CN101336300A - 神经胶质瘤的诊断、预后和治疗方法 - Google Patents
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Abstract
一般而言，本发明提供了神经胶质瘤的监测、诊断、预后和治疗方法。具体而言，本发明提供了神经胶质瘤的三(3)种预后子类，其有差异地与akt和notch信号传导途径的活化关联。展示神经或促神经PN系标志物(包括notch途径元件)的肿瘤显示出较长的中值患者存活，而余下两种肿瘤标志物Prolif和Mes与缩短的存活关联。以该方式分类的肿瘤也可用对应于子类的合适的PN－、Prolif－或Mes－治疗剂与抗有丝分裂剂、抗血管发生剂、Akt拮抗剂、和神经分化剂组合治疗。另外，本发明还提供了基于PTEN和DLL3表达水平的两基因模型来预后和诊断神经胶质瘤的方法。
Description
相关申请
根据35U.S.C.§119(e)，本发明要求享有2005年12月16日提交的USSN60/750,944的优先权。
发明领域
本发明致力于癌症(具体是神经胶质瘤)的诊断、预后和治疗方法。
发明背景
恶性肿瘤(癌症)在美国是位居心脏病之后的第二位死亡原因(Boring等，CA Cancel J.Clin.43：7(1993))。癌症的特征为衍生自正常组织、增殖形成肿瘤块的异常或赘生性细胞的数目增加，这些赘生性肿瘤细胞侵入邻近组织，及产生恶性细胞，所述恶性细胞最终经血液或淋巴系统传播至局部淋巴结并经称为转移的过程传播到远处。在癌性状态，细胞在正常细胞不会生长的条件下增殖。癌症自身表现为很多种形式，特征为不同程度的侵入力和进攻性。
神经胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤类型，通常与严重预后关联。高级星形细胞瘤，包括成胶质细胞瘤(GBM)和多形成星形细胞瘤(AA)，是成人最常见的内脑肿瘤。尽管已经有进展能理解高级星形细胞瘤的分子遗传学(Kitange等，Curr.Opin.Oncol.15：197-203(2003))，但是来源的细胞类型仍是不确定的，而且也没能很好地了解疾病侵入性的分子决定因素。更好地理解这些肿瘤的细胞来源和分子发病机理，可鉴定治疗这些几乎一律致命的赘生物的新靶物。
肿瘤的分级通常对疾病进展的精确诊断和预后是关键的，神经胶质瘤也不例外。数十年的经验形成了基于组织学的神经胶质瘤诊断系统。神经胶质瘤根据它们是否展现出主要为星形细胞或少突胶质细胞的形态在组织学上定义，并通过细胞性质、核异型、坏死、有丝分裂象、和微血管增殖来分级-所有这些特征都与生物学进攻性行为关联。该诊断系统在神经胶质瘤的临床经验上发展了几十年，现在已经成为神经肿瘤学的基石(Kleihues，P.等，WorldHealth Organization(“WHO”)classification of tumors，Cancer 88：2887(2000))。星形细胞神经胶质瘤的WHO分类方案将其分成四(4)个等级。较不恶性的肿瘤归为等级I(纤维状细胞/毛细胞性星形细胞瘤)和II(星形细胞神经胶质瘤)，而较恶性的肿瘤定为等级III(多形成星形细胞瘤)和等级IV(多形性成胶质细胞瘤)。少突神经胶质瘤和混合性神经胶质瘤(都有少突胶质细胞和星形细胞成分)出现于低级(WHO等级II)和较恶性的变体(WHO等级III)。
直到最近，星形细胞瘤和其他神经胶质瘤被推测起于位于脑实质内的神经胶质细胞。可是，新的人类和动物研究证据提示神经干细胞是神经胶质瘤的另一种细胞来源(Caussinus和Gonzalez，Nat.Genet.37：1125(2005)；Singh等，Cancer Res.63：5821-5828(2003)；Zhu等，Cancer Cell 8：119(2005))。小鼠模型证明星形细胞或神经干/祖细胞能产生展现出人神经胶质瘤的组织病理学特点的赘生物(Bachoo等，Cancer Cell 1：269-277(2002)；Uhrbom等，Cancer Res.62：5551-5558(2002))。证实，即成人前脑包含神经干细胞的丰富来源(Sanai等，Nature 427：740-744(2004))和人GBM包含成瘤神经干样细胞(Galli等，Cancer Res.64：7011-7021(2004)；Ignatova等，GLIA 39：193-206(2002)；Singh等，Nature 432：396-401(2004))，表明神经干和/或祖细胞是人神经胶质瘤看似可能的来源，并给出推测，即更有效的疗法将来自目标为靶向GBM的干细胞样成分的方法(Berger等，Lancet Oncol.5：511-514(2004)；Fomchenko和Holland，Exp.Cell Res.306：323-329(2005)；Ignatova等，同上；Oliver和Wechsler-Reya，Neuron 42：885-888(2004))。可是，重要的是，还没有确定干样细胞对疾病进展或治疗响应的贡献，也不清楚肿瘤细胞展示干样性质的比例。
由于患者预后和治疗决策要根据准确的病理分级来做出，因此一致性是关键的属性。虽然对于大部分是可再现的，但是当前基于组织学的系统会使神经病理学家在类型和等级这两方面产生实质性的不同意见(Louis，DN等，Am J.Pathol.159：779-86(2001)；Prayson RA等，J.Neurol.Sci.175：33-9(2000)；Coons等，Cancer 79：1381-93(1997))。此外，分级的精确方法随时间而变化。最后，因为它是基于形态学的(Burger，Brain Pathol.12：257-9(2002))，是生物学的，而不是分子最终状态的，因此该方法的能力局限于鉴定新的潜在化合物。
当前，弥漫性浸润性神经胶质瘤的基于组织学的分级是患者存活时间的最好预测工具。可是，组织学既不说明神经胶质瘤的病理，也不对鉴定新分子标志物及用其开发新治疗剂有很大帮助。而且，有证据表面在分子标志物表达和治疗响应这两方面都存在未识别的、临床重要的弥漫性神经胶质瘤子类(Mischel PS等，Cancer Biol.Ther.2：242-7(2003))。还从大量治疗方案中注意到，对组织学相同的肿瘤的临床响应是高度可变的(Mischel等，同上；Cloughesy，TF等，Cancer 97：2381-6(2003))。这强调了组织病理学评估并不能揭示根本的生物学。由于肿瘤学家转向分子靶向疗法，因此鉴定不同分子决定的子群变得越来越重要。可是，尽管研究了特定的肿瘤相关基因，但是单独的个体基因/蛋白质测定法或与组织学特征的组合至今还不能预测存活或帮助指导做治疗决策(Tortosa，A.等，Cancer 97：1063-71(2003)；Reavey-Cantwell，JF等，J.Neurooncol.55：195-204(2001)；Bouvier-Labit，C.等，Neuropathol.Appl.Neurobiol.24：381-8(1998)；Stark，AM等，ZentralblNeurochir.64：30-6(2003)；Li，J.等，Science 275：1943-7(1997))。
数项研究调查了AA和GBM(也分别称为III和IV级星形细胞瘤)中预后和临床子类的分子相关性。肿瘤等级是最成熟、最有力的疾病结果预测工具(Prados和Levin，Semin Oncol.27：1-10(2000))。在GBM中比在AA中更频繁的发生染色体(chr)10q杂合性的丢失，这与短的GBM存活关联(Balesaria等，Br.J.Can.81：1371-1377(1999)；Schmidt等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.61：321-328(2002)；Smith等，J.Nat.Can.Inst.93：1246-1256(2001))。诊断时较大的年龄是GBM的负性预后因素(Curran等，J.Natl.Cancer Inst.85；704-710(1993))，而且结果的分子标志物在年纪较大和较小的患者中有差别(Batchelor等，Clin.Cancer Res.10：228-233(2004)；Smith等，J.Natl.Cancer Inst.93：1246-1256(2001))，说明存在与年龄相关的分子子类。尽管有报道p53突变和EGFR扩增确定互斥性GBM子群(von Deimling等，Glia 15，328-338(1995)；Watanabe等，Brain Pathology 6，217-223(1996))，但是最近的研究挑战了该分类方案的有效性(Okada等，Cancer Research 63，413-416(2003))，而且p53突变或EGFR基因座改变的预后价值并不清楚(Heimberger等，Clinical CancerResearch 11：1462-1466(2005)；Ushio等，Frontiers in Bioscience 8：e281-288(2003))。清楚的是，需要更好理解这些肿瘤的生物学基础来更有效治疗该疾病。
微阵列分析被认为是能提供无偏好、定量且可再现的肿瘤评估的工具，因为它能同时评估数以千计个体基因的表达。该方法已用于包括神经胶质瘤的许多不同癌症(Mischel，P.S.等，Oncogene 22：2361-73(2003)；Kim，S.等，Mol.Cancer Ther.1：1229-36(2002)；Ljubimova等，Cancer Res.61：5601-10(2001)；Nutt，CL等，Cancer Res.63：1602-7(2003)；Rickman，D.S.等，CancerRes.61：6885-91(2001)；Sallinen，S.L.等，Cancer Res.60：6617-22(2000)；Shai，R.等，Oncogene 22：4918-23(2003))。不像组织学评估，微阵列分析能鉴定肿瘤中的根本遗传变异，增强肿瘤分类以及患者预后。神经胶质瘤的微阵列分析能够将其分入更同质的组(Freije等，Cancer Res.64：6503-6510(2004))。此外，还发现它是优于组织学分级的存活预后工具(Freije等，同上)。
恶性神经胶质瘤的表达谱型能鉴定与肿瘤等级进展和患者存活相关的分子亚型以及基因(Godard等，Cancer Res.63：6613-6625(2003)；Rickman等，Can.Res.61：6885-6891(2001)；van den Boom等，Am.J.Pathol.163：1033-1043(2003))。尽管GBM和AA仍旧根据组织学表现来确定，但是如下发现，即表达谱型能比组织学特征更好预测结果(Freije等，同上；Nutt等，Clin.Can.Res.11：2258-2264(2003))支持了如下假说，即根据形态基础定为AA和GBM的赘生物代表了分子遗传亚型的混合体。考虑到分子不同的疾病实体可能对靶向抗癌剂展示不同临床响应的可能性，更好理解分子确定的肿瘤子集的行为可能有助于开发更有效的治疗剂。
恶性神经胶质瘤据信是逐步积累遗传损伤而发展出来的。例如，多形成星形细胞瘤通常表现为：(1)功能性p53途径丢失，通常是通过p53突变；(2)功能性p16/pRb途径丢失，通常是通过删除p16/ARF基因座；和(3)ras途径激活，通过ras突变之外的手段；和(4)端粒酶再活化，其在正常人星形细胞(NHA)或II级神经胶质瘤中少见(Kleihues和Cavenee等，“Diffuse infiltratingastrocytoma”，于Pathology and Genetics ofTumor ofthe Nervous System，W.K.Cavnee和P.Kleihues，编，pp.9-51.Lyon：IRAC Press(2000)；Ichimura等，Cancer Res.60：417-424(2000)；Feldkamp等，Neurosurgery 45：1442-1453(1999))。多形性成胶质细胞瘤(GBM)，在上述p53和p16/pRb途径改变外，还常常包含PTEN破坏，导致Akt途径激活(Hass-Kogan等，Curr.Biol.8：1195-1198(2000)；Holland等，Nat.Genet.25：55-57(2000))。通过对下游靶物的作用，Akt能导致细胞周期抑制剂的水平降低(Datta等，Cell 91：231-241(1997)；Pap等，J.Biol.Chem.273：19929-19932(1998)；Brunet等，Cell 96：857-868(1999)；Kops等，Nature，398：630-634(1999)；Medema等，Nature404：782-787(2000))，并在低氧条件下提高血管内皮生长因子水平(Mazure等，Blood 90：3322-3331(1997))。Akt能抑制凋亡，解除细胞周期调控并改变血管发生潜力。此外，观察到所有GBM肿瘤的80％的Akt表达水平升高。根据Akt对GBM中细胞生理和表达升高的已知作用，强烈暗示Akt激活牵涉GBM的发生/发展(Hass-Kogan，同上；Holland，同上)。
肿瘤抑制基因Pten编码磷酸酶，其常常在包括成胶质细胞瘤的多种人癌症中发生突变、缺失或其它体细胞失活(Li等，Science 275：1943(1997))。在致癌作用外，根据其在胚胎中普遍的中枢神经系统(CNS)表达模式的提示，并且根据人中与Pten生殖系突变相关的神经病学病症，Pten可能也在脑发育中起重要作用(Gimm等，Hum.Mol.Genet.9：1633(2000)；Luukko等，Mech.Dev.83：187(1999))。尽管常规Pten-/-敲除小鼠的早期胚胎致死性阻碍了对Pten在早期脑发育中功能的研究(Di Cristofano等，Nature Genet.19：348(1998)和Stambolic等，Cell 95：29(1998))，但是启动子驱动的转基因敲除动物，如亲本动物中Cre和loxp转基因而产生的，提出Pten负向调节神经干细胞产生(Groszer等，Science 294：2186-2189(2001))。
Notch信号传导途径卷入了许多癌症的致癌作用，包括何杰金氏病、T细胞淋巴瘤、和乳腺癌/宫颈癌/胰腺癌/结肠癌(Jundt，F.等，Blood 99：3398-403(2002)；Pear，W.S.等，J.Exp.Med.183：2283-91(1996)；Weijzen S.等，Nat.Med.8：979-86(2002)；Weijzen等，J.Cell Physiol.194：356-62(2003)；Miyamoto，Y.等，Cancer Cell 3：565-76(2003)；Nickoloff，B.J.等，Oncogene22：6598-608(2003))。notch受体家族由异二聚体跨膜蛋白组成，其密切牵涉细胞命运的决定。根据细胞类型，notch信号传导能正向或负向影响增殖、分化和凋亡(Artavanis-Tsakonas，S.等，Science 284：770-6(1999)；Miele，L.等，J.Cell Physiol.181：393-409(1999))。至今，在人中已经鉴定出4种notch受体(即，notch 1-4)，及5种相应配体，包括δ样1(dll-1)、δ样3(dll-3)、δ样4(dll-4)、jagged-1和jagged-2。notch途径与其它关键癌症途径诸如hedgehog(Hallahan等，Cancer Res.64：7794-7800(2004))和Ras(Fitzgerald，K.等，Oncogene 19：4191-8(2000)；Ruiz-Hidalgo，R.J.等，J.Oncol.14：777-83(1999))相互作用并交叠。可是，根据诸如组织类型的因素，notch在癌症中的作用似乎是复杂的。尽管notch-1活性是在ras转化的人细胞中维持癌性表型所必需的(Weijzen，S.等，Nat.Med.8：979-86(2002))，但是发现notch-1信号传导对鼠皮肤肿瘤和非小细胞肺癌有肿瘤抑制作用(Nicolas等，Nat.Genet.33：416-21(2003)；Sriuranpong，V.等，Cancer Res.61：3200-5(2001))。这些发现说明notch信号传导在癌症中作用可变。
notch信号传导在发育中的小脑中抑制分化并促进增殖(Solecki，DJ.等，Neuron 31：557-68(2001))。此外，notch信号传导特异性地与神经胶质瘤关联。具体而言，notch配体δ样1和jagged-1和notch-1受体表达在神经胶质瘤细胞系和人神经胶质瘤肿瘤中都增强，而且它们的下调在多种神经胶质瘤细胞系中诱导凋亡并抑制增殖，而且在动物模型中延长存活(Purow等，Cancer Res.65(6)：2353-2363(2005))。
可是，notch信号传导对肿瘤发生的作用可以变化。例如，已经观察到Notch-1活性抑制髓母细胞瘤增殖，而Notch-2活性促进它们杜生长(Fan等，Cancer Res.64：7787-7793(2004))。进一步使我们对notch信号传导途径的理解变复杂的是，最近提出notch配体Dll3与notch失活关联(Ladi等，J.Cell Biol.170：983-992(2005))。如此，当前对于notch在肿瘤发生中作用的理解充其量是不完整的。
尽管基因表达谱型(如微阵列分析所提供的)能鉴定出在神经胶质瘤中预测存活杜一组基因表达，但是至今还没有哪项分析鉴定出能作为存活的有效预后工具的个体基因表达。例如，在取自74位患者的III和IV期神经胶质瘤肿瘤组织的微阵列分析中，鉴定出595种差异表达基因与存活关联(Freije等，Cancer Res.64：6503-6510(2004))。在这组中，鉴定出44种最强烈且一致的差异表达基因。将该组进一步收窄到16种个体基因，其通过逆转录-PCR进一步评估。别的模型鉴定出notch配体DLL3表达增强是与存活增强关联的6种基因中的一种。可是，尽管该研究证明了得自微阵列分析的遗传谱型有预后和诊断价值，但是它不能鉴定出有预后价值的任何个体基因。
申请人在本文中鉴定出神经胶质瘤的三(3)种新的预后子类并展示出它们有区分地与akt和Notch信号传导途径激活关联(Prolif，Mes)。展示出神经或促神经(PN)系标志物和Notch途径元件的一种肿瘤类型，显示出较长的中值存活。相反，特征在于增殖或间质标志物的余下两(2)种肿瘤种类与较短的存活关联。
申请人在本文中进一步鉴定出二基因模型，并揭示PTEN和DLL3二者都较高表达与较长的存活关联，这证明了Akt和Notch信号传导途径对肿瘤进攻性的影响。此外，在复发时，一些原来出现有促神经或增殖性表型的肿瘤转变成间质种类，由此说明这些分子确定的组可代表肿瘤进展的另一种分化状态或阶段。该二基因模型不同于Freije等披露的预测值，因为在存活的二基因模型中的DLL3加PTEN的预后值在两个独立数据集中显示是统计学上显著的。BMP2是由Freije等鉴定出的标志物，作为与DLL3相同的肿瘤子类的标志物。当在二基因模型中用BMP2替换DLL3时，无法重现出用DLL3所见到的发现。
申请人进一步发现了Notch或Akt途径的激活状态是肿瘤进攻性的主要决定因素，并可预测对靶向疗法的响应。
最后，申请人鉴定出了预后不良的肿瘤的特征在于神经干细胞标志物和Akt途径信号传导和血管发生或增殖。Notch途径信号传导、和定型神经元前体的标志物能表征预后较好的肿瘤。正常脑几乎没有增殖、血管发生、或Notch和Akt信号传导，但其特征在于神经元标志物的高表达。预后良好的PN肿瘤可显示出具有不良预后Mes标志物的细胞片层，而PN肿瘤可复发为Mes表型，如此说明通过阻断合适的生物学过程，如Akt信号传导、血管发生或增殖，预后不良的肿瘤可转化成预后更好的PN样肿瘤。这些发现说明，阻断Akt信号传导、血管发生或增殖组合阻断诱导神经元分化的Notch信号传导或其它处理，可减缓神经胶质瘤肿瘤的生长。
发明概述
本发明总体上提供了监测、诊断、预后和治疗神经胶质瘤的方法。在一个实施方案中，本发明提供了神经胶质瘤的三(3)种预后子类，其有区别地与akt和notch信号传导途径关联。展示神经或促神经(PN)系标志物和notch途径元件的肿瘤类型显示出较长的中值患者存活。相反，增殖(Prolif)或间质(Mes)标志物与较短的存活关联。在另一个实施方案中，本发明提供了神经胶质瘤的二基因模型，其中PTEN和DLL3都相对高的表达水平指示延长的存活，而PTEN低表达(无论DLL3)指示缩短的存活。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗神经胶质瘤的方法，其包括：(i)测量肿瘤样品中一组神经胶质瘤决定性标志物(“GDM”)的表达，(ii)确定该组的促神经(PN)、增殖(Prolif)或间质(Mes)表达签名的子类，其中：(I)展示Prolif子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，其包括接触有效量的(a)Akt拮抗剂和/或Prolif-拮抗剂和/或抗有丝分裂剂，和(b)神经分化剂；(II)展示Mes子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，其包括接触有效量的(a)Akt和/或Mes-拮抗剂和/或抗血管发生剂，和(b)神经分化剂；和(III)展示PN子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，其包括接触有效量的：(1)PN-拮抗剂和/或(2)神经分化剂，任选组合有以下一种或多种：(3)Akt拮抗剂，(4)抗有丝分裂剂，和(5)Mes拮抗剂和/或抗血管发生剂。在一个特定方面，Akt拮抗剂选自下组：akt1、akt2、akt3的拮抗剂，PIK3、PD1、FRAP、RPS6KB1、SGK、EGFR、IGFR调控或催化结构域的拮抗剂，和PTEN、INPP5D或INPPL1的活化剂、刺激剂或恢复剂。在另一个特定方面，Prolif-拮抗剂选自下组：表A所示任意Prolif标志物的拮抗剂。在又一特定方面，抗有丝分裂剂选自下组：替莫唑胺、BCNU、CCNU、洛莫司汀、gliadel、依托泊苷、卡莫司汀、伊立替康、托泊替康、丙卡巴肼、顺铂、卡铂、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、放线菌素D、博来霉素、普卡霉素、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、帕利他塞、auristatins、美登木素生物碱。在另外一个特定方面，Mes-拮抗剂选自下组：表A所示任意Mes标志物的拮抗剂。在另外一个特定方面，抗血管发生剂选自下组：VEGF拮抗剂、抗VEGF抗体、VEGFR1和VEGFR2拮抗剂。在另外一个方面，PN-拮抗剂选自下组：表A所示任意PN标志物的拮抗剂，其中不包括DLL3、Nog、Olig1、Olig2、THR和ASCL1。在另外一个特定方面，神经分化剂选自下组：MAP2、β-管蛋白、GAD65和GAP43。示例性的神经分化剂包括，但不限于：视黄酸、丙戊酸及其衍生物(如，酯、盐、类视黄醇、视黄酸盐/酯、丙戊酸盐/酯、等)；甲状腺激素或其它甲状腺激素受体激动剂；noggin；BDNF、NT 4/5或其他NTRK2受体激动剂；提高转录因子ASCL1、OLIG1表达的试剂；dll3激动剂，Notch 1、2、3或4拮抗剂，γ分泌酶抑制剂，包括nicastrin、Aph1A、Aph1B、Psen1、Psen2和PSENEN的小分子抑制剂，δ样配体(Dll)-1拮抗剂，δ样配体(Dll)-4，jagged 1拮抗剂，jagged 2拮抗剂；numb激动剂或numb样激动剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗神经胶质瘤的方法，其包括接触有效量的(1)神经分化剂并组合有以下一种或多种：(3)Akt拮抗剂，(4)抗有丝分裂剂，和(5)Mes拮抗剂和/或抗血管发生剂。在一个特定方面，Akt拮抗剂选自下组：akt1、akt2、akt3的拮抗剂，PIK3、PD1、FRAP、RPS6KB1、SGK、EGFR、IGFR调控或催化结构域的拮抗剂，和PTEN、INPP5D或INPPL1的活化剂、刺激剂或恢复剂。在另一个特定方面，Prolif-拮抗剂选自下组：表A所示任意Prolif标志物的拮抗剂。在又一个特定方面，抗有丝分裂剂选自下组：替莫唑胺、BCNU、CCNU、洛莫司汀、gliadel、依托泊苷、卡莫司汀、伊立替康、托泊替康、丙卡巴肼、顺铂、卡铂、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、放线菌素D、博来霉素、普卡霉素、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、帕利他塞、auristatins、美登木素生物碱。在另外一个特定方面，Mes-拮抗剂选自下组：表A所示任意Mes标志物的拮抗剂。在另外一个特定方面，抗血管发生剂选自下组：VEGF拮抗剂、抗VEGF抗体、VEGFR1和VEGFR2拮抗剂。在另外一个方面，PN-拮抗剂选自下组：表A所示任意PN标志物的拮抗剂，其中不包括DLL3、Nog、Olig1、Olig2、THR和ASCL1。在另外一个特定方面，神经分化剂选自下组：MAP2、β-管蛋白、GAD65和GAP43。示例性的神经分化剂包括，但不限于：视黄酸、丙戊酸及其衍生物(如，酯、盐、类视黄醇、视黄酸盐/酯、丙戊酸盐/酯、等)；甲状腺激素或其他甲状腺激素受体激动剂；noggin；BDNF、NT 4/5或其他NTRK2受体激动剂；提高转录因子ASCL1、OLIG1表达的试剂；dll3激动剂，Notch 1、2、3或4拮抗剂，γ分泌酶抑制剂，包括nicastrin、Aph1A、Aph1B、Psen1、Psen2和PSENEN的小分子抑制剂，δ样配体(Dll)-1拮抗剂，δ样配体(Dll)-4，jagged 1拮抗剂，jagged 2拮抗剂；numb激动剂或numb样激动剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了预后和/或诊断神经胶质瘤的方法，其包括(i)测量肿瘤样品中一组神经胶质瘤决定性标志物(“GDM”)的表达，(ii)确定该组的促神经(PN)、增殖(Prolif)或间质(Mes)表达签名的子类，接着(iii)预后或诊断疾病结果，其中Prolif或Mes子类指示较差的预后或存活时间短于参照样本群中值的机会在统计学上升高，而PN子类指示较好的预后或存活时间长于参照样本群中值的机会在统计学上升高。在一个特定方面，用分级群聚分子类。在另一个特定方面，用k均值群聚分子类。在又一个特定方面，用投票方案分子类。在另外一个特定方面，通过比较肿瘤中的GDM与参照肿瘤集中的GDM来分子类。
在又一个实施方案中，本发明提供了监测或诊断神经胶质瘤的方法，其包括在来自患者的至少两份肿瘤样品中比较一组神经胶质瘤决定性标志物(“GDM”)的表达签名：
(i)在第一时间点测量第一肿瘤样品中GDM的表达；
(ii)在较晚的第二时间点测量第二肿瘤样品中GDM的表达；
(iii)将形态学子类确定为肿瘤样品中GDM的促神经(PN)、增殖(Prolif)或间质(Mes)表达签名；
其中，第一至第二肿瘤样品从PN向Prolif向Mes子类的转变指示所述肿瘤严重性或进展增加。
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制神经胶质瘤肿瘤生长的方法，其包括：(i)测量肿瘤样品中一组神经胶质瘤决定性标志物(“GDM”)的表达，(ii)确定该组的促神经(PN)、增殖(Prolif)或间质(Mes)表达签名的子类，其中：(I)展示Prolif子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，其包括接触有效量的(a)Akt拮抗剂和/或Prolif-拮抗剂和/或抗有丝分裂剂，和(b)神经分化剂；(II)展示Mes子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，其包括接触有效量的(a)Akt和/或Mes-拮抗剂和/或抗血管发生剂，和(b)神经分化剂；和(III)展示PN子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，其包括接触有效量的：(1)PN-拮抗剂和/或(2)神经分化剂，任选组合有以下一种或多种：(3)Akt拮抗剂，(4)抗有丝分裂剂，和(5)Mes拮抗剂和/或抗血管发生剂；而且，其中结果是肿瘤大小或生长减小。在一个特定方面，Akt拮抗剂选自下组：akt1、akt2、akt3的拮抗剂，PIK3、PD1、FRAP、RPS6KB1、SGK、EGFR、IGFR调控或催化结构域的拮抗剂，和PTEN、INPP5D或INPPL1的活化剂、刺激剂或恢复剂。在另一个特定方面，Prolif-拮抗剂选自下组：表A所示任意Prolif-标志物的拮抗剂。在又一特定方面，抗有丝分裂剂选自下组：替莫唑胺、BCNU、CCNU、洛莫司汀、gliadel、依托泊苷、卡莫司汀、伊立替康、托泊替康、丙卡巴肼、顺铂、卡铂、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、放线菌素D、博来霉素、普卡霉素、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、帕利他塞、auristatins、美登木素生物碱。在另外一个特定方面，Mes-拮抗剂选自下组：表A所示任意Mes标志物的拮抗剂。在另外一个特定方面，抗血管发生剂选自下组：VEGF拮抗剂、抗VEGF抗体、VEGFR1和VEGFR2拮抗剂。在另外一个方面，PN-拮抗剂选自下组：表A所示任意PN标志物的拮抗剂，其中不包括DLL3、Nog、Olig1、Olig2、THR和ASCL1。在另外一个特定方面，神经分化剂选自下组：MAP2、β-管蛋白、GAD65和GAP43。示例性的神经分化剂包括，但不限于：视黄酸、丙戊酸及其衍生物(如，酯、盐、类视黄醇、视黄酸盐/酯、丙戊酸盐/酯、等)；甲状腺激素或其他甲状腺激素受体激动剂；noggin；BDNF、NT 4/5或其他NTRK2受体激动剂；提高转录因子ASCL1、OLIG1表达的试剂；dll3激动剂，Notch 1、2、3或4拮抗剂，γ分泌酶抑制剂，包括nicastrin、Aph1A、Aph1B、Psen1、Psen2和PSENEN的小分子抑制剂，δ样配体(Dll)-1拮抗剂，δ样配体(Dll)-4，jagged1拮抗剂，jagged 2拮抗剂；numb激动剂或numb样激动剂。在一个特定方面，该接触的结果是降低肿瘤细胞的增殖或死亡。在另一个方面，拮抗剂是抗体或抗原结合抗体片段。在又一个特定方面，拮抗性抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。在另外一个特定方面，拮抗性抗体或抗原结合抗体片段偶联有生长抑制剂或细胞毒剂，如毒素，包括如美登木素生物碱或加利车霉素、auristatin、抗生素、放射性同位素、核溶酶等。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患神经胶质瘤肿瘤的哺乳动物的方法，其中该方法包括：(i)测量肿瘤样品中一组神经胶质瘤决定性标志物(“GDM”)的表达，(ii)确定该组的促神经(PN)、增殖(Prolif)或间质(Mes)表达签名的子类，其中：(I)展示Prolif子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，其包括给该哺乳动物施用治疗有效量的(a)Akt拮抗剂和/或Prolif-拮抗剂和/或抗有丝分裂剂，和(b)神经分化剂；(II)展示Mes子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，其包括接触有效量的(a)Akt和Mes-拮抗剂和/或抗血管发生剂，和(b)神经分化剂；和(III)展示PN子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，其包括接触有效量的：(1)PN-拮抗剂和/或(2)神经分化剂，任选组合有以下一种或多种：(3)Akt拮抗剂，(4)抗有丝分裂剂，和(5)Mes拮抗剂和/或抗血管发生剂；而且，其中结果是治疗性处理肿瘤。在一个特定方面，拮抗剂是抗体、抗原结合抗体片段、寡肽、小分子拮抗剂、或反义寡核苷酸。在另一个特定方面，抗体是单克隆抗体、抗原结合抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、或单链抗体。在又一个方面，适用于本方法的拮抗剂或试剂可任选偶联有生长抑制剂或细胞毒剂，如毒素，包括如美登木素生物碱或加利车霉素、抗生素、放射性同位素、核溶酶等。
在又一个实施方案中，本发明致力于测定样品中PN-、Prolif-或Mes-GDM表达水平的方法，其中该方法包括将样品暴露于PN-、Prolif-或Mes-结合剂和测定样品中每种各自结合剂的结合量，其中该结合量指示样品中各自PN-、Prolif-或Mes-GDM的表达水平。在一个特定方面，PN-、Prolif-或Mes-结合剂是(1)抗-PN-、抗-Prolif-或抗-Mes-抗体，(2)PN-、Prolif-或Mes-结合抗体片段，(3)PN-、Prolif-或Mes-结合寡肽，(4)PN-、Prolif-或Mes-小分子拮抗剂，或(5)PN-、Prolif-或Mes-反义寡核苷酸。在另一个特定方面，前述抗体是：(a)单克隆抗体，(b)抗原结合抗体片段，(c)嵌合抗体，(d)人源化抗体，或(e)单链抗体。在又一个特定方面，这些抗体是用一分子化合物可检测标记的，该化合物可用于定性和/或定量测定PN-、Prolif-或Mes-GDM结合的位置和/或量。
在又一个实施方案中，本发明致力于预后患神经胶质瘤肿瘤的哺乳动物存活可能性的方法，其中该方法包括(a)取出肿瘤测试样品，(b)测量测试样品中和一组不少于三十(30)份患者存活时间已知的高级神经胶质瘤中PTEN和DLL3基因产物的表达水平，其中测试样品中PTEN和DLL3都较高水平表达指示存活时间长于参照样本群中值的机会在统计学上升高，而测试样品中PTEN或DLL3任一较低水平表达指示存活时间短于参照样本群中值的机会在统计学上升高。
在又一个实施方案中，本发明致力于诊断哺乳动物中神经胶质瘤肿瘤严重性的方法，其中该方法包括：(a)使包含得自哺乳动物的神经胶质瘤肿瘤细胞或DNA、RNA、蛋白质或其它基因产物提取物的测试样品接触(i)第一试剂，其为能结合PTEN GDM的抗体、抗原结合抗体片段、寡肽或有机小分子和(ii)第二试剂，其为能结合DLL3GDM的抗体、抗原结合抗体片段、寡肽或有机小分子；(b)分别测量测试样品中第一和第二试剂与PTEN GDM和DLL3GDM形成复合物的量，其中高水平的PTEN GDM复合物的形成和高水平的DLL3GDM复合物的形成指示轻度肿瘤，而低水平的PTEN GDM复合物或DLL3GDM复合物任一的形成指示重度肿瘤。在一个特定方面，第一和/或第二试剂是可检测标记的，附着于固相支持物的，等等。在另一个特定方面，第一试剂是抗PTEN抗体、PTEN结合抗体片段、或PTEN结合寡肽、小分子、反义寡核苷酸。在又一个特定方面，第二试剂可以是抗DLL3抗体、DLL3结合抗体片段、或DLL3结合寡肽、小分子或反义核苷酸。在另外一个特定方面，抗PTEN抗体或抗DLL3抗体可以是单克隆抗体、抗原结合抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。在另外一个特定方面，这些抗体是用某分子或化合物标记的，该分子或化合物可用于定性和/或定量测定PTEN或DLL3结合剂与细胞结合的位置和/或量。
在又一个实施方案中，本发明致力于(a)PTEN或DLL3多肽、或(b)编码(a)的核酸在制备用于诊断性检测神经胶质瘤肿瘤的药物中的用途。在一个特定方面，药物可以是PTEN结合剂或DLL3结合剂。在另一个特定方面，PTEN结合剂可以是抗PTEN抗体、PTEN结合抗体片段、或PTEN结合寡肽、小分子拮抗剂、反义寡核苷酸，而DLL3结合剂可以是抗DLL3抗体、DLL3结合抗体片段、或DLL3结合寡肽、小分子、反义寡核苷酸。在另一个特定方面，抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。在另外一个特定方面，这些PTEN或DLL3结合剂是用某分子或化合物标记的，该分子或化合物可用于定性和/或定量测定PTEN或DLL3结合剂与细胞结合的位置和/或量。
在又一个实施方案中，本发明致力于(a)PN-、Prolif-或Mes-GDM、或(b)编码(a)的核酸在制备用于诊断性检测神经胶质瘤肿瘤的药物中的应用。在一个特定方面，药物可以是PN-、Prolif-或Mes-结合剂。在另一个特定方面，PN-、Prolif-或Mes-结合剂可以是：(1)抗-PN、抗-Prolif或抗-Mes抗体，(2)PN-、Prolif-或Mes-结合抗体片段，(3)PN-、Prolif-或Mes-结合寡肽，(4)PN-、Prolif-或Mes-结合小分子，(5)PN-、Prolif-或Mes-反义寡核苷酸。在又一个特定方面，抗-PN-、抗-Prolif-或抗-Mes-抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。在另外一个特定方面，这些PN-、Prolif-或Mes-结合剂是用某分子或化合物标记的，该分子或化合物可用于定性和/或定量测定PN-、Prolif-或Mes-结合剂与细胞结合的位置和/或量。
附图简述
图1.表达谱型揭示了高级神经胶质瘤中与存活相关的3种主要基因表达模式图1A-1和1A-2.通过108种与存活正或负相关的基因(标有正或负的基因簇)的表达得到的76份MDA原发性III和IV级星形细胞瘤的无监督群聚揭示了3种样品簇(在图顶部以空心矩形标示)。图1B-1和1B-2.用35种签名基因鉴定同样这76份样品的PN、Prolif和Mes肿瘤亚集(如所示的)。来自k均值群聚的形心(centroid)用z得分-标准化基因表达值(分值为-1至+1)表示。C-E.来自MDA、UCSF、和UCLA样品群的数据的Kaplan-Meier存活图。描绘了来自log-rank检验的p值。黑线、灰线和点线分别对应于PN、Prolif和Mes子类。垂直记号指示审查过的存活观察结果。F和G.PN和Mes标志物的强表达是互斥的。每条棒描绘的是各个样品4种标志物基因由微阵列(F)或Taqman实时PCR(G)测定的mRNA。所示基因包括BCAN、DLL3、CHI3l1/YKL40(YKL40)、和CD44。显示的值代表各个样品的基因表达相对于整个样品集的Z得分。H.5例神经胶质瘤的组织微阵列核心中BCAN和CHI3L1/YKL40(YKL40)的原位杂交。箭头指示BCAN阳性核心中的焦点CHI3L1/YKL40表达。
图2.大多数高级神经胶质瘤的特征在于与3种签名基因表达模式之一很相似，而且疾病进展时的子类转变指向Mes表型。A-C.三维图像，其中每个点占据的位置代表各样品与参照(MDA)样品集由k均值群聚定义的三个形心中每一个间的相似性(Spearman r)。A.星形细胞(黑点)或少突胶质细胞(白色)这两种形态的几乎所有III级肿瘤都与PN形心最相似，而IV级肿瘤(交叉影线)群较更均匀地由形心相似性划分。B.不同正常细胞或组织集类似于三种形心中每一种。样品如下：胎儿的脑、成人的脑(脑)、衍生自胎儿组织的两种神经干细胞系(NSC1、NSC2)、Jurkat、造血干细胞(HSC)、平滑肌(平滑肌)、内皮细胞(内皮)、滑膜(滑膜)、和骨。通过暴露于生长因子BDNF并从中回收而处理的神经干细胞系称为NSC1*和NSC2*。C.描绘的是26对匹配的原发性和复发性星形细胞瘤(灰＝IV级，黑＝III级)。在签名类别转变的情况中，每对匹配的标本用实心粗体箭头连接。D.在复发时向Mes子类转变的情况中显著上调的基因。FC＝变化倍数。E.在经历PN向Mes表型转变的情况中，匹配的原发性和复发性肿瘤中CHI3L1/YKL40和OLIG2的IHC。
图3.通过增殖、血管发生、和神经发生的标志物的表达来区分肿瘤亚类。A-E.空心圆＝脑，灰色圆或空心条＝PN，黑色三角或交叉影线条＝Prolif，空心方块或实心条＝Mes。图3A.根据PCNA和TOP2A表达来富集Prolif肿瘤，根据与所有其他组的比较，p＜1×10-6。图3B.通过PECAM、VEGF、VEGFR1、和VEGFR2的表达升高来区分Mes肿瘤，根据与所有其他组的比较，p＜.05。图3C1-6&图3D1-6.相对于PN肿瘤，Prolif和/或Mes肿瘤显示神经干和移行扩增标志物VIM、NES、TLX、CD133、MELK，和DLX2的更强表达(C1-6)，和成神经细胞和神经元标志物OLIG2、MAP2、DCX、NeuN、ERBB4，和GAD2的更弱表达(D1-6)。星号指示与PN的显著差异(在ANOVA后进行Bonferroni post-hoc，p＜.05)。图E.GFAP表达在Prolif肿瘤中相对于PN或MES肿瘤显著降低。
图4.染色体7、10、和19上拷贝数的变化在肿瘤子类中有差异，而且表达签名反映了这些差异。A.染色体10、7和19q的拷贝数变化频率作为肿瘤签名子类的函数。对于chr 10，肿瘤被报告为展示无丢失、缺失局限于包括PTEN基因座的10q、和基本上所有基因座的缺失。对于chr 7，各例评价为没有得到、得到chr 7的任意部分、或得到所有基因座。对于chr 19q，各例根据是否超过1/2的基因座显示出拷贝数变化评价为得到或丢失。B.与所有U133A&B探针集相比，PN、Prolif或Mes肿瘤标志物列表中探针集的数目(如标记的)描绘成染色体位置的函数。
图5.Prolif和Mes肿瘤展示出Akt和Notch信号传导级联的差异激活。PN、Prolif和Mes肿瘤分别由(i)空心圈或交叉影线条、(ii)黑三角或实心条和(iii)空心方块或空心条表示。(A.)PTEN丢失和(B.)EGFR扩增与PN签名负关联，而(C.)PIK3R3基因座的得到与Prolif签名正关联。A-C对于每份样品，x轴表示CGH log2比率，其表示取样基因座上的得到或丢失，而y轴表示与PN或Prolif形心的相关性，如所示的。r值表示CGH比率与表达签名形心相似性之间的Pearson和Spearman相关系数。D.与PN肿瘤子类相比，标准化的PTENmRNA水平在预后不良的肿瘤子类中较低。水平线表示组的均值。E-H.PN肿瘤显示出Notch途径元件DLL3、DLL1、HEY2、和ASCL1的强表达。I和J.肿瘤子类在p-Akt和核Notch染色中有差异。对于每种肿瘤亚型，描绘了p-Akt(J)或核Notch(K)免疫染色评为0、1、或2的样品的分数。PN、Prolif和Mes亚型分别由3幅柱状图表示。
图6.PTEN和DLL3的表达在两个独立的样品集(A和B)中预测高级星形细胞瘤的存活。左右小图中的曲线分别描述了为PTEN表达在第20和第80百分点(％-ile)的情况建模的每个样本群(A的n＝76，B的n＝34)的估算存活函数。实线和明线分别显示了DLL3表达在第20和第80百分点的样品的估算存活。
图7.神经胶质瘤细胞系的表达签名预测EGF/FGF非依赖性神经球生长。A.神经球培养物的样品衍生自5种细胞系并维持在存在或缺失EGF+FGF的条件下。在缺失EGF+FGF的条件下，各系的样品根据生长评为0-4(如所示的)。B.16种细胞系的神经球生长评分作为表达签名与Mes或Prolif形心的相关性的函数。
图8.肿瘤亚型的总结。(A)肿瘤亚型的主要特征和(B)描绘神经发生中各肿瘤亚型和阶段间平行的模型。
发明详述
I.定义
术语“神经胶质瘤”指起于脑或脊髓的神经胶质细胞或其前体的肿瘤。神经胶质瘤根据它们是否展现出主要为星形细胞或少突胶质细胞的形态在组织学上定义，并根据细胞性质、核异型、坏死、有丝分裂象和微血管增殖来分级-所有这些特征都与生物学进攻性行为关联。星形细胞瘤有两种主要类型-高级和低级。高级肿瘤生长迅速，很好地血管化，而且能容易地传播遍及脑。低级星形细胞瘤通常在长时间里是局限性的而且生长缓慢。高级肿瘤进攻性强得多，需要非常强的治疗，而且与短于低级肿瘤的存活时长关联。儿童中多数星形细胞肿瘤是低级的，而成人中多数是高级的。这些肿瘤可在脑和脊髓中任何地方发生。一些更常见的低级星形细胞瘤有：幼年型纤维状细胞/毛细胞性星形细胞瘤(Juvenile Pilocytic Astrocytoma，JPA)、纤维性星形细胞瘤(Fibrillary Astrocytoma)、多形性黄色星形细胞瘤(PleomorphicXantroastrocytoma，PXA)和胚胎发育不良性神经上皮肿瘤(DesembryoplasticNeuroepithelial Tumor，DNET)。最常见的两种高级星形细胞瘤是多形成星形细胞瘤(Anaplastic Astrocytoma，AA)和多形性成胶质细胞瘤(GlioblastomaMultiforme，GBM)。
术语“神经胶质瘤决定性标志物”(GDM)在用于本文时指通常与神经胶质瘤关联的细胞标志物。该术语涵盖编码标志物的基因(如，DNA、基因扩增)以及由其转录而得的基因产物(如，mRNA、编码的多肽)。如表A所示，GDM标志物可区分促神经(PN)、增殖(Prolif)或间质(Mes)子类。
表A
神经胶质瘤决定性标志物(GDM)
“天然序列GDM多肽”包括与衍生自自然界的相应GDM多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列GDM多肽可从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列GDM多肽”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定GDM多肽(例如胞外结构域序列)、该多肽的天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变体。在本发明的某些实施方案中，本文中公开的天然序列GDM多肽是与表A中所示多肽对应的成熟或全长天然序列多肽。
“GDM多肽变体”指与本文中所公开的全长天然序列GDM多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的GDM多肽，优选是其活性形式，如本文中所定义的，及其缺少本文中所公开的全长天然序列GDM多肽的信号肽、胞外结构域、或任何其它片段诸如本文中所提及的那些的变体形式。此类变体多肽包括如，其中全长天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。在一个特定方面，此类变体多肽与本文中所公开的全长天然序列GDM多肽序列多肽、及其缺少全长天然序列GDM多肽的信号肽、胞外结构域、或任何其它片段诸如本文中所公开的那些的变体形式具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在一个特定方面，此类变体多肽的长度与相应天然序列多肽相差至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、300个或更多个氨基酸残基。或者，此类变体多肽与相应天然多肽序列相比具有不超过一处保守氨基酸替代，或者与天然多肽序列相比具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10处保守氨基酸替代。
关于本文中所鉴定的GDM多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性一部分时，候选序列中与特定GDM多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，对于本发明，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表1中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，下文表1所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文表1中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当在UNIX操作系统上编译使用，优选在数码UNIX V4.0D上。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不改变。
“GDM变体多核苷酸”或“GDM变体核酸序列”指如下核酸分子，其编码本文中所定义的GDM多肽，优选其活性形式，而且其与编码本文中所鉴定的全长天然序列GDM多肽序列、或本文中所鉴定的相应全长GDM多肽序列的任何其它片段(诸如由只呈现全长GDM多肽的完整编码序列一部分的核酸所编码的那些)的核苷酸序列具有至少约80％的核酸序列同一性。通常，此类变体多核苷酸与编码本文中所鉴定的相应全长天然序列GDM多肽序列、或相应全长GDM多肽序列的任何其它片段的核酸序列具有至少约80％的核酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性。此类变体多核苷酸不涵盖天然核苷酸序列。
通常，此类变体多核苷酸的长度与天然序列多肽相差至少约50个核苷酸，或者长度差异可以是至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个核苷酸，其中在此语境中，术语“约”意指所述核苷酸序列长度加上或减去所述长度的10％。
关于本文中所鉴定的GDM多肽的编码核酸序列的“核酸序列同一性百分比(％)”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与感兴趣的GDM核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行测定百分比核酸序列同一性目的的序列对比，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。然而，对于本发明，％核酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表1中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，下文表1所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文表1中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当在UNIX操作系统上编译使用，优选在数码UNIX V4.0D上。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不改变。
在采用ALIGN-2来比较核酸序列的情况中，给定核酸序列C对、与、或针对给定核酸序列D的％核酸序列同一性(或者可表述为具有或包含对、与、或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下计算：
100乘分数W/Z
其中W是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的C和D对比中评分为相同匹配的核苷酸数目，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以领会，若核酸序列C的长度与核酸序列D的长度不相等，则C对D的％核酸序列同一性将不等于D对C的％核酸序列同一性。作为％核酸序列同一性计算的例子，表4和5演示了如何计算名为“比较DNA”的核酸序列对名为“REF-DNA”的核酸序列的％核酸序列同一性，其中“REF-DNA”代表感兴趣的假设的GDM编码核酸序列，“比较DNA”代表感兴趣的“REF-DNA”核酸分子针对其进行比较的核酸分子的核苷酸序列，而“N”、“L”和“V”各自代表不同的假设核苷酸。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％核酸序列同一性值都是依照上一段所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在其他实施方案中，GDM变体多核苷酸是编码GDM多肽且能够与编码本文中所公开的全长GDM多肽的核苷酸序列杂交(优选在严格杂交和洗涤条件下杂交)的核酸分子。此类变体多肽可以是由此类变体多核苷酸编码的那些。
在用于描述本文中所公开的各种GDM多肽时，“分离的”指已经鉴定且与其天然环境的一种成分分开和/或回收的多肽。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将该多肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝(或优选银染)非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。由于GDM多肽天然环境的至少一种成分不会存在，因此该分离的多肽包括重组细胞内的相应原位多肽。然而，此类分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。
“分离的”GDM多肽编码核酸指已经鉴定且与该多肽编码核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。任何上述这种分离的核酸分子都不同于在自然界中发现它时的形式或情况。因此，任何这种核酸分子与存在于天然细胞中时的特定多肽编码核酸分子有区别。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞能利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若核酸与另一核酸序列处于功能性相互关系中，则该核酸是“可操作连接”的。例如，若前序列或分泌前导的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接”指相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中指相邻且处于相同阅读框中。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么可依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
杂交反应的“严格性”可以容易地由本领域普通技术人员确定，而且通常凭经验根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度来计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所期望的同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。因此可以认为，较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等人，《CurrentProtocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文中所定义的“严格条件”或“高严格性条件”可如下确定：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)在采用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt氏溶液、超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS、和10％硫酸右旋糖苷的溶液中于42℃杂交过夜，并于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，接着在含EDTA的0.1x SSC中于55℃进行10分钟高严格性洗涤。
“中等严格条件”可以如Sambrook等人，《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》，New York，Cold Spring Harbor Press，1989所述来确定，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37℃在含20％甲酰胺、5x SSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖苷、和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着在1x SSC中于约37-50℃洗涤滤膜。普通技术人员将认识到如何根据需要来调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
术语“带表位标签的”在用于本文时指包含与“标签多肽”融合的GDM多肽或GDM结合剂的嵌合多肽。标签多肽具有足够的残基以提供针对其可制备抗体的表位，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是足够独特的，使得所述抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基且通常在约8个到约50个氨基酸残基之间(优选在约10个到约20个氨基酸残基之间)。
涉及本文目的的“有活性的”或“活性”指保留天然或天然存在的GDM多肽的生物学和/或免疫学活性的GDM多肽形式，其中“生物学”活性指除诱导针对天然或天然存在的GDM所具有的抗原性表位的抗体生成外，由天然或天然存在的GDM造成的生物学功能(或是抑制性的或是刺激性的)，而“免疫学”活性指诱导针对天然或天然存在的GDM多肽所具有的抗原性表位的抗体生成的能力。本文所用的活性GDM多肽是相对于其在未患神经胶质瘤的相似组织上的表达，在神经胶质瘤肿瘤上数量或性质方面差异表达的抗原。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括部分或完全阻断、抑制、或中和本文中所公开的天然GDM多肽生物学活性的任何分子。合适的拮抗剂分子明确包括拮抗性抗体或抗体片段、天然GDM多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子等。用于鉴定GDM拮抗剂的方法可包括使GDM多肽(包括表达它的细胞)接触候选激动剂或拮抗剂分子并测量通常与GDM多肽有关的一种或多种生物学活性的可检测的变化。
“处理”或“治疗”或“缓和”指治疗性处理及预防性或防范性措施，其中目标是预防或减缓(减轻)神经胶质瘤的进展。“预后”指对神经胶质瘤肿瘤可能进程和结果的确定或预测。“诊断”指鉴定或确定神经胶质瘤肿瘤区别特征的过程。诊断过程有时也根据严重程度或疾病进展表示成定级或肿瘤分类。
需要治疗、预后或诊断的受试者包括已经患有神经胶质瘤的那些以及倾向于患上神经胶质瘤的那些或要预防神经胶质瘤的那些。如果根据本发明的方法，在接受治疗量的GDM拮抗剂(如，PN拮抗剂、Prolif拮抗剂或Mes拮抗剂)后，患者显示出可观察到的和/或可测量到的以下一种或多种减少，那么就说成功“治疗”了受试者或哺乳动物的表达GDM多肽的神经胶质瘤：减少神经胶质瘤肿瘤细胞数目或缺失这种细胞；减少肿瘤大小；抑制(即，以某种程度减缓并优选终止)神经胶质瘤肿瘤细胞渗透入外周器官，包括癌扩散入软组织和骨；抑制(即，以某种程度减缓并优选终止)肿瘤转移；以某种程度抑制肿瘤生长；和/或以某种程度减轻与特定癌症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；和改善生活质量。在某种程度上，该GDM拮抗剂可防止现存癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。这些征兆或症状的减少也可以是由患者感觉到的。
用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可以容易的通过医师所熟悉的常规流程来测量。对于癌症治疗，可通过如评估疾病进展时间(time todisease progression，TTP)和/或确定响应率(response rate，RR)来测量功效。转移可通过定级测试和确定转移程度的钙水平和其它酶的测试来测定。还可进行CT扫描以查明是否扩散到神经胶质以外的区域。本文中与预后、诊断和/或治疗过程相关的发明涉及确定和评估GDM(如，PN、Prolif、Mes、Pten和DLL3)扩增和表达。
对于癌症的治疗、减轻症状、或诊断而言，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人、家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、雪貂等。哺乳动物优选指人。
“联合”一种或多种其它治疗剂的给药包括同时(共同)和以任意次序的连续给药。
本文所用的“载体”包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)和
“固相”或“固体支持物”指本发明的GDM拮抗剂或GDM结合剂可粘着或附着其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和层析柱)。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，诸如美国专利No.4,275,149中所述的。
“脂质体”指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的小囊泡，其可用于对哺乳动物投递药物(如GDM拮抗剂)。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。
“小分子”或“有机小分子”在本文中定义为具有小于约500道尔顿的分子量。
GDM拮抗剂或GDM结合剂的“有效量”指足以实现明确说明的目的的量。“有效量”可凭经验并以常规方式、联系说明的目的来确定。
术语“治疗有效量”指GDM拮抗剂或其它药物在受试者或哺乳动物中有效“治疗”疾病或紊乱的量。在神经胶质瘤的情况中，治疗有效量的药物可减少神经胶质瘤细胞数；缩小肿瘤体积；抑制(即以某种程度减缓并优选终止)癌细胞渗透入周围组织或器官；抑制(即，以某种程度减缓并优选终止)肿瘤转移；以某种程度抑制肿瘤生长；和/或以某种程度减轻与神经胶质瘤有关的一种或多种症状。参见本文中“治疗”的定义。就药物可预防现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。
GDM拮抗剂的“生长抑制量”指能够在体外或在体内抑制细胞(尤其是肿瘤，例如癌细胞)生长的量。为了抑制赘生性细胞生长，该量可凭经验且以常规方式来确定。
GDM拮抗剂的“细胞毒性量”指能够在体外或在体内引起细胞(尤其是神经胶质瘤细胞，例如癌细胞)破坏的量。为了抑制赘生性细胞生长，可凭经验且以常规方式来确定。
术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖如抗-PN、抗-Prolif和抗-Mes GDM单克隆抗体(包括拮抗性和中和性抗体)，具有多表位特异性的抗-PN、抗-Prolif和抗-Mes GDM抗体组合物，多克隆抗体，单链抗GDM抗体，多特异性抗体(如，双特异性)及以上列举的所有抗体的抗原结合片段(见下文)，只要它们能展现出所期望的生物学或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体可互换使用。
“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝(或优选银染)的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。由于抗体天然环境的至少一种成分不会存在，因此分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，因此包含10个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合形成包含2-5个基本的4链单元及J链的多价装配物)。在IgG的情况中，4链单元通常约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有一个可变域(VH)，接着是三个(对于α和γ链)或四个(对于μ和ε同种型)恒定域(CH)。每条轻链在N-末端具有一个可变域(VL)，接着是其另一端的一个恒定域(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定域(CH1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变域之间形成界面。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如《Basic andClinical Immunology》，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow编，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据其重链(CH)恒定域氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人类表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”指可变域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变域跨越的约110个氨基酸。事实上，V区由15-30个氨基酸，称作框架区(FR)的相对不变异的区段及将框架区分开的每个长度为9-12个氨基酸，称作“高变区”的极度变异的较短区域构成。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如VL中大约为Kabat残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，而VH中大约为Kabat残基31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近(Kabat等人，《Sequences of Proteinsof Immunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如VL中大约为Chothia残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)附近，而VH中大约为残基26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)附近(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)))。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了在单克隆抗体生产中产生的通常以极小量存在的可能变体之外，构成群体的各个抗体相同和/或结合相同的表位。这种单克隆抗体通常包括包含可结合靶物的多肽序列的抗体，其中结合靶物的多肽序列的获得过程包括从多种多肽序列中选择出结合单一靶物的多肽序列。例如，选择过程可以是从多种克隆(如一组杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆)中选出单一克隆。应能理解的事，可进一步改变所选的靶物结合序列，例如，用以改善对靶物的亲和力，用以人源化靶物结合序列，用以改善其在细胞培养中的产量，用以减少其在体内的免疫原性，用以产生多特异性抗体等，而且包含改变了靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与多克隆抗体制品通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体相反，单克隆抗体制品中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制品的优越性体现在它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体得自基本上均一的抗体群的特征，其不能解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过各种技术来制备，包括如杂交瘤方法(如，Kohler等，Nature，256：495(1975)；Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版.1988)；Hammerling等，于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681，(Elsevier，N.Y.，1981))，重组DNA方法(参见如，美国专利No.4,816,567)，噬菌体展示技术(参见如，Clackson等，Nature，352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))，和在具有部分或所有人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807；WO 1997/17852；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368：856-859(1994)；Morrison，Nature，368：812-813(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology，14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14：826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.，13：65-93(1995))。
“嵌合”抗体(免疫球蛋白)具有一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，还可以是此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文所用的人源化抗体是嵌合抗体的子集。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式为包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体或接受体抗体)，其中受体高变区的残基被来自具有所需特异性、亲合力、和能力的非人物种(供体抗体)高变区的残基所置换，所述非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应的非人残基所置换。另外，人源化抗体可以包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。构建这些修饰可以进一步改善抗体性能，如结合亲和性。总的来说，人源化抗体会包含至少一个、和典型两个基本上整个如下的可变区，其中所有的或者基本上所有的高变环相应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有的或者基本上所有的FR区均为人免疫球蛋白序列的那些，然而FR区可包括一个或多个氨基酸替代以改善结合亲和性。在重链中，这些在FR中的氨基酸替代数目通常不超过6个，而在轻链中，不超过3个。人源化抗体任选还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的。更详细的可参见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利No.5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及重链可变域(VH)和重链第一恒定域(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，即它具有一个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab′)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了少数残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。Fab’-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应器功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的部分。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，然而亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含抗体VH和VL结构域连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。关于sFv的综述参见Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994；Borrebaeck 1995，见下文。
“GDM结合剂”是结合GDM多肽(如，PN、Prolif、Mes、Pten和DLL3)的分子。该分子的例子包括抗GDM抗体、GDM结合抗体片段、GDM结合寡肽、GDM有义和反义核酸、和GDM小分子拮抗剂。
“GDM拮抗剂”是拮抗(如，中和或阻止)GDM多肽活化或信号转导能力的分子，其实现通过包括如阻断GDM转导信号的能力，如在神经胶质瘤肿瘤中阻断天然配体结合或阻断GDM从天然配体转移至下游成分。该分子的例子包括抗GDM抗体、GDM结合抗体片段、GDM结合寡肽、GDM有义和反义核酸、和GDM小分子拮抗剂。
“GDM结合寡肽”是结合(优选特异性结合)本文所公开的GDM多肽(分别包括受体、配体或信号传导成分)的寡肽。这种寡肽可以使用已知的寡肽合成方法化学合成或可以用重组技术制备并纯化。这种寡肽的长度通常至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100个氨基酸或更长。利用公知技术无需过多实验就可鉴定出这种寡肽。在这方面，注意到筛选寡肽文库获得能特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是现有公知的(参见如，美国专利No.5,556,762；5,750,373；4,708,871；4,833,092；5,223,409；5,403,484；5,571,689；5,663,143；PCT公开WO 84/03506和WO84/03564；Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81：3998-4002(1984)；Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：178-182(1985)；Geysen等，于Synthetic Peptides as Antigens，130-149(1986)；Geysen等，J.Immunol.Meth.，102：259-274(1987)；Schoofs等，J.Immunol.，140：611-616(1988)；Cwirla，S.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378(1990)；Lowman，H.B.等，Biochemistry，30：10832(1991)；Clackson，T.等，Nature，352：624(1991)；Marks，J.D.等，J.Mol.Biol.，222：581(1991)；Kang，A.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363(1991)；和Smith，G.P.，Current Opin.Biotechnol.，2：668(1991)。
“GDM小分子拮抗剂”是除了本文定义的寡肽或抗体之外，抑制(优选特异性抑制)本文所述GDM多肽的GDM信号传导途径的有机分子。这种GDM信号传导途径抑制优选抑制表达GDM多肽的神经胶质瘤肿瘤细胞的生长。用已知方法可鉴定并化学合成出这种有机分子(参见如，PCT公开WO2000/00823和WO2000/39585)。这类有机分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者大小可小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其能结合(优选特异性结合)本文所述的GDM多肽，并可以利用公知技术无需过多实验就鉴定出。在这方面，注意到筛选有机分子文库获得能特异性结合多肽靶物的分子的技术是现有公知的(参见如，PCT公开WO00/00823和WO00/39585)。
“结合”感兴趣的靶抗原(如GDM)的GDM拮抗剂或GDM结合剂(如，抗体、多肽、寡肽或小分子)是以足以用作靶向表达该抗原的细胞或组织的诊断、预后和/或治疗剂的亲和性结合靶物且不显著与其它蛋白交叉反应的分子。与非所需标志物多肽结合的程度将小于与所希望的特定靶物结合的约10％，这可通过常见技术来确定，如荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)。
另外，术语“特异结合”或“特异性结合”或“特异结合于”或“特异于”特定GDM多肽或特定GDM多肽靶物上表位指可测量出不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合比较来确定，所述对照分子通常是结构相似但没有结合活性的分子。例如，特异性结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶物相似，例如与过量的未标记靶物竞争。在这种情况中，若经标记靶物与探针的结合受到过量未标记靶物的竞争性抑制，则指示特异性结合。在一个实施方案中，该术语指如下结合，其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位。或者，该术语可通过分子所具有的针对靶物的至少约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、或更大的Kd来表示。
“抑制表达GDM多肽的肿瘤细胞生长”的GDM拮抗剂(如，PN-、Prolif-或Mes-拮抗剂)或“生长抑制”量的任何该种分子是能可测量地抑制表达或过表达适当GDM多肽的癌细胞生长的物质。优选用于治疗的组合物包括生长抑制量的至少一类GDM拮抗剂(如，抗GDM抗体、GDM结合抗体片段、寡肽或小分子)，其与合适对照相比，可抑制神经胶质瘤肿瘤细胞生长超过20％，优选约20％至约50％，甚至更优选超过50％(如，约50％至约100％)。在一个实施方案中，生长抑制可在细胞培养物中以约0.1至30μg/ml或约0.5nM至200nM的分子浓度来测量，其中在将肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测定生长抑制。神经胶质瘤肿瘤细胞的体内生长抑制可用各种方式测定，如用以下实验实施例中所述的来进行。如果施用该分子约1μg/kg至约100mg/kg体重能在首次施用抗体后约5天至3月内(优选在5至30天内)减小肿瘤大小或肿瘤细胞增殖，则本段任意上述分子的量是体内抑制生长的。
“诱导凋亡”的GDM拮抗剂是根据膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊形成(称作凋亡小体)的测定，能诱导神经胶质瘤肿瘤细胞程序性细胞死亡的分子。这种细胞通常是过表达GDM多肽的细胞。有多种方法可用于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化来评估DNA断裂；可通过亚二倍体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓缩。优选的是，诱导凋亡的抗体、寡肽或其它有机分子是在膜联蛋白结合测定法中能使膜联蛋白结合的诱导相对于未处理的细胞提高约2至50倍，优选约5至50倍，最优选约10至50倍的分子。
“诱导细胞死亡”的GDM拮抗剂是使活的神经胶质瘤肿瘤细胞变得不活的分子。这类神经胶质瘤肿瘤细胞是与无病细胞相比表达GDM多肽(优选过表达它)的细胞。GDM多肽可以是该癌细胞表面上表达的跨膜多肽或可以是该细胞产生并分泌的多肽。细胞体外死亡可在缺乏补体和免疫效应细胞的条件下测定，以区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。如此，用热失活血清(即，在缺失补体的条件下)和缺失免疫效应细胞的条件下进行细胞死亡测定法。诱导细胞死亡的能力可通过合适的技术相对于未处理的细胞来评估，如通过碘丙啶(PI)、台盼蓝(参见Moore等，Cytotechnology 17：1-11(1995))或7AAD摄取来评估膜完整性的丧失。优选的诱导细胞死亡的GDM拮抗剂是在BT474细胞的PI摄取测定法中诱导PI摄取的那些。
“Prolif-拮抗剂”和“Mes-拮抗剂”是分别特异性结合或以其它方式特异性抑制表A所述Prolif或Mes GDM标志物活性的GDM拮抗剂。“PN-拮抗剂”是特异性结合或以其它方式特异性抑制表A所述PN GDM标志物活性的GDM拮抗剂，其中不包括DLL3、Nog、Olig1、Olig2、THR和ASCL1。
Akt拮抗剂是部分或完全阻断、抑制或中和Akt信号传导途径生物学活性的任何分子。合适的Akt拮抗剂包括拮抗剂抗体或抗体片段、akt信号传导途径天然成分(“Akt多肽”)的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子等。鉴定Akt拮抗剂的方法可包括使Akt多肽接触候选分子并测量通常与Akt多肽相关的一种或多种生物学活性的可检测变化。其它Akt拮抗剂的例子包括特异性针对akt1、akt2、或akt3的拮抗剂；针对PIK3激酶(如PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R4)，PDK1，FRAP(如，雷帕霉素)，RPS6KB1，SGK，EGFR(如，erlotinib
)，IGFR催化或调控结构域(包括互相间的相互作用)的拮抗剂。或者，Akt拮抗剂包括激动、刺激或恢复PTEN、INPP5D或INPPL1活性的分子。
“抗有丝分裂剂”包括部分或完全阻断、抑制或以其它方式干扰细胞分裂期间发生的有丝分裂的分子。此类药剂的例子包括：替莫唑胺、BCNU、CCNU、洛莫司汀、gliadel、依托泊苷、卡莫司汀、伊立替康、托泊替康、丙卡巴肼、顺铂、卡铂、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、放线菌素D、博来霉素、普卡霉素、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、帕利他塞、auristatins、美登木素生物碱。
“抗血管发生剂”指部分或完全阻断、抑制或以其它方式中和血管发生或血管结构形成过程(尤其是与疾病或病症相关的过程)的分子。许多血管发生拮抗剂已经鉴定，而且是本领域已知的，包括Brem，Cancer Control 6(5)：436-458(1999)所列的那些。一般而言，血管发生拮抗剂包括靶向特定血管发生因子或血管发生途径的分子。在某些方面，血管发生拮抗剂是蛋白质组合物，诸如靶向血管发生因子的抗体。血管发生因子的例子有VEGF(有时也称为“VEGF-A”)，是165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子和相关的121、189、和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leung等，Science，246：1306(1989)和Houck等，Mol.Endocrin.，5：1806(1991)所述，以及其天然存在的等位基因和加工形式。术语“VEGF”也用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的第8至109位或第1至109位氨基酸的截短形式的多肽。此类截短型式的天然VEGF具有与天然VEGF可比的对Flt-1(VEGF-R1)和KDR(VEGF-R2)受体的结合亲和力。
抗血管发生因子的例子有中和性抗VEGF抗体。“抗VEGF抗体”指特异性结合VEGF的抗体。优选的是，本发明的抗VEGF抗体可作为治疗剂用于靶向和干扰VEGF活性所参与的疾病或疾患。此类抗VEGF抗体通常不结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所产生的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，其依照Presta等(1997)Cancer Res.57：4593-4599(1997)产生，包括但不限于称为贝伐单抗(bevacizumab，B V；AvastinTM)的抗体。
或者，抗血管发生剂可以是能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性，包括与一种或多种VEGF受体(如，VEGFR1和VEGFR2)结合的任何小分子。
“神经分化剂”指促进、引起、刺激或以其它方式诱导神经元前体(如，神经干细胞、移行扩增细胞、成神经细胞等)分化成神经元的分子。神经元前体指衍生自胎儿神经系统、成人脑或神经嵴并能进行细胞分裂和产生神经元的细胞。神经元是有丝分裂后(不分裂)的细胞，其表达参与轴突突出(axonal projection)、动作电位传播(action potential propagation)、和突触传递(synaptic transmission)的蛋白质。神经(元)分化剂是诱导神经元前体降低其增殖速率并增加其参与轴突长出、动作电位产生、和突触传递的蛋白质表达的分子。神经元分化标志物的例子包括但不限于，MAP2、β-管蛋白、GAD65和GAP43。神经分化剂的例子包括，但不限于：视黄酸、丙戊酸及其衍生物(如，酯、盐、类视黄醇、视黄酸盐/酯、丙戊酸盐/酯、等)；甲状腺激素或其他甲状腺激素受体激动剂；noggin；BDNF、NT 4/5或其他NTRK2受体激动剂；提高转录因子ASCL1、OLIG1表达的试剂；dll3激动剂，Notch 1、2、3或4拮抗剂、γ分泌酶抑制剂，包括nicastrin、Aph1A、Aph1B、Psen1、Psen2和PSENEN的小分子抑制剂，δ样配体(Dll)-1拮抗剂，δ样配体(Dll)-4，jagged1拮抗剂，jagged 2拮抗剂；numb激动剂或numb样激动剂。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，且其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指如下细胞毒性形式，其中某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上所结合的分泌型Ig能使这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死该靶细胞。所述抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且绝对是这类杀伤所必需的。介导ADCC的主要细胞(NK细胞)只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等、PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。
“Fc受体”或“FcR”描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，而且其包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述M.in 
，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-341(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体(FcRn)，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并执行效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从天然来源，例如从血液分离。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时靶细胞的溶解作用。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合与其关联抗原结合的(适宜子类的)抗体起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。
“表达GDM的神经胶质瘤”任选在其细胞表面上产生足够水平的GDM多肽，使得GDM多肽拮抗剂可与其结合或GDM小分子拮抗剂可以其它方式靶向神经胶质瘤并对神经胶质瘤起治疗作用。
在另一个实施方案中，“表达GDM的神经胶质瘤”任选产生和分泌足够水平的GDM多肽，使得GDM多肽拮抗剂可与其结合或GDM小分子拮抗剂可以其它方式靶向癌症并对癌症起治疗作用。对于拮抗剂，这些分子可以是降低、抑制或防止肿瘤细胞产生和分泌分泌型GDM多肽的反义寡核苷酸。
“过表达”GDM多肽的神经胶质瘤肿瘤是与相同组织类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面具有显著较高水平的GDM，或者产生和分泌更多GDM的肿瘤。这类过表达可能由基因扩增或通过升高的转录或翻译而引起。多种诊断或预后测定法测量导致细胞表面水平或其分泌水平增加的GDM表达的升高，如使用抗GDM抗体进行的免疫组化测定法、FACS分析等。或者，也可测量细胞中GDM多肽编码核酸或mRNA的水平，如，利用对应于GDM编码核酸或其互补链的基于核酸的探针通过荧光原位杂交(FISH；参见WO98/45479，公开于1998年10月)、Southern印迹、Norther印迹、或聚合酶链式反应(PCR)技术(如实时定量PCR(RT-PCR))来进行。或者，GDM多肽过表达可通过测量生物学流体(如血清)中的脱落抗原来测定，如利用基于抗体的测定法(也可参见如，美国专利No.4,933,294，发布于1990年6月12日；WO91/05264，公开于1991年4月18日；美国专利No.5,401,638，发布于1995年3月28日；和Sias等，J.Immunol.Methods 132：73-80(1990))。在上述测定法外，技术人员可利用大量体内测定法。例如，人们可将患者体内的细胞暴露于任选用可检测标记物(如，放射性同位素)标记的抗体，并评估抗体与患者中细胞的结合，如，通过外部扫描放射性或通过分析取自以前暴露于治疗剂的患者的活检来进行。
本文所用的术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”)的、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
词“标记物”在用于本文时指可检测的化合物或组合物，其与抗体、寡肽或其它有机分子直接或间接偶联从而产生“(经过)标记的”抗体、寡肽或其它有机分子。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化底物化合物或组合物的可检测化学改变。
本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或防止细胞的功能和/或造成细胞破坏的物质。该术语要包括：放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、酶及其片段(如核溶酶)、抗生素、和毒素(如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物源的酶活毒素，包括其片段和/或变体)、及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药能造成肿瘤细胞的破坏。“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括羟基脲紫杉烷(如帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(doxetaxel))和/或蒽环类抗生素；烷化剂类，如塞替派和
环磷酰胺；磺酸烷基酯类，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，诸如苯佐替派、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派；乙撑亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；番荔枝内酯类(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；δ-9-四氢大麻醇(屈大麻酚，
)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙素；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物托泊替康
CPT-11(伊立替康，)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopolectin)、和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；隐藻素类(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝脲类(nitrosureas)，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素，包括蒽环类抗生素A；埃斯波霉素；以及新制癌素发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类，诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类，诸如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁；硝酸镓；羟脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类，诸如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦；长春地辛
达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；塞替派；类紫杉醇类，例如
帕利他塞(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒制剂帕利他塞(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和多西他塞(
Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨
6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱奥沙利铂；leucovovin；长春瑞滨
能灭瘤；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇类，诸如视黄酸；卡培他滨
以及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及以上之两种或多种的组合物，如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、和波尼松龙组合治疗的缩写)、和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和leucovovin组合治疗方案的缩写)。
上述定义中还包括用于调节、降低、阻断或抑制促进癌生长的激素作用的抗激素剂，其通常是合成形式的、或用于全身治疗的。它们本身可以是激素。例子包括抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括如，他莫昔芬(包括
他莫昔芬)、
雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬、LY117018、奥那司酮、和
托瑞米芬；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；用于功能为抑制或关闭卵巢的试剂，例如，促黄体生成素释放激素(LHRH)激动剂，如
和
醋酸亮丙瑞林、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林；其它抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中雌激素的生产，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、
醋酸甲地孕酮、
依西美坦、福美坦、法倔唑、
伏氯唑、
来曲唑、和
阿那曲唑。另外，该化疗剂定义包括二膦酸盐(bisphosphonates)，如氯屈膦酸(clodronate)(例如，
或)、依替膦酸(etidronate)、NE-58095、
唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、
阿仑膦酸盐(alendronate)、
帕米膦酸盐(pamidronate)、
替鲁膦酸盐(tiludronate)、或
利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制参与异常(abherant)细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的那些，例如，PKC-α、Ralf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如
疫苗和基因治疗疫苗，例如，疫苗、
疫苗、和疫苗；
拓扑异构酶1抑制剂；
二甲苯磺酸拉帕替尼(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也被称为GW572016)；以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”在本文中使用时指抑制细胞(尤其是表达GDM的神经胶质瘤细胞)体外或体内生长的化合物或组合物。如此，所述生长抑制剂可以是显著减小S期表达GDM的细胞的百分数的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期运转(在非S期位置)的试剂，如诱导G1停滞和M期停滞的试剂。经典的M期阻断剂包括长春碱类(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类、和拓扑异构酶II抑制剂，如多柔比星、表柔比星、多柔比星、依托泊苷、和博来霉素。阻滞G1的那些试剂也可溢出进入S期停滞，例如，DNA烷化剂，如他莫昔芬、强的松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、和ara-C。可以在The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel编，第1章，标题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”，Murakami等(WBSaunders：Philadelphia)，1995中(尤其是第13页)查找到更多信息。紫杉烷类或羟基脲紫杉烷(如帕利他塞和多西他赛)都是源于紫杉树的抗癌药。多西他塞(Rhone-Poulenc Rorer)源于欧洲紫杉，是帕利他塞(
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。这些分子促进微管蛋白二聚体组装微管并通过阻止解聚而稳定微管，导致对细胞中有丝分裂的抑制。
“多柔比星”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮。
术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质而作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)；和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等价物。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商品包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、给药、禁忌症和/或警告的信息。
术语“分级群聚”(hierarchical clustering)指根据其基因表达相似性将样品集分组的方法。所使用的标准算法递归计算出树状图，其将所有元素汇编在树中，由相关矩阵起始。Eisen，M.B.等，P.N.A.S.95：14863-14868(1998)。
术语“k均值群聚”(k means clustering)指根据其基因表达相似性将样品集分组的方法。在k均值群聚中，所有样品起先随机被分配到许多簇之一中。然后计算每个样品簇中基因表达的代表值或均值，并将每个样品重新分配到显示与其相似性最接近的簇中。重复该过程直至获得稳定的结构。Duda，R.O.和Hart，P.E.，Pattern Classification和Scene Analysis，Wiley，New York(1973)。
术语“投票方案”(voting scheme)指根据比较每种肿瘤亚型以某种表达水平或其之上表达的GDM数目将肿瘤分组的方法。Freije等，同上。
表1
/*
*
*C-C increased from 12 to 15
*Zis average of EQ
*B is average of ND
*match with stop is_M；stop-stop＝0；J(joker)match＝0
*/
#define _M -8 /*value of a match with a stop*/
int _day[26][26]＝{
/* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z*/
/*A*/ {2，0，-2，0，0，-4，1，-1，-1，0，-1，-2，-1，0，_M，1，0，-2，1，1，0，0，-6，0，-3，0}，
/*B*/ {0，3，-4，3，2，-5，0，1，-2，0，0，-3，-2，2，_M，-1，1，0，0，0，0，-2，-5，0，-3，1}，
/*C*/ {-2，-4，15，-5，-5，-4，-3，-3，-2，0，-5，-6，-5，-4，_M，-3，-5，-4，0，-2，0，-2，-8，0，0，-5}，
/*D*/ {0，3，-5，4，3，-6，1，1，-2，0，0，-4，-3，2，_M，-1，2，-1，0，0，0，-2，-7，0，-4，2}，
/*E*/ {0，2，-5，3，4，-5，0，1，-2，0，0，-3，-2，1，_M，-1，2，-1，0，0，0，-2，-7，0，-4，3}，
/*F*/ {-4，-5，-4，-6，-5，9，-5，-2，1，0，-5，2，0，-4，_M，-5，-5，-4，-3，-3，0，-1，0，0，7，-5}，
/*G*/ {1，0，-3，1，0，-5，5，-2，-3，0，-2，-4，-3，0，_M，-1，-1，-3，1，0，0，-1，-7，0，-5，0}，
/*H*/ {-1，1，-3，1，1，-2，-2，6，-2，0，0，-2，-2，2，_M，0，3，2，-1，-1，0，-2，-3，0，0，2}，
/*I*/ {-1，-2，-2，-2，-2，1，-3，-2，5，0，-2，2，2，-2，_M，-2，-2，-2，-1，0，0，4，-5，0，-1，-2}，
/*J*/ {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，
/*K*/ {-1，0，-5，0，0，-5，-2，0，-2，0，5，-3，0，1，_M，-1，1，3，0，0，0，-2，-3，0，-4，0}，
/*L*/ {-2，-3，-6，-4，-3，2，-4，-2，2，0，-3，6，4，-3，_M，-3，-2，-3，-3，-1，0，2，-2，0，-1，-2}，
/*M*/ {-1，-2，-5，-3，-2，0，-3，-2，2，0，0，4，6，-2，_M，-2，-1，0，-2，-1，0，2，-4，0，-2，-1}，
/*N*/ {0，2，-4，2，1，-4，0，2，-2，0，1，-3，-2，2，_M，-1，1，0，1，0，0，-2，-4，0，-2，1}，
/*O*/ {_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，
0，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M}，
/*P*/ {1，-1，-3，-1，-1，-5，-1，0，-2，0，-1，-3，-2，-1，_M，6，0，0，1，0，0，-1，-6，0，-5，0}，
/*Q*/ {0，1，-5，2，2，-5，-1，3，-2，0，1，-2，-1，1，_M，0，4，1，-1，-1，0，-2，-5，0，-4，3}，
/*R*/ {-2，0，-4，-1，-1，-4，-3，2，-2，0，3，-3，0，0，_M，0，1，6，0，-1，0，-2，2，0，-4，0}，
/*S*/ {1，0，0，0，0，-3，1，-1，-1，0，0，-3，-2，1，_M，1，-1，0，2，1，0，-1，-2，0，-3，0}，
/*T*/ {1，0，-2，0，0，-3，0，-1，0，0，0，-1，-1，0，_M，0，-1，-1，1，3，0，0，-5，0，-3，0}，
/*U*/ {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，
/*V*/ {0，-2，-2，-2，-2，-1，-1，-2，4，0，-2，2，2，-2，_M，-1，-2，-2，-1，0，0，4，-6，0，-2，-2}，
/*W*/ {-6，-5，-8，-7，-7，0，-7，-3，-5，0，-3，-2，-4，-4，_M，-6，-5，2，-2，-5，0，-6，17，0，0，-6}，
/*X*/ {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，
/*Y*/ {-3，-3，0，-4，-4，7，-5，0，-1，0，-4，-1，-2，-2，_M，-5，-4，-4，-3，-3，0，-2，0，0，10，-4}，
/*Z*/ {0，1，-5，2，3，-5，0，2，-2，0，0，-2，-1，1，_M，0，3，0，0，0，0，-2，-6，0，-4，4}
}；
Page 1 of day.h
/*
*/
#include <stdio.h>
#include <ctype.h>
#define MAXJMP 16 /* max jumps in a diag */
#define MAXGAP 24 /* don′t continue to penalize gaps larger than this */
#define JMPS 1024 /* max jmps in an path */
#define MX 4 /* save if there′s at least MX-1 bases since last jmp */
#define DMAT 3 /*value of matching bases */
#define DMIS 0 /* penalty for mismatched bases */
#define DINS0 8 /*penalty for a gap */
#define DINS1 1 /*penalty per base */
#define PINS0 8 /* penalty for a gap */
#define PINS1 4 /* penalty per residue */
struct jmp {
short n[MAXJMP]； /*size of jmp (neg for dely)*/
unsigned short x[MAXJMP]； /*base no.of jmp in seq x */
}； /*limits seq to 2^16-1*/
struct diag {
int score； /*score at last jmp */
long offset；/*offset of prev block */
short ijmp； /*current jmp index */
struct jmp jp； /*list of jmps */
}；
struct path {
int spc； /*number of leading spaces */
short n[JMPS]；/*size of jmp (gap)*/
int x[JMPS]； /*loc of jmp(last elem before gap)*/
}；
char *ofile； /*output file name */
char *namex[2]； /*seq names:getseqs()*/
char *prog； /*prog name for err msgs */
char *seqx[2]； /*seqs:getseqs()*/
int dmax； /*best diag:nw()*/
int dmax0； /*final diag */
int dna； /*set if dna:main()*/
int endgaps； /*set if penalizing end gaps */
int gapx，gapy； /*total gaps in seqs */
int len0，len1； /*seq lens */
int ngapx，ngapy； /*total size of gaps */
int smax； /*max score:nw()*/
int *xbm； /*bitmap for matching */
long offset； /*current offset in jmp file */
struct diag *dx； /*holds diagonals */
struct path pp[2]； /*holds path for seqs */
char *calloc()，*malloc()，*index()，*strcpy()；
char *getseq()，*g_calloc()；
Page 1 of nw.h
/*Needleman-Wunsch alignment program
*
*usage:progs file1 file2
*where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.
*The sequences can be in upper-or lower-case an may contain ambiguity
*Any lines beginning with ′；′，′＞′or ′＜′are ignored
*Max file length is 65535(limited by unsigned short x in the jmp struct)
*A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA
*Output is in the file ″align.out″
*
*The program may create a tmp file in/tmp to hold info about traceback.
*Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650
*/
#include ″nw.h″
#include ″day.h″
static_dbval[26]＝{
1，14，2，13，0，0，4，11，0，0，12，0，3，15，0，0，0，5，6，8，8，7，9，0，10，0
}；
static _pbval[26]＝{
1，2|(1＜＜(′D′-′A′))|(1＜＜(′N′-′A′))，4，8，16，32，64，
128，256，0xFFFFFFF，1＜＜10，1＜＜11，1＜＜12，1＜＜13，1＜＜14，
1＜＜15，1＜＜16，1＜＜17，1＜＜18，1＜＜19，1＜＜20，1＜＜21，1＜＜22，
1＜＜23，1＜＜24，1＜＜25|(1＜＜(′E′-′A′))|(1＜＜(′Q′-′A′))
}；
main(ac，av) main
int ac；
char*av[]；
{
prog＝av[0]；
if(ac！＝3){
fprintf(stderr，″usage:％s file1 file2\n″，prog)；
fprintf(stderr，″where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.\n″)；
fprintf(stderr，″The sequences can be in upper-or lower-case\n″)；
fprintf(stderr，″Any lines beginning with ′；′or ′＜′are ignored\n″)；
fprintf(stderr，″Output is in the file \″align.out\″\n″)；
exit(1)；
}
namex[0]＝av[1]；
namex[1]＝av[2]；
seqx[0]＝getseq(namex[0]，&len0)；
seqx[1]＝getseq(namex[1]，&len1)；
xbm＝(dna)？_dbval:_pbval；
endgaps＝0； /*1 to penalize endgaps */
ofile＝″align.out″；/*output file */
nw()； /*fill in the matrix，get the possible jmps */
readjmps()； /*get the actual jmps */
print()； /*print stats，alignment */
cleanup(0)；/*unlink any tmp files */
}
Page 1 of nw.c
/*do the alignment，return best score:main()
*dna:values in Fitch and Smith，PNAS，80，1382-1386，1983
*pro:PAM 250values
*When scores are equal，we prefer mismatches to any gap，prefer
*a new gap to extending an ongoing gap，and prefer a gap in seqx
*to a gap in seq y.
*/
nw() nw
{
char *px，*py； /*seqs and ptrs */
int *ndely，*dely； /*keep track of dely */
int ndelx，delx；/*keep track ofdelx */
int *tmp； /*for swapping row0，row1*/
int mis； /*score for each type */
int ins0，ins1；/*insertion penalties */
register id； /*diagonal index */
register ij； /*jmp index */
register *col0，*col1； /*score for curr，last row */
register xx，yy； /*index into seqs */
dx ＝(struct diag *)g_calloc(″to get diags″，len0+len1+1，sizeof(struct diag))；
ndely＝(int*)g_calloc(″to get ndely″，len1+1，sizeof(int))；
dely＝(int*)g_calloc(″to get dely″，len1+1，sizeof(int))；
col0＝(int*)g_calloc(″to get col0″，len1+1，sizeof(int))；
col1＝(int*)g_calloc(″to get col1″，len1+1，sizeof(int))；
ins0＝(dna)？DINS0:PINS0；
ins1＝(dna)？DINS1:PINS1；
smax＝-10000；
if(endgaps){
for(col0[0]＝dely[0]＝-ins0，yy＝1；yy＜＝len1；yy++){
col0[yy]＝dely[yy]＝col0[yy-1]-ins1；
ndely[yy]＝yy；
}
col0[0]＝0；/*Waterman Bull Math Biol 84*/
}
else
for(yy＝1；yy＜＝len1；yy++)
dely[yy]＝-ins0；
/*fill in match matrix
*/
for(px＝seqx[0]，xx＝1；xx＜＝len0；px++，xx++){
/*initialize first entry in col
*/
if(endgaps){
if(xx＝＝1)
col1[0]＝delx＝-(ins0+insl)；
else
col1[0]＝delx ＝col0[0]-ins1；
ndelx＝xx；
}
else{
col1[0]＝0；
delx＝-ins0；
ndelx＝0；
}
page 2 of nw.c
...nw
for(py＝seqx[1]，yy＝1；yy＜＝len1；py++，yy++){
mis＝col0[yy-1]；
if(dna)
mis+＝(xbm[*px-′A′]&xbm[*py-′A′])？DMAT:DMIS；
else
mis+＝_day[*px-′A′][*py-′A′]；
/*update penalty for del in x seq；
*favor new del over ongong del
*ignore MAXGAP if weighting endgaps
*/
if(endgaps||ndely[yy]<MAXGAP){
if(col0[yy]-ins0＞＝dely[yy]){
dely[yy]＝col0[yy]-(ins0+insl)；
ndely[yy]＝1；
}else{
dely[yy]-＝ins1；
ndely[yy]++；
}
}else{
if(col0[yy]-(ins0+ins1)＞＝dely[yy]){
dely[yy]＝col0[yy]-(ins0+ins1)；
ndely[yy]＝1；
}else
ndely[yy]++；
}
/ *update penalty for del in y seq；
*favor new del over ongong del
*/
if(endgaps||ndelx<MAXGAP){
if(col1[yy-1]-ins0＞＝delx){
delx＝col1[yy-1]-(ins0+ins1)；
ndelx＝1；
}else{
delx-＝ins1；
ndelx++；
}
}else{
if(col1[yy-1]-(ins0+ins1)＞＝delx){
delx＝col1[yy-1]-(ins0+ins1)；
ndelx＝1；
}else
ndelx++；
}
/ *pick the maximum score；we′re favoring
*mis over any del and delx over dely
*/
Page 3 of nw.c
id＝xx-yy+len1-1； ...nw
if(mis＞＝delx&&mis＞＝dely[yy])
col1[yy]＝mis；
else if(delx ＞＝dely[yy]){
col1[yy]＝delx；
ij＝dx[id].ijmp；
if(dx[id].jp.n[0]&&(！dna||(ndelx＞＝MAXJMP
&&xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis ＞dx[id].score+DINS0)){
dx[id].ijmp++；
if(++ij＞＝MAXJMP){
writejmps(id)；
ij＝dx[id].ijmp＝0；
dx[id].offset＝offset；
offset+＝sizeof(struct jmp)+sizeof(offset)；
}
}
dx[id].jp.n[ij]＝ndelx；
dx[id].jp.x[ij]＝xx；
dx[id].score＝delx；
}
else{
col1[yy]＝dely[yy]；
ij＝dx[id].ijmp；
if(dx[id].jp.n[0]&&(！dna||(ndely[yy]＞＝MAXJMP
&&xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis ＞dx[id].score+DINS0)){
dx[id].ijmp++；
if(++ij＞＝MAXJMP){
writejmps(id)；
ij＝dx[id].ijmp＝0；
dx[id].offset＝offset；
offset+＝sizeof(struct jmp)+sizeof(offset)；
}
}
dx[id].jp.n[ij]＝-ndely[yy]；
dx[id].jp.x[ij]＝xx；
dx[id].score＝dely[yy]；
}
if(xx＝＝len0&&yy＜len1){
/*last col
*/
if(endgaps)
col1[yy]-＝ins0+ins1*(len1-yy)；
if(col1[yy]＞smax){
smax＝col1[yy]；
dmax＝id；
}
}
}
if(endgaps &&xx＜len0)
col1[yy-1]-＝ins0+ins1*(len0-xx)；
if(col1[yy-1]＞smax){
smax＝col1[yy-1]；
dmax＝id；
}
tmp＝col0；col0＝col1；col1＝tmp；
}
(void)free((char*)ndely)；
(void)free((char*)dely)；
(void)free((char*)col0)；
(void)free((char*)col1)；
}
Page 4 of nw.c
/*
*
*print()--only routine visible outside this module
*
*static:
*getmat()--trace back best path，count matches:print()
*pr_align()--print alignment of described in array p[]:print()
*dumpblock()--dump a block of lines with numbers，stars:pr_align()
*nums()--put out a number line:dumpblock()
*putline()--put out a line (name，[num]，seq，[num]):dumpblock()
*stars()--put a line of stars:dumpblock()
*stripname()--strip any path and prefix from a seqname
*/
#include ″nw.h″
#define SPC 3
#define P_LINE 256/*maximum output line */
#define P_SPC 3/*space between name or num and seq */
extern_day[26][26]；
int olen； /*set output line length */
FILE *fx； /*output file */
print() print
{
int lx，ly，firstgap，lastgap；/*overlap */
if((fx＝fopen(ofile，″w″))＝＝0){
fprintf(stderr，″％s:can′t write ％s\n″，prog，ofile)；
cleanup(1)；
}
fprintf(fx，″＜first sequence:％s (length ＝％d)\n″，namex[0]，len0)；
fprintf(fx，″＜second sequence:％s (length ＝％d)\n″，namex[1]，len1)；
olen＝60；
lx＝len0；
ly＝len1；
firstgap＝lastgap＝0；
if(dmax＜len1-1){/*leading gap in x */
pp[0].spc ＝firstgap ＝len1-dmax -1；
ly-＝pp[0].spc；
}
else if(dmax＞len1-1){/*leading gap in y */
pp[1].spc＝firstgap ＝dmax-(len1-1)；
lx-＝pp[1].spc；
}
if(dmax0＜len0-1){/*trailing gap in x */
lastgap＝len0-dmax0-1；
lx-＝lastgap；
}
else if(dmax0＞len0-1){/*trailing gap in y */
lastgap＝dmax0-(len0-1)；
ly-＝lastgap；
}
getmat(lx，ly，firstgap，lastgap)；
pr_align()；
}
Page 1ofnwprint.c
/*
*trace back the best path，count matches
*/
static
getmat(lx，ly，firstgap，lastgap) getmat
int lx，ly；/*″core″(minus endgaps)*/
int firstgap，lastgap；/*leading trailing overlap*/
{
int nm，i0，il，siz0，sizl；
char outx[32]；
double pct；
register n0，n1；
register char *p0，*p1；
/* get total matches，score
*/
i0＝i1＝siz0＝siz1＝0；
p0＝seqx[0]+pp[1].spc；
p1＝seqx[1]+pp[0].spc；
n0＝pp[1].spc+1；
n1＝pp[0].spc+1；
nm＝0；
while(*p0&&*p1){
if(siz0){
p1++；
n1++；
siz0--；
}
else if(siz1){
p0++；
n0++；
siz1--；
}
else{
if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′])
nm++；
if(n0++＝＝pp[0].x[i0])
siz0＝pp[0].n[i0++]；
if(n1++＝＝pp[1].x[i1])
siz1＝pp[1].n[i1++]；
p0++；
p1++；
}
}
/*pct homology:
*if penalizing endgaps，base is the shorter seq
*else，knock off overhangs and take shorter core
*/
if(endgaps)
lx＝(len0＜len1)？len0:len1；
else
lx＝(lx＜ly)？lx:ly；
pct＝100.*(double)nm/(double)lx；
fprintf(fx，″\n″)；
fprintf(fx，″＜％d match％s in an overlap of％d:％.2f percent similarity\n″，
nm，(nm ＝＝1)？″″:″es″，lx，pct)；
Page 2 of nwprint.c
fprintf(fx，″＜gaps in first sequence:％d″，gapx)； ...getmat
if(gapx){
(void)sprintf(outx，″(％d ％s％s)″，
ngapx，(dna)？″base″:″residue″，(ngapx＝＝1)？″″:″s″)；
fprintf(fx，″％s″，outx)；
fprintf(fx，″，gaps in second sequence:％d″，gapy)；
if(gapy){
(void)sprintf(outx，″(％d ％s％s)″，
ngapy，(dna)？″base″:″residue″，(ngapy＝＝1)？″″:″s″)；
fprintf(fx，″％s″，outx)；
}
if(dna)
fprintf(fx，
″\n＜score:％d(match＝％d，mismatch＝％d，gap penalty＝％d+％d per base)\n″，
smax，DMAT，DMIS，DINS0，DINS1)；
else
fprintf(fx，
″\n＜score:％d(Dayhoff PAM 250 matrix，gap penalty＝％d+％d per residue)\n″，
smax，PINS0，PINS 1)；
if(endgaps)
fprintf(fx，
″＜endgaps penalized.left endgap:％d ％s％s，right endgap:％d ％s％s\n″，
firstgap，(dna)？″base″:″residue″，(firstgap＝＝1)？″″:″s″，
lastgap，(dna)？″base″:″residue″，(lastgap＝＝1)？″″:″s″)；
else
fprintf(fx，″＜endgaps not penalized\n″)；
}
static nm； /*matches in core--for checking */
static lmax； /*lengths of stripped file names */
static ij[2]； /*jmp index for a path */
static nc[2]； /*number at start of current line */
static ni[2]； /*current elem number--for gapping */
static siz[2]；
static char *ps[2]； /*ptr to current element */
static char *po[2]； /*ptr to next output char slot */
static char out[2][P_LINE]； /*output line */
static char star[P_LINE]； /*set by stars()*/
/*
*print alignment of described in struct path pp[]
*/
static
pr_align() pr_align
{
int nn； /*char count */
int more；
register i；
for(i＝0，lmax＝0；i＜2；i++){
nn＝stripname(namex[i])；
if(nn＞lmax)
lmax＝nn；
nc[i]＝1；
ni[i]＝1；
siz[i]＝ij[i]＝0；
ps[i]＝seqx[i]；
po[i]＝out[i]；
}
Page 3 of nwprint.c
for(nn＝nm＝0，more ＝1；more；){ ...pr_align
for(i＝more＝0；i＜2；i++){
/*
*do we have more of this sequence？
*/
if(！*ps[i])
continue；
more++；
if(pp[i].spc){ /*leading space*/
*po[i]++＝″；
pp[i].spc--；
}
else if(siz[i]){ /*in a gap*/
*po[i]++＝′-′；
siz[i]--；
}
else{ /*we′re putting a seq element
*/
*po[i]＝*ps[i]；
if(islower(*ps[i]))
*ps[i]＝toupper(*ps[i])；
po[i]++；
ps[i]++；
/*
*are we at next gap for this seq？
*/
if(ni[i]＝＝pp[i].x[ij[i]]){
/*
*we need to merge all gaps
*at this location
*/
siz[i]＝pp[i].n[ij[i]++]；
while(ni[i]＝＝pp[i].x[ij[i]])
siz[i]+＝pp[i].n[ij[i]++]；
}
ni[i]++；
}
}
if(++nn＝＝olen||！more&&nn){
dumpblock()；
for(i＝0；i＜2；i++)
po[i]＝out[i]；
nn＝0；
}
}
}
/*
*dump a block of lines，including numbers，stars:pr_align()
*/
static
dumpblock() dumpblock
{
register i；
for(i＝0；i＜2；i++)
*po[i]--＝′\0′；
Page 4ofnwprint.c
...dumpblock
(void)putc(′\n′，fx)；
for(i＝0；i ＜2；i++){
if(*out[i]&&(*out[i]！＝″‖*(po[i])！＝″)){
if(i＝＝0)
nums(i)；
if(i＝＝0&&*out[1])
stars()；
putline(i)；
if(i＝＝0&&*out[1])
fprintf(fx，star)；
if(i＝＝1)
nums(i)；
}
}
}
/*
*put out a number line:dumpblock()
*/
static
nums(ix) nums
int ix； /*index in out[]holding seq line */
{
char nline[P_LINE]；
register i，j；
register char *pn，*px，*py；
for(pn＝nline，i＝0；i＜lmax+P_SPC；i++，pn++)
*pn＝″；
for(i＝nc[ix]，py＝out[ix]；*py；py++，pn++){
if(*py＝＝″||*Py ＝＝′-′)
*pn＝″；
else{
if(i％10＝＝0||(i＝＝1&&nc[ix]！＝1)){
j＝(i＜0)？-i:i；
for(px＝pn；j；j/＝10，px--)
*px＝j％10+′0′；
if(i＜0)
*px＝′-′；
}
else
*pn＝″；
i++；
}
}
*pn ＝′\0′；
nc[ix]＝i；
for(pn＝nline；*pn；pn++)
(void)putc(*pn，fx)；
(void)putc(′\n′，fx)；
}
/*
*put out a line(name，[num]，seq，[num]):dumpblock()
*/
static
putline(ix) putline
int ix；
{
Page 5 of nwprint.c
...putline
int i；
register char *px；
for(px＝namex[ix]，i ＝0；*px &&*px ！＝′:′；px++，i++)
(void)putc(*px，fx)；
for(；i＜lmax+P_SPC；i++)
(void)putc(″，fx)；
/*these count from 1:
*ni[]is current element(from 1)
*nc[]is number at start of current line
*/
for(px＝out[ix]；*px；px++)
(void)putc(*px&0x7F，fx)；
(void)putc(′\n′，fx)；
}
/*
*put a line of stars(seqs always in out[0]，out[1]):dumpblock()
*/
static
stars() stars
{
int i；
register char *p0，*p1，cx，*px；
if(！*out[0]||(*out[0]＝＝″&&*(po[0])＝＝″)||
！*out[1]||(*out[1]&&*(po[1])＝＝″))
return；
px＝star；
for(i＝lmax+P_SPC；i；i--)
*px++＝′；
for(p0＝out[0]，p1＝out[1]；*p0&&*p1；p0++，p1++){
if(isalpha(*p0)&&isalpha(*p1)){
if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′]){
cx＝′*′；
nm++；
}
else if(！dna &&_day[*p0-′A′][*p1-′A′]＞0)
cx＝′.′；
else
cx＝″；
}
else
cx＝″；
*px++＝cx；
}
*px++＝′\n′；
*px＝′\0′；
}
Page 6 of nwprint.c
/*
*strip path or prefix from pn，return len:pr_align()
*/
static
stripname(pn) stripname
char*pn；/*file name(may be path)*/
{
register char *px，*py；
py＝0；
for(px＝pn；*px；px++)
if(*px＝＝′/′)
py＝px+1；
if(py)
(void)strcpy(pn，py)；
return(strlen(pn))；
}
Page 7 of nwprint.c
/*
*cleanup()--cleanup any tmp file
*getseq()--read in seq，set dna，len，maxlen
*g_calloc()--calloc()with error checkin
*readjmps()--get the good jmps，from tmp file ifnecessary
*writejmps()--write a filled array of jmps to a tmp file:nw()
*/
#include ″nw.h″
#include<sys/file.h>
char *jname＝″/tmp/homgXXXXXX″； /*tmp file forjmps*/
FILE *fj；
int cleanup()； /*cleanup tmp file*/
long lseek()；
/*
*remove any tmp file if we blow
*/
cleanup(i) cleanup
int i；
{
if(fj)
(void)unlink(jname)；
exit(i)；
}
/*
*read，return ptr to seq，set dna，len，maxlen
*skip lines starting with ′；′，′<′，or ′>′
*seq in upper or lower case
*/
char *
getseq(file，len) getseq
char*file；/*file name */
int *len；/*seq len */
{
char line[1024]，*pseq；
register char *px，*py；
int natgc，tlen；
FILE *fp；
if((fp＝fopen(file，″r″))＝＝0){
fprintf(stderr，″％s:can′t read ％s\n″，prog，file)；
exit(1)；
}
tlen＝natgc＝0；
while(fgets(line，1024，fp)){
if(*line＝＝′；′||*line ＝＝′<′||*line ＝＝′>′)
continue；
for(px＝line；*px！＝′\n′；px++)
if(isupper(*px)||islower(*px))
tlen++；
}
if((pseq＝malloc((unsigned)(tlen+6)))＝＝0){
fprintf(stderr，″％s:malloc()failed to get％d bytes for％s\n″，prog，tlen+6，file)；
exit(1)；
}
pseq[0]＝pseq[1]＝pseq[2]＝pseq[3]＝′\0′；
Page 1 of nwsubr.c
...getseq
py＝pseq+4；
*len＝tlen；
rewind(fp)；
while(fgets(line，1024，fp)){
if(*line＝＝′；′||*line ＝＝′<′||*line＝＝′>′)
continue；
for(px＝line；*px！＝′\n′；px++){
if(isupper(*px))
*py++＝*px；
else if(islower(*px))
*py++＝toupper(*px)；
if(index(″ATGCU″，*(py-1)))
natgc++；
}
}
*py++＝′\0′；
*py＝′\0′；
(void)fclose(fp)；
dna＝natgc＞(tlen/3)；
return(pseq+4)；
}
char *
g_calloc(msg，nx，sz) g_calloc
char*msg； /*program，calling routine */
int nx，sz； /*number and size of elements */
{
char *px，*calloc()；
if((px＝calloc((unsigned)nx，(unsigned)sz))＝＝0){
if(*msg){
fprintf(stderr，″％s:g_calloc()failed％s(n＝％d，sz＝％d)\n″，prog，msg，nx，sz)；
exit(1)；
}
}
return(px)；
}
/*
*get final jmps from dx[]or tmp file，set pp[]，reset dmax:main()
*/
readjmps() readjmps
{
int fd＝-1；
int siz，i0，i1；
register i，j，xx；
if(fj){
(void)fclose(fj)；
if((fd＝open(jname，O_RDONLY，0))＜0){
fprintf(stderr，″％s:can′t open()％s\n″，prog，jname)；
cleanup(1)；
}
}
for(i＝i0＝i1＝0，dmax0＝dmax，xx＝len0；；i++){
while(1){
for(j＝dx[dmax].ijmp；j＞＝0&&dx[dmax].jp.x[j]＞＝xx；j--)
；
Page 2 of nwsubr.c
...readjmps
if(j＜0&&dx[dmax].offset &&fj){
(void)lseek(fd，dx[dmax].offset，0)；
(void)read(fd，(char *)&dx[dmax].jp，sizeof(struct jmp))；
(void)read(fd，(char *)&dx[dmax].offset，sizeof(dx[dmax].offset))；
dx[dmax].ijmp ＝MAXJMP-1；
}
else
break；
}
if(i＞＝JMPS){
fprintf(stderr，″％s:too many gaps in alignment\n″，prog)；
cleanup(1)；
}
if(j＞＝0){
siz＝dx[dmax].jp.n[j]；
xx＝dx[dmax].jp.x[j]；
dmax+＝siz；
if(siz＜0){ /*gap in second seq */
pp[1].n[i1]＝-siz；
xx+＝siz；
/*id ＝xx-yy +len1-1
*/
pp[1].x[i1]＝xx -dmax+len1-1；
gapy++；
ngapy-＝siz；
/*ignore MAXGAP when doing endgaps */
siz＝(-siz＜MAXGAP||endgaps)？-siz:MAXGAP；
i1++；
}
else if(siz＞0){ /*gap in first seq */
pp[0].n[i0]＝siz；
pp[0].x[i0]＝xx；
gapx++；
ngapx+＝siz；
/*ignore MAXGAP when doing endgaps */
siz＝(siz＜MAXGAP||endgaps)？siz:MAXGAP；
i0++；
}
}
else
break；
}
/*reverse the order of jmps
*/
for(j＝0，i0--；j＜i0；j++，i0--){
i＝pp[0].n[j]；pp[0].n[j]＝pp[0].n[i0]；pp[0].n[i0]＝i；
i＝pp[0].x[j]；pp[0].x[j]＝pp[0].x[i0]；pp[0].x[i0]＝i；
}
for(j＝0，i1--；j ＜i1；j++，i1--){
i＝pp[1].n[j]；pp[1].n[j]＝pp[1].n[i1]；pp[1].n[i1]＝i；
i＝pp[1].x[j]；pp[1].x[j]＝pp[1].x[i1]；pp[1].x[i1]＝i；
}
if(fd＞＝0)
(void)close(fd)；
if(fj){
(void)unlink(jname)；
fj＝o；
offset＝0；
}
Page 3 of nwsubr.c
/*
*write a filled jmp struct offset of the prev one (if any):nw()
*/
writejmps(ix) writejmps
int ix；
{
char*mktemp()；
if(！fj){
if(mktemp(jname)＜0){
fprintf(stderr，″％s:can′t mktemp()％s\n″，prog，jname)；
cleanup(1)；
}
if((fj＝fopen(jname，″w″))＝＝0){
fprintf(stderr，″％s:can′t write ％s\n″，prog，jname)；
exit(1)；
}
}
(void)fwrite((char *)&dx[ix].jp，sizeof(struct jmp)，1，fj)；
(void)fwrite((char *)&dx[ix].offset，sizeof(dx[ix].offset)，1，fj)；
}
Page 4 of nwsubr.c
表2
参照 XXXXXXXXXXXXXXX (长度＝15个氨基酸)
比较蛋白质 XXXXXYYYYYYY (长度＝12个氨基酸)
％氨基酸序列同一性＝
(ALIGN-2测定为两种多肽序列之间相同匹配的氨基酸残基数)÷(参照多肽的氨基酸残基总数)＝
5÷15＝33.3％
表3
参照 XXXXXXXXXX (长度＝10个氨基酸)
比较蛋白质 XXXXXYYYYYYZZYZ (长度＝15个氨基酸)
％氨基酸序列同一性＝
(ALIGN-2测定为两种多肽序列之间相同匹配的氨基酸残基数)÷(参照多肽的氨基酸残基总数)＝
5÷10＝50％
表4
参照DNA NNNNRNNNNNNNNN (长度＝14个核苷酸)
比较DNA NNNNNNLLLLLLLLLL (长度＝16个核苷酸)
％核酸序列同一性＝
(ALIGN-2测定为两种核酸序列之间相同匹配的核苷酸数)÷(参照DNA核酸序列的核苷酸总数)＝
6÷14＝42.9％
表5
参照-DNA NNNNNNNNNNNN (长度＝12个核苷酸)
比较DNA NNNNLLLVV (长度＝9个核苷酸)
％核酸序列同一性＝
(ALIGN-2测定为两种核酸序列之间相同匹配的核苷酸数)÷(参照DNA核酸序列的核苷酸总数)＝
4÷12＝33.3％
II.本发明的组合物和方法
A.方法和意义
当前，高级神经胶质瘤可用组织病理学标准诊断，并且对于这些肿瘤中的大多数而言，已知的有力预后因素在肿瘤等级和患者年龄中有限制。在染色体1p和19q上有缺失被广泛接受有少突神经胶质瘤的预后价值(Cairncross等，J.Natl Cancer Inst.90：1473-1479(1998))，这激发了开发分子标志物来预测更多类神经胶质瘤治疗结果和应答的兴趣。GBM中已有许多遗传改变被公开，而且一些(如EGFR扩增和p53突变)似乎在原发性和继发性GBM之间有差异(yon Deimling等，Glia 15：328-338(1995)；Watanabe等，Brain Pathol.6：217-223(1996))，这些标志物具有预测结果或指导疾病管理方面的决定的边际效用。重要的是，近来的表达谱型研究揭示对神经胶质瘤进行分子分类有预后价值(Freije等，Cancer Res.64：6503-6510(2004)；Nutt等，Cancer Res.63：1602-1607(2003))。在当前研究中，我们鉴定了与肿瘤进攻性以及与疾病进展有关的分子变化，并提供了证据提示可用分子分类来预测对靶向疗法的响应性。
肿瘤子类具有预后价值并描述疾病进展模式
本发明人在本文中描述了一种新的针对高级星形细胞瘤的预后分类方案，其根据所定义的表达签名的相似性将肿瘤分成亚型。3种神经胶质瘤分子亚型之每一种代表不同组织集，并集中了组织生长不同方面的标志物。尽管当前分析利用了35种标志物基因的集合，但这些标志物代表了可用于鉴定每种肿瘤亚型的长得多的标志物列表。我们称为促神经(PN)的一种肿瘤亚型的区别在于显著更好的预后，而且它表达与正常脑和神经发生过程相关的基因。两种不佳的预后亚型的特征在于分别类同高增殖性细胞系或间质来源组织，分别表现出指示细胞增殖或血管发生的基因表达程序的激活。我们推测与Mes和Prolif肿瘤型相关的不佳存活与由快速的细胞分裂或新血管化所致肿瘤细胞存活延长带来的生长优势有关。尽管仅仅有新血管化或有丝分裂象的存在或缺失并不能区分子类，但由于这些特征是几乎所有多形性成胶质细胞瘤的特点，因此这是可期待的。以前的研究提示过神经胶质瘤中增殖或血管发生标志物的预后价值(Ho等，Am.J.Clin.Pathol.119：715-722(2003)；Hsu等，Cancer Res.56：5684-5691(1996)；Osada等，Anticancer Res.24：547-552(2004))，但并没有指示存在与这些过程差异关联的不同肿瘤子集。值得注意的是，我们的Prolif和Mes神经胶质瘤亚型的特征在于表达伤口愈合签名的标志物亚集，其与数种上皮肿瘤类型的不佳结果有关。参见表A。
当前研究中鉴定出的肿瘤亚型揭示了与以前报道的由表达谱型鉴定出的预后亚型相似。具体而言，3项以前公开的研究报道了近似于我们描述的PN和Mes肿瘤亚型的表型(Freije等，同上；Liang等，P.N.A.S.(USA)102：5814-5819(2005)；Nigro等，Cancer Res.65：1678-1686(2005))。另外，以前的工作(Godard等，Cancer Res.63：6613-6625(2003))强调了一簇血管发生基因，其确定的肿瘤子群与我们的Mes肿瘤亚型显示出有相似性。我们观察到的PN对Mes标志物表达的互斥模式帮助解释了有关这两种肿瘤亚型存在的一致性。即使在PN和Mes标志物都表达的肿瘤标本中，我们发现了表达的非交叠空间分布。LOH10间的强相关性和Mes和PN签名间的区别与以前发现的LOH10与预后表达签名的联系一致(Nigro等，Cancer Res.65：1678-1686(2005))，而且血管发生表型和LOH10间的相关性与chr 10导入GBM细胞系所证实的抗血管发生作用一致(Hsu等，Cancer Res.56：5684-5691(1996))。
以前的一项报道注意到了存在富集有增殖标志物的不同肿瘤亚型(Freije等，同上)，但在其它研究中没有描述。我们的发现表明Prolif签名比PN或Mes签名更不具有排他性，而且带有Prolif签名的神经胶质瘤比例在不同机构获得的样品群之间有变化。为了支持我们将Prolif肿瘤子类分作为肿瘤的不同分子亚型，我们指向Prolif肿瘤中区分该肿瘤亚型的基因组变化模式的存在。最显著的是，在chr1上获得PIK3R3基因座似乎是Prolif类肿瘤独特的特征。带有Prolif签名肿瘤独特的基因组变化的存在有利于说明将这些肿瘤分派成不同的子类，而且提示流行病学因素可影响该子类在调查群体中的发生率。
PN和Mes肿瘤签名惊人的互斥性提示了这些肿瘤亚型反映了不同疾病实体(也许由不同细胞类型的来源产生的)的可能性。可是通过配对研究相同患者的原发和复发肿瘤，我们发现一些最初作为PN或Prolif亚型的肿瘤以Mes签名复发。在包括在复发时变为Mes类的肿瘤的原发肿瘤中，见到CHI3L1/YKL40，即Mes表型的一种标志物的病灶表达。值得注意的是，在初始出现和复发间没有案例见到肿瘤获得了可评估的PN特征。综合神经干细胞系从PN转变为Mes签名的能力，肿瘤改变子类的能力提示肿瘤亚型可代表疾病的交替分化状态。可是我们不能排除以下可能性，即一些表观变化而不是肿瘤特征的时间变化，可影响肿瘤异质性。另外，我们的实验设计不能使我们将反映疾病进展的基因表达的改变与治疗效果所引起的基因表达的改变区分开。无论如何，我们的单向肿瘤子类转变的发现提示了肿瘤细胞能由于累积遗传或后生异常而获得Mes表型的可能性。患Mes亚型肿瘤的老年患者符合该假说。
尽管我们没有分子层面直接证据来支持肿瘤细胞签名的表观改变，但是chr 10缺失和Mes签名间的强相关性可能提供了疾病进展的生物学的重要见解。无论内在机制如何，向Mes表型的改变似乎是疾病进展的共有模式，而且能使人联想到与上皮肿瘤恶性行为增加相关的上皮向间质转变(EMT)。与EMT中Akt激活的核心作用(Larue和Bellacosa，Oncogene 24：7443(2005))一致，我们的数据提示Akt在诱导神经胶质瘤间质转变中起作用。
Notch和Akt信号传导中的标志物预测神经胶质瘤进攻性
我们的发现在基因组、mRNA和蛋白水平展示了在不佳预后亚型的肿瘤中有激活Akt信号传导改变的证据。很多以前的数据支持了akt信号传导促进高级神经胶质恶性肿瘤形成和生长的作用(Knobbe等，Neuro-Oncology 4：196-211(2002)；Sonoda等，Cancer Res.61：6674-6678(2001))。在遗传工程小鼠模型中的一系列好的研究有说服力地证明了akt促进神经胶质恶性肿瘤形成和生长的作用(Holland等，Nature Genetics 25：55-57(2000)；Rajasekhar等，Mol.Cell 12：889-901(2003)；Uhrbom等，Cancer Res.62：5551-5558(2002)；Xiao等，Cancer Res.65：5172-5180(2005))。在人肿瘤中，EGFR扩增和PTEN缺失都是公知的激活akt的改变，而且特异性地与GBM和低级损伤间的差别关联(Stiles等，Mol.Cell Biol.22：3842-3851(2002))。近来，AA和GBM中已经被公开有PIK3CA中的突变与PIK3CA和PIK3CD中平衡的拷贝数增加(Broderick等，Cancer Res.64：5048-5050(2004)；Mizoguchi等，BrainPathol.14：372-377(2004)；Samuels等，Science 304：554(2004))。尽管EGFR扩增或PI3K亚基中遗传改变的预后价值不清楚，但数项研究表明，chr 10上的缺失、PTEN基因座的缺失、或PI3K信号传导增强都与GBM不良结果相关(Chakravarti等，J.Clin.Oncol.22：1926-1933(2004)；Lin等，Clin.Cancer Res.4：2447-2454(1998)；Schmidt等，J.Neur.Exp.Neurol.61：321-328(2002)；Smith等，J.Nat.Cancer Inst.93：1246-1256(2001)；Tada等，J.Neurosurg.95：651-659(2001))。PI3K/akt信号传导的激活参与数种带来生长优势的生物学过程，包括增殖、存活、和血管发生(Abe等，Cancer Res.63：2300-2305(2003)；Pore等，Cancer Res.63：236-241(2003)；Su等，Cancer Res.63：3585-3592(2003))。如此，我们推测Prolif和Mes亚型肿瘤的不良结果的起因分别是PI3K/akt信号传导促进特征在于高速增殖或新血管发生的更具攻击性的生长模式的作用。当前发现并不能给出一清楚假说来解释akt信号传导在这两种不良预后亚型中的增殖和血管发生表现间的分歧，但一种可能性是在Mes肿瘤中chr 10p上更频繁缺失基因座或chr 7上更频繁获得将对该区别有帮助。在这方面，ch19上编码的标志物的高频率是令人感兴趣的。
Notch1信号传导的激活近来与包括神经胶质瘤的几种恶性肿瘤联系起来了(Fan等，Cancer Res.64：7787-7793(2004)；Purow等，Cancer Res.65：2353-2363(2005)；Radtke和Clevers，Science 307：1904-1909(2005)；Weng等，Science 306：269-271(2004))。我们的观察结果证实了Notch途径标志物在高级神经胶质瘤中的预后价值。具体而言，我们发现，与不佳预后亚型相比，几种Notch途径元件的Notchl核染色和mRNA在较佳结果的PN肿瘤亚型中显著富集。另外，我们在两个独立的样本群中发现，尤其在高PTEN表达的情况下，DLL3的mRNA表达与较长的存活相关。尽管几种解释是可能的，但一种令人感兴趣的可能性是在存在完整的PTEN时，DLL3对Notch信号传导的抑制活性(Ladi等，J.Cell Biol.170：983-992(2005))可通过促进更分化的表型来限制肿瘤生长。无论Notch信号传导的精确作用如何，我们的二基因PTEN&DLL3Cox模型的预后价值清楚表明akt和Notch信号传导能作为肿瘤生长的主要决定因素。
神经胶质瘤生长和前脑神经发生调节间的并行性。
当前研究将预后肿瘤亚型和神经干细胞与成神经细胞标志物的相对表达差异以及和Akt与Notch信号传导元件中的差异联系起来。人神经胶质瘤的一个模型是所有分子确定的亚型来自于相似细胞类型的来源，但一些肿瘤保持为更加未分化的神经干细胞样(Mes)或移行扩增样(Prolif)表型，而其它(PN)具有更接近于成神经细胞或未成熟神经元的表型。得到动物研究支持的该模型(Bachoo等，Cancer Cell 1：269-277(2002)；Fomchenko和Holland，Exp.CellRes.306：323-329(2005))不能具体预测高级神经胶质瘤的细胞类型来源处在从神经干细胞到神经元或神经胶质系的分化轴的什么阶段，而且减缓了用信号传导途径中的分子改变来描述肿瘤表型。在PTEN和notch在前脑神经发生期间将神经干细胞或祖细胞维持在增殖未分化状态的关键作用的启示下(Groszer等，Science 294：2186-2189(2001)；Sakamoto等，J.Biol.Chem.278：44808-44815(2003)；Yoon和Gaiano，Nature Neurosci.8：709-715(2005))，我们的发现提示神经胶质瘤生长的进攻性可能主要由神经发生过程中调节细胞命运选择的过程来决定。
新确定的肿瘤亚型的表型与成人前脑神经发生中的阶段平行。与定型神经元(或神经元少突神经胶质)前体相似，PN亚型肿瘤似乎具有低增殖速率，并表达与成神经细胞和未成熟神经元相关的标志物，转录因子OLIG2和Ascl1伴随有其他神经元系标志物。相反，Mes和Prolif亚型肿瘤缺乏神经元系标志物，但再现神经干细胞和/或移行扩增细胞的各方面。Prolif肿瘤和移行扩增细胞增殖的显著快速速率间的平行性是很明显的。另外，我们发现Prolif亚型(而不是其它类型)的一些肿瘤的特征在于强表达MELK——啮齿类动物前脑中迅速增殖的多能前体细胞的标志物(Nakano等，J.Cell Biol.170：413(2005))。另外，Prolif和Mes子类肿瘤中的EGFR扩增与神经干细胞和移行扩增细胞对EGF的响应性平行(Doetsch等，Neuron 36：1021-1034(2002))。Mes肿瘤的平滑肌、内皮细胞、和软骨标志物的表达使人联想到报道的成人前脑中神经干细胞的多能性(Bani-Yaghoub等，Development 131：4287-4298(2004)；Rietze等，Nature 412：736-739(2001)；Sieber-Blum，DevelopmentalNeuroscience 25：273-278(2003)；Wurmser等，Nature 430：350-356(2004))。可是，一个要解释的说明是肿瘤表达谱型会由干细胞样群募集至肿瘤块而被混淆的可能性。
令人感兴趣的是，Mes肿瘤表型和神经干细胞延伸间的平行包括神经干细胞和内皮细胞间所见的紧密相关性的再现。与其他肿瘤亚型相反，Mes肿瘤显示强表达VEGF、其受体、和内皮细胞标志物。近来发现表明VEGF促进成人前脑神经干细胞增殖和存活，并证明了内皮细胞所分泌的因子也促进神经干细胞增殖(Cao等，Nature Genetics 36：827-835(2004)；Fabel等，Eur.J.Neurosci.18：2803-2812(2003)；Jin等，P.N.A.S.(USA)99：11946-11950(2002)；Maurer等，Neurosci.Lett.344：165-168(2003)；Schanzer等，Brain Pathol.14：237-248(2004)；Shen等，Science 304：1338-1340(2004)；Yasuhara等，ReviewsNeurosci.15：293-307(2004)；Zhu等，FASEB J.17：186-193(2003))。有趣的是，来推测VEGF和/或内皮衍生因子水平升高的作用可支持Mes肿瘤表型的肿瘤细胞的生长。由此，靶向VEGF或其受体的疗法所证实的好处不仅在于能靶向新血管结构，而且直接抑制表现出神经干细胞样生物学的肿瘤细胞的生长。近来已证明在神经管中靶向灭活VEGF能在鼠前脑中产生血管缺陷和深度神经元凋亡(Raab等，Thrombosis Haemostasis 91：595-605(2004))。
治疗意义
本发现为开发神经胶质瘤的有效疗法提供了几个意义。首先，当前研究深化了共识，即神经胶质恶性肿瘤的最佳治疗可能依赖于靶向不同分子类别肿瘤的治疗方案(Mischel等，Cancer Biol.Therapy 2：242-247(2003)；Newton，Expert Rev.Antican.Ther.4：105-128(2004)；Rao等，Frontier Biosci.8：e270-280(2003))。我们的体外发现提示我们确定的分子标志物能预测靶向特定信号传导途径的试剂的应答。其次，我们的发现支持了靶向Akt和Notch途径在开发针对高级神经胶质瘤新治疗方案中的价值。第三，标准疗法后的肿瘤复发可伴随有指向间质、血管发生状态的表型转变的提示强调了靶向进攻性表型状态在甚至带有较少进攻性表型的肿瘤中的价值。最后，干细胞生物学和更具进攻性的神经胶质瘤表型间的相关性提示更好地理解前脑神经发生可产生关于神经胶质恶性肿瘤治疗性干预的新思维。
A.抗GDM抗体
在一个实施方案中，本发明提供了抗GDM抗体的用途，在本文中发现其可用作治疗、诊断和/或预后剂来确定神经胶质瘤的严重性和/或预后其疾病进展。可用于此目的的示例性的抗体包括多克隆、单克隆、人源化、双特异性、和异型偶联抗体。
1.多克隆抗体
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。将相关抗原(尤其在使用合成肽时)与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。例如，可使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(经半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(经赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烃基，将抗原与匙孔
血蓝蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂缀合。
通过将例如100μg或5μg(分别用于兔或小鼠的)蛋白质或偶联物与3倍体积的弗氏完全佐剂混和，并将溶液皮内注射于多个部位，由此使动物对抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用初始量的1/5-1/10的溶于弗氏完全佐剂中的肽或偶联物对动物进行强化免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化免疫直到滴度达到稳定。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂(诸如明矾)来增强免疫应答。
2.单克隆抗体
单克隆抗体可以通过最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利No.4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠)以引发出生成了或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体能特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称作融合配偶)生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的融合配偶骨髓瘤细胞是那些高效融合的、支持所选择的抗体生成细胞稳定的、高水平的生成抗体的、并对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤系，诸如可从Salk Institute Cell Distribution Center(San Diege，California，美国)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤所衍生的那些，以及可从American TypeCulture Collection(Manassas，Virginia，美国)获得的SP-2及衍生细胞，例如X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
测定杂交瘤细胞所生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测试，诸如放射性免疫测试(RIA)或酶联免疫吸附测试(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
例如，单克隆抗体的结合亲和力可通过Munson等，Anal.Biochem.107：220(1980)所述的Scatchard分析来测定。
一旦鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，则可通过有限稀释流程进行亚克隆，并使用标准方法培养该克隆(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。适于这一目的的培养基包括如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养，例如通过将细胞i.p.注射到小鼠中。
可通过常规抗体纯化流程，例如亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可用作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，用以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion in Immuno1.5：256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)所述的技术构建的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992))、以及组合感染和体内重组来构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))，从而生成高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。
可以修饰编码抗体的DNA以生成嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重链和轻链恒定域(CH和CL)序列替代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))来进行，或通过融合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列来进行。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，从而产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
3.人和人源化抗体
本发明实施中所用的抗GDM抗体还可包括人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠源)抗体的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括如下人免疫球蛋白(受体抗体)，其中的互补决定区(CDR)残基被具有所期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体或输入CDR或框架序列中没有发现的残基。通常，人源化抗体有至少一个、通常两个可变域基本整个如下，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最好还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992))。
用于将非人抗体人源化的方法在本领域是现有公知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))，通过用啮齿类CDR序列替代相应的人抗体序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中用来自非人物种的相应序列替代基本少于整个人可变域。在实践中，人源化抗体通常是如下的人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代。
当抗体意图在于人类治疗性用途时，用于制备人源化抗体的人可变域(包括轻链和重链)的选择，对于降低抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)都非常重要。根据所谓的“最适”方法，用啮齿类抗体可变域序列对已知的整个人可变域序列文库进行筛选。鉴定与啮齿类最接近的人V结构域序列，并接受其中的人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高结合亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得计算机程序，其能图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
设想了人源化抗GDM抗体的各种形式。例如，人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，其任选偶联有一种或多种细胞毒剂以生成免疫偶联物。或者，人源化抗体可以是完整的抗体，如完整的IgG1抗体。
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成转基因动物(例如小鼠)，其在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够由免疫而生成完全的人抗体全集。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失，其能导致内源抗体生成的完全抑制。将大量人种系免疫球蛋白基因转移到此类种系突变小鼠中将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,806，5,569,825，5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807；和WO 97/17852。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V结构域基因以符合阅读框的方式克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根据抗体的功能特性进行的选择也就选择了编码展示那些特性的抗体的基因。由此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行，综述参见如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinionin Structural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离得到极其多种抗噁唑酮抗体。基本依照Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对极其多种抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。
如上所述，还可通过体外激活的B细胞(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)来生成人抗体。
4.抗体片段
在某些情况中，使用抗体片段而非完整抗体是有利的。较小大小的片段能被快速清除，而保持着与相应全长分子相似的抗原结合特异性，而且能改善对实体瘤的进入性。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见如Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)；和Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达并由大肠杆菌分泌，由此可方便生成大量的这些片段。可从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并通过化学方法偶联形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段描述于美国专利5,869,046中。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；和美国专利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点且缺乏恒定区的唯一种类；因此，它们适合于在体内使用过程中降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以在sFv氨基末端或羧基末端生成效应器蛋白的融合物。参见《AntibodyEngineering》，Borrebaeck编，同上。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利No.5,641,870中描述的抗体。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
5.双特异性抗体
双特异性抗体对至少两种不同表位具有结合特异性。示例性的双特异性抗体可结合分离的PDM抗原或本文所述的特定GDM多肽的两种不同表位。其它此类抗体可将以上GDM结合位点与针对另一种蛋白质的结合位点联合起来。或者，可以将抗GDM臂与结合白细胞上触发分子(如T细胞受体分子(例如CD3))或IgG的Fc受体(FcγR)(如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂联合起来，从而将细胞防御机制聚焦并定位于表达GDM的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达GDM的细胞。这些抗体拥有GDM结合臂及结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
WO 96/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体，美国专利No.5,837,234公开了双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。双特异性抗ErbB2/Fcα抗体显示于WO 98/02463。美国专利No.5,821,337教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。
用于制备双特异性抗体的方法是现有已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)生成了潜在有10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行纯化正确分子，这相当麻烦，且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)中公开了类似的流程。
根据一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，融合使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域。优选的是，在至少一种融合物中出现有包含轻链结合所必需位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及(如果需要的)免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供期望双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达产生高产量时或在该比率对期望链组合的产量没有显著影响时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个载体。
在本方法的一个优选的实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链、和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步细节参见如Suresh等，Methods inEnzymology 121：210(1986)。
根据美国专利No.5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，从而使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，从而在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了提高异二聚体产量的机制，而不是其它不想要的终产物，如同二聚体。
双特异性抗体包括交联或“异型偶联”抗体。例如，异型偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体被建议用于使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异型偶联抗体。合适的交联剂是现有公知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利No.4,676,980中。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81(1985)描述了一种方法，其通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最近的进展使得从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段变得更加容易，其可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的生产。每个Fab′片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，并触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶物的溶解活性。
从重组细胞培养物中直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术也被描述了。例如，已使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的VH和VL，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体(Tutt等，J.Immunol.147：60(1991))。
6.异型偶联抗体
异型偶联抗体也在本发明的范围之内。异型偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。例如，此类抗体被建议用于使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)及用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。设想了可在体外使用合成蛋白质化学的已知方法来制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁亚氨酸甲酯及诸如美国专利No.4,676,980中所公开的那些。
7.多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快地被表达该抗体所结合抗原的细胞来内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(不同于IgM类)，其可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由其组成)。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含三个至约八个、但优选四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选还包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。例如，本文中的多价抗体可包含约两条至约八条轻链可变域多肽。本文设想的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选还包含CL结构域。
8.效应器功能的工程改造
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如用以增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可工程改造成具有双重Fc区的，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-CancerDrug Design 3：219-230(1989)。为了提高抗体的血清半衰期，人们可如美国专利No.5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。本文所用的术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。
9.免疫偶联物
本发明还涉及包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、生长抑制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)。
a.化疗剂
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹蛋白(dianthin proteins)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的示例性的螯合剂。参见WO 94/11026。
本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素(如加利车霉素、美登木素生物碱类、单端孢霉素和CC1065，及这些毒素具有毒素活性的衍生物)的偶联物。
b.美登素和美登木素生物碱
在一个优选的实施方案中，本发明的抗GDM抗体(全长或片段)与一个或多个美登木素生物碱分子偶联。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。例如，下列美国专利公开了合成的美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533，其公开内容特别纳入本文作为参考。
在改进其治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱与特异性结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。例如，下列专利公开了包含美登木素生物碱的免疫偶联物及其治疗用途：美国专利No.5,208,020、5,416,064、及欧洲专利EP 0425235B1，其公开内容特别纳入本文作为参考。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)记载了免疫偶联物，其包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测试中显示有抗肿瘤活性。Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)记载了免疫偶联物，其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联。在体外对人乳癌细胞系SK-BR-3测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3×105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示出低全身性细胞毒性。
抗GDM抗体-美登木素生物碱或GDM结合抗体片段-美登木素生物碱偶联物可通过将抗GDM抗体或GDM-结合抗体片段与美登木素生物碱分子化学连接而不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用提高细胞毒性，但每个抗体分子平均偶联3-4个美登木素生物碱分子能在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，而对抗体的功能或溶解度没有负面影响。美登木素生物碱是现有公知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如，美国专利No.5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱。优选的美登木素生物碱是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，如各种美登醇酯。
现有已知有许多连接基团可用于制备抗体或抗体片段-美登木素生物碱偶联物，包括如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0425235B1及Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)中所公开的那些。连接基团包括如上文所述专利中所公开的二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，优选二硫化物和硫醚基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体或抗体片段和美登木素生物碱的偶联物，如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。
c.加利车霉素
另一种感兴趣的免疫偶联物包括偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗GDM抗体或GDM结合抗体片段。加利车霉素抗生素家族能够以亚皮摩尔浓度造成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备，参见美国专利No.5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都是美国Cyanamid公司的)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode等，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取会大大增强它们的细胞毒效果。
d.其他细胞毒剂
可与本发明的抗GDM抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星、长春新碱和5-氟尿嘧啶、美国专利No.5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(美国专利No.5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐毒蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒蛋白、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗GDM抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32、pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于诊断时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中涉及如用氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可通过肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以通过赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy(Chatal、CRC Press、1989)详细记载了其它方法。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如用N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述的，制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是易于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗GDM抗体或GDM结合抗体片段和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂清除循环中的未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)缀合的“配体”(如生物素)。
10.免疫脂质体
本文中所公开的抗GDM抗体或GDM结合抗体片段还可配制成免疫脂质体。“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的、可用于对哺乳动物投递药物的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。含有抗体的脂质体可通过现有已知的方法来制备，诸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利No.4,485,045和4,544,545；及公开于1997年10月23日的WO 97/38731中所述的。循环时间延长的脂质体披露于美国专利No.5,013,556。
可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，产生具有期望直径的脂质体。可如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989。
B.GDM结合寡肽
本发明的GDM结合寡肽指结合(优选特异结合)本文所述GDM多肽的寡肽。GDM结合寡肽可以使用已知的寡肽合成方法学化学合成，或者可使用重组技术制备和纯化。GDM结合寡肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中此类寡肽能够结合(优选特异结合)本文所述的GDM多肽。GDM结合寡肽无需过多试验就可使用公知技术来鉴定。在这方面，注意到用于对寡肽文库筛选能够特异结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域公知的(参见例如美国专利No。5,556,762；5,750,373；4,708,871；4,833,092；5,223,409；5,403,484；5,571,689；5,663，143；PCT公开号WO 84/03506和WO84/03564；Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81：3998-4002(1984)；Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：178-182(1985)；Geysen等，于Synthetic Peptides as Antigens，130-149(1986)；Geysen等，J.Immunol.Meth.，102：259-274(1987)；Schoofs等，J.Immunol.，140：611-616(1988)；Cwirla，S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378；Lowman，H.B.等(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.等(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.等(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363；和Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.，2：668)。
在这方面，噬菌体展示是一种让人筛选大型寡肽文库来鉴定那些文库中能够特异结合多肽靶物的成员的公知技术。噬菌体展示是将变体多肽与外壳蛋白作为融合蛋白展示在噬菌体颗粒表面的一种技术(Scott，J.K.和Smith，G.P.(1990)Science 249：386)。噬菌体展示的效用在于，可以对选择性随机化蛋白质变体(或随机克隆cDNA)的大型文库迅速且有效地分选那些以高亲和力结合靶分子的序列。在噬菌体上展示肽(Cwirla，S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378)或蛋白质(Lowman，H.B.等(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.等(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.等(1991)，J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363)的文库已经用于对数以百万计的多肽或寡肽筛选具有特异结合特性的(Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.2：668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要构建和繁殖大量变体的策略，使用靶受体进行亲和纯化的流程，及评估结合富集结果的手段。参见美国专利No.5,223,409、5,403,484、5,571,689和5,663,143。
尽管大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，但是λ样噬菌体展示系统(WO 95/34683；US 5,627,024)、T4噬菌体展示系统(Ren等，Gene，215：439(1998)；Zhu等，Cancer Research，58(15)：3209-3214(1998)；Jiang等，Infection&Immunity，65(11)：4770-4777(1997)；Ren等，Gene，195(2)：303-311(1997)；Ren，Protein Sci.，5：1833(1996)；Efimov等，Virus Genes，10：173(1995))和T7噬菌体展示系统(Smith和Scott，Methods in Enzymology，217：228-257(1993)；U.S.5,766,905)也是已知的。
现在已经对基础噬菌体展示概念发展出了很多其它改进和变种。这些改进增强了展示系统对肽文库筛选与选定靶分子的结合及展示功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有筛选这些蛋白质期望特性的潜力。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO 98/14277)，而且噬菌体展示文库已经用于分析和控制生物分子相互作用(WO 98/20169；WO 98/20159)和受约束螺旋肽的特性(WO 98/20036)。WO 97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库接触其中配体将结合靶分子的一种溶液和其中亲和配体将不会结合靶分子的第二种溶液，以选择性分离能结合的配体。WO97/46251描述了一种方法，即用亲和纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示库，然后分离结合的噬菌体，随后使用微量板的孔进行淘选过程以分离高亲和力结合的噬菌体。已经报道了金黄色葡萄球菌蛋白A作为亲和标签的使用(Li等(1998)Mol Biotech.，9：187)。WO 97/47314描述了底物扣除文库用于区别酶特异性的用途，其中使用组合文库，其可以是噬菌体展示库。WO97/09446描述了使用噬菌体展示选择适用于洗涤剂的酶的方法。美国专利No.5,498,538、5,432,018和WO 98/15833中描述了选择特异结合的蛋白质的其它方法。
产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开于美国专利No.5,723,286；5,432,018；5,580,717；5,427,908；5,498,530；5,770,434；5,734,018；5,698,426；5,763,192；和5,723,32。
C.GDM小分子拮抗剂
GDM小分子拮抗剂是本文所定义的寡肽或抗体(或其片段)以外的结合(优选特异结合)本文所述GDM多肽的信号传导成分(如，受体、配体、细胞内成分等)的小分子。这些有机分子可以使用已知方法来鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO 00/39585)。这些有机分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者其大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类能够结合(优选特异结合)本文所述GDM多肽的有机分子无需过多实验就可使用公知技术来鉴定。在这方面，注意到了用于对有机分子文库筛选能够结合多肽靶物的分子的技术是现有公知的(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO 00/39585)。例如，GDM分子拮抗剂可以是醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫缩酮、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯、烃基卤、烃基磺酸酯、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、吖丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯等。
D.筛选GDM拮抗剂
以上描述了产生本发明抗体、多肽、寡肽和有机分子的技术。人们可以进一步根据需要选择带有某些生物学特性的抗体(及其抗原结合片段)、寡肽或其他有机分子。
可通过本领域公知的方法，例如使用内源性表达GDM多肽的神经胶质瘤细胞或在用GDM基因转染之后，来评估本发明中可使用的各种GDM拮抗剂的生长抑制效果。例如，可将用GDM编码核酸转染的适宜肿瘤细胞系和细胞用不同浓度的本发明的GDM拮抗剂处理几天(例如2-7天)，并用结晶紫或MTT染色，或者通过一些其它比色测试来分析。测量增殖的另一种方法是通过比较在存在或缺乏这些GDM拮抗剂时所处理细胞的3H-胸苷摄取。处理后，收获细胞并在闪烁计数器中对掺入DNA的放射量定量。适宜的阳性对照包括用已知抑制该细胞系生长的生长抑制性抗体处理选定细胞系。可以现有已知的多种方法来测定体内肿瘤细胞的生长抑制。优选的是，肿瘤细胞是过表达GDM多肽的细胞。优选的是，与未处理的肿瘤细胞相比，该GDM拮抗剂将在体外或在体内抑制表达GDM的肿瘤细胞的细胞增殖达约25-100％，更优选约30-100％，甚至更优选约50-100％或70-100％，在一个实施方案中，抗体浓度为约0.5-30μg/ml。可在细胞培养物中在GDM拮抗剂浓度为约0.5-30μg/ml或约0.5nM至200nM时测量生长抑制，其中在使肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测量生长抑制。如果以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用拮抗剂和/或激动剂导致在自首次施用抗体起约5天至3个月内、优选约5至30天内肿瘤体积缩小或肿瘤细胞增殖降低，那么该抗体是体内生长抑制性的。
为了选择诱导细胞死亡的GDM拮抗剂，可相对于对照来评估膜完整性的丧失，这由诸如碘化丙啶(PI)、锥虫蓝或7AAD摄取来指示。PI摄取测试可在缺乏补体和免疫效应细胞时进行。将表达GDM多肽的肿瘤细胞与单独的培养基或含有适宜的GDM拮抗剂的培养基一起温育。将细胞温育3天时间。每次处理后，清洗细胞并等分到35mm带滤盖的12×75试管中(每支试管1ml，每个处理组3支试管)，用以去除细胞团块。然后向试管加入PI(10μg/ml)。使用
流式细胞仪和
CellQuest软件(BectonDickinson)分析样品。可选择那些GDM拮抗剂，其通过PI摄取确定为诱导统计学上显著水平的细胞死亡。
为了筛选结合感兴趣的抗体所结合的GDM多肽上的表位的GDM拮抗剂，可进行常规的交叉阻断测试，如Antibodies：ALaboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)中所描述的。此测试可用于确定测试抗体、寡肽或其它有机分子是否与已知的抗GDM抗体结合相同的位点或表位。或者/另外，可通过现有已知的方法进行表位作图。例如，可通过诸如丙氨酸扫描来诱变抗体序列以鉴定接触残基。首先对突变体抗体测试与多克隆抗体的结合以确保正确折叠。在一种不同的方法中，可在竞争测试中使用对应于GDM多肽不同区域的肽和测试抗体群或者一种测试抗体和具有已表征或已知表位的抗体。
E.抗体依赖性酶介导的前体药物疗法(ADEPT)
通过将抗体与前体药物活化酶偶联，本发明的GDM拮抗性抗体还可用于ADEPT，所述前体药物活化酶将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO 88/07378和美国专利No.4,975,278。
可用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转变为更有活性的细胞毒性形式的任何酶。
可用于本发明方法的酶包括但不限于用于将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸(酯)酶；用于将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸(酯)酶；用于将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；用于转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；用于将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将用β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；及用于将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体(本领域也称作“抗体酶”)将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey，Nature 328：457-458(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。
可通过现有公知的技术将本发明的酶与抗GDM抗体共价结合，诸如使用上文所讨论的异双功能交联剂。或者，可使用现有公知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger等，Nature 312：604-608(1984))。
F.GDM多肽变体
除了本文所述的GDM多肽，设想了可制备这些分子的变体，用于本文发明中。这些变体可通过将适宜的核苷酸改变引入编码DNA和/或通过合成所期望的抗体或多肽来制备。本领域技术人员将能理解，氨基酸改变可改变这些分子的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。
可在氨基酸序列中产生变异，例如使用如美国专利No.5,364,934所述的保守和非保守突变的任何技术和指导方针。变异可以是编码氨基酸序列的一个或多个密码子的替代、删除或插入，其导致氨基酸序列相对于天然序列改变。任选的是，变异是通过感兴趣的氨基酸序列的一个或多个结构域中至少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代来进行。通过比较感兴趣的氨基酸序列的序列与已知同源蛋白质分子的序列，并将高同源区中进行的氨基酸序列改变的数目最少化，可发现确定哪些氨基酸残基可插入、替代或删除而不会对期望活性有不利影响的方针。氨基酸替代可以是将一种氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替代的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。插入或删除可任选在约1个至5个氨基酸的范围内。可通过在序列中系统性地进行氨基酸插入、替代或删除，并对所得变体测试由全长或成熟的天然序列展示的活性，由此来确定可容许的变异。
本文提供了各种PDM多肽片段。例如，在与全长天然抗体或蛋白质比较时，此类片段可在N-末端或C-末端截短，或者可缺少内部残基。这些缺少对于所期望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基的片段也可用于所公开的方法中。
以上多肽片段可通过多种常规技术中的任一种来制备。所期望的肽片段可化学合成。一种备选方法涉及通过酶促消化产生这些片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基确定的位点处切割蛋白质的酶来处理蛋白质，或者通过用合适的限制酶消化DNA，并分离所期望的片段。还有一种合适的技术涉及分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码所期望片段的DNA片段。确定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCR中用作5′和3′引物。优选的是，这些片段与相应的全长分子共有至少一种生物学和/或免疫学活性。
在特定实施方案中，感兴趣的保守替代见表6中标题“优选替代”之下。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么表6中称为例示替代的更实质性改变的、或者如下文关于氨基酸类别所进一步描述的，可被引入并筛选产物，由此鉴定出所期望的变体。
表6
对GDM多肽的功能或免疫学身份的实质修饰通过选择在保持以下方面的效果上有显著不同的替代来完成：(a)替代区域中的多肽骨架的结构，例如作为折叠或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr；Asn；Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员替换另一个类别的。还可以将此类替代残基引入保守替代位点中，或者更优选的是，引入剩余的(非保守)位点中。
变异可使用现有已知的方法来进行，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carter等，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987))、盒式诱变(Wells等，Gene，34：315(1985))、限制性选择诱变(Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986))或其它已知技术，以产生抗GDM分子。
还可采用扫描氨基酸分析来鉴定沿着连续序列的一个或多个氨基酸。在优选的扫描用氨基酸中有相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这组中的优选扫描用氨基酸，因为它消除了β-碳上的侧链，而且不大可能改变变体的主链构象(Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989))。丙氨酸通常也是优选的，因为它是最常见的氨基酸。另外，常常在隐蔽位置和暴露位置都能发现它(Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman&Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976))。如果丙氨酸替代不能产生足够量的变体，那么可使用等排(isoteric)氨基酸。
任何不涉及保持GDM多肽正确构象的半胱氨酸残基也可被替代，通常用丝氨酸替代，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向分子中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是诸如Fv片段的抗体片段时)。
特别优选的一类替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得的变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法包括使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，以在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物而展示在丝状噬菌体颗粒上。然后如本文所公开的，对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和靶多肽之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述，对该组变体进行筛选，并可选择在一种或多种相关测试中有优良特性的抗体用于进一步的开发。
编码GDM多肽氨基酸序列变体的核酸分子可通过现有已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对天然序列或早期制备的变体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
G.GDM多肽的修饰
共价修饰的GDM也适宜应用在本发明的范围内。一种类型的共价修饰包括使这类抗体和多肽的靶氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生化试剂能够与这类抗体和多肽的选定的侧链或者N-或C-末端残基起反应。例如，用双功能试剂进行的衍生化可用于使前述分子与不溶于水的支持基质或表面交联，从而用于纯化。常用的交联剂包括如，1，1-双(重氮-乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯，诸如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺，诸如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷和诸如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚氨酸酯的试剂。
其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。
另一类GDM多肽的共价修饰包括改变抗体或多肽的天然糖基化样式。“改变天然糖基化样式”在本文中意图指缺失一个或多个在天然序列中发现的碳水化合物部分(或是通过消除潜在糖基化位点，或是通过以化学和/或酶促手段删除糖基化来进行)，和/或添加一个或多个在相应天然序列中不存在的糖基化位点。另外，此短语包括天然蛋白质糖基化中的定性改变，包括所存在的多种碳水化合物部分的性质和比例的改变。
抗体和其它多肽的糖基化通常或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物部分附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。由此，多肽中这些三肽序列其中任一的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而完成(用于N-连接的糖基化位点)。这种改变还可通过向这些原始抗体或多肽的序列中添加、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。可通过DNA水平上的变化，特别是通过在预先选择的碱基处突变编码前述氨基酸序列的DNA从而产生翻译成期望氨基酸的密码子，由此来任选改变这些抗体或多肽序列。
增加碳水化合物部分的数量的另一种方法是通过使糖苷与多肽化学或酶促偶联。本领域对此类方法有描述，例如1987年9月11日公开的WO87/05330，和Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)。
去除碳水化合物部分可通过化学或酶促方法来实现，或者通过编码充当糖基化靶位的氨基酸残基的密码子的诱变替代来实现。化学脱糖基技术是现有已知的，而且描述于诸如Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.，118：131(1981)中。酶促切割多肽上的碳水化合物部分可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等，Meth.Enzymol.，138：350(1987)所述。
另一类共价修饰包括以美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述的方式，连接多种非蛋白质性质的聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。GDM多肽还可包裹于诸如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如可分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于诸如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo，A.编，1980。
修饰形成嵌合分子是通过将GDM多肽与另一种异源多肽或氨基酸序列融合来实现，设想应用于本发明的方法中。
在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的GDM多肽的融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于这种抗体或多肽的氨基或羧基末端。可使用针对标签多肽的抗体来检测此类带表位标签形式的抗体或多肽的存在。而且，表位标签的提供使这种抗体或多肽易于通过亲和纯化使用抗标签抗体或另一类结合所述表位标签的亲和基质来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是现有公知的。例子包括聚组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988))；c-myc标签及其抗体8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等，Molecular and CellularBiology，5：3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990)))。其它标签多肽包括Flag肽(Hopp等，BioTechnology，6：1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin等，Science，255：192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner等，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991))；及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990))。
在一个备选的实施方案中，嵌合分子可包括GDM多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为“免疫粘附素”)，此类融合物可以是与IgG分子Fc区融合的。Ig融合物优选包含替代，即用可溶(跨膜结构域删除或灭活)形式的前述抗体或多肽替换Ig分子内至少一个可变区。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgG1分子的铰链、CH2和CH3，或者铰链、CH1、CH2和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的制备还可参见1995年6月27日公告的美国专利No.5,428,130。
H.GDM多肽的制备
下面的描述主要涉及通过培养用包含编码该抗体、多肽和寡肽的核酸的载体转化或转染的细胞来制备GDM多肽。当然设想了，可采用本领域公知的备选方法来制备该抗体、多肽和寡肽。例如，可使用固相技术通过直接肽合成来生成适宜的氨基酸序列或其部分(参见如，Stewart等，Solid-PhasePeptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963))。体外蛋白质合成可使用人工技术或自动化来进行。例如，自动化合成可依照制造商的说明书使用AppliedBiosystems肽合成仪(Foster City，CA)来完成。该抗体、多肽或寡肽的各个部分可分开化学合成，并使用化学或酶促方法组合来生成所期望的产品。
1.分离编码GDM多肽的DNA
编码GDM多肽的DNA可以从据认为具有所述抗体、多肽或寡肽mRNA的并以可检测水平表达它的组织制备得到的cDNA文库中获得。因此，编码该多肽的DNA可从人组织制备的cDNA文库、基因组文库或通过已知的合成流程(例如自动化核酸合成)而方便地获得。
设计用于鉴定感兴趣的基因或由其编码的蛋白质的探针(诸如至少约20-80个碱基的寡核苷酸)可以用来筛选文库。用所选的探针筛选cDNA或基因组文库可使用标准流程进行，诸如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(纽约：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)所述。或者，可用PCR方法(Sambrook等，同上；Dieffenbach等，PCR Primer：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995))。
用于筛选cDNA文库的技术是本领域公知的。选择作为探针的寡核苷酸序列应该足够长且足够专一，使得假阳性降到最低。寡核苷酸优选是经过标记的，使得它在与所筛选文库中的DNA杂交时可被检测出。标记方法是本领域公知的，包括使用放射性标记物，像32P-标记的ATP、生物素化或酶标记。Sambrook等(同上)提供了杂交条件，包括中等严格和高度严格条件。
在此类文库筛选方法中鉴定到的序列可以与公共数据库(如GenBank)或其它私有序列数据库中可得到的和保藏的其它已知序列比较和对比。分子确定区域内的或跨越全长序列的序列同一性(在氨基酸水平上或在核苷酸水平上)可使用现有已知的和本文所述的方法来确定。
具有蛋白质编码序列的核酸可通过使用本文首次公开的所推断的氨基酸序列来筛选选定的cDNA或基因组文库而获得，并且如果必要，使用Sambrook等(同上)所述的常规引物延伸流程来检测可能不会逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间产物。
2.选择和转化宿主细胞
宿主细胞用本文所述的用于生成GDM多肽的表达或克隆载体进行转染或转化，并在适宜诱导启动子、选择转化子、或扩增编码所期望的序列的基因而进行调整的常规营养培养基中培养。培养条件，如培养基、温度、pH等，可以由本领域技术人员无需过多实验就选择出。一般来说，用于使细胞培养物产量最大化的原理、方案和实用技术可在Mammalian CellBiotechnology：A Practical Approach，M.Butler编(IRL Press，1991)和Sambrook等(同上)中找到。
真核细胞转染和原核细胞转化的方法是普通技术人员所知的，例如有CaCl2、CaPO4、脂质体介导的和电穿孔。根据所用宿主细胞，使用适于此类细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等(同上)所述，对原核细胞一般使用采用氯化钙的钙处理法或电穿孔。如Shaw等，Gene，23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO 89/05859所述，根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)感染可用于某些植物细胞的转化。对于没有这样的细胞壁的哺乳动物细胞，可采用Graham和van der Eb，Virology，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般情况参见美国专利No.4,399,216。转化入酵母通常可依照Van Solingen等，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)的方法来进行。然而，也可使用将DNA导入细胞的其它方法，如核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、或聚阳离子(如聚凝胺、聚鸟氨酸)。对于转化哺乳动物细胞的多种技术，可参见Keown等，Methods in Enzvmology，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature，336：348-352(1988)。
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括，原核生物、酵母、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌，如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5772(ATCC 53,635)。其它合适的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))、和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)(如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P))、假单胞菌属(pseudomonas)(如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、和链霉菌属(Streptomyces)。这些例子是例示性的而非限制性的。W3110株是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用于重组DNA产物发酵的常用宿主菌株。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，W3110株可以被修饰，从而在编码宿主内源性蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanr；大肠杆菌W3110株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degPompT rbs7 ilvG kanr；大肠杆菌W3110株40B4，其是带有非卡那霉素抗性的degP缺失突变的37D6株；及1990年8月7日颁布的美国专利No.4,946,783中公开的具有突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法也是合适的，例如PCR或其它核酸聚合酶反应。
特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，如当治疗性抗体与细胞毒剂(例如毒素)偶联且免疫偶联物自身能显示出对肿瘤细胞破坏的效力时，可在细菌中制备全长抗体、抗体片段及抗体融合蛋白。全长抗体在循环中具有较长半衰期。大肠杆菌中的生产更快且更加省钱。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，可参见如US 5,648,237(Carter等)、US 5,789,199(JoIy等)、和US 5,840,523(Simmons等)，它们描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列，这些专利纳入本文作为参考。表达后，以可溶性级分方式从大肠杆菌细胞浆中分离出抗体，并且可根据同种型而通过诸如蛋白A或G柱来纯化。最终的纯化可以用与纯化在合适细胞(如，CHO细胞)中表达的抗体类似的方法来进行。
除了原核生物以外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是编码GDM多肽的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature 290：140(1981)；EP139,383，1985年5月2日公开)；克鲁维酵母宿主(Kluyveromyces)(美国专利No.4,943,529；Fleer等，Bio/Technology 9：968-975(1991))，如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C、CBS683、CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.154(2)：737-742(1983))、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906；Van den Berg等，Bio/Technology 8：135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.28：265-278(1988))；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：5259-5263(1979))；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(EP 394,538，1990年10月31日公开)；和丝状真菌，如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(WO 91/00357，1991年1月10日公开)、和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)(Balance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.112：284-289(1983)；Tilburn等，Gene 26：205-221(1983)；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes、EMBO J.4：475-479(1985))。甲基营养型酵母适于本发明，包括但不限于能够在甲醇上生长的、选自以下属的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、和红酵母属(Rhodotorula)。作为这类酵母的例子的具体物种列表可在C.Anthony，The Biochemistry of Methylotrophs，269(1982)中找到。
适用于表达糖基化GDM多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾Sf9、以及植物细胞，如棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、和烟草的细胞培养物。已经鉴定出了许多杆状病毒株和变体及相应能接受的昆虫宿主细胞，所述细胞来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)、和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种用于转染的病毒株，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明作为本文的病毒使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
然而，脊椎动物细胞是最感兴趣的，而且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已经成为常规流程了。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养基中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，1977，J.Gen Virol.36：59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216)；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.23：243-251)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，1982，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。
用上述用于GDM多肽生成的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在适宜诱导启动子、选择转化子、或扩增编码所期望的序列的基因而调整的常规营养培养基中培养。
3.选择和应用复制型载体
可以将编码各GDM多肽的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体，用于克隆(DNA扩增)或表达。多种载体是公众可得到的。例如，载体可以是质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种方法将适宜的核酸序列插入载体中。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入适宜的限制性内切核酸酶位点。载体成分通常包括但不限于一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标志物基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。构建包含一种或多种这些成分的合适载体可采用技术人员已知的标准连接技术。
GDM多肽不仅可以直接重组生产，而且可以与异源多肽作为融合多肽来生产，所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特异性切割位点的信号序列或其它多肽。一般而言，信号序列可以是载体的成分，或者它可以是插入载体的编码成熟序列的DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp、或热稳定的肠毒素II前导。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母和克鲁维酵母的α-因子前导序列，后者如美国专利No.5,010,182所述)、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公开的EP 362,179)、或1990年11月15日公开的WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞的表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，如用来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列、以及病毒分泌前导序列。
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。多种细菌、酵母、和病毒的此类序列是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达和克隆载体通常将包含选择基因，也称为选择标志物。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性的，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)弥补营养缺陷的；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物的，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
适于哺乳动物细胞的选择标志物的例子是能够鉴定出能摄取编码所期望蛋白质的核酸的细胞的选择标志物，诸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其制备和繁殖如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980)所述。适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979)；Kingsman等，Gene，7：141(1979)；Tschemper等，Gene，10：157(1980))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株提供了选择标志物，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics，85：12(1977))。
表达和克隆载体通常包含与编码所期望氨基酸序列的核酸序列可操作连接的启动子，用以指导mRNA合成。由多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等，Nature，275：615(1978)；Goeddel等，Nature，281：544(1979))、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，Nucleic acids Res.8：4057(1980)；EP 36,776)、和杂合启动子，如tac启动子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25(1983))。用于细菌系统的启动子还将包含与编码所期望的蛋白质序列的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7：149(1968)；Holland，Biochemistry 17：4900(1978))(如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、和葡糖激酶)的启动子。
作为具有生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 73,657中。
在哺乳动物宿主细胞中的DNA转录是受控的，例如只要此类启动子与宿主细胞系统相容的话，可由病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40))基因组中获得的启动子控制，由异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、及由热休克启动子)控制。
可通过在载体中插入增强子序列来提高编码GDM多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约有10至300bp，其作用于启动子以增加转录。来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列是已知的。然而，人们通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起点晚期一侧上的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期一侧上的多瘤病毒增强子、和腺病毒增强子。增强子可以剪接到载体中前述氨基酸序列的编码序列的5′或3′位置上，但是优选位于启动子的5′位点。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的多核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5′端(偶尔是3′端)非翻译区获得。这些区域包含在编码本节所述的各抗体、多肽或寡肽的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
适合在重组脊椎动物细胞培养中合成各抗体、多肽或寡肽的其它方法、载体和宿主细胞见Gething等，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等，Nature，281：40-46(1979)；EP 117,060；和EP 117,058。
4.培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生成GDM多肽的宿主细胞。商品化培养基，如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)，适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中描述的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利再审号30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(其被定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适当浓度包括本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(如温度、pH等)是先前为表达而选择用于宿主细胞中的条件，这对于普通技术人员而言是显然的。
5.检测基因扩增/表达
基因的扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如根据本文提供的序列使用适宜的带标记探针，通过常规的Southern印迹、Northern印迹来定量mRNA转录(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)或原位杂交。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可标记抗体，并可进行测试，其中将双链体结合到表面上，从而在表面上形成双链体后，可检测与双链体结合的抗体的存在。
或者，为了直接对基因产物的表达定量，可通过免疫学方法测量基因表达，如通过细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液测试来进行。用于免疫组化染色和/或样品液体测试的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。可针对天然序列的多肽或寡肽或针对与DNA融合且编码该多肽或寡肽的特定抗体表位的外源序列，来便利地制备适用于本方法的抗体。
6.蛋白质纯化
可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收GDM多肽。如果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促裂解使其从膜释放。前述表达所用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，如通过冻融循环、超声处理、机械破裂、或细胞溶解剂。
可期望从重组细胞蛋白质或多肽中纯化出前述物质。下面的流程是合适纯化流程的例示：在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅土或阳离子交换树脂(如DEAE)上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用诸如Sephadex G-75的凝胶过滤；用蛋白A Sepharose柱以除去污染物，如IgG；及用金属螯合柱来结合所期望的分子的带表位标签形式。可采用多种蛋白质纯化方法，而且此类方法是本领域已知的并描述于诸如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principes and Practice，Springer-Verlag，纽约(1982)中。选择的纯化步骤将取决于例如所用的生产方法和为所要求保护的方法生成的特定抗体、多肽或寡肽的性质。
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成GDM多肽，或者直接将其分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤来清除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时，使细胞浆融化超过约30分钟。可以通过离心除去细胞碎片。当抗体分泌到培养基中，则一般首先使用商品化的蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括用蛋白酶抑制剂(如PMSF)来抑制蛋白水解，而且可以包括用抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、和亲和层析来进行纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是其它基质也可用。机械稳定的基质(如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含CH3结构域的抗体而言，可使用BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何初步的纯化步骤后，包含感兴趣的抗体和污染物的混合物可以使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液进行低pH疏水相互作用层析，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)进行。
I.药用配制剂
可制备本发明所用的GDM拮抗剂(“治疗剂”)的治疗用配制剂共贮存，制备通过将具有期望纯度的治疗剂与任选的制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington：The Science of Practice of Pharmacy，第20版，Gennaro，A.等，Ed.，Philadelphia College of Pharmacy and Science(2000))混合成冻干剂型或水溶液的形式来进行。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如醋酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；渗透压调节剂，诸如海藻糖和氯化钠；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，诸如聚山梨醇酯；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如
或聚乙二醇(PEG)。抗体优选包含浓度介于5-200mg/ml、优选介于10-100mg/ml的抗体。
本文中的制剂还可含有超过一种治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选它们具有补充活性且彼此没有不利影响的。例如，在前述治疗剂之外，期望在一种配制剂中含有另一种抗体，如第二种此类治疗剂，或针对一些其它靶物(诸如影响神经胶质瘤生长的生长因子)的抗体。或者/另外，组合物还可包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。此类分子以对于预定目的有效的量适宜地组合存在。
活性成分还可包裹于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如可分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或包裹在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(同上)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，其是定型制品形式的，例如为薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体))及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
J.使用GDM拮抗剂的诊断和治疗
为了确定神经胶质瘤中的GDM表达，可利用多种诊断测定法。在一个实施方案中，可通过免疫组化(IHC)来分析GDM多肽的过表达。可对来自肿瘤活组织检查的石蜡包埋的组织切片进行IHC测定法，并如下给予GDM蛋白质染色强度标准评分：
得分0-未观察到染色或者在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。
得分1+-在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。细胞只在其部分膜上有染色。
得分2+-在超过10％的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。
得分3+-在超过10％的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。
那些GDM多肽表达得分为0或1+的肿瘤可表征为未过表达GDM，而那些得分2+或3+的肿瘤可表征为过表达GDM。
或者/另外，可在福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤组织上进行FISH测定法诸如
(Ventana，Arizona)或
(Vysis，Illinois)以确定肿瘤中GDM过表达的程度(如果有的话)。
例如施用结合待检测分子且标记有可检测标志物(例如放射性同位素或荧光标志物)的分子(诸如抗体、寡肽或有机分子)并对患者进行外部扫描以定位标志物，由此可使用体内诊断测定法来评估GDM过表达或扩增。
当前，根据癌症的阶段，癌症治疗牵涉下列疗法中的一种或组合：手术以去除癌性组织、放疗和化疗。包括施用GDM拮抗剂的疗法对于不能很好承受化疗的毒性和副作用的老年患者并对于放疗只有有限效用的转移性疾病来说，是尤其理想的。本发明方法的肿瘤靶向性GDM拮抗剂可在疾病的最初诊断时或在复发期间用于减轻表达GDM的癌症。对于治疗应用，此类GDM拮抗剂可在应用治疗神经胶质瘤的其它常规试剂和/或方法之前或之后，与例如激素、抗血管发生剂或放射标志物的化合物、或者与手术、冷冻疗法、放疗和/或化疗的联合使用。化疗药物(如
(多西他塞)、
(帕利他塞)、雌莫司汀和米托蒽醌)可用于治疗癌症，特别是高风险的患者。
具体而言，设想了与帕利他塞及改良衍生物的联合疗法(参见例如EP0600517)。将前述抗体、多肽、寡肽或有机分子与治疗有效剂量的化疗剂一起施用。在另一个实施方案中，此类抗体、多肽、寡肽或有机分子与化疗联合施用，用以提高化疗剂(例如帕利他塞)的活性和功效。Physicians′DeskReference(PDR)公开了这些药剂已经在多种癌症治疗中所使用的剂量。这些前述化疗药物在治疗上有效的给药方案和剂量将取决于所治疗的具体癌症、疾病的程度及本领域内科医师所熟悉的其它因素，而且可以由内科医师确定。
在一个具体的实施方案中，将包含与细胞毒剂偶联的此类GDM拮抗剂的免疫偶联物施用于患者。优选的是，此类免疫偶联物由细胞内在化，导致免疫偶联物在杀死其所结合的癌细胞方面的治疗功效提高。在一个优选的实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子在上文有描述，包括美登木素生物碱、加利车霉素、核糖核酸酶及DNA内切核酸酶。
前述GDM拮抗剂或其毒素偶联物依照已知方法施用于人类患者，诸如静脉内施用(如推注或一段时间的连续输注)，通过颅内、脑脊髓内、关节内、鞘内、静脉内、动脉内、皮下、口服、表面或吸入路径施用。
其它治疗方案可与前述GDM拮抗剂的施用组合起来。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂来共施用，及以任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有两种(或多种)活性试剂同时发挥其生物学活性。优选的是，此类联合疗法导致协同治疗效果。
在另一个实施方案中，本发明的治疗性处理方法牵涉以上GDM拮抗剂与一种或多种化疗剂或生长抑制剂的联合给药，包括不同化疗剂的混合物的共施用。示例性的化疗剂在前已提供。此类化疗剂的制剂和给药方案可依照制造商的说明书来使用，或由熟练从业人员根据经验确定。此类化疗的制备和给药方案还可参阅Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
为了预防或治疗疾病，给药剂量和模式可以由内科医师依照已知标准来选择。GDM拮抗剂的适宜剂量将取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、是为了预防还是治疗目的而给药、先前的疗法(包括患者临床史及响应)、及主治医师的判断。将前述GDM拮抗剂恰当地一次性或在一系列治疗中施用于患者。施用可通过静脉内输注或通过皮下注射来进行。例如，根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至约50mg/kg体重(例如约0.1-15mg/kg/剂)的GDM拮抗剂可作为初始侯选剂量向患者给药，无论是通过一次或多次分开给药的，还是通过连续输注的。给药方案可包括施用一剂约4mg/kg的初始加载剂量，接着是约2mg/kg此类GDM拮抗剂的每周维持剂量。然而，可使用其它剂量方案。根据上述因素，典型的每日剂量可在约1μg/kg到100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，根据状况，可维持治疗直到对疾病症状的期望遏制发生。这种疗法的进展可容易地通过常规方法和测定法并基于内科医师或其它本领域技术人员知道的标准来监测。
除了将抗体蛋白质施用于患者，本申请设想通过基因疗法来施用抗体类编码GDM多肽拮抗剂的此类核酸的施用涵盖在表述“给药治疗有效量的抗体”中。关于使用基因疗法来产生胞内抗体，可参见例如1996年3月14日公开的WO 96/07321。
主要有两种方法使此类核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞：体内和回体。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射入患者。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞直接施用于患者，或是例如装入多孔膜再植入患者(参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至目的宿主的体外培养的细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒载体。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(例如，可用于脂质介导的基因转移的脂质有DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行转染。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述可参见Anderson等，Science 256：808-813(1992)。还可参见WO 93/25673及其引用的参考文献。
K.制品和试剂盒
为了治疗应用，制品包括容器和指明神经胶质瘤治疗用途的容器上或与其相关的标签或包装插页。例如，合适的容器包括瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有有效治疗癌症状况的组合物，而且可带有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性试剂是GDM拮抗剂。标签或包装插页指示该组合物用于治疗神经胶质瘤。标签或包装插页进一步包含施用GDM拮抗剂的说明书。另外，制品还可包括第二容器，其中装有制药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可包括从商业和用户立场上来看所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
还提供了可用于多种其它目的的试剂盒，例如用于表达GDM的细胞的杀伤测定法，用于从细胞中纯化或免疫沉淀GDM多肽。为了分离和纯化GDM多肽，试剂盒可包含各种与珠子(例如sepharose珠子)偶联的GDM结合剂。可以提供包含此类分子的试剂盒，用于GDM多肽的体外检测和定量，例如用在ELISA或Western印迹中。与制品相同，试剂盒包括容器和容器上或与其相关的标签或包装插页。容器中装有包含至少一种可用于本发明的这类GDM结合抗体、寡肽或有机分子的组合物。可包括另外的容器，其中装有例如稀释剂和缓冲剂、对照抗体。标签或包装插页可提供对组合物的描述以及用于预期体外或诊断用途的说明书。
L.正义和反义编码GDM的核酸
GDM拮抗剂包括编码GDM的核酸的片段，诸如反义或和寡核苷酸，其包括能够结合靶GDM mRNA(正义)或GDM DNA(反义)序列的单链核酸序列(RNA或DNA)。依照本发明，反义或正义寡核苷酸包含各GDM DNA编码区的片段。根据编码给定蛋白质的cDNA序列来衍生反义或正义寡核苷酸的能力在例如Stein和Cohen(Cancer Res.48：2659，1988)和van der Krol等(BioTechniques 6：958，1988)中有描述。
反义或正义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致双链体的形成，其通过几种手段之一来阻断靶序列的转录或翻译，所述手段包括双链体的降解增强、转录或翻译的过早终止、或其它手段。此类方法包括在本发明中。因而，反义寡核苷酸可用于阻断GDM蛋白的表达，其中那些GDM蛋白可在哺乳动物中起诱导癌症的作用。反义或正义寡核苷酸还包括具有修饰的糖-磷酸二酯骨架(或其它糖连接键，诸如WO 91/06629中所述的)的寡核苷酸，且其中此类糖连接键对内源核酸酶有抗性。此类具有抗性糖连接键的寡核苷酸在体内是稳定的(即能够抵抗酶促降解)，但保留了结合靶核苷酸序列的序列特异性。
本发明中所用的反义化合物可方便且常规地通过众所周知的固相合成技术来制备。有几家供应商销售用于此类合成的设备，包括例如AppliedBiosystems(Foster City，Calif.)。另外/或者，可采用本领域已知的用于此类合成的任何其它手段。众所周知，可使用类似技术来制备寡核苷酸，诸如硫代磷酸酯和烃基化衍生物。本发明的化合物还可与其它分子、分子结构或化合物混合物混合、胶囊化、偶联或以其它方式连接，形成例如脂质体、受体靶向分子、口服的、直肠的、表面的或其它配制剂，从而辅助摄取、分布和/或吸收。教导制备此类摄取、分布和/或吸收辅助制剂的专利包括但不限于美国专利No.5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，其每一个都纳入本文参考。
正义或反义寡核苷酸的其它例子包括那些与有机模块(诸如WO90/10048中描述的)及能提高寡核苷酸对靶核酸序列亲和力的其它模块(诸如聚-(L-赖氨酸))共价连接的寡核苷酸。而且，嵌入剂(诸如玫瑰树碱)和烷化剂或金属络合物可附着于正义或反义寡核苷酸，以修饰反义或正义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。
可通过任何基因转移方法将反义或正义寡核苷酸导入包含靶核酸序列的细胞中，包括例如用CaPO4介导的DNA转染、电穿孔、或通过使用基因转移载体(诸如埃巴二氏病毒)。在一种优选的规程中，将反义或正义寡核苷酸插入合适的逆转录病毒载体。让包含靶核酸序列的细胞在体内或回体接触重组逆转录病毒载体。合适的逆转录病毒载体包括但不限于那些衍生自鼠逆转录病毒M-MuLV的那些，N2(衍生自M-MuLV的逆转录病毒)，或命名为DCT5A、DCT5B和DCT5C的双拷贝载体(见WO 90/13641)。
如WO 91/04753中所述，还可通过与配体结合分子形成偶联物而将正义或反义寡核苷酸导入包含靶核苷酸序列的细胞。合适的配体结合分子包括但不限于细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子、或结合细胞表面受体的其它配体。优选的是，配体结合分子的偶联基本上不干扰配体结合分子结合其相应分子或受体的能力或者阻断正义或反义寡核苷酸或其偶联形式进入细胞。
或者，如WO 90/10448中所述，可通过形成寡核苷酸-脂质复合物来将正义或反义寡核苷酸导入包含靶核酸序列的细胞。正义或反义寡核苷酸-脂质复合物优选在细胞内由内源脂肪酶解离。
反义或正义RNA或DNA分子的长度一般是至少约5个核苷酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、或1000个核苷酸，其中该文中的术语“约”指所述核苷酸序列长度加或减该所述长度的10％。
M.用于鉴定GDM拮抗剂的筛选测定法
可以多种形式进行测定法，包括本领域已经很好表征的蛋白质-蛋白质结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。
所有用于拮抗剂的测定法的共同之处在于它们需要使药物候选物接触由本文鉴定的核酸所编码的GDM多肽，接触的条件和时间足以使这两种组分相互作用。
在结合测定法中，相互作用指结合，而且所形成的复合物可在反应混合物中被分离或检测。在一个特定的实施方案中，将由本文鉴定的基因所编码的GDM多肽或药物候选物通过共价或非共价附着固定在固相上，例如在微量滴定板上。非共价附着一般通过用GDM多肽溶液包被固相表面并干燥来实现。或者，特异于要固定的GDM多肽的固定化抗体(例如单克隆抗体)可用于将它锚定至固相表面。将可用可检测标志物标记的非固定化组分加至固定化组分(例如包含锚定组分的包被表面)，由此进行测定法。在反应完成时，例如通过清洗来除去未反应的组分，并检测锚定到固相表面上的复合物。在最初的非固定化组分携带可检测标志物的时候，检测出固定到表面上的标志物表明发生了复合作用。若最初的非固定化组分不携带标志物，则可通过诸如使用特异结合已固定复合物的标记抗体来检测复合作用。
如果候选化合物与本文鉴定的基因所编码的特定GDM多肽相互作用但不结合，那么它与该多肽的相互作用可通过用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的公知方法来测定。此类测定法包括传统方法，诸如例如交联、免疫共沉淀、和通过梯度或层析柱的共纯化。另外，可以如Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5789-5793(1991)所公开的，使用Fields及其同事(Fields和Song，Nature(London)，340：245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582(1991))描述的基于酵母的遗传系统来监测蛋白质-蛋白质相互作用。许多转录激活物(诸如酵母GAL4)由两个物理上离散的模组结构域组成，一个起DNA结合结构域的作用，另一个起转录激活结构域的功能。上述出版物中描述的酵母表达系统(通称为“双杂交系统”)利用了此特性，并采用两种杂合蛋白质，其中一个是将靶蛋白质与GAL4的DNA结合结构域融合，而其中另一个是将候选激活蛋白质与激活结构域融合。GAL1-lacZ报道基因在GAL4激活的启动子控制下的表达依赖于经由蛋白质-蛋白质相互作用的GAL4活性重建。用β-半乳糖苷酶的显色底物检测包含相互作用多肽的菌落。使用双杂交技术鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)可从Clontech获得。此系统还可扩展到涉及特定蛋白质相互作用中的蛋白质结构域作图以及扩展到指出对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。
干扰本文鉴定的编码GDM多肽的基因与其它胞内或胞外组分相互作用的化合物可如下测试：通常在足以使两种产物相互作用和结合的条件和时间下制备包含基因产物及胞内或胞外组分的反应混合物。为了测试候选化合物抑制结合的能力，在缺乏和存在测试化合物时进行反应。另外，可以向第三份反应混合物中加入安慰剂，作为阳性对照。如上所述，监测混合物中存在的测试化合物和胞内或胞外组分之间的结合(复合物形成)。对照反应物中形成复合物但含有测试化合物的反应混合物中没有形成表明，测试化合物干扰GDM多肽与其反应配偶体的相互作用。
为了测试拮抗剂，可将GDM多肽与要筛选特定活性的化合物一起加至细胞，在存在GDM多肽时化合物抑制感兴趣的活性的能力表明，该化合物是GDM多肽的拮抗剂。或者，可如下检测拮抗剂，将GDM多肽和潜在的拮抗剂与膜结合的GDM多肽受体或重组受体在适于竞争性抑制测定法的条件下组合在一起。GDM多肽可进行标记，诸如通过放射性，使得与受体结合的GDM多肽分子的数目可用于确定潜在拮抗剂的效力。编码受体的基因可通过本领域技术人员知道的多种方法来鉴定，例如配体淘选和FACS分选。Coligan等，Current Protocols in Immun.，1(2)：第5章(1991)。优选的是，采用表达克隆，其中从对GDM多肽有应答的细胞中制备多腺苷酸化RNA，并将从此RNA构建的cDNA文库分成几个库并用于转染COS细胞或对GDM多肽没有应答的其它细胞。让在载玻片上生长的转染细胞暴露于经过标记的GDM多肽。可通过多种手段来标记GDM多肽，包括碘化或包含位点特异性蛋白质激酶的识别位点。固定和温育后，将载玻片进行放射自显影分析。鉴定出阳性库并制备子库，并用相互作用的子库进行再次转染和再次筛选过程，最后产生编码推定受体的单个克隆。
作为受体鉴定的备选方法，可使经标记的GDM多肽与表达受体分子的细胞膜或提取物制剂进行光亲和性连接。通过PAGE解析交联物质并对X-射线胶片曝光。可切下包含受体的标记复合物，解离成肽片段，并进行蛋白质微量测序。从微量测序获得的氨基酸序列可用于设计一组简并寡核苷酸探针，用于筛选cDNA文库以鉴定编码推定受体的基因。
在用于拮抗剂的另一种测定法中，在存在候选化合物时将表达受体的哺乳动物细胞或膜制品与经过标记的GDM多肽一起温育。然后测量化合物增强或阻断此相互作用的能力。
潜在拮抗剂的更具体的例子包括结合免疫球蛋白与GDM多肽融合物的寡核苷酸，特别是抗体，包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体、和嵌合的或人源化形式的此类抗体或片段、以及人抗体和抗体片段。或者，潜在的拮抗剂可以是密切相关的蛋白质，例如突变形式的GDM多肽，其识别受体但没有功效并由此竞争性抑制GDM多肽的作用。
另一种潜在的GDM多肽拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中例如反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交并防止蛋白质翻译来起直接阻断mRNA翻译的作用。
潜在的拮抗剂包括结合GDM多肽的活性位点、受体结合位点、或生长因子或其它相关结合位点并由此阻断GDM多肽正常生物学活性的小分子。小分子的例子包括但不限于小肽或肽样分子(优选可溶性肽)和合成的非肽基有机或无机化合物。
核酶是能够催化对RNA的特异性切割的酶性RNA分子。通过与互补靶RNA发生序列特异性杂交，随后进行内切核酸水解切割，由此核酶起作用。可通过已知技术来鉴定潜在RNA靶物内的特定核酶切割位点。更多细节可参见例如Rossi，Current Biology，4：469-471(1994)，和PCT公开号WO 97/33551(公开于1997年9月18日)。
用于抑制转录的三螺旋形成中的核酸分子应当是单链的且由脱氧核苷酸组成。设计这些寡核苷酸的碱基组成，使得它通过Hoogsteen碱基配对规则促进三螺旋形成，这通常需要在双链体的一条链上有大段嘌呤或嘧啶。更多细节参见例如PCT公开号WO 97/33551(同上)。
这些小分子可通过上文讨论的一种或多种筛选测定法和/或通过本领域技术人员公知的任何其它筛选技术来鉴定。
提供下列实施例仅仅为了示例目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引用的所有专利和文献全文都纳入本文参考。
实施例
实施例1：
实验规程
肿瘤样品和患者特征
图8A中包括了所有研究的肿瘤病例的概要。为进行存活分析，分析了3个表达谱型数据集。我们得到了MDA的76个病例的冷冻组织样品、UCSF的39个病例的RNA(Nigro等，Cancer Res.65：1678-1686(2005)、及以前UCLA公开的研究的数据(Freije等，同上)。在前两个数据集中分析的病例达到以下标准：新鲜冷冻的样品得自患者(年龄＞21岁)最初外科切除时，所述患者以前没接受过放疗或化疗。至少在手术后2年内或直到死亡时都可获得临床跟踪信息。这些UCSF和MDA的追溯性实验室研究得到机构评估委员会/人受试者(Institutional Review Board/Human Subjects)的批准。根据WHO标准将病例分级成AA或GBM，并由神经病理学家(KA)检查所有组织切片来确保＞90％的样品表现出肿瘤。排除不常见的组织学变体。对于UCLA数据集，我们使用来自以前公开研究中所有病例的数据，其达到我们对患者年龄和微阵列质量控制参数的标准。该数据集包括少突神经胶质或混合形态的病例以及在少于2年时检查存活时间的病例。
正常成人脑组织由无脑肿瘤或神经学病症的捐献者的大脑皮层的尸检标本组成，其得自国家神经学研究脑库(Los Angeles，CA)。
为了比较肿瘤等级和签名类别(图2A)，我们包括了无法获得临床病历的其他样品标本。正常成人脑组织由无脑肿瘤或神经学病症病历的大脑皮层的尸检标本组成，其得自国家神经研究脑库(LosAngeles，CA)。除了脑和胎儿星形细胞的标本，图2B中分析的样品的数据通过订阅人样品的Affymetrix数据的Gene Logic(Gaithersburgh，MD)数据库而获得。
基因表达制谱、比较基因组杂交、和定量PCR
对于未包括在前面出版物(Freije等，同上；Nigro等，同上)中的标本，用Qiagen的RNA分离试剂盒依照制造商的规程从肿瘤和正常脑标本中提取总细胞RNA。通过过柱进行DNA酶消化步骤以除去基因组DNA污染。依照以前公开的技术(Tumor Analysis Best Practices Working，2004)，用AffymetrixU133A&B芯片进行表达制谱。质量控制参数如该出版物所述，只是样品对于肌动蛋白展示出＞3的3’/5’比率，倘若GAPDH的3’/5’比率为＜3的话。在ABIPrism7700序列检测仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上用Taqman PCRCore试剂(Applied Biosystems，Foster City，CA)对每个样品双份进行定量PCR。每50μl反应液中使用25ng总RNA。用Rab 14进行标准化，因为它在大量样品间的表达中几乎不显示出变化。设计所有引物对来产生67-79bp长的扩增子。如前所述进行DNA提取和阵列CGH。Misra等，Clin.Cancer Res.11(8)：2907-18(2005)。在通过CGH分析的96个样品中，43个样品的数据来自以前公开的研究(Nigro等，同上)。
微阵列数据分析
用来自微阵列分析套件版的信号强度值，所有微阵列数据分析的换算系数为500。应用Spotfire Decision Site软件7.3版，使用Pearson相关性作为相似性度量，进行K-均值群聚和会聚群聚(agglomerative clustering)。对每个基因，在群聚前将数据标准化成Z得分。用于肿瘤分类的35个签名基因代表了MDA存活样品集中3个肿瘤子集每一个的最强标志物。每个子集的标志物如下鉴定：基于与存活最强相关的108个基因表达的k-均值群聚，将76个样品中的每一个分配入三个组之一。应用1×10-4的p值截留，利用t检验来鉴定与其他亚类的肿瘤相比在每个亚类中的样品间差异表达的所有基因(参见表A，GDM)。然后对于每一项比较，我们通过倍数变化对具有最小p值的500个探针集进行等级排序。用作每种肿瘤亚型签名基因的探针集是那些对应于显示出最大的倍数变化且达到最小表达截留(感兴趣的组内平均强度为400)的所鉴定全长序列的探针。使用k-均值群聚进行的经验性测定揭示了使用30-60个探针集进行群聚时得到了稳定的样品簇，倘若能平衡用于群聚的基因列表使之包括3种肿瘤亚型之一的较少标志物。最终的35个签名基因包括15个PN、15个Mes、和5个Prolif标志物。针对PN、Prolif和Mes形心的相似性得分代表针对76个MDA存活样品k-均值群聚产生的每个形心的Pearson相关系数。为了图4F-I和图7中呈现的数据的统计学比较，通过为多组比较校正的t检验来分析对数转化的数据。也可用对数转化的表达数据对图5进行统计学分析。
原位杂交和免疫组化
用Promega的体外转录系统(Promega，Madison，WI)翻译出33P-UTP-标记的反义RNA探针，并用前述方法(Phillips等，Science 250：290-294(1990)与得自多种来源的、石蜡包埋的人神经胶质瘤组织微阵列杂交。图1所描绘的图片是得自Petagen公司的组织微阵列中包括的组织核心的。BCAN探针代表668bp片段(939至1606)，而CHI3L1/YKL40为1158bp片段(121至1278)。
如前所述(Simmons等，Cancer Res.61：1122-1128(2001)，在石蜡包埋的切片上进行免疫组化。一抗是来自Cell Signalling Technology(Beverly，MA)的抗-p-akt(ser473)和来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)的抗Notch。由不知道所分析标本的签名组的神经病理学家进行分级。
体外研究
用前述GBM细胞系进行体外研究(Hartmann等，Internat.J.Oncol.15：975-982(1999)。对于神经球培养物，如关于原代GBM标本所述的(Singh等，Nature 432396-401(2004)，在培养中维持用CD133珠正分选出的细胞。所有神经球培养物维持在含有N2补充物(Invitrogen)和NSF1(Cambrex)的神经基础培养基(Invitrogen)中。在存在时，加入20ng/ml浓度的EGF和FGF。在缺少EGF+FGF时，由不知道细胞系的分子签名的观测者为每种细胞系的神经球生长定级。定级尺度如下：0＝无存活的神经球，1＝缓慢扩大的神经球，2＝中等生长速率，3＝中等至快速生长，但其慢于用EGF+FGF所观察到的，4＝不由EGF+FGF加速的迅速生长。
在96孔板中用标准细胞培养条件，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中进行生长抑制测定法。对于雷帕霉素、LY294002、或γ分泌酶抑制剂GSI-1或S-2188的处理，将细胞以每孔1500或2000的细胞密度铺于96孔板中(第0天)，在第1天用药物处理，并在第4天用Alamar Blue读数评估存活性。在最少3个实验中评估每种处理条件，除了S-2188，其在两个测试中产生几乎相同的结果。图6显示的结果来自一个代表性实验。
结果
分子签名确定了高级星形细胞瘤的预后亚类
来自GBM(n＝55)和AA(n＝21)的新诊断病例的76个样品得自MDAnderson癌症中心(MDA)，并通过DNA微阵列制谱以鉴定基因表达模式，将肿瘤归入具有不同预后的组(图1A-C)。对当前研究中分析的这些和所有肿瘤病例进行的人口统计如图8A所述。我们首先鉴定其表达与存活最强相关的(对数转化的表达强度值与存活时间的Spearman r＞0.45或＜-0.45)探针集，接着双路汇聚群聚108个所得探针集和76个样品。该分析鉴定出样品集的3个离散组，它们在存活相关基因的表达中有显著差异(图1A)。
为了开发3种肿瘤亚类之每一种的一组标志物，我们鉴定与余下亚类中的肿瘤相比由每个亚组中的肿瘤最强过表达的探针集(参见表A：神经胶质瘤确定性标志物)。利用3个肿瘤亚集之每一个的最强标志物，我们推导出称为签名基因的35个基因的集合，其能在分级群聚(图1B)或k-均值群聚中用于将肿瘤分成亚类。通过k-均值群聚确定的肿瘤亚类命名为促神经(PN)、增殖性(Prolif)和间质(Mes)，以识别表征每个亚类的标志物基因列表的主要特征。对于每个肿瘤亚类，形心由35个签名基因的平均表达值计算得出(图1B)。可以将形心视为肿瘤亚型的原型表达模式，而且可基于它们的签名基因表达与这些形心的相似性来对其他样品分类。MDA数据集中的病例的Kaplan-Meier图显示，PN亚类的均值存活期(174.5周)显著长于Prolif(60.5)或Mes亚型(65.0周；图1C)的。
为了证明新肿瘤分类方案的预后值，我们检查了另外2个独立的数据集。一个数据集产生自在加州大学旧金山分校(UCSF)进行治疗的病例得到的AA和GBM样品集，而第二个验证数据集得自以前公开的关于在UCLA观察的星形细胞、少突神经胶质、和混合形态的III&IV级肿瘤病例的研究(Freije等，2004)。基于其签名基因表达与MDA数据集中确定的形心的相似性，将两个验证集中的肿瘤归入PN、Prolif、和Mes亚型。两个验证集中的肿瘤亚型的存活的Kaplan-Meier图显示出与最初数据集中观察到的模式非常相似的模式(图1D&E)。仅考虑GBM病例，观察到PN与其他类别间差别的预后值在MDA样品集中或在所有3个组合的数据集间有统计学显著性(p＜.05，对PN与其它类别的两项比较都进行t检验)。
我们接着通过微阵列和定量实时PCR比较所选的PN和Mes标志物的表达。我们从签名基因列表中分别选择了DLL3(δ样配体3)和CHI3L1/YKL40作为PN和Mes标志物，而从这两个相同的亚类的更广泛的标志物列表(表A)中分别选出了BCAN和CD44。如图1F&G所见，大多数神经胶质瘤样品显示出表达值高于PN标志物对或Mes标志物对的群体均值，但对于PN和Mes标志物组合则很少。
对独立的肿瘤病例集的原位杂交证实了BCAN和CHI3L1/YKL40mRNA互斥的表达模式(图1H)。大多数标本展示出BCAN或CHI3L1/YKL40的强信号，但不是这两个标志物二者。然而，一些标本确实在非交叠细胞元件中展示两个标志物之每一个的聚焦表达(focal expression)。最典型的是，在含宽BCAN阳性区的标本中，这些是具有CHI3L1/YKL40表达小焦点的标本。在这种情况中，CHI3L1/YKL40表达通常与血管相关。
PN、Prolif、和Mes签名确定了肿瘤等级和患者年龄有差异的肿瘤亚群
扩大我们的分析以包括总共256个高级神经胶质瘤(附表1)，我们观察到大多数肿瘤显示出与PN、Prolif或Mes任一形心的强相似性和与其它两个形心的中性的或负的相关性(图2A)。该发现由样品在图2A所示三维图中的三角形顶点处群聚的倾向反映出来。尽管一些样品显示出与两个形心的中度相似性，而很少有样品显示出与所有3个形心的弱的或中间的相似性。如此，大多数高级神经胶质瘤倾向于处于3种离散表型状态之一，但可能更少存在于两种状态的中间状态。
新确定的肿瘤亚类显示出与组织学肿瘤等级的强相关性。几乎所有检查的III级肿瘤标本(89％)都归入PN，无论它们是否展示出少突神经胶质或星形细胞形态。相反，有显著比例的IV级损伤(GBM)归入3种分子类别之每一个。在所检查的184个GBM样品中，32％是PN，20％是Prolif，和48％是Mes。
定量检查来自包括了GBM病例的MDA样品集的H&E染色切片，揭示了没有组织学特征能均一地区别肿瘤的分子亚类。仅有的其存在在统计学上与分子亚类相关的形态特征是肿瘤坏死，其在PN肿瘤中出现频率较低。在鉴定为PN的9个GBM病例中，4个缺少任何坏死区域。相反，22个Mes GBM中仅有2个(p＜.05，PN对Mes，Fischer氏精确检验)以及24个Prolif GBM中有0个(p＝0.005，PN对Prolif)没有展示出坏死。
同已经确立的肿瘤等级和存活时间二者与患者年龄的相关性一致，我们发现将肿瘤分成分子亚型的分配根据年龄将患者分层。在我们的存活分析中的185个新诊断病例中，具有PN亚类肿瘤的患者显著较那些具有Prolif或Mes亚类肿瘤的年轻(p＜.005，两项比较都进行t-检验)。具有PN、Prolif和Mes亚类肿瘤的患者的均值年龄+/-SEM分别为40.5+/-1.4岁、49.0+/-2.5岁、和50.7+/-1.3岁。对于GBM，Mes病例显著较PN的年老(p＜.05，t检验)，而Prolif病例与其他两类在年龄上无差异。
PN、Prolif、和Mes签名表征了不同正常组织集
为了洞悉PN、Prolif和Mes形心所代表的分子签名的生物学意义，我们检查了数种人组织和细胞类型中35个签名基因的表达。该分析揭示了，不同组织集类似于确定神经胶质瘤亚类的每一个形心(图2B)。胎儿和成人脑都与PN(促神经)形心有正相关性。在正常培养条件下，2种衍生自人胎儿脑的神经干细胞系也显示出PN签名(图2B)。展示出Mes(间质)签名的组织包括骨、滑膜、平滑肌、内皮细胞、和树突细胞。另外，培养的人胎儿星形细胞的样品展示出与Mes形心有清晰的正相关性。分离自外周血的造血干细胞和高增殖性细胞系Jurkat都与Prolif形心有强相关性。有趣的是，在响应治疗和停用神经营养因子BDNF时，这两种神经干细胞系的签名亚类从PN转变为Mes类别(图2B)。
在复发时，肿瘤倾向于向Mes表型转变
为了确定限定肿瘤亚类的分子签名是否对每个肿瘤病例都是一项固定特征或是否可以随治疗功能或疾病进程而改变，我们比较了代表相同患者的原发性和复发性星形细胞瘤的26对匹配标本的表达签名。所有26个原发性和复发性样品对中签名的均值变化对应于0.18+/-0.06(Pearson r均值变化+/-SEM)的PN形心相似性的丧失、0.20+/-0.09的Mes形心相似性的获得、和Prolif形心相似性的很小改变(获得0.02+/-0.08)。26个病例中的18个以相同的分子亚类引发和复发，而8个肿瘤在复发时改变了类别(图2C)。在这8个表型类别改变的病例中，除了一个之外的其他全部都转变成Mes亚类；3个病例由PN转变成Mes亚型，而4个从Prolif转变成Mes表型。最后一例类别转变是由中度Mes相似性转变成中度Prolif相似性的病例。
使用成对分析，微阵列显著性分析(SAM)鉴定出在转变成Mes亚类的复发性肿瘤中显著上调的基因(图2D)。上调的基因包括CHI3L1/YKL-40、CD44、和STAT3，即以前牵涉GBM生物学的基因以及波形蛋白(VIM)，即间质组织的经典标志物(Eibl等，J.Neuro-Oncol.26：165-170(1995)；Nigro等，同上；Nutt等，Cancer Res.63：1602-1607(2005)；Rahaman等，Oncogene 21：8404-8413(2002)；Tanwar等，Cancer Res.62：4364-4368(2002))。据报道，CHI3L1/YKL-40能预测人肿瘤中的放射性抗性(Pelloski等，Clin.Cancer Res.11：3326-3334(2005))并能延长体外照射后的产克隆存活(clonogenic survival)(Nigro等，同上)，该发现与治疗后肿瘤复发时表达的相对增加一致。没有发现在转变成Mes类别的病例中显著下调的基因。
对来自复发时从PN转变掉的病例的组织进行的免疫组化表明频繁缺失显著的核OLIG2表达并上调CHI3L1/YKL-40。在图3所示的例子中，显示出OLIG2(据以前的报道与低级损伤优先相关的一种PN标志物)(Ligon等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.63：499-509(2004))的显著核表达的PN肿瘤展示出复发时相对缺失OLIG2表达。正常脑在少突神经胶质中仅展示出低水平染色，这表明阵列数据中PN肿瘤的这种标志物的上调并未组织加工期间正常脑污染的表现。相反，尽管CHI3L1/YKL-40(Mes的标志物)仅在原发性样品的极少肿瘤细胞中表达，但是在复发时见到丰富的表达。在所有检查到在复发时有Mes转变的肿瘤中观察到了这种相对表达的变化。
不良预后的肿瘤亚型通过增殖或血管发生标志物来区分
限定了肿瘤的预后亚类后，我们试图鉴定对疾病攻击性差异有作用的生物学方面。为了检查肿瘤亚类的表型，我们从我们的存活分析中选出显示出与用于分类的形心有强相似性的星形细胞瘤病例集(每种亚型的n＝12)。我们在我们的比较中包括了8份正常脑组织样品。在检查增殖标志物时，我们发现与PN或Mes肿瘤相比，增殖中细胞核抗原(PCNA)和拓扑异构酶IIα(TOP2A)都在Prolif肿瘤中显著过表达(图3A)。Mes肿瘤在缺少高速率细胞分裂时表现出攻击性表型的一种可能机制是通过血管发生。如图3B所示，Mes肿瘤展示出血管内皮生长因子(VEGF)、flt1或VEGF受体1(VEGFR1)、kdr或VEGF受体2(VEGFR2)、和内皮标志物PECAM1的过表达。
不良预后的肿瘤亚型表达神经干和/或移行扩增细胞的标志物，而较好预后的肿瘤表达成神经细胞或神经元的标志物
签名基因集中的一些PN标志物(诸如NCAM、GABBR1和SNAP91)与神经元相关。根据近来的发现，即GBM的肿瘤产生性细胞表达神经干细胞标志物CD133(Singh等，Nature 432：396-401(2004))，我们试图比较神经干细胞标志物与定型(committed)神经元谱系标志物的表达(图3C-E)。对于我们的分析，我们选择了与成人前脑神经发生相关的标志物(Abrous等，Physiol.Rev.85：523-569(2005)；Anton等，Nature Neurosci.7：1319-1328(2004)；Nakano等，J.Cell Biol.170：413(2005)；Shi等，Nature 427：78-83(2004))。对于神经干细胞或多能移行扩增细胞的6个标志物中的5个，我们发现了不良预后的肿瘤亚类中的一种或全部两种与PN肿瘤相比显示出表达升高了(图3C)。发现波形蛋白(VIM)、nestin(NES)、TLX、CD133、和MELK中有这种差异。虽然DLX2(移行扩增细胞的标志物)不在肿瘤组间显示出统计学上显著差异，但是一些Prolif肿瘤显示出该基因的强表达。相反，与Prolif和/或Mes肿瘤相比，干细胞标志物、成神经细胞或发育中的神经元的标志物在PN肿瘤中过表达(图3D)。这些标志物包括OLIG2、MAP2、DCX、ENC1(NeuN)、ERBB4、和GAD2。PN肿瘤中神经元标志物的表达不能通过肿瘤标本被正常脑污染来说明，因为与正常脑标本相比，OLIG2、DCX、NeuN、和GAD2的表达水平在肿瘤中升高了(数据未显示，所有t检验比较肿瘤与正常得到p＜.005，未因多重比较而校正)。与Prolif肿瘤相比，GFAP(神经干细胞和星形细胞二者的标志物)在Mes和PN亚类肿瘤中都更强地表达(图3E)。
chr 10上的缺失和chr 7上的获得与Prolif和Mes肿瘤亚型相关
在通过表达制谱检查的病例中，96个AA和GBM标本的DNA可用于通过阵列比较性基因组杂交(CGH)来分析。对肿瘤在chr 1、7、10和19上拷贝数的变化进行评分。对肿瘤在chr 1、7、10和19上相对拷贝数的变化进行评分。大多数样品证明在chr 7上有增加并在chr 10上有缺失(图4A)。在检查chr 10上的缺失时，我们发现肿瘤亚类间这些基因组变化频率有令人震惊的差异(图4A)。虽然大多数Prolif和Mes肿瘤在chr 10上有跨越10q23.3的缺失(分别为78％和84％)，但是少数(20％)PN肿瘤亚类在chr 10上显示有缺失。对于Mes肿瘤，大多数病例缺失了chr 10上几乎所有的基因座，而仅有两个病例的缺失局限于10q。相反，Prolif肿瘤在Chr 10上有更异质的缺失。预后签名与Chr10状态间的相关性是高度显著的(p＜.0001，Fisher氏精确检验)。肿瘤签名与相对拷贝数变化之间相似但较不强的相关性是在chr 7或19q上的(图4A，对chr7和19q进行Fisher氏精确检验，p＜.01)，而不是在chr 1p或1q上的(p＞.05)。
考虑到相对基因组拷贝数变化与肿瘤亚型间的相关性，我们试图确定限定每种肿瘤亚型的基因是否对染色体位置有偏好。对肿瘤亚类标志物的扩大表(表A)的卡方分析揭示，对于3个列表中的每一个，观察到的染色体位置频率与表达阵列上所有探针集的位置频率所期望的有显著差异(对于PN，p＜1×10-14；对于Prolif，p＜.001；对于Mes，p＜.0005)。PN和Mes标志物列表分别过多地代表了chr10和19上的标志物(对72项比较的Bonferroni校正后，两组比较都P＜.05)。这些发现确证了肿瘤亚型之间在chr 10和19q上的相对DNA拷贝数变化方面的差异。
Notch和akt途径在具有良好的和不良的预后的肿瘤亚类中差异活化
同chr10缺失与肿瘤亚类的相关性一致，对涵盖PTEN基因座的BAC克隆的阵列CGH数据进行的直接检查证实了高百分比的Prolif和Mes病例展示出PTEN基因座的缺失。在PTEN基因座的缺失同与PN形心的相似性之间观察到负相关性(图5A)。大多数基因座得到增加或扩增的病例是Prolif或Mes亚类的肿瘤，而且在EGFR拷贝数增加同与PN形心的相似性之间观察到负相关性(图5B)。在对应于akt1、akt2、或akt3的基因座没有观察到明显的扩增或删除，PI3K催化亚基也是如此(未显示)。少数样品证实PIK3R3(PI3K的调控亚基)拷贝数增加，而且该基因座的CGH比率同与Prolif签名的相似性正相关(图5C)。
由于我们的结果表明在akt途径活化与肿瘤亚型之间有强相关性，因此我们比较了肿瘤亚型中PTEN mRNA表达和磷酸-akt(p-akt)免疫组化。我们发现与PN肿瘤相比，Prolif和Mes肿瘤表达约低2倍的PTEN mRNA和更强的p-akt(ser473)(图4E；图4J)。结果是高度显著的(PN与其他亚型的t检验，对于PTEN mRNA，p＜5×10-5；对于p-akt免疫组化，p＜5×10-8)。PTEN结果在第二个独立的样品集中得从了确认(数据未显示)。
在检查MDA样品集中PN肿瘤标志物的完整列表时，我们发现与Notch途径元件DLL3、DLL1、HEY2和ASCL1对应的探针集达到了我们对PN肿瘤标志物的标准(图5E-H)。这些基因被证实在两个验证数据集的PN肿瘤中都显著过表达。这4个Notch途径元件之每一个都牵涉前脑神经发生(Campos等，J.Neurosci.Res.64：590-598(2001)；Casarosa等，Development 126：525-534(1999)；Sakamoto等，J.Biol.Chem.278：44808-44815(2003))，而且近来将ASCL1与成人前脑中神经元和少突神经胶质二者的说明(specification)联系起来(Parras等，EMBO Journal，23(22)：4495-505(2004))。微阵列数据未显示出在PN肿瘤中上调的Notch途径元件包括Notch 1-4、Jagged 1&2、Hes 1、2、4、6、7(未显示)。HEY1显示出在MDA PN肿瘤中有小但显著的上调(1.4FC，p＝5×10-5)。
为了检查Notch信号传导活化的直接证据，我们使用可用的石蜡包埋切片进行了所有MDA病例中核Notch-免疫反应性的双盲评估。阳性病例与阴性病例相比在核中显示“泛红”，这表明完全没有核染色。图4K展示了每种肿瘤亚型在Notch核染色方面评级为0、1、或2的频率。尽管阳性病例显示出相对较弱的信号，但是PN样品的评级被证明显著高于Prolif(p＜.005，t检验)或Mes(p＜.001，t检验)亚类的那些。
DLL3和PTEN表达的双基因模型预测高级星形细胞瘤的存活
由于我们的数据表明Notch和akt途径在肿瘤攻击性中的作用，因此我们寻找途径标志物表达与存活间直接相关性的证据。对于此分析，在mRNA足够可用的条件下(n＝65)，我们通过MDA存活集中所有样品的数据进行了评估，定量PCR数据评估PTEN mRNA，而微阵列数据评估DLL3mRNA。比例危险度(proportional hazard)的Cox模型揭示了PTEN和DLL3mRNA水平及其统计学相互作用都与高级星形细胞瘤的存活相关，并结合而形成了高度显著的预测模型(与有3个自由度的卡方参照分布相比，似然比检验(LikelihoodRatio Test)结果为21.6，p＜.0001)。图5A所示的预测存活函数(function)证明了，PTEN mRNA值低的样品与不良存活功能相关，不管DLL3表达水平如何。对于PTEN表达高的样品，观察到估计的存活作为DLL3的函数而变化，使得PTEN和DLL3mRNA水平都高的样品显示出最好的结果。接着我们用最小的(n＝34)III&IV级星形细胞瘤的独立集拟合相同的模型。预测的存活曲线与由MDA样品集得到的那些惊人的相似(图5B)，表明该双基因模型很坚实(图6B)。
GBM细胞系的表达签名预测EGF/FGF非依赖性神经球生长和对akt途径抑制的敏感性
为了检查肿瘤分子亚型的潜在治疗意义，我们检查了神经胶质瘤细胞系的体外应答，作为其签名基因表达的功能(function)。我们对16个GBM细胞系进行了mRNA表达制谱，调查了它们在存在或缺乏EGF+FGF时产生神经球的能力，并评估了它们对影响Notch和Akt信号传导的试剂的应答。所有16个系都与PN形心负相关，但显示出与Mes形心有广泛的相似性。虽然16个细胞系中的15个产生了能在EGF+FGF中增殖的神经球，但是它们产生能在缺乏EGF+FGF时生长的神经球的能力有所不同(图6A)，而且似乎与亲本细胞系的表达签名相关(图6B)。最惊人的是，我们发现与Mes形心负相关的两个细胞系(G112和G122)产生了能在缺乏EGF+FGF时迅速生长的神经球(图6B)，尽管与Mes形心强相关的细胞系没能产生能在缺乏EGF+FGF时迅速增殖的神经球(图7B)。
图8A&B展示了主要发现的概要，包括肿瘤亚型与与前脑神经发育阶段之间的平行。
实施例2：微阵列分析以检测癌性神经胶质瘤肿瘤中GDM多肽的上调
常常包含数以千计的基因序列的核酸微阵列可用于鉴定患病组织相对于其正常对应物中差异表达的基因。使用核酸微阵列，要将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录并标记以产生cDNA探针。然后，将cDNA探针与固定在固相支持物上的核酸阵列杂交。设置阵列使得阵列各成员的序列和位置是已知的。例如，可选择已知在某些疾病状态中表达的基因，排列到固相支持物上。标记探针与特定阵列成员的杂交表明衍生出该探针的样品表达该基因。若来自测试(疾病组织)样品的探针的杂交信号大于来自对照(正常组织)样品的探针的杂交信号，则鉴定出在疾病组织中过表达的一种或多种基因。此结果的意义是，在患病组织中过表达的蛋白质不仅可用作疾病状况存在的诊断标志物，而且可用作治疗疾病状况的治疗靶。
核酸杂交和微阵列技术的方法是本领域众所周知的。在本实施例中，用于杂交的核酸和探针的具体制备、载玻片和杂交条件都详细描述于2001年3月3O日提交的PCT专利申请号PCT/US01/10482，其纳入本文参考。
实施例3：GDM mRNA表达的定量分析
在此测定法中，使用5′核酸酶测定法(例如
)和实时定量PCR(例如ABI Prizm 7700Sequence Detection
(Perkin Elmer，AppliedBiosystems Division，Foster City，CA))来寻找在一种或多种癌性神经胶质瘤肿瘤中相对于其它癌性肿瘤或正常非癌性组织显著过表达的基因。5′核酸酶测定法反应是一种基于荧光PCR的技术，它利用Taq DNA聚合酶的5′外切核酸酶活性来实时监测基因表达。使用两种寡核苷酸引物(其序列基于感兴趣的基因或EST序列)来产生扩增子，典型的是PCR反应的。设计第三种寡核苷酸或探针来检测位于两种PCR引物之间的核苷酸序列。该探针不能由Taq DNA聚合酶延伸，且标记有报道荧光染料和淬灭荧光染料。当这两种染料如同它们在探针上一样位置靠近在一起时，任何激光诱发的来自报道染料的发射将被淬灭染料淬灭。在PCR扩增反应过程中，Taq DNA聚合酶以模板依赖性方式切割探针。所得的探针片段在溶液中解离，而来自所释放报道染料的信号不受第二荧光团淬灭的作用。每个新分子合成就释放一分子的报道染料，而对未淬灭报道染料的检测为数据定性和定量解释提供了基础。该测定法是公知的并常规地用于定量鉴定2个不同人组织样品间的基因表达差异，参见例如Higuchi等，Biotechnology 10：413-417(1992)；Livak等，PCRMethods Appl.，4：357-362(1995)；Heid等，Genome Res.6：986-994(1996)；Pennica等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(25)：14717-14722(1998)；Pitti等，Nature 396(6712)：699-703(1998)和Bieche等，Int.J.Cancer 78：661-666(1998)。
5*核酸酶规程可在实时定量PCR装置(诸如ABI Prism 7700TM SequenceDetection)上进行。该系统由热循环仪、激光、电荷耦合器件(CCD)照相机和计算机组成。该系统在热循环仪上以96孔形式扩增样品。在扩增过程中，通过针对所有96个孔的光导纤维电缆实时收集激光诱导的荧光信号，并在CCD上检测。该系统包括用于运行设备和用于分析数据的软件。
用于筛选的起始材料是从多种不同癌性组织中分离的mRNA。对mRNA进行精确定量，例如通过荧光测定法。作为阴性对照，从与所测癌性组织相同的组织类型的多种正常组织中分离RNA。通常，肿瘤样品直接与相同组织类型“匹配”的正常样品比较，相同组织类型指肿瘤和正常样品得自相同个体。
5′核酸酶测试数据最初表示为Ct或循环阈值。这定义为报道信号积累到高于背景荧光水平的循环。使用ΔCt值作为比较癌症mRNA结果和正常人mRNA结果时核酸样品中特定靶序列相对起始拷贝数的定量度量。由于一个Ct单位相当于1轮PCR循环或相对于正常的大约2倍的相对增加量，因此两个单位相当于4倍相对增加量，3个单位相当于8倍相对增加量，依此类推，人们可定性并定量测量两种或更多不同组织间mRNA表达的相对增加倍数。在这方面，本领域广泛接受的是该测定法技术上足够灵敏而能可重复地检测人肿瘤样品相对于正常对照的至少2倍mRNA表达增加量。
实施例4：原位杂交
原位杂交是用于细胞或组织制品中核酸序列检测和定位的有力且通用的技术。例如，它可用于鉴定基因表达的部位，分析转录的组织分布，鉴定和定位病毒感染，跟踪特定mRNA合成的变化及辅助染色体作图。
原位杂交遵照Lu和Gillett，Cell Vision 1：169-176(1994)方案的优化版利用PCR生成的33P标记RNA探针来进行。简而言之，将福尔马林固定、石蜡包埋的人组织切片，脱石蜡，在蛋白酶K(20g/ml)中于37℃除蛋白质15分钟，并如Lu和Gillett(同上)所述进一步处理以进行原位杂交。从PCR产物生成33P-UTP标记的反义RNA探针，并于55℃杂交过夜。将载玻片浸入KodakNTB2核迹乳液中并曝光4周。
33P-RNA探针的合成
将6.0μl(125mCi)33P-UTP(Amersham BF 1002，SA＜2000Ci/mmol)快速真空干燥。向含干燥33P-UTP的每个管中加入以下成分：
2.0μl 5x转录缓冲液
1.0μl DTT(100mM)
2.0μl NTP混合物(2.5mM：10μl各种10mM GTP、CTP&ATP+10μl H2O)
1.0μl UTP(50μM)
1.0μl Rnasin
1.0μl DNA模板(1μg)
1.0μl H2O
1.0μl RNA聚合酶(对于PCR产物，通常是T3＝AS、T7＝S)
将管于37℃温育1小时。加入1.0μl RQ1DNA酶，然后于37℃温育15分钟。加入90μl TE(10mM Tris pH 7.6/1mM EDTA pH 8.0)，将混合液转移到DE81纸上。将剩余溶液加到Microcon-50超滤单元中，用程序10旋转(6分钟)。将过滤单元倒置在第二个管上，并用程序2旋转(3分钟)。在最后的回收旋转后，加入100μl TE。将1μl终产物转移到DE81纸上，并在6ml Biofluor II中计数。
将探针在TBE/尿素凝胶上电泳。将1-3μl探针或5μl RNAMrk III加到3μl上样缓冲液中。在95℃加热板上加热3分钟后，将探针立即置于冰上。冲洗凝胶孔，加入样品，并以180-250伏特电泳45分钟。将凝胶包裹在莎纶包装纸中，并在-70℃冷柜中用增光屏对XAR胶片曝光1小时至过夜。
33P-杂交
A.冷冻切片的预处理
从冷柜中取出载玻片，放在铝盘上，并于室温融化5分钟。将盘在55℃温箱中放置5分钟以减少收缩。在通风橱中的冰上将载波片在4％多聚甲醛中固定10分钟，并在0.5x SSC(25ml 20x SSC+975ml SQ H2O)中于室温清洗5分钟。在0.5μg/ml蛋白酶K(12.5μl 10mg/ml储存液溶+250ml预热的无RNA酶的RNA酶缓冲液)中于37℃除蛋白质10分钟后，将切片在0.5x SSC中于室温清洗10分钟。将切片在70％、95％、100％乙醇中脱水，每次2分钟。
B.石蜡包埋切片的预处理
将载玻片脱石蜡，放置在SQ H2O中并在2x SSC中于室温漂洗两次，每次5分钟。切片在20μg/ml蛋白酶K(500μl 10mg/ml+250ml无RNA酶的RNA酶缓冲液中，37℃，15分钟)-人胚胎或8x蛋白酶K(100μl+250ml RNA酶缓冲液中，37℃，30分钟)-福尔马林组织中除蛋白质。随后在0.5xSSC中漂洗，并如上所述进行脱水。
C.预杂交
将载玻片放置在衬有用Box缓冲液(4xSSC、50％甲酰胺)饱和的滤纸的塑料盒中。
D.杂交
将每个载玻片1.0×106cpm探针和1.0μl tRNA(50mg/ml储存液)于95℃加热3分钟。将载玻片在冰上冷却，每个载玻片添加48μl杂交缓冲液。漩涡振荡后，向载玻片上的50μl预杂交液添加50μl 33p混合液。将载玻片于55℃温育过夜。
E.洗涤
用2xSSC、EDTA(400ml 20x SSC+16ml 0.25M EDTA、Vf＝4L)于室温进行2×10分钟的洗涤，随后于37℃用RNA酶A(500μl 10mg/ml+250ml RNA酶缓冲液＝20μg/ml)处理30分钟。将载玻片用2xSSC、EDTA于室温洗涤2×10分钟。严格洗涤条件可以如下：55℃2小时，0.1xSSC、EDTA (20ml 20xSSC+16ml EDTA、Vf＝4L)。
F.寡核苷酸
对本文所公开的多种DNA序列进行原位分析。获取这些分析中所用的寡核苷酸，使其与附图所示的核酸(或其互补序列)互补。
实施例5：结合GDM的抗体的制备
制备单克隆抗体的技术是本领域已知的，而且例如Goding(同上)所述的。可利用的免疫原包括纯化的GDM多肽、含GDM多肽的融合蛋白、和在细胞表面表达重组GDM多肽的细胞。技术人员无需过多实验就能选择出免疫原。
使用完全弗氏佐剂乳化的以上免疫原以1-100微克的量皮下或腹膜内注射，来免疫小鼠(诸如Balb/c)。或者，将免疫原在MPL-TDM佐剂(RibiImmunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化并注射到动物的后爪垫中。然后，10至12天后用在选定佐剂中乳化的额外免疫原强化已免疫的小鼠。此后，还可用额外的免疫原注射强化免疫小鼠，可持续数周。可通过眼窝后放血从小鼠中获取血清样品，用于在ELISA测定法中检测抗GDM抗体。
在检测到合适的抗体滴度后，对抗体呈“阳性”的动物可用GDM多肽静脉注射进行最后的注射。3至4天后，处死小鼠并收获脾细胞。然后，(使用35％聚乙二醇)将脾细胞与选定的鼠骨髓瘤细胞系(诸如P3X63AgU.1，可从ATCCNo.CRL 1597获取)融合。然后，将融合产生的杂交瘤细胞铺到96孔组织培养板中，其中含有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培养基以抑制未融合细胞、骨髓瘤杂合体和脾细胞杂合体的增殖。
在ELISA中对杂交瘤细胞筛选针对GDM的反应性。分泌所期望的抗GDM单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞的确定是在本领域技术范围内的。
阳性杂交瘤细胞可腹膜内注射到同系基因Balb/c小鼠中以生成含有抗GDM单克隆抗体的腹水。或者，可在组织培养瓶或摇瓶中培养杂交瘤细胞。腹水中生成的单克隆抗体的纯化可使用硫酸胺沉淀继以凝胶排阻层析来完成。或者，可采用基于抗体与蛋白A或蛋白G结合的亲和层析。
实施例6：偶联有毒素的、结合GDM的抗体的制备
在癌症的治疗中使用抗体-药物偶联物(ADC)(即免疫偶联物)局部递送细胞毒性或细胞抑制性试剂(即杀死或抑制肿瘤细胞的药物)(Payne(2003)Cancer Cell 3：207-212；Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drug Del.Rev.26：151-172；US 4,975,278)，容许将药物模块靶向递送至肿瘤并在那里在细胞内积聚，其中全身给药这些未偶联的药剂可在对要试图消除的肿瘤细胞造成毒性的同时对正常细胞也造成无法接受的毒性水平(Baldwin等，(1986)Lancet(Mar.15，1986)pp.603-05；Thorpe，(1985)″Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentsIn Cancer Therapy：A Review″，于Monoclonal Antibodies‘84：Biological AndClinical Applications，Pinchera等(编)，pp.475-506)。由此获得最大功效而毒性最小。设计并精制ADC的努力集中于单克隆抗体(mAb)以及药物连接和药物释放性质的选择性。多克隆抗体和单克隆抗体据报道都可用于这些策略(Rowland等，(1986)Cancer Immunol.Immunother.，21：183-87)。这些方法中所用的药物包括道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、和长春地辛(Rowland等，(1986)同上)。抗体-毒素偶联物中所用的毒素包括细菌毒素(诸如白喉毒素)、植物毒素(诸如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素(诸如格尔德霉素(Mandler等(2000)J.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic &Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)、美登木素生物碱(EP 1391213；Liu等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)、和加利车霉素(Lode等(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等(1993)Cancer Res.53：3336-3342))。
通过连接毒素与纯化的抗体来制备抗体-药物偶联物的技术是本领域公知并常规使用的。例如，纯化的单克隆抗体与毒素DM1的偶联可如下完成。纯化的抗体用N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)-戊酸酯衍生化以导入二硫代吡啶基。用SPP(5.3摩尔当量，其溶于2.3ml乙醇)处理溶于44.7ml含NaCl(50mM)和EDTA(1mM)的50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)中的抗体(376.0mg，8mg/mL)。在氩气中于环境温度温育90分钟，通过用35mM柠檬酸钠、154mMNaCl和2mM EDTA平衡的Sephadex G25柱，凝胶过滤反应混合物。然后合并含抗体的级分并测试。用以上35mM柠檬酸缓冲液(pH 6.5)将抗体-SPP-Py(337.0mg，含有可释放的2-硫代吡啶基团)稀释至2.5mg/ml的终浓度。然后将含DM1(1.7当量，16.1摩尔)的3.0mM二甲基乙酰胺(DMA，在最终反应混合物中为3％v/v)加入到抗体溶液中。使反应在环境温度下在氩气中进行20小时。将反应液上样于用35mM柠檬酸钠、154mM NaCl(pH 6.5)平衡的Sephacryl S300凝胶过滤柱(5.0cm×90.0cm，1.77L)。流速是5.0ml/分钟并收集65个级分(每个20.0ml)。合并级分并测试，其中每个抗体分子连接的DM1药物分子数(p′)通过测量252nm和280nm处的吸光度来确定。
作为示例，纯化的单克隆抗体与毒素DM1的偶联也可如下完成。纯化的抗体用琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC，PierceBiotechnology，Inc)衍生化以导入SMCC接头。20mg/ml的抗体在50mM磷酸钾/50mM氯化钠/2mM EDTA(pH 6.5)中用7.5摩尔当量的SMCC(20mM，溶于DMSO中，6.7mg/mL)处理。在氩气中在环境温度搅动2小时后，反应混合物通过用50mM磷酸钾/50mM氯化钠/2mM EDTA(pH 6.5)平衡的SephadexG25柱过滤。合并并测试含抗体的级分。然后，抗体-SMCC用50mM磷酸钾/50mM氯化钠/2mM EDTA(pH 6.5)稀释至终浓度10mg/mL，并在二甲基乙酰胺中与10mM DM1的溶液(1.7当量，设定为5个SMCC/抗体，7.37mg/ml)反应。在环境温度在氩气中搅拌反应16.5小时。然后，偶联反应混合物用1xPBS于pH 6.5通过Sephadex G25凝胶过滤柱(1.5×4.9cm)过滤。然后通过252nm和280nm处的吸光度测量DM1/抗体比(p)。
细胞毒性药物通常通过抗体上常见的大量赖氨酸残基来与抗体偶联。通过感兴趣的抗体中存在的或经改造导入的巯基也能进行偶联。例如，通过遗传工程技术将半胱氨酸残基导入蛋白质，从而形成配体的共价附着位点(Better等(1994)J.Biol.Chem.13：9644-9650；Bernhard等(1994)Bioconjugate Chem.5：126-132；Greenwood等(1994)Therapeutic Immunology1：247-255；Tu等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：4862-4867；Kanno等(2000)J.of Biotechnology，76：207-214；Chmura等(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 98(15)：8480-8484；美国专利No.6,248,564)。一旦游离的半胱氨酸存在于感兴趣的抗体中，则毒素可连接至该位点。例如，溶于DMSO中药物接头试剂(马来酰亚胺癸酰基-单甲基auristatin E(MMAE)即MC-MMAE、马来酰亚胺己酰基-单甲基auristatin F(MMAF)即MC-MMAF、MC-val-cit-PAB-MMAE或MC-val-cit-PAB-MMAF)以已知浓度在乙腈和水中稀释，并添加至磷酸缓冲盐液(PBS)中冷的半胱氨酸衍生化抗体。约1小时后，添加过量的马来酰亚胺以淬灭反应并封闭任何未反应的抗体巯基。通过离心超滤来浓缩反应混合物，纯化偶联有毒素的抗体，并通过G25树脂用PBS洗脱来脱盐，在无菌条件下通过0.2μm滤膜过滤，并冷冻保存。
而且，所选择的抗体上的游离半胱氨酸用双马来酰亚胺试剂BM(PEO)4(Pierce Chemical)来修饰，在抗体表面上留下未反应的马来酰亚胺基团。这可通过如下规程来完成：将BM(PEO)4溶于50％乙醇/水混合物至浓度10mM并以10倍摩尔过量添加至浓度为1.6mg/ml(10微摩尔)的抗体在磷酸缓冲盐液中的溶液，使之反应1小时。通过用含150mM NaCl的30mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6)凝胶过滤除去过量的BM(PEO)4。将约10倍摩尔过量的DM1溶于二甲基乙酰胺(DMA)，并添加至抗体-BMPEO中间体。也可用二甲基甲酰胺(DMF)来溶解药物模块试剂。让反应混合物反应过夜，然后凝胶过滤或在PBS中透析以去除未反应的药物。用PBS在S200柱上凝胶过滤来去除高分子量的聚集体，并获得纯化的抗体-BMPEO-DM1偶联物。
实施例7-体外细胞杀伤测定法
表达感兴趣的GDM多肽的哺乳动物细胞可使用标准表达载体和克隆技术获得。或者，表达感兴趣的GDM多肽的许多肿瘤细胞系是公众可获得的，例如通过ATCC获得，而且可使用标准ELISA或FACS分析进行常规鉴定。然后可将抗GDM多肽的单克隆抗体(及其偶联有毒素的衍生物)用于测定法，以确定抗体在体外杀伤表达GDM多肽的细胞的能力。
特别对于本发明，在其细胞表面上稳定表达GDM多肽的PC3衍生细胞系(本文中称为PC3-gD-MDP)可用标准技术进行改造，而且可用标准FACS细胞分选、ELISA和免疫组化分析来确认PC3-gD-MDP细胞的GDM多肽表达。MMAE偶联的抗GDM单克隆抗体对相应表达GDM的细胞的致死能力可利用体外细胞杀伤测定法来确定，其使用以下方案(Promega Corp.TechnicalBulletin TB288；Mendoza等(2002)Cancer Res.62：5485-5488)：
1.将生长培养基中含约104个细胞(PC3-gD-MDP细胞或未转染的不表达GDM的PC3细胞)的细胞培养物的50μl等分试样置于96孔不透明壁平板的每个孔中。其他对照孔中含有50μl生长培养基而没有细胞。
2.GDM-MMAE偶联抗体、或不结合GDM的MMAE偶联对照单克隆抗体以50μl并以0.0001至100μg/ml范围的各种浓度加入到每个孔中，将平板于37℃和5％CO2温育3-5天。
3.将平板平衡至室温约30分钟。
4.添加与每个孔中细胞培养基等体积的Promega Corp.的CellTiter-Glo发光细胞存活试剂，并将平板在轨道振荡器上震荡2分钟以诱导细胞裂解。
5.于室温温育平板10分钟以稳定发光信号。
6.在光度计上用Tropix Winglow程序记录发光并报告成RLU＝相对发光单位。
上述测定法所得的结果证明，GDM-MMAE抗体能够以抗体依赖性形式诱导表达相应GDM多肽的细胞死亡。即，GDM-MMAE和MMAE偶联对照在抗体浓度1μg/ml及以下时都不诱导未转染的PC3细胞死亡。在抗体浓度高于1μg/ml时，未转染的PC3细胞的死亡量以抗体依赖性方式随着抗体浓度线形增加。因此看来，高于1μg/ml抗体浓度时的未转染的PC3细胞的死亡是反应混合物中存在的MMAE毒素水平升高的非特异性结果，而且不是所用抗体的结合特异性的功能。
可是对于稳定表达GDM多肽的PC3-gD-MDP细胞，MMAE偶联对照以与该抗体杀伤未转染的PC3细胞相同的形式诱导细胞死亡，而GDM-MMAE以低于该水平(例如低至0.001μg/ml)的抗体浓度诱导出显著的细胞杀伤。事实上，在1μg/ml的抗体浓度时(其中非GDM特异性MMAE偶联对照抗体不显示出显著的细胞杀伤)，GDM-MMAE杀伤几乎所有PC3-gD-MDP细胞。由此，这些数据证明GDM特异性单克隆抗体结合GDM多肽，因为它在细胞表面表达，并能诱导那些它所结合的细胞死亡。
实施例8：体内肿瘤细胞杀伤测定法
为了测试偶联有毒素或未偶联毒素的抗GDM多肽的单克隆抗体诱导体内肿瘤细胞死亡的功效，可采用以下方案。
将5×106个表达GDM多肽的肿瘤促进细胞皮下接种到一组无胸腺裸鼠的体侧。当肿瘤达到平均肿瘤体积100-200mm3时，将小鼠等分成5组并如下处理：
组1-每周一次施用PBS对照媒介，持续4周；
组2-每周一次以1mg/kg施用非特异性对照抗体，持续4周；
组3-每周一次以3mg/kg施用非特异性对照抗体，持续4周；
组4-每周一次以1mg/kg施用特异性抗GDM多肽抗体，持续4周；
组5-每周一次以3mg/kg施用特异性抗GDM多肽抗体，持续4周。
然后以定期间隔测定每个处理组中小鼠的平均肿瘤体积并确定抗体功效。
实施例9：GDM作为杂交探针的应用
以下方法描述了编码GDM多肽的核苷酸序列作为杂交探针的用途，即用于诊断哺乳动物中肿瘤存在。
包含本文所公开的全长或成熟GDM多肽的编码序列的DNA也可作为探针用于筛选人组织cDNA文库或人组织基因组文库中的同源DNA(诸如那些编码GDM的天然存在变体的DNA)。
含任一种文库DNA的滤膜在以下高严格条件下进行杂交和清洗。放射性标记的GDM衍生探针与滤膜的杂交在50％甲酰胺、5xSSC、0.1％SDS、0.1％焦磷酸钠、50mM磷酸钠pH 6.8、2x Denhardt氏溶液和10％硫酸右旋糖苷的溶液中于42℃进行20小时。滤膜的清洗在0.1xSSC和0.1％SDS的水溶液中于42℃进行。
然后，可使用本领域已知的标准技术来鉴定与编码全长天然序列GDM多肽的DNA具有所期望序列同一性的DNA。
实施例10：GDM在大肠杆菌中的表达
本实施例通过大肠杆菌中的重组表达例示了非糖基化形式的GDM的制备。
首先使用选定的PCR引物来扩增编码前述GDM多肽序列的DNA序列。引物应当包含与选定的表达载体上的限制酶位点对应的限制酶位点。可采用多种表达载体。合适载体的一个例子是pBR322(衍生自大肠杆菌；参见Bolivar等，Gene，2：95(1977))，其包含氨苄青霉素和四环素抗性的基因。将载体用限制酶消化并去磷酸化。然后将PCR扩增序列连接入载体。载体优选包含编码抗生素抗性基因、trp启动子、聚组氨酸前导(包含头6个STII密码子、聚组氨酸序列和肠激酶切割位点)、GDM编码区、λ转录终止子和argU基因的序列。
然后，通过Sambrook等(同上)中描述的方法用连接混合液转化选定的大肠杆菌菌株。通过在LB平板上生长的能力来鉴定转化子，然后挑选抗生素抗性菌落。可分离质粒DNA，并通过限制性分析和DNA测序进行确认。
选定的克隆可在液体培养基(诸如补充有抗生素的LB培养基)中培养过夜。随后可将过夜培养物接种以大规模培养。然后，使细胞生长至所期望的光密度，在此期间表达启动子开启。
将细胞再培养若干小时后，可通过离心收获细胞。通过离心收获的细胞沉淀物可使用本领域已知的各种试剂溶解，然后可用金属螯合柱在允许蛋白质紧密结合的条件下纯化溶解的GDM多肽。
使用如下规程，可使前述GDM多肽序列以带聚组氨酸标签形式在大肠杆菌中表达。首先，用选定的PCR引物扩增编码GDM的DNA。引物包含与选定的表达载体上的限制酶位点对应的限制酶位点，以及提供有效和可靠的翻译起始、金属螯合柱上的快速纯化及肠激酶的蛋白水解切除的其它有用序列。然后，将PCR扩增的、带聚His标签的序列连接入表达载体，其用于转化基于菌株52(W3110 fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq))的大肠杆菌宿主。首先，将转化子在含50mg/ml羧苄青霉素的LB培养基中于30℃振荡培养至O.D.600达到3-5。然后将培养物在CRAP培养基(通过在500mL水中混和3.57g(NH4)28O4、0.71g柠檬酸钠·2H2O、1.07g KCl、5.36g Difco酵母提取物、5.36g Sheffield hycase SF，以及110mM MPOS pH 7.3、0.55％(w/v)葡萄糖和7mM MgSO4，由此来配制)中稀释50-100倍，并于30℃振荡培养大约20-30小时。取样，通过SDS-PAGE分析来验证表达，并将大量培养物离心以沉淀细胞。冷冻细胞沉淀物直至纯化和重折叠。
将来自0.5至1升发酵液的大肠杆菌细胞浆(6-10g沉淀物)重悬于10倍体积(w/v)的7M胍、20mM Tris(pH 8)缓冲液。添加固体亚硫酸钠和连四硫酸钠至终浓度分别为0.1M和0.02M，并将溶液于4℃搅动过夜。此步骤使蛋白质变性，所有半胱氨酸残基通过亚硫酸酰化而封闭。将溶液在Beckman超速离心机中以40,000rpm离心30分钟。将上清液用3-5倍体积的金属螯合柱缓冲液(6M胍，20mM Tris，pH 7.4)稀释，并通过0.22微米滤膜过滤以澄清。将澄清的提取物加到在金属螯合柱缓冲液中平衡的5ml Qiagen Ni-NTA金属螯合柱上。用含50mM咪唑(Calbiochem、Utrol级)pH 7.4的另外缓冲液清洗柱子。用含250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。合并含有期望蛋白质的级分并贮存于4℃。通过其在280nm的吸光度，利用根据其氨基酸序列计算的消光系数估计蛋白质浓度。
通过将样品在新鲜配制的重折叠缓冲液中缓慢稀释使蛋白质重折叠，所述重折叠缓冲液含20mM Tris(pH 8.6)、0.3M NaCl、2.5M尿素、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和1mM EDTA。选择重折叠体积使得最终的蛋白质浓度在50至100μg/ml之间。将重折叠溶液于4℃温和搅动12-36小时。通过添加TFA至终浓度0.4％(pH大约3)来淬灭重折叠反应。在进一步纯化蛋白质之前，将溶液通过0.22微米滤膜过滤，并添加乙腈至终浓度2-10％。将重折叠蛋白质在Poros R1/H反相柱上层析，使用0.1％TFA作为流动缓冲液，并用10至80％的乙腈梯度洗脱。在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析具A280吸光度的级分的等分试样，并合并含均质重折叠蛋白质的级分。一般来说，大多数蛋白质的正确重折叠形式在最低乙腈浓度得到洗脱，因为那些形式是最紧凑的，其疏水内部免于与反相树脂相互作用。聚集形式常常在较高乙腈浓度得到洗脱。除了从期望形式中去除蛋白质的错误折叠形式，反相步骤还从样品中去除内毒素。
合并含期望的、折叠的蛋白质的级分，并用对准溶液喷的温和氮流去除乙腈。通过透析或通过使用在配制缓冲液中平衡的G25 Superfine(Pharmacia)树脂的凝胶过滤，并无菌过滤，由此将蛋白质配制到含0.14M氯化钠和4％甘露糖的20mM Hepes pH 6.8中。
实施例11：GDM多肽在哺乳动物细胞中的表达
本实施例通过哺乳动物细胞中的重组表达例示了潜在糖基化形式的GDM多肽的制备。
采用载体pRK5(参阅1989年3月15日公开的EP 307,247)作为表达载体。任选的是，使用诸如Sambrook等(同上)中描述的连接方法，将编码GDM多肽的DNA连接入经选定的限制酶消化以容许插入该DNA的pRK5。所得载体称为GDM-DNA。
在一个实施方案中，选定的宿主细胞可以是293细胞。将人293细胞(ATCC CCL 1573)在组织培养皿中在诸如补充有胎牛血清和任选的营养成分和/或抗生素的DMEM等培养基中培养至汇合。将约10μg pRK5-GDM DNA与约1μg编码VA RNA基因的DNA(Thimmappaya等，Cell，31：543(1982))混合，并溶于500μl 1mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2。向此混合液中逐滴加入500μl 50mM HEPES(pH 7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO4，并于25℃沉淀10分钟。将沉淀物悬浮并添加至293细胞，使其于37℃放置约4小时。吸去培养基并加入2ml含20％甘油的PBS，进行30秒。然后用无血清培养基清洗293细胞，加入新鲜培养基，并将细胞温育约5天。
转染后大约24小时，去除培养基，并用培养基(单独)或用含200μCi/ml35S-半胱氨酸和200μCi/ml 35S-甲硫氨酸的培养基置换。温育12小时后，收集条件培养基，在旋转滤器上浓缩，并加到15％SDS凝胶上。干燥处理后的凝胶，并对胶片曝光选定的一段时间以显现GDM多肽的存在。含转染细胞的培养物可进行进一步温育(在无血清培养基中)，并在选定的生物测定法中检验培养基。
在一种备选技术中，可使用Somparyrac等，Proc.Natl.Acad.Sci.，12：7575(1981)描述的硫酸右旋糖苷法将编码GDM多肽的DNA瞬时导入293细胞中。将293细胞在旋转摇瓶中培养至最大密度，并添加700μg pRK5-GDMDNA。首先通过离心从旋转摇瓶浓缩细胞并用PBS清洗。将DNA-右旋糖苷沉淀物在细胞沉淀物上温育4小时。细胞用20％甘油处理90秒，用组织培养基清洗，再次放入装有组织培养基、5μg/ml牛胰岛素和0.1μg/ml牛运铁蛋白的旋转摇瓶中。大约4天后，将条件培养基离心并过滤以去除细胞和碎片。然后，可通过任何选定的方法，诸如透析和/或柱层析，来浓缩并纯化含表达的GDM的样品。
在另一个实施方案中，可在CHO细胞中表达GDM多肽。可使用已知试剂诸如如CaPO4或DEAE-右旋糖苷将pRK5-GDM转染入CHO细胞。如上所述，可将细胞培养物温育，并用培养基(单独的)或用含放射性标志物物诸如35S-甲硫氨酸的培养基置换培养基。确定GDM存在后，可用无血清培养基置换培养基。优选的是，将培养物温育约6天，然后收获条件培养基。然后，可通过任何选定的方法来浓缩并纯化含表达的GDM多肽的培养液。
还可在宿主CHO细胞中表达带表位标签的GDM多肽。可将编码GDM部分的序列亚克隆到pRK5载体外。亚克隆插入片段可进行PCR以融合到杆状病毒表达载体中，其与选定的表位标签(诸如聚组氨酸标签)处于同一阅读框中。然后，可将带多组氨酸标签的GDM插入片段亚克隆入SV40驱动的载体，所述载体包含选择标记(诸如DHFR)来选择稳定的克隆。最后，可用SV40驱动的载体(如上所述)转染CHO细胞。可如上所述进行标记以验证表达。然后可通过任何选定的方法，诸如Ni2+螯合亲和层析，来浓缩并纯化含所表达的带聚His标签的GDM的培养液。
GDM多肽还可通过瞬时表达流程在CHO和/或COS细胞中表达，或者通过其它稳定表达规程在CHO细胞中表达。
使用如下规程在CHO细胞中进行稳定表达。将蛋白质作为IgG构建物(免疫粘附素)表达，其中将各蛋白质的可溶形式(例如胞外结构域)的编码序列与含铰链、CH2和CH2结构域的IgG1恒定区序列融合，和/或是带聚His标签的形式。
PCR扩增后，使用如Ausubel等，Current Protocols of Molecular Biology，3.16单元，John Wiley和Sons(1997)中所描述的标准技术将各DNA亚克隆入CHO表达载体。构建CHO表达载体，在感兴趣的DNA的5’和3’具有相容限制性位点，从而容许cDNA的方便穿梭。用于在CHO细胞中表达的载体如Lucas等，Nucl.Acids Res.24(9)：1774-1779(1996)中所述，利用SV40早期启动子/增强子来驱动感兴趣的cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达允许选择转染后质粒的稳定维持。
使用商品化的转染试剂
(Quiagen)、
或
(Boehringer Mannheim)，将12微克期望的质粒DNA导入约1千万个CHO细胞。如Lucas等(同上)中所述，培养细胞。将大约3×107个细胞冻存于安瓿中以供如下所述的进一步培养和生产之用。
置于水浴中融化含质粒DNA的安瓿并震荡混合。将内容物转移到装有10mL培养基的离心管中，并以1000rpm离心5分钟。吸出上清液，并将细胞重悬于10mL选择培养基(0.2μm过滤过的PS20，其含5％0.2μm渗滤过的胎牛血清)。然后，将细胞等分到装有90mL选择培养基的100mL转瓶中。1-2天后，将细胞转移到装有150mL选择性生长培养基的250mL转瓶中，并于37℃温育。再过2-3天后，以3×105个细胞/mL接种250mL、500mL和2000mL转瓶。通过离心并重悬于生产培养基而用新鲜培养基置换细胞培养基。尽管可采用任何合适的CHO培养基，但实际上可使用1992年6月16日公告的美国专利No.5,122,469中描述的生产培养基。以1.2×106个细胞/mL接种3L生产转瓶。在第0天，测定细胞数和pH。在第1天，对转瓶采样并开始喷入过滤过的空气。在第2天，对转瓶采样，将温度转变成33℃，并添加30mL 500g/L葡萄糖和0.6mL10％防沫剂(例如35％聚二甲基硅氧烷乳液、Dow Corning 365医用乳液)。在整个生产过程中，需要时调节pH使其保持在7.2左右。在10天后，或者直至存活力降至70％以下，离心收获细胞培养物并通过0.22μm滤膜过滤。滤出液贮存于4℃或立即加到柱上进行纯化。
对于带聚His标签的构建物，使用Ni-NTA柱(Qiagen)纯化蛋白质。纯化前，向条件培养基中加入咪唑至浓度5mM。于4℃用泵将条件培养基以4-5ml/分钟的流速加到用含0.3M NaCl和5mM咪唑的20mM Hepes(pH 7.4)缓冲液平衡的6ml Ni-NTA柱上。加样后，用另外的平衡缓冲液洗柱，并用含0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白质。随后将高度纯化的蛋白质用25ml G25Superfine(Pharmacia)柱脱盐，存至含10mM Hepes、0.14M NaCl和4％甘露醇(pH 6.8)的贮存缓冲液中，并贮存于-80℃。
免疫粘附素(含Fc)构建物如下从条件培养基中纯化。用泵将条件培养液加到在20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中平衡过的5ml蛋白A柱(Pharmacia)上。加样后，用平衡缓冲液彻底清洗柱子，然后用100mM柠檬酸(pH 3.5)进行洗脱。立即通过将1ml级分收集到装有275μL 1M Tris缓冲液(pH 9)的管中，来中和洗脱的蛋白质。随后如上文关于带聚His标签的蛋白质所述的那样，将高度纯化的蛋白质脱盐，存于贮存缓冲液中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶和经Edman降解的N-末端氨基酸测序评估均质性。
实施例12：GDM在酵母中的表达
以下方法描述了GDM多肽在酵母中的重组表达。
首先，构建酵母表达载体，用于通过ADH2/GAPDH启动子细胞内生成或分泌前述GDM序列。将编码该GDM序列和启动子的DNA插入选定质粒的合适限制酶位点以指导GDM的细胞内表达。对于分泌，可将编码该GDM序列的DNA与编码用于GDM表达的ADH2/GAPDH启动子、天然GDM信号肽或其它哺乳动物信号肽或者例如酵母α因子或转化酶分泌信号/前导序列、及接头序列(如果需要)的DNA一起克隆入选定的质粒。
然后，用上文所述的表达质粒转化酵母细胞(诸如酵母AB110株)，并在选定的发酵培养基中培养。可通过使用10％三氯乙酸的沉淀并通过SDS-PAGE的分离、接着使用考马斯蓝的凝胶染色，来分析经转化的酵母的上清液。
随后可通过离心从发酵培养液中去除酵母细胞并使用选定的针筒滤器浓缩培养液，由此分离并纯化重组GDM。含GDM的浓缩液可使用选定的柱层析树脂进一步纯化。
实施例13：GDM在杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达
以下方法描述了GDM多肽在杆状病毒感染的昆虫细胞中的重组表达。
将编码前述GDM序列的序列融合到杆状病毒表达载体内所包含的表位标签的上游。此类表位标签包括聚组氨酸标签和免疫球蛋白标签(像IgG的Fc区)。可采用多种质粒，包括衍生自商品化质粒诸如pVL1393(Novagen)的质粒。简而言之，用与5′和3′区互补的引物通过PCR扩增编码前述GDM序列的序列或其编码序列的期望部分，诸如编码跨膜蛋白质胞外结构域的序列或(如果所述蛋白质是细胞外的话)编码成熟蛋白质的序列。5′引物可掺入侧翼(选定的)限制酶位点。然后，用那些选定的限制酶消化产物，并亚克隆入表达载体。
使用脂转染试剂(lipofectin)(可从GIBCO-BRL购买)将上述质粒和BACULOGOLDTM病毒DNA(Pharmingen)共转染入草地夜蛾(Spodopterafrugiperda，“Sf9”)细胞(ATCC CRL 1711)，产生重组杆状病毒。于28℃温育4-5天后，收获释放的病毒并用于进一步扩增。病毒感染和蛋白质表达如O′Reilley等，Baculovirus expression vectors：A Laboratory Manual，Oxford：Oxford University Press(1994)所述的来进行。
然后，例如通过如下的Ni2+螯合亲和层析，可纯化所表达的带聚组氨酸标签的GDM多肽。如Rupert等，Nature，362：175-179(1993)所述，从重组病毒感染的Sf9细胞中制备提取物。简而言之，清洗Sf9细胞，重悬于超声处理缓冲液(25mL Hepes pH 7.9、12.5mM MgCl2、0.1mM EDTA、10％甘油、0.1％NP-40、0.4M KCl)，在冰上超声处理20秒2次。通过离心使超声处理物澄清，将上清液在加样缓冲液(50mM磷酸盐、300mM NaCl、10％甘油，pH 7.8)中稀释50倍，并通过0.45μm滤膜过滤。准备柱床体积5mL的Ni2+-NTA琼脂糖柱(可从Qiagen商购)，用25mL水清洗并用25mL加样缓冲液平衡。将过滤后的细胞提取物以0.5mL/分钟加到柱上。用加样缓冲液清洗柱子至基线A280，此时开始收集级分。接着，用第二清洗缓冲液(50mM磷酸盐、300mMNaCl、10％甘油、pH 6.0)清洗柱子，这洗脱非特异性结合的蛋白质。再次达到A280基线后，用第二清洗缓冲液中的0至500mM咪唑梯度洗柱。收集1mL级分，并通过SDS-PAGE和银染或者通过使用偶联有碱性磷酸酶的Ni2+-NTA(Qiagen)的Western印迹进行分析。合并含所洗脱的带His10标签的GDM多肽的级分，并针对加样缓冲液进行透析。
或者，纯化带IgG标签的(或带Fc标签的)GDM多肽可使用已知的层析技术进行，包括例如蛋白A或蛋白G柱层析。
实施例14：用特异性抗体纯化GDM多肽
可通过蛋白质纯化领域的多种标准技术来纯化天然或重组GDM多肽。例如，使用该序列的特异性抗体通过免疫亲和层析纯化前述GDM序列的原(pro-)、成熟或前(pre-)多肽变体。一般来说，免疫亲和柱是通过将抗GDM抗体与活化的层析树脂共价偶联而构建的。
通过用硫酸铵沉淀或通过固定化蛋白A(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，N.J.)纯化，从免疫血清中制备多克隆免疫球蛋白。同样的，通过硫酸胺沉淀或固定化蛋白A层析，从小鼠腹水中制备单克隆抗体。将部分纯化的免疫球蛋白共价附着于层析树脂，诸如CnBr活化的SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology)。依照制造商的说明书将抗体与树脂偶联，封闭树脂，并清洗衍生的树脂。
此类免疫亲和柱用于前述GDM序列的纯化，其通过从含该序列的细胞制备可溶形式的级分。通过向全细胞或经差速离心获得的亚细胞级分中添加去污剂来溶解或通过本领域众所周知的其它方法，可衍生出该制剂。或者，可供利用量的含信号序列的可溶性GDM多肽可以分泌到培养细胞的培养基中。
使含可溶性GDM多肽的制剂流过免疫亲和柱，并在容许该序列优先吸附的条件(例如存在去污剂时的高离子强度缓冲液)下清洗柱子。然后，在破坏抗体/底物结合的条件(例如低pH缓冲液，诸如大约pH 2-3，或高浓度离液剂，诸如尿素或硫氰酸根离子)下洗脱柱子，并分别收集GDM多肽。
Claims (55)
1.治疗神经胶质瘤肿瘤的方法，其包括：
(a)在肿瘤样品中测量一组GDM的表达；
(b)确定肿瘤子类PN、Prolif或Mes；和
(c)根据子类与至少有效量的治疗剂接触；
其中
(I)呈现为Prolif子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，所述组合疗法包括接触有效量的(a)Akt拮抗剂和/或Prolif-拮抗剂和/或抗有丝分裂剂、和(b)神经分化剂；
(II)呈现为Mes子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，所述组合疗法包括接触有效量的(a)Akt和/或Mes-拮抗剂和/或抗血管发生剂、和(b)神经分化剂；和
(III)呈现为PN子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，所述组合疗法包括接触有效量的：(1)PN-拮抗剂；和/或(2)神经分化剂；任选组合有以下一种或多种：(3)Akt拮抗剂；(4)抗有丝分裂剂和(5)抗血管发生剂。
2.权利要求1的方法，其中利用分级群聚比较肿瘤与一组神经胶质瘤样品来分出子类。
3.权利要求1的方法，其中利用k均值群聚比较肿瘤与一组神经胶质瘤样品来分出子类。
4.权利要求1的方法，其中利用投票方案比较肿瘤与一组神经胶质瘤样品来分出子类。
5.权利要求1的方法，其中通过比较肿瘤与一组预先分类的神经胶质瘤样品间的一组GDM标志物的表达相似性来分出子类。
6.权利要求1的方法，其中所述PN拮抗剂选自下组：表A所示的PN标志物，其中除了DLL3、Nog、Olig1、Olig2、THR和ASCL1。
7.权利要求1的方法，其中所述Prolif拮抗剂选自下组：表A所示的任意Prolif标志物的拮抗剂。
8.权利要求1的方法，其中所述Mes拮抗剂选自下组：表A所示的任意Mes标志物的拮抗剂。
9.权利要求1的方法，其中所述Akt拮抗剂选自下组：akt1、akt2、akt3的拮抗剂，PIK3、PD1、FRAP、RPS6KB1、SGK、EGFR、IGFR的调控或催化结构域的拮抗剂，和PTEN、INPP5D或INPPL1的活化剂、刺激剂或恢复剂。
10.权利要求1的方法，其中所述抗有丝分裂剂选自下组：替莫唑胺、BCNU、CCNU、洛莫司汀、gliadel、依托泊苷、卡莫司汀、伊立替康、托泊替康、丙卡巴肼、顺铂、卡铂、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、放线菌素D、博来霉素、普卡霉素、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、帕利他塞、auristatins、美登木素生物碱。
11.权利要求1的方法，其中所述抗血管发生剂选自下组：VEGF拮抗剂、抗VEGF抗体、VEGFR1和VEGFR2拮抗剂。
12.权利要求1的方法，其中所述神经分化剂选自下组：MAP2、β-管蛋白、GAD65和GAP43。示例性的神经分化剂包括，但不限于：视黄酸、丙戊酸及其衍生物(如，酯、盐、类视黄醇、视黄酸盐/酯、丙戊酸盐/酯、等)；甲状腺激素或其他甲状腺激素受体激动剂；noggin；BDNF、NT 4/5或其他NTRK2受体激动剂；提高转录因子ASCL1、OLIG1表达的试剂；dll3激动剂，Notch 1、2、3或4拮抗剂、γ分泌酶抑制剂，包括nicastrin、Aph1A、Aph1B、Psen1、Psen2和PSENEN的小分子抑制剂，δ样配体(Dll)-1拮抗剂，δ样配体(Dll)-4，jagged 1拮抗剂，jagged 2拮抗剂；numb激动剂或numb样激动剂。
13.预后和/或诊断神经胶质瘤的方法，其包括：
(a)测量一组GDM的表达；
(b)确定肿瘤子类PN、Prolif或Mes；和
(c)预后和/或诊断疾病结果；
其中Prolif或Mes子类指示较差的预后或缩短的存活时间，而PN子类指示较好的预后或延长的存活时间。
14.权利要求7的方法，其中利用分级群聚比较肿瘤与一组样品来分出子类。
15.权利要求7的方法，其中利用k均值群聚比较肿瘤与一组样品来分出子类。
16.权利要求7的方法，其中利用投票方案比较肿瘤与一组样品来分出子类。
17.权利要求7的方法，其中通过比较肿瘤与一组预先分类的神经胶质瘤样品间的一组GDM标志物的表达相似性来分出子类。
18.预后和/或诊断神经胶质瘤的方法，其包括：
(a)在肿瘤样品中测量PTEN和DLL3肿瘤标志物的表达，和
(b)根据所述肿瘤标志物的表达来预后和/或诊断，
其中PTEN和DLL3都较高表达指示较好的预后或延长的存活时间，而PTEN表达水平较低，无论DLL3表达水平，指示较差的预后或缩短的存活时间。
19.监测或诊断神经胶质瘤的方法，其包括在来自患者的至少2份样品中比较一组神经胶质瘤决定性标志物(“GDM”)的表达签名，其包括步骤：
(a)在第一时间点测量第一肿瘤样品中的GDM表达；
(b)在较晚的第二时间点测量第二肿瘤样品中的GDM表达；和
(c)确定在第一和第二样品中的子类PN、Prolif或Mes；
其中第一至第二肿瘤样品中由PN或Prolif转变为Mes子类指示所述肿瘤增加严重性或进展。
20.抑制神经胶质瘤肿瘤大小或生长的方法，其包括：
(a)在肿瘤样品中测量一组GDM的表达；
(b)确定肿瘤子类PN、Prolif或Mes；和
(c)根据子类与至少有效量的治疗剂接触；
其中
(I)呈现为Prolif子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，所述组合疗法包括接触有效量的(a)Akt拮抗剂和/或Prolif-拮抗剂和/或抗有丝分裂剂、和(b)神经分化剂；
(II)呈现为Mes子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，所述组合疗法包括接触有效量的(a)Akt和/或Mes-拮抗剂和/或抗血管发生剂、和(b)神经分化剂；和
(III)呈现为PN子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，所述组合疗法包括接触有效量的：(1)PN-拮抗剂；和/或(2)神经分化剂；任选组合有以下一种或多种：(3)Akt拮抗剂；(4)抗有丝分裂剂和(5)抗血管发生剂；而且其中结果是减小肿瘤大小或生长。
21.权利要求20的方法，其中利用分级群聚比较肿瘤与一组神经胶质瘤样品来分出子类。
22.权利要求20的方法，其中利用k均值群聚比较肿瘤与一组神经胶质瘤样品来分出子类。
23.权利要求20的方法，其中利用投票方案比较肿瘤与一组神经胶质瘤样品来分出子类。
24.权利要求20的方法，其中通过比较肿瘤与一组预先分类的神经胶质瘤样品间的一组GDM标志物的表达相似性来分出子类。
25.权利要求20的方法，其中所述PN拮抗剂选自以下任意的拮抗剂所组成的组：表A所示的PN标志物，其中除了DLL3、Nog、Olig1、Olig2、THR和ASCL1。
26.权利要求20的方法，其中所述Prolif拮抗剂选自下组：表A所示的任意Prolif标志物的拮抗剂。
27.权利要求20的方法，其中所述Mes拮抗剂选自下组：表A所示的任意Mes标志物的拮抗剂。
28.权利要求20的方法，其中所述Akt拮抗剂选自下组：akt1、akt2、akt3的拮抗剂，PIK3、PD1、FRAP、RPS6KB1、SGK、EGFR、IGFR的调控或催化结构域的拮抗剂，和PTEN、INPP5D或INPPL1的活化剂、刺激剂或恢复剂。
29.权利要求20的方法，其中所述抗血管发生剂选自下组：VEGF拮抗剂、抗VEGF抗体、VEGFR1和VEGFR2拮抗剂。
30.权利要求20的方法，其中所述抗有丝分裂剂选自下组：替莫唑胺、BCNU、CCNU、洛莫司汀、gliadel、依托泊苷、卡莫司汀、伊立替康、托泊替康、丙卡巴肼、顺铂、卡铂、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、放线菌素D、博来霉素、普卡霉素、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、帕利他塞、auristatins、美登木素生物碱。
31.权利要求20的方法，其中所述神经分化剂选自下组：MAP2、β-管蛋白、GAD65和GAP43，示例性的神经分化剂包括，但不限于：视黄酸、丙戊酸及其衍生物(如，酯、盐、类视黄醇、视黄酸盐/酯、丙戊酸盐/酯、等)；甲状腺激素或其他甲状腺激素受体激动剂；noggin；BDNF、NT 4/5或其他NTRK2受体激动剂；提高转录因子ASCL1、OLIG1表达的试剂；dll3激动剂，Notch 1、2、3或4拮抗剂，γ分泌酶抑制剂，包括nicastrin、Aph1A、Aph1B、Psen1、Psen2和PSENEN的小分子抑制剂，δ样配体(Dll)-1拮抗剂，δ样配体(Dll)-4，jagged 1拮抗剂，jagged 2拮抗剂；numb激动剂或numb样激动剂。
32.权利要求20的方法，其中与拮抗剂和/或试剂的接触造成肿瘤细胞的死亡。
33.权利要求20的方法，其中所述PN-、Prolif-或Mes-拮抗剂是(1)抗-PN-、抗-Prolif-或抗-Mes抗体，(2)抗-PN-、抗-Prolif-或抗-Mes抗原结合片段，(3)PN-、Prolif-或Mes-结合寡肽，(4)PN-、Prolif-或Mes-小分子拮抗剂，或(5)PN-、Prolif-或Mes-反义寡核苷酸。
34.权利要求20的方法，其中所述PN-、Prolif-或Mes-拮抗剂选自下组：(1)抗-PN-、抗-Prolif-或抗-Mes抗体，和(2)抗-PN-、抗-Prolif-或抗-Mes抗原结合片段。
35.权利要求20的方法，其中所述拮抗性抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体。
36.权利要求20的方法，其中所述抗体或抗原结合片段偶联有生长抑制剂或细胞毒剂。
37.权利要求20的方法，其中所述生长抑制剂或细胞毒剂选自下组：美登木素生物碱、加利车霉素、抗生素、放射性同位素和核溶酶。
38.治疗性处理患神经胶质瘤肿瘤的哺乳动物的方法，其中该方法包括：
(a)在肿瘤样品中测量一组GDM的表达；
(b)确定肿瘤子类PN、Prolif或Mes；和
(c)根据子类与至少有效量的治疗剂接触；
其中
(I)呈现为Prolif子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，所述组合疗法包括给该哺乳动物施用治疗有效量的(a)Akt拮抗剂和/或Prolif-拮抗剂和/或抗有丝分裂剂、和(b)神经分化剂；
(II)呈现为Mes子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，所述组合疗法包括接触有效量的(a)Akt和/或Mes-拮抗剂和/或抗血管发生剂、和(b)神经分化剂；和
(III)呈现为PN子类的肿瘤用如下组合疗法治疗，所述组合疗法包括接触有效量的：(1)PN-拮抗剂；和/或(2)神经分化剂；任选组合有以下一种或多种：(3)Akt拮抗剂；(4)抗有丝分裂剂和(5)抗血管发生剂；而且其中结果是减小肿瘤大小或生长。
39.权利要求38的方法，其中施用拮抗剂或试剂造成神经胶质瘤肿瘤的死亡。
40.权利要求38的方法，其中所述拮抗剂或试剂是抗体、抗原结合抗体片段、寡肽、小分子拮抗剂或反义寡核苷酸。
41.权利要求40的方法，其中所述拮抗性抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体。
42.权利要求40的方法，其中所述抗体或抗原结合片段偶联有生长抑制剂或细胞毒剂。
43.权利要求42的方法，其中所述生长抑制剂或细胞毒剂选自下组：美登木素生物碱、加利车霉素、抗生素、放射性同位素和核溶酶。
44.确定样品中PN-、Prolif-或Mes-神经胶质瘤决定性标志物(“GDM”)表达水平的方法，其中该方法包括将样品暴露于PN-、Prolif-或Mes-结合剂，和测定样品中每种的结合量，其中结合量指示样品中PN-、Prolif-或Mes-GDM各自的表达水平。
45.权利要求44的方法，其中所述PN-、Prolif-或Mes-结合剂选自下组：抗-PN-、Prolif-或Mes-抗体；PN-、Prolif-或Mes-结合抗体片段；PN-、Prolif-或Mes-寡肽；PN-、Prolif-或Mes-小分子拮抗剂；和PN-、Prolif-或Mes-反义寡核苷酸。
46.权利要求44的方法，其中所述抗-PN-、抗-Prolif-或抗-Mes-抗体选自下组：单克隆抗体、抗原结合抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体。
47.权利要求45的方法，其中所述PN-、Prolif-或Mes-结合剂是可检测标记的。
48.预后患神经胶质瘤肿瘤的哺乳动物存活时间的方法，其中该方法包括：
a)取出肿瘤测试样品，
b)测量测试样品中的和一组不少于三十(30)份患者存活时间已知的高级神经胶质瘤中的PTEN和DLL3表达水平，
其中测试样品中PTEN和DLL3表达水平都较高指示存活时间大于参照样品群中值的机会在统计学上升高，而测试样品中PTEN或DLL3任一表达水平较低指示存活时间小于参照样品群中值的机会在统计学上升高。
49.诊断哺乳动物中神经胶质瘤肿瘤严重性的方法，其中该方法包括：
(a)使包含得自哺乳动物的组织的测试样品接触：
(i)第一试剂，其是能与PTEN多肽结合的抗体、寡肽或有机小分子，
和
(ii)第二试剂，其是能与DLL3多肽结合的抗体、寡肽或有机小分子；
(b)分别测量测试样品中第一和第二试剂与PTEN和DLL3多肽间复合物形成的量，
其中PTEN和DLL3复合物形成都有大量形成指示轻度肿瘤，而PTEN或DLL3复合物形成任一有少量形成指示重度肿瘤。
50.权利要求49的方法，其中所述第一和/或第二试剂是可检测标记的。
51.权利要求50的方法，其中所述第一和/或第二试剂是附着于固相支持物的。
52.(a)PN-、Prolif-或Mes-GDM多肽，或(b)编码(a)的核酸序列在制备用于(i)治疗性处理或(ii)诊断性检测神经胶质瘤肿瘤的药物中的用途。
53.权利要求52的用途，其中所述GDM多肽是抗体、GDM结合抗体片段、GDM结合寡肽、GDM小分子拮抗剂、或GDM反义寡核苷酸。
54.权利要求52或53的用途，其中所述抗体是单克隆抗体、抗原结合抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。
55.治疗性处理患神经胶质瘤肿瘤的哺乳动物的方法，其中该方法包括与有效量的神经分化剂接触，组合有以下的一种或多种：(1)Akt拮抗剂；(2)抗有丝分裂剂和(3)抗血管发生剂；而且其中结果是减小肿瘤大小或生长。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081231 |