MX2008007650A - Metodo para diagnostico, pronostico y tratamiento de glioma. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona en general un método para supervisar, diagnosticar, pronosticar, y tratar glioma. Específicamente, la invención proporciona tres (3) subclases de pronóstico de glioma, que se asocian en forma diferencial con activación de las rutas de señalización akt y notch. Tumor que exhibe marcadores de linaje neural o proneural PN (incluyendo elementos de ruta notch) muestra supervivencia mediana del paciente más prolongada, mientras que los dos marcadores de tumor restantes Prolif y Mes se asocian con una recortada supervivencia. Tumores clasificados de esta manera también pueden tratarse con el agente terapéutico -PN, -Prolif o -Mes apropiado correspondiente a la sub-clasificación en combinación con agentes antimitóticos, agentes antiangiogénicos, antagonistas Akt, y agentes de diferenciación neural. En forma alterna, la invención también proporciona método de pronóstico o diagnóstico de glioma con un modelo de dos genes basado en los niveles de expresión de PTEN y DLL3.

Description

METODO PARA DIAGNÓSTICO, PRONÓSTICO Y TRATAMIENTO DE GLIOMA SOLICITUDES RELACIONADAS La presente reclama prioridad de acuerdo con 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/750,944 presentada en diciembre 16, 2005. CAMPO DE LA I VENCIÓN La presente invención se dirige a métodos para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de cáncer, específicamente glioma. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los E.U.A. , después de enfermedades del corazón (Boring et al., CA Cáncer J. Clin. 4_3:7 (1993)) . El cáncer se caracteriza por el aumento en el número de células anormales o neoplásicas derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa de tumor, la invasión de tejidos adyacentes por estas células de tumor neoplásicas y la generación de células malignas que eventualmente se diseminan mediante la sangre o el sistema linfático a nodos linfáticos regionales y a sitios distantes mediante un proceso denominado metástasis. En un estado canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en donde no crecerán células normales. El cáncer se manifiesta en una amplia variedad de formas, caracterizado por diferentes grados de invasión y agresividad. Los gliomas son el tipo más común de tumores de cerebro primarios y típicamente se asocian con pronóstico grave. Los astrocitomas de alto grado, que incluyen glioblastoma (GBM) y astrocitoma anaplásico (AA) son los tumores de cerebro intrínsecos más comunes en adultos. Mientras que ha habido progreso en comprensión de la genética molecular de astrocitomas de alto grado (Kitange et al., Curr. Opin. Oncol . 15: 197-203 (2003), el o los tipos de células de origen todavía son inciertos y los determinantes moleculares de agresividad en la enfermedad no se comprenden bien. Una mejor comprensión del origen celular y patogénesis molecular de estos tumores puede identificar a nuevos objetivos para tratamiento de estos neoplasmas que son casi uniformemente fatales. La graduación de tumores a menudo es crítica para un diagnóstico y pronóstico preciso del avance de la enfermedad y los gliomas no son la excepción. Décadas de experiencia han llevado a un sistema de diagnóstico de gliomas con base en histología. Los gliomas son histológicamente definidos con base en si exhiben morfología oligodendroglial o astrocítica primordialmente , y se califican por celularidad, atipia nuclear, necrosis, figuras mitóticas y proliferación microvascular - todas características asociadas con el comportamiento biológicamente agresivo. Este sistema de diagnóstico se ha desarrollado en las décadas de experiencia clínica con gliomas y ahora se ha vuelto la piedra fundamental de la neuro-oncología . Kleihues, P. et al., en su clasificación de la Organización Mundial de la Salud ("WHO"= World Health Organization) de tumores, Cáncer 88: 2887 (2000) . El esquema de clasificación WHO de gliomas astrocíticos se divide en cuatro (4) grados. Tumores menos malignos caen bajo los grados I (astrocitoma pilocítico) y II (glioma astrocítico) mientras que los tumores más malignos se definen bajo el grado III (astrocitoma anaplásico) y grado IV (glioblastoma multiforme) . Los oligodendrogliomas y gliomas mixtos (tanto con componentes oligodendrogliales como astrocíticos) ocurren en variantes de bajo grado (Grado WHO II) y más malignos (Grado WHO III) . Hasta hace poco, se suponía que los astrocitomas y otros gliomas surgían de células gliales que residen dentro del parenquima cerebral. Sin embargo, nueva evidencia en estudios en humanos y en animales sugiere que células madre neurales como un origen celular alterno de gliomas (Caussinus and González, Nat. Genet. 37: 1125 (2005); Singh et al., Cáncer Res. 63: 5821-5828 (2003) ; Zhu et al., Cáncer Cell 8: 119 (2005). Modelos en ratón demuestran que los astrocitos o células progenitoras/madre neurales pueden dar lugar a neoplasmas que exhiben los signos característicos histopatológicos del gliomas humanos (Bachoo et al., Cáncer Cell 1: 269-277 (2002); Uhrbom et al., Cáncer Res. 6_2: 5551-5558 (2002) . Demostraciones que el prosencéfalo de humano adulto contiene una fuente abundante de células madre neurales (Sanai et al., Nature 427: 740-744 (2004) y que GBMs humano contienen células tipo madre neurales tumorigénicas (Galli et al., Cáncer Res. 4: 7011-7021 (2004) ; Ignatova et al., GLIA 39: 193-206 (2002); Singh et al., Nature 432 : 396-401 (2004) indican que las células progenitoras y/o madre neurales son un origen plausible para gliomas humanos y han dado lugar a especulación que terapias más efectivas resultarán de enfoques dirigidos a hacer blanco en el componente tipo células madre de GBM (Berger et al., Lancet Oncol . 5: 511-514 (2004) ; Fomchenko and Holland, Exp. Cell Res. 306 : 323-329 (2005); Ignatova et al., supra; Oliver and Wechsler-Reya, Neuron 42: 885-888 (2004) . De manera importante sin embargo, la contribución de células tipo madre a avance de enfermedad o respuesta terapéutica no se ha establecido, ni es claro que proporción de células de tumor exhiben propiedades tipo madre.

Ya que las decisiones de pronóstico y terapéuticas de paciente se realizan recurriendo a graduación patológica precisa, un atributo crítico es la consistencia. Mientras que en su mayoría es reproducible , el presente sistema de base histológica puede resultar en un desacuerdo sustancial entre neuropatólogos respecto tanto a tipo y grado. Louis, DN et al., Am J. Pathol . 159 : 779-86 (2001); Prayson RA et al . , J. Neurol . Sci. 175 : 33-9 (2000); Coons et al., Cáncer 79 : 1381-93 (1997). Aún más, el método preciso de graduar cambia con el tiempo. Finalmente, debido a que se basa en morfología [Burger, Brain Pathol. 12::257-9 (2002)], un estado final biológico en lugar de molecular, el enfoque es limitado en su capacidad para identificar nuevos compuestos potenciales. Actualmente, graduación de base de histología de gliomas infiltradores difusos es el mejor pronóstico de tiempo de supervivencia del paciente. Sin embargo, la histología ni es ilustrativa de la patología de gliomas ni tampoco ayuda mucho en identificar nuevos marcadores moleculares y su uso para desarrollar nuevas terapéuticas. Aún más, la evidencia es creciente en que la presencia de subclases clínicamente relevantes no reconocidas de gliomas difusos tanto respecto a la expresión de marcador molecular como respuesta terapéutica. Mischel PS et al., Cáncer Biol . Ther. 2:242-7 (2003) . Además se ha notado de una variedad de regímenes de tratamiento, que respuestas clínicas a tumores histológicamente idénticos pueden ser altamente variadas. Mischel et al., supra.; Cloughesy, TF et al., Cáncer 91_: 2381-6 (2003) . Esto mina como en la evaluación histopatológica no revela la biología subyacente. Conforme los oncólogos pasan a terapias dirigidas molecularmente , la identificación de subgrupos definidos molecularmente distintos se vuelve cada vez más importante. Sin embargo, mientras que genes asociados con tumor específicos se han estudiado, ensayos de proteínas/genes individuales solos o incluso en combinación con características histológicas hasta la fecha no han sido predictivos de supervivencia o ayudan en guiar a decisiones terapéuticas. Tortosa, A. et al., Cáncer 97: 1063-71 (2003) ; Reavey-Cantwell , JF et al., J. Neurooncol . 55: 195-204 (2001) ; Bouvier-Labit , C. et al., Neuropathol. Appl . Neurobiol. 4:381-8 (1998) ; Stark, AM et al., Zentralbl Neurochir. 64: 30-6 (2003) ; Li, J. et al., Science 275: 1943-7 (1997) . Varios estudios han investigado las correlaciones moleculares de pronóstico y subclases clínicas en AA y GBM (también conocidos como astrocitoma grado III y IV respectivamente) . El grado de tumor es el pronóstico mejor establecido y robusto del resultado de la enfermedad (Prados and Levin, Semin Oncol . 27: 1-10 (2000) . La pérdida de capacidad de heterocigoto de cromosoma (chr) lOq es una ocurrencia más frecuente en GBM que AA y se ha asociado con supervivencia GBM corta (Balesaria et al., Br. J. Can. 81: 1371-1377 (1999); Schmidt et al., J. Neuropathol . Exp. Neurol . 61: 321-328 (2002); Smith et al., J. Nat . Can. Inst . 93: 1246-1256 (2001) . La mayoría de edad en el diagnóstico es un factor de pronóstico negativo para GBM (Curran et al., J. Nati. Cáncer Inst. 85; 704-710 (1993) , y marcadores moleculares del resultado difieren en pacientes mayores y más jóvenes (Batchelor et al., Clin. Cáncer Res. 10: 228-233 (2004); Smith et al., J. Nati. Cáncer Inst. 93: 1246-1256 (2001), sugiriendo la existencia de subclases moleculares asociadas a la edad. Mientras que mutación p53 y amplificación EGFR supuestamente definen subgrupos GBM mutuamente excluyentes [von Deimling et al., Glia 15 , 328-338 (1995); atanabe et al., Brain Pathology 6, 217-223 (1996) ] , un estudio reciente cuestiona la validez de este esquema de clasificación [Okada et al., Cáncer Research 6_3, 413-416 (2003)] y el valor de pronóstico de cualquier mutación p53 o alteraciones del sitio EGFR no es claro (Heimberger et al., Clinical Cáncer Research 11 : 1462-1466 (2005); Ushio et al., Frontiers in Bioscience 8 : e281-288 (2003) . Es claro que una mejor comprensión de la base biológica de estos tumores se requiere a fin de tratar más efectivamente a esta enfermedad. Análisis de microhilera o micromatriz se ha identificado como una herramienta que puede proporcionar una evaluación de tumor no sesgada, cuantitativa y reproducible debido a que puede evaluar simultáneamente la expresión de miles de genes individuales. Este enfoque se ha aplicado a muchos cánceres diferentes incluyendo gliomas. Mischel, P.S. et al., Oncogene 2_2: 2361-73 (2003) ; Kim, S. et al., Mol. Cáncer Ther. 1:1229-36 (2002); Ljubimova et al., Cáncer Res. 61: 5601-10 (2001); Nutt, CL et al., Cáncer Res. 6_3: 1602-7 (2003); Rickman, D.S. et al., Cáncer Res. 61: 6885-91 (2001); Sallinen, S.L. et al., Cáncer Res. 60: 6617-22 (2000); Shai, R. et al., Oncogene 2/2: 4918-23 (2003). A diferencia de de la evaluación histológica, el análisis de microhileras puede identificar la variación genética subyacente en los tumores, mejorando la clasificación de tumor así como el pronóstico del paciente. Análisis de microhileras de gliomas ha resultado en una clasificación en más grupos homogéneos. Freije et al., Cáncer Res. 6_4: 6503-6510 (2004) . Aún más, también se ha encontrado que es un agente de pronóstico superior de supervivencia que la graduación histológica. Freije et al., supra.

El perfilado de expresión de gliomas malignos ha identificado subtipos moleculares así como genes asociados con avance de grado de tumor y supervivencia de paciente (Godard et al., Cáncer Res. 6_3: 6613-6625 (2003); Rickman et al., Can. Res. 61: 6885-6891 (2001); van den Boom et al., Am. J. Pathol . 163 : 1033-1043 (2003) . Mientras que GBM y AA continúan siendo definidos en base a la apariencia histológica, el hallazgo de que el perfilado de expresión pronostica resultado mejor que las características histológicas (Freije et al., supra . ; Nutt et al., Clin. Can. Res. 11: 2258-2264 (2003), proporciona soporte para la hipótesis de que neoplasmas definidos como AA y GBM en una base morfológica representan una mezcla de subtipos genéticos moleculares. Dada la posibilidad de que entidades de enfermedad molecularmente distintas pueden exhibir diferentes respuestas clínicas a agentes anticáncer dirigidos, una mayor comprensión del comportamiento de subconjuntos definidos molecularmente de tumores puede ayudar en el desarrollo de terapéuticas más efectivas. Gliomas malignos se considera que se desarrollan como resultado de acumulaciones escalonadas de lesiones genéticas. Por ejemplo, el astrocitoma anaplásico típicamente exhibe: (1) pérdida de una ruta p53 funcional, usualmente por mutación p53 ; (2) pérdida de una ruta pl6/pRb funcional, típicamente por deleción del sitio pl6/ARF; y (3) activación de ruta ras por medios diferentes a mutación ras; y (4) reactivación telomerasa, que se ve raramente en astrocitos humanos normales (NHAs= normal human astrocytes) o glioma grado II. Cavenee et al., "Diffuse infiltrating astrocytomas, " in Pathology and Genetics of Tumors of the Nervous System, W.K. Cavnee and P. Kleihues, Eds . , pp . 9-51. Lyon : IRAC Press (2000); Ichimura et al., Cáncer Res. 60 : 417-424 (2000); Feldkamp et al., Neurosurgery 4_5: 1442-1453 (1999) . Glioblastoma multiforme (GBM) , además de la alteración en la ruta p53 y pl6/pRb anteriormente anotada, también frecuentemente contiene rupturas PTEN que llevan a activación de la ruta Akt . Hass-Kogan et al., Curr. Biol . 8: 1195-1198 (2000), Holland et al., Nat. Genet. 25: 55-57 (2000) . A través del efecto en objetivos o blancos corriente abajo, Akt puede llevar a niveles reducidos de inhibidor de ciclo celular [Datta et al., Cell 91: 231-241 (1997); Pap et al., J. Biol. Chem. 273 : 19929-19932 (1998); Brunet et al., Cell 96: 857-868 (1999); Kops et al., Nature, 398 : 630-634 (1999); edema et al., Nature 404 : 782-787 (2000)], así como incrementados niveles de factor de crecimiento endotelial vascular bajo condiciones hipóxicas . Mazure et al., Blood 90: 3322-3331 (1997) . Akt puede suprimir apoptosis, desregular el ciclado celular y alterar el potencial angiogénico. Aún más, 80% de todos los tumores GBM se observa que expresan niveles elevados de Akt . A la luz del efecto conocido de Akt en fisiología celular y expresión elevada en GBM, la activación de Akt se implica fuertemente en el desarrollo de GBM. Hass-Kogan, supra. ; Holland, supra. El gen supresor de tumor Pten codifica una fosfatasa que frecuentemente se muta, elimina o de otra forma inactiva somáticamente en diversos cánceres humanos, incluyendo glioblastoma . Li et al., Science 275 : 1943 (1997) . Además de carcinogénesis , Pten también puede jugar papeles importantes en el desarrollo del cerebro, como se sugiere por su patrón de expresión del sistema nervioso central (CNS) ubicuo en embriones. Gimm et al., Hum. Mol. Genet. 9: 1633 (2000) ; Luukko et al., Mech. Dev. 8_3 : 187 (1999) , así como por desordenes neurológicos asociados con mutaciones de línea germinal Pten en humanos. Mientras que la letalidad embriónica temprana de ratón con genes inoperativos knock out Pten~^~ convencionales ha impedido estudios en la función de Pten en desarrollo temprano del cerebro, [Di Cristofano et al., Nature Genet. 19: 348 (1998) and Stambolic et al., Cell 95: 29 (1998)] animales con genes inoperativos knock out transgénicos dirigidos por promotor tales como los que resultan de transgenes Cre y loxp en los animales precursores, ha resultado en la sugerencia de que Pten regula negativamente la producción de células madre neurales. Groszer et al., Science 294: 2186-2189 (2001). La ruta de señalización Notch se ha implicado en carcinogénesis de muchos cánceres, incluyendo la enfermedad de Hodgkin, linfoma de célula T, y cáncer de mama, cervical, pancreático y de colon. 40-44 Jundt , F. et al., Blood 99:3398-403 (2002); Pear, W.S. et al., J. Exp. Med. 183 : 2283-91 (1996); Weij zen S., et al., Nat . Med. 8: 979-86 (2002); Weij zen et al., J. Cell Physiol. 194 : 356-62 (2003); Miyamoto, Y., et al . , Cáncer Cell 3: 565-76 (2003); Nickoloff, B.J. et al., Oncogene 22: 6598-608 (2003) . La familia de receptores notch consiste de proteínas transmembrana heterodiméricas involucradas íntimamente en la determinación del destino de la célula. Dependiendo del tipo celular, la señalización notch puede influenciar en forma positiva o negativa la proliferación, diferenciación y apoptosis Artavanis-Tsakonas, S. et al., Science 284 : 770-6 (1992); Miele, L. et al., J. Cell Physiol. 181: 393-409 (1999). A la fecha, cuatro receptores Notch se han identificado en humanos (es decir, Notch 1-4) con cinco ligandos correspondientes, incluyendo tipo delta 1 (dll-1), tipo delta 3 (dll-3), tipo delta 4 (dll-4), dentado-1 y dentado-2. La ruta Notch interactúa y superpone con otras rutas de cáncer críticas tales como hedgehog (Hallahan et al., Cáncer Res. 64: 7794-7800 (2004) y Ras. Fitzgerald, K. et al., Oncogene 19_: 4191-8 (2000); Ruiz-Hidalgo, R.J. et al., J. Oncol. 14: 777-83 (1999). Sin embargo, el papel de Notch en cánceres parece ser complejo con base en factores tales como el tipo de tejido. Mientras que la actividad Notch- 1 es necesaria para mantener un fenotipo canceroso en células humanas transformadas ras (Weijzen, S. et al., Nat. Med. 8: 979-86 (2002), la señalización Notch- 1 se encuentra que tiene un efecto supresor de tumor en tumores de piel murinos y en cáncer pulmonar de células no pequeñas. Wolfer et al., Nat. Genet. 3_3_: 416-21 (2003); Sriuranpong, V. et al., Cáncer Res. 61: 3200-5 (2001) . Los hallazgos sugieren un papel variable para señalización notch en cáncer. La señalización notch tanto inhibe diferenciación como promueve proliferación en el cerebelo en desarrollo. Solecki, DJ. et al., Neuron 3JL: 557-68 (2001) . Aún más, la señalización notch se ha asociado específicamente con gliomas. Específicamente, los ligandos notch tipo delta- 1 y dentado-1 y expresión de receptor notch- 1 se mejora tanto en líneas de células glioma como tumores de glioma humano, y su apoptosis inducida por regulación descendente y proliferación inhibida en lineas celulares de glioma múltiples y prolongada supervivencia en modelos de animales. Purow et al., Cáncer Res. 65(6): 2353-2363 (2005). Sin embargo, el papel de señalización notch en tumorigénesis , puede variar. Por ejemplo, se ha observado que la actividad Notch- 1 inhibe la proliferación de células de meduloblastoma , en donde la actividad Notch-2 promueve su crecimiento. Fan et al., Cáncer Res. 64: 7787-7793 (2004) . Complicando adicionalmente nuestra compresión de la ruta de señalización notch, se ha sugerido recientemente que el ligando notch D113 está asociado con inactivación notch. Ladi et al., J. Cell Biol . 170: 983-992 (2005). De esta manera, en la actualidad, la compresión del papel de notch en tumorigénesis es en la mejor de las circunstancias, incompleto. Mientras que el perfilado de expresión de genes, tal como el que se proporciona por análisis de microhileras , puede identificar un panel de expresión de genes en gliomas que es predictivo de supervivencia, ningún análisis a la fecha ha identificado todavía la expresión de gen individual para ser efectivos agentes de pronóstico de supervivencia. Por ejemplo, en un análisis de microhileras de tejido de tumor de glioma etapa III y IV retirado de 74 pacientes, 595 genes diferencialmente expresados identificados se asocian con supervivencia. Freije et al., Cáncer Res. 64: 6503-6510 (2004). De este grupo, 44 de los genes expresados más fuertemente y en forma consistentemente diferencial fueron identificados. Este grupo se estrechó más a 16 genes individuales, que además se evaluaron por transcripción inversa- PCR. Modelado adicional identifica expresión mejorada del ligando notch DLL3 como uno de 6 genes asociados son supervivencia mejorada. Sin embargo, mientras que este estudio demuestra el valor de pronóstico y diagnóstico de perfilado genético que resulta de análisis de microhileras , no resulta en la identificación de ninguno de estos genes individuales que tengan valor de pronóstico. Los solicitantes identifican aquí tres (3) subclases de pronósticos novedosas de glioma y muestran asociadas en forma diferencial con activación de las rutas de señalización akt y Notch (Prolif, Mes) . Una clase de tumor, que exhibe marcadores de linaje neural y proneural (PN) y elementos de ruta Notch muestran supervivencia promedio mayor. En contraste, las dos (2) clases de tumor restantes, caracterizadas por marcadores de proliferación de mesénquima, se asocian con más corta supervivencia.

Los solicitantes además identifican aquí un modelo de dos genes, y revelan que una superior expresión tanto de PTEN como DLL3 se correlaciona con mayor supervivencia, demostrando el impacto de rutas de señalización Akt y Notch en agresividad de tumor. Aún más, ante recurrencia, algunos tumores que originalmenten se presentaron con fenotipos proneurales o proliferativos se desplazan a la clase mesenquimal, de esta manera sugiriendo que estos grupos definidos molecularmente pueden representar etapas o estadios de diferenciación alternos del avance del tumor. Este modelo de dos genes es distinto del valor predictivo descrito por Freije et al., debido a que el valor de pronóstico de DLL3 más PTEN en un modelo de dos genes de supervivencia se muestra que es estadísticamente-significante en dos conjuntos de datos independientes. BMP2 es un marcador identificado por Freije et al., como un marcador de la misma subclase de tumor que DLL3. Cuando BMP2 se sustituye por DLL3 en el modelo dedos genes, falla en reproducir los hallazgos vistos con DLL3. Los solicitantes además han descubierto que el estado de activación de la ruta Notch o Akt es una disuación principal de agresividad de tumor y puede pronosticar respuesta a terapias dirigidas. Finalmente, los solicitantes han identificado que tumores con deficiente pronóstico se caracterizan por marcadores de células madre neurales y señalización de ruta Akt y angiogénesis o proliferación. La señalización de ruta Notch, y marcadores de precursores neurales comprometidos caracterizan a tumores de mejor pronóstico. El cerebro normal tiene poca proliferación, angiogénesis, o señalización Notch y Akt, pero se caracteriza por alta expresión de marcadores neuronales. Tumores PN de buen pronóstico pueden mostrar parches de células con marcadores Mes de deficiente pronóstico y tumores PN pueden recurrir con el fenotipo Mes, sugiriendo de esta manera que tumores de deficiente pronóstico pueden convertirse en tumores tipo PN de mejor pronóstico al bloquear el proceso biológico apropiado tal como señalización angiogénesis o proliferación Akt. Estos hallazgos sugieren que bloquear la señalización angiogénesis o proliferación de Akt en combinación con bloqueo de señalización Notch u otros tratamientos que inducen diferenciación neuronal pueden frenar el crecimiento de tumores de glioma. COMPENDIO La presente invención proporciona en general un método para supervisar, diagnosticar, pronosticar y tratar glioma. En una modalidad, la invención proporciona tres (3) subclases de pronóstico de glioma, que se asocian diferencialmente con activación de las rutas de señalización akt y Notch. La clase de tumor que exhibe marcadores de linaje neural o proneural (PN) , y elementos de ruta Notch, muestran supervivencia de paciente promedio mayor. En contraste, los marcadores de proliferación {Prolif) o mesenquima (Mes) , se asocian con más corta supervivencia. En otra modalidad, la invención proporciona un modelo de dos genes de glioma, en donde niveles de expresión relativamente altos tanto de PTEN como DLL3 son indicativos de prolongada supervivencia y una baja expresión de PTEN (independientemente de DLL3) es indicativa de supervivencia más corta. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar glioma, que comprende: (i) medir la expresión de un conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM") en una muestra de tumor, (ii) determinar la firma de expresión de sub-clasificación proneural (PN) , proliferativa (Prolif) o mesenquimal (Mes) del conjunto, en donde: (I) tumores exhibin una sub-clasificación Prolif se tratan con una terapia combinada, que comprende contactar con cantidades efectivas de (a) un antagonista Akt y/o antagonista Prolif, y/o agente anti-mitótico, y (b) un agente de diferenciación neural; (II) tumores que exhiben una sub-clasificación Mes se tratan con una terapia combinada que comprende contactar con cantidades efectivas de (a) un antagonista Akt y/o Mes y/o agente anti-angiogénico, y (b) un agente de diferenciación neural ; y (III) tumores que exhiben una sub-clasificación PN se tratan con terapia combinada que comprende contacto con cantidades efectivas de: (1) un antagonista PN y/o (2) un agente de diferenciación neural que opcionalmente esté en combinación con uno o más de lo siguiente: (3) un antagonista Akt, (4) un agente anti -mitótico , y (5) antagonista Mes y/o agente anti-angiogénico. En un aspecto específico, el antagonista Akt se elige del grupo que consiste de: antagonistas de aktl, akt2 , akt3, antagonistas de dominio regulatorio o catalítico de PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1 , SGK, EGFR, IGFR, y activadores, estimuladores o restauradores de PTEN, INPP5D o INPPL1. En otro aspecto específico, el antagonista Prolif se elige del grupo que consiste de: antagonistas de cualquiera de los marcadores Prolif indicados en la Tabla A. En un aspecto específico adicional, el agente anti-mitótico se elige del grupo que consiste de: temozolamida , BC U, CC U, lomustina, gliadel, etoposido, carmustina, ironotecan, topotecan, procarbazina , cisplatina carboplatina ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina , dactinomicina , bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas , maytansinoides . En un aspecto específico aún adicional, el antagonista Mes se elige del grupo que consiste de: antagonistas de cualquiera de los marcadores Mes indicados en la Tabla A. En un aspecto específico adicional, el agente anti -angiogénico se elige del grupo que consiste de: antagonistas VEGF, anticuerpo anti-VEGF, antagonistas VEGFR1 y VEGFR2. En un aspecto aún adicional, el antagonista PN se elige del grupo que consiste de: antagonista de cualquiera de los marcadores PN indicados en la Tabla A, excepto por DLL3 , Nog, Oligl, 01ig2, THR y ASCL1. En un aspecto específico aún adicional, el agente de diferenciación neural se elige del grupo que consiste de: MAP2 , beta-tubulin, GAD65 y GAP43. Ejemplos de agentes de diferenciación neurales incluyen, pero no están limitados a: ácido retinóico, ácido valproico y sus derivados (por ejemplo, ésteres, sales, retinoides, retinatos, valproatos, etc.); hormona tiroide u otros agonistas de receptor de hormona tiroide; noggin; BDNF, NT 4/5 u otros agonistas del receptor NTRK2 ; agentes que aumentan la expresión de factores de transcripción ASCL1, 0LIG1 ; dll3 agonistas, antagonistas Notch 1, 2, 3 o 4, inhibidores de gamma secretasa, incluyendo inhibidores de molécula pequeña de nicastrina, AphlA, AphlB, Psenl, Psen2 y PSENEN, antagonista de ligando tipo delta (Dll)-l, antagonista de ligando tipo delta (Dll)-4, dentado 1, antagonista dentado 2; agonista numb o agonista tipo numb. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar glioma que comprende contactar con cantidades efectivas de (1) un agente de diferenciación neural en combinación con uno o más de lo siguiente: (3) un antagonista Akt , (4) un agente anti-mitótico, y (5) antagonista Mes y/o agente anti-angiogénico. En un aspecto específico, el antagonista Akt se elige del grupo que consiste de: antagonistas de aktl, akt2, akt3, antagonistas de dominio regulatorio o catalítico de PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR, y activadores, estimuladores o restauradores de PTEN, INPP5D o INPPL1. En otro aspecto específico, el antagonista Prolif se elige del grupo que consiste de: antagonistas de cualquiera de los marcadores Prolif indicados en la Tabla A. En un aspecto específico adicional, el agente anti-mitótico se elige del grupo que consiste de: temozolamida, BCNU, CCNU, lomustina, gliadel, etoposido, carmustina, ironotecan, topotecan, procarbazina , cisplatin, carboplatin, ciclofosfamida , vincristina, doxorubicina , dactinomicina, bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas , maytansinoides . En un aspecto específico adicional, el antagonista Mes se elige del grupo que consiste de: antagonistas de cualquiera de los marcadores Mes indicados en la Tabla A. En un aspecto específico aún adicional, el agente anti -angiogénico se elige del grupo que consiste de: antagonistas VEGF, anticuerpo anti-VEGF, antagonistas VEGFR1 y VEGFR2. En un aspecto aún adicional, el antagonista PN se elige del grupo que consiste de: antagonista de cualquiera de los marcadores PN indicados en la Tabla A, excepto por DLL3 , Nog, Oligl, 0lig2, THR y ASCL1. En un aspecto específico aún adicional, el agente de diferenciación neural se elige del grupo que consiste de: MAP2 , beta-tubulin, GAD65 y GAP43. Agentes de diferenciación neural ejemplares incluyen, pero no están limitados a: ácido retinóico, ácido valpróico y sus derivados (por ejemplo, ésteres, sales, retinoides, retinatos, valproatos, etc.); hormona tiroide u otros agonistas de receptor de hormona tiroide; noggin; BDNF, NT 4/5 u otros agonistas del receptor NTRK2 ; agentes que aumentan la expresión de los factores de transcripción ASCL1, OLIG1 ; agonistas dll3, antagonistas Notch 1, 2, 3 o 4, inhibidores de gamma secretasa, incluyendo inhibidores de molécula pequeña de nicastrina, AphlA, AphlB, Psenl, Psen2 y PSENEN, antagonista de ligando tipo delta (Dll)-l, antagonista de ligando tipo delta (Dll)-4, dentado 1, antagonista dentado 2; agonista numb o agonista tipo numb.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para pronóstico y/o diagnóstico del glioma que comprende (i) medir la expresión de un conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM" = glioma determinative markers) en una muestra de tumor, (ii) determinar la sub-clasificación, firma de expresión, proneural (PN) , proliferativo de {Prolif) o mesenquimal (Mes) en el conjunto, seguido por (iii) pronóstico y diagnóstico de resultado de enfermedad, en donde una subclasificación de Prolif o Mes es indicativa de un pronóstico más pobre o una posibilidad estadísticamente elevada de tiempo de supervivencia menor que la mediana de la población de muestra de referencia y una sub-clasificación de PN es indicativa de un mejor pronóstico o posibilidad estadísticamente elevada de tiempo de supervivencia mayor que la media de la población de muestra de referencia. En un aspecto específico, la sub-clasificación se lleva a cabo utilizando enjambrado jerárquico. En otro aspecto específico, la sub-clasificación se lleva a cabo utilizando agrupamiento k-medias. Todavía en otro aspecto específico, la sub-clasificación se lleva a cabo por un esquema de votación. En un aspecto específico aún adicional, la sub-clasificación se lleva a cabo por una comparación de GDMs en el tumor a GDMs en un conjunto de referencia de tumores . En una modalidad aún adicional, la invención proporciona un método para supervisar o diagnosticar glioma, que comprende comparar la forma de expresión de un conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM") en al menos dos muestras de tumor de un paciente: (i) medir la expresión de GDM en una primer muestra de tumor en un primer punto en tiempo; (ii) medir la expresión de GDM en una segunda muestra de tumor en un segundo punto en tiempo posterior; (iii) determinar la sub-clasificación morfológica como firma de expresión proneural (PN) , proliferativa (Prolif) o mesenquimal (Mes) de GDM en las muestras de tumor; en donde una transición de la sub-clasificación de PN a Prolif a Mes de la primera a la segunda muestra de tumor, es indicativa de una severidad incrementada o avance del tumor. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de tumores de glioma que comprende: (i) medir la expresión de un conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM") en una muestra de tumor, (ii) determinar la firma de expresión de sub-clasificación proneural {PN) , proliferativa (Prolif) o mesenquimal (Mes) del conjunto, en donde: (I) tumores que exhiben una sub-clasificación Prolif se tratan con una terapia combinada que comprende contactar con cantidades efectivas de (a) un antagonista Akt y/o un antagonista Prolif y/o un agente anti-mitótico, y (b) un agente de diferenciación neural; (II) tumores que exhiben una sub-clasificación Mes son tratados con una terapia combinada que comprende contactar con cantidades efectivas de (a) un antagonista Akt y/o Mes y/o agente anti-angiogénico, y (b) un agente de diferenciación neural; y (III) tumores que exhiben una sub-clasificación PN se tratan con una terapia combinada que comprende contacto con cantidades efectivas de: (1) un antagonista PN y/o (2) un agente de diferenciación neural opcionalmente en combinación con uno o más de los siguientes: (3) un antagonista Akt, (4) un agente anti-mitótico, y (5) un antagonista Mes y/o un agente anti-angiogénico; y en donde el resultado es reducido tamaño o crecimiento del tumor. En un aspecto específico, el antagonista Akt se elige del grupo que consiste de: antagonistas de aktl, akt2, akt3, antagonistas de dominio regulatorio o catalítico de PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR, y activadores, estimuladores o restauradores de PTEN, INPP5D o INPPL1. En otro aspecto específico, el antagonista Prolif se elige del grupo que consiste de: antagonistas de cualquiera de los marcadores Prolif indicados en la Tabla A. En un aspecto específico adicional, el agente anti -mitótico se elige del grupo que consiste de: temozolamida, BCNU, CCNU, lomustina, gliadel, etoposido, carmustina, ironotecan, topotecan, procarbazina, cisplatin, carboplatin, ciclofosfamida, vincristina, doxorubicin, dactinomicina, bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas , maytansinoides . En un aspecto específico adicional, el antgonista Mes se elige del grupo que consiste de: antagonistas de cualquiera de los marcadores Mes indicados en la Tabla A. En un aspecto específico aún adicional, el agente anti -angiogénico se elige del grupo que consiste de: antagonistas VEGF, anticuerpo anti-VEGF, antagonistas VEGFR1 y VEGFR2. En un aspecto aún adicional, el antagonista PN se elige del grupo que consiste de: antagonista de cualquiera de los marcadores PN indicados en la Tabla A, excepto por DLL3 , Nog, Oligl, 01ig2, THR y ASCL1. En un aspecto específico adicional, el agente de diferenciación neural se elige del grupo que consiste de: MAP2 , beta-tubulin, GAD65 y GAP43. Agentes de diferenciación nueral ejemplares incluyen pero no están limitados a: ácido retinoico, ácido valproico y sus derivados (por ejemplo, esteres, sales, retinoides, retinatos, valproatos, etc.); hormona tiroide u otros agonistas de receptor de hormona tiroide; noggin; BDNF, NT 4/5 u otros agonistas del receptor NTRK2 ; agentes que aumentan la expresión de los factores de transcripción ASCL1, 0LIG1; agonistas dll3, agonistas Notch 1, 2, 3 o 4, inhibidores de gamma secretasa, incluyendo inhibidores de molécula pequeña de nicastrin, AphlA, AphlB, Psenl, Psen2 y PSENEN, antagonistas de ligando tipo delta (Dll) -1, antagonistas de ligando tipo delta (Dll) -4, dentado 1, antagonista dentado 2; agonista numb o agonista tipo numb. En un aspecto específico, el resultado de este contacto es la proliferación disminuida o muerte de la célula de tumor. En otro aspecto, el antagonista es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno. Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo antagonista es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de cadena sencilla. En un aspecto específico adicional, el anticuerpo antagonista o fragmento de anticuerpo que enlaza antígeno se conjuga con un agente inhibitorio de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo por ejemplo, un maytansinoide o calicheamicina, una auristatina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica , o semej antes . En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de tratamiento terapéutico de un mamífero que tiene un tumor de glioma, en donde el método comprende: (i) medir la expresión de un conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM") en una muestra de tumor, (ii) determinar la firma de expresión de sub-clasificación proneural (PN) , proliferativa (Prolif) o mesenquimal {Mes), en donde: (I) tumores que exhiben una sub-clasificación Prolif se tratan con una terapia combinada que comprende administrar al mamífero cantidades terapéuticamente efectivas de (a) un antagonista Akt y/o un antagonista Prolif y/o un agente anti-mitótico, y (b) un agente de diferenciación neural; (II) tumores que exhiben una sub-clasificación Mes se tratan con una terapia combinada que comprende poner en contacto cantidades efectivas de (a) un antagonista Akt y Mes y/o agente anti-angiogénico, y (b) un agente de diferenciación neural; y (III) tumores que exhiben una sub-clasificación PN se tratan con una terapia combinada que comprende contacto con cantidades efectivas de: (1) un antagonista PN y/o (2) un agente de diferenciación neural opcionalmente en combinación con uno o más de lo siguiente: (3) un antagonista Akt, (4) un agente anti-mitótico, y (5) un antagonista Mes y/o un agente anti-angiogénico; y en donde el resultado es el tratamiento terapéutico del tumor. En un aspecto específico, el antagonista es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno, un oligopéptido, un antagonista de molécula pequeña, o un oligonucleót ido antisentido. En otro aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo de cadena sencilla. Todavía en otro aspecto, los antagonistas o agentes adecuados para utilizar con los presentes métodos, opcionalmente pueden conjugarse con un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo por ejemplo, un maytansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o semejantes. En una modalidad aún adicional, la presente invención se dirige a un método para determinar el nivel de expresión de un GDM -PN, -Prolif o -Mes en una muestra, en donde el método comprende exponer la muestra a agentes de enlace -PN, -Prolif o -Mes y determinar la cantidad de enlace de cada agente de enlace respectivo en la muestra, en donde la cantidad de enlace es indicativa del nivel de expresión del GDM - PN, -Prolif o -Mes respectivo en la muestra. En un aspecto específico, el agente de enlace -PN, -Prolif o -Mes es (1) un anticuerpo anti-PN- -anti-Prolif o anti-Mes, (2) un fragmento de anticuerpo de enlace -PN, -Prolif o -Mes, (3) un oligopéptido de enlace -PN, -Prolif o -Mes, (4) un antagonista de molécula pequeña -PN, -Prolif o -Mes, o un (5) oligonucleótido antisentido -PN, -Prolif o -Mes. En otro aspecto específico, los anticuerpos precedentes son: (a) un anticuerpo monoclonal, (b) un fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno, (c) un anticuerpo quimérico, (d) un anticuerpo humanizado, o (e) un anticuerpo de cadena sencilla. Todavía en otro aspecto específico, estos anticuerpos son etiquetados en forma detectable con una molécula de compuesto que es útil para determinar en forma cualitativa y/o cuantitativa la ubicación y/o cantidad de enlace del GDM -PN, -Prolif o -Mes . En una modalidad aún adicional, la presente invención se dirigie a un método para pronosticar la probabilidad de supervivencia en un mamífero que tiene un tumor de glioma, en donde el método comprende (a) retirar una muestra a prueba de tumor, (b) medir el nivel de expresión de producto de gen PTEN y DLL3 en la muestra de prueba y en un conjunto de gliomas con no menos de treinta (30) de alto grado para el cual se conocen tiempos de supervivencia de paciente, en donde un nivel superior de expresión tanto de PTEN y DLL3 la muestra de prueba es indicativa de una posibilidad estadísticamente elevada de tiempo se supervivencia mayor que la mediana de la población de muestra de referencia y un nivel menor de expresión ya sea de PTEN o DLL3 en la muestra de prueba es indicativo de una posibilidad estadísticamente elevada de tiempo de supervivencia menor que el promedio o la media de la población de muestra de referencia. En una modalidad aún adicional, la presente invención se dirige a un método para diagnosticar la severidad de un tumor de glioma en un mamífero, en donde el método comprende: (a) poner en contacto una muestra de prueba que comprende células de tumor de glioma o extractos de ADN, ARN, proteína u otros productos de gen que se obtienen del mamífero con (i) un primer reactivo que es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno, oligopéptido o molécula orgánica pequeña que liga a un PTEN GDM y (ii) un segundo reactivo que es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno, oligopéptido o molécula orgánica pequeña que liga a un DLL3 GDM; (b) medir la cantidad de formación de complejo entre el primero y segundo reactivos con PTEN GDM y DLL3 GDM en la muestra de prueba, respectivamente, en donde la formación de un alto nivel de formación de complejo PTEN GDM y alto nivel de formación de complejo DLL3 GDM es indicativo de un ligero tumor y la formación de un bajo nivel ya sea de complejo PTEN GDM o DLL3 GDM es indicativo de un severo tumor. En un aspecto específico, el primer y segundo reactivos se etiquetan en forma detectable, conectan a un soporte sólido o semejante. En otro aspecto específico, el primer reactivo es un anticuerpo anti-PTEN, fragmento de anticuerpo de enlace PTEN, u oligopéptido de enlace PTEN, molécula pequeña, oligonucleótido de antisentido. En otro aspecto específico adicional, el segundo reactivo puede ser un anticuerpo anti-DLL3, fragmento de anticuerpo de enlace DLL3 , u oligopéptido de enlace DLL3 , molécula pequeña o nucleótido antisentido. En un aspecto específico adicional, el anticuerpo anti-PTEN o anticuerpo anti-DLL3 puede ser un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de cadena sencilla. En un aspecto aún adicional específico, estos anticuerpos son etiquetados con una molécula o compuesto que es útil para determinar en forma cualitativa y/o cuantitativa la ubicación y/o cantidad de enlace del agente de enlace PTEN o DLL3 a la célula. En una modalidad aún adicional la invención se dirige al uso de: (a) PTEN, o polipéptido DLL3 , o (b) un ácido nucleico que codifica (a) , en la preparación de un medicamento útil para la detección de un diagnóstico de un tumor de glioma. En un aspecto específico, el medicamento puede ser un agente de enlace PTEN o un agente de enlace DLL3. En otro aspecto específico, el agente de enlace PTEN puede ser un anticuerpo anti-PTEN, fragmento de anticuerpo de enlace PTEN, u oligopéptido de enlace PTEN, antagonista de molécula pequeña, oligonucleótido antisentido, mientras que el agente de enlace DLL3 puede ser un anticuerpo anti-DLL3, fragmento de anticuerpo de enlace DLL3 , u oligopéptido de enlace DLL3 , molécula pequeña, oligonucleótido antisentido. Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpos de cadena sencilla. En un aspecto específico aún adicional, estos agentes de enlace PTEN o DLL3 se etiquetan con una molécula o compuesto que es útil para determinar en forma cualitativa y/o cuantitativa la ubicación y/o cantidad de enlace del agente de enlace PTEN o DLL3 a la célula. En una modalidad aún adicional, la invención se dirige al uso de: (a) un GDM -PN, -Prolif o -Mes, o (b) un ácido nucleico que codifica (a) , en la preparación de un medicamento útil para la detección de un diagnóstico de un tumor de glioma. En un aspecto específico, el medicamento es un agente de enlace -PN, -Prolif o -Mes. En otro aspecto específico, el agente de enlace -PN, Prolif o -Mes puede ser: (1) un anticuepro anti-PW, anti-Prolif o anti-Mes, (2) un fragmento de anticuerpo de enlace -PN, -Prolif o -Mes, (3) un oligopéptido de enlace -PN, -Prolif o -Mes, (4) una molécula pequeña de enlace -PN, -Prolif o -Mes, (5) un oligonucléotido anti-sentido -PN, -Prolif o -Mes. Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo anti-PN, anti-Prolií o anti-Mes puede ser un anticuerpo monoclonal , anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de cadena sencilla. En un aspecto aún adicional específico, estos agentes de enlace -PN, -Prolif o -Mes se etiquetan con una molécula o compuesto que es útil para determinar en forma cualitativa y/o cuantitativa la ubicación y/o cantidad de enlace del agente de enlace -PN, -Prolif o -Mes a la célula . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. El perfilado de expresión revela tres patrones principales de expresión de gen relacionados a supervivencia en glioma de alto grado A-l y A-2. Un enjambrado no supervisado de astrocitomas de grado primario III y IV de 76 MDA por expresión de 108 genes correlacionados en forma positiva o negativa con supervivencia (enjambres de genes etiquetados positivos o negativos) revelan tres enjambres de muestra (líneas gris oscuras) . B-l y B-2. subconjuntos de tumor PN, Prolif y Mes (como se indica) de las mismas 76 muestras se identifican utilizando 35 genes firma. Centroides de agrupamiento k-medias se ilustran utilizando valores de expresión de gen normalizados de calificación z (escala de -1 a +1) . C-E. Trazos de supervivencia Kaplan-Meier de datos de poblaciones de muestras MDA, UCSF, y UCLA. Valores p de pruebas de rango log ilustradas. Lineas gris claro, negras y gris corresponden a subclases PN, Prolif, y Mes, respectivamente. Señales verticales indican observaciones de supervivencia sensadas . F y G. Fuerte expresión de marcadores PN y Mes es mutuamente excluyente. Cada barra ilustra determinaciones ARNm por microhilera (F) o PCR de tiempo real Taqman (G) , de cuatro genes marcadores en una muestra individual . Genes incluyen BCAN, DLL3 , CHI311/YKL40 (YKL40) , y CD44 como se indica. Valores exhibidos representan Z calificaciones para expresión de gen de muestras individuales respecto a todo el conjunto de muestras. H. Hibridización ir¡ situ de BCAN y CHI3L1/YKL40 (YKL40) en núcleos de microhileras de tejido de 5 casos de glioma. Flechas indican expresión focal CHI3L1/YKL40 en núcleos positivos BCAN. Figura 2. La mayoría de los gliomas de alto grado se caracterizan por una fuerte similaridad con uno de tres patrones de expresión de gen de firma y desplazamiento de subclase ante avance de enfermedad son hacia el fenotipo Mes. A-C. Representación gráfica tri-dimensional en donde la posición ocupada por cada punto representa la similaridad (Spearman r) entre una muestra individual y cada uno de tres centroides definidos por agrupamiento de k-medias del conjunto de muestras de referencia ( DA) . A. Casi todos los tumores grado III tanto de morfología astrocítica (puntos negros) u oligodendroglial (puntos gris claro) son más similares al centroide PN mientras que la población de tumores grado IV (puntos grises) se divide más uniformemente por similaridad a los centroides. B. Conjuntos diferentes de células o tejidos normales semejan a cada uno de los tres centroides. Las muestras son como sigue: Cerebro fetal, cerebro de adulto (cerebro), dos líneas de células madre neurales derivadas de tejido fetal (NSC1, NSC2), Jurkat , células madre hematopoyéticas (HSC) , músculo liso (SmoMusc) , células endoteliales (endothel) , sinovio (synov) , y hueso. Líneas celulares madre neurales tratadas por exposición a y abstinencia del factor de crecimiento BDNF se designan NSC1* & NSC2* . C. 26 pares de astrocitomas primarios y recurrentes acoplados (gris = grado IV, negro = grado III) son representados. Cada par de especímenes acoplados se conecta por una flecha que es sólida y por ejemplo de desplazamiento de clase de firma. D. Genes de regulación ascendente significativa en casos que cambian en subclase Mes ante recurrencia. FC= cambio de pliegue E. IHC de CHI3L1/YKL40 y OLIG2 en tumores primarios y recurrentes acoplados de un caso que se somete a un cambio de fenotipo PN a Mes. Figura 3. Subclases de tumor se distinguen por expresión de marcadores por proliferación, angiogénesis , y neurogénesis . A-E. Círculos abiertos = cerebro, círculos o barras grises = PN, triángulos o barras negros = Prolif. , cuadrados o barras grises = Mes. A. Tumores Prolif se enriquecen por expresión de PCNA y T0P2A, p< 1 x 10"6 para comparaciones con todos los otros grupos. B. Tumores Mes se distinguen por expresión incrementada de PECAM, VEGF, VEGFR1 , y VEGFR2 , p <.05 para comparaciones con todos los otros grupos. C-l - C-6; D-l - D-6 y E. Respecto a tumores PN, tumores Prolif y/o Mes muestran más fuerte expresión de tronco neural y marcadores de amplificación de transmisión VIM, NES, TLX , CD133, MELK, y DLX2 (D) y expresión más débil de los marcadores de neuroblastos y neuronales OLIG2, MAP2 , DCX, NeuN, ERBB4 , y GAD2 (E) . Las estrellas indican diferencia significante de PN (p <.05 Bonferroni post-hoc después de ANOVA) . E. Expresión GFAP se disminuye significativamente en tumores Prolif respecto a ya sea tumores PN o MES . Figura 4. Cambios en número de copias en cromosoma 7, 10, y 19 difieren en subclases de tumor y esta diferencia se reflejan en firmas de expresión.

A. Frecuencias de cambios de número de copias de cromosomas 10, 7 y 19q como una función de subclase de firma de tumor. Para chr 10, se reportan tumores ya sea que no exhiben pérdidas, pérdidas confinadas a lOq que incluyen el sitio PTEN, y pérdidas esencialmente de todos los sitios. Para chr 7, los casos se califican como sin ganancias, ganancias de cualquier porción de chr 7, o ganancia de todos los sitios. Para chr 19q, casos se califican como ganancias o pérdidas sin más de 1/2 de los sitios muestran cambios de números de copias. B. Número de conjunto de sondas en listas de marcadores de tumor PN, Prolif, o Mes (como se etiquetan) en comparación con todos los conjuntos de sondas U133 A&B trazados como una función de ubicación de cromosoma. Figura 5. Tumores Prolif y Mes exhiben activación diferencial de cascadas de señalización Akt y Notch. Tumores PN, Prolif, y Mes denotados por círculos gris claros, triángulos negros y cuadrados grises, respectivamente. (A.) pérdida de PTEN y (B.) amplificación EGFR están asociados negativamente con firma PN, mientras que (C.) ganancia del sitio PIK3R3 se asocia positivamente con la firma Prolif. A-C Para cada muestra, el eje x exhibe la proporción CGH log2 que denota ganancias o pérdidas en el sitio muestreado mientras que el eje y indica correlación ya sea de centroide PN o Prolif, como se indica. Valores r indican coeficientes de correlación Pearson y Spearman entre las proporciones CGH y similaridades de centroide para firma de expresión. D. Niveles ARNm PTEN normalizados son menores en subtipos de tumor de pronóstico pobre comparado con la subclase de tumor PN. Líneas horizontales denotan medios de grupo. E - H. Tumores PN muestran fuerte sobre-expresión de los elementos de ruta Notch DLL3 , DLL1 , HEY2 , y ASCL1. I - J. Subclases de tumor difieren en tinción para p-Akt y Notch nuclear. Para cada subtipo de tumor, la fracción de muestras calificada como 0, 1, o 2 para p-Akt (J) o inmunotinción Notch nuclear (K) , se ilustra. Subtipos PN, Prolif, y Mes se indican por las tres gráficas de barras, respectivamente. Figura 6. Expresión de PTEN y DLL3 pronostica supervivencia en gastrocitoma de alto grado en dos conjuntos de muestras independientes (A y B) . Trazos en los paneles izquierdo y derecho ilustran funciones de supervivencia estimadas de cada población de muestra (n= 76 para A, n=34 para B) modelado para el caso de expresión PTEN en el 20° y 80° percentil (%-il) , respectivamente. Líneas negras y grises muestran supervivencia estimada para muestras con expresión DLL3 en el 20° y en el 80° %-il de expresión, respectivamente.

Figura 7. Firmas de expresión de líneas de células de glioma pronostica crecimiento de neuroesferas independiente de EGF/FGF. A. Ejemplos de cultivo de neuroesferas derivados de 5 líneas celulares y mantenidos en la presencia o ausencia de EGF+FGF. Ejemplos de líneas calificadas de 0-4 (como se indica) para crecimiento de la ausencia de EGF+FGF 4. B. Calificación de crecimiento de neuroesferas para 16 líneas celulares como una función de correlación de firma de expresión con los centroides Mes o Prolif. Figura 8. Resumen de subtipos de tumor (A) características principales de subtipos de tumor y (B) modelo que ilustra paralelos entre subtipos y etapas de tumor en neurogénesis . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Definiciones El término "glioma" se refiere a un tumor que surge de células gliales o sus precursores del cerebro o médula espinal. Los gliomas se definen histológicamente con base en sin exhiben morfología oligodendroglial o astrocítica primaria, y se gradúan por celularidad, atípia nuclear, necrosis, figuras mitósicas y proliferación microvascular - todas características asociadas con comportamiento biológicamente agresivo. Los astrocitomas son de dos tipos principales - de alto grado y de bajo grado. Tumores de alto grado crecen rápidamente, están bien vascularizados y pueden dispersarse fácilmente a través del cerebro. Astrocitomas de bajo grado usualmente se localizan y crecen lentamente sobre un periodo prolongado de tiempo. Tumores de alto grado son mucho más agresivos, requieren terapia muy intensa y se asocian con duraciones de tiempo de supervivencia más cortas que los tumores de bajo grado. La mayoría de tumores astrocíticos en niños son de bajo grado, mientras que la mayoría en los adultos son de alto grado. Estos tumores pueden ocurrir en cualquier punto en el cerebro y médula espinal. Algunos de los astrocitomas de bajo grado más comunes son astrocitoma pilocítico juvenil (JPA= Juvenile Pilocytic Astrocytoma) , Xantroastrocitoma Pleomórfico-astrocitoma fibrilar (PXA= Fibrilary Astrocitoma Pleomorphic) y tumor neuroepitelial desembrioplástico (DNET= Desembryoplastic Neuroepithelial Tumor) . Los dos astrocitomas de alto grado más comunes son Astrocitoma Anaplásico (AA= Anaplastic Astrocytoma) y Glioblastoma Multiforme (GBM= Glioblastoma Multiforme) . Los términos "marcador o marcadores determinantes de glioma" ("GDM") como se emplea aquí, se refieren a marcadores celulares que están comúnmente asociados con gliomas. Este término abarca tanto el gen que codifica el marcador (por ejemplo, ADN, amplificación de gen) así como productos de genes que resultan de su trascripción (por ejemplo, ARNm, polipéptidos codificados) . Marcadores GDM pueden ser distintivos de las subclasificaciones proneural (PN) , proliferativo (Prolif) o mesenquimal {Mes) como se ilustra en la Tabla Tabla A Marcadores de determinación de glioma (GDM= Glioma Determinative Markers) Prolif ' - s ' -» -, " . - ·.» · . . ' * . Número de. Núrnero¾|-: Número de ' « gen acceso ID de sonda de af. í Gen JÉesó 't' .. ¾*.3 ¾¾nda]¾¾ ¾:: gen" " ¾ *v . acceso ¾· !D de sonda af. Sí NCAM1 AI569787 229799_s_at USP1 AW499935 202412_s_at MYH9 AI827941 211926_s_at Rpll3 AI369389 229590 at CDK2 M68520 204252 at DLC1 AF026219 210762 s at AP1G2 BF513474 226918_at SMC4L1 AL136877 201654_at TI P1 NM_003254 201666_at JDP1 NMJ21800 218976 at RR 1 NM.001033 201477 s at OSM R NM 003999 205729 at Cllorf2 N _013265 217969.at DHFR N _000791 202534_x_at FÜ10945 NM.018280 220681_at FAM13C1 AI829726 226623 at PMSCL1 N .005033 205061 s at PTRF BC004295 208789 at NCAM1 M22094 217359_s_at DEK N .003472 200934_at HRH1 D28481 205580 j.at DKFZp761C ABHD6 BC001698 221552_at 121 AL136560 223542_at CH13L1 M80927 209396_s_at AP2B1 NM 001282 200612 s at BRCA1 NM 007295 204531 s at PVRL2 BE867789 232079 s at CYFIP2 AL161999 215785_s_at HMGB2 BC000903 208808_s_at C20orfl63 AW298115 230283. at VGCNL1 N49852 228608 at NY - REN - 41 AI458313 226287 at COL4A2 AA909035 211966 at O G N .002544 207093_sjt MCM6 N .005915 201930_at TIA - 2 AU154455 221898_at ASB13 NM_024701 218862 at FKSG14 BC005400 222848 at E P3 NM_001425 203729 at FLRT1 AF169675 21 0414_at KIAA0186 NM.021067 206102_at TRIM56 AL512757 231876_at CRYAB AF007162 209283 at RBBP8 NM_002894 203344 s at KIAA0963 NM_014963 204166 at SOX8 BF527050 226913_s.at DHFR BC000192 202532_s.at DLC1 AA524250 224822_at ATP6V1G2 BF340635 214762 at ms N 001071 202589 at S100A11 N _005620 200660 at GALNT13 BF346193 243779_at LSM5 BC005938 211747_s_at FGFRL1 AF312678 223321_s_at HDAC5 NMJ05474 202455 at DHFR AI144299 48808 at CHI3L1 M80927 209395 at TNKS2 NMJ25235 218228 j.at C20ORF172 NM.024918 21 9512_at MAP2K3 AA780381 215498_s_at FGF12 AL119322 214589 at PIR51 BE966146 204146 at MSCP BE677761 221920 s at SKIP BE549786 228509_at WDHD1 AK001538 216228_s.at ITGA5 NM.002205 201389_at GALNT13 R38990 236536 at DONSON AF232674 221677 s at CLN2 AA6025 32 214196 s at MGC1136 NM.024025 219144_at ITGB3BP N .014288 205176_s_at TMEPAI NM_020182 217875_s_at FGF12 NMJ04113 207501 s at P SCL1 AI346350 213226 at ENIGMA NM_005451 203370 s at DSCAML1 AI433419 232059_at NUCB2 N _005013 203675 jt DEF6 NM.022047 221293 Jjt FU90798 AA131324 21241 Jt 96 NM_007358 203347.s.at CD151 N _004357 204306_s_at ELM01 NM 014800 204513 _s_at LSM5 NM_012322 202904_s_at SLC22A1L NM_002555 204981 at PCSK1N NM 013271 218952_at NASP NMJM2482 201970_s_at EMP1 BF445047 213895_ at CKLFSF5 AJ147740 230942 at BRIP1 BF056791 235609 at EFE P2 AB030655 209356 x at OUGl AL355743 228170_at GMPS NM_003875 214431_at SERP1NA1 NM_000295 202833 j_at SRRM2 BE464483 227984 at E2F7 AI341146 228033 at C1QTNF1 AF232905 224197 s at FGF12(3') AV707343 23852 l_at Ect2 NM_018098 219787_s_at EPAS1 NM_001430 2O0879_s_at IR AA770170 221824 s at PCNA NM_002592 201202 3t FOSL2 N36408 218880 at GLUD1 AI339331 200946_x_at KIAA0101 NM.014736 202503_s_at C1QTNF1 NM.030968 220975_s_at RAP2B N .002886 21 4487 s at ORC6L N .014321 219105 x at COL4A1 N 001845 211981 at NINGUNO BF724210 224763_at CGI - 09 BE897074 222768 jjt SOCS3 BG035761 206359_at NCA 1 BF348061 214952 at LOC388279 AA954994 238021_s_at CD164L1 NM_020404 219025_at P2RX7 NMJ02562 207091_at G GH NM.O03878 203560_at ICAM1 NM.000201 202638_s_at FXYD6 NM.022003 217897 at TRIPIN AW965339 235425 at FPRL1 M88107 210772 at APOE NM_000041 203382.s.at KIAA0895 AB020702 213424_at HS03B7 BC004929 222817_at PLCB1 AA393484 215687 x at FÜ10036 AA824298 2 22606 at MGC10204 AI674922 227592 at GRID1 N48357 231977.at MAGOH AF067173 2100 3_s_at EDG2 AW269335 204036_at MAPT AA199717 225379_at TOP2A AU159942 201291 s at BHLHB2 BG326045 201169 s at TMOD2 AW207699 226186.at FU22028 A1962943 212918.at PLAUR U088 39 210845_s_at LOC388538 P NOX2 AK023792 222171_s_at NINGUNO AA430014 228776_at (31) BE673775 230046_at C6orfl59 AW511485 236771 at FBX05 NM_012177 218875 s at MMP14 AU149305 202827 s at C20ORF58 BF593263 228017_s.at TRIPIN N31731 230165_at NRP2 AF022859 2 11844_s_at C20orf42 BF591031 229545 at ASK N .006716 204244 s at UGP2 AV661152 231698 at ARL3 AF038193 213433_at HCAP - G N .022346 218663 jt RAB34 AF322067 224710_at NAP1L3 NM.004538 204749 at SHF 1 NM_006304 202276 at TUWD12 NM 003774 220442 at APT Al 870749 203928_x.at IQGAP3 AW271106 229490_s.at IFITM2 NMJ06435 201315_x_at THRA M24899 35846 at FU233U NMJK4680 219990 at SLC12A9 BC000154 223994 s at NDRG2 M.016250 206453_s_at FOXD4L1 NMJ20667 220175_s_at COL4A2 X05610 211964_at C14orf59 AI36319 3 229875 at PRIM2A NMJ00947 205628 at LOC284207 BG231494 225955 at GLUD2 AC006144 215794_x_at HMMR NMJ12485 207165.at PTRF AF312393 208790.s.at EHD3 NM 014600 218935 at CDCA7 AY029179 224428 s at ITGA3 NM 002204 201474 s at WSM32627 AU145402 232192 a t MGC5576 NM_024056 201764 at PLAUR AY029180 211924 s at APOE N33009 203381 Jjt ZF NM.021212 202979.s_at FA 20C 8E874872 226722 jt GALNT13 AC0O9227 234472 at HEC NM_006101 204162 at KIAA0963 AC005390 215760 s at MGC14126 GNAL AI082827 214071_at (3') AW 665748 230860.at SLC39A8 NM 022154 219869 _s_at DKFZP434G FU37659 AA909330 23U31.at 2226 NM.031217 221258 jjt FINA AI625550 214752_xjt THADA FAIM2 NM.012306 203619 jjt RAMP NM.016448 218585_sjt (intrón) AI674059 238938 Jt C10orf30 A 195407 227341_at TO 1L1 NM.005486 204485 Jjt EFNB2 U16797 20266 jjt GC32 NM.014O59 218723_s_at HELLS(3') AI889959 227350_at NRP1 AF145712 210510 s at MAPT J03778 206401_s_at STK18 AL043646 204886 jt HO ER3 AC002985 222222 jjt MAPT AI056359 203929 s at NJ U - Rl NM_0 22344 203830 at FU25348 BF689253 235417 at GRIK4 N _014619 208552 jt CCNB1 N90191 22872 jt RUNX1 D43968 209360_s_at MGC20785 AW173080 2 1729 at GAJ AY028916 223700 at ACTN1 BC003576 208637 x at PLCB1 AL049593 213222 jt TCF19 BC002493 223274_at ACTN1 M 95178 211160 _xjt AOAM22 AW242701 213411 at ABCA5 BF693921 213353 at TNFRSF10D AI738556 227345 at DLL3 N .Q16941 219537_x_at T2BP AA195074 226U7.at IFIT 3 BF338947 212203. J¡ TPCN2 AL137479 231978 at HCAP - G NM.022346 218662 s at OSBPL3 AI202969 209626 s at ABUM1 N _006720 200965 jjt EZH2 NM_004456 203358.s_at SERPINE1 AL574210 202627.sjt NINGUNO BE223030 213841 at SIP AF275803 210691 s at FLNA AW051856 213746 s at NINGUNO N47328 239509.at WEE1 X62048 212533.at YL9 NM.006097 201058 jjt PDE2A NM.00259 9 204134 at CHEK1 AA224205 238075 at PVRL2 BE867789 232078 at EPB41L2 BF511685 201718_s_at FSHPRH1 BF793446 214804_at TIA - 2 AW590196 226658 jt C20ORF58 BF593263 228018 at FU10706 NM_018186 220840 s at BACE2 NM_012105 217867 x at ARPP - 21 AL133109 231935 _at LOC388279 AA954994 238022_at VP NMJ17458 202180 jjt KLRC3 NU 002261 207723 s at Stk6 NM 003158 208079 s at FAM20C AK026140 229438 at AF038169 (intrón) AW665278 23033 jt FU20060 N _017645 218602.s.at CD97 NM_001784 202910 jjt HBT8 BG413612 2265 91_at MGC12458 BC002836 211200_s_at TAGLN NM_O03186 205547_s_at ABHD6 AF225418 221679 s at ZNF367 N62196 229551 x at SGSH NM_000199 204293 at SOX6 AF309034 223865 jt NINGUNO AA969238 227793 jt TIA - 2 NM.006474 204879 jt NINGUNO AV724769 235118 at FU10292 NM_0 18048 218894 s at ECE1 NM_001397 201750 S at RRP22 NM.006477 206850 jt BARD1 NM_000465 205345.at GARP NM_005512 203835 jt DLL3 BE350882 222898 s at TMEM14B BC001033 223133 at PLEKHF1 NM 024310 219566 at PIPPIN AL023553 20998 ljt MGC14801 BC005997 224443 _at UF NM 002309 205266_at EPHB1 AF037333 211898 s at ABHD3 AL534702 213017_at TSAP6 N 018234 218424 s at NINGUNO BF433749 241255_at tt? NM_003318 204822 jt TNC N _002160 201645_at GCU279 NM_024326 218938 jt KIF14 AW183154 236641 at SALL4 NM_02O436 229 661 at PARD3 AF196185 221527_s.at NPHP1 BF216535 238843_at PAPPA BG434272 224942 Jt FU20581 AI733019 89977 at FU20105 NM_017669 219650 at FGG AI133452 226621 at dA201G10.1 AF070565 232833 jt KNTC1 NM_014708 206316_s_at ANGPTL4 AF169312 223333_s_at SN AP91 NM.01484I 204953 at MAD2L1 NM.002358 203362 s at ANGPT2 AF187858 211148 s at GABBRl NM.001470 203146 s at CDC6 U77949 203967_at ACTA2 NM_001613 200974_at NINGUNO H12055 240869 jt FLJ20641 NM.017915 220060_s.at ICAM1 AI608725 202637_s_at PAPPA B3GAT1 NM 0186 44 219521_at ANAPC7 NM.0O4856 204709_s.at (intrón) AU156721 232748_at NINGUNO N63005 236576_at RFC4 NM_002916 204023_at WARP AW292148 222723_at FAM13C1 U79304 214914 at CCNE2 NM_004702 205034_at ARHJ AI583530 235489 at APOE AI358867 212884_x_at EIF1A BE542684 201016_at ZYX N _003461 200808_s_at NINGUNO BF724178 229613 at GC20486 BG338983 224715 at FES NM_002O05 205418 at GAB2 NM_012296 203853 jjt SIP1 NMJM3616 205063_at ITGA1 X68742 214660 _at RTN1 BC00031 210222 s at ELK N _014791 204825 at FOSL2 AI670862 225262 at SOX6 AI480314 227498 jt LOC115106 AV715391 225297jt FU14464 AL040631 226401_at MCF2 NM_005369 208017 s at TTC12 NM_017868 219587 at EHD2 AI417917 221870 at GPR27 AI703476 227769_at CCDC2 NM.025103 219174 jt PDC01LG1 AI608902 227458 _at NDRG2 W74452 214279 s at POLG W74442 213007 at LOC255783 AW172584 227325 at MPPE1 BF476502 213924_at IAA0912 AI130715 239413_at ITGA7 AF072132 209663 _s_at BCAN AF229053 221623 at FU10493 NM.018112 218772 x at UNC93B1 A 001274 225869 s at RGC32 Al 744499 228193.s.at FU32745 BF213953 235644 jt ANPEP NM_001150 202888_s_at NINGUNO H39185 240433 x at PIN4 BE674061 214224 s 3t ShrmL AB040914 225548 at PTGDS NM.000954 212187 jcjt SMC2L1 NM.006444 204240 j_at PLAU K03226 211668 jjt KCNB1 L02840 211006 s at KLAA0101 BC005832 211713 x at BCL3 N 005178 204908 s at NINGUNO A1984607 227425 jt SMC4L1 NM.005496 201663.s.at FLT1 U01134 210287_sjt KIAA0820 AL136712 209839 at KUP1 NM_024629 218883_s_at MSCP BG251467 222528 s at SCG3 NM_013243 219196jt FU10036 NM.017975 218349 _s_at PP2447 BG399562 221807 jjt SNRPN AU118874 214834 at d]383J4.3 N29457 232065 x at PYG02 AIO91079 214853 s at SLC18A2 AI890972 213549 at PPIL5 AA742244 235113 at PI3 L10343 41469 at HSPA12A A8007877 21443 Jt AQP1 NM_0O1107 205260. s.at EOG2 BF055366 204037_at 13CDNA73 NM_023037 204072 at XRCC4 AB017445 205071 x at SERPINE1 NM.000602 202628 s at MY01D NTRK2 BE858459 236095 jt CHNL28862 AW293376 237585_at (¡ntrón) AI821121 241645_at C20orf42 M469071 60474 at CDKN2C NM.001262 204 159_at RUNX1 L34598 209359.x_at RIMS2 NM 014677 206137 jt PPIC BE962749 204517 at GGN AA421493 231420 at DKFZp762E 0V0L1 NM_00 561 20660 Jt 1312 NM.018410 218726.at PDGFRL NM 006207 205226.at KIAA1244 AIS79261 228051_at MNS1 NM.018365 219703.at C0L4A1 A I922605 211980_at ALDOC NM.005165 202022 jt CHNL28862 AA625683 236915_at NINGUNO BE045384 230501 at N1 NM.002430 205330 Jt MGC13102 BC005094 223544 PLA2G5 AL158172 215870.s.at LOC338645 X81895 215323 at KÍF14 NM_014875 206364 at ANGPT2 NM 001147 205572 at SO BS1 AF136381 211819_s_at PAWR NM.002583 204O05.s.at SERPINH1 NM.004353 207714_s_at C20orf42 N .017671 218796 at TMPO AL566034 224944 at KLF16 BF590630 226328 at RAB6B AW118072 221792 Jt TOP2A AL561834 201292.at FLT1 AA149648 226498 MAPK8IP2 N .012324 205050 at CGI - 09 AB032979 233970.s.at FU20699 NM.017931 218272 at ALDH5A1 NM.001080 203609 jjt NINGUNO AW262022 232242.at SOCS3 AI244908 227697_at LR C4 Af 196976 223552_at IL13RA2 NM.000640 206172 at SERPINA1 AF119873 211429 at NINGUNO N50714 2 36038_at MLF1 NM.022443 204784_sjt THBO NM.000361 203888.at NUMA1 AI337584 214251 s at FBX05 AK026197 234863.xjt LOC56926 AA781143 222206 s at 104 U16153 209293 j.at CHAF1B NM_005441 204775_at FUMA NMJW1456 20O859_x.at FU20581 NMJ17888 220061 at CH EK1 NM.001274 205394 at ITGA7 AI827972 227055 at THRA NM_0O325O 204100_at LOC51668 N _016126 203960.s.at RRBP1 AA706065 201204.s_at WNT7B BE736994 217681 at PPIG U40763 208995 s at RYR3 NM.001036 206306 at DLGAP1 U55983 23552 jt Stk6 N .003600 204092 .at PI3 NM.002638 203691 jt PLE HB1 AF081583 209504 s at PRPS2 N .002765 203401 at PLA2G5 NM.000929 206178 at C20ORF58 AI569665 23077 l.at TRIM36 N .018700 219736.at HK3 NM.002115 205936.s_at PSD NM.002779 208102_s_at LMNB1 N .006573 203276 at LZTS1 NM 0 21020 219042 at SM0C1 BF516292 222783_s_at NEK2 NM.002497 20464 l.at PDGFA NM.002607 205463.s t NTRK2 R39159 229463 at MGC14289 AI188445 228280 at GPR116 N95226 212951 at 0UG2 AA757419 213825_at RRM2 BE966236 201890.at THBD NM.000361 203887_s_at SH3GL 2 NM.003026 205751 at PAWR AI189509 226231 at RIL BC003096 211564 at DLL3 AW341182 230568 x at ARNTL2 AF231339 224204_xjt PTK9 AA827894 243033 at CRF N JW6688 205575 jt ASPM NM_01S123 219918 J t C1RL NM.016546 218983 jt MGC20785 BE552411 236290 at PAWR AI091432 226223 at T IM47 AW249467 225868 at KIF5A NM_0O4984 205318_at RPA3 BCO05264 209507 jt FBXL9 AF176701 232545 jt GRIA2 NM 000826 205358 at CCNB1 BE407516 214710 s at LOC151300 AI125183 239507 at ASRG13336 AW300 83 23628 t PAIP1 NM.006451 2 0805U Jt FCGR2A U90939 210992.x Jt SCD AF132203 223839 s at ANKRD5 NM_022096 220144 S at KIAA0233 NMJ14745 202771 jt NINGUNO AW242720 227550_at NINGUNO AI220427 230696 jt 3UNB NM.002229 201473 jt RT 1 NM 021136 203485 jt EMP2 AV686514 225078 at PML BC00008 0 211012_s.at OLIG2 AI870776 213824_at LOC400802 BF508679 230121 jt SLC16A3 NMJ04207 202856_s_at GRIA4 H20055 238663 x at XM 377845 AI822134 238865 at ITGA7 AK022548 216331 at C5orfl2 (intreón) A1700633 212812_at ACN9 NM 020186 218981 Jt FU43339 BE6732 26 227272 jt SATB1(3') AA002140 241365 at MCM2 N .004526 202107 s at CA12 BC000278 210735 s at SLC25A21 AA770060 230307_at RAD51 D14134 205023 Jt ESM1 NM_007036 20839 _x_at LOC91752 AF052145 215767 at CHEK1 NM.001274 205393 s at FBN1 AI264196 202765 s a t CALCRL M478743 234996 t CDKN2A NM_000077 207039 Jt N 4 NM.004221 203828 jjt KIAA0843 NM 014945 205730 s at FANCD2 AA579890 242560 at B4GALT1 AV687517 228498 at CALN1 AF282250 223885_at TIMELESS NM.003920 203046 Jjt C1R AL573058 212067_s_at TMLHE N 018196 218790 S at GCLM NM.002061 203925 Jt CECR2 AB051527 233695 s at FU12571 LOC255426 AI828026 236748 Jt (3') BF664545 235949 Jt FGF14 NM.004115 221310_at KIF4A N J12310 218355 jt EPHB1 AF037334 210753 s at CDCA1 AF326731 223381 at ARR Bl(3') AL157484 221861jt CHAF1A NM 005483 203976 jjt C19orf4 NM.012109 219005 at FLJ12571 NM_024926 219758 at HBT8 BE783065 226587 jt Pfs2 BC003186 221521jjt BMP2 NM.001200 205290 s at FLJ90806 A1469788 235572 at PACE4 NMJW2570 207414. s.at NUSAP1 N .018454 219978_s_at KIAA0937 AV728526 212611 at DHFR BC003584 202533 Jjt FU20701 NM.017933 219093_at APG12L NM.004707 204833 Jt NINGUNO BF224377 231214 at HT021 NM_020685 219288 at NINGUNO AU90170 213904_at ZWINT NM.007057 204026 jjt SCD BC005807 211708 s at BUB1 AF043294 209642 at KIF5A BF196255 229921 at DLG7 NM.014750 203764 jt DKFZp761D112 AL136588 223614_at AAT1 N62817 236222_at CSMD3 AI187364 240228 at LOC161577 AA020920 243198 at NINGUNO AI692426 230551_at PD 1 AUH6532 226452 jt SLIT1 AB011537 213601 at C S2 N .001827 204170 s at ADCY2 AU149572 213217_at HIC AF054589 211675_s_at DKFZp586G DPP10 AL538781 228598_at 0123 NM.013386 204342.at Nrg3 H05240 229233 at CENPA NM.001809 204962 s at SL L4764 AA017721 214046_at CDC2 AL524035 203213_at 10 0SCAM(3') BF941609 240218 at GAS41 N 006530 218911 at DSCAM AF023450 211484.s.at PEG10 AL582836 212094_at FSD1 NM.024333 219170_at LOC139886 AU145277 228654 at PTGDS BC005939 211748_x_at EVC2 AA234305 229974 jt JPH3 N J20655 220188 at BRRN1 038553 212949 at 15 NINGUNO BF345233 228679_at ABCA5 AI568925 241705_at ASCL1 BC002341 209987_s_at CDKN2A U38945 209644 x at PLCB1 AY004175 211925_s_at HMMR U29343 209709_s_at MAPK10(3') AI2630 4 214376 at CENPE NM 001813 205046 at UNQ470 AL541276 228403_at E2F1 NM M5225 204947_at 20 T0P2A LOC340554 AW007160 229234_at (intrón) T96523 23746 jt GNA01 BE670563 204762 s at CDC6 NM 001254 203968 s at GAD1 N _0OO817 205278 jt BCAA BG492359 226936_at CLONE25003 N66656 229655 at SIL NM_003035 205339 at 25 RhoGAP2 N _021226 206298_at RNPC6 AI677701 2350O4.at FGF12 (intrón) 060438 240067 _at FU12973 AJ220472 239680_at GRIA2 BE219628 236538_at FLJ90440 AI627704 226908 at REPRIMO NM_019845 219370_at CDC25C N .O01790 205167_s.at 30 LAA086K3') AI186173 242651 at KLIP1 AA460299 229305 at ARRB1(3') N80935 49Ul.at CENPF U30872 209172_s_at ARRB1(3') AI201594 43511 s at FBX011 N 025133 219208 at GPR49 AL524520 2 13880_at MGC14801 BC005997 224444 s at GNAL R20102 206355 jt G?6?2 N95414 22731 jt TPM1 NM.000366 206117 at BM039 N _018455 219555 s at GP 51 AF069755 209991 JA SHOX2 NM.006884 208443 _x.at GC20785 AL120332 231980 at NINGUNO AA706282 244184 jt UBE1C BE221817 229831 at D FZp547D2210 AI186464 228165.at TR1M31 X81006 215 44_s_at EB - 1 AW005572 227440_at 10 NEU4 A 02561 222957 at NINGUNO AW450397 236433.at CECR6 AF307451 224393 s at LOC286 097 AI868167 238458 jt FU 10970 NM 018286 219230 at 15 RPIP8 NMJXJ6695 206196 _s_at RGC32 BG542501 239827 at SSTR1 R62424 23559 l.at SLC1A1 AW235061 213664 at KIAA0527 BF977837 214954 jt 20 FU20300 N _017753 219732 at DLL1 AF196571 224215_sjt SALF(intrón) AL049443 215306 at GPR86 NMJ23914 220005 jt GPR158 R41459 232195 at 25 C20orfl9 NM_018474 219961_s_at WSM32627(3') R39126 230932 at CNTN1 U07820 211203_s_at N TN4 AF278532 223315 at PDK4 NM_002612 205960.at 30 CDR1 NM 004065 207276 at NET1 NM.005863 201830_s_at SHD AW452918 227845 s at LOC254559 AI611973 238603 at 30 GS9 NM.003835 206518_S_at NINGUNO AF339807 215469_at GABRB3 AJ693153 22972 jt VMP R38624 239293 at ME T1 AB014516 213091_at TAL1 X51990 216925 s at GPR51 AF095723 217077_s.at NINGUNO AI656867 231103 at SUTRK2 AL109653 233051_at KIF21B NM 017596 204411 at KCNN3 NM_002249 205903_s_at SGCG N .000231 207302 at RAC3 NM_005052 206103_at ZNF488 AI056483 229901 at S0RCS3 AB028982 215522 t IAA1941 BE222282 230287 at FGF13 NM_004114 205110_sjt PKP4 AL050364 214874 at REPS2(3') AW962020 242571 jt 20 NINGUNO BF513800 244623 at OPCML AF070577 214111_at CNTN1 AW072790 227202 at NINGUNO AI374686 24 4218 Jt Maf BF508646 209347 s at 25 SUTRK5 AW449813 214930 jt SCAPIN1 AL357503 227949 at HS3ST4 AF105378 228206 jt alfa - 1,3 - galactosil 30 transiera sa tipol AI972498 228376 at NINGUNO AW269887 236333 jt FBX02 NM 012 168 219305 x at GPRC5B AF202640 203631_s_at MGC39325 BE672313 221959 at SEC31L2 AF274863 209889_at CCNK NM.003858 219273 at KLRC3 NMJ02260 206785_s_at AKR1C1 S68290 216594_x_at ATSV AL533416 225482_at PDK2 AI870615 213724 s at CLONE25003 AV723914 229459 jt 10 NOG AL575177 231798 at SHREW1 AA835004 215789 jjt RASSF4 AF260335 221578 at BCAN NM_021948 219107 jt 1L17D BE856748 227401 at USH1C AB006955 211184_ sjt NTRK2 BF674712 214680 at RPL5 U66589 210035 J.at SEZ6L BE672217 231650 s at 20 t ?? NM.020659 219415_at PTGOS 61900 211663 x at KIAA1713(3') AF070541 214162_at HLF W60800 204754 at TIMP4 N .003256 206243jt 25 KCTD4 N52767 239787 at TNKS2 H03262 241909_at L0C387944(3') H09780 230869 at SCD AF116616 211162_xjt Un "polipéptido GDM de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido GDM correspondiente derivado de la naturaleza. Estos polipéptidos GDM de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido GDM de secuencia nativa" específicamente abarca formas secretadas o truncadas de origen natural del polipéptido GDM específico (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas combinadas en forma alterna) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. En ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos GDM de secuencia nativa aquí descritos son polipéptidos de secuencia nativa de longitud completa o maduros que corresponden a los polipéptidos descritos en la Tabla A. "Variante de polipéptidos GDM" significa un polipéptido GDM que de preferencia sus formas activas, como aquí se define, que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de polipéptidos GDM de secuencia nativa de longitud íntegra, como aquí se describe, y sus formas variantes que carecen de péptido de señal, un dominio extracelular, o cualquier otro fragmento de un polipéptido GDM de secuencia nativa de longitud completa tal como aquellos aquí referidos. Estos polipéptidos variantes incluyen por ejemplo polipéptidos en donde uno o más residuos aminoácido se agregan, o eliminan, en el extremo N- o C- de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud íntegra. En un aspecto específico, estos polipéptidos variantes tendrán al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% en identidad de secuencia de aminoácidos a un polipéptido de secuencia de polipéptido GDM de secuencia nativa de longitud íntegra como se describe aquí, y sus formas variantes que carecen del péptido de señal, un dominio extracelular, o cualquier otro fragmento o polipéptido polipéptido GDM de secuencia nativa de longitud íntegra, tales como aquellos aquí descritos. En un aspecto específico, estos polipéptidos variantes, variarán al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300 o más residuos aminoácido en longitud del polipéptido de secuencia nativa correspondiente. En forma alterna, estos polipéptidos variantes no tendrán más que una sustitución de aminoácido concebadora en comparación con la secuencia de polipéptido nativo correspondiente, en forma alterna no más que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de aminoácidos concebadores en comparación con la secuencia de polipeptidos nativa. "Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias polipéptido GD aquí identificadas como se define como el por ciento de residuos aminoácido en una secuencia candidato que son idénticos con los residuos aminoácido en la secuencia de polipéptido GDM específica, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia, y sin considerar sustituciones concebadoras como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la especialidad, por ejemplo, utilizando el programa de computadora disponible al público tal como el programa BLAST, BLAST-2 , ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos con destreza en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir alineamiento, incluyendo cualesquiera algoritmos requeridos para lograr máximo alineamiento sobre la longitud íntegra se secuencias comparadas. Para los presentes propósitos, sin embargo valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa de computadora para comparación de secuencia ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la siguiente Tabla 1. El programa de computadora para comparación de secuencia ALIGN-2 tiene como autor Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 siguiente se ha identificado con la documentación de usuario en la oficina de derechos de autor de los E.U.A. (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, en donde está registrado con el Número de derechos de autor de los E.U.A. Número TXU510087. El programa ALIGN-2 esta disponible al público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse del código fuente que se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 deberá compilarse para utilizar en un sistema operativo UNIX, de preferencia UNIX V4.0D digital . Todos los parámetros de comparación de secuencia se ajustan por el programa ALIGN-2 y no varían. " Polinucleótido variante GDM" o "Secuencia de aminoácidos variantes GDM" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido GDM, de preferencia sus formas activas, como se define aquí, y que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polipeptido GDM de secuencia nativa de longitud íntegra aquí identificada o cualquier otro fragmento de la secuencia de polipéptido GDM de longitud íntegra respectivo como aquí se identifica (tales como aquellos codificados por un ácido nucleico que representa solo una porción de la secuencia de codificación completa para un polipéptido GDM de longitud íntegra) . De manera ordinaria, estos polinucleótidos variantes tendrán al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de polipéptido GDM y secuencia nativa de longitud íntegra respectiva o cualquier otro fragmento de la secuencia de polipéptido GDM de longitud íntegra respectivo aquí identificado. Estos polinucleótidos variantes no abarcan la secuencia de nucleótidos nativa. De manera ordinaria, estos polinucleótidos variantes, varía al menos aproximadamente 50 nucleótidos en longitud del polipéptido de secuencia nativa, en forma alterna la variancia puede ser de al menos aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 , 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770 , 780 , 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, o 1000 nucleótidos de longitud, en donde este contexto, el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia de nucleótidos referida más o menos 10% de esa longitud referida. "Por ciento (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptido GDM aquí identificadas, se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidato que son idénticos con los nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico GDM, de interés, respectivamente, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia. El alineamiento para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de ácido nucleico puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la técnica, por ejemplo utilizando el programa de computadora disponible al público tal como el programa BLAST, BLAST-2 , ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Para los presentes propósitos, sin embargo, valores de por ciento de identidad de secuencia de ácido nucleico se generan utilizando el programa de computadora para comparación de secuencia ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2 tiene como autor Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 siguiente se han presentado con la documentación de usuario en la oficina de derecho de autor de los E.U.A. (U.S. Copyright Office) Washington D.C., 20559, en donde esta registrado bajo en Número de derechos de autor de los E.U.A. TXU510087. El programa ALIGN-2 esta disponible al público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede ser compilado del código fuente que se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 deberá compilarse para utilizar en un sistema operativo UNIX, de preferencia UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se ajustan por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencias de ácido nucleico, el por ciento de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico determinada C a, con o contra una secuencia de ácido nucleico D (que puede ser en forma alterna determinado como una secuencia de ácido nucleico C que tiene o comprende un cierto % de identidad de ácido nucleico a, con o contra una secuencia de ácido nucleico D determinada) se calcula como sigue: 100 veces por la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencia ALIGN-2 en ese alineamiento de programa de C y D, en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de secuencia de ácido nucleico D, el por ciento de identidad de secuencia de ácido nucleico de C y D no se verá igual al por ciento de identidad de secuencia de ácido nucleico de D y C . Como ejemplos de cálculos de por ciento de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, las tablas 4 y 5, demuestran como calcular el por ciento de identidad de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico designada "ADN comparación" con la secuencia de ácido nucleico designada "ADN- ref" (REF-DNA) en donde "ADN-REF" representa una secuencia de ácido nucleico que codifica GDM hipotético de interés. "ADN de comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la cual la molécula de ácido nucleico "ADN-REF" de interés se compara, y "N" , "L" y "V" cada uno representan diferentes nucleótidos hipotéticos. A menos de que se establezca específicamente de otra forma, todos los valores de por ciento de identidad de secuencia de ácido nucleico aquí empleados, se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2. En otras modalidades, polinucleotidos variantes GDM son moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos GDM, y que son capaces de hibridizar, de preferencia bajo condiciones de lavado e hibridización severas, a secuencias nucleótido que codifican un polipéptido GDM de longitud íntegra, como se describe aquí. Estos polipéptidos variantes pueden ser aquellos que se codifican por estos polinucleotidos variantes. "Aislado", cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos GDM aquí descritos, significan polipéptido que se ha identificado y ceparado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente interfieren con los usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteinaceos o no proteinaceos. En modalidades preferidas, estos polipéptidos serán purificados (1) a un grado suficiente para obtener cuando menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos internas o N- terminales por uso de un secuenciador de copa de centrifugado o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o de preferencia tinción con plata. Estos polipéptidos aislados incluyen los polipéptidos correspondientes in situ dentro de células recombinantes , ya que al menos un componente del polipéptido GDM de su ambiente natural no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, estos polipéptidos aislados se prepararán en por al menos una etapa de purificación. Un ácido nucleico que codifica polipéptido GDM "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y cepara de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas anteriores es diferente en la forma o ambiente en el que se encuentra en la naturaleza. Cualesquiera moléculas de ácido nucleico semejantes por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica polipéptido específico como existe en células naturales. El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo anfitrión particular. Las secuencias de control que son adecuados para procariotas, por ejemplo incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de enlace de ribosoma. Células eucarióticas se conoce que utilizan promotores, señales de poliadenilacion y mej oradores. Ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una líder de presecuencia o secretorio se enlaza operativamente con ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si afecta la trascripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si se ubica a fin de facilitar la traducción. En general "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y en el caso de un líder de secreción contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mej oradores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores oligonueclót idos sintéticos se emplean de acuerdo con la práctica convencional . "Severidad" de reacciones de hibridización se determina fácilmente por una persona con destreza en la especialidad y en general es un cálculo empírico que depende de longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, más largas sondas requieren superiores temperaturas para una adecuada hibridización o alineado, mientras que sondas más cortas requieren menores temperaturas. La hibridización en general depende de la capacidad de ADN desnaturalizado para re-asociar cuando hebras complementarias están presentes en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Entre mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia de hibridización, mayor será la temperatura relativa que puede emplearse. Como resultado, se concluye que superiores temperaturas relativas tenderán a ser más severas las condiciones de reacción, mientras que temperaturas menores harán menos. Para detalles adicionales y explicación de severidad de reacciones de hibridización ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) . "Condiciones severas" o "condiciones de alta severidad", como se define aquí, pueden identificarse por aquellos que: (1) emplean baja concentración iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio 0.1% a 50EC; (2) emplean durante hibridización un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0.1%/Ficoll al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1% /amortiguador fosfato de sodio 50mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) hibridización durante la noche en una solución que emplea formamida al 50%, 5 x SSC (0.75 M NaCl , citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 1 0.1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml) , SDS al 0.1% y dextran sulfato al 10% a 42°C, con un lavado de 10 minutos a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido por un lavado de alta severidad de 10 minutos que consiste de EDTA que contiene SSC a 0.1 x a 55°C. "Condiciones moderadamente severas" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridización (por ejemplo temperatura, concentración iónica y por ciento de SDS) menos severas que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas es incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, dextran sulfato al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado seguido por lavado y los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. La persona con destreza ordinaria en la especialidad reconocerá cómo ajusfar la temperatura, concentración iónica, etc. según sea necesario para ajusfar factores tales como longitud de sonda y semejantes. El término "etiquetado con epítope" cuando se emplea aquí, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido GDM o agente de enlace GDM fusionado a un "polipéptido de etiqueta" . El polipéptido de etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual puede elaborarse un anticuerpo, sin embargo es suficientemente corto de manera tal que no interfiere con la actividad del polipéptido al cual se fusiona. El polipéptido de etiqueta de preferencia también es suficientemente único de manera tal que este anticuerpo no reacciona sustancialmente en forma cruzada con otros epítopes. Polipéptidos de etiqueta convenientes en general tienen cuando menos seis residuos aminoácido y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos aminoácido (de preferencia entre aproximadamente 10 y 20 residuos aminoácido) . "Activo" o "actividad" para los presentes propósitos se refiere a una o varias formas de polipéptidos GDM que retienen una actividad biológica y/o inmunológica de un polipéptido GDM nativo o de origen natural, en donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibitoria o estimulatoria) provocada por un GDM nativo o de origen natural diferente a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico que posee un polipéptido GDM nativo o de origen natural, y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico que posee un polipéptido GDM nativo o de origen natural. Un polipéptido GDM activo como se emplea aquí, es un antígeno que se expresa en forma diferencial ya sea a partir de una perspectiva cualitativa o cuantitativa, en un tumor-glioma, respecto a su expresión en tejido similar que no está afectado con glioma. El término "antagonista" se emplea en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza en forma parcial o completa una actividad biológica de un polipéptido GDM nativo aquí descrito. Moléculas antagonistas convenientes incluyen específicamente anticuerpos antagonistas o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de secuencia de aminoácido de polipéptidos GDM nativos, oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Métodos para identificar antagonistas GDM pueden comprender el contactar un polipéptido GDM, incluyendo una célula que lo expresa, con una molécula agonista o antagonista candidato y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido GDM. "Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren tanto a tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es evitar o frenar (reducir) el avance del glioma. "Pronóstico" se refiere a la determinación o pronóstico del curso probable y resultado de un tumor-glioma. "Diagnóstico" se refiere al proceso de identificar o determinar las características distintivas de un tumor- glioma. El proceso de diagnóstico en ocasiones también se expresa como clasificación por etapas o j erarquización de tumor con base en avance de enfermedad o severidad. Sujetos que requieren tratamiento, prognosis o diagnóstico incluyen aquellos que ya tienen glioma, así como aquellos tendientes a tener glioma o aquellos en quienes se va a evitar glioma. Un sujeto o mamífero se "trata" exitosamente para un glioma que expresa polipéptido GDM si, de acuerdo con el método de la presente invención, después de recibir una cantidad terapéutica de un antagonista GDM (por ejemplo antagonista PN, antagonista Prolif o antagonista Mes) , el paciente muestra una reducción observable y/o medible en o en ausencia de uno o más de los siguientes: reducción en el número de células de tumor-glioma o ausencia de estas células; reducción en el tamaño del tumor; inhibición (es decir frenado en cierta proporción y de preferencia parado) de infiltración de células de tumor-glioma en órganos periféricos incluyendo la diseminación de cáncer en tejido suave y huesos; inhibición (es decir frenar en cierta medida y de preferencia detener) metástasis de tumor; inhibición, en cierta medida, el crecimiento de tumor; y/o alivio en cierta medida de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; reducida morbilidad y mortalidad y aspectos de mejora en calidad de vida. En la extensión de que estos antagonistas GDM puedan evitar el crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, pueden ser citostáticos y/o citotóxicos. La reducción de estos signos o síntomas puede también ser percibida por el paciente . Los parámetros anteriores para estimar tratamiento exitoso y mejora en la enfermedad se miden fácilmente por procedimientos rutinarios familiares a un médico. Para terapia de cáncer, la eficacia puede medirse por ejemplo al estimar el tiempo para avance de enfermedad (TTP = time to disease progression) y/o determinar la velocidad de respuesta (RR = response rate) . Metástasis puede determinarse por pruebas de clasificación y pruebas para nivel de calcio y otras enzimas para determinar la extensión de metástasis. También puede efectuarse tomografía computarizada para buscar diseminación a regiones fuera de glía. La invención aquí descrita se refiere al proceso de pronóstico, diagnóstico y/o tratamiento involucra la determinación y evaluación de amplificación y expresión de GDM (e.g., PN, Prolif, Mes, Pten y DLL3) . "Mamífero" para propósitos del tratamiento de, alivio de los síntomas de o diagnóstico de un cáncer, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, para deportes o mascotas, tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, hurones, etc. De preferencia, el mamífero es humano. Administración "en combinación con" uno o más adicionales agentes terapéuticos, incluye una administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. "Portador" como se emplea aquí, incluye portadores incipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos a la célula o mamífero expuestos a él o a ellos a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución de pH amortiguado acuosa. Ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinil pirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutaminas, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcar alcoholes tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN7, polietilen glicol (PEG) , y PLUR0NICS7. Por "fase sólida" o "soporte sólido" se entiende una matriz no acuosa a la cual puede adherirse o conectarse un antagonista GDM o agente de enlace GDM de la presente invención. Ejemplos de fases sólidas aquí marcadas incluyen aquellas formadas parcial o totalmente de vidrio (por ejemplo vidrio de poro controlado) , polisacáridos (por ejemplo agarosa) , poliacrilamidas , poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo una columna de cromatografía definida) . Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquellas descritas en la Patente de los E.U.A. Número 4,275,149. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante que es útil para el suministro de una droga (tal como un antagonista GDM) a un mamífero. Los componentes de liposomas se disponen comúnmente en una formación bicapa, similar al arreglo de lípido de membranas biológicas . Una "molécula pequeña" o "molécula orgánica pequeña" se define aquí que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 500 Daltons. Una "cantidad efectiva" de un antagonista GDM o agente de enlace GDM es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito establecido específicamente. Una "cantidad efectiva" puede determinarse empíricamente y en forma rutinaria en relación al propósito establecido. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a un antagonista GDM u otra droga efectiva para "tratar" una enfermedad o desorden en un sujeto o mamífero. En el caso del glioma, la cantidad terapéuticamente efectiva de la droga puede reducir el número de células de glioma; reducir el tamaño de tumor; inhibir (es decir frenar en cierta medida y de preferencia detener) la infiltración de células de tumor-glioma en órganos o tejidos periféricos; inhibir (es decir frenar en cierta medida y de preferencia detener) metástasis de tumor; inhibir, en cierta medida, crecimiento de tumor; y/o aliviar en cierta proporción o en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con glioma. Ver la definición aquí de "tratar". En la medida en que la droga pueda evitar crecimiento y/o extermine células de cáncer existentes, puede ser citostática y/o citotóxica . Una "cantidad inhibitoria de crecimiento" de un antagonista GDM es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente el tumor, por ejemplo célula de cáncer, ya sea in vi tro o in vivo. Para propósitos de inhibir crecimiento de células neoplásicas, tal cantidad puede determinarse empíricamente y en una forma rutinaria. Una "cantidad citotóxica" de un antagonista GDM es una cantidad capaz de provocar la destrucción de la célula, especialmente una célula de glioma, por ejemplo célula de cáncer, ya sea in vitro o in vivo. Para propósitos de inhibir el crecimiento de células neoplásicas puede determinarse empíricamente y en una forma rutinaria. El término "anticuerpo" se emplea en el sentido más amplio y cubre específicamente por ejemplo anticuerpos monoclonales GDM anti-PN, anti-Prolif y anti-Mes (incluyendo antagonista y anticuerpos neutralizantes) , composiciones de anticuerpo GDM anti-PN, anti-Prolif" y anti-Mes con especificidad poliepitópica, anticuerpos policlonales , anticuerpos anti-GDM de cadena sencilla, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo biespecí fieos) y fragmentos de enlace de antígeno (ver a continuación) de todos los anticuerpos anteriormente citados siempre que exhiban la actividad biológica o inmunológica deseada. El término " inmunoglobulina " (Ig) se emplea en forma intercambiable con anticuerpo aquí. Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y ceparado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interfieren con usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95% en peso de anticuerpo como se determina por el método Lowry, y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácido interna o N-terminal por uso de un secuenciador de copa de centrifugado o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie, o de preferencia tinción con plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo anticuerpos aislados se prepararán por al menos una etapa de purificación.

La unidad de anticuerpo de 4 cadenas básico es una glicoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste de 5 unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J, y por lo tanto contiene 10 sitios de enlace de antígeno, mientras que anticuerpos IgA secretados pueden polimerizar para formar ensamblados polivalentes que comprenden 2-5 de las 4 unidades de cadena básicas junto con cadena J) . En el caso de IgGs, las 4 unidades de cadena en general son de aproximadamente 150,000 daltons. Cada cadena L se enlaza con una cadena H por un puente disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se enlazan entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena H tiene en el extremo N, un dominio variable (VH) seguido por tres dominios constantes (CH) por cada una de las cadenas a y ? y cuatro dominios CH para los isotipos µ y e . Cada cadena L tiene en el extremo N un dominio variable (VL) seguido por un dominio constante (CL) en su otro extremo. El VL se alinea con el VH y el CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) . Residuos aminoácido particulares se considera que forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El apareamiento de VH y VL en conjunto forma un sitio de enlace de antígeno sencillo. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver, por ejemplo Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6. La cadena L de cualesquiera especie de vertebrado puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, con base en la secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) , las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, que tienen cadenas pesadas designadas c , d, e, ? , y µ , respectivamente. Las clases ? y a además se dividen en subclases en base a diferencias relativamente menores en secuencia y función CH, por ejemplo los humanos expresan las siguientes subclases: IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgAl, y IgA2. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos. El dominio V media el enlace de antígeno y define especificidad de un anticuerpo particular para este antígeno en particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de la extensión aproximada de 110 aminoácidos de los dominios variables. Por el contrario, las regiones V consisten de tramos relativamente invariantes denominados regiones marco (FRs = framework regions) de 15-30 aminoácidos ceparados por regiones más cortas de extrema variabilidad denominadas "regiones hipervariables " cada una que tienen 9 a 12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas cada uno comprende cuatro FRs, adoptando sustancialmente una configuración de hoja ß , conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y que en algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß . Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en proximidad inmediata por las FRs y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en ligar un anticuerpo con un antígeno, sino que exhiben diversas funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . El término "región hipervariable " cuando se emplea aquí, se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables para enlace de antígeno. La región hipervariable en general comprende residuos aminoácidos de una "región de determinación de complementaridad" o "CDR" (por ejemplo alrededor de aproximadamente los residuos Kabat 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en VL, y alrededor de los residuos Kabat 31-35B (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en VH (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD . (1991)) y/o esos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo alrededor de aproximadamente residuos Chothia 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en VL, y 26-32 (Hl) , 52A-55 (H2) y 96-101 (H3) en VH (Chothia and Lesk J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)) . El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o ligan a el o los mismos epítopes, excepto por variantes posibles que pueden surgir durante producción del anticuerpo monoclonal, estas variantes en general están presentes en cantidades menores. Este anticuerpo monoclonal típicamente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipéptido que liga un blanco u objetivo, en donde la secuencia polipéptido de enlace de objetivo se obtiene por un proceso que incluye la selección de una sola secuencia polipéptido de enlace objetivo de una pluralidad de secuencias de polipéptido. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de ciónos, tales como un conjunto de ciónos de hibridoma, ciónos fago o ciónos de ADN recombinante . Habrá de entenderse que la secuencia de enlace de objetivo selecta puede ser además alterada, por ejemplo para mejorar la afinidad para el blanco, para humanizar la secuencia de enlace objetivo, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecí fico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de enlace objetivo alterada también es un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas ya que típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no habrá de considerarse que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por una variedad de técnicas, incluyendo por ejemplo el método de hibridoma (por ejemplo Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. Número 4,816,567), tecnologías de exhibición fago (ver por ejemplo Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) :299-310 (2004); Lee et al., J.Mol .Biol .340 (5) : 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Nat. Acad. Sci. USA 101 (34) : 12467-12472 (2004); y Lee et al. J. Iwmunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o tipo humanos en animales que tienen partes o la totalidad de sitios de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (ver por ejemplo O 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Inmuno., 7:33 (1993); Patentes de los E.U.A. Números 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807; WO 1997/17852; Patentes de los E.U.A. Números 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology, 10 : 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368 : 856-859 (1994) ; Morrison, Nature, 368 : 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996) ; Neuberger, Nature Biotechnology, 14 : 826 (1996) ; y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol . , 13 : 65-93 (1995) . Anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica con u homologa con las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico con u homólogo con las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los E.U.A. Número 4,816,567; y orrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticuerpo humanizado como se emplea aquí es un subconjunto de anticuerpos quiméricos. Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo aceptor o recipiente) en donde residuos de región hipervariable del recipiente se reemplazan por residuos de región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donado) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen las deseadas especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos de región marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen que refinen adicionalmente el desempeño de anticuerpo tal como afinidad de enlace. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todo o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas la regiones FR son aquellas de una secuencia inmunoglobulina humana aunque las regiones FR pueden incluir una o más sustituciones de aminoácido que mejoran afinidad de enlace. El número de estas sustituciones de aminoácido en las FR típicamente no son mayores a 6 en la cadena H y en la cadena L no mayores que 3. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol . 2 : 593-596 (1992) . "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, de referencia la región de enlace de antígeno o variable del anticuerpo humano. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab ' , F(ab')2/ y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (ver Patente de los E.U.A. Número 5,641,870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng . 8(10): 1057-1062

[1995] ) ; moléculas de anticuerpo en cadena sencilla y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo . La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab" y un fragmento "Fe" residual, una designación que refleja la capacidad por cristalizarse fácilmente. El fragmento Fab consiste de una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (VH) , y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1) . Cada fragmento Fab es monovalente respecto al enlace de antígeno, es decir, tiene un solo sitio de enlace de antígeno. Tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un fragmento F(ab')2 grande sencillo que corresponde aproximadamente con dos fragmentos Fab de enlace disulfuro que tienen actividad de enlace de antígeno divalente y aún son capaces de entrelazar antígeno. Fragmentos Fab' difieren de fragmentos Fab al tener unos cuantos sitios adicionales en el extremo carboxi del dominio CH1 incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab' en donde el o los residuos cisteína de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos también son conocidos. El fragmento Fe comprende las porciones carboxi terminales de ambas cadenas H mantenidas por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpo se determinan por secuencias en la región Fe, esta región también es la parte reconocida por receptores Fe (FcR) que se encuentran en ciertos tipos de células. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y enlace de antígeno completo. Este fragmento consiste de un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y una ligera en asociación no covalente cerrada. Del pliegue de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos aminoácido para el enlace de antígeno y confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable sencillo (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicos para un antígeno) , tiene la capacidad por reconocer y ligar antígeno, aunque a una afinidad menor que todo el sitio de enlace. "Fv de cadena sencilla" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominio de anticuerpo VH y VL conectados en una sola cadena polipéptido. De preferencia, el polipéptido sFv además comprende un enlazador polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten a sFv formar la estructura deseada para enlace de antigeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun in The Pharmacology of onoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp . 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra. Un "angente de enlace GDM" es una molécula que liga un polipéptido GDM (por ejemplo, PN, Prolif, Mes, Pten y DLL3) . Moléculas ejemplares incluyen anticuerpos anti-GDM, fragmentos de anticuerpo de enlace, oligopéptidos de enlace GDM, ácido nucleido sentido y anti-sentido GDM y antagonista de molécula pequeña GDM. Un "antagonista GDM" es una molécula que antagoniza (por ejemplo, neutraliza o impede) la activación o capacidad de transducción de señal de un polipéptido GDM, incluyendo por ejemplo al bloquear la capacidad de un GDM para transducir una señal, tal como al bloquear un ligando nativo de enlace o por bloqueo de GDM de transmitir desde un ligando nativo a un componente corriente abajo en un tumor-glioma . Moléculas ejemplares incluyen anticuerpos anti-GDM, fragmentos de anticuerpo de enlace GDM, oligopéptidos de enlace GDM, ácido nucleido sentido y anti-sentido GDM y antagonistas de molécula pequeña GDM.

Un "oligopéptido de enalce GDM" es un oligopéptido que liga, de preferencia específicamente, con un polipéptido GDM, incluyendo un receptor, ligando o componente de señalización, respectivamente como se describe aquí. Estos oligopéptidos , pueden sintetizarse químicamente utilizando metodología de síntesis de oligopéptido conocida o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante . Estos oligopéptidos usualmente son de al menos aproximadamente 5 amino ácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 amino ácidos de longitud o más. Estos oligopéptidos pueden ser identificados sin indebida experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para cribar bibliotecas oligopéptido para oligopéptidos que son capaces de ligar específicamente a un objetivo polipéptido, son bien conocidas en la especialidad (ver por ejemplo, las patentes de los E.U.A. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; las publicaciones del PCT Nos. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc . Nati. Acad. Sci . U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986) ; Geysen et al., J. Immunol. Meth. , 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J . Immunol . , 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378 (1990); Lowman, H.B. et al. Biochemistry, 30:10832 (1991); Clackson, T. et al. Nature, 352: 624 (1991); Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Kang, A.S. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363 (1991), and Smith, G. P., Current Opin. Biotechnol., 2:668 (1991). Un "antagonista de molécula pequeña GDM" es una molécula orgánica diferente a un oligopéptido o anticuerpo como se define aquí que inhibe, de preferencia específicamente una ruta de señalización GDM de un polipeptido GDM como se describe aquí. Esta inhibición de ruta de señalización GDM de preferencia inhibe el crecimiento de células de tumor-glioma que expresan un polipéptido GDM. Estas moléculas orgánicas pueden ser identificadas y sintetizadas químicamente utilizando metodología conocida (ver, por ejemplo, publicaciones de PCT Nos. WO2000/00823 y WO2000/39585) . Estas moléculas orgánicas usualmente son menos de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, en forma alterna con menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltons en tamaño, son capaces de ligar, de preferencia específicamente, a un polipéptido GDM como se describe aquí, y pueden ser identificados sin indebida experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para cribar bibliotecas de moléculas orgánicas por moléculas que son capaces de ligar a un objetivo o blanco polipéptido, son bien conocidas en la especialidad (ver, por ejemplo, las publicaciones del PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Un antagonista GDM o agente de enlace GDM (por ejemplo, anticuerpo, polipéptido, oligopéptido o molécula pequeña) "que liga" un antígeno objetivo de interés, por ejemplo un GDM, es aquel que liga el objetivo con afinidad suficiente para ser un agente útil de diagnóstico, pronóstico y/o terapéutico para ser blanco en una célula o tejido que expresa el antígeno, y no reacciona significativamente en forma cruzada con otras proteínas. La extensión de enlace con un polipéptido marcador no deseado será menos de aproximadamente 10% del enlace con un blanco deseado particular, como se determina por técnicas comunes tales como análisis de clasificación de células de activación por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitacíon (RIA) . Aún más, el término "enlace específico" o "enlace específicamente con" o es "específico para" un polipéptido GDM particular o un epítope en un blanco polipéptido GDM particular significa enlace que es medible en forma diferente de una interacción no específica. El enlace específico puede medirse, por ejemplo al determinar enlace de una molécula en comparación con enlace de una molécula de control, que en general es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de enlace. Por ejemplo, enlace específico puede determinarse por competencia con una molécula de control que es similar al objetivo, por ejemplo un exceso de un objetivo no etiquetado. En este caso, el enlace específico se indica si el enlace del blanco etiquetado a una sonda se inhibe en forma competitiva por un blanco no etiquetado en exceso. En una modalidad, estos términos se refieren a enlace en donde una molécula liga a un polipéptido o epítope particular en un polipéptido particular sin ligar substancialmente a cualquier otro polipéptido o epítope polipéptido. En forma alterna, estos términos pueden describirse por una molécula que tiene una Kd para el blanco de al menos aproximadamente 10"4 M, 10"5 M, 10"6 M, 10"7 M, 1CT8 M, 10"9 M, 10"10 M, 10"11 M, 10"12 M, o mayor.

Un antagonista GDM (por ejemplo, un antagonista -PN, -Prolif o -Mes) que "inhibe el crecimiento de células de tumor que expresan un polipéptido GDM" o una cantidad "inhibitoria de crecimiento" de cualquiera de esta molécula, es aquel que resulta en una inhibición de crecimiento medible de células de cáncer que expresan o sobre-expresan el polipéptido GDM apropiado. Composiciones preferidas para utilizar en el tratamiento comprenden cantidades inhibitorias de crecimiento de al menos un tipo de antagonista GDM (por ejemplo, anticuerpo anti-GDM, fragmento de anticuerpo de enlace GDM, oligopéptidos o molécula pequeña) , para inhibir el crecimiento de células de tumor-glioma en más de 20%, de preferencia aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, y aún más preferible, más de 50% (por ejemplo, de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) en comparación con el control apropiado. En una modalidad, la inhibición de crecimiento puede medirse a una concentración de molécula de aproximadamente 0.1 a 30 µg/ l o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en cultivo celular, en donde la inhibición de crecimiento se determina 1-10 días después de exposición de las células de tumor al anticuerpo. Inhibición de crecimiento de células de tumor-glioma in vivo puede determinarse en diversas formas tal como se describe en la sección siguiente de ejemplos experimentales. Una cantidad de cualquiera de las moléculas anteriores de este párrafo es inhibitorio de crecimiento in vivo si la administración de esta molécula a aproximadamente 1 /¿g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal resulta en reducción en tamaño de tumor o proliferación de células de tumor dentro de aproximadamente 5 dias a 3 meses de la primera administration del anticuerpo, de preferencia dentro de aproximadamente 5 a 30 días. Un antagonista GDM que "induce apoptosis" es aquel que induce muerte celular programada de una célula de tumor-glioma como se determina por enlace de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento de células, dilatación de retículo endoplásmico, fragmentación de células y/o formación de vesículas de membrana (denominados cuerpos apoptósicos) . La célula usualmente es aquella que sobre-expresa un polipéptido GDM. Diversos métodos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con apoptosis. Por ejemplo, translocación de fosfatidil serina (PS) puede medirse por enlace de anexina; fragmentación de ADN puede evaluarse a través de escleramiento o arreglo tipo escalera de ADN; y condensación nuclear/cromatina junto con fragmentación de ADN puede evaluarse por cualquier aumento en células hipodiploides . De preferencia, el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que induce apoptosis es aquel que resulta en aproximadamente 2 a 50 veces, aproximadamente 5 a 50 veces, y aún más preferible aproximadamente 10 a 50 veces, inducción de enlace de anexina respecto a células sin tratar en un ensayo de enlace de anexina. Un antagonista GDM que "induce muerte celular" es aquel que provoca que una célula de tumor-glioma viable se vuelva no viable. Esta célula de tumor-glioma es aquella que expresa un polipéptido GDM, de preferencia lo sobre-expresa, en comparación con una célula no enferma. El polipéptido GDM puede ser un polipéptido transmembrana que se expresa en la superficie de esta célula de cáncer o puede ser un polipéptido que se produce y secreta por dicha célula. La muerte celular in vi tro puede determinarse en la ausencia de complemento y células efectoras inmune para distinguir muerte celular inducida por citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . De esta manera, el ensayo para muerte celular puede realizarse utilizando suero inactivado con calor (es decir, en la ausencia de complemento) y en la ausencia de células efectoras inmune. La capacidad por inducir muerte celular puede estimarse respecto a célula sin tratar por técnicas convenientes, tales como pérdida de integridad de membrana como se evalúa por la absorción de yoduro de propidio (PI), azul triptano (ver Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) o 7AAD. Antagonistas GDM que inducen muerte celular preferidos son aquellos que inducen absorción de PI en el ensayo de absorción de PI en las células BT474. Un "antagonista -Prolif" y un "antagonista Mes" son antagonistas GDM que ligan específicamente con o de otra forma inhiben específicamente la actividad de un marcador GDM Prolif o Mes descrito en la Tabla A, respectivamente. Un "antagonista -PN" es un antagonista GDM que liga específicamente con o de otra forma inhibe específicamente la actividad de un marcador GDM PN descrito en la Tabla A, excepto por DLL3 , Nog, Oligl, Olig2, THR, y ASCL1. Un antagonista Akt es cualquier molécula que bloquea parcial o completamente, inhibe o neutraliza una actividad biológica de la ruta de señalización Akt. Antagonistas Akt convenientes incluyen anticuerpos antagonistas o fragmentos de anticuerpo, fragmentos o variantes de secuencia de amino ácido de componentes nativos de la ruta de señalización Akt ( " Polipéptido Akt"), oligonucleótidos anti-sentido péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Métodos para identificar antagonistas Akt pueden comprender contacto de un Polipéptido Akt con una molécula candidato y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido Akt. Antagonistas Akt ejemplares adicionales incluyen: antagonistas dirigidos específicamente a aktl, akt2 o akt3 ; antagonistas dirigidos al dominio catalítico o regulatorio (incluyendo la interacción entre sí) si PIK3 cinasa tal como PIK3CA, PIK3CB , PIK3CD, PIK3CG, PIK3R1, PIK3R2, PIK3R3, PIK3R4; PDK1 ; FRAP (por ejemplo, rapamicina) ; RPS6KB1 ; SGK; EGFR (por ejemplo, erlotinib TARCEVA®, IGFR. En forma alterna, antagonistas Akt incluyen moléculas que agonizan, estimulan o restauran actividad de PTEN, INPP5D o INPPL1. Un "agente anti-mitótico" incluye una molécula que bloque, inhibe o de otra forma interfiere parcial o completamente con mitosis que ocurre durante división celular. Ejemplo de estos agentes incluyen: temozolamida , BCNU, CC U, lomustina, gliadel, etoposido, carmustina, ironotecan, topotecan, procarbazina , cisplatin, carboplatin, ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina, dactinomicina , bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel. auristatinas , maytansinoides . Un "agente anti -angiogénico" es una molécula que bloque, inhibe o de otra forma neutraliza parcial o completamente el proceso de angiogénesis o formación de vaculatura, en especial aquel que se asocia con una enfermedad o desorden. Muchos antagonistas angiogénesis se han identificado y se conocen en las técnicas, incluyendo aquellos citados por Brem, Cáncer Control 6(5): 436-458 (1999). En general, un antagonista de angiogénesis comprende una molécula que es blanco a un factor angiogénico específico o ruta de angiogénesis. En ciertos aspectos, el antagonista de angiogénesis es una composición de proteína tal como un anticuerpo que hace blanco a un factor angiogénico. Un factor angiogénico ejemplar es VEGF (también en ocasiones conocido como "VEGF-A"), un factor de crecimiento celular endotelial vascular de 165 aminoácidos y factor de crecimiento celular endotelial vascular de 121, 189 y 206 aminoácidos relacionados como se describe por Leung et al. Science, 246:1306 (1989), y Houck et al. Mol. Endocrin. , 5:1806 (1991) , junto con formas alélicas de origen natural y sus formas procesadas. El término "VEGF" también se utiliza para referirse a formas truncadas del polipéptido que comprende los aminoácidos 8 a 109 o 1 a 109 del factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 165 aminoácidos. Estas versiones truncadas del VEGF nativo tienen afinidad de enlace para los receptores Flt-1 (VEGF-R1) y KDR (VEGF-R2) comparables con VEGF nativo.

Un factor anti -angiogénico ejemplar es un anticuerpo anti-VEGF neutralizante. Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que liga específicamente a VEGF . De preferencia, el anticuerpo anti-VEGF de la invención puede emplearse como un agente terapéutico para ser blanco e interferir con enfermedades o condiciones en donde se involucra la actividad VEGF. Este anticuerpo anti-VEGF usualmente no ligará a otros homólogos VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C, ni otros factores de crecimiento tales como PlGF, PDGF o bFGF . Un anticuerpo anti-VEGF preferido es un anticuerpo monoclonal que liga al mismo epítope que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709. Más preferiblemente, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante que comprende las regiones marco IgGl humanas mutadas y regiones de determinación de complementariedad que enlazan antígeno del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1, y generadas de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997) , incluyendo pero no limitados al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; Avastin™) . En forma alterna, un agente anti -angiogénico puede ser cualquier molécula pequeña capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con actividades VEGF incluyendo su enlace a uno o más receptores VEGF (por ejemplo, VEGFR1 y VEGFR2) . Un "agente de diferenciación neural" es una molécula que promueve, provoca, estimula o de otra forma induce precursores neuronales (por ejemplo, células madre neurales, células de amplificación de tránsito, neuroblastos , etc.) para diferenciarse en neuronas. Precursores neuronales son células derivadas de sistema nervioso fetal, cerebro de adulto o cresta neural y son capaces tanto de división celular como la creación de neuronas. Neuronas son células post-mitóticas (no-divisoras) que expresan proteínas involucradas en proyecciones axonales, propagación de potencial de acción, y transmisión sináptica. Un agente de diferenciación neuronal es una molécula que induce precursores neuronales al disminuir su velocidad de proliferación e incrementar su expresión de proteínas involucradas en excrecencia axonal , generación de potencial de acción, y transmisión sináptica. Marcadores ejemplares de diferenciación neuronal incluyen pero no están limitados a MAP2 , beta-tubulina, GAD65 y GAP43. Agentes de diferenciación neural ejemplares incluyen pero no están limitados a: ácido retinoico, ácido valproico y sus derivados (por ejemplo ésteres, sales, retinoides, retinatos, valproatos, etc.); hormona de tiroides u otros agonistas de receptor de hormona tiroides; noggin; BDNF, NT 4/5 u otros agonistas del receptor NTRK2 ; agentes que aumentan la expresión de los factores de transcripción ASCL1, OLIG1; agonistas dll3, antagonistas Notch 1, 2, 3 o 4, inhibidores de gamma secretasa, incluyendo inhibidores de molécula pequeña de nicastrina, AphlA, AphlB, Psenl , Psen2 y PSENEN, antagonista de ligando tipo delta (Dll)-l, antagonista ligando tipo delta (Dll)-4, dentado 1, antagonista dentado 2; agonista numb o agonista tipo numb. "Funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia de amino ácido) de un anticuerpo, y varían con isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: enlace Clq y citotoxicidad dependiente de complemento; enlace de receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) ; y activación de célula B. "Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en donde Ig secretado ligado en receptores Fe (FcRs) presenta en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células Destructoras Naturales linfocitos citolíticos espontáneos (NK = Natural Killer) , neutrófilos y macrófagos) , permiten que estas células efectoras citotóxicas liguen específicamente a una célula objetivo que contiene antígeno y subsecuentemente exterminan a la célula objetivo con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y se requieren absolutamente para dicha destrucción. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan solo Fe/ RUI, mientras que los monocitos expresan Fc^RI, Fc/RII y Fc^RIII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resumen en la Tabla 3 en página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-92 (1991). Para estimar la actividad ADCC de una molécula de interés, como en un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente de los E.U.A. No. 5,500,362 o la patente de los E.U.A. 5,821,337 puede realizarse. Células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Destructuras Naturales (NK) . En forma alterna, o adicionalmente , la actividad ADCC de la molécula de interés puede estimarse in vivo, por ejemplo, en un modelo de animal tal como el descrito en Clynes et al . (USA) 95:652-656 (1998).

"Receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que liga a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Aún más, un FcR preferido es aquel que liga un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las sub-clases Fc^RI, Fc/RII y Fe ? RUI, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente combinadas de estos receptores. Receptores Fc^RII incluyen Fc^RIIA (un "receptor de activación") y Fc^RIIB (un "receptor de inhibición") , que tienen similares secuencias de amino ácidos que difieren primordialmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor de activación Fc^RIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunoreceptora (ITAM = immunoreceptor tyrosine-based activation motif) en su dominio citoplásmico . El receptor de inhibición Fc RIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunoreceptora (ITI = immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) en su dominio citoplásmico. (Ver revisión M. in Daéron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)) . FcRs se revisan por Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) ; Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) ; and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) . Otros FcRs, incluyendo aquellos que se identificaron en el futuro, se abarcan por el término "FcR" aquí. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgGs maternales al feto (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol . 24 :249 (1994) ) . "Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos Fe ? RUI y realizan función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células destructoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos ; con PB Cs y células NK preferidos. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre . "Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en la presencia de complemento. La activación de la ruta de complemento clásica se inicia por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que se ligan a su antígeno cognato. Para estimar la activación de complemento, un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. ethods 202:163 (1996), puede realizarse . Un "Glioma que expresa GDM" opcionalmente produce niveles suficientes de polipeptido GDM en la superficie de sus células, tal que un antagonista polipeptido GDM pueda ligarlo o un antagonista de molécula pequeña GDM pueda de otra forma hacer blanco y tener un efecto terapéutico con respecto al glioma. En otra modalidad, un "glioma que expresa GDM" opcionalmente produce y secreta niveles suficientes de polipéptido GDM, tal que un antagonista de polipéptido GDM pueda ligarlo o un antagonista de molécula pequeña GDM pueda de otra forma ser blanco y tener un efecto terapéutico respecto al cáncer. Con respecto a antagonistas, estas moléculas pueden ser un oligonucleótido antisentido que reduce, inhibe o evita producción y secreción del polipéptido GDM secretado por las células de tumor. Un tumor-glioma que " sobre -expresa" un polipéptido GDM es aquel que tiene niveles significativamente superiores de GDM en su superficie celular, o que produce y secreta, comparado con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Esta sobre-expresión puede resultar de amplificación de gen o por transcripción o traducción incrementada. Diversos ensayos de diagnóstico o pronóstico que miden la expresión mejorada de GDM resultan en niveles incrementados en la superficie celular o aquel que se secreta, tal como un ensayo de inmunohistoquímica que utiliza anticuerpos anti-GD , análisis FACS, etc. En forma alterna, los niveles de ácido nucleico que codifica polipéptido GDM o ARNm puede medirse en la célula, por ejemplo, mediante hibridización in situ fluorescente utilizando una sonda de base ácido nucleico que corresponde a un ácido nucleico que codifica GDM o su complemento; (FISH; ver W098/45479 publicada en octubre, 1998) , transferencia Southern, transferencia Northern, o técnicas de reacción en cadena polimerasa (PCR) , tal como PCR cuantitativo de tiempo real (RT-PCR) . En forma alterna, la sobre-expresión de polipéptido GDM se determina al medir el antígeno desprendido en un fluido biológico tal como suero, por ejemplo utilizando ensayos basados en anticuerpo (ver también, por ejemplo, la patente de los E.U.A. No. 4,933,294 otorgada en junio 12, 1990; WO91/05264 publicada en abril 18, 1991; patente de los E.U.A. No. 5,401,638 otorgada en marzo 28, 1995; y Sias et al., J. Immunol . Methods 132:73-80 (1990)). Además de los ensayos anteriores, diversos ensayos in vivo están disponibles al practicante con destreza. Por ejemplo, se puede exponer células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que opcionalmente se etiqueta con una etiqueta detectable, por ejemplo, un isótopo radioactivo, y ligar el anticuerpo a células en el paciente puede ser evaluado, por ejemplo, por exploración externa para radioactividad o por análisis de una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al agente terapéutico . Como se emplea aquí, el término "inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que combinan la especificidad de enlace de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina . Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de amino ácidos con la especificidad de enlace deseada que es diferente al reconocimiento de antígeno y sitio de enlace de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de amino ácidos contigua que comprende al menos el sitio de enlace de un receptor o ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de una inmunoglobulina, tal como los sub-tipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2) , IgE, IgD o IgM. La palabra "etiqueta" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a fin de generar un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "etiquetada" . La etiqueta puede detectarse por si misma (por ejemplo radioisótopos o etiquetas fluorescentes) o en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de substrato que es detectable. El término "agente citotóxico" como se emplea aquí, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca destrucción de células. El término se pretende que incluya isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos , enzimas y sus fragmentos tales como enzimas nucleolíticas , antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimát icamente activas de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes anti -tumor o anti -cáncer descritos a continuación. Otros agentes citotóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricida provoca destrucción de células de tumor. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen hidroxiureataxanos (tales como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina ; agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CITOXAN®; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquone, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida , trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina ; acetogeninas (en especial bulatacina y bulatacinona) ; delta- 9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapachone ; lapachol; colchicinas ; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina , scopolectin, y 9 -aminocamptotecina) ; briostatina ; callystatin; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina ; ácido podofilínico; teniposido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatin; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CBl-TMl) ; eleuterobina ; pancratistatina ; una sarcodictina ,- espongistatina ; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina , colofosfamida , estramustina , ifosfamida, mecloretamina , hidrocloruro óxido de mecloretamina , melfalan, novembichina , fenesterina, prednimustina, trofosfamida , mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina , fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina ; antibióticos tales como los antibióticos enediina (por ejemplo, calicheamicina, en especial calicheamicina gammall y calicheamicin omegall (ver, por ejemplo Agnew, Chem Intl. Ed. Engl . , 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina ,- así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de cromoproteína en enediina relacionados), aclacinomisinas , actinomicina , autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina , carabicin, carminomicina, carzinofilina , cromomicinis , dactinomicina , daunorubicina, detorubicina , 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorubicina (incluyendo morfolin-doxorubicina, cianomorfolin-doxorubicina, 2 -pirrolin-doxorubicina y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina , olivomicinas , peplomicina, potfiromicina , puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina , estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti -metabolitos tales como metotrexato y 5 - fluorouracil (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina , trimetrexato ; análogos purina tales como fludarabina, 6 -mercaptopurina , tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidine tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina , doxifluridina , enocitabina, floxuridina ; androgenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol , mepitiostano, testolactona ; anti- adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosido; ácido aminolevulínico ; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina ; diaziquona; elfornitina ; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea ; lentinano; lonidainina; maytansinoides tales como maytansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona ; mopidanmol ; nitraerina; pentostatina ; fenamet ; pirarubicina ; losoxantrona ; 2 -etilhidrazida ; procarbazina ; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxana; rizoxina; sizofirano; espirogermanio ; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 2 ' , 2 " -triclorotrietilamina ; tricotecenos (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; mannomustina ; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación de nanopartículas de ingeniería de albúmina de placitaxel, libre de Cremofor ABRAXANETM (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y doxetaxel TAXOTERE® (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucil ; gemcitabina (GEMZAR®) ; 6 -1ioguanina ; mercaptopurina ; metotrexato ; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina (VELBAN®) ; platino; etoposido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona ; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatina ; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina ; aminopterina ; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®) ; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida , doxorubicina , vincristina y prednisolona , y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATINTM) combinada con 5 -FU y leucovovin. También se incluyen en esta definición agentes anti -hormonales que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer, y a menudo están en la forma de tratamiento sistémico o de todo el cuerpo. Pueden ser las propias hormonas. Ejemplos incluyen anti -estrógenos y moduladores de receptor de estrógeno selectivo (SERMs) , incluyendo por ejemplo tamoxifen (incluyendo tamoxifen NOLVADEX®) , raloxifen EVISTA®, droloxifen, 4 -hidroxitamoxifen, trioxifen, queoxifen, LY117018, onapristona, y toremifen FARESTON®; anti-progesteronas ; reguladores a la baja receptores de estrógeno (ERDs) ; agentes que funcionan para suprimir o desactivar los ovarios, por ejemplo, agonistas de hormona de liberación de hormona leutinizante (LHRH = leutinizing hormone-releasing hormone) tales como leuprolid acetato LUPRON® y ELIGARD®, goserelin acetato, buserelin acetato y tripterelina ,- otros anti -andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida ; e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimida, megestrol acetato MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanin, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX® . Además, esta definición de agentes quimioterapéuticos incluyen bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®) , etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA® , tiludronato SKELID®, o risedronato ACTONEL®; así como troxacitabina (un análogo de citosina nucleósido 1 , 3 -dioxolano) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de células aberrantes, tales como por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia de genes, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN® ; rmRH ABARELIX®; lapatinib ditosilato (un inhibidor de molécula pequeña tirosina cinasa dual ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016) ; y sus sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables. Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, en especial una célula de glioma que expresa GDM, ya sea in vi tro o in vivo. De esta manera, el agente inhibidor de crecimiento puede ser aquel que reduzca significativamente el por ciento de células que expresan GDM en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance de ciclo celular (en un sitio diferente a fase S) , tales como agentes que inducen freno Gl y freno de fase M. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicina , epirubicina, daunorubicina , etoposido, y bleomicina. Aquellos agentes que frenan Gl también derraman sobre el freno de fase S, por ejemplo agentes de alquilación de ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina , cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Mayor información puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds . , Capítulo 1, con título por "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. ( B Saunders : Philadelphia , 1995), especialmente p. 13. Los taxanos o hidroxiureataxanos (paclitaxel y docetaxel) son drogas anticáncer ambas derivadas del árbol del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del tejo Europeo, es un análogo semi-sintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Estas moléculas promueven el ensamblado de microtúbulos de dímeros de tubulina y estabiliza microtúbulos al evitar despolimerización, que resulta en la inhibición de mitosis en las células. "Doxorubicina" es un antibiótico de antraciclina . El nombre químico completo de doxorubicina es (8S-cis)-10-[ (3-amino-2 , 3 , 6-trideoxi- a -L-lixo-hexapiranosil) oxi] -7,8,9, 10 -tetrahidro- 6 , 8 , 11-trihidroxi-8 - (hidroxiacetil ) - 1-metoxi -5 , 12 -naftacendiona . El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas de una población celular que actúan en otra célula como mediadores intercelulares . Ejemplos de estas citocinas son linfocinas, monocinas, y hormonas polipéptido tradicionales. Incluidos entre las citocinas están hormona de crecimiento tal como hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionilo, y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroides ; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteínas tales como hormona de estímulo de folículos (FSH) , hormona de estímulo de tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno placentario; factor a y ß de necrosis de tumor; sustancia de inhibición muleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factor de crecimiento de nervios tal NGF-/?; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF- y TGF- ß ; factor de crecimiento tipo insulina -I y -II; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos ; interferonas tales como interferona -a, -ß y - ? ; factores de estímulo de colonias (CSFs) tales como CSF macrófago (M-CSF) ; CSF granulocito-macrófago (GM-CSF) ; y CSF granulocito (G-CSF) ; interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL- la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumor tal como TNF- a o TNF-/?; y otros factores de polipéptido incluyendo LIF y ligando kit (KL) . Como se emplea aquí, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de célula recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa. El término "inserto de empaque" se emplea para referirse a instrucciones usualmente incluidas en empaques comerciales de productos terapéuticas, que contienen información respecto a las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o advertencias respecto al uso de estos productos terapéuticos. El término "agrupamiento jerárquico" significa un método para agrupar conjuntos de muestras con base en sus similaridad de expresión de gen. El algoritmo estándar empleado en forma recursiva calcula un dendrograma que ensambla todos los elementos en un árbol, partiendo de una matriz de correlación. Eisen, M.B. et al., P.N.A.S. 95:14863-14868 (1998). El término " agrupamiento por k-medias" significa un método para agrupar conjuntos de muestras con base en su similaridad de expresión de gen. En agrupamiento por k-medias, todas las muestras se asignan inicialmente al asar a uno de una cantidad de enjambres o agrupamientos . Los valores promedio o representativos de expresión de gen en cada agrupamiento de muestra se calculan entonces y cada muestra se vuelve a asignar al agrupamiento al cual muestra la más cercana similaridad. Este procedimiento se reitera hasta que se logra una estructura estable. Duda, R.O. and Hart , P.E., Pattern Classification and Scene Analysis, Wiley, New York (1973) . El término "esquema de votación" significa un método de asignar tumores a grupos con base en comparar el número de GDMs por cada subtipo de tumor que expresan en o sobre un nivel de expresión determinado. Freije et al . , supra . Tabla 1 Tabla 1 /* * * C C incrementado de 12 a 15 * Z es promedio de EQ * B es promedio de ND * apareamiento con parada es _M; parada-parada = 0 ; J (comodín) parada = 0 */ #define _M 8 /* valor de un apareamiento con una parada */ int _day[26] [26] = { /* A B C D E F G H I J K L M N 0 Q R S T U V W X Y Z */ /* A */ { 2, o, -2, o, 0, -4, 1, -i,-i, o, -i, -2, - 1, o». _M, 1, 0, -2, 1, 1, 0, 0, -6, o, -3, /* B */ { 0, 3, -4, 3, 2, -5, 0, 1,-2, o, o, -3, -2, 2, _M, -i, 1, o, o, 0, 0, -2 , -5, 0, -3, i}, /* C */ { -2, -4 , 15, -5, -5, -4 , -3, -3,-2, 0, -5, -6, -5, _M, -3, -5, -4, 0, -2, 0, -2,-8, o, 0, -5}, /* D */ { o, 3, -5, 4 , 3, -6, 1, 1,-2, o, 0, -4, - 3, 2, _M, -i, 2, -i, o, 0, 0, -2, -7, 0, -4, 2}, /* E */ { 0, 2 , -5, 3, 4, -5, 0, 1,-2, o, 0, -3, -2, 1, _ , -i, 2, -i, 0, 0, 0, -2, -7, 0, -4, 3}, /* F */ { -4 , -5, -4, -6, -5, 9, -5, -2, 1, o, -5, 2, 0, -4, _M, -5, -5, -4 , -3 , -3, 0, -i, 0, 0, 7,-5}, /* G */ { 1, 0, -3, 1, 0, -5, 5, -2,-3, 0, -2, -4, - 3, o, _M, -i, -i, -3, 1, 0, 0, -1, -7, 0, -5, o}, /* H */ { -1, 1, -3, 1, 1, -2 , -2, 6,-2, 0, 0, -2, - 2, 2'._?, ?, 3, 2, - 1, - 1, 0 , -2 , -3 , ?, 0, 2}, /* I */ {-1, - 2 , -2, -2, -2, 1, -3 , - 2, 5, ?, - 2, 2, 2, -2, _?, -2, -2, - 2, - 1, 0, 0, 4, -5, ?, - 1,-2}, /* J */ { ?, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, ?, ?, 0, 0, o». _?, 0, 0, 0, ?, 0, ?, 0, 0, 0, 0, ?}, /* ? */ {" 1, 0, -5, 0, 0, -5, -2, 0,-2, ?, 5, - 3, 0, 1,_ _?, -1, 1, 3, ?, 0, 0, -2 , -3, 0 -4 , ?}, /* L */ {" 2, - 3, -6, -4 -3, 2 -4 , - 2, 2, ?, - 3, 6, 4, -3, _?, -3, -2, - 3, - 3, -1 0 2 -2 ?, - 1,-2}, /* ? */ {- 1, - 2, -5 -3 -2 0 -3, - 2, 2, ?, 0, 4, 6, -2, _?, -2, -1, ?, - 2 -1 0 2 -4 ?, - 2,-1}, /* ? */ { ?, 2 -4 2 1 -4 ?, 2,-2, ?, 1, - 3, - 2, 2, _?, -1, 1, ?, 1, 0 0 -2 -4 0 -2, }, /* 0 */ { ?, ?, ?, ?, ?, ?, ?, ?, ?, ?, , , ?, ? 0, ?, ?, ?, ?, ?, ? ? ? ? ?}, /* ? */ { 1, - 1 -3 -1 -1 -5 -1, 0,-2, ?, -1, -3, -2, -?,_ _?, 6 0 0 1 0 , ?,- 1,-6, ?, - 5, ?}, /* Q */ { ?, 1 -5 2 , 2 -5 , -i, 3,-2, ?, 1, - 2, - 1, 1, _?, 0, 4, 1, - 1, - 1 0 r -2 , -5 , ? , "4, 3}, /* R */ {- 2 , 0 , - , -1 , -1 , -4 , -3, 2,-2, ?, 3, - 3, 0, 0, _?, ?, 1, 6, ?, - 1 , ? , -2 , 2 , ? , -4, ?}, /* S */ { 1, 0 , 0 , ? , ? , -3 , ?,- ?,-?, ?, ?, - 3, - 2, 1, _?, 1, -1, 0, 2, 1 , ? , -1 , -2 , ? , -3, ?}, /* ? */ { 1, 0 , -2 , ? , ? , -3 , ?,- 1, ?, ?, ?, - 1, - 1, 0, _?, ?, -1, -i, 1, 3 , ? , o , -5 , ? , -3, ?}, /* u */ { 0, 0, o, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, o, o, o, 0, _M, 0, o, 0, 0, 0, o, 0, 0, 0, 0, o}, /* V */ { 0, -2, -2, -2, -2, -1, -1, -2, 4, o, -2, 2, 2, -2, _M, -1, -2, -2, -1, o, 0, 4, -6, 0, -2,-2} /* W */ { -6, -5, -8, -7, -7, 0, -7, -3,-5, 0, -3, -2, -4, _M, -6, -5, 2 , -2, -5, 0, -6,17, o, o, -6}, /* X */ { 0 , 0, 0, 0 , o, 0 , 0, 0, 0, o, o, 0, 0, 0, _ , o, o, 0, 0, 0, 0, o, 0, 0, 0, o}, /* Y */ { -3, -3, 0, -4 , -4, 7, -5, ?,-?, 0, -4, -i, -2, -2<. _M, -5, -4 , -4 , -3, -3, 0, -2, 0, o, 10, -4}, /* Z */ { o, 1, -5, 2, 3, -5, 0, 2,-2, o, o, -2,-1, 1, _M, o, 3, 0, 0, 0, 0, -2, -6, 0, -4, 4} /* */ #include <stdio.h> #include <ctype.h> #define MAXJMP 16 /* saltos máximos en una diagonal */ #define MAXGAP 24 /* no continuar penalizando espacios mayores a esto */ #define JMPS 1024 /* saltos máximos en una ruta */ #define MX 4 /* guardar si hay al menos MX 1 bases desde el último salto */ #define D AT 3 /* valor de bases apareadas */ #define DMIS O /* penalidad por bases mal apareadas */ #define DINSO 8 /* penalidad por un espacio */ #define DINS1 1 /* penalidad por base */ #define PINSO 8 /* penalidad por un espacio */ #define PINS1 4 /* penalidad por residuo */ struct jmp { short n [MAXJMP] ; /* tamaño por salto (negativo por dely) */ unsigned short x [MAXJMP] ; /* no. base de salto en seq x */ }; /* limita sec. a 2^16 1 */ struct diag { int score; /* califica en último salto */ long offset; /* desplazamiento de bloque previo */ short ijmp; /* índice de saltos actual */ struct jmp jp; /* lista de saltos */ }; struct path { int spc; /* número de saltos principales */ short n[JMPS] tamaño de salto (espacio) */ int x[JMPS] ; /* de salto (último elemento antes de espacio) */ }; char *ofile; /* nombre de archivo de salida */ char *namex[2] ; /* nombres de sec . : getseqsO */ char *prog; /* nombre de programa para mensajes de error */ char *seqx [2 ] ; /* secs. : getseqsO */ int dmax; /* mejor diag.: nw ( ) */ int dmaxO ; /* final diag. */ int dna; /* ajusta si dna: main() */ int endgaps; /* ajusta si se penalizan espacios finales */ int gapx, gapy; /* total de espacios en secuencias */ int lenO, lenl; /* lens de secuencia */ int ngapx, ngapy /* tamaño total de espacios */ int smax; /* calif. máxima: nw ( ) */ int *xbm; /* mapa de bits por apareamiento */ long offset ,- /* desplazamiento actual en archivo de saltos */ struct diag *dx; /* mantiene diagonales */ struct path pp[2] ; /* mantiene ruta por secs. */ char *calloc() , *malloc() , *index() , *strcpy() ; char *getseq() , *g_calloc() ; /* programa de alineamiento Needleman-Wunsch * * uso: programa filel file2 * en donde filel y file2 son dos secuencias de adn o de proteína. * Las secuencias pueden ser en mayúsculas o minúsculas y pueden contener ambigüedad * Cualesquiera líneas que empiezan con 1 ; ', '>' o '<' son ignoradas * Longitud máxima de archivo es 65535 (limitada por x corto no visible en la estructura de salto) * Una secuencia con 1/3 o más de sus elementos ACGTU se considera un ADN * Las salida es en el archivo "align.out" * * El programa puede crear un archivo temporal en /tmp y mantener información respecto a traceback. * Versión original desarrollada bajo BSD 4.3 en un vax 8650 */ #include "nw.h" #include "day.h" static _dbval[26] = { 1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0 , 10, 0 }; static _pbval [26] = { 1, 2| (1«('D' '?' ) ) I (1« ( '?' '?')), 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1<<10, 1<<11, 1<<12, 1<<13, 1<<14, 1<<15, 1<<16, 1<<17, 1<<18, 1<<19, 1<<20, 1<<21, 1<<22 , 1<<23, 1<<24, 1<<25 I (1<< ( ?' ?' ) ) | (1<< ( ' Q ' 1 A ' ) ) }; main(ac, av) main int ac ; char *a [ ] ; { prog = a [0] ; if (ac != 3) { fprintf (stderr, "usage : %s filel file2\n" , prog) ; fprintf (stderr , "where filel and file2 are two dna or two protein sequences . \n" ) ; fprintf (stderr , "The sequences can be in upper or lower case\n") ; f rintf (stderr , "Any lines beginning with ' ; ' or '<' are ignored\n" ) ; fprintf (stderr, "Output is in the file \"align.out\"\n") ; exit (1) ; } namex [0] = av [1] ; namex [1] = av [2] ; seqx[0] = getseq (namex [0] , &len0) ; seqx[l] = getseq (name [1] , &lenl) ; xbm = (dna)? dbval : pbval ,- endgaps = 0; /* 1 para penalizar espacios de extremo */ ofile = "align.out" ; /* archivo de salida */ nw ( ) ; /* llenar la matriz, obtener los saltos posibles */ readjmpsO ; /* adquirir los saltos actuales */ printO ; /* imprimir estadísticas, alineamiento */ cleanup (0) ; desvincular cualesquiera archivos temporales */ } /* hacer alineamiento, regresar mejor calificación: main ( ) * adn: valores en Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: valoers PAM 250 * Cuando las calificación son iguales, se prefiere mal apareamientos en cualquier espacio, se prefiere * un nuevo espacio que extiende un espacio en curso, y se prefiere un espacio en seqx * a un espacio en sec y. */ nw ( ) nw { char *px, *py; /* secs y ptrs */ int *ndely, *dely; /* seguimiento de dely */ int ndelx, delx; /*seguimiento de delx */ int *tmp; /* para intercambiar rowO , */ int mis ; /*calificación para cada tipo*/ int insO, insl; /* inserción de penalidades register id; /* índice diagonal */ register ij ; /* índice de salto */ register *colO, *coll; /* calificación actual, última hilera */ register xx, yy; /* índice en secs */ dx = (struct diag * ) g_calloc ( " to get diags", lenO+lenl+1, sizeof (struct diag)); ndely = (int * ) g_calloc ( " to get ndely" , lenl+1, sizeof (int) ) ; dely = (int * ) g_calloc ( " to get dely" , lenl+1, sizeof (int) ) ; colO (int *) g_calloc ( "to get colO", lenl+1, sizeof (int) ) ; coll = (int *) g_calloc ( "to get coll", lenl+1, sizeof ( int ) ) ; insO = (dna) ? DINSO : PINSO; insl = (dna)? DINS1 : PINS1; smax = 10000; if (endgaps) { for (col0[0] = dely[0] = insO, yy = i; yy <= lenl; yy++) { colO [yy] = dely [yy] = colO [yy 1] insl ; ndely [yy] = yy; } colO[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ } else for (yy = 1; yy <= lenl; yy++) dely[yy] = insO; /* llenar la matriz de apareamiento */ for (px = seqx[0] , xx = 1; xx <= lenO; px++, xx++) { /* initializa primera entrada en col */ if (endgaps) { if (xx == 1) coll [0] = delx = (insO+insl) ; else coll[0] = delx = colO [0] insl; ndelx = xx; } else { coll[0] = 0; delx = insO; ndelx = 0; } for (py = seqx[l], yy = 1 ; yy <= lenl; py++, YY++) { mis = colO [yy 1] ; if (dna) mis += (xbm[*px ' A' ] &xbm [*py ?'])? DMAT : DMIS; else mis += _day[*px ' A 1 ] [*py ?1]; /*actualiza penalidad por del en x sec . ; * favorece nueva del sobre del en curso * ignora MAXGAP si se ponderan espacios de extremo */ if (endgaps | | ndelytyy] < MAXGAP) { if (colO [yy] insO >= dely [yy] ) { dely[yy] = colO [yy] (insO+insl) ; ndelytyy] = 1; } else { delytyy] = insl; ndely [yy] ++ ; } } else { if (col0[yy] (insO+insl) >= dely [yy] ) { dely [yy] colO [yy] ndely[yy] = 1; } else ndely [yy] ++ ; actualiza penalidad por del in y seq; favorece nuevo del sobre del en curso (endgaps | | ndelx < MAXGAP) { if (coll[yy 1] insO >= delx) { delx = coll [yy 1] (insO+insl) ; ndelx = 1 ; } else { delx = insl; ndelx++ ; } lse { if (coll [yy 1] (insO+insl) >= delx! delx = coll [yy 1] (insO+insl) ; ndelx = 1 ; } else ndelx++ ,- selecciona la calificación máxima favorecemos * faltante sobre cualquier del y delx sobre dely . nw id = xx yy + lenl 1; if (mis >= delx && mis >= dely [yy] ) coll [yy] = mis ; else if (delx >= dely[yy]) { coll [yy] = delx; ij = dx [id] . ijmp; if (dx[id] . jp.n[0] && ( ! dna (ndelx >= MAXJMP && xx > dx [id] . jp . [ij ] +MX) mis > dx [id] . score+DINSO) ) { dx [id] . ijmp++ ; if (++ij >= MAXJMP) { writej mps ( id) ; ij = dx[id] .ijmp = 0 ; dx [id] . offset = offset; offset += sizeof (struct jmp) + sizeof (offset) ; dx [id] . jp . n [ij ] = ndelx; dx [id] . jp .x [ij ] = xx; d [id] . score = delx; } else { coll[yy] = dely[yy] ; ij = dx [id] . ijmp; if (dx[id] . jp.n[0] && (!dna | | (ndely[yy] >= MAXJMP && xx > dx[id] . jp . x [ij ] +MX) | | mis > dx[id] .score+DINSO) ) { dx [id] . ijmp++ ; if (++ij >= MAXJ P) { writejmps (id) ; ij = dx[id] .ijmp = 0 ; dx [id] . offset = offset; offset += sizeof (struct jmp) + sizeof (offset ) ; } dx [id] . jp.n [ij ] = ndely[yy] ; dx [id] . jp .x [ij ] = xx; dx[id] .score = dely [yy] ; } last col if (endgaps) coll [yy] = insO+insl* (lenl yy) if (coll [yy] > smax) { smax = coll [yy] ; dmax = id; } } } if (endgaps && xx < lenO) coll [yy 1] = insO+insl* (lenO xx) ; if (coll [yy 1] > smax) { smax = coll [yy 1] ; dmax = id; } tmp = colO; colO = coll; coll = tmp; } (void) free((char *)ndely); (void) free((char *)dely); (void) free((char *)colO); (void) free((char *)coll); } print ( ) sólo rutina visible fuera de este módulo * static: * getmatO -- traceback mejor ruta, cuenta apareamientos: print() * pr_align() -- imprimir alineamiento descrito en array p [ ] : print () * dumpblockO -- descarga un bloque de líneas con números, estrellas: pr_align() * nums ( ) -- coloca una línea de número: dumpblockO * putlineO -- coloca una línea (ñame, [num] , seq, [num] ) : dumpblockO * stars 0 -- coloca una línea de estrellas: dumpblock ( ) * stripname 0 desprende cualquier ruta y prefijo de un seqname */ #include "nw.h" #define SPC 3 #define P_LINE 256 /* línea de salida máxima */ #define P_SPC 3 /* espacio entre nombre o número y sec. */ extern _day [26] [26] ; int olen; /* ajusta longitud de línea de salida */ FILE *fx; /* archivo de salida */ print ( ) print { int lx, ly, firstgap, lastgap; /* superposición */ if ((fx = fopen(ofile, "w")) == 0) { fprintf ( stderr, " %s : can ' t write %s\n" , prog, ofile) ,- cleanup (1) ; } fprintf(fx, "<first sequence : %s (length = %d) \n" , namex [0] , lenO) ,- fprintf(fx, "<second sequence: %s (length = %d) \n" , name [1] , lenl) ; olen = 60; lx = lenO; ly = lenl; firstgap = lastgap = 0; if (dmax < lenl 1) { /* espacio delantero en x */ pp[0] . spc = firstgap = lenl dmax 1; ly = pp [0] . spc; } else if (dmax > lenl 1) { /*espacio delantero en y */ pp[l] · spc = firstgap = dmax (lenl 1) ; lx = pp [1] . spc ; } if (dmaxO < lenO 1) { /* espacio trasero en x */ lastgap = lenO dmaxO 1 ; lx = lastgap; } else if (dmaxO > lenO 1) { /* espacio trasero en y */ lastgap = dmaxO (lenO 1) ; ly = lastgap; } getmat (lx, ly, firstgap, lastgap) ; pr_align ( ) ; } /* * traceback la mejor ruta, cuenta apareamientos */ static getmat (lx, ly, firstgap, lastgap) getmat int lx, ly; /* "core" (menos espacios de extremo) */ int firstgap, lastgap; /* superposición de seguimiento principal */ int nm, iO, il, sizO, sizl; char outx [32] ; double pct; register ?? , nl ; register char *p0 , *pl; /* obtener total de apareamientos, calificación */ pO = seqx[0] + pp[l] .spc; pl = seqx[l] + pp[0].spc; nO = pp [1] . spc + 1 ; nl = pp [0] . spc + 1 ; nm = 0 ; while ( *p0 && *pl ) { if (sizO) { pl++; nl++ ; sizO ; } else if (sizl) { p0++; n0++ ; sizl ; } else { if (xbm[*pO ' A ' ] &xbm [*pl 'A 1 ] ) nm++ ; if (nO++ == pp[0].x[iO]) sizO = pp[0] .n[iO++] ; if (nl++ == pp[l] .x[il] ) siz1 = pp [1] . n [i1++] ; pO++; pl++; } } /* homología de pct : * si se penalizan espacios de extremo, la base es la más corta sec . * de otra forma, desprender extensiones y tomar el núcleo más corto */ if (endgaps) lx = (lenO < lenl) ? lenO : lenl; else lx = (lx < ly) ? lx : ly; pct = 100.* (double) nm/ (double) lx; fprintf (fx, "\n") · fprintf (fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\n" , nm, (nm == 1)? "" : "es", lx, pct) ,· fprintf(fx, "<gaps in first sequence : %d" , gapx) ; ... getmat if (gapx) { (void) sprintf (outx, " (%d %s%s)'\ ngapx, (dna) ? "base" : "residue" , (ngapx == 1 ) ? " " : " s " ) ; fprintf (fx, "%s" , outx) ; fprintf(fx, ", gaps in second sequence: %d" , gapy) ; if (gapy) { (void) sprintf (outx, " (%d %s%s)", ngapy, (dna) ? "base " : " residue " , (ngapy == 1 ) ? " " : " s " ) ; fprintf (fx, "%s" , outx); } if (dna) fprintf (fx, "\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %d + %d per base)\n", smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS1); else fprintf (fx, "\n<score: %d (Dayhoff PA 250 matrix, gap penalty = %d + %d per residue) \n", smax, PINSO, PINS1) ; if (endgaps) fprintf ( fx, "<endgaps penalized. left endgap : %d %s%s, right endgap: %d %s%s\n" , firstgap, (dna) ? "base" : "residue", (firstgap == 1) ? " " : "s" , lastgap, (dna) ? "base" : "residue", (lastgap == 1 ) ? " " : " s " ) ; else fprintf(fx, "<endgaps not penalized\n" ) ; } static nm; apareamientos en núcleo para verificar */ static lmax; tramos de nombres archivo desprendidos static ij [2] ; índice de saltos para una ruta */ static nc [2] ; número al inicio de línea actual */ static ni [2] ; número de elem actual para espacios */ static siz [2] static char *ps[2] /* ptr un elemento actual*/ static char *po[2] /* ptr una ranura de car. de salida siguiente */ static char out [2] [P_LINE] ; /* línea de salida */ static char star [P_LINE] ; /* ajustado por starsO */ /* * imprimir alineamiento de lo descrito en la ruta struct P t ] */ static pr_align ( ) pr_align { int nn; /* conteo de caracteres */ int more; register i ; for (i = 0, lmax = 0; i < 2; i++) { nn = stripname (namex [i] ) ; if (nn > lmax) lmax = nn; nc [i] = 1 ; ni [i] = 1; SÍZ [i] = ij [i] = 0 ; ps [i] = seqx [i] ; po [i] = out [i]; } for (nn = nm = 0, more = 1; more; ) ...pr_align for (i = more = 0; i < 2; i++) { /* * tenemos más de esta secuencia? */ if (!*ps[i]) continué ; more++ ; if (pp[i].spc) { /* espacio delantero */ *po [i] ++ = 1 pp [i] . spc } else if (siz[i]) { /* en un espacio */ *po [i] ++ = ¦ 1 ; siz[i] } else { /* estamos poniendo un elemento de sec . */ *po [i] = *ps [i] ; if (islower (*ps [i] ) ) *ps[i] = toupper ( *ps [i] ) ; po [i] ++; ps[i]++; /* *estamos en el siguiente espacio para esta sec . ? */ if (ni [i] == pp[i] .x[ij [i] ] ) { /* * requerimos una fusión de todos los espacios * en esta ubicación */ siz[i] = pp [i] .n [ij [i] ++ ] ; while (ni [i] == pp [i] .x [ij [i] ] ) siz[i] += pp [i] .n [ij [i] ++] ; } ni [i] ++ ; } } if (++nn == olen | | !more && nn) { dumpblock ( ) ; for (i = 0; i < 2; i++) po [ i ] = out [ i ] ; nn = 0 } /* * vaciar un bloque de líneas, incluyendo números estrellas: pr_align() */ static dumpblock ( ) dumpblock { register i; for (i = 0; i < 2; i++) *po[Í] = '\0'; ... dumpblock (void) putc('\n', fx) ; for (i = 0; i < 2; i++) { if (*out[i] && (*out[i] != ' ' II *(po[i]) ! = ·)) { if (i == 0) nums ( i ) ; if (i == 0 && *out [1] ) stars ( ) ; putline (i) ; if (i == 0 && *out [1] ) fprintf(fx, star); nums ( i ) ; } } } /* *retirar una linea de número: dumpblockO */ static nums ( ix) nums int ix; /* índice en out [ ] mantener línea secuencia */ { char nline [P_LINE] ; register i , j ; register char *pn, *px, *py; for (pn = nline, i = 0 ; i < lmax+P_SPC; i++, pn++) *pn = ' 1 ; for (i = nc [ix] , py = out [ix] ; *py; py++, pn++) { if (*py == · 1 II *py == ' ' ) *pn = ' ' ; else { if (i%10 == 0 I I (i == 1 nc[ix] != 1)) { j = (i < 0)? i : i; for (px = pn; j ; j /= 10, px ) *px = j %10 + ' 0 ' ; if (i < 0) *px = } else *pn = i ++; } } *pn = ' \0 ' ; nc [ix] = i ; for (pn = nline; *pn; pn++) (void) putc(*pn, fx) ; (void) putc('\n', fx) ; } /* * retirar una línea (ñame, [num] , seq, [num] ) dumpblock ( ) */ static putline ( ix) putline int ix; { Table 1 (cont ' ) ... putline int i ; register char *px; for (px = namex[ix] , i = 0; *px && *px != 1 : ' ; px++, i++) (void) putc(*px, fx) ; for (; i < lmax+P_SPC; i++) (void) putc ( 1 ' , fx) ; /* éstos cuentan desde 1: * ni [ ] es el elemento actual (de 1) * nc [ ] es el número al inicio de la línea actual */ for (px = out [ix] ; *px; px++) (void) putc (*px&0x7F, fx) ; (void) putc('\n', fx) ; } /* * poner una línea de estrellas (secs siempre en out [0] , out[l]): dumpblockO */ static stars ( ) stars { int i ; register char *pO, *pl, cx, *px; if (!*out[0] II (*out[0] == ' ' S S *(po[0] !*out[l] II (*out[l] == 1 1 && *(po[l]) == 1 ')) return; px = star; for (i = lmax+P_SPC; i ; i ) *px++ = 1 ' ; for (?? = out[0], pl = out [1] ; *p0 && *pl; p0++, pl++) { if (isalpha (*p0) && isalpha ( *pl ) ) { if (xbm[*p0 'A']&xbm[*pl 1 A ' ] ) { cx nm++; } else if (!dna && _day[*p0 ?'] [*?1 '?'] > 0) CX = ' . ' ; else cx = ' } else cx = ' *px++ = CX; } *px++ = ' \n ' ; *px = ' \01 ; } /* * desprende ruta o prefijo de pn, regresar len: pr_align ( ) */ static stripname (pn) stripname char *pn; /*nombre de archivo (puede ser ruta) */ { register char *px, *py; py = 0; for (px = pn; *px; px++) if (*px == ' / ' ) py = px + 1 ; if (py) (void) strcpy(pn, py) ; return (strlen (pn) ) ; } /* * cleanu O limpiar cualquier archivo tmp * getseqO leer seq, set dna, len, maxlen * g_calloc() callocO con checkin de error * readjmpsO obtener los buenos saltos, del archivo tmp de ser necesario * writejmpsO escribe un arreglo relleno de saltos a un archivo tmp : nw ( ) */ #include "nw.h" #include <sys/file.h> char *jname = " /tmp/homgXXXXXX" ; /* archivo tmp para jmps */ FILE *fj ; int cleanupO ; /* limpieza de archivo tmp */ long lseek ( ) ; /* * eliminar cualquier archivo tmp, de fallar */ cleanup (i) cleanup int i ; { if (fj) (void) unlink (jname) ; exit ( i ) ; } /* * leer, regresar ptr una seq, set dna, len, maxlen * salta líneas partiendo de '<', o ¦>' * sec . en mayúsculas o minúsculas */ char * getseq(file, len) getseq char *file,- /* nombre de archivo */ int *len; /* sec. len */ { char line

[1024], *pseq; register char *px, *py; int natgc, tlen; FILE *fp; if ((fp = fopen(file, "r") ) == 0) { fprintf (stderr, "%s : can ' t read %s\n" , prog, file) ; exit ( 1 ) ; } tlen = natgc = 0; while (fgetsdine, 1024, fp) ) { if (*line == ' ; ' ¡ I *line == '<' | | *line == '>' ) continué ; for (px = line; *px != '\?'; px++) if (isupper (*px) || islower (*px) ) tlen++ ; } if ( (pseq = malloc ( (unsigned) (tlen+6) ) ) == 0) { fprintf (stderr, " %s : malloc () failed a get %d ytes for %s\n" , prog, tlen+6, file); exit ( 1 ) ; } pseq[0] = pseq[l] = pseq[2] = pseq[3] = 1 \0 ' ; ...getseq py = pseq + 4 ; *len = tlen; rewind ( fp) ; while (fgetsdine, 1024, fp) ) { if (*line == '; ' I I *line == '<' || *line == ¦>' ) continué ; for (px = line; *px != px++) { if (isupper ( *px) ) *py++ = *px; else if ( islower ( *px) ) *py++ = toupper (*px) ; if (index("ATGCU", * (py 1) ) ) natgc++ ; } } *py++ = ' \01 ; *py = '\0' ; (void) fclose(fp) ; dna = natgc > (tlen/3) ; return (pseq+4 ) ; } char * g_calloc (msg, nx, sz) g calloc char *msg; /* programa, requiere rutina */ int nx, sz; /* número y tamaño de elementos */ { char *px, *calloc() ; if ( (px = calloc ( (unsigned) nx, (unsigned) sz) ) == 0) { if (*msg) { fprintf (stderr , "%s: g_calloc() failed %s (n=%d, sz=%d)\n", prog, msg, nx, sz) ; exit ( 1 ) ; } } return (px) ; } /* * obtener final de saltos de dx [ ] o archivo tmp, sea pp [ ], reajustar dmax: main() */ readjmps ( ) readjmps { int fd = 1; int siz, iO, il; register i, j, xx; f (fj) { (void) fcióse (fj); if ((fd = open (j name, 0_RDONLY, 0)) < 0) { fprintf (stderr, "%s: can't open ( ) %s\n" , prog, jname) ; cleanup (1) ; } } for (i = iO = il = 0, dmaxO = dmax, xx = lenO; ; i++) { while (1) { for (j = dx [dmax] . dx [dmax] . j . x [j ] >= xx; j ) ... readjmps if (j < 0 && dx[dmax] .offset && fj ) { (void) lseek(fd, dx[dmax] .offset, 0) ; (void) read(fd, (char *)&dx[dmax] .jp, sizeof (struct jmp)); (void) read(fd, (char *)&dx[dmax] .offset, sizeof (dx [dmax] .offset)); dx[dmax] .ijmp = MA JMP 1; } else break; } if (i >= JMPS) { fprintf (stderr, "%s: too many gaps in alignment\n" , prog) ; cleanup ( 1 ) ; } if (j >= 0) { siz = dx[dmax] . jp.n[j] ; xx = dx [dmax] .jp.x[j] ; dmax += siz; if (siz < 0) { /*espacio en segunda sec. */ pp [1] .n [il] = siz; XX += S i Z ; /* id = xx yy + lenl 1 */ pp[l] . x[il] = xx dmax + lenl 1 ; gapy++; ngapy = siz; /* ignora MAXGAP al hacer espacios de extremo */ siz = ( siz < MAXGAP I I endgaps) ? siz : MAXGAP; i1++ ; } else if (siz > 0) { /* espacio en primer sec. */ pp [0] . n [iO] = siz ; pp [0] . x [i0] = xx; gapx++; ngapx += siz; /* ignora MAXGAP al hacer espacios de extremo */ siz = (siz < MAXGAP | | endgaps) ? siz : MAXGAP; Í0++; } } else break; } /* invertir el orden de saltos */ for (j = 0, iO ; j < i0; iO ) { i = pp[0].n[j]; pp[0].n[j] = pp [0] . n [iO] ; pp [0] .n [iO] = i ; i = pp[0].x[j]; pp[0].x[j] = pp[0].x[iO]; pp [0] .x[iO] = i; } for (j = 0, il ; j < il; il ) { i = pp[l].n[j]; pp[l].n[j] = pp[l].n[il]; pp [1] . n [i1] = i ; i = pp[l].x[j]; pp[l].x[j] = pp[l].x[il]; pp [1] . X [i1] = i ; } if (fd >= 0) (void) close (fd); f (fj) { (void) unlink (jname) ; fj = 0; offset = 0; /* * escribir un desplazamiento de estructura de saltos rellena de la previa (de haber) : nw ( ) */ writejmps (ix) writej mps int ix; { char *mktemp ( ) ; if (!fj) { if (mktem (j ñame) < 0) { fprintf (stderr, "%s: can ' t mktemp () %s\n" , prog, jname) ; cleanup ( 1 ) ; } if ( (fj = fopen (jname, "w")) == 0) { fprintf (stderr, "%s: can ' t write %s\n" , prog, jname) ; exit ( 1 ) ; } } (void) fwrite ( (char *) &dx [ix] . jp, sizeof (struct jmp) , 1, fj ) ; (void) fwrite ( (char *) &dx [ix] .offset, sizeof (d [ix] .offset) , 1, fj ) ; } Tabla 2 Referencia xxxxxxxxxxxxxxx (Longitud 15 amino ácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYY (Longitud 12 amino ácidos) % de identidad de secuencia amino ácido = (el número de residuos amino ácidos de idéntica correspondencia entre las dos secuencias polipéptido como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos amino ácido del polipéptido de referencia) = 5 dividido por 15 = 33.3% Tabla 3 Referencia XXXXXXXXXXXXXXX (Longitud = 10 amino ácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYZZYZ (Longitud = 15 amino ácidos) % de identidad de secuencia amino ácido = (el número de residuos amino ácidos de idéntica correspondencia entre las dos secuencias polipéptido como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos amino ácido del polipéptido de referencia) = 5 dividido por 10 = 50% Tabla 4 Referencia-ADN NNNNNNNNNNNMNÍN (Longitud = 14 nucleótidos) ADN de Comparación NNNNNNLLLLLLLLLL (Longitud = 16 nucleótidos) % de identidad de secuencia ácido nucleico = (el número de nucleótidos de idéntica correspondencia entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico ADN de referencia) = 6 dividido por 14 = 42.9% Tabla 5 ADN de Referencia NNNNNNNNNNNN (Longitud = 12 nucleótidos) ADN de Comparación NNNNLLLW (Longitud = 9 nucleótidos) % de identidad de secuencia de ácido nucleico = (el número de nucleótidos de idéntica correspondencia entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico ADN de referencia) = 4 dividido por 12 = 33.3% II. Composiciones y Métodos de la Invención A. Métodos y Significados En la actualidad, los gliomas de alto grado se diagnostican por criterios histopatologicos y factores de pronóstico robusto conocidos para la mayoría de estos tumores están limitados a grado de tumor y edad del paciente. La aceptación difundida que pérdidas en chrs lp y 19q son de valor de pronóstico en oligodendroglioma (Cairncross et al., J. Nati Cáncer Inst. 90: 1473-1479 (1998) ha estimulado el interés en desarrollo de marcadores moleculares para pronosticar el resultado y respuesta al tratamiento a través de una más amplia población de gliomas. Mientras que númerosas alteraciones genéticas se han descrito en GBM, y algunas tales como la amplificación EGFR y mutación p53, parecen distinguir entre GBMs primarios y secundarios (von Deimling et al., Glia 15: 328-338 (1995); Watanabe et al., Brain Pathol . 6: 217-223 (1996), estos marcadores son de utilidad marginal para pronosticar resultado o guiar decisiones respecto al manejo de la enfermedad. De manera importante, recientes estudios de perfilado de expresión han revelado que la clasificación molecular de gliomas puede ser de valor de pronóstico (Freije et al., Cáncer Res. 64: 6503-6510 (2004); Nutt et al., Cáncer Res. 63: 1602-1607 (2003). En el actual estudio, identificamos alteraciones moleculares asociadas con agresividad de tumor así como con avance de enfermedad y proporciona evidencia para sugerir que la clasificación molecular puede utilizarse para pronosticar respuestas a terapias objetivo. Subclases de tumor que tienen valor de pronóstico y delinean un patrón de avance de enfermedad. Los solicitantes aquí describen, un esquema de clasificación de pronóstico novedoso para astrocitoma de alto grado que asigna tumores a subtipos con base en similaridad para definir firmas de expresión. Cada uno de los tres subtipos moleculares de gliomas semeja un conjunto distinto de tejidos y se enriquece para marcadores de aspectos diferentes de crecimiento de tejido. Mientras que el actual análisis utiliza un conjunto de 35 genes firma, estos marcadores son representativos de listas de marcadores mucho más largas que pueden utilizarse para identificar cada subtipo de tumor. Un subtipo de tumor, que denominamos proneural (PN) , se distingue por un pronóstico marcadamente mejor y expresa genes asociados con cerebro normal y el proceso de neurogénesis . Dos subtipos de pronóstico pobre que se caracterizan por una semejanza a cualquiera de líneas celulares o tejidos altamente proliferativos de origen mesenquimal muestran activación de programas de expresión de gen indicativos de proliferación de células o angiogénesis , respectivamente. Especulamos que la pobre supervivencia asociada con los tipos de tumor Mes y Prolif se relaciona a una ventaja de crecimiento conferida ya sea por una velocidad rápida de división celular o supervivencia mejorada de células de tumor que se logra por neovascularización . Mientras que la sola presencia o ausencia o neovascularización o figuras mitóticas no distingue subclases, esto habrá de esperarse, ya que estas características son signos característicos de casi todos los glioblastoma multiforme. Estudios previos han sugerido que el valor de pronóstico de marcadores de proliferación o angiogénesis en glioma (Ho et al., Am. J. Clin. Pathol . 119: 715-722 (2003); Hsu et al., Cáncer Res. 56: 5684-5691 (1996); Osada et al., Anticancer Res. 24: 547-552 (2004) , pero no han indicado la presencia de subconjuntos de tumor distintos que se asocian en forma diferencial con estos procesos. Vale la pena notar, que nuestros subtipos de glioma Prolif y Mes se caracterizan por expresión de subconjuntos de marcadores de una firma de sanado de herida que se ha asociado con un pobre resultado en varios tipos de tumor epitelial. Ver Tabla A; (Chang et al., P.N.A.S. (USA) 85: 704-710 (2005). Los subtipos de tumor identificados en el estudio actual tienen semejanza a subtipos de pronóstico previamente reportados identificados por perfilado de expresión. En particular, tres estudios previamente publicados reportan fenotipos que semejan cercanamente a los subtipos de tumos PN y Mes que describimos (Freije et al., supra; Liang et al., P.N.A.S. (USA) 102: 5814-5819 (2005); Nigro et al., Cáncer Res. 65: 1678-1686 (2005). Además, trabajo previo (Godard et al., Cáncer Res. 63: 6613-6625 (2003) resalta un agrupamiento de genes angiogénicos que definen una subpoblación de tumor que parece similar a nuestro subtipo de tumor Mes. Nuestra observación de un patrón de expresión mutuamente excluyente de marcadores PN contra Mes ayuda a explicar el consenso respecto a la existencia de estos dos subtipos de tumor. Incluso con especímenes de tumor que expresan tanto marcadores PN como Mes, encontramos una distribución espacial no superpuesta de expresión. La fuerte asociación entre LOH10 y la distinción entre las firmas Mes y PN es consistente con hallazgos previos que enlazan LOH10 a firmas de expresión de pronósticos (Nigro et al., Cáncer Res. 65: 1678-1686 (2005) y la asociación entre un fenotipo angiogénico y LOH10 es consistente con la demostración de acciones anti -angiogénicas de introducción de chr 10 en líneas celulares GBM (Hsu et al., Cáncer Res. 56: 5684-5691 (1996). La existencia de un subtipo de tumor distinto que se enriquece por marcadores de proliferación se ha denotado por un reporte previo (Freije et al., supra.), pero no se ha descrito en otros estudios. Nuestros hallazgos indican que la firma Prolif es menos exclusiva que las firmas PN o Mes y que la proporción de gliomas que ocurren con una firma Prolif varia a través de las mismas poblaciones obtenidas de diferentes instituciones. Soportando nuestra categorizacion de la subclase de tumor Prolif como un subtipo de tumor molecular distinto, señalamos la existencia en tumores Prolif de un patrón de alteraciones genómicas que distinguen este subtipo de tumor. En forma más notable, ganancias del sitio PIK3R3 en chrl parecen ser una característica que es única para los tumores de la clase Prolif. La existencia de una alteración genómica única a tumores que contienen la firma Prolif argumenta en favor de la designación de estos tumores como una subclase distinta y sugiere que factores epidemiológicos pueden haber influenciado la incidencia de esta subclase de las poblaciones investigadas. La exclusividad mutua marcada de las firmas de tumor PN y Mes sugiere la posibilidad de que estos subtipos de tumor reflejan distintas entidades de enfermedad, que probablemente surgen de diferentes tipos de origen celular. Al estudiar pares acoplados de tumores primarios y recurrentes de los mismos pacientes, sin embargo, observamos que algunos tumores que originalmente surgen como subtipo PN o Prolif recurren a una firma con Mes. La expresión Focal de CHI3L1/YKL40 , un marcador del fenotipo Mes, se ve en tumores primarios, incluyendo aquellos que cambian a la clase Mes ante recurrencia. En forma notable, no se ven instancias de tumores que logran carácter PN apreciable entre presentación y recurrencia inicial. En conjunto con la habilidad de líneas celulares madre neurales para desplazar de firma PN a Mes, la habilidad de tumores para cambiar subclases sugiere que los subtipos de tumor puedan representar estados de diferenciación alternos de enfermedad. Sin embargo no podemos, descartar la posibilidad de que algunos cambios aparentes puedan reflejar heterogeneidad de tumor en vez de cambios temporales en carácter del tumor. Además, nuestro diseño experimental no nos permite distinguir entre alteraciones en expresión de genes que reflejen avance de la enfermedad de aquellos que son producidos por los efectos del tratamiento. Sin embargo, cambios de subclase de tumor unidireccional sugieren la posibilidad de que las células de tumor puedan adquirir el fenotipo Mes como resultado de acumulación de anormalidades genéticas o epigenéticas . La edad mayor de pacientes con tumores de subtipos Mes es consistente con dicha hipótesis. Mientras que no tenemos evidencia directa por eventos moleculares subyacentes al cambio aparente en firma de células de tumor, la fuerte correlación entre perdidas de crio y la firma Mes puede ofrecer una percepción importante en la biología del avance de la enfermedad. Independientemente del mecanismo subyacente, los cambios hacia el fenotipo Mes parecen ser un patrón común de avance de enfermedad y son reminiscentes de transiciones epiteliales-a-mesenquimales (EMT epithelial-to-mesenchymal transition) que se asocian con comportamiento maligno incrementado de tumores epiteliales. Consistente con el papel central de activación Akt en EMT [Larue and Bellacosa, Oncogene 24: 7443 (2005)], nuestros datos sugieren que Akt juega un papel para inducir una transición mesenquimal en gliomas. Marcadores en señalización Notch y Akt pronostican agresividad de glioma Nuestros hallazgos demuestran eviencia en niveles genóico, de ARNm y proteína para activar alteraciones de señalización Akt en tumores de subtipos de deficiente pronóstico. Una abundancia de datos previos soporta un papel para señalización akt para promover la formación y crecimiento de malignidades gliales de alto grado (Knobbe et al., Neuro-Oncology 4: 196-211 (2002); Sonoda et al., Cáncer Res. 61: 6674-6678 (2001) . Una serie de estudios elegantes en modelos de ratón de ingeniería genética ha demostrado en forma convincente un papel para akt en promover formación y crecimiento de malignidades gliales (Holland et al., Nature Genetics 25: 55-57 (2000); Rajasekhar et al., Mol. Cell 12: 889-901 (2003); Uhrbom et al., Cáncer Res. 62: 5551-5558 (2002); Xiao et al., Cáncer Res. 65: 5172-5180 (2005) . En tumores humanos, tanto amplificación EGFR como deleción PTEN son alteraciones bien conocidas que activan akt y se asocian específicamente con la distinción entre GBM contra lesiones de menor grado (Stiles et al., Mol. Cell Biol . 22: 3842-3851 (2002). Más recientemente, ambas mutaciones en PIK3CA y un número de copias equilibrado aumenta en PIK3CA y PIK3CD se han descrito en AA y GBM (Broderick et al., Cáncer Res. 64: 5048-5050 (2004); Mizoguchi et al., Brain Pathol . 14: 372-377 (2004); Samuels et al., Science 304: 54 (2004). Mientras que el valor de pronóstico de amplificación EGFR o cambios genéticos en subunidades PI3K no es claro, varios estudios han mostrado que perdidas en chr 10, perdida del sitio PTEN, o señalización PI3K mejorada todas se asocian con deficiente resultado en GBM (Chakravarti et al., J. Clin. Oncol . 22: 1926-1933 (2004); Lin et al., Clin. Cáncer Res. 4: 2447-2454 (1998); Schmidt et al., J. Neur. Exp . Neurol . 61: 321-328 (2002); Smith et al., J. Nat . Cáncer Inst . 93: 1246-1256 (2001); Tada et al., J. Neurosurg. 95: 651-659 (2001). La activación de señalización PI3K/akt se implica en varios procesos biológicos que confieren una ventaja de crecimiento, incluyendo proliferación, supervivencia y angiogénesis (Abe et al., Cáncer Res. 63: 2300-2305 (2003); Pore et al., Cáncer Res. 63: 236-241 (2003); Su et al., Cáncer Res. 63: 3585-3592 (2003). De esta manera, especulamos que el deficiente resultado de los tumores de subtipo Prolif y Mes resulta de acciones de señalización PI3K/akt para promover patrones de crecimiento más agresivos caracterizados por una alta velocidad de proliferación o neoangiogénesis , respectivamente. Los hallazgos actuales no llevan a una hipótesis clara para explicar la divergencia entre las manifestaciones proliferativas contra angiogénicas de señalización akt en los dos subtipos de pronóstico pobre, pero una posibilidad es que una perdida de sitios más frecuente en cr lOp o ganancias en cr7 en tumores Mes puedan contribuir a esta distinción. La alta frecuencia de marcadores codificados en chl9 es interesante en este aspecto . La activación de señalización de Notchl recientemente se ha ligado con varias malignidades, incluyendo glioma (Fan et al., Cáncer Res. 64: 7787-7793 (2004); Purow et al., Cáncer Res. 65: 2353-2363 (2005); Radtke and Clevers, Science 307: 1904-1909 (2005); Weng et al., Science 306: 269-271 (2004). Nuestras observaciones demuestran un valor de pronóstico de los marcadores de ruta Notch en gliomas de alto grado. Específicamente, encontramos que la tensión nuclear Notchl y ARNm para varios elementos de ruta Notch se enriquecen significativamente en el subtipo de tumor PN de mejor resultado en comparación con los subtipos de deficiente pronóstico. Además, encontramos en dos poblaciones muestra independientes que la expresión de ARNm para DLL3 se correlaciona con más larga supervivencia, particularmente en casos en donde la expresión PTEN es elevada. Mientras que varias interpretaciones son posibles, una posibilidad interesante es que la presencia de PTEN intacto, actividad inhibitoria de DLL3 en señalización notch [Ladi et al., J. Cell Biol . 170: 983-992 (2005)] puede limitar el crecimiento de tumor al promover un fenotipo más diferenciado. Independientemente del papel preciso de la señalización Notch, el valor de pronóstico de nuestro modelo PTEN & DLL3 Cox de dos genes señala más claramente a señalización akt y Notch como principales determinantes de crecimiento de tumor. Paralelos entre regulación de crecimiento de glioma y neurogénesis de prosencéfalo . La actual investigación liga los subtipos de tumor de pronóstico a diferencias en expresión relativa en células madre neurales contra marcadores de neuroblastos así como diferencias en elementos de señalización Akt y Notch. Un modelo para gliomas humanos es que todos los subtipos molecularmente definidos surgen de similares tipo (s) -de-originen celular, pero algunos tumores se mantienen en fenotipos tipo célula medre neural no diferenciada (Mes) o tipo-amplificación- transito (Prolif) , mientras que otros (PN) adoptan un fenotipo más cercano al de neuroblastos o neuronas inmaduras. Este modelo, soportado por estudios en animales [Bachoo et al., Cáncer Cell 1: 269-277 (2002); Fomchenko and Holland, Exp . Cell Res. 306: 323-329 (2005)], no hace pronóstico específico en cuanto a que etapa o etapas sobre el eje de diferenciación de la célula madre neural a linaje o linajes neuronales o gliales el o los tipos-de-origen de célula para gliomas de alto grado residen y frenan el fenotipo de tumor pueda ser dictado por alteraciones moleculares en rutas de señalización. A la luz de los papeles críticos que el experto en PTEN y notch suring?? neurogenesis de prosencéfalo para mantener células madre neurales o progenitoras en un estado no diferenciado proliferante (Groszer et al., Science 294: 2186-2189 (2001); Sakamoto et al., J. Biol. Chem. 278: 44808-44815 (2003); Yoon and Gaiano, Nature Neurosci . 8: 709-715 (2005), nuestros hallazgos sugieren que la agresividad de crecimiento de glioma puede ser regulada substancialmente por procesos que regulan las selecciones del destino celular durante neurogénesis . El fenotipo de los subtipos de tumor definidos de nuevo hace paralelas etapas en neurogénesis en el prosencéfalo adulto. Similar a precursores neuronales comprometidos (o neuronales-oligodendrogliales) , los tumores del subtipo PN parecen tener una baja velocidad de proliferación, y expresa marcadores asociados con neurblastos y neuronas inmaduras, los factores de transcripción 0LIG2 y Ascll junto con otros marcadores de linaje neuronal . En contraste, los tumores de subtipo MES y Prolif carecen de marcadores de linajes neuronales, pero recapitulan aspectos de células madres neurales y/o células de amplificación de tránsito. El paralelo entre la velocidad de proliferación aparentemente rápida de tumores Prolif y las células de amplificación de tránsito es fácilmente aparente. Además, encontramos que algunos tumores del subtipo Prolif pero ningunas otras clases, se caracterizan por expresión robusta de MELK, un marcador de células precursoras multipotenciales rápidamente proliferantes en el prosencéfalo de roedor. Nakano et al., J. Cell Biol . 170: 413 (2005). Además, las amplificaciones EGFR en tumores de ambas subclases Prolif y Mes hace paralelo a la respuesta de ambas células madre neurales y células de amplificación de tránsito a EGF (Doetsch et al., Neuron 36: 1021-1034 (2002). La expresión de músculo liso, células endoteliales y marcadores de cartílago por tumores Mes recuerda el multipotencial reportado de células madre neurales del prosencéfalo de adulto. Bani-Yaghoub et al., Development 131: 4287-4298 (2004); Rietze et al., Nature 412: 736-739 (2001); Sieber-Blum, Developmental Neuroscience 25:273-278 (2003); Wurmser et al . , Nature 430: 350-356 (2004). Una advertencia en interpretación sin embargo se refiere a la posibilidad de que los perfiles de expresión de tumor puedan ser confundidos por reclutamiento de poblaciones tipo células madre con la masa del tumor. De forma intrigante, los paralelos entre el fenotipo de tumor Mes y las células madre neurales se extienden, incluyen una recapitulación de la cercana asociación que se ve entre células madre neurales y células endoteliales . En contraste con otros subtipos de tumor, los tumores Mes exhiben expresión robusta de VEGF, sus receptores y marcadores de células endoteliales. Recientes hallazgos indican que VEGF promueve proliferación y supervivencia de células madre neurales de prosencéfalo de adulto y demuestran que factores secretados de células endoteliales también promueven proliferación de células madre neurales (Cao et al., Nature Genetics 36: 827-835 (2004); Fabel et al., Eur. J. Neurosci. 18: 2803-2812 (2003); Jin et al., P.N.A.S. (USA) 99: 11946-11950 (2002); Maurer et al., Neurosci. Lett. 344: 165-168 (2003); Schanzer et al., Brain Pathol . 14: 237-248 (2004); Shen et al., Science 304: 1338-1340 (2004); Yasuhara et al., Reviews Neurosci. 15: 293-307 (2004); Zhu et al., FASEB J. 17: 186-193 (2003). Es interesante especular que el crecimiento de células de tumor del fenotipo de tumor Mes puede ser soportado por las acciones de niveles incrementados de VEGF y/o factores derivados endoteliales . En este aspecto, las terapias que hacen blanco en VEGF o sus receptores pueden demostrar ser benéficas no solo haciendo blanco en neovasculatura , sino también inhibiendo en forma directa el crecimiento de células de tumor que manifiestan una biología tipo célula madre neural . Una inactivación dirigida de VEGF en el tubo neural recientemente se ha demostrado que produce tanto efectos vasculares y un grado profundo de apoptosis neuronal en el prosencéfalo murino (Raab et al., Thrombosis Haemostasis 91: 595-605 (2004) . Implicaciones terapéuticas Los presentes hallazgos ofrecen varias implicaciones para el desarrollo de terapias efectivas para glioma. Primero, la actual investigación contribuye al consenso creciente de que el tratamiento óptimo de malignidades gliales puede basarse en regímenes de tratamiento dirigidos a distintas categorías moleculares de tumor (Mischel et al., Cáncer Biol . Therapy 2: 242-247 (2003) ; Newton, Expert Rev. Antican. Ther. 4: 105-128 (2004) ; Rao et al., Frontier Biosci. 8: e270-280 (2003). Nuestros hallazgos in vitro sugieren que las firmas moleculares que definimos pueden pronosticar respuestas a agentes que hacen blanco en rutas de señalización específicas. En segundo, nuestros hallazgos soportan el valor de hacer blanco tanto a rutas Akt como Notch, en el desarrollo de novedosos regiones terapéuticos para glioma de alto grado. En tercero, la sugerencia de que recurrencia del tumor después de terapias estándar puede estar acompañada por un desplazamiento fenotípico en un estado mesenquimal, angiogénico, resalta el valor de hacer blanco a este estado fenotípico agresivo incluso en tumores con un fenotipo menos agresivo. Finalmente, correlaciones entre biología de células madre y fenotipos de glioma más agresivos sugiere que una mayor comprensión de la neurogénesis del esencéfalo puede llevar a novedosos conocimientos para intervención terapéutica en malignidades gliales. A. Anticuerpos Anti-GDM En una modalidad, la presente invención proporciona el uso de anticuerpos anti-GDM que puede encontrar utilidad aquí como agentes terapéuticos de diagnóstico y/o pronostico para determinar la severidad de y/o pronóstico del curso de la enfermedad de glioma. Anticuerpos ejemplares que pueden emplearse para estos propósitos incluyen anticuerpos policlonales , monoclonales , humanizados, biespecífieos y heteroconjugados . 1. Anticuerpos Policlonales Anticuerpos policlonales de preferencia se desarrollan en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil el conjugar el antígeno relevante (en especial cuando se emplean péptidos sintéticos) a una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar. Por ejemplo, el antígeno puede ser conjugado a hemocianina de erizo de mar (KLH= keyhole limpet hemocyanin) albúmina de suero, tiroglobulina bobina, o inhibidor de tripsina de soya, utilizando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo maleimidobenzoil sulfosiccinimida éster (conjugación a través de residduos cisteína) , N-hydroxysuccinimide (a través de residuos lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados al combinar por ejemplo 100 /g o 5 xg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con tres volúmenes de adyuvante completo de Freund's, e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en el adyuvante completo de Freund ' s por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después, los animales son sangrados y el suero se ensaya para titular anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta que el título alcanza una meseta. Los conjugados también pueden elaborarse en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También, agentes de agregación tales como alumbre son utilizados en forma conveniente para mejorar la inmunorespuesta . 2. Anticuerpos Monoclonales Pueden elaborarse anticuerpos monoclonales utilizando el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden elaborarse por métodos de ADN recombinante (patente de los E.U.A. número 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal anfitrión apropiado tal como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente para producir linfocitos que generan o son capaces de producir anticuerpos que ligan específicamente a la proteína usada para inmunización. En forma alterna, pueden inmunizarse linfocitos in vitro. Después de inmunización, los linfocitos se aislan y después fusionan con una línea de células de mieloma utilizando un agente de fusión conveniente tal como polietilen glicol para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp . 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células de hibridoma así preparadas se siembran y desarrollan en un medio de cultivo conveniente, este medio de preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma precursoras no fusionadas (también referidas como socio de fusión) . Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo selectivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) que estas substancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Células de mieloma socio de fusión preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo selectas, y son sensibles a medio selectivo que elige contra las células precursoras sin fusión. Líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y PC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y SP-2 y derivados, por ejemplo células X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); and Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Medio de cultivo en donde células de hibridoma se desarrollan se ensaya para producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. De preferencia, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producida por células de hibridoma, se determina por inmunoprecipitación o por un proceso de enlace in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunosorbente enlazado para enzima (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede por ejemplo determinarse por el análisis Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem. , 107:220 (1980) . Una vez que las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, se identifican, los ciónos pueden ser subclonados por procedimientos de dilución limitante y desarrollan por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)) . Medio de cultivo conveniente para este propósito incluye por ejemplo medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como tumores de ascitos en un animal, por ejemplo por inyección i.p. de las células en el ratón. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclonos se ceparan convenientemente del medio de cultivo, fluido de ascitos o suero por procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como por ejemplo cromatografía de afinidad (por ejemplo utilizando proteína A o proteína G-Sefarosa) o cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de hidroxilapatita , electroforesis en gel, diálisis, etc. ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de ligar específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . Estas células de hibridoma sirven como una fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión que después se transectan en células anfitrionas tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra forma no producen proteina de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes . Artículos de revisión en expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) and Plückthun, Immunol. Revs . 130:151-188 (1992). En una modalidad adicional, anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en cCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991), describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos respectivamente utilizando bibliotecas fago.

Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por entremezclado de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas fago muy grandes (Waterhouse et al., Nuc . Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas y alternativas viables a técnicas de hibridoma anticuerpo monoclonal tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales . El ADN que codifica el anticuerpo puede ser modificado para producir polipéptidos de anticuerpo quimérico o de fusión, por ejemplo al sustituir secuencias de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera humana (CH y CL) para las secuencias murinas homologas (patente de los E.U.A. número 4,816,567; y Morrison, et al., Proc . Nati Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o por fusión de la secuencia de codificación de inmunoglobulina con todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . Las secuencias de polipéptido no- inmunoglobulina pueden sustituir los dominios constantes de un anticuerpo, o se substituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo divalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente. 3. Anticuerpos Humano y Humanizados Los anticuerpos anti-GDM útiles en la práctica de la invención además pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o sus fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab 1 , F(ab')2 u otras subsecuencias de enlace de antígeno de anticuerpos) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en donde residuos de una región de determinación de complementaridad (CDR) del recipiente se reemplaza por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tienen las deseadas especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos de marco Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo recipiente ni el CDR importado o las secuencias marco. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables en donde todo substancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todo substancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado en forma óptima también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmiunoglobulina (Fe) típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. O . Struct . Biol . , 2:593-596 (1992)]. Métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácido introducidos en el de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácidos no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización esencialmente puede realizarse siguiendo el método de Winter and co-workers [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], al sustituir CDRs o secuencia CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de los E.U.A. número 4,816,567), en donde substancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha substituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La selección de dominio variables humanos, tanto ligeros y pesados, a utilizarse en la elaboración de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y respuesta HAMA (anticuerpo humano antiratón) cuando el anticuerpo se pretende para uso terapéutico humano. De acuerdo con el así denominado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo roedor se criba contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia de dominio V humano que es la más cercana a la del roedor se identifica y en la región marco humano (FR) dentro de esta se acepta para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol . 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol . , 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región marco particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151 :2623 (1993) ) . Además es importante que anticuerpos se humanicen con retensión de alta afinidad de enlace para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias precursora y humanizada. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares con aquellos con destreza en la técnica. Programas de computadora están disponibles que ilustran y exhiben estructuras de conformación tridimensional probables de secuencias de inmunoglobulina candidatos selectas. Inspección de estas exhibiciones permiten análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia inmunoglobulina candidato, es decir el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidato para ligar a su antígeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias de importación y recipiente de manera tal que la característica del anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada para el o los antígenos objetivo, se logra. En general, los residuos de región hipervariable están involucrados directa y más sustancialmente para influenciar el enlace de antígeno. Diversas formas de un anticuerpo anti-GDM humanizado se contemplan. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo tal como Fab, que opcionalmente se conjuga con uno o más agentes citotóxicos a fin de generar un inmunoconj ugado . De forma alterna, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto tal como un anticuerpo IgGl intacto. Como una alternativa a humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, ante inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal, resulta en inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de conjunto de genes de inmunoglobulina y línea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos ante prueba con antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno . 7:33 (1993); patentes de los E.U.A. Números 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807; y WO 97/17852. En forma alterna, la tecnología de exhibición fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553

[1990]) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, de repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina (V) a partir de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, genes de dominio de anticuerpo V se clonan en cuadro ya sea en un gen de proteína de revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso tal como M13 o fd, y exhiben como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma fago, selecciones con base en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe estás propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La exhibición fago puede realizarse en una variedad de formatos, revisado por ejemplo en por ejemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de gen V pueden utilizarse para exhibición fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislan un conjunto diverso de anticuerpos anti -oxazoloana a partir de una biblioteca combinatoria al azar pequeña de genes V derivados de los vasos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados puede construirse y anticuerpos a un conjunto diverso de antígenos (incluyendo auto antígenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por arks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBQ J. 12:725-734 (1993). Ver también las patentes de los E.U.A. Números 5,565,332 y 5,573,905. Como se discutió anteriormente, anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadas in vitro (ver patentes de los E.U.A. Números 5,567,610 y 5, 229, 275) . 4. Fragmento de anticuerpo En ciertas circunstancias, hay ventajas de utilizar fragmentos de anticuerpo, en vez de anticuerpos enteros. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite una rápida liberación, mientras que retienen especificidad de enlace de antígeno similares de la molécula de longitud íntegra correspondiente y pueden llevar a acceso mejorado a tumores sólidos. Diversas técnicas se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente , estos fragmentos se derivaron mediante digestión protolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)) . Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células anfitrionas recombinantes . Fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv todos pueden expresarse en y secretarse de E. coli, permitiendo de esta manera la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas fago de anticuerpo discutidas anteriormente. En forma alterna, fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse directamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de células anfitrionas recombinante . Fragmento Fab y F(ab')2 con incrementada vida media in vivo que comprende un receptor de recuperación que liga residuos epítope se describe la patente de los E.U.A. Número 5,869,046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes al practicante con destreza. En otras modalidades, el anticuerpo de selección es un fragmento Fv de cadenas sencilla (scFv) . Ver WO 93/16185; patente de los E.U.A. Número 5,571,894; y patente de los E.U.A. Número 5,587,458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que están carentes de regiones constantes; de esta manera son adecuados para reducir enlace no específico durante uso in vivo. Proteínas de fusión sFv pueden construirse para dar por resultado fusión de una proteína efectora en cualquiera del extremo amino o carboxi de un sFv. Ver Antibody Engineering , ed. Borrebaeck, supra . El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de los E.U.A. Número 5,641,870 por ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecífieos o biespecífieos . 5. Anticuerpos biespecífieos Anticuerpos biespecífieos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos epítopes diferentes. Anticuerpos biespecífieos ejemplares pueden ligar antígenos PDM ceparados o a dos epítopes diferentes de un polipéptido GDM particular aquí descrito. Otros de estos anticuerpos pueden combinar el sitio de enlace GDM anterior con un sitio de enlace para otra proteína. En forma alterna, un brazo anti -GDM puede combinarse con un brazo que liga a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula de receptor de células T (por ejemplo CD3 ) , o receptores Fe para IgG (Fc/R), tales como Fc/RI (CD64) , Fc/RII (CD32) y Fc^RIII (CD16) , para enfocar y localizar mecanismos de defensa celulares a la célula que expresa GDM.

Anticuerpos biespecí fieos también pueden emplearse para localizar agentes citotóxicos a células que expresan GDM. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace GDM y un brazo que liga el agente citotóxico (por ejemplo saporina, ant i - interferona- , vinca alcaloide, cadena resina A, metotrexato o isótopos radioactivo hapteno) . Anticuerpos biespecí fieos pueden prepararse como anticuerpos de longitud íntegra o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, F(ab')2 anticuerpos biespecíficos) . O 96/16673 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-Fc RUI biespecífico y la patente de los E.U.A. Número 5,837,234 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-Fc ? RI biespecífico. Un anticuerpo anti-ErbB2/Fca biespecífico se ilustra en WO98/02463. La patente de los E.U.A. Número 5,821,337 ilustra anticuerpo ant i -ErbB2/ant i-CD3 biespecífico . Métodos para producir anticuerpos biespecí fieos se conocen en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecífieos de longitud íntegra se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)) . Debido al surtido al azar de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza por etapas de cromatografía por afinidad, es más bien problemática, y los rendimientos de productos son bajos. Se describen procedimientos similares en O 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J . 10:3655-3659 (1991) . De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antigeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina . De preferencia, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada Ig que comprende al menos parte de la bisagra, regiones CH2 , y CH3. Se prefiere tener que la primer región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión ceparados, y se co-transfectan en una célula anfitriona conveniente. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipéptido en modalidades en donde proporciones diferentes de las tres cadenas polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipéptido en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipéptido en proporciones iguales resulta con alto rendimientos o cuando las proporciones no tienen efecto significante en el rendimiento de la combinación de cadena deseada. En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecífieos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura simétrica facilita la ceparacion del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena inmunoglobulina indeseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo la mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma de ceparacion fácil . Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles en general anticuerpos biespecífieos , ver por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986). De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de los E.U.A. Número 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para llevar al máximo el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivo de células recombinantes . La interfase preferida comprende cuando menos una parte del dominio CH3. En este método, uno o más cadenas laterales de aminoácido pequeño de la interfase de la primer molécula de anticuerpos se reemplazan con más grandes cadenas laterales (por ejemplo tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar de la o las cadenas laterales grandes, son creadas en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar grandes cadenas laterales aminoácido con más pequeñas (por ejemplo alanina o trionina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar rendimiento del heterodímeros sobre otros productos finales indeseados tales como homodímeros . Anticuerpos biespecífieos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con avidina, el otro con biotina. Estos anticuerpos por ejemplo se han propuesto para hacer blanco en células del sistema inmune a células indeseadas (patente de los E.U.A. Número 4,676,980), y para tratamiento de infección HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Anticuerpos heteroconjugados pueden elaborarse utilizando cualesquiera métodos de entrelazamiento convenientes. Agentes de entrelazamiento convenientes son bien conocidos en la técnica y se describen en la patente de los E.U.A. Número 4,676,980, junto con una cantidad de técnicas de entrelazamiento. Técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2- Estos fragmentos se reducen en la presencia de agente complejante ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar ditioles vecinales y evitar formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab ' generados después se convierten a derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab'-TNB después se reconvierte al Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden emplearse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Reciente avance ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que puede acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby et al., J . Exp . Med . 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico totalmente humanizada. Cada fragmento Fab ' se secreta por ceparado de E. coli y somete a acoplamiento químico dirigido in vi tro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de ligar a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como disparar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra blancos de tumor de mama humana . Diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente de cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras leucina. Kostelny et al., Immunol . 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo.

Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alterno para producir fragmentos de anticuerpo biespecífieos . Los fragmentos comprenden un VH conectado con VL por un enlazador que es muy corto para permitir apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparear con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, de esta manera formando dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecífieos por el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv) también se ha reportado. Ver, Gruber et al., J. Immunol . , 152:5368 (1994). Anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo anticuerpos triespecífieos pueden prepararse. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). 6. Anticuerpos heteroconj ugados Anticuerpos heterocon ugados también están dentro del alcance de la presente invención. Anticuerpos heteroconj ugados están compuestos por dos anticuerpos unidos en forma covalente. Estos anticuerpos por ejemplo se han propuesto en hacer blancos a células de sistema inmune con células indeseadas [patente de los E.U.A.

Número 4,676,980], y para el tratamiento de infección HIV [ O 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vi tro utilizando métodos conocidos en química de proteína sintética, incluyendo aquellos que involucran agentes de entrelazamiento. Por ejemplo, inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio disulfuro o al formar un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos convenientes para este propósito incluyen iminotiolato y metil -4 -mercaptobutirimidato y aquellos descritos por ejemplo en la patente de los E.U.A. Número 4 , 676, 980. 7. Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno a la cual liga los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes a la clase IgM) con tres o más sitios de enlace de antígeno (por ejemplo anticuerpos tetravalentes) , que pueden producirse fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de enlace de antígeno amino-terminales a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido aquí comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero de preferencia cuatro sitios de enlace de antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipéptido (y de preferencia dos cadenas polipéptido) , en donde la o las cadenas polipéptido comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender VD1- (XI) n-VD2 - (X2 ) n-Fc , en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un amino ácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender: región de cadena VH-CHl -enlazador flexible -VH-CHl -Fe ; o región de cadena VH-CHl - o VH-CHl -Fe. El anticuerpo multivalente aquí de preferencia además comprende al menos dos (y de preferencia cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente aquí, puede por ejemplo, comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera, y opcionalmente , además comprenden un dominio CL. 8. Ingeniería de Función Efectora Puede ser conveniente el modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, para mejorar la citotoxicidad mediada por célula dependiente de antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse al introducir una o más substituciones amino ácido en una región Fe del anticuerpo. En forma alterna o adicional, puede o pueden introducirse residuos cisteína en la región Fe, de esta manera permitiendo formación de enlace disulfuro inter-cadena en esta región. El anticuerpo homodimérico de esta manera generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o exterminio celular mediado por complemento incrementado y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Ver Carón et al., Exp Med. 176:1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992). Anticuerpos homodiméricos con actividad anti -tumor mejorada pueden también prepararse utilizando entrelazadores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993) . En forma alterna, un anticuerpo puede diseñarse que tenga regiones Fe duales y de esta manera tiene capacidades de lisis de complemento mejorada y ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) . Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítope de enlace de receptor de recuperación en el anticuerpo (en especial un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente de los E.U.A. de los E.U.A. 5,739,277, por ejemplo. Como se emplea aquí, el término "epítope de enlace de receptor de recuperación" se refiere a un epítope de la región Fe de una molécula IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable por incrementar la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG. 9. Inmunoconj ugados La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, o sus fragmentos) , o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado) . a . Agentes quimioterapéuticos Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de estos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden ser empleadas incluyen cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina , fenomicina, enomicina, y tricotenos. Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re . Conjugados del anticuerpo y agente citotoxico se elaboran utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2 -piridilditiol ) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutareldehido) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexandiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolieno 2 , 6 -diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5 -difluoro-2 , 4 -dinitrobenzeno) .

Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science , 238 : 1098 (1987) . Ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilen riaminapenta-acético etiquetado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionucleotido al anticuerpo. Ver WO94/11026. Conjugados del anticuerpo y uno o más toxinas de molécula pequeña, tales como calicheamicina , maytansinoides , un tricoteno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan aquí . b . Maytansina y maytansinoides En una modalidad preferida, un anticuerpo anti-GDM (longitud completa o fragmentos) de la invención se conjuga con una o más moléculas de maytansinoide. Los maytansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan al inhibir la polimerización de tubulina.

Maytansina primero se aisló del arbusto Africano oriental Maytenus serrata (patente de los E.U.A. No. 3,896,111).

Subsecuentemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maytansinoides, tales como maytansinol y C-3 maytansinol ásteres (patente de los E.U.A. No. 4,151,042). Maytansinol sintético y derivados y análogos de los mismos se describen por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533, las descripciones de las cuales aquí se incorporan expresamente por referencia . En un intento por mejorar su índice terapéutico, maytansina y maytansinoides se han conjugado con anticuerpos que ligan específicamente a antígenos de célul de tumor. Inmunoconjugados que contienen maytansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,208,020, 5,416,064 y la patente Europea EP 0 425 235 Bl, las descripciones de las cuales aquí se incorporan expresamente por referencia. Liu et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describe inmunoconj ugados que comprenden un maytansinoide designado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorectal humano. El conjugado se encuentra que es altamente citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivadas, y muestra actividad antitumor en un ensayo de crecimiento de tumor in vivo. Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe inmunoconj ugados en donde se conjugó un maytansinoide mediante un enlazador disulfuro al anticuerpo murino A7 que liga a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que liga al oncógeno HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado maytansonoide-TA.1 se probó in vi tro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 HER-2 antígenos de superficie por célula. El conjugado de droga logró un grado de citotoxicidad similar a la droga libre de maytansonide , que puede aumentarse al incrementar el número de moléculas de maytansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maytansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones. Maytansinoide-anticuerpo anti-GDM o conjugados de maytansinoide-fragmento de anticuerpo que enlaza GDM pueden prepararse por enlace químico de un anticuerpo anti-GDM o fragmento de anticuerpo de enlace GDM a una molécula maytansinoide sin disminución significante de la actividad biológica de cualquiera del anticuerpo o la molécula de maytansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas de maytansinoide conjugadas por moléculas de anticuerpo ha mostrado eficacia para mejorar la citotoxicidad de células objetivo sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso una molécula de toxina/anticuerpo se esperaría que mejore la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpo desnudo. Maytansinoides son bien conocidos en la técnica y pueden ser sintetizados por técnicas conocidas o aislados de fuentes naturales. Maytansinoides convenientes se describen por ejemplo, en la patente de los E.U.A. No. 5,208,020 y en las otras patentes y publicaciones que no son de patente referidas previamente. Maytansinoides preferidos son maytansinol y análogos de maytansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maytansinol, tales como diversos ésteres de maytansinol . Hay muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para producir conjugados de maytansinoide fragmento de anticuerpo o -anticuerpo incluyendo por ejemplo, aquellos descritos en la patente de los E.U.A. No. 5,208,020 o en la patente EP 0 425 235 Bl , y Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992). Los grupos de enlace incluyen grupos disufuro, grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábiles, grupos de peptidasa lábil, o grupos de esterasa lábil, como se describen en las patentes anteriormente identificadas, se prefieren grupos disulfuro y tioéter. Conjugados del anticuerpo o fragmento de anticuerpo y maytansinoide pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2 -piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil -4 - (N-maleimidometil ) ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehido) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenzeno) . Agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737

[1978]) y N-succinimidil -4 - (2 -piridiltio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro . El enlazador puede conectarse a la molécula de maytansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace éster puede formarse por reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidoximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maytansinol o un análogo de maytansinol. c . Calicheamicina Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo anti-GD o fragmento de anticuerpo de enlace GDM conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. La familia de calicheamicina de antibióticos es capaz de producir ruptura de ADN de doble hebra en concentraciones sub-picomolar . Para la preparación de conjugados de la familia calicheamicina, ver patentes de los E.U.A. Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas a American Cyanamid Company) . Análogos estructurales de calicheamicina que pueden emplearse incluyen pero no están limitados a, ? , , cc^, N-acetil - / 11 , PSAG y ?t? (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993) , Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de los E.U.A. anteriormente mencionadas otorgadas a American Cyanamid) . Otra droga anti -tumor con la que puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tango calicheamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la absorción celular de estos agentes a través de internalización mediada por anticuerpo mejora enormemente su efectos citotóxico. d . Otros agentes citotóxico Otros agentes antitumor que pueden conjugarse con los anticuerpos anti-GD de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5 - fluorouracil , la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,053,394, 5,770,710, así como esperamicinas (patente de los E.U.A. No. 5,877,296). Toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden emplearse incluyen cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina , fenomicina, enomicina y los tricotenos. Ver, por ejemplo WO 93/21232 publicado en octubre 28, 1993. La presente invención además contempla un inmunoconj ugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como deoxiribonucleasa ; DNasa) . Para destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos anti-GDM radioconjugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se emplea para diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo para estudios de escintigráficos , por ejemplo tc99m o I123, o una etiqueta de espín para formación de imagen por resonancia magnética nuclear (NMR = nuclear magnetic resonance) (también conocido como formación de imagen por resonancia magnética (MRI = magnetic resonance imaging) , tales como yodo-123, yodo- 131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno- 15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Las radio- u otras etiquetas pueden incorporarse en el conjugado en formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por síntesis de aminos química utilizando precursores de amino ácidos convenientes que involucran por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Etiquetas tales como tc99m o I123, .Re186, Re188 y In111 pueden conectarse mediante un residuo de cisteína en el péptido. Itrio-90 puede conectarse mediante un residuo lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys . Res. Commun. 80: 49-57 puede emplearse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle. Conjugado del anticuerpo y agente citotóxico pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2 -piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil -4 - (N-maleimidometil ) ciclohexano- 1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como derivados bis-diazonio (p-azidobenzoil ) hexandiamina) , diisocianatos (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , (tales como tolien 2,6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenzeno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil -3 -metildietilen triaminapentaacético etiquetado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugar radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilitan la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, un enlazador ácido lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); patente de los E.U.A. No. 5,208,020) puede emplearse . En forma alterna, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-GDM o fragmento de anticuerpo de enlace GD y agente citotóxico pueden elaborarse, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptido. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado ya sea adyacentes entre sí o ceparadas por una región que codifica un enlazador péptido que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. Todavía en otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilizar en pre-blanco del tumor, en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por remoción de conjugado no ligado de la circulación utilizando un agente de liberación y después administrar un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) . 10. Inmuno1iposornas Los anticuerpos anti-GDM o fragmento de anticuerpo de enlace GDM aquí descritos pueden también formularse como inmunoliposomas . Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta por diversos tipos de lipidos, fosfolípidos y/o surfactante que es útil para suministro de una droga a un mamífero. Los componentes de liposoma se disponen comúnmente en una formación bicapa, similar al arreglo de lipidos de membranas biológicas. Liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la especialidad, tal como se describe en Epstein et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); patente de los E.U.A. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y 097/38731 publicada en octubre 23, 1997. Liposomas con tiempo de circulación mejorado se describe en la patente de los E.U.A. No. 5,013,556. Liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina , colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros con tamaño de poros definido para dar por resultado liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos Fab ' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe por Martin et al., J. Biol . Chem. 257:286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio disulfuro. Un agente quimioterapéutico está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. Nacional Cáncer Inst . 81 (19) : 1484 (1989) . B . Oligopéptidos de Enlace GDM Oligopéptidos de enlace GDM de la presente invención son oligopéptidos que ligan, de preferencia específicamente, a un polipéptido GDM como se describe aquí. Oligopéptidos de enlace GDM pueden sintetizarse químicamente utilizando metodología de síntesis de oligopéptido conocida o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante . Oligopéptidos de enlace GDM usualmente son de al menos aproximadamente 5 amino ácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 amino ácidos de longitud o más, en donde estos oligopéptidos que son capaces de ligar, de preferencia específicamente, a un polipéptido GDM como se describe aquí. Oligopéptidos de enlace GDM pueden identificarse sin indebida experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para cribar bibliotecas oligopéptido para oligopéptidos que son capaces de ligar específicamente a un objetivo polipéptido son bien conocidas en la especialidad (ver, por ejemplo, patente de los E.U.A. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicaciones del PCT Nos. WO 84/03506 y O84/03564; Geysen et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol . Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J . Immunol . , 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363, and Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668). En este aspecto, la exhibición de bacteriófago (fago) es una técnica bien conocida que permite cribar grandes bibliotecas de oligopéptidos para identificar uno o varios miembros de estas bibliotecas que son capaces de ligar específicamente a un objetivo polipéptido. La exhibición fago es una técnica por la cual se exhiben polipéptidos variantes como proteínas de fusión a la proteína de revestimiento en la superficie de partículas de bacteriófago (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386) . La utilidad de la exhibición fago se encuentra en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas al azar selectivamente (o ADNcs clonados al azar) pueden ser clasificadas en forma rápida y eficiente por aquellas secuencias que ligan a una molécula objetivo con alta afinidad. Exhibición de péptido (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378) o de proteína (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; arks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363) en fago se han empleado para criba millones de polipéptidos u oligopéptidos por aquellos con propiedades de enlace específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668). La clasificación de bibliotecas fago de imitantes al azar requiere una estrategia para construir y propagar una gran cantidad de variantes, un procedimiento para purificación de afinidad utilizando el receptor objetivo, y medios para evaluar los resultados de los enriquecimientos de enlace. Patente de los E.U.A. Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, y 5,663,143. Aunque la mayoría de los métodos de exhibición fago han utilizado fago filamentoso, sistemas de exhibición fago lambdoide (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), sistemas de exhibición fago T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research, 58(15): 3209-3214 (1998) ; Jiang et al., Infección & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2) :303-311 (1997); Ren, Protein Sci . , 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de exhibición fago T7 (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5,766,905) también se conocen. Muchas otras mejoras y variaciones del concepto de exhibición fago básico ahora se han desarrollado. Estas mejoras aumentan la capacidad de sistemas de exhibición para cribar bibliotecas péptido para ligar a moléculas objetivo selectas y exhibir proteínas funcionales con el potencial de cribar estas proteínas por propiedades deseadas. Dispositivos de reacción combinatoria para reacciones de exhibición fago se han desarrollado (WO 98/14277) y bibliotecas de exhibición fago se han empleado para analizar y controlar interacciones bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales restringidos (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en donde una biblioteca de exhibición fago se pone en contacto con una solución en donde el ligando ligará a una molécula objetivo y una segunda solución en donde el ligando de afinidad no ligará a la molécula objetivo, para aislar selectivamente ligandos de enlace. WO 97/46251 describe un método de bio-selección por ciclos de adsorción-desorción, de una biblioteca de exhibición fago al azar, con un anticuerpo purificado por afinidad y después aislar el fago de enlace, seguido por un proceso de micro- selección por ciclos de adsorción-desorción utilizando pozos de microplacas para aislar el fago de enlace de alta afinidad. El uso de proteína A de Staphlylococcus aureus como una etiqueta de afinidad también se ha reportado (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de substracción de substrato para distinguir especificidades de enzima utilizando una biblioteca combinatoria que puede ser una biblioteca de exhibición fago. Un método para seleccionar enzimas adecuados para utilizar en detergentes utilizando exhibición fago se describe en WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de enlace específico se describe en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,498,538, 5,432,018, y WO 98/15833.

Métodos para generar bibliotecas péptido y cribar estas bibliotecas también se describen en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, y 5,723,323. C . Antagonistas de Molécula Pequeña GDM Antagonistas de molécula pequeña GDM son moléculas pequeñas diferentes a oligopéptidos o anticuerpos (o sus fragmentos) como se define aquí, que ligan, de preferencia específicamente, a un componente de señalización (por ejemplo, receptor, ligando, componente intacelular, etc.) de un polipéptido GDM como se describe aquí. Estas moléculas orgánicas pueden identificarse y sintetizarse químicamente utilizando metodología conocida (ver, por ejemplo, las Publicaciones del PCT Nos. O00/00823 y WO00/39585) . Estas moléculas orgánicas usualmente son menos de aproximadamente 2000 daltons en tamaño, en forma alterna menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltons en tamaño, en donde dichas moléculas orgánicas que son capaces de ligar de preferencia específicamente, a un polipéptido GDM como se describe aquí, pueden identificarse sin indebida experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para cribar bibliotecas de moléculas orgánicas por moléculas que son capaces de ligar a un objetivo polipéptido, son bien conocidas en la especialidad (ver, por ejemplo, las Publicaciones de PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Antagonistas de molécula GDM pueden por ejemplo ser aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas , carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-substituidas , hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílieos , ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, aril haluros, aril sulfonatos, alquil haluros, alquil sulfonatos, compuestos aromáticos, compuestos heterociclicos , anilinas, alquenos, alquinos, dioles, amino alcoholes, oxazolidinas , oxazolinas, tiazolidinas , tiazolinas, enaminas, sulfonamidas , epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruro de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros de ácido, o semejantes. D . Cribado por Antagonistas GDM Técnicas para generar los anticuerpos, polipéptidos , oligopéptidos y moléculas orgánicas de la invención se han descrito anteriormente. Además se pueden seleccionar anticuerpos (y sus fragmentos de enlace de antígeno) , oligopéptidos u otras moléculas orgánicas con ciertas características biológicas, según se desee.

Los efectos inhibitorios de crecimiento de los diversos antagonistas GDM útiles en la invención pueden estimarse por métodos conocidos en la especialidad, por ejemplo, utilizando células de glioma que expresan un polipéptido GDM ya sea en forma endógena o después de transfección con el gen GDM. Por ejemplo, líneas celulares de tumor apropiadas y células transfectadas con GDM-codifican nucleico pueden tratarse con antagonistas GDM de la invención a diversas concentraciones por unos cuantos días (por ejemplo 2-7) días y teñirse con violeta cristal o MTT o analizarse por algún otro ensayo colorimétrico . Otro método para medir proliferación sería al comparar la adsorción 3H-timidina por las células tratadas en la presencia o ausencia de estos antagonistas GDM. Después de tratamiento, las células se cosechan y la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN cuantifica en un contador de destelleo. Controles positivos apropiados incluyen tratamiento de una línea celular selecta con un anticuerpo inhibidor de crecimiento conocido que inhibe el crecimiento de esa línea celular. La inhibición de crecimiento de células de tumor in vivo puede determinarse en diversas formas conocidas en la especialidad. De preferencia, la célula de tumor es aquella que sobre-expresa un polipéptido GDM. De preferencia, estos antagonistas GDM inhibirán la proliferación celular de una célula de tumor que expresa GDM in vi tro o in vivo en aproximadamente 25-100% en comparación con la célula de tumor sin tratar, más preferiblemente en aproximadamente 30-100%, y aún más preferiblemente en aproximadamente 50-100% o 70-100%, en una modalidad, a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µ9/t?1. La inhibición de crecimiento puede medirse a una concentración de antagonista GDM de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en cultivo celular, en donde se determina la inhibición de crecimiento 1-10 días después de exposición de las células de tumor al anticuerpo. El anticuerpo es inhibitorio de crecimiento in vivo si la administración de antagonista y/o agonista a aproximadamente 1 g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal resulta en reducción en tamaño de tumor o reducción en proliferación de células de tumor dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primer administración del anticuerpo, de preferencia dentro de aproximadamente 5 a 30 días. Para seleccionar los antagonistas GDM que inducen muerte celular, pérdida de integridad de membrana como se indica, por ejemplo, por yoduro de propidio (PI), azul triptano o adsorción de 7AAD pueden estimarse respecto al control . Un ensayo de adsorción PI puede realizarse en la ausencia de complemento y células efectoras inmune. Células de tumor que expresan polipeptido GDM se incuban con medio solo o medio que contiene el antagonista GDM apropiado. Las células se incuban por un periodo de tiempo de 3 días. Después de cada tratamiento, las células se lavan y se toman alícuotas en tubos de 12 x 75 tapados con colador, de 35 mm (1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para retirar grumos celulares. Tubos reciben entonces PI (10 µg/ml) . Muestras pueden analizarse utilizando citómetro de flujo FACSCA 7 y el soporte lógico FACSC0NVERT7 CellQuest (Becton Dickinson) . Estos antagonistas GDM que inducen niveles estadísticamente significantes de muerte celular como se determinan por adsorción de PI pueden entonces seleccionarse. Para cribar antagonistas GDM que ligan a un epítope en un polipeptido GDM ligado por un anticuerpo de interés, un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como se describe en Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988), puede realizarse. Este ensayo puede utilizarse para determinar si un anticuerpo de prueba, oligopéptido u otra molécula orgánica liga al mismo sitio o epítope que un anticuerpo anti-GDM conocido. En forma alterna o adicional, la cartografía de epítope puede realizarse por métodos conocidos en la especialidad. Por ejemplo, la secuencia de anticuerpo puede mutagenizarse tal como por exploración de alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante inicialmente se prueba para enlace con anticuerpo policlonal para asegurar ligado adecuado. En un método diferente, péptidos que corresponden a diferentes regiones de un polipéptido GDM pueden utilizarse en ensayos de competencia con anticuerpos de prueba o con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo con un epítope caracterizado o conocido. E . Terapia de Prodroga Mediada por Enzima Dependiente de Anticuerpo (ADEPT = Antibody Dependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy) Los anticuerpos antagonistas GDM de la presente invención también pueden utilizarse en ADEPT por conjugación del anticuerpo con una enzima de activación de prodroga que convierte una prodroga (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, ver WO81/01145) a una droga anti-cáncer activa. Ver, por ejemplo, WO 88/07378 y la patente de los E.U.A. No. 4,975,278. El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en una prodroga de manera tal que para convertirla en su forma más activa, citotóxica. Enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir prodrogas que contienen fosfato en drogas libres; arilsulfatasa útil para convertir prodrogas que contienen sulfato en drogas libres; citosina deaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en la droga anti-cáncer, 5-fluorouracilo ; proteasas, tales como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir prodrogas que contienen péptido en drogas libres; D-alanilcarboxipeptidasas , útiles para convertir prodrogas que contienen sustituyentes D-amino ácido; enzimas que escinden carbohidrato tales como ß-galactosidasa y neuroamidinasa útiles para convertir prodrogas glicosiladas en drogas libres; ß-lactamasa útil para convertir drogas derivatizadas con ß-lactamas en drogas libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir drogas derivatizadas en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente en drogas libres. En forma alterna, anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la especialidad como "aczimeas", pueden utilizarse para convertir las prodrogas de la invención en las formas activas libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328:457- 458 (1987) ) . Conjugados de anticuerpo aczima pueden prepararse como se describe aquí para suministro de la aczima a una población de células de tumor. Las enzimas de esta invención pueden ligarse covalentemente a los anticuerpos anti-GDM por técnicas bien conocidas en la especialidad tales como el uso de reactivos de entrelazamiento heterobifuncionales discutidos anteriormente. En forma alterna, proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace de antígeno de un anticuerpo de la invención enlazado al menos una porción funcionalmente activa de la enzima de la invención, pueden construirse utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la especialidad (ver, e.g., Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984). F . Variantes Polipéptidos GDM Además de los polipéptidos GDM aquí descritos, se contempla que variantes de estas moléculas pueden prepararse para utilizar con la presente invención. Estas variantes pueden prepararse al introducir cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de codificación, y/o por síntesis del anticuerpo o polipéptido deseado. Aquellos con destreza en la técnica apreciarán que cambios de amino ácidos pueden alterar procesos de post-traducción de estas moléculas, tales como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje de membrana. Variaciones en secuencia de amino ácido pueden realizarse, por ejemplo utilizando cualquiera de las técnicas y guías para mutaciones concebadoras y no concebadoras establecidas, por ejemplo en la patente de los E.U.A. No. 5,364,934. Variaciones pueden ser una substitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican la secuencia amino ácidos que resulta en un cambio en la secuencia amino ácido en comparación con la secuencia nativa. Opcionalmente , la variación es por substitución de al menos un amino ácido con cualquier otro amino ácido en uno o más de los dominios de la secuencia amino ácidos de interés. La guía para determinar que residuo amino ácido puede insertarse, substituirse o eliminarse sin afectar adversamente la actividad deseada, puede encontrarse al comparar la secuencia de la secuencia de amino ácido de interés con moléculas de proteínas conocidas homologas y reducir al mínimo el número de cambios de secuencia de amino ácidos realizados en regiones de alta homología. Substituciones de amino ácidos pueden ser el resultado de reemplazar un amino ácido con otro amino ácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos de amino ácidos concebadores. Inserciones o deleciones pueden opcionalmente estar en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 amino ácidos. La variación permitida puede determinarse por realizar sistemáticamente insercciones , deleciones o substituciones de amino ácidos en la secuencia y probar las variantes resultantes por actividad exhibida por la secuencia nativa de longitud íntegra o madura. Fragmentos de los diversos polipéptidos PDM se proporcionan aquí . Estos fragmentos pueden ser truncados en el extremo N o extremo C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo cuando se comparan con proteína o anticuerpo nativo de longitud íntegra. Estos fragmentos que carecen de residuos amino ácido que no son esenciales para actividad biológica deseada también son útiles con los métodos descritos. Los fragmentos polipéptido anteriores pueden prepararse por cualquiera de una cantidad de técnicas convencionales. Fragmentos péptidos deseados pueden ser sintetizados químicamente. Un enfoque alterno involucra generar estos fragmentos por digestión enzimática, por ejemplo, al tratar la proteína con una enzima conocida que escinda proteínas en sitios definidos por residuos amino ácido particulares, o al digerir el ADN con enzimas de restricción convenientes y aislar el fragmento deseado. Todavía otra técnica conveniente involucra aislar y amplificar un fragmento ADN que codifica el fragmento deseado por reacción de cadena polimerasa (PCR) . Oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se emplean en los cebadores 5' y 3' en PCR. De preferencia, estos fragmentos comparten cuando menos una actividad biológica y/o inmunológica con la molécula de longitud integra correspondiente . En modalidades particulares, substituciones concebadoras de interés se ilustran en la Tabla 6 bajo el encabezado de substituciones preferidas. Si estas substituciones resultan en in cambio en actividad biológica, entonces más cambios substanciales, denominados substituciones ejemplares en la Tabla 6, o como se describe adicionalmente a continuación con referencia a clases de amino ácido, se introduce y los productos se criban en a fin de identificar la variante deseada . Tabla 6 Residuo Substituciones Substituciones Original Ejemplares Preferidas Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg (R) Lys ; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp; Lys ; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu C) Ser, Ala Ser Q) Asn; Glu Asn E) Asp, Gln Asp G) Pro; Ala Ala H) Asn; Gln; Lys ; Arg Arg I) Leu; Val; Met; Ala; Phe ; Lúe Norleucina L) Norleucina; lie; Val; lie Met; Ala; Phe; K) Arg; Gln; Asn Arg M) Leu; Phe; lie Lúe F) Trp; Leu; Val; lie; Lúe Ala; Tyr; P) Ala Ala S) Thr Thr T) Val; Ser Ser W) Tyr; Phe Tyr Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe V) lie; Leu; Met; Phe; Lúe Ala; Norleucina Modificaciones substanciales en función de la identidad inmunologica de los polipéptidos GDM se logran al seleccionar substituciones que difieren significativamente en su efecto al mantener (a) la estructura principal del polipéptido en el área de la substitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Residuos de origen natural se dividen en grupos con base en propiedades de cadena lateral comunes : (1) hidrofobicidad : Norleucina Met; Ala; Val, Leu, lie; (2) hidrofobicidad neutra: Cys, Ser, Thr; Asn; Gln (3) acidico: Asp; Glu; (4) básico: Lys; Arg; His; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; y (6) aromático: Tyr, Tyr, Phe . Substituciones no concebadoras involucraran intercambio de miembro de una de estas clases por otra clase. Estos residuos substituidos también pueden introducirse en los sitios de substitución concebadora o más preferiblemente en los sitios restantes (no conservados) . Las variaciones pueden realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótido (dirigida por sito) , exploración de alanina, y mutagénesis PCR. La mutagénesis dirigida por sitio [Cárter et al., Nucí . Acids Res . , 13_:4331 (1986); Zoller et al., Nucí. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene , 3_4:315 (1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans . R. Soc . London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden realizarse en ADN clonado para producir la molécula anti-GDM. Análisis de exploración de amino ácidos también puede emplearse para identificar uno o más amino ácidos sobre una secuencia contigua. Entre los amino ácidos de exploración preferidos están amino ácidos neutros relativamente pequeños. Estos amino ácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteina. Alanina típicamente es un amino ácido de exploración preferido entre este grupo, debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. Alanina también típicamente se prefiere debido a que es el amino ácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones enterradas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol . , 150 : 1 (1976)]. Si la substitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede emplearse un amino ácido isotérico. Cualquier residuo cisteina no involucrado en mantener la conformación adecuada de los polipéptidos GDM también puede ser substituido, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrelazamiento aberrante. Por el contrario, el o los enlaces cisterna pueden agregarse a esta molécula para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo particularmente preferido de variante de substitución involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para mayor desarrollo tendrán propiedades biológicas mejoradas respecto al anticuerpo precursor del cual se generan. Una forma conveniente para generar dichas variantes de substitución involucra abrasión de afinidad utilizando exhibición fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, los 6 a 7 sitos) son mutados para generar todas las substituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se exhiben en una forma monovalente de partículas fago filamentosas como fusiones al producto gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes de exhibición fago después de criban por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace) como se describe aquí. A fin de identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, puede realizarse mutagénesis de exploración alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyan significativamente a enlace de antígeno. En forma alterna o adicionalmente , puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y polipéptido objetivo. Estos residuos de contacto y residuo vecino son candidatos para substitución de acuerdo con las técnicas aquí elaboradas. Una vez que estas variantes se generan, el panel de variante se somete a cribado como se describe aquí y anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para mayor desarrollo . Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia amino ácido de polipéptidos GDM se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia amino ácido de origen natural) o preparación de mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida de sito) , mutagénesis PCR y mutagénesis de cassette de una secuencia nativa o una variante previamente preparada. G . Modificaciones de polipéptidos GDM El GDM que ha sido modificado covalentemente también puede ser conveniente para utilizar dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye reaccionar residuos de amino ácido dirigidos de estos anticuerpos y polipéptidos con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales selectas o los residuos N- o C- de estos anticuerpos y polipéptidos. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrelazar las moléculas precedentes a una matriz de soporte insoluble en agua o superficie para utilizar en purificación. Agentes de entrelazamiento comúnmente empleados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehido, N-hidroxisucinimida esteres, por ejemplo, esteres con ácido 4-azidosalicilico, imidoesteres homobifunctional , incluyendo disuccinimidil esteres tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido- 1 , 8 -octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil ) ditio] ropioimidato . Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo a los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, metilación de grupos a-amino de cadenas laterales lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co . , San Francisco, p . 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal . Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos GDM comprende alterar el patrón de glicosilacion nativo del anticuerpo o polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilacion nativo" se pretende para los presentes propósitos que significa eliminar una o más porciones carbohidrato que se encuentran en secuencia nativa (ya sea al retirar el sitio de glicosilacion subyacente o al eliminar la glicosilacion por medios químicos y/o enzimáticos) , y/o agregar uno o más sitios de glicosilacion que no están presentes en la secuencia nativa respectiva. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilacion de las proteínas nativas, que involucran un cambio en la naturaleza y proporciones de las diversas porciones carbohidrato presentes . Glicosilacion de anticuerpos y otros polipéptidos típicamente esta N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la conexión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina , en donde X es cualquier amino ácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para conexión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación O-enlazada se refiera a la conexión de uno de los azucares N-aceilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiamino ácido, más comúnmente serina o treonina, aunque 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina también pueden emplearse . La adición de sitios de glicosilación puede lograrse al alterar la secuencia de amino ácidos de manera tal que contiene una o más de las secuencias tripéptido anteriormente descritos (para sitios de glicosilación N-enlazados) . La alteración también puede realizarse por la adición de, o substitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del original anticuerpo o polpéptido (para sitios de glicosilación O-enlazados) . Esta secuencia de anticuerpo o polipéptido puede opcionalmente alterarse a través de cambios a nivel ADN, particularmente al mutar el ADN que codifican las secuencias de amino ácido precedentes en bases preselectas de manera tal que se generan codones que se traducirán en los amino ácidos deseados. Otro medio para incrementar el número de porciones carbohidrato es por acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Estos métodos se describen en la especialidad, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 septiembre 1987, y en abril y Wriston, CRC Crit . Rev. Biochem. , pp . 259-306 (1981) . La remoción de porciones carbohidrato puede lograrse en forma química o enzimática o por substitución mutacional de codones que codifican residuos amino ácido que sirven como objetivos para glicosilación . Técnicas de desglicosilacion química se conocen en la especialidad y describen, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Arch . Biochem. Biophys . , 259:52 (1987) and by Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Escisión enzimática de porciones carbohidrato en polipéptidos puede lograrse por el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe en Thotakura et al., eth . Enzymol . , 138 : 350 (1987) . Otro tipo de modificación covalente comprende enlazar con uno de una variedad de polímeros no proteináceos , por ejemplo, polietilen glicol (PEG) , polipropilen glicol o polioxialquilenos , en la forma establecida en las Patentes de los E.U.A. números 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. Los polipeptidos GDM también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina y microcapsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente) , en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocapsules) , o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980). Modificaciones que forman moléculas quiméricas resultan de fusiones de polipéptidos GDM a otro polipéptido heterólogos o secuencia de amino ácidos se contemplan para utilizar con los presentes métodos. En una modalidad, tal molécula quimérica comprende una fusión de los polipéptidos GDM con un polipéptido de etiqueta que proporciona un epítope al cual puede ligar selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta epítope generalmente se coloca en el extremo amino- o carboxilo- de este anticuerpo o polipeptido. La presencia de estas formas etiquetadas con epítope de dichos anticuerpos o polipéptidos pueden detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. También, el proporcionar la etiqueta epítope permite a estos anticuerpos o polipéptido que se purifican fácilmente por purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti -etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que liga a la etiqueta epítope. Diversos polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen etiquetas poli -histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli -his-gli ) ; el polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol . , 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4 , B7 y 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de glicoproteina D (gD) de virus Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido-Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el epítope péptido catéteres KT3 [Martin et al., Science, 255 : 192-194 (1992)]; una a -tubulina epítope péptido [Skinner et al., J . Biol . Chem . , 266 : 15163-15166 (1991)]; y la etiqueta péptido de proteína 10 gen T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc . Nati.

Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)] . En una modalidad alterna, la molécula quimérica puede comprender una fisión de los polipéptidos GDM con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una inmunoadhesina) , esta fusión puede ser la región Fe de una molécula IgG. Las fusiones Ig de preferencia incluyen la substitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o inactivado) de un anticuerpo o polipéptido precedente en el lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, CHlr CH2 y CH3 de una molécula IgGl . Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también la patente de los E.U.A, número 5,428,130 otorgada en junio 27, 1995. H . Preparación de polipéptidos GDM La siguiente descripción se refiere primordialmente a la producción de polipéptidos GDM al cultivar células transformadas o transíectadas con un vector que contiene ácido nucleico, tales anticuerpos, polipéptidos y oligopéptidos . Por supuesto, se contempla que los métodos alternos que son bien conocidos en la especialidad, pueden emplearse para preparar dichos anticuerpos, polipéptidos y oligopéptidos . Por ejemplo, la secuencia de amino ácido apropiado o sus porciones, puede producirse por síntesis de péptido directo utilizando técnicas de fase sólidas [ver, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman & Co . , San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963)]. Síntesis de proteínas in vitro puede administrarse utilizando técnicas manuales o por automación. Síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando un aparato Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Diversas porciones de dichos anticuerpos, polipéptidos y oligopéptidos puede sintetizarse químicamente por ceparado y combinarse utilizando métodos químicos o enzimático para producir el producto deseado. 1. Aislamiento de polipéptidos GDM que codifican ADN ADN que codifica un polipéptido GDM puede obtenerse de una biblioteca ADNc preparada a partir de tejido que se considera posee dicho anticuerpo, polipéptido u oligopéptido ARNm y para expresarlo a un nivel detectable. De acuerdo con esto, ADN que codifica dichos polipéptidos GDM puede obtenerse convenientemente de una biblioteca ADNc preparada a partir de tejido humano, una biblioteca genómica o por procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis de ácido nucleico automatizada) . Las bibliotecas pueden ser cribadas con sondas (tales como oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína por ella codificada. El cribado del ADNc o biblioteca genomica con la sonda selecta puede realizarse utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et al . , Molecular Cloning : A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . En forma alterna, metodología PCR puede emplearse. [Sambrook et al., supra ; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). Técnicas para cribar una biblioteca ADNc son bien conocidas en la especialidad. Las secuencias oligonucleótido seleccionadas como sondas deberán ser de suficiente longitud y suficientemente in ambiguas que se reduzcan al minino falsos positivos. El oligonucleótido de preferencia se etiqueta de manera tal que pueda ser detectado ante hibridización a ADN en la biblioteca que se criva. Métodos de etiquetado son bien conocidos en la especialidad, e incluyen el uso de radio etiquetas como ATP etiquetada con 32P, etiquetado de enzima o biotinilación . Condiciones de hibridización, incluyendo moderada severidad y alta severidad, se proporcionan en Sambrook et al., supra . Secuencias identificadas en estos métodos de cribado de biblioteca pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. Identidad de secuencia (en cualquier nivel de amino ácido o nucleótido) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de toda la secuencia de longitud integra, pueden determinarse utilizando métodos conocidos en la especialidad y como se describe aquí . Ácido nucleico que tiene secuencia de codificación de proteina puede obtenerse al cribar ADNc selecto o bibliotecas genómicas utilizando la secuencia amino ácido deducida descrita aquí por primera vez y de ser necesario utilizando procedimientos de extensión de cebador convencionales como se describen en Sambrook et al., supra , para detectar precursores y procesar intermediarios de AR m que pueden no ser transcritos inversos en ADNc . 2. Selección y Transformación de Células Anfitrionas Células anfitrionas se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación aquí descritos para producción de polipéptido GDM y cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura, pH y semejantes, pueden seleccionarse por la persona con destreza sin indebida experimentación. En general, principios, protocolos, y técnicas practicas para llevar al máximo la producción de cultivos celulares, pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology : A Practical Approach, . Butler, ed. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., supra . Métodos de transfección de célula eucarióticas y transformación de célula procarióticas se conocen por la persona con destreza ordinaria en la especialidad, por ejemplo, CaCl2, CaP04, mediada por liposomas y electroporación . Dependiendo de la célula anfitriona empleada, se realiza transformación utilizando técnicas estándar apropiadas para estas células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., supra , o electroporación en general se emplean para procariótas. Infección con Agrojbacte ium tumefaciens se utiliza para transformación de ciertas células de plantas, como se describe por Sha et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio 1989. Para células de mamífero sin estas paredes celulares, el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham and van der Eb, Virology, 52 : 456-457 (1978) puede emplearse. Aspectos generales de transfecciones de sistemas de anfitrión de células de mamífero se han descrito en la Patente de los E.U.A. número 4,399,216. Transformaciones en levadura típicamente se llevan a cabo de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J. Bact . , 130 : 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Nati. Acad. Sci . (USA), 7^:3829 (1979). Sin embargo, otros métodos para introducir ADN en células, tales como por microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas o policationes , por ejemplo, polibreno, poliornitina , también pueden emplearse. Para diversas técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., ethods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). Células anfitrionas convenientes para clonar o expresar el ADN en los vectores aquí, incluyen procariota, levadura o células eucariotas superiores. Procariotas convenientes incluyen pero no están limitados a eubacterias, tal como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli. Están disponibles al publico diversas cepas de E. coli, tales como la cepa E. coli K12 MM294 (ATCC 31,446); la cepa de E. coli X1776 (ATCC 31,537); la cepa E. coli 3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células anfitrionas procarióticas convenientes incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Sal onella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia arcescans, y Shigella, así como Bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis {por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicada en 12 abril 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. La cepa W3110 es un anfitrión precursor o anfitrión particularmente preferido debido a que es una cepa anfitriona común para fermentaciones de producto de ADN recombinante . De preferencia, las célula anfitriona secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas . Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al anfitrión, con ejemplos se estos anfitriones que incluyendo la cepa 1A2 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 ; la cepa 27C7 de (ATCC 55,244) E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; la cepa 37D6 E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; la cepa 40B4 de E. coli W3110, que es la cepa 37D6 con una mutación de deleción degP no resistente a canamicina; y una cepa E. coli que tiene proteasa periplasmica mutante descrita en la Patente de los E.U.A. número 4,946,783 otorgada en 7 agosto 1990. En forma alterna, métodos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones polimeraza de ácido nucleico, son convenientes . Anticuerpo de longitud integra, fragmentos de anticuerpo y proteína de fusión de anticuerpo pueden producirse en bacterias, en particular cuando glicosilación y función efectora Fe no se requieren, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por si mismo muestra efectividad en destrucción de células de tumor. Anticuerpos de longitud integra tienen mayor vida media en circulación. Producción en E. coli es más rápida y más eficiente en costo. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. (Cárter et . al.), Patente de los E.U.A.

(Joly et al.), y Patnete de los E.U.A. (Simmons et al.) que describen región de inicio de traducción (TIR = translation initiation región) y secuencias de señal para optimizar expresión y secreción, estas patentes se incorporan aquí por referencia. Después de expresión, el anticuerpo se aisla de la pasta de célula de E. coli en una fracción soluble y puede ser purificado a través, por ejemplo, de una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. Puede llevarse a cabo purificación final similar al proceso para purificar anticuerpo expresado en células convenientes (por ejemplo, células CHO) . Además de procariótas, microbios eucarióticos tales como levadura u hongos filamentosos son anfitriones de clonación o expresión convenientes para vectores que codifican polipéptidos GDM. Saccharo yces cerevisiae es un microorganismo anfitrión eucariótico inferior comúnmente empleado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140

[1981]; EP 139,383 publicado en mayo 2 1985); anfitriones de Kluyveromyces (patente de los E.U.A. número 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (M 98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol . , 154 (2) : 737-742

[1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. ther otolerans, and K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol . , 28:265-278

[1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 76:5259-5263

[1979]); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicada el 31 de octubre 1990) ; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado el 10 enero 1991) , y anfitriones Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. , 112:284-289

[1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221

[1983]; Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474

[1984]) and A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J. , 4:475-479

[1985] ) . Levaduras metilotrópicas son convenientes aquí e incluyen pero no están limitadas a, levadura capaz de crecimiento en metanol seleccionada de los géneros que consisten de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, and Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982) . Células anfitrionas convenientes para la expresión de producción de polipéptido GDM glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células de plantas, tales como cultivos celulares de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate y tabaco. Numerosas cepas de báculo virus y variantes y células anfitrionas de insectos permisibles correspondientes de anfitriones tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de las frutas) , y Bombyx mori se han identificado. Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus pueden emplearse como virus aquí de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda . Sin embargo, ha sido más grande el interés en células de vertebrados, y la propagación de las células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares anfitrionas de mamíferos útiles son de la línea de riñon de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebe (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde Africano (VERO- 76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065) ; tumor mamario de ratón (M T 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 ; y una línea de hepatoma humano (Hep G2 ) . Células anfitrionas se transforman con la expresión anteriormente descrita o vectores de clonación para producción de polipéptido GDM y cultivan en medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas . 3. Selección y Uso de un Vector Replicable El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica el polipéptido GDM respectivo, puede insertarse en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Diversos vectores están disponibles al público. El vector por ejemplo puede, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fag. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector por una variedad de procedimiento. En general, ADN se inserta en el o los sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en la especialidad. Componentes de vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, uno o más de una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes de marcadores, un elemento mej orador, un promotor y una secuencia de terminación de trascripción. La construcción de vectores convenientes que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándar que se conocen por la persona con destreza en la especialidad. El polipéptido GDM puede producirse en forma recombinante no solo en forma directa, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia se señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N- de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de señal pede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica la secuencia madura que se inserta en le vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica selecciona, por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinaza, lpp o líderes de enterotoxina termo estable II. Para secreción de levadura, la secuencia de señal puede ser por ejemplo, el líder de invertasa levadura, líder de factor alfa (incluyendo líderes de factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces, este ultimo descrito en la Patente de los E.U.A. número 5,010,182), o líder de fosfatasa acida, el líder de glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicada el 4 abril 1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 noviembre de 1990. En expresión de células de mamífero, secuencias de señal de mamífero pueden emplearse para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencia de señal de polipéptidos secretados de las mismas o especies relacionadas, así como líderes secretorios virales. Tanto vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar en una o más células anfitrionas selectas. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levadura y virus. El originen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas , el origen plasmado 2µ es conveniente para levadura, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Vectores de expresión y clonación típicamente contiene un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable . Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, tales como, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotroficas , o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilos . Un ejemplo de marcadores de selección convenientes para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para recoger ácido nucleico que codifica la proteína deseada, tal como DHFR o timidina cinasa. Una célula anfitriona apropiada cuando DHFR de tipo silvestre se emplea es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección conveniente para utilizar en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para desarrollar en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076, o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. Vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor enlazado operativamente con la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de amino ácidos deseada, a fin de dirigir la síntesis de ARNm. Promotores reconocidos por una variedad de células anfitrionas potenciales son bien conocidos. Promotores adecuados para utilizar con anfitriones procarióticos incluyen los sistemas promotores ?-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazado operativamente con el ADN que codifica la secuencia de proteína deseada. Ejemplos de secuencias de promoción convenientes para utilizar con anfitriones de levadura incluyen los promotores para 3 - fosfoglicerato cinasa [Hitzeman et al., J. Biol . Chem. , 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicoliticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. , 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa , hexoquinasa, piruvato decarboxilasa , fosfofructoquinasa , glucosa-6-fosfato isomeraza, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomeraza, fosfoglucosa isomeraza y glucoquinasa . Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles tienen la ventaja adicional de trascripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol dehidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneina , gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa y enzimas responsables para utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores convenientes para utilizar en expresión de levadura se describen adicionalmente en EP 73 , 657. Transcripción de ADN en células anfitrionas de mamífero se controla, por ejemplo, por promotores que se obtienen de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela aviar (UK 2,211,504 publicado el 5 julio 1989) , adenovirus (tal como Adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus , un retrovirus, virus de hepatitis-B y Virus Simian 40 (SV40), de promotores de mamífero heterologos, por ejemplo, el promotor actina o un promotor de inmunog1obulina, y de promotores de choque térmico, siempre que estos promotores, sean compatibles con los sistemas de células anfitrionas. La trascripción de un ADN que codifica el polipéptido GDM puede incrementarse al insertar una secuencia mej oradora en el vector. Mej oradores son elementos de acción cis de ADN, usualmente de aproximadamente 10 a 300 bp, que actúan en un promotor para aumentar su trascripción. Muchas secuencias mej oradoras ahora se conocen de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a - fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se utilizará un me orador de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el mej orador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100-270) , el mejorador promotor temprano de citomegalovirus , el mejorador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y mej oradores de adenovirus. El mejorador puede ser combinado en el vector en una posición 51 o 3 ' a la secuencia de codificación de las secuencias de amino ácido precedentes, pero de preferencia se ubican del sito 5' del promotor. Vectores de expresión utilizados en células anfitrionas eucarióticas (células de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de trascripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias están comúnmente disponibles de las regiones sin traducción 5 ' y ocasionalmente 31 , de ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm que codifica el respectivo anticuerpo, polipéptido u oligopéptido descrito en esta sección. Todavía otros métodos, vectores, y células anfitrionas adecuadas para adaptación a la síntesis del anticuerpo polipéptido u oligopéptido respectivo en cultivo de células de vertebrados recombinantes , se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058. 4. Cultivo de las Células Anfitrionas Las células anfitrionas utilizadas para producir los polipéptidos GDM pueden cultivarse en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma) , medio esencial mínimo ( (MEM) , (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y medio Eagle modificado con Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células anfitrionas. Además, cualquiera los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255,(1980), patente de los E.U.A. Números 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; O 87/00195; o la patente de los E.U.A. Re. números 30,985 pueden utilizarse como medio de cultivo para las células anfitrionas. Cualquiera de estos medios puede ser suplementado según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferina, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como la droga GENTAMYCINMR) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o un fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios también pueden ser incluidos a concentraciones apropiadas que serán conocidos por aquellos con destreza en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y semejantes, son aquellas previamente utilizadas con la célula anfitriona seleccionada para expresión, y serán aparentes para la persona con destreza ordinaria . 5. Conservar Detección de Amplificación/Expresión de Gen La amplificación y/o expresión de genes pueden ser medidas en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la trascripción de ARNm [Thomas, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia punto (análisis de ADN) , o hibridización in si tu, utilizando una sonda apropiadamente etiquetada, con base en las secuencias que aquí de proporcionan. En forma alterna, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína . Los anticuerpos a su vez pueden ser etiquetados y el ensayo puede llevarse a cabo cuando el dúplex se liga a una superficie, de manera tal que ante la formación de dúplex en la superficie, la presencia de anticuerpo ligado al dúplex puede detectarse. La expresión de genes, en forma alterna, puede ser medida por métodos inmunológicos , tales como tinción inmunohistoquimica de células o secciones de tejido y ensayo del cultivo celular o fluidos corporales para cuantificar directamente la expresión de producto de gen. Anticuerpos útiles para tinción inmunohistoquimica y/o ensayo de muestras fluidas ya puede ser monoclonal o policlonal, y puede ser preparado en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos adecuados para el presente método pueden prepararse contra un polipéptido u oligopéptido de secuencia nativa, o contra secuencia exógena fusionado a ADN y que codifica un epítope de anticuerpo específico de dicho polipéptido u oligopéptido. 6. Purificación de Proteína Los polipéptidos GDM pueden recuperarse de medio de cultivo o de lisados de células anfitrionas. Si están ligados a membrana, pueden liberarse de la membrana utilizando solución detergente conveniente (por ejemplo Triton-X 100) o por escisión enzimática. Células empleadas en expresión de la precedente pueden romperse por diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelado-descongelado, sonicación, ruptura mecánica o agentes de lisis celular. Puede ser conveniente el purificar lo precedente de las proteínas o polipéptidos de células recombinantes . Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación convenientes: por fraccionación en una columna de intercambio de iones; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio de cationes tal como DEAE ; cromatoenfoque ; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración de gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sefarose para retirar contaminante tales como IgG; y columnas de quelado de metal para ligar formas etiquetadas con epítopo de las moléculas deseadas. Pueden emplearse diverso métodos para purificación de proteína y estos métodos se conocen en la especialidad y describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes, Protein Purification : Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982) . La o las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el anticuerpo polipéptido o oligopéptido particular que se produce para los métodos reivindicados . Cuando se utilizan técnicas recombinantes , el polipéptido GDM puede producirse intracelularmente , en el espacio periplásmico, o directamente secretado al medio. Si estas moléculas se producen intracelularmente, como una primera etapa, los deshechos en partículas, ya sea células anfitrionas o fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultra filtración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli . Brevemente, se descongela pasta celular en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Pueden retirarse deshechos celulares por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, sobrenadantes de estos sistemas de expresión en general primero de concentran utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultra filtración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir proteólisis y antibióticos pueden incluirse para evitar el crecimiento de de contaminantes adventicios. Puede ocurrir Purificación utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis y cromatografía de afinidad, con cromatografía de afinidad que es la técnica de purificación preferida. La conveniencia de proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier dominio de inmunoglobulina Fe que este presente en el anticuerpo. Proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas ??, ?2 o ? 4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)) . Proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ? 3 humana (Guss et al., E BO J . 5:15671575 (1986)) . La matriz a la cual se conecta el ligando de afinidad más a menudo es agarosa, pero están disponibles otras matices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil ) benzeno permiten gastos de flujo más rápidos y más cortos de tiempos de procesamiento que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABXJ (J. T. Baker, Phillipsburg , NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tales como fraccionación en una columna de intercambio de iones; precipitación de etanol ; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice cromatografía en heparina cromatografía en SEPHAROSEMR en una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como una columna de ácido poliaspártico) cromatoenfoque ; SDS-PAGE; y precipitación de sulfato de amonio, también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar. Siguiendo cualesquiera etapas de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes, puede someterse a cromatografía de interacción hidrofobica de bajo pH utilizando un amortiguador de elusión a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, de preferencia que se realiza a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0.25M de sal) . I . Formulaciones farmacéuticas Formulaciones terapéuticas de los antagonistas GDM ("agente terapéutico") utilizados de acuerdo con la presente invención, pueden prepararse para almacenamiento al mezclar el o los agentes terapéuticos que tienen el grado de pureza deseado con portadores excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington: The Science of Practice of Pharmacy, 20th edition, Gennaro, A. et al., Ed. , Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000) ) , en la forma de soluciones acuosas o formulaciones liofilizadas . Portadores excipientes o estabilizante aceptables, no son tóxicos a los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyen ácido ascorbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, butilo o benzil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol ; resorcinol ,- ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol ) ; polipéptidos de bajo peso molecular (con menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextriñas; agentes quelantes tales como EDTA; tonificantes tales como trealosa y cloruro de sodio; azucares y sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; surfactante tal como polisorbato; contra iones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína Zn) ; y/o surfactantes no iónico tal como TWEEN7 , PLURONICS7 o polietilen glicol (PEG) . El anticuerpo de preferencia comprende el la anticuerpo a un concentración de entre 5-200 mg/ml, de preferencia entre 10-100 mg/ml. Las formulaciones presentes también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre si. Por ejemplo, además de el, o los agentes terapéuticos precedentes, puede ser conveniente el incluir en la formulación, un anticuerpo adicional, por ejemplo un segundo de dicho agente terapéutico, o un anticuerpo para cierto otro objetivo, tal como un factor de crecimiento que afecta el crecimiento del glioma. De manera alterna o adicional, la composición además puede comprender un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citosina, agente inhibidor de crecimiento, agente anti -hormonal y/o cardioprotector . Estas moléculas se presentan convenientemente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido . Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente) , en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocapsulas) , o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, supra. Preparaciones de liberación sostenida pueden prepararse. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrofobicos sólidos que contienen el anticuerpo, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo película o microcapsulas Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluye poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2 -hidroxietil -metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , polilactidas (Patente de los E.U.A. Número 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico ácido-glocólico tales como el LUPRON DEP0T7 (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico - ácido glicolico y leuprolida acetato) , y ácido poli-D- (-) -3 -hidroxibutírico . Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles. J . Diagnóstico y Tratamiento con antagonista GDM Para determinar la expresión GDM en el glioma, están disponibles diversos ensayos de diagnóstico. En una modalidad, sobre expresión del polipéptido GDM puede analizarse por inmunohistoquímica (IHC) . Secciones de tejido incrustadas en parafina de una biopsia de tumor pueden someterse al ensayo IHC y otorgársele un criterio de intensidad de tinción de proteína GDM como sigue: Calificación 0 - sin tinción se observa o tinción de membrana se observa en menos de 10% de células de tumor . Calificación 0 - una tinción de membrana escasamente/débilmente perceptible se detecta en más de 10% de las células de tumor. Las células solo se tiñen en parte de su membrana. Calificación 2+ - una tinción de membrana débil a moderada completa se observa en más de 10% de las células de tumor. Calificación 3+ - una tinción de membrana moderada a fuerte completa se observa en más de 10% de las células de tumor. Esos tumores con 0 o 1+ de calificaciones para expresión de polipéptido GDM pueden caracterizarse que no sobre expresan GDM, mientras que aquellos tumores con calificaciones 2+ o 3+ pueden caracterizarse porque sobre expresan GDM. En forma alterna, o adicional, ensayos FISH tales como el INFORM7 (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION7 (Vysis, Illinois) pueden llevarse a cabo en tejido de tumor fijo en formalina o incrustado en parafina para determinar la extensión (de haber) de sobre expresión GDM en el tumor. Sobre expresión o amplificación de GDM puede evaluarse utilizando un ensayo de diagnóstico in vivo, por ejemplo, al administrar una molécula (tal como un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica) que liga a la molécula al detectarse y se etiqueta con una etiqueta detectable [por ejemplo, un isótopo radioactivo o una etiqueta fluorescente) y explorar externamente al paciente para localización de la etiqueta. Actualmente, dependiendo de la etapa del cáncer, tratamiento de cáncer involucra uno o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para retirar el tejido canceroso, terapia de radiación y quimioterapia. Terapia que comprende administrar antagonista GDM puede ser especialmente conveniente en pacientes mayores que no toleran la toxicidad y efectos secundarios de quimioterapia bien y en enfermedad metastática en donde la terapia de radiación tiene utilidad limitada. Los antagonistas GDM que hacen blanco de tumor del presente método de la invención también puede utilizarse para aliviar cánceres que expresan GDM ante diagnóstico inicial de la enfermedad o durante relapso. Para aplicaciones terapéuticas, estos antagonistas GDM pueden utilizarse en combinación con, antes o después de la aplicación del otros agentes convencionales y/o métodos para el tratamiento de glioma, por ejemplo, de hormonas, antiangiógenos , o compuestos radio etiquetados o con cirugía, crioterapia, radioterapia y/o quimioterapia. Drogas quimioterapéuticas tales como TAX0TERE7 (docetaxel) , TAX0L7 (palictaxel) , estramustina y mitoxantrona se utilizan para tratar cáncer, particularmente, en pacientes de buen riesgo. En particular, terapia de combinación con palictaxel y derivados modificados (ver, por ejemplo, EP0600517) se contempla. Los precedentes anticuerpo, polipéptido, oligopéptido o molécula orgánica se administrarán con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico . En otra modalidad, este anticuerpo, polipéptido, oligopéptido o molécula orgánica se administrara en conjunto con quimioterapia para mejorar la actividad y eficacia del agente quimioterapéutico, por ejemplo, paclitaxel. El Physicians = Desk Reference (PDR) describe dosis de estos agentes que se han empleado en el tratamiento de diversos cánceres. El régimen de dosis y las dosificaciones de estas drogas quimioterapéuticas anteriormente mencionadas que son terapéuticamente efectivas, dependerán del cáncer particular que se trata, la extensión de la enfermedad y otros factores familiares al médico con destreza en la técnica y pueden determinarse por el médico. En una modalidad particular, un inmunoconj ugado que comprende este antagonista GDM conjugado con un agente citotóxico, se administra al paciente. De preferencia el inmunoconj ugado se internaliza por la célula, resultando en una eficacia terapéutica incrementada del inmunoconj ugado para exterminar la célula de cáncer a la cual se liga. En una modalidad preferida, el agente citotóxico hace blanco o interfiere con el ácido nucleico en la célula de cáncer. Ejemplos de estos agentes citotoxicos se describen anteriormente e incluye maitansinoides , calcheamicinas , rubonucleasas y endonucleasas de ADN. Los antagonistas GDM precedentes o sus conjugados de toxina se administran a un paciente humano, de acuerdo con método conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua sobres un periodo de tiempo, por rutas intracraneal, intracerobroespinal , intra-articular , intrathecal, intravenosa, intraarterial , subcutánea, oral, tópica o por inhalación. Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración de los antagonistas GDM anteriores. La administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica sencilla, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde de preferencia hay un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. De preferencia, esta terapia combinada resulta en un efecto terapéutico sinergista. En otra modalidad, los métodos de tratamiento terapéutico de la presente invención involucran la administración combinada de los antagonistas GDM anterior y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento, incluyendo co-administracion de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos . Ejemplos de agentes quimioterapéuticos se han proporcionado previamente. Programas de dosificación y preparación para estos agentes quimioterapéuticos pueden emplearse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el practicante con destreza. Programas de dosificación y preparación para esta quimioterapia también se describe en Chemotherapy Service Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis y modo de administración se seleccionaran por el médico de acuerdo con criterios conocidos. La dosis apropiada de antagonistas GDM dependerá del tipo de enfermedad a tratar, la severidad y curso de la enfermedad, si la administración es para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa (incluyendo) la historia y respuesta química del paciente, y la discreción del médico a cargo. Los antagonistas GDM precedentes pueden administrarse convenientemente al paciente en un tiempo o sobre una serie de tratamientos. La administración puede ocurrir por infusión intravenosa o por inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 /¿g/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0.1-15 mg/kg/dosis) de antagonista GDM puede ser una dosis candidato inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por uno o más administraciones separadas o por infusión continua. Un régimen de dosis puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por una dosis de mantenimientos semanal de aproximadamente 2 mg/kg de dicho antagonista GDM. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles. Una dosis típica diaria puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. El avance en esta terapia puede supervisarse fácilmente por métodos y ensayos convencionales y basado en criterios conocidos por el médico u otras personas con destreza en la especialidad. Aparte de la administración de la proteína-anticuerpo al paciente, la presente aplicación contempla administración del anticuerpo por terapia de genes. Esta administración del ácido nucleico que codifica los antagonistas polipéptidos GDM se abarca por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo" . Ver, por ejemplo, WO96/07321 publicada en marzo 14, 1996 referente al uso de terapia de genes para generar anticuerpos intracelulares . Hay dos enfoques principales para hacer llegar este ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) a las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para suministro in vivo el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, usualmente en el sitio donde se requiere el anticuerpo. Para tratamiento ex vivo, se retiran las células del paciente, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente ya sea en forma directa o, por ejemplo, encapsuladas en membranas micro porosas, que se implantan en el paciente (ver por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. números 4,892,538 y 5,283,187) . Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células de cultivo in vitro, o in vivo en las células del anfitrión pretendido. Técnicas adecuadas para transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente empleado para suministro ex vivo del gen es un vector retroviral . Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de Herpes simplex I, o virus adeno asociado) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para transferencia mediada por lípido del gene son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). Para revisar los protocolos de terapia de genes y marcados genes conocidos actualmente ver Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Ver también WO 93/25673 y las referencias ahí citadas. K. Artículos de Manufactura y Equipos Para aplicaciones terapéuticas, el artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el recipiente o contenedor que indica un uso para el tratamiento de glioma. Recipientes convenientes incluyen, por ejemplo botellas, ampolletas, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es efectiva para tratar la condición de cáncer y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa para solución intravenosa o ampolleta que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un antagonista GDM. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición de utiliza para tratar glioma. La etiqueta o inserto de empaque además comprenderá instrucciones para administrar el antagonista GDM. Adicionalmente , el artículo de manufactura además puede comprender un segundo recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI = bacteriostatic water for injection) , salino amortiguado con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y de usuario incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Equipos también pueden proporcionarse que son útiles para diversos otros propósitos, por ejemplo, para ensayos de exterminio de células que expresan GDM, para purificación o inmunoprecipitacion de polipeptido GDM de células. Para aislamiento y purificación de polipéptido GDM, el equipo puede contener el reactivo de enlace GDM respectivo acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de sepharose) . Pueden proporcionarse equipos que contienen estas moléculas para detección y cuantificación de polipéptido GDM in vi tro, por ejemplo, en un ELISA o transferencia Western. Como con el artículo de manufactura, el equipo comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque o asociado con el recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo, oligopétido o molécula orgánica-de enlace GDM utilizable con la invención. Recipientes adicionales pueden incluirse que contienen, por ejemplo diluyentes, y amortiguadores, anticuerpo de control. La etiqueta o inserto de empaque puede proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el uso in vitro o de diagnostico pretendido . L . Ácidos Nucleicos que Codifican GDM Sentido y Anti-sentido Antagonistas GDM incluye fragmentos de los ácidos nucleicos que codifican GDM tales como oligonucleótidos anti-sentido o sentido, que comprenden una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (ya sea ARN o ADN) capaz de ligar a secuencias objetivo ARNm GDM (sentido) o ADN GDM (antisentido) . Oligonucleotidos antisentido o sentido, de acuerdo a la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación del ADN GDM respectivo. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, con base en la secuencia de ADNc que codifica una proteína determinada, se describe por ejemplo en Stein and Cohén {Cáncer Res. £8:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958 (1988). El ligar oligonucleotidos antisentido o sentido con secuencias de ácido nucleico objetivo, resulta en la formación de dúplex que bloquea la transcripción o traducción de la secuencia objetivo por uno o varios medios, incluyendo degradación mejorada de los dúplex, terminación prematura de transcripción o traducción o por otros medios. Estos métodos se abarcan por la presente invención. Los oligonucleotidos antisentido de esta manera pueden utilizarse para bloquear la expresión de proteínas GDM, en donde estas proteínas GDM pueden jugar un papel en la inducción de cáncer en mamíferos. Oligonucleotidos antisentido o sentido además comprenden oligonucleotidos que tienen estructuras principales azúcar fosfodiéster modificadas (u otros enlaces de azúcar tales como aquellos descritos en WO 91/06629) y en donde estos enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Estos oligonucleotidos con enlaces de azúcar resistentes son estable in vivo (es decir, capaces de resistir degradación enzimática) pero retienen especificidad de secuencia para poder ligar a secuencias de nucleótido objetivo. Los compuestos antisentido utilizados de acuerdo con esta invención pueden elaborarse en forma conveniente y rutinaria a través de la técnica bien conocida de síntesis de fase sólida. Equipo para esa síntesis se vende por varios distribuidores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif .) . Cualesquiera otros medios para esta síntesis conocidos en la técnica pueden emplearse en forma adicional o alterna. Es bien conocido el utilizar técnicas similares para preparar oligonucleotidos tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse , conjugarse o de otra forma asociarse con otras moléculas, estructuras de moléculas o mezclas de compuestos, tal como por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en ingestión, distribución y/o absorción. Patentes que ilustran la preparación de estas formulaciones que asisten la ingestión, distribución y/o absorción incluyen pero no están limitadas a las Patentes de los E.U.A. Números 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5,595,756, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia. Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que se ligan covalentemente con porciones orgánicas, tales como aquellos descritos en WO 90/10048, y otras proporciones que aumentan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico objetivo, tales como poli- (L-lisina) . Aún más, agentes de intercalado, tales como elipticina y agentes alquilantes o complejos de metales puede conectarse a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de enlace de oligonuótido antisentido o sentido para la secuencia de nucleótido objetivo. Oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo por cualquier método de transferencia de genes, incluyendo por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaP04, electroporación o al utilizar vectores de transferencia de genes tales como virus Epstein-Barr . En un procedimiento preferido, un oligonucleótido antisentido o sentido se inserta en un vector retroviral conveniente. Una célula que contiene la secuancia de ácido nucleico objetivo se contacta con el vector retoviral recombinante ya sea in vivo o ex vivo. Vectores retrovirales convenientes incluyen, pero no están limitados a, aquellos derivados del retrovirus murino -MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) , o vectores de doble copia designados de DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641) . Oligonucleótido sentido o antisentido también puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos objetivo por formación de un conjugado con una molécula de enlace de ligando, como se describe en WO 91/04753. Moléculas de enlace de ligando convenientes incluye pero no están limitadas a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citosinas, u otros ligandos que ligan a receptores de superficie celular. De preferencia, la conjugación de la molécula de enlace de ligando no interfiere substancialmente con la capacidad de la molécula de enlace de ligando para ligar a su molécula o receptor correspondiente o bloquear entrada del oligonuclótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula. En forma alterna, un oligonucleótido sentido o antisentido puede ser introducido en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo por formación de un complejo oligonucleótido-lípido como se describe en O 90/10448. El complejo oligonucleótido-lípido sentido o antisentido de preferencia se disocia dentro de la célula por una lipasa endógena. Moléculas de ARN o ADN antisentido o sentido en general son de al menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550 , 560, 570, 580 , 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680 , 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, o 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia de nucleótidos de referencia más o menos 10% de esa longitud de referencia. M. Ensayos de Criba para Utilizar en Identificación de Antagonistas GDM: Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de enlace proteína-proteína, ensayos de criba bioquímica, inmunoensayos y ensayos basados en células, que son bien caracterizados en la especialidad. Todos los ensayos para antagonistas son comunes ya que requieren contacto del candidato de droga con un polipéptido GDM codificado por un ácido nucleico identificado aquí bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que interactúen estos dos componentes. En ensayos de enlace, la interacción es ligar y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido GDM codificado por el gen identificado aquí o el candidato de droga se inmoviliza en una fase sólida, por ejemplo, en una placa de micro titulación, por conexiones covalentes o no covalentes . La conexión no covalente en general se logra al revestir la superficie sólida con una solución del polipéptido GDM y secar. En forma alterna, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal , específico para el polipéptido GDM a inmovilizar puede utilizarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza al agregar el componente no inmovilizado, que puede ser etiquetado por una etiqueta detectable al componente inmovilizado, por ejemplo la superficie revestida que contiene el componente anclado. Cuando la reacción se completa, se retiran los componentes no reaccionados, por ejemplo por lavado y los complejos anclados en la superficie sólida son detectados. Cuando el componente no inmovilizado originalmente transporta una etiqueta detectable, la detección de la etiqueta inmovilizada en la superficie indica que ocurrió complejado. Cuando el componente no inmovilizado originalmente no transporta una etiqueta, puede detectarse complejado, por ejemplo, al utilizar un anticuerpo etiquetado que liga específicamente al complejo inmovilizado. Si el compuesto candidato interactúa con, pero no liga a un polipéptido GDM particular codificado por un gen aquí identificado, su interacción con este polipéptido puede ensayarse por métodos bien conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Estos ensayos incluyen enfoques tradicionales tales como, por ejemplo, entrelazamiento, co- inmunoprecipitación y co-purificación a través de columnas gradientes o cromatografícas . Además, interacciones proteína-proteína pueden supervisarse utilizando un sistema genético basado en levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields and Song, Nature (London) , 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) como se describe por Chevray and Nathans, Proc. Nati . Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Muchos activadores de trascripción, tales como levadura GAL4 , consisten de dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de enlace ADN, el otro que funciona como el dominio de activación-trascripción . El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (en general referido como el "sistema de dos híbridos") aprovecha esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en donde la proteína objetivo se fusiona al dominio de enlace ADN de GAL4 , y otra en donde proteínas de activación candidato se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen reportero GAL1-lacZ bajo control de un promotor activado GAL4 depende de la reconstitución de la actividad GAL4 mediante interacción proteína-proteína. Colonias que contienen polipéptidos de interacción se detectan con un substrato cromogénico para ß -galactosidasa . Un equipo completo (MATCHMAKERMR) para identificar interacciones de proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos, esta comercialmente disponible de Clontech. Este sistema también puede extenderse para cartografiar dominios de proteína involucrados en interacciones de proteínas específicas así como para señalar residuos amino ácidos que son cruciales para estas interacciones. Compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido GDM aquí identificado y otros componentes intra- o extra-celulares, pueden probarse como sigue: usualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra- o extra-celular bajo condiciones y por un tiempo que permite la interacción y enlace de los dos productos. Para probar la habilidad de un compuesto candidato para inhibir el enlace, la reacción se ejecuta en la ausencia y en la presencia del compuesto de prueba. Además, puede agregarse un placebo a una tercer mezcla de reacción, para servir como control positivo. El enlace (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra- o extracelular presente en la mezcla, se supervisa como se describió previamente. La formación de un complejo en la o las reacciones de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su socio de reacción. Para ensayar antagonistas, el polipéptido GDM puede agregarse a una célula junto con el compuesto a cribar para una actividad particular y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en la presencia del polipéptido GDM, indica que el compuesto es un antagonista al polipéptido GDM. En forma alterna, pueden detectarse antagonistas al combinar el polipéptido GDM y un antagonista potencial con receptores de polipéptido GDM ligados a membrana o receptores recombinantes bajo condiciones apropiadas para un ensayo de enlace competitivo. El polipéptido GDM puede ser etiquetado, tal como por radioactividad, de manera tal que el número de moléculas de polipéptido GDM ligados al receptor pueden emplearse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica el receptor puede ser identificado por numerosos métodos conocidos por aquellos con destreza en la técnica, por ejemplo, selección por sitios de adsorción-desorción de ligando y clasificación FACS . Coligan et al., Current Protocols in Immun. , 1(2): Capítulo 5 (1991). De preferencia, se emplea clonación de expresión en donde AR poliadenilado se prepara a partir de una célula que responde al polipéptido GDM y una biblioteca ADNc creada de este ARN se divide en reservas y utiliza para transferir células COS u otras células que no responden al polipéptido GDM. Células transíectadas que se desarrollan en porta-objetos de vidrio se exponen al polipéptido GDM etiquetado. El polipéptido GDM puede ser etiquetado por una variedad de medios incluyendo yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica de sitio. Después de fijación e incubación, los porta-objetos se someten a análisis autoradiográf ico . Las células positivas se identifican y se preparan sub-reservas y re- transfectan utilizando un proceso de sub-reserva y re-criba interactivo, produciendo eventualmente un solo clon que codifica el receptor putativo. Como un enfoque alterno para identificación de receptor, el polipéptido GDM etiquetado puede ser enlazado por fotoafinidad con preparaciones de extracto o membrana celular que expresan la molécula receptora. Material entrelazado se resuelve por PAGE y expone a película de rayos-X. El complejo etiquetado que contiene el receptor puede ser cortado, resuelto en fragmentos péptido y sometido a micro-secuenciado de proteína. La secuencia de amino ácidos obtenida de micro-secuenciado se utilizará para diseñar un conjunto de sondas oligonucleotido generadas para cribar una biblioteca ADNc para identificar el gen que codifica el receptor puta ivo . En otro ensayo para antagonistas, células de mamífero o una preparación de membrana que expresa el receptor se incubará con polipéptido GDM etiquetado en la presencia del compuesto candidato. La capacidad del compuesto para mejorar o bloquear esta interacción puede entonces ser medida. Ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que liga a las fusiones de inmunoglobulina con polipéptido GDM, y en particular anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos anti - idiotípicos , y versiones quiméricas o humanizadas de estos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. En forma alterna, un antagonista potencial puede ser una proteína cercanamente relacionada, por ejemplo una forma mutada del polipéptido GDM que reconoce el receptor pero no imparte efecto, de esta manera inhibiendo en forma competitiva la acción del polipéptido GDM. Otro antagonista polipéptido GDM potencial es una construcción ARN o ADN antisentido preparada utilizando tecnología antisentido, en donde por ejemplo, una molécula de ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traduction de ARNm al hibridizar a ARNm objetivo y evitar traducción de proteína. Antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que ligan al sitio activo, el sitio de enlace de receptor, o factor de crecimiento u otro sitio de enlace relevante del polipéptido GD , de esta manera bloqueando la actividad biológica normal del polipéptido GDM. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no están limitados a, péptidos pequeños o moléculas tipo péptido, de preferencia péptidos solubles y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptidilo sintéticos. Ribozimas son moléculas de AR enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica de ARN. Las ribozimas actúan por hibridización específica de secuencia al ARN objetivo complementario, seguido por escisión de endonucleolítica . Sitios de escisión de ribozima específicos dentro de un blanco ARN potencial pueden ser identificados por técnicas conocidas. Para mayores detalles ver, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y publicación de PCT No. WO 97/33551 (publicado en septiembre 18, 1997) . Moléculas de ácido nucleico en formación de triple-hélice utilizadas para inhibir transcripción deberá ser de una sola hebra y compuestas por deoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera tal que promueve formación de triple-hélice por reglas de apareamiento de base Hoogsteen, que en general requieren tramos dimensionales de purinas o pirimidinas en una hebra de un dúplex. Para mayores detalles ver, por ejemplo, la publication de PCT No. WO 97/33551, supra. Estas moléculas pequeñas pueden ser identificadas por cualquiera uno o más los ensayos de criba discutidos previamente y/o por cualquier otra técnica de criba bien conocida por aquellos con destreza en la especialidad. Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en forma alguna. Todas las patentes y referencias de literatura citadas en la presente especificación aquí se incorporan por referencia en su totalidad. EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Procedimientos Experimentales Muestras de Tumor y Características de Paciente Un resumen de todos los casos de tumor estudiados y se incluyen en la Figura 8A. Para análisis de supervivencia, se analizaron tres conjuntos de datos perfilado de expresión. Obtuvimos muestras de tejido congelado de 76 casos en MDA, ARN de 39 casos para UCSF (Nigro et al., Cáncer Res. 65: 1678-1686 (2005), y datos de un estudio previamente publicado de UCLA (Freije et al., supra.) . Casos analizados en los primeros dos conjuntos de datos cumplen con los siguientes criterios: muestras congeladas frescas se obtuvieron al tiempo de resección quirúrgica inicial de pacientes (> 21 años de edad) que no reciben previa radio- o quimioterapia. Información de seguimiento clínico estuvo disponible por un periodo de al menos 2 años posterior a cirugía o hasta morir. Aprobación de Sujetos Humanos/Junta de Revisión Institucional se obtuvo de estos estudios de laboratorio en retrospectiva en UCSF y MDA. Los casos se graduaron como AA o GBM de acuerdo con los criterios WHO y secciones de todos los tejidos se examinaron por un neuropatólogo (KA) para asegurar que >9Q% de la muestra representa tumor. Variantes histológicas inusuales se excluyeron. Para el conjunto de datos UCLA, utilizamos datos de todos los casos en el estudio previamente publicado que cumplen con nuestro criterio para edad del paciente y parámetros de control de calidad de micro-hilera o micro-matriz. Este conjunto de datos incluye casos de morfología oligodendrogl ial o mixta así como casos con tiempos de supervivencia censados a menos de 2 años .

Tejido de cerebro adulto normal que consiste de especímenes de autopsia de corteza cerebral de donadores sin historia de tumor cerebral o desórdenes neurologicos y se obtuvo del Banco de Investigación Neurológica del Cerebro Nacional (National Neurological Rsearch Brain Bank) (Los Angeles, CA) .

Para comparaciones de grado de tumor contra clase de firma (Figura 2A) , incluimos especímenes de muestra adicionales para los cuales no están disponibles historias clínicas. El tejido de cerebro de adulto normal consiste de especímenes y autopsia de corteza cerebral desde sin historia de tumor cerebral o desórdenes neurologicos y se obtuvo del National Neurological Research Brain Bank (Los Angeles, CA) . Excepto por especímenes de cerebro y astrocitos fetales, datos de muestra analizados en la Figura 2B se obtuvieron mediante suscripción a la Base de datos Gene Logic (Gaithersburgh, MD) de datos Affymetrix de muestras humanas .

Perfilado de Expresión de Gen, Hibridización Genómica Comparativa, y PCR Cuantitativo Para especímenes que no están incluidos en publicaciones previas (Freije et al., supra; Nigro et al., supra) ARN celular total de especímenes de cerebro normal y de tumor se extrajeron utilizando el equipo de aislamiento de ARN de Qiagen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se retiró contaminación de ADN genómico a través de una etapa de digestión DNasa en columna. Chips Affymetrix U133A & B se emplearon para perfilado de expresión de acuerdo con una técnica previamente publicada (Tumor Analysis Best Practices Working, 2004) . Parámetros de control de calidad fueron como se describió en esta publicación excepto porque las muestras se dejó que exhibieran proporciones 3'/5' de >3 para actina siempre que la proporción de 3'/5' para GAPDH fue <3. PCR cuantitativo se realizó en duplicado para cada muestra en el Detector de Secuencia ABI Prism7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) con reactivos Taqman PCR Core (Applied Biosystems, Foster City, CA) . 25 ng de ARN total se utilizan en cada reacción de 50 µ? . Rab 14 se utiliza para normalización ya que exhibe muy poca variación en expresión a través de una gran cantidad de muestras. Todos los pares cebadores se diseñaron para generar amplicones de 67-79 bp . Extracción de ADN y arreglo CGH se realizan como se describió previamente. Misra et al., Clin. Cáncer Res. 11(8): 2907-18 (2005). De las 96 muestras analizadas mediante CGH, datos de 43 muestras vienen de un estudio previamente publicado (Nigro et al., supra.) . Análisis de datos de miero-hilera o micro-matriz Valores de intensidad de señal de la versión Suite Microarray Analysis se utilizaron con un factor de escala de 500 para todos los análisis de datos de micro-hileras o micro-matrices. Agrupamiento por k-medias y agrupamiento aglomerativo se realizaron con el uso de programa Spotfire Decisión Site versión 7.3 utilizando la correlación Pearson como la medida de similaridad. Para cada gen, se normalizaron datos en calificaciones Z antes de agrupamiento. Los 35 genes de firma utilizados para clasificación de tumor representan los marcadores más robustos para cada uno de los tres sub-conjuntos de tumor en el conjunto de muestra de supervivencia MDA. Marcadores de cada sub-conjunto se identifican como sigue: Cada una de las 76 muestras se asigna a uno de los tres grupos con base en agrupamiento de k media de expresión de los 108 genes más fuertemente correlacionados con supervivencia. Utilizando un corte de valor p de 1 x 10"4, pruebas t se utilizaron para identificar todos los genes cuya expresión difiera entre las muestras en cada subclase comparadas con tumores de otra subclase (ver Tabla A, POLYPEPTIDE GDM) . Para cada comparación, ordenamos en forma jerárquica los conjuntos de 500 sondas con los valores p más pequeños, por cambio de pliegue. Los conjuntos de sondas empleados como genes de firma para cada sub-tipo de tumor fueron aquellos que corresponden a secuencias de longitud íntegra identificadas que mostraron el cambio de pliegue más grande, y que cumplen con un corte de expresión mínimo (intensidad media de 400 dentro del grupo de interés) . Determinaciones empíricas utilizando agrupamiento k-medias reveló que agrupamientos de muestra estables resultaron cuando se realizó agrupamiento utilizando los conjuntos de 30-60 sondas, siempre que la lista de genes para agrupamiento se equilibra para incluir menos marcadores en uno de tres sub-tipos de tumor. Los 35 genes de firma finales contienen 15 marcadores PN, 15 Mes, y 5 Prolif. Calificaciones de similaridad a centroides PN, Prolif y Mes, representan coeficientes de correlación Pearson a cada uno de los centroides generados en agrupamiento k-medias de 76 muestras de supervivencia MDA. Para comparaciones estadísticas de datos presentados en la Figura 4 F-I y Figura 7, se analizaron datos de transformación log mediante pruebas t corregidas para comparaciones de múltiples grupos. Datos de expresión transformados log también se utilizaron para el análisis estadístico realizado para la Figura 5. Hibridización In Situ e Inmunohistoquímica Ribosondas antisentido etiquetadas 33P-UTP se transcribieron utilizando el sistema de transcripción in vitro de Promega (Promega, Madison, WI) hibridizaron en micro-hileras de tej ido-glioma humano incrustados en parafina que se obtienen de una variedad de fuentes utilizando un método previamente descrito (Phillips et al., Science 250 : 290-294 (1990) . Imágenes ilustradas en la Figura 1 son de núcleos de tejido incluidos en una micro-hilera de tejido obtenida de Petagen, Inc. La sonda a BCAN representa un fragmento de 668 bp (939 a 1606) y para CHI3L1/YKL40 un fragmento de 1158 bp (121 a 1278) . Se realizó inmunohistoquímica en secciones incrustadas en parafina como se describió previamente (Simmons et al., Cáncer Res. 61: 1122-1128 (2001). Anticuerpos primarios fueron anti-p-akt (ser473) de Cell Signaling Technology (Beverly, MA) y anti-Notch de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) . Se realizaron calificaciones por un neuropatólogo ciego al grupo de firma de los especímenes analizados. Estudios In vitro Líneas celulares GBM previamente descritas se utilizan para estudios in vitro (Hartmann et al., Internat. J. Oncol . 15_: 975-982 (1999) . Para cultivos de neuroesferas , células clasificadas positivamente con perlas CD133 se mantuvieron en cultivo como se describe para especíemens GBM primarios (Singh et al., Nature 432 396-401 (2004). Todos los cultivos de neuroesferas se mantienen en medio Neurobasal (Invitrogen) con suplemento N2 (Invitrogen) y NSF1 (Cambrex) . Cuando están presentes, EGF y FGF se agregan a una concentración de 20 ng/ml. Cada línea celular se califica por crecimiento de neuroesfera en la ausencia de EGF+FGF por un observador ciego a la firma molecular de las líneas celulares. La escala de calificaciones es como sigue: 0 = sin neuroesferas viables, 1 = neuroesferas de lente de expansión, 2 = moderada velocidad de crecimiento, 3 = crecimiento moderado a rápido, pero más lento que lo visto con EGF+FGF, 4 = rápido crecimiento que no se acelera por EGF+FGF. Se realizan ensayos de inhibición de crecimiento en placas de 96 pozos utizizando condiciones de cultivo de células estándar en medio de DMEM con 10% de suero bovino fetal. Para tratamiento con rapamicina, LY294002, o los inhibidores gamma secretasa GSI-1 o S-2188, se revistieron células (Día-0) en placas de noventa y seis pozos a una densidad celular de 1500 o 2000 por pozo, trataron en el Día-1 con droga, y estimaron para viabilidad el Día-4 utilizando lectura Alamar Blue . Cada condición de tratamiento se evalúa en un mínimo de tres experimentos excepto por S-2188 que produce resultados casi idénticos en dos ensayos. Resultados ilustrados en la figura 6 son de un experimento representativo. Resultados Firmas Moleculares Definen Subclase de Pronóstico de Astrocitoma de Alto Grado 76 muestras de los casos recientemente diagnosticados de GB (n=55) y AA (n=21) se obtuvieron del MD Anderson Cáncer Center (MDA) y perfilados mediante micro-hileras de ADN para identificar patrones de expresión de gen que clasifican tumores en grupos con diferentes pronósticos (Figura 1 A-C) . Los datos demográficos para estos y todos los casos de tumor analizados en el estudio actual se describen en la Figura 8A. Primero identificamos conjuntos de sondas cuya expresión se correlaciona más fuertemente con supervivencia (Spearman r de valores de intensidad de expresión transformados log contra tiempos de supervivencia >0.45 o <-0.45), seguido por agrupamiento aglomerativo de dos días de los 108 conjuntos de sonda resultantes y 76 muestras. Este análisis identifica tres grupos discretos de conjuntos de muestras que difieren marcadamente en su expresión de los genes relacionados a supervivencia (Figura 1A) .

A fin de desarrollar un conjunto de marcadores para cada una de las tres subclases de tumor, identificamos conjuntos de sondas que se sobre-expresan más fuertemente por tumores dentro de cada subgrupo como se compara con tumores en las subclases restantes (ver Tabla A: Marcadores Determinantes de Glioma) . Utilizando los marcadores más robustos para cada uno de los tres subconjuntos de tumor, derivamos un conjunto de 35 genes, referidos como genes firma, que pueden ser utilizados ya sea en agrupamiento jerárquico (Figura IB) o agrupamiento de k-medias para asignar tumores a subclase. Las subclases de tumor definidas por agrupamiento k-medias se designan proneural (PN) , proliferativo {Prolif) y mesenquimal (Mes) para reconocer la característica dominante de la lista de genes marcadores que caracteriza a cada subclase. Para cada subclase de tumor, se calcula un centroide a partir de los valores de expresión promedio de los 35 genes de firma (Figura IB) . Puede verse un centroide como el patrón de expresión prototipo para un sub-tipo de tumor y muestras adicionales pueden clasificarse con base en la similaridad de su expresión de los genes de firma a estos centroides. Trazos Kaplan-Meier para casos en el conjunto de datos MDA mostraron que la supervivencia media de la subclase PN (174.5 wks) fue marcadamente más larga que cualquiera de los subtipos Prolif (60.5) o Mes (65.0 wks; Figura 1C) .

Para demostrar el valor de pronóstico del esquema de clasificación de tumor novedoso, examinamos dos conjuntos de datos independientes adicionales. Un conjunto de datos se generó a partir de un conjunto de muestras AA y GBM que se obtienen de casos tratados en la University of California San Francisco (UCSF) mientras que el segundo conjunto de datos de validación se obtuvo de un estudio previamente publicado en casos de tumores grados III y IV de morfologías astrocítica, oligodendroglial y mixtas, vistos en UCLA (Freije et al., 2004) . Tumores en ambos conjuntos de validación se clasificaron en los subtipos PN, Prolif, y Mes con base en similaridad de su expresión de los genes de firma a los centroides definidos en el conjunto de datos MDA. Trazos Kaplan-Meier para supervivencia de subtipos de tumor en ambos conjuntos de validación mostraron un patrón muy similar al observado en el conjunto de datos inicial (Figura 1 D&E) . Considerando solo casos GBM, el valor de pronóstico de la distinción entre PN contra otras clases se vieron estadísticamente significantes ya sea dentro del conjunto de muestra MDA o a través de todos los 3 conjuntos de datos combinados (p<.05, prueba t para ambas comparaciones de PN contra otras clases) .

A continuación comparamos expresión de marcadores PN y Mes selectos por ambos PCR tiempo real cuantitativo y micro-matriz. Seleccionamos DLL3 (ligando tipo delta 3) y CHI3L1/YKL40 como marcadores PN y Mes, respectivamente, de la lista de genes de firma y BCAN y CD44 de la lista más extensa de marcadores (Tabla A) para estas mismas dos subclases, respectivamente. Como se ve en las Figuras 1F yG, la mayoría de muestras de glioma exhiben valores de expresión sobre el promedio de población para cualquiera del par de marcadores PN o el par de marcadores Mes, pero raramente para combinaciones de marcadores PN y Mes. Hibridización in situ en un conjunto de casos de tumor independientes confirmó un patrón mutuamente excluyente de expresión para BCAN y CHI3L1/YKL40 mRNAs (Figura 1H) . La mayoría de los especímenes exhibieron fuerte señal para cualquiera de BCAN o CHI3L1/YKL40 , pero no para ambos marcadores. Algunos especímenes sin embargo, exhiben expresión focal de cada uno de dos marcadores en elementos celulares no superpuestos. Más típicamente, estos fueron especímenes con pequeños focos de expresión CHI3L1/YKL40 en especímenes que contienen regiones positivas BCAN amplias. En dichos casos, la expresión CHI3L1/YKL40 se asoció frecuentemente con vasos sanguíneos.

Firmas PN, Prolif, y Mes Definen sus Poblaciones de Tumor Que Difieren en Grado de Tumor y Edad del Paciente Expandiendo nuestro análisis para incluir un total de 256 gliomas de alto grado (tabla suplementaria 1) , observamos que la mayoría de los tumores exhibieron una fuerte similaridad ya sea al centroide PN, el Prolif o el Mes y una correlación neutra o negativa con los otros dos centroides (Figura 2A) . Este hallazgo se refleja por la tendencia de muestras para agrupar en los ápices de un triángulo en el trazo tri -dimensional exhibido en la Figura 2A. Mientras que algunas muestras presentan similaridad intermedia con dos centroides, muy pocas muestras presentan similaridades débiles o neutras a todos los tres centroides. De esta manera, la mayoría de los gliomas de alto grado tienden a residir en uno de tres estados fenotípicos discretos, pero pueden existir más raramente en una condición que sea intermedia entre las dos condiciones. Las sub-clases de tumor recientemente definidas exhiben una fuerte asociación con el grado de tumor histológico. Casi todos los especímenes de tumor grado III examinados (89%) fueron clasificados como PN independientemente de si exhiben morfología oligodendroglial o astrocítica. En contraste, una proporción significante de lesiones grado IV (GBM) fue clasificada en cada una de tres categorías moleculares. De 184 muestras GBM examinadas, 32% fueron PN, 20% fueron Prolif, y 48% fueron Mes. Examen cualitativo de secciones teñidas con H&E de los casos GBM incluyen I el conjunto de muestra MDA reveló nueva característica histológica que distinguiera uniformemente las subclases moleculares de tumor. La única característica morfológica cuya ocurrencia se asocia estadísticamente con subclase molecular fue necrosis de tumor, que fue menos frecuente en tumores PN. Entre 9 casos GBM identificados como PN, 4 carecen de regiones necróticas. En contraste, solo 2 de 22 Mes GBMs (p<.05, PN, Mes contra la prueba exacta Fischer) y 0 de 24 Prolif GBMs (p=0.005, PN contra Prolif) fallaron en exhibir necrosis. Consistente con correlaciones bien establecidas tanto de grado de tumor como el tiempo de supervivencia a la edad del paciente, encontramos que la asignación de tumores a subtipos moleculares estratifica pacientes en base a edad. Entre los 185 casos recientemente diagnosticados en nuestro análisis de supervivencia, pacientes con tumores en la subclase PN fueron significativamente más jóvenes que aquellos con tumores en cualquiera de las subclases Prolif o Mes (p<.005 pruebas t para ambas comparaciones) . Edad promedio +/-SEM para pacientes con tumores de la subclase PN, Prolif y Mes fueron 40.5 +/- 1.4 años, 49.0 +/- 2.5 años, y 50.7 +/- 1.3 años, respectivamente. Para GBMs , casos Mes fueron significativamente mayores que PN (p <.05, prueba t) mientras que los casos Prolif no difieren en edad de cualquiera de las otras 2 clases. Firmas PN, Prolif, y Mes Caracterizan Distintos Conjuntos de Tejidos Normales Para lograr comprensión del significado biológico de las firmas moleculares representadas por los centroides PN, Prolif y Mes, examinamos la expresión de los 35 genes de firma en los varios tipos de células y tejido humano. Este análisis reveló que distintos conjuntos de tejidos semejan a cada uno de los centroides que definen subclases de glioma (Figura 2B) . Tanto el cerebro fetal como adulto tienen correlación positiva con el centroide PN (proneural) . Dos líneas celulares madre neurales derivadas de cerebro humano fetal también exhiben una firma PN bajo condiciones de cultivo normal (Figura 2B) . Tejidos que exhiben la firma Mes (mesenquimal ) incluyen células de hueso, sinovio, músculo liso, endotelial, y células dendríticas. Además, una muestra de astrocitos fetales humanos cultivados exhibe una asociación positiva clara con el centroide Mes.

Tanto células madre hematopoyéticas aisladas de sangre periférica como la línea celular altamente proliferativa Jurkat tuvieron fuerte asociación con el centroide Prolif. De manera interesante, las dos líneas celulares madre neurales cambiaron subclase de firma de la clase PN a la Mes en respuesta al tratamiento y retiro del factor neurotrófico BDNF (Figura 2B) . Ante recurrencia, los tumores tienden a cambiar hacia el fenotipo Mea Para determinar si las firmas moleculares que definen las subclases de tumor son una característica fija de cada caso de tumor o pueden cambiar como una función de tratamiento o avance de enfermedad, comparamos firmas de expresión de 26 pares de especímenes acoplados o apareados que representan astrocitomas primarios y recurrentes de los mismos pacientes. El cambio promedio en firma en todos los 26 pares de muestras primarias contra recurrentes corresponde a una pérdida en similaridad al centroide PN de 0.18 +/- 0.06 (cambio en promedio de Pearson r +/- SEM) , una ganancia en similaridad al centroide Mes de 0.20 +/- 0.09 y muy poco cambio en similaridad al centroide Prolif (ganancia de 0.02 +/- 0.08) . 18 de los 26 casos surgen y recurren en la misma subclase molecular mientras que ocho tumores cambiaron clase ante recurrencia (Figura 2C) . De estos ocho casos de cambio de clase fenotípica, todos excepto uno representan cambios a la subclase Mes; tres casos cambiaron del subtipo PN a Mes y cuatro cambiaron de fenotipo Prolif a Mes. La instancia final de cambio de clase es un caso que pasa de similaridad moderada Mes a similaridad moderada Prolif. Utilizando un análisis a manera de pares o apareado, análisis de significancia de micro-hileras (SAM) identifica genes que fueron significativamente regulados a la alta en tumores recurrentes que cambiaron a la subclase Mes (Figura 2D) . Genes regulados a la alta incluyen CHI3L1/YKL-40 , CD44 y STAT3 , genes previamente implicados en biología GBM así como vimentina (VIM) , un marcador clásico de tejidos mesenquimales (Eibl et al., J. Neuro-Oncol. 26: 165-170 (1995); Nigro et al., supra.; Nutt et al., Cáncer Res. 63: 1602-1607 (2005); Rahaman et al., Oncogene 21: 8404-8413 (2002); Tanwar et al., Cáncer Res. 62: 4364-4368 (2002). CHI3L1/YKL-40 se reporta que pronostica radioresistencia en tumores humanos (Pelloski et al., Clin. Cáncer Res. 11: 3326-3334 (2005) y promueve la supervivencia clonogénica después de radiación in vi tro (Nigro et al., supra.), hallazgos consistentes con un incremento relativo en expresión ante recurrencia de tumor después de tratamiento. No se encontraron genes que se regularon a la baja significativamente en casos que cambian a la clase Mes. Inmunohistoquimica en tejido de casos que cambian alejándose de PN ante recurrencia, sugieren frecuente pérdida de expresión 0LIG2 nuclear prominente y regulación a la alta de CHI3L1/YKL-40. En el ejemplo mostrado en la Figura 3, un tumor PN que muestra expresión nuclear prominente de 0LIG2, un marcador PN previamente reportado como preferencialmente asociado con lesiones de bajo grado (Ligón et al., J. Neuropathol . Exp. Neurol . 63: 499-509 (2004), exhibió relativa pérdida de expresión 0LIG2 en la recurrencia. El cerebro normal exhibe solo un bajo nivel de tinción en oligodendroglia, indicando que la regulación a la alta de este marcador por tumores PN en datos de hileras no es una manifestación de contaminación de cerebro normal durante procesamiento de tejido. Por el contrario, mientras que CHI3L1/YKL-40 , un marcador Mes, se expresó solo en células de tumor raras en la muestra primaria, se ve expresión abundante en la recurrencia. Estos cambios en expresión relativa se ven en todos los tumores examinados con un cambio Mes en recurrencia. Subtipos de tumor de pobre pronóstico se distinguen por marcadores de proliferación o angiogénesis Habiendo definido las subclases de pronósticos de tumor, buscamos identificar aspectos de biología que puedan contribuir a diferencias en agresividad de la enfermedad. Para examinar los fenotipos de subclases de tumor, seleccionamos conjuntos de casos de astrocitoma de nuestros análisis de supervivencia que mostraron la más fuerte similaridad a los centroides empleados para clasificación (n=12 por subtipo) . Incluimos en nuestra comparación ocho muestras de tej ido de cerebro normal . Al examinar marcadores de proliferación, encontramos que tanto antígeno nuclear celular de proliferación (PCNA = proliferating cell nuclear antigen) y topoisomerasa II alfa (TOP2A) , se sobre-expresaron significativamente en los tumores Prolif en comparación con los tumores PN o Mes (Figura 3A) . Un mecanismo posible por el cual los tumores Mes manifiestan un fenotipo agresivo en la ausencia de una alta velocidad de división celular es a través de angiogénesis . Como se ve en la Figura 3B, los tumores Mes exhiben sobre-expresión de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF = vascular endothelial growth factor) , fltl o receptor VEGF 1 (VEGFR1) , kdr o receptor VEGF 2 (VEGFR2) , y el marcador endotelial PECAM1. Subtipos de tumor con deficiente pronóstico expresan marcadores de células de amplificación de tránsito y/o madre neurales mientras que subtipos de tumor de mejor pronóstico expresan marcadores de neuroblastos o neuronas . Algunos de los marcadores PN en el conjunto de genes de firma tales como NCAM, GABBR1 y SNAP91 están asociados con neuronas. A la luz de recientes hallazgos que células tumorigénicas de GBM expresan el marcador de célula madre neural CD133 (Singh et al., Nature 432: 396-401 (2004), buscamos el comparar la expresión de marcadores para células madre neurales contra marcadores de linaje neuronal comprometido (Fig. 3C-E) . Para nuestro análisis, seleccionamos marcadores asociados con neurogénesis de prosencéfalo o cerebro anterior de adulto (Abrous et al., Physiol. Rev. 85: 523-569 (2005); Antón et al., Nature Neurosci. 7: 1319-1328 (2004); Nakano et al., J. Cell Biol . 170: 413 (2005); Shi et al., Nature 427: 78-83 (2004) . Para cinco de seis marcadores de células madre neurales o células de amplificación de tránsito multipotente , encontramos que una o ambas de las subclases de tumor de deficiente pronóstico mostraron expresión elevada en comparación con tumores PN (Figura 3C) . Estas diferencias se vieron con vimentina (VIM) , nestina (NES) , TLX, CD133, y MELK. Mientras que DLX2 , un marcador de células de amplificación de tránsito, no muestran diferencias significantes estadísticamente entre grupos de tumor, algunos tumores Prolif mostraron fuerte expresión de este gen. En contraste marcadores de células madre, marcadores de neuroblastos o neuronas de desarrollo se sobre expresaron en tumores PN en comparación con tumores Prolif y/o Mes (Figura 3D) . Estos marcadores incluyen 0LIG2, MAP2 , DCX, ENC1 (NeuN) , ERBB4 , y GAD2. La expresión de marcadores neuronales en tumores PN no se toma en cuenta por contaminación de especímenes de tumor con cerebro normal, ya que los niveles de expresión de 0LIG2, DCX, NeuN, y GAD2 fueron elevados en tumores en comparación con especímenes de cerebro normal (datos no mostrados, p<.005 para todas las comparaciones de prueba t de tumor contra normal, sin corregir para múltiples comparaciones) . GFAP, un marcador de tanto células madre neurales como astrocitos se expresó mas fuertemente en tumores de ambas subclases Mes y PN en comparación con tumores Prolif (Figura 3E) . Pérdidas en chr 10 y ganancia en chr 7 se asocian con subtipos de tumor Prolif y Mes De los casos examinados por perfilado de expresión, ADN de 96 especímenes de AA y GBM estuvo disponible para análisis por hibridización genómica comparativa de matriz (CGH= comparative genomic hybridization) . Se calificaron tumores por cambios de número de copia en chrs 1, 7, 10 y 19. Los tumores se calificaron por cambios de número de copia relativos en chrs 1, 7, 10 y 19. La mayoría de las muestras demostraron ganancias en chr 7 y pérdidas en chr 10 (Figura 4A) . Al examinar pérdidas en chr 10, encontramos marcadas diferencias en la frecuencia de estas alteraciones genómicas entre subclases de tumor (Figura 4A) . Mientras que la mayoría de los tumores Prolif y Mes tuvieron pérdidas en chr 10 que se extienden 10q23.3 (78% y 84% respectivamente) , una minoría (20%) de la subclase de tumor PN mostró pérdidas en chr 10. Para tumores Mes, la mayoría de los casos perdieron esencialmente todos los sitios en chr 10, y solo dos casos tuvieron pérdidas confinadas a lOq. En contraste, tumores Prolif tuvieron más pérdidas heterogéneas en Chr 10. La asociación entre firmas de pronóstico y estado en Chr 10 es altamente significante (p<.0001, prueba exacta de Fisher) . Asociaciones similares pero menos robustas entre firma de tumor y cambios del número de copias relativos en chr 7 o 19q (Figura 4A, p < .01 tanto para chr7 como 19q por prueba exacta de Fisher) , pero no en chrlp o lq (p > .05) . Dada la asociación entre cambios de número de copia genómica relativos y subtipos de tumor, buscamos determinar si los genes que definen cada subtipo de tumor estaban sesgados por ubicación cromosomal . Análisis Chi al cuadrado en las listas extendidas de marcadores de subclase de tumor (Tabla A) reveló que por cada una de las tres listas, las frecuencias observadas de ubicaciones de cromosomas difirieron significativamente de lo que se esperaba por las frecuencias de ubicaciones para todos los conjuntos de sondas en las hileras de expresión (p < 1 x 10"14 para PN, p < .001 para Prolif, p < .0005 para Mes) . Litas de marcador PN y Mes sobre-representan marcadores en chrlO y 19 , respectivamente (P <.05 para ambas comparaciones después de corrección Bonferroni para 72 comparaciones) . Estos hallazgos corroboran las diferencias entre subtipos de tumor para cambios en número de copia de ADN relativos en chrlO y 19q. Rutas Notch y akt se activan diferencialmente en subclases de tumor con pronóstico bueno contra deficiente. Consistente con la asociación de la pérdida de chrlO y subclase de tumor, un examen directo de datos CGH de hilera para ciónos BAC que abarca en el sitio PTEN confirman que un alto porcentaje de casos Prolif y Mes exhibe pérdidas en el sitio PTEN. Una asociación negativa se vio entre pérdidas del sitio PTEN y la similaridad al centroide PN (Figura 5A) . La mayoría de los casos de ganancias o amplificaciones del sitio fueron tumores ya sea de la subclase Prolif o Mes y una correlación negativa se vio entre ganancia de número de copia EGFR y similaridad al centroide PN (Figura 5B) . No se vieron amplificaciones y eliminaciones obvias en sitios correspondientes a aktl, akt2, o akt3 , ni de subunidades catalíticas de PI3K (no mostrado) . Un pequeño número de muestras demuestran ganancias en número de copia para PIK3R3, una subunidad regulatoria a PI3K, y proporciones CGH para este sitio fueron correlacionadas en forma positiva con similaridad a la firma Prolif (Figura 5C) . Ya que nuestros resultados sugieren fuertes relaciones entre la activación de ruta akt y subtipos de tumor, comparamos la expresión ARNm PTEN y inmunohistoquímica de fosfo-akt (p-akt) en subtipos de tumor. Encontramos que tumores Prolif y Mes expresan aproximadamente 2 veces menos ARNm PTEN y más fuerte p-akt (ser473) en comparación con tumores PN (Figura 4E; Figura 4J) . Los resultados fueron altamente significantes (p < 5 X 10"5 para ARNm PTEN; p< 5 X 10~8 para inmunohistoquímica p-akt para pruebas t de PN vs . otro). Los resultados PTEN fueron validados en un segundo conjunto de muestras independiente (datos no mostrados) . Al examinar la vista completa de marcadores de tumor PN en el conjunto de muestras MDA, encontramos que conjuntos de sondas correspondientes a los elementos de ruta Notch DLL3 , DLL1 , HEY2 y ASCL1 cumplieron con nuestro criterio para marcadores de tumor PN (Figura 5 E- H) . Estos genes se confirmaron que sobre -expresan significativamente en tumores PN de ambos conjuntos de cados de validación. Cada uno de estos 4 elementos de ruta Notch se ha implicado en neurogénesis de prosencéfalo . (Campos et al., J. Neurosci. Res. 64: 590-598 (2001); Casarosa et al., Development 126: 525-534 (1999); Sakamoto et al., J. Biol . Chem. 278: 44808-44815 (2003) y ASCL1 recientemente se ha enlazado a especificación tanto de neuronas como oligodendroglia en el prosencéfalo de adulto. (Parras et al., EMBO Journal, 23(22) : 4495-505 (2004). Elementos de la ruta Notch para la cual datos de microhilera no muestran regulación a la alta en tumores PN incluyen Notch 1-4, Jagged 1 & 2 , Hes 1, 2, 4, 6, 7 (no mostrado) . HEY1 mostró una regulación a la alta pequeña pero significante en tumores MDA PN (1.4FC, p= 5 X 10~5) . Para examinar evidencia directa para activación de señalización Notch, utilizamos una evaluación ciega de inmunoreactividad Notch nuclear en todos los casos MDA con secciones incrustadas en parafina disponibles. Casos positivos mostraron un "enrojecimiento" en el núcleo en comparación con casos negativos, que muestran una ausencia completa de tinción nuclear. La figura 4k exhibe frecuencias de cada subtipo de tumor calificadas 0, 1, o 2 para tinción nuclear Notch. A pesar de la señal relativamente débil exhibida por casos positivos, las calificaciones de muestras PN se demostraron significativamente superiores que aquellas de cualquier subclase Prolif (p<.005, prueba t) o Mes (p<.001, prueba t) . Un modelo de dos genes de expresión DLL3 y PTEN pronostica supervivencia de astrocitoma de alto grado. Ya con estos datos sugieren un papel para rutas Notch y akt en agresividad de tumor, buscamos evidencia para una asociación directa entre expresión de marcadores de ruta y supervivencia. Para este análisis, evaluamos ARNm PTEN por PCR cuantitativo y ARNm DLL3 por datos de microhilera de todas las muestras en el conjunto de supervivencia MDA en donde suficiente ARNm estaba disponible (n=65) . Un modelo Cox de riesgos proporcionales reveló que niveles de ARNm PTEN y DLL3 y su interacción estadística todas se asociaron con supervivencia en astrocitomas de alto grado, y combinaron para formar un modelo predictivo altamente significante (prueba de proporción de probabilidad de 21.6 en comparación con una distribución de referencia Chi al cuadrado con 3 grados de libertad, p < .0001) . Las funciones de supervivencia pronosticada ilustradas en Figura 5A demuestran que muestras con bajos valores de ARNm PTEN se asociaron con una función de supervivencia deficiente independientemente del nivel de expresión DLL3. Para muestras con alta expresión PTEN, supervivencia estimada se ve que varia con una función de DLL3 de manera tal que muestran con altos niveles de ambos AR m PTEN y DLL3 mostraron los mejores resultados. A continuación ajustamos el mismo modelo con un conjunto independiente más pequeño (n=34) de astrocitomas grado III & IV. Curvas de supervivencia pronosticadas son marcadamente similares a aquellas obtenidas del conjunto de muestra MDA (Figura 5B) , indicando la robustez de este modelo de dos genes (Figura 6B) . Firmas de expresión de lineas celulares GBM pronostican crecimiento y sensibilidad de neuroesfera independiente EGF/FGF a inhibición de ruta akt Para examinar la significancia terapéutica potencial de los subtipos moleculares de tumor, examinaron respuestas in vi tro de líneas celulares de glioma como una función de su expresión de los genes de firma. Perfilamos 16 líneas celulares GBM para expresión ARNm, investigamos su habilidad para generar neuroesferas en la presencia o ausencia de EGF+FGF, y evaluamos su respuesta a agentes que afectan señalización Notch y Akt. Todas las 16 líneas se correlacionaron negativamente respecto al centroide PN, pero mostraron un amplio rango de similaridades a un centroide Mes. Mientras que 15 de las 16 líneas celulares generaron neuroesferas que pueden propagarse en EGF+FGF, su habilidad para generar neuroesferas que crecen en la ausencia de EGF+FGF varió (Figura 6A) , y pareció relacionarse con la firma de expresión de la linea celular precursora (Figura 6B) . En forma más notable, encontramos que dos líneas celulares se correlacionan negativamente con el centroide Mes (G112 & G122) generan neuroesferas que crecen rápidamente en la ausencia de EGF+FGF (Figura 6B) , mientras que líneas celulares con una fuerte correlación al centroide Mes fallaron en generar neuroesferas que pueden propagarse fácilmente en ausencia de EGF+FGF (Figura 7B) . Un resumen de mayores hallazgos incluyendo los paralelos entre subtipos de tumor y etapas en el desarrollo neuronal del prosencéfalo, se exhibe en las figuras 8 A & B. EJEMPLO 2 : Análisis de microhileras para detectar regulación a la alta de polipéptidos GDM en tumores de glioma cancerosos Microhilera de ácido nucleico a menudo que contienen miles de secuencias de genes son útiles para identificar genes expresados diferencialmente en tejidos enfermos en comparación con sus contrapartes normales. Utilizando microhileras de ácido nucleico, muestras de ARNm de prueba de control de muestras de tejido de prueba de control se someten a transcripción inversa y etiquetan para generar sondas ADNc . Las sondas ADNc después se hibridizan a una hilera de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. El conjunto o matriz se configura de manera tal que la secuencia y posición de cada miembro del conjunto se conoce. Por ejemplo, una selección de genes que se conoce expresan en ciertos estados de enfermedad pueden arreglarse en un soporte sólido. La hibridización de una sonda etiquetada con un miembro de conjunto o matriz particular indica que la muestra de la cual se derivó la sonda expresa ese gen. Si la señal de hibridización de una sonda de una muestra de prueba (tejido enfermo) es mayor que la señal de hibridización de una sonda de una muestra de control (tejido normal) el gen o genes sobreexpresados en el tejido enfermo se identifican. La implicación de este resultado es que una proteína sobreexpresada en un tejido enfermo es útil no solo como marcador de diagnóstico por la presencia de una condición enferma sino también como un objetivo terapéutico para tratamiento de la condición de enfermedad . La metodología de hibridización de ácidos nucleicos y la tecnología de micro-hileras o micro-matriz son bien conocidas en la técnica. En el presente ejemplo, la preparación específica de ácidos nucleicos para hibridización y sondas, porta-objetos y condiciones de hibridización todos se detallan en la solicitud de patente PCT No. de Serie PCT/USOl/10482 , presentada en marzo 30, 2001 y que aquí se incorpora por referencia. EJEMPLO 3 : Análisis Cuantitativo de Expresión ARNm GDM En este ensayo, un ensayo 5' nucleasa (por ejemplo, TaqMan7) y PCR cuantitativo de tiempo real (por ejemplo, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System7 (Perkin Elmer, Applied Biosystems División, Foster City, CA) ) , se utiliza para encontrar genes que se sobre-expresan significativamente en un tumor o tumores de glioma cancerosos en comparación con otros tumores cancerosos o tejido no canceroso normal. La reacción de ensayo 5 ' nucleasa es una técnica basada en PCR fluorescente que utiliza la actividad 5' exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para supervisar expresión de genes en tiempo real. Dos cebadores oligonucleótido (cuyas secuencias se basan en la secuencia EST o gen de interés) se utilizan para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se diseña para detectar secuencia de nucleótido ubicada entre los dos cebadores PCR. La sonda no es extensible por la enzima Taq ADN polimerasa, y se etiqueta con un colorante fluorescente reportero y un colorante fluorescente neutralizador . Cualquier emisión inducida por láser del colorante reportero se neutraliza por el colorante de neutralización cuando los dos colorantes se ubican cerca entre sí como están en la sonda. Durante la reacción de amplificación PCR, la enzima Taq ADN polimerasa escinde la sonda en una forma dependiente de plantilla. Los fragmentos de sonda resultantes se desasocian en solución, y señalan desde la señal del colorante reportero liberado está libre del efecto de neutralización del segundo fluoróforo. Una molécula del colorante reportero se libera por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del coloranten reportero sin neutralizar proporciona la base para interpretación cuantitativa y cualitativa de los datos. Este ensayo es bien conocido y empleado rutinariamente en la especialidad para identificar cuantitativamente diferencias de expresión de genes entre dos muestras de tejido humano diferentes, ver por ejemplo, Higuchi et al., Biotechnology 10:413-417 (1992); Livak et al., PCR ethods Appl . , 4:357-362 (1995); Heid et al., Genome Res . 6:986-994 (1996); Pennica et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 95 (25) : 14717-14722 (1998); Pitti et al., Nature 396 (6712) : 699-703 (1998) y Bieche et al., Int. J. Cáncer 78 : 661-666 (1998) . El procedimiento 5' nucleasa se ejecuta en un dispositivo PCR cuantitativo de tiempo real tal como el Dispositivo de Detección de Secuencia ABI Prism 7700TM. El sistema consiste de un termociclador, láser, cámara dispositivo acoplado de carga (CCD) y computadora. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pozos en un termociclador. Durante amplificación, señal fluorescente inducida por láser se recolecta en tiempo real a través de cables de fibras ópticas para todos los 96 pozos, y se detecta en la CCD. El sistema incluye programa para operar el instrumento y para analizar los datos. El material de partida para la criba es ARNm aislado de una variedad de diferentes tejidos cancerosos. El ARNm se cuantifica en forma precisa, por ejemplo, fluorométricamente . Como un control negativo, ARN se aisla de diversos tejidos normales del mismo tipo de tejido como el tejido canceroso que se prueba. Frecuentemente, una o varias muestras de tumor se comparan directamente con la o las muestras normales "acopladas" del mismo tipo de tejido, lo que significa que la o las muestras de tumor normales se obtienen del mismo individuo. Datos de ensayo 5 ' nucleasa inicialmente se expresan como Ct , o el ciclo umbral. Esto se define como el ciclo en el cual la señal reportera se acumula sobre el nivel de fondo de fluorescencia. Los valores ACt se utilizan como medida cuantitativa del número relativo de copias de partida de una secuencia objetivo particular en una muestra de ácido nucleico cuando se compara resultados de ARNm de cáncer con resultados de ARNm humano normal . Como una unidad Ct corresponde a 1 ciclo PCR o aproximadamente un aumento relativo de 2 veces respecto a dos unidades normales, dos unidades corresponden a un aumento relativo 4 veces, 3 unidades corresponden a un aumento relativo de 8 veces y así en adelante, se puede medir en forma cuantitativa y cualitativa el aumento relativo en veces en expresión de ARNm entre dos o más tejidos diferentes. En este aspecto, es bien aceptado en la técnica que este ensayo sea suficientemente sensible desde un punto de vista técnico para detectar en forma reproducible un aumento de al menos 2 veces en la expresión de ARNm en una muestra de tumor humano respecto a un control normal . EJEMPLO 4 : Hibridización In situ Hibridización in situ es una técnica poderosa y versátil para la detección y localización de secuencias de ácido nucleico dentro de preparaciones de célula o tejido. Puede ser útil por ejemplo, para identificar sitios de expresión de genes, analizar la distribución de tejido de transcripción, identificar y localizar infección viral, seguir cambios en síntesis de ARNm específico y ayudar en cartografía de cromosomas. La hibridización in situ se realiza siguiendo una versión optimizada del protocolo por Lu y Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), using PCR-generated 33P-labeled riboprobes . Brevemente, tejidos humanos incrustados en parafina fijos con formalina, se seccionan, desparafinan, desproteínan en proteinasa K (20 g/ml) por 15 minutos a 37 grados C, y procesan adicionalmente para hibridización in situ como se describe por Lu and Gillett, supra. Ribosonda antisentido etiquetada A [33-P] UTP se generan de un producto PCR e hibridizan a 55 grados C durante la noche. Los porta objetos se sumergen en emulsión de seguimiento nuclear Kodak NTB2 y exponen por 4 semanas. Síntesis de Ribosonda 33P 6.0 µ? (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) se secaron con vacío acelerado. A cada tubo que contiene 33P-UTP seco, se agregaron los siguientes ingredientes: 2.0 µ? de amortiguador de transcripción 5x 1.0 µ? DTT (100 mM) 2.0 µ? de mezcla NTP (2.5 mM : 10 µ; cada uno de GTP 10 mM, CTP & ATP + 10 µ? H20) 1.0 µ? UTP (50 µ?) 1.0 µ? de Rnasina 1.0 µ? de molde ADN {lµg) 1.0 µ? H20 1.0 µ? de ARN polimerasa (para productos PCR T3 = AS, T7 = S, usualmente) Los tubos se incubaron a 37 grados C por una hora. 1.0 µ? de RQ1 DNasa se agrega, seguido por incubación a 37 grados C por 15 minutos. 90 µ? TE (10 mM Tris pH 7.6/1 mM EDTA pH 8.0) se agregan y la mezcla se transfiere con pipeta en papel DE81. La solución restante se carga en una unidad de ultrafiltración Microcon-50, y centrifuga utilizando el programa 10 (6 minutos) . La unidad de filtración se invierte sobre un segundo tubo y centrifuga utilizando el programa 2 (3 minutos) . Después del centrifugado de recuperación final, 100 µ? TE se agregan. 1 µ? de producto final se transfiere con pipeta en papel DE81 y cuentan en 6 mi de Biofluor II. La sonda se corre en un gel de TBE/urea. 1-3 µ? de la sonda o 5 µ? de RNA Mrk III se agregan a 3 µ? de amortiguador de carga. Después de calentar en un bloque térmico de 95 grados C por tres minutos, la sonda se coloca inmediatamente en hielo. Los pozos de gel se inundan, la muestra se carga y se corren a 180-250 volts por 45 minutos. El gel se envuelve en envoltura sarano y expone a película XAR con una pantalla intensificadora en congelador a -70 grados C una hora durante la noche. Hibridización 33P A. Pretratamiento de secciones congeladas Los porta-objetos se retiran del congelador, colocan en bandejas de aluminio y descongelan a temperatura ambiente por 5 minutos. Las bandejas se colocan en incubador a 55 grados C por cinco minutos para reducir condensación. Los porta-objetos se fijan por 10 minutos en paraformaldehido al 4% en hielo en la campana de humos, y lavan en 0.5 x SSC por 5 minutos, a temperatura ambiente (25 mi 20 x SSC + 975 mi SQ H20) . Después de desproteinación en 0.5 µg/ml proteinasa K por 10 minutos a 37 grados C (12.5 µ? de 10 mg/ml de material concentrado en 250 mi de amortiguador RNasa-libre de RNAsa precalentado) , las secciones se lavan en 0.5 x SSC por 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidratan en 70%, 95%, 100% de etanol, 2 minutos cada una . B . Pretratamiento de secciones incrustadas en parafina Los porta-objetos se desparafinan, colocan en SQ H20 y enjuagan dos veces en 2 x SSC a temperatura ambiente por 5 minutos cada vez. Las secciones se desproteinan en 20 µ9/t?1 de proteinasa K (500 µ? de 10 mg/ml en 250 mi de amortiguador RNasa-libre de RNasa; 37 grados C, 15 minutos) - embrión humano, o proteinasa 8 x K (100 µ? en 250 mi de amortiguador RNasa, 37 grados C, 30 minutos) - tejidos en formalina. Subsecuente enjuague en 0.5 x SSC y deshidratación se realizan como se describió anteriormente. C . Prehibridización Los porta-objetos se colocan en una caja de plástico forrada con amortiguador Box (4 x SSC, 50% formamida) - papel filtro saturado. D . Hibridización 1.0 x 106 cpm de sonda y 1.0 µ? tRNA (50 mg/ml de material concentrado) por portaobjetos se calientan a 95 grados C por 3 minutos. Los portaobjetos se enfrían en hielo, y 48 µ? de amortiguador de hibridización se agregan por portaobjetos. Después de torbellino, 50 µ? de mezcla 33P se agregan a 50 µ? de prehibridización en portaobjetos. Los portaobjetos se incuban durante la noche a 55 grados C. E . Lavados El lavado se realiza 2 x 10 minutos con 2xSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 mi 20 x SSC + 16 mi 0.25M EDTA, Vf=4L) , seguido por tratamiento de RNasa A a 37 grados C por 30 minutos (500 µ? de 10 mg/ml en 250 mi de amortiguador Rnasa = 20 µg/ml) . Los portaobjetos se lavan 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de severidad de lavado pueden ser como sigue: 2 horas a 55 grados C, 0.1 x SSC, EDTA (20 mi 20 x SSC + 16 mi EDTA, Vf=4L) . F . Oligonucleótidos Análisis in situ se realiza en una variedad de secuencias de ADN aquí descritas. Los oligonucleótidos empleados para estos análisis se obtienen para ser complementarios con los ácidos nucleicos (o sus complementos) como se muestra en las figuras acompañantes. EJEMPLO 5 : Preparación de Anticuerpos que Ligan GDM Técnicas para producir anticuerpos monoclonales se conocen en la especialidad y se describen por ejemplo, en Goding, supra . Inmunógenos que pueden emplearse incluyen polipéptidos GDM purificados, proteínas de fusión que contienen polipéptidos GDM, y células que expresan polipéptidos GDM recombinantes en la superficie celular. La selección de inmunógeno puede realizarse por la persona con destreza en la técnica sin indebida experimentación. Ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno anterior emulsificado en adyuvante de Freund completo e inyectan subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad desde 1-100 microgramos. En forma alterna, el inmunógeno se emulsifica en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, T) e inyecta en las plantas de las patas traseras del animal. Los ratones inmunizados son entonces reforzados 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsificado en el adyuvante selecto. Posteriormente, por varias semanas, los ratones también pueden ser reforzados con inyecciones de inmunización adicionales. Muestras de suero pueden obtenerse periódicamente de los ratones por sangrado retro-orbital para prueba en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-GDM. Después de que se ha detectado un título de anticuerpo conveniente, los animales "positivos" para anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de polipéptido GDM. Tres a cuatro días después, los ratones son sacrificados y las células de bazos se recolectan. Las células de bazo después se fusionan (utilizando polietilen glicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino selecta tal como P3X63AgU.l, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que pueden entonces revestirse en placas de cultivo de tejido de 96 pozos que contienen medio HAT (hipoxantina , aminopterina , y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de bazo . Las células de hibridoma se criban en una ELISA para reactividad contra GDM. Determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra GDM está dentro de la destreza en la especialidad. Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singenéicos para producir ascitos que contienen los anticuerpos monoclonales anti-GDM. En forma alterna, las células de hibridoma pueden desarrollarse en matraces de cultivo de tejido o botellas giratorias. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascitos puede lograrse utilizando precipitación de sulfato de amonio, seguida por cromatografía de exclusión de gel . En forma alterna, puede emplearse cromatografía de afinidad basada en enlace de anticuerpo a proteína A o proteína G. EJEMPLO 6 : Preparación de Anticuerpos Conjugados con Toxina que ligan GDM El uso de conjugados anticuerpo-droga (ADC) , es decir inmunoconjugados , para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos , es decir drogas para exterminar o inhibir células de tumor en el tratamiento de cáncer (Payne (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Re . 26:151-172; US 4,975,278) permiten el suministro dirigido de la porción de droga a tumores, y acumulación intracelular ahí, en donde la administración sistémica de estos agentes de droga no conjugados puede resultar en niveles de toxicidad inaceptables a células normales así como células de tumor que se buscan eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet (Mar. 15, 1986) pp . 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review, " in Monoclonal Antibodies >84 : Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.)/ PP- 475-506). De esta manera se busca eficacia máxima con toxicidad mínima. Esfuerzos para diseñar y refinar ADC se han enfocado en la selectividad de anticuerpos monoclonales (mAbs) así como propiedades de enlace de droga y liberación de droga. Tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales se han reportado como útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol . Immunother . , 21:183-87). Drogas empleadas en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . Toxinas utilizadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina de difteria, toxinas de plantas tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina (Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cáncer Inst . 92 (19) : 1573-1581 ; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maytansinoids (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y calicheamicin (Lode et al. (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342). Técnicas para producir conjugados de anticuerpo-droga al enlazar toxinas con anticuerpos purificados son bien conocidas y empleadas rutinariamente en la especialidad. Por ejemplo, la conjugación de un anticuerpo monoclonal purificado con la toxina DM1 puede lograrse como sigue. El anticuerpo purificado se derivatiza con N- sucinimidil -4 - (2 -piridiltio) -pentanoato para introducir grupos ditiopiridilo . Anticuerpo (376.0 mg, 8 mg/mL) en 44.7 mi de 50 mM amortiguadores de fosfato de potasio (pH 6.5) que contiene NaCl (50 mM) y EDTA (1 mM) se trata con SPP (5.3 equivalentes molares en 2.3 mi de etanol) . Después de incubar por 90 minutos bajo argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra en gel a través de una columna Sephadex G25 equilibrada con 35 mM de citrato de sodio, 154 mM NaCl y 2 mM EDTA. Fracciones que contienen anticuerpo después se reúnen y ensayan. Anticuerpo-SPP-Py (337.0 mg con grupos 2 -tiopiridina liberables) se diluye con el amortiguador citrato de sodio 35 mM anterior pH 6.5, a una concentración final de 2.5 mg/ml. DM1 (1.7 equivalentes, 16.1 moles) en dimetilacetamida 3.0 mM (DMA, 3% v/v en la mezcla de reacción final) después se agrega a la solución de anticuerpo. La reacción se deja que proceda a temperatura ambiente bajo argón por 20 horas. La reacción se carga en una columna de filtración gel Sephacryl S300 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L) equilibrada con citrato de sodio 35 mM, 154 mM NaCl , pH 6.5. El gasto de flujo es 5.0 ml/min y 65 fracciones (20.0 mi cada una) se recolectan. Se reúnen y ensayan fracciones, en donde el número de moléculas de droga DM1 enlazadas por molécula de anticuerpo (p1) se determina al medir la absorbancia a 252 nm y 280 nm. Para propósitos ilustrativos, la conjugación de un anticuerpo monoclonal purificado con la toxina DM1 puede lograrse como sigue. Anticuerpo purificado se derivatiza con (Sucinimidil 4- (N-maleimidometil ) ciclohexano- 1 -carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) para introducir el enlazador SMCC. El anticuerpo se trata a 20 mg/ml en fosfato de potasio 50mM/ cloruro de sodio 50 mM/ 2 mM EDTA, pH 6.5 con 7.5 equivalentes molares de SMCC (20 mM en DMSO, 6.7 mg/ml). Después de agitar por 2 minutos bajo argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra a través de una columna Sephadex G25 equilibrada con fosfato de potasio 50mM/ cloruro de sodio 50 mM/ EDTA 2 m , pH 6.5. Fracciones que contienen anticuerpo se reúnen y ensayan. Anticuerpo-SMCC después se diluye con 50mM fosfato de potasio 50mM/ cloruro de sodio 50 mM/ EDTA 2 mM, pH 6.5, a una concentración final de 10 mg/ml, y reaccionan con solución 10 mM de DM1 (1.7 equivalentes considerando 5 SMCC/anticuerpo, 7.37 mg/ml) en dimetilacetamida . La reacción se agita a temperatura ambiente bajo argón por 16.5 horas. La mezcla de reacción de conjugación después de se filtra a través de una columna de filtración de gel (1.5 x 4.9 cm) con 1 x PBS a pH 6.5. La proporción de DM1/anticuerpo (p) después de mide por absorbancia a 252 nm y a 280 nm. Drogas citotóxicas que típicamente se han conjugado anticuerpos a través de los a menudo numerosos residuos lisina del anticuerpo. La conjugación a través de grupos tiol presente, o diseñados en el anticuerpo de interés también se han logrado. Por ejemplo, residuos cisteina se han introducido en proteínas por técnicas de ingeniería genética para formar sitios de conexión covalente para ligandos (Better et al. (1994) J. Biol . Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al . (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al . (1999) Proc . Natl . Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al . (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al . (2001) Proc . Nat. Acad. Sci . USA 98 (15) : 8480-8484 ; Patente de los E.U.A. número 6,248,564). Una vez que existe un residuo cisteina libre en los anticuerpos de interés, las toxinas pueden enlazarse a ese sitio. Como un ejemplo, los reactivos enlazadores de droga, maleimidocaproil -monometil auristatina E (MMAE) , es decir MC-MMAE, maleimidocaproil -monometil auristatina F (MMAF) , es decir MC-MMAF, MC-val -cit -PAB-MMAE o MC-val-cit-PAB-MMAF, disolver en DMSO, se diluyen en acetonitrilo y agua a concentraciones conocidas, y se agregan a anticuerpo derivatizado con cisteina enfriado en salino amortiguado con fosfato (PBS) . Después de aproximadamente una hora, se agrega un exceso de maleimida para neutralizar la reacción y taparon en extremo cualesquiera grupos tiol anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentra por ultrafiltración centrifuga y el anticuerpo conjugado con toxina se purifica y desalifica por elusión a través de resina G25 en PBS, filtra a través de filtros 0.2m bajo condiciones estériles y congela para almacenamiento. Aún más, una cisteina libre en un anticuerpo de elegido puede modificarse por el reactivo bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical), dejando un grupo maleimido sin reaccionar en la superficie del anticuerpo. Esto puede lograrse al disolver BM(PE0)4 en una mezcla etanol/agua al 50% a una concentración de 10 m y agregar un exceso diez veces molar a una solución que contiene el anticuerpo en salino amortiguado con fosfato a una concentración de aproximadamente 1.6 mg/ml (10 micromolar) y permitir que reaccione por 1 hora. Exceso BM(PE0)4 se retira por filtración en gel en citrato 30 mM, con pH 6 con amortiguador NaCl 150 mM. Un exceso 10 veces molar aproximado de DM1 se disuelve en dimetil acetamida (DMA) y agrega al intermediario anticuerpo-BMPEO. Dimetil formamida (DMF) también puede emplearse para disolver el reactivo de porción de droga. La mezcla de reacción se deja que reaccione durante la noche antes de filtración en gel o diálisis en PBS para retirar la droga sin reaccionar. Filtración en gel en columnas S200 en PBS se utiliza para retirar agregados de alto peso molecular y proporcionar conjugado anticuerpo-BMPEO-DMl purificado . EJEMPLO 7 - Ensayos de Exterminio de Células In Vi tro Células de mamífero que expresan el polipéptido GDM de interés pueden obtenerse utilizando técnicas de clonación y vector de expresión estándar. En forma alterna, muchas líneas de células de tumor que expresan polipéptidos GDM de interés están disponibles públicamente, por ejemplo, a través de ATCC y pueden identificarse rutinariamente utilizando análisis FACS o ELISA estándar. Anticuerpos monoclonales polipéptido anti-GDM (y derivados conjugados de toxina de los mismos) pueden entonces emplearse en ensayos para determinar la capacidad del anticuerpo para exterminar células que expresan GDM polipéptido in vi tro. Con consideración específica a la presente invención, una línea celular derivada de PC3 que expresa en forma estable polipéptido GDM en su superficie celular (aquí denominado PC3 -gD-MDP) puede someterse a ingeniería utilizando técnicas estándar y expresión del polipéptido GDM por las células PC3 -gD-MDP puede confirmarse utilizando clasificación celular FACS estándar, análisis de inmunohistoquimica y ELISA. La capacidad de un anticuerpo monoclonal anti-GDM conjugado con MMAE para provocar muerte de las células que expresan GDM respectivas puede determinarse utilizando un ensayo de exterminio celular in vitro que emplea el siguiente protocolo (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al (2002) Cáncer Res. 62:5485-5488): 1. Una alícuota de 50 µ 1 de cultivo celular que contiene aproximadamente 104 células (ya sea células PC3-gD-MDP o células PC3 sin transfectar que no expresan GDM) en medio de crecimiento se deposita en cada pozo de una placa de paredes opacas con 96 pozos. Pozos de control adicionales se configuran que contienen 50 µ? de medio de crecimiento sin células. 2. El anticuerpo conjugado GDM-MMAE, o un anticuerpo monoclonal de control conjugado con MMAE que no liga a GDM, se agrega a cada pozo en un volumen de 50 µ 1 y a diversas concentraciones en intervalo de 0.0001 a 100 //g/ml y las placas se incuban a 37 grados C y C02 al 5% por 3-5 días. 3. Las placas se equilibran a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. 4. Un volumen de reactivo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo de Promega Corp. igual al volumen del medio de cultivo celular presente en cada pozo presente en cada pozo se agrega y las placas se agitan por 2 minutos en un agitador orbital para inducir lisis de células. 5. Las placas se incuban a temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos para estabilizar la señal se luminiscencia. 6. Se registra luminiscencia en un luminometro con el programa Tropix Winglow y reporta como RLU = unidades de luminescencias relativa. Los resultados obtenidos del ensayo anteriormente descrito pueden demostrar que el anticuerpo GDM- MAE es capaz de inducir la muerte de células que expresan el polipéptido GDM correspondiente en una forma dependiente de anticuerpo. Esto es, ni GDM-MMAE ni el control conjugado con MMAE pueden inducir muerte significante de células PC3 sin transfectar a una concentración de anticuerpo de 1 µg/ml e inferior. A concentraciones de anticuerpo sobre 1 µg/ml, la cantidad de muerte celular PC3 sin transfectar puede incrementar linealmente con concentración de anticuerpo en una forma independiente de anticuerpo. Por lo tanto, aparecerá que la muerte células PC3 sin transfectar a concentraciones de anticuerpo sobre 1 µg/ l es un resultado no específico de los niveles crecientes de toxina MMAE presente en la mezcla de reacción y no es una función de la especificidad de enlace del anticuerpo empleado. Con respecto a células PC3-gD-MDP que expresan en forma estable el polipéptido GDM, sin embargo, mientas que el control conjugado MMAE induce muerte celular con un patrón que es idéntico a la capacidad del anticuerpo para exterminar células PC3 sin transfectar, el GDM-MMAE inducirá exterminio ' celular significante a concentraciones de anticuerpo significativamente por debajo de este nivel (por ejemplo tan bajo como 0.001 /¿g/ml) . De hecho, a una concentración de anticuerpo de 1 g/ml (el conde el anticuerpo de control conjugado MMAE no específico GDM no exhibe significante exterminio celular) , virtualmente todas las células PC3-gD- DP serán exterminadas por GDM-MMAE. Como tal, estos datos demostraran que anticuerpo monoclonal específico de GDM liga al polipéptido GDM como expresa en la superficie de células y es capaz de inducir la muerte de estas a las cuales se liga. EJEMPLO 8 : Ensayos de Exterminio Celular de Tumor In Vivo Para probar la eficacia de anticuerpos monoclonales polipéptido anti-GDM conjugados con toxina o no conjugados para la capacidad en inducir muerte de las células de tumor in vivo puede emplearse el siguiente protocolo . Se inocula un grupo de ratones desnudos atimicos con 5 x 106 de las células promotoras de tumor que expresan polipéptido GDM subcutáneamente en un flanco. Cuando los tumores alcanzan un volumen promedio de tumor de entre 100-200 mm3 , los ratones se agrupan igualmente en 5 grupos y se tratan como sigue: Grupo 1 - Vehículo de control PBS administrado una vez por semana por 4 semanas; Grupo 2 - anticuerpo de control no específico administrado a 1 mg/kg, una vez por semana por 4 semanas; Grupo 3 - anticuerpo de control no específico administrado a 3 mg/kg, una vez por semana por 4 semanas; Grupo 4 - anticuerpo polipéptido anti-GDM específico administrado a 1 mg/kg, una vez por semana por 4 semanas; Grupo 5 - anticuerpo polipéptido anti-GDM específico administrado a 3 mg/kg, una vez por semana por 4 semanas; Volumen de tumor promedio puede entonces determinarse en los ratones de cada grupo de tratamiento a intervalos periódicos y de eficacia de los anticuerpos se determina. EJEMPLO 9 : Uso de GDM como una sonda de hibridización El siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptido GDM como una sonda de hibridización para, es decir, diagnóstico de la presencia de un tumor en un mamífero. ADN que comprende la secuencia de codificación de polipéptido GDM maduro o de longitud integra, como se describe aquí también puede emplearse como una sonda para cribar ADNs homólogos (tales como aquellos que codifican variantes de origen natural de GDM) en biblioteca ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido humano. La hibridización y lavado de filtros que contiene ya sea ADNs de biblioteca se realiza bajo las siguientes condiciones de alta severidad. Hibridización de sonda derivada de GDM radio etiquetada GDM a los filtros se realiza en una solución de 50% de formamida, 5x SSC, 0.1% SDS, pirofosfato de sodio 0.1%, fosfato de sodio 50 mM, pH 6.8, solución Denhardt 2h, y sulfato dextrano 10% al a 42 grados C por 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0.1% SSC y 0.1% SDS a 42 grados C. ADNs que tiene una identidad de secuencia deseada con ADN que codifica polipéptido GDM de secuencia nativa de longitud integra, pueden ser identificados utilizando técnicas estándar conocidas en la especialidad . EJEMPLO 10: Expresión de GDM en E. coli Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de GDM por expresión recombinante en E. coli. La secuencia de ADN que codifica las secuencias polipéptido GDM precedentes se amplifica inicialmente utilizando cebadores PCR selectos. Los cebadores deberán contener sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión selecto. Una variedad de vectores de expresión puede emplearse. Un ejemplo de un vector conveniente es pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolívar et al., Gene , 2_:95 (1977)) que contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina . El vector se digiere con enzima de restricción y desfosforila . Las secuencias amplificadas por PCR después se ligan en el vector. El vector de preferencia incluirá secuencias que codifican para un gen de resistencia a antibiótico, un promotor trp, un líder polyhis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencias polyhis, y sitio de escisión enterocinasa) , la región de codificación GDM, terminado de transcripción lambda, y un gen argU. La mezcla de ligación después se utiliza para transformar una cepa E. coli selecta utilizando los métodos descritos en Sambrook et al., supra . Transformantes se identifican por su habilidad para desarrollar en placas LB y se eligen entonces colonias resistentes a antibiótico. ADN plásmido puede aislarse y confirmarse por análisis de restricción y secuenciado de ADN. Ciónos selectos pueden desarrollarse durante la noche en un medio de cultivo líquido tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo durante la noche puede emplearse subsecuentemente para inocular un cultivo a mayor escala. Las células después se desarrollan a una densidad óptica deseada, durante lo cual se activa el promotor de expresión. Después de cultivar las células por varias horas más, las células pueden cosecharse por centrifugación. El nodulo o precipitado celular obtenido por la centrifugación puede solubilizarse utilizando diversos agentes conocidos en la especialidad, y el polipéptido GDM solubilizado puede entonces purificarse utilizando una columna de quelado de metal bajo condiciones que permiten un firme enlace de la proteína. Las secuencias GDM polipéptido precedentes pueden expresarse en E. coli en una forma etiquetada poly-His, utilizando el procedimiento siguiente. El ADN que codifica GDM inicialmente se amplifica utilizando cebadores PCR selectos. Los cebadores contendrán sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión selecto, y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio de traducción eficiente y confiable, rápida purificación en columna de quelado de metal, y remoción proteolítica con enterocinasa . Las secuencias etiquetas poly-His amplificadas con PCR después se ligan en un vector de expresión, que se utiliza para transformar un anfitrión E. coli con base en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP(lacIq). Los transformantes primero se desarrollan en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30 grados C con agitación hasta que se alcanza un O.D.600 de 3-5. Los cultivos después se diluyen 50-100 veces en medio CRAP (preparado al mezclar 3.57 g (NH4)2S04, 0.71 g de citrato de sodio, $2H20, 1.07 g de KCl , 5.36 g de extracto de levadura Difco, 5.36 g de Sheffield hycase SF en 500 mL de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7.3, 0.55% (p/v) de glucosa y MgS04 7 mM) y desarrollan por aproximadamente 20-30 horas a 30 grados C con agitación. Las muestras se retiran para verificar la expresión por análisis SDS-PAGE, y el cultivo en volumen se centrifuga para precipitar las células. Los precipitados celulares se congelan hasta purificación y replegamiento . Pasta de E. coli de fermentación de 0.5 a 1 L (6-10 g de nodulos) se resuspende en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 , Tris 20 mM, amortiguador pH 8. Sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio se agregan para producir concentraciones finales de 0.1 M y 0.02 M, respectivamente, y la solución se agita durante la noche a 4 grados C. Esta etapa resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos cisteina bloqueados pro sulfitolización . La solución se centrifuga a 40,000 rpm en una ultracentrífuga Beckman por 30 min. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de amortiguador de columan quelato de metal (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7.4) y filtran a través de filtros 0.22 mieras para clarificar. El extracto clarificado se carga en una columna de quelato de metal Qiagen Ni-NTA 5 mi equilibrada en el amortiguador de columna de quelato de metal. La columna se lava con amortiguador adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, Utrol grade) , pH 7.4. La proteína se eluye con amortiguador que contiene imidazol 250 mM. Fracciones que contienen la proteína deseada se reúnen y almacenan a 4 grados C. La concentración de proteína se estima por su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado con base en su secuencia de amino ácidos. Las proteínas se pliegan al diluir la muestra lentamente en amortiguador de plegado recientemente preparado que consiste de: Tris 20 mM, pH 8.6, NaCl 0.3 M, urea 2.5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegamiento se eligen de manera tal que la concentración de proteína final está entre 50 a 100 microgramos/ml . La solución de replegamiento se agita ligeramente a 4 grados C por 12-36 horas. La reacción de replegamiento se neutraliza por la adición de TFA a una concentración final de 0.4% (pH de aproximadamente 3) . Antes de mayor purificación de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0.22 mieras y se agrega acetonitrilo a una concentración final de 2-10%. La proteína replegada se cromatografía en una columna de fase inversa Poros Rl/H utilizando un amortiguador móvil de TFA 0.1% con elusión con un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Alícuotas de fracciones con absorbancia A280 se analizan en geles SDS poliacrilamida y fracciones que contienen proteína replegada homogénea se reúnen. En general, las especies replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a las más bajas concentraciones de acetonitrilo ya que estas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de interacción con la resina de fase inversa. Especies agregadas usualmente se eluyen a superiores concentraciones de acetonitrilo. Además de resolver formas mal plegadas de proteínas de la forma deseada, la etapa de fase inversa también retira endotoxina de las muestras. Fracciones que contienen la proteína plegada deseada se reúnen y el acetonitrilo retirado utilizando una ligera corriente de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mM, pH 6.8 con cloruro de sodio 0.14 M y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el amortiguador de formulación y filtrado estériles. EJEMPLO 11: Expresión de polipéptido GDM en células de mamífero Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de polipéptido GDM por expresión recombinante en células de mamífero. El vector, pRK5 (ver EP 307,247, publicada en marzo 15, 1989), se emplea como el vector de expresión. Opcionalmente , ADN que codifica los polipéptidos GDM aquí descritos se liga en pRK5 con enzimas de restricción selectas para permitir inserción de este ADN utilizando métodos de ligación tal como describe en Sambrook et al., supra . El vector resultante se denomina GDM-DNA. En una modalidad, las células anfitrionas selectas pueden ser células 293. Células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se desarrollan a confluencia en placas de cultivo de tejido en medio tal como DMEM suplementado con suero bovino fetal y opcionalmente componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 ^g de ADN pRK5-GDM se mezclan con aproximadamente 1 µg de ADN que codifica el gen VA ARN [Thimmappaya et al., Cell , 3JL:543 (1982)] y disuelve en 500 µ? de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0.1 mM, CaCl2 0.227 M. A esta mezcla se agregan por gotas, 500 µ? de HEPES 50 mM (pH 7.35), NaCl 280 mM, NaP041.5 mM, y el precipitado se deja que se forme por 10 minutos a 25 grados C. El precipitado se suspende y agrega a las células 293 y deja que repose por aproximadamente cuatro horas a 37 grados C. El medio de cultivo se aspira y 2 mi de glicerol al 20% en PBS se agregan por 30 segundos. Las células 293 después se lavan con medio libre de suero, medio fresco se agrega y las células se incuban por aproximadamente 5 días. Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones , el medio de cultivo se retira y reemplaza con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 µ??/??? 35S-cisteína y 200 /zCi/ml de 35S-metionina. Después de una incubación de 12 horas, el medio acondicionado se recolecta, concentra en un filtro de centrifugado y carga en gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a película por un periodo de tiempo selecto para revelar la presencia de polipéptidos GDM. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden someterse a mayor incubación (en medio libre de suero) y el medio se prueba en bioensayos selectos. En una técnica alterna, ADN que codifica los polipéptidos GDM puede introducirse en células 293 en forma transitoria utilizando el método dextran sulfato descrito por Somparyrac et al., Proc . Nati. Acad. Sci . , 12:7575 (1981). Células 293 se desarrollan a densidad máxima en un matraz centrifugador y 700 /xg de ADN pRK5-GDM se agregan. Las células primero se concentran del matraz centrifugador mediante centrifugación y lavan con PBS . El precipitado ADN-dextrano se incuba en el precipitado celular por cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% por 90 segundos, lavan con medio de cultivo de tejido y re-introducen en el matraz centrifugador que contiene el medio de cultivo de tejido, 5 µg/ml de insulina bovina y 0.1 µg/ml de transferina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y filtra para retirar células y desechos. La muestra que contiene GDM expresado puede entonces concentrarse y purificarse por cualquier método selecto, tal como diálisis y/o cromatografía en columna. En otra modalidad, el polipéptido GDM puede expresarse en células CHO. El pRK5-GDM puede transíectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos tales como CaP04 o DEAE-dextrano . Como se describió anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio reemplazarse con medio de cultivo (solo) o medio que contiene una radioetiqueta tal como 35S-metionina . Después de determinar la presencia de GDM, el medio de cultivo puede ser reemplazo con medio libre de suero. De preferencia, los cultivos se incuban por aproximadamente 6 días, y después se cosecha el medio acondicionado. El medio que contiene el polipéptido GDM expresado puede entonces concentrarse y purificarse por cualquier método selecto. Polipéptido GDM etiquetado con epítopo también puede ser expresado en células CHO anfitrionas. La secuencia que codifica la porción GDM puede ser subclonada del vector pRK5. El inserto de subclon puede someterse a PCR para fusionar en cuadro con una etiqueta epítopo selecta tal como una etiqueta poly-his en un vector de expresión de Baculovirus. Este inserto GDM etiquetado poly-his puede entonces ser subclonado en un vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para selección de ciónos estables. Finalmente, las células CHO pueden ser transíectadas (como se describió anteriormente) con vector dirigido por SV40. El etiquetado puede ser realizado como se describió anteriormente, para verificar expresión. El medio de cultivo que contiene GDM etiquetado como poly-His expresado puede ser entonces concentrado y purificado por cualquier método selecto, tal como cromatografía de afinidad Ni2+-quelato . Polipéptido GDM también puede expresarse en células CHO y/o COS por un procedimiento de expresión transitorio o en células CHO por otro procedimiento de expresión estable.

Expresión estable en células CHO se realiza utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG ( inmunoadhesina) , en donde las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante IgGl que contiene la bisagra, dominios CH2 y CH2 y/o una forma poly-His etiquetada. Después de amplificación PCR, los ADNs respectivos se subclonan en un vector de expresión CHO utilizando técnicas estándar como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Vectores de expresión CHO se construyen para tener sitios de restricción compatibles 5= y 3= del ADN de interés para permitir el entre-mezclado conveniente de ADNc 1 s . El vector utiliza expresión en células CHO como se describe en Lucas et al., Nucí. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el promotor/mej orador temprano SV40 para desplazar la expresión del ADNc de interés y dihidrofolato reductasa (DHFR) . Expresión DHFR permite selección para mantenimiento estable del plásmido después de transfección . Doce microgramos del ADN plásmido deseado se introducen en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección comercialmente disponibles SUPERFECT7 (Quiagen) , DOSPER7 o FUGENE7 (Boehringer annheim) . Las células se desarrollan como se describe en Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 107 células se congelan en una ampolleta para mayor crecimiento y producción como se describe a continuación. Las ampolletas que contienen el ADN plásmido se descongelan al colocar en baño de agua y mezclan por torbellino. Los contenidos se transfieren por pipeta en un tubo de centrífuga que contiene 10 mLs de medio y centrifugan a 1000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 mL de medio selectivo (PS20 filtrado 0.2 Om con suero bovino fetal diafiltrado 0.2 Om al 5%) . Las células después se toman en alícuotas en un centrifugador de 100 mL que contiene 90 mL de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren a un centrifugador de 250 mL lleno con medio de crecimiento selectivo 150 mL e incuba a 37 grados C. Después de otros 2-3 días, centrifugadores de 250 mL, 500 mL y 2000 mL se siembran con 3 x 105 células/mL. El medio celular se intercambia con medio fresco por centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque cualquier medio CHO conveniente puede emplearse, un medio de producción descrito en la patente de los E.U.A. No. 5,122,469, otorgada en junio 16, 1992 puede ser empleado actualmente. Un centrifugador de producción de 3L se siembra a 1.2 x 106 células/mL. El día 0, se determina el pH de número de células. El día 1, el centrifugado se muestrea y se empieza el burbujeo con aire filtrado. El día 2, se muestrea el centrifugador, la temperatura cambia a 33 grados C, y 30 mL de 500 g/L de glucosa y 0.6 mL de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Emulsión Grado Medico Dow Corning 365) se toma. A través de la producción, el pH se ajusta según sea necesario para mantenerlo alrededor de 7.2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cayó por debajo de 70%, se cosecha el cultivo celular al centrifugar y filtrar a través de un filtro de 0.22 <J>m. El filtrado ya se almacena a 4 grados C o carga inmediatamente en columnas para purificación. Para las construcciones etiquetadas con poli-His, las proteínas se purifican utilizando una columna Ni-NTA (Qiagen) . Antes de purificación, se agrega imidazol al medio acondicionado a una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea y en una columna de Ni-NTA de 6 mi equilibrada en Hepes 20 mM, pH 7.4, amortiguador que contiene NaCl al 0.3 M e imidazol 5 mM a un gasto de flujo de 4-5 ml/minutos a 4 grados C. Después de cargar, la columna se lava con amortiguador de equilibrio adicional y la proteína se eluye con amortiguador de equilibrio que contiene imidazol 0.25 M. La proteína altamente purificada se desalifica subsecuentemente en un amortiguador de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl a 0.14 M y manitol al 4%, pH 6.8, con una columna G25 Superfine de 25 mi (Pharmacia) y almacenan a -80 grados C . Construcciones de inmunoadesina (que contiene Fe) se purifican del medio acondicionado como sigue. El medio acondicionado se bombea en una columna de Proteína A (Pharmacia) de 5 mi que se ha equilibrado con amortiguador fosfato de Na 20 mM, pH 6.8. Después de cargar, la columna se lava extensamente con amortiguador de equilibrio antes de elusión con ácido cítrico 100 mM, pH 3.5. La proteína eluida se neutraliza inmediatamente al recolectar fracciones de 1 mi en tubos que contienen 275 OL de amortiguador Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada subsecuentemente se desalifica en amortiguador de almacenamiento como se describió anteriormente para las proteínas etiquetadas por poli-His. La homogenidad se estima por geles SDS poliacrilamida y por secuenciado de aminoácido N-terminal por degradación Edman. EJEMPLO 12 : Expresión de GDM en Levadura El siguiente método describe expresión recombinante de polipeptido GDM en levadura. Primero, se construyen vectores de expresión de levadura para producción o secreción intracelular de las secuencias GDM precedentes del promotor ADH2/GAPDH. ADN que codifica estas secuencias GDM y el promotor se insertan en sitios de enzima de restricción convenientes en el plásmido selecto para dirigir expresión intracelular de GDM. Para secreción, ADN que codifica esta secuencias GDM puede clonarse en el plásmido selecto, junto con ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal GDM nativo u otro péptido de señal de mamífero, o, por ejemplo una secuencia líder/señal secretoria invertasa o factor alfa de levadura, y secuencias enlazadoras (si se requieren) para expresión de GDM. Células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, pueden ser entonces transformadas con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivados en medio de fermentación selecto. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden ser analizados por precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación por SDS-PAGE, seguido por tinción de los geles, con tinción de Azul Coomassie. GDM recombinante puede aislarse y purificarse subsecuentemente al retirar las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y después concentrar el medio utilizando filtros de cartuchos selectos. El concentrado que contiene GDM además puede purificarse utilizando resinas de cromatografía en columnas selectas. EJEMPLO 13 : Expresión de GDM en células de insecto infectadas con baculovirus. El siguiente método describe expresión recombinante de polipéptido GDM en células de insecto infectadas con baculovirus. La codificación de secuencia para la secuencia GDM precedente se fusiona corriente arriba de una etiqueta epitopo contenida dentro de un vector de expresión de vaculovirus. Estas etiquetas de epitomó??epítopo incluyen etiquetas poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (como regiones Fe de IgG) . Una variedad de plásmidos puede emplearse, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como pVL1393 (Novagen) . Brevemente, la secuencia que codifica la secuencia GDM precedente o la porción deseada de la secuencia de codificación de tal, por ejemplo la secuencia que codifica un dominio extracelular de una proteína de transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular, se amplifica por PCR con cebadores complementados en las regiones 5 ' y 31. El cebador 51 puede incorporar sitios de enzima de restricción de flanqueo (seleccionados) . El producto después se digiere con aquellas enzimas de restricción selectas y subclona en el vector de expresión. Baculovirus recombinantes se generan por co-transfección del plásmido anterior y ADN de virus BACULOGOLDR (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponible de GIBCO-BRL) . Después de 4-5 días de incubación a 28 grados C, los virus liberados se cosechan y utilizan para mayores amplificaciones. Infección viral y expresión de proteínas se realizan como se describe por O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors : A Laboratory Manual , Oxford: Oxford University Press (1994) . Polipéptido GDM etiquetado poli-His expresado puede entonces purificarse por ejemplo por cromatografía de afinidad Ni2+-quelato como sigue. Extractos se preparan de las células Sf9 infectadas con virus recombinante como se describe por Rupert et al., Nature , 362 : 175-179 (1993). Brevemente, se lavan células Sf9 resuspenden en amortiguador de sonicación (25 mL de Hepes, pH 7.9; MgCl2 12.5 mM; EDTA 0.1 mM; 10% glicerol; NP-40 al 0.1%; KC1 0.4 M) , y sónica dos veces por 20 segundos en hielo. Los sonicados se liberan por centrifugación y el sobrenadante se diluye 50 veces en amortiguador de carga (fosfato 50 m , NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7.8) y filtran a través de un filtro de <t>m. Una columna de Ni2+-NTA agarosa (comercialmente disponible de Qiagen) se prepara con un volumen de lecho de 5 mL, lava con 25 mL de agua y equilibra con 25 mL de amortiguador de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0.5 mL por minuto. La columna se lava a la línea base A2so con amortiguador de carga, en cuyo punto se inicia la recolección de fracción. A continuación, la columna se lava con amortiguador de lavado secundario (50 mM fosfato; NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6.0), que eluye proteína ligada no específicamente. Después de alcanzar de nuevo línea base A280 la columna se revela con un gradiente de Imidazol 0 a 500 mM en el amortiguador de lavado secundario. Fracciones de un mL se recolectan y analizan por SDS-PAGE y tinción de plata o transferencia Western con Ni2+-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen) . Fracciones que contienen el polipéptido GDM etiquetado con Hisio eluído se reúnen y la dializan contra el amortiguador de carga. En forma alterna, purificación del polipéptido GDM etiquetado con IgG (o etiquetado Fe) puede realizarse utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo cromatografía en columna de proteína A o proteína G. EJEMPLO 14: Purificación de Polipéptido GDM Utilizando Anticuerpos Específicos Polipéptidos GDM nativos o recombinantes pueden ser purificados por una variedad de técnicas estándar en la especialidad de purificación de proteínas. Por ejemplo, variantes pro-, maduras o pre-polipéptido de las secuencias GDM precedentes se purifican por cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para estas secuencias. En general, una columna de inmunoafinidad se construye por acoplamiento covalente del anticuerpo anti-GDM con una resina cromatográfica activada . Inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de suero inmune ya sea por precipitación con sulfato de amonio o por purificación en Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.) . Igualmente, se preparan anticuerpos monoclonales a partir de fluido ascitos de ratón por precipitación de sulfato de amonio o cromatografía en proteína A inmovilizada. Inmunoglobulina parcialmente purificada se conecta covalentemente a una resina cromatografía tal como SEPHAROSEMR activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación de las secuencias GDM precedentes al preparar una fracción de células que contienen éstas secuencia en una forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de toda la célula o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial por adición del detergente o por otros métodos bien conocidos en la especialidad. En forma alterna, polipéptido GDM soluble que contiene secuencia de señal puede secretarse en cantidad útil en el medio en el que se desarrollan las células. Una preparación que contiene polipéptido GDM soluble se pasa sobre la columna de inmunoafinidad y la columna se lava bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial de estas secuencias (por ejemplo amortiguadores de alta concentración iónica en la presencia de detergentes) . Después, la columna se eluye bajo condiciones que rompen el enlace entre el anticuerpo/substrato (por ejemplo un amortiguador de bajo pH tal como aproximadamente pH 2-3, o una alta concentración de un caótropo tal como urea o ión tiocinato) y se recolecta respectivamente GDM polipéptido.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar un tumor-glioma , que comprende: (a) medir la expresión de un conjunto de GDM en una muestra del tumor; (b) determinar la sub-clasificación, PN, Prolif o Mes del tumor; y (c) poner en contacto con al menos una cantidad efectiva del agente terapéutico con base en la sub-clasificación; en donde (I) tumores que exhiben una sub-clasificación Prolif se tratan con una terapia combinada que comprende contactar con cantidades efectivas de (a) un antagonista Akt y/o un antagonista Prolif y/o un agente anti-mitótico, y (b) un agente de diferenciación neural; (II) tumores que exhiben una sub-clasificación Mes, se tratan con una terapia combinada que comprende contactar con cantidades efectivas de (a) un antagonista Akt y/o Mes y/o un agente anti-antiangiogénico y (b) un agente de diferenciación neural; y (III) tumores que exhiben una sub-clasificación PN se tratan con una terapia combinada que comprende contactar con cantidades efectivas de: (1) un antagonista con PN; y/o (2) un agente de diferenciación neural; opcionalmente en combinación con uno o más de los siguientes: (3) un antagonista Akt; (4) un agente anti-mitóico y (5) un agente anti -angiogénco . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sub- clasificación se lleva a cabo al comparar el tumor a un conjunto de muestras de glioma utilizando agrupamiento j erárquico . 3. El método de conformidad con la 5 reivindicación 1, caracterizado porque la sub- clasificación se lleva a cabo al comparar el tumor con un conjunto de muestras utilizando agrupamiento K-media. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la subió clasificación se lleva a cabo al comparar el tumor a un conjunto de muestras utilizando un esquema de votación. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sub- clasificación se lleva a cabo al comparar la similaridad 15 de expresión de un conjunto de marcadores GDM entre el tumor y un conjunto de muestras de glioma previamente clasificadas . 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista PN 20 se elige del grupo que consiste de: los marcadores PN indicados en la Tabla A, excepto por DLL3 , Nog, Oligl, 01ig2, THR y ASCL1. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista 25 Prolif se elige del grupo que consiste de: antagonista de cualquiera de los marcadores Prolif indicados en la Tabla A. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista Mes se elige del grupo que consiste de: antagonistas de cualquiera de los marcadores Mes indicados en la Tabla A. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista Akt se elige del grupo que consiste de: antagonistas de aktl, akt2, akt3, antagonistas de dominio regulatorio o catalítico de PIK3 , PD1, FRAP , RPS6KB1 , SGK, EGFR, IGFR y activadores, estimuladores o restauradores de PTEN, INPP5D o INPPL1. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente antimitótico se elige del grupo que consiste de: temozolamida , BCNU, CCNU, lomustina, gliadel, etopósido, carmustina, ironotecan, topotecan, procarbazina , cisplatina, carboplatina , ciclofosfamida , vincristina, doxorubicina, dactinomicina, bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas , maitansinoides . 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente antiangiogénico se elige del grupo que consiste de: Antagonistas VEGF, anticuerpo anti-VEGF, antagonistas VEGFR1 y VEGFR2. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de diferenciación neuronal se elige del grupo que consiste de: MAP2, beta- tubulina, GAD65 y GAP43. Agentes de diferenciación neural ejemplares incluyen pero no están limitados a: ácido retinoico, ácido valproico y sus derivados (por ejemplo ásteres, sales, retinoides, retinatos, valproatos, etc.) ; hormona tiroides u otros agonistas de receptor de hormona tiroides; noggin; BDNF, NT 4/5 u otros agonistas del receptor NTRK2 ; agentes que aumentan la expresión de los factores de transcripción ASCL1, 0LIG1; agonistas dll3, antagonistas Notch 1, 2, 3 o 4, inhibidores de gama secretasa, incluyendo inhibidores de molécula pequeña de nicastrina, AphlA, AphlB , Psenl, Psen2 y PSE EN, antagonistas de ligando tipo delta (Dll)-l, ligando tipo delta (Dll)-4, antagonista dentado 1, antagonista dentado 2; agonista numb o agonista tipo numb. 13. Método para pronóstico y/o diagnóstico de glioma, que comprende: (a) medir la expresión de un conjunto de GDM; (b) determinar la sub-clasificación PN, Prolif o Mes del tumor; y (c) pronosticar y/o diagnosticar del resultado de la enfermedad; en donde una sub-clasificación de Prolíf o Mes es indicativa del más pobre pronóstico o tiempo de supervivencia recortado y una sub-clasificación de PN es indicativa de un mejor pronóstico o tiempo de supervivencia alargado. 14. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la sub-clasificación se lleva a cabo al comparar el tumor con un conjunto de muestras utilizando agrupamiento jerárquico. 15. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la sub-clasificación se lleva a cabo al comparar el tumor con un conjunto de muestras utilizando agrupamiento de k-medias. 16. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la subclasificación se lleva a cabo al comparar el tumor con un conjunto de muestras utilizando un esquema de votación. 17. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la sub-clasificación se lleva a cabo al comparar la similaridad de expresión de un conjunto de marcadores GDM entre el tumor y un conjunto de muestras de glioma previamente clasificadas . 18. Método para pronosticar y/o diagnosticar de glioma, caracterizado porque comprende: (a) medir la expresión de marcadores de tumor PTEN y DLL3 en una muestra de tumor, y (b) pronosticar y/o diagnosticar, con base en la expresión de los marcadores de tumor, en donde una superior expresión de ambos PTEN y DLL3 indica un mejor pronóstico o tiempo de supervivencia alargado, y un menor nivel de expresión de PTEN independientemente del nivel de expresión DLL3 , indica un peor pronóstico o tiempo de supervivencia recortado. 19. Un método para supervisar o diagnosticar glioma, que comprende comparar la firma de expresión de un conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM"= glioma determinative markers) , en al menos dos muestras de un paciente, que comprende las etapas de: (a) medir la expresión de GDM en una primer muestra de tumor en un primer punto en tiempo; (b) medir la expresión de GDM en una segunda muestra de tumor en un segundo punto en tiempo posterior; y (c) determinar la sub-clasificación PN, Prolif o Mes en la primera y segunda muestras; en donde una transición de la sub-clasificación PN, Prolif o Mes de la primera a la segunda muestras de tumor, es indicativa de una incrementada severidad o progresión del tumor . 20. Un método para inhibir el tamaño o crecimiento de un tumor-glioma que comprende: (a) medir la expresión de un conjunto de GDM en una muestra del tumor; (b) determinar la sub-clasificación PN, Prolif o Mes del tumor; y (c) poner en contacto con al menos una cantidad efectiva de agente terapéutico con base en la sub-clasificación; en donde (I) tumores que exhiben una sub-clasificación Prolif, se tratan con una terapia combinada que comprende contactar con cantidades efectivas de (a) un antagonista Akt y/o un antagonista Prolif y/o agente anti -mitotico , y (b) un agente de diferenciación neural ; (II) tumores que exhiben una sub-clasificación Mes se tratan con una terapia combinada que comprende contacto con cantidades efectivas de (a) un antagonista Akt y/o Mes y/o un agente antiantiogénico , y (b) un agente de diferenciación neural; y (III) tumores que exhiben una sub-clasificación PN se tratan con una terapia combinada que comprende contacto con cantidades efectivas de: (1) un antagonista PN; y/o (2) un agente de diferenciación neural; opcionalmente en combinación con uno o más de los siguientes: (3) un antagonista Akt; (4) un agente anti-mitótico y (5) un agente anti-angiogéico; y en donde los resultados es el tamaño o crecimiento reducido del tumor. 21. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque la sub-clasificación se lleva a cabo al comparar el tumor con un conjunto de muestras de glioma utilizando agrupamiento jerárquico. 22. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque la sub-clasificación se lleva a cabo al comparar el tumor con un conjunto de muestras de glioma utilizando agrupamiento por k-medias. 23. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque la sub-clasificación se lleva a cabo al comparar el tumor con un conjunto de muestras de glioma utilizando un esquema de votación. 24. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque la sub-clasificación se lleva a cabo al comparar la similaridad de expresión de un conjunto de marcadores GDM entre el tumor y un conjunto de muestras de glioma previamente clasificadas. 25. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el antagonista PN se elige del grupo que consiste de un antagonista de cualquiera de: los marcadores PN indicados en la Tabla A, excepto por DLL3 , Nog, Oligl, 0lig2, THR y ASCL1. 26. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el antagonista Prolif se elige del grupo que consiste de antagonistas de cualesquiera marcadores Prolif indicados en la Tabla A. 27. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el antagonista Mes se elige del grupo que consiste de antagonistas de cualesquiera marcadores Mes indicados en la Tabla A. 28. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el antagonista Akt se elige del grupo que consiste de antagonistas de aktl, akt2 , akt3 , antagonistas de dominio regulatorio o catalítico de PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1 , SGK, EGFR, IGFR, y activadores, estimuladores o restauradores de PTEN, INPP5D o INPPL1. 29. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el agente antiangiogénico se elige del grupo que consiste de antagonistas VEGF, anticuerpo anti-VEGF, antagonistas VEGFRl y VEGFR2. 30. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque al agente antimitótico se elige del grupo que consiste de: temozolamida , BC U, CCNU, lomustina, gliadel, etopósido, carmustina, ironotecan, topotecan, procarbazina, cisplatina, carboplatina , ciclofosfamida , vincristina, doxorubicina, dactinomicina, bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas , maitansinoides . 31. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el agente de diferenciación neural se elige del grupo que consiste de: MAP2 , beta-tubulina, GAD65 y GAP43. Agentes de diferenciación ejemplares incluyen pero no están limitados a ácido retinóico, ácido valpróico y sus derivados (por ejemplo, ésteres, sales, retinoides, retinatos, valproatos, etc.); hormona tiroides u otros agonistas de receptor de hormona tiroide, noggin; BDNF, NT 4/5 u otros agonistas del receptor NTRK2 ; agentes que aumentan la expresión de factores de transcripción ASCL1, 0LIG1; agonistas dll3, antagonistas Notch 1, 2, 3 ó 4, inhibidores de gama secretasa incluyendo inhibidor de molécula pequeña de nicastrina, AphlA, AphlB, Psenl, Psen2 y PSE EN, antagonista ligando tipo delta (Dll)-l, ligando tipo delta (Dll)-4, antagonista dentado 1, antagonista dentado 2; agonista numb o agonista tipo numb. 32. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el contacto con el antagonista y/o agente resulta en la muerte de la célula de tumor. 33. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el antagonista -PN, -Prolif o -Mes es (1) un anticuerpo anti-PN, anti-Prolif o anti-Mes, (2) un fragmento de enlace de antígeno anti-PN, anti-Prolif" o anti-Mes, (3) un oligopéptido de enlace -PN, -Prolif o -Mes, (4) un antagonista de molécula pequeña -PN, -Prolif o -Mes o (5) un oligonucleótido antisentido -PN, -Prolif o -Mes. 34. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el antagonista -PN, -Prolif o -Mes se elige del grupo que consiste de: (1) un anticuerpo anti-PN, anti-Prolif o anti- es, y (2) un fragmento de enlace de anticuerpo anti-PN, anti-Prolif o anti-Mes. 35. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo antagonista se elige del grupo que consiste de: anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado y anticuerpo de cadena sencilla. 36. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno se conjuga a un agente inhibitorio de crecimiento o agente citotóxico. 37. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque al agente inhibitorio de crecimiento o agente citotóxico se elige del grupo que consiste de: maitansinoide , calicheamicina , antibiótico, isótopo radioactivo y enzima nucleolítica . 38. Método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor-glioma, en donde el método comprende: (a) medir la expresión de un conjunto de GDM en una muestra del tumor; (b) determinar la sub-clasificación, PN, Prolif o Mes del tumor; y (c) poner en contacto con al menos una cantidad efectiva de agente terapéutico con base en la sub-clasificación; en donde (I) tumores que exhiben una sub-clasificación Prolif se tratan con una terapia combinada que comprende administrar a un mamífero, una cantidad terapéuticamente efectiva de (a) un antagonista Akt y/o un antagonista Prolif y/o un agente antimitótico , (b) un agente de diferenciación neural ; (II) tumores que exhiben una sub-clasificación Mes, se tratan con una terapia combinada que comprende contactar con cantidades efectivas de (a) un antagonista Akt y/o Mes y/o agente antiangiogénico, y (b) un agente de diferenciación neural; y (III) tumores que exhiben una sub-clasificación PN se tratan con una terapia combinada que comprende contactar con cantidades efectivas de: (1) un antagonista PN; y/o (2) un agente de diferenciación neural; opcionalmente en combinación con uno o más de los siguientes: (3) un antagonista Akt; (4) un agente antimitótico (5) un agente antiangiogénico; y en donde el resultado es el tamaño reducido o crecimiento del tumor. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la administración del antagonista o agente resulta en la muerte del tumor-glioma . 40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el antagonista o agente es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de enlace anti-antígeno, un oligopéptido, un agonista de molécula pequeña o un oligonucleotido antisentido. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo antagonista se elige del grupo que consiste de: anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado y anticuerpo de cadena sencilla. 42. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno se conjuga con un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico. 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico se elige del grupo que consiste de: maitansinoide , calicheamicina, antibiótico, isótopo radioactivo y enzima nucleolítica . 44. Un método para determinar el nivel de expresión de marcadores determinantes de glioma ("GDM= Glioma Determinative Markers") -PN, -Prolif o -Mes en una muestra, en donde el método comprende exponer la muestra a agentes de enlace -PN, -Prolif o -Mes y determinar la cantidad de enlace de cada uno de la muestra, en donde la cantidad de enlace es significativa del nivel de expresión del respectivo GDM -PN, -Prolif o -Mes en la muestra . 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde el agente de enlace -PN, Prolif o -Mes se elige del grupo que consiste de: anticuerpo anti-PN, -Prolif o -Mes; fragmento de enlace -PN, -Prolif o -Mes; oligopéptido -PN, -Prolif o -Mes, agonista de molécula pequeña-PN, -Prolif o -Mes y oligonucleótido antisentido -PN, -Prolif o -Mes. 46. El método de conformidad con la reivindicación 44, el anticuerpo anti- PN, anti- Prolif o anti -Mes se elige del grupo que consiste de anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado y anticuerpo de cadena sencilla. 47. El método de conformidad con la reivindicación 45, el agente de enlace -PN, -Prolif o -Mes es etiquetado en forma detectable. 48. Un método para pronóstico del tiempo de supervivencia en un mamífero que tiene un tumor-glioma , en donde el método se caracteriza porque comprende: a) retirar una muestra de prueba del tumor, b) medir el nivel de expresión de PTEN y DLL3 en la muestra de prueba y en un conjunto de no menos de treinta (30) gliomas de alto grado para el cual se conocen los tiempos de supervivencia del paciente, en donde un nivel superior de expresión tanto de PTEN como de DLL3 en la muestra de prueba es indicativo de una posibilidad estadísticamente elevada de tiempo de supervivencia mayor que la mediana de la población muestra de referencia y un nivel inferior de expresión ya sea de PTEN o DLL3 en la muestra de prueba es indicativo de una posibilidad estadísticamente elevada de tiempo de supervivencia menor que la mediana de la población de muestra de referencia. 49. Método para diagnóstico de la severidad de un tumor-glioma en un mamífero, en donde el método comprende: (a) poner en contacto una muestra de prueba que comprende un tejido obtenido del mamífero con: (i) un primer reactivo que es un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña que liga a un polipéptido PTEN, y (ii) un segundo reactivo que es un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña que liga a un polipéptido DLL3 ; (b) medir la cantidad de formación de complejo entre el primer y segundo reactivos con los polipéptidos PTEN y DLL3 en la muestra de prueba respectivamente, en donde la formación de alta cantidad de ambos complejos PTEN y DLL3 es indicativa de un tumor ligero y la formación de una baja cantidad de formación de complejo PTEN o DLL3 es indicativa de un tumor severo. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el primer y segundo reactivos se etiquetan en forma detectable. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el primer y/o segundo reactivos se conectan a un soporte sólido. 52. Un uso de: (a) un polipéptido GDM -PN, -Prolif o -Mes, o (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica (a) , en la preparación de un medicamento útil para (i) el tratamiento terapéutico o (ii) detección-diagnóstico de un tumor-glioma. 53. El uso de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el polipéptido GDM es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo de enlace GDM, un oligopéptido de enlace GDM, un antagonista de molécula pequeña GDM o un oligonucleótido antisentido GDM. 54. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 o 53, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de cadena sencilla. 55. Método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor-glioma, en donde el método comprende contactar con cantidades efectivas de un agente de diferenciación neural ; en combinación con uno o más de los siguientes: (1) un antagonista Akt ; (2) un agente antimitótico y (3) un agente antiangiogénico ; y en donde el resultado es el reducido tamaño o crecimiento del tumor .