CN108290949B - 对asct2具有特异性的结合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了ASCT2‑结合分子，例如抗ASCT2抗体及其抗原结合片段。在某些方面中，将这些ASCT2‑结合分子轭合至细胞毒性药物，例如ASCT2抗体‑药物轭合物(ADC)。在某些方面中，这些抗ASCT2抗体及其片段可以是杂交瘤衍生的鼠单克隆抗体及其人源化形式。在某些方面中，这些ASCT2‑结合分子特异性结合至表达ASCT2的细胞，并且在一些情况下，在细胞中被内化。此外，本披露提供了用于诊断和治疗由ASCT2过表达表征的疾病或障碍(例如某些类型的癌症)的组合物和方法。在具体的实施例中，本披露提供了使用ASCT2 ADC用于治疗癌症的方法。

Description

对ASCT2具有特异性的结合分子及其用途
背景技术
溶质运载体(SLC)家族包括多于300个编码膜转运蛋白的基因，组织成数十个亚家族。SLC1A亚家族包括转运系统ASC，该系统介导脊椎动物细胞中钠依赖性中性氨基酸转运。丙氨酸；丝氨酸；和半胱氨酸是ASC系统的优选底物。已经鉴定出ASC系统的两种亚型，ASC转运蛋白1(ASCT1，又称为SLC1A4)和ASC转运蛋白2(ASCT2，又称为SLC1A5)。
ASCT2是具有八种跨膜结构域的541个氨基酸的多通路膜蛋白。取决于各种糖基化特性，ASCT2的分子量在从55至75KD之间变化。除了转运L-丙氨酸、L-丝氨酸、和L-半胱氨酸，ASCT2还转运L-苏氨酸和L-谷氨酰胺。此外，ASCT2起细胞表面受体的作用，该细胞表面受体由D型猿逆转录病毒和C型病毒共享。
已报道ASCT2在各种癌症中的过表达，这些癌症包括结肠直肠癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、以及血液癌(如骨髓瘤和淋巴瘤)。通过免疫组织化学分析(IHC)评估的ASCT2的过表达在各种癌症中显示出预后不良，这些癌症包括结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、和胰腺癌(K Kaira等人，(2015)，Histopathology[组织病理学]；Shimizu等人，(2014)，BJC[英国癌症杂志]；D Witte等人，(2002)，Anticancer Research[抗癌研究]；R Li等人，(2003)，Anticancer Research[抗癌研究])。剧报道，ASCT2是雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)信号传导途径的一个驱动子，并且因此是肿瘤生长的一个驱动子(Nicklin P.等人，(2009)Cell[细胞])。
抗体-药物轭合物(ADC)代表了一种有希望的新治疗方法，通过将抗体的特异性与细胞毒素小分子或毒素的效力结合，更有效地治疗癌症，同时减少药物相关的毒性。ADC可以包含细胞毒素，该细胞毒素可以是经化学修饰以含有接头的小分子。然后使用该接头从而将细胞毒素与抗体或其抗原结合片段轭合。当ADC结合至靶阳性细胞的抗原表面时，诱导细胞毒性，被内化并被运送到溶酶体，在溶酶体中细胞毒素在可切割接头的蛋白质水解(例如通过在溶酶体中发现的组织蛋白酶B)或通过抗体的蛋白质降解(当非可切割接头用于将细胞毒素附接至抗体时)后释放。细胞毒素然后从溶酶体中转移出并且转移到细胞溶质中，在细胞溶质中然后它可以根据其作用机制结合到其靶标上。通常，这些细胞毒素诱导细胞周期停滞，这随后导致细胞凋亡。含有显像剂的对应轭合物还代表在体内或体外检测癌细胞的有希望的新方式。
本披露提供了特异性结合ASCT2的分子，以及使用此类分子，例如，用于检测ASCT2、用于将异源试剂递送至细胞、或用于治疗由ASCT2过表达表征的疾病或障碍(例如，癌症)的方法。本披露提供了轭合至细胞毒性药物(如微管溶素(tubulysin)衍生物或吡咯并苯并二氮杂卓)的抗ASCT2抗体(抗ASCT2-ADC)。本发明的这些抗体对于治疗由ASCT2过表达表征的疾病或障碍(例如，癌症)是有用的。例如，诸位发明人已经示出在人结肠直肠癌和头颈部癌的异种小鼠模型中抗ASCT2ADC引起肿瘤消退。
发明内容
本发明的一些主要方面总结如下。另外的方面描述于此披露的具体实施方式、实例、附图、和权利要求书部分。此披露的每个部分中的描述旨在与其他部分一起阅读。此外，此披露的每个部分中所述的各种实施例能以各种不同的方式进行组合，并且所有此类组合旨在落入本发明的范围之内。
本披露提供了ASCT2-结合分子，例如，抗ASCT2抗体或其抗原结合片段，例如能够结合ASCT2的单克隆抗体。在一些方面中，该结合分子轭合至试剂(如细胞毒素)。
在一些情况下，特异性地结合至ASCT2表位的分离的结合分子或其抗原结合片段，作为包含17c10或1e8的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至相同的ASCT2表位。
在一些情况下，17c10的VH包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5，并且17c10的VL包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6。
在一些情况下，1e8的VH包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7，并且1e8的VL包含SEQID NO:4或SEQ ID NO:8。
在一些情况下，特异性结合至ASCT2的分离的结合分子或其抗原结合片段包含抗体VL，其中该VL包含与选自下组的参考氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:8。
在一些情况下，特异性结合至ASCT2的分离的结合分子或其抗原结合片段包含抗体VH，其中该VH包含与选自下组的参考氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQID NO:7。
在一些情况下，将特异性结合至ASCT2的分离的结合分子或其抗原结合片段轭合至选自下组的试剂，该组由以下各项组成：抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药物试剂(pharmaceutical agent)、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、以及任何所述试剂中的两种或更多种的组合。
在一些情况下，将特异性结合至ASCT2的分离的结合分子或其抗原结合片段轭合至细胞毒素。在某些实施例中，该细胞毒素选自下组，该组由以下各项组成：AZ1508、SG3249、和SG3315。
在一些情况下，该结合分子或其片段包含抗体或其抗原结合片段。
在一些情况下，特异性结合至ASCT2的分离的抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中该VH和VL分别包含与选自下组的参考氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、以及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。在一些情况下，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，并且该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。在一些情况下，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，并且该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。
在一些情况下，该抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区或其片段。在一些情况下，该重链恒定区或其片段是IgG恒定区。在一些情况下，该IgG恒定区包含氨基酸序列SEQID NO:9。在一些情况下，该IgG恒定区是人IgG1恒定结构域。
在一些情况下，该抗体或其抗原结合片段包含选自下组的轻链恒定区，该组由以下各项组成：人κ恒定区和人λ恒定区。
在一些情况下，该抗体或其抗原结合片段是鼠类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、多特异性抗体、或其抗原结合片段。在一些情况下，该抗原结合片段是Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、和sc(Fv)2。
在一些情况下，该抗体或其抗原结合片段可以结合至人ASCT2和食蟹猴(cyno)ASCT2。
在一些情况下，该抗体或其抗原结合片段不特异性结合至人ASCT1。
在一些情况下，将该抗体或其抗原结合片段轭合至选自下组的试剂，该组由以下各项组成：抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药物试剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标记、PEG、以及任何所述试剂中的两种或更多种的组合。
在一些情况下，将该抗体或其抗原结合片段轭合至细胞毒素。在某些实施例中，该细胞毒素选自下组，该组由以下各项组成：AZ1508、SG3249、和SG3315。
在一些情况下，本发明提供了分离的多核苷酸或多核苷酸的组合，该分离的多核苷酸或多核苷酸的组合包含编码如本文所述的结合分子或其片段的核酸。在一些情况下，本发明提供了分离的多核苷酸或多核苷酸的组合，该分离的多核苷酸或多核苷酸的组合包含编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段的核酸。
在一些情况下，本发明提供了包含如本文所述的多核苷酸的载体。在一些情况下，包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸在相同的载体中。在一些情况下，包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸在不同的载体中。
在一些情况下，本发明提供了组合物，该组合物包含(i)如本文所述的结合分子或其片段、和(ii)运载体。在一些情况下，本发明提供了组合物，该组合物包含(i)如本文所述的抗体或其抗原结合片段、和(ii)运载体。在一些情况下，本发明提供了组合物，该组合物包含(i)编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段的核酸、和(ii)运载体。在一些情况下，本发明提供了组合物，该组合物包含(i)如本文所述的载体、和(ii)运载体。在一些方面中，该运载体是药学上可接受的运载体。
在一些情况下，本发明提供了宿主细胞，该宿主细胞包含如本文所述的多核苷酸、如本文所述的载体、或如本文所述的组合物。
在一些情况下，本发明提供了制备如本文所述的结合分子或片段的方法，该方法包括(a)培养如本文所述的宿主细胞；并且(b)分离结合分子或片段。在一些情况下，本发明提供了制备如本文所述的抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括(a)培养如本文所述的宿主细胞；并且(b)分离该抗体或抗原结合片段。
在一些情况下，本发明提供了诊断试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包含如本文所述的结合分子或其片段、或如本文所述的抗体或其抗原结合片段。
在一些情况下，将试剂递送至表达ASCT2的细胞的方法包括使细胞与如本文所述轭合至试剂的结合分子或片段接触、或与如本文所述轭合至试剂的抗体或其抗原结合片段接触，其中该试剂被细胞内化。在一些情况下，该试剂可以选自下组，该组由以下各项组成：抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药物试剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标记、PEG、以及任何所述试剂中的两种或更多种的组合。在一些情况下，该试剂可以是细胞毒素。
在一些情况下，在表达ASCT2的细胞中诱导死亡的方法包使细胞与如本文所述轭合至细胞毒素的结合分子或片段接触、或与如本文所述轭合至细胞毒素的抗体或其抗原结合片段接触，其中该细胞毒素被细胞内化。在一个优选的实施例中，该细胞毒素选自下组，该组由以下各项组成：AZ1508、SG3249、和SG3315。
在一些情况下，在受试者中治疗由ASCT2过表达表征的疾病或障碍(例如，癌症)的方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的如本文所述的结合分子或片段、或如本文所述的抗体或抗原结合片段、或如本文所述的组合物。
在一些情况下，治疗由ASCT2过表达表征的疾病或障碍(例如，癌症)的方法包括从实体瘤到血液瘤的广泛的癌症。治疗方法的这种广泛的有效性并不常见，而是出乎意料的。除了在实体瘤和血液瘤上证实的广泛的有效之外，本文所述的本发明还可以用于确定癌症干细胞(CSC)存在的方法和涉及CSC的治疗的方法，这些方法进一步支持本文描述的本发明的用途的广泛性和意想不到的效果。
在一些情况下，该癌症选自下组，该组由以下各项组成：结肠直肠癌、HNSCC、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、以及血液癌(急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL))。此外，方法包含含有靶向CSC治疗的方法。优选地，该受试者是人受试者。
在一些情况下，用于在样品中检测ASCT2表达水平的方法包括(a)使所述样品与如本文所述的结合分子或片段、或如本文所述的抗体或抗原结合片段、或如本文所述的组合物接触，并且(b)在所述样品中检测结合分子或其片段、或抗体或其抗原结合片段与ASCT2的结合。在一些情况下，该样品是细胞培养物。在一些情况下，该样品是分离的组织。在一些情况下，该样品来自受试者，优选地是人受试者。
附图说明
图1A显示流式细胞术分析的量化，证实与来自健康样品的骨髓相比，在来自AML和MM样品的骨髓穿刺液中高的ASCT2表达。
图1B显示在CD34+/CD38+群中ASCT2(所报道的定义白血病干细胞群(LSC)的标志物)的高表达。另外，在所有其他亚型(如CD34+CD38-、CD34+CD38+和CD34-CD38+群)中评估ASCT2的表达。
图1C显示了在来自MM样品的浆细胞(PC；CD138+/CD19-)和干细胞(SC；CD138-/CD19+)中的ASCT2表达。
图1D显示了在EpCAM+/CD24+/CD44+细胞群中评估的ASCT2(所报道的胰腺CSC的标志物)表达。流式细胞术分析表明在胰腺肿瘤中CSC的高ASCT2表达。
图1E显示了在体内用ASCT2-PBD ADC(将抗体17c10轭合至SG3249)处理后胰腺肿瘤中CSC(EpCAM+/CD24+/CD44+)群的消融。
图2显示了一幅图，该图描绘了经纯化的人抗ASCT2IgG 1e8、3f7、5a2、9b3、10c3、16b8、17c10、和17a10与用表达人ASCT2的质粒转染的293F细胞的结合活性的倍数变化。
图3A显示了相比于未处理的对照细胞的活力用以下各项处理的表达ASCT2的293F细胞的相对活力的条形图：用阴性对照处理的(未处理的)；用第一抗ASCT2抗体1e8和17c10处理的；用轭合至皂草素的抗ASCT2抗体处理的；或用连接至皂草素(hIgG-皂草素)对照抗体处理的。
图3B显示了Sw48细胞中经典轭合至微管溶素AZ1508的抗ASCT21E8、抗ASCT217C10、和同种型对照R347的细胞毒性的图。
图4显示了一副条形图，该条形图描绘了如通过流式细胞术所评估的，在ASCT2表达的shRNA敲除的情况下，抗ASCT2抗体17c10和1e8与WiDr细胞或WiDr细胞的结合。
图5A显示了抗ASCT2抗体17c10和同种型对照的内化动力学。
图5B显示了如通过细胞毒性杀灭所测量的ASCT2-ADC(轭合至AZ1508的抗体17c10)的内化动力学。将细胞用ASCT2-ADC(17c10-AZ1508)进行脉冲，持续相应时间段。此后，含有介质的ADC被新鲜介质替换，并且再孵育4天。通过使用CTG试剂盒测量细胞活力。将剂量-应答曲线绘制为未处理的对照细胞的百分数。
图6A至图6H显示了由抗ASCT2抗体17c10和1e8，以及同种型对照R347与表达ASCT2的细胞系的结合而产生的流式细胞术图。图6A，人癌细胞系Cal27；图6B，人癌细胞系FaDu；图6C，人癌细胞系SSC15；图6D，人癌细胞系WiDr；图6E，稳定表达人ASCT2的CHOK1细胞；图6F，稳定表达cyno ASCT2的CHOK1细胞；图6G，cyno癌细胞系CynoMK1；以及图6H，mock转染的CHOK1细胞。
图7A显示了抗ASCT2抗体17c10与SKMEL-2细胞的结合没有被ASCT1shRNA改变，然而在ASCT2特异性shRNA敲除后该结合显著降低。
图7B显示了ASCT1shRNA敲除后抗ASCT2抗体ADC(轭合至AZ1508的抗体17c10)的细胞毒性杀灭未受影响，然而在ASCT2shRNA沉默后观察到细胞毒性杀灭的显著降低。将来自所有shRNA敲除组的数据相对于未处理的对照进行归一化。
图8A和图8B显示了轭合至针对表达人或cyno ASCT2蛋白或无关受体的稳定CHO-K1细胞系的微管溶素1508的抗ASCT2抗体17c10(图8A)和1e8(图8B)的细胞毒性效应。
图9A至图9D显示了17c10亲本抗体、17c10种系化的抗体、和R347同种型对照抗体与表达人ASCT2的稳定的CHO-K1细胞系(图9A)；表达cyano ASCT2的稳定CHO-K1细胞系(图9B)；表达ASCT2的结肠直肠癌细胞WiDr(图9C)；和mock转染的对照细胞(图9D)结合的流式细胞术图。
图10A至图10F显示了对于胰腺癌细胞(图10A)、结肠癌细胞(图10B)、肺癌细胞(图10C)、HNSCC癌细胞(图10D)、前列腺癌细胞(图10E)、以及不表达ASCT2的细胞系(图10F)，用轭合至微管溶素AZ1508的抗ASCT2抗体17c10、和轭合至微管溶素AZ1508的R347同种型对照抗体处理的癌细胞系的归一化为未处理的对照细胞的相对活力(％)。
图11A显示了用轭合至SG3249的抗ASCT2抗体17c10归一化为用轭合至SG3249的对照抗体处理的细胞的活力的相对活力。
图11B显示了用轭合至SG3315的抗ASCT2抗体17c10归一化为用轭合至SG3315的对照抗体处理的细胞的活力的相对活力。
图12A、图12B、和图12C显示了用轭合至微管溶素或PBD的抗ASCT2抗体17c10处理后，在WiDr结肠直肠癌或原发性胰腺癌异种移植物模型中肿瘤体积的时程。图12A，17c10抗体轭合至微管溶素1508；图12B，抗ASCT2抗体17c10轭合至SG 3315；图12C，抗ASCT2抗体17c10轭合至SG 3249。
图13A显示了ASCT2-PBD ADC(抗体17c10轭合至SG3249)在播散性TF1αAML小鼠模型中的抗肿瘤功效。将ADC和同种型对照按Q1Wx4计划对进行给予。每天监测发病率和死亡率。与未处理的对照组相比，所有剂量水平的ADC(0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.25mg/kg、和0.5mg/kg)显著改进了存活率。将数据呈现于Kaplan-Meier存活图中，该Kaplan-Meier存活图显示了每组内个体动物的命运。
图13B显示了ASCT2-PBD ADC(抗体17c10轭合至SG3249)在播散性MM.1S MM小鼠模型中的抗肿瘤功效。如图13A中所述，用ADC或同种型对照对小鼠进行处理。每天监测发病率和死亡率。与未处理的对照组(55.5天)相比，两种剂量水平的ADC(0.1mg/kg和0.4mg/kg)显著改进了存活率(分别是117天和123.5天)。将数据呈现于Kaplan-Meier存活图中，该Kaplan-Meier存活图显示了每组内个体动物的命运。
具体实施方式
本发明提供了特异性结合至ASCT2的抗体及其抗原结合片段。在某些实施例中，该抗体或抗原结合片段轭合至试剂，优选地细胞毒素。包括编码抗体及其抗原结合片段的多核苷酸、含有这些多核苷酸的载体，以及表达这些抗体的宿主细胞。还提供了包含抗ASCT2抗体或其抗原结合片段的组合物，以及制备抗ASCT2抗体和抗原结合片段的方法。进一步提供了，如在诊断应用或在治疗由ASCT2过表达表征的疾病或障碍(例如，癌症)的方法中使用新颖抗ASCT2抗体的方法。
为了使本发明可以更容易理解，首先定义了某些术语。另外的定义贯穿详细说明阐明。
I.定义
如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”、和“该/所述(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。术语“一个/一种(a或an)”、以及术语“一个或多个/一种或多种(one or more)”和“至少一个/至少一种(atleast one)”可以在本文中互换使用。
此外，“和/或”被理解为这两个指定的特征或组分的每一者与或不与另一者的特定披露。因此，例如在短语如“A和/或B”中使用的术语“和/或”，旨在包括A和B、A或B、A(单独)、以及B(单独)。同样，例如在短语如“A、B、和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括A、B、以及C；A、B、或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
当用语言“包括”来描述实施例时，包括了关于“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施例。
除非另外定义，否则在本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，The Dictionary of Cell and MolecularBiology[细胞与分子生物学词典](第5版，J.M.Lackie编辑，2013)，the OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology[生物化学和分子生物学牛津词典](第2版，R.Cammack等人编辑，2008)，和The Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology[生物医学与分子生物学简明词典]，P-S.Juo，(第2版.2002)可以为技术人员提供本文使用的一些术语的通用定义。
单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统(SI)接受形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。在此提供的小标题不是本发明的不同方面或实施例的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。
氨基酸在本文中通过其通常已知的三字母符号抑或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。
术语“ASCT2”是指系统ASC氨基酸转运蛋白2蛋白、和/或其活性片段。ASCT2是以Na+-依赖性方式介导转运小中性氨基酸(包括谷氨酰胺、丙氨酸、和丝氨酸、半胱氨酸、和苏氨酸)的跨膜蛋白。ASCT2的RNA、DNA、和氨基酸序列对本领域技术人员是已知的，并且可以在许多数据库中(例如，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中)发现。在NCBI发现的这些序列的实例是具有Genbank登录号NM_005628和NP_005619的人ASCT2序列；具有Genbank登录号NM_001284054和NP-001270983的食蟹猴(成束猴(Macacafascicularis))ASCT2序列。
术语“抑制”、“阻断”、以及“阻遏”在此可互换地使用，并且指生物活性的任何统计学显著的降低，包括活性的完全阻断。例如，“抑制”可以指生物活性或过程的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的降低。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”可在本文中互换使用。典型的抗体包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每个重链由一个重链可变区(本文缩写为VH)和一个重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间插入更保守的称为构架区(FW)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FW构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或宿主因素(包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。本披露的示例性抗体包括杂交瘤-产生的鼠类单克隆抗体17c10和1e8，人源化、亲和力优化、种系化的、和/或其他类型的这些抗体，以及血清半衰期优化的抗ASCT2YTE抗体(例如，K44VHa-N56Q、K44VHa6-N56Q、或K2Ha-N56Q)。
术语“种系化”意指抗体中特定位置的氨基酸突变回种系中的那些。
术语“抗体”可以指通过免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合靶标(例如蛋白质，多肽，肽，碳水化合物，多核苷酸，脂质或前述的组合)的免疫球蛋白分子。如本文使用的，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体，完整单克隆抗体，抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段)，单链式Fv(scFv)突变体，产生自至少两个完整抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白、以及包含抗原酶识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子的多特异性抗体(如双特异性抗体)，只要这些抗体展现出所希望的生物活性。抗体可以是基于其分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链恒定结构域的同一性的以下免疫球蛋白的五个主要类别中的任何一个：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸的或轭合至其他分子如毒素、放射性同位素等等。
术语“ASCT2抗体”或“结合至ASCT2的抗体”或“抗ASCT2”是指能够以足够亲和力结合至ASCT2的抗体，这样使得该抗体可用作靶向ASCT2的治疗剂或诊断试剂。抗ASCT2抗体与不相关的、非ASCT2蛋白的结合程度少于该抗体与ASCT2结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、
Figure BDA0001651849830000141
(使用重组ASCT2作为分析物，并且抗体作为配体，或反之亦然)、
Figure BDA0001651849830000142
或本领域已知的其他结合测定所测量的。在某些实施例中，结合至ASCT2的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤10pM、≤1pM、或≤0.1pM的解离常数(KD)。
术语“抗原结合片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的互补决定可变区。全长抗体片段可以是抗体的抗原结合片段。抗体片段的实例包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段、线性抗体、单链抗体(例如，ScFv)、以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”(mAb)是指涉及单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体群。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以任何数目的方式制备的此类抗体，包括但不限于：杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、和转基因动物。
术语“人源化抗体”是指衍生自非人类(例如鼠类)免疫球蛋白的抗体，其被工程化成包含最小的非人类(例如鼠类)序列。典型地，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、或仓鼠)的CDR的残基替换，该来自非人物种的CDR的残基具有所希望的特异性、亲和力、和能力(Jones等人，1986，Nature[自然]，321:522-525；Riechmann等人，1988，自然，332:323-327；Verhoeyen等人，1988，科学，239:1534-1536)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FW)残基被来自非人物种的具有所希望特异性、亲和性和能力的抗体中的相应残基替代。
人源化抗体可以通过在Fv构架区和/或置换的非人残基内替代的另外的残基的替代来进一步修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个(并且典型地两个或三个)可变结构域，该可变结构域包含对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利号5,225,539或5,639,641中。
“药学上可接受的运载体”是指在药物配制品中除了活性成分之外的成分，该成分对于受试者是无毒性的。药学上可接受的运载体包括，但不限于：缓冲液、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。如本文使用的，“药学上可接受的运载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收/再吸收延迟剂等。
抗体的“可变区”指单独的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区或它们的组合。重链和轻链的这些可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(又称为高变区)连接的四个构架区(FW)组成。每条链中的CDR由FW区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成。有至少两种技术用于确定CDR：(1)一种基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学目的的蛋白质序列]，(第5版，1991，National Institutes of Health,Bethesda Md.[国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州])；和(2)一种基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等人，(1997)，J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]273:927-948))。此外，这两种方法的组合有时在本领域中用于确定CDR。
当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，Sequences of Immunological Interest[免疫学目的的序列]，第5版，公共卫生服务(Public Health Service)，国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)，贝塞斯达，马里兰州(1991))。
在Kabat中的氨基酸位置编号是指在Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学目的的蛋白质的序列]，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991)中用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的FW或CDR的截短或插入。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据卡巴特的残基52a)和在重链FW残基82之后的插入残基(例如，根据卡巴特的残基82a、82b和82c等)。
可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。相反，Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入放置于H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅存在35A，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。AbM高变区表示Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且被牛津分子(Oxford Molecular)AbM抗体建模软件使用。表1，以下列出了包含在每个系统中抗体可变区的氨基酸的位置。
表1
在每个系统中的氨基酸位置
Figure BDA0001651849830000171
Figure BDA0001651849830000181
1Kabat编号
2Chothia编号
免疫遗传学(IMGT)还提供了一种用于免疫球蛋白可变区(包括CDR)的编号系统。参见，例如，Lefranc,M.P.等人，Dev.Comp.Immunol.[发育和比较免疫学]27:55-77(2003)。IMGT编号系统是基于高变环的多于5,000个序列的比对、结构数据和表征，并且允许容易地比较所有物种的可变区和CDR区。根据IMGT编号方案，VH-CDR1在位置26至35处，VH-CDR2在位置51至57处，VH-CDR3在位置93至102处，VL-CDR1在位置27至32处，VL-CDR2在位置50至52处，并且VL-CDR3在位置89至97处。
如贯穿本说明书使用的，所述的VH CDR序列对应于经典的Kabat编号位置，即Kabat VH-CDR1在位置31-35，VH-CDR2在位置50-65，并且VH-CDR3在位置95-102。VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3也对应于经典的Kabat编号位置，分别即位置24-34、50-56和89-97。
术语“人抗体”意指在人体中产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的在人体中产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体，像例如包含鼠类轻链和人重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自两种或更多种物种的抗体。典型地，轻链和重链的可变区对应于衍生自具有所需特异性、亲和力、和能力的一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，而恒定区同源于衍生自另一种(通常为人)的抗体中的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
术语“YTE”或“YTE突变体”是指IgG1Fc中的突变，这导致结合至人FcRn的增加，且提高了具有突变的抗体的血清半衰期。YTE突变体包含引入IgG1的重链的三个突变M252Y/S254T/T256E的组合(EU编号，Kabat等人，(1991)，Sequences ofProteinsofImmunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白序列]，美国公共卫生服务，国立卫生研究院，华盛顿D.C.)。参见美国专利号7,658,921，通过引用将其并入本文。与相同抗体的野生型相比，YTE突变体显示出增加了抗体的血清半衰期大约四倍(Dall'Acqua等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]281:23514-24(2006)；Robbie等人，(2013)，Antimicrob.Agents Chemother[抗微生物制剂与化学疗法]57，6147-6153)。还参见美国专利号7,083,784，其全部内容通过引用并入本文。
“结合亲和力”总体上是指分子(例如，抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文使用的，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于更长地保持结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域中已知的，其中的任何方法均可以用于本发明的目的。
除非另外说明，否则结合分子的效力通常表达为以ng/ml计的IC50值。IC50是抗体分子的半数抑制浓度。在功能测定中，IC50是将生物应答降低其最大值的50％的浓度。在配体结合研究中，IC50是减少受体结合达最大特异性结合水平的50％的浓度。IC50可以通过本领域已知的任何数目的手段来计算。
与参考抗体相比，针对本发明的抗体或多肽的效力改进倍数可以是至少约2倍、至少约4倍、至少约6倍、至少约8倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍、或至少约180倍或更多。
除非另有说明，抗体的结合效力通常表示为EC50值，以nM或pM计。EC50是在具体暴露时间后诱导基线和最大值之间的中值应答的药物的浓度。EC50可以通过本领域已知的任何数目的手段来计算。
“治疗性抗体”是可以向受试者给予以治疗或预防疾病或病症的抗体。“受试者”是需要诊断、预后或治疗的任何个体，特别是哺乳动物。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜、体育动物、和动物园动物，例如人、非人灵长类、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛等。
“治疗”是指治愈、减慢已诊断的病理状况或障碍，减轻已诊断的病理状况或障碍的症状，和/或停止已诊断的病理状况或障碍的进展的治疗性措施。因此，需要治疗的患者包括已患有该障碍的那些。在某些实施例中，如果患者显示了例如全部、部分或者瞬时减轻或消除与疾病或障碍相关的症状，则根据本文提供的方法成功地“治疗”了该受试者的疾病或障碍(例如，癌症)。
“预防”是指预防和/或减缓靶标病理状况或障碍发展的防御性或预防性措施。因此，需要预防的患者包括那些容易患有或易患该障碍的那些人。在某些实施例中，如果相比于未经受本发明方法的患者，患者瞬时或永久地表现出，例如与疾病或障碍相关的更少或不太严重的症状，或与该疾病或障碍相关的症状的更迟的发作，则根据本文提供的方法成功地预防了疾病或障碍。
术语“药物组合物”是指如下制剂，该制剂处于允许该活性成分的生物活性有效的形式，并且不含有另外的、对其将要给予的受试者具有不可接受的毒性的组分。这种组合物可以是无菌的并且可以包含药学上可接受的运载体，如生理盐水。适合的药物组合物可以包含一种或多种缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、稳定剂(例如，人白蛋白)、防腐剂(例如，苄醇)、以及增强生物利用度的吸收促进剂、和/或其他常规的增溶剂或分散剂。
如本文披露的，抗体的“有效量”是足以进行具体阐述目的的量。关于阐述的目的，“有效量”可以经验为主地并且以常规方式来确定。
“标记”是指可以直接或间接地轭合至结合分子或抗体的可检测的化合物或组合物，以便产生“标记的”结合分子或抗体。该标记可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下可以催化可检测底物化合物或组合物的化学改变。
可在本文中互换使用的术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是线性或支化的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分轭合。该定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。在某些实施例中，这些多肽可以作为单链或相关链出现。
如本文使用的“多核苷酸”可以包括一种或多种“核酸”、“核酸分子”、或“核酸序列”是指任何长度的核苷酸聚合体，并且包括DNA和RNA。这些多核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和它们的类似物。前述说明适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“载体”意指一种构建体，该构建体能够在宿主细胞中递送一个或多个感兴趣的基因或序列并且在一些实施例中，能够表达该一个或多个基因或序列。载体的实例包括但不限于：病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞(如生产细胞)。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈自然界中未发现形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至它们不再呈自然界中发现形式的程度的那些。在一些实施例中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞、或组合物是基本上纯的。
在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“同一”或百分比“同一性”是指当比较和比对(如有必要，引入缺口)以获得最大对应性(不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分)时相同或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。百分比同一性可以使用序列比较软件或算法或者通过目测测量。本领域中已知有各种可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的算法和软件。
序列比对算法的一个这样的非限制性实例是描述于Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，87:2264-2268(1990)中的算法，如由Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，90:5873-5877(1993)的改进，并纳入NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402(1991))。在某些实施例中，有缺口的BLAST可如由Altschul等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402(1997)中所述使用，BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人，Methods in Enzymol.[酶学方法]266:460-480(1996))、ALIGN、ALIGN-2(基因泰克公司，南旧金山，加利福尼亚)或Megalign(DNASTAR)是另外可用于比对序列的可公开获得的软件程序。在某些实施例中，两个核苷酸序列间的百分比同一性是使用GCG软件包中的GAP程序来确定(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或90的缺口权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重)。在某些替代性实施例中，GCG软件包中包含Needleman和Wunsch的算法的GAP程序(J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444-453(1970))可用于确定两个氨基酸序列间的百分比同一性(例如，使用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6、或4的缺口权重以及1、2、3、4、5的长度权重)。可替代地，在某些实施例中，核苷酸或氨基酸序列间的百分比同一性是使用Myers和Miller的算法来确定的(CABIOS，4:11-17(1989))。例如，百分比同一性可使用ALIGN程序(2.0版本)以及使用具有残基表的PAM120和12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来确定。本领域的技术人员可确定适当的参数以通过特定比对软件获得最大比对。在某些实施例中，使用比对软件的默认参数。
在某些实施例中，第一氨基酸序列与第二序列氨基酸的同一性百分比“X”计算为100x(Y/Z)，其中Y是氨基酸残基数目，计分为比对该第一和第二序列时的一致匹配数(如通过目检或特定序列比对程序比对的)，并且Z是该第二序列中的残基的总数目。如果第一序列的长度比第二序列长，该第一序列与该第二序列的百分比同一性将高于该第二序列与该第一序列的百分比同一性。
“保守的氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基替代。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸对于酪氨酸的取代是保守取代。在某些实施例中，本发明的结合分子、抗体、和抗原结合片段的氨基酸序列中的保守取代没有消除含有氨基酸序列的结合分子、抗体、或抗原结合片段与一种或多种抗原，即与结合分子、抗体、或抗原结合片段结合的ASCT2的结合。鉴定没有消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域中熟知的。参见，例如，Brummell等人，Biochem.[生物化学]32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.[蛋白质工程]12(10):879-884(1999)；Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]94:412-417(1997)。
II.抗ASCT2-抗体和抗原结合片段
本发明提供了特异性结合ASCT2的抗ASCT2抗体及其抗原结合片段。人和食蟹猴ASCT2的全长氨基酸(aa)和核苷酸(nt)序列是本领域已知的，并且可以至少在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中发现。该NCBI数据库可在线获得。在一些实施例中，本文提供的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或人抗体。在一些实施例中，抗ASCT2抗体轭合至细胞毒素，因此它们被称为抗-ASTC2ADC。
在一些实施例中，本发明的抗ASCT2抗体结合至在细胞表面上的ASCT2，并且被内化至细胞中。在一些实施例中，在IC50为如下的情况下，在10分钟时，抗ASCT2抗体被内化至表达ASCT2的细胞中：约100ng/ml至约1μg/ml、约100ng/ml至约500ng/ml、约100ng/ml至约250ng/ml、约250ng/ml至约500ng/ml、约350ng/ml至约450ng/ml、约500ng/ml至约1μg/ml、约500ng/ml至约750ng/ml、约750ng/ml至约850ng/ml、或约900ng/ml至约1μg/ml。在一些实施例中，在IC50为如下的情况下，在30分钟时，抗ASCT2抗体在表达ASCT2的细胞中被内化：约100ng/ml至约1μg/ml、约100ng/ml至约500ng/ml、约100ng/ml至约250ng/ml、约250ng/ml至约500ng/ml、约250ng/ml至约350ng/ml、约350ng/ml至约450ng/ml、约500ng/ml至约1μg/ml、约500ng/ml至约750ng/ml、约750ng/ml至约850ng/ml、或约900ng/ml至约1μg/ml。在一些实施例中，在IC50为如下的情况下，在120分钟时，抗ASCT2抗体在表达ASCT2的细胞中被内化：约50ng/ml至约500ng/ml、约50ng/ml至约100ng/ml、约100ng/ml至约200ng/ml、约200ng/ml至约300ng/ml、约300ng/ml至约400ng/ml、或约400ng/ml至约500ng/ml。在一些实施例中，在IC50为如下的情况下，在8小时，抗ASCT2抗体在表达ASCT2的细胞中被内化：约5ng/ml至约250ng/ml、约10ng/ml至约25ng/ml、约25ng/ml至约50ng/ml、约50ng/ml至约100ng/ml、约100ng/ml至约150ng/ml、约150ng/ml至约200ng/ml、或约200ng/ml至约250ng/ml。在一些情况下，轭合至细胞毒素的抗ASCT2抗体是抗ASCT2ADC。
在某些方面中，本披露提供了包含三个重链互补决定区(HCDR)和三个轻链互补决定区(LCDR)的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段。在某些方面中，HCDR1具有选自SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:16的氨基酸序列；HCDR2具有选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:11、和SEQ IDNO:17的氨基酸序列；HCDR3具有选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:18的氨基酸序列；LCDR1具有选自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:19的氨基酸序列；LCDR2具有选自SEQID NO:14、SEQ ID NO:20、和SEQ ID NO:24的氨基酸序列；LCDR3具有选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、和SEQ ID NO:25的氨基酸序列。如本文所提供的，VH包含SEQ ID NO:1或SEQID NO:5的氨基酸序列；并且VL包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些方面中，该抗ASCT2抗体包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL。任选地，抗ASCT2抗体包含具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH，以及具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL。在一些实施例中，该抗ASCT2抗体包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH以及具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL。
另外，本披露提供了特异性结合至ASCT2的分离的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中该VH和VL分别含有与参考氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8分别具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列。
在一个方面中，本披露提供包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:5和VL氨基酸序列SEQID NO:6的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段。在一个方面中，本披露提供包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:7和VL氨基酸序列SEQ ID NO:8的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段。
如本文所述的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段可以是，例如鼠类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、多特异性抗体、或其任何组合。抗ASCT2抗体抗原结合片段可以是Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dsFv片段、scFv片段、或sc(Fv)2片段。
在一个方面中，本披露提供在物种间可以结合至ASCT2分子的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段，例如可以结合至小鼠ASCT2、大鼠ASCT2、兔ASCT2、人ASCT2和/或食蟹猴ASCT2的抗体或片段。例如，该抗体或片段可以结合至人ASCT2和食蟹猴ASCT2。在另外的实例中，该抗体或片段还可以结合至小鼠ASCT2。
在本文提供的某些实施例中，抗ASCT2抗体或其抗原结合片段可以特异性结合至ASCT2，例如人ASCT2和食蟹猴ASCT2，但不特异性结合至人ASCT1。
如本文所述的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段可以包括，除了VH和VL之外的重链恒定区或其片段。在某些方面中，该重链恒定区是人重链恒定区，例如，人IgG恒定区，例如，人IgG1恒定区。在一些实施例中，特别是在该抗体或其抗原结合片段轭合至试剂(如细胞毒素剂)的情况下，半胱氨酸残基被插入到IgG1的CH2区中的氨基酸S239和V240之间。该半胱氨酸被称为“239插入”或“239i”。
在某些方面中，重链恒定区或其片段，例如，人IgG恒定区或其片段相对于野生型IgG恒定结构域可以包括一个或多个氨基酸取代，其中与具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比，修饰的IgG具有增加的半衰期。例如，IgG恒定结构域可以含有在位置251-257、285-290、308-314、385-389、和428-436上的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸位置编号是根据如Kabat中所阐明的EU索引。在某些方面中，IgG恒定结构域可以含有以下中的一个或多个：Kabat位置252上的氨基酸经酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、或苏氨酸(T)的取代，Kabat位置254上的氨基酸经苏氨酸(T)的取代，Kabat位置256上的氨基酸经丝氨酸(S)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、或苏氨酸(T)的取代，Kabat位置257上的氨基酸经亮氨酸(L)的取代，Kabat位置309上的氨基酸经脯氨酸(P)的取代，Kabat位置311上的氨基酸经丝氨酸(S)的取代，Kabat位置428上的氨基酸经苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、或丝氨酸(S)的取代，Kabat位置433上的氨基酸经精氨酸(R)、丝氨酸(S)、Iso亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、或谷氨酰胺(Q)的取代，或Kabat位置434上的氨基酸经色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、或酪氨酸的取代。更具体地，IgG恒定结构域相对于野生型人IgG恒定结构域可以含有氨基酸取代，包括Kabat位置252上的氨基酸经酪氨酸(Y)的取代，Kabat位置254上的氨基酸经苏氨酸(T)的取代，和Kabat位置256上的氨基酸经谷氨酸(E)的取代。本披露提供了抗ASCT2抗体或其抗原结合片段，其中重链是人IgG1YTE突变体。
本文提供的例如如上所述的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段可以包括除了VH和VL以及任选地重链恒定区或其片段之外的轻链恒定区或其片段。在某些方面中，该轻链恒定区是κλ轻链恒定区，例如人κ恒定区或人λ恒定区。
如上所述的，VH和/或VL氨基酸序列可以与在本文列出的序列例如具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似性，和/或包含1、2、3、4、5或更多个取代，例如，相对于本文所阐明的序列的保守取代。具有与VH区或VL区具有一定百分比相似性的VH和VL区或具有一个或多个取代(例如，保守取代)的VH和VL区的ASCT2抗体，可以通过编码本文所述的VH和/或VL区的核酸分子的诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)获得，随后测试编码的改变的抗体对ASCT2的结合，并且任选地使用本文所述的功能测定测试保留的功能。
抗体针对抗原的亲和力或亲合力可以使用本领域熟知的任何适合的方法(例如，流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、或放射免疫测定(RIA)、或动力学(例如
Figure BDA0001651849830000291
或BIACORETM分析))经实验确定。可以容易地采用直接结合测定以及竞争性结合测定形式。(参见，例如，Berzofsky等人，Antibody-Antigen Interactions[抗体-抗原相互作用]，在Fundamental Immunology[在基础免疫学]，Paul,W.E.编辑，雷文出版社(RavenPress)：纽约市，纽约州(1984)；Kuby，Immunology[免疫学]，W.H.弗里曼公司(W.H.Freemanand Company)：纽约市，纽约州(1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH、温度)下测量，特定抗体-抗原相互作用的所测量的亲和力可以变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD或Kd、Kon、Koff)的测量是用如本在领域中已知的抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行。
在一些实施例中，在IC50为如下的情况下，抗ASCT2抗体或其抗原结合片段可以结合至表达ASCT2的细胞：低于约500nM、低于约350nM、低于约250nM、低于约150nM、低于约100nM、低于约75nM、低于约60nM、低于约50nM、低于约40nM、低于约30nM、低于约20nM、低于约15nM、低于约10nM、低于约5nM、低于约1nM、低于约500pM、低于约350pM、低于约250pM、低于约150pM、低于约100pM、低于约75pM、低于约60pM、低于约50pM、低于约40pM、低于约30pM、低于约20pM、低于约15pM、低于约10pM、或低于约5pM，如通过流式细胞术所测量的。
III.结合到与抗ASCT2抗体及其抗原结合片段相同的表位的结合分子
在某些实施例中，本披露提供了结合至与本文所述的抗ASCT2抗体相同的表位的抗ASCT2抗体。术语“表位”是指能够结合本发明抗体的靶蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于：在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失但与后者的结合不丧失。在标准ASCT2结合测定或活性测定中，可以基于此类抗体与抗体如本文所述的那些交叉竞争(例如，以统计学显着的方式竞争性地抑制结合)的能力，对此类抗体进行鉴定。
因此，在一个实施例中，本发明提供了抗ASCT2抗体及其抗原结合片段(例如单克隆抗体)，该抗体及其抗原结合片段与本发明另一种抗ASCT2抗体或其抗原结合片段(如鼠类单克隆抗体17c10或1e8、或如本文披露的人源化变体)竞争结合至ASCT2。测试抗体抑制例如17c10或1e8的结合的能力证实该测试抗体可以与那种抗体竞争结合至ASCT2；根据非限制性理论，此种抗体可以结合到与它竞争的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段的相同或相关的(例如，结构上相似或空间上接近的)ASCT2上的表位。在一个实施例中，抗ASCT2抗体或其抗原结合片段结合做与例如鼠类单克隆抗体17c10或1e8相同的ASCT2上的表位。
IV.抗ASCT2抗体和抗原结合片段的制备
单克隆抗ASCT2抗体可使用杂交瘤方法制备，如由Kohler和Milstein，Nature[自然]256:495(1975)所描述的那些。使用杂交瘤方法，小鼠、仓鼠、或其他适当的宿主动物如上所述进行免疫，以引发淋巴细胞产生将特异性地结合至免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外免疫。免疫后，分离淋巴细胞，并利用例如聚乙二醇与合适骨髓瘤细胞系融合，以形成可随后从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞选择出的杂交瘤细胞。然后产生特异性针对选定的抗原的单克隆抗体的杂交瘤(这是如通过免疫沉淀法、免疫印迹法、或通过体外结合测定(例如，放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))所确定的)可在体外培养物中使用标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice[单克隆抗体：原理和实践]，学术出版社，1986)或在体内作为动物的腹水肿瘤繁殖。然后使用已知的方法可以将单克隆抗体从培养基或腹水进行纯化。
可替代地，抗ASCT2单克隆抗体还可以使用如在美国专利号4,816,567中所述的重组DNA方法制备。编码单克隆抗体的多核苷酸是从成熟B细胞或杂交瘤细胞，如通过RT-PCR，使用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物分离，且它们的序列是利用常规程序测定。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到适合的表达载体中，这些载体在转染进入不产生免疫球蛋白的宿主细胞，如大肠杆菌细胞、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中时，通过这些宿主细胞生产单克隆抗体。同样地，所希望物种的重组抗ASCT2单克隆抗体或其抗原结合片段可从表达如下所述的所希望物种的CDR的噬菌体展示文库分离：McCafferty等人，Nature[自然]348:552-554(1990)；Clackson等人，自然，352:624-628(1991)；和Marks等人，J.Mol.Biol[分子生物学杂志]222:581-597(1991)。
编码抗ASCT2抗体或其抗原结合片段的一种或多种多核苷酸可进一步以多种不同的方式使用重组DNA技术修饰以产生可替代的抗体。在一些实施例中，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被(1)例如人抗体的那些区域取代以产生嵌合抗体或被(2)非免疫球蛋白多肽取代以产生融合抗体。在一些实施例中，平截或去除这些恒定区以产生所希望的单克隆抗体的抗体片段。定点诱变或高密度诱变可变区可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和性等。
在某些实施例中，该抗ASCT2抗体或其抗原结合片段是人抗体或其抗原结合片段。可以使用本领域已知的不同技术来直接制备人抗体。可以产生在体外免疫的或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人B淋巴细胞。参见，例如，Cole等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法]，艾伦R.丽思出版社(AlanR.Liss)，第77页(1985)；Boemer等人，J.Immunol.[免疫学杂志]147(1):86-95(1991)；美国专利5,750,373。
同样，抗ASCT2人抗体或其抗原结合片段可以选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达如在例如Vaughan等人，Nat.Biotech.[自然生物技术]14:309-314(1996)；Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，95:6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227:381(1991)；以及Marks等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222:581(1991)中所述的人抗体。用于生成和使用抗体噬菌体文库的技术还描述于美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484、和7,264,963；和Rothe等人，J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]376:1182-1200(2008)，其中每一个通过引用以其全文并入本文。
亲和力成熟策略和链改组策略在本领域中是已知的，并且可用于产生高亲和力人抗体或其抗原结合片段。参见Marks等人，BioTechnology[生物技术]10:779-783(1992)，将其通过引用以其全文结合。
在一些实施例中，抗ASCT2单克隆抗体可以是人源化抗体。用于工程化、人源化或表面重修非人抗体或人抗体的方法也可以使用并且是本领域熟知的。人源化、表面重修或相似工程化抗体可以具有来自非人来源的一个或多个氨基酸残基，该来源例如但不限于：小鼠、大鼠、兔、非人灵长动物或其他哺乳动物。这些非人氨基酸残基被通常称为“输入”残基的残基替换，这些残基典型地取自已知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域。此类输入序列可以用于降低免疫原性或减小、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、或如本领域已知的任何其他适合的特征。一般来说，这些CDR残基直接且最实质性地参与影响ASCT2结合。因此，保持部分或全部非人或人CDR序列，同时可变区和恒定区的非人序列可以被人或其他氨基酸替换。
抗体还可以任选地人源化、表面重修、工程化或人抗体工程化，保留针对抗原ASCT2的高亲和力以及其他有利生物性质。为实现这个目标，人源化(或人)或工程化抗ASCT2抗体以及表面重修的抗体可任选地通过使用亲本、工程化和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化和工程化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型是通常可得到的并且对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。说明并展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原如ASCT2的能力的残基。按照此方式，可以从共有序列和输入的序列中选择并且组合FW残基，这样使得所希望的抗体特征，如增加一种或多种靶抗原的亲和性得以实现。
本发明的抗-ASCT2抗体或其抗原结合片段的人源化、表面重修或工程化可使用任何已知方法进行，例如但不限于描述在以下文献中的那些：Jones等人，Nature[自然]321:522(1986)；Riechmann等人，Nature[自然]332:323(1988)；Verhoeyen等人，Science[科学]239:1534(1988)；Sims等人，J.Immunol.[免疫学杂志]151:2296(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.[免疫学杂志]151:2623(1993)；美国专利号5,639,641；5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；4,816,567；7,557,189；7,538,195；和7,342,110；国际申请号PCT/US 98/16280；PCT/US 96/18978；PCT/US 91/09630；PCT/US 91/05939；PCT/US 94/01234；PCT/GB 89/01334；PCT/GB 91/01134；PCT/GB 92/01755；国际专利申请公开号WO90/14443；WO 90/14424；WO 90/14430；和欧洲专利公开号EP 229246；其每一个通过引用完全结合在此，包括其中引用的参考文献。
抗ASCT2人源化抗体及其抗原结合片段也可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造，这些基因座在免疫时能够在内源性免疫球蛋白产生不存在时产生全套人抗体。这种途径描述在美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、以及5,661,016中。
在某些实施例中，提供了抗ASCT2抗体片段。已知各种用于生产抗体片段的技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解衍生，例如由Morimoto等人，J.Biochem.Biophys.Meth.[生物化学和生物物理方法杂志]24:107-117(1993)；Brennan等人，[科学]Science 229:81(1985)所描述的。在某些实施例中，抗ASCT2抗体片段是重组地产生的。所有Fab、Fv、和scFv抗体片段都可以表达在大肠杆菌或其他宿主细胞中并且从其分泌，因而允许大量这些片段的生产。此类抗ASCT2抗体片段也可以从以上讨论的抗体噬菌体文库分离。抗ASCT2抗体片段也可以是如美国专利号5,641,870中所述的线性抗体。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练的从业人员将是清楚的。
根据本发明，可对技术进行改编以生产对ASCT2具有特异性的单链抗体(参见，例如，美国专利号4,946,778)。此外，方法可经改编以构建Fab表达文库，以允许快速且有效地鉴定具有针对ASCT2或其衍生物、片段、类似物或同系物的所希望特异性的单克隆Fab片段。参见，例如，Huse等人，Science[科学]246:1275-1281(1989)。抗体片段可通过本领域已知的技术来产生，包括但不限于：由抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段；通过还原F(ab')2片段的二硫键产生的Fab片段；通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段；或Fv片段。
在某些方面中，可以对抗ASCT2抗体或其抗原结合片段进行修饰以便于增加它的血清半衰期。这可以例如通过将补救受体结合表位并入抗体或抗体片段，通过使抗体或抗体片段中的适当的区域突变，或通过将表位并入随后融合在抗体或抗体片段的末端或中部的肽标签(例如，通过DNA或肽合成)，或通过YTE突变来实现。本领域中已知其他增加抗体或其抗原结合片段的血清半衰期的方法，例如，轭合至异源分子如PEG。
如本文所提供的修饰的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段可以包含任何类型的提供该抗体或多肽与ASCT2的缔合的可变区。在这点上，可变区可包含或衍生自可诱导增加体液应答并生成针对所希望抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。正因如此，抗ASCT2抗体或其抗原结合片段的可变区可以是例如，人、鼠类、非人灵长类动物(例如，食蟹猴、猕猴等)或狼来源的。在一些实施例中，修饰的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段的可变区和恒定区二者是人的。在其他实施例中，相容性抗体的可变区(通常衍生自非人来源)可经工程化或专门定制来改进结合性质或减少分子的免疫原性。在这点上，在本发明中有用的可变区可经人源化或另外通过纳入输入的氨基酸序列改变。
在某些实施例中，抗ASCT2抗体或其抗原结合片段的重链和轻链二者中的可变结构域通过至少部分替换一个或多个CDR并且通过部分框架区替换和序列改变而改变。虽然CDR可以衍生自与构架区所衍生自的抗体相同的类别或甚至子类别的抗体，但是设想CDR将衍生自不同类别的抗体并且在某些实施例中衍生自不同物种的抗体。不必用来自供体可变区的完整CDR来替换所有CDR以将一个可变域的抗原结合能力转移至另一个。而是，只需要转移维持抗原结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到在美国专利号5,585,089、5,693,761和5,693,762中所阐明的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验获得具有减少的免疫原性的功能抗体。
尽管对可变区进行改变，本领域技术人员将理解，本发明的修饰的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段将包含抗体(例如，全长抗体或其抗原结合片段)，其中至少一个或多个恒定区结构域的一部分已被缺失或以其他方式改变，以便提供所希望的生物化学特征，如当与包含天然或未改变的恒定区的具有大约相同免疫原性的抗体相比时增加的肿瘤定位或减少的血清半衰期。在一些实施例中，修饰的抗体的恒定区包含人恒定区。对与本发明兼容的恒定区的修饰包括在一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文披露的修饰的抗体可包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。在一些实施例中，考虑了修饰的恒定区，其中一个或多个结构域部分或全部缺失。在一些实施例中，修饰的抗体将包含缺失结构域的构建体或变体，其中整个CH2结构域被移除(ΔCH2构建体)。在一些实施例中，省略的恒定区结构域可被短氨基酸间隔区(例如，10个残基)替换，该间隔区提供通常由不存在的恒定区所赋予的一定分子柔性。
除它们的构型以外，本领域中已知恒定区介导几种效应子功能。例如，抗体经由Fc区来结合至细胞，其中抗体Fc区上的Fc受体位点结合至细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多对于不同类别的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)、以及IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要并且多样的生物应答，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破环、免疫复合物的清除、杀灭细胞溶解抗体包覆的靶标细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介体的释放、胎盘转移、以及对免疫球蛋白产生的控制。
在某些实施例中，抗ASCT2抗体或其抗原结合片段提供改变的效应子功能，进而影响给予的抗体或其抗原结合片段的生物学特性。例如，恒定区结构域的缺失或失活(经由点突变或其他手段)可以减少循环的修饰抗体的Fc受体结合。在其他情况下，与本发明一致的，恒定区修饰可以缓和补体结合并且因而减少轭合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。恒定区的又其他修饰可以用于消除二硫键或寡糖部分，从而允许由于抗原特异性或抗体灵活性增加而增强定位。相似地，根据本发明对恒定区的修饰可容易地使用技术人员认知范围内的熟知的生物化学或分子工程技术进行。
在某些实施例中，作为抗体或其抗原结合片段的ASCT2-结合分子不具有一种或更多种效应子功能。例如，在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段不具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或不具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施例中，该抗ASCT2抗体或其抗原结合片段不结合至Fc受体和/或补体因子。在某些实施例中，该抗体或其抗原结合片段不具有效应子功能。
在某些实施例中，抗ASCT2抗体或其抗原结合片段可以被工程化以将CH3结构域直接融合到相应的修饰抗体或其片段的铰链区。在其他构建体中，可以将肽间隔区插在铰链区与修饰的CH2和/或CH3结构域之间。例如，可表达相容性构建体，其中CH2结构域已经缺失，且剩余的CH3结构域(修饰的或未修饰的)与具有5-20个氨基酸间隔区的铰链区结合。可添加此间隔区，例如以确保恒定结构域的调节元件保持游离且可接触，或者铰链区保持柔性。在一些情况中，氨基酸间隔区可被证明具有免疫原性，并引发针对构建体的非所需免疫应答。因此，在某些实施例中，添加至构建体的任何间隔区都可以是相对无免疫原性的，或甚至被完全省略，以便维持修饰的抗体的所希望的生物化学性质。
除了缺失整个恒定区结构域之外，本文提供的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段可以通过恒定区中的几个或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来修饰。例如，CH2结构域中的选定区域中的单个氨基酸的突变可足以实质性地减少Fc结合，并且从而增加肿瘤定位。相似地，控制效应子功能(例如，补体C1Q结合)的一个或多个恒定区结构域可以完全或部分缺失。恒定区的这类部分缺失可以改进该抗体或其抗原结合片段的选定特征(例如，血清半衰期)，同时使与受试者恒定区结构域相关的其他所希望的功能保持完整。此外，所披露的抗ASCT2抗体及其抗原结合片段的恒定区可通过增强所得构建体特性的一个或多个氨基酸的突变或取代来修饰。在这个方面，可能干扰保守结合位点(例如，Fc结合)所提供的活性，同时基本上维持修饰的抗体或其抗原结合片段的构型和免疫原性特性。某些实施例可以包括向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强期望特征，如减少或增加效应子功能，或提供更多细胞毒素或碳水化合物附接。在这些实施例中，可以希望插入或复制衍生自选定的恒定区结构域的特定序列。
本发明进一步增强与在此所阐明的鼠类的、嵌合的、人源化或人抗ASCT2抗体、或其抗原结合片段基本同源的变体和等效物。这些可以含有例如保守取代突变，即通过相似的氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守取代是指用相同通用类别内的另一个氨基酸取代一个氨基酸，像例如，用另一个酸性氨基酸取代一个酸性氨基酸、用另一个碱性氨基酸取代一个碱性氨基酸或用另一个中性氨基酸取代一个中性氨基酸。保守氨基酸取代所指的内容在本领域是熟知的。
抗ASCT2抗体或其抗原结合片段可以被进一步修饰为含有通常不是蛋白质的一部分的另外的化学部分。那些衍生的部分可以改进蛋白质的溶解性、生物半衰期、或吸收。这些部分还可以减少或消除蛋白质的任何所希望的副作用等。对那些部分的综述可以在Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第22版，LloydV.Allen,Jr.编辑，(2012)中发现。
V.抗ASCT2抗体轭合物
本披露进一步提供了如上所述的轭合至异源试剂的抗ASCT2抗体或其片段。出于本发明的目的，“轭合”意指通过共价键或离子键的连接。在某些方面中，该试剂可以是抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药物试剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标记、PEG、或任何所述试剂中的两种或更多种的组合。在一些实施例中，此类ASCT2-结合分子是ASCT2-ADC。
因此，本披露还提供了ADC，该ADC包含本文所披露的抗ASCT2抗体，进一步包含至少一种细胞毒素剂。在一些方面中，该ADC进一步包含至少一个任选的间隔区。在一些方面中，该至少一个间隔区是肽间隔区。在一些方面中，该至少一个间隔区是非肽间隔区。
细胞毒素剂或细胞毒素可以本领域中已知的任何分子，该分子抑制或阻止细胞的功能和/或造成细胞破坏(细胞死亡)、和/或施加抗肿瘤/抗增生作用。已知许多类别的细胞毒素剂在ADC分子中具有潜在效用。这些包括但不限于：瓢菌素、奥瑞斯他汀(auristatins)、道诺霉素、多柔比星、多卡米新、多拉司他汀、烯二炔、来红霉素(lexitropsins)、紫杉烷类、嘌呤霉素、美登木素生物碱、长春花碱、微管溶素以及吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。此类细胞毒素剂的实例是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奥瑞斯他汀E、紫杉醇、多西他赛、CC-1065、SN-38、拓扑替康、吗啉代-多柔比星、根霉素、氰基吗啉代-多柔比星、多拉司他汀-10、棘霉素、康普瑞汀、杯形生长抑制素(chalicheamicin)、美登素、DM-1、长春碱、甲氨蝶呤、和纺锤菌素、及其衍生物和类似物。关于适合在ADC中使用的细胞毒素的另外的披露可以，例如，在国际专利申请公开号WO 2015/155345和WO 2015/157592中发现，将其通过引用以其全部内容并入本文。
在一个实施例中，该细胞毒素剂是微管溶素或微管溶素衍生物。微管溶素A具有以下化学结构：
Figure BDA0001651849830000401
微管溶素是从粘细菌物种分离出的一类天然产物中的成员(Sasse等人，J.Antibiot[抗生素杂志]53:879-885(2000))。作为细胞骨架相互作用剂，微管溶素是抑制微管蛋白聚合并且导致细胞周期停滞和细胞凋亡的有丝分裂毒物(Steinmetz等人，Chem.Int.Ed[国际版应用化学]43:4888-4892(2004)；Khalil等人，Chem.Biochem[化学和生物化学]7:678-683(2006)；Kaur等人，Biochem.J[生物化学杂志]396:235-242(2006))。如本文使用的，术语“微管溶素”共同地和单独地是指天然存在的微管溶素和微管溶素的类似物及衍生物。微管溶素的说明性实例被披露于，例如，WO 2004005326 A2、WO 2012019123A1、WO 2009134279 A1、WO 2009055562 A1、WO 2004005327 A1、US 7776841、US 7754885、US 20100240701、US 7816377、US 20110021568、以及US 20110263650中，将其通过引用并入本文。将理解的是此类衍生物包括，例如，包括一个或多个保护或保护基团，一个或多个连接部分的微管溶素前药或微管溶素。
在某些方面中，该微管溶素是微管溶素1508(在本文中又称为“AZ1508”)，并且更详细地描述于WO 2015157594中，将其通过引用并入本文，该微管溶素具有以下结构：
Figure BDA0001651849830000411
在另一个实施例中，该细胞毒素剂可以是吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或PBD衍生物。PBD易位于其中其交联DNA的细胞核，阻止有丝分裂期间的复制，通过诱导单链断裂来破坏DNA，并且随后导致细胞凋亡。一些PBD具有识别和结合到DNA特定序列的能力；优选的序列是PuGPu。PBD具有以下通用结构：
Figure BDA0001651849830000412
PBD在取代基的数目、类型和位置方面，在它们的芳香族A环和吡咯并C环二者方面，以及在C环的饱和度方面不同。在B环中，在N10-C11位置处存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))、或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，其是负责使DNA烷基化的亲电中心。所有已知的天然产物具有在手性C11a位置处的(S)-构型，当从从C环向A环观察时，该构型向其提供了右旋扭曲。这给予它们具有B型DNA小沟的针对异螺旋性的三维形状，导致在结合位点处的滑动配合(Kohn，在Antibiotics III[抗生素III]中，Springer-Verlag,New York[施普林格出版社，纽约]，第3-11页(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter，Acc.Chem.Res.[化学研究述评]，19，230-237(1986))。它们在小沟中形成加合物的能力使得它们能够干扰DNA加工，因此将它们用作抗肿瘤剂。
首例PBD抗肿瘤抗生素，安曲霉素于1965年(Leimgruber等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]87:5793-5795(1965)；Leimgruber等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]87:5791-5793(1965))发现。此后，已经报道了许多天然存在的PBD，并且针对各种类似物已经开发了超过10种合成路线(Thurston等人，Chem.Rev.[化学评论]1994:433-465(1994)；Antonow,D.和Thurston,D.E.，Chem.Rev.[化学评论]111:2815-2864(2011))。家族成员包括阿比霉素(abbeymycin)(Hochlowski等人，J.Antibiotics[抗体学杂志]40:145-148(1987))、奇卡霉素(chicamycin)(Konishi等人，J.Antibiotics[抗菌素杂志]37:200-206(1984))、DC-81(日本专利58-180487；Thurston等人，Chem.Brit.[英国化学]26:767-772(1990)；Bose等人，Tetrahedron[四面体]48:751-758(1992))、甲基氨茴霉素(mazethramycin)(Kuminoto等人，J.Antibiotics[抗菌素杂志]33:665-667(1980))、新氨茴霉素A和B(Takeuchi等人，J.Antibiotics[抗菌素杂志]29:93-96(1976))、波罗斯拉霉素(porothramycin)(Tsunakawa等人，J.Antibiotics[抗菌素杂志]41:1366-1373(1988))、prothracarcin(Shimizu等人，J.Antibiotics[抗菌素杂志]29:2492-2503(1982)；Langley和Thurston，J.Org.Chem.[有机化学杂志]52:91-97(1987))、西班米星(sibanomicin)(DC-102)(Hara等人，J.Antibiotics[抗菌素杂志]41:702-704(1988)；Itoh等人，J.Antibiotics[抗菌素杂志]41:1281-1284(1988))、西伯利亚霉素(Leber等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]110:2992-2993(1988))以及托马霉素(Arima等人，J.Antibiotics[抗菌素杂志]25:437-444(1972))。包含它们的PBD和ADC还被描述于国际专利申请国际专利申请公开号WO 2015/155345和WO 2015/157592中，将其通过引用以其全部内容并入本文。
在某些方面中，该PBD是PBD 3249(在本文中又称为“SG3249”)，并且更详细地描述于WO 2014/057074中，将其通过引用并入本文，该PBD具有以下结构：
Figure BDA0001651849830000431
在某些方面中，该PBD是PBD 3315(在本文中又称为“SG3315”)，并且更详细地描述于WO 2015/052322中，将其通过引用并入本文，该PBD具有以下结构：
Figure BDA0001651849830000432
使用轭合的位点特异性或非位点特异性方法可以将本文披露的抗ASCT2抗体及其抗原片段轭合至异源试剂。在一些方面中，该ADC包含一个、两个、三个、四个或更多个治疗部分。在一些方面中，所有治疗部分是相同的。
用于抗体或其抗原结合片段的常规的轭合策略依赖于通过赖氨酸或半胱氨酸将有效负载随机轭合到抗体或片段。因此，在一些方面中，将该抗体或其抗原结合片段随机轭合至试剂，例如，通过抗体或片段的部分还原，随后与所希望的试剂反应，其中接头部分被附接或不被附接。使用DTT或相似的还原剂可以还原抗体或片段。然后可以在DMSO的存在下，将接头部分被附接或不被附接的试剂以摩尔过量添加至还原的抗体或片段中。轭合后，可以添加过量的游离半胱氨酸以淬灭未反应的试剂。然后可以将反应混合物进行纯化，并且缓冲液更换为PBS。
在其他方面中，使用在具体位置处的反应的氨基酸残基，治疗部分与抗体的位点特异性轭合产出具有一致化学计量的同源ADC配制品。该位点特异性轭合可以通过半胱氨酸、残基或非天然氨基酸进行。在一个实施例中，该细胞毒素剂或显像剂通过至少一个半胱氨酸残基轭合至抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，每个治疗部分经化学轭合至Fc区中的具体Kabat位置处氨基酸的侧链上。在一些实施例中，该细胞毒素剂或显像剂通过位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、440、441、442、443，以及446中至少一处的半胱氨酸取代轭合至抗体或其抗原结合片段，其中该编号对应于Kabat中的EU指数。在一些方面中，该具体的Kabat位置是239、442、或二者。在一些方面中，该具体的位置是Kabat位置442，Kabat位置239和240之间的氨基酸插入，或二者。在一些方面中，该试剂通过硫醇-马来酰亚胺键轭合至抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，该氨基酸侧链是巯基侧链。
在一个实施例中，ASCT2-结合分子(例如，ASCT2-ADC、抗ASCT2抗体、或其抗原结合片段)将细胞毒性有效载荷递送至表达ASCT2的细胞，并且将增生抑制或压制至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或约100％。细胞增生可以使用本领域公认的技术测定，其测量的细胞分裂速率、和/或经历细胞分裂的细胞群中细胞的分数、和/或由于终末分化或细胞死亡(例如，胸苷掺入)引起的细胞群的细胞损失的速率。
VI.编码ASCT2-结合分子的多核苷酸及其表达
本披露提供了包含核酸序列的多核苷酸，该核酸序列编码特异性结合ASCT2或其抗原结合片段的多肽。例如，本发明提供了包含核酸序列的多核苷酸，该核酸系列编码抗ASCT2抗体或编码此类抗体的抗原结合片段。本发明的多核苷酸可以处于RNA形式或处于DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA、以及合成的DNA；并且如果单链可以是编码链或非编码(反义)链，那么DNA可以是双链或单链的。
在某些实施例中，多核苷酸可以是分离的。在某些实施例中，多核苷酸可以是基本上纯的。在某些实施例中，多核苷酸可以是cDNA或衍生自cDNA。在某些实施例中，多核苷酸可以是重组产生的。在某些实施例中，多核苷酸可以包含在相同阅读框中与有助于例如多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸(例如，起用于控制多肽从细胞转运的分泌序列作用的前导序列)融合的成熟多肽的编码序列。具有前导序列的多肽是前蛋白质并且可以使得前导序列被宿主细胞裂解以形成成熟形式的多肽。这些多核苷酸还可以编码ASCT2-结合前蛋白质，该前蛋白质是成熟蛋白质加另外的5'氨基酸残基。
本披露进一步提供了分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码抗体VH的核酸，其中该VH包含与选自下组的参考氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:7。
此外，本披露提供了分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码抗体VL的核酸，其中该VL包含与选自下组的参考氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、和SEQ ID NO:8。
在某些实施例中，本披露提供了分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码抗体VH的核酸，其中该VH包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且包含编码抗体VL的核酸，其中该VL包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，本披露提供了分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码抗体VH的核酸，其中该VH包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且包含编码抗体VL的核酸，其中该VL包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，本披露提供了分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码抗体VH的核酸，其中该VH包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且包含编码抗体VL的核酸，其中该VL包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，本披露提供了分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码抗体VH的核酸，其中该VH包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列，并且包含编码抗体VL的核酸，其中该VL包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％同一性的氨基酸序列。
在某些方面中，包含由如上所述的多核苷酸编码的VH或VL的抗体或其抗原结合片段可以特异性结合至ASCT2，例如人或食蟹猴ASCT2。在某些情况下，这样的抗体或其抗原结合片段可以特异性结合与包含17c10或1e8的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的相同的表位。在某些方面中，本披露提供了编码结合分子的多核苷酸或多核苷酸的组合，例如特异性结合至ASCT2的抗体或其抗原结合片段。
进一步提供一种包含如上所述的多核苷酸的载体。适合的载体在本文中进行了描述，并且是本领域的普通技术人员已知的。
在某些方面中，本披露提供一种包含如上所述的多核苷酸或载体、任选地进一步包含一种或多种载体、稀释剂、赋形剂或其他添加剂的组合物，例如药物组合物。
在如上所述的多核苷酸组合物中，包含编码VH的核酸的多核苷酸和包含编码VL的核酸的多核苷酸可以存在于单个载体中，或可以在单独的载体上。因此，本披露提供了一种或多种包含上述多核苷酸组合物的载体。
本披露进一步提供了包含如上所提供的多核苷酸、多核苷酸组合物、或载体的宿主细胞，其中在一些情况下，宿主细胞可以表达特异性结合至ASCT2的抗体或其抗原结合片段。这样的宿主细胞可以用于制备如在本文中提供的抗体或其抗原结合片段的方法中，其中该方法包括(a)培养该宿主细胞，并且(b)分离从该宿主细胞所表达的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，这些多核苷酸包含用于成熟ASCT2-结合多肽(例如，抗ASCT2抗体或其抗原结合片段)的编码序列，该编码序列在相同阅读框中与允许例如纯化该编码多肽的标志物序列融合。例如，在细菌宿主的情况下，该标志物序列可以是由pQE-9载体供给的六聚组氨酸标签以提供对融合至该标记物的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，该标记物序列可以是衍生自流感病毒血凝素蛋白的血球凝集素(HA)标签。
还提供多核苷酸变体。多核苷酸变体可以在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一些实施例中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加、或缺失而不改变编码的多肽的性质或活性的改变。在一些实施例中，多核苷酸变体由归因于遗传密码的简并性的沉默取代产生。多核苷酸变体可以因为各种原因而产生，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成细菌宿主如大肠杆菌优选的那些密码子)。还提供了包含本文描述的多核苷酸的载体和细胞。
在一些实施例中，使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建编码ASCT2-结合分子的DNA序列。此类寡核苷酸可以是基于所希望的多肽的氨基酸序列并且基于选择在宿主细胞(其中将产生感兴趣的重组多肽)中偏爱的那些密码子来设计。可以应用标准方法来合成编码分离的目的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，完整氨基酸序列可以用于构建回译基因。此外，可以合成含有对具体的分离的多肽进行编码的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可以合成若干个编码所需多肽部分的小寡核苷酸并且然后将其连接。个体的寡核苷酸典型地含有用于互补组装的5'或3'突出端。
一旦组装(通过合成、定点诱变或另一种方法)，编码特定的感兴趣的分离多肽的多核苷酸序列可以被插入至表达载体中并且可操作地连接至适于蛋白质在所需宿主中的表达的表达控制序列。可以通过例如核苷酸测序、限制酶切作图、和/或在适合的宿主中表达生物活性多肽来确认适当的组装。为了在宿主中获得高表达水平的转染基因，该基因可以可操作地连接至在所选择的表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列或与这些转录和翻译表达控制序列缔合。
在某些实施例中，重组表达载体被用于扩增和表达编码抗ASCT2抗体或其抗原结合片段的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，它具有编码抗ASCT2抗体的多肽链或及其抗原结合片段的合成的或cDNA衍生的DNA片段，操作性地连接到衍生自哺乳动物、微生物、病毒、或昆虫基因的适合的转录和翻译调节元件。转录单位总体上包含以下组件：(1)基因表达中具有调节作用的一个或多个遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构序列或编码序列，以及(3)适当的转录和翻译启动和终止序列，如本文详细所述。此类调节元件可以包括控制转录的操纵子序列。另外可并入通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力和促进识别转化体的选择基因。当DNA区域在功能上彼此相关时，将它们可操作地连接。例如，将信号肽(分泌性前导子)的DNA可操作地连接多肽的DNA，如果它被表达为参与多肽的分泌的前体的话；将启动子可操作地连接至编码序列，如果它控制该序列的转录的话；或将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列，如果它被定位地允许翻译的话。旨在用于在酵母表达系统中使用的结构元件包括前导子序列，它使得宿主细胞可以将翻译的蛋白质分泌到胞外。可替代地，在不使用前导子或转运序列表达重组蛋白的情况下，该蛋白质可包括N-末端甲硫氨酸残基。随后，此残基可以任选地从表达的重组蛋白上裂解下来，以提供终产物。
表达调控序列和表达载体的选择将依赖于宿主的选择。可以采用多种多样的表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知细菌质粒，如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9、以及其衍生物，更广泛的宿主范围质粒，如M13和丝状单链DNA噬菌体。
用于表达ASCT2-结合分子的适当的宿主细胞包括在适当的启动子控制下的原核细胞、酵母、昆虫、或高等真核细胞。原核细胞包括革兰阴性或革兰阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如本文所述的哺乳动物来源的已建立的细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。关于蛋白质产生(包括抗体产生)方法的另外的信息可以在例如美国专利公开号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501、以及国际专利公开号WO04009823中找到，这些专利各自通过引用以其全文并入本文。
还可以有利地采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统，以表达重组ASCT2-结合分子。可以在哺乳动物细胞中进行重组蛋白质的表达，因为此类蛋白质总体上被正确地折叠，适当地修饰并且完全起作用。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括HEK-293和HEK-293T、由Gluzman，Cell[细胞]23:175(1981)描述的猴肾细胞的COS-7系，以及包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa、以及BHK细胞系的其他细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，如复制起点、连接至待表达的基因的适合的启动子和增强子、以及其他5'或3'侧接非转录序列、以及5'或3'非翻译序列(如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点)，以及转录终止序列。用于产生昆虫细胞中的异源蛋白质的杆状病毒系统通过Luckow和Summers，BioTechnology[生物技术]6:47(1988)评价。
可以根据任何适合的方法对由转化宿主产生的ASCT2-结合分子进行纯化。此类标准方法包括色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、以及尺寸分级柱色谱)、离心、差别溶解度、或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。亲和标签如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外壳序列以及谷胱甘肽-S-转移酶可以附接至蛋白质，以允许蛋白质通过适当的亲和柱后较容易地得到纯化。还可以使用如蛋白质水解、核磁共振和x射线结晶等此类技术来在物理上表征分离的蛋白质。
例如，可以首先使用商业上可获得的蛋白浓缩过滤器例如艾美康恩(Amicon)或密理博皮里康恩(Millipore Pellicon)超滤单元浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的系统的上清液。浓缩步骤之后，浓缩物可以施加到适合的纯化基质。可替代地，可以采用阴离子交换树脂，例如具有侧接的二乙氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖酐、纤维素、或在蛋白质纯化中常采用的其他类型。可替代地，可以采用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基的各种不可溶基质。最后，可以使用采用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有侧接的甲基或其他脂族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤，以进一步纯化ASCT2-结合分子。还可以采用不同组合的一些或所有上述纯化步骤以提供均质的重组蛋白。
可以例如通过最初从细胞沉淀中提取，随后进行一次或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤来分离在细菌培养物中产生的重组ASCT2-结合分子。可以采用高效液相色谱(HPLC)进行最终纯化步骤。用于重组蛋白表达的微生物细胞可以通过任何常规方法来破坏，这些方法包括冻融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞溶解剂。
用于纯化抗体和其他蛋白质的本领域已知的方法还包括，例如在美国专利公开号2008/0312425、2008/0177048以及2009/0187005中描述的那些，这些专利各自通过引用以其全部内容结合在此。
VII.药物组合物和给予方法
制备本文提供的ASCT2-结合分子并将其给予至对其有需要的受试者的方法是本领域技术人员所熟知的或容易由本领域技术人员来确定的。ASCT2-结合分子的给予途径可以是例如口服、胃肠外、通过吸入、或局部给予。如在此所用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或经阴道给药。虽然所有这些给予形式可清楚地考虑为是在本发明的范围之内，但给予形式的另一实例是用于注射，特别是用于静脉或动脉注射或滴注的溶液。通常，适合的药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、任选地稳定剂试剂(例如，人白蛋白)等。在与本文传授内容相容的其他方法中，如本文提供的ASCT2-结合分子可直接递送到有害细胞群的位点处，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。在一个实施例中，直接给予至气道，例如通过吸入或鼻内给予。
如本文所讨论的，可以按药学有效量给予本文提供的ASCT2-结合分子用于体内治疗由ASCT2过表达表征的疾病或障碍，如结肠直肠癌、HNSCC、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、血液癌(AML、MM、DLBCL)、以及包括CSC的癌症。在这点上，应理解可以配制所披露的结合分子以便有助于给予并且促进活性剂的稳定性。根据本发明的药物组合物可包含药学上可接受的、无毒性的、无菌的运载体，如生理盐水、无毒性的缓冲剂、防腐剂等。出于本申请的目的，药学有效量的ASCT2-结合分子意指足以实现有效结合至靶标且实现益处，例如，改善疾病或病症的症状或检测物质或细胞的量。在本文披露的治疗方法中使用的适合的配制品被描述于Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第22版，编辑LloydV.Allen,Jr.(2012)中。
在此提供的某些药物组合物可以按一种可接受的剂型(包括例如胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液)来口服给予。某些药物组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入来给予。使用苄醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、和/或其他常规增溶剂或分散剂，这样的组合物可以作为盐水中的溶液来制备。
可以与运载体材料组合以产生单一剂型的ASCT2-结合分子的量将取决于所治疗的受试者和特定的给予方式而变化。组合物可以作为单次剂量、多次剂量或经一个既定时间段的输注来给予。还可以调整剂量方案以提供最佳的所希望的应答。
与本披露的范围相一致，ASCT2-结合分子可以根据前述治疗方法以足以产生治疗效果的量给予至人或其他动物。本文提供的ASCT2-结合分子可以按常规剂型给予至该人或其他动物，该剂型是通过根据已知技术将本发明的ASCT2-结合分子与常规药学上可接受的运载体或稀释剂组合而制备的。药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征可通过有待组合的活性成分的量、给予途径和其他熟知的变量来确定。还可以使用本发明的包含一种或多种ASCT2-结合分子(例如，ASCT2-ADC、抗ASCT2抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物)的混合物。
“治疗有效剂量或量”或“有效量”旨在当给予ASCT2-结合分子时，在治疗患有待治疗的疾病或病症的患者方面产生积极的治疗应答的量。
用于治疗其中ASCT2是过表达的疾病或障碍(如某些癌症)的本发明的组合物的治疗有效剂量取决于许多不同因素(包括给予手段、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、以及给予的其他药物)而变化。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定，以最优化安全性和功效。
至少一种待给予的ASCT2-结合分子量容易由本领域的普通技术人员考确定，而无需过多的此披露给出的实验。影响给予方式和至少一种ASCT2-结合分子的相应量的因素包括但不限于：疾病的严重性，疾病的病史，以及经历治疗的个体的年龄、身高、体重、健康、和身体状况。相似地，有待给予的ASCT2-结合分子的量将取决于给予方式以及该受试者将经历这种药剂的单次剂量还是多次剂量。
本披露还提供了ASCT2-结合分子(例如，ASCT2-ADC，抗ASCT2抗体，或其抗原结合片段、变体、或衍生物)在治疗由ASCT2过表达表征的疾病或障碍(例如，结肠直肠癌、HNSCC、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、或血液癌)中使用的用途。
本披露还提供了ASCT2-结合分子(例如，ASCT2-ADC，抗ASCT2抗体，或其抗原结合片段、变体、或衍生物)在制造用于治疗由ASCT2过表达表征的疾病或障碍(例如，结肠直肠癌、HNSCC、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、或血液癌)的药物中的用途。
VIII.诊断
本披露进一步提供了在诊断由ASCT2-过表达表征的疾病(如某些癌症)期间有用的诊断方法，该方法涉及对来自个体的细胞或组织中的ASCT2的表达水平进行测量，并且将所测量的表达水平与在正常的细胞或组织中的标准ASCT2表达进行比较，由此与标准相比，表达水平的增加表明可由本文提供的ASCT2-结合分子治疗的障碍。
使用本领域技术人员已知的经典免疫组织方法，可以将本文提供的ASCT2-结合分子用于在生物样品中测定ASCT2蛋白水平。参见Jalkanen等人，J.CellBiol.[细胞生物杂志]105:3087-3096(1987)；Jalkanen等人，J.Cell Biol.[细胞生物杂志]101:976-985(1985)。用于检测ASCT2蛋白表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，如ELISA、免疫沉淀法、或蛋白质印迹法。
“测定ASCT2多肽的表达水平”旨在直接地(例如，通过确定或估算绝对蛋白水平)或相对地(例如，通过与第二生物样品中的疾病相关多肽水平比较)定性或定量测量或估算第一生物样品中的ASCT2多肽水平。可测量或估计第一生物样品中的ASCT2多肽表达水平并且将该第一生物样品中的ASCT2多肽表达水平与标准ASCT2多肽水平进行比较，标准取自从不患有障碍的个体中获得的第二生物样品或由来自不患有障碍的个体群的平均水平确定。正如本领域将理解的，一旦已知“标准”ASCT2多肽水平，其可重复地被用作为比较的标准。
“生物样品”旨在从潜在地表达ASCT2的个体、细胞系、组织培养物、或其他细胞来源获得的任何生物样品。本领域熟知用于从哺乳动物获得组织活检和体液的方法。
IX.包含ASCT2-结合分子的试剂盒
本披露进一步提供了试剂盒，该试剂盒包含本文所述的ASCT2-结合分子，并且该试剂盒可以用于进行本文所述的方法。在某些实施例中，试剂盒在一个或多个容器中包含至少一种纯化的抗ASCT2抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，试剂盒在一个或多个容器中包含至少一种纯化的ASCT2-ADC。在一些实施例中，这些试剂盒含有进行检测测定的必要和/或足够的所有组件，这些组件包括所有对照、用于进行测定的指导、以及用于分析和呈现结果的任何必要的软件。本领域技术人员将容易地认识到，所披露的ASCT2-结合分子可以容易地并入本领域熟知的已建立的试剂盒形式之一。
X.免疫测定
可以通过本领域已知的任何方法将本文提供的ASCT2-结合分子用于针对免疫特异性结合的测定。可使用的免疫测定包括但不限于，使用如以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：蛋白质印迹、RIA、ELISA、ELISPOT、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、以及蛋白质A免疫测定。此类测定是常规的并且在本领域是熟知的。参见，例如，Ausubel等人，编辑，(1994)Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法](John Wiley&Sons,Inc.,NY[约翰威利父子公司，纽约])第1卷，将其通过引用以其全文结合在此。
可以在组织学上采用本文提供的ASCT2-结合分子，如在免疫荧光法、免疫电子显微术、或非免疫学测定中，例如用于原位检测ASCT2或其保守变体或肽片段。原位检测可以通过如下来完成：从患者中取出组织学样本，并向其施用标记的ASCT2-结合分子，例如通过将该标记的ASCT2-结合分子覆盖在生物样品上来施加。通过使用这一程序，不仅可确定ASCT2、或保守变体或肽片段的存在，还可确定其在检查的组织中的分布。使用本发明，普通技术人员应容易地知道，可修改众多的组织学方法(如染色程序)中的任一种以便实现这种原位检测。
给定批次的ASCT2-结合分子的结合活性可根据熟知的方法来确定。本领域技术人员应能够通过采用常规实验确定每个测定的操作和最佳测定条件。
适用于确定分离的ASCT2-结合分子的结合特征的方法和试剂是在本领域中已知的和/或可商购的。设计用于此类动力学分析的设备和软件是可商购的(例如，
Figure BDA0001651849830000561
Figure BDA0001651849830000562
软件，GE医疗集团(GE Healthcare)；
Figure BDA0001651849830000563
软件，Sapidyne仪器)。
本发明的实践将采用(除非另外指明)细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA、以及免疫学的常规技术，这些技术史是在本领域之内。此类技术在文献中得到充分解释。参见，例如，Sambrook等人编辑(1989)，Molecular Cloning ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版，冷泉港实验室出版社)；Sambrook等人编辑(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，(冷泉港实验室，纽约)；D.N.Glover编辑(1985)DNA Cloning[DNA克隆]，第I卷和第II卷；Gait编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]；Mullis等人，美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic Acid Hybridization[核酸杂交]；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription And Translation[转录与翻译]；Freshney(1987)Culture OfAnimal Cells[动物细胞的培养](Alan R.Liss公司)；Immobilized Cells And Enzymes[固定化细胞与酶](IRL出版社)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To MolecularCloning[分子克隆实用指南]；专题论文，Methods In Enzymology[酶学方法]，(学术出版社公司，纽约州)；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors For MammalianCells[哺乳动物细胞的基因转移载体]，(冷泉港实验室)；Wu等人编辑，Methods InEnzymology[酶学方法]，第154卷和第155卷；Mayer和Walker编辑(1987)ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology[细胞与分子生物学中的免疫化学方法](学术出版社，伦敦)；Weir和Blackwell编辑(1986)Handbook Of Experimental Immunology[实验免疫学手册]，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo[操纵小鼠胚胎]，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州，(1986)；以及Ausubel等人(1989)Current Protocols inMolecular Biology[当代分子生物学方案](约翰威利父子公司，巴尔的摩，马里兰州)。
在Borrebaeck编辑(1995)Antibody Engineering(2nd ed.；Oxford Univ.Press)[抗体工程(第二版；牛津大学出版社)]中，提出了抗体工程的普遍原理。蛋白质工程化的一般原理列举在Rickwood等人编辑(1995)Protein Engineering,A Practical Approach(IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)[蛋白质工程化，实用方法(牛津大学出版社的IRL出版社，牛津，英国)]中。在Nisonoff(1984)Molecular Immunology[分子免疫学](第2版；西诺埃联合公司(Sinauer Associates)，桑德兰，马萨诸塞州)；以及Steward(1984)Antibodies,Their Structure and Function[抗体，它们的结构和功能](Chapman和Hall出版社，纽约，纽约州)中阐明了抗体和抗体半抗原结合的普遍原理。另外，本领域中已知的免疫学标准方法，不再做具体的描述，大体上遵循以下：免疫学现代方法，约翰威利父子公司，纽约；Stites等人编辑(1994)Basic and Clinical Immunology[基础和临床免疫学](第8版；阿普尔顿和兰格公司(Appleton&Lange)，诺瓦克，康涅狄格州)；以及Mishell和Shiigi(编辑)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology[细胞免疫学中所选择的方法](W.H.弗里曼与公司(W.H.Freeman and Co.)，纽约州)。
阐明免疫学的普遍原理的标准参考文献包括Current Protocols in Immunology[免疫学现代方法]，约翰威利父子公司，纽约；Klein(1982)J.,Immunology:The Scienceof Self-NonselfDiscrimination[免疫学杂志：自身-非自身辨别科学](约翰威利父子公司，纽约)；Kennett等人编辑(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimensionin Biological Analyses[单克隆抗体、杂交瘤：生物分析中的新维度](Plenum出版社，纽约州)；Campbell(1984)“Monoclonal Antibody Technology”in Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology[生物化学与分子生物学的实验室技术的“单克隆抗体技术”]，编辑，Burden等人，(爱思唯尔出版社(Elsevier)，阿姆斯特丹)；Goldsby等人，编辑(2000)Kuby Immunology[库比免疫学](第4版；H.弗里曼与公司(H.Freemand&Co.))；Roitt等人(2001)Immunology[免疫学](第6版；伦敦：莫斯比)；Abbas等人(2005)Cellular and Molecular Immunology[细胞和分子免疫学](第5版；爱思唯尔出版社健康科学部(Elsevier Health Sciences Division))；Kontermann和Dubel(2001)AntibodyEngineering[抗体工程](施普林格出版社(Springer Verlan))；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](冷泉港出版社)；Lewin(2003)Genes VIII[基因VIII](普伦蒂斯·霍尔出版(Prentice Hall)2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册](冷泉港出版社)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer[PCR引物](冷泉港出版社)。
此披露中所引用的所有这些参考文献通过引用以其全文并入本文。此外，任何制造商的针对本文所引用或提及的任何产品的说明或目录均通过引用并入。通过引用并入本文的文献或其中的任何传授内容可以用于本发明的实践中。通过引用并入本文的文件不被承认是现有技术。
XI.实施例
实施例1.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段特异性地结合至中性氨基酸转运蛋白2(ASCT2)的表位，其中该抗体或抗原结合片段特异性地结合至与抗体或其抗原结合片段的相同ASCT2表位，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)的三个重链互补决定区(HCDR)和轻链可变区(VL)的三个轻链互补决定区(LCDR)；其中HCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中阐明；HCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:22中阐明；HCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:23中阐明；LCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中阐明；LCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中阐明；以及LCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:25中阐明。
实施例2.如实施例1所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HCDR1；SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:17的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR3、SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCDR2、以及SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3。
实施例3.如实施例1或实施例2中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且其中该VL包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、和SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
实施例5.根据实施例1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，并且该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。
实施例6.根据实施例1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该IgG恒定区包含在位置239处的丝氨酸(S)和位置240处的V之间的半胱氨酸(C)插入。
实施例7.根据实施例6所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链。
实施例8.根据实施例1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当抗体结合至细胞表面上的ASCT2时，该抗体被内化到细胞中。
实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含选自下组的轻链恒定区，该组由以下各项组成：人κ恒定区和人λ恒定区。
实施例10.根据实施例9所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含SEQ ID NO:26的人κ恒定区。
实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段进一步轭合至选自下组的细胞毒素，该组由以下各项组成：抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药物试剂、淋巴因子、异源抗体、异源抗体的片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、放射性同位素、以及任何所述细胞毒素中的两种或更多种的组合。
实施例12.根据实施例11所述的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段轭合至细胞毒素。
实施例13.根据实施例12所述的抗体或抗原结合片段，其中该细胞毒素选自微管溶素衍生物和吡咯并苯并二氮杂卓。
实施例14.根据实施例13所述的抗体或抗原结合片段，其中该微管溶素衍生物是微管溶素AZ1508。
实施例15.根据实施例13所述的抗体或抗原结合片段，其中该吡咯并苯并二氮杂卓选自SG3315和SG3249。
实施例16.根据实施例15所述的抗体或抗原结合片段，其中该吡咯并苯并二氮杂卓是SG3315。
实施例16A.根据实施例15所述的抗体或抗原结合片段，其中该吡咯并苯并二氮杂卓是SG3249。
实施例17.根据实施例1至16中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体结合至人ASCT2和食蟹猴ASCT2。
实施例18.根据实施例1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体不特异性结合人ASCT1。
实施例19.一种药物组合物，该药物组合物包含如实施例1至18中任一项所述的抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的运载体。
实施例20.一种编码根据实施例1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸或多核苷酸的组合。
实施例21.一种载体，该载体包含根据实施例20所述的多核苷酸或多核苷酸的组合。
实施例22.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据实施例20所述的多核苷酸或多核苷酸的组合或根据实施例21所述的载体。
实施例23.一种抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR2、以及SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR3，并且其中该抗体或抗原结合片段轭合至细胞毒素。
实施例23A.一种抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR2、以及SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR3，并且其中该抗体或抗原结合片段轭合至细胞毒素。
实施例24.根据实施例23所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VH结构域和含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的VL结构域。
实施例24A.根据实施例23所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VH结构域和含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的VL结构域。
实施例25.根据实施例23或实施例24所述的抗体或抗原结合片段，其中该细胞毒素选自下组，该组由以下各项组成：抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药物试剂、淋巴因子、异源抗体、异源抗体的片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、放射性同位素、以及任何所述细胞毒素中的两种或更多种的组合。
实施例26.根据实施例23或实施例24所述的抗体或抗原结合片段，其中该细胞毒素选自微管溶素衍生物和吡咯并苯并二氮杂卓。
实施例27.根据实施例26所述的抗体或抗原结合片段，其中该微管溶素衍生物是微管溶素AZ1508。
实施例28.根据实施例26所述的抗体或抗原结合片段，其中该吡咯并苯并二氮杂卓选自SG3315和SG3249。
实施例29.根据实施例28所述的抗体或抗原结合片段，其中该吡咯并苯并二氮杂卓是SG3315。
实施例29A.根据实施例28所述的抗体或抗原结合片段，其中该吡咯并苯并二氮杂卓是SG3249。
实施例30.一种药物组合物，该组合物包含根据实施例23至29所述的抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的运载体。
实施例31.一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养如实施例22所述的宿主细胞；并且分离该抗体或抗原结合片段。
实施例32.一种诊断试剂，该诊断试剂包含根据实施例1至18或23至29中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
实施例33.一种试剂盒，该试剂盒包含根据实施例1至18或23至29中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或根据实施例19或30所述的组合物。
实施例34.一种将试剂递送至表达ASCT2的细胞的方法，该方法包括使该细胞与根据实施例23至29中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触，其中该试剂被该细胞内化。
实施例35.一种诱导表达ASCT2的细胞死亡的方法，该方法包括使该细胞与根据实施例23至29中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触，其中该轭合至细胞毒素的抗体诱导表达ASCT2的细胞的死亡。
实施例36.一种在受试者中治疗由ASCT2的过表达表征的癌症的方法，该方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的根据实施例1至18或23至29中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或根据实施例19或实施例30所述的组合物。
实施例37.根据实施例36所述的方法，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：结肠直肠癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、以及血液癌(AML、MM、DLBCL)。
实施例37A.根据实施例36所述的方法，其中该癌症包含CSC。
实施例38.根据实施例37所述的方法，其中该血液癌选自以下各项：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、以及多发性骨髓瘤。
实施例39.一种用于在样品中检测ASCT2表达水平的方法，该方法包括：使该样品与根据实施例1至18或23至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施例19或实施例30所述的组合物接触，并且检测样品中该抗体或其抗原结合片段与ASCT2的结合。
实施例40.根据实施例39所述的方法，其中该样品是细胞培养物。
实施例41.根据实施例39所述的方法，其中该样品是分离的组织。
实施例42.根据实施例39所述的方法，其中该样品来自人。
实施例43.一种ASCT2抗体-药物轭合物(ASCT2-ADC)，该ASCT2抗体-药物轭合物包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HCDR3、SEQ IDNO:13的氨基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LCDR3、以及微管溶素AZ1508。
实施例44.一种ASCT2-ADC，该ASCT2-ADC包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LCDR1、SEQ IDNO:14的氨基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LCDR3、以及PBD SG3249。
实施例45.一种ASCT2-ADC，该ASCT2-ADC包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LCDR1、SEQ IDNO:14的氨基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LCDR3、以及微管溶素、和PBDSG3315。
实施例46.一种ASCT2-ADC，该ASCT2-ADC包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR1、SEQ IDNO:20的氨基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3、以及微管溶素AZ1508。
实施例47.一种ASCT2-ADC，该ASCT2-ADC包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR1、SEQ IDNO:20的氨基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3、以及PBD SG3249。
实施例48.一种ASCT2-ADC，该ASCT2-ADC包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR1、SEQ IDNO:20的氨基酸序列的LCDR2、SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3、以及PBD SG3315。
实例
以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。
本披露的实施例可以是通过参考以下非限制性实例来进一步限定，这些非限制性实例具体说明了本披露的某些抗体的制备和用于使用本披露的抗体的方法。本领域普通技术人员应当清楚的是在不背离本披露的范围的情况下，可以对材料和方法二者做出许多修改。
实例1.在人正常组织和癌症组织中的ASCT2表达
通过IHC分析的在正常组织和肿瘤组织中的ASCT2蛋白表达
为了评估ASCT2的蛋白表达，从正常人和从人肿瘤甲醛固定的组织切片进行IHC。用柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)抗原修复处理后，遵循制造商的方案，将这些组织用抗ASCT2兔多克隆抗体(EMD Millipore(EMD密理博公司)，比尔里卡，马萨诸塞州；目录号ABN73)进行测试。使用HT29细胞系作为阳性对照，并且使用原代人肝细胞作为阴性对照来进行方案优化。
在正常组织中，在肝脏、心脏、肺细胞(pneumocye)、肾小球、和脑中均未观察到ASCT2的染色。
在人肿瘤中的ASCT2表达
通过IHC评估不同癌组织中的ASCT2表达。在包括结肠癌、肺鳞状细胞癌、头颈部癌、和前列腺癌组织在内的实体瘤中，以及在血液癌(如AML、MM，和DLBCL)中观察到强列的膜ASCT2表达。此外，在卵巢子宫内膜癌组织和在黑色素瘤组织中观察到高ASCT2表达。下表2提供了在人癌症组织中ASCT2表达的概述。
表2
在人肿瘤中的ASCT2表达
Figure BDA0001651849830000681
在从AML和MM的癌症干细胞中观察到ASCT2表达。使用与荧光团Alexa 647轭合的ASCT2抗体17c10通过流式细胞术来评估癌症干细胞中的ASCT2。如在图1A中所述，ASCT2在AML和MM患者中的表达明显高于在正常骨髓中。通过使用流式细胞术对不同的亚群(如CD38+、CD38-，CD34+、CD34-、CD38+和CD34+、以及CD38-和CD34-)进行分类，细胞被分离并且将它们的干细胞性质通过对每个亚群进行克隆生成测定来进一步表征。我们发现只有CD38+、CD34+细胞形成菌落，这进一步证实了在文献中描述的发现(Lapidot T等人，Nature[自然]1994；367(6464):645-8；Bonnet D等人Nat Med[自然医学杂志]1997；3(7):730-7)。评估以上所述的所有亚群中的ASCT2表达。图1B描述了在白血病干细胞群(即，AML患者样品的CD38+、CD34+群)中的高ASCT2表达。同样地，如在图1C中所述，ASCT2表达在AML的大部分或非白血病干细胞群中也很高。此外，还评估了MM肿瘤细胞的CD138+、CD19-(浆细胞)和CD138-、CD19+(干细胞)中的ASCT2表达。图1C中的直方图表明了与MM的干细胞相比，浆细胞中的高ASCT2表达。数据支持，与来自正常供体的骨髓相比，在来自AML和MM患者样品的骨髓中观察到ASCT2表达。此外，ASCT2在AML患者样品的白血病干细胞(LSC)(CD34+/CD38+)中高度过表达。此外，与干细胞群(CD138-、CD19+)相比，还被定义为MM浆细胞的CD138+、CD19-细胞显示出更高的ASCT2的表达。
还在来自胰腺肿瘤的癌症干细胞中观察到ASCT2表达。用胶原蛋白III消化胰腺实体瘤片段并且制备单细胞悬浮液。用针对细胞表面蛋白、EpCAM、CD44、CD24的抗体，以及用先前描述的ASCT2抗体对解离的细胞进行染色。已经针对胰腺癌干细胞的细胞表面蛋白标记进行了充分表征。EpCAM+CD44+CD24+细胞被定义为胰腺肿瘤中的癌症干细胞(Li,C等人，Cancer Res.[癌症研究]2007；67:1030-1037)。CSC群(EpCAM+、CD44+、CD24+)中ASCT2表达的实例在图1D中进行了描述。使用此相同策略，在用ASCT2-PBD ADC或同种型对照ADC的单次剂量处理后，评估了胰腺肿瘤的癌症干细胞群中的ASCT2表达。图1E证实ASCT2-PBD ADC消融癌症干细胞群。本文数据证实靶向ASCT2不仅在实体瘤中，而且在血液癌症和癌症干细胞中也是有效的。
实例2.抗ASCT2抗体的产生
免疫和杂交瘤产生
通过具有人ASCT2基因的质粒的DNA免疫(Chowdhury等人，J.Immunol.Methods[免疫方法杂志]249:147，2001)产生对ASCT2的抗体。将人ASCT2的基因克隆到表达质粒pcDNA3.1(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中。对八周龄VelocImmuneII小鼠(再生元公司(Regeneron)，塔里敦，纽约)在尾部的基部每隔一周以1mg/mL在PBS中经皮内注射100μg的ASCT2表达质粒。在第一次注射后的第28天开始以2周间隔收集测试血液，并通过流式细胞术测定ASCT2-特异性抗体。将测试血液的连续稀释液与表达ASCT2或无关细胞表面蛋白的293F细胞一起孵育。在第56和70天，处死具有最高特异性滴度的小鼠。分离来自淋巴结和脾的淋巴细胞，并且遵循聚乙二醇(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，印第安纳波利斯，印第安纳州)融合方法，将这些淋巴细胞与骨髓瘤细胞系P3x/63Ag8.653以1:1比率融合。在含有次黄嘌呤-氨蝶呤-胸苷(HAT)的杂交瘤生长介质中选择融合的细胞。
流式细胞术筛选测定
针对与表达ASCT2的HEK 293F细胞的结合来评估杂交瘤上清液。通过流式细胞术发现特异性结合至表达ASCT2的HEK 293F细胞的上清液进一步通过用一组表达ASCT2的癌细胞系的流式细胞术染色确认了ASCT2-特异性结合。最后，将确认的上清液转化为人IgG1，用于进一步的结合评估。
人抗ASCT2IgGmAb和Fab的克隆和表达
通过有限稀释法亚克隆杂交瘤。对于亲本杂交瘤，通过如上所述流式细胞术，针对ASCT2-特异性抗体筛选蛋白质A-亲和纯化的IgG亚克隆的上清液。使用Dynabeads mRNADirect试剂盒(英杰公司)分离亚克隆的杂交瘤的mRNA。使用SuperScript III逆转录酶(英杰公司)和随机六聚体引物合成cDNA的第一链。通过用一组
Figure BDA0001651849830000701
简并的Ig-引物(EMD密理博公司，目录号69830)的PCR扩增人Ig VL和VH基因。将PCR扩增的VL和VH产物克隆到质粒pCR2.1-TOPO(英杰公司)中，并进行测序。在添加用于克隆到人IgGκpOE载体的限制性内切酶位点的情况下，将来自每个杂交瘤的VH和VL基因通过PCR进行再扩增，其中VL被克隆在与人c-κ融合的BssHII/BsiWI位点处，并且VH被克隆在与人IgG-1重链恒定区(或用于产生Fab的CH1区)融合的BsrGI/SalI位点处。将所得pOE质粒通过DNA测序来验证。
抗ASCT2抗体在Hek293F(英杰公司)或CHO-G22细胞中瞬时表达。为了在Hek293F细胞中表达，根据制造商的方案使用293fectinTM(英杰公司；目录号12347-019)进行转染。将这些细胞在FreeStyleTM 293表达介质(英杰公司；目录号12338-018)中培养，并且在转染后第三天和第六天将培养体积加倍。将转染的Hek293F细胞总共培养十一天。为了在CHO-G22细胞中表达，使用制造商的方案利用25kDa线性聚乙烯亚胺(波利塞斯公司(Polysciences)，沃灵顿，宾夕法尼亚州)对细胞进行转染。将这些细胞在CD CHO介质(英杰公司)中培养，并且用内部饲料每隔一天补料。将转染的CHO-G22细胞总共培养十二天。
通过蛋白质A色谱法分离全长人IgG后，通过流式细胞术对结合进行再次评估。图2描绘了一副条形图，该条形图显示了与mock转染的细胞相比，分离的人IgG 1e8、3f7、5a2、9b3、10c3、16b8、17c10、和17a10与表达人ASCT2的细胞的结合的倍数变化。如在图中所见，发现若干全长人IgG保持ASCT2结合活性。
实例3.ASCT2-结合抗体作为抗体-药物轭合物(ADC)
评估ASCT2-结合抗体的ADC-介导的细胞毒性
为了确认亲本抗体的内化，并且为了预测它们是否可以递送细胞毒性有效载荷，根据制造商的说明书在Hum-ZAP抗体内化测定(高级靶向系统公司(Advanced TargetingSystems)，圣地亚哥，加利福尼亚州)中测试亲本抗体。简言之，将ASCT2-阳性WiDr细胞以1,000个细胞/孔的处理的组织培养物的密度在在96孔板上铺板于培养基中，并且允许这些细胞在37℃/5％CO2下粘附过夜。为了制备测试品，将每个亲本抗体用与核糖体失活蛋白(皂草素)相轭合的第二抗体(山羊抗人IgG)在室温下孵育30分钟以形成第二轭合物。然后制备该第二轭合物的连续稀释液，并且添加至含有细胞的孔中。
在37℃/5％CO2下孵育72小时后，将
Figure BDA0001651849830000721
发光活力测定(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康辛州)用于确定相对细胞毒性。简言之，将
Figure BDA0001651849830000722
试剂添加至每个孔中，并且允许在室温下伴随轻微晃动孵育10分钟。使用Perkin Elmer
Figure BDA0001651849830000723
光度计在560nM处对每个样品的吸光度读数。将用亲本抗体1E8或17C10、化学连接至皂草素(hIgG-皂草素)的抗ASCT2抗体、或化学连接至皂草素的同种型对照的处理的细胞的相对增生率(％)与未处理的对照细胞的相对活力进行比较。如在图3A中示出，在用非化学连接皂草素的抗ASCT2抗体处理的细胞中比在用皂草素轭合的抗体处理的那些细胞中，相对细胞增生率较低。
评估经典轭合的抗ASCT2抗体与微管溶素有效载荷的ADC-介导的细胞毒性
为了确认由轭合至微管溶素有效载荷的抗ASCT2抗体的ADC-介导的杀灭，直接将前导抗体1E8和17C10轭合至毒素的微管溶素类，并且在ASCT2-阳性结肠癌细胞上测试用所轭合的抗体的细胞毒性杀灭。简言之，将SW48细胞以1,000个细胞/孔的处理的组织培养物的密度在在96孔板上铺板于培养基中，并且允许这些细胞在37℃/5％CO2下粘附过夜。为了制备测试品，将与微管溶素有效载荷轭合的每种抗体(ASCT2前导1E8和17C10，以及同种型对照)进行连续稀释并且添加至对应的孔中。在37℃/5％CO2下孵育72小时后，如上所述，将
Figure BDA0001651849830000724
发光活力测定用于确定相对细胞毒性。
通过下式计算百分比细胞活力：(处理的样品的平均发光/对照样品的平均发光)x100。使用GraphPad Prism软件的逻辑非线性回归分析确定IC50值。图3B显示了经典轭合至微管溶素AZ1508的抗ASCT21E8、抗ASCT217C10、和同种型对照R347的细胞毒性的图。该图显示了两种抗ASCT2抗体具有相似的细胞毒性。将所计算的IC50值在下表3中示出。
表3
ASCT2前导抗体的ADC-介导的细胞毒性杀灭经典轭合至微管溶素
抗体克隆 17c10 1e8 R347
IC<sub>50</sub>(ng/ml) 45.98 34.83 NA
针对位点特异性轭合的半胱氨酸突变的克隆
使用标准重叠PCR方法来将半胱氨酸残基引入抗ASCT2抗体1E8和17C10的CH2区中的氨基酸S239和V240之间。此半胱氨酸(称为“239插入”或“239i”)将充当在抗ASCT2ADC抗体的制备中细胞毒性药物的轭合位点。含有Maia插入的重链主链的氨基酸序列示出在SEQID NO:9中。将含有引入的半胱氨酸的抗体轭合至微管溶素有效载荷(微管溶素AZ1508)或轭合至吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)有效载荷(SG3249或SG3315)，基本上如下文所述。
含有马来酰亚胺的药物的轭合
评估ADC有效载荷的所有化合物(AZ1508、SG3249、SG3315)都含有接头和，易于与抗体的硫醇残基轭合(形成巯基-马来酰亚胺键)的马来酰亚胺基团。可以将包含马来酰亚胺基团(例如，微管溶素1508)的细胞毒素轭合至工程化到本发明的抗ASCT2抗体(例如，17c10，1e8)中的具体的半胱氨酸残基上。可替代地、或任选地，人们可以使用经典的轭合方法将细胞毒素剂附接至所述的抗体。用于将细胞毒素轭合至抗体上的天然赖氨酸和半胱氨酸残基的方法是本领域熟知的。以下提供了用于位点特异性(在工程化的半胱氨酸残基处)和经典的轭合(在天然半胱氨酸残基处)的代表性方法。
代表性的位点特异性抗体-药物轭合过程包括以下步骤：(a)将可衍生的氨基酸(例如，半胱氨酸)的侧链去封端，(b)氧化，(c)轭合有效载荷(例如，细胞毒素剂，如微管溶素1508)，以及(d)通过去除轭合试剂和未反应的有效载荷进行精滤(polishing)。例如，可以通过在1X PBS中用1mM乙二胺四乙酸(EDTA)配制抗体进行与工程化的半胱氨酸的轭合。通过添加四十当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐/抗体并且在37℃下孵育三小时，使用轻度还原来产生游离硫醇。使用在1X PBS中的用1mM EDTA进行的三次连续渗析来去除三(2-羧乙基)膦盐酸盐。可替代地，可以使用脱盐柱来去除三(2-羧乙基)膦盐酸盐。通过添加约20当量的脱氢枞酸(dhAA)并且在室温下孵育约四小时允许抗体链间二硫键重新形成。
在准备轭合时，将二甲亚砜添加至抗ASCT2抗体中至百分之十v/v。添加在二甲亚砜中的八或十二当量的微管溶素1508有效载荷(分别针对2T和4T载药量)，并且将该混合物在室温下孵育约1小时。可替代地，该孵育可以在4℃下进行约16小时。通过添加约4摩尔当量的N-乙酰基半胱氨酸(NAC)/有效载荷(即，32或48)淬灭该反应。遵循制造商的建议，通过使用陶瓷羟基磷灰石从轭合的抗体中去除游离的有效载荷。如果需要，最终产品可以经受缓冲液更换。为了确认纯度和与重链的轭合，可以通过本领域已知的任何方法分析这些轭合的抗体。在一些情况下，可以将非还原性和还原性SDS-PAGE用于确认纯度和与重链的缀合。
通过部分还原抗体，然后用所希望的接头-药物反应来制备具有随机轭合至天然半胱氨酸残基的药物的ADC。通过在pH 8.0下添加约3摩尔当量的DTT，随后在约37℃下孵育约2小时，将浓度为5mg/mL的抗体部分还原。然后将还原反应在冰中冷却，并例如通过透滤去除过量的DTT。然后以约1:10的接头-药物/硫醇摩尔比添加接头-药物。在约10％v/vDMSO的存在下进行轭合反应。轭合后，添加过量游离的半胱氨酸(超过接头-药物约2倍摩尔比)以淬灭未反应的接头-药物以产生半胱氨酸-接头-药物加合物。将反应混合物进行纯化(例如，通过疏水性相互作用层析法)，并且经受缓冲液更换为PBS。使用标准方法(如疏水性相互作用层析法和还原反相色谱法)确定载药量分布。
实例4.ASCT2-结合的mAb和ADC的特征
结肠直肠癌细胞中ASCT2抗体的ASCT2特异性结合
为了确定某些杂交瘤克隆的结合对ASCT2抗原是否具有特异性，遵循ASCT2表达的shRNA敲除来评估结合。简言之，用表达ASCT2shRNA或非靶标shRNA(NTshRNA)的慢病毒转导WiDr细胞。在感染后72小时对两种抗ASCT2杂交瘤克隆17c10和1e8的结合进行评估。如图4中所见，ASCT2表达的敲除显著消融了对应克隆的结合，并且进一步确认了ASCT2mAbs17c10和1e8的抗原-特异性结合。
抗ASCT2未轭合抗体的内化动力学
当与靶抗原结合时抗体的内化是实现所希望的ADC效应的先决条件。因此，检验ASCT2抗体的内化特征。将WiDr细胞与轭合至Alexa 488的抗ASCT2抗体17c10(17c10-Alexa488)进行孵育持续不同时间段。然后将细胞洗涤并在有或没有抗Alexa 488抗体的情况下在冰上孵育45分钟以淬灭细胞表面信号。通过流式细胞术分析测量总信号和淬灭信号(代表内化的抗体)的荧光强度。如在图5A中所见，与未显示内化的同种型对照抗体相比，抗ASCT2抗体17c10显示了随时间增加的内化。
通过细胞毒性杀灭测量的ASCT2-ADC(17c10AZ1508)的内化动力学
用轭合至微管溶素AZ1508的抗ASCT2抗体(17C10-AZ1508)将细胞进行脉冲持续不同的时间段。此后，含有介质的ADC被新鲜介质替换，并且将细胞再孵育4天。通过使用CTG试剂盒测量细胞活力。绘制剂量-应答曲线为未处理的对照细胞的百分比，并且将代表性的图在图5B中示出。如上所述的计算IC50值，并且将这些结果汇总在下表4中。
表4
ASCT2-ADC(17c10AZ1508)的内化动力学
Figure BDA0001651849830000761
亲和力确定(17c10和1e8与表达ASCT2的细胞系的结合)
利用表达ASCT2的人、食蟹猴，和CHO-衍生的细胞系来评估ASCT2-特异性抗体的结合亲和力和交叉反应性。通过滴定荧光团标记的抗体测量表观亲和力。将代表性的结果汇总在下表6中，并且在图6中示出。
图6显示了由抗ASCT2抗体17c10和1e8，以及同种型对照R347与表达ASCT2的细胞系的结合而产生的流式细胞术图。人癌细胞系Cal27的结果示于图6A中；人癌细胞系FaDu的结果示于图6B中；人癌细胞系SSC15的结果示于图6C中；人癌细胞系WiDr的结果示于图6D中；稳定表达人ASCT2的CHOK1细胞的结果示于图6E中；稳定表达cyno ASCT2的CHOK1细胞的结果示于图6F中；cyno癌细胞系CynoMK1的结果示于图6G中；以及mock转染的CHOK1细胞的结果示于图6H中。将结合至表达ASCT2的细胞系的17c10和1e8的EC50值在下表5中示出。
表5
针对与表达ASCT2的细胞系结合的17c10和1e8的EC50值
细胞系 17c10EC<sub>50</sub>(nM) 1E8EC<sub>50</sub>(nM)
Fadu 3.8 6.8
SSC15 3.6 8.8
WiDr 7.0 5.8
Cal27 2.8 13
CynoMK1 6.7 14.8
HuASCT2-CHOK1 8.6 8.1
CynoASCT2-CHOK1 9.6 28.4
17c10抗体对ASCT2抗原的特异性
抗ASCT2抗体17c10不具有针对ASCT1(SLC1A4)SLC1A家族的其他成员的亲和力。如图7A所示的图中所见，shRNA对ASCT1表达的沉默不消融17c10在SKMEL-2细胞中的ASCT2特异性结合。通过蛋白质印迹分析进一步确认shRNA的敲除效率。此外，如在图7B中示出的图中看出，在细胞的细胞毒性特性中没有观察到变化，其中通过各自的shRNA沉默ASCT1表达。结果汇总在表6中。
表6
17c10-ADC的ASCT2-特异性结合和细胞毒性杀灭
Figure BDA0001651849830000771
ASCT2-ADC抗体对Cyno ASCT2的交叉反应性&细胞毒性
对轭合至微管溶素AZ1508的抗ASCT2-结合克隆17c10和1e8评估与在CHOK1细胞中稳定表达的cyno ASCT2、在CHOK1细胞中稳定表达的人ASCT2、以及在CHOK1细胞中表达的对照分子的结合。当轭合至微管溶素1508有效载荷时，ASCT2抗体17c10(图8A)和ASCT2抗体1e8(图8B)在表达人和cyno ASCT2的CHOK1细胞中显示出有效的细胞毒活性，但在未转染的CHOK1或CHOK1-ABCB5中显示出。将这些结果汇总在下表7中。
表7
17c10-ADC的ASCT2-特异性结合和细胞毒性杀灭
Figure BDA0001651849830000781
17c10的种系化
将17c10的VH和VL结构域的氨基酸序列与VBASE数据库中已知的人种系序列进行比对，并通过序列相似性鉴定最接近的种系。对于VH结构域，这是IgVh4-34*01；对于VL结构域，它是IgKv1-5*03。对于17c10，该种系化过程涉及在VH结构域中回复1个构架残基并且在VL结构域中回复5个残基。在VH结构域中，回复突变是在Kabat位置82a处，其中苏氨酸(T)回复为丝氨酸(S)。在VL结构域中，这些突变是在Kabat位置13、21、39、70、和76处，其中在Kabat位置13处，苏氨酸(T)回复为丙氨酸(A)；在Kabat位置21处亮氨酸(L)回复为异亮氨酸(I)；在Kabat位置39处天冬氨酸(N)回复为赖氨酸(K)；在Kabat位置70处天冬氨酸(D)回复为谷氨酸(E)，以及在Kabat位置76处苏氨酸(T)回复为丝氨酸(S)。通过用这些突变合成VH和VL结构域并使用限制性消化和连接替换现有的VH和VL来产生这变化。种系化的和原始的(非种系化的)17c10二者均表达为IgG，并且通过流式细胞术评估其对多个表达ASCT2的细胞系的亲和力。如在图9A至图9D中所见，在种系化的17c10或亲本17c10与WiDr细胞、或与表达HuASCT2或CyASCT2的CHO细胞的结合方面不存在差异。
实例5.在各种癌症中通过ASCT2-ADC的细胞毒性杀灭
如上所述的，通过位点特异性轭合位点，将17c10抗体与PBD(SG3315)或微管溶素(AZ1508)有效载荷轭合。每一个样品的药物-抗体比率(DAR)估计为约2.0。使用来自不同适应症(如来自胰腺癌、结肠癌、肺癌、头颈部鳞状癌(HNSCC)、前列腺癌，和ASCT2阴性肺癌)的癌细胞进行细胞毒性测定。如在图10A至图10F中所示，与AZ1508结合的17c10ADC抗体比与微管溶素结合的对照抗体具有更高的细胞毒性活性。轭合至SG3249或SG3315的抗ASCT2抗体17c10也比与微管溶素AZ1508结合的、或与PBD SG3249结合的、或与SG3315结合的对照抗体具有更高的细胞毒性活性。显示来自使用轭合至SG3249的17c10的细胞毒性测定的结果的图示出在图11A中，并且显示来自使用轭合至SG3315的17c10的细胞毒性测定的结果的图示出在图11B中。将IC50值汇总在下表8中。
表8：
通过ASCT2-ADC抑对癌细胞增生的抑制
Figure BDA0001651849830000791
Figure BDA0001651849830000801
实例6.ASCT2-ADC在体内抑制肿瘤生长
所有体内操作均按照AAALAC认证设施的规格化指导进行，并得到米迪缪尼有限责任企业(MedImmune LLC)机构动物护理和使用委员会的批准。为了测试ASCT2-ADC抗体杀灭肿瘤细胞的能力，将WiDr(100μl/106细胞/小鼠)或原发性胰腺肿瘤(PDX)经皮下接种到雌性3-5周龄裸鼠的右侧翼(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)，威明顿，马萨诸塞州)。将小鼠保留若干周以发展肿瘤；一旦肿瘤达到约150-200mm3，将小鼠随机化并分配到治疗组(10只小鼠/组)。此后，对小鼠经静脉内注射不同剂量的抗ASCT2ADC(17c10-Az1508或17c10-SG3315或17c10-SG3249)或同种型对照药物轭合的抗体。对处理的异种移植小鼠的体重和肿瘤体积进行监测，持续对应时间段。使用以下公式计算肿瘤体积：(最短直径)2x(最长直径)x 0.5，并且将这些结果在图12A、图12B、和图12C中示出。
另外，在代表表达不同水平的ASCT2的不同亚群的血液恶性肿瘤模型的小组中评估17c10-SG3249的体内功效。在播散性肿瘤异种移植物模型中，每周以0.4mg/kg(或0.5mg/kg)和0.1mg/kg的剂量给予ADC，共计四次剂量。如图13A和图13B中示出，与未经治疗的或同种型ADC对照相比，Kaplan-Meier曲线证实17c10-SG3249组的存活益处显著增加。与其他组(如，SOC、未处理的、和同种型对照ADC)相比，在若干AML异种移植物肿瘤模型中给予17c10-SG3249显示出存活益处的显著增加。与同种型对照ADC(66天)相比，在TF1a AML模型中，17c10-SG3249证实了优异的活性(中位存活期>205天)。相似地，在若干MM1.S多发性骨髓瘤(MM)模型中，17c10-SG3249证实了强烈的肿瘤生长抑制和存活益处(中位存活期的123.5天对比未处理的对照的55.5天)。将若干恶性血液肿瘤中17c10-SG3249的结果汇总在下表9中。
表9：血液学中位存活期
Figure BDA0001651849830000811
来自未处理的统计学显著性(对数秩(曼特尔-考克斯(Mantel-Cox))测试)-***＝P<0.0001，**＝P<0.001，*＝P<0.01
实例7.化学部分与抗ASCT2抗体轭合以形成ADC
发展了抗ASCT2mAb的纯化方法。简言之，使用MAbSelect Sure树脂(GE医疗集团)将收获的细胞培养液进行蛋白质A捕获步骤，以从细胞培养上清液中捕获蛋白质，并且以去除与过程和产物有关的杂质。以300cm/hr的线性流速进行所有的过程步骤。将该树脂用50mM Tris(pH 7.4)平衡，并且将条件介质加载到柱上至30g/L树脂的加载量挑战。将该柱用50mM Tris(pH 7.4)再次平衡，并且然后暴露于经优化的两个洗涤步骤中以减少杂质并减少存在于条件介质中的轻链过量。第一洗涤步骤由50mM Tris、500mM氯化钠(pH 7)组成，并且第二洗涤步骤含有50mM乙酸钠、500mM氯化钠(pH 5.0)。然后将该柱用50mM Tris(pH7.4)重新平衡，并且将该产物用25mM乙酸钠(pH 3.6)洗脱。从洗脱峰上升一侧的0.5OD至下降一侧的0.5OD收集产物。在每个纯化循环后，将柱用100mM乙酸汽提，然后用的50mM Tris(pH 7.4)重新平衡，用0.1N氢氧化钠消毒，并储存在2％(v/v)苄醇、100mM乙酸钠(pH 5.0)中。该步骤的典型产率为70％-75％。
进行低pH处理用于病毒灭活。简言之，通过添加1M乙酸将MAbSelect Sure产物调节至3.5的靶pH。保持60分钟后，通过添加1M Tris将该溶液中和至7.4的靶pH。随后过滤产物。
作为中间物纯化步骤，使用树脂Capto Adhere树脂(GE医疗集团)进行混合模式色谱法。该柱以流通模式运行：将该柱用50mM Tris(pH7.4)平衡，并将中和的蛋白质溶液加载到该柱上。杂质与树脂结合，而将产物在通过池的流体中回收。典型的步骤产率是80％-84％。
使用阳离子交换树脂HS 50(POROS)进行精滤步骤。将该步骤以结合-洗脱模式进行，并用于进一步减少与程序相关的杂质。将该柱用50mM Tris(pH 7.4)平衡，并将来自混合模式色谱步骤的产物加载到柱上。随后用50mM Tris(pH 7.4)，然后用50mM Tris、150mM氯化钠(pH 7.4)洗涤该柱，并且然后用50mM Tris、400mM氯化钠(pH 7.4)进行洗脱。从洗脱峰上升一侧的0.5OD至下降一侧的0.5OD收集产物。在每个纯化循环后，将柱使用50mMTris、500mM氯化钠(pH 7.4)进行汽提，用1N氢氧化进行钠消毒，并且储存在0.1N NaOH中。该步骤的典型产率为95％-98％。
使用具有30kDa分子量截留(MWCO)的Pellicon 3Ultracel膜将纯化的mAb中间物进行浓缩，并且通过透滤转移至配制缓冲液(20mM组氨酸，240mM蔗糖，pH 6.0)中。最终的蛋白质浓度是约20mg/ml。如果需要，将蛋白质在-80℃下冷冻储存直到轭合。下表10中汇总了单克隆抗体纯化过程中的产物质量。
表10
抗ASCT2抗体下游过程中的过程纯度
Figure BDA0001651849830000831
抗ASCT2抗体与微管溶素AZ1508的轭合
通过经马来酰亚胺化学的微管溶素(AZ1508)与两个游离的工程化的半胱氨酸残基的定点轭合来制备抗体-药物轭合物。
将纯化的mAb中间物解冻，并且通过添加1M Tris碱将pH调节至pH 7.0。用20mM组氨酸缓冲液(pH 7.0)，将蛋白质溶液稀释至7.5mg/ml的终浓度，并且添加EDTA至1mM的终浓度。将蛋白质转移到合适的反应容器中，并将温度调节到37℃。以TCEP:mAb＝30:1的摩尔比添加来自新鲜制备的50mM储备溶液的还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)。将该溶液在37℃下伴随轻微搅动孵育3小时。此孵育时间后，通过针对20mM组氨酸/1mM EDTA缓冲液(pH 7.0)的渗析或透滤，去除该还原剂。将该回收的产物通过0.22μm过滤器进行过滤。用于氧化，用脱氢抗坏血酸(DHA)以10:1(DHA:mAb)的摩尔比将蛋白质溶液进行孵育。在22℃-25℃下伴随轻微搅动(以50rpm混合速度)进行孵育持续4小时。该时间后，以8:1(有效载荷:mAb)的摩尔比添加来自在DMSO中的10mM储备溶液的微管溶素有效载荷(AZ1508)。逐滴添加另外的DMSO以达到10％(v/v)的终浓度。将该混合物在22℃-25℃下伴随轻微搅动孵育1小时，以允许抗体-药物轭合物的形成。然后通过以5:1的NAC:微管溶素的摩尔比添加来自100mM储备溶液的N-乙酰半胱氨酸(NAC)将该反应淬灭。
为了去除蛋白质片段、聚合物、和过量的游离的微管溶素有效载荷，使用陶瓷羟磷灰石(CHT)I型(伯乐公司(Biorad))进行轭合后纯化。将该柱以结合-洗脱模式按180cm/hr的线性流速操作。向淬灭的抗体-药物-轭合混合物中添加来自300mM储备溶液的磷酸钠至10mM的终浓度。将CHT柱用300mM磷酸钠(pH 6.5)预平衡，并且用10mM磷酸钠(pH6.5)平衡。将抗体-药物轭合混合物加载至20g/L的加载量挑战，并且用10mM磷酸钠(pH 6.5)将该柱重新平衡。以在10mM磷酸钠(pH 6.5)中至1M氯化钠的线性梯度，经10个柱体积进行洗脱。将洗脱峰分级，并且将这些级分通过HP SEC进行分析。将含有具有单体纯度>95％的轭合蛋白质的级分合并。在每个纯化循环后，将柱用300mM磷酸钠(pH 6.5)进行汽提，用1N氢氧化钠消毒，并且储存在0.1N氢氧化钠中。
将合并的抗体药物轭合物(ADC)浓缩并且通过切向流过滤使用再生纤维素或具有30kDa MWCO的PES膜更换成最终配制的缓冲液。加入来自10％储备溶液的赋形剂PS80。在20mM组氨酸、240mM蔗糖、0.02％PS80(pH 6.0)中，最终的ADC浓度是5mg/ml。在这些条件下，产生的ADC显示了<12％未轭合的重链，75％至82％单轭合的重链，以及1.8-1.9的药物-与-抗体的比率。
抗ASCT2抗体与吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)SG3249的轭合
通过马来酰亚胺化学将PBD(SG3249)与两个游离的工程化的半胱氨酸残基定点轭合来制备抗体-药物轭合物。过程顺序与针对以上汇总的微管溶素轭合所讨论的相同，尽管精确的条件不同。
将纯化的mAb中间物解冻，并且通过添加1M Tris碱将pH调节至pH 7.0。以在20mM组氨酸、1mm EDTA(pH 7.0)中20mg/ml的蛋白质浓度进行针对PBD轭合物的还原、氧化、和轭合步骤。将蛋白质转移到合适的反应容器中，并将温度调节到37℃。以DTT:mAb＝30:1的摩尔比添加来自新鲜制备的50mM储备溶液的还原剂二硫苏糖醇(DTT)。将该溶液在37℃下伴随轻微搅动孵育1小时。此孵育时间后，通过针对20mM组氨酸/1mM EDTA缓冲液(pH 7.0)的渗析或透滤，去除该还原剂。将该回收的产物通过0.22μm过滤器进行过滤。用于氧化，用脱氢抗坏血酸(DHA)以10:1(DHA:mAb)的摩尔比将蛋白质溶液进行孵育。在22℃-25℃下伴随轻微搅动(以50rpm混合速度)将孵育进行1小时。该时间后，以8.5:1的有效载荷:mAb的摩尔比添加来自在DMSO中的10mM储备溶液的PBD有效载荷(SG3249)。没有向该反应中添加另外的DMSO，由于DHA和有效载荷添加造成的有效的DMSO浓度是约11.4％。将该混合物在22℃-25℃下伴随轻微搅动孵育1小时，以允许抗体-药物轭合物的形成。然后通过以4:1的NAC:PBD的摩尔比添加来自100mM储备溶液的N乙酰半胱氨酸(NAC)将该反应淬灭。
为了去除蛋白质片段、聚合物、和过量的游离的PBD有效载荷，使用陶瓷羟磷灰石(CHT)I型(伯乐公司(BioRad))进行轭合后纯化。将该柱以结合-洗脱模式按180cm/hr的线性流速操作。通过添加1M Tris碱，将淬灭的抗体-药物反应混合物的pH调节至pH 7.0。将CHT柱用300mM磷酸钠(pH 6.5)预平衡，并且用10mM磷酸钠(pH 6.5)平衡。将抗体-药物轭合混合物加载至20g/L的加载量挑战，并且用10mM磷酸钠(pH 6.5)将该柱重新平衡。然后将结合蛋白用10mM磷酸钠、25mM辛酸钠(pH 6.5)进行洗涤以去除过量游离的药物，随后用10mM磷酸钠(pH 6.5)重新平衡。以在10mM磷酸钠(pH 6.5)中从0.3至1M氯化钠的线性梯度，经10个柱体积进行洗脱。将洗脱峰分级，并且将所有级分通过HP SEC进行分析。将含有具有单体纯度>95％的轭合蛋白质的级分合并。在每个纯化循环后，将柱用2M氯化钠进行汽提，用1N氢氧化钠消毒，并且储存在0.1N氢氧化钠中。
将ADC浓缩并且通过切向流过滤使用再生纤维素或具有30kDa MWCO的PES膜更换成最终配制的缓冲液。加入来自10％储备溶液的赋形剂PS80。在20mM组氨酸、240mM蔗糖、0.02％PS80(pH 6.0)中，最终的ADC浓度是5mg/ml。
氨基酸序列：
原始的17c10VH；SEQ ID NO:1
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIHHSGGANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGQGKNWHYDYFDYWGQGTLVTVSSA
原始的17c10VL；SEQ ID NO:2
DIQMTQSPSTLSTSVGDRVTLTCRASQSIRSWLAWYQQNPGKAPKLLIYKASILKIGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYYSYSRTFGQGTKVEIK
原始的1e8VH；SEQ ID NO:3
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIPQPPGKGVEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISSDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGQGKNWNYDYFDYWGQGTLVTVSSA
原始的1e8VL；SEQ ID NO:4
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTLTCRASQSIRSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSFSRTFGQGTKVEIK
种系化的17c10VH；SEQ ID NO:5
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIHHSGGANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGQGKNWHYDYFDYWGQGTLVTVSSA
种系化的17c10VL；SEQ ID NO:6
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIRSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASILKIGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSYSRTFGQGTKVEIK
种系化的1e8VH；SEQ ID NO:7
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIHHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGQGKNWNYDYFDYWGQGTLVTVSSA
种系化的1e8VL；SEQ ID NO:8
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIRSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLKSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSFSRTFGQGTKVEIK
Maia重链主链(半胱氨酸插入加框并且加粗)；SEQ ID NO:9
STKGPSVFPLAPSSKST
Figure BDA0001651849830000871
GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
17c10种系化的HCDR1(Kabat编号)；SEQ ID NO:10
GYYWS
17c10种系化的HCDR2(Kabat编号)；SEQ ID NO:11
EIHHSGGANYNPSLKS
17c10种系化的HCDR3(Kabat编号)；SEQ ID NO:12
GQGKNWHYDYFDY
17c10种系化的LCDR1(Kabat编号)；SEQ ID NO:13
RASQSIRSWLA
17c10种系化的LCDR2(Kabat编号)；SEQ ID NO:14
KASILKI
17c10种系化的LCDR3(Kabat编号)；SEQ ID NO:15
QQYYSYSRT
1e8种系化的HCDR1(Kabat编号)；SEQ ID NO:16
GYYWS
1e8种系化的HCDR2(Kabat编号)；SEQ ID NO:17
EIHHSGSTNYNPSLKS
1e8种系化的HCDR3(Kabat编号)；SEQ ID NO:18
GQGKNWNYDYFDY
1e8种系化的LCDR1(Kabat编号)；SEQ ID NO:19
RASQSIRSWLA
1e8种系化的LCDR2(Kabat编号)；SEQ ID NO:20
KASSLKS
1e8种系化的LCDR3(Kabat编号)；SEQ ID NO:21
QQYYSFSRT
共有的HCDR2；SEQ ID NO:22
EIHHSGX1X2NYNPSLKS；其中X1是S或G，并且X2是A或T
共有的HCDR3；SEQ ID NO:23
GQGKNWX1YDYFDY；其中X1是H或N
共有的LCDR2；SEQ ID NO:24
KASX1LKX2；其中X1是I或S，并且X2是I或S
共有的LCDR3；SEQ ID NO:25
QQYYSX1SRT；其中X1是Y或F
人κ轻链；SEQ ID NO:26
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
具体实施例的以上描述将充分地揭示本发明的总体性质，使得在不脱离本发明的一般概念的情况下，其他人可以无需过多的实验通过应用本领域的技术范围内的知识，容易地针对此类具体实施例的各种应用进行修改和/或改编。因此，基于本文提出的传授和指导，此类改编和修改旨在处于所披露的实施例的含义和等效范围内。应当理解本文的短语或术语是出于描述而非限制的目的，这样使得本说明书的术语或短语可根据这些传授内容和指导为技术人员所理解。
<110> 米迪缪尼有限责任公司
<120> 对ASCT2具有特异性的结合分子及其用途
<130> ASCT2-100-WO-PCT
<140> PCT/US2016/061219
<141> 2016-11-10
<150> 62/253,774
<151> 2015-11-11
<150> 62/253,371
<151> 2015-11-10
<160> 27
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His His Ser Gly Gly Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gln Gly Lys Asn Trp His Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ile Leu Lys Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Pro Gln Pro Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gln Gly Lys Asn Trp Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His His Ser Gly Gly Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gln Gly Lys Asn Trp His Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ile Leu Lys Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gln Gly Lys Asn Trp Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 9
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 10
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 11
Glu Ile His His Ser Gly Gly Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 12
Gly Gln Gly Lys Asn Trp His Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 13
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 14
Lys Ala Ser Ile Leu Lys Ile
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 15
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg Thr
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 16
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 17
Glu Ile His His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 18
Gly Gln Gly Lys Asn Trp Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 19
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 20
Lys Ala Ser Ser Leu Lys Ser
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 21
Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Ser Arg Thr
1 5
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /替换="Gly"
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换="Thr"
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(9)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基对于变体位置的注释中的残基没有偏好”
<400> 22
Glu Ile His His Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /替换="Asn"
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(9)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基对于变体位置的注释中的残基没有偏好”
<400> 23
Gly Gln Gly Lys Asn Trp His Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换="Ser"
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /替换="Ser"
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(9)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基对于变体位置的注释中的残基没有偏好”
<400> 24
Lys Ala Ser Ile Leu Lys Ile
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Phe"
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(9)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基对于变体位置的注释中的残基没有偏好”
<400> 25
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg Thr
1 5
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成的6xHis标签”
<400> 27
His His His His His His
1 5

Claims (20)

1. 一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段特异性结合至中性氨基酸转运蛋白2（ASCT2）的表位，其中该抗体或抗原结合片段包含重链可变区（VH）的三个重链互补决定区（HCDR）和轻链可变区（VL）的三个轻链互补决定区（LCDR），其中该抗体或其抗原结合片段包含:
(a) SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的HCDR1； SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的HCDR2；SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的HCDR3；SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的LCDR1； SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LCDR2；和SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的LCDR3；或
(b) SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的HCDR1； SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的HCDR2；SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的HCDR3；SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的LCDR1； SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCDR2；和SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的LCDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中：
(a) 该VH包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列；
(b) 该VH包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列；或
(c) 该VH包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。
3. 根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。
4. 根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。
5.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段特异性结合至ASCT2的表位，其中该抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的重链可变区（VH）和含有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链可变区（VL）。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含IgG恒定区，该IgG恒定区包含在位置239处的丝氨酸（S）和位置240处的缬氨酸（V）之间的半胱氨酸（C）插入，其中该编号对应于Kabat中的EU索引。
7. 根据权利要求6所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的重链。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在该抗体结合至细胞表面上的ASCT2后，该抗体内化至该细胞中。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含选自下组的轻链恒定区，该组由以下各项组成：人κ恒定区和人λ恒定区。
10.根据权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含SEQ ID NO: 26的人κ恒定区。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段轭合至细胞毒素。
12.根据权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，其中该细胞毒素选自微管溶素衍生物和吡咯并苯并二氮杂卓。
13.根据权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中该微管溶素衍生物是微管溶素AZ1508。
14.根据权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中该吡咯并苯并二氮杂卓选自SG3315和SG3249。
15.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体结合至人ASCT2和食蟹猴ASCT2。
16.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体不会特异性结合至人ASCT1。
17.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1至16中任一项所述的抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
18.一种多核苷酸或多核苷酸组合，其编码根据权利要求1至16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
19.一种制备如权利要求1至16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养包含如权利要求18所述的多核苷酸的宿主。
20.如权利要求1至16中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求17所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗特征在于ASCT2过表达的癌症。
CN201680064905.2A 2015-11-10 2016-11-10 对asct2具有特异性的结合分子及其用途 Active CN108290949B (zh)

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