CN101437536A - 抗肿瘤细胞抗原抗体治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过给予能够结合肿瘤细胞抗原的抗体或抗体片段来诊断、检测或治疗癌的方法，其中的癌所表达的该肿瘤细胞抗原相对于邻近的正常组织升高。该方法包括能结合肿瘤细胞抗原KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5的抗体的应用。

Description

抗肿瘤细胞抗原抗体治疗
发明领域
本发明涉及抗肿瘤细胞抗原的激动剂或拮抗剂，其中包括人源化的抗癌抗体，以及利用这些抗体进行诊断和/或治疗的方法。
相关领域的描述
尽管在抗癌治疗的研究中取得了明显的进展，但是癌症依然是总体人群中导致死亡的第二位原因(2002年为22.8％，根据最近的统计)。事实上，据估计美国男性在其一生中有1/2的几率会发生某种癌，而女性发生癌的几率为1/3(来自www.cancer.org)。最常规的癌症治疗方法是主动杀死增殖的细胞，因此结果通常是非特异性的，可能会损伤健康组织或导致系统毒性。另一种替代方法是试图鉴定和利用肿瘤细胞表达的标志物以区分机体内的靶癌细胞和正常的健康细胞。激动剂/拮抗剂分子或抗体可作为那些肿瘤标志物的偶联物而加以利用，直接作用于肿瘤细胞本身，或者诱导抗那些癌细胞的免疫反应，或者选择性地运送某种方式的治疗有效载荷(参见综述Houshmand和Zlotnik(2003)，Current Opinion in Cell Biology 15(5)：640-44)。
目前已有几种抗癌抗体药物被批准用于治疗或诊断的目的，或者正处于临床前和临床试验阶段。目前已被批准上市的治疗性抗癌抗体包括用于治疗慢性淋巴性白血病(CLL)的阿仑单抗(Campath)(ILEX Oncology和Schering AG)、用于治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的利妥昔单抗(Rituxan)(IDEC和Hoffmann-LaRoche)以及用于治疗乳腺癌的曲妥单抗(Herceptin)(Genentech和Hoffmann-LaRoche)。目前正在进行临床实验的例子包括用于治疗小细胞肺癌的抗体huN901-DM1(Immunogen)、用于治疗前列腺癌的比伐单抗美坦新(Bivatuzumab mertansine)(MLN2704)(Millennium)以及用于治疗前列腺、卵巢和乳腺癌的帕珠弹壳(Pertuzumab)(Omnitarg)(Genentech)。(参见综述：Krauss(2003)Mol.Biotechnol25(1)：1-17)。一般来说，这些抗体可特异性地靶向肿瘤细胞表面的蛋白，通过激发某种抗肿瘤细胞免疫反应(例如，补体依赖的细胞毒作用(CDC)或抗体依赖的细胞毒作用(ADCC))，或者通过抗体与肿瘤细胞标志物相互作用以后将抗体连接的细胞毒性分子运送到靶细胞而发挥作用。
虽然越来越多的抗癌抗体药物被批准用于临床，但是在此领域依然有很多未被满足的需求。已知某些被批准的药物有很明显的副作用。很多副作用是由于治疗性抗体与健康的非肿瘤细胞发生非特异性的和不希望的作用而引起的。另外，也并不是所有患者在使用现有抗体药物后都能产生预期程度的反应。因此，开发出对肿瘤细胞具有更高特异性的能靶向到肿瘤细胞抗原的药物将是癌症治疗领域的重要方向。
在筛选用于开发抗癌抗体的肿瘤细胞标志物时，最理想的标志物是那种只在一类肿瘤的大多数患者的癌细胞表面丰富而均匀表达而在其他组织内不表达的标志物。不幸的是，具有这种水平特异性的标志物是很少的，因此，在健康组织和特异性癌组织之间具有一定程度的表达差异的标志物也必须被利用。例如，已被批准的抗体药物能识别的蛋白，其中包括CD52(Campath)、CD20(Rituxan，US5736137)，Zevalin，Bexxar)、HER2(Herceptin，US5821337)、EGFR(Erbitux)和VEGF(Avastatin)。这些细胞标志物的大多数既在健康组织表达，也在癌细胞上表达，但是与正常组织相比，通常在肿瘤上的表达量更高(参见Flynn和Byrd(2000)Current Opinion in Oncology12(6)：574)。这些组织特异性方面的考虑对于可携带细胞毒药物的免疫连接抗体构建体来说尤其重要。
癌细胞的特异性靶向作用是开发抗癌药物的重要方向。尽管已经鉴定出了几个与某些类型的癌相关的标志物，但是依然还需要找到对某种类型的癌有更高特异性的标志物用于开发不损伤健康组织的抗癌药物。利用这些标志物来开发抗体性的靶向性癌症治疗药物而不损伤机体内的正常细胞将是本领域重要的研究进展，具有清晰而明显的医学需求。
发明概述
本发明提供了哺乳动物癌的诊断和/或治疗方法。该方法包括给予有效量的抗肿瘤抗原激动剂或拮抗剂，其中肿瘤抗原被定义为相对于正常组织表达量至少升高3倍，以及其中肿瘤抗原选自如下一组：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。在一个特殊实施方式中，激动剂或拮抗剂是抗肿瘤细胞抗原的抗体或小分子。
在另外一个实施方式中，本发明涉及鉴定肿瘤细胞抗原激动剂或拮抗剂的方法，该方法包括使肿瘤细胞抗原与候选分子接触，监测所述肿瘤细胞介导的或者所述候选分子与所述肿瘤细胞抗原之间的相互作用介导的生物学效应。
在另外一个实施方式中，本发明涉及物质的组合物，该组合物包含本文所述的肿瘤细胞抗原的激动剂或拮抗剂，或者抗肿瘤细胞抗原的抗体，加上载体。可选的是，载体是药学上可接受的载体。
本文包括各种形式的抗体。例如，抗肿瘤抗原的抗体可以是全长抗体(例如，具有人免疫球蛋白恒定区)或抗体片段(例如F(ab’2)、Fv或单链抗体或可特异结合靶抗原的功能性片段)。另外，抗体可用可检测标记物标记，可被固定到固相支持物上，和/或与异源化合物(如细胞毒药物)结合。抗体可选自亚人灵长类抗肿瘤细胞抗原抗体、鼠抗肿瘤细胞抗原单克隆抗体、嵌合的抗肿瘤细胞抗原抗体、人抗肿瘤细胞抗原抗体以及人源化的抗肿瘤细胞抗原抗体。
本发明涉及诊断或治疗人癌的方法，其中优选的癌包括结肠癌、直肠癌或结肠直肠癌、乳腺癌以及前列腺癌，该方法包括给予人有效量的能结合如下肿瘤抗原的抗体：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。
本发明涉及抗体的诊断用途。在一种诊断应用中，本发明提供了确定选自如下一组的肿瘤细胞抗原是否存在的方法：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5，该方法包括使怀疑包含肿瘤细胞抗原的样品与本发明的抗体接触，以及确定抗体与样品的结合。为了此用途，本发明提供了包含抗体和指导如何使用抗体来检测肿瘤细胞抗原的说明书的试剂盒。
在另一些实施方式中，本发明提供了上述方法所使用的制品(包括其他物品)。例如，本发明提供了包含一个容器和容器内所含组合物的制品，其中的组合物可用于治疗表达一种能被本发明的激动剂/拮抗剂或抗体结合的肿瘤细胞抗原的癌，以及包含包装插页，该插页说明组合物可用于治疗表达选自如下一组的肿瘤抗原之一的癌：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。
本发明还提供了：编码抗体的游离核酸；包含核酸的载体，其中的核酸还可与控制序列可操控地连接，该控制序列可被转化该载体的宿主细胞识别；包含载体的宿主细胞；制备抗体的方法，该方法包括培养宿主细胞以使核酸表达，以及可选的，从宿主细胞培养物(例如，宿主细胞培养基)中回收抗体。
本发明还涉及包含抗体的免疫连接物，其中的抗体可与选自如下一组的肿瘤细胞抗原结合：连接到一个或多个异源分子上的KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5，以及这种连接物在治疗癌症中的用途，其中的癌细胞表达如下肿瘤抗原之一：人的KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。免疫连接物中的抗体可以是完整抗体(如完整的IgG1抗体)或抗体片段(Fab，F(ab)2，双功能抗体等)。
本发明还提供了多价、多特异性抗体或其片段，其中的多价抗体含有与选自如下一组的肿瘤细胞抗原有亲和力的结合位点：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5，以及多个其他结合位点中的一个。
本发明还涉及将诊断/检测或治疗剂运送到表达选自如下一组的肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞上的方法：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。该方法包括提供本发明的抗体或免疫连接组合物以及将其给予需要的患者。
本发明还涉及两个抗体或其片段在癌的检测/诊断或治疗中的用途，其中至少一种抗体或片段可与选自如下一组的肿瘤细胞抗原结合：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。
本发明的一个实施方式是诊断、检测或治疗哺乳动物癌的方法，其中的癌所表达的肿瘤细胞抗原比其邻近的正常组织样品或冷冻的正常组织样品至少高3倍，该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的能与肿瘤细胞抗原结合的抗体或其片段，以及其中的肿瘤细胞抗原选自如下一组：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。
在一个优选实施方式中，抗体或其片段是人的、人源化的、嵌合的抗体或其片段。
在另一个实施方式中，抗体或其片段选自由Fv、F(ab′)2、Fab′和Fab组成的一组。
在一个特别优选的实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物肿瘤的方法中所用的抗体或其片段可特异地结合肿瘤细胞抗原的胞外域，其中的肿瘤细胞抗原选自由KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5组成的一组。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物肿瘤的方法中所用的抗体或其片段可结合KIAA1815的胞外域，胞外域选自由约1-408位氨基酸、约474-489位氨基酸、约545-581位氨基酸、约603-621位氨基酸、约642-653位氨基酸和约674-904位氨基酸组成的一组。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物肿瘤的方法中所用的抗体或其片段可结合BC017881的胞外域，胞外域选自由约1-117位氨基酸、约140-148位氨基酸、约165-211位氨基酸和约230-240位氨基酸组成的一组。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物肿瘤的方法中所用的抗体或其片段可结合FLJ20421的胞外域，胞外域包含约30-359位氨基酸。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物肿瘤的方法中所用的抗体或其片段可结合DSCD75的胞外域，胞外域包含约20-208位氨基酸。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物肿瘤的方法中所用的抗体或其片段可结合GPR160的胞外域，胞外域选自由约1-15位氨基酸、约80-93位氨基酸、约157-182位氨基酸、约263-276位氨基酸组成的一组。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物肿瘤的方法中所用的抗体或其片段可结合GPCR41的胞外域，胞外域选自由约31-49位氨基酸、约104-112位氨基酸、约134-145位氨基酸、约170-195位氨基酸、约212-270位氨基酸、约299-307位氨基酸、约360-368位氨基酸、约390-403位氨基酸和约424-445位氨基酸组成的一组。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物肿瘤的方法中所用的抗体或其片段是免疫偶联物。
在一个优选实施方式中，包含抗体的诊断、检测或治疗性免疫偶联物与至少一种诊断/检测剂或至少一种治疗药物结合，其中的抗体包含抗肿瘤细胞抗原的抗体或其片段或者抗肿瘤细胞抗原的抗体融合蛋白或其片段。
在另一个实施方式中，诊断/检测免疫偶联物包含诊断/检测剂，该药剂包含至少一种光敏的诊断/检测剂，其中的光敏诊断剂包括发色团或染料。
在一个优选实施方式中，诊断/检测免疫偶联物用于手术中的、内窥镜的或血管内的肿瘤检测/诊断。
在另一个实施方式中，治疗性免疫偶联物包含选自下组的治疗剂：放射性核素、硼、钆或铀原子、免疫调节剂、细胞因子、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、光敏治疗剂、细胞毒药物、毒素、血管生成素抑制剂、不同的抗体及其组合。
在另一个实施方式中，治疗性免疫偶联物包含细胞毒剂，这些细胞毒剂是药物、前药、酶或毒素。
在另一个实施方式中，治疗性免疫偶联物包含细胞毒剂，这些细胞毒剂是刺孢霉素或刺孢霉素类似物、美登素或美登素衍生物、或奥瑞斯他汀E或奥瑞斯他汀E衍生物。
在另一个实施方式中，治疗性免疫偶联物包含细胞毒剂，这些细胞毒剂是毒素或其片段，其中所述的毒素选自由植物、微生物和动物毒素及其合成变体组成的一组。
在另一个实施方式中，治疗性免疫偶联物包含免疫调节剂，这些免疫调节剂选自由细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、抗体及其组合组成的一组
在一个优选实施方式中，治疗性免疫偶联物包含酶，这种酶是前药活化酶。
在另外一个实施方式中，治疗性免疫偶联物包含选自如下一组的前药活化酶：碱性磷酸酶、芳基硫酸酯酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、糖裂解酶如β-半乳糖苷酶和神经酰胺酶、β-内酰胺酶、青霉素酰胺酶以及具有酶活性的抗体。
在另外一个实施方式中，多价、多特异性抗体或其片段包含一个或多个与肿瘤细胞抗原有亲和力的抗原结合位点以及一个或多个与表位有亲和力的表位结合位点，其中所述的肿瘤细胞抗原选自由KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5组成的一组。
在一个优选实施方式中，多价、多特异性抗体或其片段包含人的、人源化的或嵌合的多价、多特异性抗体或其片段。
在另一个实施方式中，多价、多特异性抗体或其片段包含诊断/检测或治疗剂。
在另一个实施方式中，抗体融合蛋白或其片段包含至少两个抗肿瘤细胞抗原的抗体或其片段，其中的抗体或其片段选自如上述实施方式所述的抗肿瘤细胞抗原的抗体或其片段。
在一个优选实施方式中，治疗哺乳动物癌症的方法包括利用治疗有效量的前述任一实施方式所述的抗体或其片段进行治疗，其中的抗体被制成治疗上可接受的制剂。
在另一个实施方式中，诊断/检测哺乳动物癌症的方法包括给予所述的哺乳动物诊断有效量的前述任一实施方式所述的抗体或其片段的步骤，其中的抗体或其片段用药学上可接受的载体制成制剂。
在另一个实施方式中，治疗或诊断/检测哺乳动物癌症的方法包括(i)给予有需要的哺乳动物以前述任一实施方式所述的抗体或其片段；(ii)等待一段足够的时间使一定量的非结合蛋白被清除出哺乳动物的血流；以及(iii)给予所述哺乳动物以包含诊断剂、治疗剂或其组合的载体分子，其中的载体分子可结合到所述抗体的结合位点上。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物癌症的方法包括包含核酸的DNA序列，其中的核酸编码前述任一实施方式所述的抗肿瘤细胞抗原的抗体或其片段或免疫偶联物。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物癌症的方法包括表达载体，其中的表达载体包含前述任一实施方式所述的抗肿瘤细胞抗原的抗体或其片段或免疫偶联物的DNA序列。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物癌症的方法包括包含表达载体的宿主细胞。
在另一个实施方式中，诊断、检测或治疗哺乳动物癌症的方法包括向靶细胞运送诊断/检测或治疗剂或其组合的方法，该方法包括(i)提供包含前述任一实施方式所述的抗体或其片段的免疫偶联物的组合物；以及(ii)给予有需要的哺乳动物所述的组合物。
在另一个实施方式中，治疗哺乳动物癌症的方法包括给予所述的哺乳动物治疗有效量抗体或其片段，其中的抗体或其片段包含至少两个抗体或其片段，以及包含使用前述任一实施方式所述的抗体，这些抗体或其片段用药学上可接受的赋形剂制成制剂。
在另一个实施方式中，治疗哺乳动物癌症的方法包括给予所述的哺乳动物治疗有效量抗体或其片段，以及不与肿瘤细胞抗原结合的第二抗体或其片段，其中的肿瘤细胞抗原选自由KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5组成的一组。
在另一个实施方式中，治疗哺乳动物癌症的方法包括给予所述的哺乳动物治疗有效量抗体或其片段，以及与肿瘤细胞抗原结合的第二抗体或其片段，其中的肿瘤细胞抗原选自由KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5组成的一组。
在另一个实施方式中，治疗哺乳动物癌症的方法包括给予所述的哺乳动物治疗有效量抗体或其片段，以及第二抗体或其片段，其中的第二抗体与治疗或诊断/检测剂连接。
在另一个实施方式中，治疗哺乳动物癌症的方法包括给予所述的哺乳动物治疗有效量抗体或其片段，其中的抗肿瘤细胞抗原的抗体或其片段在与所述肿瘤表达的第二肿瘤细胞抗原反应的第二偶联抗体之前、同时或之后给予。
在另一个实施方式中，前述任一实施方式所述的方法包括以每剂10ng/kg到100mg/kg哺乳动物体重的剂量给予抗肿瘤细胞抗原的抗体。
在另一个实施方式中，前述任一实施方式所述的方法包括以重复给药的方式给予抗肿瘤细胞抗原的抗体。
在一个优选实施方式中，检测或诊断哺乳动物乳腺癌、前列腺癌或结肠癌的方法包括使用前述任一实施方式所述的抗体或免疫偶联物。
在一个优选实施方式中，治疗哺乳动物乳腺癌、前列腺癌或结肠癌的方法包括使用前述任一实施方式所述的抗体或免疫偶联物。
在另一个实施方式中，治疗哺乳动物乳腺癌、前列腺癌或结肠癌的方法包括使用前述任一实施方式所述的抗体或免疫偶联物，其中的肿瘤细胞抗原选自由KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5组成的一组。
在另一个实施方式中，方法包括用于诊断或检测哺乳动物癌症的试剂盒，其中所述的试剂盒装有：
a)前述任一实施方式所述的抗体或其片段或免疫偶联物或其片段，其中所述的抗体或其片段能特异地结合肿瘤细胞抗原，其中所述的肿瘤细胞抗原选自由KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5组成的一组；
b)能够对所述哺乳动物的所述癌症进行所述的诊断或检测的检测方法；以及
c)试剂盒使用说明书。
附图简述
图1描述了对癌组织及正常组织内的肿瘤细胞抗原KIAA1815进行微阵列表达分析的图示。
图2描述了对癌组织及正常组织内的肿瘤细胞抗原LOC157378进行微阵列表达分析的图示。
图3描述了对癌组织及正常组织内的肿瘤细胞抗原FLJ20421进行微阵列表达分析的图示。
图4描述了对癌组织及正常组织内的肿瘤细胞抗原GPR160进行微阵列表达分析的图示。
图5描述了对癌组织及正常组织内的肿瘤细胞抗原GPCR41进行微阵列表达分析的图示。
图6描述了对癌组织及正常组织内的肿瘤细胞抗原SLC1A5进行微阵列表达分析的图示。
优选实施方式的详细描述
I.定义
除非特别说明，术语“KIAA1815”用于本文中是指人基因组内未知功能的一个蛋白，其中该蛋白最初被称作FLJ23309。该基因位点的另一个名称是LLID79956或bA207C16.3。KIAA1815基因包含一个推测的氨肽酶区。KIAA1815可来源于任何哺乳动物，优选来源于人。KIAA1815可从天然来源的分子中分离，也可以通过合成的方式制备(例如，利用重组DNA技术)。人KIAA1815的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_024896。利用登录号NP_079172可找到其氨基酸序列。KIAA1815也指癌细胞特异表达的任何KIAA1815变体，其中与非癌细胞所表达的KIAA1815的氨基酸同源性可达80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另一个实施方式中，KIAA1815可以是人KIAA1815的小鼠同源物，被称作D19Wsu12e。其他的名字是Fxna、MGC28280、mFLJ23309和D19Ertd410e。鼠D19Wsu12e的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为XM_358328。在另一个实施方式中，KIAA1815可以是人KIAA1815的大鼠同源物，被称作Fxna。大鼠Fxna的序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_184050。在另一个实施方式中，KIAA1815可以是人KIAA1815的灵长类同源物。例如，泛类人猿(黑猩猩)可在NCBI序列检索网上找到，登录号XM_526478用于检索核酸序列，XP520478用于检索氨基酸序列。
“KIAA1815 ECD”是指KIAA1815肿瘤细胞抗原的胞外域(ECD)。KIAA1815 ECD还可以指癌细胞特异表达的任何KIAA1815ECD变体。KIAA1815 ECD是指与蛋白的细胞外部分具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的任何蛋白或肽。拓扑学预测程序可用于估计包含ECD的蛋白区(见实施例2)。在其他实施方式中，KIAA1815 ECD可来源于人KIAA1815 ECD的小鼠、大鼠或灵长类同源物。
除非特别说明，术语“BC017881”用于本文中是指人基因组内未知功能的一个跨膜蛋白，该蛋白也被称作LOC157378或TMEM65。BC017881可来源于任何哺乳动物，优选来源于人。BC017881可从天然来源的分子中分离，也可以通过合成的方式制备(例如，利用重组DNA技术)。人BC017881的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_194291。利用登录号NP_919267可找到其氨基酸序列。BC017881也指癌细胞特异表达的任何BC017881变体，其中与非癌细胞所表达的BC017881的氨基酸同源性可达80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另一个实施方式中，BC017881可以是人BC017881的小鼠同源物，被称作4930438D12Rik。4930438D12Rik其他的名字是2610029O13Rik。小鼠4930438D12Rik的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_175212。在另一个实施方式中，BC017881可以是大鼠同源物，被称作LOC500874。LOC500874的序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为XM_576273。在另一个实施方式中，BC017881可以是人BC017881的灵长类同源物。例如，泛类人猿(黑猩猩)可在NCBI序列检索网上找到，登录号XM_528228用于检索核酸序列，XP_528228用于检索氨基酸序列。
“BC017881 ECD”是指BC017881肿瘤细胞抗原的胞外域(ECD)。BC017881 ECD还可以指癌细胞特异表达的任何BC017881 ECD变体。BC017881 ECD是指与蛋白的细胞外部分具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的任何蛋白或肽。拓扑学预测程序可用于估计包含ECD的蛋白区(见实施例2)。在其他实施方式中，BC017881 ECD可来源于人BC017881 ECD的小鼠、大鼠或灵长类同源物。
除非特别说明，术语“FLJ20421”用于本文中是指人基因组内未知功能的一个内消旋肌醇单核苷酸酶蛋白，其中该蛋白的其他名字是BAA91158、IMPA3和Impad1。FLJ20421包含一个位于约62位到349位氨基酸位置的推测的IPPase区。FLJ20421可来源于任何哺乳动物，优选来源于人。FLJ20421可从天然来源的分子中分离，也可以通过合成的方式制备(例如，利用重组DNA技术)。人FLJ20421的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为BC067814。利用登录号AAH67814可找到其氨基酸序列。FLJ20421也指癌细胞特异表达的任何FLJ20421变体，其中与非癌细胞所表达的FLJ20421的氨基酸同源性可达80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另一个实施方式中，FLJ20421可以是人FLJ20421的小鼠同源物，被称作Impad1。Impad1也被称作AA08880、AI451589、AL022796、B23027P20或1110001C29Rik。小鼠Impad1的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_177730。在另一个实施方式中，FLJ20421可以是人FLJ20421基因的大鼠同源物，被称作RGD1306455。RGD1306455的序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为XM_575759。在另一个实施方式中，FLJ20421可以是人FLJ20421基因的灵长类同源物。例如，泛类人猿(黑猩猩)可在NCBI序列检索网上找到，登录号XM_519770用于检索核酸序列，XP_519770用于检索氨基酸序列。
“FLJ20421 ECD”是指FLJ20421肿瘤细胞抗原的胞外域(ECD)。FLJ20421ECD还可以指癌细胞特异表达的任何FLJ20421 ECD变体。FLJ20421 ECD是指与蛋白的细胞外部分具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的任何蛋白或肽。拓扑学预测程序可用于估计包含ECD的蛋白区(见实施例2)。在其他实施方式中，FLJ20421 ECD可来源于人FLJ20421 ECD的小鼠、大鼠或灵长类同源物。
除非特别说明，术语“DSCD75”用于本文中是指间充质干细胞所表达的一个功能未知的蛋白，包含FcbC区，据推测该区具有硫酯酶的功能，位于约54位到178位氨基酸之间。DSCD75位点的其他名字是的其他名字是LOC51337或C8orf55。DSCD75可来源于任何哺乳动物，优选来源于人。DSCD75可从天然来源的分子中分离，也可以通过合成的方式制备(例如，利用重组DNA技术)。人DSCD75的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为AF242773。同样，利用登录号AAF65450可找到其氨基酸序列。DSCD75也指癌细胞特异表达的任何DSCD75变体，其中与非癌细胞所表达的DSCD75同源性可达80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另一个实施方式中，DSCD75可以是人DSCD75基因的小鼠同源物，被称作4930572J05Rik或MGC54796。小鼠4930572J05Rik的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_198607。在另一个实施方式中，DSCD75可以是人DSCD75基因的大鼠同源物，被称作MGC94661。大鼠DSCD75的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_001007658。在另一个实施方式中，DSCD75可以是人DSCD75基因的灵长类同源物。例如，泛类人猿(黑猩猩)同源物可在NCBI序列检索网上找到，登录号XM_519991用于检索核酸序列，XP_519991用于检索氨基酸序列。
“DSCD75 ECD”是指DSCD75肿瘤细胞抗原的胞外域(ECD)。DSCD75ECD还可以指癌细胞特异表达的任何DSCD75 ECD变体。DSCD75 ECD是指与蛋白的细胞外部分具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的任何蛋白或肽。拓扑学预测程序可用于估计包含ECD的蛋白区(见实施例2)。在其他实施方式中，DSCD75 ECD可来源于人DSCD75ECD的小鼠、大鼠或灵长类同源物。
除非特别说明，术语“GPR160”用于本文中是指一个推测的未知功能的G蛋白偶联受体。Takeda等描述了该蛋白以及其他一系列推测的G蛋白受体(FEBS Lett.520(1-3)，97-101(2002))。该蛋白也被称作GPCR1或GPCR150，尽管不止一个独特的人位点被称作GPCR1。GPR160可来源于任何哺乳动物，优选来源于人。GPR160可从天然来源的分子中分离，也可以通过合成的方式制备(例如，利用重组DNA技术)。人GPR160的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_014373。利用登录号NP_055188可找到其氨基酸序列。GPR160也指癌细胞特异表达的任何GPR160变体，其中与非癌细胞所表达的GPR160的同源性可达80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另一个实施方式中，GPR160可以是人GPR160基因的小鼠同源物，被称作Gpr160。小鼠Gpr160的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为XM_896590。在另一个实施方式中，GPR160可以是人GPR160基因的大鼠同源物，被称作Gpr160。大鼠Gpr160的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_001025147。在另一个实施方式中，GPR160可以是人GPR160基因的灵长类同源物。例如，泛类人猿(黑猩猩)同源物可在NCBI序列检索网上找到，登录号XM_530685用于检索核酸序列，XP_530685用于检索氨基酸序列。
“GPR160 ECD”是指GPR160肿瘤细胞抗原的胞外域(ECD)。GPR160 ECD还可以指癌细胞特异表达的任何GPR160 ECD变体。GPR160 ECD是指与蛋白的细胞外部分具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的任何蛋白或肽。拓扑学预测程序可用于估计包含ECD的蛋白区(见实施例2)。在其他实施方式中，GPR160 ECD可来源于人GPR160 ECD的小鼠、大鼠或灵长类同源物。
除非特别说明，术语“GPCR41”用于本文中是指一个推测的未知功能的G蛋白偶联受体。GPCR41也被称作PAR1(蛋白酶活化的受体1)和PERV-A受体(猪内源性逆转录病毒受体)、D15Ertd747e和GPR172A。GOCR41被Ericsson等描述为猪内源性逆转录病毒的受体(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(11)，6759-6764(2003))。GPCR41包含一个位于约265-371位氨基酸的DUF1011区。DUF区是一个未知功能的几种蛋白所共有的区。GPCR41可来源于任何哺乳动物，优选来源于人。GPCR41可从天然来源的分子中分离，也可以通过合成的方式制备(例如，利用重组DNA技术)。人GPCR41的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为BC002917。利用登录号AAH02917可找到其氨基酸序列。GPCR41也指癌细胞特异表达的任何GPCR41变体，其中与非癌细胞所表达的GPCR41的氨基酸同源性可达80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另一个实施方式中，GPCR41可以是人GPCR41的小鼠同源物，被称作Gpr172b，其他的名字有GPCR、PAR2、GPCR42、D15Ertd747e或2010003P03Rik。小鼠GPCR41同源物的序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_029643。在另一个实施方式中，GPCR41可以是人GPCR41基因的大鼠同源物，被称作LOC362942。大鼠GPCR41的序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为XM_343272。在另一个实施方式中，GPCR41可以是人GPCR41基因的灵长类同源物。例如，狒狒(狒狒)同源物可在NCBI序列检索网上找到，登录号AY070778用于检索核酸序列，AAL59884用于检索氨基酸序列。
“GPCR41 ECD”是指GPCR41肿瘤细胞抗原的胞外域(ECD)。GPCR41ECD还可以指癌细胞特异表达的任何GPCR41 ECD变体。GPCR41 ECD是指与蛋白的细胞外部分具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的任何蛋白或肽。拓扑学预测程序可用于估计包含ECD的蛋白区(见实施例2)。在其他实施方式中，GPCR41 ECD可来源于人GPCR41ECD的小鼠、大鼠或灵长类同源物。
除非特别说明，术语“SLC1A5”用于本文中是指中性氨基酸转运子，被称作ASCT-2或ATBO，可作为钠非依赖性氨基酸转运子转运中性氨基酸如丙氨酸、丝氨酸或半胱氨酸。另外，SLC1A5可作为多种病毒的受体，如猫内源性病毒、狒狒内源性病毒，人W型和D型内源性病毒、灵长类或猿感染性免疫缺陷相关逆转录病毒。该分子被Kekuda等描述为广谱的中性氨基酸转运子Bo，是从胚胎细胞系中分离出来的(J.Biol.Chem.271(31)，18657-18661(1996))。SLC1A5包含一个保守的钠羧化酶共输送体(SDF)区，位于约54到485位氨基酸之间。SLC1A5的其他名字有R16、AAAT、M7V1、RDRC和M7VS1。SLC1A5可来源于任何哺乳动物，优选来源于人。SLC1A5可从天然来源的分子中分离，也可以通过合成的方式制备(例如，利用重组DNA技术)。人SLC1A5的核酸序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为BC000062。利用登录号AAH00062.1可找到其氨基酸序列。SLC1A5也指癌细胞特异表达的任何SLC1A5变体，其中与非癌细胞所表达的SLC1A5的氨基酸同源性可达80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另一个实施方式中，Slcla5可以是人SLC1A5的小鼠同源物，也被称作Slcla5或R16，AAAT、ATBO、M7V1、RDRC、ASCT2、M7VS1、Slcla7或MGC46952。小鼠Slcla5的序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_009201。在另一个实施方式中，SLC1A5可以是人SLC1A5基因的大鼠同源物，也被称作Slcla5或Asct2、Slcla7或H4-ASCT2。大鼠Slcla5的序列可在NIH NCBI序列检索网上找到，登录号为NM_175758。在另一个实施方式中，SLC1A5可以是人SLC1A5基因的灵长类同源物。例如，Macaca fasicularis(长尾猴)同源物可在NCBI序列检索网上找到，登录号AB168329用于检索核酸序列，BAE00453.1用于检索氨基酸序列。
“SLC1A5 ECD”是指SLC1A5肿瘤细胞抗原的胞外域(ECD)。SLC1A5 ECD还可以指癌细胞特异表达的任何SLC1A5 ECD变体。SLC1A5 ECD是指与蛋白的细胞外部分具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的任何蛋白或肽。拓扑学预测程序可用于估计包含ECD的蛋白区(见实施例2)。在其他实施方式中，SLC1A5 ECD可来源于人SLC1A5 ECD的小鼠、大鼠或灵长类同源物。
“天然序列”多肽是指与天然来源的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。这种天然序列多肽可从自然界中分离，也可以通过重组或合成方式制备。因此，天然序列多肽可能含有天然的人多肽、鼠多肽或其他任何哺乳动物多肽的氨基酸序列。
“氨基酸序列变体”是指氨基酸序列与天然序列多肽有某种程度不同的多肽。一般而言，氨基酸序列变体与天然配基的至少一个受体结合区或与天然受体的至少一个配基结合区至少有约70％的同源性，优选与这种受体或配基结合区有至少约80％的同源性，更优选的是至少有约90％的同源性。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置上含有取代、缺失和/或插入突变。
“同源性”被定义为将序列比对，如果需要，并引入间隙以达到最大百分同源性后氨基酸序列变体内一致残基的百分数。序列比对的方法和计算机程序是本领域所熟知的。
术语“拮抗剂”可以被广义使用，包括部分或完全阻断、抑制或中和本文所述的肿瘤细胞抗原的生物学活性。同样，术语“激动剂”也可以被广义使用，包括可模拟本文所述的肿瘤细胞抗原的生物学活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子特别包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段、肿瘤细胞抗原的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、小的有机分子等。鉴定肿瘤细胞抗原的激动剂或拮抗剂的方法包括使表达目的抗原的肿瘤细胞与候选激动剂或拮抗剂分子接触，检测肿瘤细胞抗原相关的一种或多种生物学活性可检测的变化。拮抗剂还可以是通过合理设计或通过噬菌体展示技术制备的肽(参见，例如WO98/35036，1998年8月13日公开)。在一个实施方式中，备选分子是根据抗体的CDR所设计的CDR“模拟物“或抗体类似物。当这种肽被其自身拮抗时，肽还可以融合到细胞毒剂上以增加或增强肽的拮抗特性。
“小分子”在本文中被定义为分子量在约500Da以下的分子。
术语“抗体”在本文中含义广泛，特别包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)单链抗体、Fc区被修饰的抗体和抗体片段，只要它们具有理想的生物学活性，其中理想的生物学活性被定义为与目的靶位的结合特异性。
术语“单克隆抗体”用于本文中是指来自于基本同源的抗体群的抗体，即，每一个抗体所包含的群都是一样的，除了少量抗体可能存在天然突变以外。单克隆抗体是高度特异的，直接抗单一抗原位点。另外，与多克隆抗体包含抗不同决定子(表位)的不同抗体相反，每一个单克隆抗体只针对抗原上的单一决定子。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于可以人工合成，因而不会被其他抗体污染。修饰子”单克隆”是指抗体的特征是来自于基本同源的抗体群，不能被理解为需要通过任何特殊方法制备抗体。例如，本发明所使用的单克隆抗体可通过Kohler等Nature，256：495(1975)首先设计的方法或通过重组DNA方法(参见美国专利号4816567)来制备。例如，单克隆抗体也可以利用Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)描述的技术从噬菌体抗体库中分离。
本文的单克隆抗体特地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与特定物种来源的抗体的相应序列一致或同源，而链的其余部分与另一物种来源的抗体的相应序列一致或同源，或者属于另一类或亚类抗体以及这种抗体的片段，只要他们具有预期的生物学活性(美国专利号4816567；以及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文的目的嵌合抗体包括包含非人灵长类(如，旧世界猴、大猩猩等)来源的可变区抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类动物化”的抗体。
“抗体”片段包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab/Fab′/F(ab′)2和Fv片段；双功能抗体；线性抗体(Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；以及抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整”抗体是指包含抗原结合可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以是天然序列恒定区(如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。优选的是，完整抗体具有一种或多种效应功能。
抗体的“效应功能”是指抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列突变的Fc区)所具有的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括Clq结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调作用(如，B细胞受体；BCR)等。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用”或“ADCC”是指一种形式的细胞毒作用，其中分泌的Ig结合到某种细胞毒细胞(如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)表面的Fc受体(FcR)上，使这些细胞毒效应细胞与携带抗原的靶细胞特异地结合，随后利用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒细胞是发挥这种杀伤作用所必须的。介导ADCC的初级细胞NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞所表达的FcR总结在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页的表3中。为了评价目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC试验，如美国专利号5500362或5821337所描述的。进行这种试验可以使用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另外，目的分子的ADCC活性也可以通过体内试验进行分析，例如，动物模型中，如Clynes等，(USA)95：652-656(1998)所描述的。
“人源效应细胞”是表达一种或多种FcR并且具有效应功能的白细胞。优选的是，细胞至少表达FcγRIII，并且能执行ADCC效应功能。能介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可从其天然资源中分离，如从本文所述的血液或PBMC中。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述可偶联抗体Fc区的受体。优选的FcR天然序列是人FcR。另外，优选的FcR是能够结合IgG抗体的受体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，其中包括这些受体的等位基因变体和其他的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(”活化受体)和FcγRIIB(”抑制受体”)，它们的氨基酸序列一致，主要区别在于其胞浆区。活化受体FcγRIIA在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见综述M，见Daron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods4：25-34(1994)；以及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。其他FcR，包括在未来可能被鉴定出的那些，都包括在本文术语“FcR”的范围之内。该术语还包括新生儿受体FcRn，它负责产妇IgG向胎儿的转运(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。
“补体依赖的细胞毒作用”或“CDC”是指在补体存在的情况下分子溶解靶细胞的能力。补体活化通路是通过补体系统的第一组分(Clq)与分子(如抗体)的结合启动的，其中分子与同源抗原形成复合物。为了评价补体的活化，可进行CDC试验，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)所述。
可“诱导细胞死亡”的抗体、寡肽或其他有机分子是能够导致活细胞变成死细胞的分子。细胞是指表达癌细胞特异性抗原的细胞，优选与同一组织类型的正常细胞相比过量表达癌细胞抗原的细胞。优选的是，细胞是癌细胞，例如，乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌或胆囊癌细胞。在缺少补体和免疫效应细胞的情况下在体外确定细胞的死亡以区分抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或补体依赖的细胞毒作用(CDC)所诱导的细胞死亡。因此，可以利用热灭活血清(即，缺少有功能的补体)并在缺少免疫效应细胞的情况下进行死亡细胞的分析。为了确定抗体、寡肽或其他有机分子是否能够诱导细胞死亡，可以通过碘化丙啶(PI)、台盼蓝(参见Moore等，Cytotechnology 17：1-11(1995))或7AAD的摄取来分析相对于未处理细胞的细胞膜完整性的丢失情况。优选的细胞死亡诱导抗体、寡肽或其他有机分子是那些在PI摄取试验中诱导至少20％的靶细胞摄取PI的分子。
“诱导凋亡”的抗体是指可诱导程序性细胞死亡的抗体，可根据膜联蛋白V的结合、DNA的片段化、细胞皱缩、内质网扩张、细胞碎片化和/或膜囊泡(被称作凋亡小体)来确定细胞的凋亡。优选的细胞是肿瘤细胞，例如，乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌或胆囊癌细胞。现在有许多方法可用于评价与凋亡相关的细胞事件。例如，磷脂酰丝氨酸(PS)的易位可通过膜联蛋白结合来测定；DNA片段化可通过DNA梯度来评价；以及伴随DNA片段化的核/染色质浓缩可通过低二倍体细胞的增加来评价。优选的是，能够诱导凋亡的抗体是指在用BT474细胞进行的膜联蛋白结合试验中，与未处理细胞相比，诱导膜联蛋白结合升高约2到50倍、优选约5到50倍、最优选约10到50倍或50倍以上的抗体(见下文)。
“天然抗体”通常是分子量约为150,000Da、包含两个相同轻链(L)和两个相同重链(H)的杂合四聚体糖蛋白。每个轻链通过一个共价的二硫键与重链相连，但是不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键连接的数目是不同的。每个重链和轻链之间还有规则的空间链内二硫键桥。每个重链的末端是可变区(VH)以及随后的几个恒定区。每个轻链在其一端是可变区(VL)，另一端是恒定区。轻链的恒定区与重链的第一恒定区比对在一起，轻链可变区与重链可变区比对在一起。特定氨基酸残基被认为形成了轻链和重链可变区之间的界面。
“裸抗体”通常是指没有连接或结合任何化学的、生物的或放射性核素基序的抗体或其片段，但是可以包含天然修饰如糖基化。
术语“可变的”是指可变区的某些部分在不同抗体之间集中发生改变，以及可变区用于每一个特定抗体结合其特定抗原并且决定对其特定抗原的特异性的事实。但是，可变区的变异度不是平均分布在抗体的整个可变区，主要集中在三个片段，分别是位于轻链的两个被称为超变区的片段和重链可变区。保守程度较高的可变区部分被称为框架区(FR)。每一天然重链和轻链的可变区包含4个FR，大多数呈现β折叠构型，与两个超变区相连形成环连接，在某些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链上的超变区和其他链的超变区被近处的FR束缚在一起，形成抗体的结合位点(参见Kabat等，《免疫性蛋白的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，国立健康研究所公众健康服务部(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是具有各种效应功能，如抗体参与抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。
术语“超变区”用于本文中是指抗体上负责抗原结合的氨基酸残基。超变区通常包含来自于“补体决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变区上的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变区上的95-102(H3)；Kabat等，《免疫性蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，国立健康研究所公众健康服务部，，Bethesda，Md.(1991))和/或来自于”超变环”的那些残基(例如，轻链可变区上的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变区上的96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是本文所定义的超变区残基之外的那些可变区残基。
抗体经木瓜蛋白酶消化后可产生两个一样的抗原结合片段，被称为“Fab”片段，每个片段含一个抗原结合位点，以及一个剩余的“Fc”片段，其名字反映了其很容易被结晶化的能力。胃蛋白酶处理可产生F(ab′)2片段，该片段有两个抗原结合位点，也能交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的小抗体片段。这个区是以紧密的非共价方式结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体。在其构型中，每一可变区的三个超变区相互作用构成了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总之，6个超变区决定了抗体的抗原结合特异性。但是，即使单一一个可变区(或只包含抗原特异性的三个超变区的Fv的一半)也能够识别和结合抗原，尽管其亲和力比完整结合位点低。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同在于它还包括重链CH1区羧基端的几个残基，其中包括抗体铰链区的一个或几个半胱氨酸。Fab′-SH在本文中被定义为恒定区的半胱氨酸残基包含至少一个自由巯基基团的Fab′。F(ab′)2抗体片段最初是以Fab′片段对的形式制备的，在二者之间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
根据抗体恒定区的氨基酸序列，任何脊椎动物来源的抗体的“轻链”都被定义为两个完全不同的类型中的一个类型，被称为κ和λ。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，完整抗体被分成不同的“类”。完整抗体主要分为5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中它们中的几个又被进一步分成“亚类”(同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。不同类抗体相应的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是大家熟知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL区，其中这些区存在于一条多肽链上。优选的是，Fv多肽还包含VH和VL区之间的能使scFv形成理想的抗原结合结构的多肽连接子。有关scFv的综述参见Pluckthun，《单克隆抗体药理学》(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，纽约，269-315页(1994)。抗ErbB2抗体的scFv片段见WO93/16185；美国专利号5571894和5587458的描述。
术语“双功能抗体”是指包含两个抗原结合位点的小抗体片段，片段包含连接到同一多肽链(VH-VL)的可变轻链区(VL)上的可变重链区(VH)。由于使用的连接子太短使同一条链上的两个区之间无法配对，因此这些区被迫与其他链的互补区配对，形成两个抗原结合位点。有关双功能抗体较全面的描述见EP404，097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。
“多价抗体”是那些包含至少两个结合位点的抗体或抗体片段，其中结合位点都对同一表位具有特异性，或者对两个不同的表位有特异性。
非人(例如，啮齿类动物)抗体的“人源化”形式是指包含来源于非人免疫球蛋白的小序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者超变区的残基被具有理想特异性、亲和力和结合能力的非人物种(供者抗体)抗体如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的超变区的残基所取代。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基所取代。另外，人源化抗体可包含受者抗体或供者抗体上不存在但是其他人源抗体上却存在的残基。这些修饰(“超级人源化”)可进一步优化抗体的性能。一般而言，人源化抗体包含至少一个，一般两个可变区的几乎全部序列，其中非人免疫球蛋白超变区相应的超变环的全部或几乎全部序列以及FR的全部或几乎全部序列是人免疫球蛋白序列的超变环。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白恒定区的一部分。进一步的详细描述见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
“游离的”抗体是指已被鉴定并从其天然环境的组分中被分离和/或回收出来的抗体。其天然环境的污染组分是指将会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，可包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白可溶物。在优选实施方式中，抗体将被纯化到：(1)通过Lowry方法确定抗体占重量百分比超过95％，最优选的是重量百分比超过99％，(2)通过使用旋杯式测序仪(spinning cup sequenator)足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或者(3)使用考马斯兰，或者优选银染色，在降低的或非降低的条件下达到SDS-PAGE均一性。游离抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境的至少一个组分是不存在的。但是，游离抗体通常通过至少一个纯化步骤进行制备。
“可结合”目的抗原的抗体是指能以足够的亲和力结合抗原的抗体，这样抗体可用作靶向到抗原表达细胞时的治疗或诊断剂。
抗体“特异性结合”特定多肽或特定多肽上的表位或者是特定多肽或特定多肽上的表位”特异性的”是指抗体可结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本不结合其他任何多肽或多肽表位。优选的是，抗体对目的靶位的特异性达到与靶细胞上抗原的结合要超过其他非特异性1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更高。可选的是，抗体可证明对任何已知靶肿瘤细胞抗原同源物的特异性或特异性非结合，其中包括灵长类、小鼠和/或大鼠的同源物。可选的是，抗原可以辨别同一物种内目的肿瘤细胞抗原和已知的同源物。其区别可通过对一种同源物的结合特异性超过另一种来确定，其中抗体与目的同源物结合能力比抗体与非目的同源物的结合能力高1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更高。当解离常数低于1μM，优选低于100nM，最优选低于10nM时，可以说抗体是与表位特异性结合。
本发明的抗肿瘤细胞抗原的抗体可结合氨基酸残基特异性表位、糖类特异性表位或氨基酸残基和分子的糖链部分共同形成的表位，如带靶位的肿瘤细胞所表达的表位。如果抗体肿瘤细胞抗原的抗体携带细胞毒剂或细胞静止剂，优选与能够内化抗体-靶受体复合物的表位结合的抗体。如果抗靶位抗体是通过ADCC和CDC发挥作用，那么优选在抗体的Fc区结合到效应细胞上之前存在于靶肿瘤细胞表面的抗靶位抗体。确定与同源细胞表面抗原结合的抗体是停留在细胞表面还是被内化的方法是本领域所熟知的。
术语“表位”是指抗原上能与抗体的可变末端结合的特异性结合位点或抗原决定子。表位可以是线性的，即，由一级蛋白质(pormin)序列上的氨基酸残基序列组成。表位可以是构型性的，这样抗体可识别表达蛋白质(porimin)的细胞表面表达的折叠的蛋白质(porimin)分子上的三维结构，这样被识别的氨基酸就不一定是一级序列上的连续氨基酸。表位还可以是线性和构型性元件的组合。另外，分子的糖链部分也可以是表位，如携带靶位的肿瘤细胞所表达的。
术语“肿瘤细胞抗原”是指能激发免疫反应的任何蛋白质、糖类或其他组分。这个定义包括而不限于以含有所有相关抗原的完整肿瘤细胞作为抗原，以及从细胞中分离的任何组分，如浆膜、从细胞表面或膜中纯化的蛋白质、或者与细胞表面相连的独特糖类基序。该定义还包括需要对细胞进行特殊处理才能获得的来自于细胞表面的那些抗原。“标志物”是指与对应的正常细胞相比在肿瘤细胞表面有更高表达水平的肿瘤细胞抗原。
单词“标记物”用于本文中是指直接或间接连接到抗体上以制备“标记”抗体的可检测化合物或组合物。标记物自身可以是可检测的(如，放射性同位素标记物或荧光素标记物)，或者酶催化标记物，可以催化可被检测的底物化合物或组合物发生化学改变。
“固相基质”是指本发明的抗体可粘附于上的非水性基质。本文所述的固相基质的例子包括部分或完全由玻璃(例如，可控多孔玻璃)、糖(如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和有机硅制成的基质。在某些实施方式中，根据上下文，固相基质可包含分析板的孔；在其他例子中是纯化柱(例如，亲和色谱柱)。该术语还包括由分散颗粒组成的不连续固相基质，如美国专利号4275149描述的那些。
“拮抗剂抗体”或“拮抗抗体”是指可阻断、抑制或中和本文所述的肿瘤细胞抗原的生物学活性的抗体。鉴定目的肿瘤细胞抗原的拮抗抗体的方法包括使表达目的肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞与候选抗体接触，然后测定与肿瘤细胞上肿瘤细胞抗原相关的正常生物学活性的变化。例如，肿瘤细胞抗原如果是能诱导肿瘤细胞增殖的抗原，那么有效的拮抗抗体将是能与肿瘤细胞抗原发生特异性相互作用，导致细胞增殖能力降低的抗体。优选的拮抗剂抗体是可导致目的生物活性下降30-75％的抗体，更优选的是下降75-99.9％或更多。
可“阻断”配基活化的抗体或“阻断抗体”是一类降低或抑制与抗体结合的配基的活化的拮抗抗体。优选的是，在推测的阻断抗体存在或不存在的情况下同时进行活化配基分析，阻断抗体是可阻断30-75％配基活化的抗体，最优选的是阻断75-99.9％或更高的配基活化。配基活化的抑制可通过观察如下现象来确定，例如，受体磷酸化水平的降低、目的配基下游的信号转导通路的其他组分活化的丢失。
“激动剂抗体”是指可诱导与抗体结合的配基活化的抗体。优选的是，在配基活化分析中，候选抗体与其对应的非特异性对照抗体相比，使配基活化水平升高2倍、4倍、10倍、50倍或更高的抗体是激动剂抗体。配基活化可通过观察如下现象来确定，例如，受体磷酸化水平的升高、目的配基下游的信号转导通路的其他组分活化的增多。
具有指定抗体的“生物学特征”的抗体是指具有一种或多种生物学特征从而能使其与结合同一抗原的其他抗体区分开来的抗体。
“生长抑制剂”用于本文中是指在体外或体内能抑制细胞生长尤其是癌细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是明显降低处于S期的细胞所占百分数的试剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期进展(处于S期之外的其他期)的试剂，例如诱导G1期阻滞和M期阻滞的试剂。典型的G1期阻滞剂包括长春花(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类和拓扑II抑制剂，如阿霉素，表阿霉素，柔红霉素，依托泊苷和博莱霉素。那些G1期阻滞剂也可以导致S期阻滞，例如，DNA烷化剂，如三苯氧胺，泼尼松，达卡巴嗪，氮芥，顺铂，甲氨蝶呤，氟尿嘧啶和阿糖胞苷。其他信息可参见《肿瘤的分子基础》(TheMolecular Basis of Cancer)，Mendelsohn和Israel编辑，第一章”细胞周期调节、原癌基因和抗肿瘤药物”(Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplasticdrugs)，Murakami等，(W B Saunders：Philadelphia，1995)，尤其是第13页。优选的生长抑制剂是那些在生长抑制剂存在的情况下将细胞生长抑制20％以上、或25％、30％、35％、40％、45％以上的试剂，更优选的是抑制50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％以上，最优选的是抑制95％或99.9％以上。
“细胞静止剂”用于本文中是指可抑制细胞分裂但不会导致细胞死亡的化合物或组合物。细胞静止剂可抑制细胞生长通过细胞周期，导致分裂停止在细胞周期的特定点，如S期前。优选的细胞静止剂是那些可导致30-50％的细胞发生静止的试剂，更优选的是使细胞群中50-95％的细胞、最优选的是使细胞群中95-99.9％的细胞发生静止的试剂。
术语“处理”用于本文中通常是指获得期望的药理和/或生理效应。“处理”既指治疗性处理又指预防性或抑制性措施。需要处理的动物包括已经产生疾病的动物以及疾病已被阻止的动物。因此，被处理的哺乳动物可以被诊断为患有疾病或者易感或易患疾病。
本文所述的多肽或其激动剂或拮抗剂的“有效量”是指该剂量足以达到特定的目的。“有效量”可根据所述目的依靠经验确定，也可以通过常规方式确定
用于处理的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，其中包括人、家畜以及动物园动物、体育动物和宠物，如狗、马、猫、奶牛等。优选的哺乳动物是人。
“疾病”是指可从本发明的激动剂/拮抗剂或靶向抗体或免疫偶联物处理中受益的任何状况。这包括慢性和急性失调或疾病，其中包括那些哺乳动物被怀疑易患疾病的病理状况。可用本文方法处理的疾病的非限制性例子包括良性和恶性肿瘤；白血病和恶性淋巴瘤；神经元疾病、胶质瘤、星形细胞瘤、下丘脑和其他腺体疾病、巨噬细胞病、上皮细胞瘤、基质瘤和囊胚腔病；以及炎性、血管性和免疫性疾病。
术语“治疗有效量”是指可有效地治疗哺乳动物疾病或失调的药物的量。对于癌症来说，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；降低肿瘤的大小；抑制(即，一定程度的延缓，优选终止)癌细胞侵润到周围器官；抑制(即，一定程度的延缓，优选终止)肿瘤的转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻癌症相关的一种或多种症状。如果一种药物可在一定程度上阻止现有癌细胞的生长和/或杀死癌细胞，那么它就是细胞静止剂和/或细胞毒剂。对于癌症治疗来说，例如，效应可通过评价疾病进展时间(TTP)和/或确定反应率(RR)来测定。
“过度增生性疾病或失调”是指所有的肿瘤细胞生长和增殖，不论是恶性的还是良性的，其中包括所有的转化细胞和组织以及所有的癌细胞和组织。过度增生性疾病或失调包括而不限于癌前损伤、异常细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤和”癌”。过度增生性疾病、失调和/或状况的其他例子包括而不限于位于如下位置的良性或恶性肿瘤：前列腺、结肠、腹部、骨、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺体(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛，头部和颈部、神经(中枢和外周)、淋巴系统、盆腔、皮肤、软组织、脾、胸以及泌尿生殖道。
术语“癌”和“肿瘤”是指或描述哺乳动物的生理状态，这种状态的特征一般是不受调节的细胞生长。一般而言，可用于本发明的检测或治疗目的细胞包括癌前的(例如，良性的)、恶性的、转移的和非转移的细胞。尤其有意义的是检测癌细胞。癌的例子包括而不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴系统恶性肿瘤。这种癌的更具体的例子包括鳞状细胞癌(如上皮鳞状细胞癌)、肺癌，其中包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及鳞状细胞癌肺癌、腹膜癌、肝癌、胃癌，包括胃肠道癌、胰腺癌、神经母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
“过量表达”肿瘤细胞抗原的癌是指所表达的该抗原比同一组织类型的非癌细胞明显升高的癌。这种过量表达可由基因扩增或转录或翻译水平升高引起。抗原的过量表达可通过评价患者体内配基(或编码该配基的核酸)的水平来诊断确定，如肿瘤组织活检或上述各种诊断实验如IHC、FISH、蛋白印迹、PCR或体内实验。
术语“预后”是在本领域被认识的，包括预测对治疗性干预措施可能的反应进程以及疾病或疾病进展可能的过程，特别是与疾病缓解、疾病复发、肿瘤复发、转移和死亡有关的可能性。本发明的体外预后分析可用于预测候选患者对特定抗肿瘤细胞抗原治疗剂或一类抗肿瘤细胞抗原治疗剂的反应，或者调节ADCC。“预测候选患者的反应”是指分析疑似患者接受特定的抗肿瘤细胞抗原治疗剂的处理以后将会产生阳性或阴性结果的可能性。为了本发明的目的，在本发明的体外预后分析中”阳性处理结果的标志”意味着候选患者对抗肿瘤细胞治疗剂的处理产生反应而获得有益结果的可能性升高，因此用抗肿瘤细胞抗原治疗剂进行治疗是值得的。相反，“阴性处理结果的标志”意味着候选患者用抗肿瘤细胞治疗剂处理不会从中受益，因此用抗肿瘤细胞抗原治疗剂进行治疗是不值得的。
用抗肿瘤细胞抗原治疗剂处理所能得到的有益结果包括任何阳性治疗反应。与癌症治疗有关的“阳性治疗反应”是指与抗肿瘤细胞抗原治疗剂相关的疾病的改善和/或与目的疾病相关的症状的改善。也就是说，可以观察到表达肿瘤抗原的细胞的刺激所介导的抗增殖效应、肿瘤过度生长被进一步抑制、肿瘤尺寸的缩小、癌细胞数目减少和/或一种或多种症状减轻。因此，例如，阳性治疗反应是指疾病的下列一种或多种情况改善：(1)肿瘤尺寸的缩小；(2)癌(即，肿瘤)细胞的数目减少；(3)死亡的肿瘤细胞增多；(4)肿瘤细胞存活被抑制；(4)肿瘤生长的抑制(即，某种程度的延缓，优选终止)；(5)癌细胞侵润到周围器官被抑制(即，某种程度的延缓，优选终止)；(6)肿瘤转移被抑制(即，某种程度的延缓，优选终止)；(7)肿瘤进一步过度生长被阻止；(8)患者生存率升高；以及(9)与癌相关的一种或多种症状发生一定程度的缓解。任何给定的恶性肿瘤的阳性治疗反应可通过该肿瘤特异性的标准反应评价指标来确定。
肿瘤反应可通过肿瘤形态学(即，整体肿瘤负荷、肿瘤大小等)的变化来评价，所用技术为筛选技术，如磁共振成像(MRI)扫描、X射线成像、电脑断层(CT)扫描、骨骼扫描成像、内窥镜以及肿瘤活检取样，其中包括骨髓穿刺(BMA)和循环中的肿瘤细胞计数。除了这些阳性治疗反应之外，用抗肿瘤细胞抗原治疗剂进行治疗的患者可获得疾病相关症状改善这样的有益效果。因此，对于B细胞肿瘤来说，患者可经历所谓的B症状的减轻，即夜汗、发烧、体重下降和/或荨麻疹。对于癌前疾病来说，用抗肿瘤细胞抗原治疗剂治疗可阻断和/或延迟相关恶性疾病发生前的时间。
在某些实施方式中，本发明的方法中所使用的体外预后分析包括提供候选患者来源的实验生物样品和对照生物样品，其中患者需要进行预后分析以便于利用本文所述的抗肿瘤细胞抗原治疗剂进行治疗，实验和对照生物样品包含表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞，这些细胞已在体外或体内用肿瘤细胞配基刺激；使实验生物样品与有效量的抗肿瘤细胞抗原治疗剂接触；检测这个实验生物样品中至少一个生物标志物的水平，其中生物标志物根据抗肿瘤细胞抗原治疗剂作用模式的不同选自如下一组：细胞凋亡的生物标志物以及细胞存活的生物标志物；以及比较实验生物样品和对照生物样品中生物标志物的水平，后者未与抗肿瘤细胞抗原治疗剂接触。当抗肿瘤细胞抗原治疗剂是能阻断或干扰信号转导并且能调节ADCC的拮抗剂时，本文所述的使用细胞增殖和存活、凋亡以及信号转导的任何或所有这些生物标志物的体外预后分析可单独或与分析细胞因子标志物的实验和/或用于分析本文所述的一种或多种肿瘤细胞抗原相关因子的实验联合用于评价治疗剂的潜在有益效应，从而鉴定出患有癌或癌前疾病的患者中哪些可能会对抗肿瘤细胞抗原治疗剂的治疗产生反应，其中细胞因子标志物可被信号转导通路上调。当抗肿瘤细胞抗原治疗剂具有通过调节ADCC活性而发挥作用的作用模式时，例如，抗肿瘤细胞抗原的抗体，用于一种或多种凋亡标志物的体外预后分析实验可单独或与分析本文所述的一种或多种肿瘤细胞抗原相关因子的实验联合用于评价治疗剂的潜在有益效应，从而确定患有癌或癌前疾病的患者中哪些可能会对抗肿瘤细胞抗原治疗剂的治疗产生反应。
根据本发明的体外预后分析实验，与目的抗肿瘤细胞抗原治疗剂接触的实验生物样品中的一种或多种生物标志物以及可选的一种或多种细胞因子标志物的表达水平与对照生物样品中的生物标志物以及可选的细胞因子标志物的表达水平进行比较。”实验生物样品”是指从候选患者中获得的包含表达CD40的肿瘤细胞的生物样品，该样品将与用于治疗候选患者的抗肿瘤细胞抗原治疗剂接触。“对照生物样品”是指与实验生物样品进行比较的生物样品，其中也包含大约相同数量和种类的表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞，在同一时间点以实验生物样品同样的获取方式从候选患者体内获得，对照样品的实验条件与实验样品相同，只是不与目的抗肿瘤细胞抗原治疗剂接触。实验生物样品和对照生物样品可取自同一患者来源同一生物样品，将其分成两份，其中一份作为实验生物样品，另一份作为对照生物样品。另外，实验生物样品和对照生物样品可得自两个或多个生物样品，将其混合后再分成上述两份，或者分别作为实验生物样品和对照生物样品。
术语“细胞毒剂”用于本文中是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞损伤的物质。这些试剂可以是抗有丝分裂剂、烷化剂、抗代谢物、血管生成抑制剂、凋亡剂、生物碱、COS-2抑制剂和抗生素化合物及其组合。该术语还包括放射性同位素(例如，225Ac、18F、68Ga、67Ga、90Y、86Y、111In、131I、125I、123I、99mTc、94mTc、86Re、188Re、177Lu、62Cu、64Cu、67Cu、212Bi、213Bi、32P、11C、13N、15O、76Br以及211At。其他放射性核素也可用作诊断和治疗剂，尤其是那些能量范围在20-10,000keV的放射性核素)、化疗药物以及毒素如小分子毒素和细菌、真菌、植物或动物来源的酶催化活化毒素，其中包括其片段和/或变体。
“化疗药物”是用于治疗癌症的化学化合物。化疗药物的例子包括烷化剂如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基苯磺酸盐如白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡；氮丙啶类如苄替派(benzodopa)、卡巴醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；氯丙啶类和甲基胺类(methylamelamine)，其中包括六甲蜜胺、三亚胺嗪(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆汁磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、马法兰、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝脲类如卡莫司汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、刺孢霉素、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、达替咪星、柔红霉素、地托比星、重氮氧代正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、块菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-尿嘧啶(5-FU)；以及叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸、曲美沙特；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫代鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素如二甲睾酮、丙酸甲雄烷酮、表硫雄醇、环戊缩环硫雄烷、睾内酯；抗肾上腺素如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如叶酸；乙酰葡醛酸内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基-γ-酮戊酸；安吖啶；倍他布群(bestrabucil)；比山群；依达曲沙；德佛法明(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；醋酸羟哔咔唑；依托格鲁；硝酸镓；羟(基)脲；香菇多糖；氯尼达明；丙米腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK.RTM.；丙亚胺；西佐喃；螺旋锗；细格孢氮杂酸；三亚胺苯醌；2，2′，2＂-三氯三乙酰胺；乌拉坦；长春酰胺；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；盖托新(gacytosine)；阿拉伯糖苷(＂Ara-C＂)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL.RTM.，Bristol-Myers Squibb Oncology，普林斯顿，纽约州)和多西紫杉醇(TAXOTERE.RTM.，Rhne-Poulenc Rorer，安东尼(Antony)，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；6-巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；异长春花碱；去甲长春碱；诺消灵；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；卡培他滨；伊班膦酸盐；CPT-11；拓朴异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃泊拉米星(esperamicin)；卡培他滨；及上述任一物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。本定义还包括可用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药，如抗雌激素药，例如，其中包括他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、凯欧昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮以及托瑞米芬(法乐通)；以及抗雄激素药如氟他米特、安得乐、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；及上述任一物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
“抗血管生成剂”是指可在某种程度上阻断或干扰血管形成的化合物。例如，抗血管生成剂可以是与参与促进血管形成的生长因子或生长因子受体结合的小分子或抗体。
术语“细胞因子”是一个遗传学术语，是指一个细胞群所释放的蛋白质，该蛋白质可作为细胞间介质作用于另一种细胞。这种细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。其他细胞因子有生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素以及牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如卵泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和β；苗勒抑制物质；鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生长素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGFα和β；胰岛素样生长因子I和II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF；粒细胞巨噬细胞-CSF(GM-CSF)以及粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α和β；以及其他多肽因子如LIF和kit配基(KL)。本文所用的术语细胞因子包括天然来源的蛋白，也包括重组细胞培养物来源的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等价物。
在蛋白质或核苷酸水平检测目的生物标志物可用本领域技术人员熟知的任何检测方法完成。“检测表达”或“检测...的水平”是指确定生物样品内生物标志物蛋白或基因是否存在或者存在的量。因此，“检测表达”包括生物标志物被确定为不表达、不可检测的表达、低水平表达、正常水平表达或过量表达的情况。为了确定抗肿瘤细胞抗原治疗剂的效应，包含表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞的实验生物样品与抗肿瘤细胞抗原治疗剂接触足够的时间以使治疗剂能够激发细胞反应，然后将实验生物样品中一种或多种目的生物标志物的表达水平与未与抗肿瘤细胞抗原治疗剂接触的对照生物样品中的表达水平进行比较。在某些实施方式中，肿瘤细胞的对照生物样品与中性物质或阴性对照接触。例如，在一个实施方式中，不与肿瘤细胞抗原结合的非特异性免疫球蛋白如IgG1用作阴性对照。检测可在一段时间内多次进行以监测生物标志物随时间的变化。检测还可以用与不同浓度的抗肿瘤细胞抗原治疗剂接触的样品以绘制任何给定的目的生物标志物的”剂量-效应”曲线。
术语“前药”用于本申请是指药理活性物质的前体或衍生形式，该物质对肿瘤细胞的细胞毒性比亲本药低，能够被催化活化或转化成活性更高的亲本形式。参见，例如，Wilman，“癌症化疗中的前药”(＂Prodrugs in CancerChemotherapy＂)，《生化学会细目》(Biochemical Society Transactions)，14，375-382页，第615界Belfast会议(1986)以及Stella等，“前药：靶向药物转运的化学途径”(＂Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，＂)，《直接药物转运》(Directed Drug Delivery)，Borchardt等(编辑)，247-267页，赫曼达出版社(Humana Press)(1985)。本发明的前药包括而不限于含磷酸盐的前药、含硫代硫酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、D氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含β-内酰胺的前药、含可选取代苯氧乙酰胺的前药或含可选取代苯乙酰胺的前药、可转化成更活泼的细胞毒性游离药物的5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿嘧啶前药。可用于本发明的衍生成前药形式的细胞毒药物的例子包括而不限于上述那些化疗药物。
“脂质体”是由不同类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小载体，可用于运送药物(如本文所述的抗肿瘤细胞抗原的抗体以及，可选的，化疗药物)到哺乳动物体内。脂质体的组分一般以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列方式。
术语“包装说明书”用于指治疗产品的上市包装中通常所包含的说明书，其中含有使用这种治疗产品所涉及的指导、用法、用量、给药途径、禁忌症和/或警告有关的信息。
“游离”核酸分子是指从至少一个污染核酸分子中鉴定和分离出来的核酸分子，该核酸分子在抗体核酸的天然资源中与污染核酸分子通常联系在一起。游离核酸分子不以其天然状态或形式存在。因此游离核酸分子与其存在于天然细胞中的核酸分子不同。但是，游离核酸分子包括通常表达抗体的细胞中所含有的核酸分子，例如，其中核酸分子位于染色体上，但其所处位置与天然细胞的核酸分子不同。
表达“控制序列”是指可操控连接的编码序列在特定宿主有机体内表达所必须的DNA序列。例如，适用于原核细胞的控制序列包括启动子、可选的操作子序列、以及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸信号和增强子。
当核酸与另一种核酸序列处于功能性相互关系中时则核酸是“可操控连接的”。例如，当原序列或分泌前导子的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白时，则该DNA与多肽的DNA可操控地连接；当启动子或增强子可影响序列的转录时，则该启动子或增强子与编码序列可操控地连接；或者当核糖体结合位点所处的位置能促进翻译时则该核糖体结合位点与编码序列可操控地连接。一般而言，“可操控连接”意味着被连接的DNA序列是连续的，以及在分泌前导序列中是连续的，并且处于阅读框架中。然而，增强子不一定是连续的。在方便的限制性酶切位点上通过连接反应可完成连接。如果这样的位点不存在，那么可按照常规实验合成寡核苷酸接头或连接子。
在本文中，表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交互使用，所有这些定义都包括子代细胞。因此，单词“转化子”和“转化细胞”包括患者的原代细胞及其衍生的培养物，不论传代次数。还应当理解，子代细胞在DNA含量上不一定完全一致，因为存在故意或无意的突变。在筛选原始转化细胞的过程中具有相同功能或生物活性的突变子代细胞也包括在该定义之内。如果意味着不同的含义，那么可以从上下文中看出来。
II.筛选肿瘤细胞抗原的激动剂或拮抗剂
为了分析拮抗剂，将肿瘤细胞抗原与待筛选特定活性的化合物一起加入到细胞内，化合物能够在肿瘤细胞抗原存在的情况下抑制目的活性则说明化合物是肿瘤细胞抗原的拮抗剂。另外，可通过使肿瘤细胞抗原与具有膜结合肿瘤细胞抗原受体或重组受体的潜在拮抗剂在合适的条件下组合，通过竞争抑制实验来检测拮抗剂。肿瘤细胞抗原可被标记，如放射性标记，这样结合到受体上的肿瘤细胞抗原分子的数量可用于确定潜在拮抗剂的效应。编码受体的基因可通过本领域技术人员熟知的多种方法鉴定，例如，配基淘选和FACS分类。Coligan等，《当代免疫学手册》(Current Protocols in Immun)，1(2)：第5章，(1991)。优选的是，利用表达克隆，其中多聚腺苷酸化的RNA分离自肿瘤细胞抗原反应性的细胞和构建自该RNA的cDNA文库，将其分成多组，用于转染不对肿瘤细胞抗原产生反应的COS细胞或其他细胞。在玻片上生长的转染细胞暴露于标记的肿瘤细胞抗原。肿瘤细胞抗原可通过各种方式标记，其中包括碘化或插入位点特异性蛋白激酶的识别位点。固定和孵育以后，玻片进行放射自显影分析。鉴定出阳性组，然后通过交互亚分组和重筛选过程分成亚组再转染，最终得到编码推测抗体的单一克隆。
作为鉴定受体的另一种方法，标记的肿瘤细胞抗原可以光亲和连接到表达受体分子的细胞膜或提取制备物上。交联的材料通过PAGE分离，暴露于X射线胶片。切下包含受体的标记复合物，剪切成肽片段，然后进行蛋白微测序。微测序获得的氨基酸序列用于设计一组变性寡核苷酸探针以筛选cDNA文库，从而鉴定出编码推测受体的基因。
在分析拮抗剂的其他实验中，表达受体的哺乳动物细胞或膜制备物在候选化合物存在的条件下与标记的肿瘤细胞抗原共孵育。然后检测化合物增强或阻断这种相互作用的能力。
潜在拮抗剂更特殊的例子包括能结合免疫球蛋白和肿瘤细胞抗原融合蛋白，尤其是抗体，的寡核苷酸，其中包括而不限于多克隆和单克隆抗体和抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体和这些抗体或片段的嵌合或人源化版本，以及人抗体和抗体片段。另外，潜在拮抗剂可能是密切相关的蛋白，例如，能识别受体但不产生效应因而能竞争性地抑制肿瘤细胞抗原的作用的肿瘤细胞抗原的突变形式。
另一种潜在肿瘤细胞抗原是利用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中，例如，通过与靶mRNA杂交以及阻断蛋白质翻译而发挥直接阻断mRNA翻译的作用的反义RNA或DNA分子。反义技术可用于通过三螺旋形成或反义DNA或RNA来控制基因的表达，两种方法都是基于多聚核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，在本文中编码成熟肿瘤细胞抗原的多聚核苷酸序列的5’编码区可用于设计约10到40碱基对长的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸可设计成与基因的参与转录的区互补的序列(三螺旋，参见Lee等，Nucl.Acids Res.，6：3073(1979)；Cooney等，Science，241：456(1988)；Dervan等，Science，251：1360(1991))，从而抑制转录和肿瘤细胞抗原的合成。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，阻断mRNA分子翻译成肿瘤细胞抗原(反义技术—Okano，Neurochem.，56：560(1991)；“寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂”(Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression)(CRC出版社：博卡拉通(Boca Raton)，佛罗里达州，1988)。上述寡核苷酸还可以被运送到细胞从而使反义RNA或DNA在体内表达以抑制肿瘤细胞抗原的合成。当使用反义DNA时，优选翻译起始位点来源的寡脱氧核糖核酸，例如，位于靶基因核苷酸序列约-10到+10位之间的序列。
拮抗肿瘤细胞抗原的另一种方法是利用siRNA技术，其中单链小干扰RNA(siRNA：长度为19-29个核苷酸)用于使基因静默，其中siRNA的作用是指导靶抗原mRNA的裂解(参见Martinez等，Cell(2002)110(5)：563-74)。
潜在拮抗剂包括能结合肿瘤细胞抗原的活性位点、受体结合位点、或生长因子或其他相关结合位点从而阻断肿瘤细胞抗原的正常生物活性的小分子。小分子的例子包括而不限于小肽或肽样分子，优选可溶性肽，以及合成的非肽有机或无机化合物。
核酶是能催化RNA发生特异性裂解的酶性RNA分子。核酶通过与互补靶RNA发生序列特异性的杂交，随后用内切核酸酶切割。潜在RNA靶位内的特异性核酶裂解位点可利用已知的技术进行鉴定。进一步的细节参见Rossi，Current Biology，4：469-471(1994)以及PCT出版物WO 97133551(公开日期1997年9月18日)。
用于抑制转录的三螺旋构型内的核酸分子应该是单链的，由脱氧核糖核苷酸组成。可以设计出这些寡核苷酸的组合物以便于其通过Hoogsteen碱基配对原则促使三螺旋形成，三螺旋形成通常需要在双螺旋的一条链上具有相当长的嘌呤或嘧啶。进一步的细节参见PCT出版物WO 97/33551，同上。
这些小分子可通过上文所讨论的任何一种或多种筛选实验和/或本领域技术人员熟知的其他任何筛选技术来鉴定。
III.制备抗肿瘤细胞抗原的抗体
下面所描述的是可用于本发明的制备抗体的典型技术。用于制备抗体的肿瘤细胞抗原可以是，例如，肿瘤细胞抗原胞外域或其片段的可溶性形式，其中包含所需的表位。另外，在细胞表面表达肿瘤细胞抗原的细胞可用于制备抗体。在另一个实施方式中，利用编码肿瘤细胞抗原的基因进行以DNA为基础的免疫也可用于制备抗体(参见Ramos J.D.A.等，《变态反应》(Allergy)，59卷，5册，2004年3月，539-547(9)页)。可用于制备抗体的其他形式的肿瘤细胞抗原是本领域技术人员所熟知的，
(i)多克隆抗体
抗肿瘤细胞抗原的抗体可包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是技术人员所熟知的。多克隆抗体可通过，例如，一次或多次注射免疫剂，如果需要，加上佐剂，在哺乳动物体内产生。一般来说，免疫剂和/或佐剂可通过多次皮下注射或腹腔内注射给予哺乳动物。免疫剂包括肿瘤细胞抗原或其融合蛋白。将免疫剂连接到已知在被免疫的哺乳动物体内具有免疫原性的蛋白质上将是有益的。这种免疫原性蛋白的例子包括而不限于锁孔蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白以及大豆胰蛋白酶抑制剂。可使用的佐剂的例子包括福氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，合成的海藻糖二霉菌酸酯(trehalosedicorynomycolate))。本领域的技术人员无需特别的实验就可以选择免疫方法。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体得自一群基本同源的抗体，即，抗体群所包含的抗体除了可能天然存在的少量突变之外是一致的。因此，修饰子“单克隆”是指抗体作为不连续抗体混合物的特征。
单克隆抗体可利用杂交瘤方法制备，如Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)所描述的那些方法。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物以刺激淋巴细胞产生或者能够产生与免疫剂特异性结合的抗体。另外，可在体外免疫淋巴细胞。
免疫剂一般包括肿瘤细胞抗原多肽或其融合蛋白。一般而言，如果需要人源的细胞则使用外周血淋巴细胞(PBL)，如果需要非人哺乳动物来源的抗体则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后淋巴细胞与永生化的细胞系用合适的融合试剂融合，如聚乙二醇，以形成杂交瘤细胞[Goding，《单克隆抗体：原理与实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，学术出版社(Academic Press)，(1986)，59-103页]。永生化的细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别啮齿类动物、牛和人源的骨髓瘤细胞。通常利用的是大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基内培养，培养基优选包含一种或多种可抑制非融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRTM)，培养杂交瘤的培养基一般包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，其中的物质可抑制缺乏HGPRT的细胞的生长。
优选的永生化细胞系是那些有效融合的、能支持筛选出的抗体生成细胞稳定高水平表达抗体并且对培养基如HAT培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，例如，可以从加州圣地亚哥的索尔克研究所细胞配送中心和弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心获得。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也被用于制备人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，《单克隆抗体制备技术和应用》(MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications)纽约MD有限公司(MarcelDekker，Inc.，New York)，(1987)，51-63页]。
然后分析培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对肿瘤细胞抗原的单克隆抗体。优选的是，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀技术或体外结合实验来确定，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)。这种技术和分析方法是本领域熟知的。例如，单克隆抗体的结合亲和力可通过Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107：220(1980)所描述的Scatchard分析来确定。
利用常规的免疫球蛋白纯化方法如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱可以从培养基或腹水中分离或纯化亚克隆分泌的单克隆抗体。
单克隆抗体还可以通过重组DNA方法制备，如美国专利号4816567所描述的那些方法。利用常规方法可以很容易地分离和测序编码本发明的单克隆抗体的DNA(例如，通过利用能特异性结合编码小鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞可作为这种DNA的优选来源。DNA一旦被分离出来，就可以插入到表达载体内，然后将载体转染到宿主细胞如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不会另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞内，使其在重组的宿主细胞内合成单克隆抗体。DNA也可以是经过修饰的，例如，用编码人重链和轻链恒定区的序列取代同源的小鼠序列[美国专利号4816567；Morrison等，同上]，或者将编码全部或部分非免疫球蛋白多肽的序列共价连接到免疫球蛋白编码序列上。这种非免疫球蛋白序列可以被本发明的抗体的恒定区或本发明抗体的一个抗原结合位点的可变区取代，形成嵌合的双价抗体。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域熟知的。例如，一种方法包括重组表达免疫球蛋白轻链和经修饰的重链。通常重链在Fc区的任一一点被截短以防止重链交联。另外，相关的半胱氨酸残基被其他氨基酸取代或者被删除以避免交联。
在鉴定出理想的杂交瘤细胞以后，可以通过有限稀释过程对克隆进行亚克隆并用标准方法培养[Goding，同上]。用于此目的的合适培养基包括，例如，DMEM和RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞还可以哺乳动物腹水的形式在体内生长。
分析培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对抗原的单克隆抗体。优选的是，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀技术或体外结合实验来确定，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)。在鉴定出能产生具有理想特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞以后，可以通过有限稀释过程对克隆进行亚克隆并用标准方法培养[Goding，《单克隆抗体：原理与实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，59-103页(学术出版社，(1986))]。用于此目的的合适培养基包括，例如，DMEM和RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞还可以哺乳动物腹水肿瘤的形式在体内生长。
例如，单克隆抗体的结合亲和力可以通过Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)描述的Scatchard分析方法确定。
亚克隆分泌的单克隆抗体适于利用常规的抗体纯化方法如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱从培养基、腹水或血清中分离。
利用常规方法可以很容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA(例如，通过利用能特异性结合编码小鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可作为这种DNA的优选来源。DNA一旦被分离出来，就可以插入到表达载体内，然后将载体转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不会另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞内，使其在重组的宿主细胞内合成单克隆抗体。有关在细菌内重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)以及Pluckthun，Immunol.Revs.，130：151-188(1992)。
在其他实施方式中，可以从利用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)描述的技术制备的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离小鼠和人抗体的方法。以后出版的文献描述了高亲和力(nM范围)人抗体的制备方法，例如通过链穿梭技术(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及以联合感染和体内重组为策略构建很大的噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是对分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的有效取代。
DNA也可以是经过修饰的，例如，用编码人重链和轻链恒定区的序列取代同源的小鼠序列[美国专利号4816567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984)]，或者将编码全部或部分非免疫球蛋白多肽的序列共价连接到免疫球蛋白编码序列上。
一般来说，这种非免疫球蛋白序列可以抗体的恒定区或抗体的一个抗原结合位点的可变区取代，形成嵌合的双价抗体，其中包含一个具有抗原特异性的抗原结合位点和具有另一种抗原特异性的另一个抗原结合位点。
(iii)人源化抗体
本发明的抗肿瘤细胞抗原的抗体还包括人源化的抗体或人抗体。非人(例如，小鼠)抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合序列)，其中包含非人免疫球蛋白来源的小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者补体决定区(CDR)的残基被具有理想特异性、亲和力和结合能力的非人物种(供者抗体)抗体如小鼠、大鼠、兔或兔的CDR的残基所取代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被相应的非人残基所取代。人源化抗体还可能包含既不见于受者抗体又不见于输入的CDR或框架序列的残基。一般而言，人源化抗体包含至少一个，一般两个可变区的几乎全部序列，其中非人免疫球蛋白可变区相应的CDR区的全部或几乎全部序列以及FR区的全部或几乎全部序列是人免疫球蛋白共有序列的可变区。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白恒定区的一部分。[Jones等，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)]。
人源化非人抗体的方法在本领域已有描述。一般而言，人源化抗体包含插入到其中的一个或多个非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它们一般来自于“输入”可变区。人源化可基本按照Winter及其同事的方法(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))操作，用人抗体的相应序列取代超变区序列。据此，这种“人源化”抗体就是嵌合抗体(美国专利号4816567)，其中完整的人可变区只有很少被非人物种来源的相应序列取代。实际上，人源化抗体一般都是某些超变区残基和可能的某些FR残基被啮齿类抗体类似位点的残基所取代的人抗体。
选择用于制备人源化抗体的人可变区，既包括轻链也包括重链，对于降低抗原性来说是十分重要的。根据所谓的“最佳适配”法，从已知的整个人可变区序列文库中筛选啮齿类抗体可变区的序列。与啮齿类抗体最接近的人序列用作人源化抗体的框架区(FR)(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法使用具有特定亚群轻链和重链的所有人抗体的共有序列来源的特定框架区。同一框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。
抗体人源化后能够保持对抗原的高亲和力以及其他优秀的生物学特性也是十分重要的。为达到此目的，根据优选的方法，人源化抗体通过利用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念化的人源化产品的过程来制备。三维免疫球蛋白模型通常都是现有的，也是本领域技术人员所熟知的。现在有阐释和显示所选择的候选免疫球蛋白可能的三维构型的计算机程序。检查这些显示可对残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中可能的任务进行分析，即，分析残基对候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的影响。以这种方式可以从受者和输入序列中筛选出FR残基并进行组合以完成理想的抗体特征，如对靶抗原的亲和力升高。一般来说，超变区的残基直接而最实质地参与影响抗原结合。
抗体人源化的另一种方法依赖于对抗体可变区上那些氨基酸的鉴定，这些氨基酸可被修饰而不会使可变区对抗原的天然亲和力消失，同时可以降低异源物种相关的抗体的免疫原性。经过修饰的氨基酸是那些对于抗原结合来说不是关键的但是可以暴露于免疫原性刺激因子的氨基酸(参见，例如，WO931179)。
利用上述已知的筛选和/或突变方法可以对抗体进行亲和力成熟。优选的亲和力成熟抗体的亲和力比制备成熟抗体的起始抗体(一般是小鼠的，人源化的或人的抗体)的亲和力高5倍，更优选的是10倍，甚至20倍或30倍。
各种形式的人源化抗体或亲和力成熟抗体都包括在本发明的范围之内。例如，人源化抗体或亲和力成熟抗体是抗体片段，如Fab，可选的是它可以与一种或多种细胞毒剂连接以制备免疫偶联物。另外，人源化抗体或亲和力成熟抗体可以是完整抗体，如完整的IgG1抗体。
(iv)人抗体
作为人源化的取代可以制备人抗体。例如，现在可以制备出在缺少内源性免疫球蛋白产生的情况下经过免疫以后能够产生全套人抗体的转基因动物(例如，小鼠)。例如，有文献报道嵌合的和种系突变的小鼠内发生抗体重链结合区(JH)基因的同源缺失可导致内源性抗体的产生被完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因比对转移到这种种系突变的小鼠内可使小鼠在接种抗原后产生人抗体，参见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；以及美国专利号5591669、5589369和5545807。
另外，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature348：552-553(1990))可用于在体外从未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)区全套基因制备抗体和抗体片段。根据这种技术，抗体V区基因被克隆到丝状噬菌体如M13或fd的主要或小包被蛋白基因的阅读框架内，作为功能性抗体片段展示到噬菌体颗粒的表面。由于丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于抗体的功能特性进行的筛选也会筛选出编码具有那些特性的抗体的基因。因此，噬菌体可模拟B细胞的某些特性。噬菌体展示可以各种方式完成；参见综述，例如，Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。几种来源的V基因片段可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)从免疫小鼠脾来源的V基因小随机组合文库中分离出了不同比对的抗唑酮抗体。按照Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)描述的技术可以构建未免疫人供者来源的全套V基因并分离出抗不同比对的抗原(包括自身抗原)的抗体。也可参见美国专利号5565332和5573905。
如上所述，人抗体也可通过体外活化的B细胞制备(参见美国专利号5567610和5229275)。
(v)抗体片段
有许多技术被开发出来用于制备抗体片段。在传统上，这些片段是通过蛋白酶消化完整抗体获得的(参见，例如，Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)；以及Brennan等，Science，229：81(1985))。但是，现在是直接利用重组宿主细胞生成这些片段。例如，可以从上述抗体噬菌体文库中分离抗体片段。另外，Fab′-SH片段可直接从大肠杆菌中回收，然后化学连接形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology10：163-167(1992))。按照另一种方法，F(ab′)2片段可以直接从重组的宿主细胞培养物中分离。制备抗体片段的其他技术是本领域技术人员所熟知的。在其他实施方式中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5571894和5587458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利号5641870所描述的。这种线性抗体片段可以是单特异性的，也可以是双特异性的。
结合区-免疫球蛋白融合蛋白也包括在本发明中。在这些构建体中，构建的融合蛋白包含目的抗原的结合区，这个结合区融合到抗体的铰链区和免疫球蛋白CH2和CH3区上，该蛋白可诱导ADCC和/或CDC，同时主要以单体的形式存在，因为其形成二硫键连接的多聚体的能力受损(参见US20030118592)。这些融合蛋白可通过重组技术高水平地制备。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体是与至少两个不同表位有结合特异性的抗体。典型的双特异性抗体可结合肿瘤抗原蛋白的两个不同表位。另外，抗肿瘤抗原臂可与白细胞上的激发分子如T细胞受体(如CD2或CD3)、IgG的Fc受体(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)结合的臂连接，从而将细胞防御机制集中到肿瘤抗原表达细胞上。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位到表达肿瘤抗原的细胞上。这些抗体拥有肿瘤抗原结合臂和细胞毒剂(如皂草素、抗干扰素α抗体、长春花碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或方式同位素半抗原)结合臂。双特异性抗体可作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)制备。
制备双特异性抗体的方法是本领域所熟知的。全长双特异性抗体的传统制备方法是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个链具有不同的特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)可产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化是相当麻烦的，通常通过亲和层析步骤来完成，产率也低。相似的方法见WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)的描述。
具有理想结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)被融合到免疫球蛋白恒定区序列上。融合优选与免疫球蛋白重链恒定区融合，其中包含至少铰链区CH2和CH3区的一部分。优选的是包含轻链结合所必须的位点的第一重链恒定区(CH1)，出现在至少一个融合蛋白上。编码免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA以及，如果需要，包括编码免疫球蛋白轻链的DNA，被插入到表达载体内，共转染到合适的宿主有机体内。有关制备双特异性抗体的进一步细节参见，例如，Suresh等，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，121：210(1986)。
按照WO 96/27011所描述的另一种方法，一对抗体分子之间的界面可以经过改造以使从重组细胞培养物中回收的异源二聚体所占比例达到最大值。优选的界面包含至少抗体恒定的CH3区的一部分。在这种方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。用较小的氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链会在第二抗体的界面上产生相同或相似尺寸侧链对大侧链的补偿“空洞”。这为提高杂合二聚体的产率使其超过其他不需要的终产物如同源二聚体提供了一个机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源结合的”的抗体。异源结合的抗体由两个共价结合的抗体组成。这种抗体已被用于，例如，将免疫系统细胞靶向到不需要的细胞(美国专利号4676980)以及用于HIV感染的治疗(WO 91/00360，WO92/200373和EP 03089)。本发明还涉及在体外用合成蛋白质化学领域已知的方法来制备抗体，其中包括那些使用交联剂的方法。例如，可通过二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的例子包括亚氨酸硫醇盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰胺(methyl-4-mercaptobutyrimidate)以及，例如，美国专利号4676980所描述的那些。
双特异性抗体可以全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)来制备。利用抗体片段制备双特异性抗体的技术也可见于文献的描述。例如，可以利用化学连接的方法制备双特异性抗体。Brennan等，Science，229：81(1985)描述了一种方法，其中完整抗体通过蛋白酶裂解制备出F(ab′)2片段。这些片段在二巯基复合试剂亚砷酸钠存在的条件下被还原以稳定连位二巯基化合物，防止分子间二硫键形成。产生出的Fab′片段再被转化成硫代硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。一个Fab′-TNB衍生物通过与巯基乙胺的还原反应再转化成Fab′-巯基，与等摩尔的其他Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。所制备出的双特异性抗体可作为试剂用于特异性地固化酶。
Fab′-SH片段可直接从大肠杆菌回收，该片段通过化学方法偶联可形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的制备方法。每一种Fab′片段都独自从大肠杆菌中分泌，在体外经过直接化学偶联后形成双特异性抗体。因此所形成的双特异性抗体能够结合过量表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞，并且能够激发人细胞毒淋巴细胞抗人乳腺肿瘤靶位的溶解活性。
直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已有报道。例如，利用亮氨酸拉链可制备出双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合的方式连接到两个不同抗体的Fab′部分。抗体同源二聚体在铰链区被还原形成单体，然后再氧化形成抗体异源二聚体。这种方法还被用于制备抗体同源二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)所描述的“双功能抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的机制。片段包含重链可变区(VH)，重链可变区通过连接子连接到轻链可变区(VL)上，由于连接子太短无法使同一条链上的两个区配对。相应的，一个片段的VH和VL区被迫与另一片段的互补VL和VH区配对，从而形成两个抗原结合位点。利用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的其他策略也已有报道。参见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。
本发明涉及二价以上的抗体。例如，可以制备三重特异性的抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。
典型的双特异性抗体可结合本文所述的一个给定肿瘤细胞抗原上的两个不同表位。另外，抗肿瘤细胞抗原臂可与白细胞上的激发分子如T细胞受体(如CD2、CD3、CD28或B7)、IgG的Fc受体(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)结合的臂连接，从而将细胞防御机制集中到表达特定肿瘤细胞抗原细胞上。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位到表达特定肿瘤细胞抗原的细胞上。这些抗体拥有肿瘤抗原结合臂和能结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。另一种目的双特异性抗体可结合肿瘤细胞抗原，并且还能结合组织因子(TF)。
(vii)其他氨基酸序列修饰
本发明还涉及本文所述的抗肿瘤细胞抗原抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将合适的核苷酸改变引入到抗肿瘤细胞抗原抗体的核酸内或者通过肽合成可以制备出抗肿瘤细胞抗原抗体的氨基酸序列变体。这种修饰包括，例如，抗肿瘤细胞抗原抗体内残基的缺失和/或插入和/或取代。缺失、插入和取代的任意组合都可使用以获得最后的构建体，只要最后的构建体具有理想的特征。氨基酸改变还可以改变抗肿瘤细胞抗原抗体的翻译后处理过程，例如改变糖基化位点的数目和位置。
一种用于鉴定抗肿瘤细胞抗原抗体的某个残基或区是否是优选的突变位点的有用方法被称为“丙氨酸扫描突变”(＂alanine scanning mutagenesis)，如Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)所描述。其中，残基或靶残基的基团被鉴定(例如，带电荷的残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并被中性的或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代以影响氨基酸与肿瘤细胞抗原的相互作用。那些被证明对取代具有功能敏感性的氨基酸位置再通过在取代位点上进一步引入突变或引入其他突变来确认。因此，虽然引入氨基酸序列改变的位点要被预先确定，但是突变的本质性质无法预先确定。例如，为了分析给定位点上突变的表现，要在靶编码子或编码区上进行丙氨酸扫描或随机突变，然后筛选表达的具有理想活性的抗肿瘤细胞抗体变体。
氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，长度范围从一个残基到包含100或100以上残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括带N端蛋氨酰残基的抗肿瘤细胞抗原抗体，或者与细胞毒多肽融合的抗体。抗肿瘤细胞抗原抗体分子的其他插入变体包括抗肿瘤细胞抗原抗体的N或C端与能提高抗体的血清半衰期的酶(如ADEPT)或多肽。
另一类变体是氨基酸取代突变。这些抗肿瘤细胞抗原抗体分子的变体包含至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。最让人感兴趣的取代突变位点包括超变区，但是FR改变也可以考虑。保守取代列于下面的表1“优选取代”中。如果这种取代可导致生物活性的改变，那么表1中被称为“典型取代”的更多实质改变，或者如下文在氨基酸分类部分中更加详细的描述，可以被引入并进行产物筛选。
表1
原始残基          典型取代                          优选取代
Ala(A)            val；leu；ile                     val
Arg(R)            lys；gln；asn                     lys
Asn(N)            gln；his；asp，lys；arg           gln
Asp(D)            glu；asn                          glu
Cys(C)            ser；ala                          ser
Gln(Q)            asn，glu                          asn
Glu(E)            asp；gln                          asp
His(H)            asn；gln；lys；arg                arg
Ile(I)            leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸 leu
Leu(L)            正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe ile
Lys(K)            arg；gln；asn                     arg
Met(M)            leu；phe；ile                     leu
Phe(F)            leu；val；ile；ala；tyr           tyr
Pro(P)            ala                               ala
Ser(S)            thr                               thr
Thr(T)          ser                               ser
Trp(W)          tyr；phe                          tyr
Tyr(Y)          trp；phe；thr；ser                phe
Val(V)          ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸 leu
抗体生物特性的实质改变可通过筛选取代来完成，其中的取代在以下方面具有明显不同的效应：(a)维持取代区多肽骨架的结构，例如，形成折叠或螺旋构型，(b)维持分子在靶位上的电荷或疏水性，或(c)维持侧链的主体。天然残基根据常见的侧链特性可分成以下几组：
1)疏水性的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
2)中性亲水性的：cys，ser，thr；
3)酸性的：asp，glu；
4)碱性的：asn，gln，his，lys，arg；
5)影响侧链定位的残基：gly，pro；以及
6)芳香族残基：trp，tyr，phe。
非保守取代必需用这些类别中一类的成员与其他类别的成员进行交换。
这种取代残基也可以被引入到保守取代位点，或者更优选的，被引入到其余(非保守的)位点。
不参与维持抗肿瘤细胞抗原抗体正确构型的所有半胱氨酸残基都可以被取代，一般是用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性，阻止异常交联发生。相反，半胱氨酸键可以被加到抗体上以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段如Fv片段时)。
一类特别优选的取代特别包括取代亲本抗体(例如，人源化的抗体或人抗体)的一个或多个超变区残基。一般来说，筛选出来用于进一步开发的变体的生物学特性相对于其来源的亲本抗体都有改善。制备这种取代突变的一种常规方法是利用噬菌体展示技术进行亲和力突变。简言之，突变几个超变区位点(如，6-7个位点)使每个位点上都产生所有可能的氨基酸取代。这样制备出的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒上展示出来，与包装到每个颗粒内的M13基因III的产物形成融合蛋白。然后根据本文所述的生物活性(如结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体。为了鉴定候选超变区位点发生的修饰，可进行丙氨酸扫描突变以鉴定出对抗原结合产生明显影响的超变区残基。另外，分析抗原抗体复合物的晶体结构有利于确定抗体和人肿瘤细胞抗原之间的接触点。根据本文描述的技术，这种接触残基及其邻近残基是取代的候选残基。一旦这种变体被制备出来，就按照本文描述的方法筛选一组变体，在一种或多种相关分析实验中展示优越特性的抗体可被筛选出来用于进一步开发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原有糖基化模式。改变意味着抗体的一个或多个糖基基序的缺失、和/或抗体上不存在的一个或多个糖基化位点的添加。
抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指糖基基序连接到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是糖基基序经酶催化连接到天冬酰胺侧链上的识别序列。因此，多肽上的这些三肽序列只要有一个存在就可以成为潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指一个糖基N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖连接到羟氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸也可以使用。
在抗体上添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而使其包含一个或多个上述三肽序列来方便地实现(对于N-连接糖基化位点来说)。改变还可以通过在抗体的原始序列上添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代(对于O-连接糖基化位点来说)。
编码抗肿瘤细胞抗原抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可用本领域已知的方法制备。这些方法包括而不限于从天然资源中分离(在出现天然氨基酸序列突变的情况下)或者通过寡核苷酸介导的(位点特异性的)突变制备，以及盒式突变先前制备的变体或抗肿瘤细胞抗原抗体的非突变版本。
为了提高抗体的血清半衰期，人们可以将一个补救的受体结合表位插入到抗体(尤其是抗体片段)上，如美国专利号5739277所述。本文所用的术语“补救抗体结合表位”是指负责提高IgG分子在体内的血清半衰期的IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区的表位。
(viii)亲和力成熟
提高本发明抗体的亲和力可能是必需的，本领域有许多已知的方法可完成这一任务。例如，可利用噬菌体表达的抗体文库进行著名的逐步突变，其中为了提高抗体亲和力表达和筛选包含单一突变的所有6个重链和轻链CDR(参见Wu等，(1998)Proc Natl Acad Sci USA95(11)：6037-42)。另一种受关注的方法被称为“热点突变”，其中在最可能提高亲和力的位点上随机引入突变(参见Ho等，(2005)J.Biol.Chem.280：607-17)。备受关注的方法如这些方法在只需要筛选小文库时是有优势的，但是在需要后期集中筛选所有突变组合才能获得最佳克隆时却没有优势。
实现抗体亲和力成熟的第二种通用方法依赖于几种不同类型的展示技术中的一种技术的应用。在这些技术中，百万级的抗体变体在适合那些变体提高亲和力的条件下被展示和筛选。展示系统通常与某些导入随机突变的方法如错配PCR突变技术配对使用。可用于本发明的展示技术包括而不限于核糖体-、酵母-、噬菌体-、微珠-、蛋白-DNA连接-、细菌-以及逆转录病毒展示技术。据报道，利用这些技术可将抗体亲和力提高1000倍，可以获得亲和力低到48fM的抗体。综述请参考Hoogenboom(2005)Nature Biotechnology 23：1105-16。
另一种被称为“间断突变(look-through matugenesis)”的方法是一种多维突变方法，可通过检测CDR区内的化学成分分布以及定位氨基酸侧链化学成分的协同贡献来同时评价和优化组合突变(参见Rajpal等，(2005)Proc Natl AcadSci USA 102(24)：8466-71)。
(ix)效应功能改造
修饰与效应功能有关的本发明的抗体是我们所期望的，例如，以此来增强抗体所具有的抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒作用(CDC)。可以通过在抗体的Fc区引入一个或多个氨基酸取代来达到此目的。另外，半胱氨酸残基可以被引入到Fc区，从而允许在该区形成链间二硫键(综述参见：Weiner和Carter(2005)Nature Biotechnology 23(5)：556-557)。因此，由此制备出的同源二聚体抗体的内化能力得以提高，和/或补体介导的细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)得以增强。参见Caron等，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。抗肿瘤活性增强的同源二聚体抗体还可以用异源双功能交联子来制备，如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)的描述。另外，抗体可以经过改造使其包含两个Fc区，从而增强其补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-CancerDrug Design 3：219-230(1989)。可以制备出Fc区内含有经修饰的糖基化位点抗体。例如，减少糖链内岩藻糖的含量可以提高抗体的内在ADCC活性(例如，参见WO0061739所描述的BioWa’s PotillegentTMADCC增强技术)。另外，可以在细胞系内制备出添加了二等份非岩藻糖化寡糖链的抗体(参见US6602684)。这两种技术都可以制备出对效应细胞的FcγIIIa受体亲和力增加从而导致ADCC效应增强的抗体。还可以通过改造Fc区来改变本发明抗体的血清半衰期。Abdeg是一种经过改造对FcRn胎儿抗体亲和力升高的抗体，该抗体的半衰期比常规IgG短(参见Vaccaro等，(2005)Nature Biotechnology 23(10)：1283-1288)。为了提高半衰期，可以将特异性突变引入Fc区，从而降低与FcRn的亲和力(参见Hinton等，(2004)J Biol Chem297(8)：6213-6216)。本发明的抗体还可以经过修饰后利用其他机制来改变血清半衰期，例如添加血清白蛋白结合区(dAb)(例如，参见WO05035572)。经过改造的Fc区(参见，例如，XmABTM，WO05077981)也可以被插入到本发明的抗体内以改善ADCC活性，改变血清半衰期或提高抗体蛋白的稳定性。
(x)免疫偶联物
本发明还涉及包含抗体的免疫偶联物(immunoconjugate)，其中的抗体被连接到细胞毒剂如化疗药物、毒素(例如，酶催化活化毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶催化活化毒素，其中包括片段和/或其变体)、前药，或者其他试剂如免疫调节剂、激素或激素拮抗剂以及酶或酶抑制剂，光活化治疗剂如发色团或染料，血管生成抑制剂，其他抗体或其片段，或放射性同位素(即，放射性偶联物)上(综述参见Schrama等，(2006)Nature Reviews 5：147-159)。
用于制备这种免疫偶联物的化疗剂已在上文描述。本文还包括抗体和一种或多种小分子毒素如刺孢霉素、美登素(美国专利号5208020)、单端孢霉酮、duocarmycin(也被称为“超强毒素”，参见Lillo等，(2004)Chemistry and Biology11；897-906页)和CC-1065的偶联物。
在本发明的一个优选实施方式中，抗体被连接到一个或多个美登素分子(例如，约1到10个美登素分子连接一个抗体分子)上。例如，美登素可以转化成May-SS-Me，后者被还原成May-SH3，然后与修饰的抗体反应(Chari等，CancerResearch 52：127-131(1992))生成美登素-抗体免疫偶联物。另外，被筛选的药物可以是高活性的美登素衍生物DM1(N2’-脱乙酰-N2’-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素)(参见，例如，WO02/098883，2002年12月12日公开)，该分子的IC50约为10-11M(综述参见，Payne(2003)Cancer Cell 3：207-212)，或DM4(N2-脱乙酰二乙酰-N2′(4-甲基-4-巯基-1-氧苯基)-美登素)(参见，例如，2004年12月2日公开)。
另一种感兴趣的免疫偶联物包含连接有一个或多个刺孢霉素分子的抗肿瘤细胞抗原抗体。抗生素的刺孢霉素家族能以亚pm的浓度产生双链DNA断裂。可使用的刺孢霉素结构类似物包括而不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等，Cancer Research 53：3336-3342(1993)和Lode等，CancerResearch 58：2925-2928(1998))。也可参见，美国专利号5714586；5712374；5264586；以及5773001，本文已特地纳入作为参考。
还有另外一种方法用于连接肿瘤细胞抗原抗体和前药，可以被许多癌中过量表达的酶催化而以活化形式释放出来。例如，可以利用阿霉素的前药形式制备抗体偶联物，其中活性组分被纤溶酶催化后从偶联物中释放出来。已知许多癌组织都过量表达纤溶酶(参见Decy等，(2004)FASEB Journal 18(3)：565-567)。
可用于本发明的酶催化活化毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A(链(来自绿脓杆菌)、假单胞杆菌内毒素、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、核糖核酸酶(Rnase)、脱氧核糖核酸酶(Dnase)、美洲商陆抗病毒蛋白、苦瓜素抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、新霉素和单端孢菌毒素(tricothecene)。参见，例如，WO93/21232，公开日为1993年10月28日。特别优选的是内在免疫原性低且作用机制(例如，通过细胞静止机制的细胞毒作用机制)为降低癌细胞变成对毒素耐受的细胞的几率的毒素。
本发明的抗体与免疫调节剂之间形成的偶联物也包括在本发明的范围之内。例如，可以使用免疫刺激性寡核苷酸。这些分子是高效的免疫原，能够刺激抗原特异性的抗体反应(参见Datta等，(2003)Ann N.Y.Acad.Sci1002：105-111)。其他免疫刺激性化合物包括干细胞生长因子如“S1因子”、淋巴毒素如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子如白细胞介素、集落刺激因子(CSF)如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素(IFN)如干扰素α或γ、红细胞生成素和血小板生成素。
许多放射性同位素可用于制备放射性标记的抗肿瘤细胞抗原抗体。治疗性放射性偶联物可利用P-32、P-33、Sc-47、Fe-59、Cu-64、Cu-67、Se-75、As-77、Sr-89、Y-90、Mo-99、Rh-105、Pd-109、Ag-I11、I-125、I-131、Pr-142、Pr-143、Pm-149、Sm-153、Th-161、Ho-166、Er-169、Lu-177、Re-186、Re-188、Re-189、Ir-194、Au-198、Au-199、Pb-211、Pb-212、以及Bi-213、Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-ill、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m、Ir-192、Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Fm-255及其组合来制备。另外，硼、钆或铀原子也可以使用，其中硼原子优选B-10，钆原子优选Gd-157，铀原子优选U-235。
优选的是，治疗性放射性核素偶联物包含能量在20到10,000keV之间的放放射性核素。放射性核素可以是能量低于1000keV的俄歇发射体、能量在20到5000keV之间的P发射体或者能量在2000到10,000keV之间的α或“a”发射体。
诊断性放射性偶联物可以包含是γ-、β-或正电子发射同位素的放射性核素，其中放射性核素的能量在20到10,000keV之间。放射性核素和选自如下一组：18F、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、68Ga、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86y、89Zr、94mTc、IIn、120i、124i、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67CU、67Ga、75Se、97Ru、99mTc、I11In、114mIn、123i、125i、131i、169、197Hg和21′T1。
其他类型的诊断性免疫偶联物也包括在本发明的范围之内。本发明的抗体或片段可连接到是光活化剂或造影剂的诊断剂上。光活化化合物包括化合物如发色团或染料。造影剂可以是，例如，顺磁性离子，其中离子包括选自如下一组的金属：铬(III)、镁(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)。造影剂还可以是用于X射线技术或计算机断层扫描术的射线不透性化合物，如碘、铱、钡、镓、铊化合物。射线不透性化合物可选自如下一组：钡、泛影酸、乙碘油、枸橼酸镓、碘卡明酸、碘卡酸、碘达酸、胆影酸、碘撒酸、碘磺拉胺(iogulamide)、碘海索、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘砜葡胺、碘琥酸(iosemetic acid)、碘酞硫、碘得酸(iotetric acid)、碘拉酸、碘托酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影钠、丙碘酮和氯化亚铊。另外，诊断性免疫偶联物可包含超声增强剂如与本发明的抗体连接的充气脂质体。诊断性免疫偶联物可用于各种方法，其中包括而不限于肿瘤或癌诊断和检测的术中、内窥镜或血管内方法。
抗体和细胞毒剂的偶联物可利用各种双功能蛋白偶联剂来制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺苄甲基)环己烷-1-羰化物、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯(dimethyl adipimidate HCL))、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰)己二胺(bis(p-azidobenzoyl)hexanediamine))、二重氮盐(bis-diazonium)衍生物(如双-(对-二重氮苯甲酰)-乙二胺(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))、二异氰酸酯(如亚苄基2，6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按照Vitetta等，Science 238：1098(1987)描述的方法制备。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺戊酸(isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid)(MX-DTPA)是一个典型的用于将放射性核苷酸连接到抗体上的螯合剂。参见WO94/11026。连接子可以是促使细胞毒药物在细胞内释放的“可裂解连接子”。例如，可以使用酸脆性连接子、肽酶敏感性连接子、二甲基连接子或含二硫键的连接子(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992))。试剂还可以通过糖类基序连接到本发明的抗体上。
另外，也可以制备包含抗肿瘤细胞抗体和细胞毒剂的融合蛋白，例如，通过重组技术或肽合成技术。
在另一个实施方式中，抗体可以连接到“受体”(如链亲和素)上以用于肿瘤预打靶，其中先将抗体-受体偶联物给予患者，然后利用清除因子从循环中去除未结合的偶联物，再给予连接有细胞毒剂(例如，放射性核苷酸)的配基(例如，抗生物素蛋白)。
抗肿瘤细胞抗原抗体还可以连接到只在靶细胞溶酶体内释放的细胞毒分子上。例如，药物单甲基奥瑞斯他汀E(monomethyl auristatin E)(MMAE)可通过缬氨酸-瓜氨酸连接子连接，该连接子可在抗体偶联物内化后被蛋白水解的溶酶体酶组织蛋白酶B裂解(参见，例如，WO03/026577，2003年4月13日公开)。另外，可以利用具有腙功能基团的酸脆性连接子将MMAE连接到抗体上，其中腙功能基团作为可裂解基序(参见，例如，WO02/088172，2002年11月11日公开)。
(xi)抗体依赖的酶介导的前药治疗(ADEPT)
本发明的抗体还可以通过将抗体连接到可将前药(例如，肽基化疗药，参见WO81/01145)转化成有活性的抗癌药物的前药活化酶上用于ADEPT。参见，例如，WO 88/07378和美国专利号4975278。
可用于ADEPT的免疫偶联物中的酶组分包括能够作用于前药并以这种方式将前药转化成其具有更高活性的细胞毒形式的任何酶。
可用于本发明的方法中的酶包括而不限于用于将含磷酸盐的前药转化成游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸盐的前药转化成游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将非毒性的5-氟半胱氨酸转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的半胱氨酸脱氨酶；用于将含肽的前药转化成游离药物的蛋白酶如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；用于转化含D氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰羧肽酶；用于将糖基化前药转化成游离药物的糖链裂解酶如β-半乳糖苷酶和神经酰胺酶；以及用于将氨基氮分别衍生苯氧乙酰基或苯乙酰基的药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。另外，具有酶活性的抗体，在本领域中也被称为“抗体酶”，可用于将本发明的前药转化成游离的活性药物(参见，例如，Massey，Nature 328：457-458(1987))。抗体-抗体酶偶联物可按照本文所述的方法制备，用于将抗体酶转移给肿瘤细胞群。
本发明的酶可通过本领域熟知的技术如上述异源双功能交联剂共价结合到抗肿瘤细胞抗原抗体上。另外，利用本领域熟知的重组DNA技术可以构建融合蛋白，其中融合蛋白至少包含连接到本发明的酶的至少功能活性部分的本发明抗体的抗原结合区(参见，例如，Neuberger等，Nature，312：604-608(1984)。(xii)其他抗体修饰
本文还涉及抗体的其他修饰。例如，抗体可连接到各种非蛋白聚合物上，例如，聚乙二醇、聚丙烯甘油、聚氧烷烯或聚乙二醇和聚丙烯甘油的共聚物。抗体还可以被包裹到胶体药物转运系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳化剂、纳米颗粒和纳米囊)或微乳化剂的微囊内，其中微囊可通过凝聚技术或界面聚合法(例如，分别制备羟甲基纤维素或明胶微囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)制备。这种技术在《雷明顿药物科学》(Remington′s PharmaceuticalSciences)，第16版，Oslo，A.编辑，(1980)中有描述。
本文所描述的抗肿瘤细胞抗原抗体还可以制备成免疫脂质体。包含抗体的脂质体可利用本领域熟知的方法制备，例如，Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利号4485045和4544545；以及1997年10月23日公开的WO97/38731所描述的方法。美国专利号5013556描述了循环时间延长的脂质体。
特别有用的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的反相蒸发方法制备。通过一定孔径的滤膜抽提就可以得到具有理想直径的脂质体。本发明的抗体的Fab′片段可按照Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)描述的方法通过二硫键互变反应连接到脂质体上。可选的是，化疗药物也可以包含在脂质体内。参见Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
可以构建包含本发明抗体的诊断性或治疗性融合蛋白。这些融合蛋白可以包含来源于本发明抗体的至少两个抗肿瘤细胞抗原结合区，或者包含一个融合到能结合其他目的表位的结合区上的抗肿瘤细胞抗原结合区。这个其他表位可以是癌相关表位。这些融合蛋白还可以是免疫偶联物，由全长抗体或其片段组成。
(IV)筛选具有理想特性的抗体
制备抗体的方法已在上文描述。人们可以根据描述进一步选择具有某种理想生物学特征的抗体。
为了鉴定能促进细胞死亡的抗体，可以利用表达肿瘤细胞抗原和本发明的抗体的癌细胞进行体外试验。本领域熟知的一种分析方法是CellTiter 96水性非放射性细胞增殖试验(CellTiter 96 Aqueous Cell Non-radioactive Cellproliferation assay)(Promega，编号G5421)。在这种分析方法中，利用了一种新型的四唑化合物[3-(4，5-二甲噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐，MTS(a)]溶液和一种质子偶联剂(吩嗪硫酸甲酯)PMS。MTS可被细胞生物降解成可溶于组织培养基中的甲月替产物。无需其他处理就可以直接从96孔分析板测定甲月替产物在490nm处的吸光度。MTS向水溶性的甲月替产物的转化可由代谢活跃的细胞内所含有的脱氢酶完成。根据490nm处吸光度值测定的甲月替产物的量与培养基中的活细胞数成正比。另一种优选分析方法是CytoTox96试验(Promega，编号G1780)，该方法结合偶联酶催化分析可定量测定培养物上清中释放的乳酸脱氢酶(LDH)，其中偶联酶催化分析可将四唑盐(INT)转化成红色的甲月替产物。所形成的颜色的量与裂解的细胞数成正比。利用标准的96孔板计数仪读取可见波长吸光度数据。
鉴定以细胞静止方式而不是细胞毒方式发挥作用的抗体可通过测定处理靶细胞培养物的活力并与未处理对照培养物比较来完成。利用本领域熟知的方法可检测活力，如
Figure A200780016191D0057184425QIETU
细胞活力分析或
Figure A200780016191D0057184436QIETU
发光细胞活力分析(Promega，编号分别为G8080和G5750)。与对照培养物相比，如果处理可导致细胞数下降而没有出现细胞死亡的现象，则抗体可以被认为是细胞静止的，其中细胞死亡现象可通过上面描述的方法测定。
为了鉴定可以促进ADCC的抗体，可以按照本领域熟知的一种分析方法进行体外筛选试验。一种优选的分析方法是体外ADCC试验：为了制备51Cr标记的靶细胞，在组织培养板上培养肿瘤细胞系，用PBS配制的10mM EDTA收获细胞。消化下的细胞用细胞培养基洗涤两次。细胞(5×106)用200μCi的51Cr(新西兰核制品公司(New England Nuclear)/杜邦公司(DuPont))标记，37℃标记1小时，期间偶尔进行混合。标记的细胞用细胞培养基洗涤三次，然后重悬成1×105细胞/mL。在下一步试验前细胞或者不进行调理，或者进行调理，PBMC试验中细胞与100ng/ml和125ng/ml的试验抗体共孵育，NK试验中细胞与20ng/mL和1ng/mL的试验抗体共孵育。外周血单个核细胞按照如下过程制备：从正常健康供者体内采集肝素化的血液，用等体积的磷酸缓冲盐水(PBS)稀释。按照说明书的指导，将血液加到淋巴细胞分离液(LYMPHOCYTESEPARATION 
Figure A200780016191D0058184452QIETU
(LSM：Organon Teknika))上层并离心。从LSM-血浆界面上收集单个核细胞，用PBS洗涤三次。效应细胞以1×107细胞/mL的终浓度悬浮到细胞培养基中。经过LSM纯化以后，按照厂家的说明书，利用NK细胞分离试剂盒和磁柱(Miltenyi Biotech)通过负筛选从PBMC中分离天然杀伤细胞(NK)。然后收集分离的NK细胞，洗涤后重悬到细胞培养基内，浓度为2×106细胞/mL。通过流式细胞术分析确定NK细胞。在微孔滴定板上用细胞培养基无菌倍比稀释效应细胞(PBMC或NK)以制备不同效：靶比例的细胞混合物(每孔的最终体积为100μL)。效应细胞的浓度范围为：PBMC从1.0×107/mL到2.0×104/mL，NK从2.0×106/mL到3.9×103/mL。稀释好效应细胞以后，滴定板的每个孔内加入100μL浓度为1×105细胞/ml的51Cr标记靶细胞(调理的或未调理的)。这样PBMC的初始效：靶比为100:1，NK的初始效:靶比为20:1。所有样品都设双复孔，每个滴定板都包含自发裂解(无效应细胞)和完全裂解(靶细胞加100μL1％十二烷基硫酸钠，1N氢氧化钠)对照。滴定板在37℃孵育18小时，然后利用上清液收获系统(Skatron仪器公司(Skatron Instrument，Inc.))细胞培养上清，在Minaxi自动γ5000系列γ计数仪(Packard)计数1分钟。结果表示为百分细胞毒性，使用下列公式计算：％细胞毒性＝(样品cpm-自发裂解)/(完全裂解-自发裂解)×100。
为了鉴定能以高通量的模式刺激ADCC的抗体，(待批申请60/756301，本文已纳入作为参考)，可以利用ACEA Biosciences 
Figure A200780016191D0058184519QIETU
(实时细胞电子传感器(Real Time Cell Electronic Sensor))系统进行实时ADCC分析，方法如下：细胞接种到E-Plate微滴定板(ACEA Biosciences)上，其中细胞与微电极表面的接触可导致细胞-电极阻抗反应产生，这可以显示细胞在形态学、粘附质量和数目方面的状态。从人血(来自健康志愿者)中分离新鲜的人PBMC，然后根据试验确定的最佳比例与靶细胞混合，例如，25:1的效：靶比。然后加入试验抗体，将细胞滴定板放回ACEA系统继续检测细胞指数48小时。加入PBMC和试验抗体后，被记录的细胞指数中的一个点就反应了试验抗体介导的ADCC对靶细胞的杀伤作用。所设的对照可包括在无效应细胞PBMC细胞或使用无关同种型对照抗体的情况下进行的试验。
为了鉴定可以促进CDC的抗体，技术人员可进行本领域熟知的一种分析方法。一种优选的分析方法是体外CDC试验：在体外，在存在或不存在不同浓度的试验抗体的条件下，通过使表达肿瘤细胞抗原的细胞与人(或其他来源的)含补体血清共孵育来测定CDC活性。然后利用ALAMAR 
Figure A200780016191D0059184533QIETU
通过定量活细胞来测定细胞毒性(Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202163-171(1997))。对照试验组为不加抗体，或者添加抗体但是使用的是热灭活血清和/或使用不表达待测肿瘤细胞抗原的细胞。另外，红细胞可包被肿瘤抗原或肿瘤抗原来源的肽，然后通过观察红细胞的裂解情况来分析CDC(参见，例如，Karjalainen和Mantyjarvi，Acta Pathol Microbiol Scand[C].1981/10；89(5)：315-9)。
为了鉴定生长抑制性的抗肿瘤细胞抗原抗体，可以筛选能够抑制过量表达肿瘤细胞抗原的癌细胞生长的抗体。在一个实施方式中，筛选出的生长抑制性抗体在浓度约为0.5到30μg/mL时能够将细胞培养物中表达肿瘤细胞抗原的细胞的生长抑制约20-100％，优选约50-100％。
为了筛选能诱导细胞死亡的抗体，可以分析与对照相比膜完整性的丧失情况，如PI、台盼蓝或7AAD摄取试验所示。优选的试验是使用表达肿瘤抗原的细胞进行的PI摄取试验。按照这个试验，表达肿瘤细胞抗原的细胞用添加10％热灭活FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的DMEM:Ham F-12(50：50)中培养。(因此，试验可在无补体和免疫效应细胞的条件下进行)。肿瘤细胞接种到100×20mm培养皿中，接种密度为3×106/皿，培养过夜使细胞贴壁。然后去掉培养基，或者更换单独的培养基，或者更换含10μg/mL合适单克隆抗体的培养基。在经过一次处理以后，用PBS洗涤细胞单层，然后用胰酶消化分离细胞。细胞在4℃、1200rpm离心5分钟，细胞团重悬到3mL预冷的Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes，pH7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)中，然后分装分别加入到35mm带过滤盖子的12×75管内(每管1mL，每个处理组3管)，用于去除细胞团块。在管内再加入PI(10μg/mL)。样品用FACSCANTM流式细胞仪和FAC SCONVERTTM CellQuest软件(BD公司(Becton Dickinson))分析。那些能够明显诱导根据PI摄取试验所测定的细胞死亡水平升高的抗体被选择为细胞死亡诱导抗体。
为了筛选能够诱导凋亡的抗体，可利用BT474细胞进行膜联蛋白结合试验。利用任一商品化的膜联蛋白V染色试剂都可以检测细胞表面磷脂酰丝氨酸(PS)，其原理是膜联蛋白V对PS有高亲和力。按照前面段落所讨论的在培养皿内接种并培养BT474细胞。然后去掉培养基，或者更换单独的新鲜培养基，或者更换含10μg/mL单克隆抗体的培养基。经过三天的培养以后，细胞单层用PBS洗涤，用胰酶消化分离。然后按照上述方法离心细胞，重悬到Ca2+结合缓冲液中，分装到管内用于细胞死亡分析。管内再加入标记的膜联蛋白(例如，膜联蛋白V-FTIC)(1μg/mL)。样品用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件(BD公司)分析。那些能诱导膜联蛋白结合水平比对照明显升高的抗体被选择为凋亡诱导抗体。另外，参见如，罗氏应用科技公司(Roche Applied Science)的商品化膜联蛋白V染色试剂。通过在膜联蛋白V上连接FITC，以单细胞为基础利用流式细胞术鉴定和定量凋亡细胞成为可能。同时标记FITC-膜联蛋白V(绿色荧光)和非致命性染料碘化丙啶(红色荧光)的染色细胞可用于区分完整细胞(FITC-PI-)、早期凋亡细胞(FITC+PI-)和晚期凋亡细胞或坏死细胞(FITC+PI+)。
除了膜联蛋白结合分析之外，利用BT474细胞进行DNA染色分析也是已有的方法。为了进行该试验，如前两段所描述，经过目的抗体处理的BT474细胞与9μg/ml HOECHST33342TM在37℃共孵育2小时，然后利用MODFITTM软件(Verity Software House)在EPICS ELITETM流式细胞仪(Coulter Corporation)上分析。通过该试验，可诱导凋亡细胞百分数与未处理细胞(细胞凋亡可达100％)相比改变2倍或2倍以上(优选3倍或3倍以上)的抗体被选择为原凋亡抗体。
另外，利用以核酸为基础的方法也可以确定生物样品内增高的凋亡水平，该方法检测的是DNA片段化，这是凋亡的特征。初始凋亡的DNA在琼脂糖凝胶电泳上呈现特征性的“梯形”模式，与坏死或其他非特异性DNA降解中所观察到的核酸污迹不同。用于检测DNA片段化的常用组织化学技术利用的是末端标记DNA。用商业化的试剂盒可完成该试验，例如APOLERT DNA片段化试剂盒(克隆技术有限公司(Clontech Laboratories，Inc.)，帕洛阿托(PaloAlto)，加州(California))。这个试验的原理是末端脱氧核糖核苷酰转移酶(Tdt)介导的dUTP切口端标记(TUNEL)，其中Tdt在经历凋亡的细胞内催化荧光素-dUTP掺入到片段化DNA的游离3’羟基末端。
许多分析级联酶标志物的试剂盒都是商品化的。例如，单一胱冬酶试验(Homogeneous Caspases Assay)(罗氏应用科技公司，印第安纳波利斯，印第安纳州)是一种在体外定量分析微孔板内级联酶活性的荧光测定方法。该方法特别适用于高通量的筛选试验，例如，在96孔板上可进行100个检测，在384孔板上可进行400个检测(目录号3005372)。这种方法可用于检测生物样品，其中包括，如血清或血浆，中的几种级联酶，其中包括级联酶-2、级联酶-3、级联酶-7，以及范围较小的级联酶-6、级联酶-8、级联酶-9和级联酶-10。细胞死亡检测ELISA+试验(Cell Death Detection ELISAPLUS assay)(目录号1774425；罗氏应用科技公司，印第安纳波利斯，印第安纳州)的原理是定量三明治酶免分析，分别使用直接抗DNA和组蛋白的小鼠单克隆抗体。该方法可特异性地检测和定量死于凋亡的细胞释放到细胞浆内的单核小体和寡核小体。它可用于多种样品，其中包括细胞裂解物、血清、培养物上清等。
本发明的抗体也可在体内筛选其凋亡活性，以18F-膜联蛋白为PET造影剂。在这种方法中，膜联蛋白V用18F放射性标记，与待测抗体一起给予试验动物。凋亡过程中最早发生的事件之一就是磷脂酰丝氨酸的外翻，从细胞膜的内侧转移到细胞外表面，其中磷脂酰丝氨酸易于和膜联蛋白结合。然后对动物进行PET造影(参见Yagle等，J Nucl Med.2005Apr；46(4)：658-66)。还可以处死动物，取出各个器官或肿瘤按照标准方法分析凋亡标志物。
为了筛选能够结合被目的抗体结合的肿瘤细胞抗原上的表位的抗体，可以进行常规的交叉阻断试验，如《抗体，实验室手册》(Antibodies，ALaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow和David Lane编辑，(1988)所描述的。另外，通过本领域熟知的方法可以进行表位绘图。
本发明的抗体还可以被筛选以确定其一旦与待测肿瘤细胞抗原结合后是快速内化还是依然停留在细胞表面的能力。在某些实施方式中，例如在构建某些类型的免疫偶联物时，如果内化是释放毒素基序所必需的，那么理想的抗体是能够被内化的抗体。另外，如果抗体被用于促进ADCC或CDC，依然能停留在细胞表面的抗体将是更理想的。筛选方法可被用于区分这些类型的行为。例如，可以使用细胞携带的肿瘤细胞抗原，其中细胞与人IgG1(对照抗体)或本发明的一种抗体以约1μg/mL浓度在冰上(用0.1％叠氮钠阻断内化)或37℃(不加叠氮钠)共孵育3小时。然后用冷染色缓冲液(PBS+1％BSA+0.1％叠氮钠)洗涤细胞，再用羊抗人IgG-FITC在冰上染色30分钟。利用FACS Calibur记录算术平均荧光强度(MFI)。如果所观察到的MFI在冰上共孵育且有叠氮钠存在的本发明的抗体与37℃无叠氮钠共孵育的抗体之间没有差异，则该抗体将被怀疑是与细胞表面结合而不是被内化的抗体。但是，如果细胞在37℃、无叠氮钠存在的条件下共孵育时发现表面可染色的抗体减少，则抗体将被换衣是能够内化的抗体。
V.载体、宿主细胞及重组方法
本发明还提供了编码人源化抗肿瘤细胞抗原抗体的游离核酸、包含核酸的载体和宿主细胞、以及用于制备抗体的重组技术。
为了通过重组方法制备抗体，将编码抗体的核酸分离出来并插入到可复制载体内以便于进一步克隆(扩增DNA)或表达。利用常规方法(例如，通过利用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)很容易分离和测序编码单克隆抗体的DNA。许多载体都是可用的。载体一般包括而不限于下列元件中的一个或多个：信号序列、复制起始位点、一个或多个标志基因、增强子元件、启动子以及转录终止序列。
(i)信号序列元件
本发明的抗肿瘤细胞抗原抗体不仅可以通过重组方法直接制备，而且还可以与异源多肽形成融合多肽来制备，优选的是，位于成熟蛋白或多肽N末端的信号序列或其他多肽包含特异性裂解位点。所选择的异源信号序列优选能够被宿主细胞识别和处理(即，被信号肽酶裂解)的信号序列。对于不能识别和处理天然抗肿瘤细胞抗原抗体的原核宿主细胞来说，信号序列可用所选择的原核信号序列所取代，例如，来源于碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定内毒素II前导子的信号序列。对于酵母分泌来说，天然信号序列可以被，例如，酵母转化酶前导子、α因子前导子(包括酵母属和克鲁维酵母属α因子前导子)或酸性磷酸酶前导子、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导子或WO90/13646所描述的信号所取代。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导子，如单纯疱疹gD信号。
编码这种前体区的DNA被连接到编码抗肿瘤细胞抗原抗体的DNA的阅读框架内。
(ii)复制起始位点元件
表达载体和克隆载体都包含能使载体在一种或多种特殊宿主细胞内复制的核酸序列。一般而言，在克隆载体内这个序列是能够使载体独立于宿主染色体DNA而复制的序列，其中包含复制起始位点或自主复制序列。许多细菌、酵母和病毒的这种序列都是已知的。质粒pBR322的复制起始位点适于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起始位点适于酵母，各种病毒(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)的起始位点适于哺乳动物细胞的克隆载体。通常来说，哺乳动物表达载体不需要复制起始位点元件(一般只使用SV40起始位点，因为它包含早期启动子)。
(iii)筛选基因元件
表达载体和克隆载体可包含筛选基因，也被称为筛选标志。典型的筛选基因编码的蛋白质能够(a)赋予对抗生素或其他毒素如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的耐药性，(b)弥补营养缺陷，或者(c)提供复合培养基中缺少的关键营养素，例如，编码芽孢杆菌(Bacilli)D丙氨酸消旋酶的基因。
筛选方法的一个例子是利用可以使宿主细胞生长停止的药物。成功转化外源基因的那些细胞可产生耐药性蛋白，因而可在选择培养基中存活下来。这种优势筛选的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
对于哺乳动物细胞来说，合适筛选标志物的另一个例子是那些能够用于鉴定细胞内摄取抗肿瘤细胞抗原抗体核酸的原件的标志物，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，转化DHFR筛选基因的细胞首先通过在包含甲氨蝶呤(Mtx)的培养基内培养所有转化子来鉴定，其中甲氨蝶呤是DHFR的竞争性拮抗剂。如果使用野生型DHFR，那么合适的宿主细胞是DHFR活性缺失的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
另外，转化或共转化编码抗肿瘤细胞抗原抗体、野生型DHFR蛋白以及其他筛选标志物如氨基糖甙3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列的宿主细胞(特别是包含内源性DHFR的野生型宿主细胞)也可以通过在含筛选标志物的筛选药物如氨基糖甙类抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基内培养来进行筛选。参见美国专利号4965199。
适用于酵母的筛选基因是酵母质粒YRp7上存在的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979))。trp1基因可为不能在色氨酸中生长的酵母的突变株提供筛选标志物，例如，ATCC号44076或PEP4-1。Jones，Genetics，85：12(1977)。因此，酵母宿主细胞基因组内存在的trp1损伤可为检测转化提供了一个有效环境，其中酵母可在缺乏色氨酸的条件下生长。同样，缺乏Leu2的酵母细胞系(ATCC20622或38626)可被已知的携带Leu2基因的质粒弥补。
另外，1.6μm环状质粒pKD1来源的载体可用于转化克鲁维酵母。另外，利用乳酸克鲁维酵母表达系统大规模制备重组牛凝乳酶也已有报道。Berg，Bio/Technology，8：135(1990)。文献还公开过利用稳定的多拷贝表达载体和克鲁维酵母的工业化细胞系分泌成熟的重组人血清白蛋白。Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991)。
(iv)启动子元件
表达和克隆载体一般都包含能被宿主有机体识别并与抗肿瘤细胞抗原抗体的核酸可操控连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子如tac启动子。但是其他已知的细菌启动子也可以使用。适用于细菌系统的启动子还包含与编码抗肿瘤细胞抗原抗体的DNA可操控连接的夏因-达尔加诺(S.D.)序列。
真核细胞的启动子序列是已知的。几乎所有的真核细胞基因都有AT富含区，该区位于转录起始位点上游约25到30个碱基处。位于许多基因的转录起始位点上游70到80个碱基处的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’末端是AATAAA序列，这一序列可能是在编码序列3’末端添加多聚腺苷酸尾巴的信号。所有这些序列都适于插入到真核表达载体内。
可用于酵母宿主的合适启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他酵解酶如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、三磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子。
其他酵母启动子包括乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区，这些启动子是可诱导启动子，具有可通过培养条件控制转录的额外优势。适用于酵母表达的载体和启动子在EP73657中有进一步描述。酵母启动子优选与酵母增强子联合使用。
在哺乳动物细胞内，抗肿瘤细胞抗原抗体从载体的转录是可控的，例如，通过病毒基因组来源的启动子以及哺乳动物异源启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、热休克蛋白启动子，只要这种启动子与宿主细胞系统相容，其中病毒的例子有多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，最优选的是猿猴病毒40(SV40)。
SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40的限制性酶切片段可以很方便的获得，其中还包含SV40的复制起始位点。人巨细胞病毒的立即早期启动子作为Hind III E限制性酶切片段可以很方便地获得。美国专利号4419446公开了利用牛乳头状瘤病毒为载体的在哺乳动物宿主内表达DNA的系统。美国专利号4601978描述了对该系统的修饰。也可参见Reyes等，Nature297：598-601(1982)所描述的在单纯疱疹胸苷激酶启动子的控制之下人β干扰素cDNA在小鼠细胞内的表达。另外，鲁斯氏肉瘤病毒长末端重复序列也可用作启动子。
(v)增强子元件
通过在载体内插入增强子序列通常会增强编码本发明的抗肿瘤细胞抗原抗体的DNA在较高级的真核细胞内的转录。现在已知有许多哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)来源的增强子序列。但是，人们通常使用真核细胞病毒来源的增强子。其中的例子包括位于复制起始位点后侧(100-270bp)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起始位点后侧的多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。也可参见Yaniv，Nature297：17-18(1982)所描述的用于活化真核启动子的增强子元件。增强子可被插入到载体内抗肿瘤细胞抗原抗体编码序列的3’或5’位置，但是优选位于启动子的5’位置。
(vi)转录终止序列
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或其他多细胞有机体来源的有核细胞)还包含终止转录以及稳定mRNA所必需的序列。这种序列通常位于真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻译区，偶尔也会位于3’非翻译区。这些区包含转录成多聚腺苷酸片段的核苷酸片段，位于编码抗肿瘤细胞抗原抗体的mRNA非翻译部分内。一个有用的转录终止序列是牛生长激素多聚腺苷酸区。参见WO94/11026及其公开的表达载体。
(vii)宿主细胞的筛选和转化
宿主细胞用本文所述的用于制备抗体的表达载体或克隆载体转染或转化，并在经过调整的常规营养培养基内培养，其中的调整包括适于诱导启动子、筛选转化子或扩增编码目的序列的基因。技术人员无需额外的试验就可以选择培养条件，如培养基、温度、pH等。总之，用于使细胞培养物产率最大化的原理、方法和操作技术可见于《哺乳动物细胞生物技术：实用方法》(MammalianCell Biotechnology：a Practical Approach)，M.Butler编辑(IRL出版社，1991)和Sambrook等，同上，的描述。
真核细胞转染和原核细胞转化的方法是本领域技术人员所熟知的，例如，CaCl2、CaPO4、脂质体介导的转染以及电穿孔方法。根据所使用的宿主细胞，可以选择适于这种细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等，同上，所述的用氯化钙处理或电穿孔方法通常用于原核细胞。用根瘤土壤杆菌感染通常用于转化某些植物细胞，如Shaw等，Gene，23：315(1983)和1989年1月29日公开的WO 89/05859所述。对于没有这种细胞壁的哺乳动物细胞来说，可以利用Graham和van der Eb，Virology，52：456-457(1978)描述的磷酸钙沉淀法。美国专利号4399216描述了哺乳动物细胞宿主系统转染的主要方面。转化酵母通常按照Van Solingen等，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)描述的方法进行。但是，将DNA导入到细胞内的其他方法也可以使用，如核微注射、电穿孔、细菌原生质与完整细胞融合或多聚阴离子如聚凝胺、多聚鸟氨酸。转化哺乳动物细胞的各种方法参见Keown等，Methods in Enzymology，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature，336：348-352(1988)。
可用于克隆或表达本文所述的载体内的DNA的合适宿主细胞包括上述原核细胞、酵母或较高级的真核细胞。用于此目的的合适原核细胞包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如，肠杆菌科的细菌，如埃希氏杆菌属的细菌如大肠杆菌，肠道细菌属的细菌、克雷白氏杆菌属的细菌、变形杆菌属的细菌、沙门氏菌属的细菌如鼠伤寒沙门氏菌、沙雷氏菌属的细菌如粘质沙雷氏菌和志贺氏菌属的细菌，以及杆菌如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如，1989年4月12日公开的DD 266，710所述的地衣芽孢杆菌)，假单胞菌属的细菌如绿脓杆菌，和链霉菌属的细菌。一个优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31，446)，尽管其他株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)也适用。这些实施例是说明性的，而不是限制性的。
除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母是最常用的低级真核宿主微生物。其他的例子包括粟酒裂殖酵母(Beach和Nurse，Nature，290：140[1981]；EP 139，383，1985年2月2日公开)；克鲁维酵母宿主(美国专利号4943529；Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991))如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)：737-742[1983])，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12，424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16，045)，K wickeramii(ATCC24，178)，瓦尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC56，500)，K.drosophilarum(ATCC36，906；Van den Berg等，Bio/Technology，8：135(1990))，K.thermotolerans以及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母(EP402，226)；毕赤酵母(EP183，070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28：265-278[1988])；念珠菌属；Trichoderma reesia(EP244，234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：5259-5263[1979])；许旺酵母属如Schwanniomyces occidentalis(P394，538，1990年10月31日公开)；以及丝状真菌如链孢霉属、青霉属、弯颈霉(WO91/00357，1991年1月10日公开)；以及曲霉属宿主如构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112：284-289[1983]；Tilburn等，Gene，26：205-221[1983]；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1470-1474[1984])和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.，4：475-479[1985])。甲基营养酵母适用于本发明，其中包括而不限于能在甲醇中生长的酵母，如汉森(氏)酵母属、念珠菌属、克勒克酵母属、毕赤酵母属、酵母属、球拟酵母属和红酵母属的酵母。这一类酵母中典型的特异性种的列表见C.Anthony，The Biochemistry of Methylotrophs(甲基营养菌生物化学)，269(1982)。
适用于表达糖基化抗体的宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞如果蝇属S2和夜蛾Sf9细胞，以及植物细胞。可用的哺乳动物宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和COS细胞。更特殊的例子包括转化SV40的猴肾CVI细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(可在悬浮培养物中生长的293或293亚克隆细胞)，Graham等，J.Gen Virol.，36：59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠塞尔托利氏细胞(IM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；以及小鼠乳房肿瘤细胞系(MMT060562，ATCC CCL51)。本领域的技术人员熟知选择合适细胞的方法。
棉花、玉米、大豆、牵牛花和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
但是，最感兴趣的是无脊椎动物细胞，在培养物(组织培养物)中繁殖无脊椎动物细胞已经成为常规方法。可使用的哺乳动物细胞的例子包括转化SV40的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(可在悬浮培养物中生长的293或293亚克隆细胞，Graham等，J.Gen Virol.，36：59(1977))；幼儿仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠塞尔托利氏细胞(IM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；以及小鼠乳房肿瘤细胞系(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞，(Mather等，Annals N.Y Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；以及人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。
宿主细胞可用上述表达或克隆载体转化用于制备抗肿瘤细胞抗原抗体，并在常规的营养培养基中培养，培养基可加以调整以便于诱导启动子、筛选转化子或扩增编码目的序列的基因。
(viii)培养宿主细胞
用于制备本发明的抗肿瘤细胞抗原抗体的宿主细胞可在各种培养基内培养。商品化的培养基如Ham F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)以及达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM，Sigma)适用于培养宿主细胞。另外，Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利号4767704；4657866；4927762；4560655或5122469；WO 90/03430；WO 87/00195；或者美国专利号Re.30,985所描述的培养基也可用于培养宿主细胞。所有这些培养基都必需添加激素和/或其他生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如，氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶)、抗生素(例如，庆大霉素药物)、微量元素(通常定义为最终浓度以微摩尔计的无机化合物)以及葡萄糖或等价的能量源。其他必需的添加物也可以适当的浓度添加，这是本领域技术人员所熟知的。培养条件如温度、pH等为上面筛选宿主细胞表达时所用的那些条件，也是本领域技术人员所熟知的。
(ix)基因扩增/表达的检测
基因扩增和/或表达可在样品内直接检测，例如，通过常规的DNA印迹，定量检测mRNA转录的RNA印迹[Thomas，Proc.Nad.Acad.Sci.USA.77：5201-5205(1980)]，利用合适标记探针根据本文所提供的序列进行的点杂交(DNA分析)或原位杂交。另外，可以使用能够识别特异性双螺旋的抗体，其中包括DNA双螺旋、RNA双螺旋和DNA-RNA杂合双螺旋或DNA-蛋白质双螺旋。反之，抗体也可以被标记，分析双螺旋与表面的结合，因此当表面形成双螺旋时可以检测与双螺旋结合的抗体。
另外，可以利用免疫学方法检测基因表达，例如，细胞或组织切片的免疫组化染色以及分析细胞培养物或体液，从而直接定量基因产物的表达情况。可用于免疫组化染色和/或液体样品分析的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，可在任何哺乳动物细胞内制备。为了方便，可以制备抗如下序列的抗体：天然序列的肿瘤细胞抗原多肽、根据本文所提供的DNA序列合成的肽、或者融合到肿瘤细胞抗原DNA上并编码特异性抗体表位的外源序列。
(x)抗肿瘤细胞抗原抗体的纯化
如果使用重组技术，抗体可在细胞内产生，如胞质周围空间或直接分泌到培养基内。如果抗体在细胞内合成，那么作为第一步，要去除宿主细胞的特定碎片或裂解片段，例如，通过离心或超滤。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了一种分离分泌到大肠杆菌胞质周围空间的抗体的方法。简言之，用乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解细胞团约30分钟以上，离心去除细胞碎片。如果抗体分泌到培养基中，那么这种表达系统的上清液通常首先用商品化的蛋白浓缩滤膜浓缩，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单位。上述所有步骤都要添加蛋白酶抑制剂如PMSF以防止意外污染物的生长。
从细胞制备的抗体组合物可通过，例如，羟磷灰石色谱、凝胶电泳和亲和层析纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A是否合适作为亲和配基依赖于抗体的免疫球蛋白Fc区的种和同种型。基于人γ1、γ2或γ4重链，可用蛋白A纯化抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。推荐使用蛋白G纯化所有小鼠同种型抗体和人γ3(Guss等，EMBO J.5：15671575(1986))。连接亲和力配基最常用的基质是琼脂糖，但是其他基质也可以使用。机械稳定性的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯比琼脂糖更易达到较快的流速和较短的处理时间。如果抗体包含CH3区，那么可以利用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)进行纯化。根据所回收的抗体，用于蛋白纯化的其他技术如利用离子交换柱进行分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅层析、利用阳离子或阴离子交换树脂进行heparin SEPHAROSETM层析(例如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀也可以使用。
在进行初步纯化步骤以后，包含目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用的洗脱缓冲液的pH在约2.5-4.5之间，优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M的盐)进行。
VI.药学上可接受的制剂
可用于本发明的激动剂/拮抗剂或抗体的治疗上可接受的制剂可通过使具有理想纯度的分子与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备以便于保存(《Remington药物学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol，A.编辑，(1980))，制剂可以是冻干制剂或水溶液的形式。在应用剂量和浓度下，药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂对受者无毒，其中还包含缓冲盐如磷酸盐、枸橼酸盐和其他有机酸；抗氧化剂如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如，十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐逆离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选的抗肿瘤细胞抗原抗体的冻干制剂见WO97/04801的描述，本文已特地纳入作为参考。
本文的制剂还包含一种以上的活性化合物，这是特殊治疗目的所必需的，优选的是那些不会对彼此产生副作用的互补活性。例如，在一个制剂中另外包含能结合蛋白家族的其他成员或者所选择的肿瘤细胞抗原上的其他表位的其他抗体将是更理想的。合适的第二抗体包括抗如下分子的抗体：CEA、EGP-1、EGP-2(例如17-1A)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、PAM-4、KC4、TAG-72、EGFR、HER2/neu、BrE3、Le-Y、A3、Ep-CAM、Tn、和Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、铁蛋白、酸性异铁蛋白、结合腕蛋白、原癌基因、原癌基因产物、IL-6、IGF-1、IGFR-1、肿瘤血管生成抗原如血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PIGF)、ED-B纤连蛋白和其他血管生长因子、Ga733、或其组合。另外，第二抗体可以是能结合同一肿瘤细胞抗原但是利用不同表位的抗体。在另一实施方式中，第二抗体可结合其他的肿瘤细胞抗原，其中肿瘤细胞抗原选自如下一组：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。值得注意的是，所有第二抗体都可以是免疫偶联物，也可以是裸抗体，并且可以是多价抗体。这些抗体组合可在本发明的抗体给药前、同时或给药后给予。
另外，组合物还可以包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素药物、抗血管形成药物和/或心脏保护剂。这种分子适合组合使用，其用量对于所要达到的目的来说是有效的。这些试剂可在本发明的抗体给药前、同时或给药后给予。
可用于体内的制剂必须是无菌的。在冻干和重新溶解前或后通过无菌滤膜过滤可以很容易地做到这一点。
本文的治疗性组合物通常被放在带有无菌进入口的容器内，例如，带有可被皮下注射针刺入的塞子的静脉注射溶液袋。
根据已知的方法，给药途径可以是，例如，静脉注射或静脉输注、腹腔内注射、脑内注射、肌肉注射、眼内给药、动脉内或腹膜内给药、局部给药，或者通过缓释洗脱给药。
活性成分还可以被包裹到微囊内，例如，通过凝聚技术或界面聚合法制备的微囊。例如，胶体药物转运系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳化剂、纳米颗粒和纳米囊)或微乳化剂中分别使用的羟甲基纤维素或明胶微囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊。这种技术在《雷明顿药物科学》(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第16版，Oslo，A.编辑，(1980)中有描述。
本发明的药学上可接受的组合物的给药剂量和理想药物浓度根据使用目的的不同而不同。普通的医生了解如何确定合适的给药剂量或给药途径。动物试验为确定用于治疗人时的有效剂量提供了可靠的指导。根据Mordenti，J.和Chappell，W.“种间定标在毒物代谢动力学中的应用”(The use ofinterspeciesscaling in toxicokinetics)《毒物代谢动力和新药开发》(Toxicokinetics and NewDrug Development)，Yacobi等编辑，Pergamon出版社，纽约，1989，42-96页确立的原则可以估算出有效剂量的种间定标。
当抗肿瘤细胞抗原抗体用于体内给药时，根据给药途径的不同，给药剂量也不同，范围从每天约10ng/kg到100mg/kg哺乳动物体重或更高，优选约1μg/kg/天到10mg/kg/天。文献中有关于特定给药剂量和给药方法的指导；参见，例如，美国专利号4657760；5206344；5225212。可以预计的是，不同治疗化合物的不同制剂针对不同的疾病时才有疗效，例如，靶向到一个器官或组织的制剂与靶向到另一个器官或组织的制剂必须以不同的方式给药。
如果在治疗需要给予抗体的任何疾病或失调时需要缓释给药，那么抗肿瘤细胞抗原抗体制备成具有缓释特征的制剂是比较理想的，这时可以考虑抗体的微囊。具有缓释特征的重组蛋白微囊已被成功研制出来，其中包裹的药物有人生长激素(ehGH)、干扰素(rhIFN)、白细胞介素-2和MN rgp120。Johnson等，Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，27：1221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technology.8：755-758(1990)；Cleland，“利用聚乳酸聚乙醇酸微球洗脱设计和制备单价免疫疫苗”(”Design and Production of Single ImmunizationVaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems”)，《疫苗设计：亚单位和佐剂方法》(Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach)，Powell和Newman编辑，(Plenum出版社，纽约，1995)，439462页；WO 97/03692，WO 96/40072，WO 96/07399；以及美国专利号5654010。
这些蛋白的缓释制剂可用聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)聚合物制备，因为它具有良好的生物相容性和宽范围的生物可降解特性。PLGA的降解产物乳酸和乙醇酸在人体内可被快速清除。另外，根据分子量和组合物的不同，这个聚合物的降解能力可以被调节，从数月到数年不等。Lewis，“乳酸/乙醇酸聚合物来源的活性剂的控制释放”(“Controlled release of bioactive agents fromlactide/glycolide polymer”)，M.Chasin和R.Langer(编辑)，《可用作药物转运系统的生物可降解聚合物》(Biodegradable Polymers as Drug DeliverySystems)(MD有限公司(Marcel Dekker)：纽约，1990)，1-41页。
VII.用抗肿瘤细胞抗原抗体治疗
根据本发明，可以考虑使用抗肿瘤细胞抗原激动剂/拮抗剂或抗体分子治疗各种疾病或失调。典型的疾病或失调包括良性或恶性肿瘤；白血病和淋巴瘤；其他失调如神经元的、神经胶质的、星形细胞的、下丘脑的、腺体的、巨噬细胞的、上皮细胞的、体细胞的、囊胚腔的、炎症性的、血管形成的和免疫性的失调。
一般而言，可被治疗的疾病或失调是癌。本文中可被治疗的癌的例子包括而不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴瘤。这种癌的更特殊的例子包括鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)、肺癌如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌如胃肠癌、胰腺癌、胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、胆囊癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、直肠结肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌、肛门癌、阴茎癌、以及头颈癌。
癌通常包含表达肿瘤细胞抗原的细胞，这样本文的抗肿瘤细胞抗原抗体能够结合到癌上。检测试验生物样品和对照生物样品内本发明的生物标志物以及可选的细胞因子标志物的表达水平的方法包括能在核酸或蛋白质水平上定量测定这些标志物或检测这些标志物是否表达的任何方法。这种方法是本领域熟知的，其中包括而不限于蛋白印迹、RNA印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术、免疫组化、核酸杂交技术、核酸反转录方法以及核酸扩增方法。在一个特殊实施方式中，可利用，例如直接抗特异性生物标志物蛋白的抗体在蛋白质水平上检测生物标志物的表达。这些抗体可用在各种方法中，例如，蛋白印迹、ELISA、多路技术(multiplexing technology)、免疫沉淀或免疫组化技术。在某些实施方式中，可通过电化学发光法(ECL)检测细胞因子标志物。这些检测生物标志物和可选的细胞因子标志物的方法中的任一方法都可以和以下方法组合使用：临床信息评估、常规诊断方法、肿瘤细胞抗原相关因子的表达、细胞表面肿瘤细胞抗原的特异表达以及潜在可溶性肿瘤细胞抗原的循环水平、以及本领域已知的临床可用的和特征性的诊断标志物的表达或是否存在，其中包括而不限于本文所提到的癌症患者所表达的标志物。在这种方式中，公开的方法能够更准确地确定候选患者的癌或前恶性疾病能否从本文所述的抗肿瘤细胞抗原治疗剂的治疗中受益。
因此，在某些实施方式中，可利用体外诊断试验检测候选患者对目的抗肿瘤细胞抗原治疗剂的反应性，评价治疗剂对一个或多个肿瘤细胞抗原介导的活性的影响，其中候选患者患有与表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞相关的过度增生性、癌性或癌前疾病。如果需要进一步优化体外诊断试验，那么可以检测候选患者体内是否表达上文鉴定的一种或多种肿瘤细胞抗原相关因子以及一种或多种有临床价值的诊断标志物或者其表达水平。在这种方式中，可从候选患者体内收集包含表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞的生物样品，分析其中是否表达肿瘤细胞抗原相关因子以及有临床价值的诊断标志物或者其表达水平。包含表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞的任何生物样品都可以收集用于这些诊断试验。另外，本领域技术人员所熟知的任何检测方法都可用于检测本文其他地方所提及的肿瘤细胞抗原相关因子以及有临床价值的诊断标志物是否表达或者其表达水平。
如果需要检测一种或多种肿瘤细胞抗原相关因子的表达水平以便于鉴定患者是否患有能对抗肿瘤细胞抗原治疗剂产生反应的癌或癌前疾病，那么可以从患者体内收集生物样品，比较样品中的表达水平与对照或标准参照中该因子的表达水平。对于细胞表面肿瘤细胞抗原表达水平的检测来说，上述包含表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞的任何生物样品都可以使用。对于可溶性肿瘤细胞抗原循环水平的检测来说，可以使用来自候选患者的血样或包含血液成分如血浆或血清的样品。“对照”或“标准参照”是指同一生物来源(即，组织或体液)的能区分癌或癌前疾病患者与未患病健康有机体的标准。技术人员通过如下措施可以提供标准参照：测定未患病健康有机体和患者体内这些肿瘤细胞抗原相关因子(即，细胞表面肿瘤细胞抗原或可溶性的肿瘤细胞抗原)的表达水平，控制年龄、性别、种族等因素，以及比较表达水平以确定健康有机体内预期的标准表达水平。在某些实施方式中，患有癌或癌前疾病的候选患者体内的表达水平至少比标准参照的表达水平高20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、100％、150％、200％、250％、300％以上。应该认识到，通过检测一种或多种这些肿瘤细胞抗原相关因子的表达水平可以评价抗肿瘤细胞抗原治疗剂治疗的适用性，其中生物样品内的表达水平相对于标准参照升高就足以说明患有癌或癌前疾病的患者将会对目的抗肿瘤细胞抗原治疗剂的治疗产生反应，而无需进行其他试验来分析抗肿瘤细胞抗原治疗剂对肿瘤细胞抗原介导的活性如细胞存活和增殖和/或ADCC活性的效应。
还可以在核酸水平上确定候选患者来源的生物样品内是否存在本文所述的目的肿瘤细胞抗原。用于分析表达的以核酸为基础的技术是本领域所熟知的，其中包括，例如，确定生物样品内生物标志物mRNA的水平。许多表达检测方法使用游离的RNA。任何不会特异地对抗mRNA分离的RNA分离技术都可用于纯化RNA(参见，例如，Ausubel等编辑，(1987-1999)，《当代分子生物学手册》(Current Protocols in Molecular Biology)(约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约)。另外，利用本领域技术人员熟知的技术可以很容易地处理大批量的组织样品，例如，美国专利号4843155所描述的一步RNA分离方法。
因此，在某些实施方式中，可利用核酸探针在核酸水平上检测其他目的蛋白的生物标志物。术语“核酸探针”是指能够特异地结合到特殊靶核酸分子如核苷酸转录子上的任何分子。探针可由本领域的技术人员合成，也可以从合适的生物样品中制备。探针经过特殊设计可被标记，例如，用放射性标记物、荧光素标记物、酶、化学发光标签、发色标签、或者上面提到的或本领域已知的其他标记物或标签。可用作探针的分子的例子包括而不限于RNA和DNA。
例如，游离mRNA可用于杂交或扩增分析，其中包括而不限于DNA印迹或RNA印迹分析、多聚酶链式反应分析和探针芯片。用于检测mRNA水平的一种方法包括使游离mRNA与能和被检测基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。例如，核酸探针可以是全长cDNA或其片段，例如，至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸长并且足以特异性地与编码上述生物标志物、CD40相关因子或有临床诊断价值的诊断标志物的mRNA或基因组DNA在严格条件下杂交的寡核苷酸。mRNA能与探针杂交说明表达目的生物标志物或其他靶蛋白。
在一个实施方式中，mRNA被固定在固相表面与探针接触，例如，通过对游离mRNA进行琼脂糖凝胶电泳并将mRNA从凝胶转移到膜如硝酸纤维素膜上。在另一个实施方式中，探针被固定在固相表面，mRNA与探针接触，例如，基因芯片上的探针。技术人员可以很容易地选择已知的mRNA检测方法来检测编码目的生物标志物或其他蛋白的mRNA的表达水平。
确定样品中目的mRNA表达水平的另一种方法包括核酸扩增过程，例如，通过RT-PCR(参见，例如，美国专利号4683202)、连接酶链式反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：189-193)、自主序列复制(Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等(1988)Bio/Technology6：1197)、滚环复制(美国专利号5854033)或其他任何核酸扩增方法扩增，然后利用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。这些检测方案特别适用于检测存在数目很低的核酸分子。在本发明的特殊方面，可通过定量荧光RT-PCR(即，
Figure A200780016191D0075185107QIETU
系统)检测生物标志物的表达、肿瘤细胞抗原相关因子或其他有临床价值的诊断标志物的表达。
利用膜印迹(例如，杂交分析如Northern、斑点杂交等所使用的)或微孔、样品管、凝胶、小珠或纤维(或者包含结合核酸的任何固相支持物)可检测目的RNA的表达水平。参见美国专利号5770722、5874219、5744305、5677195和5445934，本文已纳入作为参考。表达的检测方法还可以包括使用溶液中的核酸探针。
在本发明的一个实施方式中，微阵列可用于检测一种或多种生物标志物、肿瘤细胞抗原相关因子和/或有临床价值的诊断标志物的表达。微阵列特别适用于此目的，因为它在不同试验之间具有较高的可重复性。DNA微阵列为同时检测大量基因的表达水平提供了一种方法。每一个阵列由一个粘附到固相支持物上的捕获探针的可重复模式组成。标记的RNA或DNA与阵列中的互补探针杂交，然后通过激光扫描进行检测。测定阵列中每一个探针的杂交强度，然后转化成代表基因表达水平的定量值。参见美国专利号6040138、5800992和6020135、6033860和6344316，本文已纳入作为参考。高密度的寡核苷酸阵列特别适用于确定样品中大量RNA的基因表达模式。
利用机械合成方法合成这些阵列的技术见于，例如，美国专利号5384261的描述，本文已完整纳入作为参考。虽然二维阵列表面是优选的，但是事实上阵列也可以构建在任何表面上，甚至是多重表面上。阵列可以是位于小珠、凝胶、聚合物表面、纤维如光纤维、玻璃或其他任何合适支持物上的肽或核酸。参见美国专利号5770358、5789162、5708153、6040193和5800992，本文都已完整纳入作为参考。阵列可以这种方式包装以便于在总括一切的装置上进行诊断或其他操作。参见，例如，美国专利号5856174和5922591，本文已纳入作为参考。
在一种方法中，分离自样品的总mRNA被转化成标记的cRNA，然后与寡核苷酸阵列杂交。每个样品杂交到一个独立的阵列上。通过参照阵列上和样品中合适的对照可以计算出相对的转录水平。
如果癌的特征是肿瘤抗原的过量表达，那么本发明还提供了一种方法用于治疗被认为不是过量表达肿瘤抗原的癌的方法。为了确定癌中肿瘤抗原的表达水平，可进行各种诊断/预后分析。在一个实施方式中，可通过IHC分析肿瘤抗原的过量表达。对肿瘤活检组织来源的石蜡包埋组织切片进行IHC分析，参照的肿瘤抗原蛋白染色密度标准如下：
0分
未看到染色或者发生膜染色的肿瘤细胞数低于10％。
1+分
在10％以上的肿瘤细胞上检测到微弱的/几乎不可看到的膜染色。染色只发生在细胞膜的一部分上。
2+分
在10％以上的肿瘤细胞上观察到弱到中度的完整膜染色。
3+分
在10％以上的肿瘤细胞上观察到中度到强的完整膜染色。
在肿瘤抗原过量表达分析中表现为0或1+分的那些肿瘤可以被定义为没有过量表达肿瘤抗原的肿瘤，而那些2+或3+的肿瘤则被定义为过量表达肿瘤抗原的肿瘤。
另外，可利用甲醛固定的、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH分析如INFORMTM(由亚利桑那州Ventana销售)的或PATHVISIONTM(Vysis，伊利诺伊州)以确定肿瘤上肿瘤抗原过量表达的程度(如果存在)。
另外，可利用体内诊断方法评价肿瘤抗原的过量表达或扩增，例如，通过给予能结合被检测分子并用可检测标记物(例如，放射性同位素)标记的分子(如抗体)，然后通过体外扫描患者以定位标记物。
在一个优选实施方式中，通过比较邻近健康组织或储存的正常组织内抗原的表达水平来选择目标肿瘤抗原。优选的候选肿瘤抗原包括那些表达水平相对于周围正常组织升高3倍(300％)的肿瘤抗原，其中这个3倍的升高可见于和大多数储存的商品化正常组织样品的比较。利用激光捕获显微镜切开癌组织与邻近正常组织，然后利用标准的商品化芯片如标准的Affimetrix芯片U133(编号900370)(参见，例如，Yang等，(2005)Oncogene，10-31)进行表达微阵列分析来筛选优选的肿瘤抗原。另外，可以制备包含核酸样品的商业芯片用于分析表达模式，其中的核酸样品来源于根据癌类型分组的患者组织样品库(参见，例如，Makino等，Dis Esophagus.2005；18(1)：37-40)。
如果被治疗的癌是不依赖激素的癌，那么可以利用现有的各种方法，例如上面所描述的方法，分析肿瘤内激素(例如，雄激素)和/或其同源受体的表达。另外，如果患者不再对抗雄激素治疗产生反应，那么该患者可被诊断为患有不依赖雌激素的癌。
在某些实施方式中，包含连接有细胞毒剂的抗肿瘤抗原抗体的免疫偶联物可以给予患者。优选的是，免疫偶联物和/或其结合的肿瘤细胞抗原蛋白可被细胞内化，导致免疫偶联物在杀伤其结合的癌细胞方面的治疗效应升高。在一个优选实施方式中，细胞因子靶向癌细胞内的核酸或干扰癌细胞的核酸。这种细胞毒剂的例子包括美登素、刺孢霉素、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。
抗肿瘤细胞抗原抗体或免疫偶联物可按照已知的方法给予病人，例如静脉注射，例如，推注或在一段时间内连续输注，通过肌肉注射、腹腔注射、脑脊髓内注射、皮下注射、关节内注射、滑膜腔内注射、鞘内注射、口服、局部给药、或吸入途径。静脉或皮下给予抗体是优选的。
给予抗肿瘤细胞抗原抗体也可以结合其他治疗方案。组合给药方案包括利用单独制剂或单一药学上可接受的制剂共同给药，以及以任何次序连续给药，其中优选的是期间有一段时间使两种(或所有)活性剂同时发挥其生物活性(综述参见，Lin等(2005)Clinical Cancer Research 11：129-138)。
在一个实施方式中，本发明的治疗方法包括共同给予抗肿瘤细胞抗原抗体(或抗体)和一种或多种化疗药物或生长抑制剂，其中包括共同给予不同化疗药物的混合物。优选的化疗药物包括紫杉类(例如紫杉醇和多西紫杉醇)和/或蒽环类抗生素。这种化疗药物的配制和给药方案可按照厂家的说明书制定或者技术人员根据经验确定。这种化疗的配制和给药方案也可参见《化疗服务》(Chemotherapy Service)，M.C.Perry编辑，Williams & Wilkins，巴尔的摩，马里兰州(1992)的描述。
抗体可以和抗激素化合物联合使用，例如，抗雌激素化合物如他莫昔芬；抗-孕激素化合物如奥那司酮(参见，EP 616 812)；或抗雄激素化合物如氟他米特，给药剂量为这种分子的已知给药剂量。如果被治疗的癌是不依赖激素的癌，或者患者以前已经进行过抗激素治疗并且在癌变成不依赖激素的癌以后，可以给予患者抗肿瘤细胞抗原抗体(以及可选的本文所述的其他试剂)。
在另一个实施方式中，免疫偶联物抗体可与裸抗体联合使用，其中非偶联抗体是与免疫偶联物中所使用的抗体相同的抗体或其变体。可以先给予裸抗体以结合和阻断低亲和力的或非特异性的结合位点。另外，如果裸抗体具有ADCC或CDC活性，那么给予该抗体后就能够通过这些活性中的一种尽可能多地清除靶肿瘤细胞。然后给予免疫偶联物抗体以杀伤剩余的肿瘤细胞。这种方式所用的免疫偶联物剂量更小，因此可降低与偶联物毒素部分相关的副作用。
上述共同给药的试剂的合适剂量是那些目前使用的剂量，由于试剂和抗肿瘤细胞抗原抗体协同效应可以适当降低。
对于疾病的预防或治疗来说，抗体合适剂量要根据上述被处理疾病的类型、疾病的严重程度和病程、是否为了预防或治疗的目的给予抗体、抗体是否结合药物或放射性同位素、以前的治疗、患者的临床历史和对抗体的反应以及主治医师的判断来定。抗体适于一次或通过一系列治疗来给予。根据疾病的类型和严重程度，给予患者的初始候选剂量为约1μg/kg到15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体，例如，通过一次或多次独立给药，或者连续输注。根据上述因素，一般的日用剂量为约1μg/kg到100mg/kg或更高。为了在几天或更长时间内重复给药，根据疾病的不同，治疗可以连续进行直到达到理想的疾病症状抑制效果。优选的抗体剂量为约0.05mg/kg到10mg/kg。因此，可以给予患者一次或多次约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的剂量(或其任何组合)。这种剂量可间断给予，例如，每周或每三周一次(例如，这样患者接受约2到20个剂量，如约6个剂量的抗肿瘤细胞抗原抗体)。剂量范围可以是约0.01mg/kg到40mg/kg、约0.01mg/kg到30mg/kg、约0.1mg/kg到30mg/kg、约1mg/kg到30mg/kg、约3mg/kg到30mg/kg、约3mg/kg到25mg/kg、约3mg/kg到20mg/kg、约5mg/kg到15mg/kg、或约7mg/kg到12mg/kg。应该认识到，治疗方法可包括单次给予治疗有效量，或者多次给予治疗有效量。另外，可以首先给予较高的起始剂量，然后再给予一次或多次较低的剂量。典型的给药方案包括给予约4mg/kg的起始剂量，然后给予约2mg/kg抗肿瘤细胞抗原抗体的每周维持剂量。但是，也可以采用其他给药方案。利用常规的技术和试验可以很容易地检测这种治疗方法所取得的进展。
本申请涉及向靶细胞转运诊断/检测或治疗剂的方法。诊断/检测剂可以是上面所描述的试剂，例如光活化剂、放射性核素或造影剂。治疗剂也可以是上述试剂，例如放射性核素、免疫调节剂、激素或激素拮抗剂、酶或酶抑制剂、光活化治疗剂、细胞毒剂及其组合。方法涉及提供本发明的组合物并将其给予有此需要的患者。本发明的抗体或免疫偶联物可首先给药，待其被从血流中清除后再给予包含诊断/检测或治疗剂或其组合的载体分子，其中载体分子与本发明的抗体结合。载体分子可结合到本发明的抗体或免疫偶联物的一个或多个位点上。
除了给予患者本发明的抗体蛋白以外，本申请还涉及通过基因治疗给予抗体。给予编码抗体的核酸的这种方式包括“给予治疗有效量的抗体”。参见，例如，1996年4月14日公开的WO96/07321所涉及的利用基因治疗产生细胞内抗体。
将核酸(可选的是，可包含在载体内)导入到患者细胞内的方法主要有两种，体内方法和体外方法。体内转运核酸是指直接注射到患者体内，通常注射到需要抗体的部位。体外处理是指将患者的细胞取出，将核酸导入到这些分离的细胞内，经修饰的细胞直接给予患者，或者，例如，包裹到有孔膜内再植入到患者体内(参见，例如美国专利号4892538和5283187)。现在已经有许多技术可用于将核酸导入到活细胞内。可以根据核酸是被转移到体外培养的细胞内还是被转移到目的宿主的体内细胞内来选择导入技术。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞内的方法包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、二乙氨乙基葡聚糖、钙磷酸盐沉淀方法等。体外转移基因的常用载体是逆转录病毒。
当前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(例如，腺病毒、单纯疱疹I病毒或腺相关病毒)和以脂质为基础的系统(例如，适用于脂质介导的基因转移的脂质有DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行转染。在某些情况下，比较理想的是提供核酸和能靶向到靶细胞的试剂，例如，细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体、靶细胞上的受体的配基等。如果使用脂质体，那么可以利用能结合到细胞表面内吞作用相关膜蛋白上的蛋白质来达到靶向作用和/或促进摄取，例如，对特定类型的细胞有亲嗜性的衣壳蛋白或其片段，在细胞周期中经历内化的蛋白质的抗体，以及指导细胞内定位和提高细胞内半衰期的蛋白质。例如，Wu等，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)描述了受体介导的内吞作用的技术。有关当前已知的基因标记和基因治疗方法的综述参见Anderson等，Science 256：808-813(1992)。也可参见WO 93/25673和其中引用的参考文献。
VIII.安全性研究
本发明抗体的安全性和毒理学特征将被研究。这类研究的指导可见于美国农业部生物制品评价和研究中心发布的文件“人用单克隆抗体产品制备和检测中需要考虑的要点”(“Points to Consider in the Manufacture and Testing ofMonoclonal Antibody Products for Human Use”)(参见http://www.fda.gov/cber/gdlns/ptc_mab.pdf)，本文已纳入作为参考。一般而言，处于临产前研究的候选抗体应该用大量的人组织样品和/或分离的多种人细胞进行筛选以评价非靶组织结合和交叉反应。从这些人组织研究中获得满意的结果以后，再筛选各种动物来源的一组组织样品或分离细胞以鉴定适用于一般毒理学研究的动物种类。如果未鉴定出有交叉反应的动物物种，也可以考虑其他合适类型的模型。这些模型包括试验如异种移植模型，其中人肿瘤细胞被植入到啮齿类宿主体内，或者使用能识别被选作毒理学研究的动物物种内相应的肿瘤细胞抗原的取代单克隆抗体。应当注意的是，这些类型的取代模型来源的数据应该首先进行近似，转化成较高物种时应该谨慎。
对于候选裸抗体来说可进行测定简单耐受性的研究。在这些研究中，可通过观察剂量依赖的药效学效应来确定候选治疗性抗体的治疗指数。所使用的剂量范围应该较宽(例如，0.1mg/kg到100mg/kg)。在估计治疗指数时应考虑肿瘤细胞抗原数之间的差异、候选抗体对交叉反应性动物靶位的亲和力以及抗体结合后细胞反应的差异。还应当用合适的动物模型进行药效学和药动学研究以帮助确定候选抗体用于人体试验时的初始剂量。
对于候选免疫偶联物来说，必须进行偶联物的体内稳定性研究。最好进行免疫偶联物各个组分的药效学和药动学研究以确定从候选免疫偶联物上裂解下来的产物可能造成的结果。如上所述，也需要用合适的动物模型进行药效学和药动学研究以帮助确定初始剂量。如果药物与裸抗体预处理组合使用，那么在进行安全性研究设计时还要考虑其他因素。必须单独用裸抗体进行安全性研究，在设计免疫偶联物的安全性研究时必须要记得，在这类治疗方案中免疫偶联物的最终给药剂量要适当降低。
对于放射性免疫偶联物来说，应该进行动物组织分布研究以获得生物分布数据。另外，应该计算所给放射性总剂量在早期和晚期采样点时的代谢降解。利用血清或血浆可检测放射性免疫偶联物的体外稳定性，所用方法应当能够测定游离放射性核素、放射性免疫偶联物和标记的非抗体化合物所占的百分率。
IX.制品
在本发明的另一个实施方式中，提供了包含治疗上述失调的材料的制品。制品包含一个容器和贴在容器上的标签或插页。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以是各种材料制成的，例如玻璃或塑料。容器内含有能有效治疗疾病的组合物，还可以带有一个无菌进入口(例如，容器可以是带有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉溶液袋或瓶)。组合物内至少有一种活性剂是抗肿瘤细胞抗原抗体。标签或包装插页说明组合物用于治疗选择的疾病，例如癌。在一个实施方式中，标签或包装插页说明包含与肿瘤细胞抗原结合的抗体的组合物可用于治疗表达肿瘤细胞抗原的癌。标签或包装插页还说明组合物可用于治疗癌，其中癌不具备过量表达肿瘤细胞抗原的特征。例如，虽然HERCEPTIN.RTM.现在的包装插页说明抗体可用于治疗转移乳腺癌患者，其中患者的肿瘤过量表达ErbB2蛋白，但是本文的包装插页可说明抗体或组合物可用于治疗癌，无论肿瘤细胞抗原过量表达的程度如何。在其他的实施方式中，包装插页可说明抗体或组合物可用于治疗乳腺癌(例如，转移的乳腺癌)；不依赖激素的癌；前列腺癌(例如，不依赖雄激素的前列腺癌)；肺癌(例如，非小细胞肺癌)；结肠、直肠或结肠直肠癌；或者本文公开的其他疾病或失调。另外，制品可包括(a)其中包含组合物的第一容器，其中的组合物包含可结合肿瘤细胞抗原并且能抑制过量表达肿瘤细胞抗原的细胞生长的第一抗体；以及(b)其中包含组合物的第二容器，其中的组合物包含可结合肿瘤细胞抗原的第二抗体。本发明的这个实施方式中的制品还可以包含说明第一和第二抗体组合物可用于治疗癌的包装插页。另外，包装插页可以指导组合物(包含可结合肿瘤细胞抗原的抗体)的使用者如何与抗体和前面章节所描述的任一辅助治疗方法(例如，化疗药物，抗血管形成药物、抗激素化合物和/或细胞因子)组成联合疗法。另外，制品还可以包含第二(或第三)容器，容器内包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包含满足商业需要和用户需要的其他材料，其中包括其他缓冲液、稀释剂、滤膜、针头和注射器。
X.抗肿瘤细胞抗原的抗体的非治疗用途
本发明的抗体(例如，抗肿瘤细胞抗原的抗体)还具有非治疗性的用途。
例如，抗体可用作亲和纯化材料。在这个过程中，抗体被固定在固相支持物如Sephadex树脂或滤纸上，所用方法是本领域所熟知的。固化的抗体与包含待纯化肿瘤细胞抗原蛋白(或其片段)的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤支持物，其中溶剂可基本去除样品中除肿瘤细胞抗原蛋白以外的所有材料，因为肿瘤细胞抗原蛋白被结合到固化的抗体上。最后，用另一种合适的溶剂洗涤支持物，例如甘氨酸缓冲液，pH5.0，这种溶剂可使肿瘤细胞抗原从抗体上释放下来。
抗肿瘤细胞抗原的抗体还可用于肿瘤细胞抗原蛋白的诊断试验，例如，检测特殊细胞、组织或血清内肿瘤细胞抗原蛋白的表达水平。
对于诊断用途来说，抗体一般要用可检测基序标记。现有许多标记物可用，一般可分为以下几类：
(a)放射性核素，如上面所讨论的那些。抗体可用放射性同位素标记，所用技术可见于《当代免疫学手册》(Current Protocols in Immunology)，1和2卷，Coligen等编辑，威利国际出版公司(Wiley-Interscience)，纽约，纽约州，出版(1991)，可通过闪烁计数来测定放射活性。
(b)荧光素标记物如稀土螯合剂(铕螯合剂)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红。荧光素标记物可结合到抗体上，所用技术可见于《当代免疫学手册》(Current Protocols in Immunology)，同上，的描述。荧光强度可用荧光计数仪定量测定。
(c)各种酶-底物标记物，美国专利号4275149提供了这些标记物中部分标记物的综述。酶通常可催化生色底物发生化学变化，利用各种方法可检测这种变化。例如，酶可催化底物的颜色发生改变，利用分光光度计可以测定这种改变。另外，酶可以改变底物的荧光强度或化学发光强度。上面已经描述了定量测定荧光强度变化的技术。化学发光底物通过化学反应可以变成电激发的，然后发射出可以测定(例如，利用化学发光计数仪)的光，或者供给荧光素受体能量。酶催化标记物的例子包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利号4737456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮(2，3-dihydrophthalazinedione)、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶酶体酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸氧化酶)、乳糖过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶连接到抗体上的技术见于O′Sullivan等，“用于酶免分析的酶-抗体偶联物的制备方法”(Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for usein Enzyme Immunoassay)，《酶学方法》(Methods in Enzym.)(J.Langone & H.VanVunakis编辑)，学术出版社，纽约，73：147-166(1981)。
酶-底物组合的例子包括，例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)和底物过氧化氢酶，其中过氧化氢酶可氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)和生色底物磷酸对硝基苯；以及
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和生色底物(例如，P-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或发荧光底物4-甲基伞形基(methylumbelliferyl)-β-D-半乳糖苷酶。
其他无数的酶-底物组合是本领域技术人员熟知的。这些组合的一般概况参见美国专利号4275149和4318980。
标记物有时可间接标记到抗体上。技术人员熟知用于达到此目的的各种技术。例如，抗体可用能与链亲和素结合的生物素和上述三类标记物中的任一标记物标记，反之亦然。生物素可特异性地结合链亲和素，因此，标记物可以这种间接方式连接到抗体上。另外，为了达到抗体与标记物间接连接的目的，抗体可与能结合抗半抗原抗体(例如，抗地高辛抗体)的小半抗原(如，地高辛)或上述三类标记物中的任一标记物结合。因此，可以达到抗体与标记物的间接连接。
在本发明的另一实施方式中，抗肿瘤细胞抗原抗体无需标记，其是否存在可用能结合肿瘤细胞抗原抗体的标记抗体检测。
本发明的抗体可用于任何已知的分析方法，例如，竞争结合分析、直接和间接三明治分析以及免疫沉淀分析。Zola，《单克隆抗体：技术手册》(MonoclonalAntibodies：A Manual ofTechniques)，147-158页(CRC出版有限公司，1987)。
对于免疫组化来说，肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的样品，或者可以用石蜡包埋，并用防腐剂如甲醛固定。
抗体还可用于体内诊断分析。一般来说，抗体用放射性核素标记，这样就可以通过免疫闪烁成像术来确定肿瘤的位置。为了便于操作，本发明的抗体可以试剂盒的方式提供，即，预定量的试剂和诊断分析操作说明书的包装组合。如果抗体用酶标记，那么试剂盒将包含酶所需要的底物和辅因子(例如，可提供可检测发色基团或荧光基团的底物前体)。另外，其他附加物也可以包括在内，例如，稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以变化很大，只要试剂溶液的浓度可以使分析的敏感性达到最佳就可以。优选的是试剂以干粉的形式提供，通常的冷冻干燥的，其中包括溶解时能提供具有合适浓度的试剂溶液的赋形剂。
本发明的其他细节通过下面非限定性的实施例来说明。说明书中所引用的所有文献都已特地纳入作为参考。
XI.实施例
实施例1肿瘤相关抗原靶位的选择A.激光分离肿瘤细胞和邻近正常组织并从分离的细胞中提取RNA
利用激光捕获显微解剖术(LCM)从患者体内取出正常组织和癌组织，然后用本领域熟知的技术从这些组织中提取RNA(参见，例如，Ohyama等(2000)Biotech′iques 29：530-6；Curran等(2000)Mol.Pathol.53：64-8；Suarez-Quian等(1999)Biotech′iques 26：328-35；Simone等(1998)Trends Gerzet 14：272-6；Conia等(1997)J.Clin.Lab.Anal.11：28-38；Emmert-Buck等(1996)Science 274：998-1001)。由于LCM可以分离出特定类型的细胞从而提供基本均一的细胞样品，因此所得到的是同样纯的RNA样品。
B.微阵列阵列分析
cDNA制备：从分离细胞中提取的总RNA用于制备cDNA，所用的是Affymetrix两轮cDNA合成试剂盒(Affymetrix Two-cycle cDNA Synthesis Kit)(编号900432)。8μL总RNA加入1μL T7-(dT)24引物(50pmol/μL)，反应体积为11μL，70℃加热12分钟。然后将混合物冷却到室温5分钟。加入9μL主混合物(4μL5×第一链cDNA缓冲液，2μL 0.1M DTT，1μL 10mM dNTP混合物，2μL Superscript II(600U/μL))，混合物在42℃孵育2.5小时(混合物总体积为20μL)。在冰上冷却以后按照如下步骤完成第二链合成：上述20μL混合物与130μL第二链主混合物(91μL水，30μL 5×第二链反应缓冲液，3μL 10mM dNTP混合物，1μL 10U/μL大肠杆菌DNA连接酶，4μL 10U/μL大肠杆菌DNA聚合酶I，1μL 2U/μL大肠杆菌RNA酶H)混合，并在16℃培育2小时，在16℃培育10分钟(and was incubated for 2 hours at 16℃ for 10minutes)。在冰上冷却以后，从反应混合物中纯化dsDNA。简言之，利用QiaQuick PCT纯化试剂盒(QiaQuick PCT Purification Kit)(Qiagen，编号28104)，5倍体积的缓冲液PB与1倍体积的cDNA混合物混合。然后按照厂家的说明书用QIAquick旋转柱纯化cDNA，得到的最终体积为60μL。
生物素标记cRNA的制备。按照上述方法制备和纯化的cDNA用于制备生物素标记的RNA，方法如下：从QIAQuick柱中回收的60μL cDNA用中度真空(medium heated speed vacuum)浓缩到22μL体积。然后用ENZO生物阵列高产率RNA转录试剂盒(ENZO BioArray High Yield RNA Transcription Kit)(编号4265520)处理。简言之，包含4μL 10×HY反应缓冲液、4μL 10×生物素标记的核糖核苷酸、4μL DTT、4μLRNA酶抑制剂混合物和2μL T7RNA聚合酶的主混合物加到22μL纯化的cDNA中，在37℃孵育4到6小时。然后按照厂家的说明书用Qiagen Rneasy试剂盒(编号74104)纯化反应产物。
cRNA的片段化。上述15到20μg cRNA与8μL 5×片段化缓冲液(200mMTris-乙酸，pH8.1，500mM乙酸钾，150mM乙酸镁)和水混合，终体积为40μL。混合物在94℃孵育35分钟。一般而言，这种片段化方法可使RNA片段分布在35到200个碱基大小的范围内。通过TAE琼脂糖电泳确认片段化情况。
阵列阵列杂交。上述片段化的cRNA用于制备杂交混合物。简言之，40μL上述cRNA片段与1mg/mL人Cot DNA和合适的对照寡核苷酸混合。另外，加入3mg鲱鱼精DNA(10mg/mL)和150μL 2×杂交缓冲液(100mM MES，1MNaCl，20mM EDTA，0.01％ Tween-20)以及水是终体积达到300μL。然后将200μL这种溶液加载到U133阵列(Affymetrix编号900370)上，45℃、45rpm恒速振荡过夜。然后去掉杂交缓冲液，用200μL非严格洗涤缓冲液(6X SSPE，0.01％ Tween-20)洗涤阵列并按照厂家的说明书用基因芯片射流工作站450(GeneChip Fluidics Station450)(Affymetrix，编号00-0079)染色。
扫描阵列。按照厂家提供的操作方法，用基因芯片扫描仪3000(GeneChipScanner 3000)(Affymetrix编号00-0217)扫描上述阵列。
潜在肿瘤细胞抗原靶位的筛选。通过比较肿瘤细胞(原发肿瘤或转移瘤)内抗原的表达水平与邻近健康组织或储存的正常组织内抗原的表达水平来选择肿瘤抗原。筛选出的肿瘤抗原的表达水平至少比周围正常组织升高3倍(300％)，其中这个3倍升高见于和大多数储存的商品化的正常组织样品的比较(标准参照混合或RSM，每一种类型的组织都有储存库)。下面的表2给出了KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5的阵列分析所得到升高倍数，其中数字代表所分析的与正常组织比较表达水平升高2、3或5倍的患者样品数量。
表2-KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5的微阵列分析结果
表2a-FLJ23390
 
患者类型 患者数 升高2倍 升高3倍 升高5倍
原发结肠癌 对 正常 RSM 25 20 4 0
结肠转移癌 对 正常 RSM 33 0 0 0
原发乳腺癌 对 正常 RSM 20 100 75 25
原发前列腺癌 对 正常 RSM 22 0 0 0
原发前列腺癌 对正常 17 6 6 0
表2b-LOC157378
 
患者类型 患者数 升高2倍 升高3倍 升高5倍
原发结肠癌 对 正常 RSM 26 50 23 9
结肠转移癌 对 正常 RSM 32 50 44 22
原发乳腺癌 对 正常 RSM 49 24 6 2
原发前列腺癌 对 正常 RSM 21 14 0 0
原发前列腺癌 对正常 15 40 7 0
表2c-FLJ20421
 
患者类型 患者数 升高2倍 升高3倍 升高5倍
原发结肠癌 对 正常 RSM 26 35 15 0
结肠转移癌 对 正常 RSM 33 24 3 0
原发乳腺癌 对正 常 RSM 50 70 40 14
原发前列腺癌 对 正常 RSM 22 14 5 0
原发前列腺癌 对 正常 17 24 0 0
表2d-DCSD75
 
患者类型 患者数 升高2倍 升高3倍 升高5倍
原发结肠癌 对 正常 RSM 27 52 37 7
结肠转移癌 对 正常 RSM 33 76 36 9
原发乳腺癌 对 正常 RSM 49 22 2 0
原发前列腺癌 对 正常 RSM 22 5 0 0
原发前列腺癌 对 正常 16 12 0 0
表2e-GPR160
 
患者类型 患者数 升高2倍 升高3倍 升高5倍
原发结肠癌 对 正常 RSM 26 23 8 0
结肠转移癌 对 正常 RSM 33 12 0 0
原发乳腺癌 对 正常 RSM 46 24 9 0
原发前列腺癌 对 正常 RSM 22 36 9 5
原发前列腺癌 对 正常 17 59 24 6
表2f-GPCR41
 
患者类型 患者数 升高2倍 升高3倍 升高5倍
原发结肠癌 对 正常 RSM 23 48 17 4
结肠转移癌 对 正常 RSM 30 77 50 13
原发乳腺癌 对 正常 RSM 43 63 40 23
原发前列腺癌 对 正常 RSM 0 0 0 0
原发前列腺癌 对 正常 3 33 33 33
表2g-SLC1A5
 
患者类型 患者数 升高2倍 升高3倍 升高5倍
原发结肠癌 对 正常 RSM 26 15 4 0
结肠转移癌 对 正常 RSM 31 13 0 0
原发乳腺癌 对 正常 RSM 39 18 3 0
原发前列腺癌 对 正常 RSM 1 100 0 0
 
原发前列腺癌 对 正常 6 67 50 33
实施例2-癌组织对正常组织的表达分析
实施例1所用的微阵列方法还可用于检测多种类型的癌和多种正常样品来源的组织内的表达。cDNA、RNA的制备方法和杂交条件与实施例1所使用的相同，除了使用U133 Plus 2.0阵列(Affymetrix编号900470)之外。DecisionSite软件(Spotfire，萨默维尔，马萨诸塞州)和内部开发的Pipeline Pilot(SciTegic，圣地亚哥，加州，内部开发者Josef Ringgenberg)程序用于生成图1-6所示的说明图。在图示中，正常组织和癌组织置于水平轴。癌组织标记以“c”，例如，“c_乳腺_导管(c_breast_duct)”代表乳腺癌组织样品，“n”都代表正常组织。组织类型还标记上相关的组织类型和亚型，如果是已知的话。例如，“c_乳腺_导管”是定位在乳腺导管的乳腺癌来源的癌组织。如果在手术切除时不清楚亚型或者亚型是未知的，那么标记“ns”代表“非特异性的”。垂直轴上的每一个点代表一个患者来源的一个组织样品，每个点在垂直轴上的高度(以log2为基础)探针组的相对表达水平。实心圈代表表达水平在线性检测范围内的样品。空心圈代表样品中的基因表达水平位于上限，其中基因处于探针组的检测限以下。空心方块代表样品中的基因表达水平处于低限，其中探针组是饱和的。简言之，在进行分析之前，通过分析大量不同样品组的组成探针的行为来校正每一个探针组。这种校正决定了每一个探针的相对敏感性和强度范围，在此范围内探针之间的探针组反应是线性的。该范围以下的强度被称为“未检测出”，而该范围以上的强度被称为“饱和的”。由于样品之间的杂交效率和标记效率存在变异，因此每一个芯片在经过校正以后还要进行标准化。
实施例3-分析肿瘤细胞抗原的胞外域
肿瘤细胞抗原经过上述鉴定以后，分析蛋白质的拓扑学结构以鉴定其理论胞外域。两种分析算法可用于预测跨膜区，结果进行比较。第一种算法是TMpred(参见K.Hofmann & W.Stoffel(1993)TMbase-跨膜蛋白片段数据库(TMbase-A database of membrane spanning proteins segments)，B iol.Chem.Hoppe-Seyler 374，166)。第二种分析程序是TMHMM(A.Krogh，B.Larsson，G.von Heijne，和E.L.L.Sonnhammer，利用隐藏的Markov模型预测跨膜蛋白的拓扑学结构：应用于完整基因组(Predicting transmembrane protein topologywith a hidden Markov model：Application to complete genomes)，Journal ofMolecular Biology，305(3)：567-580，2001/01)。所得到的每一个肿瘤细胞抗原的结果列于下面的表3中。总之，两组分析方法所得到的结果比较一致，尽管在某些例子中算法不能预测一个拓扑学方向的准确性一定超过另一个。在那些例子中，两种方向都被列出。表3列出了推测的跨膜螺旋(跨膜螺旋)的位置以及蛋白质理论上位于浆膜外或浆膜内的部分。另外，SignalP 3.0(Bednsten等，(2004)J Mol Biol.2004 Jul 16；340(4)：783-95)也可用于预测信号肽是否存在以及预测那些肽从全长蛋白上裂解下来的位置。处于细胞外的蛋白部分可以作为抗原作用的靶位。
表3a-KIAA1815：登录号NP_079172，902aas.
Figure A200780016191D00881
SignalP3.0预测的无信号肽
表3b-BC017881：登录号NP_919267，240aas
Figure A200780016191D00882
Figure A200780016191D00891
SignalP 3.0预测的信号肽位于aa1-48。
表3c-FLJ20421：登录号AAH67814，359aas.
Figure A200780016191D00892
SignalP3.0预测的信号肽位于aa1-50。
表3d-DSCD75：登录号AAF65450，208aas
SignalP3.0预测的信号肽位于aa1-30.
表3e-GPR160：登录号NP_055188，，338aas
Figure A200780016191D00894
SignalP 3.0预测的信号肽位于aa1-38.
表3f-GPCR41：登录号AAH02917，445aas
Figure A200780016191D00902
SignalP 3.0预测的信号肽位于aa1-25.
表3g-SLC1A5：登录号AAH00062，541aas
SignalP 3.0预测的信号肽位于aa1-35
实施例4-抗KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5单克隆抗体的制备
A.KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5的PCR克隆
基本按照Chirgwin等，Biochemistry(1979)17：5294所描述的方法从表达癌细胞抗原的人癌细胞群中分离RNA。简言之，细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次，在含0.7M2-巯基乙醇的5M硫氰酸胍中裂解。然后通过氯化铯梯度离心(Chirgwin等)使细胞裂解物分层，离心用Beckman SW28转子，26,000rpm离心16小时。用DEPC处理的水溶解沉淀后得到RNA。RNA用乙醇沉淀一次，重悬于DEPC处理水中，-70℃保存。
用随机六聚引物将总RNA(每个反应10μg)转化成cDNA，反应缓冲液体积为50μl，其中包含500U MLV-RT(马里兰州贝斯达的贝斯达研究实验室(Bethesda Research Laboratories，Bethesda，Md.))、5μM随机六聚引物(Pharmacia，皮斯卡塔韦，新泽西州)、1mM DTT、dNTP混合物(每种dNTP0.5mM)、10mM Tris-HCL pH8.3、50mM KCl、2.5mM MgCl2和0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)。37℃孵育1小时后，样品煮沸3分钟，-70℃保存。编码KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5分子的DNA通过PCR制备，引物包含与已知的KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5序列同源的序列，其中引物还编码用于克隆的限制性酶切位点。这些引物是根据已公开的编码KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5的cDNA序列来设计的。所有引物的5’端都以C-G夹起始，随后是用于克隆的限制性酶切位点。
在进行PCR扩增时，1μl cDNA与1μl(10皮摩尔)正向引物、1μl(10皮摩尔)反向引物和47μl PCR混合物混合。PCR混合物包含1.25U Taq聚合酶(Perkin-Elmer/Cetus，诺沃克(Norwalk)，国康涅狄格州)、dNTP混合物(每种0.2mM)、10mM Tris-HCL pH8.3、50mM KCl、2.5mM MgCl2和0.1mg/ml BSA。50μl PCR混合物上覆盖70μl矿物油，在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪上进行25个循环的扩增(95℃变性30秒、55℃引物复性30秒和72℃延伸1.5分钟)。经过25个扩增循环以后可得到PCR产物。
扩增产物通过大小排阻色谱分离。在杆状病毒内表达之前，所有片段的DNA序列都要通过序列分析加以确认，以免引入RNA诱导的突变。
扩增片段与合适的表达载体(例如，杆状病毒表达系统所使用的pAcC8载体)连接。连接产物转化到菌株DH5α(Gibco/BRL，盖茨伯格(Gaithersburg)，马里兰州)内，根据氨苄青霉素的耐药性筛选重组的pAcC8载体。从细菌克隆中分离重组质粒(Maniatis等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)(纽约冷泉港：冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratories))，1982；Ausubel等，《当代分子生物学手册》(Current Protocols inMolecular Biology)(米底亚(Media)，宾夕法尼亚州：约翰威利父子公司(JohnWiley and Sons)))，通过聚合酶链式反应确认目的插入片段是否存在(见上)。大规模质粒的制备可按标准方法操作(Ausubel等；Maniatis等；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(纽约冷泉港：冷泉港实验室)，1989)。
B.人KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5的杆状病毒表达
利用包含全长目的DNA分子的转移载体将编码人KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5的序列分别重组到苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)杆状病毒(AcNPV)内。质粒与野生型的杆状病毒DNA(2-10pfu)共转染(AcNPV；Summers等，《杆状病毒载体操作方法和昆虫细胞培养方法》(A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect CellCulture Procedures)，得克萨斯州农业实验站第1555号公报(Texas AgriculturalExperimental Station Bulletin No.1555)(1987))到Sf9(草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda))细胞内，密度为106细胞/mL(Summers等)。重组杆状病毒感染的Sf9细胞经过鉴定后进行克隆纯化(Summers等)。对于细胞表面表达的重组蛋白来说，在培养后48小时收获细胞。
C.宿主动物免疫
在0天和14天时，雌性BALB/c小鼠腹腔注射5×106Sf9细胞，该细胞感染有包含目的基因的病毒或不含任何插入片段的对照病毒。在21天时，采集100μl血清用于检测特异性抗体是否存在。在经过至少两周的休息期后，小鼠最后一次接受重组病毒或对照病毒感染的5×106Sf9细胞的注射。最好一次注射后3天，收获脾细胞用于细胞融合。
D.杂交瘤克隆的制备
免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，比例为10:1，使用的试剂为50％的聚乙二醇，融合方法为de Boer等，J.Immunol.Meth.(1988)113：143以前描述的方法。融合细胞重悬到添加次黄嘌呤(0.1mM)、氨基蝶呤(0.01mM)、胸腺嘧啶核甙(0.016mM)和0.5ng/ml hIL-6(Genzyme，剑桥(Cambridge)，马萨诸塞州)的完全IMDM中。然后将细胞分散到96孔组织培养板内，使每一个孔平均包含一个活的杂交瘤细胞。
10-14天以后，检测杂交瘤细胞群的上清中是否有特异性抗体产生。阳性杂交瘤细胞通过在含0.5ng/mL hIL-6的IMDM/FBS中有限稀释进行三次克隆。
E.噬菌体展示技术或转基因动物技术的应用
除了通过杂交瘤技术制备抗体以外，还可以利用展示技术或转基因动物来生产本发明的抗体。
目前有多种展示技术可用于纯化人抗体(参见Hoogenboom(2005)NatureBiotechnology 23(9)：1105-1116)。噬菌体展示是一种特异性的展示技术，可用于制备本发明的人抗体。利用1-20μg纯化的肿瘤细胞抗原包被ELISA板的孔以进行第一轮淘选。一般每个孔内加入1×1010到1×1011pfu的噬菌体文库(关于噬菌体文库构建方法以及更详细的操作信息，参见，例如P.M.O′Brien和R.Aitken的《抗体噬菌体展示技术》(Antibody Phage Display)Humana出版社，2001)。孵育以后，洗涤孔，然后用盐或低pH的甘氨酸溶液洗脱结合的噬菌体。洗脱下来的噬菌体通过感染细菌来扩增，扩增和纯化的噬菌体颗粒用于下面几轮的淘选。如果需要也可以利用其他淘选技术，例如以细胞为基础的抗肿瘤细胞抗原表达细胞的淘选技术。另外，也可以利用液相淘选方法。一般而言，在后面几轮的淘选中使用较低浓度的纯化抗原以筛选出具有较高亲和力的抗体。需要进行的淘选轮数要根据靶抗原和文库而定。在其他的轮次中也可以采用淘选技术如固相支持物上和完整细胞上进行淘选。一旦鉴定出能够产生具有理想特性的抗体的抗体克隆，就可以从噬菌体分离编码该抗体的基因，并在各种以细菌、真菌或哺乳动物细胞为基础的表达系统中表达。
如果用转基因小鼠制备人抗体，那么可以给动物注射纯化的肿瘤细胞抗原或者表达该抗原的完整细胞。例如，小鼠按照下列方式共进行8次注射：在0天时，将107表达目的肿瘤细胞抗原的细胞注射到转基因小鼠的脚掌内。在3、7、10和14天，小鼠进行加强注射，每次注射107表达目的肿瘤细胞抗原的细胞加10μgCpG多聚核苷酸。在17、21和27天，小鼠再次加强注射纯化的肿瘤细胞抗原蛋白。在31天时收集免疫转基因小鼠的全血，利用标准方法制备杂交瘤细胞。得到的杂交瘤细胞按照上述“D”部分描述的方法筛选。
F.人源化/其他修饰
如果希望本发明抗体的ADCC或CDC活性能够得到提高，那么抗体必须包含人的或人源化的恒定区。如果本发明的抗体来源于非人物种，那么本发明抗体的可变区可融合到人恒定区上。融合到人恒定区上以后，可变区还可以被进一步人源化以降低其潜在的免疫原性。另外，在该位点上还可以进行其他遗传学的或重组的修饰，例如其中包括构建融合蛋白、亲和力突变或构建其他效应功能。
G.单克隆抗体的纯化
可利用标准的蛋白A层析和本领域熟知的技术从杂交瘤培养物中纯化目的抗体。按照木领域熟知的方法，收获杂交瘤上清，然后通过过滤去除所有的细胞。滤液上载到蛋白A层析柱上(如果需要可以重复多次)。洗涤层析柱后从中洗脱下表达的和分泌的免疫球蛋白多肽。为了制备抗体，蛋白A池要置于低pH环境中(在pH3的环境中最少保持30分钟，最多保持1小时)作为灭活病毒的步骤。然后利用吸附性的阳离子交换步骤进一步纯化产物。从吸附性的分离层析柱中洗脱下来的洗脱液通过病毒滞留滤器以进一步清除潜在的病毒颗粒。通过产物不会与之结合的阴离子交换柱进一步纯化滤液。最后，通过渗滤将产物转移到制剂缓冲液中结束纯化过程。将渗滤液的蛋白浓度调整到至少1mg/mL并加入稳定剂。
H.结合亲和力的特征
可以利用BlACore微芯片分析技术分析本发明的抗体对目的靶位的亲和力，例如，使用BlACore 2000分析仪以及与其配套的CM5传感芯片(BlACore；皮斯卡塔韦，新泽西州)。按照厂家的说明书，利用连续流动的HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，0.15M NaCI，3.4mM EDTA，0.005％P-20，pH7.4)将纯化的抗原蛋白固定在传感芯片表面。通过注射60uL包含0.2M N-乙基-N′-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物活化传感芯片表面的羧基基团。通过注射重组的肿瘤细胞抗原获得特异性表面，其中的抗原溶于10mM乙酸盐，pH4.5(BlACore公司；皮斯卡塔韦，新泽西州)中，浓度为10ug/mL，得到2000共振单位(RU)的中等表面密度。在某些实施方式中，可以采用其他浓度的肿瘤细胞抗原，例如25g/mL。芯片表面多余的反应基团通过注射60uL1M乙醇胺灭活。每个传感芯片上都制备一个空白的模拟物偶联参照表面。模拟物偶联、活化和灭活步骤不涉及蛋白。
将候选单克隆抗体稀释到样品缓冲液(1X PBS+0.005％P-20+0.1mg/mLBSA(成分V，无IgG；Sigma公司)，过滤并除去气体)，浓度为25nM，以80pUmin的流速在2分钟内注射到肿瘤细胞抗原表面上。对于所有的分析，设备运行缓冲液都是1×PBS(无氯化钙，无氯化镁；Gibco Inc.)+0.005％P-20(过滤并除去气体)，温度设定在25℃。定量比较抗体结合曲线的结合信号强度和解离速率。
I.偶联
如果本发明的抗体被用作免疫偶联物的成分，那么现在就将纯化的抗体连接到另一个基序上。例如，抗体可连接到ADEPT技术所使用的前药活化酶、放射性核素、毒素或其他免疫调节剂上。
实施例5-抗肿瘤细胞抗原抗体的体外筛选试验
A.筛选ADCC活性
体外ADCC试验：为了制备51Cr标记的靶细胞，在组织培养板上培养肿瘤细胞系，用PBS配制的10mM无菌EDTA收获细胞。消化下的细胞用细胞培养基洗涤两次。细胞(5×106)用200μCi的51Cr(新西兰核制品公司/杜邦公司)标记，37℃标记1小时，期间偶尔进行混合。标记的细胞用细胞培养基洗涤三次，然后重悬成1×105细胞/mL。在下一步试验前细胞或者不进行调理，或者进行调理，PBMC试验中细胞与100ng/ml和125ng/ml的试验抗体共孵育，NK试验中细胞与20ng/mL和1ng/mL的试验抗体共孵育。外周血单个核细胞按照如下过程制备：从正常健康供者体内采集肝素化的血液，用等体积的磷酸缓冲盐水(PBS)稀释。按照说明书的指导，将血液加到淋巴细胞分离培养基(LYMPHOCYTE SEPARATION 
Figure A200780016191D0096185848QIETU
)(LSM：Organon Teknika))上层并离心。从LSM-血浆界面上收集单个核细胞，用PBS洗涤三次。效应细胞以1×107细胞/mL的终浓度悬浮到细胞培养基中。经过LSM纯化以后，按照厂家的说明书，利用NK细胞分离试剂盒和磁柱(Miltenyi Biotech)通过负筛选从PBMC中分离天然杀伤细胞(NK)。然后收集分离的NK细胞，洗涤后重悬到细胞培养基内，浓度为2×106细胞/mL。通过流式细胞术分析确定NK细胞。在微孔滴定板上用细胞培养基无菌倍比稀释效应细胞(PBMC或NK)以制备不同效：靶比例的细胞混合物(每孔的最终体积为100μL)。效应细胞的浓度范围为：PBMC从1.0×107/mL到2.0×104/mL，NK从2.0×106/mL到3.9×103/mL。稀释好效应细胞以后，滴定板的每个孔内加入100μL浓度为1×105细胞/ml的51Cr标记靶细胞(调理的或未调理的)。这样PBMC的初始效:靶比为100:1，NK的初始效；靶比为20:1。所有样品都设双复孔，每个滴定板都包含自发裂解(无效应细胞)和完全裂解(靶细胞加100μL1％十二烷基硫酸钠，1N氢氧化钠)对照。滴定板在37℃孵育18小时，然后利用上清液收获系统(Skatron仪器公司)细胞培养上清，在Minaxi γ5000系列自动γ计数仪(Minaxi auto-gamma 5000seriesgamma counter)(Packard)计数1分钟。结果表示为百分细胞毒性，使用下列公式计算：％细胞毒性＝(样品cpm-自发裂解)/(完全裂解-自发裂解)×100。
B.筛选凋亡活性
该试验依据的是膜联蛋白V对磷脂酰丝氨酸(PS)有较高的亲和力，膜联蛋白V暴露于细胞外，是凋亡过程的早期标志。表达肿瘤细胞抗原的细胞用添加10％热灭活FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的DMEM:Ham′s F-12(50:50)中培养。表达肿瘤抗原的细胞接种到100×20mm培养皿中，接种密度为3 x 106/皿，培养过夜使细胞贴壁。利用现有的任何膜联蛋白V染色试剂都可以检测细胞表面PS，这些试剂所依据的都是膜联蛋白V对PS的高亲和力。然后去掉培养基，或者更换单独的培养基，或者更换含10μg/mL单克隆抗体的培养基。培养三天以后，用PBS洗涤细胞单层，然后用胰酶消化分离细胞。细胞离心、重悬到Ca2+结合缓冲液中，然后分装到管内。在管内加入标记的膜联蛋白V(例如，膜联蛋白V-FITC)(1μg/mL)。样品用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件(BD公司)分析。那些能够明显诱导膜联蛋白结合水平相对于对照升高的抗体被选择为凋亡诱导抗体。
实施例6-目的抗体的体内特征
检测抗体在体内抑制肿瘤形成和/或生长、抑制接种肿瘤的生长或降低其大小、抑制转移肿瘤、或治疗接种的转移肿瘤的能力。根据RNA或蛋白表达分析所检测出的肿瘤细胞系上表达的肿瘤抗原来选择每种肿瘤抗原的相关肿瘤模型。本文所描述的肿瘤细胞抗原的代表性肿瘤细胞系包括而不限于：
KIAA1815：
    人乳腺癌细胞系T47D
    人结肠癌细胞系COLO205
    人结肠癌细胞系HT29
    人结肠癌细胞系HCT116
LOC157378：
    人非小细胞肺癌细胞系A549
FLJ20421：
    MDA-MB-435
DSCD74：
    人结肠癌细胞系KM12
    COLO205
GPR160：
    人乳腺癌细胞系T47D
    人乳腺癌细胞系MCF7
GPCR41：
    人结肠癌细胞系COLO205
    人前列腺癌细胞系PC3-M-luc
    人乳腺癌细胞系MDA-MB-435
SLC1A5
    人结肠癌细胞系COLO205
    人结肠癌细胞系SW620
A.肿瘤形成或生长
4-7周龄、平均体重20g的免疫妥协小鼠用于这些试验。
i)用抗肿瘤细胞抗原抗体治疗直肠结肠癌
按照Sheng等J.Clin.Invest.99：2254-2259(1997)的描述将人直肠结肠癌细胞系如COLO205、KM-12或SW620植入到无胸腺裸鼠皮下。小鼠随机分组并在肿瘤植入的当天开始用0.1-50mg/kg目的单克隆抗体治疗，通过静脉注射或腹腔注射，每周两次。用卡钳测量肿瘤的宽度和长度用于计算肿瘤的体积。预计上述试验的结果是肿瘤形成或生长被抑制。
ii)用抗肿瘤细胞抗原的抗体治疗乳腺癌
按照Sheng等J.Clin.Invest.99：2254-2259(1997)的描述将人乳腺癌细胞系如T47D、MCF-7或MDA-MB-435植入到无胸腺裸鼠皮下。另外，细胞也可以通过直接注射或手术正位植入到乳房脂肪垫内。这些肿瘤模型的生长是雌激素依赖性的，所用小鼠为喂养雌激素的雌性小鼠。小鼠随机分组并在肿瘤植入的当天开始用0.1-50mg/kg目的单克隆抗体治疗，通过静脉注射或腹腔注射，每周两次。用卡钳测量肿瘤的宽度和长度用于计算肿瘤的体积。预计上述试验的结果是肿瘤形成或生长被抑制。
iii)用抗肿瘤细胞抗原的抗体治疗肺癌
按照Sheng等J.Clin.Invest.99：2254-2259(1997)的描述将人非小细胞肺癌细胞系如A549植入到无胸腺裸鼠皮下。小鼠随机分组并在肿瘤植入的当天开始用0.1-50mg/kg目的单克隆抗体治疗，通过静脉注射或腹腔注射，每周两次。用卡钳每周两次测量肿瘤的宽度和长度用于计算肿瘤的体积。预计上述试验的结果是肿瘤形成或生长被抑制。
iv)用抗肿瘤细胞抗原的抗体治疗前列腺癌
利用人前列腺癌PC-3或PC-M-luc肿瘤模型评价本发明的抗体对人前列腺癌细胞的效应。细胞皮下注射给雄性小鼠。小鼠随机分组(每组10只)，在0天时用本发明的抗体或同种型MAb对照静脉或腹腔注射给小鼠。动物每周治疗两次，用卡钳每周两次测量肿瘤的宽度和长度以检测肿瘤的生长情况。另外，如果植入的是PC-3M-luc细胞，可以利用Xenogen IVIS系统通过生物发光造影来监测肿瘤的生长，每周一次或两次测定肿瘤内的荧光素酶信号。
B.转移抑制
利用人前列腺PC-M-luc肿瘤模型评价本发明的抗体对然前列腺癌细胞转移和转移癌在骨及软组织内生长的影响。细胞通过心内注射途径注射给雄性小鼠。小鼠随机分组，在0天时用本发明的抗体或同种型MAb对照初次静脉或腹腔注射给小鼠。动物每周治疗两次。利用Xenogen IVIS(带Living Image 2.5软件的Xenogen 100系列)系统通过生物发光造影来监测骨和软组织内肿瘤的生长，每周一次测定肿瘤内的荧光素酶信号。另外，在植入肿瘤细胞后1-3周利用Xenogen IVIS系统对动物进行造影，然后在开始抗体治疗前根据荧光素酶信号将小鼠随机分组。每周一次利用Xenogen IVIS造影评价肿瘤生长反应。权利要求书。

Claims (43)

1.一种诊断、检测或治疗哺乳动物体内的癌的方法，其中的癌所表达的肿瘤细胞抗原相对于邻近的正常组织样品或储存的正常组织样品至少升高3倍，该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的能结合该肿瘤细胞抗原的抗体或其片段，且其中所述肿瘤细胞抗原选自如下一组：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。
2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体是人的、人源化的、嵌合的抗体或其片段。
3.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述片段选自由Fv、F(ab′)2、Fab′和Fab组成的一组。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段特异性结合所述肿瘤细胞抗原的胞外域，其中所述肿瘤细胞抗原选自如下一组：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。
5.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体结合KIAA1815的胞外域，且其中所述胞外域选自如下一组：约1-408位的氨基酸、约474-489位的氨基酸、约545-581位的氨基酸、约603-621位的氨基酸、约642-653位的氨基酸以及约674-904位的氨基酸。
6.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体结合BC017881的胞外域，且其中所述胞外域选自如下一组：约1-117位的氨基酸、约140-148位的氨基酸、约165-211位的氨基酸以及约230-240位的氨基酸。
7.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体结合FLJ20421的胞外域，且其中所述胞外域是约30-359位的氨基酸。
8.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体结合DSCD75的胞外域，且其中所述胞外域是约20-208位的氨基酸。
9.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体结合GPR160的胞外域，且其中所述胞外域选自如下一组：约1-15位的氨基酸、约80-93位的氨基酸、约157-182位的氨基酸以及约263-276位的氨基酸。
10.如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体结合GPCR41的胞外域，且其中所述胞外域选自如下一组：约31-49位的氨基酸、约104-112位的氨基酸、约134-145位的氨基酸、约170-195位的氨基酸、约212-270位的氨基酸、约299-307位的氨基酸、约360-368位的氨基酸、约390-403位的氨基酸以及约427-445位的氨基酸。
11.如上述权利要求中任一权利要求所述的诊断、检测或治疗哺乳动物体内的癌的方法，其特征在于，所述抗体或其片段是免疫偶联物。
12.如权利要求11所述的诊断、检测或治疗性免疫偶联物，其包含抗体，所述抗体包含抗肿瘤细胞抗原抗体或其片段或者抗肿瘤细胞抗原抗体融合蛋白或其片段，其中，所述抗体组分连接有至少一种诊断/检测剂或至少一种治疗剂。
13.如权利要求12所述的诊断/检测免疫偶联物，其特征在于，所述诊断/检测剂包含至少一种光活化的诊断/检测剂，其中所述光活化诊断剂包括发色团或染料。
14.如权利要求12所述的诊断/检测免疫偶联物，其特征在于，所述的免疫偶联物被用于术中的、内窥镜的、或血管内的肿瘤检测/诊断中。
15.如权利要求12所述的治疗性免疫偶联物，其特征在于，所述的治疗剂选自下组：放射性核素、硼、钆或铀原子、免疫调节剂、细胞因子、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、光敏治疗剂、细胞毒药物、毒素、血管生成素抑制剂、不同的抗体及其组合。
16.如权利要求15所述的治疗性免疫偶联物，其特征在于，所述细胞毒药物是药物、前药、酶或毒素。
17.权利要求15所述的治疗性免疫偶联物，其特征在于，所述细胞毒药物是刺孢霉素或刺孢霉素类似物、美登素或美登素衍生物、或奥瑞斯他汀E或奥瑞斯他汀E衍生物。
18.如权利要求15所述的治疗性免疫偶联物，其特征在于，所述细胞毒药物是毒素或其片段，其中所述毒素选自由植物、微生物和动物毒素及其合成变体组成的一组。
19.如权利要求15所述的治疗性免疫偶联物，其特征在于，所述免疫调节剂选自由细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、抗体及其组合组成的一组。
20.如权利要求15所述的治疗性免疫偶联物，其特征在于，所述酶是前药活化酶。
21.如权利要求20所述的治疗性免疫偶联物，其特征在于，所述前药活化酶选自由碱性磷酸酶、芳基硫酸酯酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、糖裂解酶如β-半乳糖苷酶和神经酰胺酶、β-内酰胺酶、青霉素酰胺酶以及具有酶活性的抗体组成的一组。
22.一种多价、多特异性抗体或其片段，其中包含一个或多个与肿瘤细胞抗原有亲和力的抗原结合位点以及一个或多个与表位有亲和力的表位结合位点，其中所述肿瘤细胞抗原选自由KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5组成的一组。
23.如权利要求22所述的多价、多特异性抗体或其片段，其特征在于，所述多价、多特异性抗体或其片段是人的、人源化的或嵌合的多价、多特异性抗体或其片段。
24.如权利要求22所述的多价、多特异性抗体或其片段，还包含诊断/检测或治疗剂。
25.一种抗体融合蛋白或其片段，其包含至少两个抗肿瘤细胞抗原的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段选自权利要求1所述的抗肿瘤细胞抗原的抗体或其片段。
26.一种治疗哺乳动物体内的癌的方法，该方法包括用治疗有效量的上述任一权利要求所述的抗体或其片段治疗，其中所述抗体被制备成治疗上可接受的制剂。
27.一种诊断/检测哺乳动物体内的癌的方法，该方法包括给予所述哺乳动物诊断有效量的前述任一权利要求所述的抗体或其片段的步骤，其中所述抗体或其片段用药学上可接受的载体制成制剂。
28.一种治疗或诊断/检测哺乳动物体内的癌的方法，该方法包括(i)给予有此需要的哺乳动物上述任一权利要求所述的抗体或其片段；(ii)等待足够的时间使非结合蛋白被清除出哺乳动物的血流；以及(iii)给予所述的哺乳动物包含诊断剂、治疗剂或其组合的载体分子，其中载体分子能与所述抗体的结合位点结合。
29.一种DNA序列，其包含编码上述任一权利要求所述的抗肿瘤细胞抗原的抗体或其片段或免疫偶联物的核酸。
30.一种包含权利要求29所述DNA序列的表达载体。
31.一种包含权利要求30所述表达载体的宿主细胞。
32.一种将诊断/检测或治疗剂或其组合递送到靶点的方法，该方法包括(i)提供一种包含免疫偶联物的组合物，其包含上述任一权利要求所述的抗体或其片段，以及(ii)给予有此需要的哺乳动物所述组合物。
33.一种治疗哺乳动物体内的癌的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量抗体或其片段，其中的抗体或其片段包含至少两个抗体或其片段，包含前述任一权利要求所述的抗体，这些抗体或其片段用药学上可接受的赋形剂制成制剂。
34.如权利要求33所述的方法，还包含非权利要求1所述的第二抗体或其片段。
35.如权利要求33所述的方法，还包含权利要求1所述的第二抗体或其片段。
36.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述第二抗体与治疗性或诊断/检测剂偶联。
37.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述抗肿瘤细胞抗原的抗体或其片段在与所述肿瘤表达的第二肿瘤细胞抗原反应的第二偶联抗体给予所述哺乳动物之前、同时或之后给予。
38.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述抗肿瘤细胞抗原的抗体以每剂10ng/kg到100mg/kg哺乳动物体重的剂量给药。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述剂量重复给予。
40.一种检测或诊断哺乳动物体内的乳腺癌、前列腺癌或结肠癌的方法，该方法包括使用上述任一权利要求所述的抗体或免疫偶联物。
41.一种治疗哺乳动物体内的乳腺癌、前列腺癌或结肠癌的方法，该方法包括使用上述任一权利要求所述的抗体或免疫偶联物。
42.一种治疗哺乳动物体内的乳腺癌、前列腺癌或结肠癌的方法，该方法包括使用上述任一权利要求所述的抗体或免疫偶联物，其中所述肿瘤细胞抗体选自：KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5。
43.一种用于诊断或检测哺乳动物体内的癌的试剂盒，其中，所述试剂盒装有：
a)前述任一权利要求所述的抗体或其片段或免疫偶联物或其片段，其中所述抗体或其片段能特异地结合肿瘤细胞抗原，其中所述肿瘤细胞抗原选自由KIAA1815、LOC157378、FLJ20421、DSCD75、GPR160、GPCR41和SLC1A5组成的一组；
b)能够对所述哺乳动物的所述癌症进行所述诊断或检测的检测方法；以及
试剂盒使用说明书。
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WO (1) WO2007109376A2 (zh)
ZA (1) ZA200808128B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103109190A (zh) * 2010-08-19 2013-05-15 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于测量结合治疗性单克隆抗体的抗体的测定法
CN106554962A (zh) * 2015-09-30 2017-04-05 中国科学院上海药物研究所 过表达gpr160的癌症的预防、诊断和治疗
CN108025071A (zh) * 2015-09-17 2018-05-11 斯克利普斯研究院 双重可变结构域免疫缀合物及其用途
CN108290949A (zh) * 2015-11-10 2018-07-17 免疫医疗有限责任公司 对asct2具有特异性的结合分子及其用途
CN110055249A (zh) * 2019-03-19 2019-07-26 江苏医药职业学院 降低THEM6基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN110225970A (zh) * 2017-01-26 2019-09-10 特希生物制药有限公司 具有经修饰的代谢的免疫细胞及其用途
CN111366547A (zh) * 2018-12-26 2020-07-03 贵州中烟工业有限责任公司 一种用连续流动法测定烟草或烟草制品中α-氨基氮的检测方法
CN115372604A (zh) * 2022-07-07 2022-11-22 山东第一医科大学附属省立医院(山东省立医院) 一种用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物及其应用

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103172735B (zh) * 2008-07-17 2014-12-10 协和发酵麒麟株式会社 抗-系统asc氨基酸转运蛋白2(asct2)抗体
WO2011051271A2 (en) 2009-10-26 2011-05-05 Externautics S.P.A. Prostate tumor markers and methods of use thereof
WO2011051280A1 (en) 2009-10-26 2011-05-05 Externautics S.P.A. Ovary tumor markers and methods of use thereof
EP3345920A1 (en) * 2009-10-26 2018-07-11 Externautics S.p.A. Breast tumor markers and methods of use thereof
CA2818237C (en) * 2009-11-18 2021-05-18 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to matriptase antibodies
US9849192B2 (en) 2009-11-18 2017-12-26 Rutgers, The State University Of New Jersey Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to matriptase antibodies
JP5812869B2 (ja) * 2010-01-15 2015-11-17 協和発酵キリン株式会社 抗システムａｓｃアミノ酸トランスポーター２（ａｓｃｔ２）抗体
WO2013151649A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 Sialix Inc Glycan-interacting compounds
CN105073776B (zh) * 2012-11-13 2019-04-12 拜恩科技股份公司 用于治疗表达紧密连接蛋白的癌症疾病的制剂
JP2016029335A (ja) * 2012-12-17 2016-03-03 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 大腸がんの判定方法
CA2911514A1 (en) 2013-05-06 2014-11-13 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
PT3218005T (pt) 2014-11-12 2023-04-11 Seagen Inc Compostos que interagem com glicano e métodos de uso
SG11201803213XA (en) 2015-11-12 2018-05-30 Siamab Therapeutics Inc Glycan-interacting compounds and methods of use
WO2017161288A1 (en) 2016-03-18 2017-09-21 Rutgers, The State University Of New Jersey Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to anti-matriptase antibodies by in vivo cleavable linking moieties
WO2018006034A1 (en) * 2016-07-01 2018-01-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Conjugates for targeted cell surface editing
JP2020503258A (ja) * 2016-11-10 2020-01-30 メディミューン，エルエルシー Ａｓｃｔ２特異的結合分子及びその使用
US11401330B2 (en) 2016-11-17 2022-08-02 Seagen Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
AU2018226824A1 (en) 2017-03-03 2019-09-19 Seagen Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
KR101899426B1 (ko) * 2017-05-25 2018-09-17 (주)큐브바이오 종양 진단을 위한 퓨린 대사체 하이포잔틴 및 잔틴 농도 분석용 효소 조성물
CN111033238A (zh) * 2017-06-27 2020-04-17 定量癌症诊断有限责任公司 定量的液体活检诊断系统与方法
CN112135904A (zh) 2018-01-03 2020-12-25 帕利昂制药有限公司 重组人唾液酸酶、唾液酸酶融合蛋白及其使用方法
MX2020008404A (es) 2018-02-13 2020-09-25 Gilead Sciences Inc Inhibidores de molecula de muerte programada 1 (pd-1)/ligando de molecula de muerte programada 1 (pd-l1).
CA3093130C (en) 2018-04-19 2023-10-17 Gilead Sciences, Inc. Pd-1/pd-l1 inhibitors
AU2019301811B2 (en) 2018-07-13 2022-05-26 Gilead Sciences, Inc. PD-1/PD-L1 inhibitors
JP7158577B2 (ja) 2018-10-24 2022-10-21 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｐｄ－１／ｐｄ－ｌ１阻害剤
KR102242900B1 (ko) * 2019-08-07 2021-04-22 연세대학교 산학협력단 Slc1a5 전사물 변이체를 이용한 항암용 조성물, 항암제 스크리닝 방법 및 암 진단 방법

Family Cites Families (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4943529A (en) 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
AU3145184A (en) 1983-08-16 1985-02-21 Zymogenetics Inc. High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US4843155A (en) 1987-11-19 1989-06-27 Piotr Chomczynski Product and process for isolating RNA
JPH04501201A (ja) 1987-12-21 1992-03-05 ジ・アップジョン・カンパニー 発芽植物種子類のアグロバクテリウム媒介形質転換
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0394538B1 (en) 1989-04-28 1996-10-16 Rhein Biotech Gesellschaft Für Neue Biotechnologische Prozesse Und Produkte Mbh A yeast cell of the genus schwanniomyces
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2062795A1 (en) 1989-06-29 1990-12-30 Michael W. Fanger Bispecific reagents for aids therapy
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
FR2678930B1 (fr) 1991-07-10 1995-01-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de derives de la baccatine iii et de la desacetyl-10 baccatine iii.
US5264586A (en) 1991-07-17 1993-11-23 The Scripps Research Institute Analogs of calicheamicin gamma1I, method of making and using the same
ES2097925T3 (es) 1991-09-18 1997-04-16 Affymax Tech Nv Metodo para sintetizar diversas colecciones de oligomeros.
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JP3939338B2 (ja) 1991-11-22 2007-07-04 アフィメトリックス， インコーポレイテッド ポリマー合成に対する組合わせの戦略
US5384261A (en) 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
WO1993011161A1 (en) 1991-11-25 1993-06-10 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
JP3571337B2 (ja) 1992-02-11 2004-09-29 セル ジェネシス，インコーポレーテッド 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
PL174721B1 (pl) 1992-11-13 1998-09-30 Idec Pharma Corp Przeciwciało monoklonalne anty-CD20
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DE69329295T2 (de) 1992-12-02 2001-03-15 Alkermes Inc Wachstumhormon enthaltende mikrosphaeren mit kontrollierter freisetzung
EP0616812B1 (en) 1993-03-24 1999-11-03 Berlex Biosciences Combination with anti-hormonal compounds and binding molecules for the treatment of cancer
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5910486A (en) 1994-09-06 1999-06-08 Uab Research Foundation Methods for modulating protein function in cells using, intracellular antibody homologues
KR100356550B1 (ko) 1994-09-09 2002-12-18 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 펩티드의금속염을함유한서방성제제
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
PL184531B1 (pl) 1995-06-07 2002-11-29 Alkermes Inc Kompozycja o opóźnionym uwalnianiu ludzkiego hormonu wzrostu do wytwarzania leku do terapii
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
ZA965368B (en) 1995-07-14 1997-01-14 Novo Nordisk As A pharmaceutical formulation
JPH11510170A (ja) 1995-07-27 1999-09-07 ジェネンテック インコーポレーテッド タンパク質の処方
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
AU2582897A (en) 1996-03-15 1997-10-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of neoplastic cell growth and proliferation
WO1998035036A1 (en) 1997-02-10 1998-08-13 Genentech, Inc. Heregulin variants
DE69829402T2 (de) 1997-10-31 2006-04-13 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corp.), Santa Clara Expressionsprofile in adulten und fötalen organen
US6020135A (en) 1998-03-27 2000-02-01 Affymetrix, Inc. P53-regulated genes
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US20030148408A1 (en) * 2001-09-18 2003-08-07 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003009814A2 (en) * 2001-07-25 2003-02-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of prostate cancer
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US7504222B2 (en) * 2001-10-31 2009-03-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
AU2002359777A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-30 Idec Pharmaceuticals Corporation Genes overexpresses by ovarian cancer and their use in developing novel therapeutics especially antibodies
AU2003217774A1 (en) * 2002-02-28 2003-09-16 Georgetown University Method and composition for detection and treatment of breast cancer
JP4557497B2 (ja) * 2002-03-03 2010-10-06 ローム・アンド・ハース・エレクトロニック・マテリアルズ，エル．エル．シー． シランモノマー及びポリマーを製造する方法及びそれを含むフォトレジスト組成物
WO2005001092A2 (en) * 2003-05-20 2005-01-06 Wyeth Compositions and methods for diagnosing and treating cancers
BRPI0410748B8 (pt) 2003-05-20 2021-05-25 Immunogen Inc compostos de maitansinóides, suas composições farmacêuticas, métodos de esterificação de maitansinóides, bem como métodos para a sua produção, e conjugado de maitansinóide-agente de ligação celular
ATE414106T1 (de) 2003-06-30 2008-11-15 Domantis Ltd Pegylierte single-domain-antikörper (dab)
WO2005012493A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-10 Immunomedics, Inc. Anti-cd19 antibodies
WO2005019258A2 (en) * 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
WO2005026325A2 (en) * 2003-09-10 2005-03-24 Surromed, Inc, Bivalent targeting of cell surfaces
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
EP2298933A1 (en) * 2005-07-27 2011-03-23 Oncotherapy Science, Inc. Method of diagnosing esophageal cancer

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103109190B (zh) * 2010-08-19 2015-07-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于测量结合治疗性单克隆抗体的抗体的测定法
CN103109190A (zh) * 2010-08-19 2013-05-15 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于测量结合治疗性单克隆抗体的抗体的测定法
CN108025071A (zh) * 2015-09-17 2018-05-11 斯克利普斯研究院 双重可变结构域免疫缀合物及其用途
CN108025071B (zh) * 2015-09-17 2022-11-01 斯克利普斯研究院 双重可变结构域免疫缀合物及其用途
US10865415B2 (en) 2015-09-30 2020-12-15 Shanghai Institute Of Materia Medica, Chinese Academy Of Sciences Prevention, diagnosis and treatment of cancer overexpressing GPR160
WO2017054759A1 (zh) * 2015-09-30 2017-04-06 中国科学院上海药物研究所 过表达gpr160的癌症的预防、诊断和治疗
CN106554962B (zh) * 2015-09-30 2021-06-04 中国科学院上海药物研究所 过表达gpr160的癌症的预防、诊断和治疗
CN106554962A (zh) * 2015-09-30 2017-04-05 中国科学院上海药物研究所 过表达gpr160的癌症的预防、诊断和治疗
CN108290949A (zh) * 2015-11-10 2018-07-17 免疫医疗有限责任公司 对asct2具有特异性的结合分子及其用途
CN108290949B (zh) * 2015-11-10 2021-12-14 免疫医疗有限责任公司 对asct2具有特异性的结合分子及其用途
CN110225970A (zh) * 2017-01-26 2019-09-10 特希生物制药有限公司 具有经修饰的代谢的免疫细胞及其用途
CN111366547A (zh) * 2018-12-26 2020-07-03 贵州中烟工业有限责任公司 一种用连续流动法测定烟草或烟草制品中α-氨基氮的检测方法
CN110055249A (zh) * 2019-03-19 2019-07-26 江苏医药职业学院 降低THEM6基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN115372604A (zh) * 2022-07-07 2022-11-22 山东第一医科大学附属省立医院(山东省立医院) 一种用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物及其应用

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