CN115807082A - lncRNA LINREP在胶质瘤诊断、预后和治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及lncRNA LINREP在胶质瘤诊断、预后和治疗中的应用。本发明筛选出在胶质瘤/瘤旁/正常脑组织中差异表达同时与PTBP1特异性结合的lncRNA LINREP，且证明其是胶质瘤患者的不良预后因素。同时进一步确定了LINREP通过抑制PTBP1的泛素‑蛋白酶体降解途径增强PTBP1蛋白稳定性，从而促进PTBP1介导RTN4 3号外显子跳跃突变的分子调控机制，并从m⁶A甲基化修饰角度探究LINREP异常表达的上游调控机制。本发明对LINREP在胶质瘤中的临床价值、生物学功能及分子机制进行深入探索，有望开发其在脑胶质瘤诊断、预后及治疗中的应用。

Description

lncRNA LINREP在胶质瘤诊断、预后和治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及lncRNA LINREP在胶质瘤诊断、预后和治疗中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

胶质瘤是临床成人最常见的颅内原发性肿瘤，约占中枢神经系统原发性肿瘤的一半，年发病率约为3～6.4/10万。根据世界卫生组织(WHO)病理分级，胶质瘤分为I～IV级，其中恶性程度最高的多形性母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，WHO IV)，具有侵袭性高、异质性大、临床进展快等特点，预后极差。尽管过去几十年中胶质瘤治疗取得了一定进展，但是目前胶质瘤患者经过手术、放疗和化疗的标准方案治疗后，中位生存时间仍然只有14～16个月。胶质瘤的恶性进展是涉及多因素紊乱、多基因调控、多种信号通路介导的复杂病理学过程。因此，揭示胶质瘤发生发展的潜在机制并寻找新的靶向治疗策略至关重要。

可变剪接是真核生物中受到严格调控的生物学过程，一个mRNA前体(pre-mRNA)的蛋白编码序列(外显子)可以被选择性地组装为不同形式，最终产生多种具有独特功能的蛋白亚型。可变剪接失调是肿瘤的重要特征之一，多项研究证实异常剪接产物可参与调控胶质瘤的发生发展。肿瘤相关的可变剪接主要由剪接因子异常表达或活性改变导致，在癌症发生、发展、转移的各个阶段均发挥重要的驱动作用。作为hnRNP家族的成员，多聚嘧啶区结合蛋白1(Polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP1)在多种肿瘤中高表达，可通过调节肿瘤特异性的可变剪接事件，促进肿瘤的多种恶性生物学效应，包括细胞增殖、血管生成、侵袭、凋亡、糖酵解代谢、化疗耐药等。这些发现具有重要意义，提示PTBP1介导的异常可变剪接事件有望成为癌症治疗的新兴靶点。然而，目前胶质瘤中PTBP1异常表达或活性改变的调控机制仍不明确。

长链非编码RNA((long noncoding RNA，lncRNA)作为一类新兴的表观遗传调控因子，具有二级结构复杂，功能调控多样等特点。lncRNA通过互补碱基形成复杂、保守的二级结构，可与DNA、RNA或蛋白质相互结合，在染色质重构、转录或转录后水平调控基因的表达。越来越多的研究表明lncRNA与肿瘤发生发展的多种病理进程密切相关，这意味着lncRNA可能在胶质瘤相关的异常可变剪接调控方面也发挥着重要作用，但是发明人发现，相关研究仍比较匮乏，特别是在PTBP1介导的异常剪接事件发生中，大多数lncRNA的功能和生物学效应仍未可知。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供lncRNA LINREP在胶质瘤诊断、预后和治疗中的应用。本发明首次筛选出在胶质瘤/瘤旁/正常脑组织中差异表达同时与PTBP1特异性结合的新型lncRNA LINREP。且证明其是胶质瘤患者的不良预后因素。同时进一步确定了LINREP通过抑制PTBP1的泛素-蛋白酶体降解途径增强PTBP1蛋白稳定性，从而促进PTBP1介导的RTN4 3号外显子跳跃突变的分子调控机制，并从m⁶A甲基化修饰角度探究胶质瘤中LINREP异常表达的上游调控机制。本发明对LINREP在胶质瘤中的临床价值、生物学功能及分子机制进行了深入探索，有望开发其作为脑胶质瘤诊断/治疗/预后标志物的应用。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供检测LINREP的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的产品中的应用。

本发明通过lncRNA组织表达谱芯片分析胶质瘤组织、瘤旁组织和正常脑组织中差异表达的lncRNA，最终从与PTBP1结合强度最高的前8条候选lncRNAs中鉴定出3条差异表达且与PTBP1特异性结合的lncRNA(NONHSAT036725，ENST00000582029和ENST00000504508)。其中，NONHSAT036725(NONCODE TRANSCRIPT ID NONHSAT036725，重命名为LINREP-Longintergenic noncoding RNA for ELAVL1 and PTBP1)在胶质瘤样本中的表达水平较正常脑组织增加了4倍以上，进一步研究证明，LINREP表达量和肿瘤级别是胶质瘤患者预后不良的独立预测因素，因此，所述LINREP可作为诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的生物标志物。

本发明的第二个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的产品，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样品中LINREP的表达。

本发明的第三个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的系统，所述系统包括：

i)分析模块，所述分析模块包含用于确定受试者的待测样品中选自上述LINREP表达水平的检测物质，以及；

ii)评估模块，所述评估模块包含：根据i)中确定的所述LINREP的表达水平判断所述受试者患病情况。

本发明的第四个方面，提供抑制LINREP表达和/或活性降低的物质在如下a1)-a7)至少一种中的应用：

a1)抑制脑胶质瘤细胞增殖或制备抑制脑胶质瘤细胞增殖的产品；

a2)抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭或制备抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭的产品；

a3)抑制脑胶质瘤生长或制备抑制脑胶质瘤生长的产品；

a4)抑制PTBP1泛素化或制备抑制PTBP1泛素化的产品；

a5)抑制PTBP1/RTN4可变剪接或制备抑制PTBP1/RTN4可变剪接的产品；

a6)抑制LINREPm⁶A甲基化或制备抑制LINREPm⁶A甲基化的产品；

a7)治疗脑胶质瘤或制备治疗脑胶质瘤的产品。

本发明的第五个方面，提供促进LINREP表达和/或活性提高的物质在b1)-b7)至少一种中的应用：

b1)促进脑胶质瘤细胞增殖或制备促进脑胶质瘤细胞增殖的产品；

b2)促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭或制备促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭的产品；

b3)促进脑胶质瘤生长或制备促进脑胶质瘤生长的产品；

b4)促进PTBP1泛素化或制备促进PTBP1泛素化的产品；

b5)促进PTBP1/RTN4可变剪接或制备促进PTBP1/RTN4可变剪接的产品；

b6)促进LINREPm⁶A甲基化或制备促进LINREPm⁶A甲基化的产品；

b7)构建脑胶质瘤细胞和/或脑胶质瘤动物模型。

本发明的第六个方面，提供一种治疗脑胶质瘤的方法，所述方法包括向受试者施用上述抑制LINREP表达和/或活性降低的物质。

与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：

上述技术方案从可变剪接的调控机制出发，揭示了新型lncRNA LINREP与PTBP1介导胶质瘤可变剪接失调之间的功能联系。机制上，LINREP通过与PTBP1直接结合，抑制PTBP1的泛素-蛋白酶体降解途径以增强PTBP1蛋白稳定性，从而调控下游一系列致癌基因的可变剪接事件，尤其是参与RTN4 3号外显子跳跃，最终促进胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭等恶性生物学行为。此外，METTL3介导LINREP的m6A甲基化修饰，促进HuR结合并稳定m6A修饰的LINREP，导致LINREP表达上调。

上述技术方案对lncRNA在胶质瘤异常剪接调控中的重要功能及分子机制进行探究，为寻找胶质瘤临床诊断和预后评估的生物标志物及药物治疗靶点提供了新的视角，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为筛选、识别与剪接因子PTBP1相互作用的lncRNA LINREP。A.RNA-seq测序数据显示与PTBP1结合的lncRNAs(RIP/Input倍数变化>2，FDR<0.01)，红色标记为与PTBP1结合强度最高的前8位lncRNAs。B.结合lncRNA组织表达谱芯片，从8条候选lncRNAs中挑选出3条差异表达且与PTBP1特异性结合的lncRNAs。C.芯片原始数据显示NONHSAT036725(LINREP)、ENST00000582029和ENST00000504508在胶质瘤/瘤旁/正常脑组织中的相对表达量。D.RIP实验显示相比于IgG抗体，PTBP1抗体可显著富集LINREP。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns.无显著差异。

图2为LINREP与HuR/PTBP1蛋白复合体相互结合。A.使用生物素标记的正义和反义LINREP进行RNA pull-down实验，SDS-PAGE凝胶电泳银染显示在35～70kDA区域存在多处差异蛋白条带，经蛋白质谱分析，PTBP1和HuR蛋白评分最高。B.用生物素标记的反义和正义LINREP进行RNA pull-down实验，Western Blot实验证实PTBP1和HuR蛋白与LINREP结合。C.RIP实验显示相比于IgG抗体，HuR抗体能显著富集LINREP。D.FISH-免疫荧光实验检测U251细胞中LINREP和HuR或PTBP1蛋白共定位的情况。E.利用CGGA、TCGA和REMBRANDT数据库，分析胶质瘤组织中HuR和PTBP1 mRNA表达量之间的相关性(皮尔森相关系数)。F-G.提取胶质瘤细胞或转染HA-HuR和Flag-PTBP1质粒HEK293细胞的蛋白裂解物，进行内源性和外源性Co-IP实验后，Western Blot实验证实HuR与PTBP1相互结合。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图3为LINREP在胶质瘤中的表达、分布及临床意义。A-B.RNA-ISH检测LINREP在WHOII-IV级胶质瘤组织中的表达量及统计图。C.Kaplan-Meier曲线分析LINREP高/低表达的胶质瘤患者总生存率(n＝104)。D.使用COX回归模型对胶质瘤患者生存期进行多变量分析。E.RNA-FISH实验检测在U87和U251细胞中LINREP的亚细胞分布。F.RNA核浆分离实验定量分析LINREP的细胞核和细胞质分布。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图4为体外条件下LINREP促进胶质瘤细胞的增殖能力。A-B.RT-qPCR实验检测在U87和U251细胞中LINREP的敲除或过表达效率。C.CCK-8实验检测敲低LINREP后U87和U251细胞的增殖能力。D.CCK-8实验检测过表达LINREP后U87和U251细胞的增殖能力。E.EdU实验检测敲低LINREP后U87和U251细胞的增殖活性。F.EdU实验检测过表达LINREP后U87和U251细胞的增殖活性。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图5为体外条件下LINREP促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力。A.Transwell小室检测敲低LINREP后U87和U251细胞的迁移、侵袭能力。B.Transwell小室检测过表达LINREP后U87和U251细胞的迁移、侵袭能力。C.细胞划痕实验检测敲低LINREP后U87和U251细胞的迁移、修复能力。D.细胞划痕实验检测过表达LINREP后U87和U251细胞的迁移、修复能力。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图6为体内条件下LINREP促进胶质瘤细胞生长。A-B.生物发光成像显示裸鼠颅内原位成瘤12或24天后，LINREP过表达组荷瘤裸鼠瘤体的荧光强度显著高于对照组。C.生长曲线显示与对照组相比，LINREP过表达组荷瘤裸鼠生存期显著缩短。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图7为LINREP参与调控PTBP1蛋白的表达。我们进一步探究了LINREP对HuR和PTBP1表达量的影响，RT-qPCR结果显示与对照组相比，LINREP敲低或过表达后HuR和PTBP1的mRNA表达水平均无明显变化(图5.1A-B)。Western Blot结果证实，在U87和U251胶质瘤细胞敲低LINREP后，PTBP1的蛋白表达水平相较于对照组明显降低；相反，过表达LINREP则PTBP1的蛋白表达水平相较于对照组显著上调，而LINREP敲低或过表达后HuR的蛋白水平均没有明显变化(图5.1C-D)。

图8为LINREP通过抑制PTBP1的泛素-蛋白酶体降解途径稳定其表达。A-D.用CHX(100μg/mL)处理LINREP敲低(A-B)或过表达(C-D)的U87和U251细胞，Western Blot实验检测不同时间段的PTBP1蛋白表达量。E-F.用MG132(50μmol/L)处理LINREP敲低或过表达的U87和U251细胞，Western Blot实验分析PTBP1蛋白的表达量。G-H.用MG132处理LINREP敲低或过表达的U87和U251细胞，进行Co-IP实验，Western Blot检测PTBP1蛋白的泛素化水平。

图9为LINREP与PTBP1调控的可变剪接事件及相关基因。A-B.RNA-seq测序数据显示在U251细胞中敲低LINREP或PTBP1后显著变化的可变剪接类型(A)，及每种可变剪接类型上调或下调的比例(B)，筛选标准为FDR<0.05和IncLevelDifference>0.2或<-0.2。C.将U251细胞中LINREP或PTBP1敲除后发生显著变化的外显子跳跃基因取交集，共发现175个受两者共同影响的可变剪接基因。D.上述175个基因的GO功能分析和功能注释。E.IGV软件可视化RTN4、MAP4K4、PICALM、TPM1和RAPGEF1中受LINREP或PTBP1调控的外显子。F.RT-qPCR分析U87和U251细胞中敲低LINREP或PTBP1后，RTN4、MAP4K4、PICALM、TPM1和RAPGEF1发生外显子跳跃产生的两种剪接异构体的比值(外显子跳跃亚型/外显子保留亚型)。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图10为LINREP通过与PTBP1结合调控RTN4的可变剪接。A.RTN4 3号外显子跳跃产生两种转录本的示意图，RTN4A(3号外显子保留)和RTN4B(3号外显子跳跃)。B.TSVdb数据库分析胶质母细胞瘤组织和正常脑组织中RTN4A和RTN4B的mRNA表达水平。C.TSVdb数据库分析胶质母细胞瘤组织和正常脑组织中RTN4外显子的保留/跳跃频率与PTBP1mRNA表达水平的相关性。D.Western Blot分析U87和U251细胞中敲低LINREP后RTN4A和RTN4B的蛋白表达量。E-F.RT-qPCR和Western Blot分析在LINREP敲低的U87和U251细胞中过表达PTBP1后，RTN4A和RTN4B的mRNA和蛋白表达量。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图11为HuR通过依赖m⁶A甲基化修饰方式增强LINREP的RNA稳定性。A.GEPIA2数据库分析胶质母细胞瘤组织、低级别胶质瘤组织和正常脑组织中HuR的mRNA相对表达水平。B.Western Blot实验检测在U87和U251细胞中HuR的敲除效率。RT-qPCR分析U87和U251细胞中敲低HuR后LINREP的表达水平。C.MeRIP-qPCR分析U87和U251细胞中LINREP的m⁶A修饰水平。D.Western Blot实验检测在U87和U251细胞中METTL3的敲除效率。RT-qPCR显示U87和U251细胞中敲低METTL3后LINREP的表达水平。E.Western Blot实验检测在U87和U251细胞中ALKBH5的敲除效率。RT-qPCR显示U87和U251细胞中敲低ALKBH5后LINREP的表达水平。FMeRIP-qPCR分析U87和U251细胞中敲低METTL3后LINREP的m⁶A修饰水平。G.用放线菌素D(Act D)处理METTL3的U87和U251细胞，RT-qPCR实验检测不同时间段LINREP的相对表达量。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。H.免疫荧光实验检测U251细胞中m⁶A修饰和HuR蛋白共定位情况。I.RT-qPCR分析在U251细胞中敲低HuR和(或)过表达METTL3后LINREP和HuR的表达水平。J.RIP-PCR分析在U251细胞中敲低METTL3后HuR或IgG抗体富集LINREP的相对倍数。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，lncRNA可能在胶质瘤相关的异常可变剪接调控方面也发挥着重要作用，但是相关研究仍比较匮乏，特别是在PTBP1介导的异常剪接事件发生中，大多数lncRNA的功能和生物学效应仍未可知。

有鉴于此，本发明的一种典型具体实施方式中，提供检测LINREP的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的产品中的应用。

本发明通过lncRNA组织表达谱芯片分析胶质瘤组织、瘤旁组织和正常脑组织中差异表达的lncRNA，最终从与PTBP1结合强度最高的前8条候选lncRNAs中鉴定出3条差异表达且与PTBP1特异性结合的lncRNA(NONHSAT036725，ENST00000582029和ENST00000504508)。其中，NONHSAT036725(NONCODE TRANSCRIPT ID NONHSAT036725，重命名为LINREP-Longintergenic noncoding RNA for ELAVL1 and PTBP1，即LINREP)在胶质瘤样本中的表达水平较正常脑组织增加了4倍以上，进一步研究证明，LINREP表达量和肿瘤级别是胶质瘤患者预后不良的独立预测因素，因此，所述LINREP可作为诊断(辅助诊断)、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的生物标志物。

其中，所述LINREP为人源；

所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(I-II级)和高级别胶质瘤(III-IV级)；

且相关研究证实，LINREP上调表达与胶质瘤WHO分级升高呈正相关。

具体的，所述用于诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展包括但不限于对脑胶质瘤的早期诊断、恶性程度评估以及脑胶质瘤患者的总生存期评估。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的产品，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样品中LINREP的表达情况的物质。

所述样品可以为受试者脑胶质瘤样品，如受试者脑胶质瘤细胞或脑胶质瘤组织。

所述产品可以为检测试剂、检测试剂盒或生物传感器等，在此不做具体限定。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的系统，所述系统包括：

i)分析模块，所述分析模块包含用于确定受试者的待测样品中选自上述LINREP表达水平的检测物质，以及；

ii)评估模块，所述评估模块包含：根据i)中确定的所述LINREP的表达水平判断所述受试者患病情况。

其中，所述LINREP为人源。

所述判断所述受试者患病情况至少包括对受试者脑胶质瘤的早期诊断、恶性程度以及脑胶质瘤患者的总生存期进行评估。

本发明的又一具体实施方式中，提供抑制LINREP表达和/或活性降低的物质在如下a1)-a7)至少一种中的应用：

a1)抑制脑胶质瘤细胞增殖或制备抑制脑胶质瘤细胞增殖的产品；

a2)抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭或制备抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭的产品；

a3)抑制脑胶质瘤生长或制备抑制脑胶质瘤生长的产品；

a4)抑制PTBP1泛素化或制备抑制PTBP1泛素化的产品；

a5)抑制PTBP1/RTN4可变剪接或制备抑制PTBP1/RTN4可变剪接的产品；

a6)抑制LINREPm⁶A甲基化或制备抑制LINREPm⁶A甲基化的产品；

a7)治疗脑胶质瘤或制备治疗脑胶质瘤的产品。

抑制LINREP表达和/或活性降低的物质包括但不限于针对LINREP的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质等。

本发明的又一具体实施方式中，提供促进LINREP表达和/或活性提高的物质在如下b1)-b7)至少一种中的应用：

b1)促进脑胶质瘤细胞增殖或制备促进脑胶质瘤细胞增殖的产品；

b2)促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭或制备促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭的产品；

b3)促进脑胶质瘤生长或制备促进脑胶质瘤生长的产品；

b4)促进PTBP1泛素化或制备促进PTBP1泛素化的产品；

b5)促进PTBP1/RTN4可变剪接或制备促进PTBP1/RTN4可变剪接的产品；

b6)促进LINREPm⁶A甲基化或制备促进LINREPm⁶A甲基化的产品；

b7)构建脑胶质瘤细胞和/或脑胶质瘤动物模型。

所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。

根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等，优选为人。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗脑胶质瘤的方法，所述方法包括向受试者施用上述抑制LINREP表达和/或活性降低的物质。

以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。

实施例

1.材料及方法

1.1胶质瘤组织样本采集

经医院伦理委员会批准以及患者同意，我们从山东省千佛山医院神经外科收集行手术切除的原发脑胶质瘤标本104例，按照中枢神经系统肿瘤分类及分级标准(WHO，2007)，将其分为WHO IV级50例及WHO II-III级54例。所收集的脑胶质瘤组织分为两部分，一部分存放于无DNA、RNA酶的冻存管中，贴好标签后迅速置于液氮中以备后续RT-qPCR技术检测，另一部分经福尔马林溶液浸泡，石蜡包埋后用于后续ISH、免疫组化等实验。本课题中所用的胶质瘤组织样本均由两位病理医生诊断，确定为胶质瘤。

1.2胶质瘤及其他细胞系

本研究中所用的人胶质瘤细胞系U87、U251和T98G，人胚肾细胞系HEK-293T均购自武汉普诺赛生命科技有限公司，正常人星形胶质细胞系NHA购自Sciencell ResearchLaboratories，经细胞STR检测分型无误，无交叉污染，无支原体或细菌等污染。

1.3组织原位杂交(ISH)

切片脱蜡、水化：胶质瘤组织脱水、浸蜡、包埋，切片厚度6-8μm。石蜡切片经过常规脱蜡，水化，3％H2O2室温浸泡5-10min，灭活组织内源性酶，蒸馏水洗3次。暴露核酸片段、固定：组织切片上滴加3％柠檬酸稀释的胃蛋白酶，37℃消化25min，暴露核酸片段；用1％多聚甲醛/0.1M PBS(pH 7.2-7.6)，含有1/1000DEPC的固定液，室温固定6min，蒸馏水洗涤3次。预杂交：准备湿盒，底部加20％甘油20mL，按每张切片加20μL预杂交液，38-42℃恒温箱孵育2-4小时，吸取多余液体，勿洗。杂交：每张切片滴加20μL杂交液，盖上原位杂交专用盖玻片，38-42℃恒温箱孵育过夜。杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃的2×SSC缓冲液洗涤5min×2次；37℃的0.5×SSC缓冲液洗涤15min×1次；37℃的0.2×SSC缓冲液洗涤15min×1次。滴加封闭液，37℃封闭30min，吸取多余液体，勿洗。滴加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃孵育60min，PBS洗涤5min×3次。滴加SABC溶液，37℃孵育20min，PBS洗涤5min×3次。滴加生物素化过氧化物酶，37℃孵育20min，PBS洗涤5min×3次。DAB显色：按照DAB显色试剂盒的实验步骤，在1mL蒸馏水中加入显色剂A，B，C各一滴，混匀，滴至标本上，镜下观察显色反应，阳性着色为棕黄色，一般在30min内，若无背景则继续延长显色时间，充分水洗。

1.4LINREP过表达和沉默

查阅NONCODE数据库获取LINREP全长序列，由铂尚生物技术(上海)有限公司设计、合成全长序列，并构建在pcDNA3.1(+)载体上，上下游的酶切位点为HindIII和XhoI。LINREP序列，抑制序列和阴性对照序列购自广州锐博生物科技有限公司。使用Lipo2000或Lipo3000转染质粒，siRNA或ASO。

1.5细胞迁移、浸润实验

细胞转染24h后，胰酶消化，用不含血清的DMEM培养基制备细胞悬液。在Transwell上室中(未处理的小室用于迁移实验，铺基质胶的小室用于浸润实验)接种10000-30000个细胞，加入适量无血清DMEM培养基至180μL，下室即24孔板中加入600μL含10％FBS的完全培养基，在37℃恒温培养箱中常规培养8-12h。取出小室，用棉签将小室内部液体和上层细胞擦去，以4％多聚甲醛室温固定小室底部细胞30min。用棉签吸尽固定液，置于0.1％结晶紫溶液中染色15-20min。用清水洗净结晶紫染液后自然晾干，置于显微镜下观察，并随即选取3个视野，拍照、计数穿膜细胞并求平均值，至少重复3次实验。

1.6放线菌酮和放线菌素D加药实验

放线菌酮实验：胶质瘤细胞转染24h后，弃掉完全培养基，加入无血清DMEM培养基，滴加终浓度为50mg/mL的放线菌酮溶液；放置37℃细胞培养箱分别孵育0h，4h，8h和12h，收取细胞沉渣，Western Blot实验检测PTBP1蛋白的半衰期。

放线菌素D加药实验：胶质瘤细胞转染24h后，加入放线菌素D(5mg/mL)，放置37℃细胞培养箱分别孵育0h和8h，收集细胞沉渣，RT-qPCR实验检测LINREP RNA的半衰期。

1.7蛋白酶体抑制剂MG132加药实验

胶质瘤细胞转染24h后换成无血清DMEM培养基，饥饿处理24h后，实验组加入终浓度为50μmol/L的MG132溶液，对照组加入相同体积的DMSO溶液，放置37℃细胞培养箱中孵育24h，收集细胞沉淀，Western Blot实验检测PTBP1蛋白的表达水平。

1.8裸鼠原位成瘤实验

通过慢病毒和嘌呤药物筛选，建立LINREP稳定过表达的U87胶质瘤细胞及对照组细胞。饲养4周龄雄性BALB/c-Nude裸鼠(购自北京维通利华)，按每只裸鼠2.5×10⁶细胞进行颅内原位种植(定位在冠状缝后2mm、正中线旁2mm的右侧额叶区域，深度为颅骨以下5mm)。种瘤完毕后，分别在种瘤结束后第6日，第12日和第24日行小动物活体荧光成像，应用IVIS成像系统检测荷瘤鼠颅内肿瘤体积。每日观察荷瘤鼠是否出现任何持续不适的症状，例如严重的驼背姿势、运动或活动减少、步态变化或体重减轻超过20％，如果出现上述症状，及时记录并对小鼠安乐死。

1.9统计方法

R 4.0、GraphPad Prism 8和Adobe Illustrator CC 2018软件用于统计分析和图形制作。Student's t-test用于分析两组或两组以上计量数据；Kaplan Meier法和Logrank检验进行生存分析。所有实验至少重复3次。检验均为双侧检验，P值小于0.05被认为具有统计学意义。

2.实验结果：

2.1筛选、鉴定与剪接因子PTBP1相互作用的lncRNAs

为明确胶质瘤中与PTBP1相互作用的lncRNAs，我们首先通过RIP-seq高通量测序，筛选与PTBP1特异性结合的候选lncRNAs。根据差异倍数和FDR值的筛选标准(Fold change＞2，FDR＜0.01)，挑选出与PTBP1结合强度最高的前8位lncRNAs(图1A)。随后通过lncRNA组织表达谱芯片分析胶质瘤组织、瘤旁组织和正常脑组织中差异表达的lncRNA，最终从8条候选lncRNAs中鉴定出3条差异表达且与PTBP1特异性结合的lncRNA(NONHSAT036725，ENST00000582029和ENST00000504508)(图1B)。其中，NONHSAT036725，其序列信息如下：

CTGGGAGTATATATTGGAACACTGTTAACATAAGGCTTACGACAATGAAATTCTCCCAGATACACATTCAACAGAAACACATATCCCCACCAAAACACATGTACTACAATGTGTGTATTCATAGCGGCACTATTTCATAGTTGACAAATTCTGGAAGCAACCCAAATTCTCATTCATAGTAGAATGGATAAATGTAAATATCCACCCACACAATGCACTACTCAACAGTATAGATGAGTATCATTAACATAATGGTGCTTGAAAGAAACCAGATGTAAAATAATACATATGACTCTGTCATATAATAGACAAAACATGGCAAAATAAATCTGTTAAGCCAAGCTAGTGATGGCCATGTTGGGAGAGCTTCTGGGTGAGGGTCTGTTAATCTTGGTTACATTGGGTGTGCAATTTGTGAAATTCATTGTGCTGTACGCTGACAGTAGATTTTATGTATCTTATACTTTTAGAGTTAAAAAATGTACTTTTTTTTTTTTGAGACAGAGTCTCCCTTTGTTATCTAGGCTGCAGTGCAGTGGCACAATCTCAGCTCATTGCAACCTCCGCCTCCCAGGTTCAAGCAGTTCTCCTGCCTCAACCTCCCGAGTAGCTGGGATTACAGATGCCCACCACCACGCCCGGCTAATTTTTCTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCGCCACGTTGGCCAGGCTGCTGTCAAACTCCTGACCTCAGGTGACCATGCTGGTGAGGCGCCTGGACTCCAGTCAGATAACCCAGCATCAACTCTGCTGTGACCCTTACCAGCTGTGTGACTTTGGGCAACTTATTTAACCTACCTATGCCTGTTTTCTTCATGTATAACTAAAGGTGATAGTGAACCTAATGAGGATTAAATTGCGCAATGAATAAGCACTTACCACAGTGCCTAGCATAGTAAACATTTAATACATGTATTAAAGAATTGGAGCAATGGTCTTGCAACCTTTTCCACAACCCCCCCAGCCCTTTAATTCAGAAAACCTGCCTAAAAATGAAGCCCAAAGTGTAAGCACAATAAAAACAATAAAAGTGGAGCCCTTGAATAGAGTGGGTAGGAGCCTTGGCTCCAGAGAAAACGCATATATGTGCATAGGATCAGAATGAAATGTCCCATTTTAAGTTTACCTTCCCTGCTATGAGCTACCACCACCATTACAAGAGGACACTAAATTTCACAGATGGTGGTGAATGACTGGGGCTCACCTGATTTTGCTTAATAAGGATCTCTTATGGACTACAAAATCAAATTCCTATGCCTGTACCGAAAAATCCAGATTTCTCTAAAATGGCCCCATAGGCCTGGTTTCCTGCATGGCTGCCCCTGGCTGAAGAATGCTTCATTCGGTCTGTCCAGTCTCTGGCATTCTGTGGTTTCCCTACAGAAACCACGTGTTTGCTTTTTTTATAGTAGAGAAATCTTACCACTATCTCTGTGTGTTAACAATCTGGCTCCTGCTTTGAGGTGCACCTTCACTTAATGGTGCCTCGTAAACAGATTGCAGCAGTGAGATCAGCCGGGCTTCAGCTGATTAAACACCCAGTTGGGAACACCCAGCTGGGAACACACTGTCTCTGTTCTTTACTAAAGCAAAGTCCACTCTTTCACACCGGCTCCTCTGCTGTCCTATCTTACAGACCTTGGCTTTCTTTTCCATCTCTGGACGATGTTGATCCTCACCTGGTTCTAGTTCCTGCCTTACCTTATTCTAATATTGATGGCCTGCTTCTGGCAATTTACACTGCCTTGTTTCACTTCACTTCATCTTGTTTAACC，SEQ ID NO.1(NONCODETRANSCRIPT ID NONHSAT036725，重命名为LINREP-Long intergenic noncoding RNA forELAVL1 and PTBP1)在胶质瘤样本中的表达水平较正常脑组织增加了4倍以上(图1C)，我们最终挑选LINREP作为下一步研究对象。我们通过RIP实验进一步验证，结果显示，在U87和U251胶质瘤细胞中，与对照组IgG相比，PTBP1可显著富集LINREP，提示LINREP能够与PTBP1蛋白结合(图1D)。

2.2LINREP与HuR/PTBP1蛋白复合体相互结合

我们接下来进行了RNA pulldown实验，结合Western Blot和蛋白银染分析，发现与对照组反义LINREP相比，正义LINREP在PAGE凝胶35～70kDa区域存在多处差异条带。随后将该区域的蛋白质条带切下进行蛋白质谱分析(Mass spectrometry，MS)，筛选可能与LINREP相互作用的蛋白质。结果显示，根据MS鉴定的蛋白独特肽段，PTBP1和HuR(又称为ELAVL1)是评分较高的靶蛋白(图2A)。RNA pulldown结合Western Blot实验证实，在U87和U251胶质瘤细胞中，与反义对照组相比，LINREP直接与PTBP1和HuR稳定结合(图2B)。RIP实验同时证实，与IgG对照相比，HuR能够显著富集LINREP(图2C)。此外，我们通过FISH免疫荧光共定位实验检测LINREP与靶蛋白的细胞定位情况，结果显示，LINREP与PTBP1共定位于U87/U251细胞的细胞核；与HuR共定位于U87/U251细胞的细胞核和细胞质中(图2D)。为了明确PTBP1和HuR是否作为蛋白复合物相互结合，我们首先提取CGGA、TCGA和REMBRANDT三个数据库中胶质瘤患者的转录组学数据，分析HuR和PTBP1 mRNA的表达相关性，发现HuR和PTBP1在三个胶质瘤队列中均呈显著正相关(图2E)。内源性和外源性的Co-IP实验均证实PTBP1和HuR稳定结合(图2F-G)。

2.3LINREP与HuR/PTBP1蛋白复合体相互结合

为进一步明确LINREP在胶质瘤组织中的表达情况和临床价值，我们于山东省千佛山医院收集了104例胶质瘤组织样本，检测LINREP表达情况，ISH实验结果表明不同WHO分级胶质瘤患者间LINREP的表达具有统计学差异，且随着WHO分级升高，LINREP的组织表达水平也随之增高(图3A-B)。以LINREP在所有胶质瘤组织中表达量的中位数作为cut-off值，将患者分为LINREP高表达组和LINREP低表达组，生存分析显示高表达组的OS明显高于低表达组(Log-Rank P＜0.01，图3C)。此外，多因素Cox回归分析表明，LINREP表达量和肿瘤级别是胶质瘤患者预后不良的独立预测因素(图3D)。FISH和RNA核质分离实验均证实，LINREP主要定位于胶质瘤细胞细胞核，同时也定位于细胞质中(图3E-F)。上述实验结果提示LINREP的异常表达可能与胶质瘤的恶性进展有关。

2.4体外条件下LINREP促进胶质瘤细胞的增殖能力

为进一步阐明LINREP对胶质瘤细胞生物学行为的影响，我们选用胶质瘤细胞系U87、U251细胞进行研究。首先构建LINREP敲除(LINREP反义寡核苷酸ASO，具体序列：ASO1＝GCTGTCCTATCTTACAGACC，SEQ ID NO.2；ASO 2＝CCATAGGCCTGGTTTCCTGC，SEQ ID NO.3；ASO3＝GGAGCAATGGTCTTGCAACC，SEQ ID NO.4)及LINREP过表达(LINREP-pcDNA3.1，简称LINREP)细胞模型，转染48h后收集细胞，利用RT-qPCR技术检测LINREP的敲除和过表达效率。结果显示，与对照组相比，LINREP敲除组能够显著抑制LINREP在胶质瘤细胞中的表达水平(图4A)，而LINREP过表达组可成百倍地上调LINREP的表达量(图4B)。

随后我们采用CCK-8、EdU细胞增殖实验验证LINREP对胶质瘤细胞增殖能力的影响。如CCK-8结果所示，与对照组相比，敲低LINREP显著降低了胶质瘤细胞在48h或72h的增殖活性(图4C)，而过表达LINREP后胶质瘤细胞的活性状态明显增强(图4D)。EdU实验结果显示，与对照组相比，敲低LINREP的胶质瘤细胞EdU染色阳性率明显降低(图4E)，而LINREP过表达后，胶质瘤细胞的EdU染色阳性率较对照组显著提高(图4F)。

2.5体外条件下LINREP促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力

我们进一步通过Transwell小室、细胞划痕实验检测了LINREP对胶质瘤细胞迁移和浸润能力的影响。Transwell小室结果显示，在胶质瘤细胞U87和U251细胞中敲低LINREP后，细胞在有基质胶和无胶条件下穿透小室底膜的能力均减弱(图5A)。相反，在胶质瘤细胞U87和U251细胞中过表达LINREP后，其穿透能力显著增强(图5B)。此外，细胞划痕实验补充证实了LINREP对胶质瘤细胞侵袭迁移能力的促进作用(图5C-D)。

2.6体内条件下LINREP促进胶质瘤细胞生长

为研究LINREP在体内条件下对胶质瘤细胞致瘤能力的影响，我们将稳筛后LINREP稳定过表达的U87胶质瘤细胞及对照细胞种植于BALB/c-Nude裸鼠颅内，颅内原位成瘤后每隔2天观察裸鼠的状态，记录裸鼠生存期。分别于第6日，第12日和第24日行小动物活体荧光成像，记录荷瘤鼠颅内肿瘤体积(图6A)。结果显示，LINREP过表达显著促进了原位肿瘤的形成并缩短了荷瘤小鼠的存活时间(图6B-C)。这些结果表明LINREP可在体内条件下促进胶质瘤细胞生长。

2.7LINREP参与调控PTBP1蛋白的表达

我们进一步探究了LINREP对HuR和PTBP1表达量的影响，RT-qPCR结果显示与对照组相比，LINREP敲低或过表达后HuR和PTBP1的mRNA表达水平均无明显变化(图7A-B)。Western Blot结果证实，在U87和U251胶质瘤细胞敲低LINREP后，PTBP1的蛋白表达水平相较于对照组明显降低；相反，过表达LINREP则PTBP1的蛋白表达水平相较于对照组显著上调，而LINREP敲低或过表达后HuR的蛋白水平均没有明显变化(图7C-D)。

2.8LINREP通过抑制PTBP1的泛素-蛋白酶体降解途径稳定其表达

我们进一步采用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)加药实验来探究LINREP对PTBP1半衰期的影响。Western Blot实验分析表明，与对照组相比，过表达LINREP显著增加了PTBP1蛋白稳定性，而敲除LINREP则加快了PTBP1蛋白的降解速率(图8A-D)。为了阐明LINREP是否是通过抑制PTBP1的蛋白酶体途径降解来增强PTBP1蛋白稳定性，我们利用蛋白酶体抑制剂MG132处理LINREP敲低或过表达的U87和U251胶质瘤细胞，提取蛋白，WesternBlot实验检测PTBP1的表达水平。结果显示，与DMSO对照组相比，MG132处理组细胞中PTBP1的蛋白表达水平显著提高，MG132可以明显逆转LINREP对PTBP1蛋白表达水平的调控作用(图8E-F)。此外，我们检测了细胞内LINREP对PTBP1蛋白泛素化的调控作用。我们利用蛋白酶体抑制剂MG132处理LINREP敲低或过表达的胶质瘤细胞，8h后收取细胞并用PTBP1抗体进行Co-IP实验，Western Blot实验检测洗脱液中PTBP1蛋白的泛素表达情况。结果显示，与对照组相比，LINREP敲除促进了PTBP1蛋白的泛素化，而在LINREP过表达组中PTBP1蛋白的泛素化水平显著下降(图8G-H)。上述结果提示LINREP通过抑制PTBP1的泛素-蛋白酶体降解途径来稳定其蛋白表达。

2.9LINREP与PTBP1调控的可变剪接事件及相关基因

PTBP1作为一种经典的剪接因子，与诸多癌症的恶性进展有关。为了研究在胶质瘤中LINREP调控的可变剪接事件及相关基因，我们利用RNA-seq高通量测序数据联合rMATS可变剪接分析工具，以FDR<0.05和IncLevelDifference>0.2或<-0.2作为差异剪接事件的筛选标准，分析LINREP或PTBP1敲低后U251胶质瘤细胞中显著变化的可变剪接事件。结果显示，与对照组相比，LINREP或PTBP1敲低可影响各种类型的可变剪接事件，包括外显子跳跃、内含子保留、互斥外显子、外显子5’端的选择性剪接与外显子3’端的选择性剪接等(图9A)。其中，LINREP或PTBP1敲除后细胞外显子跳跃事件的变化频率最高且外显子保留呈现增强趋势(图9B)。鉴于LINREP与PTBP1在调控可变剪接功能上的一致性，我们将LINREP或PTBP1敲除后发生差异变化的外显子跳跃基因取交集，共发现175个同时受LINREP和PTBP1影响下发生外显子跳跃的基因(图9C)。随后将175个基因进行基因本体(GO)富集分析，结果显示这些基因主要参与调节癌细胞的运动和生长功能，如Ras蛋白信号转导、肌动蛋白细胞骨架调控和细胞生长(图9D)。我们从中挑选差异较为显著的5个代表性基因(RTN4、MAP4K4、PICALM、TPM1和RAPGEF1)，并利用基因组浏览器(Integrative Genomic Viewer，IGV)将其发生的外显子跳跃突变事件进行可视化(图9E)。基因发生外显子跳跃事件后，会产生两种基因亚型，即外显子保留亚型和外显子跳跃亚型。我们根据上述5种基因发生外显子跳跃突变后产生的不同类型剪接异构体，设计特定引物(图9F)。RT-qPCR实验结果显示，在U87和U251胶质瘤细胞系中敲低LINREP或PTBP1后，与对照组相比，RTN4、MAP4K4、PICALM、TPM1和RAPGEF1外显子跳跃受到显著抑制，外显子保留亚型的表达水平增高。其中，RTN4第3个外显子的跳跃突变受到最显著抑制(图9G)。

2.10LINREP通过与PTBP1结合调控RTN4的可变剪接

网状蛋白4(Reticulon 4，RTN4)的3号外显子跳跃可以产生两种可变剪接异构体：RTN4A(3号外显子保留)和RTN4B(3号外显子跳跃)(图10A)。通过生物信息学网站TSVdb分析两种剪接异构体(RTN4A和RTN4B)在胶质母细胞瘤和正常脑组织中的表达情况(图10B)，结果显示RTN4A在胶质母细胞瘤组织中的表达水平低于正常脑组织，相反，RTN4B在胶质母细胞瘤组织中的表达水平则高于正常脑组织，这与胶质瘤中LINREP或PTBP1异常高表达导致RTN4可变剪接失调的调控模式相一致。TSVdb数据库进一步显示，在胶质母细胞瘤中PTBP1的表达水平增高与RTN4第3个外显子的跳跃频率增加具有正向调节关系(图10C)。WesternBlot实验结果显示，在胶质瘤细胞中敲低LINREP后，RTN4A的表达水平较对照组明显上调，而RTN4B的表达水平较对照组明显下调(图10D)。为进一步验证LINREP是否通过PTBP1来促进RTN4的3号外显子跳跃，我们进行了拯救实验。RT-qPCR和Western Blot实验结果均显示，在U87和U251胶质瘤细胞中同时转染ASO-LINREP和PTBP1过表达质粒可显著逆转LINREP沉默对RTN4 3号外显子跳跃的抑制作用(图10E-F)。

2.11HuR通过依赖m⁶A甲基化修饰方式增强LINREP的RNA稳定性

根据文献报道，RNA结合蛋白HuR能够优先结合并稳定m⁶A修饰的RNA，促进肿瘤生长和侵袭。我们利用GEPIA2生物信息学网站检测HuR在胶质瘤组织中的表达情况，结果显示与正常脑组织相比，HuR在胶质母细胞瘤和低级别胶质瘤中的表达均异常增高(图11A)。为进一步探究HuR对LINREP的调控作用，我们首先在胶质瘤细胞中转染HuR siRNA，WesternBlot结果显示转染HuR siRNA能够显著抑制HuR的蛋白表达。RT-qPCR结果显示与对照组相比，HuR敲低后LINREP的表达水平显著下调(图11B-C)。同时，我们通过MeRIP实验证实LINREP存在高水平的m⁶A甲基化修饰(图11C)。

m⁶A甲基化修饰是RNA的可逆转录后修饰，受到甲基转移酶、去甲基化酶和识别蛋白的动态调节。内源性甲基化转移酶3(Methyltransferase-like protein 3，METTL3)是m⁶A甲基转移酶复合物的重要组成部分，我们通过Western Blot和RT-qPCR检测发现，在胶质瘤细胞中敲低METTL3后，LINREP的表达水平较对照组显著降低(图11D)。此外，在胶质瘤细胞中敲低关键的m⁶A去甲基化酶ALKBH5(AlkB homolog 5，ALKBH5)后，与对照组相比，LINREP的表达水平显著增加(图11E)。为明确METTL3是否通过调控LINREP的m⁶A甲基化修饰增强其稳定性，我们在胶质瘤细胞中敲低METTL3后进行了MeRIP和放线菌素D加药实验，RT-qPCR分析表明沉默METTL3可显著降低LINREP的m⁶A甲基化修饰水平，并促进LINREP降解(图11F-G)。以上结果提示，METTL3参与调控LINREP的m⁶A甲基化修饰，从而维持其RNA稳定性。

为了阐明HuR是否以m⁶A依赖性方式结合并稳定LINREP，我们首先利用HuR和m⁶A抗体进行免疫荧光共定位实验，检测了m⁶A修饰RNA与HuR的亚细胞分布。共聚焦成像显示，m⁶A修饰RNA与HuR在胶质瘤细胞的细胞核和细胞质中共定位(图11H)。随后我们进一步探索在胶质瘤细胞中敲低HuR后过表达METTL3对LINREP表达的影响，RT-qPCR结果显示敲低HuR能够一定程度上抑制METTL3稳定LINREP表达的作用(图11I)。同时我们在胶质瘤细胞系U87中通过RIP实验检测METTL3敲低后HuR与LINREP的结合能力，结果表明，与正常对照组相比，METTL3敲低后HuR抗体对LINREP的富集程度显著降低(图11J)，提示METTL3沉默导致的LINREP m⁶A修饰水平降低能够抑制HuR与LINREP的结合能力。以上实验结果表明HuR可能通过依赖m⁶A甲基化修饰的方式结合LINREP，并增强其RNA稳定性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.检测LINREP的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的产品中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述LINREP为人源；所述脑胶质瘤包括低级别胶质瘤(I-II级)和高级别胶质瘤(III-IV级)。

3.一种用于诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的产品，其特征在于，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样品中LINREP表达的物质；

优选的，所述样品为受试者脑胶质瘤细胞或组织；

优选的，所述产品为检测试剂、试剂盒或生物传感器。

4.一种用于诊断、检测、监测或预测脑胶质瘤的进展的系统，其特征在于，所述系统包括：

i)分析模块，所述分析模块包含用于确定受试者的待测样品中选自上述LINREP表达水平的检测物质，以及；

ii)评估模块，所述评估模块包含：根据i)中确定的所述LINREP的表达水平判断所述受试者患病情况。

5.如权利要求4所述系统，其特征在于，所述LINREP为人源；

所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(I-II级)和高级别胶质瘤(III-IV级)。

6.如权利要求4所述系统，其特征在于，判断所述受试者患病情况至少包括对受试者脑胶质瘤的早期诊断、恶性程度以及脑胶质瘤患者的总生存期进行评估。

7.抑制LINREP表达和/或活性降低的物质在如下a1)-a7)至少一种中的应用：

a1)抑制脑胶质瘤细胞增殖或制备抑制脑胶质瘤细胞增殖的产品；

a2)抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭或制备抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭的产品；

a3)抑制脑胶质瘤生长或制备抑制脑胶质瘤生长的产品；

a4)抑制PTBP1泛素化或制备抑制PTBP1泛素化的产品；

a5)抑制PTBP1/RTN4可变剪接或制备抑制PTBP1/RTN4可变剪接的产品；

a6)抑制LINREPm⁶A甲基化或制备抑制LINREPm⁶A甲基化的产品；

a7)治疗脑胶质瘤或制备治疗脑胶质瘤的产品。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述抑制LINREP表达和/或活性降低的物质包括针对LINREP的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质。

9.促进LINREP表达和/或活性提高的物质在如下b1)-b7)至少一种中的应用：

b1)促进脑胶质瘤细胞增殖或制备促进脑胶质瘤细胞增殖的产品；

b2)促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭或制备促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭的产品；

b3)促进脑胶质瘤生长或制备促进脑胶质瘤生长的产品；

b4)促进PTBP1泛素化或制备促进PTBP1泛素化的产品；

b5)促进PTBP1/RTN4可变剪接或制备促进PTBP1/RTN4可变剪接的产品；

b6)促进LINREPm⁶A甲基化或制备促进LINREPm⁶A甲基化的产品；

b7)构建脑胶质瘤细胞和/或脑胶质瘤动物模型。

10.如权利要求8或9所述应用，其特征在于，所述产品为药物或者实验试剂。

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