JP6342329B2 - Ｅｇｆｒ阻害剤による治療に対する応答性を予測するための方法 - Google Patents

Description

本発明は、癌治療の化学療法を個別化するため、特に、１以上の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に対する患者の応答性をそのような薬剤による治療の前に評価するための方法を提供する。

プロテアソームは、活性化された細胞膜増殖因子受容体により誘導される調節伝達タンパク質のターンオーバーに中枢的な役割を果たす。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路は、ヒト上皮癌の発生および進行において重要である。ＥＧＦＲ阻害剤との併用治療は、より効果的かつ持続的なＡｋｔ阻害を介して、機能的ＥＧＦＲに依存する自己分泌増殖経路を有する種々のヒト癌細胞において、相乗的な増殖阻害活性およびアポトーシス誘導活性を有する。

ＥＧＦＲ阻害剤は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部癌、結腸直腸癌、およびＨｅｒ２陽性乳癌を含む様々な癌の治療に対して承認済みであるか、または試験されており、標準療法に加えられつつある。ＥＧＦＲ標的の細胞内チロシンキナーゼドメインか細胞外ドメインのいずれかを標的とし得るＥＧＦＲ阻害剤は、一般に集団応答率の低さを悩みとし、多くの場合、効果のないまたは最適でない化学療法、ならびに不要な薬物毒性および出費もたらす。例えば、セツキシマブ（ＥＧＦＲの細胞外ドメインを標的とするキメラモノクローナル抗体）による結腸直腸癌治療に関して報告されている臨床応答率は約１１％であり(Cunningham et al, N Engl Med 2004;351: 337-45)、エルロチニブによるＮＳＣＬＣ治療に関して報告されている臨床応答率は約８．９％である(Shepherd F A, et al, N Engl J Med 2005; 353:123-132)。

特に、ＫＲＡＳ突然変異の場合には耐性が認められている。

結腸直腸癌では、ＫＲＡＳ突然変異は抗ＥＧＦＲ抗体に対する耐性と明らかに関連があるので(Lievre et al, Cancer Res. 2006 66(8):3992-5)、非突然変異型ＫＲＡＳ患者において、この療法に対する応答の欠如を予測できる他のマーカーを同定することが、大きな挑戦の１つである。中でも、癌遺伝子の増幅または活性化突然変異、および上記の腫瘍抑制遺伝子の不活性化突然変異は、例えば、ＥＧＦＲ下流リンタンパク質発現の測定により評価されるＥＧＦＲ下流シグナル伝達経路の活性化レベルなど、関連のある候補である。

肺癌では、３群の患者が現れ、第１群は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ ＴＫＩ）の使用が転帰を改善することが分かっている、ＥＧＦＲ変異型腫瘍を有する患者であり、第２群は、抗ＥＧＦＲ療法がおそらく良好な選択肢とはならない、ＫＲＡＳ変異型腫瘍を有する患者であり、第３群は、応答が予測できない非ＥＧＦＲ変異型かつＫＲＡＳ変異型腫瘍である。非変異型腫瘍群における薬物応答に関連するマーカーで、これまでに有益であることが分かっているものはない。

よって、特許療法のより良い個別化のためには、ＥＧＦＲ阻害剤に対する患者の応答性をそのような薬剤による治療の前に予測する必要がある。

従来技術において、種々の抗癌治療に対する感受性または耐性におけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の関与に関する多数の文献が存在する。しかしながら、ほとんどの場合、研究は部分的であり、不完全であり、実際には、治療に対する臨床応答または非応答の真の予測を可能とするものではない。事実、多くの場合で、研究は、特定の治療に対して感受性もしくは耐性の細胞株におけるか、または患者腫瘍から単離された腫瘍細胞において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍｉＲＮＡの発現の分析に限定されている。さらに、多くの研究では、２つの細胞集団間または患者集団間での発現レベルの違いが示されるものの、新たな患者において応答または非応答の予測を実際に可能とする閾値またはスコアは示されていない。このことは、１つには、多くの研究が臨床現場で得られるデータを欠いているという第１の欠点に関連している。さらに、臨床現場で得られたデータをいくらか示している場合であっても、これらのデータはほとんどの場合で後向きでしかなく、新たなコホートにおける予測法をバリデートするデータを欠いている場合が多い。

一例として、ＷＯ２０１０／１２１２３８には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養での、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性または耐性の肺癌細胞株におけるｍｉＲＮＡ発現の分析が記載されている。臨床現場出得られたデータは示されてない。

ＷＯ２００９／０８０４３７では、抗癌治療に対する応答または非応答を予測するための方法が広く特許請求されている。しかしながら、ＷＯ２００９／０８０４３７に示されているデータは従来の化学療法処理に限られ、ＥＧＦＲ阻害剤に関するデータは示されていない（抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体についてもＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤についても無い）。さらに、化学療法薬分子に関して示されているデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された、患者の腫瘍から単離された腫瘍細胞におけるｍｉＲＮＡの発現に基づいて得られたものである。臨床現場で得られたデータは示されていない。

同様に、ＷＯ２０１１／１３５４５９では、抗癌治療に対する応答または非応答を予測するための方法が広く特許請求されているものの、この文献に示されているデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける種々の抗癌剤に対する癌細胞株の感受性または耐性の予測に限定されている。この場合もまた、臨床現場で得られたデータは示されておらず、従って、ｍｉＲＮＡの発現レベルと患者の臨床応答または生存率の間の相関は示されていない。

Ragusa et al-2010 (Ragusa M. et al. Mol Cancer Ther. 2010 Dec;9(12):3396-409)は、セツキシマブ治療に感受性または耐性であることが知られている結腸直腸癌細胞株において、セツキシマブによる治療後のｍｉＲＮＡの発現レベルを分析した。二者のｍｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ野生型患者とＫＲＡＳ変異型患者で差次的に発現されることが示されている。しかしながら、ＫＲＡＳ野生型患者とＫＲＡＳ変異型患者の差次的発現では、ＫＲＡＳ野生型患者におけるＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を予測することはできない。さらに、多くの他の研究と同様に、これらのｍｉＲＮＡの発現レベルの、患者におけるＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を独立に予測できる能力を示す、臨床現場で得られたデータは示されていない。

Hatakeyama et al-2010 (Hatakeyama H. et al. PLoS One. 2010 Sep 13;5(9):e12702)は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるセツキシマブ処置後の、頭頸部扁平上皮癌に由来する２つの細胞株（一方はセツキシマブ感受性、他方は耐性）において活性化されたタンパク質の比較を開示している。ＥＧＦＲリガンド（ＨＢ−ＥＧＦまたはＴＧＦＡ）は、セツキシマブ耐性細胞株では多量に見られる。このタンパク質はｍｉＲ−２２により調節される。この研究でも、ｍｉＲ−２２発現レベルの、患者におけるセツキシマブに対する応答を予測できる能力を示す、臨床現場で得られたデータは示されていない。

よって、多くの研究が、治療に対して臨床応答を示す患者（結果的に生存率が上昇する）と進行性疾患および生存率の低下を伴う患者の間の識別を実際に可能とする、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルを示す臨床データを欠いている。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞株または腫瘍細胞に対するデータは臨床現場での応答または非応答の予測のためのさらなる分析の裏付けとなると考えられるが、患者において臨床応答を予測するための真の方法を提供すると考えるには明らかに十分でない。このことは、特に、上述の文献でｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて感受性細胞株または腫瘍細胞と耐性細胞株または腫瘍細胞とで差次的に発現されることが判明したｍｉＲＮＡが、本出願において分析した臨床データにおいては臨床応答（無進行生存率または全生存率）と有意に相関することが判明しなかったという事実により証明される。

よって、このような療法がいくつかの選択肢のうちの１つとなる患者において、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を予測するための真の、バリデートされた方法の必要があった。本発明は、この必要に対する対応を提供する。

本発明は、癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を提供し、その方法は、前記患者のサンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（旧称ｈｓａ−ｍｉＲ−３１^＊、配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定することを含んでなる。

好ましくは、患者はＫＲＡＳ野生型癌を有する。

癌は、好ましくは、結腸直腸癌、好ましくは転移性結腸直腸癌である。

最も好ましい実施態様では、本発明は、転移性結腸直腸癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブに応答する可能性が高いかどうかを予測するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を提供し、その方法は、前記患者の腫瘍組織サンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定することを含んでなる。

本発明はまた、癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するためのキットであって、前記患者のサンプルにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための試薬と、前記患者のＢＲＡＦの状態を決定するための試薬を含んでなる、またはからなるキットも提供する。

本発明はさらに、患者が本発明による方法により応答する可能性が高いと分類された場合に、癌に罹患しているその患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤に関する。

本発明はまた、本発明の方法により「応答者」と分類された患者において癌の治療に使用することを意図した薬物の製造のためのＥＧＦＲ阻害剤の使用に関する。

本発明はまた、癌に罹患している患者を治療するための方法であって、（ｉ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法により、前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定すること、および（ｉｉ）前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いと決定された場合に、前記患者にＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含んでなる方法に関する。

図１は、アレイにより定量されたｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルを示すグラフである（ｎ＝４３；平均±ＳＥＭ）。分子量を示す。Ｐ＞０．０００１。 図２Ａは、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより定量された発現レベルを示すグラフである（ｎ＝２３；平均±ＳＥＭ）。分子量を示す。Ｐ＜０．０００１。図２Ｂは、予測値を最適化した発現閾値を用いてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの高発現（ｎ＝１２）または低発現（ｎ＝１１）により分類した、結腸直腸癌を有する非変異型ＫＲＡＳ患者の生存率のカプラン・マイヤーモデルを示す。このＣｏｘ比例ハザードモデルでは、ｐ＝０．０２。ｐ値は、発現データが生存率を予測するという仮説を検定している。１００の並べ替えに基づくログランク検定の並べ替えｐ値：ｐ＝０．０８。 図３は、予測値を最適化した発現閾値を用いてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの高発現（ｎ＝１７）または低発現（ｎ＝１６）により分類された、結腸直腸癌を有する非変異型ＫＲＡＳ患者の生存率のカプラン・マイヤーモデルを示す。このＣｏｘ比例ハザードモデルでは、ｐ＝０．０１６。 図４Ａ〜４Ｃは、予測値を最適化した発現閾値を用いてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの高発現または低発現により分類した、結腸直腸癌を有する非変異型ＫＲＡＳ患者の無進行生存率のカプラン・マイヤーモデルを示す。図４Ａ：群２＋３（患者３８人）、図４Ｂ：群２（セツキシマブで処置した１９人）、図４Ｃ：群３（パニツムマブで処置した１９人）。 図５は、ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現レベルおよび関連の予後（良好：ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現に基づく良好な予後、および不良：ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現に基づく不良な予後）に基づいて分離したＫＲＡＳ変異型患者（ＫＲＡＳＭ）集団と２つのＫＲＡＳ野生型患者集団の生存率のカプラン・マイヤーモデル。 図６Ａ：病勢進行の尤度（ＰＦＳ）を予測するためにＢＲＡＦ突然変異の状態とｍｉＲ発現の対数の因子を用いた多変量ロジスティック回帰モデルを設定するために行ったモデル構築分析。図６Ｂ：ＢＲＡＦ突然変異の状態（ｂｒａｆｍ、ＮＭ：非変異；Ｍ：変異）およびｍｉＲ発現の対数（ｍｉＲ）に基づいて構築した生存、リスク、病勢進行を予測するためのＰＦＳのノモグラム。各患者のリスク予測を個別化するために、点数スケールから対応する点数を選択することにより、それぞれの変数に点数を割り当てる（例えば、変異型ＢＲＡＦを有する患者はスコア８点となり、ｍｉＲ対数＝０．５を有する患者はスコア１２点となる）。次に、点数の合計を、予測される進行速度に相当する合計点数スケールにプロットする。１５０回ブートストラップを行った後、ＰＦＳのノモグラムのｃ−ｉｎｄｅｘ(concordance indices)は０．７５であった。 図７Ａ：病勢進行の尤度（ＰＦＳ）を予測するためにＢＲＡＦ突然変異の状態、年齢、性別およびｍｉＲ発現の対数の因子を用いた多変量ロジスティック回帰モデルを設定するために行ったモデル構築分析。図７Ｂ：ＢＲＡＦ突然変異の状態（ｂｒａｆｍ、ＮＭ：非変異；Ｍ：変異）、年齢、性別（性１：男性、２：女性）およびｍｉＲ発現の対数（ｍｉＲ）に基づいて構築した生存率、リスク、病勢進行を予測するためのＰＦＳのノモグラム。各患者のリスク予測を個別化するために、点数スケールから対応する点数を選択することにより、それぞれの変数に点数を割り当てる（例えば、変異型ＢＲＡＦを有する患者はスコア１７点となり、性＝２の患者はスコア２２点となり、１０歳まで２５歳を超える患者はスコア１点となり、ｍｉＲ対数＝０．５の患者はスコア１２点となる）。次に、点の合計を、予測される進行速度に相当する合計点数スケールにプロットする。１５０回ブートストラップを行った後、ＰＦＳのノモグラムのｃ−ｉｎｄｅｘは０．７７であった。 ＦＦＰＥサンプルと冷凍サンプルにおけるｍｉＲ３１−３ｐの発現レベルの散布図。線形回帰分析は、直線で表され、ｙ＝４０．４３９^＊ｘ−３９７．３として計算され得る両変数間の密接な関係を示す。丸は個々のサンプルを示し、直線は線形回帰を示す。 ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現の「冷凍期待」（ＦＥ）水準に対して行った病勢進行の尤度（ＰＦＳ）を推定するためのロジスティック回帰モデル。曲線はｍｉＲの発現レベル（１０を底とするｌｏｇ）の四分位数分布に相当する。グレーの陰は９５％信頼区間を形成している。 ＢＲＡＦ突然変異の状態とｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現の対数の両方を用いて実施例２で精密化した、ＰＦＳに基づくノモグラムから算出した「病勢進行リスク」スコアに対して行った、病勢進行の尤度（ＰＦＳ）を推定するためのロジスティック回帰モデル。曲線上の数値はスコアに相当する。グレーの陰は９５％信頼区間を形成している。

発明の具体的説明

定義
「患者」は、齢または性を問わず、任意の哺乳動物 、好ましくは、ヒトであり得る。患者は、癌に罹患している。患者は、任意の化学療法薬により治療をすでに受けていてもよいし、または未治療であってもよい。

癌は、好ましくは、ＥＧＦＲを介したシグナル伝達経路が関与する癌である。特に、癌は、例えば、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎臓癌、膵臓癌、膀胱癌、または脳癌であり得る(Ciardello F et al. N Engl J Med. 2008 Mar 13;358(11):1160-74; Wheeler DL et al. Nat Rev Clin Oncol. 2010 September; 7(9): 493-507; Zeineldin R et al. J Oncol. 2010;2010:414676; Albitar L et al. Mol Cancer 2010;9:166; Leslie KK et al. Gynecol Oncol. 2012 Nov;127(2):345-50; Mimeault M et al. PLoS One.2012;7(2):e31919; Liebner DA et al. Ther Adv Endocrinol Metab. 2011 Oct;2(5): 173-95; Leboulleux S et al. Lancet Oncol. 2012 Sep;13(9):897-905; Pan J et al. Head Neck. 2012 Sep 13; Chan SL et al. Expert OpinTher Targets. 2012 Mar;16 Suppl 1 :S63-8; Chu H et al. Mutagenesis.2012 Oct 15; Li Y et al. Oncol Rep. 2010 Oct;24(4): 1019-28; Thomasson M et al. Br J Cancer 2003, 89:1285-1289; Thomasson M et al. BMC Res Notes.2012 May 3;5:216)。特定の実施態様では、腫瘍は固形組織腫瘍および／または事実上、上皮のものである。例えば、患者は、結腸直腸癌患者、Ｈｅｒ２陽性またはＨｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ、すなわち、Ｈｅｒ２陰性、エストロゲン受容体陰性およびプロゲステロン受容体陰性）乳癌患者、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者、頭頸部癌患者（特に、頭頸部扁平上皮癌患者）、膵臓癌患者、または子宮内膜癌患者であり得る。より詳しくは、患者は、結腸直腸癌患者、Ｈｅｒ２陽性またはＨｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ）乳癌患者、肺癌（特に、ＮＳＣＬＣ）患者、頭頸部癌患者（特に、頭頸部扁平上皮癌患者）、または膵臓癌患者であり得る。

好ましい実施態様では、癌は結腸直腸癌であり、さらに好ましくは、癌は転移性結腸直腸癌である。実際に、実施例１〜３に示したデータ、ならびにMosakhani et al-2012 (Mosakhani N. et al. Cancer Genet. 2012 Oct 22. doi:pii: S2210-7762(12)00229-3. 10.1016/j.cancergen.2012.08.003)に開示されているデータは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベルが結腸直腸癌におけるＥＧＦＲ阻害剤（特に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブおよびパニツムマブ）治療に対する応答の予測因子として使用可能であることを明らかに示している。

ＥＧＦＲシグナル伝達経路が関与することが知られている癌において得られたこれらの結果は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルが、肺癌、卵巣癌、子宮内膜、甲状腺癌、鼻咽頭癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎臓癌、膵臓癌、膀胱癌、または脳癌などの、ＥＧＦＲシグナル伝達経路が関与することが知られている他のいずれの癌においても、ＥＧＦＲ阻害剤（特に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブおよびパニツムマブ）に対する応答の予測因子として使用可能であることを明らかに示唆している。ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐはこれらの他の癌のいくつかで過剰発現されることが示されているので（Chang KW et al. Oral Oncol. 2012 Jul 30, Xiao W et al. 2012. PLoS ONE 7(6): e38648、およびZhao L. et al. Int J Biochem Cell Biol. 2012 Nov;44(11):2051-9参照）、このことは特にそう言える。ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐはＥＧＦＲ阻害剤に対する、従ってＥＧＦＲシグナル伝達経路に対する応答に相関があることから、また、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐはＥＧＦＲシグナル伝達経路が関与することが知られているいくつかの癌で発現されることから、ＥＧＦＲシグナル伝達経路が関与することが知られている他のいずれの癌においても、ＥＧＦＲ阻害剤（特に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブおよびパニツムマブ）に対する応答の予測に有用であることが合理的に期待できる。

別の好ましい実施態様では、癌はＨｅｒ２陽性またはＨｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ）乳癌、好ましくは、Ｈｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ）乳癌である。

さらに別の好ましい実施態様では、癌は肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。

さらに別の好ましい実施態様では、癌は膵臓癌である。

明らかに、この予測はＥＧＦＲ阻害剤治療に関するものであるので、患者の腫瘍は好ましくはＥＧＦＲ陽性である。

好ましくは、患者は、ＫＲＡＳ野生型腫瘍を有し、すなわち、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子は、コドン１２、１３（エキソン１）、または６１（エキソン３）で変異していない。言い換えれば、ＫＲＡＳ遺伝子は、コドン１２、１３および６１において野生型である。

野生型、すなわち、非変異型のコドン１２、１３（エキソン１）、および６１（エキソン３）はそれぞれグリシン（Ｇｌｙ、コドン１２）、グリシン（Ｇｌｙ、コドン１３）、およびグルタミン（Ｇｌｎ、コドン６１）に相当する。野生型参照ＫＲＡＳアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４９７６．２（配列番号２）に見出すことができる。

特に、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子は、以下の突然変異のいずれをも示さない(Bos. Cancer Res 1989;49:4682-4689; Edkins et al. Cancer Biol Ther. 2006 August; 5(8): 928-932; Demiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115)：
Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ（ＧＧＴ＞ＡＧＴ）
Ｇｌｙ１２Ａｒｇ（ＧＧＴ＞ＣＧＴ）
Ｇｌｙ１２Ｃｙｓ（ＧＧＴ＞ＴＧＴ）
Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ＧＧＴ＞ＧＡＴ）
Ｇｌｙ１２Ａｌａ（ＧＧＴ＞ＧＣＴ）
Ｇｌｙ１２Ｖａｌ（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）
Ｇｌｙ１３Ａｒｇ（ＧＧＣ＞ＣＧＣ）
Ｇｌｙ１３Ｃｙｓ（ＧＧＣ＞ＴＧＣ）
Ｇｌｙ１３Ａｓｐ（ＧＧＣ＞ＧＡＣ）
Ｇｌｙ１３Ａｌａ（ＧＧＣ＞ＧＣＣ）
Ｇｌｙ１３Ｖａｌ（ＧＧＣ＞ＧＴＣ）。

好ましくは、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子はまた、以下の突然変異のいずれをも示さない(Demiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115)：
Ｇｌｙ１２Ｐｈｅ（ＧＧＴ＞ＴＴＴ）
Ｇｌｙ１３Ｓｅｒ（ＧＧＣ＞ＡＧＣ）。

好ましくは、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子はまた、以下の突然変異のいずれをも示さない(Bos. Cancer Res 1989;49:4682-4689; Tarn et al. Clin Cancer Res 2006;12:1647-1653; Edkins et al. Cancer Biol Ther. 2006 August; 5(8): 928-932; Demiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115)：
Ｇｌｎ６１Ｈｉｓ（ＣＡＡ＞ＣＡＣ）
Ｇｌｎ６１Ｈｉｓ（ＣＡＡ＞ＣＡＴ）
Ｇｌｎ６１Ａｒｇ（ＣＡＡ＞ＣＧＡ）
Ｇｌｎ６１Ｌｅｕ（ＣＡＡ＞ＣＴＡ）
Ｇｌｎ６１Ｇｌｕ（ＣＡＡ＞ＧＡＡ）
Ｇｌｎ６１Ｌｙｓ（ＣＡＡ＞ＡＡＡ）
Ｇｌｎ６１Ｐｒｏ ＣＡＡ＞ＣＣＡ）。

患者のＫＲＡＳの状態を知るには、当技術分野で公知のいずれの方法を用いてもよい。

例えば、腫瘍組織を顕微解剖し、パラフィン包埋組織ブロックからＤＮＡを抽出する。ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、１３、および６１を包含する領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅する。突然変異の状態は、ＰＣＲプローブを用いた対立遺伝子識別法(Laurent-Puig P, et al, J Clin Oncol. 2009, 27(35):5924-30)によるか、またはパイロシーケンス法(Ogino S, et al. J Mol Diagn 2008;7:413-21)などの他の任意の方法により判定する。

「サンプル」とは、患者に由来するいずれの生体サンプルであってもよく、核酸を含有する。このようなサンプルの例としては、体液（血液、血漿、唾液、尿、精液を含む）、組織、細胞サンプル、器官、生検などが挙げられる。好ましくは、サンプルは腫瘍サンプル、好ましくは、腫瘍組織生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部である。サンプルは、従来技術に従って採取してよく、そのまま診断に用いてもよいし、または保存してもよい。腫瘍サンプルは新鮮物、冷凍物またはパラフィン包埋物であってもよい。通常、利用可能な腫瘍サンプルは冷凍物またはパラフィン包埋物であり、ほとんどの場合、パラフィン包埋物である。本発明者らは、冷凍およびパラフィン包埋両方の腫瘍サンプルが使用可能であることを示した。

「参照サンプル」とは、ＥＧＦＲ阻害剤治療に対して陽性または陰性の応答が知られている患者の腫瘍サンプル（特に、腫瘍生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部）を意味する。好ましくは、参照サンプルのプールは、少なくとも１人（好ましくは数人、より好ましくは少なくとも５人、より好ましくは少なくとも６人、少なくとも７人、少なくとも８人、少なくとも９人、少なくとも１０人）の応答患者と、少なくとも１人（好ましくは数人、より好ましくは少なくとも６人、少なくとも７人、少なくとも８人、少なくとも９人、少なくとも１０人）の非応答患者を含んでなる。応答者（「陽性」とも称される）および非応答者（「陰性」とも称される）参照サンプルの数が多いほど、本発明による予測方法の信頼性が良好となる。

本発明に関して、患者が「応答する可能性が高い」または「応答者」であるとは、抗ＥＧＦＲ阻害剤による治療に応答し得る、すなわち、その患者の症状の少なくとも１つが緩和されると期待される、またはその疾患の進展が停止される、もしくは緩徐化される患者を意味する。ＲＥＣＩＳＴ判定基準(Eisenhauer et al, European Journal of Cancer, 2009, 45:228-247)による完全応答者、部分応答者、または安定患者は、本発明に関して「応答する可能性が高い」または「応答者」とみなされる。

固形腫瘍では、ＲＥＣＩＳＴ判定基準は、少なくとも１つの測定可能な病巣の存在に基づく国際標準である。「完全応答」は、総ての標的病巣の消失を意味し、「部分応答」は、標的病巣の最大直径の合計における３０％の減少を意味し、「進行性疾患」は、標的病巣の最大直径の合計における２０％の増大を意味し、「安定疾患」は、上記の判定基準を満たさない変化を意味する。

より好ましくは、「応答者」患者は、良好な無進行生存期間（ＰＦＳ）を示すと予測され、すなわち、前記患者は疾患の症状の悪化なく、少なくとも２５週間生存する可能性があり、かつ／またはこのような患者は良好な全生存期間（ＯＳ）を示し、すなわち、前記患者は少なくとも１４か月生存する可能性がある。

「予測」または「予後」とは、患者がＥＧＦＲ阻害剤による治療に応答する確率または尤度を意味する。

本発明によれば、ＥＧＦＲ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性は、腫瘍細胞がｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ ｍｉＲＮＡを発現するかどうかによって予測される。

用語「治療する」または「治療」とは、癌の進行を安定化させる、緩和する、治癒する、または軽減することを意味する。

「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」は、ＤＮＡから転写されるがタンパク質には翻訳されない遺伝子（非コードＲＮＡ）によりコードされている約２１〜２４、好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長の一本鎖分子であり、その代わりとして、それらはプリｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物から、プレｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステム−ループ構造へ、そして最終的には機能的ｍｉＲＮＡへとプロセシングする。成熟過程で、各プレｍｉＲＮＡは高い相補性を有する２つの異なるフラグメントを生じ、一方はプリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームに起源し、他方は３’アームに起源する。成熟ｍｉＲＮＡ分子は１以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と部分的に相補的であり、それらの主要な機能は遺伝子発現をダウンレギュレートすることである。

ｍｉＲＮＡには国際命名法があり(Ambros V et al, RNA 2003 9(3):277-279; Griffiths-Jones S. NAR 2004 32(データベース公開):D109-D111; Griffiths-Jones S et al. NAR 2006 34(データベース公開):D140-D144; Griffiths-Jones S et al. NAR 2008 36(データベース公開):D154-D158;およびKozomara A et al. NAR 2011 39(データベース公開):D152-D157)、http://www.mirbase.org/においてｍｉＲＢａｓｅから入手可能である。各ｍｉＲＮＡは、下記のように所定の形式で独自の名称が割り当てられる。

・成熟ｍｉＲＮＡの場合には、ｓｓｓ−ｍｉＲ−Ｘ−Ｙ、ここで、
・ｓｓｓはｍｉＲＮＡの種を示す３文字コードであり、「ｈａｓ」はヒトを表す。
・ｍｉＲの大文字「Ｒ」は、成熟ｍｉＲＮＡを表すことを示す。しかしながら、文献の著者によっては、成熟ｍｉＲＮＡに「ｍｉｒ」とも誤用している場合がある。この場合には、「−Ｙ」に存在により成熟ｍｉＲＮＡを表すと認識することができる。
・Ｘは、特定の種におけるｍｉＲＮＡの配列に割り当てられた独自の任意の数字であり、相同性の高いいくつかのｍｉＲＮＡが知られている場合には、この後に１文字が続き得る。例えば、「２０ａ」および「２０ｂ」は、相同性の高いｍｉＲＮＡを表す。
・Ｙは、プレｍｉＲＮＡの切断により得られた成熟ｍｉＲＮＡがプリｍＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームに相当するか（その場合、Ｙは「５ｐ」）または３’アームに相当するか（その場合、Ｙは「３ｐ」）を示す。ｍｉＲＮＡのこれまでの国際命名法においては、「−Ｙ」は存在しない。その後、プリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームまたは３’アームのいずれかから得られた２つの成熟ｍｉＲＮＡは、ｎのすぐ後に「^＊」の印があるかないかによって識別された。「^＊」の印があれば、その配列はあまり頻繁に検出されないｍｉＲＮＡに相当することを示した。このような分類が変化を受けたことから、「３ｐ」および「５ｐ」コードを用いた新たな分類が実施された。

・プリｍｉＲＮＡの場合には、ｓｓｓ−ｍｉｒ−Ｘ、ここで、
・ｓｓｓはｍｉＲＮＡの種を示す３文字コードであり、「ｈａｓ」はヒトを表す。
・ｍｉｒの小文字「ｒ」は、成熟ｍｉＲＮＡではなく（「−Ｙ」がないことで確認される）プリｍｉＲＮＡを表すことを示す。
・ｎは、特定の種におけるｍｉＲＮＡの配列に割り当てられた独自の任意の数字であり、相同性の高いいくつかのｍｉＲＮＡが知られている場合には、この後に１文字が続き得る。

各ｍｉＲＮＡにはまた、その配列に受託番号が割り当てられる。

本発明で検出するｍｉＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（旧称ｈｓａ−ｍｉＲ−３１^＊）である。この名称において、「ｈｓａ」はヒトｍｉＲＮＡに関するものであることを意味し、「ｍｉＲ」は成熟ｍｉＲＮＡを意味し、「３１」はこの特定のｍｉＲＮＡに割り当てられた任意の数字を意味し、「３ｐ」はプリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の３’アームから得られた成熟ｍｉＲＮＡを意味する。

ｍｉＲ−３１−３ｐは、ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＡＡＣＡＵＡＵＵＧＣＣＡＵ（配列番号１）である（http://www.mirbase.orgにおいて受託番号ＭＩＭＡＴ０００４５０４）。

サンプルにおいてｍｉＲＮＡレベルを検出する方法
ｍｉＲＮＡの発現レベルは、当業者に公知の方法によって決定することができる（例えば、ｍｉＲＮＡを定量することができる）。特に、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が有用であり得る。

また、核酸アッセイまたはアレイも、サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルを評価するために使用することができる。

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドアレイは作製または購入することができる。アレイは一般に固相支持体と、その支持体と接触する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、このオリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡの少なくとも一部に相当する。

サンプル中のｍｉＲＮＡの存在を判定するためには、任意の好適なアッセイプラットフォームを使用することができる。例えば、アッセイは、膜、チップ、ディスク、試験ストリップ、フィルター、ミクロスフェア、マルチウェルプレートなどの形態であり得る。アッセイシステムは、ｍｉＲＮＡに相当するオリゴヌクレオチドが結合された固相支持体を持ち得る。この固相支持体は、例えば、プラスチック、ケイ素、金属、樹脂、またはガラスを含んでなり得る。これらのアッセイ成分は、ｍｉＲＮＡを検出するためのキットとして一緒に調製および包装することができる。

いくつかの実施態様では、ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ標的の検出および定量の両方に使用することができる(Bustin et al., 2005, Clin. Sci., 109:365-379)。ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られた定量結果は定性データよりも情報量が多い場合があり、アッセイの標準化および品質管理を簡単にすることができる。よって、いくつかの実施態様では、ｑＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイが、細胞に基づくアッセイの際にｍｉＲＮＡレベルを測定するために有用であり得る。ｑＲＴ−ＰＣＲ法はまた、患者の療法のモニタリングにも有用であり得る。ｑＲＴ−ＰＣＲに基づく方法の例は、例えば、米国特許第７，１０１，６６３号に見出すことができる。市販のｑＲＴ−ＰＣＲに基づく方法（例えばＴａｑｍａｎ(登録商標）アレイ）。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのヒトｍｉＲＮＡパネルも利用可能である。

別の実施態様では、ｍｉＲＮＡ定量はシーケンシングによって実施可能である。

患者の分類
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現が低いほど、患者にとって良好である。従って、このｍｉＲＮＡの発現レベルが低いほど、患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する可能性が高い。一つの実施態様では、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現が対照値よりも低い場合、患者は「応答者」、すなわち、ＥＧＦＲ阻害剤による治療に応答する可能性が高いとみなされる。

このような対照値は、上記で定義したように、参照サンプルのプールに基づいて決定することができる。特に、図１および図２Ａは、参照サンプルのプールに基づき、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベルの対照値（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベルの対数）を定義することができ、これによりＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答または非応答を予測可能であることを明らかに示す。

しかしながら、好ましい実施態様では、この方法は、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルに基づく予後スコアまたは指数を決定することをさらに含んでなり、その予後スコアは、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示す。特に、前記予後スコアは、それが所定の閾値よりも高いか低いか（二分結果）によって、その患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示し得る。別の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答または非応答の離散確率は、予後スコアから導くことができる。

患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率は、ＥＧＦＲ阻害剤治療が患者に投与される場合に、この患者が病勢の進行を伴ってまたは伴わずに生存する確率と関係している。

結果として、予後スコアは、上記で定義したように、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルと参照サンプルのプールの無進行生存率（ＰＦＳ）または全生存率（ＯＳ）の間の相関の分析に基づいて決定することができる。従って、ＰＦＳまたはＯＳをｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルと相関させる関数であるＰＦＳおよび／またはＯＳスコアは、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答の予測のための予後スコアとして使用することができる。好ましくは、病勢進行の不在はＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答の明らかな指標となるので、ＰＦＳスコアが使用される。

好ましい実施態様では、予後スコアは、実施例の節に示されるように決定されるものの１つである。

予後スコアは下式（実施例１に開示されているように、２２の参照サンプルのプールに基づいて決定）により算出することができる。
・ＰＦＳスコア＝０．２０３７３８^＊ｘ−１．４５３３６２（式中、ｘはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現の対数である）
・ＯＳスコア＝０．１９０６７７^＊ｘ−１．３６０１９１（式中、ｘはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現の対数である）

患者は次に、その予後スコアが−０．０９８０８８（ＰＦＳ）および／または−０．０９１８（ＯＳ）以下であれば、応答者であると予測される。好ましくは、患者は、その予後スコアが−０．０９８０８８（ＰＦＳ）以下であれば、応答者として分類される。

別の実施態様では、予後スコアは下式（実施例２に開示されているように、３３の参照サンプルのプールに基づいて決定）により算出することができる。
・ＰＦＳスコア＝０．１７８３６６^＊ｘ−１．３６３６９３（式中、ｘはｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現の対数である）
・ＯＳスコア＝０．１０２１４２^＊ｘ−０．７８０９２７（式中、ｘはｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現の対数である）

患者は次に、その予後スコアが−０．０３１２３（ＰＦＳ）および／または−０．０１７８８４（ＯＳ）以下であれば、応答者であると予測される。好ましくは、患者は、その予後スコアが−０．０３１２３（ＰＦＳ）以下であれば、応答者として分類される。

実験の節で決定されたＰＦＳスコアおよびＯＳスコアは２３および３３の参照サンプルのプールに基づいて得られたものであったが、このことが、実施例１と２で決定されたＰＦＳスコアにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルの対数にＰＦＳを相関させる線形関数のパラメーター間の若干の変動を説明する。さらなる参照サンプルを含めると、これらのパラメーターにいくらかのさらなる若干の変動が起こり得るが、本発明者によって得られた結果により、生存率（ＰＦＳまたはＯＳ）と患者の腫瘍サンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現の対数との間に直線的相関が存在することが確認される。よって、本発明者らによって得られた実験データから、患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に走行する確率はｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルの対数と直線的に相関があると結論づけることができる。従って、好ましい実施態様では、前記予後スコアは下式で表される：予後スコア＝ａ^＊ｘ＋ｂ（式中、ｘは、患者のサンプルにおいて測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルの対数であり、ａおよびｂは、上記で定義したように、参照サンプルのプールに基づいて事前に決定されたパラメーターである）。

患者は次に、その予後スコアが閾値ｃ以下であればＥＧＦＲ阻害剤に応答する、その予後スコアが閾値ｃより大きければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測され、ここでのｃの値も参照サンプルの同じプールに基づいて決定されたものである。

本発明者らによって実施された実験に基づけば、この場合のａ、ｂおよびｃは好ましくは以下の範囲であると判定された。
・ａ：［０．１；０．２５］、好ましくは［０．１７；０．２１］；
・ｂ：［−２；−０．５］、好ましくは［−１，８；−０，６］、好ましくは［−１，５；−０，７ｊ；および
・ｃ：［−０．１１；−０．０１］、好ましくは［−０．１０；−０．０１］
好ましくは、ＰＦＳスコアを用いる場合には、ｃは［−０．１０；−０．０３］の範囲であり、ＯＳスコアを用いる場合には、ｃは［−０．１：−０．０１５］の範囲である。

別の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答または非応答の離散確率は上記のａ^＊ｘ＋ｂ予後スコアから導くことができる。予後スコアが低いほど、ＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答の確率が高い。予後スコアとＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答の確率との間の厳密な相関は、同じ参照サンプルセットに基づいて決定することができる。

また、本発明者らは、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答はｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルだけに基づいて予測することもできるが（実施例１および２参照）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルとＢＲＡＦの状態の組合せが考慮されれば、いっそう信頼性の高い予測を行うことができる（実施例２参照）。従って、好ましい実施態様では、本発明による方法は、前記患者のＢＲＡＦの状態を決定すること、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルとＢＲＡＦの状態を考慮した総合スコアを算出することをさらに含んでなり、この場合、総合スコアは、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示す。

ＢＲＡＦ遺伝子は癌原遺伝子Ｂ−Ｒａｆおよびｖ−Ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１とも呼ばれるが、このタンパク質は、より正式には、セリン／トレオニン−プロテインキナーゼＢ−Ｒａｆとして知られる。このタンパク質は、ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫシグナル伝達経路の調節に役割を果たし、細胞分裂、分化、および分泌に影響を及ぼす。この遺伝子における突然変異は、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、悪性黒色腫、甲状腺癌、非小細胞肺癌、および肺腺癌を含む種々の癌に関連づけられている。

「ＢＲＡＦの状態」は、患者の腫瘍のＢＲＡＦタンパク質が、受託番号ＮＰ＿００４３２４．２（配列番号３）で定義される野生型ＢＲＡＦタンパク質配列と比較してＶ６００Ｅ突然変異（コドン６００におけるバリンのグルタミン酸による置換）を含んでなるかならないかによって、野生型または変異型のいずれかとして定義される。ＢＲＡＦタンパク質がタンパク質配列ＮＰ＿００４３２４．２と比較してＶ６００Ｅ突然変異を含んでならない場合には、ＢＲＡＦの状態は「ＢＲＡＦ野生型」とみなされる。これに対し、患者の腫瘍におけるＢＲＡＦタンパク質が、タンパク質配列ＮＰ＿００４３２４．２と比較してＶ６００Ｅ突然変異を含んでなる場合には、ＢＲＡＦの状態は「ＢＲＡＦ変異型」と定義される。

ＢＲＡＦの状態は、腫瘍サンプルに対して、好ましくは、ＥＧＦＲ阻害剤による治療の前に、例えば、対立遺伝子識別アッセイ（Laurent-Puig P, et al, J Clin Oncol. 2009, 27(35):5924-30およびLievre et al. J Clin Oncol. 2008 Jan 20;26(3):374-9に記載の通り）または直接シーケンシングによって決定することができる。

総合スコアは、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答の予測に関連する付加的パラメーターをさらに含んでなってもよい。このような付加的パラメーターには、例えば、年齢および性別が含まれる。

総合スコアは、特にノモグラムに基づいてもよく、この場合、総合スコアの各変数に対して点数スケールが設定される。ある患者について、各変数の点数スケールから対応する点数を選択することにより、それぞれの変数に点数を割り当てる。離散変数の場合（例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルまたは年齢）、ある変数に帰属する点数は、その変数の値と直線的に相関させる。二分変数の場合（ＢＲＡＦ突然変異の状態または性別など、とり得る値が２つだけ）、とり得る２つの値または変数のそれぞれに異なる２つの値が帰属する。

次に、各変数に割り当てられた点数を加算することで総合スコアを算出する。この総合スコアの値に基づき、次に、総合スコアが閾値（二分スコア）よりも劣っているか優れているかによって良好な応答予後か不良な応答予後かを、または治療に対する応答もしくは非応答の確率を患者に与えることができる。

各変数の点数スケールは、それを上回る／下回ると応答予後が良好または不良であるという閾値、または総合スコアと応答もしくは非応答の確率との間の相関と同様に、参照サンプルの同じプールに基づいて決定することができる。

このような総合スコアの具体例は実施例２に示し（図６Ｂおよび図７Ｂも参照）、本発明の好ましい実施態様に相当する。

ＥＧＦＲ阻害剤
本発明は、１以上の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に対する患者の応答性を、そのような薬剤による治療の前に予測することを可能とする。

ＥＧＲＦ阻害剤はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であってよく、あるいはＥＧＦＲ標的の細胞外ドメインを標的とするものであってもよい。

好ましくは、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、モノクローナル抗体である。

特定の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、もしくはラパチニブ、またはＥＧＦＲ細胞外ドメインを標的とする分子、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブである。

ＥＧＦＲ細胞外ドメインを標的とする分子（抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブを含む）は、主として結腸直腸癌の治療または乳癌治療に使用される。結果として、患者の癌が結腸直腸癌（特に、転移性結腸直腸癌）または乳癌であれば、本発明による方法は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインを標的とする分子、特に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブに対する応答を予測するために使用可能であることが好ましい。

これに対して、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤は主として肺癌（特に、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）の治療に使用されるので、患者の癌が肺癌（特に、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）であれば、本発明による方法は、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブに対する応答を予測するために使用可能であることが好ましい。

膵臓癌または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））では、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤および抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が療法として試験されているので、患者の癌が膵臓癌または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））であれば、本発明による方法は、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、もしくはラパチニブ）または抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブもしくはパニツムマブ）のいずれかに対する応答を予測することが可能である。

セツキシマブおよびパニツムマブは、現在、臨床で主として使用されている抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である。しかしながら、ニモツズマブ（ＴｈｅｒａＣＩＭ−ｈ−Ｒ３）、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、およびザルツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ）などのさらなる抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が開発中である。本発明による方法はまた、特に、患者が結腸直腸癌（特に、転移性結腸直腸癌）、乳癌、膵臓癌または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））に罹患している場合には、これらの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体またはさらに開発され得るであろう他の任意の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（フラグメントを含む）に対する応答を予測するために使用可能である。

同様に、エルロチニブ、ゲフィチニブ、およびラパチニブは、現在、臨床で主として使用されているチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤である。しかしながら、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）、ダコミチニブ（ＰＦ２９９８０４，ＰＦ−００２９９８０４）、ＴＡＫ−２８５、ＡＳＴ−１３０６、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＧ−１４７８（チルホスチンＡＧ−１４７８）、ＡＶ−４１２、ＯＳＩ−４２０（デスメチルエルロチニブ）、ＡＺＤ８９３１、ＡＥＥ７８８（ＮＶＰ−ＡＥＥ７８８）、ペリチニブ（ＥＫＢ−５６９）、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＧ４９０、ＰＤ１５３０３５ＨＣｌ、ＸＬ６４７、およびＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ４８０）などのさらなるチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤が開発中である。本発明による方法はまた、特に、患者が肺癌（特に、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））に罹患している場合には、これらのチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤またはさらに開発され得るであろう他の任意のチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を予測するために使用可能である。

キット
本発明はまた、癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するためのキットであって、
ａ）前記患者のサンプル（好ましくは、腫瘍サンプル、例えば、腫瘍生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部）においてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための試薬と、
ｂ）前記患者のＢＲＡＦの状態を決定するための試薬
を含んでなる、またはからなるキットに関する。

前記患者のサンプルにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための試薬は、特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡに特異的なプライマー対（フォワードおよびリバースプライマー）および／もしくはプローブ、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡに特異的な配列を含んでなるｍｉＲＮＡマイクロアレイを含み得る。

患者のＢＲＡＦの状態を決定するための試薬は、シーケンシング前にＢＲＡＦ遺伝子の全部もしくは一部を増幅するための少なくとも１つのプライマー対、または対立遺伝子識別アッセイにて、例えば、ＡＢＩ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、ＣＡ）（Laurent-Puig P, et al, J Clin Oncol. 2009, 27(35):5924-30およびLievre et al. J Clin Oncol. 2008 Jan 20;26(3):374-9参照）で使用するための、それらの５’末端が蛍光リポーター色素ＦＡＭおよびＶＩＣで標識された特異的プローブセットを含み得る。

本発明のキットは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルおよびＢＲＡＦの状態、場合により、さらなる付加的パラメーターに基づいて、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するための説明書をさらに含んでなり得る。特に、図５Ｂおよび図６Ｂに示されるような、総合スコアおよび総合スコア（合計点数）と予測（応答／非応答または応答もしくは非応答の確率）との間の相関に含まれる総ての変数の点数スケールを含んだノモグラムが含まれてよい。

薬剤、治療的使用および治療方法
本発明の方法は、ＥＧＦＲ阻害剤に関して報告されている臨床応答率に見合う率でＥＧＦＲ阻害剤に対する患者の応答性を予測する。

よって、癌を有する患者を治療するための方法がさらに提供され、その方法は、患者に少なくとも１種類のＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含んでなり、この場合、前記患者は上記のような方法によって「応答者」と分類されている。

特に、本発明は、癌に罹患している患者を治療するための方法に関し、その方法は、（ｉ）本発明による方法によって、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定すること、および（ｉｉ）前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いと決定された場合に、前記患者にＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含んでなる。

本方法は、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が低いと決定された場合に、前記患者に別の抗癌治療を投与する工程（ｉｉｉ）をさらに含んでなり得る。このような別の抗癌治療は具体的な癌およびそれまでに試されている治療にもよるが、特に、放射線療法、他の化学療法分子、または他の抗原に対するモノクローナル抗体（抗Ｈｅｒ２、抗ＶＥＧＦ、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＣＴＬＡ４など）などの他の生物工学製品から選択されてよい。特に、結腸直腸癌の場合、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が低いと決定された場合には、工程（ｉｉｉ）で投与される別の抗癌治療は、
・ＶＥＧＦ阻害剤、特に、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ）、有利には、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン（フォリン酸）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、およびオキサリプラチンの合剤）またはＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン（フォリン酸）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、およびイリノテカンの合剤）化学療法との併用から選択してよく、
・あるいは、患者がすでにＶＥＧＦ阻害剤により、場合により、ＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩ化学療法と併用して上手く治療できなかった場合には、５−ＦＵとともに、場合により、マイトマイシンＢも併用して投与することができる。特定の抗腫瘍薬投与計画なしで生活の質を最大化することを意図して投与される治療と定義されるベストサポーティブケア（すなわち、抗癌治療ではない）を患者にさらに投与してもよい。

本発明のもう１つの課題は、上記で定義したような方法によって患者が応答する可能性が高いと分類された場合に、癌に罹患している患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤である。前記患者は、結腸直腸癌、より詳しくは、転移性結腸直腸癌患者であり得る。あるいは、前記患者は、乳癌、特に、トリプルネガティブ乳癌患者であり得る。あるいは、前記患者は、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者であり得る。あるいは、前記 患者は、頭頸部癌、特に、頭頸部扁平上皮癌患者であり得る。あるいは、前記患者は、膵臓癌患者であり得る。本発明はまた、上記のような本発明の方法によって「応答者」と分類された患者における癌の治療に使用することを意図した薬剤の製造のためのＥＧＦＲ阻害剤の使用に関する。

好ましい実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブである。あるいは、ＥＧＦＲ阻害剤は、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、特に、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブであり得る。

好ましい実施態様では、
・患者は結腸直腸癌、特に、転移性結腸直腸癌に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブであり；
・患者は乳癌、特に、トリプルネガティブ乳癌に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブであり；
・患者は肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤はチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、特に、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブであり；
・患者は頭頸部癌、特に、頭頸部扁平上皮癌、または膵臓癌に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体（好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブ）またはチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤（特に、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブ）である。

実施例および図面は本発明を例示するものであり、その範囲を限定しない。

実施例１：ＫＲＡＳ野生型結腸直腸癌におけるｍｉＲＮＡのレベルは抗ＥＧＦＲにより処置された患者の生存率の違いを決定づける
患者および方法
患者セット
第１の患者セット（本明細書では「ディスカバリーセット」と呼ぶ）は、男性２９名と女性１４名の４３名の患者から構成された。年齢の中央値は６１．３±１１．４歳であった。全員が本試験の登録時に転移性疾患を持っていた。これらの全患者はＫＲＡＳ野生型結腸癌を発症していた。

ＫＲＡＳの状態は次のようにして決定した。各患者について、手術後すぐに腫瘍断片を冷凍した。腫瘍断片中の腫瘍細胞のパーセンテージを確認した後（ＤＮＡ抽出およびＲＮＡ抽出のために、５０％を超える腫瘍細胞を含有する断片のみを選択した）、Ｑｉａｇｅｎキットを製造者の推奨に従って用いて、腫瘍組織からＤＮＡを抽出した。抽出された腫瘍ＤＮＡにおいて、Laurent-Puig P, et al, J Clin Oncol. 2009, 27(35):5924-30に報告されている方法に従い、コドン１２および１３に対するＴａｑｍａｎプローブを用いてＫＲＡＳの状態を確認した。コドン６１上の突然変異は、ＫＲＡＳ遺伝子のエキソン３シーケンシングにより検出した。この第１のセット群で選択された腫瘍は総て、コドン１２、１３および６１に関してＫＲＡＳ野生型であった。患者の応答状態をＲＥＣＩＳＴ判定基準に従って評価した。２名の患者が完全応答者、１２名が部分応答者とみなされ、１７名が安定疾患を有するとみなされ、１２名が最初の評価時に進行性であった。

追跡期間中に３４名の患者で病勢進行が報告され、追跡期間中に３１名の患者が死亡した。

病勢進行までの追跡期間の中央値は１６．１４週であり、全生存期間の中央値は１２．４か月であった。患者は２名を除く全員がイリノテカン不応であり、２名はオキサリプラチン不応であり；３３名がセツキシマブとイリノテカンの組合せを、１名がパニツムマブとイリノテカンの組合せを、６名がセツキシマブとＦＯＬＦＩＲＩの組合せを、２名がセツキシマブとＦＯＬＦＯＸの組合せを、１名がセツキシマブとゼローダの組合せを受容した。セツキシマブとパニツムマブの導入前の化学療法系統の数を記録した。

ｍｉＲＮＡ発現レベルの定量
ＡｍｂｉｏｎからのｍｉｒＶａｎａｍｉＲＮＡ単離キットを用い、患者２３名のサブグループの冷凍腫瘍から小ＲＮＡを抽出した。製造者の推奨に従い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ ｖ２マイクロＲＮＡ発現ビーズチップ上で、各サンプルから抽出したＲＮＡ７５０ｎｇの標識およびハイブリダイゼーションを行うことによって、グローバルマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）プロファイリングを行った。ビーズチップをＩｌｌｕｍｉｎａｉ Ｓｃａｎ Ｒｅａｄｅｒでスキャンし、データをＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にインポートし、クオンタイルノーマライゼーション(quantile-normalized)およびｌｏｇ_２変換を行った。ｍｉＲＮＡ ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルの特異的定量は、逆転写ＲＮＡ ｎｇに対する特異的ＴａｑＭａｎプレデザインアッセイ、およびＡＢＩ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステムを用いて行った。発現レベルをΔΔＣｔ法により参照ｓｎＲＮＡ ＲＮＵ６Ｂレベルに対して正規化した。

統計分析
統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて行った。定量的リアルタイムＰＣＲ発現データを平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として示した。ノンパラメトリックマン・ホイットニー（ＭＷ）検定を用いて定量値の比較を行った。報告したｐ値は総て両側検定であった。

生存モデル予測
生存リスク群のマイクロＲＮＡ発現に基づく予測因子を、Ｃｏｘ比例ハザードモデル[Cox, D. R. (1972). Regression models and life-tables. Journal of the Royal Statistical Society, Series B 34 (2), 187-220]とスーパービジョン主成分法(supervised principal component method)[E Bair & R Tibshirani, Semi-supervised methods to predict patient survival from gene expression data, PLOS Biology 2:511-522, 2004)]の併用によって算出した。

単変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて、発現レベルの対数が生存期間と相関しているかどうかｍｉＲＮＡを分類した。生存期間は発現レベルに依存しないという仮説を検定し、偽ディスカバリーの割合を多変量並べ替え検定を用いて確認した（Ｎ＝１０００、ｐ＜０．０５）。ｍｉＲＮＡの選択後、主成分を割り出し、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を行い、各主成分に回帰係数（ウエイト）を与えた。

発現プロフィールが、ｘの成分と各主成分値の加重平均を組み合わせた発現レベル対数のベクトルｘにより表される患者について、総合予後スコアを算出した。予後スコアの高い値は、死の危険性の高い値に、また、結果として、相対的に不良な予測生存率に相当する。予測値を評価するためには、１つ抜きクロスバリデーション(leave-one-out cross-validation)を用いる。良好な予後と不良な予後の間で最適な分離をもたらしたスコア閾値をカプラン・マイヤー分析に用いた。

結果
本発明者らは、１１４５のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するＩｌｌｕｍｉｎａヒトマイクロＲＮＡ発現プロファイリングアッセイｖ２を用い、非変異型ＫＲＡＳ結腸直腸腫瘍組織サンプルのグローバルｍｉＲＮＡ発現プロファイリングを行った。分析した１１４５のｍｉＲＮＡのうち、１つがその発現レベルと予後の間に相関を示す。図１は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐが腫瘍サンプルにおいて生存率と高い相関がある、有意に異なる発現レベルを呈し、無病生存率（ＰＦＳ）および全生存率（ＯＳ）に関して見込みのある予測を示すということを示す。他のｍｉＲＮＡは予後と有意に相関があることが判明したが（ｐ＜０．０５）、以下のｍｉＲＮＡは予後と有意な相関があると判明しなかった（ｐ＞０．０５）：ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９４−ｐｒｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−２^＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ^＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ^＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−２^＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ^＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００^＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００、５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７^＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、およびｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ。

これらの予測因子リスク群の安定性をさらに検討することを目的に、ｍｉＲＮＡの発現レベルを定量するために、ＥＧＦＲ阻害剤としてセツキシマブを受容する２３名の患者全員のサンプルに対して、特異的ＴａｑＭａｎプレデザインアッセイを用いたリアルタイムｍｉＲＮＡ定量的ＰＣＲ分析を行った。これら２つの技術により測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベル間には、ｒ＝０．８８とかなりの相関が見られた。ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐは、不良な予後を有する患者からの腫瘍サンプルと良好な予後を有する患者からのサンプルとの間で有意に異なる発現レベルを示した（図２）。トレーニングデータセットからの主成分を用いて当てはめを行ったＣｏｘ比例ハザードモデルの係数は、ＰＦＳでは３．２７１、ＯＳでは３．０６１と見積もられた。その予後スコアが−０．０９８０８８（ＰＦＳ）および−０．０９１８（ＯＳ）より大きい／以下であれば、サンプルは高リスク／低リスクであると予測された。

ＰＰＶは、応答者と予測されるサンプルが実際に応答者群に属す確率である。ＮＰＶは、非応答者と予測されたサンプルが実際に応答者群に属さない確率である。

低レベルのｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現を有する１１名の患者のうち合計９名が、無病として２５週を超えて生存し、１４か月を超える全生存期間を示したが（ＰＰＶ＝８２％、［９５％ＣＩ：４８％〜９８％］）、高レベルのｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現を有する１２名の患者のうち８名が、２５週以内に病勢進行を示し、１４か月以内に死に至った（ＮＰＶ＝６７％［９５％ＣＩ：３５％〜９０％］）。これらの値は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現に対して生存率８０％［９５％ＣＩ：４４％〜９７％］（８／１０）の特異性および６９％［９５％ＣＩ：３８％〜９１％］（９／１３）の感受性を示唆する。

次に、予後スコアを下式により算出することができる。
ＰＦＳスコア＝０．２０３７３８^＊ｘ−１．４５３３６２（式中、ｘは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現の対数である）
ＯＳスコア＝０．１９０６７７^＊ｘ−１．３６０１９１（式中、ｘは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現の対数である）

ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの予測能をバリデートするために、このｍｉＲＮＡの発現レベルを４つの独立したサンプル（１つのパニツムマブ治療、１つの（セツキシマブ＋５ＦＵ＋イリノテカン）治療、および２つの（セツキシマブ＋イリノテカン）治療）においてＴａｑＭａｎにより測定し、予後スコアを算出した（表１）。２名の患者が高リスク生存群であり、２名が低リスク生存群である予測された。低ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現を有する２名の患者のうち１名は、３４か月を超える全生存期間を示し、５０％のＰＰＶを示唆し、高レベルのｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐを有する２名の患者のうち１名は、９か月以内に死に至り、２人目の患者の生存もやはり打切りであったので、１００％のＮＰＶを示す。これらの値は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現に関して生存率５０％（１／２）に対する特異性と１００％（１／１）の感受性を示唆する。

「生存期間」は、観測時間の開始（例えば、手術）から患者の再発イベントまでの期間（ＰＦＳ、週）または死亡イベントまでの期間（ＯＳ、月）を示す。

「打切りインジケーター」は、観測期間に起こった着目イベント（再発または死亡）を示す。１：イベント時間を有する個体；０：個体が観測時間中にイベントを生じない場合、または観測が不完全である場合に発生する観測の打切り。

「予測リスク」は、ＰＦＳスコア閾値に従って、「低」（死亡リスクが低い）または「高」（死亡リスクが高い）と明示される。

「ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現」は、ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現レベル（任意の単位）を表す。

実施例２：種々の抗ＥＧＦＲで処置された患者におけるｍｉＲＮＡの予後力の確認および予後ノモグラムの精密化
患者および方法
患者のトレーニングセット（群１）は、男性２４名と女性９名の３３名の患者から構成される。年齢の平均は５８．５８±１１．６歳である。これらの患者のうち２４名が（セツキシマブ＋イリノテカン）治療を、５名が（セツキシマブ＋５ＦＵ＋イリノテカン）治療を、２名が（セツキシマブ＋５ＦＵ＋オキサリプラチン）治療を、１名が（セツキシマブ＋ゼローダ）治療を、１名が（パニツムマブ＋イリノテカン）治療を受けた。１１名が治療に応答し、２１名が応答しなかった。

バリデーションセットは、各１９名の２つの独立した群からの３８名の患者から構成される。
・この患者群の一方（群２）は、男性１１名と女性８名の１９名の患者を含んでなり、平均年齢は６７．６５±１１．６１歳である。これらの患者のうち１１名が（セツキシマブ＋イリノテカン）治療を、４名が（セツキシマブ＋５ＦＵ＋イリノテカン）治療を、４名がパニツムマブ治療を受けた。４名が治療に応答し、１５名が応答しなかった。
・もう一方の患者群（群３）は、男性１２名と女性７名の１９名の患者を含んでない、平均年齢は６１．８４±１２．２８歳である。全員がこの試験の登録時に転移性疾患を有していた。これらの患者は全員がＫＲＡＳ野生型結腸癌を発症していた。全員が（パニツムマブ＋イリノテカン）治療を受けた。８名が治療に応答し、１１名が応答しなかった。

ＫＲＡＳの状態の決定、ｍｉＲＮＡ発現レベルの定量および統計分析は実施例１で説明した通りに行った。

ＢＲＡＦの状態は腫瘍サンプルにおいて、対立遺伝子識別アッセイ（Lievre et al, Cancer Res, 2006. 66: 3992-3995;およびLaurent-Puig P, et al, J Clin Oncol. 2009, 27(35):5924-30に記載の通り）により決定した。腫瘍細胞におけるＢＲＡＦ遺伝子は、ＢＲＡＦ遺伝子がＶ６００Ｅ置換（Ｔ１７９９Ａ）を示さなければ野生型とみなした。

生存モデル予測を実施例１の場合と同様に行った。

患者の応答状態は、ＲＥＣＩＳＴ判定基準に従って評価した。病勢進行までの追跡期間の中央値は１９．８６週であり、全生存期間の中央値は１１．６７か月であった。

結果
特異的ＴａｑＭａｎプレデザインアッセイを用いたリアルタイムｍｉＲＮＡ定量的ＰＣＲ分析を行い、３３名の患者のトレーニングセットに対してｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現レベルを定量した。ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐは、不良な予後を有する患者からの腫瘍サンプルと良好な予後を有する患者からのサンプルとの間で有意に異なる発現レベルを示した（図３）。トレーニングデータセットからの主成分を用いて当てはめを行ったＣｏｘ比例ハザードモデルの係数は、ＰＦＳでは３．３８８と見積もられた。その予後スコアが−０．０３１２３（ＰＦＳ）より大きい／以下であれば、サンプルは高リスク／低リスクであると予測された。

低いｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現レベルを有した低リスクの１６名の患者のうち合計１０名が無病として２５週を超えて生存し、ＰＰＶ＝６３％［９５％ＣＩ：３５％〜８５％］となり、一方、高いｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現レベルを有した１７名の患者のうち１３名が２０週以内に病勢進行を示し、ＮＰＶ＝７６％［９５％ＣＩ：５０％〜９３％］となった。これらの値は、ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現に対して６８％［９５％ＣＩ：４３％〜８７％］（１３／１９）の特異性および７１％［９５％ＣＩ：４１％〜９１％］（１０／１４）の感受性を示唆する。

無進行生存スコア(prognostic free survival score)は下式により算出することができる。

ＰＦＳスコア＝０．１７８３６６^＊ｘ−１．３６３６９３（式中、ｘは、ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現の対数である）

ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの推定能をバリデートするために、このｍｉＲＮＡの発現レベルを３８の独立したサンプルにおいてＴａｑＭａｎで測定した。本発明者らは、患者の無病生存率を予測するために、群２および３に対して群１から得られた多変量モデルを適用した。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定およびＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いたところ、生存率は、不良な予後を有する患者からのサンプルと良好な予後を有する患者からのサンプルとの間で有意に異なる。このバリデーションセットが受ける治療によって分割されても、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定によれば、群２および群３で有意性は維持される（図４）。低いｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現を有する１６名の患者のうち１３名が２１週を超える無進行生存期間（ＰＦＳ）を示し、ＰＰＶは８１％［９５％ＣＩ：５４％〜９６％］となり、高レベルのｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐを有する２２名の患者のうち１４名が２０か月未満のＰＦＳを示し、ＮＰＶは６４％［９５％ＣＩ：４１％〜８３％］となった。これらの値は、ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現に対して８２％［９５％ＣＩ：５６％〜９６％］の特異性および６２％［９５％ＣＩ：３８％〜８２％］の感受性を示唆する。

さらに、これまでにＫＲＡＳの状態だけに基づいて応答する可能性が高いとみなされていた、高いｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現を有するＫＲＡＳ野生型の患者は、実際には抗ＥＧＦＲ抗体に応答する機会が極めて低く、従って、極めて不良な予後を持っていたことから、ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現レベルに基づく予後の評価は臨床上極めて重要である。このことは図５に示されており、図５は、ＫＲＡＳ変異型患者（ＫＲＡＳＭ）の生存曲線を示し、ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現レベルと関連の予後（低いｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現に対しては良好な予後、高いｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐ発現に対しては不良な予後）に基づいて２つのＫＲＡＳ野生型患者集団が分離した。ＫＲＡＳ変異型患者（ＫＲＡＳＭ）の生存曲線は、ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現レベルによって不良な予後の群（ＢＡＤ）に分類されたＫＲＡＳ野生型患者の生存曲線と類似している。このことは、患者がｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現レベルによって「高リスク」と分類された場合には、抗ＥＧＦＲ治療が全面的に無効であることを示唆する。

これらの結果により、ＢＲＡＦ突然変異の状態とｍｉＲ発現の対数を共変量として用いる多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて、病勢進行の尤度を予測するためのＰＦＳに関するノモグラムを構築した（図６Ａおよび６Ｂ参照）。本発明者らは、患者から入手可能なデータを、予測モデルを開発するために用いるトレーニングセット（群１の患者を含む）とバリデーションセット（群２および３の患者を含む）に分割した。このモデルの予測精度は、ｉ）受信者動作特性曲線(receiver operating characteristic curve)下面積（０．７５３５８８８）と数値的に同じＣ−ｉｎｄｅｘ、およびｉｉ）病勢進行スコアのリスクに基づいて行った単変量Ｃｏｘ生存分析（ｐ＜０．０００１）を用い、独立したバリデーションデータセットで定量した。（図６Ｂ）それは、ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現レベルと無進行生存率との間の相関を示す。ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現レベルが高いほど、予後は良好でなくなる。

ｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現レベルに基づく別のノモグラムを、年齢、性別およびＢＲＡＦ突然変異の有無を考慮して精密化した。なお、モデルの予測精度はＡＵＣ＝０．７７とし、単変量ｃｏｘ ｐ＜０．０００１を用いた（図７Ａおよび７Ｂ）。

実施例３：ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルと冷凍腫瘍サンプルの結果間の相関、およびＦＦＰＥ非依存性腫瘍サンプルに対して精密化したノモグラムの予測値の確認
患者および方法
患者サンプルは、男性２７名と女性１４名の４１名の患者から構成される。年齢の平均は６０．５±１２．４歳である。患者は全員、イリノテカンに基づく化学療法で病勢進行を示し、その後、２週間周期ごと（周期は１４日ごとである）の１日目にイリノテカン１８０ｍｇ／ｍ^２を９０分で投与したすぐ後に、１日目に用量６ｍｇ／ｋｇのパニツムマブを６０分静注として受容した。これらの患者の全員について、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍サンプルが入手可能であり、それらのうち１５名については、冷凍腫瘍サンプルも入手可能であり、これらの２つのサンプル種の間のｈｓａ−ｍｉＲＮＡ−３１−３ｐ発現レベルの直接比較が可能であった。

小ＲＮＡは、ＦＦＰＥ腫瘍サンプルからはｍｉＲＮｅａｓｙ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、冷凍腫瘍サンプルからはＡｍｂｉｏｎ製のｍｉｒＶａｎａｍｉＲＮＡ単離キットを用いて抽出した。

回帰分析を行い、同じ患者（ｎ＝１５）の冷凍値とＦＦＰＥ値を比較した。データを適合させる式の決定を可能とした直線を用い、両変数間の関係を説明する線形回帰モデルの試みを行った。

ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦの状態の決定、ｍｉＲＮＡ発現レベルの定量ならびに統計分析 は、実施例１および２に記載の通りに行った。ＫＲＡＳ変異が存在するために２名の患者を除外した。患者の応答状態はＲＥＣＩＳＴ判定基準に従って評価した。３９名の患者のうち、１７名が治療に応答し、２１名が応答せず、１名の患者は評価ができなかった。病勢進行までの追跡期間の中央値は２８．３週であり、全生存期間の中央値は１２．９か月であった。

残った３９名の患者に対して生存分析とモデル予測を実施例２に記載の通りに行った。

結果
ＦＦＰＥサンプルと冷凍サンプルで、特異的ＴａｑＭａｎプレデザインアッセイを用いたリアルタイムｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）定量的ＰＣＲ分析を行い、３９名の患者全員のｈｓａ−ｍｉＲ３１−３ｐの発現レベルを定量した。

線形回帰モデル（図８参照）は、１３の冷凍サンプルと対応するＦＦＰＥサンプルとの発現値間の強い相関（修正Ｒ^２＝０．７８）を導き、直線性に対する確かな証拠は推定されず（ｐ＝７．６ｅ−０６、Ｆ検定＝５０．９８、ＤＦ＝１３）、下式が得られた：
ｙ＝４０．４３９^＊ｘ−３９７．３
〔式中、ｙは、患者の冷凍サンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルに相当し、ｘは、対応する患者のＦＦＰＥサンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルに相当する〕。この式を用いて、採取した各ＦＦＰＥサンプルについて「冷凍期待」（ＦＥ）発現値を決定した。

Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた単変量生存分析により、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現のＦＥ水準（Ｗａｌｄ検定、ｐ＝０．００４）単独の生存リスク進行に対する予測値を確認した（図９参照）。

また、ＦＥのｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベルの予測精度は、ＢＲＡＦ変異の状態およびｍｉＲ発現の対数の療法を用いて実施例２で精密化したＰＦＳに関するノモグラムに基づいて測定した。１５０回ブートストラップを行った後、このモデルは０．６６４のｃ−ｉｎｄｅｘを示した。各サンプル値から「病勢進行リスク」スコアが得られ（実施例２に記載の通り）、これは病勢進行の生存リスクの予測因子となることが判明した（Ｗａｌｄ検定、ｐ＝０．０００５）（図１０参照）。

参照文献

Claims (16)

1. 結腸直腸癌または肺癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測することを補助するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、前記患者のサンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定することを含んでなる、方法。
2. 前記患者がＫＲＡＳ野生型癌を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記癌が結腸直腸癌である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記癌が肺癌である、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記ＥＧＦＲ阻害剤が抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ＥＧＦＲ阻害剤がチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記癌が結腸直腸癌であり、かつ、前記ＥＧＦＲ阻害剤が抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項１〜３および５のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記癌が肺癌であり、かつ、前記ＥＧＦＲ阻害剤がチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤である、請求項１、２、４および６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記サンプルが腫瘍組織生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが低いほど、患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する可能性が高い、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ｍｉＲＮＡの発現レベルに基づいて予後スコアを決定することをさらに含んでなり、その予後スコアは患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示すものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 結腸直腸癌または肺癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するための方法であって、前記患者のサンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定すること、および、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルに基づいて予後スコアを決定することを含んでなり、その予後スコアは患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示すものであり、並びに、
    前記予後スコアが式：
    予後スコア＝ａ^＊ｘ＋ｂ
    であり、式中、
    ｘは、患者のサンプルで測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルの対数であり、
    ａおよびｂは、参照サンプルのプールに基づいて事前に決定されたパラメーターであり、かつ、
    患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃ以下であればＥＧＦＲ阻害剤に応答すると予測され、その予後スコアが閾値ｃより大きければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測され、ここで、前記ｃの値は参照サンプルの同じプールに基づいて決定されたものである、方法。
14. ａ、ｂおよびｃが以下の範囲：
    ａ：［０．１；０．２５］；
    ｂ：［−２；−０．５］；および
    ｃ：［−０．１１；−０．０１］
    である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記患者のＢＲＡＦの状態を決定すること、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルとＢＲＡＦの状態を考慮した総合スコアを算出することをさらに含んでなり、前記総合スコアは前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
16. 結腸直腸癌または肺癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するためのキットであって、
    ａ）前記患者のサンプルにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための試薬と、
    ｂ）前記患者のＢＲＡＦの状態を決定するための試薬
    を含んでなる、またはからなる、キット。