以鉴定到重要的基因。因此，分析NACT处理疗效相关的有生物学意义的基因通路而非单个基因显得十分可行，并已证明与NACT的结果相关。

例如公告号为CN103602746A的中国专利文献公开了一种预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物，该生物标记物是一种长非编码RNA，其在pCR组和NpCR组新鲜乳腺癌组织中存在差异(P<0.05),在NpCR组乳腺癌组织中的表达显著高于pCR组。提示该生物标记物可以用来预测新辅助化疗疗效，避免新辅助化疗盲目性。

继续寻找能够有效预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物对乳腺癌新辅助化疗具有重要意义。

发明内容

本发明提供了细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因在作为用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物中的应用，该细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因能够有效预测乳腺癌新辅助化疗疗效，避免新辅助化疗盲目性。

细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因在作为用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物中的应用，所述细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因为碱基序列如SEQIDNo.1的CCL2基因、碱基序列如SEQIDNo.2的CCR1基因、碱基序列如SEQIDNo.3的CXCL10基因、碱基序列如SEQIDNo.4的CXCL11基因和碱基序列如SEQIDNo.5的IL2RG基因中的至少一种。

本申请先收集乳腺癌患者进行新辅助化疗前的癌组织穿刺样本，再对患者进行新辅助化疗，并根据疗效区分pCR和NpCR组；对新辅助化疗前收集的癌组织穿刺样本进行高通量测序，分析筛选出在pCR和NpCR组中差异表达的基因，对筛选出的差异表达基因进行pathway分析，分离得到与乳腺癌NACT疗效显著相关的五个细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路(cytokine-cytokinereceptorinteractionpathway)相关基因，即CCL2基因、CCR1基因、CXCL10基因、CXCL11基因和IL2RG基因，这五个基因可作为生物标记物，用于测乳乳腺癌NACT疗效。

本发明还提供了用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物，是碱基序列如SEQIDNo.1的CCL2基因、碱基序列如SEQIDNo.2的CCR1基因、碱基序列如SEQIDNo.3的CXCL10基因、碱基序列如SEQIDNo.4的CXCL11基因和碱基序列如SEQIDNo.5的IL2RG基因中的至少一种。

本发明还提供了所述生物标记物在制备用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的PCR试剂盒中的应用。

作为优选，所述PCR试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。

本发明还提供了两种用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的荧光定量PCR试剂盒。

其一：基于Taqman探针法的荧光定量PCR试剂盒，包括针对所述生物标记物设计的特异性引物和Taqman探针，所述特异性引物和Taqman探针为以下①～⑤中的至少一组：

①针对CCL2基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-CAAGCAGAAGTGGGTTCAGGAT-3'；

下游引物：5'-TCTTCGGAGTTTGGGTTTGC-3'；

Taqman探针：5'-CATGGACCACCTGGACA-MGB-3'；

②针对CCR1基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-GACTCTTGGCACAGCATGGA-3'；

下游引物：5'-GCCACCATTACATTCCCTCTCT-3'；

Taqman探针：5'-TCACAGCCACTTGGGA-MGB-3'；

③针对CXCL10基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-TTCCTGCAAGCCAATTTTGTC-3'；

下游引物：5'-TCTTCTCACCCTTCTTTTTCATTGT-3'；

Taqman探针：5'-CGTGTTGAGATCATTGC-MGB-3'；

④针对CXCL11基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-GGTGGGTGAAAGGACCAAAA-3'；

下游引物：5'-ACTCCTTTGGGCAGTGGAATT-3'；

Taqman探针：5'-TCCTGAATGAATGACAATCA-MGB-3'；

⑤针对IL2RG基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-CTCTGTGGAAGTGCTCAGCATT-3'；

下游引物：5'-AGTATTGCTCCCCCAGTGGAT-3'；

Taqman探针：5'-TGAATGGAGCCACCC-MGB-3'。

其二：基于SYBRGreen荧光染料法的荧光定量PCR试剂盒，包括荧光染料以及针对所述生物标记物设计的特异性引物，所述特异性引物为以下⑥～⑩中的至少一对：

⑥针对CCL2基因设计的特异性引物：

上游引物：5'-CTCATAGCAGCCACCTTCATTC-3'；

下游引物：5'-ACCGCTTCTTTGGGACACTTG-3'；

⑦针对CCR1基因设计的特异性引物：

上游引物：5'-CCCATAGCCAATCAGTAGCC-3'；

下游引物：5'-TTAGGTCTCAACTCTTCCGTCAT-3'；

⑧针对CXCL10基因设计的特异性引物：

上游引物：5'-CAACAGCGGAACCTCCAGTCTC-3'；

下游引物：5'-CGGTCCTCCTTGAATGCCAC-3'；

⑨针对CXCL11基因设计的特异性引物：

上游引物：5'-AGCATTCCACTGCCCAAAGG-3'；

下游引物：5'-CGCTCCACCGTAACCACAGATAG-3'；

⑩针对IL2RG基因设计的特异性引物：

上游引物：5'-TTGGTAGCCGTGGTTATCTCT-3'；

下游引物：5'-ACACTCTCAGCCAGTCCCTTAG-3'。

上述两种荧光定量PCR试剂盒中均进一步包含有针对内参基因β-actin设计的特异性引物，该内参基因的特异性引物为：

上游引物：5'-GCATACACGAAACTACCTTCAACTCC-3'；

下游引物：5'-ATGGTGGTGCCGCCAGACA-3'。

此外，还可针对本发明的生物标记物涉及探针，用以制备用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物芯片。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明筛选到一组细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因，与NpCR组相比，这五个基因均在pCR组中高表达，其中，CCL2基因、CCR1基因、CXCL10基因、CXCL11基因在pCR组和NpCR组中存在显著的表达差异(P<0.05)，而IL2RG基因在pCR组和NpCR组中存在极显著的表达差异(P<0.01)，提示这五个细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因能够作为生物标记物，用来预测乳腺癌新辅助化疗疗效，避免新辅助化疗盲目性。

附图说明

图1A为pCR和NpCR组基因表达分布；

其中，“log₂₍readcountsforeachgene)inpCR”表示pCR组中基因的读长log₂值；“log₂₍readcountsforeachgene)inNpCR”表示NpCR组中基因的读长log₂值；pCR代表新辅助化疗后，在乳腺和腋窝淋巴结均无浸润性癌组织残留的样本组；NpCR代表新辅助化疗后，只要原发肿块或/和转移病灶仍有浸润性癌组织残留的样本组；下同；

图1B为pCR和NpCR组中分配到人转录本上的唯一性匹配的reads数分布；

其中，“log₂(Numberofreadsmappedtoagene)”表示比对到转录本片段的有效读长数的log₂值；

图2为数字基因表达谱测序差异表达基因聚类分析；

图3为荧光定量验证pCR组和NpCR组中差异基因的表达；

其中，“RelativeQuantification”表示相对表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1

在浙江省肿瘤医院接受治疗的20例未经NACT的乳腺癌患者穿刺癌组织获取乳腺癌组织样本，入组患者要求有明确的细胞学诊断，手术前未经任何治疗，且有完整的病理信息。

取样完成后对患者进行新辅助化疗，并根据疗效区分pCR组和NpCR组；同时对乳腺癌组织样本作如下处理：

1、乳腺癌组织总RNA提取

(1)总RNA提取

1)在较少RNase干扰的清洁区(所有用具均用1‰DEPC水擦拭)，研钵需200℃灭菌5个小时并冷却4个小时，称取离体乳腺组织样本约20mg至已倒有液氮预冷的研钵中，用杵棒研磨至粉末状(研磨不彻底则会严重影响的RNA的产量)；

2)加入700μlQIAzol裂解液至研钵中，继续研磨至无明显组织块的均匀液体，然后转移至无RNA酶的1.5mleppendorf管中；

3)冷冻离心机4℃，12000×g，离心10min以除去溶液中未裂解完全组织及细胞碎片；

4)小心吸取离心后的上清液，移至另一新的eppendorf管，切勿吸取下层细胞碎片残渣沉淀；

5)加入140μl氯仿，上下颠倒，剧烈振荡后静置2min；

6)冷冻离心机4℃离心，12000×g，15min，并将上层清液转移至一新的无RNA酶eppendorf管中；

7)加入1.5倍无水乙醇，涡旋混匀，完成组织裂解；

8)将所有液体全部转移至吸附柱中，并将吸附柱置于2ml的收集管内，8000×g离心15s，弃收集管中的滤液；

9)取700μl的RWT溶液至吸附柱中，8000×g离心15s，弃滤液；

10)取500μl的bufferRPE至吸附柱中洗涤，8000×g离心15s，弃滤液；

11)再次用500μl的bufferRPE洗涤吸附柱，8000×g离心2min，弃滤液及下层收集套管；

12)将吸附柱转移至一个新的2ml收集管中，全速离心1min；

13)弃下层收集管，把吸附柱移入新的1.5mleppendorf管中，加入45μlRNase-freewater洗脱吸附膜，静置1min，8000×g离心1min；

14)再次全速离心1min，得到总RNA。

(2)总RNA的定量和质量检测

利用Nanodrop2000检测乳腺组织RNA样本的含量，经OD值定量测定，以便计算目标基因反转录时所需要的RNA溶液的体积；经定性检测排除已降解的和DNA污染较严重的RNA样本，以保证后续实验的特异性。具体检测方法如下：

1)总RNA定量：在紫外分光光度计上测定260nm和280nm的OD值，并得出A260/A280，当其数值在1.8～2.0之间说明总RNA的纯度较好；当小于2.0说明有残余的盐离子和小分子杂志的污染，当大于2.0则说明可能总RNA的降解：

2)总RNA的完整性检测：1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离总RNA中的核糖体RNA(rRNA)，最大的两条条带28rRNA和18sRNA的亮度大致比为2:1时，说明RNA的完整性较好，未出现降解现象。

2、分离获取mRNA

使用ThermoFisher公司的Sera-magMagneticOligo(dT)Beads分离得到mRNA：向总RNA中加入NaOH将mRNA打断成短片段，并以此为模板，用RT引物合成第一条cDNA链。纯化回收RT产物后连接测序接头(5’DNA/DNAadaptor)，PCR扩增cDNA，6％TBEPAGEGel割胶回收300bp-500bp目的产物进行测序。

3、solexa测序

将已构建完成的RNA文库交至华大基因进行Solexa测序。采用的测序仪为HiSeq2000，策略为单末端测序，测50bp。高通量测序的数据分析主要包括匹配(mapping)，拼接(assembly)，测序序列定量以及下游功能分析。从原始数据到可用数据的具体的处理包括以下几个方面：

(1)测序质量评估：

高通量测序原始数据的质量是后续实验的重要基础，碱基质量值是衡量测序质量的重要指标。软件FastQC是较为成熟的对高通量测序数据进行质量控制的软件。碱基质量值用Q表示，其值越高代表碱基被出错的概率(P)越小，其计算公式为Q＝-10lgP，一般采用Q20和Q30这两个值评估，Q20即表示碱基测序出错的概率为1％，Q30表示碱基测序出错的概率为1‰。本实验采用的是HiSeq2000的1×50的单末端(Single-end)策略进行的，Illumina公司常用大于70％的碱基准确度到达Q30才可用于后续的实验分析。

(2)测序read低质量过滤

鉴于测序数据错误率对结果的影响，我们对原始数据进行去接头，去低质量，去污染等处理，得到Clean的序列数据，并对Clean序列进行长度分布统计。数据质量预处理步骤：

1)去除低质量read：质量阈值20(错误率＝1％)，比例阈值40％；

2)去除Reads中含N部分比例较大序列：比例阈值4％；

3)去除接头序列。

通过solexa测序技术所得数据，共检测到715条异常表达的基因，其中342条基因仅在NpCR组中高表达，而在pCR组中低表达；373条在NpCR组中低表达，而在pCR组中高表达。pCR组和NpCR组测序基因的表达分布见图1A和图1B。

4、显著差异表达基因的筛选

(1)差异表达基因GO富集分析

差异表达基因的筛选要符合两个标准：差异倍数为2倍以上，即|logFC|>1；pvalue<0.05。GO功能显著性富集分析给出与基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集的GO功能条目，从而给出差异表达基因与哪些生物学功能显著相关。该分析首先把所有差异表达基因向GeneOntology数据库(http://www.geneontology.org/)的各个term映射，计算每个term的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集。

2.差异表达基因KEGG富集分析

我们使用fishertest对差异表达基因进行KEGGPathway富集分析。KEGG功能显著性富集分析给出与基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集的KEGG的代谢通路，从而给出差异表达基因与哪些生物学功能显著相关。该分析首先把所有差异表达基因向KEGG数据库(www.genome.jp/kegg/)的各个pathway映射，计算每个pathway的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集。

通过solexa测序技术、GO富集分析和KEGG富集分析筛选出五个差异表达基因，筛选结果见表1。

表1

由表1可见，CCL2基因、CCR1基因、CXCL10基因、CXCL11基因和IL2RG基因均为细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因，这五个基因在pCR组中高表达而在NpCR组中低表达。

实施例2差异表达基因的荧光定量PCR分析

针对CCL2基因、CCR1基因、CXCL10基因、CXCL11基因和IL2RG基因，利用primer5.0进行荧光定量PCR引物设计，引物设计信息见表2。

表2用于荧光定量PCR的特异性引物

2.Real-TimePCR

1)cDNA第一链的合成

分别以组织中总RNA为模板进行反转录反应合成cDNA。

在新的200μl光学PCR八联管中依次加入以下试剂：

2)混匀后稍微离心于ABIPRISM7300中进行PCR反应，反应条件设置为:

两步法PCR扩增标准程序

Stage1：预变性

循环数：1

95℃30s

Stage2:PCR反应

循环数：40

95℃5s

60℃31s

3.数据的处理及分析

如图2所示，荧光定量PCR定量检测基因的相对表达变化量时，以β-actin为内参基因，来对目标基因进行归一化处理，以确保在相等的数量的样本中比较目标基因的表达量。表达量倍数的变化的公式为：

RQ＝2^-△△Ct，△△Ct＝(Ct₁-Ct₂)_pCR-(Ct₁-Ct₂)_NpCR；

其中，RQ代表相对表达量(RelativeQuantitation)，Ct₁代表荧光定量检测到的目标基因的Ct值，Ct₂代表荧光定量检测到的内参基因β-actin的Ct值；pCR代表新辅助化疗后，在乳腺和腋窝淋巴结均无浸润性癌组织残留的样本组，NpCR代表新辅助化疗后，只要原发肿块或/和转移病灶仍有浸润性癌组织残留的样本组。

定量中设置三次重复实验和阴性对照实验，定量样本中每个样本重复3次，阴性对照中不加入样本模板cDNA，而是用水代替，用于检测是否存在PCR污染或者较高的引物二聚体污染。

荧光定量得出的数据进行统计学分析，采用SPSS16.0统计学分析软件。目标基因在两个样本中的相对表达量分析采用levene’s卡方检验和independent-samplet检验，当P值＜0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异。当P值＜0.01时，认为结果在统计学上具有极显著性差异。目标基因在不同的乳腺癌患者组织中表达的差异性分析的直观表现通过绘制含误差线的柱状图实现(如图3)。

如图3所示，五个基因均在pCR组中高表达而在NpCR组中低表达，其中，CCL2基因、CCR1基因、CXCL10基因、CXCL11基因在pCR组和NpCR组中存在显著的表达差异(P<0.05)，而IL2RG基因在pCR组和NpCR组中存在极显著的表达差异(P<0.01)。

实施例3基于SYBRGreen荧光染料法的荧光定量PCR试剂盒

一种用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的荧光定量PCR试剂盒，包括表2所示的引物，以及Taq酶、dNTP等试剂。

采用本实施例所提供的试剂盒，基于DNA染料法的荧光定量PCR检测的使用方法如下：

在新的0.2μl光学PCR反应管中依次加入：

此试剂盒的价值在于通过患者的癌组织RNA样品，利用简单的DNA染料法检测五个细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因的表达水平，再通过该表达水平的差异程度预测乳腺癌患者进行NACT的疗效情况，从而减少不必要的治疗。因此该试剂盒投入生产实践，可在乳腺癌的NACT的疗效效果及乳腺癌的治疗选择情况中得到应用。

实施例4基于Taqman探针法的荧光定量PCR试剂盒

一种用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的荧光定量PCR试剂盒，包括以下①～⑤中至少一组特异性引物和Taqman探针：

①针对CCL2基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-CAAGCAGAAGTGGGTTCAGGAT-3'；

下游引物：5'-TCTTCGGAGTTTGGGTTTGC-3'；

Taqman探针：5'-CATGGACCACCTGGACA-MGB-3'；

②针对CCR1基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-GACTCTTGGCACAGCATGGA-3'；

下游引物：5'-GCCACCATTACATTCCCTCTCT-3'；

Taqman探针：5'-TCACAGCCACTTGGGA-MGB-3'；

③针对CXCL10基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-TTCCTGCAAGCCAATTTTGTC-3'；

下游引物：5'-TCTTCTCACCCTTCTTTTTCATTGT-3'；

Taqman探针：5'-CGTGTTGAGATCATTGC-MGB-3'；

④针对CXCL11基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-GGTGGGTGAAAGGACCAAAA-3'；

下游引物：5'-ACTCCTTTGGGCAGTGGAATT-3'；

Taqman探针：5'-TCCTGAATGAATGACAATCA-MGB-3'；

⑤针对IL2RG基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-CTCTGTGGAAGTGCTCAGCATT-3'；

下游引物：5'-AGTATTGCTCCCCCAGTGGAT-3'；

Taqman探针：5'-TGAATGGAGCCACCC-MGB-3'。

还包含有针对内参基因β-actin设计的特异性引物：

上游引物：5'-GCATACACGAAACTACCTTCAACTCC-3'；

下游引物：5'-ATGGTGGTGCCGCCAGACA-3'。

Claims

1.细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因在作为用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物中的应用，其特征在于，所述细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因为碱基序列如SEQIDNo.1的CCL2基因、碱基序列如SEQIDNo.2的CCR1基因、碱基序列如SEQIDNo.3的CXCL10基因、碱基序列如SEQIDNo.4的CXCL11基因和碱基序列如SEQIDNo.5的IL2RG基因中的至少一种。

2.用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物，其特征在于，是碱基序列如SEQIDNo.1的CCL2基因、碱基序列如SEQIDNo.2的CCR1基因、碱基序列如SEQIDNo.3的CXCL10基因、碱基序列如SEQIDNo.4的CXCL11基因和碱基序列如SEQIDNo.5的IL2RG基因中的至少一种。

3.如权利要求2所述生物标记物在制备用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的PCR试剂盒中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。

5.用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括针对权利要求2所述生物标记物设计的特异性引物和Taqman探针，所述特异性引物和Taqman探针为以下①～⑤中的至少一组：

①针对CCL2基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-CAAGCAGAAGTGGGTTCAGGAT-3'；

下游引物：5'-TCTTCGGAGTTTGGGTTTGC-3'；

Taqman探针：5'-CATGGACCACCTGGACA-MGB-3'；

②针对CCR1基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-GACTCTTGGCACAGCATGGA-3'；

下游引物：5'-GCCACCATTACATTCCCTCTCT-3'；

Taqman探针：5'-TCACAGCCACTTGGGA-MGB-3'；

③针对CXCL10基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-TTCCTGCAAGCCAATTTTGTC-3'；

下游引物：5'-TCTTCTCACCCTTCTTTTTCATTGT-3'；

Taqman探针：5'-CGTGTTGAGATCATTGC-MGB-3'；

④针对CXCL11基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-GGTGGGTGAAAGGACCAAAA-3'；

下游引物：5'-ACTCCTTTGGGCAGTGGAATT-3'；

Taqman探针：5'-TCCTGAATGAATGACAATCA-MGB-3'；

⑤针对IL2RG基因设计的特异性引物和Taqman探针：

上游引物：5'-CTCTGTGGAAGTGCTCAGCATT-3'；

下游引物：5'-AGTATTGCTCCCCCAGTGGAT-3'；

Taqman探针：5'-TGAATGGAGCCACCC-MGB-3'。

6.用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括荧光染料以及针对权利要求2所述生物标记物设计的特异性引物，所述特异性引物为以下⑥～⑩中的至少一对：

⑥针对CCL2基因设计的特异性引物：

上游引物：5'-CTCATAGCAGCCACCTTCATTC-3'；

下游引物：5'-ACCGCTTCTTTGGGACACTTG-3'；

⑦针对CCR1基因设计的特异性引物：

上游引物：5'-CCCATAGCCAATCAGTAGCC-3'；

下游引物：5'-TTAGGTCTCAACTCTTCCGTCAT-3'；

⑧针对CXCL10基因设计的特异性引物：

上游引物：5'-CAACAGCGGAACCTCCAGTCTC-3'；

下游引物：5'-CGGTCCTCCTTGAATGCCAC-3'；

⑨针对CXCL11基因设计的特异性引物：

上游引物：5'-AGCATTCCACTGCCCAAAGG-3'；

下游引物：5'-CGCTCCACCGTAACCACAGATAG-3'；

⑩针对IL2RG基因设计的特异性引物：

上游引物：5'-TTGGTAGCCGTGGTTATCTCT-3'；

下游引物：5'-ACACTCTCAGCCAGTCCCTTAG-3'。

7.如权利要求5或6所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，还包括内参基因β-actin的特异性引物，该内参基因β-actin的特异性引物为：

上游引物：5'-GCATACACGAAACTACCTTCAACTCC-3'；

下游引物：5'-ATGGTGGTGCCGCCAGACA-3'。