ES2608923T3

ES2608923T3 - Métodos y composiciones para aumentar la sensibilidad a los inhibidores de la tirosina quinasa

Info

Publication number: ES2608923T3
Application number: ES10832418.7T
Authority: ES
Inventors: Peter Jeffery Leedman; Keith Michael Giles; Felicity Caris Kalinowski
Original assignee: University of Western Australia
Current assignee: University of Western Australia
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2017-04-17
Anticipated expiration: 2030-11-24
Also published as: DK2521555T3; AU2010324530B2; EP2521555A1; CN102762214A; WO2011063456A1; US20130090366A1; CA2781571A1; AU2010324529A1; WO2011063455A1; JP2013511559A; CN102762213A; US9051551B2; EP2521555B1; EP2504014A4; AU2010324530A1; JP2013511560A; US20130116299A1; CA2781572A1; EP2521555A4; EP2504014A1

Abstract

Un miARN miR-7, o un precursor del mismo, en el que el precursor se selecciona del grupo que consiste en hsamiR- 7-1, hsa-miR-7-2 y hsa-miR-7-3, en combinación con un inhibidor de la tirosina quinasa selectivo o específico para el EGFR, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto, en el que las células cancerosas expresan o expresan de forma aumentada el EGFR, y de forma opcional en el que el cáncer presenta resistencia a la tirosina quinasa en ausencia de tratamiento.

Description

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Métodos in vitro de aumento de la sensibilidad a los inhibidores de la tirosina quinasa.

En realizaciones particulares, la presente invención proporciona métodos in vitro de sensibilización de una célula enferma que expresa el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) a un inhibidor de la tirosina quinasa selectivo o específico para el EGFR, y medios para el tratamiento de un cáncer que expresa el EGFR.

En el presente documento se describe que el contacto de la célula o el cáncer con el miARN, o un agente que tenga la capacidad de estimular o potenciar la expresión o actividad de un miARN miR-7, puede conseguirse mediante cualquier método conocido en la técnica. El contacto de la célula y el miARN se produce in vivo. El miARN o agente que tiene la capacidad de estimular o potenciar la expresión o actividad de un miARN miR-7 se puede poner en contacto con la célula de forma directa, es decir aplicado de forma directa a una célula que requiere sensibilización a un TKI o, como alternativa, puede combinarse con la célula de forma indirecta, por ejemplo mediante inyección de la molécula en la circulación sanguínea de un sujeto la cual, después, porta la molécula hasta la célula que requiere sensibilización a un TKI. Adicionalmente, puede retirarse una muestra de un sujeto y combinarse con un miARN o agente que tenga la capacidad de estimular o potenciar la expresión o actividad de un miARN miR-7 in vitro, antes de devolver al menos una porción de la muestra de vuelta al sujeto. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre que se retira de un sujeto y se combina con el miARN antes de la inyección de al menos una porción de la sangre de vuelta en el sujeto.

El miARN o agente que tiene la capacidad de estimular o potenciar la expresión o actividad de un miARN miR-7 se pone en contacto con una célula, en la que los niveles endógenos del miARN son distintos en comparación con la célula antes del contacto con el miARN. El término “endógeno”, como se utiliza en este contexto, se refiere a los niveles de expresión y/o actividad “de origen natural” del miARN relevante. Los compuestos o composiciones pueden ponerse en contacto con las células de forma que la expresión y/o actividad del miARN esté aumentada o disminuida en comparación con los niveles “de origen natural”.

Los niveles elevados de algunos ligandos del EGFR, por ejemplo de TGFα, son indicativos de resistencia o insensibilidad al TKI (Addison et al. (2010) J. Clin Oncol. publicado antes de la edición impresa el 15 de noviembre de 2010 como documento 10.1200/JCO.2010.31.0805). Por consiguiente, en algunas realizaciones la sensibilización de una célula enferma que expresa el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) a un inhibidor de la tirosina quinasa selectivo o específico para el EGFR, puede determinarse mediante el análisis de los niveles de ligando del EGFR. Por ejemplo, la administración de miARN miR-7, un precursor o variante del mismo, o un miARN que comprende una región semilla que comprende la secuencia GGAAGA a un sujeto, puede cambiar el nivel de expresión de un ligando del EGFR. Las muestras obtenidas a partir de tales sujetos pueden ensayarse mediante cualquier método conocido en la técnica, para determinar el nivel de expresión de un ligando del EGFR en la muestra. Repitiendo el procedimiento de muestreo y ensayo a lo largo del tiempo, se puede controlar y/o comparar el nivel de expresión del ligando del EGFR. Un cambio del nivel de expresión del ligando del EGFR en la muestra puede ser predictivo del nivel de sensibilidad o resistencia del cáncer al inhibidor de la tirosina quinasa. Normalmente, un nivel elevado de expresión de TGFα en células cancerosas con respecto a las células normales es indicativo de resistencia del cáncer al inhibidor de la tirosina quinasa. Por lo tanto, además, normalmente una reducción del nivel de expresión de TGFα en las células cancerosas es indicativo de un aumento en la sensibilidad del cáncer al inhibidor de la tirosina quinasa. El inhibidor de la tirosina quinasa puede ser erlotinib. El ligando del EGFR puede ser TGFα, HB-EGF, anfirregulina, epirregulina, betacelulina, epigén, NRG-1, NRG-2, NRG-3 o NRG-4. En realizaciones particulares el ligando del EGFR es TGFα. La muestra puede ser cualquier muestra biológica, por ejemplo plasma sanguíneo o suero sanguíneo. El inhibidor de la tirosina quinasa puede ser erlotinib.

La administración de los polinucleótidos (por ejemplo miARN) puede ser a través de una estrategia a base de un vector (por ejemplo vírico), o mediante la administración de un polinucleótido en forma de una proteína de fusión en donde el polinucleótido está unido a un fragmento de anticuerpo Fab-protamina que dirige el polinucleótido a las células de interés, es decir, las células que expresan el EGFR.

Enfermedades y afecciones

El EGFR se expresa en células implicadas en muchas afecciones, incluyendo el cáncer. En el presente documento se proporcionan métodos y composiciones para la sensibilización de una célula a un TKI, utilizando el miARN o agente que tenga la capacidad de estimular o potenciar la expresión o actividad de un miARN miR-7 descrito anteriormente. Las composiciones y métodos también se pueden aplicar al tratamiento o prevención de las afecciones asociadas con la expresión del EGFR. Las afecciones a las que los métodos y composiciones de la invención se limitan son cáncer. El término “cáncer”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier crecimiento celular maligno o tumor provocado por la división anómala o descontrolada:

El cáncer puede ser cualquier célula que exprese o tenga expresión aumentada del EGFR. Normalmente, tales cánceres estarán asociados con niveles de expresión o actividad del EGFR regulados de forma positiva o elevados, con respecto a las células y tejidos normales. Los cánceres ejemplares incluyen, pero sin limitación, cánceres de hígado, de ovario, de vejiga, uterino, de cuello uterino, colorrectal, de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, de mama, de próstata, pancreático, de riñón, de colon, gástrico, de endometrio, de estómago, nasofaríngeo, faríngeo,

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(1:15.000, Abcam ab6276-100, Massachusetts, EE.UU.). Antes de la detección con el sistema de detección de transferencia de Western ECL Plus (General Electric Healthcare, Wisconsin, EE.UU.) y ECL-Hyperfilm (General Electric Healthcare, Wisconsin, EE.UU.), se utilizaron los anticuerpos secundarios anti IgG de conejo unido a peroxidasa de rábano picante (1:10.000, General Electric Healthcare n.º NA934V, Wisconsin, EE.UU.), anti IgG de ratón unido a peroxidasa de rábano picante (1:10.000, General Electric Healthcare n.º NA931V; Wisconsin, EE.UU.) y anti IgG de cabra unido a peroxidasa de rábano picante (1:10.000, Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-2020, California, EE.UU.).

Ensayos de viabilidad celular

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5,0 x 103 células por pocillo y se transfectaron con moléculas de precursor de miARN como anteriormente. La viabilidad celular se midió 5 d después de la transfección utilizando el kit de ensayo de proliferación celular CellTitre 96 Aqueous One Solution (Promega, Sydney, Australia), según las instrucciones del fabricante, y un lector de microplacas FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech, Victoria, Australia). Las placas de 96 pocillos se fotografiaron utilizando una cámara digital Canon EOS 400D (Sydney, Australia). Para la transfección de las células FaDu, a las que se añadió erlotinib después de la transfección con los precursores de miARN, las células se sembraron en placa como anteriormente y 3 días después de la transfección se añadió erlotinib (7,5 μM) durante 4 días, después de lo cual se midió la viabilidad celular (medida en total 7 días después de la transfección).

Análisis por transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qRT-PCR)

Se extrajo ARN total a partir de las células HN5 con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Victoria, Australia) y se trató con ADNasa I (Promega, Sydney, Australia) para eliminar el ADN genómico contaminante. Para el análisis de la expresión de ARNm de EGFR y de GAPDH por qRT-PCR, se transcribieron de forma inversa 0,5 μg de ARN total a ADNc, con hexámeros aleatorios utilizando Thermoscript (Invitrogen, Victoria, Australia). La PCR en tiempo real para el ADNc de EGFR y GAPDH se realizó en un instrumento Corbett 3000 RotorGene (Corbett Research, Sydney, Australia) utilizando el kit SensiMixPlus SYBR (Quantace, new South Wales, Australia) y los cebadores para EGFR y GAPDH de PrimerBank (Wang y Seed , 2003, Nucleic Acid Res., 31: e154): EGFR-F, 5’-GCG TTC GGC ACG GTG TAT AA-3’ (SEQ ID NO: 6); EGFR-R, 5’-GGC TTT CGG AGA TGT TGC TTC-3’ (SEQ ID NO: 7); GAPDH-F, 5’-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3’ (SEQ ID NO: 8); GAPDH-R, 5’-GGG GTC ATT GAT GGC AAC ATT A-3’ (SEQ ID NO: 9). Para el análisis adicional de los datos se requirieron curvas de fusión de único pico y eficacias de reacción de > 0,9. La expresión del ARNm de EGFR, RAF1 y PAK1 con respecto al ARNm de GAPDH se determinó utilizando el método 2-ΔΔTT (Livak y Schmittgen (2001), Methods 25: 402-408).

Estadística

Todos los resultados se presentan como medias ± desviación típica (D.T.). La significación estadística se calculó utilizando la prueba t de Student (de dos vías, de datos no apareados) y el nivel de significación se estableció en p <0,05. Para la inmunotransferencia todas las muestras se cargaron en duplicado para validar una carga equivalente de proteína. El análisis estadístico de los datos de qRT-PCR se realizó utilizando el programa informático GenEx (MultiD, California, EE.UU.). La normalidad de los datos se confirmó utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov (prueba KS).

La sensibilidad a erlotinib (CE50) se calculó utilizando el programa informático GraphPad Prism (GraphPad Software, California, EE.UU.). Se definió que una línea celular sensible tiene una CE50 por debajo de erlotinib 5 μM y que una línea celular resistente tiene una CE50 por encima de erlotinib 5 μM. La sinergia entre la combinación de miR-7 y erlotinib se evaluó utilizando el modelo de aditivismo Bliss (Elia y Flescher (2008), Neoplasia 10: 1303-1313), utilizando la fórmula:

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EA se definió como la inhibición fraccional obtenida mediante miR-7 solo y EB se definió como la inhibición fraccional obtenida mediante erlotinib solo. Ebliss era la inhibición fraccional que se esperaría si la combinación de miR-7 y erlotinib era aditiva. Si la inhibición fraccional medida de forma experimental era mayor que Ebliss, la combinación de miR-7 y erlotinib se decía que era sinérgica.

Ejemplo 1 -Expresión de EGFR y sensibilidades a erlotinib en líneas celulares de CCC

Las líneas celulares de CCC FaDu, SCC-9 y HN5 expresan la ruta del EGFR y poseen una serie de sensibilidades a erlotinib. Para establecer si miR-7 podría utilizarse para regular a sus dianas conocidas, EGFR y Akt activo (P-Akt) (Kefas et al., (2008), Cancer Res 68: 3566-3572; Webster et al., 2009, citado anteriormente) se caracterizó la ruta del EGFR en las tres líneas celulares de CCC para confirmar la expresión de estas dianas. Para la medición de la expresión basal de las moléculas de la ruta del EGFR, se optimizó la cantidad de células sembradas en placa seguido de la restricción de suero en DMEM complementado con suero fetal bovino al 0,5 % durante 24 h. Se recogieron las proteínas, seguido de la inmunotransferencia para EGFR, P-EGFR (EGFR activo), Akt, P-Akt y β

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Claims

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