CN115372604A - 一种用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物及其应用。本发明通过试验证明肿瘤免疫治疗与肿瘤患者血清元素含量之间存在显著关系，血清微量元素(如Fe、Mn、Mo)水平对免疫治疗的变化较PD‑1表达更为敏感，可以对免疫治疗疗效提前做出更精确预测，单独使用一种元素或联合多种元素(如Fe/Mn、Fe/Mn/Mo)具有更高的敏感性和特异性，所以血清微量元素水平由于其检测速度快，费用更低，创伤性更小或可成为监测免疫治疗疗效的指标之一，从而有助于进一步精确筛选免疫治疗优势人群。因此血清微量元素预测并监测免疫检查点抑制剂疗效具有良好的实际应用之价值。

Description

一种用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

近年来，靶向程序性死亡受体1(programmed cell death 1，PD-1)/程序性死亡受体配体1(programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)通路的免疫检查点抑制剂成为肿瘤治疗领域的一大热点，主要是通过激活免疫系统并增强其固有的癌症治疗能力来实现抗肿瘤治疗，由于其抗肿瘤的疗效持久、适用性广，目前已成为有良好发展前景和治疗价值的肿瘤免疫治疗策略。PD-1/PD-L1单抗已成为包括恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌等在内的多种恶性肿瘤的标准治疗方法。虽然PD-1/PD-L1单抗在临床抗肿瘤应用中取得了可喜的成果，但并非所有患者均可从治疗中获益，接受免疫检查点抑制剂单药治疗的患者总体客观缓解率(objective responserate，ORR)为10％-30％，总体有效率偏低，且不能预估免疫相关不良反应的发生及严重程度，这些限制了免疫检查点抑制剂的临床应用。因此，开发预测免疫治疗疗效的生物标志物可以筛选潜在的临床获益人群，从而在临床实践中指导免疫药物的合理应用。

PD-L1表达水平作为候选的免疫疗效预测生物标志物之一，在临床上应用较为广泛。KEYNOTE-001、CheckMate-012等研究证实PD-L1高表达(PD-L1TPS>50％)患者获益明显。但临床实践中发现，PD-L1高表达的患者并不能全部获益，在CheckMate-026研究中PD-L1低表达甚至阴性患者也能从免疫治疗中获益。而且PD-L1的表达存在时空异质性，伴随不同治疗而发生变化。因此，PD-L1表达预测免疫疗效已经不能满足当今精准医疗的要求。肿瘤突变负荷(TMB)是另一个有潜力的疗效预测标志物。CheckMate-227证明在TMB高表达(≥10muts/Mb)的NSCLC患者中可获得更好的PFS。但是TMB在临床应用中有较大限性，包括在晚期肿瘤患者中难以获取TMB检测所需的较为大量的肿瘤组织，并且TMB检测目前尚缺乏统一检测标准，同时检测费用高昂。除此之外，类似于驱动基因突变状态、肠道菌群、外泌体等新兴疗效预测标志物也因检测费用昂贵、周期长、预测效能不佳而无满足临床疗效预测需要。因此探索开发有效的免疫治疗生物标志物具有较高的临床意义和应用价值，也是免疫治疗领域的研究热点。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物及其应用，本发明通过检测免疫治疗肿瘤患者体内微量元素水平变化，开发可能的疗效预测标志物模型，进一步精确筛选免疫治疗优势人群，最终希望提高免疫检查点抑制剂的疗效，改善恶性肿瘤患者的预后。基于上述研究成果，从而完成本发明。

为了实现上述技术目的，本发明的技术方案为：

本发明的第一个方面，提供一种用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物，所述标志物包括Fe、Mn、Mo中的任意一种或多种；

其中，所述免疫治疗具体为免疫检查点抑制剂治疗；

所述标志物选自受试者血液；更具体的，选自受试者血清。

本发明的第二个方面，提供检测上述标志物的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a2)中的至少一种：a1)评估肿瘤患者的临床预后；a2)评价肿瘤患者的免疫治疗效果。

本发明的第三个方面，提供一种系统，所述系统包括：

i)分析模块，所述分析模块用于确定受试者的待测样品中选自上述标志物表达水平，以及；

ii)评估模块，所述评估模块包含：根据i)中确定的所述标志物表达水平判断所述受试者的免疫治疗情况和/或临床预后情况。

本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，包括用于检测上述标志物的物质；所述试剂盒具有如下a1)至a2)中至少一种功能：a1)评估肿瘤患者的临床预后；a2)评价肿瘤患者的免疫治疗效果。

本发明的第五个方面，提供一种用于评估肿瘤患者的临床预后和/或肿瘤患者免疫治疗效果的方法，所述方法包括：检测受试者血清中上述标志物含量。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案通过试验证明肿瘤免疫治疗与肿瘤患者血清元素含量之间存在显著关系，血清微量元素(如Fe、Mn、Mo)水平对免疫治疗的变化早于临床影像学，可以对免疫治疗疗效提前做出预测，而由于其检测速度快，费用更低，创伤性更小或可成为监测免疫治疗疗效的指标之一，从而有助于进一步精确筛选免疫治疗优势人群，提高免疫检查点抑制剂的疗效，改善恶性肿瘤患者的预后，因此具有良好的实际应用之价值。

说明书附图

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中两组患者(进展组和疗效组)数据散点图和微量元素ROC曲线图；其中，a-c分别为Fe、Mn、Mo中两组患者的数据分布图；d-j分别为Fe、Mn、Mo以及Fe/Mn、Fe/Mo、Mn/Mo两两联合以及Fe/Mn/Mo三者联合ROC曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。

在原理上，可以通过应用标准统计学方法基于给定标志物的平均值或中值来对本发明所指定的对象组或群组计算参考量。特别地，例如旨在或不旨在判断事件的方法的测试的精确度最好由其接受者操作特征(receiver-operating characteristic，ROC)来描述(尤其参见Zweig 1993，Clin.Chem.39：561-577)。ROC图是由在所观察到的整个数据范围上不断改变判定阈值获得的所有灵敏度相对于特异性对的图。诊断方法的临床表现取决于其精确度，即其将对象正确地分配到某种预后或诊断的能力。ROC图通过在适于区分的完整阈值范围将灵敏度相对于1-特异性绘图来表示两个分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度或真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性数和假阴性测试结果数之和的比率。这在疾病或病症的存在下也被称为阳性。其单独地由受影响的亚组计算。在x轴上是假阳性分数或1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性数和假阳性结果数之和的比率。其是特异性的指数，并且完全由未受影响的亚组计算。由于真和假阳性分数是完全单独地进行计算，因此通过使用来自两个不同亚组的测试结果，ROC图独立于群组中事件的普遍性。ROC图上的每个点表示对应于特定判定阈值的灵敏度/-特异性对。具有完美辨别(在两个结果分布中没有重叠)的测试具有经过左上角的ROC图，其中真阳性分数为1.0或100％(完美灵敏度)，假阳性分数为0(完美特异性)。没有辨别(两组结果的分布相同)的测试的理论图为从左下角到右上角的45°对角线。大多数图落在这两个极端之间。如果ROC图完全落在45°对角线之下，则这容易地通过将“阳性”标准从“大于”反转为“小于”来矫正，反之亦然。定性地，图越靠近左上角，测试的整体精确度就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线推导出阈值，允许分别用灵敏度和特异性的适当平衡诊断或预测给定事件。因此，可以优选地通过如上所述建立用于所述群组的ROC并从其推导出阈值量来生成用于本发明方法的参考。根据诊断方法的期望灵敏度和特异性，ROC图允许推导出合适的阈值。优选地，参考量位于这样的值范围内，其表示至少75％的灵敏度和至少45％的特异性、或者至少80％的灵敏度和至少40％的特异性、或者至少85％的灵敏度和至少33％的特异性、或者至少90％的灵敏度和至少25％的特异性。

术语“试剂盒”是指优选地单独提供或提供在单个容器内的上述组分的集合。容器还优选地包含有用于实施本发明方法的说明。在本说明书中已经给出了试剂盒的这些组分的实例及其使用方法。优选地，试剂盒包含在即用型制剂中的上述组分。优选地，试剂盒可另外地包括说明书，例如用于调节组分(例如，检测剂的浓度)以及用于解释关于通过本发明方法所提供诊断的任何测定的结果的用户手册。特别地，这样的手册可以包括用于将确定基因产物的量分配至诊断类型的信息。细节见于本说明书的别处。此外，这样的用户手册可以提供关于正确地使用试剂盒组分用于确定相应生物标志物的量的说明。用户手册可以以纸质或电子形式提供(例如，存储在CD或CD ROM上)。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。

等离子体质谱法(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry,ICP-MS)检测血清元素，具有检测线性范围宽，检出限低，灵敏度高，检测速度快，可同时检测多种元素，ICP-MS是元素检测金标准。可以选用任意基于等离子体质谱法制备得到的装置，如等离子体质谱仪。

如前所述，现有免疫疗效预测生物标志物普遍存在检测费用昂贵、周期长、预测效能不佳而无满足临床疗效预测需要。

发明人通过研究发现，元素在体内按含量不同分为常量元素和微量元素，微量元素体内含量虽低却在酶活性、氧化还原过程和基因表达等方面发挥着特殊的调节作用，而且是作为免疫应答的调节因子，可以直接作用于免疫系统的细胞和影响免疫反应。比如铁能够通过诱导活性氧中间体的产生来激活NF-κB通路，而过量的铁则会抑制信号转导与转录激活因子1等转录因子的活性。除此之外，锰作为人体的一种必需微量元素，对人体免疫功能及肿瘤的发生发展也发挥了重要作用。锰离子向胞外释放可以激活cGAS-STING通路，增强免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的疗效。同时锰离子可以促进DC细胞的成熟和肿瘤特异性抗原的提呈，并增强CD8⁺T细胞的分化和激活。因此，鉴于元素对体内免疫调控的重要影响，为我们提示监测免疫治疗患者治疗期间体内微量元素水平变化与预后可能存在重要意义。经过进一步试验证明，较临床最常用的PD-L1表达水平预测免疫疗效相比，本发明使用的微量元素(如Fe、Mn、Mo)预测免疫疗效有更高的特异性及灵敏度。

有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物，所述标志物包括Fe、Mn、Mo中的任意一种或多种；优选为Fe。

其中，所述免疫治疗具体为免疫检查点抑制剂的治疗；

所述标志物选自受试者血液；更具体的，选自受试者血清。

所述标志物还可以包括其他现有已知的用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物，如PD-L1表达水平。

本发明的又一具体实施方式中，提供检测上述标志物的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a2)中的至少一种：a1)评估肿瘤患者的临床预后；a2)评价肿瘤患者的免疫治疗效果。

所述产品可以为试剂盒。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种系统，所述系统包括：

i)分析模块，所述分析模块用于确定受试者的待测样品中选自上述标志物表达水平，以及；

ii)评估模块，所述评估模块包含：根据i)中确定的所述标志物表达水平判断所述受试者的免疫治疗情况和/或临床预后情况。

本发明的又一具体实施方式中，所述系统还包括结果输出模块，所述结果输出模块用于输出评估模块分析得到的结果。

本发明的又一具体实施方式中，所述受试者为接受免疫治疗的肿瘤患者，所述免疫治疗具体为免疫检查点抑制剂治疗；

本发明的又一具体实施方式中，所述待测样品为受试者血液，进一步为受试者血清。

所述分析模块中包含检测装置，所述检测装置可以为检测上述标志物的任意装置，如等离子体质谱仪。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种试剂盒，包括用于检测上述标志物的物质；所述试剂盒具有如下a1)至a2)中至少一种功能：a1)评估肿瘤患者的临床预后；a2)评价肿瘤患者的免疫治疗效果。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于评估肿瘤患者的临床预后和/或肿瘤患者免疫治疗效果的方法，所述方法包括：检测受试者血清中上述标志物含量。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例

研究方法

研究初始纳入2021.06.01-2022.02.31就诊于山东省立医院肿瘤中心使用免疫检查点抑制剂的肿瘤患者400名，收集患者临床基本信息，2021.06.01-2021.11.31就诊肿瘤患者为预测组，2021.12.01-2022.2.31期间肿瘤患者为验证组。采用实体瘤治疗疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumors,RECIST)肿瘤测量：肿瘤最长径的总和，肿瘤以(总)长度来测量“CR：全部肿瘤病灶消失&并维持4周；PR：缩小30％或以上，维持4周；SD-：缩小但不足30％；SD+：增加但不足20％；PD：病灶增加20％，病灶增加前非PR,SD。”并在每次免疫治疗前收集患者血样(使用BD公司一次性真空采血管采集，经3700r/min离心10分钟后取上层血清，冻存于-80℃超低温冰箱)。经6个月随访后根据不同疗效纳入PR及SD-患者33人(疗效组)，PD及SD+患者30人(进展组)。采用稀释法进行血清样本前处理，应用电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)仪(仪器型号：安捷伦7900)检测19种微量元素(Li、Mg、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Sr、Mo、Cd、Hg、Tl、Pb、Bi)含量，使用GraphPad Prism 9、SPSS 26.0对结果进行统计学分析。

研究结果

对全部入组患者的基线信息进行统计，包括患者年龄、性别、疾病分期、病理类型、PD-L1表达情况。如表1所示：

表1

表1：患者年龄、性别、分期、病理类型均与免疫治疗疗效无统计学意义；PD-L1表达检测率太低无法显示统计学差异。

预测组：

分别对两组患者的Fe(PD/SD+：p＝0.1205＜0.05、PR/SD-：p＝0.0001＜0.05)、Mn(PD/SD+：0.0085、PR/SD-：p＝0.2375＞0.05)、Mo(PD/SD+：<0.0001＜0.05、PD/SD+：p＝0.0075＜0.05)进行正态性检验。由于Fe、Mn、Mo数据中存在非正态性数据，因此对Fe、Mn、Mo全部使用非参数检验其差异性，在所测的19种微量元素中，Fe、Mn、Mo三种元素含量差别在两组间具有统计学意义(Fe：p＜0.0001、Mn：p＝0.0309＜0.05、Mo：p＝0.0434＜0.05)(见图1，a-c)。对Fe、Mn、Mo分别绘制ROC曲线，两两组合和三者组合绘制联合ROC曲线(见图1，d-j)。曲线下面积分别为：

Fe(曲线下面积：0.7956，灵敏度：91.18％、95％CI：77.04％to 96.95％，特异性：56.67％、95％CI：39.20％to 72.62％)、Mn(曲线下面积：0.6569，灵敏度：70.59％、95％CI：53.83％to 83.17％，特异性：66.67％、95％CI：48.78％to 80.77％)、Mo(曲线下面积：0.6471，灵敏度：73.53％、95％CI：56.88％to 85.40％，特异性：53.33％、95％CI：36.14％to 69.77％)、Fe+Mn(曲线下面积：0.8294，灵敏度：91.18％、95％CI：77.04％to 96.95％，特异性：60％、95％CI：42.32％to 75.41％)、Fe+Mo(曲线下面积：0.8108，灵敏度：64.71％、95％CI：47.91％to 78.51％，特异性：83.33％、95％CI：66.44％to 92.66％)、Mn+Mo(曲线下面积：0.7167，灵敏度：50％、95％CI：34.07％to 65.93％，特异性：86.67、95％CI：70.32％to 94.69％)、Fe+Mn+Mo(曲线下面积：0.8412，灵敏度：64.71、95％CI：47.91％to78.51％，特异性：93.33、95％CI：78.68％to 98.82％)。Cut off分别值为：Fe>672μg/L、Mn>1.779μg/L、Mo>1.035μg/L(见表1，图1，d-f)。任意一项大于其cut off值可以认为能从免疫治疗中获益。使用纳入患者的PD-L1表达水平预测免疫疗效，灵敏度及特异度分别为50％、60％。较临床最常用的PD-L1表达水平预测免疫疗效相比，本研究使用的微量元素预测免疫疗效有更高的特异性及灵敏度。

表2

表2：表格列出PD-L1表达的灵敏度与特异性(肿瘤细胞PD-L1的表达属于半定量数据无法绘制ROC曲线)分别与Fe、Mn、Mo、Fe/Mn、Fe/Mo、Mn/Mo、Fe/Mn/Mo比较，可以发现Fe、Fe/Mn组具有最大的灵敏度，且同时特异性较好；而Fe/Mn/Mo组具有最高的特异性。

验证组：

选取与预测组无重复的肿瘤患者共30名为验证组。其中进展组12名患者，疗效组18名患者。验证结果如表3所示：

表3

综上，本发明通过试验证明肿瘤免疫治疗与肿瘤患者血清元素含量之间存在显著关系，血清微量元素(如Fe、Mn、Mo)水平对免疫治疗的变化较PD-1表达更为敏感，可以对免疫治疗疗效提前做出更精确预测，单独使用一种元素(Fe)或联合多种元素(如Fe/Mn、Fe/Mn/Mo)具有更高的敏感性和特异性，同时，PD-1表达由于受到样本创伤性限制无法重复检测而作为动态监测指标，所以血清微量元素水平由于其检测速度快，费用更低，创伤性更小或可成为监测免疫治疗疗效的指标之一，从而有助于进一步精确筛选免疫治疗优势人群。应用微量元素(如Fe、Mn)与免疫检查点抑制剂联合治疗或能提高免疫检查点抑制剂的疗效。在监测血清微量元素水平变化后及时调整或更换治疗方案从而改善恶性肿瘤患者的预后。鉴于以上所述，认为血清微量元素预测并监测免疫检查点抑制剂疗效具有良好的实际应用之价值。

应注意的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实施例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物，其特征在于，所述标志物包括Fe、Mn、Mo中的任意一种或多种。

2.如权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述免疫治疗为免疫检查点抑制剂治疗；

所述标志物选自受试者血液；优选的，选自受试者血清。

3.如权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述标志物还包括其他现有已知的用于预测肿瘤患者免疫治疗疗效的标志物。

4.检测权利要求1-3任意一项所述标志物的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a2)中的至少一种：a1)评估肿瘤患者的临床预后；a2)评价肿瘤患者的免疫治疗效果。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述产品为检测试剂盒。

6.一种系统，其特征在于，所述系统包括：

i)分析模块，所述分析模块用于确定受试者的待测样品中选自权利要求1-3任一项所述标志物表达水平，以及；

ii)评估模块，所述评估模块用于根据i)中确定的所述标志物表达水平判断所述受试者的免疫治疗情况和/或临床预后情况。

7.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述系统还包括结果输出模块，所述结果输出模块用于输出评估模块分析得到的结果。

8.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述受试者为接受免疫治疗的肿瘤患者，所述免疫治疗具体为免疫检查点抑制剂治疗；

所述待测样品为受试者血液，进一步为受试者血清。

9.一种试剂盒，其特征在于，包括用于检测权利要求1-3任一项所述标志物的物质；所述试剂盒具有如下a1)至a2)中至少一种功能：a1)评估肿瘤患者的临床预后；a2)评价肿瘤患者的免疫治疗效果。

10.一种用于评估肿瘤患者的临床预后和/或肿瘤患者免疫治疗效果的方法，其特征在于，所述方法包括：检测受试者血清中权利要求1-3中任一项所述标志物的含量。

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