KR102578551B1 - 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법 - Google Patents

편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102578551B1
KR102578551B1 KR1020177010586A KR20177010586A KR102578551B1 KR 102578551 B1 KR102578551 B1 KR 102578551B1 KR 1020177010586 A KR1020177010586 A KR 1020177010586A KR 20177010586 A KR20177010586 A KR 20177010586A KR 102578551 B1 KR102578551 B1 KR 102578551B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
expression level
sim2
cell carcinoma
squamous cell
Prior art date
Application number
KR1020177010586A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170058984A (ko
Inventor
히로키 사사키
가즈히코 아오야기
마나부 무토
히루 다카하시
Original Assignee
국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터
고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
시스멕스 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터, 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠, 시스멕스 가부시키가이샤 filed Critical 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터
Publication of KR20170058984A publication Critical patent/KR20170058984A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102578551B1 publication Critical patent/KR102578551B1/ko

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법이며, 하기 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 방법 (a) 피검체로부터 분리된 편평상피암 시료에 대해, SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨을 검출하는 공정, (b) 공정 (a)에서 검출된 발현 레벨을 각 유전자의 기준 발현 레벨과 비교하는 공정, (c) 공정 (b)에 있어서의 비교 결과, 상기 피검체에 있어서의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 높은 경우, 상기 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성은 높다고 판정하는 공정.

Description

편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법{METHOD FOR EVALUATING EFFICACY OF CHEMORADIOTHERAPY IN SQUAMOUS-CELL CARCINOMA}
본 발명은 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법, 또는 해당 방법에 이용되는 약제에 관한 것이다.
편평상피암은 편평 중층 상피 등의 기저 세포가 악성화한 것이며, 주로 식도암, 두경부암, 자궁 경부암, 폐암 등에서 볼 수 있다.
특히, 식도암에 있어서, 동아시아의 황색 인종에서는 편평상피암이 90％ 이상을 차지하고, 구미의 백인종에서도 편평상피암이 또 하나의 식도암인 선상피암보다도 많다. 이 2종의 암, 편평상피암과 선상피암은, 병리 조직으로부터도 발생 계보로부터도 다른 것이다. 그러나, 이 2종의 식도암은 현재 동일한 치료가 행해지고 있고, 병기가 II, III기인 국소 진행암의 표준 치료는, 일본에서는 수술 전 보조 화학 요법(CT, chemotherapy)과 근치적 화학 방사선 요법(CRT, chemoradiotherapy)이며, 구미에서는 수술 전 보조 화학 방사선 요법이다. 근치적 CRT에 의한 5년 생존율은 50％ 정도로, 수술 전 CT의 55％보다 약간 떨어지지만, 장기를 온존할 수 있어, 고령 환자나 약 10％인 위암이나 두경부암 병발 환자에게 있어서 매우 유효하다. 그로 인해, 치료 전에 수술 전 CRT가 유효한 환자를 예지, 선택하는 것이 강하게 요망되고 있다.
이러한 치료법의 유효성을 평가하는 방법으로서, 유방암이나 대장암 등에 있어서는, 생검의 유전자 발현 프로파일을 이용하는 방법이 있고, 특히 서브 타입 분류법이 유효한 것으로 나타나고 있다.
식도암에서도, 임상적으로 유용한 서브 타입을 동정하려는 시도는 이루어져 왔지만, 선암의 샘플수가 많고，편평상피암의 CRT 감수성 서브 타입을 동정하기에는 해석하는 샘플의 수가 적고, 더욱이 샘플에 있어서의 병기도 제각기 다르다(비특허문헌 1 내지 6, 또한 비특허문헌 1 내지 6에서 해석되어 있는 식도 편평상피암의 샘플수는, 각각 33, 2, 26, 21, 7 및 0이다). 그로 인해, 국소 진행암의 예지 의료에 공헌할 수 있는 확고한 결과를 얻을 수 없어, 편평상피암의 화학 방사선 요법의 감수성, 예후를 예측하는 방법은 아직 개발되어 있지 않다.
Ashida A. 등, Int J Oncology, 2006년, 28권, 1345-1352페이지 Luthra R. 등, Journal of Clinical Oncology, 2006년, 24권, 259-267페이지 Greenawalt. 등, Int J Cancer, 2007년, 120권, 1914-1921페이지 Duong C. 등, Ann Surg Oncol, 2007년, 14권, 3602-3609페이지 Maher SG. 등, Ann Surg, 2009년, 250권, 729-737페이지 Kim SM. 등, Plos one, 2010년, 5: e15074
본 발명은 상기 종래 기술이 갖는 과제를 감안하여 이루어진 것이며, 편평상피암의 화학 방사선 요법의 유효성을 정밀도 높게 평가하는(감수성, 예후를 예측하는) 것을 가능하게 하는, 방법 및 약제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해, 망라적 유전자 발현 프로파일에 기초하는 무감독 클러스터 해석(unsupervised cluster analysis)에 의해, 편평상피암의 화학 방사선 요법(CRT)에 의한 치료의 예후에 상관된 서브 타입의 동정을 행했다. 그 결과, 편평상피암을 재현성 좋게, 특정의 유전자 프로브 세트를 고발현하는 5종의 증례 클러스터(서브 타입)로 분류할 수 있는 것을 알아내었다. 그리고, 그들 5종의 서브 타입 중 서브 타입-7에 속하는 증례는 예후 양호군이며, 한편 서브 타입-5에 속하는 증례는 예후 불량군임이 밝혀졌다.
또한, 서브 타입-7에 있어서, 고발현하고 있는 유전자군의 발현을 지배하고 있는 전사 인자를 증례마다 발현량의 상관 해석에 의해 탐색한 바, SIM2 유전자를 알아내었다. 또한, 서브 타입-5에 있어서도 마찬가지의 탐색을 행한 결과, 해당 서브 타입의 유전자군의 발현을 지배하고 있는 전사 인자는 FOXE1인 것을 알아내었다. 그리고, CRT 감수성인 서브 타입-7을 규정하는 유전자, 즉 SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현(共發現)하고 있는 유전자(191 유전자)를 동정하고, 또한 CRT 비감수성인 서브 타입-5를 규정하는 유전자, 즉 FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자(121 유전자)를 동정했다.
또한, 편평상피암의 증례에 있어서, 서브 타입-7로 분류되지만, 서브 타입-5로는 분류되지 않는 증례를 순(純) 서브 타입-7로서 선택하고, 마찬가지로 서브 타입-5로 분류되지만, 서브 타입-7로는 분류되지 않는 증례를 순 서브 타입-5로 선택하였다. 그리고, 이들 재분류한 순 서브 타입-7 및 순 서브 타입-5에 속하는 증례에 대해, CRT 시행 후의 완전 관해율, 생존 곡선 및 5년 생존율을 분석한 바, 정밀도 높게, 순 서브 타입-7에 속하는 증례를 예후 양호군으로, 순 서브 타입-5에 속하는 증례를 예후 불량군으로 분류할 수 있음이 밝혀졌다. 한편, 놀랍게도, CRT가 아니라 외과적 절제 치료를 실시한 증례에 대해서도 마찬가지의 해석을 행했지만, 순 서브 타입-7에 속하는 증례와 순 서브 타입-5에 속하는 증례간에서 생존율에 관해, 유의차는 인정되지 않았다. 따라서, 서브 타입-5와 서브 타입-7, 또는 이 서브 타입 분류법은, 외과적 절제 치료의 예후의 예지, 예후 인자가 아니라, CRT의 유효성을 예지하는 데 특화되어 유효하다는 것이 밝혀졌다.
또한, 상술한 바와 같이, 편평상피암의 CRT 감수성에 관여하는 유전자로서 동정된 SIM2 유전자에 대해, 그의 분화 유도 활성을 평가한 바, SIM2 유전자가 미분화 기저 세포의 분화를 유도할 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 편평상피암 세포에 SIM2 유전자를 도입함으로써, 당해 암에 있어서의 항암제 감수성 및 γ선 감수성이 항진하는 것도 알아내어, 서브 타입-7(SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자의 발현)을 지표로 하여, 편평상피암에 대한 CRT의 유효성을 평가할 수 있음이, 분자 메커니즘의 관점에서도 확인되었다.
또한, 중국의 식도 편평상피암 및 프랑스의 두경부 편평상피암의 마이크로 어레이 데이터를 상기와 동일한 방법으로 해석한 결과, 타국의 식도 편평상피암에 있어서도, 나아가 식도 편평상피암이 아닌 편평상피암(두경부 편평상피암)에 있어서도, 서브 타입-5, -7의 존재를 확인할 수 있어, SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자의 발현, 및 FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자의 발현을 지표로 하여, 식도 편평상피암 뿐만 아니라, 다른 편평상피암에 대해서도 CRT의 유효성을 평가할 수 있음을 알아내었다.
또한, 상술한 유전자의 망라적 발현 해석 결과를, 유전자 해석 수에 한계가 있는 PCR 등에 의한 해석에 적용하기 위해, 편평상피암의 샘플간 발현 변동이 적은 유전자(참조 유전자)를 다수 동정하는 것에 성공했다. 또한, 그들 참조 유전자 중에서 가장 유용하다고 판단한 SRSF3 유전자의 발현에 기초하여, SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자(191 유전자), 및 FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자(121 유전자)에 있어서, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가할 수 있는 유전자의 범위 감축을 각각 행한 결과, 어느 유전자군에 관해서도, 하나의 유전자를 검출해도 높은 정밀도로 평가할 수 있는 것을 확인했다. 또한, 적어도 5의 유전자를 검출함으로써 매우 높은 정밀도로 평가할 수 있는 것, 즉 SIM2 유전자 등에 관해서는, 적어도 5의 유전자를 검출함으로써, 191 유전자 모두를 검출한 경우에 준하는 정밀도로 유효성을 판정할 수 있고, 또한 FOXE1 유전자 등에 관해서는, 적어도 5의 유전자를 검출함으로써, 121 유전자 모두를 검출한 경우에 준하는 정밀도로 유효성을 판정할 수 있는 것도 확인하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법, 또는 해당 방법에 사용되는 약제에 관한 것이며, 보다 상세하게는 이하에 관한 것이다.
(1) 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법이며, 하기 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 방법
(a) 피검체로부터 분리된 편평상피암 시료에 대해, SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨을 검출하는 공정,
(b) 공정 (a)에서 검출된 발현 레벨을 각 유전자의 기준 발현 레벨과 비교하는 공정,
(c) 공정 (b)에 있어서의 비교 결과, 상기 피검체에 있어서의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 높은 경우, 상기 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성은 높다고 판정하는 공정.
(2) 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법이며, 하기 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 방법
(a) 피검체로부터 분리된 편평상피암 시료에 대해, SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨, 및 FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨을 검출하는 공정,
(b) 공정 (a)에서 검출된 발현 레벨을 각 유전자의 기준 발현 레벨과 비교하는 공정,
(c) 공정 (b)에 있어서의 비교 결과, 상기 피검체에 있어서의 SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 높고, 또한 상기 피검체에 있어서의 FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 낮은 경우, 상기 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성은 높다고 판정하는 공정.
(3) (1) 또는 (2)에 기재된 방법에 의해, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 약제이며, 하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 적어도 1의 화합물을 포함하는 약제
(a) SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 전사산물 또는 그의 상보적 핵산에 하이브리다이즈하는, 적어도 15 뉴클레오티드의 쇄길이를 갖는 올리고뉴클레오티드,
(b) FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 전사산물 또는 그의 상보적 핵산에 하이브리다이즈하는, 적어도 15 뉴클레오티드의 쇄길이를 갖는 올리고뉴클레오티드,
(c) SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 번역산물에 결합하는 항체,
(d) FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 번역산물에 결합하는 항체.
본 발명에 따르면, 편평상피암의 화학 방사선 요법의 유효성을 정밀도 높게 평가하는 것이 가능해진다.
도 1은 망라적 유전자 발현 프로파일에 기초하는 무감독 클러스터 해석에 의해, 편평상피암의 화학 방사선 요법(CRT)에 의한 생존율에 상관된 서브 타입의 동정을 행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자의 고발현을 지표로 하여 분류된 편평상피암 환자군(도면 중 서브 타입-7)과, FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자의 고발현을 지표로 하여 분류된 편평상피암 환자군(도면 중 서브 타입-5)과의, CRT 후의 생존율의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 3은 편평상피암의 환자군에 있어서, 서브 타입-7, 서브 타입-5 및 양 서브 타입에 속하는 환자수를 나타내는 벤 다이어그램이다.
도 4는 순 서브 타입-7로 분류된(서브 타입-7로 분류되지만, 서브 타입-5로는 분류되지 않는) 편평상피암 환자군과, 순 서브 타입-5로 분류된(서브 타입-5로 분류되지만, 서브 타입-7로는 분류되지 않는) 편평상피암 환자군과의, CRT 또는 외과적 절제 치료 후의 생존율의 비교를 나타내는 그래프이다. 도면 중 우측 하단의 그래프만, 외과적 절제 치료에 의한 치료 후의 생존율을 나타낸다. 다른 것은 CRT 후의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 5는 SIM2 유전자의 분화 유도 활성에 대해 해석한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중 좌측의 2개의 그래프는, SIM2 유전자를 일과적으로 발현시킨 식도 편평상피암 세포주(KYSE510 및 TE8)에 있어서의, 미분화 기저 세포 마커인 PDPN과 분화 마커 SPRR1A의 mRNA 발현량을 나타내는 그래프이다. 우측의 사진은, 식도 편평상피암 세포주 KYSE510, TE8 및 T.Tn의 SIM2 안정 발현 세포주(KYSE510-SIM2-27, -37, TE8-SIM2-2, -3, T.Tn-SIM2-9, -23)에 있어서의, SIM2, 분화 마커(CEA, FLG, KRT1, SPRR1A, MUC4) 및 미분화 마커(VIM, PDPN, NGFR)의 발현량을 나타내는 겔 전기 영동의 사진이다.
도 6은 SIM2 유전자 안정 발현주의 항암제(시스플라틴(CDDP), 5-플루오로우라실(5FU), 도세탁셀(DTX))의 감수성을, 2차원 배양법에 의해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 SIM2 유전자 안정 발현주의 CDDP의 장기 투여에 대한 감수성을, 3차원 배양법에 의해 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 현미경 사진이다.
도 8은 SIM2 유전자 안정 발현주의 γ선에 대한 감수성을, 2차원 배양법에 의해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 서브 타입-5에 관해, 해석하는 유전자수를 1에서 연 20까지 증가시킨 경우에 있어서, 서브 타이핑용 107 증례 세트(세트-1) 및 검증용 167 증례 세트(세트-2)에 있어서의 각각의 예측 오차를, 가중치 부여 다수결 결정법에 의해 해석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 서브 타입-7에 관해, 해석하는 유전자수를 1에서 연 20까지 증가시킨 경우에 있어서, 상기 세트-1 및 상기 세트-2에 있어서의 각각의 예측 오차를, 가중치 부여 다수결 결정법에 의해 해석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 상기 세트-1 및 상기 세트-2를 대상으로 하고, 서브 타입-5를 규정하는 유전자군으로부터 선택된 5 유전자(표 33 참조)의 발현 레벨을 지표로 하여, 순 서브 타입-5로 분류된 편평상피암 환자군과, 그 밖의 편평상피암 환자군의, CRT 후의 생존율의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 12는 상기 세트-1 및 상기 세트-2를 대상으로 하고, 서브 타입-7을 규정하는 유전자군으로부터 선택된 5 유전자(표 34 참조)의 발현 레벨을 지표로 하여, 순 서브 타입-7로 분류된 편평상피암 환자군과, 그 밖의 편평상피암 환자군의, CRT 후의 생존율의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 13은 서브 타입-5에 관해, 상기 세트-1의 증례 데이터로부터 1000회의 리샘플링을 행하고, 모델 구축을 행했다. 그리고, 이들 모델(각 리샘플링에서 선택된 1 내지 연 20의 유전자)을 사용하여, 상기 세트-1 및 -2를 대상으로 한 평가를 행하고, 평균 예측 오차를 산출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 서브 타입-7에 관해, 상기 세트-1의 증례 데이터로부터 1000회의 리샘플링을 행하고, 모델 구축을 행했다. 그리고, 이 모델(각 리샘플링에서 선택된 1 내지 연 20의 유전자)을 사용하고, 상기 세트-1 및 -2를 대상으로 한 평가를 행하고, 평균 예측 오차를 산출한 결과를 나타내는 그래프이다.
<편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법>
후술하는 실시예에서 나타내는 대로, 망라적 유전자 발현 프로파일에 기초하는 무감독 클러스터 해석에 의해, 편평상피암의 화학 방사선 요법에 의한 치료의 예후(생존율)에 상관된 서브 타입의 동정을 행했다. 그 결과, 얻어진 예후 양호한 서브 타입에 있어서, SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자가 고발현하고 있는 것이 명확해졌다. 따라서, 본 발명은 하기 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법을 제공한다.
(a) 피검체로부터 분리된 편평상피암 시료에 대해, SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨을 검출하는 공정,
(b) 공정 (a)에서 검출된 발현 레벨을 각 유전자의 기준 발현 레벨과 비교하는 공정,
(c) 공정 (b)에 있어서의 비교 결과, 상기 피검체에 있어서의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 높은 경우, 상기 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성은 높다고 판정하는 공정.
또한, 후술하는 실시예에서 나타내는 대로, 편평상피암의 화학 방사선 요법에 의한 치료의 예후에 상관된 상기 서브 타입의 동정을 행한 결과, 얻어진 예후 불량한 서브 타입에 있어서, FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자가 고발현하고 있는 것도 명확해졌다. 또한, SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자의 발현에 더해, FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자의 발현을 지표로 함으로써 화학 방사선 요법 후의 예후 양호군과 예후 불량군을, 보다 정밀도 높게 판별할 수 있음을 알아내었다. 따라서, 본 발명은 그의 바람직한 형태로서, 하기 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법도 제공한다.
(a) 피검체로부터 분리된 편평상피암 시료에 대해, SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨, 및 FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨을 검출하는 공정,
(b) 공정 (a)에서 검출된 발현 레벨을 각 유전자의 기준 발현 레벨과 비교하는 공정,
(c) 공정 (b)에 있어서의 비교 결과, 상기 피검체에 있어서의 SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 높고, 또한 상기 피검체에 있어서의 FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 낮은 경우, 상기 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성은 높다고 판정하는 공정.
본 발명에 있어서, 「편평상피암」이란, 편평 중층 상피 등의 기저 세포가 악성화한 것이면 되고, 특별히 제한은 없지만, 식도(상부 식도, 중부 식도, 하부 식도) 및 직장 등의 소화기관, 비강, 상악, 상악동, 혀, 구강 바닥, 잇몸, 볼 점막, 상인두, 중인두, 하인두 및 후두 등의 두경부, 폐, 항문, 외음부, 질 및 자궁 경부에 있어서의 편평상피암을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하는 대상으로서는, 식도 편평상피암 및 두경부 편평상피암이 바람직하고, 식도 편평상피암이 보다 바람직하다.
「화학 방사선 요법」이란, 항암제 투여 등에 의한 「화학 요법」과 방사선 조사에 의한 「방사선 요법」의 양쪽을 조합한 치료법이며, 본 발명에 있어서, 「화학 방사선 요법」은 해당 치료법만을 단독으로 행하는 치료법이어도 되고, 수술전에 행하는 수술 전 화학 방사선 요법이어도 되고, 수술 후에 행하는 수술 후 화학 방사선 요법이어도 되며, 수술 이외의 그 밖의 치료법과 조합하여 행하는 화학 방사선 요법이어도 된다. 화학 요법에 있어서의, 항암제의 종류는 특별히 제한되지 않고, 당업자에게 주지의 항암제이면 되고, 예를 들어 시스플라틴(CDDP), 카르보플라틴, 옥살리플라틴 및 네타플라틴 등의 백금 제제, 5-플루오로우라실(5FU), 테가푸르ㆍ우라실, TS-1(테가푸르와 기메라실과 오테라실칼륨을 배합), 메토트렉세이트 및 염산 겜시타빈 등의 대사 길항제, 도세탁셀(DTX) 및 이리노테칸 등의 식물 알칼로이드, 시클로포스파미드, 멜팔란, 라니무스틴, 니무스틴 및 테모졸로미드 등의 알킬화제, 독소루비신 등의 항암성 항생 물질, 및 인터페론 α 등의 생물학적 응답 조절제를 들 수 있다. 항암제의 투여량, 투여 스케줄 등은, 항암제의 종류나 피검체의 조건에 따라 선택되며, 복수종의 항암제가 공투여되어도 된다. 방사선 요법에 있어서의, 방사선의 종류(예를 들어, γ선, X선, 전자선, 양자선, 중입자선), 방사선 강도, 방사 시간 등은 암의 치료에 통상 사용되는 범위이면 되고, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 「편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성」이란, 예를 들어 피검체의 화학 방사선 요법에 의한 치료 후(예후)의 생존율 또는 완전 관해율을 들 수 있다. 즉, 상기 유효성이 높다는 것은 상기 생존율이 높은 것이며, 보다 구체적으로는, 화학 방사선 요법에 의한 치료 후 5년(1800일）경과 후의 생존율이 50％ 이상이 되는 것이다. 한편, 상기 유효성이 낮다는 것은 상기 생존율이 낮은 것이며, 보다 구체적으로는, 화학 방사선 요법에 의한 치료 후 5년 경과 후의 생존율이 50％ 미만이 되는 것이다(후술하는 도 1, 2 및 4 참조). 또한, 상기 유효성이 높다는 것은 상기 완전 관해율이 높은 것이며, 보다 구체적으로는, 화학 방사선 요법에 의한 치료 후 2 내지 3개월에 있어서의 완전 관해율이 50％ 이상이 되는 것이다. 한편, 상기 유효성이 낮다는 것은 상기 완전 관해율이 낮은 것이며, 보다 구체적으로는, 화학 방사선 요법에 의한 치료 후 2 내지 3개월에 있어서의 완전 관해율이 50％ 미만이 되는 것이다(후술하는 표 15 참조).
본 발명에 있어서, 「피검체」란, 화학 방사선 요법에 의한 치료 전의 편평상피암 환자뿐만 아니라, 화학 방사선 요법에 의한 치료 중인 편평상피암 환자, 화학 방사선 요법에 의한 치료 후의 편평상피암 환자여도 된다. 또한, 편평상피암을 앓고 있는 사람뿐만 아니라, 편평상피암을 치료에 의해 제거했지만 재발이 염려되는 사람도, 본 발명에 관한 「피검체」의 예로서 들 수 있다.
「피검체로부터 분리된 편평상피암 시료」로서는, 피검체(인간의 생체)로부터 적출되어, 그 유래의 생체와 완전히 격리되어 있는 상태에 있는 편평상피암 또는 그것을 포함하는 조직이면 되고, 예를 들어 치료 개시 전에 피검체로부터 검사를 위해 채취된 편평상피암을 포함하는 조직(생검 샘플), 수술에 의해 적출된 편평상피암을 포함하는 조직을 들 수 있지만, 「피검체로부터 분리된 편평상피암 시료」로서는, 생검 샘플이 보다 바람직하다. 또한, 「편평상피암 시료」가 피검체로부터 분리되는 시기로서는 특별히 제한은 없지만, 해당 암의 원격 전이를 인정하지 않는 시기(병기: II, III기)가 바람직하다.
본 발명에 있어서 발현 레벨을 검출하는 대상이 되는 「SIM2 유전자」는, 싱글-마인드 상동체(single-minded homolog) 2(드로소필라(Drosophila)), 싱글-마인드 패밀리 bHLH 전사 인자 2, SIM, bHLHe15, HMC13F06 또는 HMC29C01이라고도 칭해지는 유전자이며, 인간 유래라면 전형적으로는, Entrez Gene(엔트레즈 유전자) ID: 6493으로 특정되는 유전자(Ref Seq ID: NM_005069로 특정되는 DNA 서열을 포함하는 유전자, Ref Seq ID: NP_005060으로 특정되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자)이다.
또한, 본 발명에 있어서 발현 레벨을 검출하는 대상이 되는 「SIM2 유전자와 공발현하고 있는 유전자」란, SIM2 유전자의 발현과 상관하여 발현이 변동하는(SIM2 유전자의 발현 패턴과 동일한 그것을 나타내는) 유전자이다. 해당 유전자와 SIM2 유전자가 유전자 발현에 있어서 고도로 상관하고 있는지 여부는, 당업자라면 당해 기술 분야의 공지의 방법을 사용하여 해석하여 판별할 수 있다. 예를 들어, 샘플(전술한 편평상피암 시료 등) 간의 유전자 발현량에 대해, 피어슨 상관 계수 혹은 스피어만(Spearman) 상관 계수를 계산함으로써, 또는 클러스터링법에 의해 계산할 수 있다. 또한, 공발현의 분석은, 정규화되거나 또는 표준화 및 정규화된 발현 데이터를 사용하여 계산할 수도 있다. 본 발명에 있어서, 「SIM2 유전자와 공발현하고 있는 유전자」로서는, SIM2 유전자의 발현과의 상관이 피어슨 적률 상관 계수로 0.4 이상인 유전자가 바람직하다. 또한, 보다 바람직한 「SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자」로서는 하기 표 1 내지 7에 나타내는 191의 유전자를 들 수 있고, 더욱 바람직한 유전자로서는, 후술하는 표 36에 나타내는 69의 유전자를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 발현 레벨을 검출하는 대상이 되는 「FOXE1 유전자」는, 포크헤드 박스 E1(갑상선 전사 인자 2), TTF2, FOXE2, HFKH4, HFKL5, TITF2, TTF-2 또는 FKHL15로도 칭해지는 유전자이며, 인간 유래라면 전형적으로는, Entrez Gene ID: 2304로 특정되는 유전자(Ref Seq ID: NM_004473로 특정되는 DNA 서열을 포함하는 유전자, Ref Seq ID: NP_004464로 특정되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자)이다.
또한, 본 발명에 있어서 발현 레벨을 검출하는 대상이 되는 「FOXE1 유전자와 공발현하고 있는 유전자」란, 전술한 SIM2 유전자의 경우와 마찬가지로, FOXE1 유전자의 발현과 상관하여 발현이 변동하는(FOXE1 유전자의 발현 패턴과 동일한 그것을 나타내는) 유전자이며, 해당 유전자와 FOXE1 유전자가 유전자 발현에 있어서 고도로 상관하고 있는지의 여부도, 전술한 SIM2 유전자의 경우와 같은 해석 방법으로 판별할 수 있다. 본 발명에 있어서, 「FOXE1 유전자와 공발현하고 있는 유전자」로서는, FOXE1 유전자의 발현과의 상관이 피어슨 적률 상관 계수로 0.4 이상인 유전자가 바람직하다. 또한, 보다 바람직한 「FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자」로서는 하기 표 8 내지 12에 나타내는 121의 유전자를 들 수 있고, 더욱 바람직한 유전자로서는, 후술하는 표 35에 나타내는 56의 유전자를 들 수 있다.
또한, 표 1 내지 12에서의 「ID」는 「Entrez Gene ID」를 의미하고, 「SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자(이하 「SIM2 공발현 유전자군」이라고도 칭함)」 및 「FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자(이하 「FOXE1 공발현 유전자군」이라고도 칭함)」의 각 유전자는, 인간 유래라면 전형적으로는 각 Entrez Gene ID로 특정되는 유전자이다. 그러나, 유전자의 DNA 서열은, 그의 변이 등에 의해 자연계에서(즉, 비인공적으로) 변이할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 이러한 천연 변이체도 검출 대상이 될 수 있다.
본 발명의 평가 방법은, 「SIM2 공발현 유전자군」으로부터 적어도 1의 유전자 발현을 검출하는 것이며, 1의 유전자 발현을 검출해도 되고(예를 들어, SPRR3의 유전자 발현만을 검출해도 되고), 2의 유전자 발현을 검출해도 되고, 3의 유전자 발현을 검출해도 되지만(예를 들어, SPRR3, CEACAM1 및 PPL의 유전자 발현을 검출해도 되지만), 매우 높은 정밀도로 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가한다는 관점에서, 적어도 5의 유전자 발현(예를 들어, 표 34에 나타내는 모든 유전자의 발현)을 검출하면 충분하지만, 적어도 10의 유전자 발현을 검출하는 것이 바람직하고, 적어도 20의 유전자 발현을 검출하는 것이 더 바람직하고, 적어도 30의 유전자 발현을 검출하는 것이 더욱 바람직하고, 적어도 50의 유전자 발현을 검출하는 것이 더 바람직하고, 적어도 100의 유전자 발현을 검출하는 것이 더욱 바람직하고, SIM2 공발현 유전자군의 모든 유전자의 발현을 검출하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 후술하는 실시예에 나타내는 대로, 표 36에 나타내는 SIM2 공발현 유전자의 순위는, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성 평가에 있어서의 정밀도 향상에 기여하는 순위이다. 따라서, 본 발명의 평가 방법에 있어서는, 당해 순위에 기초한 유전자를 선택하고, 그의 발현을 검출하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 평가 방법에 있어서는, 더 높은 정밀도로 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가한다는 관점에서, SIM2 공발현 유전자군으로부터의 적어도 1의 유전자 발현의 검출 외에, 「FOXE1 공발현 유전자군」으로부터 적어도 1의 유전자 발현을 검출해도 된다. FOXE1 공발현 유전자군으로부터는 1의 유전자 발현을 검출해도 되고(예를 들어, LOC344887의 유전자 발현을 검출해도 되고), 2의 유전자 발현을 검출해도 되고, 3의 유전자 발현을 검출해도 되지만(예를 들어, LOC344887, NTRK2 및 TMEM116의 유전자 발현을 검출해도 되지만), 매우 높은 정밀도로 평가한다는 관점에서, 적어도 5의 유전자 발현(예를 들어, 표 33에 나타내는 모든 유전자의 발현)을 검출하면 되고, 적어도 10의 유전자 발현을 검출하는 것이 바람직하고, 적어도 20의 유전자 발현을 검출하는 것이 더 바람직하고, 적어도 30의 유전자 발현을 검출하는 것이 더욱 바람직하고, 적어도 50의 유전자 발현을 검출하는 것이 더 바람직하고, 적어도 100의 유전자 발현을 검출하는 것이 더욱 바람직하고, FOXE1 공발현 유전자군의 모든 유전자의 발현을 검출하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 후술하는 실시예에 나타내는 대로, 표 35에 나타내는 FOXE1 공발현 유전자의 순위는, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성 평가에 있어서의 정밀도 향상에 기여하는 순위이다. 따라서, 본 발명의 평가 방법에 있어서는, 당해 순위에 기초한 유전자를 선택하고, 그의 발현을 검출하는 것이 바람직하다.
또한, 후술하는 실시예에서 나타내는 대로, 후술하는 발현 검출 방법 및 통계학적 해석 방법에 따라서는, 하나의 유전자에 복수의 프로브가 설치되는 경우나, 하나의 유전자에 관해 상이한 시그널비의 역치나 모델의 중량이 설정되는 경우 등이 있다. 이러한 경우, 상술한 본 발명의 방법에 있어서 검출하는 유전자의 수는, 총 수일 수도 있다.
본 발명에 있어서 「유전자의 발현 레벨을 검출한다」란, 유전자의 발현 정도를 검출하는 것을 의미한다. 또한, 유전자의 발현 레벨은, 절대량으로서 또는 상대량으로서 파악할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 상대량은, 후술하는 실시예에 나타내는 대로, 참조 유전자의 발현량을 기준으로 하여 산출할 수 있다. 본 발명에 관한 「참조 유전자」는, 샘플(전술한 편평상피암 시료 등)에 있어서 안정적으로 발현하고 있으며, 또한 상이한 샘플간에 있어서, 그의 발현량의 차가 작은 유전자이면 되고, 바람직하게는 후술하는 표 16 내지 32에 기재된 유전자이며, 보다 바람직하게는, SRSF3, TPM3, ZNF207, ZNF143, PUM1, RAB1A 및 LOC101059961이며, 특히 바람직하게는 SRSF3이다.
또한, 본 발명에 있어서 「유전자의 발현 레벨」이란, 유전자의 전사 레벨 및 번역 레벨 쌍방을 포함하는 뜻이다. 따라서, 본 발명에 있어서의 「유전자의 발현 레벨의 검출」에는, mRNA 레벨 및 단백질 레벨에서의 검출의 쌍방이 포함된다.
본 발명에 있어서의 유전자의 발현 검출에는, 공지의 방법을 사용할 수 있다. mRNA 레벨을 정량적으로 검출하는 방법으로는, 예를 들어 PCR(RT-PCR, 실시간PCR, 정량 PCR), DNA 마이크로 어레이 해석법을 들 수 있다. 또한, 소위 차세대 시퀀싱법에 있어서 리드수를 카운트함으로써, mRNA 레벨을 정량적으로 검출할 수 있다. 차세대 시퀀싱법으로서는 특별히 제한은 없지만, 합성 시퀀싱법(sequencing-by-synthesis, 예를 들어 일루미나사제 Solexa 게놈 애널라이저 또는 Hiseq(등록 상표) 2000에 의한 시퀀싱), 파이로 시퀀싱법(예를 들어, 로슈 다이아그노스틱스(454)사제의 시퀀서 GSLX 또는 FLX에 의한 시퀀싱(소위 454 시퀀싱)), 리가제 반응 시퀀싱법(예를 들어, 라이프 테크놀로지사제의 SoliD(등록 상표) 또는 5500xl에 의한 시퀀싱) 등을 들 수 있다. 또한, mRNA 레벨을 정량적으로 검출하는 방법으로는, 노던 블롯팅, 생체 내(in situ) 하이브리다이제이션, 도트 블롯, RNase 보호 검정법, 질량 분석법도 들 수 있다.
또한, 단백질 레벨에서 정량적으로 검출하는 방법으로는, 예를 들어 ELISA법, 항체 어레이, 면역 블롯팅, 이미징 세포측정법, 유동 세포측정법, 방사선 면역검정, 면역 침강법, 면역 조직 화학적 염색법 등의 항체를 사용하여 검출하는 방법(면역학적 방법)이나, 질량 분석법을 들 수 있다.
또한, 상기 검출 방법의 검출 대상이 되는, mRNA, 그의 상보적 핵산인 cDNA 혹은 cRNA, 또는 단백질은, 당업자라면 상기 시료의 종류 및 상태 등을 고려하여, 그것에 적합한 공지의 방법을 선택하여 제조하는 것이 가능하다.
본 발명의 평가 방법에 있어서는, 이와 같이 하여 검출된 유전자의 발현과, 동 유전자의 기준 발현 레벨을 비교한다. 이러한 비교는, 당업자라면 상기 발현 검출 방법에 맞는 통계학적 해석 방법을 적절히 선택하여 행할 수 있다. 통계학적 해석 방법으로는, 예를 들어 t검정, 분산 분석(ANOVA), 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 검정, 윌콕슨(Wilcoxon) 검정, 맨ㆍ휘트니(MannㆍWhitney) 검정 및 오즈비를 들 수 있다. 또한, 비교 시에는, 정규화되거나 또는 표준화 및 정규화된 발현 데이터를 사용할 수도 있다.
또한, 비교 대상인 「각 유전자의 기준 발현 레벨」로서는 특별히 제한은 없고, 당업자라면 상기 발현 검출 방법 및 통계학적 해석 방법에 맞추어, 그것을 기준으로 함으로써 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성이 높거나 또는 낮다고 판단할 수 있는, 소위 컷 오프값으로서 설정할 수 있다. 이러한 기준 발현 레벨은, 후술하는 실시예에 있어서 나타내는 바와 같은, 복수의 편평상피암에 있어서 검출된 유전자의 발현 레벨의 각 유전자마다의 평균값이어도 된다. 또한 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성이 높은 환자의 집단과, 해당 유효성이 낮은 환자의 집단에 있어서, 검출된 각 유전자의 발현 레벨을 비교함으로써 결정되는 값이어도 된다. 또한, 비암부나 세포주 등의 유전자 발현량을 기준으로 CRT의 유효성이 높은 환자와 해당 유효성이 낮은 환자의 집단에 있어서 설정되는 상수값이어도 된다. 또한, SIM2 공발현 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자 기준 발현 레벨로서는, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성이 낮다고 사전에 판명된 환자에게서 분리한 편평상피암 시료에 있어서의 각 유전자의 발현 레벨을 사용할 수도 있다. 한편, FOXE1 공발현 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 기준 발현 레벨로서는, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성이 높다고 사전에 판명된 환자로부터 분리한 편평상피암 시료에 있어서의 각 유전자의 발현 레벨을 사용할 수도 있다.
그리고, 이러한 비교 결과, 상기 피검체에 있어서의 SIM2 공발현 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 높은 경우, 상기 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성은 높다고 판정할 수 있다. 여기서 「각 기준 발현 레벨보다도 높다」라는 것은, 당업자라면 상기 통계학적 해석 방법에 기초하여 적절히 판단할 수 있다. 예를 들어, 후술하는 실시예에 있어서 나타낸 바와 같이, 검출된 유전자의 발현 레벨과 대응하는 기준 발현 레벨보다 높고, t검정에 있어서 그 차가 유의미라고 인정되는 것(P<0.05)을 들 수 있다. 또한, 검출된 유전자의 발현 레벨이 대응하는 기준 발현 레벨의 2배 이상인 것도 들 수 있다.
또한, 본 발명의 평가 방법에 있어서는, 더 높은 정밀도로 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가한다는 관점에서, 상기 SIM2 공발현 유전자군의 발현 레벨에 기초한 판단에 더해, FOXE1 공발현 유전자군의 발현 레벨에 기초한 판단을 행하는 것이 바람직하다. 즉, SIM2 공발현 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 높고, 또한 상기 피검체에 있어서의 FOXE1 공발현 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 낮은 경우, 상기 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성은 높다고 판정하는 것이 바람직하다. 여기서 「각 기준 발현 레벨보다도 낮다」라는 것은, 당업자라면 상기 통계학적 해석 방법에 기초하여 적절히 판단할 수 있다. 예를 들어, 후술하는 실시예에 있어서 나타낸 바와 같이, 검출된 유전자의 발현 레벨과 대응하는 기준 발현 레벨보다도 낮고, t검정에 있어서 그 차가 유의미라고 인정되는 것(P<0.05)을 들 수 있다. 또한, 검출된 유전자의 발현 레벨이 대응하는 기준 발현 레벨의 2분의 1 이하인 것도 들 수 있다.
이상과 같이, 본 발명의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법의 바람직한 실시 형태에 대해 설명했지만, 본 발명의 평가 방법은 상기 실시 형태에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상술한 바와 같이, 망라적 유전자 발현 프로파일에 기초하는 무감독 클러스터 해석에 의해, 얻어진 예후 불량한 서브 타입에 있어서, FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자가 고발현하고 있음이 명확해진 것에 기초하여, 본 발명은 하기 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법도 제공할 수 있다.
(a) 피검체로부터 분리된 편평상피암 시료에 대해, FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨을 검출하는 공정,
(b) 공정 (a)에서 검출된 발현 레벨을 각 유전자의 기준 발현 레벨과 비교하는 공정,
(c) 공정 (b)에 있어서의 비교 결과, 상기 피검체에 있어서의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 낮은 경우, 상기 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성은 높다고 판정하는 공정.
또한, 이상과 같이, 본 발명에 따르면, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 고정밀도로 평가할 수 있다. 그리고 이러한 평가의 결과에 의해, 편평상피암의 치료 방법으로서 화학 방사선 요법을 선택할지, 별도의 치료 방법(외과적 수술 또는 내시경적 수술에 의해 편평상피암을 제거하는 치료법, 레이저광 조사에 의해 편평상피암을 제거하는 치료법 등)을 선택할지를 판단할 수도 있다.
따라서, 본 발명은, 본 발명의 평가 방법에 의해 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성이 높다고 판정된 피검자에게, 화학 방사선 요법을 실시하는 공정을 포함하는, 편평상피암의 치료 방법을 제공할 수도 있다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 평가 방법에 의해 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성이 높다고 판정되지 않았던 피검자에게, 외과적 수술 혹은 내시경적 수술에 의해 편평상피암을 제거하는 치료법, 또는 레이저광 조사에 의해 편평상피암을 제거하는 치료법을 실시하는 공정을 포함하는, 편평상피암의 치료 방법을 제공할 수도 있다.
또한, 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성 평가는, 통상적으로 의사(의사의 지시를 받은 자도 포함함, 이하 동일)에 의해 행해지지만, 본 발명의 방법에 의해 얻어지는, 상술한 유전자 발현 레벨 등에 관한 데이터는, 의사에 의한 치료법의 선택도 포함한 진단에 도움이 되는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은, 의사에 의한 진단에 도움이 되는 데이터를 수집하고, 제시하는 방법이라고도 표현할 수 있다.
<편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 약제>
상술한 바와 같이, 본 발명의 평가 방법에 있어서는, SIM2 공발현 유전자군 등의 발현 레벨을 mRNA(전사산물) 레벨 또는 단백질(번역산물) 레벨에서 검출함으로써, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상술한 평가 방법에 의해, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 약제이며, 하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 적어도 1의 화합물을 포함하는 약제를 제공한다.
(a) SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 전사산물 또는 그의 상보적 핵산에 하이브리다이즈하는, 적어도 15 뉴클레오티드의 쇄길이를 갖는 올리고뉴클레오티드,
(b) FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 전사산물 또는 그의 상보적 핵산에 하이브리다이즈하는, 적어도 15 뉴클레오티드의 쇄길이를 갖는 올리고뉴클레오티드,
(c) SIM2 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 번역산물에 결합하는 항체,
(d) FOXE1 유전자 및 해당 유전자와 공발현하고 있는 유전자로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 번역산물에 결합하는 항체.
본 발명의 약제에 포함되는 올리고뉴클레오티드는, 상기 mRNA(전사산물) 레벨에서의 검출 방법에 맞추어, 프라이머의 형태여도 되고, 프로브의 형태여도 된다.
본 발명의 약제에 포함되는 프라이머는, SIM2 공발현 유전자군 및 FOXE1 공발현 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자(이하 「예후 관련 유전자」라고도 칭함)의 전사산물(mRNA) 또는 그의 상보적 핵산(cDNA, cRNA)에 하이브리다이즈하고, 해당 전사산물 등의 증폭 및 검출을 가능하게 하는 한 특별히 한정되지 않는다. 프라이머는, DNA만이어도 되고, 또한 그의 일부 또는 전부에 있어서, 가교화 핵산 등의 인공 핵산(수식 핵산)에 의해 치환되어 있는 것이어도 된다. 또한, 프라이머의 사이즈는, 적어도 약 15 뉴클레오티드 길이 이상이면 되고, 바람직하게는 15 내지 100 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 18 내지 50 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 뉴클레오티드 길이이다. 또한, 상기 검출 방법의 종류에 따라 필요한 프라이머수가 상이하기 때문에, 본 발명의 약제에 포함되는 프라이머수는 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 약제는, 1의 예후 관련 유전자에 대해 2 이상의 프라이머를 포함해도 된다. 또한, 이러한 프라이머는, 상기 검출 방법에 맞추어, 당업자라면 공지의 방법에 의해 설계하여, 제작할 수 있다.
본 발명의 약제에 포함되는 프로브는, 예후 관련 유전자의 전사산물 또는 그의 상보적 핵산에 하이브리다이즈하고, 해당 전사산물 등의 검출을 가능하게 하는 한 특별히 한정되지 않는다. 프로브는 DNA, RNA, 인공 핵산 또는 그들의 키메라 분자 등일 수 있다. 프로브는, 1가닥 쇄 또는 2가닥 쇄의 어느 것이어도 된다. 프로브의 사이즈는, 적어도 약 15 뉴클레오티드 길이 이상이면 되고, 바람직하게는 15 내지 1000 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 20 내지 500 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 30 내지 300 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 프로브는, 당업자라면 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 또한, 프로브는, 마이크로 어레이처럼, 기판 위에 고정된 형태로 제공되어도 된다.
본 발명의 약제에 포함되는 항체는, 예후 관련 유전자의 번역산물에 특이적으로 결합할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 해당 번역산물에 대한 항체는, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체의 어느 것이어도 되고, 또한 항체의 기능적 단편(Fab, Fab', scFv 등)이어도 된다. 이러한 항체는, 당업자라면 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 또한, 항체는, ELISA법이나 항체 어레이 등에 사용하기 위해, 플레이트 등의 기판 위에 고정된 형태로 제공되어도 된다.
또한, 본 발명의 약제에 포함되는 올리고뉴클레오티드 또는 항체는, 상기 검출 방법에 맞추어, 표지용 물질로 표지되어 있어도 된다. 표지용 물질로서는, 예를 들어 FITC, FAM, DEAC, R6G, TexRed, Cy5 등의 형광 물질, β-D-글루코시다아제, 루시페라아제, HRP 등의 효소, 3H, 14C, 32P, 35S, 123I 등의 방사성 동위체, 비오틴, 스트렙트아비딘 등의 친화성 물질, 루미놀, 루시페린, 루시게닌 등의 발광 물질을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약제는, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 항체 외에, 조성물로서 허용되는 다른 성분을 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분으로서는, 예를 들어 담체, 부형제, 붕해제, 완충제, 유화제, 현탁제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염, 2차 항체 등을 들 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 약제 외에, 표지의 검출에 필요한 기질, 양성 대조나 음성 대조, 혹은 시료의 희석이나 세정에 사용하는 완충액 등을 조합할 수 있고, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 키트로 할 수도 있다. 또한 이러한 키트는, 당해 키트의 사용 설명서를 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[1] 망라적 유전자 발현 프로파일에 기초하는 무감독 클러스터 해석에 의한 서브 타입의 동정
편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하는 방법을 개발하기 위해, 망라적 유전자 발현 프로파일에 기초하는 무감독 클러스터 해석에 의해, 편평상피암의 화학 방사선 요법에 의한 치료의 예후에 상관된 서브 타입의 동정을 행했다.
즉 우선, 병기 II-III기의 국소 진행 식도 편평상피암의 환자 274예의 치료전의 생검 조직으로부터 total(총) RNA를 추출하고, 아피메트릭스(Affymetrix)사의 권장 방법에 따라 GeneChip(등록 상표) Human Genome(인간 게놈) U133 Plus 2.0 Array에 의한 망라적 유전자 발현 프로파일을 얻었다. 유전자 발현 프로파일은, 서브 타이핑용 107 증례 세트(세트-1)와, 검증용 167 증례 세트(세트-2)로 나눠, 스탠포드 대학에서 제공되는 무료 소프트웨어 Cluster 3.0 및 Java Tree View를 사용하여 2차원 클러스터 해석(유전자 프로브 클러스터와 증례 클러스터의 2차원 계통수를 제작하는 방법)을 행했다. 세트-1에 있어서, 모든 증례에서 검출 한계 이하가 되는 유전자 프로브(하나의 유전자에 복수의 프로브가 합성, 탑재되어 있는 경우가 있음), 및 증례 사이에서 시그널의 변동이 없는 유전자 프로브를 제거함으로써 2054 유전자 프로브를 선택하고, 임상 병리 정보를 입력하지 않는 무감독 클러스터 해석을 행했다. 이어서, 얻어진 유전자 프로브 클러스터와 증례 클러스터의 2차원 계통수 중 유전자 프로브 클러스터를 상위부터 7종의 세트로 분할했다. 7 유전자 프로브 세트에 대해, 증례 세트-1, -2의 유전자 발현 데이터로써 개별로 클러스터 해석을 행하고, 양쪽 세트에서 재현성 좋게 유전자 프로브 세트 전체의 시그널값이 고발현을 나타내는 5종의 증례 클러스터, 서브 타입-1a, -2b, -3b, -5, -7을 동정했다. 각 서브 타입에 있어서, 서브 타입과 그 밖의 샘플의 생존 곡선과 5년 생존율을 전체 274예 중의 화학 방사선 요법(chemoradiotherapy, CRT) 121예(세트-1=34예, 세트-2=87예)를 사용하여 비교하고, 재현성 좋게 예후 양호한 서브 타입-7과 예후 불량한 서브 타입-5를 동정했다(도 1 참조).
[2] 화학 방사선 요법의 감수성과, 비감수성 서브 타입의 재분류
애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)사의 유전자 발현 해석 어레이의 데이터 마이닝 소프트웨어 GeneSpring을 이용하여, 생물학적인 의의를 갖고 CRT 감수성 서브 타입-7과 비감수성 서브 타입-5를 분류할 수 있는 유전자 세트의 선발과, 그들 유전자를 이용한 재분류를, 이하의 A) 내지 C)의 순서로 행했다.
A) [1]에서 동정한 서브 타입-7과 -5 각각에 대해, 서브 타입과 그 밖의 샘플 사이에 유전자 발현 시그널값의 t검정(P<0.05)과 평균값의 비교(2배 이상)를 세트-1에서 행하고, 서브 타입에서 유의미하게 고발현하고 있는 유전자를 선발했다.
B) A)에서 선발된 유전자의 조성으로부터, 서브 타입-7에 있어서는 전사 인자 SIM2에 의한 분화 유도 경로의 활성화를, 서브 타입-5에 있어서는 FOXE1에 의한 방사선, 약제 저항성 경로의 활성화를 각각 예측했다. 이어서, SIM2, FOXE1과 공발현하고 있는 유전자를, 세트-1에 있어서의 샘플간의 발현 패턴의 상관을 피어슨 적률 상관 계수로 평가(0.4 이상)함으로써 선발했다. 선발된 유전자 세트의 조성으로부터 예측한 2 서브 타입에서 활성화되어 있는 분자 경로의 타당성을 확인했다.
C) 각 서브 타입에서, A)와 B)에 공통된 유전자를 선발하고, 서브 타입-7을 분류하기 위한 191 유전자 세트(표 1 내지 7)와 서브 타입-5를 분류하기 위한 121 유전자 세트(표 8 내지 12)를 결정했다. 이들 유전자 세트를 사용한 클러스터링 해석에 의해 세트-1과 -2에서 각 서브 타입의 재분류와 서브 타입으로 분류된 샘플 군과 그 이외의 샘플 군의 생존 곡선의 비교에 의해, 재현성 좋게 CRT 감수성 서브 타입-7과 비감수성 서브 타입-5가 분류되는 것이 명확해졌다(도 2 참조).
[3] 순 서브 타입-7과 -5의 동정법
서브 타입-7과 -5로 분류 후, 양쪽의 서브 타입에 속하는 일부의 샘플은, 어느 쪽의 서브 타입에도 속하지 않는 것으로 하여, 순 서브 타입-7, 순 서브 타입-5 및 기타로 분류했다(도 3 참조).
[4] 순 서브 타입-7과 -5의 CRT와 외과적 절제 치료의 성적 비교
[3]에서 분류된 순 서브 타입-7, 순 서브 타입-5 및 기타에 대해, CRT 치료 2개월 후의 완전 관해율, 생존 곡선 및 5년 생존율을 비교했다(표 15, 도 4 참조). 또한 외과적 절제(수술) 시행 65예에 대해서도 마찬가지로 서브 타입 분류를 행하고, 생존 곡선과 5년 생존율을 비교했다(도 4 참조).
[5] CRT 감수성 서브 타입-7을 규정하는 SIM2 유전자의 분화 유도 활성의 평가
SIM2 유전자의 분화 유도 활성을 평가하기 위해, 이화학 연구소 BRC 또는 JCRB로부터 입수한 식도 편평상피암 유래 세포주 KYSE510, TE8에, Lipofectamin(등록 상표) 2000(Invitrogen사)를 사용하고, pCMV-AC-GFP 플라스미드 벡터에 연결된 SIM2 유전자 cDNA를 일과적으로 도입했다. 대조군으로서, pCMV-neo 플라스미드 벡터를 일과적으로 도입했다. 통상 배지(RPMI1640 또는 DMEM, 10％ FBS)에서 1일간 배양한 후에, NanoCulture(등록 상표) Plate(SCIVAX사)에 파종해, 통상 배지에서 3일간 배양했다. total RNA를 추출해 정량적 RT-PCR법으로 유전자의 발현량을 측정했다. cDNA는, SuperScript(등록 상표) III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(RT-PCR을 위한 슈퍼스크립트 (등록 상표) III 퍼스트-스트랜드 합성 시스템; Invitrogen사)를 따라 제작했다. 희석한 cDNA는, iQTMSYBER(등록 상표) GreenSupermix(BIO-RAD사), 프라이머 및 뉴클레아제-무함유 물과 혼합하고, MyiQ(등록 상표)(BIO-RAD사)에 의해 정량했다. 표 13에 프라이머의 염기 서열을 나타낸다. 그 결과는 도 5에 나타낸다.
이화학 연구소 BRC로부터 입수한 TE8, JCRB 세포 뱅크로부터 입수한 KYSE510 및 T.Tn에, SIM2 유전자를 도입하고, 400㎍/ml의 G-418을 포함하는 배지에서 약 2주일 배양했다. G418 내성 콜로니를 단리 배양하고, RT-PCR법에 의해 SIM2 유전자의 발현을 확인하고, SIM2 유전자 안정 발현주를 수립했다. GFP 발현 플라스미드 벡터만을 도입한 세포주를 대조 세포주로 했다. total RNA를 추출하고, SIM2 유전자 안정 발현주에 있어서의 분화 유도 활성을 평가하기 위해, NanoCulture(등록 상표) Plate에 SIM2 유전자 안정 발현주를 파종한 후, 통상 배지에서 3일간 배양했다. total RNA를 추출하고, RT-PCR법을 행했다. cDNA는, SuperScript(등록 상표) III First-Strand Synthesis System for RT-PCR로 합성하고, 희석한 cDNA를 Accu Prime(등록 상표) Taq DNA Polymerase System(Invitrogen), 프라이머 및 뉴클레아제-무함유 물과 혼합하여, GeneAmp(등록 상표) PCR System 9700(어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem)사)에 의해 증폭하고, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해, 비교 정량했다. 표 14에 프라이머의 염기 서열을 나타낸다. 그 결과는 도 5에 나타냈다.
[6] 2차원 배양에 의한 SIM2 유전자 안정 발현주의 항암제 감수성의 평가
SIM2 유전자 안정 발현주의 시스플라틴(CDDP), 5-플루오로우라실(5FU), 도세탁셀(DTX)에 대한 감수성을 평가하기 위해, 항암제 감수성 시험을 행했다. 6웰 플레이트에 SIM2 유전자 안정 발현주를 파종해, 통상 배지에서 1일간 배양한 후에, CDDP(2μM, 5μM, 10μM), 5FU(10μM), DTX(1nM) 첨가 배지 또는 통상 배지에서 3일간 배양했다. 약물 처치 종료 후, 0.25％ 트립신/EDTA를 이용하여 세포를 회수하고, 트리판 블루 염색 후, 생세포수를 계측했다. 그 결과는 도 6에 나타냈다.
[7] 3차원 배양에 의한 SIM2 유전자 안정 발현주의 시스플라틴 감수성의 평가
SIM2 유전자 안정 발현주의 CDDP의 장기 투여에 대한 감수성을 평가하기 위해, 3차원 배양을 사용한 항암제 감수성 시험을 행했다. 3.5㎝ NanoCulture(등록 상표) Plate에 SIM2 유전자 안정 발현주를 파종해, 통상 배지에서 1일간 배양한 후에, CDDP(5×10-6M)을 포함하는 배지로 교환했다. CDDP(5×10-6M)를 포함하는 배지를 2일 간격으로 교환하면서, 14일간 배양했다. 약물 처치 종료 후, Spheroid Dispersion Solution(스페로이드 분산액; SCIVAX사)을 이용하여 세포를 회수하고, 트리판 블루 염색 후, 생세포수를 계측했다. 그 결과는 도 7에 나타냈다.
[8] 2차원 배양에 의한 SIM2 유전자 안정 발현주의 γ선 감수성의 평가
SIM2 유전자 안정 발현주의 방사선에 대한 감수성을 평가하기 위해, γ선 감수성 시험을 행했다. 6웰 플레이트에 SIM2 유전자 안정 발현주를 파종해, 통상 배지에서 1일간 배양한 후에, γ선 조사(0Gy, 1Gy, 5Gy, 10Gy)를 행했다. 그 후 7일간 배양하고, 0.25％ 트립신/EDTA를 이용하여 세포를 회수하고, 트리판 블루 염색 후, 생세포수를 계측하고, IC50을 계산했다. 그 결과는 도 8에 나타낸다.
이상의 방법에 기초하여, 얻어진 결과를 이하에 나타낸다.
[1] 망라적 유전자 발현 프로파일에 기초하는 무감독 클러스터 해석에 의한 서브 타입의 동정
증례 세트-1에서 선발한 2054 유전자 프로브 세트로 무감독 클러스터 해석을 행하고, 유전자 계통수를 7종으로 나누어, 증례 세트-2에서의 재현성을 확인한 바, 7종의 유전자 프로브 클러스터 중 세트-2에서도 재현된 것은 5종의 유전자 프로브 클러스터였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 이들 5종의 유전자 프로브 세트를 고발현하는 증례 클러스터(서브 타입) 중 서브 타입-7은 CRT에서의 5년 생존율이 세트-1에서 64％, 세트-2에서 75％로 감수성을 나타냈다. 한편, 서브 타입-5는 CRT에서의 5년 생존율이 세트-1에서 11％, 세트-2에서 28％로 비감수성이었다.
[2] 화학 방사선 요법에의 감수성 서브 타입과 비감수성 서브 타입의 재분류
세트-1에 있어서 CRT 감수성 서브 타입-7과 기타를 비교하여, t-검정에서 p<0.05의 조건과 평균 발현 강도가 2배 이상인 조건을 충족하는 유전자 프로브를 선발한 결과, 599종이었다. 그 중에 포함되는 키가 되는 전사 인자, 즉 이들 유전자의 발현을 지배하고 있는 전사 인자를 증례마다의 발현량의 상관 해석에 의해 탐색한 바 SIM2를 찾아내었다. SIM2의 발현과 상관하여 발현하는 유전자는 상기 통계학적으로 선발된 599 유전자 프로브 중 256 유전자 프로브였다. 마찬가지로 비감수성 서브 타입-5로 특이적으로 발현하는 525 유전자 프로브 중 163 유전자 프로브와 상관된 전사 인자 FOXE1을 동정했다. 이어서, 각 256 유전자 프로브와 163 유전자 프로브의 수치 데이터를 사용하여, 세트-1과 세트-2에서 클러스터 해석을 행하고, CRT 감수성 서브 타입-7과 비감수성 서브 타입-5를 재분류하여, 생존 곡선을 그리고, 5년 생존율을 조사한 결과를 도 2에 나타냈다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 서브 타입-7은 5년 생존율이 세트-1에서 67％, 세트-2에서 70％로 성적이 좋았다. 한편, 서브 타입-5는 CRT에서의 5년 생존율이 세트-1에서 11％, 세트-2에서 32％로 불량했다. CRT 감수성 서브 타입-7을 규정하는 256 유전자 프로브를 중복이 없는 191종의 유전자명으로 정리하고, 상술한 표 1 내지 7에 나타냈다. 이 CRT 감수성 서브 타입-7을 규정하는 191 유전자에는, 식도 편평상피의 분화층에서 발현하는 유전자(분화 마커)가 많이 포함되어 있었다. 한편, 비감수성 서브 타입-5를 규정하는 163 유전자 프로브는 상술한 표 8 내지 12의 121 유전자로서 나타냈다. 이 유전자에는 미분화의 기저 세포 마커 등이 많이 포함되어 있었다. 따라서, SIM2는 식도암의 분화를 유도하고, FOXE1은 분화를 억제함으로써 화학 방사선 저항성의 획득에 기여하고 있는 것이 나타났다.
[3] 순 서브 타입-7과 -5의 동정
도 3에 나타낸 바와 같이, 세트-1의 107 증례 중, 서브 타입-7로 분류되는 것은 30예, 서브 타입-5로 분류되는 것은 29예였다. 중복은 6예 있었으므로, 순 서브 타입-7은 24예, 순 서브 타입-5로 분류되는 것은 23예였다. 이들 2종의 서브 타입 이외의 증례는 60예였다. 마찬가지로, 세트-2의 167 증례 중, 순 서브 타입-7은 34예, 순 서브 타입-5로 분류되는 것은 48예였다. 기타 증례는 85예였다.
[4] 순 서브 타입-7과 -5에 있어서의 CRT와 외과적 절제 치료의 성적 비교
[3]에서 분류된 순 서브 타입-7, 순 서브 타입-5 및 기타 증례에 대해, CRT 치료 2개월 후의 완전 관해(CR, complete response)율을, 표 15에 나타냈다. 또한, 표 15 중, 「ST」는 「서브 타입」을 나타내고, 「CR」은 「완전 관해」를 나타내고, 「non CR」은 「비관해」를 나타낸다. 표 15에 나타낸 바와 같이, CRT 시행 121예의 완전 관해율이 47％인 것에 비해, 순 서브 타입-7은 세트-1에서 100％, 세트-2에서 59％로 재현성 좋게 양호하여 전체적으로는 71％였다. 한편, 순 서브 타입-5는, 세트-1에서 18％, 세트-2에서 24％로 재현성 좋게 불량하여 전체적으로는 23％였다.
도 4에 CRT 시행 121예에 있어서의 순 서브 타입-7, 순 서브 타입-5 및 기타 증례의 생존 곡선, 5년 생존율을 비교한 데이터를 나타냈다(좌측 상단: 세트-1, 우측 상단: 세트-2, 좌측 하방: 세트-1 & -2). 또한, 전체 274예 중의 수술 65예에 대해서도 마찬가지로 서브 타입 분류를 행하고, 생존 곡선과 5년 생존율을 비교했다(우측 하단: 수술예). CRT 시행 121예에 있어서의 5년 생존율 44％에 대해 순 서브 타입-7은 세트-1에서 86％, 세트-2에서 70％로 재현성 좋게 높고 전체(세트-1 & -2)에서는 74％였다. 한편 서브 타입-5의 5년 생존율은, 세트-1에서 15％, 세트-2에서 27％로 재현성 좋게 낮고, 전체(세트-1 & -2)에서는 24％였다. 수술예에 있어서는, 전체 65예에 있어서의 5년 생존율 59％에 대해 순 서브 타입-7, 순 서브 타입-5 및 기타는 각각 62％, 61％, 57％로 유의미한 차는 인정되지 않았다. 따라서, 서브 타입-5와 서브 타입-7 또는 이 서브 타입 분류법은, 외과적 절제 치료의 예후의 예지, 예후 인자가 아니라, CRT의 치료 성적을 예지하는 데 특화하여 유효한 것이 명확해졌다.
[5] CRT 감수성 서브 타입-7을 규정하는 SIM2 유전자의 분화 유도 활성의 평가
도 5의 좌측에, 식도 편평상피암 세포주 KYSE510과 TE8에 SIM2 유전자 cDNA를 도입 후, 3일째, 5일째에 있어서, 미분화 기저 세포 마커인 PDPN과 분화 마커 SPRR1A의 발현을 조사한 정량적 RT-PCR의 데이터를 나타냈다. SIM2 유전자를 도입 후 3일째에 분화 마커 SPRR1A가 상승하고, 미분화 기저 세포 마커 PDPN의 발현이 하강했다. 이 결과로부터, SIM2가 미분화 기저 세포의 분화를 유도할 수 있는 것이 명확해졌다.
도 5의 우측에, 식도 편평상피암 세포주 KYSE510, TE8 및 T.Tn의 SIM2 안정 발현 세포주(KYSE510-SIM2-27, -37, TE8-SIM2-2, -3, T.Tn-SIM2-9, -23)와 대조 벡터 도입주(KYSE510-Mock, TE8-Mock, T.Tn-Mock)를 3차원 배양하고, SIM2, 분화 마커(CEA, FLG, KRT1, SPRR1A, MUC4) 및 미분화 마커(VIM, PDPN, NGFR)의 발현을 조사한 RT-PCR로 조사한 데이터를 나타냈다. 대조 세포에 비해 SIM2 안정 발현 세포에서는 분화 마커의 발현이 높고, 미분화 마커의 발현이 낮아져 있었다. 이 데이터로부터, 전술(도 5의 왼쪽)의 일과성 SIM2 유전자 발현 유도의 데이터와 마찬가지로, SIM2이 미분화 기저 세포의 분화를 유도할 수 있는 것이 확인되었다.
[6] 2차원 배양에 의한 SIM2 유전자 안정 발현주의 항암제 감수성의 평가
도 6에 나타낸 바와 같이, SIM2 안정 발현주(KYSE510-SIM2-27, -37, TE8-SIM2-2, -3, T.Tn-SIM2-9, -23)에서는, 대조 벡터 도입주(KYSE510-Mock, TE8-Mock, T.Tn-Mock)와 비교하여, 시스플라틴(CDDP), 5-플루오로우라실(5FU), 도세탁셀(DTX)에 대한 감수성이 상승해 있는 것이 밝혀졌다. 즉, 어느 SIM2 안정 발현주에서는, 통상의 플레이트 2차원 배양으로, 3종의 항암제를 IC50 근방의 농도로 첨가했더니, 3일 후의 생세포수가 유위하게(*: p<0.05) 줄어들어 있었다.
[7] 3차원 배양에 의한 SIM2 유전자 안정 발현주의 시스플라틴 감수성의 평가
통상의 2차원 배양에서, IC50 근방의 농도에서는, 5일간 이상의 장기 관찰에서는 세포가 포화하기 때문에, 3일간에서의 효과를 조사했다. 그로 인해, 도 6에서 나타낸 CDDP의 효과는 유위했지만 작았다. 따라서, CDDP에 관해서는 3차원 배양에서 14일간의 장기 관찰을 행했다. 도 7(왼쪽에 생세포수, 오른쪽에 세포 집괴)에 나타낸 바와 같이, SIM2 안정 발현주(T.Tn-SIM2-9, -23)에서는, 대조 벡터 도입주(T.Tn-Mock)와 비교하여, CDDP에 대한 감수성이 현저하게 상승해 있었다.
[8] 2차원 배양에 의한 SIM2 유전자 안정 발현주의 γ선 감수성의 평가
도 8에 나타낸 바와 같이, SIM2 안정 발현주(TE8-SIM2-2, -3, T.Tn-SIM2-9, -23)에서는, 대조 벡터 도입주(TE8-Mock, T.Tn-Mock)와 비교하여, γ선에 대한 감수성이 상승하는 것이 명확해졌다. 또한, KYSE510은 친주(親株), 대조 벡터 도입주(KYSE510-Mock) 모두, γ선에 고감수성이기 때문에 평가로부터 제외했다.
[9] 타국의 식도 편평상피암, 두경부 편평상피암에서의 서브 타입-5, -7의 존재 확인
EMBL-EBI의 ArrayExpress 데이터베이스로부터 액세스 번호 E-GEDO-23400의 중국의 식도 편평상피암 53예와 액세스 번호 E-MTAB-1328의 프랑스의 두경부 편평상피암 89예의 마이크로 어레이 데이터를, 상기 [1]-[2]와 동일한 방법으로 클러스터 해석을 행했다. 그 결과, 도면에는 도시하지 않았으나, 타국의 식도 편평상피암에 있어서도, 나아가 식도 편평상피암이 아닌 편평상피암(두경부 편평상피암)에 있어서도, 서브 타입-5, -7의 존재를 확인할 수 있었다.
[10] 망라적 유전자 발현 프로파일에 기초하는 발현 변동이 적은 참조 유전자의 동정
상술한 바와 같이, SIM2 공발현 유전자군의 유전자의 발현 레벨을 지표로 함으로써, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가할 수 있다. 또한, FOXE1 공발현 유전자군의 유전자의 발현 레벨도 지표로 함으로써, 보다 정밀도 높게 상기 유효성을 평가할 수 있다. 또한, 이러한 유전자군의 발현 레벨을 망라적으로 해석하는 데 있어서, 본 실시예에서도 사용하고 있는 DNA 마이크로 어레이에 의한 해석은 유용하다.
DNA 마이크로 어레이 해석법 등의 망라적인 해석에 있어서는, 샘플간에서 유전자의 총 발현량은 거의 동일하다는 전제에 기초하여, 당해 샘플간의 유전자의 발현 레벨을 비교하는 것(글로벌 정규화)을 할 수 있다.
그러나, 유전자 해석수에 한계가 있는 PCR 등에 의한 해석에 있어서는, 이러한 글로벌 정규화를 사용할 수는 없다. 그로 인해, 샘플간에서 발현 변동이 적은 유전자(참조 유전자)의 발현량을 기준으로 하여, 해석 대상인 유전자의 발현량을 그의 상대량(발현 레벨)으로 환산하고 나서, 당해 샘플간의 유전자의 발현 레벨을 비교하는 것이 행해진다.
또한, PCR 등에 의한 해석에 있어서는, 통상, 항상적으로 발현하고 있어, 일반적으로 발현 변동이 적다고 여겨지는, β-액틴이나 GAPDH 등이 참조 유전자로서 사용되고 있지만, 편평상피암을 대상으로 한 경우에, 그들이 참조 유전자로서 적당하다고만은 할 수 없다. 따라서, β-액틴 등보다도 보다 유효한 편평상피암에 있어서의 참조 유전자를 동정하기 위해, 이하의 해석을 행했다.
상술한 [1]에서 얻어진, GeneChip(등록 상표) Human Genome U133 Plus 2.0 Array에 의한 식도 편평상피암 환자 274예의 치료 전의 생검 조직으로부터의 망라적 유전자 발현 프로파일에 기초하여, 증례간에서 발현 변동이 적은 표준 유전자의 순위 부여를 행했다. 발현 변동이 적은 표준 유전자의 순위 부여 방법으로서 하기 3가지의 방법을 사용하여 검토했다.
방법 1: 시그널값의 95％ 백분위수와 5％ 백분위수를 유전자 프로브마다 산출하고, 그 차를 각 유전자 프로브의 시그널값의 중앙값(50％ 백분위수)으로 나눈다.
방법 2: 시그널값의 중앙 절대 편차를 유전자 프로브마다 산출하고, 그 차를 각 유전자 프로브의 시그널값의 중앙값으로 나눈다.
방법 3: 시그널값의 표준 편차를 유전자 프로브마다 산출하고, 그 차를 각 유전자 프로브의 시그널값의 평균값으로 나눈다.
이상 3 종류의 방법으로, 유전자 발현 변동의 크기를 평가했다. 즉, 어느 방법에서도, 유전자 발현 변동이 작으면 산출되는 수치도 작아지기 때문에, 그 수치가 작은 순서대로 유전자 프로브를 배열하여 평가했다. 또한, 하나의 유전자에 대해, 복수의 프로브가 상기 Array에는 합성, 탑재되어 있는 경우가 있기 때문에, 동일 유전자에 대해서는, 각 방법으로 산출된 가장 작은 수치를 선택하고, 나머지는 제외했다. 이와 같이 하여 해석한 결과 중 β-액틴과 동등 이상으로 발현 변동이 적은 것으로서 평가된 유전자를, 표 16 내지 32에 나타낸다. 표 16 내지 19에는, 상기 방법 1에 의해 동정된 합계 243 유전자를 나타내고, 표 20 내지 26에는, 상기 방법 2에 의해 동정된 합계 377 유전자를 나타내고, 표 27 내지 32에는, 방법 3에 의해 동정된 합계 330 유전자를 나타낸다.
이와 같이 하여 얻어진, β-액틴과 동등 이상의 유용한 참조 유전자(컨트롤 유전자)에 있어서, 어느 방법에서도 상위 10의 유전자에 포함되어 있는, SRSF3, TPM3, ZNF207, ZNF143, PUM1, RAB1A 및 LOC101059961은, 편평상피암의 유전자의 발현 레벨을 해석하는 데 있어서 보다 유용한 참조 유전자이다. 특히, SRSF3 유전자는, 방법 1 내지 3의 어느 것에서도 최상위이며, 가장 유용한 참조 유전자이다.
[11] 소수(小數) 유전자 세트를 이용한 서브 타입 분류
상술한 바와 같이, PCR 등에 의한 해석에 있어서는, 해석하는 유전자의 수를 소수로 한정하는 것이 요망된다. 따라서, 적은 유전자군을 해석 대상으로 해도, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가할 수 있음을 확인하기 위해, 서브 타입-5의 분류에 유용한 163 유전자 프로브(표 8 내지 12 참조), 또한 서브 타입-7의 분류에 유용한 256 유전자 프로브(표 1 내지 7 참조)로부터, 더 한층의 유전자 프로브의 범위 감축을 검토했다.
구체적으로는, 효율적인 유전자 조합에 기초하는 모델 구축 방법의 일종인 부스팅(가중치 부여 다수결 결정법)을 이용하여, 서브 타이핑용 107 증례 세트(상술한 세트-1)에 의해 유전자를 선발하고, 검증용의 167 증례 세트(상술한 세트-2)를 사용하여 평가를 행했다. 또한, 이 때에는, [10]에 있어서, 방법 1 내지 3 어느 것에서도 1위였던 SRSF3 유전자를 참조 유전자로서 사용하고, 각 유전자 프로브의 시그널값을 SRSF3 유전자의 시그널값으로 나눈 시그널비를 사용하여 검토를 행했다. 또한, 부스팅이란, 단순한 예측 모델을 효율적으로 선택하고, 적절한 중량을 정의하여, 가중치 부여 다수결에 의해 조합 판정함으로써 고정밀도의 예측 결과를 얻는 방법이다. 본 실시예에서는, 단순한 예측 모델로서 각 유전자에 기초하는 깊이 1의 결정 트리를 구축하고, 모델수를 1부터 20개까지 증가시킨 경우의 세트-1, -2의 각각의 예측 오차를 서브 타입마다 산출했다. 이 경우의 각 유전자에 기초하는 깊이 1의 결정 트리는, 각 유전자의 시그널비의 한 역치를 기준으로, 2치화한 것이다. 이와 같이 하여, 모델수를 1부터 총 20개까지 증가시킨 경우의 세트-1, -2의 예측 오차를 각 서브 타입(-5, -7)에 대해 나타낸 결과를, 도 9에 나타낸다.
도 9에 나타내는 대로, 해석의 대상으로 하는 유전자수가 1이어도, 그 예측 오차가 0.1 정도로 억제되어 있어, 본 발명에 관한 유전자의 유용성이 확인되었다. 또한, 학습 데이터인 세트-1에 대해서는 모델수의 증가와 함께 예측 오차가 저하되었지만, 평가 데이터인 세트-2에 대해서는, 모델수 5가 최소 오차를 나타냈다. 또한, 어느 서브 타입 예측에서도 마찬가지의 경향이 얻어지고, 모델수 5일 때, 서브 타입-5에서 정답율 95.8％, 서브 타입-7에서 정답율 98.2％에 달했다. 이러한 점에서, 세트-1과 세트-2에서 공통의 역치를 사용할 수 있는 것, SRSF3 유전자가 참조 유전자로서 매우 유용할 수 있는 것, 및 불과 5모델을 포함하는 유전자 세트에서도, 매우 높은 정밀도로 각 서브 타입을 예측 가능한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 각 서브 타입에 대한 5모델의 유전자 세트, 그 시그널비의 역치, 모델의 중량은, 표 33 및 34에 나타낸 대로이다. 또한, 표 33에 있어서는, LOC344887이 연 2회 선택되어 있지만, 이것은, 시그널비의 역치나 모델의 중량 차이로부터, 동일한 유전자가 중복 선택되었기 때문이다. 또한, 이때의 순 서브 타입-5, -7에 관한 생존 해석은, 도 11 및 12에 나타낸 바와 같이, 서브 타입-5의 분류에 유용한 163 유전자 프로브, 또한 서브 타입-7의 분류에 유용한 256 유전자 프로브를 모두 사용한 해석에 준하는 것도 확인할 수 있었다.
[12] 리샘플링에 의한 유전자 세트의 평가 및 순위 부여
상기 [11] 등에 있어서의 예비적인 검토로부터, 다수의 유용한 소수 유전자 세트가 존재하는 것이 시사되었다. 따라서, 세트-1의 107 증례의 데이터로부터, 중복을 허용하여 200 증례분을 선택하는 리샘플링을 행하여 1000회 행했다. 각 리샘플링에서 얻어진 학습용 데이터로 만든 모델 구축을 행하고, 세트-1과 -2를 사용하여 평가를 행했다. 이 1000회의 리샘플링에 기초하여 평균 예측 오차를 산출하고, 또한 각 리샘플링에서 선택된 5모델의 유전자 세트에서 선택된 유전자를, 선택 횟수로 유전자의 순위 부여를 행했다. 유전자 세트는, 서브 타입-5의 분류에 유용한 163 유전자 프로브로부터, 또한 서브 타입-7의 분류에 유용한 256 유전자 프로브로부터 선택하고, 상이한 유전자 프로브가 선택되어도 동일 유전자라면 합산된 선택 횟수를 산출했다. 그리고, 이와 같이 하여, 1000회의 리샘플링에 있어서, 모델수 1부터 연 20까지의 세트-1, -2에 있어서의 예측 오차의 평균값을 산출했다. 얻어진 결과를, 도 13 및 14에 나타낸다.
도 13 및 14에 나타난 결과로부터 명백해진 바와 같이, 5모델의 유전자 세트에서, 세트-2의 예측 정답율이 최대가 되고, 보다 구체적으로는, 서브 타입-5에서 평균 정답율 94.4％, 서브 타입-7에서 정답율 97.6％에 달하는 것이 확인되었다.
또한, 1000회의 리샘플링의 5모델에 포함되는 유전자를 집계한 바, 상위에 선택되는 유전자에는 치우침이 있고, 서브 타입-5에 있어서는 56 유전자(표 35 참조)가 선발되어, 또한 서브 타입-7에서는 69 유전자(표 36 참조)가 선발되었다.
따라서, 서브 타입-5의 분류에 유용한 163 유전자(표 8 내지 12 참조) 및 서브 타입-7의 분류에 유용한 256 유전자(표 1 내지 7 참조)에 있어서, 표 35 및 36의 유전자가 특히, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가함과 함께 유용한 유전자인 것이 확인되었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, SIM2 공발현 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨을 지표로 함으로써, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가할 수 있다. 또한, FOXE1 공발현 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨도 지표로 함으로써, 보다 정밀도 높게 상기 유효성을 평가할 수 있다.
따라서, 본 발명의 평가 방법 및 해당 방법에 사용되는 약제는, 편평상피암의 치료 방침을 결정하는 데 있어서 매우 유효하다.
서열 번호: 1 내지 20
<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 서열
SEQUENCE LISTING <110> National Cancer Center Kyoto University Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. <120> ?G?????????????????????w????????????L?????????????????????? <130> IBPF15-530WO <150> JP2014/194379 <151> 2014-09-24 <160> 20 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 1 cttccctctg gactctcacg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 2 aggctgtgcc tagcagtgtt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 3 tggccactgg atactgaaca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 4 cccaaatcca tcctcaaatg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 5 tgactccagg aaccagcgaa g 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 6 gcgaatgcct gttacactgt tga 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 7 gaagtccctt gccatcctaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 8 gcacgaaggc tcatcattca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 9 agactctgac cagagatcga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 10 ggtggacagt ttcatgaagc 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 11 ggagattctg ggtcaagtaa tgtt 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 12 tgtgctagcc ctgatgttga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 13 accggagaaa agagctatgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 14 tggggagttt aagacctctc 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 15 tacttcagat gcgatggcta c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 16 ctgagttcag gaaataggag a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 17 gctttcaagt gcctttctgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 18 gttggttgga tacttgctgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 19 agctctagac aaccctgcaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 20 agggttccat ctcagctcaa 20

Claims (3)

  1. 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법이며,
    (a) 피검체로부터 분리된 편평상피암 시료에 대해,
    SIM2 유전자의 발현 레벨과,
    SIM2 유전자와 공발현하고 있는 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨
    을 검출하는 공정,
    (b) 공정 (a)에서 검출된 발현 레벨을 각 유전자의 기준 발현 레벨과 비교하는 공정, 및
    (c) 공정 (b)에 있어서의 비교 결과, 상기 피검체에 있어서의 발현 레벨이 각 기준 발현 레벨보다도 높은 경우, 상기 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성은 높다고 판정하는 공정을 포함하고, 또한
    상기 SIM2 유전자와 공발현하고 있는 유전자군이, FMO2, PPL, SPRR3, CD24, SPINK5, TGM1, SERPINB1, SCEL, S100A14, RHCG, IL1RN, MPZL2, CRNN, C1orf177, KRT13 및 CRABP2로 이루어지는 유전자군인, 방법.
  2. 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법이며,
    (a) 피검체로부터 분리된 편평상피암 시료에 대해,
    SIM2 유전자의 발현 레벨과,
    SIM2 유전자와 공발현하고 있는 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨과,
    FOXE1 유전자의 발현 레벨과,
    FOXE1 유전자와 공발현하고 있는 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨
    을 검출하는 공정,
    (b) 공정 (a)에서 검출된 발현 레벨을 각 유전자의 기준 발현 레벨과 비교하는 공정, 및
    (c) 공정 (b)에 있어서의 비교 결과,
    상기 피검체에 있어서의 SIM2 유전자의 발현 레벨이 SIM2 유전자의 기준 발현 레벨보다도 높고,
    상기 피검체에 있어서의 SIM2 유전자와 공발현하고 있는 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨이, 각 유전자의 기준 발현 레벨보다도 높고,
    상기 피검체에 있어서의 FOXE1 유전자의 발현 레벨이 FOXE1 유전자의 기준 발현 레벨보다도 낮고, 또한
    상기 피검체에 있어서의 FOXE1 유전자와 공발현하고 있는 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 발현 레벨이, 각 유전자의 기준 발현 레벨보다도 낮은 경우,
    상기 피검체에 있어서의 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성은 높다고 판정하는 공정을 포함하고,
    상기 SIM2 유전자와 공발현하고 있는 유전자군이, FMO2, PPL, SPRR3, CD24, SPINK5, TGM1, SERPINB1, SCEL, S100A14, RHCG, IL1RN, MPZL2, CRNN, C1orf177, KRT13 및 CRABP2로 이루어지는 유전자군이고, 또한
    상기 FOXE1 유전자와 공발현하고 있는 유전자군이, LOC344887, NTRK2, AKR1C1, TMEM116, SCN9A, NRCAM, SAMD12, JAKMIP3, CCL26, MRAP2, FAXC, SOX2-OT, GCLC, SLC35G1, AKR1C3, SLCO3A1 및 ABCC5로 이루어지는 유전자군인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 의해, 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 조성물이며, 하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 적어도 1의 조합을 포함하는 조성물:
    (a) SIM2 유전자의 전사산물 또는 그의 상보적 핵산에 하이브리다이즈하는, 적어도 15 뉴클레오티드의 쇄길이를 갖는 올리고뉴클레오티드와, 상기 SIM2 유전자와 공발현하고 있는 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 전사산물 또는 그의 상보적 핵산에 하이브리다이즈하는, 적어도 15 뉴클레오티드의 쇄길이를 갖는 올리고뉴클레오티드와의 조합,
    (b) FOXE1 유전자의 전사산물 또는 그의 상보적 핵산에 하이브리다이즈하는, 적어도 15 뉴클레오티드의 쇄길이를 갖는 올리고뉴클레오티드와, 상기 FOXE1 유전자와 공발현하고 있는 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 전사산물 또는 그의 상보적 핵산에 하이브리다이즈하는, 적어도 15 뉴클레오티드의 쇄길이를 갖는 올리고뉴클레오티드와의 조합,
    (c) SIM2 유전자의 번역산물에 결합하는 항체와, 상기 SIM2 유전자와 공발현하고 있는 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 번역산물에 결합하는 항체와의 조합,
    (d) FOXE1 유전자의 번역산물에 결합하는 항체와, 상기 FOXE1 유전자와 공발현하고 있는 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1의 유전자의 번역산물에 결합하는 항체와의 조합.
KR1020177010586A 2014-09-24 2015-09-24 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법 KR102578551B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014194379 2014-09-24
JPJP-P-2014-194379 2014-09-24
PCT/JP2015/076927 WO2016047688A1 (ja) 2014-09-24 2015-09-24 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170058984A KR20170058984A (ko) 2017-05-29
KR102578551B1 true KR102578551B1 (ko) 2023-09-15

Family

ID=55581211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177010586A KR102578551B1 (ko) 2014-09-24 2015-09-24 편평상피암에 대한 화학 방사선 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10969390B2 (ko)
EP (1) EP3199640A4 (ko)
JP (2) JP7016466B2 (ko)
KR (1) KR102578551B1 (ko)
CN (1) CN106715722A (ko)
CA (1) CA2962551C (ko)
WO (1) WO2016047688A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101561502B1 (ko) * 2014-05-27 2015-10-20 노명규 로만쉐이드 겸용 커튼
CN110632318B (zh) * 2019-10-28 2023-04-07 四川大学华西医院 Tpm3自身抗体检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途
CN114167059B (zh) * 2021-11-03 2023-07-14 郑州大学 一种用于食管鳞癌诊断的生物标志物及检测试剂盒

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2494356A1 (en) 2002-08-02 2004-02-12 Compugen Ltd. Sim2 polypeptides and polynucleotides and uses of each in diagnosis and treatment of ovarian, breast and lung cancers
JP5150909B2 (ja) * 2005-07-27 2013-02-27 オンコセラピー・サイエンス株式会社 食道癌を診断する方法
US7914988B1 (en) * 2006-03-31 2011-03-29 Illumina, Inc. Gene expression profiles to predict relapse of prostate cancer
WO2009126310A2 (en) * 2008-04-10 2009-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identification and use of agents targeting cancer stem cells
WO2009151511A1 (en) * 2008-04-29 2009-12-17 Therasis, Inc. Systems and methods for identifying combinations of compounds of therapeutic interest
US8211643B2 (en) * 2008-05-14 2012-07-03 University Health Network Prognostic and predictive gene signature for non-small cell lung cancer and adjuvant chemotherapy
WO2010053717A1 (en) 2008-10-29 2010-05-14 William Beaumont Hospital Methods of using biomarkers
EP2370813A4 (en) * 2008-12-04 2012-05-23 Univ California MATERIALS AND METHODS FOR DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF PROSTATE CANCER
US20110224088A1 (en) 2010-03-11 2011-09-15 Heidi Lyng Biomarkers for subtypes of cervical cancer
JP5702944B2 (ja) 2010-03-31 2015-04-15 独立行政法人国立がん研究センター バイオマーカー
AU2013347838A1 (en) * 2012-11-26 2015-06-11 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Biomarker compositions and methods

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ann Oncol, 25(9): 1769-1774 (2014.06.06.)*
Ann Surg Oncol, 14(12): 3602-3609 (2007.09.26.)*

Also Published As

Publication number Publication date
US20170292955A1 (en) 2017-10-12
KR20170058984A (ko) 2017-05-29
US10969390B2 (en) 2021-04-06
CA2962551A1 (en) 2016-03-31
CA2962551C (en) 2023-10-24
JP7016466B2 (ja) 2022-02-07
EP3199640A1 (en) 2017-08-02
WO2016047688A1 (ja) 2016-03-31
JP2022009848A (ja) 2022-01-14
EP3199640A4 (en) 2018-03-14
JPWO2016047688A1 (ja) 2017-07-06
CN106715722A (zh) 2017-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9315869B2 (en) Marker for predicting gastric cancer prognosis and method for predicting gastric cancer prognosis using the same
JP7186700B2 (ja) 腫瘍抑制ｆｏｘｏ活性を酸化ストレスから区別する方法
CN117965741A (zh) 胰腺癌的检测试剂盒或装置以及检测方法
KR20200019849A (ko) 폐암의 검출을 위한 키트, 디바이스 및 방법
JP2015536667A (ja) 癌のための分子診断検査
KR20130115250A (ko) 암에 대한 분자적 진단 테스트
CN105874079A (zh) 用于肺癌的分子诊断测试
JP2022009848A (ja) 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法
WO2013052480A1 (en) Marker-based prognostic risk score in colon cancer
KR20160057416A (ko) 식도암에 대한 분자적 진단 검사
US20210164056A1 (en) Use of metastases-specific signatures for treatment of cancer
CA2504403A1 (en) Prognostic for hematological malignancy
US10036070B2 (en) Methods and means for molecular classification of colorectal cancers
WO2018127786A1 (en) Compositions and methods for determining a treatment course of action
CN112020566A (zh) 用于膀胱癌的检测的试剂盒、器件和方法
US10301685B2 (en) Method for predicting the benefit from inclusion of taxane in a chemotherapy regimen in patients with breast cancer
CN109182528B (zh) 一种基于itgb5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒及其使用方法
US10351913B2 (en) Compositions and methods for identification of relapse risk and treatment in patients with colorectal cancer
WO2014072086A1 (en) Biomarkers for prognosis of lung cancer
JP2018500046A (ja) 血管内皮細胞増殖因子受容体阻害剤に対する感受性予測方法
WO2010076887A1 (en) Predictive biomarkers useful for cancer therapy mediated by a wee1 inhibitor
JPWO2015137406A1 (ja) 肺扁平上皮癌と肺腺癌の鑑別評価方法
Kawaguchi et al. Identification and validation of a gene expression signature that predicts outcome in malignant glioma patients
WO2016013807A1 (ko) 표적 항암 치료제에 대한 감수성 예측 방법
US20160304961A1 (en) Method for predicting the response to chemotherapy treatment in patients suffering from colorectal cancer

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant