CN106554962A - 过表达gpr160的癌症的预防、诊断和治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与前列腺癌(PCa)相关的基因及其用途，所述基因为孤儿G蛋白偶联受体GPR160基因。GPR160在PCa组织中高表达，降低GPR160的表达可明显抑制PCa细胞的生长，因而GPR160可作为预防或治疗PCa的靶点。本发明提供了以GPR160为靶点进行临床诊断和开展药物筛选的方法。本发明还提供了抑制肿瘤细胞增殖(例如PCa细胞)的方法，所述方法通过将肿瘤细胞与GPR160的SiRNA组合物接触实施。本发明还涉及应用所述方法开发的产品，包括但不限于核酸序列和载体、诊断试剂、抗体、化学拮抗剂以及包含它们的组合物。本发明还提供了预防和治疗癌症，尤其是PCa的方法。

Description

过表达GPR160的癌症的预防、诊断和治疗
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及与前列腺癌(Prostate cancer，PCa)相关的GPR160基因功能及其应用，包括GPR160基因表达抑制剂或其蛋白产物拮抗剂。本发明还涉及诊断、预防和治疗PCa的方法。本发明涉及GPR160基因及其蛋白产物。
背景技术
前列腺癌是一种严重的男性老年疾病，在欧美是男性癌症死亡的主要原因之一。其发病率随年龄增长，80岁以上老年男性的前列腺检查半数发现有癌症病灶。我国PCa的发病率虽低于欧美国家，但近年来呈显著增长势态且患者的年纪出现低龄化倾向。有关前列腺增生和PCa病因学的研究和临床治疗已在世界范围内受到医学界的广泛关注。
传统的PCa治疗方法包括雄激素去势、前列腺切除、激素替代以及放/化疗。早期的PCa常用雄激素去势治疗。激素替代疗法相对简单，痛苦也少，但容易引起药物耐受。局部性PCa常用手术切除结合放化疗，但病人经常因受副作用如脱发或免疫功能异常等的折磨。由于肿瘤本身存在异质性且大部分PCa会由激素依赖性发展为激素非依赖性，给治疗带来了极大的困扰。发现新的治疗靶点并开发具有全新作用机制的抗PCa药物因而具有广阔的市场需求。
在癌组织中表达上调的基因产物可作为潜在的抗癌药物作用靶点。目前已有根据在某些类型癌症中异常表达、导致癌细胞增殖和扩散的分子靶标成功开发出来的新药，如治疗慢性粒细胞白血病的Glivec和治疗乳腺癌的Herceptin等。人们在PCa中也发现了多种过度表达的分子并将其归为PCa标记物或治疗靶标，这方面的探索正方兴未艾。
综上，本领域迫切需要找到与PCa发生和发展密切相关、仅在PCa组织中特异表达的基因或其产物作为干预靶标，从而为诊断、预防和治疗PCa提供新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效抑制GPR160基因表达的抑制剂。
本发明的第一方面，提供了一种dsRNA构建物，所述dsRNA构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式中，
Seq正向为GPR160基因或GPR160基因片段；
Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，所述GPR160基因序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述GPR160基因片段的序列如SEQ ID NO.:6、或7任一所示。
在另一优选例中，所述Seq正向的序列如SEQ ID NO.:6、或SEQ ID NO.:7所示。
在另一优选例中，所述间隔序列X的长度为1-100bp，较佳地为4-10bp。
在另一优选例中，所述GPR160基因或GPR160基因片段来源于哺乳动物，较佳地来源于人。
在另一优选例中，所述dsRNA构建物在宿主细胞中形成式II所示的dsRNA：
式中，
Seq’正向为Seq正向序列对应的RNA序列或序列片段；
Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；
X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补，
||表示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键。
本发明的第二方面，提供了一种dsRNA，所述dsRNA具有式II所示的结构：
式中，
Seq’正向为与GPR160基因或GPR160基因片段的核苷酸序列对应的RNA序列或序列片段；
Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；
X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补；
||表示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键。
在另一优选例中，所述GPR160基因的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述GPR160基因片段的序列如SEQ ID NO.:6，或SEQ ID NO.:7所示。
在另一优选例中，所述间隔序列X的长度为1-100bp，较佳地4-10bp。
在另一优选例中，所述GPR160基因或GPR160基因片段来源于哺乳动物，较佳地来源于人。
本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第一方面所述的dsRNA构建物。
在另一优选例中，所述的表达载体为病毒载体或质粒载体。
在另一优选例中，所述的病毒载体为慢病毒载体及腺病毒载体。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有本发明第三方面所述的表达载体或者染色体中整合有对应于本发明第一方面所述的dsRNA构建物的DNA序列。
在另一优选例中，所述宿主细胞整合有对应于权利要求1所述的dsRNA构建物的DNA序列。
本发明的第五方面，提供了一种组合物，所述的组合物包括抑制GPR160基因表达或拮抗GPR160受体活性的抑制剂或拮抗剂；优选地，所述抑制剂包括：特异性干扰GPR160基因表达的小干扰分子或反义核苷酸；或
与GPR160基因编码蛋白特异性结合的生物或化学配体。
在另一优选例中，所述组合物包括本发明第一方面所述的dsRNA构建物和/或本发明第二方面所述的dsRNA，以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物是用于抑制动物内源GPR160基因表达的组合物。
在另一优选例中，所述的dsRNA具有对应于SEQ ID NO.:6，或SEQ ID NO.:7所示的序列。
在另一优选例中，所述组合物为试剂或药物组合物。
本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的dsRNA构建物，或本发明第二方面所述的dsRNA，或本发明第三方面所述的表达载体，或本发明第五方面所述的组合物的用途：用于制备抑制GPR160基因表达的抑制剂。
在另一优选例中，所述GPR160基因为人GPR160基因。
在另一优选例中，所述用途还包括：用于制备预防或治疗癌症的药物。
在另一优选例中，所述癌症包括但不限于：实体瘤如前列腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌；血液肿瘤如白血病、淋巴瘤；皮肤肿瘤如黑色素瘤等。
本发明的第七方面，提供了一种制备dsRNA的方法，包括步骤：
(i)制备表达dsRNA的构建物，所述构建物为双链，并且其正义链或反义链含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式中，
Seq正向为GPR160基因或GPR160基因片段；
Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
(ii)将步骤(i)所述的构建物转入宿主细胞，从而在宿主细胞中表达形成式II所示的dsRNA，
式中，
Seq’正向为Seq正向序列对应的RNA序列或序列片段；
Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；
X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补，
||表示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键。
在另一优选例中，所述GPR160基因的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述GPR160基因片段的序列如SEQ ID NO.:6、或SEQ ID NO.:7所示。
在另一优选例中，所述间隔序列X的长度为1-100bp，较佳地为4-10bp。
在另一优选例中，所述GPR160基因或GPR160基因片段来源于哺乳动物，较佳地来源于人。
本发明的第八方面，提供了一种核酸序列的用途，所述核酸序列如SEQ ID NO.:6、或7所示，所述核酸序列用于制备GPR160基因表达抑制剂。
在另一优选例中，所述表达抑制剂为小干扰RNA。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1、图示了GPR160在人类前列腺癌组织和前列腺癌细胞株中的表达情况。A为正常前列腺和前列腺癌组织中GPR160的表达情况；B为正常前列腺上皮细胞RWPE-1和四种前列腺癌细胞株(PC-3、DU145、LNCaP和22RV1)中GPR160的表达情况。
图2、图示了GPR160小干扰RNA对前列腺癌细胞的抑制作用。A和B显示了定量RT-PCR的检测结果，特异性小干扰RNA显著降低了PC-3细胞(A)和LNCaP细胞(B)内GPR160基因的表达；C和D：特异性小干扰RNA抑制了PC-3细胞(C)和LNCaP细胞(D)的增殖；E和F：特异性小干扰RNA抑制了PC-3细胞(E)和LNCaP细胞(F)的克隆形成。
图3、图示了GPR160特异性小干扰RNA作用后显著增加了PC-3细胞(A)和LNCaP细胞(B)中DNA亚二倍体峰的比例。
图4、图示了GPR160特异性小干扰RNA诱导了前列腺癌细胞的凋亡。PC-3细胞(A)和LNCaP细胞(B)经编码GPR160小干扰RNA的慢病毒感染后，进行AnnexinV和PI双染，图示为Annexin V单染阳性的细胞比例，该比例在GPR160小干扰RNA处理的细胞中显著高于对照小干扰RNA处理的细胞。
图5、图示应用稳定转染GPR160和Gα16的CHO细胞株筛选GPR160的小分子激动剂。其中绿色的曲线为DMSO溶剂对照；红色曲线表示8μM的Ionomycin(离子霉素)刺激引起的信号反应，黄色曲线为2μM的Ionomycin；灰色曲线为5μg/ml的化合物H5产生的信号反应。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得了能够有效抑制GPR160基因的小干扰RNA，实验结果表明，所述小干扰RNA能够显著的抑制肿瘤的生长，在此基础上完成了本发明。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明揭示了GPR160基因在PCa组织和细胞中均存高表达，且与PCa的发生和发展密切相关。抑制GPR160的过表达可抑制肿瘤细胞生长，诱导其凋亡，提示GPR160可作为干预PCa的靶点。
本发明的一个目的在于提供一种与PCa相关的G蛋白偶联受体GPR160基因及其应用。
本发明的另一目的在于提供所述GPR160在PCa临床诊断、疗效评价和预后推测中的应用。
本发明的另一目的在于提供所述GPR160基因表达抑制剂或受体拮抗剂及其在预防或治疗PCa的药物中的应用。
本发明的另一目的在于应用所述GPR160基因表达抑制剂或受体拮抗剂对PCa进行预防或治疗的方法。
本发明的另一目的在于提供基于所述GPR160作为药物作用靶点，筛选预防或治疗PCa的活性物质的方法。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种基于GPR160基因或蛋白产物、GPR160受体对PCa进行诊断、疗效评价和预后推测的方法。
在一优选例中，所述方法包括采用特异性识别GPR160基因或其编码的蛋白的物质(包括：特异性扩增GPR160基因的引物；特异性识别GPR160基因的探针；或特异性结合GPR160蛋白的配体)对GPR160基因的表达水平进行检测。
在一优选例中，所述的方法包括但不限于PCR、NGS、ELISA、Western Blot、同位素标记、流式细胞术等。
在另一优选例中，所述方法的检测对象为人体样本，包括但不限于血液、细胞、组织和体液等。
在另一优选例中，所述的PCR检测方法所用引物包含对应序列：
SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列；和/或
SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列。
在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一种抑制GPR160基因表达或拮抗GPR160受体活性的抑制剂的用途，用于制备预防或治疗前列腺癌(PCa)的组合物。
在另一优选例中，所述的PCa组织或细胞表达GPR160。
在另一优选例中，所述的抑制剂选自(但不限于)：
特异性干扰GPR160基因表达的小干扰分子或反义核苷酸；或
与GPR160基因编码蛋白特异性结合的生物或化学配体。
在另一优选例中，所述小干扰分子为小干扰RNA分子(Small interfering RNA，siRNA)。
在另一优选例中，所述siRNA包含GPR160基因的有义核苷酸和反义核苷酸。
在另一优选例中，所述的小干扰RNA分子以对应序列SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列作为靶序列。
在另一优选例中，所述的小干扰RNA分子包含对应序列：
SEQ ID NO.:6所示的核苷酸序列；和/或
SEQ ID NO.:7所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的GPR160基因来源于哺乳动物，优选为人。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种预防或治疗PCa的方法，包括给需要的对象施用siRNA组合物，所述组合物包含降低GPR160基因表达的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述方法包括给予患者反义组合物，所述组合物包含与GPR160编码序列互补的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述方法包括给予患者有效量的拮抗剂，所述拮抗剂与GPR160基因编码的受体结合。
在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一种用于预防或治疗PCa的小干扰RNA分子，所述的小干扰RNA为双链分子，其包含有义链和反义链，其中有义链包含对应：
SEQ ID NO.:6所示的核苷酸序列；和/或
SEQ ID NO.:7所示的核苷酸序列。
反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和反义链相互杂交形成所述双链分子。
优选的，所述双链分子被引入表达GPR160基因的细胞时抑制所述基因的表达。
在另一优选例中，所述双链分子的靶序列包含来自SEQ ID NO.:1组成的核苷酸的至少约10个连续核苷酸。
优选的，所述双链分子的靶序列包含来自SEQ ID NO.:1组成的核苷酸的至少约19到约25个连续核苷酸。
优选的，所述双链分子是包含有义链和反义链组成的单一核糖核苷酸转录物。
在本发明的另一个实施方式中，本发明提供一种用于预防或治疗PCa的组合物，所述的组合物含有：
1、有效量的GPR160基因表达抑制剂或受体拮抗剂；
2、药学上可接受的载体。
优选的，所述组合物包含GPR160基因的小干扰RNA分子。
优选的，所述的小干扰RNA为双链分子，其包含有义链和反义链，其中有义链包含对应：
SEQ ID NO.:6所示的核苷酸序列；和/或
SEQ ID NO.:7所示的核苷酸序列。
反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和反义链相互杂交形成所述双链分子。
优选的，所述双链分子被引入表达GPR160基因的细胞时抑制所述基因的表达。
在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一种筛选预防或治疗PCa活性潜在物质的方法，所述方法包括：
1、用被测物质处理表达GPR160的体系；
2、检测所述体系中GPR160基因的表达及活性；
3、选择可抑制GPR160基因表达或降低其受体活性的被测物质。
在另一优选例中，所述方法的步骤(1)包括：在测试组中，将被测物质加入到表达GPR160的体系中，和/或
所述方法的步骤(2)包括：检测被测物质对体系中GPR160基因的表达或活性，并与对照比较，其中所述的对照是不添加所述被测物质的GPR160表达体系。
如果含被测物质体系中GPR160基因的表达或受体活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照，即表明该被测物质具有预防或治疗PCa的潜力。
在另一优选例中，所述的体系是细胞。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的活性物质进行细胞功能和/或动物实验，以便进一步选择和确定其是否有益于预防或治疗PCa。
在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一种双链分子，其包含有义链和反义链，其中有义链包含对应SEQ ID NO.:6和/或SEQ ID NO.:7组成的靶序列的核糖核苷酸序列，反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和反义链相互杂交形成所述双链分子，并且其中所述双链分子被引入表达GPR160基因的细胞时抑制所述基因的表达。
在另一优选例中，其中所述靶序列包含来自SEQ ID NO.:1组成的核苷酸的至少约10个连续核苷酸。
在另一优选例中，所述靶序列包含来自SEQ ID NO.:1组成的核苷酸的至少约19到约25个连续核苷酸。
在另一优选例中，所述双链分子是包含有义链和反义链组成的单一核糖核苷酸转录物。
为了阐明发明内容且不受其局限，对发明分成以下几个小节进行详细描述。
A.定义
除非另有定义，本发明所用的技术和科学上的术语，与本发明所属领域的通用技术的一般理解具有相同意义。本处提到的来源于基因库和其他数据库的所有专利申请、专利授权和其他出版物与序列被全面收入引用作为参考。如果本节阐明的定义与本专利参用的来源于基因库和其他数据库的所有专利申请、专利授权和其他出版物与序列被收入和引用的定义阐述相反，或不一致时，以本节阐明的定义为准。
除非另外特别指出，本文术语“一种”、“该”和“所述”意指“至少一种”或“一个或多个”。
本文所用，“前列腺癌”系指一类男性生殖系统常见的恶性肿瘤，以腺癌为主。
本文所用的用于治疗某一特定疾病化合物的“有效量”系指能够足够改善或在某种程度上减轻与此病相伴症状的剂量。本发明中主要为治疗病理性上调的基因的表达，“有效量”因个体中癌灶大小、数目或转移可能性而异。这一剂量可以单一剂量给药，也可按照治疗方案给药。这一剂量可治愈疾病，但典型的是为了缓解症状而给药。当治疗用于预防时，“有效的”是指延缓或阻止PCa的形成，或预防、延缓或减轻临床症状。前列腺肿瘤的评估可利用标准临床方案来进行。此外，有效性可根据任何诊断和治疗PCa的已知方法来关联测定，如PCa的诊断可通过鉴定出现症状的异常情况，例如体重降低、腹部疼痛、背痛、厌食、恶心、呕吐、全身不适、虚弱以及黄疸等。为改善症状重复给药可能是需要的。
本文所用，“治疗”系指疾病和症状用任何方式得以改善，或其他有益的改变。治疗也包括本发明在药物上的应用。
本文所用，给予某一特定药物组合物“改善”某一特定疾病的症状是指任何减轻，无论永久的，临时的，长时期的，短暂的，都能归因于或与该药物组合物的施用有关。
这里所用的“组合物”指任何混合物。可以是溶液、混悬液、液体、粉末、油膏、水性的、非水性的或它们的任何组合。
这里所用的“组合”指两种或多种之间的任何联合。
这里使用的术语“对象”包括人和动物，例如，狗，猫，牛，猪，啮齿动物等。有经验的实施者应可理解对象为适于并愿意接受预防和治疗的个体。
B.GPR160基因
GPR160属于孤儿G蛋白偶联受体。人类GPR160基因位于第3染色体q26.2-q27的位置，其编码的蛋白质属于A族蛋白偶联受体，包含338个氨基酸。目前，人们对GPR160的生理功能尚不认识，其与癌症发生和发展的关系更不清楚。本发明通过对正常前列腺和前列腺癌组织的cDNA芯片进行qRT-PCR检测，发现GPR160的转录水平在前列腺癌组织中显著高于正常前列腺组织。本发明同时分析了GPR160在四种PCa细胞(PC-3，DU145，LNCaP和22RV1)和一种正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)中的表达，发现PCa细胞株中的GPR160表达水平显著高于其在正常前列腺上皮中的表达。上述结果说明GPR160的表达与PCa的发生发展存在一定的联系。
为了研究干预GPR160的表达是否可以抑制PCa细胞的生长，本发明制备了包含可显著降低内源性GPR160表达水平的小干扰RNA分子并高效感染PCa细胞株的慢病毒。实验发现，与对照小干扰RNA分子处理对比，GPR160小干扰RNA分子作用后的PCa细胞中大部分内源性GPR160表达量降低，细胞生长受到抑制，克隆形成数明显减少，说明降低GPR160的表达可以抑制PCa细胞的生长。
优选地，所述GPR160基因为人GPR160基因，其多核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.:1，人源GPR160基因(NM_014373.2)
C.基于GPR160基因或蛋白产物的诊断方法
基于上述发现，可以将GPR160作为诊断PCa的标志物用于：
1、PCa的分型、鉴别诊断和/或易感性分析；
2、相关人群对PCa治疗反应、药物疗效和预后的评估以及选择合适的治疗方案；
3、相关人群PCa患病风险的早期评估、早期监测早期防治。如遴选由GPR160表达异常的人群进行针对性干预。
因此，本发明提供了GPR160基因或蛋白的用途，用于制备诊断(和/或检测)PCa的试剂和/或试剂盒，对PCa进行诊断、疗效评价和预后推测。
可采用各种本领域已知的技术来检测GPR160基因的表达情况，这些方法都包括在本发明中，包括但不限于PCR、NGS、ELISA、Western Blot、同位素标记、流式细胞术等。
D.GPR160基因抑制剂或受体拮抗剂
基于上述发现，本发明提供了一种GPR160基因表达抑制剂或受体拮抗剂的用途，用于制备预防或治疗PCa的组合物。
如本文所用，所述的GPR160基因抑制剂或受体拮抗剂包括了抑制剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂和拮抗剂等。
所述的GPR160基因抑制剂或受体拮抗剂是指任何可下调GPR160基因表达、降低受体活性、减少GPR160基因或受体稳定性和缩短受体作用时间或抑制基因转录和翻译的物质。这些物质均可用于本发明，作为GPR160基因抑制剂或受体拮抗剂用于预防或治疗PCa。例如，所述的抑制剂是：特异性干扰GPR160基因表达的siRNA分子或反义核苷酸；所述的拮抗剂是：特异性与GPR160受体结合的生物或化学配体。
作为本发明的一种优选方式，所述的抑制剂是一种GPR160基因特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA(siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)。
作为本发明特别优选的方式，提供了一种效果良好的小干扰RNA分子，所述的小干扰RNA分子可以特异性地干扰人类GPR160基因的表达，与其他人类核酸序列没有显著的同源性，并经实验验证具有干扰GPR160表达的良好效果。所述的小干扰RNA分子包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7序列的一种或多种。更优选的，所述的小分子干扰RNA是包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7序列的小干扰RNA分子的组合分子。
本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法、体外转录法及用特定载体进行体内表达等。本领域技术人员在得知了本发明所提供的小干扰RNA序列以后，可以以各种途径方便地制备或表达所述的小干扰RNA。例如，本发明的一种优选例中，所述的小干扰RNA是化学合成的，而在另一优选例中，是用慢病毒表达载体表达的。
小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，含一条正义链和一条反义链，这两条链仅在杂交条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。例如，在化学合成法中，互补的正义链和反义链分别合成后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生产的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。例如用慢病毒表达系统制备，正义链和反义链经连接序列组成shRNA，构建入公知慢病毒表达载体，体内表达后经酶切加工后成为小干扰RNA分子，进而发挥特异性沉默PCa中内源性GPR160基因表达的作用。
在本发明的一个优选地实施方式中，由正义链和反义链经连接序列组成的对应于本发明的shRNA的构建物序列包括SEQ ID NO.:6所示的正义链序列和SEQ IDNO.:11所示的反义链序列：
5’-TTGGTACAGGCTATCAGGATAACTTCCTA-3’(SEQ ID NO.:6)
5’-TAGGAAGTTATCCTGATAGCCTGTACCAA-3’(SEQ ID NO.:11)
在本发明的一个优选地实施方式中，由正义链和反义链经连接序列组成的对应于本发明的shRNA的构建物序列包括SEQ ID NO.:7所示的正义链序列和SEQ IDNO.:12所示的反义链序列：：
5’-TTCTATGTCAGCATTCAGAGTTACTGGCT-3’(SEQ ID NO.:7)
5’-AGCCAGTAACTCTGAATGCTGACATAGAA-3’(SEQ ID NO.:12)
所述的小干扰RNA分子可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
E.以GPR160为靶点的药物筛选技术
基于GPR160在PCa细胞中过表达以及干扰其表达可抑制肿瘤细胞生长的特性，以其为靶点来筛选能够抑制GPR160基因表达或拮抗受体活性的物质有望提供预防和治疗PCa的新药。因此，本发明提供一种筛选抑制GPR160基因表达或拮抗受体活性物质的方法，所述方法包括：
1、用被测物质处理表达GPR160的体系；
2、检测被测物质在所述体系对GPR160基因表达及活性的影响；
3、选择可抑制GPR160基因表达或拮抗受体活性的被测物质。
所述的体系较佳的是细胞(或细胞培养物)，所述的细胞可以是内源性表达GPR160或重组表达GPR160的细胞。例如所述的细胞选自PC-3、LNCaP或经基因转染后表达GPR160的工程细胞株如CHO、HEK293等。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到GPR160表达或受体活性的改变，还可设置对照，所述的对照可以是不添加所述被测物质的GPR160表达体系。
作为本发明的优选方式，所述方法还包括对获得的活性物质进行细胞功能和/或动物实验，以便进一步选择和确定其是否有益于预防或治疗PCa。
F.GPR160基因抑制剂或受体拮抗剂组合物
本发明还提供了一种用于预防或治疗PCa的组合物，所述的组合物含有有效量的GPR160基因抑制剂或受体拮抗剂以及药学上可接受的载体。任何前述的GPR160基因抑制剂或受体拮抗剂均可用于组合物的制备。
作为本发明的一种优选方式，提供了一种用于预防或治疗PCa的组合物，所述的组合物含有有效量的本发明所述靶向GPR160的小干扰RNA分子、特异性结合受体的抗体或化学拮抗剂，以及药学上可接受的载体。
如本文所用，“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物接受的治疗量。所述“药学上可接受的载体”系指用治疗量给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指代的药剂载体本身并不是必要的活性成分且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域技术人员所熟知的，可含有液体，如水、盐水、缓冲液，另还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流液、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述载体中还可以含有细胞转染试剂。
G.治疗和预防方法
本发明涉及预防或治疗GPR160高表达的PCa及其症状的方法。该方法包括对需要或愿意接受预防或治疗的对象，给予有效量的、选择性地干扰GPR160基因表达的抑制剂或降低GPR160受体活性的拮抗剂及其组合物来预防或治疗上述疾病或症状。
优选地，上述前列腺癌通过给予有效量的本发明所述靶向GPR160的特异性小干扰RNA分子、GPR160受体特异性生物或化学拮抗剂，以及药学上可接受的载体来预防或治疗。
可以用本方法治疗任何对象，优选哺乳动物，更优选人。
在预防或治疗由上述疾病和症状时，可单独使用或与其他已经上市或将要上市的抗肿瘤药物联合使用本发明的GPR160抑制剂或拮抗剂。
对于所述GPR160基因抑制剂或受体拮抗剂或其药物组合物，可以通过任何合适的方法单独以本发明的组合物，或与其他合适的抗肿瘤药物联合使用。可以采用的给药方式包括但不限于：腔内注射，皮下注射，静脉注射，肌肉注射，真皮内注射，局部、植入和缓释给予等。
本发明所述GPR160基因抑制剂或受体拮抗剂的有效量可随给药对象、给药模式和待治疾病的严重程度等而变化。优选有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定，例如通过临床试验。所述因素包括但不限于：所述GPR160基因抑制剂或受体拮抗剂的药代动力学参数例如生物利用度、代谢、半衰期等；患者所要治疗疾病的严重程度、患者体重、免疫状况和给药途径等。
在具体实施方案中，本方法进一步包括对给药对象的疾病或症状进行诊断、疗效评估和预后判断。可以使用任何适合的方法用于诊断和评估相关疾病或症状、治疗效果及其预后。诊断和预后可以基于检测和/或鉴定任何或所有的体内物质，例如酶、抗原、抗体、核酸或其他病理性和临床标记物等以及相关症状。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明经过大量的筛选，获得一类对GPR160基因具有显著抑制作用的小干扰RNA；
(2)本发明的小干扰RNA对GPR160阳性的肿瘤，特别是前列腺癌有显著的抑制效果。
(3)本发明提供了以GPR160表达抑制剂或蛋白拮抗剂为主要成分的药物组合物，用于GPR160高表达肿瘤，尤其是前列腺癌的治疗。
(4)本发明提供了以GPR160为靶点进行临床诊断和开展药物筛选的方法。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1.细胞培养
人胚肾上皮细胞293T、前列腺癌细胞株PC-3、LNCaP、DU145、22RV1、正常前列腺上皮细胞RWPE-1及中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1购自ATCC。LNCaP和22RV1培养在含10％FBS和100U/ml青链霉素的高糖RPMI1640培养基中，PC-3和DU145培养在含10％FBS和100U/ml青链霉素的普通RPMI1640培养基中。RWPE-1所用培养基为含50μg/ml和5ng/ml表皮生长因子的K-SF培养基。293T以含10％FBS和100U/ml青链霉素的高糖DMEM培养。CHO细胞在含10％FBS和100U/ml青链霉素的F12培养基中培养。所有细胞均在37℃含5％CO2的培养箱中培养。
实施例2.定量RT-PCR(探针法)检测GPR160在前列腺癌组织和前列腺癌细胞中的表达
前列腺癌组织和正常前列腺组织的cDNA芯片购自OriGene。检测所用Taqman探针购自Invitrogen，仪器选用ViiA 7Real-Time PCR检测系统(Applied Biosystems)。各培养细胞的总RNA用Trizol试剂(Invitrogen)提取，以Oligo-dT做引物，逆转录酶转录生成cDNA。内参基因为TATA盒结合蛋白(TATA-box binding protein，TBP)基因。结果如图1所示，前列腺癌组织中GPR160的表达水平显著高于正常的前列腺组织(图1A)；无论是雄激素依赖性(LNCaP和22RV1)还是激素非依赖性(PC-3和DU145)的前列腺癌细胞，其内源性GPR160的表达水平均显著高于正常的前列腺上皮细胞RWPE-1(图1B)。
实施例3.定量RT-PCR(SYBR法)检测GPR160在前列腺癌细胞中的表达
各培养细胞的总RNA用Trizol试剂(Invitrogen)提取，以Oligo-dT做引物，逆转录酶转录生成cDNA。将模板、引物与SYBR检测试剂(TaKaRa)混合后，应用7300定量PCR仪进行检测。内参基因为编码β-actin基因ACTB(NC_000007.14)。
扩增序列所针对的靶基因如SEQ ID NO:1所示。
引物序列分别如下：
GPR160基因：
正向，SEQ ID NO.：2
5’-TGCAGTCCGGAGACGAACG-3’
反向，SEQ ID NO.：3
5’-GTAAGCTCGGAGACATTTGCG-3’
ACTB
正向，SEQ ID NO.：4
5’-GAGAAAATCTGGCACCACACC-3’
反向，SEQ ID NO.：5
5’-TACCCCTCGTAGATGGGCAC-3’
实施例4.GPR160干扰小RNA抑制前列腺癌细胞的生长
4.1GPR160干扰小RNA的制备
为持续性地抑制细胞内GPR160基因的表达，本发明人采用了慢病毒表达系统。慢病毒shRNA表达质粒(货号：TL312662)购自OriGene，其中GPR160小干扰RNA所针对的靶基因序列如SEQ ID NO:1所示，小干扰RNA的正义链序列分别如SEQ IDNO.:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO:9所示。非特异性对照小干扰RNA的正义链序列如SEQ ID NO:10所示。
SEQ ID NO.:6(ShGPR160-S6)
5’-TTGGTACAGGCTATCAGGATAACTTCCTA-3’
SEQ ID NO.:7(ShGPR160-S7)
5’-TTCTATGTCAGCATTCAGAGTTACTGGCT-3’
SEQ ID NO.:8(ShGPR160-S8)
5’-CCATCTACCAAAGCCTGAAGGCACAGAAT-3’
SEQ ID NO.:9(ShGPR160-S9)
5’-CCATTTGTCAACTGGAAGTGCTGCTTCAT-3’
SEQ ID NO.:10(ShGPR160-S10)
5‘-GCACTACCAGAGCTAACTCAGATAGTACT-3’
以Qiagene公司的质粒抽提试剂盒提取小干扰RNA表达质粒pGFP-C-shGPR160和对照质粒pGFP-C-Scramble，与包装质粒混合均匀后，用MegaTran(OriGene)转染已接种24小时的293T细胞，72小时后收集病毒上清。15000rpm离心15分钟去除细胞碎片后，加入四分之一体积的慢病毒浓缩液(Biomiga)进行浓缩，分装后贮于-80℃。由包含序列SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:9的pGFP-C-shGPR160质粒转染产生的病毒分别标记为ShGPR160-S6、ShGPR160-S7、ShGPR160-S8和ShGPR160-S9，由非特异性对照质粒转染产生的病毒标记为ShGPR160-S10。
将制备好的慢病毒分别按感染复数(Multiplicity of infection，MOI)40和10感染PC-3和LNCaP细胞，72小时后提取被感染细胞的总RNA，定量RT-PCR检测细胞内的GPR160表达情况。结果显示，与对照病毒ShGPR160-S10处理组相比，ShGPR160-S6在PC-3和LNCaP中的抑制效率分别为87.8％和86.2％，ShGPR160-S7在两个细胞中的抑制效率分别为85.0％和91.7％；ShGPR160-S8在PC-3和LNCaP中的抑制效率分别为41.7％和32.8％，ShGPR160-S9在两个细胞中的抑制效率分别为41.8％和56.2％。ShGPR160-S6和ShGPR160-S7对细胞内源的GPR160表达的抑制作用明显优于ShGPR160-S8和ShGPR160-S9(图2A和2B)。
本发明人筛选了大量的针对GPR160基因的小干扰RNA分子，发现了包含SEQID NO.:6、或SEQ ID NO.:7所示的核苷酸序列的小干扰RNA分子能够显著地抑制GPR160基因的表达，抑制活性远优于其它的小干扰RNA分子。
4.2GPR160特异性小干扰RNA对前列腺癌细胞生长的影响
为检测GPR160特异性干扰小RNA对前列腺癌细胞增殖的影响，病毒感染48小时后的PC-3和LNCaP细胞分别按5000个/100μl/孔和2500个/100μl/孔的密度接种于96孔板，并分别培养1、3、5天，培养结束前4小时加入10μl/孔的CCK-8检测试剂(TaKaRa)，孵育结束后450nm光吸收。参比波长为650nm。Scramble组的读数设为100％。结果如图2C和2D所示，ShGPR160-S6和ShGPR160-S7均显著抑制了PC-3和LNCaP细胞的增殖；ShGPR160-S8对两个细胞均无抑制作用；ShGPR160-S8的效果在PC-3中比较明显，而对LNCaP的生长没有显著影响。
基于上述结果，本发明人将ShGPR160-S6、ShGPR160-S7和ShGPR160-S10感染PC-3和LNCaP细胞48小时后，以1000个/2ml/孔接种于96孔板，连续培养12～20天后，细胞用0.1％结晶紫溶液染色，晾干，计数每孔克隆数。以ShGPR160-S10病毒感染组设为100％的对照。结果显示，无论在PC-3还是LNCaP细胞中，ShGPR160-S6和ShGPR160-S7感染后形成的克隆数均显著少于ShGPR160-S10对照组(图2E和2F)。
由此可见，降低内源性GPR160之表达可以抑制前列腺细胞的生长和克隆形成。
4.3GPR160干扰小RNA诱导了前列腺癌细胞的凋亡
病毒感染48小时后的PC-3和LNCaP细胞重新用胰酶(Invitrogen)消化培养，继续培养48小时后以1000rpm×5分钟收集细胞，包括培养液中的细胞碎片。4℃预冷的PBS洗一遍，重新离心，弃上清后以4℃预冷的70％酒精固定细胞，50μg/ml的PI溶液和100μg/ml的RNase A(Tiangen)在37℃处理30分钟，细胞内DNA含量用Accuri C6流式细胞仪进行检测(BD Biosciences)。编码GPR160特异性干扰小RNA的慢病毒感染显著增加了细胞DNA的亚二倍体(sub-G1)峰(图3)，表明存在细胞凋亡。
进一步的细胞凋亡检测应用APC标记的Annexin V和碘化丙啶(propidiumiodide,PI)和双染进行。细胞感染48小时后，收集细胞并重新接至6孔板中。继续培养48小时后，收集细胞，PBS洗一次，以100μL 1X Annexin-binding buffer重悬，加入1μl的PI溶液(100μg/ml)和5μl经APC偶联的Annexin V溶液，室温染色15分钟，细胞再补入400μL 1X Annexin-binding buffer，流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞数。编码GPR160特异性干扰小RNA的慢病毒感染显著增加了细胞的凋亡(图4)。
实施例5.GPR160小分子调节剂的筛选
为筛选GPR160的小分子拮抗剂，本发明人拟制备筛选模型筛选其小分子激动剂。将表达GPR160和Gα16的质粒共转染CHO细胞，用600μg/ml新霉素和200μg/ml潮霉素筛选稳定克隆，通过免疫荧光分析细胞表面的受体表达情况，并以钙离子载体Ionomycin鉴定细胞的钙流反应，筛选获得持续高水平表达GPR160并有较好细胞内钙流反应的细胞株用于GPR160小分子调节剂的筛选。具体筛选过程如下：
将CHO-Gα16-GPR160细胞以5000个/30μl/孔接种于384孔细胞培养板，培养过夜后，每孔加入等体积的Calcium 5检测试剂(Molecular Devices)，37℃孵育45分钟后，置于FLIPR荧光读板机中检测。化合物加液体积为10μl/孔(20μg/ml，DMSO含量为2％)。激发波长为485nm，发射波长525nm。如图5所示，阴性对照为终浓度0.5％的DMSO，阳性对照分别为8μM(红色)和2μM(黄色)的离子霉素，灰色曲线为代表性活性化合物H5(终浓度5μg/ml)的反应信号。
上述例子仅作为说明的目的，本发明的范围并不受此限制。对本领域的技术人员来说进行修改是显而易见的，本发明仅受所附权利要求范围的限制。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种dsRNA构建物，其特征在于，所述dsRNA构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式中，
Seq正向为GPR160基因或GPR160基因片段；
Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
2.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述GPR160基因序列如SEQ ID NO.:1所示；和/或
所述GPR160基因片段的序列如SEQ ID NO.:6、或7所示。
3.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述Seq正向的序列如SEQ ID NO.:6、或SEQ ID NO.:7所示。
4.一种dsRNA，其特征在于，所述dsRNA具有式II所示的结构：
式中，
Seq’正向为与GPR160基因或GPR160基因片段的核苷酸序列对应的RNA序列或序列片段；
Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；
X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补；
||表示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键；
优选地，所述GPR160基因的序列如SEQ ID NO.:1所示；
更优选地，所述GPR160基因片段的序列如SEQ ID NO.:6，或SEQ ID NO.:7所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的dsRNA构建物。
6.一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有权利要求5所述的表达载体或者染色体中整合有对应于权利要求1所述的dsRNA构建物的DNA序列。
7.一种组合物，所述的组合物包括抑制GPR160基因表达或拮抗GPR160受体活性的抑制剂或拮抗剂；优选地，所述抑制剂包括：特异性干扰GPR160基因表达的小干扰分子或反义核苷酸；或
与GPR160基因编码蛋白特异性结合的生物或化学配体。
8.权利要求1所述的dsRNA构建物，或权利要求2所述的dsRNA，或权利要求3所述的表达载体，或权利要求5所述组合物的用途：用于制备抑制GPR160基因表达的抑制剂；
优选地，所述用途还包括：用于制备预防或治疗癌症的药物；
更优选地，所述癌症包括但不限于：实体瘤如前列腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌；血液肿瘤如白血病、淋巴瘤；皮肤肿瘤如黑色素瘤等。
9.一种制备dsRNA的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)制备表达dsRNA的构建物，所述构建物为双链，并且其正义链或反义链含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式中，
Seq正向为GPR160基因或GPR160基因片段；
Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
(ii)将步骤(i)所述的构建物转入宿主细胞，从而在宿主细胞中表达形成式II所示的dsRNA，
式中，
Seq’正向为Seq正向序列对应的RNA序列或序列片段；
Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；
X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补，
||表示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键；
优选地，所述GPR160基因的序列如SEQ ID NO.:1所示；
更优选地，所述GPR160基因片段的序列如SEQ ID NO.:6、或SEQ ID NO.:7所示。
10.一种核酸序列的用途，所述核酸序列如SEQ ID NO.:6、或7所示，所述核酸序列用于制备GPR160基因表达抑制剂；优选地，所述表达抑制剂为小干扰RNA。
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