CN111500729B - 血浆lnc-SCA7在制备判断患者是否对新辅助化疗敏感的生物标志物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种血浆lnc‑SCA7在制备判断患者是否对新辅助化疗敏感的生物标志物中的应用，属于生物医学技术领域。本发明通过测定患者血浆中lnc‑SCA7的相对含量，即可将对新辅助化疗敏感的患者和对新辅助化疗不敏感的患者进行区分。

Description

血浆lnc-SCA7在制备判断患者是否对新辅助化疗敏感的生物 标志物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种血浆lnc-SCA7在制备判断患者是否对新辅助化疗敏感的生物标志物中的应用，并涉及用于该应用的试剂盒及其使用方法。

背景技术

胃癌是我国常见恶性肿瘤之一，造成了极大的经济社会负担。我国进展期胃癌占比大，术前新辅助化疗是进展期胃癌有效的治疗手段，新辅助化疗是指在实施局部治疗方法(如手术或放疗)前所做的全身化疗，目的是使肿块缩小、及早杀灭看不见的转移细胞，以利于后续的手术、放疗等治疗，其可以缩小肿瘤体积，提高手术根治性切除率，并减少肿瘤的微转移，可有效提高肿瘤患者生存时间。在美国NCCN指南、欧洲ESMO指南和中国卫健委《胃癌诊疗规范》中，新辅助化疗均被推荐为术前治疗策略之一。然而，并非所有患者均能从新辅助化疗中获益，因此，如何将对新辅助化疗敏感患者和对新辅助化疗不敏感患者进行区分是关键之处，可以有效避免新辅助化疗的副作用，并减少不敏感患者的经济花费。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供了血浆lnc-SCA7在制备判断患者是否对新辅助化疗敏感的生物标志物中的应用。

上述应用为测定血浆中lnc-SCA7的相对含量，若所述lnc-SCA7的相对含量≥1.1，患者对新辅助化疗敏感；若所述lnc-SCA7的相对含量<1.1，患者对新辅助化疗不敏感；其中所述 lnc-SCA7的相对含量的计算以GAPDH作为内参。

上述用于测定所述lnc-SCA7的含量的引物为：序列表中SEQ ID NO:2所示的上游引物 lnc-F和序列表中SEQ ID NO:3所示的下游引物lnc-R。

上述用于测定所述GAPDH的含量的引物为：序列表中SEQ ID NO:4所示的上游引物GAPDH-F和序列表中SEQ ID NO:5所示的下游引物GAPDH-R。

上述lnc-SCA7的相对含量的计算方法为相对定量法，计算公式为F＝2^-ΔΔct，其中，ΔΔct＝(患者血浆中lnc-SCA7的ct平均值-患者血浆中GAPDH的ct平均值)-(健康个体血浆中 lnc-SCA7的ct平均值-健康个体血浆中GAPDH的ct平均值)。

本发明另一方面提供用于上述的应用的试剂盒，其包括：

1）上述提及的上游引物lnc-F和下游引物lnc-R；

2）上述提及的上游引物GAPDH-F和下游引物GAPDH-R。

上述试剂盒还包括：

3)lnc-SCA7的相对含量的计算方法的说明：计算公式为F＝2^-ΔΔct，其中，ΔΔct＝(患者血浆中lnc-SCA7的ct平均值-患者血浆中GAPDH的ct平均值)-(健康个体血浆中lnc-SCA7 的ct平均值-健康个体血浆中GAPDH的ct平均值)；和

4)判断患者是否对新辅助化疗敏感的标准说明：若lnc-SCA7的相对含量≥1.1，患者对新辅助化疗敏感；若所述lnc-SCA7的相对含量<1.1，患者对新辅助化疗不敏感。

本发明再一方面提供了上述的试剂盒在非诊断目的中的使用方法，其包括以下步骤：

a)提取待测患者血浆和健康个体血浆的总RNA，逆转录合成cDNA；

b)以cDNA为模板，在所述引物lnc-F和lnc-R的引导下进行lnc-SCA7的实时荧光定量 PCR检测，在所述引物GAPDH-F和GAPDH-R的引导下进行GAPDH内参的实时荧光定量 PCR检测；

c)根据所述试剂盒提供的计算方法计算lnc-SCA7的相对含量。

上述使用方法还包括：

d)根据所述试剂盒提供的判断标准对待测患者是否对新辅助化疗敏感进行分组，若 lnc-SCA7的相对含量≥1.1，则将待测患者归于对新辅助化疗敏感组；若lnc-SCA7的相对含量 <1.1，则将待测患者归于对新辅助化疗不敏感组。

上述患者包括但不限于胃癌患者。

本发明提供了血浆lnc-SCA7在作为判断患者是否对新辅助化疗敏感的生物标志物中的新应用，该应用首先通过qRT-PCR方法测定患者血浆中lnc-SCA7的相对含量，然后可以利用血浆中lnc-SCA7的相对含量来区分对新辅助化疗敏感的患者和对新辅助化疗不敏感的患者，进而对患者进行分组，同时还提供了用于该应用的试剂盒及其使用方法。实施例结果表明：若血浆中lnc-SCA7的相对含量≥1.1，说明患者对新辅助化疗较为敏感，若血浆中lnc-SCA7 的相对含量<1.1，说明患者对新辅助化疗不敏感，进而实现将对新辅助化疗敏感患者和对新辅助化疗不敏感患者进行区分的目的。

附图说明

图1为实施例2中有效病例和无效病例两组患者的血浆中lnc-SCA7相对含量的统计分布图；

图2为根据实施例2中有效病例和无效病例两组患者的血浆中lnc-SCA7相对含量绘制的 ROC曲线。

具体实施方式

为了判断患者(以胃癌患者为例)是否对新辅助化疗敏感，本发明旨在提供一种能够作为判断患者是否对新辅助化疗敏感的生物标志物，并提供了用于检测该生物标志物在血浆中的相对含量的试剂盒及其使用方法，进而实现将敏感患者和不敏感患者进行区分的目的。

为了实现上述目的，本发明人考虑到长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA，是一类200个核苷酸长度的小RNA)可以调节胃癌细胞对化疗的敏感度，有潜力作为诊断和预后的生物标志物；并且lncRNA不但能在肿瘤组织中检测到，而且在众多体液中也能稳定存在，能耐受酸碱等极端环境；同时根据发明人之前的研究成果(Zhang K,Shi H,XiH,等. Genome-Wide lncRNA Microarray Profiling Identifies Novel CirculatinglncRNAs for Detection of Gastric Cancer.Theranostics.2017；7:213-227)借助生物芯片技术筛选获得了与胃癌相关的 lncRNA，发现五种新颖的血浆lncRNA(TINCR，CCAT2，AOC4P，BANCR和LINC00857) 的组合可作为胃癌检测的一组新型诊断生物标志物。随后发明人还以血浆lncRNA AOC4P为例探究了lncRNA分子机制(Zhang K,Lu C,Huang X,等.Longnoncoding RNA AOC4P regulates tumor cell proliferation and invasion byepithelial-mesenchymal transition in gastric cancer.Therap AdvGastroenterol.2019)，表明AOC4P在肿瘤组织中的表达水平显著高于非肿瘤组织。然而遗憾的是，这些血浆中存在的与胃癌相关的lncRNAs并不能作为胃癌患者对新辅助化疗是否敏感的有效生物标志物。

本发明人在一系列血浆lncRNA分子研究中意外发现，血浆lncRNA中的lnc-SCA7(RNA SCA7)可以作为判断肿瘤患者对新辅助化疗是否敏感的有效生物标志物，并在实施例中证明了lnc-SCA7确实可以作为判断患者对新辅助化疗是否敏感的有效生物标志物，从而来区分对新辅助化疗敏感的患者和对新辅助化疗不敏感的患者。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.， Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例1：血浆lnc-SCA7和内参GAPDH的检测引物

本例以血浆lnc-SCA7作为判断胃癌患者对新辅助化疗是否敏感的生物标志物，其中该 lnc-SCA7的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，检测lnc-SCA7在血浆中的含量时确定的引物为：

上游引物lnc-F：GGGCCTCCTTCGAAGTTTTAG(SEQ ID NO:2)；

下游引物lnc-R：TGTATCAAAGAGGCCCAATTGG(SEQ ID NO:3)；

本例选择GAPDH作为内参来计算血浆lnc-SCA7的相对含量，其中该内参GAPDH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，检测GAPDH在血浆中的含量时采用的引物为：

上游引物GAPDH-F：5'-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3'(SEQ ID NO:5)；

下游引物GAPDH-R：5'-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3'(SEQ ID NO:6)；

以上序列合成均由上海生工生物工程有限公司完成。

实施例2：基于血浆lnc-SCA7筛选对新辅助化疗敏感的胃癌患者

该实施例基于胃癌患者血浆中lnc-SCA7的相对含量来区分对新辅助化疗敏感的患者和对新辅助化疗不敏感的患者，具体包括以下步骤：

2.1、从50例拟接受新辅助化疗前的胃癌患者(平均年龄为59.6±5.1岁，男性35人，女性15人，其中II期18人，III期32人)中各获取血液5ml(所有血液样品均在中国人民解放军总医院完成，并得到了中国人民解放军总医院研究伦理委员会的批准)，通过梯度离心法(在4℃下2000g，10分钟；在4℃下12,000g，10分钟)分离血浆，利用RNA提取试剂盒(购自Qiagen)根据说明书从血浆中提取总RNA，随后使用逆转录试剂盒(购自Takara 公司)按照说明书将RNA逆转录成cDNA，然后通过qRT-PCR方法利用上述实施例1的引物lnc-F和lnc-R进行PCR反应实时测定血浆中的lnc-SCA7含量，同时利用引物GAPDH-F 和引物GAPDH-R实时测定血浆中GAPDH的含量，同步设置阴性对照，即分别测定健康个体血浆中的lnc-SCA7和GAPDH含量，其中20μL PCR反应体系为：2×聚合酶链反应预混液 (包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl₂，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR Green I)11μL，cDNA 1μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，无RNA酶水7μL； PCR反应程序为：95℃孵育5分钟，95℃，15s；60℃，40s；40个循环，并根据lnc-SCA7 的ct值标准化为GAPDH的表达值，该标准化的方法采用2^-ΔΔct相对定量法，计算公式为 F＝2^-ΔΔct，其中，ΔΔct＝(胃癌患者血浆中lnc-SCA7的ct平均值-胃癌患者血浆中GAPDH的 ct平均值)-(健康个体血浆中lnc-SCA7的ct平均值-健康个体血浆中GAPDH的ct平均值)，从而获得血浆中lnc-SCA7的相对含量。具体操作方法可参见文献“Zhang K,Shi H,Xi H,等. Genome-Wide lncRNA MicroarrayProfiling Identifies Novel Circulating lncRNAs for Detection of GastricCancer.Theranostics.2017；7:213-227”。随后对该50例胃癌患者施用新辅助化疗，统计其中的有效病例(即敏感病例)和无效病例(即不敏感病例)，并按照有效病例和无效病例两组对50例胃癌患者血浆中的lnc-SCA7相对含量进行分组，结果如下表1所示。

表1：有效病例和无效病例的血浆中lnc-SCA7的相对含量

2.2、对步骤2.1获得的分组结果数据进行统计分析(SPSS，版本22.0，IBM，美国，P值≤0.05被认为具有统计学意义)，如图1所示，示出了有效病例和无效病例两组的血浆中lnc-SCA7含量的统计结果，可见对新辅助化疗敏感的胃癌患者组(有效病例)血浆中lnc-SCA7 含量显著(P<0.05)高于对新辅助化疗敏感的胃癌患者组(无效病例)，证明可以通过测定血浆中lnc-SCA7含量来判断胃癌患者是否对新辅助化疗敏感，也证明血浆lnc-SCA7可以作为判断胃癌患者对新辅助化疗是否敏感的有效生物标志物。

2.3、ROC曲线绘制：根据上述步骤2.1和步骤2.2的测定结果和统计分析结果，确定测定值的上下限、组距以及截断点(cut-off point)，以敏感度为纵坐标，以1-特异度为横坐标作图，得到ROC曲线，如图2所示，可见其曲线下面积AUC＝0.87，证明该实施例通过测定血浆中lnc-SCA7的相对含量来判断胃癌患者对新辅助化疗是否敏感的结果可靠，即通过测定血浆中lnc-SCA7相对含量来判断胃癌患者对新辅助化疗是否敏感的准确率可达87％，具有较高的准确性。并且根据尤登指数确定最佳截断点取值为1.1(即血浆中lnc-SCA7相对含量为1.1)，其区分有效病例和无效病例的敏感度和特异度分别为83％和82％，具有非常好的区分效果。

本实施例结果证明了血浆lnc-SCA7可以作为判断胃癌患者对新辅助化疗是否敏感的有效生物标志物，即当测定获得的患者的血浆中lnc-SCA7的相对含量≥1.1时，说明患者对新辅助化疗较为敏感，当测定获得的患者的血浆中lnc-SCA7的相对含量<1.1时，说明患者对新辅助化疗不敏感。因此，通过测定血浆中lnc-SCA7的相对含量确实能够判断胃癌患者对新辅助化疗是否敏感，实现敏感患者和不敏感患者的区分，并具有较高的准确率。

实施例3：基于血浆lnc-SCA7判断患者是否对新辅助化疗敏感的试剂盒

基于以上实施例2的结果，即血浆lnc-SCA7可以作为判断胃癌患者对新辅助化疗是否敏感的有效生物标志物，可以获得用于判断患者(例如胃癌患者)是否对新辅助化疗敏感的试剂盒，其包括以下组分：

1)实施例1中所述的引物lnc-F和引物lnc-R以及使用说明书，其包括：20μL PCR反应体系可以为：2×聚合酶链反应预混液(包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl₂，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR Green I)11μL，cDNA 1μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，无RNA酶水7μL；反应程序可以为：95℃孵育5分钟，95℃，15s； 60℃，40s；40个循环；

2)实施例1中内参GAPDH的检测引物GAPDH-F和引物GAPDH-R；

试剂盒中还包含：

3)血浆lnc-SCA7的相对含量的计算方法：计算公式为F＝2^-ΔΔct，其中，ΔΔct＝(胃癌患者血浆中lnc-SCA7的ct平均值-胃癌患者血浆中GAPDH的ct平均值)-(健康个体血浆中 lnc-SCA7的ct平均值-健康个体血浆中GAPDH的ct平均值)；

4)判断患者是否对新辅助化疗敏感的标准(由实施例2获得)，即当测定获得的患者的血浆中lnc-SCA7的相对含量≥1.1时，说明患者对新辅助化疗较为敏感；当测定获得的患者的血浆中lnc-SCA7的相对含量<1.1时，即说明患者对新辅助化疗不敏感。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院

<120> 血浆lnc-SCA7在制备判断患者是否对新辅助化疗敏感的生物标志物中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3701

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggcgctctg aggggcggaa gcggagaggc ggggctaggc ccgacagggg agcggaagag 60

gcccaggagg ctgggtgagg cgctgagacg gtttggcggt gagtcctggg ccaggcgcag 120

ctgaaaggcc cgcaacccgg gaaacgtcaa aacaaacaga aggacttggg attccggagc 180

agtcgcccct atcgctgctc ctgcagttgc ggacgccacc gaccccgccg ccggaggact 240

gggcactgaa aggcctctag gcctaggcgc ggcccgcgga gccagacgtg ttgctgccgt 300

gagtaaaacg agcgccctct ccgcactcgt ttacaaatta aaatggagga aatttcgttg 360

gccaacctgg atactaacaa gctagaggcc atcgctcagg agatttacgt agacctgata 420

gaggattctt gtttgggatt ctgctttgag gtgcaccggg cagtcaagtg tggctacttc 480

tacctggagt tcgcagagac tggtagcgtg aaggattttg gcattcagcc agtggaagac 540

aaaggagcgt gccgcctccc gctttgctcc cttcccggag aacctgggaa tgggcctgat 600

cagcagctgc agcgctcacc tccggaattc cagtagctgc aaaatgagag tctgaaagtg 660

gccaggacaa taacatagac tggtcctgtg gcttcgagga gtaagctaag tagaaaaaag 720

tagaaaaatc agacaaaagt tttaattccc ccttgaagat cctagcattt aaaaacccaa 780

agtggataat ttaggaatcc tttttttaaa gtgtattacc tggagcaagc tctgaagccc 840

tgggcaggag gagctgcaca gcctgcgggc catgcagtgc ctgttgatct ctaaacacac 900

caggatgtgc gcaagatcct gtagtgcccc cagtgcacag gtgagcagtt gtgtgcccag 960

catataaaat ttttggttcc tcagcctttc tgtctgcctg atgtcaaggg cttcctggac 1020

agtttggacg ttacagttcg tcaggccgtg atcagtggcc tgcagtggga ctgctccttt 1080

gatatctgaa cctctgttat gggcttctct gagacaagta aatgtcaggt gcaagatctg 1140

gatactaaca gtttcagttt gggaaatcca agaaaaagaa ttatcaagtt tgatagggaa 1200

gctctgtagc cttgactcca gcaagaagaa aaggtcaaaa ccacgtgttt cccaaaagtc 1260

cagactacaa tgattcagct gacttgagga caaggcctag catttggctg agcagagccc 1320

tcttccttgc cctccaacct ggtggcatag gcttggcaaa tggacaactt ggttgtccag 1380

acaggttgag gattcggtta tgatcccctg gggaggtagc agggacctct gcaactatgc 1440

atgatttctc aaacttcaag attcatgtct ggatgtatta tgctgtggat ataagtttag 1500

tagggcggtc atttcctact ctgagttact ggttacctag ccagtccatg ggtgtgactt 1560

ggtccttaag tcaggtcact atctgcctcc caccctgggg gcaggactga agtatagaag 1620

agcatcatgg ctgtgcagga ggctgtggtt tgaaaactga gcccagaggg cactttcagc 1680

tgccctcaat aatgtgaatg gattagtgct aggagccaag gagcaggact ggattatctc 1740

atctgactgt gtgcagaatc ctgttgaatg tccctgtttt ctttggttgg gcagtcagag 1800

ctctgctatg gtgaacatcc agactgtcac cactttctgt ctgccgctcg aaagggatag 1860

tcctttccac tcggtcccct ttggatcttc ttgacaacag gagcagtcct tttattgtta 1920

gaagtcagag aaagacctcc agaatctcct gactttaggg aatggtatag gggaagatgg 1980

gaagtaagag tcacatatca aaactaccct ccactttatt ccctgagcga gggtttatga 2040

agtataaagg ggtgggagcc ccgaggtgag cgggaacggt gctgctttat ttgaaatgtt 2100

ttcttacctc attctgtgcc ccagtagggg gtccagcctc atctgtctgg cttggccctg 2160

tgttcctcct gtcccctgct ccactgccta tctggtgccc caggtgctgc ttgccactcc 2220

agctgtcaca ttgaacagtt tcaattcagc tcttaatgct cctgcttccg aagcctgccc 2280

aatttctttt ttcttggcct ctgttttttt tttttctttc tttttccctt gtttttgtag 2340

aagactcaga ggagaatctt tcttatggct ccctctgttg agattggaat tggaagagaa 2400

cttaattttt tgtatttaaa atgcagtgtc atgcctataa gcatttctcc tatataggac 2460

tgctttgcta gtgtgccctc ttgctgtgtc ttacttcata aggagttgta tcttcccacc 2520

tccatttcaa tactgccggt taggacctaa gtagaagagc agtaaaggct gattgacaca 2580

cagggggatg gagttggtcc ttgtccattc tctcaccctt gctgtgcatg tatcaatcct 2640

tatcccagaa ggtactattt agactgtata gactgattta gattacatac tttagaggat 2700

taaggaaacc atagagtttg ggccttggaa ctgttactgc cttgtcctag agttgtcctg 2760

atcaggcttg gggcctagtt acagattagt cttaaagaat tgcattaact taaaaaaaat 2820

caaaccttgg caagagctaa aataatttgg agatatcttt gcccttgact tgtagacgac 2880

atctaagagg atgaagaaag gagagtctaa gtgagactct ggcctacttc ctaacaatgt 2940

cttggaagtg ggatgatggt aaaggagaaa ggccacagtc caatccctct gccttcagat 3000

agggaactca aatcctgaaa ttactgtttt ctttctggcc ttttctcctg gttagaggag 3060

gaagcggaaa gtagttttga gtaatacttt gttcatatta cccccctttt gttttttgtt 3120

tctggcccct ctaccaatag ggcagtagcc tcctgccctg gatgggtata aggtgggctt 3180

ggtccaacag gtgcccagag ggtacatact cctttctggg gagagaatgc tccctaccat 3240

atagttgaca gtggttagga actctccctt tccctaccta ccttcctttt aatagcagaa 3300

ttcctatttt tcccttgatt atgtgtattg atcaccctgc aatcctatta tgtatctgag 3360

tgtgtgtgtg tgtgtatgtg tgtgttatgg gggaaggggg gggttcttta aaatttctgt 3420

ggtttgtggc tttttcttcc atacattagt tcccaccatc gcatgcccag ggaccactgc 3480

ctggcattat cgcatgctgg gatcatcggg ggagggtagt gaagctcacc actgtccttt 3540

gttttggaga tttttatttt tgcataagta gtccatccta tacagatagc tgattaactg 3600

tattcccctt tcccctatgg ctgctggtgt aaataaactg catctcccca ttggtaaaca 3660

gtaataaaat tttaaaaaat gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3701

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggcctcctt cgaagtttta g 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtatcaaag aggcccaatt gg 22

<210> 4

<211> 10880

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcctcatctc cccttcctgc agacagctcc tctcctacat caccaaggac aagcagacag 60

agagcctggt ggaaaagctg tgtcagcggt tccgcacatc ccggtatgct gccctccctg 120

agggttcttt gtgctgagcg gggccctgca ggggagaaag gcccatccct caccccttca 180

atgcccccac tgtggcatcc ctgggactgg ggaggctgat ggggaaggtt gagcctttac 240

tagctggatc tcccagttcc tcacaaagcc cttcctatct gcagaactga gcggcagcag 300

cgagacctgg cctactgtgt gtcacagctg cccctcacag agcgaggcct ccgtaagatg 360

cttgacaatt ttgactgttt tggagacaaa ctgtcagatg agtccatctt cagtgctttt 420

ttgtcagttg taggcaagct gcgacgtggg gccaagcctg agggcaaggt gagcagcaca 480

ggacacttca atgcctgttg ggttctgggc tggctaagac atctgccggc cctgggcagc 540

atacggctct tgcagtcacc ttcccgtcct ccttatcccc agctgggttg caaccaaatt 600

gccagagtga cctaagacca gatctttgtc tccagttctt tttttattac tccaaaaaca 660

caaccaaagc agcatctcat ccaattcttg tttgtttgtt tttaatagtt tttatttttc 720

agagcagttt taggttcaaa gcaaaattga gcagaaagta cagggagttc ccttctaccc 780

cttgccccta cacatcacag ccttccccac cttcaacatc ctgcaccagg gtggcacatt 840

tgttacagct gaacctacac ttacacatca tctcctaaag tcatggttta ccttggagtt 900

cactgcacgt aatgacatgt acccaccatt gcagtatcat acagaagagt ttcactgcct 960

tacaaatccc ctgcactcca cctatttatc cctctctccc cacaacccct gatcttttta 1020

ctgttgccat cactttgtct tttccagaat gtatcattgg aatgatccgg tatggagcct 1080

tctcaccttg gcttcttagt aatgtgcgtt taaggcctcc atgtcttcca tggccttgtt 1140

tctttttaat cagaagtaac tgttttcagg cctgctctga atctcctttt ctccctccag 1200

gctataatag atgaatttga gcagaagctt cgggcctgtc ataccagagg tttggatgga 1260

atcaaggagc ttgagattgg ccaagcaggt agccagagag cgccatcagc caagaaacca 1320

tccactggta cgtaaggcag cctgtgcggg cgagaccaga ctgggccctc ccctcctgca 1380

gtgatttgtt tcttcttctt ttttaaatca cgttttcctg ccttttctag gttctaggta 1440

ccagcctctg gcttctacag cctcagacaa tgactttgtc acaccagagc cccgccgtac 1500

tacccgtcgg catccaaaca cccagcagcg agcttccaaa aagaaaccca aagttgtctt 1560

ctcaagtgat gagtccagtg aggaaggtat gatgctcccg cctgttcccg gccgagaagg 1620

cacacagcta gggtgcagag ggctggtttc cataggacct gctgcggggg cctgagtgta 1680

gatgctctgc cccactgccg cagaagggcc tctcctgtac agcttggatt ttatttcttc 1740

tgtgcggtgt gggattgtct cacttgttct ctgatatcta ttttttcacc atctttgtga 1800

ctcagctttt tcttattcct ttaattcttt gcatagatct ttcagcagag atgacagaag 1860

acgagacacc caagaaaaca actcccattc tcagagcatc ggctcgcagg cacagatcct 1920

aggaagtctg ttcctgtcct ccctgtgcag ggtatcctgt agggtgacct ggaattcgaa 1980

ttctgtttcc cttgtaaaat atttgtctgt ctcttttttt taaaaaaaaa aaaggccggg 2040

cactgtggct cacgcctgta atcccagcac tttgcgatac caaggcgggt ggataacctg 2100

aggtagggag ttcgagacca gcctgaccaa catggagaaa ccccatctct actaaaaata 2160

aaaaattagc cgggcgtatt ggcgtgcgcc tgtaatccca gctactcaag aggctgaggc 2220

aggagaatcg cctgaaccca gaggcggagg ttgtagtgag ccgaaatcac accattgcac 2280

tccagcttgg gcaacaatag cgaacctcca tctcaaatta aaaaaaaaat gcctacacgc 2340

tctttaaaat gcaaggcttt ctcttaaatt agcctaactg aactgcgttg agctgcttca 2400

actttggaat atatgtttgc caatctcctt gttttctaat gaataaatgt ttttatatac 2460

ttttagacat tttttcctaa gcttgtcttt gtttcatctt tcacattagc ccagtttcat 2520

gcagcagaga gagggttatc agtgcagaga gagatgagtg agcccagagt cctagggcct 2580

gtcccgggat ggcagatgag cttcctgccc cgtcactgcc acctttcccc tctcaacctc 2640

tggaccctgc acagtgacca gacagcctct ctggggagaa ttatgcagtg cctaggctcc 2700

agatcagtgc ttctgaaccg ggggcaattt tgtctgccag aggacatctg acaacacctg 2760

gggcctgttt tgttgtcata gcctataggg gaagaatgct accagcattt gtgggaagag 2820

gccagggatg tggctcaaca tcctgcagtg cacaggatgg cccctcaaca aagaatcaca 2880

cggcccacaa tgtcaatagc gtcacagttg agaaaacctg ctctagacca agggttgctt 2940

tctgccgtgt gcctcacccc acccccactc gtgttcccta atcccatctc caaaggttgg 3000

cagcagaccg gcccaggctc gtggaagttc agatcatgat cccctccagc tctgcaggag 3060

acaagacctg tctcccagca ttcctcattg ttcccgggtc tgcagagggc gtgagctatg 3120

ctgcaggcgg gctgccccct gaagcctgcg cacccctctc cagctcctca agtcttctct 3180

gctgagtcac cttcgaaccg gaggctgtga gctggctgtc gtgaccacac tggtgcctct 3240

gctgtcatga caacagcaca ctacgtcagt agtgctccct gggcactgag ctccctcttt 3300

gcggggagaa gacagtaatg aaaaatgaca agcatgaggc agaggggaag atcacgcttg 3360

ggtggtgcag gagcatggag gtgctcttaa tgctctcaat gagaaagggt taacggtcct 3420

ggttgcagga atagctgagt cagaggtggg gcttcctcca ctcccccacc ccaccccttt 3480

caccattagg gaccttcttg ccttgctctt gctactctgc tctgggtggt cattgtgaaa 3540

agcccgcacc aaccatgcca gtggcagcca gacgaggaca cagcctggct ctgggtccca 3600

gcaggaaagg caatcccaga aaggcagggt cagggactgg agtcctgtgg gtgcttttta 3660

agcaaagatt atcaccaggc aggctaaact tagcaaccgg cttttagcta gaagggcagg 3720

gggctggtgt caggttatgc tgggccagca aagaggcccg ggatccccct cccatgcacc 3780

tgctgatggg ccaaggccac cccaccccac ccccttcctt acaagtgttc agcaccctcc 3840

catcccacac tcacaaacct ggccctctgc cctcctacca gaagaatgga tcccctgtgg 3900

gagggggcag gggacctgtt cccaccgtgt gcccaagacc tcttttccca ctttttccct 3960

cttcttgact caccctgccc tcaatatccc ccggcgcagc cagtgaaagg gagtccctgg 4020

ctcctggctc gcctgcacgt cccagggcgg ggagggactt ccgccctcac gtcccgctct 4080

tcgccccagg ctggatggaa tgaaaggcac actgtctctc tccctaggca gcacagccca 4140

caggtttcca ggagtgcctt tgtgggaggc ctctgggccc ccaccagcca tcctgtcctc 4200

cgcctggggc cccagcccgg agagagccgc tggtgcacac agggccggga ttgtctgccc 4260

taattatcag gtccaggcta cagggctgca ggacatcgtg accttccgtg cagaaacctc 4320

cccctccccc tcaagccgcc tcccgagcct ccttcctctc caggccccca gtgcccagtg 4380

cccagtgccc agcccaggcc tcggtcccag agatgccagg agccaggaga tggggagggg 4440

gaagtggggg ctgggaagga accacgggcc cccgcccgag gcccatgggc ccctcctagg 4500

cctttgcctg agcagtccgg tgtcactacc gcagagcctc gaggagaagt tccccaactt 4560

tcccgcctct cagcctttga aagaaagaaa ggggaggggg caggccgcgt gcagccgcga 4620

gcggtgctgg gctccggctc caattcccca tctcagtcgt tcccaaagtc ctcctgtttc 4680

atccaagcgt gtaagggtcc ccgtccttga ctccctagtg tcctgctgcc cacagtccag 4740

tcctgggaac cagcaccgat cacctcccat cgggccaatc tcagtccctt cccccctacg 4800

tcggggccca cacgctcggt gcgtgcccag ttgaaccagg cggctgcgga aaaaaaaaag 4860

cggggagaaa gtagggcccg gctactagcg gttttacggg cgcacgtagc tcaggcctca 4920

agaccttggg ctgggactgg ctgagcctgg cgggaggcgg ggtccgagtc accgcctgcc 4980

gccgcgcccc cggtttctat aaattgagcc cgcagcctcc cgcttcgctc tctgctcctc 5040

ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagg tgaagacggg cggagagaaa 5100

cccgggaggc tagggacggc ctgaaggcgg caggggcggg cgcaggccgg atgtgttcgc 5160

gccgctgcgg ggtgggcccg ggcggcctcc gcattgcagg ggcgggcgga ggacgtgatg 5220

cggcgcgggc tgggcatgga ggcctggtgg gggaggggag gggaggcgtg tgtgtcggcc 5280

ggggccacta ggcgctcact gttctctccc tccgcgcagc cgagccacat cgctcagaca 5340

ccatggggaa ggtgaaggtc ggagtcaacg ggtgagttcg cgggtggctg gggggccctg 5400

ggctgcgacc gcccccgaac cgcgtctacg agccttgcgg gctccgggtc tttgcagtcg 5460

tatgggggca gggtagctgt tccccgcaag gagagctcaa ggtcagcgct cggacctggc 5520

ggagccccgc acccaggctg tggcgccctg tgcagctccg cccttgcggc gccatctgcc 5580

cggagcctcc ttcccctagt ccccagaaac aggaggtccc tactcccgcc cgagatcccg 5640

acccggaccc ctaggtgggg gacgctttct ttcctttcgc gctctgcggg gtcacgtgtc 5700

gcagaggagc ccctccccca cggcctccgg caccgcaggc cccgggatgc tagtgcgcag 5760

cgggtgcatc cctgtccgga tgctgcgcct gcggtagagc ggccgccatg ttgcaaccgg 5820

gaaggaaatg aatgggcagc cgttaggaaa gcctgccggt gactaaccct gcgctcctgc 5880

ctcgatgggt ggagtcgcgt gtggcgggga agtcaggtgg agcgaggcta gctggcccga 5940

tttctcctcc gggtgatgct tttcctagat tattctctgg taaatcaaag aagtgggttt 6000

atggaggtcc tcttgtgtcc cctccccgca gaggtgtggt ggctgtggca tggtgccaag 6060

ccgggagaag ctgagtcatg ggtagttgga aaaggacatt tccaccgcaa aatggcccct 6120

ctggtggtgg ccccttcctg cagcgccggc tcacctcacg gccccgccct tcccctgcca 6180

gcctagcgtt gacccgaccc caaaggccag gctgtaaatg tcaccgggag gattgggtgt 6240

ctgggcgcct cggggaacct gcccttctcc ccattccgtc ttccggaaac cagatctccc 6300

accgcaccct ggtctgaggt taaatatagc tgctgacctt tctgtagctg ggggcctggg 6360

ctggggctct ctcccatccc ttctccccac acacatgcac ttacctgtgc tcccactcct 6420

gatttctgga aaagagctag gaaggacagg caacttggca aatcaaagcc ctgggactag 6480

ggggttaaaa tacagcttcc cctcttccca cccgccccag tctctgtccc ttttgtagga 6540

gggacttaga gaaggggtgg gcttgccctg tccagttaat ttctgacctt tactcctgcc 6600

ctttgagttt gatgatgctg agtgtacaag cgttttctcc ctaaagggtg cagctgagct 6660

aggcagcagc aagcattcct ggggtggcat agtggggtgg tgaataccat gtacaaagct 6720

tgtgcccaga ctgtgggtgg cagtgcccca catggccgct tctcctggaa gggcttcgta 6780

tgactggggg tgttgggcag ccctggagcc ttcagttgca gccatgcctt aagccaggcc 6840

agcctggcag ggaagctcaa gggagataaa attcaacctc ttgggccctc ctgggggtaa 6900

ggagatgctg cattcgccct cttaatgggg aggtggccta gggctgctca catattctgg 6960

aggagcctcc cctcctcatg ccttcttgcc tcttgtctct tagatttggt cgtattgggc 7020

gcctggtcac cagggctgct tttaactctg gtaaagtgga tattgttgcc atcaatgacc 7080

ccttcattga cctcaactac atggtgagtg ctacatggtg agccccaaag ctggtgtggg 7140

aggagccacc tggctgatgg gcagcccctt cataccctca cgtattcccc caggtttaca 7200

tgttccaata tgattccacc catggcaaat tccatggcac cgtcaaggct gagaacggga 7260

agcttgtcat caatggaaat cccatcacca tcttccagga gtgagtggaa gacagaatgg 7320

aagaaatgtg ctttggggag gcaactagga tggtgtggct cccttgggta tatggtaacc 7380

ttgtgtccct caatatggtc ctgtccccat ctccccccca cccccatagg cgagatccct 7440

ccaaaatcaa gtggggcgat gctggcgctg agtacgtcgt ggagtccact ggcgtcttca 7500

ccaccatgga gaaggctggg gtgagtgcag gagggcccgc gggaggggaa gctgactcag 7560

ccctgcaaag gcaggacccg ggttcataac tgtctgcttc tctgctgtag gctcatttgc 7620

aggggggagc caaaagggtc atcatctctg ccccctctgc tgatgccccc atgttcgtca 7680

tgggtgtgaa ccatgagaag tatgacaaca gcctcaagat catcaggtga ggaaggcagg 7740

gcccgtggag aagcggccag cctggcaccc tatggacacg ctcccctgac ttgcgccccg 7800

ctccctcttt ctttgcagca atgcctcctg caccaccaac tgcttagcac ccctggccaa 7860

ggtcatccat gacaactttg gtatcgtgga aggactcatg gtatgagagc tggggaatgg 7920

gactgaggct cccacctttc tcatccaaga ctggctcctc cctgccgggg ctgcgtgcaa 7980

ccctggggtt gggggttctg gggactggct ttcccataat ttcctttcaa ggtggggagg 8040

gaggtagagg ggtgatgtgg ggagtacgct gcagggcctc actccttttg cagaccacag 8100

tccatgccat cactgccacc cagaagactg tggatggccc ctccgggaaa ctgtggcgtg 8160

atggccgcgg ggctctccag aacatcatcc ctgcctctac tggcgctgcc aaggctgtgg 8220

gcaaggtcat ccctgagctg aacgggaagc tcactggcat ggccttccgt gtccccactg 8280

ccaacgtgtc agtggtggac ctgacctgcc gtctagaaaa acctgccaaa tatgatgaca 8340

tcaagaaggt ggtgaagcag gcgtcggagg gccccctcaa gggcatcctg ggctacactg 8400

agcaccaggt ggtctcctct gacttcaaca gcgacaccca ctcctccacc tttgacgctg 8460

gggctggcat tgccctcaac gaccactttg tcaagctcat ttcctggtat gtggctgggg 8520

ccagagactg gctcttaaaa agtgcagggt ctggcgccct ctggtggctg gctcagaaaa 8580

agggccctga caactctttt catcttctag gtatgacaac gaatttggct acagcaacag 8640

ggtggtggac ctcatggccc acatggcctc caaggagtaa gacccctgga ccaccagccc 8700

cagcaagagc acaagaggaa gagagagacc ctcactgctg gggagtccct gccacactca 8760

gtcccccacc acactgaatc tcccctcctc acagttgcca tgtagacccc ttgaagaggg 8820

gaggggccta gggagccgca ccttgtcatg taccatcaat aaagtaccct gtgctcaacc 8880

agttacttgt cctgtcttat tctagggtct ggggcagagg ggagggaagc tgggcttgtg 8940

tcaaggtgag acattcttgc tggggaggga cctggtatgt tctcctcaga ctgagggtag 9000

ggcctccaaa cagccttgct tgcttcgaga accatttgct tcccgctcag acgtcttgag 9060

tgctacagga agctggcacc actacttcag agaacaaggc cttttcctct cctcgctcca 9120

gtcctaggct atctgctgtt ggccaaacat ggaagaagct attctgtggg cagccccagg 9180

gaggctgaca ggtggaggaa gtcagggctc gcactgggct ctgacgctga ctggttagtg 9240

gagctcagcc tggagctgag ctgcagcggg caattccagc ttggcctccg cagctgtgag 9300

gtcttgagca cgtgctctat tgctttctgt gccctcgtgt cttatctgag gacatcgtgg 9360

ccagccccta aggtcttcaa gcaggattca tctaggtaaa ccaagtacct aaaaccatgc 9420

ccaaggcggt aaggactata taatgtttaa aaatcggtaa aaatgcccac ctcgcatagt 9480

tttgaggaag atgaactgag atgtgtcagg gtgacttatt tccatcatcg tccttagggg 9540

aacttgggta ggggcaaggc gtgtagctgg gacctaggtc cagacccctg gctctgccac 9600

tgaacggctc agttgctttg ggcagttact cccgggcctc actttgcacg tgtgcttacc 9660

tagtggagac aaaagtacat acctcggtag agcgcgcacg cctgtaaccc cagcactttg 9720

ggaggccaag gtgggtgtat cacctgaggt caggagtttg agaccagcct ggccaacatg 9780

gtgaaactcc gtctctacta aaattacaaa aatcagccag gcttcatggc acatgcctat 9840

agtcccagct acaggcatgc tgaagcagga gaatcgcttg caccccggag gcagaggctg 9900

cagtgagctg agaccacacc actgcactcc agcctaggca acagagtatg agactccatc 9960

tcaaaaaaaa aaaaagtacc tacctcagag ttcaaactag tgaatattag gaagtgcttg 10020

agacagtgac accaaagtgc acaataaata ctcgccagtt tcattattat taaagaatcc 10080

atttgaatgt cagctcaaca cagcctccta taccgaggca ttgtgaaccg catctcccca 10140

gcttctccag gcttttccaa gaatcaggga cactgtagcc tgttggtctc agtgtatgac 10200

agacacggag gaagcacatc tttagctgat acttaaacag agaccctgag cgcacataca 10260

cccgcgcaca catgcatgga gcttcacctt ctctgtcatt ctgcagtgac caggagagca 10320

agagctccca cctcccttca aaacactgtg cccatcccgg gcactaaggc ctctttaaag 10380

cacggcacct ccacgaggga gggccacagc cacatacact ccacctggca ggtggacagc 10440

gtgagcacgt ggaccatagc agggacaagg tgccccggcc agccccaacg ccctctgccg 10500

ctgacaggga cagaagccct ctccagctgc gtgtgctgca gaggccatgc gtagcctcca 10560

gctgcattct attccactcc agtgcctggg ccagttagca ccagtgtgga agacagtgag 10620

ctggctccgg acaacaggga tggaggaaag gtcccacatt cacattcctg atacgtggac 10680

aaggtgaggg gccgcaatcg ctctggcagc attttaaaga tggggaagta gcagacaccc 10740

acgcgtgaag gcaggagagc cccaactgtg gtggaaatgg ccccagaatg gtagggccaa 10800

gcctagctcc agacacccca gagccctgga gaagccaaga ctgagggaga aagcctgagg 10860

gaggagcgcc ccagtcccca 10880

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgggaaact gtggcgtgat gg 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

Claims (7)

1.测定血浆中lnc-SCA7的相对含量的试剂在制备判断胃癌患者是否对新辅助化疗敏感的试剂盒中的应用；

所述lnc-SCA7的相对含量的计算方法为相对定量法，计算公式为F=2^-∆∆ct，其中，∆∆ct=（患者血浆中lnc-SCA7的ct平均值−患者血浆中GAPDH的ct平均值）−（健康个体血浆中lnc-SCA7的ct平均值−健康个体血浆中GAPDH的ct平均值）。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为测定血浆中lnc-SCA7的相对含量，若所述lnc-SCA7的相对含量≥1.1，患者对新辅助化疗敏感；若所述lnc-SCA7的相对含量<1.1，患者对新辅助化疗不敏感；其中所述lnc-SCA7的相对含量的计算以GAPDH作为内参。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于测定所述lnc-SCA7的含量的引物为：序列表中SEQ ID NO:2所示的上游引物lnc-F和序列表中SEQ ID NO:3所示的下游引物lnc-R。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于测定所述GAPDH的含量的引物为：序列表中SEQ ID NO:4所示的上游引物GAPDH-F和序列表中SEQ ID NO:5所示的下游引物GAPDH-R。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述试剂盒包括：

1）权利要求3提及的上游引物lnc-F和下游引物lnc-R；

2）权利要求4提及的上游引物GAPDH-F和下游引物GAPDH-R。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述试剂盒还包括：

3）lnc-SCA7的相对含量的计算方法的说明：计算公式为F=2^-∆∆ct，其中，∆∆ct=（患者血浆中lnc-SCA7的ct平均值−患者血浆中GAPDH的ct平均值）−（健康个体血浆中lnc-SCA7的ct平均值−健康个体血浆中GAPDH的ct平均值）；和

4）判断患者是否对新辅助化疗敏感的标准说明：若lnc-SCA7的相对含量≥1.1，患者对新辅助化疗敏感；若所述lnc-SCA7的相对含量<1.1，患者对新辅助化疗不敏感。

7.根据权利要求1所述的应用，测定血浆中lnc-SCA7的相对含量包括以下步骤：

a）提取待测患者血浆和健康个体血浆的总RNA，逆转录合成cDNA；

b）以cDNA为模板，在权利要求3提及的引物lnc-F和lnc-R的引导下进行lnc-SCA7的实时荧光定量PCR检测，在权利要求4提及的引物GAPDH-F和GAPDH-R的引导下进行GAPDH内参的实时荧光定量PCR检测；

c）根据权利要求1提及的计算方法计算lnc-SCA7的相对含量。

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