CN102762213A - 增加对酪氨酸激酶抑制物的敏感度的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及致敏表达表皮生长因子受体（EGFR）的患病细胞而使其敏感于对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物的方法，所述方法包括使细胞接触miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA。

Description

增加对酪氨酸激酶抑制物的敏感度的方法和组合物
【相关申请的交叉引用】
本申请要求2009年11月24日提交的澳大利亚临时专利申请No.2009905758的权利，将其通过引用并入本文。
【技术领域】
本发明总的涉及增加患病细胞，尤其是癌细胞，对酪氨酸激酶抑制物的敏感度的方法。尤其是，本发明涉及增加酪氨酸激酶抑制物抗性癌对特别或选择性地靶向表皮生长因子受体和其信号传导通路的酪氨酸激酶抑制物的敏感度的方法。
【背景技术】
表皮生长因子受体（EGFR）是ErbB受体家族的配体活化的受体酪氨酸激酶和成员。EGFR配体包括成员表皮生长因子（EGF）家族诸如EGF，转化生长因子-α（TGFα），肝素结合EGF-样生长因子（HB-EGF），双调蛋白（AR），表皮调节素（EPR），β动物纤维素（BTC），后生素和神经调节素(NRG)-1，NRG-2，NRG-3和NRG-4。EGFR配体失调在许多疾病中明显。例如，在非-小-细胞肺癌中，增加的血浆TGFα相关于厄洛替尼抗性及增加的双调蛋白是差预后的指示物。
EGFR是抗-癌治疗的靶，由于其在大量的癌中过表达。例如，大于80%的全部头颈癌（HNC）过表达EGFR。自EGFR的信号传导导致促进全部贡献于癌进展和差患者预后的肿瘤增殖，侵入，转移，血管发生和凋亡抑制的下游膦酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt和Ras/Raf/MAPK通路的活化。EGFR的许多抑制物，发挥酪氨酸激酶抑制物的作用，已开发为抗-癌治疗剂。但是，用靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制物，包括吉非替尼和厄洛替尼和单克隆抗体西妥昔单抗，在一系列癌包括HNC中的临床试验中已达到限制的结果。迎对抗-EGFR酪氨酸激酶抑制物的临床应用的主要挑战之一是癌对这些治疗剂的固有和获得性抗性。有对开发克服酪氨酸激酶抑制物抗性及更一般而言增加酪氨酸激酶抑制物的功效的有效方法的增加的兴趣，及增长的需求。
微RNA（miRNA）是丰富的类的高度保守的，负面地调控基因表达的小（一般21～25个核苷酸）内源性非-蛋白-编码RNA。miRNA结合信使RNA（mRNA）内的特定3’-非翻译区（3’-UTR）而诱导mRNA切割或翻译阻遏。个体miRNA一般不完全结合它们的同源靶信使RNA（mRNA），而独特miRNA可调控多基因的表达。
miRNA从通常含有自非-编码DNA区转录的几百个核苷酸的RNA前体（pri-miRNA）产生。pri-miRNA在核中被RNA酶III内切核酸酶加工而形成约70个核苷酸的茎-环前体（前-miRNA）。前-miRNA被活跃地运输到细胞质，其中它们还被加工成一般21～23bp的短RNA双联体。功能miRNA链解离自其互补非-功能链，且位于RNA-诱导的-沉默-复合物（RISC）内。（替代性地,RISC可直接装载前-miRNA发卡结构.）miRNA结合靶mRNA的3’UTR，且在此结合中重要的是接近miRNA的5’端（一般核苷酸位置2～8）的约6～7个核苷酸的所谓的‘种’区。3’端的作用是欠清楚的。基因表达的miRNA-诱导的调节一般通过翻译阻遏达到，随着它们自核糖体新出现而降解蛋白或‘冷冻’核糖体，和/或促进靶mRNA移动到RNA破坏位点。
miRNA是对于许多正常细胞功能关键的，且涉及过程诸如干细胞分裂，胚胎发育，细胞分化，发炎和免疫。特定miRNA，及表达模式及个体miRNA的表达的改变的调节，也越来越牵涉各种疾病状态，包括癌。癌中一些miRNA改变，且可发挥肿瘤抑制物或癌基因的作用。例如，let-7d（miRNA的let-7家族的成员）在正常头和颈组织中调控RAS癌基因表达，尽管let-7d表达在许多头颈癌中减少，导致RAS表达上调，增加的肿瘤生长及减少的患者存活。相反，miR-184表达在舌鳞状细胞癌中上调，导致癌基因c-Myc的增加的表达，增加的细胞增殖和肿瘤生长。
【发明概述】
在第1方面，本发明提供致敏表达表皮生长因子受体（EGFR）的患病细胞而使其敏感于对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物的方法，所述方法包括使细胞接触miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA。
一般患病细胞是癌细胞。
一般致敏致使细胞敏感于少于缺失miRNA中需要的细胞生长抑制性或细胞毒性剂量的细胞生长抑制性或细胞毒性剂量的酪氨酸激酶抑制物。
酪氨酸激酶抑制物可为，例如，小分子或抗体。在特定实施方式中，酪氨酸激酶抑制物可选自厄洛替尼，吉非替尼和AG1478。
miR-7miRNA可为hsa-miR-7且可包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。miR-7miRNA前体可选自hsa-miR-7-1，hsa-miR-7-2和hsa-miR-7-3，且可包含SEQ ID NO:2～4之任一个所示的序列。
在第2方面，本发明提供致敏表达表皮生长因子受体（EGFR）的患病细胞而使其敏感于对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物的方法，所述方法包括使细胞接触能刺激或增强miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA的表达或活性的剂，其中表达或活性被刺激或增强的miRNA致敏患病细胞敏感于酪氨酸激酶抑制物。
在第3方面，本发明提供治疗受试者中癌的方法，其中癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括给受试者施用下列的组合：对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物，和miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA。
癌可在治疗缺失下显示对酪氨酸激酶抑制物的抗性。抗性可为获得性或先天性的。
表达EGFR的癌可选自，例如头颈癌，成胶质细胞瘤，胰腺癌，结肠癌，结直肠癌，鼻咽癌，子宫癌，子宫颈癌，食管癌，胃癌，肾癌，膀胱癌，包括非-小细胞肺癌的肺癌，前列腺癌，乳腺癌，肝癌，成神经细胞瘤或黑色素瘤。
酪氨酸激酶抑制物可为，例如，小分子或抗体。在特定实施方式中，酪氨酸激酶抑制物选自厄洛替尼，吉非替尼和AG1478。
miR-7miRNA可为hsa-miR-7且可包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。miR-7miRNA前体可选自hsa-miR-7-1，hsa-miR-7-2和hsa-miR-7-3，且可包含SEQ ID NO:2～4之任一个所示的序列。
酪氨酸激酶抑制物和miRNA可以单组合物施用，其与药学可接受的载体，赋形剂或佐剂配制在一起或可以分开的组合物施用。其中剂独立地施用，施用可为同时或连续施用。
在特定实施方式中，miRNA的施用致使癌敏感于少于缺失miRNA中需要的细胞生长抑制性或细胞毒性剂量的细胞生长抑制性或细胞毒性剂量的酪氨酸激酶抑制物。因此，当施用是连续的时，一般miRNA在酪氨酸激酶抑制物之前施用。
在第4方面，本发明提供治疗受试者中癌的方法，其中癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括给受试者施用下列的组合：对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物和能刺激或增强miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA的表达或活性的剂。
在第5方面，本发明提供对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物和miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA用于制备治疗癌的药物的用途，其中癌细胞表达或过表达EGFR。
在第6方面，本发明提供对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物和能刺激或增强miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA的表达或活性的剂用于制备治疗癌的药物的用途，其中癌细胞表达或过表达EGFR。
本发明的第7方面提供预防或减少受试者中肿瘤生长，癌转移或再发生的方法，其中肿瘤或癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括给受试者施用有效量的对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物和miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA。
本发明的第8方面提供预防或减少受试者中肿瘤生长，癌转移或再发生的方法，其中肿瘤或癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括给受试者施用有效量的对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物和能刺激或增强miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA的表达或活性的剂。
本发明的第9方面提供测定表达表皮生长因子受体（EGFR）的癌对对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物的敏感度的变化的方法，所述方法包括：
（a）给受试者施用miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA；
（b）测定来自受试者的生物学样品中EGFR配体的表达水平；
（c）经时重复步骤（a）及（b）至少一次；以及
（d）比较样品中EGFR配体的表达水平，
其中EGFR配体的表达水平的变化指示癌对酪氨酸激酶抑制物的敏感度。
EGFR配体可为TGFα，HB-EGF，双调蛋白，表皮调节素，β动物纤维素，后生素NRG-1，NRG-2，NRG-3或NRG-4。在特定实施方式中，EGFR配体是TGFα。样品可包含血浆或血清。一般而言，癌细胞相对于正常细胞中，提升的TGFα的表达水平指示癌对酪氨酸激酶抑制物的抗性。因此，也一般而言，癌细胞中TGFα的表达水平的减少指示癌对酪氨酸激酶抑制物的敏感度的增加。酪氨酸激酶抑制物可为厄洛替尼。
本发明的第10方面提供治疗受试者中癌的方法，其中癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括：
（a）给受试者施用miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA；
（b）获得来自受试者的生物学样品；
（c）测定样品中EGFR配体的表达水平和/或活性；
（d）经处理时间重复步骤（b）及（c）至少一次；
（e）测定是否EGFR配体的表达和/或活性经处理时间变化；以及
（f）当EGFR配体的表达水平和/或活性的变化明显时，施用对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物。
本发明的第11方面提供评价患癌的受试者中治疗方案的功效的方法，其中癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括：
（a）用下列的组合治疗受试者足以评价方案的功效的时期：
对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物，和
miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA；
（b）获得来自受试者的生物学样品；
（c）测定样品中EGFR配体的表达水平；
（d）经处理时间重复步骤（b）及（c）至少一次；以及
（e）测定是否EGFR配体的表达经处理时间变化，
其中EGFR配体的表达水平的变化指示治疗方案的功效。
样品中的TGFα的表达水平可为预测癌对酪氨酸激酶抑制物的敏感度或抗性水平，且治疗方案可因此调整。
本文也提供药物组合物，其包含对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物和miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA，或能刺激或增强该miRNA的表达或活性的剂。
【附图说明】
本发明的实施方式在本文中参照下列图通过仅非-限制例的方式描述及例示。
图1显示HNC细胞系的EGFR通路表达和厄洛替尼敏感度的表征。（A）显示使用从在含有0.5%FBS的培养基中血清饥饿之后24h的FaDu，SCC-9和HN5HNC细胞系收获的蛋白提取物的相对EGFR，P-EGFR，Akt，P-Akt和β-肌动蛋白（对照）表达的免疫印迹检测。数据是3次独立实验的代表。（B）显示3种HNC细胞系对厄洛替尼的敏感度。数据表达为添加0μM（DMSO阴性对照）和100μM之间的浓度的厄洛替尼之后3d的最大细胞生长。数据标准化为药物的最低浓度。条代表细胞计数（±SD）相比仅媒质（DMSO）的平均差异。数据是至少3次独立实验的代表。
图2显示miR-7在HNC细胞系中调控EGFR表达及信号传导。（A）显示使用用仅媒质（阳离子脂质体2000,LF），30nM miR-7或30nM miR-NC（阴性对照）前体转染之后3d自FaDu和HN5HNC细胞系收获的蛋白提取物的EGFR，P-EGFR，Akt，P-Akt和β-肌动蛋白（对照）表达的免疫印迹检测。数据是3次独立实验的代表。（B）显示用30nM miR-7或miR-NC前体转染之后24hHN5细胞中EGFRmRNA表达的定量RT-PCR分析。EGFR mRNA表达标准化到GAPDH mRNA表达及使用2-ΔΔCT方法显示为miR-NC-转染的细胞（±SD）的比。条代表平均mRNA表达（±SD）相比miR-NC。数据是单次实验的代表。＊＊＊指示与miR-NC处理的细胞的显著差异（p<0.001）。（C）显示荧光素酶报告子测定，以确证在转染之后24h，miR-7对全长野生型EGFR 3’-UTR之内的miR-7靶位点的活性。将FaDu细胞用全长野生型EGFR 3’-UTR萤火虫荧光素酶质粒和1nMmiR-7或miR-NC前体转染。相对荧光素酶表达（萤火虫标准化为肾海鳃属（Renia））值表达为仅媒质（阳离子脂质体2000,LF）的比。条代表标准偏差（SD）。数据是单次实验的代表。＊＊＊指示与媒质(阳离子脂质体2000，LF)-处理的报告子载体的显著差异（p<0.001）。
图3显示厄洛替尼-敏感HN5HNC细胞敏感于被miR-7的EGFR通路阻断。用5nM miR-7或miR-NC前体转染之后5d细胞活力的细胞滴度分析。条代表细胞计数（±SD）相比仅媒质（阳离子脂质体2000,LF）的平均差异。下图是良好用以产生图中的数据的照片。数据是3次独立实验的代表。＊＊表示与阴性对照(miR-NC)-处理的细胞的显著差异（p<0.01）。
图4显示，耐厄洛替尼的FaDu HNC细胞可被miR-7致敏为敏感于厄洛替尼。小图A显示，用5nM miR-7或miR-NC前体转染之后7d细胞活力的细胞滴度分析。在转染4d之后3d添加厄洛替尼（7.5μM）。条代表细胞计数（±SD）相比仅媒质（DMSO）的平均差异。数据是3次独立实验的代表。＊＊指示与阴性对照（miR-NC）厄洛替尼-处理的细胞的显著差异（p<0.01）.
Figure BDA00001843405400081
指示当miR-7和厄洛替尼联用时协同。小图B显示使用用仅媒质（阳离子脂质体2000），miR-7或miR-NC前体转染之后4d自FaDu HNC细胞收获的蛋白提取物的EGFR，P-EGFR，Akt，P-Akt和β-肌动蛋白（对照）表达的免疫印迹检测。在转染24h之后3d添加厄洛替尼（7.5μM）。数据是2次独立实验的代表.
Figure BDA00001843405400082
指示用miR-7和厄洛替尼的联合治疗。
图5显示，将miR-7表达恢复到细胞系U251（A），U87（B）和U373（C）的成胶质细胞瘤细胞致敏细胞敏感于酪氨酸激酶抑制物AG1478。将细胞用10nM miR-7或miR-NC转染。2天之后，将细胞用知道的无效剂量的AG1478处理（对于U251和U87细胞是7.5μM,及对于U373细胞是12.5μM），还3天之后测定活细胞数。在（B）中，自左到右，条代表LF2000+DMSO，LF2000+AG1478，pre-miR-7（10nM）+DMSO，pre-miR-7（10nM）+AG1478，pre-miR-NC（10nM）+DMSO，pre-miR-NC（10nM）+AG1478。在（C）中，自左到右，条代表LF2000，LF2000+AG1478（12.5μM），pre-miR-7（10nM），pre-miR-7（10nM）+AG1478（12.5μM），pre-miR-NC（10nM），pre-miR-NC（10nM）+AG1478（12.5μM）。
提供对应于说明书中引用的序列标识符的核苷酸序列的列表。成熟人miR-7，人miR-7前体及种区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～5所示。SEQ ID NO:6～9提供本文例示的本研究中使用的寡核苷酸的序列。
【定义】
如本文及随附的权利要求中所用，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数个参照物，除非情景明显另外指示。由此，例如，“核酸分子”包括多个核酸分子，及“细胞”包括1个或更多细胞，等等。
贯穿此说明书和跟随的权利要求，除非情景另外需要，词汇"包含（comprise）"，及变异诸如"包含（comprises）"或"包含（comprising）"，会理解为暗示包括陈述的整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或整体或步骤的组。
如本文所用术语“寡核苷酸”指称核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸碱基，知道的天然的核苷酸的类似物，或其混合物的单链序列。"寡核苷酸"包含基于核酸的分子包括DNA，RNA，PNA，LNA或其任何组合。主要包含天然的或非-天然的核糖核苷酸碱基的寡核苷酸可指RNA寡核苷酸。寡核苷酸一般是可通过任何适合的方法，包括，例如，直接化学合成或克隆及适当的序列的限制来制备的短（例如小于50个核苷酸长度）序列。"反义寡核苷酸"是互补于特异性DNA或RNA序列的寡核苷酸。一般在本发明的情景中反义寡核苷酸是互补于特异性miRNA的RNA寡核苷酸。反义寡核苷酸结合于及沉默或阻遏，部分或完全，其互补miRNA的活性。并非反义寡核苷酸中的所有碱基需求是互补于'靶'或miRNA序列；寡核苷酸需求仅含有足够的互补碱基，以致使寡核苷酸识别靶。寡核苷酸也可包括额外的碱基。反义寡核苷酸序列可为未修饰的核糖核苷酸序列或可为通过本文所述的各种手段化学修饰的或缀合的。
本文所用的术语“多核苷酸”指称脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸碱基或知道的天然的核苷酸的类似物，或其混合物的单-或双链聚合物。"多核苷酸"包含基于核酸的分子包括DNA，RNA，PNA，LNA或其任何组合。术语包括特定的序列以及与之互补的序列，除非另外指示。多核苷酸可通过本领域技术人员知道的各种手段化学修饰。由此"多核苷酸"包含基于核酸的分子包括DNA，RNA，PNA，LNA或其任何组合。
术语“序列同一性”或“序列同一性百分率”可通过在比较窗或跨度比较2个最佳对齐的序列或亚序列来测定，其中比较窗中多核苷酸序列的部分可相比用于2个序列的最佳比对的参照序列（其不包含添加或缺失）任选地包含添加或缺失（即,间隔）。
如本文所用术语"治疗"和“治疗”和语法相当体指称以任何方式治疗病情或症状，预防病情或疾病的建立，或另外预防，阻碍，延缓病情或疾病或其他不期望的症状的或逆转病情或疾病或其他不期望的症状的进展的任何和全部使用。由此术语"治疗"应以其最宽情景理解。例如，治疗不必然暗示患者被治疗直到完全恢复。在显示或特征在于多症状的病情中，治疗需求不必然治疗，预防，阻碍，延缓所述症状或逆转全部所述症状的，但可预防，阻碍，延缓或逆转1种或更多所述症状。
如本文所用，术语"有效量”在其含义之内包括非-毒性但足够的量或剂量的提供期望效果的剂或化合物。需要的确切的量或剂量会因受试者而改变依赖于因素诸如治疗的物种，受试者的龄和一般情况，治疗的病情的严重性，施用的特定剂及施用模式等等。由此，不可能特定确切的“有效量”。但是，对于任何给定情况，适当的“有效量”可通过本领域普通技术人员使用仅常规实验来测定。
如本文所用，术语“选择性”当在化合物抑制EGFR的酪氨酸激酶活性的能力的情景中使用时，是指化合物，直接或间接，与EGFR，以相比其与其他受体相互作用显著更高频度相互作用。对于EGFR“特异性”的酪氨酸激酶抑制物是对任何其他受体不具有可辨别的活性的抑制物。由此，对于EGFR“特异性”的酪氨酸激酶抑制物，通过定义，对于EGFR是选择性的。
本文所用的术语“受试者”指称哺乳动物且包括人，灵长类动物，家畜动物（例如绵羊,猪,牛,马,驴），实验室测试动物（例如小鼠,兔,大鼠,豚鼠），表演和展出动物（例如马,家畜,狗,猫），伴侣动物（例如狗,猫）和俘虏野生动物。优选地，哺乳动物是人或实验室测试动物。甚至更优选，哺乳动物是人。
【发明详述】
需知，本文提供的图和例旨在例示，且不限制本发明和其各种实施方式。
如本文例示，发明人将表皮生长因子受体（EGFR）鉴定为miRNAmiR-7的靶，其在癌细胞系中被miR-7下调。而且，发明人鉴定了miR-7的使用致敏癌细胞敏感于酪氨酸激酶抑制物。因此，在本文公开的实施方式中提供使用miR-7，miR-7的前体和变体，带有miR-7种区的miRNA致敏表达表皮生长因子受体（EGFR）的患病细胞敏感于对于EGFR选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物的方法和组合物。在本文公开的特定实施方式中，方法和组合物用于治疗与EGFR表达关联的疾病和病情，诸如癌。
本发明的实施方式采用，除非另外指示的，本领域技术人员知道及普通技能之内的常规分子生物学和药理学。该技术描述于，例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2nd Ed.,(ed.bySambrook,Fritsch and Maniatis)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress:1989);“Nucleic Acid Hybridization”,(Hames & Higgins eds.1984);“Oligonucleotide Synthesis”(Gait ed.,1984);Remington'sPharmaceutical Sciences,17th Edition,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,USA.;“The Merck Index”,12th Edition(1996),Therapeutic Category and Biological Activity Index,-and“Transcription & Translation”,(Hames & Higgins eds.1984)。
此说明书引用的任何现有出版物（或信息源于其），或知道的任何物质，不是，及不应被认为承认或准许或任何形式的建议现有出版物（或源于其的信息）或知道的物质形成在此说明书相关尽力的领域中的公知常识的部分。
【miRNA】
微RNA（miRNA）是在植物和动物中发挥调控分子的功能来通过结合mRNA上的互补位点来控制基因表达的小非-编码RNA。不被任何理论或假说束缚，本发明基于发明人的如下发现，miRNA miR-7特异性结合编码EGFR的mRNA的3’-UTR。而且，发明人意外地发现，增加表达或过表达EGFR的癌细胞，诸如头颈癌细胞中miR-7的表达，导致减少的水平的EGFR mRNA和蛋白表达，EGFR的减少的信号传导下游，G1期细胞周期停滞及细胞死亡。
miRNA结合靶mRNA的3’UTR，且在此结合中重要是接近miRNA的5’端（一般核苷酸位置2～8）的约6～7个核苷酸的所谓的‘种’区。因此，本发明的实施方式广泛地涵盖接触细胞或组织，或给有需求的受试者施用，一种或更多miRNA，至少其中之一包含miR-7的种区。在特定实施方式中，此种区包含序列GGAAGA（SEQ ID NO:5）。
在特定实施方式中，采用miR-7。SEQ ID NO:1所示的人miR-7的核苷酸序列。miR-7miRNA的附加序列信息可见于http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml.如多数miRNA，miR-7在不同物种之间高度保守。由此，尽管一般miRNA可源于待治疗的受试者物种，或与自该物种的miRNA构成序列同一，此在视，例如，物种之间的miRNA序列的高水平的序列保守的情况下不是必需的。
本发明的实施方式也涵盖施用miR-7的miRNA变体。变体包括基本上类似于本文公开的miRNA的序列的核苷酸序列。变体包括基本上类似于本文公开的miRNA的序列的核苷酸序列。在一些实施方式中，待施用的变体miRNA包含与miR-7的序列（SEQ ID NO:1）显示至少80%序列同一性的序列。在一些实施方式中，待施用的miRNA包含与SEQ ID NO:1显示至少90%序列同一性的序列。在其他实施方式中，待施用的miRNA包含与SEQ ID NO:1显示至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的序列。替代性地或此外，变体可在miR-7序列的1个或更多位置包含修饰，诸如非-天然的残基。
也涵盖施用miR-7或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA的前体分子。miRNA从自非-编码DNA的区转录的通常含有几百个核苷酸的RNA前体（pri-miRNA）产生。pri-miRNA在核内被RNA酶III内切核酸酶加工而形成约70个核苷酸的茎-环前体（前-miRNA）。前-miRNA被活跃地运输到细胞质，在其中它们还被加工成一般21～23bp的短RNA双联体，其中之一代表功能miRNA链。该pri-miRNA和前-miRNA前体的施用涵盖在本发明中，其中pri-miRNA或前-miRNA被切割及细胞内化而产生功能miRNA。
除了全长miR-7分子之外，诸如显示于SEQ ID NO:1的，术语“miR-7”也包括miR-7分子的片段，只要片段是功能片段。miRNA分子的术语“片段”是指部分全长分子。片段的尺寸的限制仅在于其必需是功能片段，即，能调节EGFR的表达，调节细胞生长，和/或调节细胞分化。一般而言，其会包含至少种区序列GGAAGA（SEQ ID NO:5）。
miRNA施用可为直接给需求治疗的受试者，或可为离体施用给源于受试者的细胞或组织。待施用的miRNA可合成产生或天然地源于细胞来源。
本发明也涵盖的实施方式是施用能刺激或增强本文所述的miRNA的表达或活性的剂。该剂可为基于蛋白性，非-蛋白性或核酸的，且包括，例如，能结合于miRNA基因的调控序列，由此诱导或增强miRNA的内源性表达的水平的分子和化合物。本领域技术人员会同意，本发明的范围不受此限制的及能刺激或增强miRNA表达或活性的任何剂涵盖及落入本公开的范围之内。
本发明也涵盖的实施方式是连接于能将miRNA递送到期望的位点的额外的剂的miRNA的施用。额外的剂可本身能抑制EGFR的活性和/或表达。例如，可将miR-7缀合于抗体诸如西妥昔单抗，以便使miR-7靶向表达EGFR的细胞。在一些实施方式中，miRNA和额外的剂之间的连接是可切割的连接。可切割的连接的存在允许miRNA自额外的剂切割，例如在内化进表达EGFR的细胞之后。
【EGFR酪氨酸激酶抑制物】
本发明的实施方式，在期望治疗患表达EGFR的癌的受试者的情况下，提供酪氨酸激酶抑制物（TKI）的施用。本领域技术人员会容易同意，根据本文公开的实施方式使用的适合的TKI可取各种形式。TKI可在性质上为基于蛋白性，非-蛋白性或核酸的。TKI可为，例如，小分子或抗体。TKI可为天然存在的化合物或源于天然的来源的分子，或可为合成的或其组合。需知，TKI可对EGFR是选择性或特异性的。
具有EGFR TKI活性的小分子或其药学可接受的盐包括下列：
N-(3-氯苯基)-6,7-二甲氧基-4-喹唑啉胺（AG1478）
N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺，或其药学-可接受的盐（OSI-774,厄洛替尼或塔西法）；
N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺（ZD1839,吉非替尼）；
N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺（凡德他尼）；
6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺（PD 183805或CI 1033）；
4-[(1R)-1-苯基乙基氨基]-6-(4-羟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶（PKI-166,CGP 75166或CGP 59326）；
N-[4-(3-溴苯胺基)喹唑啉-6-基]丁-2-炔酰胺（CL-387785或EKB-785）；以及
4-(3-氯-4-氟苯胺基)-3-氰基-6-(4-二甲基氨基丁-2(E)-烯酰氨基)-7-乙氧基喹啉（EKB-569）。
N-[-4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-2-丙烯酰胺二盐酸盐（PD169540）。
4-[(3-溴苯基)氨基]-6-(甲氨基)-吡啶并[3,4-d]嘧啶称之为PD-158780
4-[(3-溴苯基)氨基]-6,7-二甲氧基喹唑啉盐酸盐称之为PD153035。
4-(R)-苯乙基氨基-6-(羟基)苯基-7H-吡咯并[2,3-d]-嘧啶称之为PKI-166。
GW-2016也称之为GW-572016或二甲苯磺酸拉帕替尼。
具有EGFR TKI活性的其他小分子，或其药学可接受的盐，包括ZD1839，CP 358774，CI 1033，PKI-166，CL-387785和EKB-569。在优选的实施方式中，具有EGFR TKI活性的小分子是吉非替尼，厄洛替尼或AG1478。
在其他实施方式中，小分子EGFR TKI可为BE-23372M，BIBX-1382，BBR-1611，naamidine A，AS-23，DAB-720，ADL-681，CGP-52411，CGP-60261，CGP-62706系列，PKI-166，CP-292597，PD-0158780，RG-13022，RG-14620，RG-50875，AG-1478，VRCTC-310，SU-5271。
可根据本发明使用的低分子量EGFR TKI的特定例可为[6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺，N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺（也称之为OSI-774，厄洛替尼或塔西法
Figure BDA00001843405400151
（厄洛替尼HCl））。
可根据本发明使用的低分子量EGFR TKI的另一特定例可为吉非替尼（也称之为ZD1839或易瑞沙
Figure BDA00001843405400152
）。易瑞沙是阻断促进癌生长中牵涉的信号传导通路的经口有活性的抑制物。易瑞沙据说具有抗血管生成活性，其具有针对该癌的抗肿瘤活性，所述癌如结肠，乳腺，卵巢，胃，非-小肺癌，胰腺前列腺，及白血病，其消除EGFR，HER2和HER3磷酸化，其抑制人乳腺异种移植物生长和其已用于患者。易瑞沙是一种喹唑啉，且具有化学名称4-喹唑啉胺，N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-(9Cl)和化学式C22H24ClFN4O3。
低分子量EGFR TKI的其他特定例可为N-[-4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-2-丙烯酰胺二盐酸盐（称之为CI-1033或PD183805或卡纽替尼）。
在其他实施方式中，EGFR TKI可包含可部分或完全阻断EGFR活化的抗体或抗体片段。具有EGFR TKI活性的特定抗体包括帕尼单抗，奈昔木单抗，RG-7160和尼妥珠单抗。
在其他实施方式中，EGFR TKI可包含天然地存在的化合物。具有EGFR TKI活性的特定天然存在的化合物或其药学可接受的盐包括kahalalide化合物例如那些自软体动物，海天牛属（Elysia sp.）分离的。kahalalide可为kahalalide A，B，C，D，E，F，G，H，I，J，K和O的任一种或任何组合。在特定实施方式中，kahalalide可为kahalalide F。在一些实施方式中，kahalalide化合物可合成。
【增加对酪氨酸激酶抑制物的敏感度的方法】
在特定实施方式中，本发明提供致敏表达表皮生长因子受体（EGFR）的患病细胞敏感于对于EGFR选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物的方法和治疗表达EGFR的癌的方法。
使细胞或癌接触miRNA或能刺激或增强miR-7miRNA的表达或活性的剂可通过任何本领域知道的方法达到。在一些实施方式中，接触细胞和miRNA体内发生。miRNA或能刺激或增强miR-7miRNA的表达或活性的剂可与细胞直接接触，即直接应用于需要被致敏为敏感于TKI的细胞，或替代性地可与细胞间接组合，例如通过将分子注射进受试者血流，然后其携带分子到需要被致敏为敏感于TKI的细胞。而且，样品，可从受试者移出及在至少部分样品返回受试者之前与miRNA或能刺激或增强miR-7miRNA的表达或活性的剂体外组合。例如，样品可为从受试者移出的血样品及在至少部分血注射返回受试者之前与miRNA组合。
在一些实施方式中，miRNA或能刺激或增强miR-7miRNA的表达或活性的剂与细胞接触，其中miRNA的内源性水平相比细胞与miRNA接触之前不同。在此情景中使用的术语“内源性”指称关联miRNA的表达和/或活性的“天然存在的”水平。在这些实施方式中，化合物或组合物可与细胞接触，使得miRNA的表达和/或活性相比“天然存在的”水平增加或降低。
高水平的一些EGFR配体，例如TGFα指示TKI抗性或不敏感性（Addison et al(2010)J.Clin Oncol.published ahead of print on 15November 2010as 10.1200/JCO.2010.31.0805）。因此，在一些实施方式中，致敏表达表皮生长因子受体（EGFR）的患病细胞敏感于对于EGFR选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物可通过分析EGFR配体水平测定。例如，miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA施用给受试者可改变EGFR配体的表达水平。自该受试者获得的样品可通过任何本领域知道的方法检定以测定样品中EGFR配体的表达水平。通过重复采样及经时检定过程，可监控和/或比较EGFR配体的表达水平。样品中EGFR配体的表达水平的变化可预测癌对酪氨酸激酶抑制物的敏感度或抗性水平。一般，癌细胞中相对于正常细胞中提升的TGFα的表达水平指示癌对酪氨酸激酶抑制物的抗性。因此，也一般癌细胞中TGFα的表达水平的减少指示癌对酪氨酸激酶抑制物的敏感度的增加。酪氨酸激酶抑制物可为厄洛替尼。EGFR配体可为TGFα，HB-EGF，双调蛋白，表皮调节素，β动物纤维素，后生素NRG-1，NRG-2，NRG-3或NRG-4。在特定实施方式中，EGFR配体是TGFα。样品可为任何生物学样品，例如，血浆或血清。酪氨酸激酶抑制物可为厄洛替尼。
在一些实施方式中，多核苷酸（例如miRNA）经基于载体(例如病毒)的方法施用，或通过融合蛋白的形式施用多核苷酸，其中多核苷酸结合到使多核苷酸靶向目的细胞，即表达EGFR的细胞的鱼精蛋白-Fab抗体片段。
【疾病和病情】
EGFR在许多病情包括癌中的涉及的细胞中表达。本文提供的方法和组合物用于使用以上描述的miRNA或能刺激或增强miR-7miRNA的表达或活性的剂致敏细胞敏感于TKI。那些组合物和方法也可应用于关联于EGFR表达的病情的治疗或预防。可应用本发明的方法和组合物的病情包括，但未限于癌，肾疾病，肺部疾病，心脏疾病，皮肤疾病或感染性疾病。本文所用的术语“癌”指称由异常及不受控的细胞分裂导致的任何恶性细胞生长或肿瘤。
癌可为任何表达或过表达EGFR的癌。一般该癌会相关于相对于正常细胞和组织，EGFR的表达或活性的上调的或提升的水平。例示癌包括，但未限于肝，卵巢，膀胱，子宫，子宫颈，结直肠，肺，小细胞肺，乳腺，前列腺，胰腺，肾，结肠，胃，子宫内膜，胃，鼻咽，咽，食管，甲状腺和头颈癌，腹膜癌扩散，淋巴瘤，肉瘤或其继发性转移，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤和黑色素瘤。
在一些实施方式中，有效剂量，最佳数的剂量，个体剂量的间隔和最佳治疗过程可通过监控血清或血浆EGFR配体诸如TGFα的水平来确定。例如，在给受试者施用剂诸如miRNA或TKI或开始治疗过程之前，样品诸如血，血清或血浆样品，可通过任何本领域知道的方法检定以测定EGFR配体的水平。在施用剂之后或在治疗过程期间的间隔，可取其他样品及检定，以测定EGFR配体的水平。在EGFR配体的水平未降低的实例中，增加的剂量或增加的剂量频度可指示优化剂量或治疗。在EGFR配体的水平降低了的实例中，降低的剂量或降低的剂量频度可指示优化剂量或治疗。
基于EGFR配体诸如TGFα的水平测定对酪氨酸激酶抑制物的抗性的能力也允许选择根据本发明的治疗可适合的患者的有用的手段。
【组合物和施用途径】
本发明的实施方式涵盖用于致敏表达EGFR的细胞敏感于酪氨酸激酶抑制物及用于治疗或预防与EGFR表达关联的病情的组合物。该组合物可以任何方便的或适合的途径施用诸如通过肠胃外（包括,例如,动脉内,静脉内,肌内,皮下），口腔，鼻，粘膜（包括舌下），腔内或局部途径。由此组合物可以各种形式配制，包括溶液，悬浮液，乳剂和固体形式，且一般如此配制，以适合于选择的施用途径，例如作为胶囊，片剂，小胶囊，酏剂用于口服摄入，以气雾剂形式，适合于通过吸入（诸如通过鼻内吸入或口腔吸入）施用，软膏，霜剂，凝胶，胶冻剂或洗液适合于局部施用，或以可注射的制剂，其适合于肠胃外施用。优选的施用途径会依赖于许多因素包括待治疗的病情及期望的结果。对于任何给定环境的最有利的途径可通过本领域技术人员确定。例如，在需要适当的浓度的期望的剂直接递送到待治疗的身体位点的情况中，施用可为局部性而非系统性。区域施用提供将非常高局部浓度的期望的剂递送到需要的位点的能力，由此是适合于达到期望的治疗性或预防性效果，而避免身体的其他器官暴露于化合物和由此潜在地减少副作用。
一般而言，适合的组合物可根据本领域普通技术人员已知的方法制备，且可包括药学可接受的稀释剂，佐剂和/或赋形剂。稀释剂，佐剂和赋形剂必需在与组合物的其他成分相容，且不有害于其受者的方面是"可接受的"。
药学可接受的稀释剂的例是脱矿质化的或蒸馏水；盐溶液；基于植物的油诸如花生油，红花油，橄榄油，棉籽油，玉米油，芝麻油诸如花生油，红花油，橄榄油，棉籽油，玉米油，芝麻油，花生油或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷，诸如甲基聚硅氧烷，苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油诸如液体石蜡，软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物诸如甲基纤维素，乙基纤维素，羧甲基纤维素，羧甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素钠；低级烷醇，例如乙醇或异-丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇，丙二醇，1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯诸如棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；黄蓍胶或阿拉伯胶，及石油胶。一般而言，载体会形式以组合物重量计1%～99.9%。
对于作为可注射溶液或悬浮液的施用，非-毒性肠胃外可接受的稀释剂或载体可包括，Ringer溶液，中链甘油三酯（MCT），等渗盐水，磷酸盐缓冲液，乙醇和1,2丙二醇。用于口服使用的适合的载体，稀释剂，赋形剂和佐剂的一些例包括花生油，液体石蜡，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，藻酸钠，阿拉伯胶，黄蓍胶，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，明胶和卵磷脂。此外，这些口服制剂可含有适合的调味及着色剂。当以胶囊形式使用时，胶囊可用延迟解离的化合物诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯来包被。
佐剂一般包括软化剂，乳化剂，增稠剂，防腐剂，杀菌剂和缓冲剂。
用于口服施用的固体形式可含有人和兽医学药学实践中可接受的结合剂，甜味剂，解离剂，稀释剂，调味，包衣剂，防腐剂，润滑剂和/或时间延迟剂。适合的结合剂包括阿拉伯胶，明胶，玉米淀粉，黄蓍胶，藻酸钠，羧甲基纤维素或聚乙二醇。适合的甜味剂包括蔗糖，乳糖，葡萄糖，阿司帕坦或糖精。适合的解离剂包括玉米淀粉，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，瓜儿胶，黄原胶，膨润土，藻酸或琼脂。适合的稀释剂包括乳糖，山梨糖醇，甘露糖醇，右旋糖，高岭土，纤维素，碳酸钙，硅酸钙或磷酸二钙。适合的调味剂包括辣薄荷油，冬青，樱桃，橙或树莓调味油。适合的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物或共聚物，蜡，脂肪醇，玉米醇溶蛋白，紫胶或谷蛋白。适合的防腐剂包括苯甲酸钠，维生素E，α-生育酚，抗坏血酸，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适合的润滑剂包括硬酯酸镁，硬脂酸，油酸钠，氯化钠或滑石粉。适合的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于口服施用的液体形式可含有，除了以上剂以外，液体载体。适合的液体载体包括水，油诸如橄榄油，花生油，芝麻油，葵花油，红花油，花生油，椰子油，液体石蜡，乙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙醇，丙醇，异丙醇，甘油，脂肪醇，甘油三酯或其混合物。
用于口服施用的悬浮液可还包含分散剂和/或悬浮剂。适合的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基-纤维素，聚-乙烯基-吡咯烷酮，藻酸钠或乙酰醇。适合的分散剂包括卵磷脂，脂肪酸诸如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯或二油酸酯，-硬酯酸酯或-月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯或二油酸酯，-硬酯酸酯或-月桂酸酯等。
用于口服施用的乳剂可还包含1种或更多乳化剂。适合的乳化剂包括以上例示的分散剂或天然的胶诸如瓜儿胶，阿拉伯胶或黄蓍胶。
制备肠胃外可施用的组合物的方法是本领域技术人员明晰的，及更详细描述于，例如，Remington's Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.，其通过引用并入本文。组合物可掺入任何适合的表面活性剂诸如阴离子，阳离子或其非-离子表面活性剂诸如山梨糖醇酐酯或聚氧乙烯衍生物。也可包括悬浮剂诸如天然的胶，纤维素衍生物或无机物质诸如火成氧化硅，及其他成分诸如羊毛脂。
用于制备药物组合物的方法和药学载体是本领域熟知的，如教科书诸如Remington's Pharmaceutical Sciences,20th Edition,Williams& Wilkins,Pennsylvania,USA所给出。载体会依赖于施用途径，及再次本领域技术人员会容易能确定用于各特定情况的最适合的制剂。
组合物也可以脂质体形式施用。脂质体是通常源于磷脂或其他脂质物质，及由在水性介质中分散的单-或多层水合的液晶形成。可使用能形成脂质体的任何非-毒性，生理学可接受的且可代谢的脂质。脂质体形式的组合物可含有稳定剂，防腐剂，赋形剂等。优选的脂质是天然的和合成的磷脂和磷脂酰胆碱（卵磷脂）。本领域知道形成脂质体的方法，及关于此特别参考：Prescott,Ed.,Methods in Cell Biology,Volume XIV,Academic Press,New York,N.Y.(1976),p.33 etseq.，其通过引用整体并入本文。
【组合方案】
治疗性优势可通过组合方案实现。在联合治疗中，可共施用miRNA，或能刺激或增强miRNA的表达或活性的剂和至少额外的治疗剂。例如，在癌的情景中，可寻求维持持续抗-癌治疗诸如化学治疗和/或放射治疗，以便管理患者病情，以改善局部肿瘤控制和/或减少转移风险，而采用剂根据本发明的实施方式。因此，根据本发明的治疗方法可与常规治疗联合应用，诸如用酪氨酸激酶抑制物，放射治疗，化学治疗，手术或其他形式的医疗干预。“共施用的”是指以相同的制剂或以经相同的或不同途径的2个不同制剂同时施用，或通过相同的或不同途径的连续施用。“连续”施用是指，例如，2个制剂或治疗施用之间秒钟，分钟，小时，天，周或月的时间差异。制剂或治疗可以任何顺序施用。
在联合治疗的方面，癌细胞表达或过表达EGFR的癌可起初通过给受试者施用miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA来治疗。一段时间之后，自受试者的生物学样品可通过任何本领域知道的方法检定以测定样品中EGFR配体的表达和/或活性水平。通过重复采样及经治疗时间至少一次检定过程，可测定是否EGFR配体的表达和/或活性经处理时间变化。当EGFR配体的表达水平和/或活性的变化是明显时，可施用对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物。
EGFR配体可为TGFα，HB-EGF，双调蛋白，表皮调节素，β动物纤维素，后生素NRG-1，NRG-2，NRG-3或NRG-4。在特定实施方式中，EGFR配体是TGFα样品，其可包含血浆或血清。样品中的TGFα的表达水平可预测癌对酪氨酸激酶抑制物的敏感度或抗性水平，及治疗方案可因此调整的。一般，癌细胞相对于正常细胞中提升的TGFα的表达水平指示癌对酪氨酸激酶抑制物的抗性。酪氨酸激酶抑制物可为厄洛替尼。
使用的额外的治疗剂会依赖于待治疗或预防的病情。例如其中病情是头颈癌时，适合的治疗剂包括厄洛替尼（Tarecva），吉非替尼（易瑞沙或ZD1839）或AG1478，凡德他尼PD 183805，CI 1033，PKI-166，CGP 75166，CGP 59326，CL-387785，EKB-785，EKB-569，PD169540，PD-158780，PD 153035，PKI-166，二甲苯磺酸拉帕替尼，CP 358774，BE-23372M，BIBX-1382，BBR-1611，naamidine A，AS-23，DAB-720，ADL-681，CGP-52411，CGP-60261，CGP-62706系列，PKI-166，CP-292597，PD-0158780，RG-13022，RG-14620，RG-50875，AG-1478，VRCTC-310，SU-5271。
在其他实施方式中，额外的治疗剂可为TKI抗体诸如帕尼单抗，奈昔木单抗，RG-7160和尼妥珠单抗。在其他实施方式中，额外的治疗剂可为天然地存在的化合物诸如kahalalide F。
化学治疗剂的例包括阿霉素，泰素，氟尿嘧啶，美法仑，顺铂，奥沙利铂，α干扰素，长春新碱，长春碱，血管抑制素，TNP-470，聚硫酸戊聚糖，血小板因子4，血管抑素，LM-609，SU-101，CM-101，Techgalan，沙利度胺，SP-PG等。其他化学治疗剂包括烷化剂诸如氮芥包括氮芥，美法仑，苯丁酸氮芥，环磷酰胺和异环磷酰胺，亚硝基脲包括卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀和链佐星；磺酸烷酯包括白消安；三嗪包括达卡巴嗪；乙烯亚胺包括噻替派和六甲蜜胺；叶酸类似物包括甲氨喋呤；嘧啶类似物包括5-氟尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷；嘌呤类似物包括6-巯嘌呤和6-硫代鸟嘌呤；抗肿瘤抗生素包括放线菌素D；蒽环类抗生素包括多柔比星，博来霉素，丝裂霉素C和普卡霉素；激素和激素拮抗剂包括他莫昔芬和皮质类固醇和混杂剂包括顺铂和布喹那，及方案诸如COMP（环磷酰胺,长春新碱,甲氨喋呤和泼尼松），依托泊苷，mBACOD（甲氨喋呤,博来霉素,多柔比星,环磷酰胺,长春新碱和地塞米松），及PROMACE/MOPP（泼尼松,甲氨喋呤（w/leucovin rescue），多柔比星,环磷酰胺,泰素,依托泊苷/氮芥,长春新碱,泼尼松和丙卡巴肼）。
本文公开的剂和组合物可治疗或预防性地施用。在治疗性应用中，将剂和组合物以足以治愈或至少部分阻拦病情和其症状和/或并发症的量施用于已患病情的患者。剂或组合物应提供足以有效治疗患者的量的活性化合物。
【剂量】
施用的剂诸如miRNA或TKI对任何特定受试者的有效剂量水平会依赖于各种因素，包括：待治疗的病情类型及病情阶段；采用的剂的活性和性质；采用的组合物；受试者的龄，体重，一般健康，性别及摄食；施用时间；施用途径；化合物的隔离速度；治疗的持续时间；与医学中熟知的其他相关的因素一起与治疗组合或同时使用的药物。
本领域技术人员会能，通过常规实验，测定治疗可应用的病情会需要的有效，非-毒性剂量。这些会最常基于个案确定。
一般而言，有效剂量预期为约0.0001mg～约1000mg的范围/kg体重每24小时；一般，约0.001mg～约750mg/kg体重每24小时；约0.01mg～约500mg/kg体重每24小时；约0.1mg～约500mg/kg体重每24小时；约0.1mg～约250mg/kg体重每24小时；或约1.0mg～约250mg/kg体重每24小时。更一般而言，有效剂量范围预期为约10mg～约200mg的范围/kg体重每24小时。
或者，有效剂量可为达约5000mg/m2。一般而言，有效剂量预期在约10～约5000mg/m2的范围，一般约10～约2500mg/m2，约25～约2000mg/m2，约50～约1500mg/m2，约50～约1000mg/m2，或约75～约600mg/m2。而且，本领域普通技术人员明晰，最佳量及个体剂量的间隔会通过待治疗的病情的性质和程度，施用形式，途径和位点，及待治疗的特定个体的性质确定。而且，该最佳条件可通过常规技术确定。
本领域普通技术人员明晰，治疗的最佳过程，诸如，给的组合物剂量数/天持续定义的天数，可由本领域技术人员使用治疗确定测试的常规过程来查明。
如上所述，在一些实施方式中，有效剂量，最佳剂量数，个体剂量间隔和最佳治疗过程可通过监控血清或血浆EGFR配体诸如TGFα的水平来测定。
也可通过测定自用下列的组合治疗的受试者的样品中EGFR配体的表达水平来评价治疗方案的功效：对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物，和miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA。在一段时间之后，测定来自受试者的其他样品中EGFR配体的表达的水平，而EGFR配体的表达水平变化可指示治疗方案的功效。
EGFR配体可为TGFα，HB-EGF，双调蛋白，表皮调节素，β动物纤维素，后生素NRG-1，NRG-2，NRG-3或NRG-4。在特定实施方式中，EGFR配体是TGFα。样品可包含血浆或血清。样品中的TGFα的表达水平可预测癌对酪氨酸激酶抑制物的敏感度或抗性水平，及治疗方案可因此调整。一般而言，癌细胞相对于正常细胞中提升的TGFα的表达水平指示癌对酪氨酸激酶抑制物的抗性。酪氨酸激酶抑制物可为厄洛替尼。
本发明会现在通过参考下列特定实施例更详细描述，其不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
【实施例】
【实验过程】
【化学品和试剂】
厄洛替尼（LC Laboratories;Woburn,Massachusetts）在96%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich;Sydney,澳大利亚）和4%（v/v）MilliQ水中制备为23mM浓储物溶液。对应于人miR-7的合成miRNA前体分子（Pre-miR miRNA前体产物ID：PM10047）（Ambion;Victoria,澳大利亚）和阴性对照miRNA（miR-NC;Pre-miR miRNA前体阴性对照#1,产物ID：AM17110）（Ambion;Victoria,澳大利亚）在RNA酶-游离的水（Ambion;Victoria,澳大利亚）中制备为50μM浓储物溶液。在测试miR-7和/或厄洛替尼的效应的实验中，将媒质对照细胞培养物用DMSO（替代厄洛替尼）或阳离子脂质体2000（Invitrogen;Victoria,澳大利亚）（替代miR-7和miR-NC）的当量v/v稀释液处理。
【DNA质粒】
使用下列DNA质粒：pRL-CMV肾海鳃属（Renilla）荧光素酶报告子（Promega,New South Wales,Australia）和pmiR-report-EGFR3’-UTR萤火虫荧光素酶报告子载体（Webster et al.,2009,J BiolChem 284:5731-5741）。
【细胞系和细胞培养】
HNC细胞系FaDu和SCC-9获自美国典型培养物保藏中心（ATCC;Virginia,USA）和HNC细胞系HN5由A/Prof.TerranceJohns（Monash Institute of Medical Research）友谊地提供。将FaDu和HN5细胞系于37℃在5%CO2在补充了10%胚胎牛血清（FBS）的低葡萄糖DMEM（Invitrogen;Victoria,澳大利亚）中培养。将细胞系SCC-9于37℃在5%CO2在补充了10%胚胎牛血清和400ng/ml氢化可的松的低葡萄糖DMEM（Invitrogen;Victoria,澳大利亚）中培养。使用初始培养物的20代之内的细胞系用于全部实验。为分析基础EGFR通路表达及信号传导，将细胞以2.8～4.0×105细胞每孔的密度接种于6孔板，及在平铺之后24h，在在蛋白提取之前，在补充了0.5%FBS的DMEM中血清饥饿24h。
【厄洛替尼敏感度测定】
将细胞系以5.0×103细胞每孔的密度接种于96孔板。在初始细胞平铺之后24h添加含有不同浓度的厄洛替尼（0mM-100mM）的新鲜培养基。在添加厄洛替尼之后3d，使用CellTitre 96Aqueous OneSolution细胞增殖测定试剂盒（Promega;Sydney,澳大利亚）按照生产商的使用说明和FLUOstar OPTIMA酶标仪（BMG Labtech;Victoria,澳大利亚）测量细胞活力。
【miRNA前体转染和荧光素酶报告基因测定】
将细胞以4.5×105（FaDu）或5.0×105（HN5）细胞的密度接种进6孔板，及使用含miR-7或miR-NC前体分子的阳离子脂质体2000（Invitrogen;Victoria,澳大利亚），以1～30nM的终浓度转染。在24h收获细胞用于RNA提取或在3d收获细胞用于蛋白提取。对于也添加了厄洛替尼的FaDu细胞转染，如上平铺细胞，并在转染24h之后3d添加厄洛替尼（7.5mM），其之后，收获细胞用于蛋白提取。为荧光素酶报告子测定，将细胞以2.0×105细胞每孔的密度接种进24孔板，及使用含miR-7或miR-NC前体分子（1nM）阳离子脂质体2000（Invitrogen;Victoria,澳大利亚）共转染，及将100ng每孔的萤火虫荧光素酶报告子DNA和5ng每孔的pRL-CMV肾海鳃属（Renilla）荧光素酶报告子作为转染对照。在转染之后24h使用1×被动裂解缓冲剂（Promega;Sydney,澳大利亚）收集裂解产物，于-80℃冷冻过夜，解冻及以13,000×g离心5min。使用双-荧光素酶报告子测定系统（Promega;Sydney,澳大利亚）和FLUOstar OPTIMA光度计（BMGLabtech;Victoria,澳大利亚）检定各上清液的萤火虫和肾海鳃属（Renilla）荧光素酶活性。通过标准化萤火虫荧光素酶值到肾海鳃属（Renilla）荧光素酶值来测定相对荧光素酶表达。
【蛋白提取】
蛋白提取从在6孔板中的细胞使用CEB裂解缓冲剂（Giles等人,2003,J Biol Chem 278:2937-2946）含有PhosSTOP磷酸酶抑制物（Roche;New South Wales,澳大利亚）和无完全EDTA的蛋白酶抑制物（Roche;New South Wales,澳大利亚）。将细胞裂解物于-80℃过夜冷冻，通过以13,000×g清除离心5min来，及收集上清液。通过Bio-Rad蛋白测定（Bio-Rad;New South Wales,澳大利亚）按照生产商的使用说明和FLUOstar OPTIMA酶标仪（BMG Labtech;Victoria,澳大利亚）测定总蛋白浓度。
【蛋白印迹】
将20μg的总蛋白样品溶解于NuPAGE NOVEX 4～12%双-Tri凝胶（Invitrogen;Victoria,澳大利亚）及转移到PVDF蛋白印迹膜（Roche;New South Wales,澳大利亚）。膜用抗-EGFR兔单克隆抗体（1:5000,Abcam ab52894-100;Massachusetts,USA），抗-磷酸-EGFR（Tyr1173）山羊多克隆抗体（1:750,Santa Cruz生物技术,Inc.sc-12351;California,USA），抗-Akt兔多克隆抗体（1:1000,CellSignaling Technology,Inc.#9272;Massachusetts,USA），抗-磷酸-Akt（Ser473）兔单克隆抗体（1:500,Cell Signaling Technology,Inc.#4060S;Massachusetts,USA）或抗-β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体（1:15,000,Abcam ab6276-100;Massachusetts,USA）探查。在用ECLPlus蛋白印迹检测系统（General Electric Healthcare;Wisconsin,USA）和ECL-Hyperfilm（General Electric Healthcare;Wisconsin,USA）检测之前使用次级辣根过氧化连接的抗-兔-IgG（1:10,000,General Electric Healthcare#NA934V;Wisconsin,USA），辣根过氧化连接的抗-小鼠-IgG（1:10,000,General Electric Healthcare#NA931V;Wisconsin,USA）和辣根过氧化连接的抗-山羊-IgG抗体（1:10,000,Santa Cruz生物技术,Inc.sc-2020;California,USA）。
【细胞活力测定】
将细胞以5.0×103细胞每孔的密度接种于96孔板，及如上用miRNA前体分子转染。在转染之后5d，使用CellTitre 96Aqueous One溶液细胞增殖测定试剂盒（Promega;Sydney,澳大利亚）按照生产商的使用说明和FLUOstar OPTIMA酶标仪（BMG Labtech;Victoria,澳大利亚）测量细胞活力。使用Canon EOS 400D数字照相机（Sydney,澳大利亚）摄影96孔板。为FaDu细胞转染，其中在用miRNA前体转染之后添加厄洛替尼，将细胞如上平铺和在转染4d之后3d添加厄洛替尼（7.5μM），其后测量细胞活力（转染后共测量7d）。
【定量反转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）分析】
从HN5细胞用TRIzol试剂（Invitrogen;Victoria,澳大利亚）提取总RNA及用DNA酶I（Promega;Sydney,澳大利亚）处理，以消除混杂基因组DNA。为EGFR和GAPDH mRNA表达的qRT-PCR分析，将0.5μg的总RNA用随机六聚体使用Thermoscript（Invitrogen;Victoria,澳大利亚）反转录成cDNA。在Corbett 3000RotorGene仪器（Corbett Research;Sydney,澳大利亚）上使用SensiMixPlus SYBR试剂盒（Quantace;New South Wales,澳大利亚）和自PrimerBank(Wang & Seed，2003，Nucleic Acid Res.，31：e154)的EGFR和GAPDH引物进行EGFR和GAPDH cDNA的实时PCR：EGFR-F，5′-GCGTTC GGC ACG GTG TAT AA-3′（SEQ ID NO:6）；EGFR-R，5′-GGCTTT CGG AGA TGT TGC TTC-3′（SEQ ID NO:7）；GAPDH-F，5′-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3′（SEQ ID NO:8）；GAPDH-R，5′-GGG GTC ATT GAT GGC AAC ATT A-3′（SEQ IDNO:9）。需要>0.9的单峰熔解曲线和反应效率用于数据的进一步分析。使用2-ΔΔCT方法测定相对于GAPDH mRNA的EGFR，RAF1和PAK1mRNA的表达（Livak & Schmittgen(2001),Methods25:402-408）。
【统计学】
全部结果表示为平均值±标准偏差（S.D.）。使用Student氏t检验（2-尾的,未配对的）计算统计学显著性，及显著性水平设在p<0.05。以一式两份装载用于免疫印迹的全部样品，以确证蛋白的等同装载。使用GenEx软件（MultiD;California,USA）进行qRT-PCR数据的统计学分析。使用Kolmogorov-Smirnov测试（KS测试）确认数据的正态性。
使用GraphPad Prism软件（GraphPad软件;California,USA）计算厄洛替尼敏感度（EC50）。敏感细胞系定义为具有5μM厄洛替尼以下的EC50，和抗性细胞系定义为具有5μM厄洛替尼以上的EC50。使用Bliss additivism模型（Elia & Flescher(2008),Neoplasia10:1303-1313），使用下式评价miR-7和厄洛替尼的组合之间的协同：
ebliss=EA+EB-EA×EB。
EA定义为由miR-7单独获得的分级抑制，和EB定义为由厄洛替尼单独获得的分级抑制。ebliss是如果miR-7和厄洛替尼的组合具有加和性，则会预期的分级抑制。如果以实验方式测量的分级抑制大于Ebliss，miR-7和厄洛替尼的组合被认为是协同的。
【实施例1：HNC细胞系中的EGFR表达和厄洛替尼敏感度】
FaDu，SCC-9和HN5HNC细胞系表达EGFR通路及具有一系列厄洛替尼敏感度。为了建立是否miR-7可用于调控其知道的靶，3种HNC细胞系中的EGFR和有活性的Akt（P-Akt）（Kefas et al.,(2008),Cancer Res 68:3566-3572;Webster et al.,2009,见上），EGFR通路表征为确认这些靶表达。为测量EGFR通路分子的基础表达，优化细胞平铺数，之后是在补充了0.5%FBS的DMEM中血清饥饿24h。收获蛋白，之后是对EGFR，P-EGFR（有活性的EGFR），Akt，P-Akt和β-肌动蛋白的免疫印迹，将其用作甚至装载对照。由于β-肌动蛋白装载对照指示了甚至蛋白装载，能进行相对EGFR通路表达的比较（图1A）。分析的全部3种HNC细胞系表达靶EGFR通路的知道的miR-7（图1A）。HN5显示为具有最高相对EGFR表达和P-EGFR活性，根据之前工作（Rusnak et al.,(2007),Cell Prolif 40:580-594）。FaDu具有中等EGFR表达和P-EGFR活性，及SCC-9具有相比HN5的EGFR的最低表达和P-EGFR活性。P-Akt活性未与EGFR表达或活性关联。SCC-9呈现最高相对P-Akt活性，之后是HN5和FaDu。
在优化用于平铺的细胞数之后及使用一系列厄洛替尼浓度测定FaDu，SCC-9和HN5细胞对厄洛替尼的敏感度。观察差异厄洛替尼敏感度，而FaDu被分类为具有8.26μM的EC50的耐厄洛替尼的细胞系，和细胞系SCC-9和HN5被分类为分别具有2.15μM和0.64μM的EC50值的厄洛替尼-敏感（图1B）。选择耐厄洛替尼的（FaDu）和最厄洛替尼-敏感（HN5）HNC细胞系用于比较和用于进一步实验。
【实施例2：HNC细胞中的EGFR表达的miR-7调节】
miR-7调控HNC细胞中的EGFR表达和Akt活性。因此研究miR-7调控HNC细胞系中的EGFR表达和Akt活性的潜力。用仅转染试剂，miR-阴性对照（miR-NC）或miR-7（Ambion）转染FaDu和HN5细胞之后，收获蛋白及对EGFR，P-EGFR，Akt，P-Akt和β-肌动蛋白进行免疫印迹，将其用作装载对照（图2A）。由于β-肌动蛋白装载对照指示甚至蛋白的装载，可进行相对EGFR通路表达的比较（图2A）。仅转染试剂和miR-NC泳道与miR-7泳道的比较确认，miR-7在耐厄洛替尼的FaDu和厄洛替尼-敏感的HN5HNC细胞系中下调EGFR表达，P-EGFR和P-Akt活性（图2A）。接下来，通过用miR-7或miR-NC转染及转染后24h收获的RNA的qRT-PCR分析来测定miR-7对EGFR-丰富的HN5细胞中EGFR mRNA表达的效应。相比用miR-NC转染，用miR-7转染在HN5HNC细胞中导致显著减少的（2.92倍）mRNA表达（图2B），提示miR-7在HNC细胞中靶向EGFR mRNA降解。
荧光素酶报告子测定用于确认miR-7在FaDu细胞中对在全长野生型EGFR 3′-UTR之内的其靶位点的活性（图2C）。相比用转染试剂单独或阴性对照miRNA（miR-NC）处理的样品，含有全长野生型EGFR 3′-UTR的报告子的显著减少的表达见于用miR-7处理的样品（图2C）。此提示，EGFR 3’-UTR是在HNC细胞中miR-7的直接靶。
此例显示，miR-7可在HN5和FaDu HNC细胞系中以蛋白和RNA（在EGFR的情况中）水平调控EGFR表达和P-Akt活性（图2A,2B,2C），由此miR-7可在癌细胞系，包括HNC中同时调控EGFR和P-Akt活性。可见，miR-7靶向EGFR通路的多个成员，降低厄洛替尼-敏感细胞系的活力及增加耐厄洛替尼的细胞系对厄洛替尼的敏感度。
【实施例3：miR-7和厄洛替尼敏感的HNC细胞】
厄洛替尼-敏感HNC细胞敏感于被miR-7的EGFR通路阻断。接下来，使用表达高水平的EGFR，miR-7的靶的厄洛替尼-敏感细胞系HN5研究miR-7作为单剂的效应（图1A和图2A）。通过用仅转染试剂，miR-NC前体或miR-7前体转染HN5细胞，转染后5d经细胞滴度检定来测定细胞活力。相比用仅转染试剂或miR-NC前体转染的细胞，细胞活力的显著和剂量-依赖性减小见于用miR-7前体转染的那些细胞（图3,图和平面照片）。以5nM的miR-7前体，有几乎HN5细胞活力的完全损失（图3,平面照片）。
在厄洛替尼-敏感HN5细胞系中，发现miR-7以剂量-依赖性方式降低细胞活力（图3），且当以少于用厄洛替尼治疗的患者的血清中的那些（3～10μM）的1nM，2.5nM和5nM浓度使用时，达到的此效应。
【实施例4：miR-7和厄洛替尼抗性HNC细胞】
miR-7增加耐厄洛替尼的HNC细胞系对厄洛替尼的敏感度，且当组合使用时2种剂展示协同。由于miR-7显示在HNC细胞系中靶向EGFR表达和Akt活性（见实施例2），研究miR-7增加耐厄洛替尼的HNC细胞系FaDu对亚-最佳（即亚-EC50）浓度的厄洛替尼（7.5μM）的敏感度的潜力。用仅转染试剂，miR-NC前体或miR-7前体转染FaDu细胞之后，在转染4天之后3天添加厄洛替尼，之后是细胞活力的细胞滴度分析（图4A）。相比用miR-NC前体和厄洛替尼处理的细胞，细胞活力的显著减小见于用miR-7前体和厄洛替尼处理的细胞，指示，耐厄洛替尼的FaDu细胞对厄洛替尼的敏感度已增加（图4A）。使用Bliss模型测定当与亚-最佳浓度的厄洛替尼组合使用时的miR-7的协同潜力：ebliss=EA+EB-EAxEB（Elia & Flescher,2008,见上）。EA定义为由miR-7单独获得的分级抑制，0.15。EB定义为由厄洛替尼单独获得的分级抑制，0.18。使用以上方程及取代适当的值，Ebliss=0.15+0.18-0.15×0.18=0.30。因此，以实验方式观察的分级抑制预期为0.30，如果miR-7和厄洛替尼的组合的效应仅是加和性的；大于0.30，如果miR-7和厄洛替尼的组合是协同的。当miR-7和厄洛替尼联用时，以实验方式观察的分级抑制是0.61（图4A）。由此，miR-7和厄洛替尼的组合发挥对FaDu细胞的协同生长抑制性效应。
然后测定miR-7和厄洛替尼对FaDu细胞中EGFR信号传导通路的表达和活性的效应。在用仅转染试剂，miR-NC前体或miR-7前体转染FaDu细胞之后，转染24h之后3天添加厄洛替尼（7.5mM），之后是EGFR，P-EGFR，Akt，P-Akt和b-肌动蛋白的免疫印迹，将其用作装载对照。由于β-肌动蛋白装载对照指示甚至蛋白的装载，可进行相对EGFR通路表达的比较（图4B），且揭示，根据厄洛替尼的建立的酪氨酸激酶抑制性作用，厄洛替尼能下调FaDu细胞系中的P-EGFR活性（Specenier和Vermorken,2007,见上;Loeffler-Ragg等人,2008,见上）。此外，厄洛替尼处理也多少减少P-Akt活性（图4B）。但是，P-EGFR和P-Akt活性的更大下调见于用miR-7（其靶向EGFR表达和Akt活性）和厄洛替尼（其仅靶向EGFR活性）处理的FaDu细胞（图4B），支持用miR-7和厄洛替尼的联合治疗的协同活性。
miR-7和厄洛替尼在耐厄洛替尼的细胞系中的组合使用以协同方式减少细胞活力。相比用miR-7或厄洛替尼单独处理的细胞，细胞活力的协同减小见于用miR-7和厄洛替尼处理的耐厄洛替尼的细胞（图4A）。免疫印迹反映此趋势为，P-Akt活性的最大减小见于用miR-7和厄洛替尼处理的那些样品（图4B）。
【实施例5：miR-7和AG1478抗性成胶质细胞瘤细胞】
将用厄洛替尼抗性HNC细胞系FaDu获得的结果（实施例4）延伸到成胶质细胞瘤细胞，特别AG1478抗性细胞系U251，U87和U373。将成胶质细胞瘤细胞（3,000细胞每孔）使用阳离子脂质体2000试剂（Invitrogen）按照生产商的使用说明，用miR-NC或miR-7（10nM终浓度）转染。2天之后，向孔再补充含有DMSO（媒质）或EGFR酪氨酸激酶抑制物AG1478（对于U251和U87是7.5μM;或对于U373细胞是12.5μM）的培养基，及额外的3天之后，使用CellTitre 96Aqueous One溶液细胞增殖测定试剂盒（Promega）按照生产商的使用说明，和FLUOstar OPTIMA酶标仪（BMG Labtech）评定细胞活力。
如显示于图5，在分析的全部3种细胞系中，相比miR-NC，细胞活力在miR-7存在下显著减少，且在miR-7存在下，相比在miR-7缺失下在减少细胞活力中有效，细胞变得敏感于更低剂量的AG1478。这些结果指示，miR-7致使3种耐EGFR TKI的成胶质细胞瘤细胞系敏感于EGFR TKI AG1478，支持miR-7和EGFR TKI的组合在成胶质细胞瘤治疗中作为潜在治疗性策略。
Figure IDA00001843405800011

Claims (28)

1.致敏表达表皮生长因子受体（EGFR）的患病细胞而使其敏感于对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物的方法，所述方法包括使细胞接触miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA。
2.权利要求1的方法，其中细胞是癌细胞。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中致敏致使细胞敏感于少于缺失miRNA中需要的细胞生长抑制性或细胞毒性剂量的细胞生长抑制性或细胞毒性剂量的酪氨酸激酶抑制物。
4.权利要求1～3之任一项的方法，其中酪氨酸激酶抑制物选自：厄洛替尼和AG1478。
5.权利要求1～4之任一项的方法，其中miR-7miRNA是hsa-miR-7，且包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
6.权利要求1～4之任一项的方法，其中miR-7miRNA前体选自：hsa-miR-7-1，hsa-miR-7-2和hsa-miR-7-3，且包含SEQ ID NO:2～4之任一个所示的序列。
7.致敏表达表皮生长因子受体（EGFR）的患病细胞而使其敏感于对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物的方法，所述方法包括使细胞接触能刺激或增强miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA的表达或活性的剂，其中表达或活性被刺激或增强的miRNA致敏患病细胞敏感于酪氨酸激酶抑制物。
8.治疗受试者中癌的方法，其中癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括给受试者施用下列的组合：
对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物，和
miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA。
9.权利要求8的方法，其中癌在缺乏治疗的情况下显示对酪氨酸激酶的抗性。
10.权利要求8或9的方法，其中表达EGFR的癌可选自：头颈癌，成胶质细胞瘤，胰腺癌，结肠癌，结直肠癌，鼻咽癌，子宫癌，子宫颈癌，食管癌，胃癌，肾癌，膀胱癌，包括非-小细胞肺癌的肺癌，前列腺癌，乳腺癌，肝癌，成神经细胞瘤或黑色素瘤。
11.权利要求7～10之任一项的方法，其中酪氨酸激酶抑制物选自：厄洛替尼和AG1478。
12.权利要求7～11之任一项的方法，其中miR-7miRNA是hsa-miR-7，且包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
13.权利要求7～11之任一项的方法，其中miR-7miRNA前体选自：hsa-miR-7-1，hsa-miR-7-2和hsa-miR-7-3，且包含SEQ ID NO:2～4之任一个所示的序列。
14.权利要求1～13之任一项的方法，其中酪氨酸激酶抑制物和miRNA以单组合物施用，其与药学可接受的载体，赋形剂或佐剂配制在一起。
15.权利要求1～13之任一项的方法，其中酪氨酸激酶抑制物和miRNA以分开的组合物施用。
16.权利要求15的方法，其中miRNA在酪氨酸激酶抑制物之前施用。
17.治疗受试者中癌的方法，其中癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括给受试者施用下列的组合：
对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物，和
能刺激或增强miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA的表达或活性的剂。
18.对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物和miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA用于制备治疗癌的药物的用途，其中癌细胞表达或过表达EGFR。
19.对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物和能刺激或增强miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA的表达或活性的剂用于制备治疗癌的药物的用途，其中癌细胞表达或过表达EGFR。
20.预防或减少受试者中肿瘤生长，癌转移或再发生的方法，其中肿瘤或癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括给受试者施用有效量的对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物和miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA。
21.预防或减少受试者中肿瘤生长，癌转移或再发生的方法，其中肿瘤或癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括给受试者施用有效量的对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物和能刺激或增强miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA的表达或活性的剂。
22.测定表达表皮生长因子受体（EGFR）的癌对对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物的敏感度的变化的方法，所述方法包括：
（a）给受试者施用miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA；
（b）测定来自受试者的生物学样品中EGFR配体的表达水平；
（c）经时重复步骤（a）及（b）至少一次；以及
（d）比较样品中EGFR配体的表达水平，
其中EGFR配体的表达水平的变化指示癌对酪氨酸激酶抑制物的敏感度。
23.权利要求22的方法，其中EGFR配体是TGFα。
24.权利要求22或23的方法，其中样品包含血浆或血清。
25.权利要求23的方法，其中癌细胞中TGFα的表达水平的减少指示癌对酪氨酸激酶抑制物的敏感度的增加。
26.权利要求22～25之任一项的方法，其中酪氨酸激酶抑制物是厄洛替尼。
27.治疗受试者中癌的方法，其中癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括：
（a）给受试者施用miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA；
（b）获得来自受试者的生物学样品；
（c）测定样品中EGFR配体的表达水平和/或活性；
（d）经处理时间重复步骤（b）及（c）至少一次；
（e）测定是否EGFR配体的表达和/或活性经处理时间变化；以及
（f）当EGFR配体的表达水平和/或活性的变化明显时，施用对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物。
28.评价患癌的受试者中治疗方案的功效的方法，其中癌细胞表达或过表达EGFR，所述方法包括：
（a）用下列的组合治疗受试者足以评价方案的功效的时期：
对于EGFR和/或其信号传导通路选择性或特异性的酪氨酸激酶抑制物，和
miR-7miRNA，其前体或变体，或包含含有序列GGAAGA的种区的miRNA；
（b）获得来自受试者的生物学样品；
（c）测定样品中EGFR配体的表达水平；
（d）经处理时间重复步骤（b）及（c）至少一次；以及
（e）测定是否EGFR配体的表达经处理时间变化，
其中EGFR配体的表达水平的变化指示治疗方案的功效。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108537001A (zh) * 2018-04-12 2018-09-14 华中科技大学鄂州工业技术研究院 一种预测用于治疗肝癌的特异性治疗药物的方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2302055B1 (en) 2004-11-12 2014-08-27 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
CA2804599C (en) * 2010-07-06 2023-01-31 Interna Technologies Bv Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
EP2783017B1 (en) * 2011-11-25 2018-12-26 Integragen A method for predicting responsiveness to a treatment with an egfr inhibitor
FR2984168B1 (fr) 2011-12-19 2019-07-05 Chanel Parfums Beaute Micro-rna pour leur utilisation dans la pigmentation
WO2013173500A2 (en) * 2012-05-15 2013-11-21 New York University Method for predicting recurrence of melanoma using mirna alterations
US9795626B2 (en) 2012-10-18 2017-10-24 The University Of Western Australia Cancer therapy using miRNAs
WO2014143855A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Mirna Therapeutics, Inc. Combination cancer treatments utilizing micrornas and egfr-tki inhibitors
US20140308274A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-16 Mirna Therapeutics, Inc. Combination cancer treatments utilizing synthetic oligonucleotides and egfr-tki inhibitors
US20160175401A1 (en) 2013-07-31 2016-06-23 Dana-Farber Cancer Institute Inc. Compoitions and methods for modulating thermogenesis using pth-related and egf-related compounds

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008025073A1 (en) * 2006-08-28 2008-03-06 The University Of Western Australia Method of modulation of expression of epidermal growth factor receptor (egfr) involving mirna
WO2008073922A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Functions and targets of let-7 micro rnas

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1797183B1 (en) * 2004-09-02 2012-08-01 Yale University Regulation of oncogenes by micrornas
EP2302055B1 (en) * 2004-11-12 2014-08-27 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
JP2010516692A (ja) * 2007-01-19 2010-05-20 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 化学療法剤に対し抵抗性を有する癌の処置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008025073A1 (en) * 2006-08-28 2008-03-06 The University Of Western Australia Method of modulation of expression of epidermal growth factor receptor (egfr) involving mirna
WO2008073922A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Functions and targets of let-7 micro rnas

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
20080515: "microRNA-7 Inhibits the Epidermal Growth Factor Receptor and the Akt Pathway and Is Down-regulated in Glioblastoma", 《CANCER RESEARCH》 *
REBECCA J. WEBSTER等: "Regulation of Epidermal Growth Factor Receptor Signaling in Human Cancer Cells by MicroRNA-7", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108537001A (zh) * 2018-04-12 2018-09-14 华中科技大学鄂州工业技术研究院 一种预测用于治疗肝癌的特异性治疗药物的方法
CN108537001B (zh) * 2018-04-12 2021-06-01 华中科技大学鄂州工业技术研究院 一种预测用于治疗肝癌的特异性治疗药物的方法

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