MX2008012013A

MX2008012013A - Tratamiento con anticuerpo antigeno de celulas neoplasicas.

Info

Publication number: MX2008012013A
Application number: MX2008012013A
Authority: MX
Inventors: Mary J Janatpour; Guoying K Yu
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2007-03-22
Publication date: 2008-10-03
Also published as: EP2389949A1; CA2647107A1; EP2389951A1; MA30346B1; EP2389947A1; JP2009531031A; IL194137A0; US20110135570A1; CN101437536A; EP2389948A1; EP2004221A2; AU2007227224A1; EP2389950A1; WO2007109376A3; ZA200808128B; WO2007109376A9; RU2008141912A; NO20084479L; KR20080110810A; WO2007109376A2

Abstract

Se describen los métodos de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cáncer donde el cáncer expresa un antígeno de célula neoplásica que es elevado con relación al tejido adyacente normal, al administrar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se enlaza a ese antígeno de célula neoplásica. Los métodos involucran el uso de anticuerpos que se enlazan a los antígenos de células neoplásicas KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5.

Description

TRATAMIENTO CON ANTICUERPO ANTIGENO DE CELULAS NEOPLASICAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere en general a los agonistas o antagonistas antigeno de células neoplásicas, incluyendo anticuerpos humanizados ant icanceriggenos y los métodos de diagnóstico y/o tratamiento para utilizar estos anticuerpos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION A pesar de los avances significativos en el desarrollo de tratamientos anticancerigenos , el cáncer sigue siendo la segunda causa principal de muerte en la población general (22.8% en el 2002, estadísticas más recientemente disponibles) . De hecho, se estima que un varón Estadounidense tiene una probabilidad 1 en 2 de desarrollar alguna forma de cáncer en su vida, mientras que una mujer Estadounidense tiene una probabilidad de 1 en 3 (de www.cancer.org) . Las terapias para el cáncer más convencionales actúan al matar a las células que proliferan activamente, y como resultado son a menudo no específicas y pueden dañar los tejidos saludables o conducir a toxicidades sistémicas. Un procedimiento alternativo busca identificar y explotar los marcadores expresados por las células neoplásicas en un esfuerzo para diferenciar las células Ref.: 196533 cancerígenas objetivo de las células saludables normales en el cuerpo. Las moléculas anticuerpo agonistas/antagonistas pueden ser desarrollados, los cuales actúan como socios de enlace de esos marcadores neoplásicas y luego actúan ya sea directamente sobre las células neoplásicas misma o inducen una respuesta inmunológica contra esas células cancerígenas, o distribuyen selectivamente cierto tipo de carga terapéutica (revisión, ver Houshmand and Zlotnik (2003) Current Opinión in Cell Biology 15 ( 5 ) : 6 0-4 ) . Existen varios tratamientos de anticuerpo anticancerígeno que están ya sea probadas para el uso terapéutico o de diagnóstico, o bien están bajo desarrollo pre-clínico y clínico. Los anticuerpos terapéuticos aprobados anticancerígeno actualmente disponibles incluyen Alemtuzumab (Campath) para la leucemia linfocítica crónica (CLL) (ILEX Oncology and Schering AG) , Rituximab (Rituxan) para el linfoma no Hodgkin (NHL) (IDEC and Hoffmann-LaRoche ) , y Trastuzumab (Herceptina) para el cáncer de mama (Genentech and Hof fmann-LaRoche ) . Unos pocos ejemplos de moléculas que están actualmente sufriendo pruebas clínicas incluyen el anticuerpo huN901-DMl para el cáncer pulmonar de células pequeñas (Immunogen) , Bivatuzumab mertansina (MLN2704) para el cáncer de próstata (Millennium) , y Pertuzumab (Omnitarg) para el cáncer de próstata, ovario y mama (Genentech) . (Ver revisión: Krauss (2003) Mol. Biotechnol 25(1) : 1-17) . En general, estos anticuerpos se dirigen a proteínas específicas encontradas sobre la superficie de las células neoplásicas y funcionan ya sea mediante la promoción de una respuesta inmunógena de cierto tipo contra la célula neoplásica (por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) ) , o los anticuerpos distribuyen entidades citotóxicas conjugadas a la célula objetivo después de la interacción el anticuerpo con el marcador de la célula neoplásica. A pesar del incremento en las terapéuticas con anticuerpos anticancerígenos que han sido aprobadas, sigue existiendo una necesidad significativa no cumplida en esta área. Algunas de las terapéuticas aprobadas se sabe que tienen toxicidades asociadas significativas. Muchas de las regiones adversas, a la interacción no específica y no deseada de los anticuerpos terapéuticos con tejidos saludables no neoplásicas. Además, no todos los pacientes responden al grado deseado utilizando las terapéuticas con anticuerpo actualmente aprobadas. De este modo, el desarrollo de tratamientos que se dirigen a los antígenos de las células neoplásicas con mayor selectividad para las células cancerígenas, podrían representar un avance significativo en el área de las tratamientos contra el cáncer Cuando se selecciona marcadores de células neoplásicas para utilizarse en el desarrollo de los anticuerpos anticancerígenos, el marcador más deseable sería uno que es abundante y homogéneamente expresado únicamente sobre las células cancerígenas en la mayoría de los pacientes para cada tipo neoplásica, y no es expresado en ningún otro tejido. Desafortunadamente, los marcadores que muestran este nivel de especificidad son pocos, y de ese modo, los marcadores que muestran una cantidad aceptable de una diferencial de expresión entre los tejidos saludables y los tejidos cancerígenos específicos, deben ser explotados. Por ejemplo, las proteínas que reconocen las terapéuticas con anticuerpo actualmente aprobadas, incluyen CD52 (Campath) , CD20 (Rituxan, US5736137) , Zevalin, Bexxar) , HER2 (Herceptin, US5821337) , EGFR (Erbitux) y VEGF (Avastatin) . Muchos de estos marcadores celulares son expresados en tejidos saludables así como en células cancerígenas, pero a menudo son más altamente expresadas en el cáncer cuando se comparan en el tejido normal, (ver Flynn and Byrd (2000) Current Opinión in Oncology 12(6) : 574) . Estas consideraciones de especificidad de tejido son un asunto especialmente importante para construcciones de anticuerpo inmunoconj ugados que pueden llevar fármacos citotóxicos potentes. Dirigirse específicamente a las células cancerígenas representa una base significativa en el desarrollo de tratamientos anticancerígenos. A pesar de la identificación de varios marcadores que están asociados con algunos tipos de cánceres, sigue existiendo una necesidad notable para marcadores adicionales que son más específicos para tipos individuales de cáncer, para el desarrollo de potentes tratamientos anticancerígenos que no dañarán los tejidos saludables. La explotación de estos marcadores en el desarrollo de agentes de dirección a un objetivo vía las tratamientos contra el cáncer derivadas de anticuerpo, sin dañar las células normales en el cuerpo, podría representar un avance terapéutico importante en un área con una clara y significativa necesidad médica no cumplida.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona un método de diagnóstico y/o tratamiento para el cáncer en un mamífero. El método comprende la administración de una cantidad efectiva de un agonista o antagonista antígeno antineoplásico, en donde el antígeno es definido por estar elevado al menos tres veces en expresión con relación al tejido normal, y en donde el antígeno neoplásico se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. En una modalidad particular, el agonista o el antagonista es un anticuerpo antígeno de célula antineoplásica o una molécula pequeña. En una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para identificar los agonistas o los antagonistas de un antigeno de célula neoplásica, que comprende poner en contacto el antigeno de célula neoplásica con una molécula candidata y monitorizar un efecto biológico mediado por el antigeno de la célula neoplásica, o mediado por la interacción de la molécula candidata y el antigeno de la célula neoplásica. En una modalidad adicional, la invención se refiere a una composición de materia que comprende un agonista o antagonista de un antigeno de célula neoplásica como se describe en la presente, o un anticuerpo antigeno de célula ant ineoplásica , en combinación con un portador. Opcionalmente , el portador es un portador farmacéuticamente aceptable . Diversas formas de anticuerpos son contempladas en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo antigeno neoplásico puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, que tiene una región constante de inmunoglobulina humana) o un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, F(ab'2), Fv o un anticuerpo de cadena simple u otro fragmento funcional que se enlaza específicamente al objetivo. Además, el anticuerpo puede ser marcado con un marcador detectable, inmovilizado sobre una fase sólida y/o conjugado con un compuesto heterólogo (tal como un agente citotóxico) . El anticuerpo puede ser seleccionado del grupo de anticuerpo primates humano antígeno de célula antineoplásica , anticuerpo monoclonal murino antígeno de célula, el anticuerpo quimérico antigeno de célula ant ineoplásica , anticuerpo humano antigeno de célula antineoplásica y anticuerpo humanizado antigeno de célula antineoplásica. La invención proporciona un método para diagnosticar o tratar un cáncer en un humano, en donde las formas preferidas del cáncer incluyen los cánceres de colon, rectal, o colorrectal, de mama, y de próstata, que comprende administrarle al humano una cantidad efectiva de un anticuerpo que se enlaza a un antigeno neoplásico seleccionado del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. Los usos de diagnóstico de los anticuerpos son también contemplados. En una aplicación de diagnóstico, la invención proporciona un método para determinar la presencia de un antigeno de célula neoplásica seleccionado del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5, que comprende exponer una muestra sospechosa de contener un antigeno de célula neoplásica, al anticuerpo de la invención, y determinar el enlace del anticuerpo a la muestra. Para este uso, la invención proporciona un kit que comprende anticuerpo e instrucciones para el uso del anticuerpo, para detectar los antigenos de células neoplásicas . En modalidades adicionales, la invención proporciona los artículos de fabricación para el uso (entre otras cosas) en los métodos anteriores. Por ejemplo, la invención proporciona un artículo de fabricación que contiene un receptor y una composición contenida en éste, en donde la composición puede ser utilizada para tratar el cáncer que expresa uno de los antígenos de célula neoplásica enlazados por el agonista/antagonista o los anticuerpos de la invención y que comprende además un inserto de paquete que indica que la composición puede ser utilizada para tratar el cáncer que expresa uno de los antígenos neoplásicos seleccionados del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. La invención proporciona además: el ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo; un vector que comprende ese ácido nucleico; opcionalmente enlazado operablemente a secuencias de control reconocidas por una célula hospedera transformada con el vector; una célula hospedera que comprende ese vector; un proceso para producir el anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedera de modo que el ácido nucleico es expresado y, opcionalmente, que comprende además recuperar el anticuerpo del cultivo de células hospederas (por ejemplo, a partir del medio de cultivo de las células hospederas) . La invención pertenece además a un inmunoconj ugado que incluye un anticuerpo que se enlaza a un antígeno de célula neoplásica seleccionado del grupo de K3AA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5 conjugado a una o más moléculas heterologas y el uso de tales conjugados para el tratamiento contra el cancér, en donde la célula cancerosa expresa uno de los antigenos neoplásicos seleccionados de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. El anticuerpo del inmunoconj ugado puede ser un anticuerpo intacto (por ejemplo, un anticuerpo IgGl intacto) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab)2, diacuerpo, etc) . La invención proporciona además anticuerpos mult ivalentes , multiespecificos o fragmentos de los mismos, en donde el anticuerpo equivalente tiene un sitio de enlace con afinidad para un antigeno de célula neoplásica, seleccionado del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5 y uno o más sitios de enlace adicionales . La invención también pertenece a un método para distribuir un agente de diagnóstico/detección o agente terapéutico a una célula neoplásica que expresa un antigeno de célula neoplásica seleccionado del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR 1 , y SLC1A5. Este método comprende la provisión del anticuerpo o la composición del inmunoconj ugado de la invención y administrarlo a un paciente en necesidad del mismo.

También contemplado por la presente invención está el uso de dos anticuerpos o fragmentos de los mismos para detectar/diagnosticar o para tratar el cáncer, en donde al menos uno de los anticuerpos o fragmentos se enlaza a un antígeno de célula neoplásica seleccionado del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. Una modalidad de la invención es un método para diagnosticar, detectar o tratar el cáncer en un mamífero, en donde el cáncer expresa un antígeno de células neoplásicas que es elevado al menos tres veces en relación a una muestra de tejido adyacente normal o muestra de tejido normal combinado, que comprende administrarle al mamífero cantidades terapéuticamente efectivas de un anticuerpo o fragmento del mismo, que se enlaza a ese antígeno o célula neoplásica, y en donde el antígeno de célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. En una modalidad preferida, el anticuerpo o fragmento del mismo es humano, humanizado, quimérico o un fragmento del mismo. En otra modalidad más, el anticuerpo o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste de Fv, F(ab')2, Fab' y Fab. En una modalidad especialmente preferida, el anticuerpo o fragmento del mismo, utilizado en el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero se enlaza específicamente a un dominio extracelular de un antígeno de célula neoplásica, en donde el antígeno de célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPC 41, y SLC1A5. En otra modalidad más, el anticuerpo o fragmento del mismo, utilizado en el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero se enlaza a un dominio extracelular de KIAA1815, y el dominio extracelular es elegido del grupo de aminoácidos de aproximadamente las posiciones 1-408, de aproximadamente las posiciones 474-489, de aproximadamente las posiciones 545-581, de aproximadamente las posiciones 603-621, de aproximadamente las posiciones 642-653, y de aproximadamente 674-904. En otra modalidad más, el anticuerpo o fragmento del mismo, utilizado en el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero, se enlaza a un dominio extracelular de BC017881, y el dominio extracelular es elegido del grupo de aminoácidos de aproximadamente las posiciones 1-117, de aproximadamente 140-148, de aproximadamente 165-211, y de aproximadamente 230-240. En otra modalidad más, el anticuerpo o fragmento del mismo, utilizado en el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero, se enlaza a un dominio extracelular de FLJ20421, y el dominio extracelular es proveniente de aproximadamente las posiciones de aminoácidos 30-359. En otra modalidad más, el anticuerpo o fragmento del mismo, utilizado en el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero, se enlaza a un dominio extracelular de DSCD75, y el dominio extracelular proveniente de aproximadamente las posiciones de aminoácidos 20-208. En otra modalidad más, el anticuerpo o fragmento del mismo, utilizado en el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero, se enlaza a un dominio extracelular de GPR160, y el dominio extracelular es elegido del grupo de aminoácidos de aproximadamente las posiciones 1-15, de aproximadamente las posiciones 80-93, de aproximadamente las posiciones 157-182, de aproximadamente las posiciones 263-276. En otra modalidad más, el anticuerpo o fragmento del mismo, utilizado en el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero, se enlaza a un dominio extracelular de GPCR41, y el dominio extracelular es elegido del grupo de aminoácidos de aproximadamente las posiciones 31-49, de aproximadamente las posiciones 104-112, de aproximadamente las posiciones 134-145, de aproximadamente las posiciones 170-195, de aproximadamente las posiciones 212-270, de aproximadamente las posiciones 299-307, de aproximadamente las posiciones 360-368, de aproximadamente las posiciones 390-403 y de aproximadamente las posiciones 427-445. En otra modalidad más, el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado, es un inmunoconj ugado . En una modalidad preferida, el inmunoconj ugado de diagnóstico, detección o terapéutico que comprende un anticuerpo que incluye un anticuerpo antígeno de célula ant ineoplásica o un fragmento del mismo o una proteína de fusión del anticuerpo antígeno de célula antineoplásica o un fragmento del mismo es enlazado al menos a un agente de diagnóstico/detección o a al menos a un agente terapéutico. En otra modalidad más, el inmunoconj ugado de diagnóstico/detección comprende un agente de diagnóstico/detección que comprende al menos un agente de diagnóstico/detección fotoactivo en donde el agente de diagnóstico fotoactivo comprende un cromágeno o colorante. En una modalidad preferida, el inmunocon ugado de diagnóstico/detección es utilizado en la detección/diagnóstico de tumores intraoperatorios , endoscópicos , o intravasculares . En una modalidad adicional, el inmunoconj ugado terapéutico comprende un agente terapéutico que se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido, átomos de boro, gadolinio o uranio, un inmunomodulador , una citocina, una hormona, un antagonista de hormona, una enzima, un inhibidor de enzima, un agente terapéutico fotoactivo, un fármaco citotóxico, una toxina, un inhibidor de la angiogénesis , un anticuerpo diferente y una combinación de los mismos. En una modalidad adicional, el inmunoconj ugado terapéutico comprende un fármaco citotóxico que es un fármaco, un profármaco, una enzima o una toxina. En otra modalidad más, el inmunoconj ugado terapéutico que comprende un fármaco citotóxico que es una caliqueamicina o análogo de caliqueamicina, una maytansina o derivado de maytansina o una auristatina E o derivado de auristatina E. En otra modalidad más, el inmunoconj ugado terapéutico comprende un fármaco citotóxico que es una toxina o fragmento de la misma, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de toxinas vegetales, microbianas y animales, y una variación sintética de las mismas. En una modalidad adicional, el inmunoconj ugado terapéutico comprende un inmunomodulador que se selecciona del grupo que consiste de una citosina, un factor de crecimiento de célula madre, una linfotoxina, un factor hematopoyético , un factor estimulador de colonias (CSF) , un interferón (IFN), un factor de crecimiento de células madre, eritropoyet ina , trombopoyetina , un anticuerpo y una combinación de los mismos. En una modalidad preferida, el inmunoconj ugado terapéutico comprende una enzima que es una enzima activadora de profármaco. En una modalidad adicional, el inmunocon ugado terapéutico comprende una enzima activadora de profármaco que se selecciona del grupo de fosfatasa alcalina, arilsulfatasa, citosina-desaminasa , proteasas, D-alanilcarboxipeptidasas , enzimas de escisión de carbohidratos tales como beta.-galactosidasa y neuraminidasa , beta-lactamasa , penicilina-amidasas, y anticuerpos con actividad enzimática. En una modalidad adicional, el anticuerpo mult ivalente , multiespecifico o fragmento del mismo comprende uno o más sitios de enlace que tienen afinidad hacia un antigeno de célula neoplásica y uno o más sitios de enlace al epitopo que tienen afinidad hacia los epitopos, en donde el antigeno de célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41 y SLC1A5. En una modalidad preferida, el anticuerpo multiespecifico, multivalente o un fragmento del mismo, comprende un anticuerpo multiespecifico, multivalente o fragmento del mismo que es humano, humanizado o quimérico.

En otra modalidad más, el anticuerpo multivalente , multiespecifico o el fragmento del mismo comprende un agente de diagnóstico/detección o terapéutico. En otra modalidad más, la proteina de fusión de anticuerpo o el fragmento de la misma, comprende al menos dos anticuerpos antigeno de célula antineoplásica o fragmentos de los mismos, en donde los anticuerpos o los fragmentos de los mismos, se seleccionan de los anticuerpos antigeno de célula antineoplásica, o fragmento de los mismos, de acuerdo a las modalidades previamente descritas. En una modalidad preferida, el método para tratar el cáncer en un mamífero comprende el tratamiento con una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o fragmento del mismo, de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el anticuerpo es formulado en una formulación terapéuticamente aceptable. En otra modalidad más, el método de diagnóstico/detección del cáncer en un mamífero, comprende el paso de administrar al mamífero una cantidad diagnósticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento del mismo, de acuerdo a las modalidades precedentes, formulado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad adicional, el método de tratamiento o de diagnóstico/detección del cáncer en un mamífero comprende (i) administrarle a un mamífero en necesidad del mismo, el anticuerpo o los fragmentos del mismo de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes; (ii) esperar una cantidad suficiente de tiempo para que una cantidad de la proteina de no enlace despeje la corriente sanguínea del mamífero; y (iii) administrarle al mamífero una molécula portadora que comprende un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, o una combinación de los mismos, que se enlaza a un sitio de enlace del anticuerpo. En una modalidad adicional, el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero incluye una secuencia de ADN que comprende un ácido nucleico que codifica para anticuerpo antígeno de célula antineoplásica o un fragmento del mismo o el inmunoconj ugado de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes. En una modalidad adicional, el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero incluye un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN de un anticuerpo antígeno de célula antineoplásica o un fragmento del mismo o el inmunoconj ugado de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes. En una modalidad adicional, el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero incluye una célula hospedera que comprende el vector de expresión. En una modalidad adicional, el método de diagnóstico, detección o tratamiento contra el cancér en un mamífero, incluye un método para distribuir un agente de diagnóstico/detección o terapéutico, o una combinación de los mismos, a un objetivo que comprende (i) la provisión de una composición que comprende un inmunoconj ugado que incluye el anticuerpo o el fragmento del mismo, de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes y (ii) administrar a un mamífero en necesidad del mismo, dicha composición. En una modalidad adicional, el método de tratamiento contra el cancér en un mamífero, que comprende administrarle al mamífero, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento del mismo, comprende al menos dos anticuerpos o fragmentos de los mismos, y comprende el uso del anticuerpo de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes, que es formulado en un excipiente farmacéuticamente adecuado. En una modalidad adicional, el método de tratamiento contra el cancér en un mamífero, que comprende administrarle al mamífero, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento del mismo comprende además un segundo anticuerpo o fragmento que no se enlaza a un antígeno de célula neoplásica, en donde el antígeno de célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. En una modalidad adicional, el método de tratamiento contra el cancér en un mamífero, que comprende administrarle al mamífero, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento del mismo y comprende además un segundo anticuerpo o fragmento que se enlaza a un antígeno de célula neoplásica, en donde el antígeno de célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. En una modalidad adicional, el método de tratamiento contra el cancér en un mamífero, que comprende administrarle al mamífero, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento del mismo y comprende además un segundo anticuerpo o un fragmento del mismo, en donde el segundo anticuerpo está conjugado a un agente terapéutico o de diagnóstico/detección. En una modalidad adicional, el método de tratamiento contra el cancér en un mamífero comprende administrarle al mamífero, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo antígeno de célula antineoplásica o un fragmento del mismo es administrado antes, en conjunto con, o después de un segundo anticuerpo conjugado reactivo con un segundo antígeno de célula neoplásica, expresado por dicha malignidad . En una modalidad adicional, el método de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes comprende el uso del anticuerpo antigeno de célula antineoplásica que es administrado en una dosis de 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del mamífero por dosis. En una modalidad adicional, el método de conformidad con cualquiera de las modalidades precedentes comprende el uso del anticuerpo antígeno de célula antineoplásica, donde la dosis es repetidamente administrada. En una modalidad preferida, el método de detección o diagnóstico de un cáncer de mama, próstata o colon en un mamífero, comprende el uso de los anticuerpos o inmunoconj ugados de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes . En una modalidad preferida, el método de detección o diagnóstico de un cáncer de mama, próstata o colon en un mamífero, comprende el uso de los anticuerpos o inmunoconj ugados de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes . En una modalidad preferida, el método de detección o diagnóstico de un cáncer de mama, próstata o colon en un mamífero, comprende el uso de los anticuerpos o inmunoconj ugados de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el antígeno de célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ204 21 , DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. En otra modalidad más, el método comprende el kit para el diagnóstico o detección del cáncer en un mamífero, en donde dicho kit comprende: a) un anticuerpo o un fragmento del mismo, o un inmunoconj ugado o un fragmento del mismo, de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes, en donde el anticuerpo o el fragmento es capaz de enlazarse específicamente a un antígeno de célula neoplásica, en donde el antígeno de célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5; b) un método de detección que hace posible el diagnóstico o la detección del cáncer en el mamífero; y c) las instrucciones para el uso del kit.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 describe una representación gráfica del análisis de expresión de microarreglo del antígeno de célula neoplásica KIAA1815 en tejidos cancerígenos y normales. La figura 2 describe una representación gráfica del análisis de expresión de microarreglo del antígeno de célula neoplásica LOC157378 en tejidos cancerígenos y normales. La figura 3 describe una representación gráfica del análisis de expresión de microarreglo del antígeno de célula neoplásica FLJ20421 en tejidos cancerígenos y normales. La figura 4 describe una representación gráfica del análisis de expresión de microarreglo del antigeno de célula neoplásica GPR160 en tejidos cancerígenos y normales. La figura 5 describe una representación gráfica del análisis de expresión de microarreglo del antígeno de célula neoplásica GPCR41 en tejidos cancerígenos y normales. La figura 6 describe una representación gráfica del análisis de expresión de microarreglo del antígeno de célula neoplásica SLC1A5 en tejidos cancerígenos y normales.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION 1. Definiciones A no ser que se indique de otro modo, el término "KIAA1815" cuando se utiliza en la presente se refiere a una proteína de función desconocida en el genoma humano en donde la proteína era originalmente conocida como FLJ23309. Un nombre alternativo para el locus del gen es LLID79956 ó bA207C16.3. El gen KIAA1815 contiene un dominio de aminopeptidasa hipotético. KIAA1815 puede ser derivado de cualquier mamífero, pero preferentemente de un humano. El KEAA1815 puede ser aislado de una fuente natural de la molécula o producido por medios sintéticos (por ejemplo, utilizando tecnología de ADN recombinante . ) La secuencia de ácido nucleico para KEAA1815 humano puede ser encontrada en el sitio de la red de buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso NM_024896, por ejemplo. La secuencia de aminoácidos puede ser observada utilizando el número de acceso NP_079172. KIAA1815 puede también referirse a cualquier variante de KIAA1815 expresada exclusivamente en células cancerígenas en donde la homología de aminoácidos con KIAA1815 expresado en células no cancerosas puede ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%. En una modalidad alternativa, KIAA1815 puede ser el homólogo de ratón de KIAA1815 humano conocido como D19Wsul2e. Los nombres alternativos son Fxna, MGC28280, mFLJ23309 y D19Ertd410e. La secuencia de ácido nucleico para D19Wsul2e de ratón puede ser encontrada en el sitio de la red de buscador de secuencia NIH NCBI bajo el número de acceso XM_358328. En otra modalidad alternativa, KIAA1815 puede ser el homólogo de rata del gen de KIAA1815 humano, conocido como Fxna. La secuencia para Fxna de rata puede ser observada en el buscador de secuencias NIH NCBI utilizando el número de acceso NM_184050. En otra modalidad más, KIAA1815 puede ser un homólogo de primate del gen KIAA1815 humano. Por ejemplo, el homólogo de Pan troglodytes (chimpancé) puede ser encontrado sobre el buscador de secuencias de NCBI utilizando el número de acceso XM_526478 para la secuencia de ácido nucleico, o XP520478 para la secuencia de aminoácidos. "KIAA1815 ECD" se refiere al dominio extracelular (ECD) del antígeno de célula neoplásica KIAA1815. ECD de KIAA1815 puede también referirse a cualquier variante de ECD de KIAA1815 que pueda ser expresada exclusivamente en células cancerígenas. ECD de KIAA1815 se refiere a cualquier proteína o péptido en donde la homología de aminoácidos puede ser de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de la porción de la proteína que radica fuera de la célula. Los programas de predicción de topología pueden ser utilizados para estimar las regiones de la proteína que comprenden el ECD (ver Ejemplo 2) . En modalidades alternativas, el ECD de KIAA1815 puede ser derivado del homólogo de ratón, rata o primate del ECD de KIAA1815 humano. A no ser que se indique de otro modo, el término "BC017881" cuando se utiliza en la presente, se refiere a una proteína transmembranal de función desconocida en el genoma humano, alternativamente conocida por el nombre LOC157378 o TMEM65. BC017881 puede ser derivada de cualquier mamífero, pero preferentemente de un humano. La BCO 17881 puede ser aislada de una fuente natural de la molécula o puede ser producida por medios sintéticos (por ejemplo, utilizando tecnología de ADN recombinante ) . La secuencia de ácido nucleico para BC017881 humana puede ser encontrada en el sitio de la red de buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso NM_194291, por ejemplo. La secuencia de aminoácidos puede ser similarmente observada utilizando el número de acceso NP_919267. BC017881 puede también referirse a cualquier variante de BC017881 expresada exclusivamente en células cancerígenas, en donde la homología con BC017881 expresada en células no cancerosas puede ser de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%. En una modalidad alternativa, BC017881 puede ser el homólogo de ratón de BC017881 humana conocido como 4930 38D12RÍ k . Un nombre alternativo para 4930438D12Rik es 2610029O13Rik. La secuencia de ácido nucleico para 4930 38D12Rik de ratón puede ser encontrada en el sitio de la red de buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso NM_175212. En otra modalidad adicional, BC017881 puede ser el homólogo de rata conocido como LOC500874. La secuencia de ácido nucleico para LOC500874 puede ser observada en el buscador de secuencias NIH NCBI utilizando el número de acceso XM_576273. En otra modalidad más, BC017881 puede ser un homólogo de primate del gen de BC017881 humano. Por ejemplo, el homólogo de Pan troglodytes (chimpancé) puede ser encontrado en el buscador de secuencias NCBI utilizando el número de acceso XM_528228 para la secuencia de ácido nucleico o XP_528228 para la secuencia de aminoácidos . "ECD de BC017881" se refiere al dominio extracelular (ECD) del antígeno de célula neoplásica BC017881. El ECD de BC017881 puede también referirse a cualquier variante de ECD de BC017881 que pueda ser expresada exclusivamente en células cancerígenas. ECD de BC017881 se refiere a cualquier proteína o péptido en donde la homología de aminoácidos puede ser de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó 100% de la porción de la proteina que reside fuera de la célula. Los programas de predicción de topología pueden ser utilizados para estimar las regiones de la proteína que comprenden el ECD (ver Ejemplo 2) . En modalidades alternativas, el ECD de BC017881 puede ser derivado del homólogo de ratón, rata o primate del ECD de BC017881 humano. A no ser que se indique de otro modo, el término "FLJ0421" cuando se utiliza en la presente se refiere a una proteína de monofosfatasa de mio-inositol de función desconocida en el genoma humano, alternativamente conocida por los nombres BAA91158, IMPA3 e Impadl . La FLJ20421 tiene un dominio de IPPasa putativo localizado de aproximadamente aminoácido 62 hasta el aminoácido 349. FLJ20421 puede ser derivada de cualquier mamífero, pero preferentemente de un humano. La FLJ20421 puede ser aislada de una fuente natural de la molécula o puede ser producida por medios sintéticos (por ejemplo, utilizando tecnología de ADN recombinante . ) La secuencia de ácido nucleico para la FLJ20421 humana puede ser encontrada en el sitio de la red buscador de secuencia NIH NCBI bajo el número de acceso BC067814. La secuencia de aminoácidos puede ser similarmente observada utilizando el número de acceso AAH67814, por ejemplo. FLJ20421 puede también referirse a cualquier variante de FLJ20421 expresada exclusivamente en células cancerígenas en donde la homología con FLJ20421 expresada en células no cancerosas puede ser de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%. En una modalidad alternativa, FLJ20421 puede ser el homólogo de ratón de la humana FLJ20421 conocida como Impadl . Impadl es también conocida como AA08880, AI451589, AL022796, B23027P20 ó 1110001C29Rik. La secuencia de ácido nucleico para Impadl de ratón puede ser encontrada en el sitio de la red buscador de secuencia NIH NCBI bajo el número de acceso NM_177730. En otra modalidad alternativa, FLJ20421 puede ser homólogo de rata del gen humano FLJ20421, conocido como RGD1306455. La secuencia de ácido nucleico para RGD1306455 puede ser observada en el buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso XM_575759. En otra modalidad alternativa, FLJ20421 puede ser un homólogo de primate del gen FLJ20421 humano. Por ejemplo, el homólogo de Pan troglodytes (chimpancé) puede ser encontrado en el buscador de secuencias NCBI utilizando el número de acceso XM_519770 para la secuencia de aminoácidos, o XP_519770 para la secuencia de aminoácidos . "ECD de FLJ20421" se refiere al dominio extracelular (ECD) del antigeno de célula neoplásica FLJ20421 ECD de FLJ20421 puede también referirse a cualquier variante de ECD de FLJ20421 puede ser expresada exclusivamente en células cancerígenas. ECD de FLJ20421 se refiere a cualquier proteína o péptido en donde la homología de aminoácidos puede ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de la porción de la proteina que reside fuera de esa célula. Los programas de predicción de topología pueden ser utilizados para estimar las regiones de la proteína que comprenden el ECD (ver Ejemplo 2) . En modalidades alternativas, el ECD de FLJ20421 puede ser derivado del homólogo de ratón, rata o primate de ECD de FLJ20421 humano. A no ser que se indique de otro modo, el término "DSCD75" cuando se utiliza en la presente, se refiere a una proteína de función desconocida expresada en células madre mesenquimales y contiene un dominio FcbC que se predice que tiene función de tioesterasa localizada aproximadamente en el aminoácido 54 hasta el aminoácido 179. Los nombres alternativos para el locus DSCD75 son LOC51337 ó C8orf55. DSCD75 puede ser derivado de cualquier mamífero, pero preferentemente de un humano. La DSCD75 puede ser aislada de una fuente natural de la molécula ó puede ser producido por medios sintéticos (por ejemplo, utilizando tecnología de ADN recombinante . ) La secuencia de ácido nucleico para DSCD75 humana puede ser encontrada en el sitio de la red de buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso AF242773, por ejemplo. La secuencia de aminoácidos puede ser similarmente observada utilizando el número de acceso AAF65450. DSCD75 puede también referirse a cualquier variante de DSCD75 expresada exclusivamente en células cancerígenas, en donde la homología con DSCD75 expresada en células no cancerosas puede ser de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%. En una modalidad alternativa, DSCD75 puede ser el homólogo de ratón del gen DSCD75 humano, conocido como 4930572 J05Rik ó MGC54796. La secuencia de ácido nucleico para 4930572 J05Rik de ratón puede ser encontrada en el buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso NM_198607. En otra modalidad alternativa, DSCD75 puede ser el homólogo de rata del gen DSCD75 humano, conocido como MGC94661. La secuencia de ácido nucleico para DSCD75 de rata puede ser encontrada en el buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso NM_001007658. En otra modalidad más, DSCD75 puede ser un homólogo de primate de gen DSCD75 humano. Por ejemplo, el homólogo de Pan troglodytes (chimpancé) puede ser encontrado en el buscador de secuencias de NCBI utilizando el número de acceso XM_519991 para la secuencia de aminoácidos, o XP_519991 para la secuencia de aminoácidos. "ECD de DSCD75" se refiere al dominio extracelular (ECD) del antígeno de célula neoplásica del DSCD75. ECD de DSCD75 puede también referirse a cualquier variante de ECD de DSCD75 puede ser expresada exclusivamente en células cancerígenas. ECD de DSCD75 se refiere a cualquier proteína o péptido en donde la homología de aminoácidos puede ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de la porción de la proteína que reside fuera de esa célula. Los programas de predicción de topología pueden ser utilizados para estimar las regiones de la proteína que comprenden el ECD (ver Ejemplo 2). En modalidades alternativas, el ECD de DSCD75 puede ser derivado del homólogo de ratón, rata o primate de ECD de DSCD75 humano. A no ser que se indique de otro modo, el término "GPR160" cuando se utiliza en la presente se refiere a un receptor acoplado a la proteína G putativa de función desconocida. Este fue descrito por Takeda et al junto con una serie de muchos otros receptores de proteína G putativos (FEBS Lett. 520 (1-3), 97-101 (2002)) . Este ha sido también denominado como GPCR1, ó GPCR150, aunque existe más de un locus humano único conocido como GPCR1. GPR160 puede ser derivado de cualquier mamífero, pero preferentemente de un humano. El GPR160 puede ser aislado de una fuente natural de la molécula o puede ser producido por medios sintéticos (por ejemplo, utilizando tecnología de ADN recombinante . ) La secuencia de ácido nucleico para GPR160 humano puede ser encontrada en el sitio de la red de buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso NM_014373, por ejemplo. La secuencia de aminoácidos puede ser similarmente observada utilizando el número de acceso NP_055188. GPR160 puede también referirse a cualquier variante de GPR160 expresada exclusivamente en células cancerígenas en donde la homología con GPR160 expresada en células no cancerosas, puede ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%. En una modalidad alternativa, GPCR160 puede ser el homólogo de ratón del gen GPCR160 humano, conocido como Gprl60. La secuencia de ácido nucleico Gprl60 de ratón puede ser encontrada en el buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso XM_896590. En otra modalidad alternativa, GPR160 puede ser el homólogo de rata del gen GPR160 humano, conocido como Gprl60. La secuencia de ácido nucleico para Gprl60 de rata puede ser encontrada en el buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso NM_001025147. En otra modalidad más, GPR160 puede ser un homólogo de primate del gen GPR160 humano. Por ejemplo, el homólogo de Pan troglodytes (chimpancé) puede ser encontrado en el buscador de secuencias de NCBI utilizando el número de acceso XM_530685 para la secuencia de aminoácidos, o XP_530685 para la secuencia de aminoácidos. "ECD de GPR160" se refiere al dominio extracelular (ECD) del antigeno de célula neoplásica GPR160. ECD de GPR160 puede también referirse a cualquier variante de ECD de GPR160 puede ser expresada exclusivamente en células cancerígenas. ECD de GPR160 se refiere a cualquier proteína o péptido en donde la homología de aminoácidos puede ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de la porción de la proteína que reside fuera de esa célula. Los programas de predicción de topología pueden ser utilizados para estimar las regiones de la proteína que comprenden el ECD (ver Ejemplo 2) . En modalidades alternativas, el ECD de GPR160 puede ser derivado del homólogo de ratón, rata o primate de ECD de GPR160 humano. A no ser que se indique de otro modo, el término "GPCR41" cuando se utiliza en la presente se refiere a un receptor acoplado a la proteina G putativa de función desconocida. GPCR41 es también conocido como PARI (receptor 1 activado por proteasa) y receptor PERV-A (receptor de retrovirus endógeno porcino) , D15Ertd747e y GPR172A. Éste fue descrito por Ericsson et al., como un receptor para retrovirus endógeno de cerdo (Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos 100 (11), 6759-6764 (2003) ) . GPCR41 contiene un dominio DUF1011 de los aminoácidos 265-371. Un dominio DUF es un domino de función desconocida que es compartido por varias proteínas. GPCR41 puede ser derivado de cualquier mamífero, pero preferentemente de un humano. El GPCR41 puede ser aislado de una fuente natural de la molécula o puede ser producido por medios sintéticos (por ejemplo, utilizando tecnología de ADN recombinante . ) La secuencia de ácido nucleico para GPCR41 humano puede ser encontrada en el sitio de la red buscado de la secuencia NIH NCBI bajo el número de acceso BC002917, por ejemplo. La secuencia de aminoácidos puede ser similarmente observada utilizando el número de acceso AAH02917. GPCR41 puede también referirse a cualquier variante de GPCR41 expresada exclusivamente en células cancerígenas, en donde la homología con GPCR41 expresada en células no cancerosas puede ser de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%. En una modalidad alternativa, GPRC41 puede referirse al homólogo de ratón del gen GPCR41 humano, conocido como Gprl72b o por sus nombres alternativos GPCR, PAR2, GPCR42, D15Ertd747e ó 2010003P03Rik. La secuencia para el homólogo GPCR41 de ratón puede ser observada en el buscador de secuencia NIH NCBI utilizando el número de acceso NM_029643, por ejemplo. En otra modalidad más, GPCR41 puede referirse al homólogo de rata del gen GCPR41 humano, conocido como LOC362942. La secuencia para GCPR41 de rata puede ser observada en el buscador de secuencias NIH NCBI utilizando el número de acceso XM_343272 por ejemplo. En otra modalidad más, GPCR41 puede ser un homólogo de primate del gen de GCPR41 humano. Por ejemplo, el homólogo de Papio hamadryas (babuino) puede ser encontrado en el buscador de secuencias NCBI bajo el número de acceso AY070778 para la secuencia de aminoácidos, o AAL59884 para la secuencia de aminoácidos. "ECD de GPCR41" se refiere al dominio extracelular (ECD) del antígeno de célula neoplásica GPCR41. ECD de GPCR41 puede también referirse a cualquier variante de ECD de GPCR41 puede ser expresada exclusivamente en células cancerígenas. ECD de GPCR41 se refiere a cualquier proteína o péptido en donde la homología de aminoácidos puede ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de la porción de la proteína que reside fuera de esa célula. Los programas de predicción de topología pueden ser utilizados para estimar las regiones de la proteína que comprenden el ECD (ver Ejemplo 2) . En modalidades alternativas, el ECD de GPCR41 puede ser derivado del homólogo de ratón, rata o primate de ECD de GPCR41 humano. A no ser que se indique de otro modo, el término "SLC1A5" cuando se utiliza en la presente se refiere a un transportador de aminoácidos neutros denominado como ASCT-2 ó ATBO y funciona como un transportador de aminoácidos dependiente de sodio que transporta los aminoácidos neutros tales como alanina, serina, y cisteína. Además, SLC1A5 sirve como un receptor para un número de virus tales como el virus endógeno de felino, el virus endógeno de babuino, el virus endógeno humano tipo W y tipo D, los retrovirus de primate de simio asociados con inmunodeficiencias infecciosas. Este fue descrito por Kekuda et al., como el transportador Bo de aminoácidos neutros, de amplio alcance, y fue aislado de una línea celular de placenta humana (J. Biol. Chem. 271 (31), 18657-18661 (1996)) . SLC1A5 contiene un dominio simportador de carboxilasa de sodio conservado (SDF) de aproximadamente los aminoácidos 54 y 485. Otros nombres para SLC1A5 incluyen R16, AAAT, M7V1, RDRC, y M7VS1. SLC1A5 puede ser derivado de cualquier mamífero, pero preferentemente de un humano. SLC1A5 puede ser aislado de una fuente natural de la molécula o puede ser producido por medios sintéticos (por ejemplo, utilizando tecnología de ADN recombinante . ) La secuencia de ácido nucleico para SLC1A5 humano puede ser encontrada en el sitio de la red de buscador de secuencias NIH NCBI bajo el número de acceso BC000062, por ejemplo. La secuencia de aminoácidos puede ser similarmente observada utilizando el número de acceso AAH00062.1. SLC1A5 puede también referirse a cualquier variante de SLC1A5 expresada exclusivamente en células cancerígenas en donde la homología con SLC1A5 expresada en células no cancerosas puede ser de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%. En una modalidad alternativa, SLC1A5 puede referirse al homólogo de ratón del gen SLC1A5 humano, también conocido como SIcIaS o alternativamente R16, AAAT, ATBO, M7V1, RDRC, ASCT2, 7VS1, Slcla7 ó MGC46952. La secuencia para Slcla5 de ratón puede ser observada en el buscador de secuencias NIH NCBI utilizando el número de acceso NM_009201, por ejemplo. En otra modalidad alternativa, Slcla5 puede referirse al homólogo de rata de SLC1A5 humano, también conocido como Slcla5, o alternativamente, Asct2, Slcla7 ó H4-ASCT2. La secuencia de Slcla5 de rata puede ser observada en el buscador de secuencias NIH NCBI utilizando el número de acceso NM_175758, por ejemplo. En otra modalidad más, SLC1A5 puede ser un homólogo de primate del gen SLC1A5 humano. Por ejemplo, el homólogo de Macaca fasicularis (macaco de cola larga) puede ser encontrado en el buscador de secuencias NCBI utilizando el número de acceso AB168329 para la secuencia de ácido nucleico, o BAE00453.1 para la secuencia de aminoácidos. "ECD de SLC1A5" se refiere al dominio extracelular (ECD) del antigeno de célula neoplásica SLC1A5. ECD de SLC1A5 puede también referirse a cualquier variante de ECD de SLC1A5 puede ser expresada exclusivamente en células cancerígenas. ECD de SLC1A5 se refiere a cualquier proteína o péptido en donde la homología de aminoácidos puede ser 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de la porción de la proteína que reside fuera de esa célula. Los programas de predicción de topología pueden ser utilizados para estimar las regiones de la proteína que comprenden el ECD (ver Ejemplo 2). En modalidades alternativas, el ECD de SLC1A5 puede ser derivado del homólogo de ratón, rata o primate de ECD de SLC1A5 humano. Un polipéptido de "secuencia nativa" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos de secuencia nativa pueden ser aislados de la naturaleza o pueden ser producidos por medios recombinantes o sintéticos. De este modo, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos del polipéptido humano de origen natural, el polipéptido murino o el polipéptido proveniente de cualquier otra especie de mamífero.

El término "variante de la secuencia de aminoácidos" se refiere a los polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren en cierto grado de un polipéptido de secuencia nativa. Ordinariamente, las variantes de secuencia de aminoácidos poseerán al menos aproximadamente 70% de homología con al menos un domino de enlace al receptor de un ligando nativo o con al menos un dominio de enlace al ligando de un receptor nativo, y preferentemente, serán al menos aproximadamente 80%, más preferentemente al menos aproximadamente 90% homólogos con tal receptor o dominios de enlace al ligando. Las variantes de la secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, supresiones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa. "Homología" es definida como el porcentaje de residuos en la variante de la secuencia de aminoácidos que son idénticos después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios vacíos, si es necesario, para lograr la homología porcentual máxima. Los métodos y los programas de computadora para la alineación son bien conocidos en la técnica . El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que parcial o completamente bloquee, inhiba o neutralice una actividad biológica de un antigeno de célula neoplásica descrito en la presente. De una manera similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imite una actividad biológica de un antigeno de célula neoplásica descrito en la presente. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente los anticuerpos agonistas o antagonistas o los fragmentos de anticuerpo, fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de antígenos de células neoplásicas, péptidos, oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los métodos para identificar los agonistas o antagonistas de un antígeno de célula neoplásica pueden comprender el poner en contacto una célula neoplásica que expresa el antígeno de interés con una molécula agonista o antagonista candidata y midiendo un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el antígeno de célula neoplásica. El antagonista puede ser también un péptido generado por diseño racional o visualización de fagos (ver por ejemplo, W098/35036 publicado el 13 de Agosto de 1998) . En una modalidad, la molécula de elección puede ser un "mimético de CDR" o un análogo de anticuerpo diseñado con base en las CDRs de un anticuerpo. Mientras que tales péptidos pueden ser antagonistas por si mismos, el péptido puede ser opcionalmente fusionado a un agente citotóxico para agregar o aumentar propiedades antagonistas del péptido. Una "molécula pequeña" como se define en la presente tiene un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltones. El término "anticuerpo" se utiliza en la presente en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecí fieos (por ejemplo, anticuerpos biespecí fieos ) formados de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos con regiones Fe modificadas y fragmentos de anticuerpos, siempre y cuando éstos muestren la actividad biológica deseada, en donde la actividad biológica deseada puede ser definida por poseer especificidad de enlace para el objetivo deseado. El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un sitio antigénico simple. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos) , cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante único sobre el antigeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que éstos pueden ser sintetizados no contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que es obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe ser considerado como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a ser utilizados de acuerdo con la presente invención pueden ser elaborados mediante el método de hibridoma primeramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) , o pueden ser elaborados mediante métodos de ADN recombinantes (ver por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567) . Los "anticuerpos monoclonales" pueden ser también aislados de bibliotecas de anticuerpos fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes a los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas son idénticas con u homologas a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como los fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando éstos muestren actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) ) . Los anticuerpos quiméricos de interés incluyen en la presente los anticuerpos "primati zados " que comprenden secuencias de enlace al antigeno, de dominio variable, derivadas de un primate no humano (por ejemplo, el Mono del Viejo Mundo, Simio, etc) y secuencias de la región constante humana. "Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región variable o de enlace al antigeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab ' , F(ab')2, y Fv; los diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10) : 1057-1062 [1995]) ; las moléculas de anticuerpo de cadena simple; y los anticuerpos multiespecificos formados a partir de uno o varios fragmentos de anticuerpo) . Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende una región variable de enlace al antigeno, asi como un domino constante (CL) de cadena ligera y los dominios constantes CHi, CH2 y CH3 de cadena pesada. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o las variantes de la secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras. "Funciones efectoras" de anticuerpos se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. [Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen el enlace de Clq; la citotoxicidad dependiente del complemento; el enlace del receptor Fe; la citotoxicidad medida por células, dependiente del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; subregulación de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B; BCR) , etc. "Citotoxicidad mediada por célula dependiente del anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig secretada, enlazada sobre los receptores Fe (FcRs) presentes sobre ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK) , neutrófilos o macrófagos), hacen posibles que estas células efectoras citotóxicas se enlacen específicamente a una célula objetivo que posee antígeno, y subsecuentemente maten a la célula objetivo con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y son absolutamente requeridas para tal muerte. Las células primarias para mediar ADCC, las células NK, expresan FcyRIII únicamente, mientras que los monocitos expresan FcvRI, FcyRII y FcvRIII. La expresión de FcR sobre las células hematopoyéticas es resumido en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol. 9:457-92 (1991) . Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede ser realizado un ensayo de ADCC in vitro, tal como aquel descrito en las Patentes de los Estados Unidos Nos 5,500,362 ó 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente , la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser evaluada in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquel descrito en Clynes et al. (Estados Unidos) 95:652- 656 (1998) . "Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos Fe . gamma . RI I I y realizan la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que son mediadores de ADCC incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; con las PBMCs y las células NK que son las preferidas. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo, de sangre o de PBMCs como se describe en la presente. Los términos "receptor de Fe" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que se enlaza a la región Fe de un anticuerpo. La preferida es una FcR humana de secuencia nativa. Además, una FcR preferida es una que se enlaza a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye los receptores de las subclases Fe. gamma. RI, Fe . gamma . RI I , y Fe . gamma . RUI, incluyendo las variantes alélicas y las formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los receptores Fe. gamma. RII incluyen Fe . gamma . RI IA (un "receptor de activación") y Fe . gamma . RI IB (un "receptor de inhibición") , los cuales tienen secuencias similares de aminoácidos que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. Un receptor de activación Fe . gamma . RI IA contiene una porción de activación basada en tirosina, inmunorreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor de inhibición Fe . gamma . RI IB contiene una porción inmunorreceptora de inhibición basada en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico, (ver revisión M. in Daron, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)) . Las FcRs son realizadas en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) . Otras FcRs, incluyendo aquellas que van a ser identificadas en el futuro, son abarcadas por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994) ) . "Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la habilidad de una molécula para lisar un objetivo en presencia del complemento. La vía de activación del complemento es iniciada por el enlace del primer componente del sistema del complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) formado en complejo con un antigeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, puede ser realizado un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996) . Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "induce muerte celular" es una que provoca que una célula viable se vuelva no viable. La célula es una que expresa un antigeno especifico de célula cancerosa, preferentemente una célula que sobreexpresa el antigeno del cáncer en comparación a una célula normal del mismo tipo de tejido, preferentemente, una célula cancerosa, por ejemplo, célula de cáncer de mama, de ovario, estómago, endometriales , de glándulas salival, pulmonar, renal, de colon, de tiroides, pancreático o de vejiga. La muerte celular in vitro puede ser determinada en ausencia del complemento y células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad mediada por células, dependientes del anticuerpo (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . De este modo, el ensayo para la muerte celular puede ser realizada utilizando el suero inactivado por calor (por ejemplo, ausencia de complemento funcional) y en ausencia de células efectoras inmunitarias . Para determinar si el anticuerpo, el oligopéptido u otra molécula orgánica es capaz de inducir muerte celular, la pérdida de la integridad membranal como es evaluada por la absorción de yoduro de propidio (PI), azul de tripan (ver Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995) ) o 7AAD puede ser evaluada con relación a las células no tratadas. Los anticuerpos inductores de muerte celular, los oligopéptidos u otras moléculas orgánicas preferidas son aquellas que inducen la captación o absorción de PI en el ensayo de absorción de PI en al menos 20% de las células objetivo. Un anticuerpo que "induce la apoptosis" es una que induce la muerte celular programada determinada por el enlace de la anexina V, fragmentación del ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación de la célula, y/o formación de vesículas membranales (denominados cuerpos apoptót icos ) . Preferentemente, la célula es una célula neoplásica, por ejemplo, una célula de mama, de ovario, de estómago, endometrial, de glándula salival, de pulmón, de riñon, de colon, de tiroides, pancreático, de vejiga. Son disponibles diversos métodos para evaluar los eventos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidil-serina (PS) puede ser medida mediante el enlace de anexina; la fragmentación del ADN puede ser evaluada a través de formación de escalera de ADN; y la condensación nuclear /cromatina junto con la fragmentación del ADN puede ser evaluada por un incremento en las células hipodiploides . Preferentemente, el anticuerpo que induce a la apoptosis es uno que da como resultado aproximadamente 2 a 50 veces, preferentemente aproximadamente 5 a 50 veces, lo más preferentemente aproximadamente 10 a 50 veces, o más de 50 veces, la inducción del enlace a la anexina, con relación a las células no tratadas en un ensayo de enlace de anexina utilizando las células BT474 (ver más adelante) . Los "anticuerpos nativos" son usualmente glucoproteinas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltones, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlace disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarias , regularmente espaciados.

Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. "Anticuerpos desnudos" son usualmente anticuerpos o fragmentos de los mismos que no están ligados a o conjugados con algunas porciones químicas, biológicas o de radionúclidos , pero pueden incluir modificaciones naturales tales como la glucosilación . El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieran extensamente en secuencia entre anticuerpos, y son utilizados en el enlace y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. No obstante, la variabilidad no está uniformemente distribuida a todo lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Esta se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables en los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables son llamadas las regiones estructurales (FRs) . Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas, cada una comprenden cuatro FRs, adoptando principalmente una configuración de lámina. beta, conectados por tres regiones hipervariables , que forman bucles que conectan, en algunos casos forman parte de la estructura de lámina. beta. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas juntas en estrecha proximidad por las FRs y, con las regiones hipervariables provenientes de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace al antigeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antigeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo, que son responsables del enlace al antigeno. La región hipervariable en general comprende los residuos de aminoácidos provenientes de una "región de determinación de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987) ) . "región estructural" o residuos "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable como se definen en la presente. La digestión con papaina de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de enlace al antigeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio simple de enlace al antigeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de enlace al antigeno, y es todavía capaz de reticular el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento del antígeno y de enlace al antígeno, completo. La región consiste de un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en asociación no covalente, apretada. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace al antigeno sobre la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren al anticuerpo la especificidad de enlace al antigeno. No obstante, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres regiones hipervariables especificas para un antigeno) tienen la habilidad para reconocer y enlazarse al antigeno, aunque a una menor afinidad del sitio de enlace completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteinas proveniente de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual el o los residuos de cisteina de los dominios constantes poseen al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente fueron producidos como pares de fragmentos Fab' los cuales tienen cisteina de bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpo son también conocidos . Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos provenientes de cualquier especie de vertebrado pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos llamados kappa y lambda, con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden ser asignados a diferentes "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos pueden ser además divididos en "subclases" (isotipos) , por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos son llamados . alfa . , .delta., .epsilon., .gamma., y .mu., respectivamente. Las estructuras subunitarias y las configuraciones dimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas , son bien conocidas. Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena simple" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipept idica simple. Preferentemente, el polipéptido de Fv comprende además un ligador polipeptidico entre los dominios H y VL que hace posible que el scFv forme la estructura deseada para el enlace al antigeno. Para una revisión de scFv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Anticuerpos, vol . 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . Los fragmentos scFv del anticuerpo anti-ErbB2 son descritos en W093/16185; Patente de los Estados Unidos No. 5,571,894; y Patente de los Estados Unidos No. 5,587,458. El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace al antigeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena polipeptidica (VH-VL) . Mediante el uso de un ligador que es demasiado corto para permitir apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena, y crean dos sitios de enlace al antigeno. Los diacuerpos son descritos más completamente en, por ejemplo, la Patente Europea No. EP 404,097; O 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 90:6444-6448 (1993) . "Anticuerpos multivalentes" son aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que comprenden al menos dos sitios de enlace, en donde los sitios de enlace pueden tener especificidad para el mismo epitopo o alternadamente, para dos diferentes epitopos. Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las cuales los residuos provenientes de una región hipervariable del receptor son reemplazadas por residuos provenientes de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo del donador) tal como ratón, rata, conejo, o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana son remplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprenden residuos que no son encontrados en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donador, pero que pueden ser encontrados por ejemplo en otros anticuerpos humanos. Estas modificaciones ( "superhumanización" ) son realizadas para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todas las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de la región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana.

Para detalles adicionales ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) . Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos de diagnóstico o terapéutico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En las modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso del anticuerpo como es determinado por el método de Lowry, y lo más preferentemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coommassie o, preferentemente tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que no es un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, no obstante, el anticuerpo aislado será preparado mediante al menos un paso de purificación. Un anticuerpo "que se enlaza" a un antígeno de interés, es uno capaz de enlazarse a ese antígeno con suficiente afinidad tal que el anticuerpo es útil como un agente terapéutico o de diagnóstico en la dirección a una célula que expresa el antigeno. Un anticuerpo que "se enlaza específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epitopo sobre un polipéptido particular es uno que se enlaza a ese polipéptido particular o epitopo particular sobre un polipéptido particular sin enlazarse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epitopo del polipéptido. Preferentemente, un anticuerpo que es específico para un objetivo de interés se enlaza con 1.5-veces, 2-veces, 5-veces, 10-veces, 100-veces, 103-veces, 104-veces, 105-veces, 106-veces o mayor proporción de enlace al antígeno sobre una célula objetivo que para otros epitopos no específicos. Opcionalmente , los anticuerpos pueden demostrar especificidad para, o no enlace específico a cualesquiera ortólogos de antígeno celular neoplásica objetivo, conocidos, incluyendo ortólogos en primates, ratones, y/o ratas. Opcionalmente, los antígenos pueden discriminar entre el antígeno de célula neoplásica de interés y los homólogos conocidos dentro de la misma especie. La discriminación puede ser determinada por una especificidad de enlace para uno homólogo sobre otro donde el enlace del anticuerpo al homólogo de interés se enlaza con una afinidad de enlace a 1.5-veces, 2-veces, 5-veces, 10-veces, 100-veces, 103-veces, 104-veces, 105-veces, 106-veces o mayor en comparación al enlace del anticuerpo al homólogo no deseado. Se dice que un anticuerpo se enlaza específicamente a un epitopo cuando la constante de disociación es menor de 1 µ?, preferentemente menor de 100 nM y lo más preferentemente menor de 10 nM. Los anticuerpos antígeno de célula antineoplásica de la presente invención pueden enlazarse a los epitopos específicos de residuos de aminoácidos, epitopos específicos de carbohidratos, o epitopos formados por residuos de aminoácidos y porciones carbohidrato de la molécula como es expresados por el objetivo que lleva las células neoplásicas. Si el anticuerpo antígeno de célula antineoplásica lleva un agente citotóxico o citostático, puede ser preferible que el anticuerpo se enlace a un epitopo que internaliza el complejo anticuerpo-receptor objetivo. Si el anticuerpo anti-obj etivo va a trabajar a través de ADCC y CDC, entonces es preferible que el anticuerpo anti-obj etivo permanezca sobre la superficie de la célula neoplásica objetivo hasta que la región Fe del anticuerpo se enlace a las células efectoras. Los métodos para determinar si un anticuerpo enlazado a un antígeno de la superficie celular cognado permanece o no sobre una superficie celular o es internalizado, son bien conocidos en la materia. El término "epitopo" se refiere a los sitios de enlace específicos o al determinante antigéno sobre un antígeno al que se enlaza el extremo variable del anticuerpo. Los epitopos pueden ser lineales, por ejemplo, estar compuestos de una secuencia de residuos de aminoácidos encontrados en la secuencia de pormina primaria. Los epitopos pueden ser conformacionales , tal que un anticuerpo reconoce una estructura tridimensional encontrada sobre una molécula de porimina plegada como es expresada sobre la superficie de una célula que expresa porimina tal que los aminoácidos reconocidos no son necesariamente contiguos en la secuencia primaria. Los epitopos pueden también ser una combinación de elementos lineales y conformacionales . Además, las porciones carbohidrato de una molécula, como son expresadas por las células neoplásicas que poseen el objetivo, pueden también ser epitopos. El término "antigeno de célula neoplásica" se refiere a cualquier proteina, carbohidrato u otro componente capaz de promover una respuesta inmunitaria. Se entiende que la definición incluye, pero no está limitada a, el uso de la célula neoplásica con todos sus antigenos asociados, como un antigeno, asi como cualquier componente separado del cuerpo de la célula, tales como las membranas plasmáticas, las proteínas purificadas de la superficie o membrana celular, o las porciones carbohidrato únicas asociadas con la superficie celular. La definición también incluye aquellos antígenos de la superficie de la célula que requieren tratamiento especial de las células para acceder. "Marcador" se refiere a un antígeno de la célula neoplásica que es más altamente expresado en una célula neoplásica en comparación a la célula normal equivalente. La palabra "marcador o etiqueta" cuando se utiliza en la presente se refiere a un compuesto o composición detectable que es conjugado directa o indirectamente al anticuerpo para generar asi un anticuerpo "marcado" . El marcador puede ser detectable por si mismo (por ejemplo, marcadores radioisotópicos o marcadores fluorescentes), o en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto sustrato o composición que es detectable. Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la cual pueda adherirse el anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas abarcadas en la presente incluyen aquellas formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa) , poliacrilamidas , poliestireno, alcohol polivinílico, y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otros ésta es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad) . Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquellas descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 4,275, 149. Un "anticuerpo antagonista" o " anticuerpo antagónico" es un anticuerpo que bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biológica de un antigeno de célula neoplásica como se describe en la presente. Los métodos para identificar un anticuerpo antagonista de un antigeno de célula neoplásica de interés pueden incluir poner en contacto una célula neoplásica que expresa el antigeno de célula neoplásica de interés, con el anticuerpo candidato, y luego medir un cambio en la actividad biológica que está normalmente asociada con ese antigeno de célula neoplásica, en la célula neoplásica. Por ejemplo, un antigeno de célula neoplásica puede ser uno que induce proliferación de las células neoplásicas, y un anticuerpo antagonista efectivo podría ser uno que interactúa específicamente con el antígeno de célula neoplásica y da como resultado una disminución en la proliferación celular. Los anticuerpos antagonistas preferidos son aquellos que dan como resultado una reducción del 30-75% en la actividad biológica de interés, y son más preferidos aquellos que dan como resultado una reducción de 75-99.9% o mayor en la actividad biológica de interés. Un anticuerpo que "bloquea" la activación del ligando, o un "anticuerpo bloqueador" es un tipo de anticuerpo antagonista que reduce o previene la activación del ligando al cual se enlaza el anticuerpo. Preferentemente, un anticuerpo bloqueador es uno que bloquea 30-75% de la activación del ligando, lo más preferentemente 75-99% o más de activación del ligando cuando un ensayo de activación del ligando mide lado por lado en presencia o ausencia del anticuerpo del bloqueo putativo. La prevención de la activación del ligando puede ser medida mediante la observación de fenómenos tales como una disminución en la fosforilación del receptor o una pérdida en la activación de otros componentes de una vía de transducción de señal con corriente abajo (3'), del ligando de interés, por ejemplo. Un "anticuerpo agonista" es uno que induce la activación del ligando al cual se enlaza el anticuerpo. Preferentemente, un anticuerpo agonista es uno que incrementa la activación del ligando donde 2 veces-, 4 veces-, 10 veces-, 50 veces- o más cuando el anticuerpo candidato, es comparado lado por lado en un ensayo de activación de ligando con un anticuerpo control no especifico. La activación del ligando puede ser medida mediante la observación de fenómenos tales como un incremento en la fosforilación del receptor o un incremento en la activación de otros componentes de una vía de transducción de señal con dirección 3' del ligando de interés, por ejemplo. Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado, es uno que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que los distingue de otros anticuerpos que se enlazan al mismo antígeno . Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa ya sea in vitro o in vivo. De este modo, el agente inhibitorio de crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células en la fase S. Los ejemplos de agentes inhibitorios del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar diferente de la fase S), tales como los agentes que inducen la detención de Gl y la detención de la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos, e inhibidores topo II tales como la doxorrubicina , epirrubicina , daunorrubicina , etopósido, y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también abarcan la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina , cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo , y ara-C. Puede ser encontrada información adicional en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn y Israel, eds . , Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (W B Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. Los agentes inhibitorios del crecimiento, preferidos son aquellos que bloquean más del 20% del crecimiento celular en presencia del inhibidor del crecimiento, o más del 25%, más del 30%, más del 35%, más del 40%, más del 45%, más preferidos son aquellos que bloquean más del 50% del crecimiento celular, o más del 55%, más del 60%, más del 65%, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85%, más del 90%, y lo más preferentemente son aquellos que bloquean 95%, o más del 99.9% del crecimiento celular. Un "agente citostático" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe la división celular sin provocar muerte celular. Un agente citostático puede inhibir la progresión celular a través del ciclo celular y provocar el paro o detención de la división en un punto especifico en el ciclo celular, tal como antes de la fase S, por ejemplo. Los agentes citostáticos preferidos son aquellos que provocan la detención en 30-50% de las células, más preferentemente son aquellos que provocan la detención en 50-95% de las células y lo más preferentemente son aquellos ejemplos que provocan la detención en 95-99.9% o más de las células en la población. Los términos "tratamiento", "tratar", "trato" y similares, son utilizados en la presente para referirse en general a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. "Tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno asi como aquellos en los cuales el trastorno va a ser prevenido. Por lo tanto, el mamífero que va a ser tratado en la presente, puede haber sido diagnosticado como poseedor del trastorno o puede estar predispuesto o susceptible al trastorno. Una "cantidad efectiva" del polipéptido descrito en la presente o un agonista o antagonista del mismo, es una cantidad suficiente para llevar a cabo un fin específicamente establecido. Una "cantidad efectiva" puede ser determinada empíricamente y de una manera rutinaria, en relación al propósito establecido. "Mamífero" para los fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o de mascota, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es humano . Un "trastorno" es cualquier condición que podría beneficiarse del tratamiento con los agonistas /antagonistas o dirigirse al anticuerpo o los inmunoconj ugados de la invención. Esto incluye los trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que van a ser tratados en la presente incluyen tumores benignos y malignos; leucemias y malignidades linfoides; trastornos neuronales, gliales, astrocitales , hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos , epiteliales, estromales y blastocélico; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunitarios . El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco efectiva para tratar un trastorno o enfermedad en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células cancerígenas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (por ejemplo, retardar en cierto grado y preferentemente detener) la infiltración de las células cancerígenas dentro de los órganos periféricos; inhibir (por ejemplo, retardar en cierto grado y preferentemente detener) la metástasis neoplásica; inhibir, en cierto grado el crecimiento neoplásica; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Al grado en que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o matar a las células cancerígenas existentes, éste puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia puede ser, por ejemplo, medida mediante la evaluación del tiempo para la progresión de la enfermedad (TTP) y/o para la determinación de la velocidad de respuesta (RR) . Por "enfermedad o trastorno hiperproliferativo" se entiende todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sea malignas o benignas, incluyendo todas las células transformadas y tejidos, y todas las células y tejidos cancerígenos. Las enfermedades y trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no están limitados a, lesiones pre-cancerígenas , crecimiento de células anormales, tumores benignos, tumores malignos, y "cáncer." Los ejemplos adicionales de enfermedades, trastornos y/o condiciones hiperproliferativas incluyen, pero no están limitados a, neoplasmas, ya sea benignos o malignos, localizados en: la próstata, el colon, el abdomen, los huesos, las mamas, el sistema digestivo, el hígado, el páncreas, el peritoneo, las glándulas endocrinas (adrenal, paratiroides , pituitaria, testículos, ovarios, timo, tiroides), el ojo, cabeza y cuello, nervios (centrales y periféricos), sistema linfático, pélvico, cutáneo, tejido suave, bazo, torácico y tracto urogenital. Los términos "cáncer", "neoplasma", "tumor", "cancerígeno" y "carcinoma" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que está típicamente caracterizada por crecimiento celular desregulado. En general, las células de interés para la detección o tratamiento en la presente solicitud incluyen las células pre-cancerígenas (por ejemplo, benignas), malignas, metastáticas , y no metastáticos . La detección de la célula cancerosa es de interés particular. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer pulmonar, incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células gigantes, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular , cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma , cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de células salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello. Un cáncer que "sobreexpresa" un antígeno de célula neoplásica es uno que produce niveles significativamente más altos de ese antígeno en comparación a una célula no cancerígena del mismo tipo celular. Tal sobreexpresion puede ser provocada por amplificación de genes o por transcripción o por traducción incrementadas. La sobreexpresion del antígeno puede ser determinada diagnósticamente por la evaluación de los niveles del ligando (o el ácido nucleico que lo codifica) en el paciente, por ejemplo, en una biopsia neoplásica o mediante diversos ensayos de diagnóstico tales como IHC, FISH, transferencia de southern, PCR o ensayos in vivo descritos anteriormente. El término "prognosis" es reconocido en la técnica y abarca las predicciones respecto al probable curso de respuesta a la intervención terapéutica, y el probable curso de la progresión de la enfermedad o el trastorno particularmente con respecto a la probabilidad de remisión de la enfermedad, recaída de la enfermedad, recurrencia del tumor, metástasis y muerte. Los ensayos de pronóstico ex vivo de la presente invención pueden ser utilizados para predecir la respuesta de un sujeto candidato a un agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica particular, o la clase de agentes terapéuticos antígeno de célula neoplásica, o modula ADCC . Por "predicción de la respuesta de un sujeto candidato" se entiende la evaluación de la probabilidad de que un sujeto en cuestión experimentará un resultado positivo o negativo con un agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica particular. Para los fines de la presente invención, "indicador de un resultado de tratamiento positivo" en el contexto de pronóstico ex vivo de la presente invención, se pretende que signifique una probabilidad incrementada de que el sujeto candidato experimentará resultados benéficos en respuesta al tratamiento con el agente terapéutico antigeno de célula antineoplásica bajo consideración, y de este modo la intervención del tratamiento con ese agente terapéutico antigeno de célula antineoplásica podría ser garantizada. En contraste, "indicador de un resultado de tratamiento negativo" se pretende que signifique la probabilidad incrementada de que el paciente no se beneficiará de la intervención del tratamiento con el agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica bajo consideración, y de este modo la intervención del tratamiento con ese agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica podría no ser garantizada . Los resultados benéficos que pueden ser logrados con la intervención de tratamiento con los agentes terapéuticos antígeno de célula neoplásica, incluyen cualquier respuesta terapéutica positiva. Por "respuesta terapéutica positiva" con respecto al tratamiento contra el cancér, se entiende un mejoramiento en la enfermedad en asociación con la actividad anti-neoplásica del agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica, y/o un mejoramiento en los síntomas asociados con la enfermedad de interés. Es decir, un efecto antiproliferativo, la prevención de brotes neoplásicas adicionales, una reducción en el tamaño del tumor, una reducción en el número de células cancerígenas y/o una disminución en uno o más síntomas mediados por la estimulación de las células que expresan el antígeno de célula neoplásica, pueden ser observados. De este modo, por ejemplo, una respuesta terapéutica positiva podría referirse a uno o más de los me oramientos siguientes en la enfermedad: (1) una reducción en el tamaño del tumor; (2) una reducción en el número de células cancerígenas (por ejemplo, neoplásicas ) ; (3) un incremento en la muerte de células neoplásicas; (4) inhibición de la supervivencia de células neoplásicas; (4) inhibición (por ejemplo, retardo en cierto grado, preferentemente impedimento) del crecimiento neoplásica; (5) inhibición (por ejemplo, retardo en cierto grado, preferentemente impedimento) de la infiltración de células neoplásicas hacia los órganos periféricos; (6) inhibición (por ejemplo, retardo en cierto grado, preferentemente impedimento) de la metástasis neoplásica; (7) la prevención de los brotes neoplásicas adicionales; (8) una proporción incrementada de supervivencia de los pacientes; y (9) cierto grado de alivio de uno o más síntomas asociados con el cáncer. Las respuestas terapéuticas positivas en cualquier malignidad dada pueden ser determinadas por criterios de respuesta estandarizados, específicos para esa malignidad . La respuesta neoplásica puede ser evaluada para los cambios en la morfología del tumor (por ejemplo, carga total del tumor, tamaño del tumor, y similares) utilizando técnicas de selección tales como exploración por formación de imagen de resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés), formación de imagen de rayos x, exploración tomográfica computari zada (CT) , formación de imagen de exploración ósea, endoscopía, y muestreo de biopsia neoplásica incluyendo aspiración de médula ósea (B A) y conteo de las células neoplásicas en la circulación. Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto que sufre terapia con el agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica , puede experimentar el efecto benéfico de un mejoramiento en los síntomas asociados con la enfermedad. De este modo, para células neoplásicas B, el sujeto puede experimentar una disminución en los denominados síntomas B, por ejemplo, sudores nocturnos, fiebre, pérdida de peso y/o urticaria. Para las condiciones pre-malignas , la terapia con un agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica puede bloquear y/o prolongar el tiempo antes del desarrollo de una condición maligna relacionada. En algunas modalidades, los ensayos de pronóstico ex vivo para el uso en los métodos de la presente invención comprenden la provisión de una muestra biológica de prueba y una muestra biológica de control proveniente de un sujeto candidato en necesidad de pronóstico para la intervención de tratamiento con un agente terapéutico antigeno de célula antineoplásica , como se anotó en la presente, donde las muestras biológicas de prueba y de control comprenden células neoplásicas que expresan el antigeno de célula neoplásica, que han sido estimuladas con un ligando de célula neoplásica, ya sea in vivo o ex vivo; poniendo en contacto la muestra biológica de prueba con una cantidad efectiva del antigeno terapéutico antigeno de célula neoplásica, de interés; la detección del nivel de al menos un biomarcador en esta muestra biológica de prueba, donde el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de un biomarcador de la apoptosis celular, y un biomarcador de la supervivencia celular, dependiendo del modo de acción del agente terapéutico antigeno de célula antineoplásica, de interés; y la comparación del nivel del o de los biomarcadores en la muestra biológica de prueba, al nivel del o de los biomarcadores en la muestra biológica control, la cual no ha sido puesta en contacto con el agente terapéutico antigeno de célula antineoplásica. Donde el agente terapéutico antigeno de célula antineoplásica es un antagonista que bloquea o interfiere con la señalización y también modula la ADCC, los ensayos de pronóstico ex vivo descritos en la presente para cualesquiera o todos estos biomarcadores de la proliferación y las supervivencias celulares, la apoptosis y la señalización, pueden ser utilizados para evaluar el efecto benéfico potencial del agente terapéutico, solo o en combinación con los ensayos para marcadores de citocina que son suprarregulados por la señalización, y/o los ensayos para uno o más de los factores relacionados al antigeno de célula neoplásica descritos en la presente, con el fin de identificar un sujeto que tiene una condición cancerígena o pre-maligna que podría responder al tratamiento con ese agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica . Donde el agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica tiene su modo de acción vía la modulación de la actividad de ADCC, por ejemplo, un anticuerpo antígeno de célula antineoplásica, el ensayo de pronóstico ex vivo para uno o más marcadores de la apoptosis puede ser utilizado para evaluar el efecto benéfico potencial del agente terapéutico, solo o en combinación con ensayos para uno o más de los factores relacionados al antígeno de célula neoplásica descritos en la presente, con el fin de identificar un sujeto que tiene una condición cancerígena o pre-maligna que podría responder al tratamiento con ese agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica. De acuerdo con los ensayos de pronóstico ex vivo de la invención, el nivel de expresión de uno o más biomarcadores , y opcionalmente uno o más marcadores de citocina, en la muestra biológica de prueba que se pone en contacto con el agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica , de interés, es comparado al nivel de expresión para el o los biomarcadores , y opcionalmente el o los marcadores de citocina en una muestra biológica control. Por "muestra biológica de prueba" se entiende una muestra biológica que comprende células neoplásicas que expresan CD40, obtenidas del sujeto candidato, y que serán puestas en contacto con el agente terapéutico antigeno de célula antineoplásica bajo consideración, para el tratamiento del sujeto candidato. Por "muestra biológica control" se entiende una muestra biológica que es comparable a la muestra biológica de prueba en que ésta también comprende aproximadamente el mismo número y tipo de células neoplásicas que expresan el antigeno de célula neoplásica, y ha sido obtenida del sujeto candidato en el mismo marco de tiempo y de una manera equivalente a aquella utilizada para obtener la muestra biológica de prueba, y que será sometida a las mismas condiciones experimentales que la muestra de prueba, pero la cual no será puesta en contacto con el agente terapéutico antigeno de célula antineoplásica, de interés. La muestra biológica de prueba y la muestra biológica control pueden ser proporcionadas a partir de una muestra biológica simple que ha sido obtenida del sujeto y dividida en submuestras, una de las cuales es designada la muestra biológica de prueba y otra más de las cuales es designada la muestra biológica control. Alternativamente, la muestra biológica de prueba y la muestra biológica control pueden ser proporcionadas a partir de dos o más muestras biológicas, que pueden ser combinadas y subdivididas en sub-muestras como se describe anteriormente, o las cuales pueden representar individualmente, las muestras biológicas de prueba y de control. El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o provoca destrucción de las células. Estos agentes pueden ser ant i-mitót icos , alquilantes, anti-metabolitos , inhibidores de la angiogénesis , apoptóticos, alcaloides, compuestos inhibidores de COS-2 y antibióticos, combinaciones de los mismos. El término está también destinado a incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, 225Ac, 18F, 68Ga, 67Ga, 90Y, 86Y, inIn, 131I, 125I, 123I, " Tc, 9411Tc, 86Re, 188Re, 177Lu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 212Bi, 213Bi, 32P, UC, 13N, 150 , 75Br, y 211At. Otros radionúclidos son también disponibles como agentes de diagnóstico y terapéuticos, especialmente aquellos en el intervalo de energía de 20-10,000 keV) , agentes quimioterapéut icos , y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimát icamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento contra el cancér. [Los ejemplos de agentes quimioterapéut icos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN . TM . ) ; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilmelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida , est ramust ina , ifosfamida, mecloretamina , clorhidrato del óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina , fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisins , actinomicina , autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina , caliqueamicina , carabicina, carminomicina , car zinofilina , cromomicinas , dactinomicina, daunorrubicina , detorrubicina , 6-diazo-5-oxo-L-norleucina , doxorrubicina , epirrubicina , esorrubicina , idarrubicina , marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina , olivomicinas , peplomicina, pot firomicina , puromicina, quelamicina, rodorrubicina , estreptonigrina , est reptozocina , tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato ; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina , tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina , doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanotona , epit iostanol , mepitiostano, testolactona ; ant i-adrenales tales como aminoglutet imida , mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como el ácido frolinico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida ; ácido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina ; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona ; mitoxantrona ; mopidamol; nitracrina; pentostat ina ; fenamet; pirarrubicina ; ácido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina ; PSK-RTM.; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico ; triaziquona ; 2,2',2"-triclorotrietilamina ; uretano; vindesina; dacarbazina ; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida ; tiotepa; taxanos, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL . RTM . , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE . RTM . , Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo ; gemcitabina; 6-t ioguanina ; mercaptopurina ; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino ; vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ; Ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona ; vincristina; vinorelbina ; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina ; aminopterina ; xeloda; ibandronato ; CPT-11; inhibidor RFS 2000 de topoisomerasa ; difluoromet ilornitina (DMFO) ; ácido retinoico; esperamicinas ; capecitabina ; y las sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También incluidas en esta definición están los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores tales como antiestrógenos , incluyendo por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y ant i-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida , leuprólido, y goserelina; y las sales, ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Un "agente anti-angiogénico" se refiere a un compuesto que bloquea, o interfiere en cierto grado con el desarrollo de vasos sanguíneos. El factor anti-angiogénico puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña, o anticuerpo que se enlaza a un factor de crecimiento o al receptor del factor de crecimiento, involucrado en la promoción de la angiogénesis . El término "citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadoras intercelulares. Los ejemplos de tales citocinas son las linfocinas, monocinas, y hormonas polipept ídicas tradicionales. Incluidas entre las citocinas están la hormona del crecimiento tal como la hormona humana del crecimiento, la N-metionil-hormona humana del crecimiento, y la hormona bovina del crecimiento; hormona paratiroidea ; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteicas tales como la hormona estimuladora del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento del fibroblasto; prolactina; lactógeno placentario; factores alfa y beta de necrosis neoplásica; sustancia inhibidora muleriana; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyet ina (TPO) ; factores de crecimiento nerviosos tales como NGF-beta.; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGFs) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor I y II del crecimiento similar a insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinduct ivos ; interferones tales como interferón-alfa , beta, y gamma; factores estimuladores de colonias (CSFs) tales como CSF de macrófagos (M-CSF) ; CSF de granulocito-macrófago (GM-CSF) ; y CSF de granulocitos (G-CSF) ; interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-l-alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis neoplásica tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipept ídicos incluyendo LIF y el ligando kit (KL) . Como se utiliza en la presente, el término citocina incluye las proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa. La detección del biomarcador de interés a nivel de las proteínas o de los nucleótidos puede ser lograda utilizando cualquier método de detección conocido por aquellos expertos en la materia. Por "detección de la expresión" o "detección del nivel de" se entiende la determinación de la cantidad de la presencia de una proteína biomarcadora o un gen en la muestra biológica. De este modo, "detección de la expresión" abarca los casos donde se determina que un biomarcador no va a ser expresado, no va a ser detectablemente expresado, expresado a un bajo, nivel, expresado a un nivel normal o sobreexpresado . Con el fin de determinar el efecto de un agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica , una muestra biológica de prueba que comprende las células neoplásicas que expresan el antígeno de célula neoplásica, que es puesta en contacto el agente terapéutico antígeno de célula antineoplásica por un tiempo suficiente para permitir que el agente terapéutico ejerza una respuesta celular, y luego el nivel de expresión de uno o más biomarcadores de interés en esa muestra biológica de prueba, es comparada al nivel de expresión en la muestra biológica control que no ha sido puesta en contacto con el agente terapéutico antigeno de célula ant ineoplásica . En algunas modalidades, la muestra biológica control de las células neoplásicas es puesta en contacto con una sustancia neutra o control negativo. Por ejemplo, en una modalidad, una inmunoglobulina no especifica, por ejemplo IgGl, que no se enlaza al antigeno de célula neoplásica, sirve como el control negativo. La detección puede ocurrir en un curso de tiempo para permitir el monitoreo de los cambios en los biomarcadores sobre el tiempo. La detección puede también ocurrir con exposición a diferentes concentraciones del agente terapéutico antigeno de célula antineoplásica , para generar una curva de "dosis-respuesta" para cualquier biomarcador dado de interés. El término "profármaco" como se utiliza en esta solicitud, se refiere a un precursor o forma derivativa de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos tóxica a las células neoplásicas en comparación al fármaco progenitor y es capaz de ser enzimát icamente activado o convertido a la forma progenitora más activa. Ver por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp . 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los profármacos de esta invención incluyen, pero no están limitados a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos modificados con D-aminoácido, profármacos glucosilatos , profármacos que contienen beta-lactama , profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden ser convertidos al fármaco libre citotóxico más activos. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivati zados en una forma de profármaco para el uso de esta invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos agentes quimioterapéuticos anteriormente descritos. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante que es útil para distribución de un fármaco (tales como los anticuerpos antígeno de célula antineoplásica descritos en la presente y, opcionalmente, un agente quimioterapéut ico ) a un mamífero. Los componentes de liposoma están comúnmente acomodados en una formación de capa, similar al arreglo lipídico de las membranas biológicas. El término "inserto de envase o paquete" se utiliza para referirse a las instrucciones acostumbradamente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información respecto a las indicaciones, uso, de su ubicación, administración, contra-indicaciones y/o advertencias concernientes al uso de tales productos terapéuticos. Un molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual ésta está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente en la forma o ajuste o disposición en la cual se encuentra en naturaleza. Las moléculas aisladas de ácido nucleico son por lo tanto distinguidas de la molécula de ácido nucleico como ésta existe en las moléculas naturales. No obstante, una molécula aislada de ácido nucleico incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en un sitio cromosómico diferente de aquel de las células naturales. La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de AND necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los procariotes, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace al ribosoma. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poli-adenilación y aumentadores . El ácido nucleico está "operablemente enlazado" cuando ésta es colocada en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el AND para una pre-secuencia o guia secretora está operablemente enlazado al ADN para un polipéptido, si esto es expresado como una pre-proteina que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o aumentador está operablemente enlazado a una secuencia de codificación si éste afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace al ribosoma está operablemente enlazado a una secuencia de codificación si ésta está colocada para facilitar la traducción. En general, "operablemente enlazado" significa que las secuencias de AND que están enlazadas son contiguas y, en el caso de una guia secretora, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los aumentadores no tienen que estar contiguos. El enlace es logrado mediante ligadura en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores y ligadores oligonucleotidicos sintéticos son utilizados de acuerdo con la práctica convencional. Como se utiliza en la presente, las expresiones "célula", "lineas celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas las designaciones tales incluyen la progenie. De este modo, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen las células sujeto primaria y los cultivos derivados de ésta sin considerar el número de transferencia. Se entiende también que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de AND, debido a mutaciones deliberadas o accidentales. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como es seleccionada en la célula originalmente transformada, es también incluida. Donde se pretenden designaciones distintas, esto será claro a partir del contexto.

II. Selección para agonistas o antagonistas de los antigenos de célula neoplásica Para evaluar los antagonistas, el antigeno de célula neoplásica puede ser agregado a una célula junto con el compuesto que va a ser seleccionado para una actividad particular, y la habilidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del antigeno de célula neoplásica indica que el tumor es un antagonista para el antigeno de célula neoplásica. Alternativamente, los antagonistas pueden ser detectados mediante la combinación del antigeno de célula neoplásica y un antagonista potencial con receptores del antigeno de célula neoplásica enlazados a la membrana, o receptores recombinantes bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El antigeno de célula neoplásica puede ser marcado, tal como mediante radioactividad tal que el número de moléculas de antigeno de célula neoplásica enlazadas al receptor puede ser utilizado para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica para el receptor puede ser identificado mediante numerosos métodos conocidos por aquellos expertos en la materia, por ejemplo, visualización panorámica del ligando y clasificación por FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun . , 1(2) : Capitulo 5 (1991) . Preferentemente, la clonación de expresión es empleada en donde el ARN poliadenilado es preparado a partir de una célula que responde al antigeno de célula neoplásica y una biblioteca de ADNc creada a partir de ARN es dividida en combinados y utilizada para transfectar células COS u otras células que no responden al antigeno de célula neoplásica. Las células transíectadas que son desarrolladas sobre portaobjetos de vidrio son expuestas al antigeno de célula neoplásica marcado. El antigeno de célula neoplásica puede ser marcado mediante una variedad de medios incluyendo yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteina-cinasa especifica del sitio. Después de la fijación e incubación, los portaobjetos son sometidos a análisis auto-radiográfico. Los combinados positivos son identificados y los sub-combinados son preparados y retransfectados utilizando un proceso interactivo de sub-combinación y reselección, produciendo tarde o temprano un clon simple que codifica para el receptor putativo. Como un procedimiento alternativo para la identificación del receptor, el antigeno de célula neoplásica marcado puede ser enlazado por fotoafinidad con la membrana celular o preparaciones de extracto que expresan la molécula receptora. El material reticulado es resuelto mediante PAGE y expuesta a película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede ser extirpado, resuelto en fragmentos peptídicos, y sometido a micro-secuenciamiento de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida del microsecuenciamiento podría ser utilizada para diseñar un grupo de sondas oligonucleotídicas degeneradas para seleccionar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica para el receptor putativo. En otro ensayo más para antagonistas, las células de mamífero o una preparación membranal que expresa el receptor podrían ser incubadas con el antígeno de célula neoplásica marcado en presencia del compuesto candidato. La habilidad del compuesto para aumentar o bloquear esta interacción podría ser luego medida. Ejemplos más específicos de los antagonistas potenciales incluyen un oligonucleót ido que se enlaza a las fusiones de inmunoglobulina con el antígeno de célula neoplásica, y en particular, anticuerpos incluyendo, sin limitación, anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos anti-idiotipicos, y versiones quiméricas u humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, asi como los anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteina estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del antigeno de célula neoplásica que reconoce el receptor pero no imparte efecto, con lo cual inhibe de manera competitiva la acción del antigeno de célula neoplásica. Otro antagonista de antigeno de célula neoplásica potencial, es una construcción de ARN o ADN antisentido, preparado utilizando tecnología antisentido, donde, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción del mARN mediante hibridación al mARN objetivo y previniendo la traducción de la proteína. La tecnología antisentido puede ser utilizada para controlar la expresión del gen a través de la formación de una triple hélice o ADN o ARN antisentido, cuyos métodos están basados en el enlace de un polinucleótido al ADN o al ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia del polinucleótido, que codifica para los antígenos de células neoplásicas maduros en la presente, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucleótido de ADN está diseñado para ser complementario a una región del gen involucrada en la transcripción (triple hélice-ver Lee et al., Nucí. Acids Res., 6:3073 (1979) ; Cooney et al., Science, 241: 456 (1988) ; Dervan et al., Science, 251:1360 (1991) ), previniendo con esto la transcripción y la producción del antigeno de célula neoplásica. El oligonucleótido de ARN antisentido híbrida al mARN in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mARN en el antígeno de célula neoplásica (antisentido-Okano, Neurochem. , 56:560 (1991) ; Oligodeoxynucleot ides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Ratón, Fia., 1988) . Los oligonucleótidos descritos anteriormente pueden también ser distribuidos a las células tal que el ARN o ADN antisentido puede ser expresado in vivo para inhibir la producción de antígeno de célula neoplásica. Cuando es utilizado el ADN antisentido, los oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de inicio de la traducción, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones -10 y +10 de las secuencia nucleotídica del gen objetivo, son preferidos. Otro método del antagonismo de antígeno de célula neoplásica, es el uso de la tecnología de siARN en donde los ARNs de interferencia pequeños, de una sola hebra (siARNs: 19-29 nucleótidos de longitud) son utilizados para silenciar los genes en donde los siARNs sirven para guiar la escisión del mARN del antigeno objetivo (ver Martínez et al, Cell (2002) 110 (5) : 563- 74) . Los antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se enlazan al sitio activo, el sitio de enlace al receptor, o el factor de crecimiento u otro sitio de enlace relevante del antígeno de célula neoplásica, con lo cual se bloquea la actividad biológica normal del antígeno de célula neoplásica. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitados a, péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos, preferentemente péptidos solubles, y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptidí lieos , sintéticos. La ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica del ARN, las ribozimas actúan mediante hibridación específica de secuencia al ARN objetivo complementario, seguido por la escisión endonucleolítica . Los sitios de escisión de ribozima específicos dentro de un objetivo de ARN potencial, pueden ser identificados mediante técnicas conocidas. Para detalles adicionales ver por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y publicación del PCT No. WO 97133551 (publicada el 18 de Septiembre de 1997) . Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deben ser de una sola hebra y compuestas de desoxinucleótidos . La composición de bases de estos oligonucleótidos es diseñada tal que está promueve la formación de triple hélice vía las reglas de apareamiento de base de Hoogsteen, que en general requieren tramos ajustables a tamaño de purinas o pirimidinas sobre una hebra de un dúplex. Para detalles adicionales ver por ejemplo, Publicación del PCT No. WO 97/33551, supra. Estas moléculas pequeñas pueden ser identificadas mediante uno o más de los ensayos de selección discutidos anteriormente en la presente y/o mediante cualesquiera otras técnicas de selección bien conocidas para aquellos expertos en la materia.

III. Producción de anticuerpos antigeno de célula antineoplásica Se presenta una descripción respecto a las técnicas ejemplares para la producción de los anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente invención. El antigeno de célula neoplásica que va a ser utilizado para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular del antigeno de célula neoplásica o una porción del mismo, que contiene el epitopo deseado. Alternativamente, las células que expresan el antigeno de célula neoplásica en su superficie celular pueden ser utilizadas para generar anticuerpos. En otra modalidad más, la inmunización basada en ADN utilizando el gen que codifica para el antigeno de célula neoplásica puede ser utilizada para generar anticuerpos (ver Ramos J.D.A. et al Allergy, Volume 59, Número 5, Mayo 2004, pp . 539-547(9) ) . Otras formas del antigeno de célula neoplásica útil para generar anticuerpos serán aparentes para aquellos expertos en la técnica . (i) Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos antigeno de célula ant ineoplásica pueden comprender anticuerpos policlonales. Los métodos de preparación de los anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden ser producidos en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente de inmunización y, si se desea un adyuvante. Típicamente, el agente de inmunización y/o el adyuvante serán inyectados en el mamífero, mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente de inmunización puede incluir el antígeno de célula neoplásica o una proteína de fusión del mismo. Este puede ser útil para conjugar el agente de inmunización a una proteína que se sabe es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen pero no están limitadas a hemocianina de lapa de hoyo de cerradura, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soya. Los ejemplos de adyuvantes que pueden ser empleados incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TD (monofosforil-lipido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético) . El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por una persona experta en la técnica sin experimentación indebida. (ii) Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales son obtenidos de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos inhibidores que comprenden la población, son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. De este modo, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos discretos . Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados utilizando métodos de hibridomas, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975) . En un método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal hospedero apropiado, es típicamente inmunizado con un agente de inmunización para promover linfocitos que producen o que son capaces de producir anticuerpos que enlazarán específicamente al agente de inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro.

El agente de inmunización incluirá típicamente el polipéptido del antígeno de célula neoplásica o una proteína de fusión del mismo. En general, son utilizados ya sea linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano, o bien células del vaso o células de los nodulos linfáticos son utilizadas si se desean fuentes de mamífero no humanas. Los linfocitos son luego fusionados con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como poliet ilenglicol , para formar una célula hibridoma [Goding, Monoclonal Anticuerpos: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp . 59-103] . Las líneas celulares inmortalizadas son usualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Usualmente, son empleadas líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células hibridoma pueden ser cultivadas en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las células progenitoras carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa (HGPRT o HPRMR) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina , y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT. Las líneas celulares inmnortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la expresión estable de alto nivel del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionados, y son sensibles a un medio tal como un medio HAT. Las lineas celulares inmortalizadas más preferidas son lineas de mieloma murino, que pueden ser obtenidas, por ejemplo, del Centro de Distribución de Células del Instituto Salk (Salk Institute Cell Distribution Center) , San Diego, Calif , y la American Type Culture Collection, anassas, Va. Las lineas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano, también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984) ; Brodeur et al., Monoclonal Anticuerpo Production Techniques and Applications, arcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp . 51-63] . El medio de cultivo en el cual son cultivadas las células hibridomas puede ser luego evaluado para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los antigenos de célula neoplásica. Preferentemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por las células hibridomas es determinada por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de enlace in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) . Tales técnicas y ensayos son conocidos en la materia. La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, ser determinada mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. , 107:220 (1980) . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden ser aislados o purificados del medio de cultivo o del fluido de ascitis mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, proteina A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. Los anticuerpos monoclonales pueden ser también elaborados mediante métodos de ADN recombinante , tales como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales de la invención puede ser fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos) . Las células hibridomas de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado dentro de vectores de expresión, los cuales son luego transíectados dentro de las células hospederas tales como las células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que de otro modo no producen la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes . El ADN puede ser también modificado, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación por los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos, en lugar de las secuencias murinas homologas [Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Morrison et al., supra] o al unir covalentemente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina. Tal polipéptido no inmunoglobulina puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede ser sustituido por los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena pesada modificada. La cadena pesada es truncada en general en cualquier punto de la región Fe para prevenir así la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes son sustituidos con otro residuo de aminoácidos o son suprimidos para prevenir así la reticulación.

Después de que son identificadas las células hibridomas deseadas, los clones pueden ser subclonados mediante procedimientos de dilución limitante y desarrollados mediante métodos estándares [Goding, supra] . Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el Medio Eagle Modificado de Dulbecco y el Medio RPMI-1640. Alternativamente, las células hibridomas pueden ser desarrolladas in vivo como ascitis en un mamífero. El medio de cultivo en el cual se están desarrollando las células hibridomas es evaluado para la producción de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por las células hibridomas, es determinada por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vitro tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmnunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) . Después de que son identificadas las células hibridomas que producen anticuerpos de la especificidad afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden ser subclonados mediante procedimientos de dilución limitante y desarrollados mediante métodos estándares (Goding, Monoclonal Anticuerpos: Principies and Practice, pp . 59-103 (Academic Press, 1986)) . Los medios de cultivo adecuados para este propósito, incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células hibridomas pueden ser desarrolladas in vivo como tumores de ascitis.

La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, determinada mediante el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. , 107:220 (1980) . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son adecuadamente separados del medio de cultivo, el fluido de ascitis o el suero mediante procedimientos convencionales de purificación de anticuerpos tales como, por ejemplo, proteina A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleot ídicas que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos) . Las células hibridoma sirven como una fuente preferida de tal AND. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado dentro de vectores de expresión, los cuales son luego transfectados dentro de las células hospederas tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen la proteína anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes . Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican para el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs . , 130:151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las bibliotecas de fagos de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990) . Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Las publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology , 10:779-783 (1992) ), asi como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc . Acids. Res., 21:2265-2266 (1993) ) . De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de los anticuerpos monoclonales. El ADN puede ser también modificado, por ejemplo, al sustituir la frecuencia de codificación por los dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; y Morrison, et al., Proc. Nati Acad. Sd. USA, 81:6851 (1984)), o al unir covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina, toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina. Típicamente, tales polipéptidos no inmunoglobulina son sustituidos por dominios constantes de un anticuerpo, o éstos son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno de un anticuerpo, para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con el antígeno que tiene especificidad para un antígeno u otro sitio de combinación con el antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente. (iii) Anticuerpos Humanizados Los anticuerpos antígeno de célula ant ineoplásica de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. La formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se enlazan al antígeno) que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las cuales los residuos provenientes de una región de determinación de la complementariedad (CDR) del receptor, son reemplazados por residuos provenientes de una CDR de una especie no humana (anticuerpo del donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos estructurales de Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden también comprender residuos que no son encontrados ni el anticuerpo de receptor ni la CDR importada o las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente de aquella de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986) ; Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992) ] . Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos han sido descritos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en éste provenientes de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácido no humano son a menudo denominados como residuos de "importación", los cuales son típicamente tomados de un dominio variable de "importación". La humanización puede ser esencialmente realizada siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988) ; Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988) ) , al sustituir las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente proveniente de una secuencia no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de la región hipervariable, y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos provenientes de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La elección de los dominios variables humanos, ligeros y pesados, que van a ser utilizados en la elaboración de los anticuerpos humanizados, es importante para reducir la ant igenicidad . De acuerdo al método denominado de "menor ajuste", la frecuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es seleccionada contra la biblioteca completa de las secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana que es más parecida que aquella del roedor, es entonces aceptada como la región estructural humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)) . Otro método más utiliza una región estructural particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede ser utilizada para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos, 89:4285 (1992) ; Presta et al., 3. Immunol., 151:2623 (1993) ) . Es además importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de la alta afinidad para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo a un método preferido, los anticuerpos humanizados son preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias progenitoras y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales son comúnmente disponibles y son familiares para aquellos expertos en la materia. Los programas de computadora están disponibles, los cuales ilustran y muestran las probables estructuras conformacionales tridimensionales de las secuencias de inmunoglobulina candidatas, seleccionadas. La inspección de estas visuali zaciones permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, por ejemplo, el análisis de los residuos que influyen la habilidad de la inmunoglobulina candidata para enlazarse a su antigeno. De esta manera, los residuos FR pueden ser seleccionados y combinados del receptor y las secuencias de importación, de modo que la característica deseada del anticuerpo, tal como la afinidad incrementada para el o los antígenos objetivo, es lograda. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente involucrados en influir el enlace del antígeno. Un método alternativo de humanización de anticuerpo confía en la identificación de aquellos aminoácidos en un dominio variable de anticuerpo que pueden ser modificados sin disminuir la afinidad nativa del dominio por el antígeno, al tiempo que reducen la inmunogenicidad del anticuerpo con respecto a las especies heterólogas. Los aminoácidos que son modificados son aquellos que no son críticos para el enlace al antígeno, pero pueden ser expuestos a factores estimuladores de la inmunogenicidad (ver por ejemplo, W0931179) . Los anticuerpos pueden también ser madurados por afinidad utilizando métodos conocidos de selección y/o mutagénesis como se describen anteriormente. Los anticuerpos madurados por afinidad, preferidos, tienen una afinidad que es cinco veces, más preferentemente 10 veces, aún más preferentemente 20 ó 30 veces mayor que el anticuerpo inicial (en general murino, humanizado o humano) a partir del cual es preparado el anticuerpo madurado. Son contempladas diversas formas del anticuerpo humanizado o del anticuerpo madurado por afinidad. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo madurado por afinidad puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que es opcionalmente conjugado con uno o más agentes citotóxicos con el fin de generar un inmunoconj ugado . Alternativamente, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo modulado por afinidad puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto. (iv) Anticuerpos Humanos Como una alternativa la humanización, pueden ser generados anticuerpos humanos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, después de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de linea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción del anticuerpo endógeno. La transferencia del arreglo del gen de la inmunoglobulina de linea germinal humano, en tales ratones mutantes de linea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos después del reto con el antigeno. Ver por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immune, 7:33 (1993); y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. Alternativamente, la tecnología de visualización de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) puede ser utilizada para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios del gen del dominio variable de inmunoglobulina (V) a partir de donadores no inmunizados. De acuerdo esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo son clonados intraestructuralmente ya sea dentro de un gen de proteína recubierto mayor o menor de un bacteriófago filamentos tal como M13 o fd, y visualizados como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica para el anticuerpo que muestra esas propiedades. De este modo, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La visuali zación de fago puede ser realizada en una variedad de formatos; para sus revisiones ver, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993) . Pueden ser utilizados varias fuentes de los segmentos del gen V para la visuali zación de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aisló un arreglo diverso de anticuerpos ant i-oxazolona a partir de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes de V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V provenientes de roedores humanos no inmunizados pueden ser construidos, y los anticuerpos para un arreglo diverso de antigenos (incluyendo auto-antigenos) pueden ser aislados esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) , o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993) . Ver también Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Como se discute anteriormente, los anticuerpos humanos pueden ser también generados por las células B activadas in vitro (ver Patentes de los Estados Unidos Nos. 5, 567, 610 y 5, 229, 275) . (v) Fragmentos de anticuerpo Han sido desarrolladas diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente , estos fragmentos eran derivados vía la digestión proteolitica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) ; y Brennan et al., Science, 229:81 (1985) ) . No obstante, estos fragmentos pueden ser ahora producidos directamente por células hospederas recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las bibliotecas de fago de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden ser directamente recuperados de E. coli y químicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) ) . De acuerdo a este procedimiento más, los fragmentos F(ab' ) 2 pueden ser aislados directamente del cultivo de células hospederas recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para el experto en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) . Ver O 93/16185; Patente de los Estados Unidos No. 5,571,894; y Patente de los Estados Unidos No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo puede ser también un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,641,870 por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecí fieos o biespecí fieos .

Son también contempladas las proteínas de fusión dominio de enlace-inmunoglobulina . En estas construcciones, las proteínas de fusión son construidas, las cuales comprenden el dominio de enlace para un antígeno de interés fusionado a una región de bisagra de anticuerpo y los dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulina que son capaces de ADCC y/o CDC mientras que existen predominantemente como monómeros debido a una habilidad deteriorada para formar multímeros ligados por puente disulfuro (ver US20030118592 ) . Estas proteínas de fusión pueden ser producidas recombinantemente a altos niveles. (vi) Anticuerpos Biespecí fieos Los anticuerpos biespecí fieos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace por al menos dos diferentes epitopos. Los anticuerpos biespecí fieos ejemplares pueden enlazarse a dos epitopos diferentes de la proteína de antígeno neoplásica. Alternativamente, un brazo antígeno de célula neoplásica puede ser combinado con un brazo que se enlace a una molécula objetivo sobre un leucocito tal como una molécula receptora de célula T (por ejemplo, CD2 o CD3), o los receptores Fe para IgG ( Fc-gamma-R) , tal como Fc-gamma-RI (CD64), Fc-gamma-RII (CD32) y Fc-gamma-RI I I (CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celulares hacia la célula que expresa el antígeno neoplásica. Los anticuerpos biespecificos pueden ser también utilizados para localizar agentes citotóxicos a las células que expresan antigenos neoplásicas. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace al antigeno neoplásico y un brazo que se enlaza al antigeno citotóxico (por ejemplo, saporina, ant i-interferón-alfa , alcaloide de vinca pervinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isótopo radioactivo) . Los anticuerpos biespecificos pueden ser preparados como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab' ) 2) - Los métodos para la elaboración de anticuerpos biespecificos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecificos de longitud completa está basada en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina , donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983) ) . Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales únicamente una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, la cual es usualmente realizada mediante pasos de cromatografía de afinidad, es más bien problemática, y los rendimientos de productos son bajos. Procedimientos similares son descritos en WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) . Los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antigeno) son fusionados a las secuencias del dominio constante de inmunoglobulina . La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, la región n2, y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CHi) que contenga el sitio necesario para el enlace de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertadas en vectores de expresión separados, y son co-transfectadas en un organismo hospedero adecuado. Para detalles adicionales de la generación de los anticuerpos biespecif icos, ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) De acuerdo a otro procedimiento más, descrito en WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser manipulada por ingeniería para elevar al máximo el porcentaje de heterodímeros que son recuperados del cultivo de células recombinantes . La interfaz preferida comprende al menos una parte de una región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos, pequeñas, provenientes de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo, son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes, son creadas sobre la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas laterales de aminoácidos grandes con más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodimero sobre otros productos finales no deseados, tales como los homodimeros . Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconj ugados" . Los anticuerpos heteroconj ugados están compuestos de dos anticuerpos covalentemente enlazados. Tales anticuerpos por ejemplo, han sido propuestos para dirigir las células del sistema inmunitario hacia las células no deseadas (Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980) , y para el tratamiento de la infección por el HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Se contempla que los anticuerpos pueden ser preparados in vitro utilizando métodos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellas que involucran agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden ser construidas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980. Los anticuerpos biespecificos pueden ser preparados como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab')2) . Las técnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpo han sido también descritas en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos pueden ser preparados utilizando enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son proteolíticamente escindidos para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente formador de complejo de ditiol, el arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación de puente disulfuro intermoleculares. Los fragmentos Fab ' generados son luego convertidos a derivados de t ionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab' -TNB es luego reconvertido al Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecificos producidos pueden ser utilizados como agentes para la inmunomovili zación selectiva de enzimas. Los fragmentos Fab'-SH pueden ser directamente recuperados de E. coli, que pueden ser químicamente acoplados para formar anticuerpos biespecí fieos . Shalaby et al., J. Exp . Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab' ) 2 de anticuerpo biespecí fico, completamente humanizada. Cada fragmento Fab ' fue separadamente secretado a partir de E. coli, y sometido a acoplamiento químico dirigido, in vitro para formar el anticuerpo biespecí fico . El anticuerpo biespecífico formado de este modo, fue capaz de enlazarse a las células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T humanas normales, así como disparar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos neoplásicas de mama humanos. Las diversas técnicas para elaborar y aislar los fragmentos biespecí fieos directamente a partir del cultivo de células recombinates han sido también descritos. Por ejemplo, los anticuerpos biespecí fieos han sido producidos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos cremallera de leucina provenientes de las proteínas Fos y Jun fueron enlazados a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo fueron reducidos en la región de bisagra para formar monómeros y luego re-oxidados para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método puede ser también utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para mejorar fragmentos de anticuerpo biespecificos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento más, con lo cual se forman dos sitios de enlace al antigeno. Otra estrategia mas para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecificos mediante el uso de los dimeros de Fv de cadena simple (sFv) ha sido también reportada. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) . Los anticuerpos con más de dos valencias son también contemplados. Por ejemplo, pueden ser preparados anticuerpos triespecificos . Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) . Los anticuerpos biespecificos ejemplares pueden enlazarse a dos epitopos diferentes sobre un polipéptido de antigeno de célula neoplásica dado, en la presente. Alternativamente, un brazo antigeno de célula neoplásica puede ser combinado con un brazo que se enlaza a una molécula de desviación al objetivo sobre un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, ó B7), o receptores Fe para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) y FcyRI II (CD16) para enfocar asi los mecanismos de defensa celular a la célula que expresa el antigeno de célula neoplásica particular. Los anticuerpos biespecificos pueden ser también utilizados para localizar agentes citotóxicos a las células que expresan un antigeno de célula neoplásica particular. Estos anticuerpos poseen un brazo que se enlaza al antigeno de célula neoplásica y un brazo que se enlaza a un agente citotóxico o un quelante radionúclido, tal como EOTUBE , DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo biespécifico de interés se enlaza al antigeno de célula neoplásica y se enlaza además al factor tisular (TF) . (vii) Otras modificaciones de la Secuencia de Aminoácidos La o las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos antigeno de célula antineoplásica descritos en la presente, son también contempladas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/o las propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de anticuerpo antigeno de célula antineoplásica son preparadas mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados dentro del ácido nucleico del anticuerpo antigeno de célula antineoplásica, o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, las supresiones de, y/o las inserciones dentro y/o las sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo antígeno de célula antineoplásica. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución es realizada para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traduccionales del anticuerpo antígeno de célula antineoplásica, tal como el cambio del número o posición de los sitios de glucosilación . Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo antígeno de célula antineoplásica, que son posiciones preferidas para la mutagénesis, es llamado "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989) . Aquí, son identificados un residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido neutro o negativamente cargado (lo más preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno de célula neoplásica. Aquellas posiciones de aminoácidos que demuestran la sensibilidad funcional a las sustituciones son luego refinadas mediante la introducción de variantes adicionales u otras en, o para los sitios de sustitución. De este modo, mientras que el sitio para la introducción de una variación de la secuencia de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, la exploración de ala o la mutagénesis aleatoria es conducida en el codón o región objetivo y las variantes expresadas del anticuerpo antigeno de célula antineoplásica son seleccionadas para la actividad deseada . Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino-carboxilo-terminales en el intervalo de longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, asi como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo antigeno de célula antineoplásica con un residuo de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo antigeno de célula antineoplásica, incluyen la fusión al extremo N o el extremo C del anticuerpo antígeno de célula antineoplásica a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la vida media en suero del anticuerpo. Otro tipo más de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo antigeno de célula antineoplásica reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables , pero son también contempladas las alteraciones de FR. Las sustituciones conservadores son mostradas en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden ser introducidos cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente más adelante con referencia a las clases de aminoácidos, y luego los productos son seleccionados.

TABLA 1 Residuo Sustituciones Sustituciones original Ej emplares Preferidas Ala (A) val; leu; i le val Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gln;; his;; asp, lys; aar gln Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln (Q) asn, glu asn ;E) asp; gln asp ;H) asn; gin; lys; arg arg I) leu; val; met; ala; phe; norleucina leu :L) norleucina; lie; val; met; ala; phe ile ;K) arg; gln; asn arg ;M) leu; phe; ile leu : ) leu; val; ile; ala; tyr tyr ;p) ala ala :s) thr thr ; ) ser ser ;w) tyr; phe tyr !Y) trp; phe; thr; ser phe ; v ) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de anticuerpo son logradas mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptidica en el área principal de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o lámina, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural son divididos en grupos con base en las propiedades de cadena lateral comunes. 1) hidrofóbicos : norleucina, met, ala, val, leu, i le ; 2) hidrofilicos neutros: cys, ser, thr; 3) ácidos: asp, glu; 4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; 5) residuos que influyen la orientación de la cadena: gly, pro; y 6) aromáticos: trp, tyr, phe .

Las sustituciones no conservadoras involucrarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase . Tales residuos sustituidos pueden ser también introducidos dentro de sitios de sustituciones conservadores, más preferentemente dentro de los sitios remanentes (no conservados ) . Cualquier residuo de cisteina no involucrado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo antigeno de célula ant ineoplásica puede también ser sustituido, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. De manera contraria, el o los enlaces de cisteina pueden ser agregados al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional involucra la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo progenitor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendrán propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo progenitor del cual son generadas. Una manera conveniente para generar tales variantes sustitucionales , involucra la maduración por afinidad utilizando visualización de fago. En resumen, varios sitios de la región hipervariable (sitios 6-7) son mutados para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de este modo son visualizadas de una manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes visualizadas por fago son luego seleccionadas para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace) como se describe en la presente. Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidata para la modificación, puede ser realizada la mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace del antigeno. Alternativamente, o adicionalmente, pueden ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo antigeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antigeno de célula neoplásica humano. Tales residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo a las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que tales variantes son generadas, el panel de variantes es sometido a selección como se describe en la presente, y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden ser seleccionados para el desarrollo posterior. Otro tipo más de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Por alteración se entiende la supresión de una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de los anticuerpos es típicamente ya sea N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere al enlace de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas de asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina , en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para el acoplamiento enzimático de la porción carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptidicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación O-enlazado se refiere al enlace de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, a través de 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo es convenientemente lograda por la alteración de la secuencia de aminoácidos tal que ésta contiene una o más de las secuencias tripeptidicas anteriormente descritas (para los sitios de glucosilación N-enlazados ) . La alteración puede ser también realizada por la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o de treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glucosilación 0-enlazados ) . Las moléculas de ácido nucleico que codifican para las variantes de la secuencia de aminoácidos de la secuencia antigeno de célula neoplásica, son preparadas por una variedad de métodos conocidos en la materia. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de las variantes de la secuencia de aminoácidos de origen natural) o en la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida al sitio) , mutagénesis por PCR y mutagénesis de cásete de una variante preparada más tempranamente o una versión variante del anticuerpo antigeno de célula antineoplásica. Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epitopo de enlace al receptor silvestre dentro del anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epitopo de enlace al receptor silvestre" se refiere al epitopo de la región Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable del incremento de la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG. (viii) Maduración por Afinidad Puede ser necesario incrementar la afinidad de los anticuerpos de la invención, y existen muchos métodos conocidos en la técnica para lograr esta tarea. Por ejemplo, la mutagénesis paso por paso, enfocada, puede ser llevada a cabo utilizando las bibliotecas de anticuerpo expresado por fago en donde las seis CDRs de cadenas pesada y ligera que contienen mutaciones simples, son expresadas y seleccionadas para afinidad incrementada del antigeno (ver Wu et al, (1998) Proc Nati Acad Sci Estados Unidos 95 ( 11 ) : 6037-42 ) . Otro procedimiento enfocado es denominado "mutagénesis de punto caliente", donde las mutaciones aleatoriamente introducidas son introducidas en sitios que más probablemente van a generar afinidad mejorada (ver Ho et al, (2005) J. Biol. Chem. 280:607-17) . Procedimientos enfocados tales como éstos tienen una ventaja ya que únicamente son necesarias bibliotecas pequeñas para la selección, pero tienen una desventaja en que la selección extensa, final de todas las combinaciones de las variantes, es requerida para obtener los mejores clones. Un segundo procedimiento general para llevar a cabo la maduración por afinidad del anticuerpo confia en el uso de uno de los diversos tipos diferentes de tecnologías de visualización . En estas técnicas, en millones de variantes del anticuerpo son mostradas y seleccionadas bajo condiciones que favorecen aquellas variantes con afinidad mejorada. Los sistemas de visualización son a menudo apareados con algún método para introducir mutantes aleatorios tales como la mutagénesis de PCR propensa a errores. La tecnología de visualización que pueden ser utilizadas incluyen, pero no están limitadas a, visualización de ribosoma, de levadura, de fago, de microesferas , de enlace proteína-ADN, bacterianas y retrovirales . Utilizando estas técnicas, han sido reportados mejoramientos de 1000 veces en la afinidad del anticuerpo, generando anticuerpos con afinidades tan bajas como de 48 fM. Para una revisión, por favor ver Hoogenboom (2005) Nature Biotechnology 23:1105-16.

Un procedimiento alternativo, denominado "mutagénesis de transparencia o penetración" es un procedimiento de mutagénesis multidimensional que evalúa simultáneamente y optimiza las mutaciones combinatorias al examinar la distribución de las químicas dentro de un dominio de CDR y dirigiendo la contribución sinérgica de la química de cadena lateral de los aminoácidos (ver Rajpal et al (2005) Proc Nati Acad Sci Estados Unidos 102(24) : 8466-71) . (ix) Ingeniería de la Función Efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, par aumentar así la citotoxicidad mediada por la célula, dependiente del antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede ser logrado por la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fe del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el o los residuos de cisteína pueden ser introducidos en la región Fe, con lo cual se permite la formación de enlace disulfuro intercatenarios en esta región (para revisión: Weiner and Cárter (2005) Nature Biotechnology 23(5) : 556-557) . El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener capacidad de internalización mejorada y/o muerte celular mediada por el complemento, incrementada, así como citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, incrementada (ADCC) . Ver Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992) . Los anticuerpos homodiméricos con actividad ant i-neoplásica aumentada puede también ser preparado utilizando ret iculadores heterofuncionales como se describe en olff et al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993) . Alternativamente, un anticuerpo puede ser manipulado por ingeniería genética el cual tiene regiones Fe dobles y puede con esto tener capacidades mejoradas de lisis del complemento y de ADCC. Ver Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219- 230 (1989) . Los anticuerpos pueden ser producidos con glucosilación modificada dentro de la región Fe. Por ejemplo, la disminución del contenido de fucosa en las cadenas de carbohidrato pueden mejorar la actividad de ADCC intrínseca del anticuerpo (ver por ejemplo BioWa's Potillegent™ ADCC Enhancing Technology, descrito en WO0061739) .

Alternativamente, los anticuerpos pueden ser producidos en líneas celulares que agregan cadenas oligosacáridas no fucosiladas, bisectadas (ver Patente de los Estados Unidos No. 6,602,684) . Estas dos tecnologías producen anticuerpos con una afinidad incrementada para el receptor de Fc-gamma-IIIa sobre las células efectoras, lo cual da como resultado eficiencia de ADCC incrementada. La región Fe puede también ser manipulada por ingeniería para alterar la vida media en suero de los anticuerpos de la invención. Abdegs son IgGs manipuladas por ingeniería genética con una afinidad incrementada para el receptor silvestre de FcRn, y así pues tiene una vida media más corta que las IgGs convencionales (ver Vaccaro et al, (2005) Nature Biotechnology 23(10) : 1283-1288) . Para incrementar la vida media en suero, pueden ser introducidas mutaciones específicas dentro de la región Fe que parecen disminuir la afinidad con FcRn (ver Hinton et al, (2004) J Biol Chem 297(8) : 6213-6216) . Los anticuerpos de la invención puede también ser modificados para utilizar otros mecanismos para alterar la vida media en suero, tal como la inclusión de un dominio de enlace a la albúmina sérica (dAb) (ver O05035572 por ejemplo) . Los dominios Fe manipulados por ingeniería (ver por ejemplo XmABMR, WO05077981) pueden ser también incorporados dentro de los anticuerpos de la invención para conducir a una actividad mejorada de ADCC, vida media alterada en suero o estabilidad incrementada de la proteína anticuerpo. (x) Inmunoconj ugados La invención pertenece también a los inmunoconj ugados que pertenecen a un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéut ico, toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos), profármaco u otro agente tal como un inmunomodulador , una hormona u hormona antagonista, y enzima o inhibidor de enzima, un agente terapéutico fotoactivo tal como un cromógeno o colorante, un inhibidor de la angiogénesis , un anticuerpo alternativo o fragmento del mismo, o un isótopo radioactivo (por ejemplo, un radioconj ugado) (para revisión, ver Schrama et al. (2006) Nature Reviews 5: 147-159) . Los agentes quimioterapéut icos útiles en la generación de tales inmunoconj ugados han sido descritos anteriormente. Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tal como una caliqueamicina, maytansina (Patente de los Estados Unidos No. 5,208,020), un tricoteno, las duocarmicinas (también conocidas como "Toxinas Ultra Potentes"; ver en general Lillo et al. (2004 Chemistry and Biology 11; p. 897-906) y CC-1065 son también contemplados en la presente. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo es conjugado a una o más moléculas de maytansina (por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maytansina por molécula de anticuerpo) . La maytansina puede ser, por ejemplo, convertida a May-SS-Me la cual puede ser reducida a May-SH3 y se hace reaccionar con el anticuerpo modificado (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992) ) para generar un inmunoconj ugado maytansinoide-ant icuerpo .

Alternativamente, el fármaco seleccionado puede ser un derivado DM1 de maytansina altamente potente (N2 ' -desacetil-N2' ( 3-mercapto-l-oxopropil ) -maytansina) (ver por ejemplo WO02/098883 publicado el 12 de diciembre del 2002) que tiene una IC50 de aproximadamente 10"11 M (revisión, ver Payne (2003) Cáncer Cell 3: 207-212) o DM4 (N2 ' - { desacet il-N2 ' - ( 4 -metil-4-mercapto-l-oxopentil) -maytansina) (ver por ejemplo WO2004/103272 publicado el 2 de diciembre del 2004) . Otro inmunoconj ugado de interés comprende un anticuerpo antigeno de células neoplásicas, conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina . La familia de caliqueamicina de antibióticos son capaces de producir rompimientos del ADN de doble hebra a concentraciones sub-picomolares. Los análogos estructurales de la caliqueamicina que pueden ser utilizados incluyen, pero no están limitados a, . gamma .. sub .1. sup . I , . al fa .. sub .2. sup . I , . al fa .. sub .3. sup . I , N-acetil- . gamma .. sub .1. sup . I , PSAG y . theta .. sup . I . sub .1 (Hincan et al. Cáncer Research 53: 3336-3342 (1993) y Lode et al. Cáncer Research 58: 2925-2928 (1998) ) . Ver también, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; y 5,773,001 expresamente incorporadas por referencia en la presente. Otro procedimiento más involucra la conjugación del anticuerpo para el antigeno de células neoplásicas a un profármaco, capaz de ser liberado en su forma activa por enzimas sobreproducidas en muchos cánceres. Por ejemplo, los conjugados de anticuerpo pueden ser elaborados con una forma de profármaco de la doxorrubicina , en donde el componente activo es liberado del conjugado por la plasmina. Se sabe que la plasmina es producida en muchos tejidos cancerígenos (ver Decy et al., (2004) FASEB Journal 18(3) : 565-567) . Las toxinas y fragmentos enzimát icamente activos de los mismos que pueden ser utilizados, incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos de no enlace de la toxina de la difteria, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , endotoxina de pseudomonas, cadena A de ricina, cada A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina , proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , ribonucleasa (Rnasa) , desoxirribonucleasa (Dnasa), proteínas antiviral de hierba carmín, inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina , fenomicina, neomicina y los tricotesenos . Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Particularmente preferidas son las toxinas que tienen baja inmunogenicidad intrínseca y un mecanismo de acción (por ejemplo, un mecanismo citotóxico versus un mecanismo citostático) que reduce la oportunidad para que las células cancerígenas se vuelvan resistentes a la toxina.

Los conjugados elaborados entre los anticuerpos de la invención e inmunomoduladores son contemplados. Por ejemplo, pueden ser utilizados oligonucleótidos inmunoestimuladores . Estas moléculas son inmunógenos potentes que pueden promover respuestas de anticuerpo especificas de antigeno (ver Datta et al. (2003) Ann N.Y. Acad. Sci 1002: 105-111) . Los compuestos inmunomoduladores adicionales pueden incluir el factor de crecimiento de células madre tal como el "factor SI", linfotoxinas tales como el factor de necrosis neoplásica (TNF) , el factor hematopoyét ico tal como una interleucina , factor estimulador de colonias (CSF) tal como el factor estimulador de colonias granulocitos (G-CSF) o el factor estimulador de macrófagos granulocitos (GM-CSF) , interferón (IFN) tal como el interferón alfa, beta o gamma, eritropoyetina y trombopoyet ina . Una variedad de isótopos radioactivos son disponibles para la producción de anticuerpos antigeno de célula antineoplásica , radiocon ugados . Los radioconj ugados terapéuticos pueden ser elaborados utilizando P-32, P-33, Sc-47, Fe-59, Cu-64, Cu-67, Se-75, As-77, Sr-89, Y-90, Mo-99, Rh-105, Pd-109, Ag-III , 1-125, 1-131, Pr-142, Pr-143, Pm-149, Sm-153, Th-161, Ho-166, Er-169, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-198, Au-199, Pb-211, Pb-212, y Bi-213, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh- 103m, Pt-109, In-iII, Sb-I 19,1-125, Ho-161, Os-189m, Ir-192, Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Fm-255 y combinaciones de los mismos. Además, pueden ser utilizados los átomos de boro, gadolinio o uranio, en donde el átomo de boro es preferentemente B-10, el átomo de gadolinio es Gd-157 y el átomo de uranio es U-235. Preferentemente, el conjugado de radionúclido terapéutico tiene un radionúclido con una energía entre 20 y 10,000 keV. El radionúclido puede ser un emisor de Auger, con una energía de menos de 1000 keV, un emisor P con una energía entre 20 y 5000 keV, o un emisor alfa o "a" con una energía entre 2000 y 10,000 keV. Los radiocon ugados de diagnóstico pueden contener un radionúclido que es un isótopo emisor de radiación gamma, beta o de positrones, donde el radionúclido tiene una energía entre 20 y 10,000 keV. El radionúclido puede ser seleccionado del grupo de 18F, 5l n, 52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 86y, 89Zr, 94mTc, Hn, 120i, 124i, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67CU, 67Ga, 75Se, 97Ru, 99mTc, IHIn, 114mln, 123i, 125i, 131i, 169, 197Hg, y 21T1. Los tipos adicionales de inmunoconj ugados de diagnóstico son también contemplados. El anticuerpo o los fragmentos de la invención pueden ser enlazados a los agentes de diagnóstico que son agentes fotoactivos o de contraste.

Los compuestos fotoactivos pueden comprender compuestos tales como cromagenos o colorantes. Los agentes de contraste pueden ser por ejemplo un ion paramagnético, en donde el ion comprende un metal seleccionado del grupo de cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), yterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III). El agente de contraste puede también ser un compuesto radio-opaco utilizado en técnicas de rayos X o tomografía computarizada , tales como un compuesto de yodo, iridio, bario, galio y talio. Los compuestos radio-opacos pueden ser seleccionados del grupo de bario, diatrizoato, aceite etiodizado, citrato de galio, ácido iocármico, ácido iocetámico, yodamida, yodipamida, ácido yodoxámico, iogulamida, iohexol, iopamidol, ácido yopanoico, ácido yoprocémico, ácido yosefámico, ácido yosérico, yosulamida-meglumina , ácido yosemético, yotasul, ácido yotétrico, ácido yotalámico, ácido yotétrico, ácido yoxáglico, ácido yoxotrizoico, ipodato, meglumina, metrizamida, metrizoato, propilodona, y cloruro taloso. Alternativamente, los inmunoconj ugados de diagnóstico pueden contener agentes que aumentan el ultrasonido, tales como un liposoma relleno con gas que es conjugado a un anticuerpo de la invención. Los inmunoconj ugados de diagnóstico pueden ser utilizados para una variedad de procedimientos que incluyen, pero no están limitados a, métodos intraoperatorios , endoscópicos o intravasculares para el diagnóstico de detección de cánceres o tumores. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico pueden ser elaborados utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bi funcionales tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , ciclohehexan-1-carboxilato succinimidil-4 - (N-maleimidometilo) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como el clorhidrato de adipimidato de dimetilo) , ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidiol ) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexandiamina ) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilendiamina ) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolieno) , y compuestos de flúor-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , -dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede ser preparada como se describe en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987) . El ácido 1-isot iocianatobencil-3-met ildiet ilen-triaminopentaacét ico marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionúclidos al anticuerpo. Ver WO94/11026. El ligador puede ser un "ligador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un ligador lábil al ácido, un ligador sensible a la peptidasa, ligador de dimetilo o ligador que contiene disulfuro (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992) ), puede ser utilizado. Los agentes pueden ser adicionalmente ligados a los anticuerpos de la invención a través de una porción carbohidrato . Alternativamente, una proteina de fusión que comprende el anticuerpo antigeno de célula antineoplásica y el agente citotóxico pueden ser elaborados, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. En otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como est reptavidina ) para la utilización de la predirección al tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor es administrado al paciente, seguido por la eliminación del conjugado no enlazado de la circulación, utilizando un agente de despejo y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo un radionúclido) . Los anticuerpos antígeno de células neoplásicas pueden ser conjugados adicionalmente a una molécula citotóxica que es únicamente liberada dentro de un lisosoma de célula objetivo. Por ejemplo, el fármaco monometil-auristatina E (MMAE) puede ser conjugado vía un enlace valina-citrulina que será escindido por la enzima lisozomal proteolítica catepsina B, después de la internali zación del 13 conjugado de anticuerpo (ver por ejemplo WO03/026577 publicado el 3 de abril del 2003) . Alternativamente, el MMAE puede ser enlazado al anticuerpo utilizando un ligador lábil al ácido que contiene un grupo funcional hidrazona como la porción escindible (ver por ejemplo O02/088172 publicado el 11 de noviembre del 2002) . (xi) Terapia de Profármaco Mediada por Enzima Dependiente del Anticuerpo (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención pueden ser también utilizados en ADEPT mediante la conjugación del anticuerpo a una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo un agente quimioterapéut ico de peptidilo, ver WO81/01145) a un fármaco activo anticancerigeno . Ver, por ejemplo, O 88/07378 y Patente de los Estados Unidos No. 4,975,278. El componente enzimático del inmunoconj ugado útil para ADEPT, incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de una manera tal como para convertirlo en su forma citotóxica, más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir los profármacos que contiene fosfato a fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir los profármacos que contienen sulfato a fármacos libres; la citosina-desaminasa útil para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en un fármaco anti-canceroso, el 5-fluorouracilo; proteasa, tales como la proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipept idasas y catepsinas (tales como las catepsinas B y L) , que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas , útiles para convertir los profármacos que contienen sust ituyentes de D-aminoácido ; enzimas que rompen carbohidratos tales como . beta.-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir los profármacos glucosilados en fármacos libres; beta . -lactamasa útil para convertir los profármacos derivados con .beta.-lactamas en fármacos libres; y amidasas de penicilina, tales como amidasa de penicilina V y amidasa de penicilina G, útiles para convertir los fármacos derivat i zados en sus nitrógenos de amina, con grupo fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", pueden ser utilizados para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)) . Los conjugados ant icuerpo-abzima pueden ser preparados como se describe en la presente para la distribución de la abisma a una población de células neoplásicas. Las enzimas de esta invención pueden ser covalentemente enlazadas a los anticuerpos antígeno de célula ant ineoplásica mediante técnicas bien conocidas en la materia tales como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales discutidos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace al antígeno de un anticuerpo de la invención enlazado al menos a una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención, pueden ser construidas utilizando técnicas de ADN recombinantes bien conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984) . (xü) Otras Modificaciones de Anticuerpo Otras modificaciones del anticuerpo son contempladas en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser enlazado a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol , polipropilenglicol , polioxialquilenos , o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo puede ser también atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximet ilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli- (metacrilato de metilo) , respectivamente), en sistemas de distribución de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas ) , o en macroeraulsiones . Tales técnicas son descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed . , (1980) . Los anticuerpos antigeno de célula antineoplásica descritos en la presente, pueden ser también formulados como inmunoliposomas . Los liposomas que contienen el anticuerpo son preparados mediante métodos conocidos en la materia, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 82: 3688 (1985) ; Hwang et al.; Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980) ; U.S. Pat . Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado son descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición lipidica que comprende fosfat idilcol ina , colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) vía la reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéut ico está opcionalmente contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon et al. J. National Cáncer Inst. 81 (19) 1484 (1989) . Las proteínas de fusión de diagnóstico o terapéuticas pueden ser construidas comprendiendo los anticuerpos de la invención. Estas proteínas de fusión pueden comprender al menos dos dominios de enlace al antígeno de célula neoplásica, derivados de los anticuerpos de la invención, o pueden contener un dominio de enlace antígeno de célula neoplásica, fusionado a un dominio de enlace que se enlaza a un epitopo alternativo de interés. Este epitopo alternativo puede ser un epitopo asociado a carcinoma. Estas funciones pueden ser también inmunoconj ugadas , y pueden estar comprendidos de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de los mismos. (iv) Selección para Anticuerpos con Propiedades Deseadas Las técnicas para generar anticuerpos han sido descritas anteriormente. Se puede seleccionar además los anticuerpos con ciertas características biológicas como se desee . Para identificar un anticuerpo que promueve la muerte celular, pueden ser realizados análisis in vitro utilizando células cancerígenas que expresan el antígeno de célula neoplásica y los anticuerpos de la invención. Un ensayo que es conocido en la técnica es el ensayo de proliferación de Células No-radioactivas CellTiter 96 Aqueous (Promega Cat . #G5421) . En este ensayo, las soluciones de un nuevo compuesto de tetrazolio [ 3- , 5-dimetiltiazol-2-il ) -5-( 3-carboximetoxifenil ) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio, sal interna; MTS(a) ] y un reactivo de acoplamiento de electrones (metosulfato de fenazina) P S son utilizados. MTS es biorreducido por las células en un producto de formazan que es soluble en el medio de cultivo de tejido. La absorbancia del producto de formazan a 490 nm puede ser medida directamente a partir de las placas de ensayo de 96 pozos sin procesamiento adicional. La conversión de MTS en el producto de formazan soluble acuoso, es lograda mediante las enzimas deshidrogenadas encontradas en las células metabólicamente activas. La cantidad de producto de formazan como se mide por la cantidad de absorbancia de 490 nm es directamente proporcional a la cantidad de células vivientes en cultivo. Otro ensayo preferidos es el ensayo CytoTox 96 (Promega Cat. #G1780) que mide cuantitativamente la lactato-deshidrogenasa liberada (LDH) en sobrenadantes de cultivo con un ensayo enzimático que da como resultado la conversión de una sal de tetrazolio (INT) en un producto de formazan rojo. La cantidad de color formado es proporcional al número de células Usadas. Los datos de absorbancia de longitud de onda visible son recolectados, utilizando un lector de placas de 96 pozos, estándar. La identificación de un anticuerpo que actúa de una manera citostática, en vez de una manera citotóxica puede ser lograda mediante la medición de la viabilidad de un cultivo de células objetivo tratadas en comparación con un cultivo control no tratado. La viabilidad puede ser detectada utilizando métodos conocidos en la materia tales como el Ensayo de Viabilidad celular CellTiter-Blue® o el Ensayo de Viabilidad de Células Luminiscentes CellTiter-Glo® (Promega, números de catálogo G8080 y G5750, respectivamente) . Un anticuerpo será considerado como potencialmente citostático si el tratamiento provoca una disminución en el número de células en comparación al cultivo control sin ninguna evidencia de muerte celular como se mide por los medios anteriormente descritos. Para identificar un anticuerpo que promueve ADCC, un ensayo de selección in vitro puede ser realizado siguiendo uno de los ensayos conocidos en la técnica. Un ensayo preferido es el ensayo de ADCC in vitro: para preparar las células objetivo marcadas con cromo 51, las lineas de células neoplásicas son desarrolladas en placas de cultivo de tejidos y cosechadas utilizando EDTA 10 mM estéril en PBS . Las células desprendidas son lavadas dos veces con medio de cultivo celular. Las células (5xl06) son marcadas con 200 pCi de cromo 51 (New England Nuclear/DuPont ) a 37°C por una hora con mezclado ocasional. Las células marcadas fueron lavadas tres veces con el medio de cultivo celular, luego fueron resuspendidas a una concentración de lxlO5 células/ml . Las células son utilizadas ya sea sin opsonización o son opsonizadas antes del ensayo por incubación con el anticuerpo de prueba a 100 ng/ml y 1.25 ng/ml en el ensayo PBMC o 29 ng/ml y 1 ng/ml en el ensayo NK. Las células mononucleares de sangre periférica son preparadas mediante recolección de la sangre sobre heparina a partir de donadores saludables normales y diluido con un volumen igual de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . La sangre es luego colocada en capas sobre LYMPHOCYTE SEPARATION MEDIUM® (LSM: Organon Teknika) y centrifugada de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células mononucleares son recolectadas de la interfaz LSM-plasma, y son lavadas tres veces con PBS. Las células efectoras son suspendidas en el medio de cultivo de células a una concentración final de lxlO7 células/ml. Después de la purificación a través de LSM, las células asesinas naturales (NK) son aisladas de PBMCs mediante selección negativa utilizando un kit de aislamiento de células NK y una columna magnética (Miltenyl Biotech) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células NK aisladas son recolectadas, lavadas y resuspendidas en medio de cultivo de células a una concentración de 2xl06 células/ml. La identidad de las células NK es confirmada mediante análisis citométrico de flujo. Proporciones variantes de efector : ob et ivo son preparadas mediante la dilución en serie de las células efectoras (ya sea PBMC o NK) al 50 por ciento a lo largo de las hileras de una placa de microtitulación (volumen final de 100 µ?) en el medio de cultivo de células. La concentración de las células efectoras está en el intervalo de 1.0xl0 /ml a 2.0xl04/ml para PBMC y de 2.0xl06/ml a 3.9xl03/ml para NK. Después de la titulación de las células efectoras, 100 µ? de células objetivo marcadas con cromo 51 (opsonizadas o no opsonizadas) a lxlO5 células/ml son agregadas a cada pozo de la placa. Esto da como resultado una proporción inicial efector : obj etivo de 100:1 para PBMC y de 20:1 para las células NK. Todos los ensayos son corridos por duplicado, y cada placa contiene los controles para la lisis espontánea (células no efectoras) y la lisis total (células objetivo más 100 µ? de dodecilsulfato de sodio al 1%, hidróxido de sodio 1 N) . Las placas son incubadas a 37°C por 18 horas, después de lo cual los sobrenadantes de cultivo celular son cosechados utilizando un sistema de recolección de sobrenadante (Skatron Instrument, Inc.) y contadas en un contador gamma Minaxi auto-gamma de la serie 5000 (Packard) por un minuto. Los resultados son luego expresados como citotoxicidad porcentual utilizando la fórmula: % de citotoxicidad= ( cmp de muestra-lisis espontánea )/( lisis total-lisis espontánea) xlOO . Para identificar los anticuerpos capaces de promover ADCC en un formato de alto rendimiento (solicitudes pendiente 60/756,301, incorporada por referencia en la presente) se puede realizar el ensayo ADCC en tiempo real utilizando el sistema ACEA Biosciences RT-CES ( (Sensor Electrónico de Células en Tiempo Real) como sigue: las células son sembradas en placas de microt itulación E-Plate (ACEA Biosciences) en donde la interacción de las células con la superficie de microelectrodo conduce a la generación de una respuesta de impedancia célula-electrodo, que indica el estado de las células en términos de la morfología, la calidad de adhesión y el número. Las PBMC humanas son preparadas en fresco a partir de sangre humana (de donadores voluntarios saludables) y luego agregadas a las células objetivo a una proporción óptima determinada experimentalmente , por ejemplo efector : obj etivo 25:1. El anticuerpo de prueba es luego agregado y la placa de células es colocada nuevamente en el Sistema ACEA para el monitoreo continuo del índice Celular por las siguientes 48 horas. Una caída en el índice de células registrado después de la adición de PBMC y el anticuerpo de prueba, es indicador de la muerte de las células objetivo por ADCC mediado por el anticuerpo de prueba. Los controles que van a ser realizados pueden incluir la corrida del ensayo en ausencia de las células PBMC efectoras o el uso de un anticuerpo control isotipo, irrelevante.

Para identificar un anticuerpo que promueve CDC, el experto en la técnica puede realizar uno de los ensayos conocidos en la materia. Un ensayo preferido es el ensayo in vitro CDC: in vitro, puede ser medida la actividad CDC mediante la incubación de las células que expresan el antigeno de células neoplásicas con el suero humano que contiene complemento (o de otra fuente alternativa) en ausencia o presencia de diferentes concentraciones del anticuerpo de prueba. La citotoxicidad es luego medida mediante la cuantificación de las células vivas utilizando ALAMAR BLUE ( (Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202 163-171 (1997)) . Los ensayos de control son realizados sin anticuerpo, y con anticuerpo, pero utilizando el suero inactivado por calor y/o utilizando las células que no expresan el antigeno de células neoplásicas en cuestión. Alternativamente, las células sanguíneas rojas pueden ser recubiertas con antígeno neoplásico o péptidos derivados del antígeno neoplásica, y luego el CDC puede ser evaluado mediante la observación de la lisis de células rojas (ver por ejemplo Karjalainen y Mantyjarvi, Acta Pathol Microbiol Scand [C] . 1981 Oct: 89 (5) : 315-9) . Para identificar los anticuerpos antígeno de célula antineoplásica , inhibitorios del crecimiento, se pueden seleccionar los anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células cancerígenas que sobreexpresan el antígeno de célula neoplásica. En una modalidad, el anticuerpo inhibitorio del crecimiento de elección, es capaz de inhibir el crecimiento de las células que expresan el antigeno de célula neoplásica, en cultivo celular por aproximadamente 20 a 100% y preferentemente por aproximadamente 50 a 100% a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µ?/p?? Para seleccionar los anticuerpos que inducen la muerte celular, la pérdida de integridad membranal como se indica por, por ejemplo, PI, azul de tripan o captación de 7AAD pueden ser evaluados con relación al control. El ensayo preferido es el ensayo de captación de PI utilizando las células que expresan el antigeno neoplásica. De acuerdo a este ensayo, las células que expresan el antigeno de célula neoplásica son cultivados en el Medio Eagle Modificado de Dulbeco D-MEM ) : Ham' s F-12 (50:50) suplementado con 10% de FBS inactivado por calor (Hyclone) y L-glutamina 2 mM. (De este modo, el ensayo es realizado en ausencia del complemento y las células efectoras inmunitarias ) . Las células neoplásicas son sembradas a una densidad de 3 x 106 por caja en cajas de 100 x 20 mm y se dejan acoplar toda la noche. El medio es luego retirado o reemplazado con medio fresco solo o medio que contiene 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal apropiado. Las células son incubadas por un periodo de tiempo de 3 días. Después de cada tratamiento, las monocapas son lavadas con PBS y desprendidas mediante tripsinización . Las células son luego centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a 4°C, el botón resuspendido en 3 mi de amortiguador de enlace al Ca2 + enfriado con hielo (Hepes 10 mM, pH 7.4, NaCl 140 mM, CaC12 2.5 mM) y repartidas en alícuotas en tubos de 12 x 75 mi tapados con un tapón de 35 mm ( 1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la eliminación de los grumos celulares. Los tubos reciben luego PI (10 pg/ml) . Las muestras pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo FACSCANMR y FACSCONVERTMR . El software CellQuest (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular como es determinado por la captación de PI pueden ser seleccionados como anticuerpo inductores de la muerte celular. Con el fin de seleccionar los anticuerpos que inducen la apoptosis, está disponible un ensayo de enlace de anexina utilizando células BT474. La fosfatidilserina de la superficie celular (PS) puede ser detectada utilizando cualquiera de los reactivos de tinción de anexina V comercialmente disponibles, los cuales están basados en la alta afinidad de la anexina V para PS. Las células BT474 son cultivadas y sembradas en cajas como se discute en el párrafo precedente. El medio es luego retirado y reemplazado con medio fresco únicamente o el medio que contiene 10 g/ml de anticuerpo monoclonal. Después de un periodo de incubación de tres días, las monocapas son lavadas con PBS y desprendidas mediante tripsinización . Las células son luego centrifugadas, resuspendidas en amortiguador de enlace Ca2+ y repartidas en alícuotas en tubos como se discute anteriormente para el ensayo de muerte celular. Los tubos reciben luego la anexina marcada (por ejemplo, anexina V-FTIC) (1 pg/ml) . Las muestras pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo FACSCAN y el software CellQuest FACSCONVERTMR (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de enlace de anexina con relación al control, son seleccionados como anticuerpos inductores de la apoptosis. Alternativamente, ver por ejemplo, los reactivos de tinción de Anexina V comercialmente disponibles de Roche Applied Science. Mediante conjugación de FITC a la Anexina V es posible identificar y cuantificar las células apoptóticas en una base de célula simple mediante citometría de flujo. La tinción de las células simultáneamente con FITC-anexina V (fluorescencia verde) y el colorante no vital yoduro de propidio (fluorescencia roja) puede proporcionar la discriminación de las células intactas (FITC-PI-), las células casi apoptóticas (FITC+PI-), y las células apoptóticas tardías o necróticas (FITC+PI+) . Además del ensayo de enlace a la anexina, está disponible un ensayo de tinción del ADN utilizando las células BT474. Con el fin de realizar este ensayo, las células BT474 que han sido tratadas con el anticuerpo de interés como se describe en los dos párrafos precedentes, son incubadas con 9 g/ml de HOECHST 33342MR por 2 horas a 37 °C, luego analizada sobre un citómetro de flujo EPICS ELITE, MR (Coulter Corporation) utilizando el software MODFITMR (Verita Software House) . Los anticuerpos que inducen un cambio en el porcentaje de células apoptóticas que es 2 veces o mayor (y preferentemente 3 veces o mayor) que las células no tratadas (hasta 100% de células apoptóticas) pueden ser seleccionados como anticuerpos pro-apoptót icos utilizando este ensayo. Además, la apoptosis elevada dentro de una muestra biológica puede ser confirmada con métodos basados en ácido nucleico que detectan la fragmentación del ADN que es característica de la apoptosis. Cuando se resuelve utilizando electroforesis sobre geles de agarosa, el ADN apoptótico inicialmente tiene un patrón característico de "escalera", en oposición a una mancha de ácidos nucleicos que es observada, por ejemplo, en la necrosis u otra degradación de ADN no específica. Una técnica histoquímica común para detectar la fragmentación del ADN utiliza el ADN marcado en el extremo. Los kits para tal cosa son comercialmente disponibles, tal como el kit de fragmentación de ADN APOLERT (Clontech Laboratorios, Inc., Palo Alto, California) . Este ensayo está basado en la marcación de pseudo extremo de dUTP mediada por desoxinucleotidiltransferasa terminal (Tdt) (TUNEL) , donde Tdt cataliza la incorporación de la fluoresceina-dUTP en los extremos 3 ' -hidroxilo libres del ADN fragmentado en células que sufren apoptosis. Un número de kits de ensayo para biomarcadores de caspasas son comercialmente disponibles. Por ejemplo, el Ensayo de Caspasas Homogéneas (Roche Applied Science, Indianápolis , Indiana), es un ensayo fluorimétrico para la determinación cuantitativa in vitro de la actividad de caspasa en microplacas. El ensayo es particularmente útil para la selección de alto rendimiento permitiendo, por ejemplo, 100 pruebas de placas de 96 pozos, y 400 pruebas sobre placas de 384 pozos (Cat. No. 3 005 372) . Este ensayo permite la detección de varias caspasas, incluyendo Caspasa-2, Caspasa-3, Caspasa-7 y a un grado menor Caspasa-6, Caspasa-8, Caspasa-9 y Caspasa-10, en muestras biológicas, incluyendo, por ejemplo, suero o plasma. El ensayo de Detección de Muerte Celular ELISAPLUS (Cat. No. 1 774 425; Roche Applied Sciences, Indianápolis, Indiana) está basado en un principio de inmunoensayo enzimático de emparedado cuantitativo, utilizando anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra ADN e histonas, respectivamente. Este ensayo permite la detección especifica y la cuantificación de mono- y oligonucleosomas que son liberados hacia el citoplasma de las células que mueren de apoptosis. Éste puede ser utilizado para una variedad de muestras, incluyendo Usados celulares, suero, sobrenadante de cultivo y similares. Los anticuerpos de la invención pueden ser también seleccionados in vivo para la actividad apoptótica utilizando 18F-anexina como un agente de formación de imagen PET . En este procedimiento, la anexina V es radiomarcada con 18F y dada al animal de prueba después de la dosificación con el anticuerpo bajo investigación. Uno de los efectos más tempranos que ocurren en el proceso apoptótico es la eversión de la fosfatidilserina desde el lado interno de la membrana celular hacia la superficie celular externa, donde ésta es accesible a la anexina. Los animales son luego sometidos a formación de imagen PET (ver Yagle et al., J. Nucí Med. 2005 Abril; 46 (4) : 658-66) . Los animales pueden también ser sacrificados y los órganos o tumores individuales pueden ser retirados o analizados para los marcadores apoptóticos siguiendo protocolos estándares. Para seleccionar los anticuerpos que se enlazan a un epitopo sobre antigeno de la célula neoplásica enlazado por un anticuerpo de interés, un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988), puede ser realizado. Alternativamente, o adicionalmente , el mapeo de epitopo puede ser realizado mediante métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos de la invención pueden ser seleccionados para la habilidad ya sea de internalizarse rápidamente después del enlace al antigeno de célula neoplásica en cuestión, o para la habilidad de permanecer sobre la superficie celular después del enlace. En algunas modalidades, por ejemplo en la construcción de algunos tipos de inmunoconj ugados , la habilidad de un anticuerpo para ser internalizado puede ser deseada si la internalización es requerida para liberar la porción de toxina. Alternativamente, si el anticuerpo está siendo utilizado para promover ADCC o CDC, puede ser más deseable que el anticuerpo permanezca sobre la superficie celular. Puede ser utilizado un método de selección para diferenciar estos comportamientos tipo. Por ejemplo, una célula que posee el antigeno de la célula neoplásica puede ser utilizada donde las células son incubadas con IgGl humano (anticuerpo control) o uno de los anticuerpos de la invención a una concentración de aproximadamente 1 g/ml sobre hielo (con 0.1% de azida de sodio para bloquear la internalización) o a 37°C (sin azida de sodio) por 3 horas. Las células son luego lavadas con amortiguador de tinción frío (PBS+1% de BSA+0.1% de azida de sodio) , y son teñidas con IgG anti-humana de cabra-FITC por 30 minutos sobre hielo. La media geométrica de la intensidad de fluorescencia (MFI) es registrada mediante FACS Calibur. Si no se observa diferencia en MFI entre las células incubadas con el anticuerpo de la invención sobre hielo en presencia de azida de sodio y las células observadas a 37°C en ausencia de azida de sodio, el anticuerpo será sospechoso de ser uno que permanezca enlazado a la superficie celular, en vez de ser internalizado. No obstante, si es encontrada una disminución en el anticuerpo teñible superficialmente cuando las células son incubadas a 37°C en ausencia de azida de sodio, el anticuerpo será sospechoso de ser uno que sea capaz de realizar la internalización .

V. Vectores, Células Hospederas y Métodos Recombinantes La invención también proporciona el ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo antigeno de la célula neoplásica, humanizado, los vectores y las células hospederas que comprenden el ácido nucleico, y las técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo. Para la producción recombinante del anticuerpo, el ADN que lo codifica es aislado e insertado dentro de un vector replicable para la clonación posterior (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica para el anticuerpo monoclonal es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleotidicas que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) . Muchos vectores son disponibles. Los componentes vector en general incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento aumentador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. (i) Componente de la Secuencia de Señal El anticuerpo antigeno de la célula neoplásica de esta invención puede ser producido recombinantemente no solo de manera directa, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión especifico en el extremo N de la proteina madura o el polipéptido. La secuencia de señal heteróloga, seleccionada preferentemente es una que es reconocida y procesada (por ejemplo, escindida por una peptidasa de señal) por la célula hospedera. Para células hospederas procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal del anticuerpo antigeno de la célula neoplásica, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa , Ipp? o guias de enterotoxina II estables al calor. Para la secreción en levadura la secuencia de señal nativa puede ser sustituida por ejemplo, por la guia de invertasa de levadura, la guia del factor alfa (incluyendo las guias de factor alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces), o la guia de fosfatasa ácida, la guia de glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en WO 90/13646. En expresión de células de mamífero, las secuencias de señal de mamífero así como las guías secretoras virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple, son disponibles . El ADN para tal región precursora es ligado en la estructura de lectura al ADN que codifica para el anticuerpo antígeno de la célula neoplásica. (ii) Origen del Componente de Replicación Los vectores de expresión y de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que hace posible que el vector se replique en una o más células hospederas seleccionadas. En general, en los vectores de clonación esta secuencia es una que hace posible que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedero, e incluye los orígenes de replicación o las secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación proveniente del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas , el origen del plásmido 2. mu. es adecuado para levadura, y los diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamífero (el origen SV40 puede ser típicamente utilizado solo debido a que éste contiene el promotor temprano) . (iii) Componente del Gen de Selección Los vectores de expresión y de clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) deficiencias autotróficas del complemento, o (c) suministra nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, del gen que codifica para la D-alanina-racemasa para Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedera. Aquellas células que son exitosamente transformadas con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármacos y de este modo sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo más de los marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que hacen posible la identificación de las células competentes para recoger el ácido nucleico del anticuerpo antigeno de la célula neoplásica, tal como DHFR, timidina-cinasa , metalot ioneina-I y II, preferentemente los genes de metalot ioneina de primate, adenosina-desaminasa, ornitina-descarboxilasa , etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR son primeramente identificadas mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedera apropiada cuando es empleado DHFR de tipo silvestre, es la linea celular de ovario de hámster Chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR. Alternativamente, las células hospederas (particularmente las hospederas de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican para el anticuerpo antigeno de la célula neoplásica, la proteina DHFR de tipo silvestre, y otro marcador seleccionable tal como la aminoglucósido-3 ' fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionados mediante crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglucosidico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Ver Patente de los Estados Unidos No. 4,965,199.

Un gen de selección adecuado para el uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)) . El gen de trpl proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de levadura, que carece de la habilidad para desarrollarse en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones Genetics, 85: 12 (1977) . La presencia de la lesión de trpl en el genoma de la célula hospedera de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptofano. Similarmente , las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) son complementadas por plásmidos conocidos que poseen el gen Leu2. Además, los vectores derivados del plásmido circular 1.6 .mu.m, pkDl pueden ser utilizados para la transformación de levaduras Kluyveromyces . Alternativamente, un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina recombinante de ternera fue reportada para K. lactis Van der Berg, Bio/Technology , 8: 135 (1990) . Los vectores de expresión de copias múltiples, estables para la secreción de la albúmina sérica humana recombinante madura por cepas industriales de Luyveromyces , han sido descritos. Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991) . (iv) Componente Promotor Los vectores de expresión y de clonación comprenden usualmente un promotor que es reconocido por el organismo hospedero y está operablemente enlazado al ácido nucleico del anticuerpo antigeno de la célula neoplásica. Los promotores adecuados para el uso con hospederos procariót icos incluyen el promotor phoA, beta-lactamasa y sistemas promotores de lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) , y promotores híbridos tales como el promotor tac. No obstante, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para el uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente enlazada al ADN que codifica para el anticuerpo antígeno de la célula neoplásica. Las secuencias promotoras son conocidas para eucariotes. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases con dirección 5' del sitio donde es iniciada la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases con dirección 5' del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias son anteriormente insertadas dentro de vectores de expresión eucariót icos . Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para el uso con hospederos de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato-cinasa u otras enzimas glucolit icas , tales como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa , hexocinasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa , 3-fosfoglicerato-mutasa, piruvato-cinasa , triosafosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de realizar la transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol-deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalot ioneina , gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa y enzimas responsables para la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión de levadura son además descritos en la Patente Europea EP 73,657. Los aumentadores de levadura también son ventajosamente utilizados con promotores de levadura. La transcripción del anticuerpo antigeno de la célula neoplásica a partir de vectores de células hospederas de mamífero es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, el virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, citomegalovirus , un retrovirus, virus de la hepatitis B y lo más preferentemente el virus 40 de Simio (SV40) , a partir de promotores de mamífero heterólogo, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina , a partir de promotores de choque térmico, con la condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula hospedera . Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son convenientemente obtenidos como un fragmento de restricción del SV40, que también contiene el origen de replicación viral del SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano es convenientemente obtenido como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar ADN en hospederos mamíferos utilizando el virus de papiloma bovino como un vector, se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,419,446. Una modificación de este sistema es descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 4,601,978. Ver también Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) sobre la expresión de ADNc del beta-ínter ferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de t imidina-cinasa proveniente del virus del herpes simple. Alternativamente, la repetición terminal larga del virus de sarcoma de Rous puede ser utilizada como el promotor. (v) Componente del Elemento Aumentador La transcripción de un ADN que codifica para el anticuerpo antigeno de la célula neoplásica de esta invención por eucariotes superiores, es a menudo incrementada por la inserción de una secuencia aumentadora dentro del vector. Muchas secuencias aumentadoras son ahora conocidas de los genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina) . Típicamente, no obstante, se utilizará un aumentador proveniente de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el aumentador del SV40 sobre el lado tardío del origen de replicación (pares de bases 100-270), el aumentador del promotor temprano del citomegalovirus , el aumentador del polioma sobre el lado tardío del origen de replicación, y los aumentadores adenovirales . Ver también Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos aumentadores para la activación de promotores eucariót icos . El aumentador puede ser empalmado dentro del vector en una posición 5' o 3' a la secuencia que codifica para el antígeno antígeno de la célula neoplásica, pero está preferentemente localizado en un sitio 5' desde el promotor. (vi) Componente de Terminación de la Transcripción Los vectores de expresión utilizados en células hospederas eucarióticas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el mARN Tales secuencias son comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3', de los ADNs o de los ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotidicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica para el anticuerpo antigeno de la célula neoplásica. Un componente de terminación de la transcripción útil, es la región de poliadenilación de la hormona bovina del crecimiento. Ver WO94/11026 y el vector de expresión descrito en la presente. (vii) Selección y Transformación de Células Hospederas Las células hospederas son transfectadas o transformadas con los vectores de expresión o de clonación descritos en la presente para la producción de anticuerpos y cultivados en medios nutritivos convencionales modificados como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como los medios, temperatura, pH y similares, pueden ser seleccionadas por el experto en la materia sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para elevar al máximo la productividad de cultivos celulares pueden ser encontrados en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra. Los métodos de transfección de células eucarióticas y transformación de células procarióticas son conocidos para la persona de experiencia ordinaria en la técnica, por ejemplo, CaC12, CaP04, mediada por liposomas y electroporación . Dependiendo de la célula hospedera utilizada, la transformación es realizada utilizando técnicas estándares apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al. Supra, o electroporación, es en general utilizado para procariotes. La infección con Agrobacter ium tumefaciens es utilizada para la transformación de ciertas células vegetales, como se describe por Shaw et al., Gene, 23 315 (1983) y O 89/05859 publicados el 29 de junio de 1989. Para células de mamífero sin tales paredes celulares, el método de precipitación con fosfato de calcio de Gram. y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) puede ser empleado. Los aspectos generales de las transíecciones con sistemas hospederos de célula de mamífero han sido descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,399,216. Las transformaciones dentro de levadura son típicamente llevadas a cabo de acuerdo al método de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc . Nati. Acad. Sci . (EUA) , 76: 3829 (1979) . No obstante, otros métodos para introducir ADN dentro de las células, tal como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes , por ejemplo, polibreno, poliornit ina , pueden ser también utilizadas. Para diversas técnicas para transformar las células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) y Manssur et al., Nature 336: 348-352 (1988) . Las células hospederas adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores en la presente, son las células de procariotes, de levaduras o de eucariotes superiores descritas anteriormente. Los procariotes adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-posit ivos , por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia , por ejemplo, E. coli, Enterobacter , Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilies y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrita en DD 266,170 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces . Un hospedero de clonación E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coliB, E. ciliX1776 (ATCC 31,537), y E. coliW3110 (ATCC 27,325) . Estos ejemplos son ilustrativos en ves de limitantes. Además de los procariotes, los microbios eucariotes tales como hongos filamentosos o levaduras son hospederos de clonación o de expresión adecuados para vectores que codifican para los anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedero eucariótico inferior, comúnmente utilizado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981] Patente Europea EP 139,383 publicada el 2 de Mayo de 1985); Kluyveromyces hosts (Patente de los Estados Unidos No. 4, 943, 529; Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991) ) tal como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol, 154 (2) : 737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424) , K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waitii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135 (1990) ), K. thermotolerans , y K. marxianus; yarrowia (Patente Europea EP 402,226); Pichiapastoris (Patente Europea EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]) ; Candida; Trichoderma reesia (Patente Europea EP 244,234) ; Neurospora crassa (Case et al., Proc. Nati. Acad. SCi. EUA, 76: 5259-5263 [1979]) ; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (P 394,538 publicado el 31 de Octubre 1990) ; y filamentous fungí tal como, por ejemplo, Neurospora , Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991) , y Aspergillus hosts tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81: 1470-1474 [1984] ) y A. niger (Kelly y Hynes, E BO J. , 4: 475-479 [1985] ) . Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente e incluyen, pero no están limitadas a, levaduras capaces de desarrollarse sobre metanol seleccionadas de los géneros que consisten de Hansenula , Candida, Kloeckera , Pichia, Saccharomyces , Torulopsis, y Rhodotorula . Una lista de especies especificas que son ejemplares de esta clase de levaduras puede ser encontrada en C. Anthony, The Biochemistry of Methyfotrophs, 269 (1982) . Las células hospederas adecuadas para la expresión de anticuerpos glucosilados son derivadas de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células de insecto tales como Drosofila S2 y Spodoptera Sf9, asi como células vegetales. Los ejemplos de lineas celulares hospederas de mamífero útiles, incluyen las células de ovario de hámster Chino (CHO) y células COS. Los ejemplos más específicos incluyen la línea CVI de riñon de mono transformada por el SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la línea celular embrionaria humana (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977) ) ; células de ovario de hámster Chino /-DHFR(CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)); células de sertoli de ratón (IM4, Mather, Biol. Reprod. , 23: 243-251 (1989) ) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065) ; y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) . La selección de la célula hospedera apropiada es considerada dentro de la experiencia en la técnica. Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tabaco y tomate pueden ser también utilizadas como hospederos. No obstante, el interés ha sido mayor en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Los ejemplos de lineas celulares hospederas de mamífero útiles son las líneas CV1 de riñon de mono transformadas por el SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la línea de riñon embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) ) ; células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980) ); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980) ) ; células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70); células de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata Búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamario de ratón (MMT060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N-Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) ) ; células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2 ) . Las células hospederas son transformadas con los vectores de expresión o de clonación anteriormente descritos para la producción del anticuerpo antígeno de la célula neoplásica y cultivadas en medios de cultivos convencionales modificados como sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. (vii) Cultivo de Células Hospederas Las células hospederas utilizadas para producir el anticuerpo antígeno de la célula neoplásica de esta invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como el medio FIO de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ( (MEM) , Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Tagle Modificado de Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes de los Estados Unidos No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de los Estados Unidos No. Re. 30,985 pueden ser utilizados como medios de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios pueden ser sumplementados como sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) ; amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN. MR) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micropolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios pueden ser también incluidos a concentraciones apropiadas que podrían ser conocidas para aquellos expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente utilizadas con la célula hospedera seleccionada para la expresión, y serán aparentes para la persona de experiencia ordinaria en la técnica. (ix) Detección de Amplificación/Expresión de Genes La amplificación y/o expresión de genes puede ser medida en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia de Southern convencional, transferencia de Northern para cuantificar la transcripción del mARN (Thomas, Proc. Nad. Acad. Sci . USA . 77: 5201-5205 (1980)], transferencia por puntos (análisis de AND) , o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, con base en las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, pueden ser empleados los anticuerpos que pueden reconocer dúplex o parejas especificas, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína . Los anticuerpos a su vez pueden ser marcados y el ensayo puede ser llevado a cabo donde el dúplex es enlazado a una superficie, de modo que después de la formación del dúplex sobre la superficie, puede ser detectada la presencia del anticuerpo enlazado al dúplex. La expresión del gen, alternativamente, puede ser medida mediante métodos inmunológicos , tales como la tinción inmunohistoquímica de células o secciones titulares, y el ensayo del cultivo celular o de los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión de los anticuerpos del producto génico útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de los fluidos de muestra puede ser ya sea monoclonal o policlonal, y puede ser preparado en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden ser preparados contra un polipéptido antígeno de célula neoplásica de secuencia nativa, o contra un péptido sintético basado en secuencias de ADN proporcionadas en la presente, o contra la secuencia exógena fusionada al ADN del antigeno de la célula neoplásica y que codifica para un epitopo de anticuerpo especifico. (x) Purificación del Anticuerpo Antigeno de la Célula Neoplásica Cuando se utilizan técnicas recombinantes , el anticuerpo puede ser producido intracelularmente , en el espacio periplásmico , o directamente secretado hacia el medio. Si el anticuerpo es producido intracelularmente, como un primer paso, los desechos particulados, ya sea células hospederas o fragmentos Usados, son removidos, por ejemplo, mediante centrifugación o ultraf ilt ración . Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados hacia el espacio periplásmico de E. coli. En resumen, la pasta celular es descongelada en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) en aproximadamente 30 minutos. Los desechos celulares pueden ser removidos mediante centrifugación. Donde el anticuerpo es secretado hacia el medio, los sobrenadantes provenientes de tales sistemas de expresión son en general primeramente concentrados utilizando un filtro de concentración de proteina coraercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede ser incluido en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis, y pueden ser incluidos antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede ser purificada utilizando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita , electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, con la cromatografía de afinidad que es la técnica de purificación preferida. La adecuación de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio de Fe de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede ser utilizada para purificar anticuerpos que están basados en las cadenas pesadas humanas gamma-1, gamma-2 o gamma-4 (Lindmark et al., J. Immunol . Meth . 62: 1-13 (1983) ) . La proteína G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para gamma-3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)) . La matriz a la cual es enlazado el ligando de afinidad es lo más frecuentemente azarosa, pero son disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como el vidrio de poro controlado o el poli ( estirendivinil ) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos de los que pueden ser logrados con azarosa. Donde el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABXMR (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ. ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como el fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía en SEPHAROSAMR sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como columna de ácido poliaspárt ico ) , cromatoenfoque , SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio son también disponibles dependiendo del anticuerpo que va a ser recuperado. Siguiendo cualesquiera pasos de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede ser sometida a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH utilizando un amortiguador de elusión o un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, preferentemente realizada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25 M de sal) .

VI. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas del agonista/antagonista o de las moléculas de anticuerpo utilizadas de acuerdo con la presente invención son preparadas para el almacenamiento mediante mezclado de la molécula que tienen el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16 edición, Osol, A. Ed. (1980) ), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores o pacientes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o bencílico; alquilparabenos tales como metil- o propil-parabeno ; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas , polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; iones contrarios formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteina) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEENMR, PLURONICSMR o polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones de anticuerpo antigeno de la célula neoplásica, liofilizadas, preferidas, son descritas en WO 97/04801, expresamente incorporada por referencia en la presente. La formulación en la presente puede también contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa uno al otro. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente anticuerpos que se enlazan a proteínas de miembros de la familia alternativos o a diferentes epitopos sobre el antígeno de célula neoplásica seleccionado, en una formulación. Los segundos anticuerpos adecuados pueden incluir anticuerpos contra CEA, EGP-I, EGP-2 (por ejemplo, 17-IA) , MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, PAM-4, KC4, TAG-72, EGFR, HER2 /neu , BrE3, Le-Y, A3, Ep-CAM, Tn, y antígenos de Thomson-Friedenreich, antígenos de necrosis neoplásica, ferritina, isoferritina ácida, tenascina, un oncogen, un producto oncogénico, IL-6, IGF-1, IGFR-1, antígenos de angiogénesis neoplásica, tales como el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) , factor de crecimiento placentario (PIGF), fibronectina ED-B, y otros factores de crecimiento vascular, Ga 733, o una combinación de los mismos. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede ser uno que se enlaza al mismo antigeno de célula neoplásica, pero utiliza un epitopo alternativo. En una modalidad adicional, el segundo anticuerpo puede enlazarse a un antigeno de la célula neoplásica alternativo, donde el antigeno de la célula neoplásica se selecciona del grupo de KIM1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. Se contempla que todos los segundos anticuerpos pueden ser inmunoconj ugados o anticuerpos desnudos, y pueden ser anticuerpos multivalentes . Estas combinaciones de anticuerpo pueden ser administradas antes, concurrentemente con o después de la dosis de los anticuerpos de la invención. Alternativamente, o adicionalmente , la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, citocina, agente inhibidor del crecimiento, agente anti-hormonal , agente anti-angiogénico, y/o cardioprotector . Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Estos agentes pueden ser administrados antes, concurrentemente con o después de la dosificación con los anticuerpos de la invención. Las formulaciones que van a ser utilizadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto es fácilmente logrado mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de la liofilización y la reconstitución. Las composiciones terapéuticas en la presente en general son colocadas en un receptor que tiene una compuerta de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de inyección intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La ruta de administración está en concordancia con los métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión mediante la administración intravenosa, intraperitoneal , intracerebral , intramuscular, infraocular, intraarterial o intralesional , la administración tópica, o mediante sistemas de liberación sostenida. Los ingredientes activos pueden ser también atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina o microcápsulas de poli- (met ilmetacrilato ) respectivamente, en sistemas coloidales de distribución de fármaco (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-particulas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Tales técnicas son descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a Edición, Osol, A. Ed. (1980) . Las dosis y las concentraciones de fármaco deseadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular considerado. La determinación de la dosis apropiada o la ruta de administración está muy por dentro de la habilidad de una persona de experiencia ordinaria. Los experimentos con animales proporcionan la guia confiable para la determinación de las dosis efectivas para la terapia en humanos. El escalamiento interespecies de las dosis efectivas puede ser realizado siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics " In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds . , Pergamon Press, New York 1989, pp . 42-96. Cuando la administración in vivo de un anticuerpo antigeno de la célula neoplásica es empleada, las cantidades de dosis normales pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal de mamífero o más por día, preferentemente aproximadamente 1 g/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. La guía respecto a las dosis y métodos particulares de administración se proporciona en la literatura; ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos No. 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, de modo que la administración que se dirige a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar la distribución de una manera diferente de aquella a otro órgano o tejido. Donde la administración de liberación sostenida de un anticuerpo antigeno de la célula neoplásica es deseado en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que requiera administración del anticuerpo, es contemplado el microencapsulamiento del anticuerpo. El microencapsulamiento de las proteínas recombinantes para la liberación sostenida ha sido exitosamente realizado con la hormona humana del crecimiento (rhGH), interferón- ( rhl FN—) , interleucina-2 , y MN rgpl20. Johnson et al., Nat Med., 2: 795-799 (1996) ; Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993) ; Horaet al., Bio/Technology . 8: 755-758 (1990) ; Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp . 439462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y Patente de los Estados Unidos No. 5, 654, 010. Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas fueron desarrolladas utilizando polímero de ácido poli-láctico-coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplio intervalo de propiedades biodegradables . Los productos de degradación de PLGA, los ácidos láctico y glicólico, pueden ser depurados rápidamente dentro del cuerpo humano. Además, la capacidad de degradación de este polímero puede ser ajustada desde meses a años dependiendo de su peso molecular y de la composición. Le is, "Controlled reléase of bioactive agents from lactide/glycolide polymer, " in: M. Chasin y R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990) , pp . 1-41.

VII. Tratamiento con Anticuerpos antígeno de la célula antineoplásica Se contempla que, de acuerdo a la presente invención, las moléculas de anticuerpo o agonista/antagonista antígeno de la célula neoplásica, puedan ser utilizadas para tratar diversas enfermedades o trastornos. Las condiciones o trastornos ejemplares incluyen tumores benignos o malignos, leucemias y malignidades linfoides; otros trastornos tales como trastornos neuronales, gliales, astrocitales , hipotalámicos , glandulares, macrofágicos , epiteliales, estromales, blastocélicos , inflamatorios, angiogénicos e inmunitarios . En general, la enfermedad o trastorno que va a ser tratado es cáncer. Los ejemplos de cánceres que van a ser tratados incluyen, pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o malignidades linfoides. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen el cáncer de células escamosas (por ejemplo, el cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer pulmonar incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células gigantes, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular , cáncer gástrico o estomacal, incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma , cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hematoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello. El cáncer comprenderá en general células que expresan el antígeno neoplásica, tal que el anticuerpo antígeno neoplásico en la presente, es capaz de enlazarse al cáncer. Los métodos para detectar la expresión de los biomarcadores de la invención, y opcionalmente marcadores de citocina, dentro de las muestras biológicas de prueba y de control, comprenden cualesquiera métodos que determinan la cantidad o la presencia de estos marcadores ya sea al nivel del ácido nucleico o de las proteínas. Tales métodos son bien conocidos en la técnica e incluyen pero no están limitados a transferencia de Western, transferencia de Northern, ELISA, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia , citometria de flujo, inmunohistoquímica , técnicas de hibridación de ácido nucleico, métodos de transcripción inversa de ácido nucleico, y métodos de amplificación de ácido nucleico. En modalidades particulares, la expresión de un biomarcador es detectable a un nivel de proteina, utilizando, por ejemplo, anticuerpos que están dirigidos contra las proteínas biomarcadoras específicas. Estos anticuerpos pueden ser utilizados en diversos métodos tales como transferencia de Western, ELISA, tecnologías de multiplexión , inmunoprecipitación o técnicas de inmunohistoquímica. En algunas modalidades, la detección de los marcadores de citocina es lograda mediante electroquimioluminiscencia (ECL) . Cualquiera de estos métodos de detección para biomarcadores y opcionalmente marcadores de citocina, pueden ser combinados con la valoración de la información clínica, métodos de pronóstico convencionales, la expresión de otros factores relacionados al antígeno de la célula neoplásica, particularmente la expresión del antígeno de la célula neoplásica de la superficie celular y los niveles en circulación del antígeno de la célula neoplásica soluble potencial, y la expresión de, o presencia de marcadores de pronóstico clínicamente útiles y característicos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a aquellos anotados en la presente para los pacientes con cáncer. De esta manera, los métodos descritos pueden permitir la determinación más precisa de los sujetos candidatos cuya condición cancerígena pre-maligna podría beneficiarse de la intervención terapéutica con un agente terapéutico antígeno de la célula neoplásica, descrito en la presente. De este modo, en algunas modalidades, un sujeto candidato que tiene un trastorno o condición hiperproliferativa, cancerígena o pre-maligna, que está asociada con las células neoplásicas que expresan el antígeno de la célula neoplásica, es probado para la capacidad de respuesta a un agente terapéutico antígeno de la célula neoplásica de interés, utilizando los ensayos de pronóstico ex vivo descritos en la presente, en donde los efectos del agente terapéutico sobre una o más actividades mediadas por antígeno de la célula neoplásica, son evaluadas. Donde el refinamiento adicional del ensayo de pronóstico ex vivo es deseable, el sujeto candidato puede ser examinado para el nivel de expresión de, o ausencia de expresión de, uno o más factores relacionados al antígeno de la célula neoplásica identificados anteriormente en la presente, uno o más marcadores de pronóstico clínicamente útiles. De esta manera, una muestra biológica que comprende células neoplásicas que expresan el antígeno de la célula neoplásica, pueden ser recolectadas de un sujeto candidato y evaluadas para el nivel de expresión de, o ausencia de expresión de, el o los factores relacionados al antigeno de la célula neoplásica y/o el o los marcadores de pronóstico clínicamente útiles de interés. Cualquier muestra biológica que comprenda las células neoplásicas que expresan el antígeno de la célula neoplásica, como se anotan anteriormente en la presente, pueden ser recolectadas para estos ensayos de pronóstico. Además, cualquier método de detección conocido por aquellos expertos en la materia puede ser utilizado para detectar el nivel de expresión, o la ausencia de expresión, del o de los factores relacionados al antígeno de la célula neoplásica y/o el o los marcadores de pronóstico clínicamente útiles, de interés, como se anotó en otro sitio en la presente. Donde el nivel de expresión de uno o más factores relacionados al antígeno de la célula neoplásica va a ser evaluado con el fin de identificar a un sujeto que tiene un cáncer o condición pre-maligna que responderá al tratamiento con un agente terapéutico antígeno de la célula neoplásica, es recolectada una muestra biológica del sujeto, y el nivel de expresión en esa muestra es comparado al nivel de expresión de ese factor (o factores) en un estándar de referencia o control. Para el nivel de expresión del antígeno de la célula neoplásica de la superficie celular, cualquier muestra biológica que comprenda células neoplásicas que expresen el antígeno de la célula neoplásica puede ser utilizada como se anotó anteriormente en la presente. Para los niveles en circulación del antigeno de la célula neoplásica soluble, una muestra de sangre o muestra que comprenda un componente sanguíneo tal como plasma o suero puede ser obtenida del sujeto candidato. Por "control" o "estándar de referencia" se entiende un estándar que es de la misma fuente biológica (por ejemplo, tejido o fluido corporal) y que distingue a los sujetos que tienen el cáncer o la condición pre-maligna de los sujetos saludables que no están afectados con la enfermedad. Una persona experta en la técnica puede proporcionar un estándar de referencia al tomar una medición de los niveles de expresión de estos factores relacionados al antígeno de la célula neoplásica (por ejemplo, el antígeno de la célula neoplásica de la superficie celular o el antígeno de la célula neoplásica soluble) en sujetos saludables que no tienen la enfermedad, y sujetos que no tienen la enfermedad, controlando para la edad, sexo, raza y similares, y comparando los niveles de expresión para determinar el nivel estándar de expresión que va a ser esperado en un sujeto saludable. En algunas modalidades, el nivel de expresión en el sujeto candidato que tiene la condición cancerígena pre-maligna es al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300% mayor que el nivel de expresión en el estándar de referencia. Se reconoce que la aplicabilidad del tratamiento con un agente terapéutico antígeno de la célula neoplásica puede ser evaluada mediante la detección del nivel de expresión de uno o más de estos factores relacionados al antigeno de la célula neoplásica, en donde un nivel incrementado de expresión en una muestra biológica con relación al estándar de referencia, es suficiente para establecer que el sujeto tiene una condición cancerígena o pre-maligna que responderá al tratamiento con el agente terapéutico antígeno de la célula neoplásica de interés, sin tener que realizar selección adicional para los efectos ex vivo del agente terapéutico antígeno de la célula neoplásica sobre las actividades mediadas por el antígeno de la célula neoplásica, tal como la supervivencia y proliferación celulares, y/o la actividad ADCC. La presencia de los antígenos de célula neoplásica de interés descrita en la presente dentro de una muestra biológica obtenida de un sujeto candidato, puede ser también determinada al nivel de ácido nucleico. Las técnicas basadas en ácido nucleico para evaluar la expresión, son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, la determinación del nivel de mARN biomarcador en una muestra biológica. Muchos métodos de detección de expresión utilizan el ARN aislado. Cualquier técnica de aislamiento del ARN que no seleccione contra el aislamiento del mARN puede ser utilizada para la purificación del ARN (ver, por ejemplo, Ausubel et al., ed. (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York) . Además, grandes números de muestras de tejido pueden ser fácilmente procesados utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de un solo paso descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4,843,155. De este modo, en algunas modalidades, es evaluada la detección de un biomarcador u otra proteina de interés al nivel del ácido nucleico utilizando sondas de ácido nucleico. El término "sonda de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula que sea capaz de enlazarse selectivamente a un objetivo específicamente pretendido de molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un trascrito nucleotidico . Las sondas pueden ser sintetizadas por una persona experta en la materia, o derivadas de preparaciones biológicas apropiadas. Las sonadas pueden ser específicamente diseñadas para ser marcadas, por ejemplo, con un marcador radioactivo, un marcador fluorescente, una enzima, un marcador quimioluminiscente, un marcador colorimétrico, u otros marcadores o etiquetas que son discutidos anteriormente o que son conocidos en la técnica. Los ejemplos de moléculas que pueden ser utilizadas como sondas incluyen, pero no están limitados a, ARN y AD . Por ejemplo, el mARN aislado puede ser utilizado en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, pero no están limitados a, análisis de Southern o de Northern, análisis de reacción en cadena de polimerasa y arreglos de sonda. Un método para la detección de los niveles de mARN involucran poner en contacto el mARN aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridarse al mARN codificado por el gen que es detectado. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse específicamente bajo condiciones estrictas a un mARN o ADN genómico que codifica para un biomarcador, un factor relacionado a CD40, o un marcador de pronóstico clínicamente útil descrito anteriormente en la presente. La hibridación de un mARN con la sonada indica que el biomarcador u otra proteína objetivo de interés está siendo expresado. En una modalidad, el mARN es inmovilizado sobre una superficie sólida y puesto en contacto con una sonda, por ejemplo al correr el mARN aislado sobre un gel de agarosa y transfiriendo el mARN desde el gel hacia una membrana, tal como nitrocelulosa . En una modalidad alternativa, la o las sondas son inmovilizadas sobre una superficie sólida y el mARN es puesto en contacto con la o las sondas, por ejemplo, en un arreglo de chip de genes. Una persona experta en la técnica puede adaptar fácilmente los métodos de detección mARN conocidos para utilizarse en la detección del nivel de mARN que codifica para los biomarcadores u otras proteínas de interés. Un método alternativo para determinar el nivel de mARN de interés en una muestra involucra el proceso de amplificación del ácido nucleico, por ejemplo, mediante el RT-PCR (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,683,202) , reacción en cadena de ligasa (Barany (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 189-193), replicación de secuencia auto-sostenida (Guatelli et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), replicasa Q-Beta (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6: 1197), replicación de círculo giratorio (Patente de los Estados Unidos No. 5,854,033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de las moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en cantidades muy bajas. En aspectos particulares de la invención, la expresión del biomarcador, o la expresión de un factor relacionado al antígeno de la célula neoplásica u otro marcador de pronóstico clínicamente útil, es evaluado mediante RT-PCR fluorogénica cuantitativa (por ejemplo, el Sistema TaqMan®) .

Los niveles de expresión de un ARN de interés pueden ser monitorizados utilizando un análisis de transferencia en membrana (tal como el que se utiliza en el análisis de hibridación tal como Northern, transferencia por puntos y similares), o micropozos, tubos de ensayo, geles, esferas o fibras (o cualquier otro soporte sólido que comprenda ácidos nucleicos enlazados) . Ver Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 y 5,445,934, las cuales son incorporadas por referencia en la presente. La detección de la expresión puede también comprender el uso de sondas de ácido nucleico en solución. En una modalidad de la invención, son utilizados microarreglos para detectar la expresión de uno o más biomarcadores , factores relacionados al antigeno de la célula neoplásica, y/o marcadores de pronóstico clínicamente útiles. Los microarreglos son particularmente muy adecuados para este propósito debido a la reproducibilidad entre diferentes experimentos. Los microarreglos de ADN proporcionan un método para la medición simultánea de los niveles de expresión de grandes números de genes. Cada arreglo consiste de un patrón reproducible de sondas de captura acopladas a un soporte sólido. El ARN o el ADN marcados son hibridados a las sondas complementarias sobre el arreglo y luego detectados mediante exploración con láser. Las intensidades de hibridación para cada sonda sobre el arreglo son determinadas y convertidas a un valor cuantitativo que representa los niveles relativos de expresión de los genes. Ver, Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,040,138, 5,800,992 y 6,020,135, 6,033,860, y 6,344,316, las cuales son incorporadas por referencia en la presente. Los arreglos oligonucleotidicos de alta densidad son particularmente útiles para determinar el perfil de expresión del gen para un gran número de ARN en una muestra. Las técnicas para la síntesis de estos arreglos utilizando métodos de síntesis mecánica son descritos por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,384,261, incorporada por referencia en la presente. Aunque es preferida una superficie de arreglo plano, el arreglo puede ser fabricado sobre una superficie de virtualmente cualquier forma o incluso una pluralidad de superficies. Los arreglos pueden ser péptidos o ácidos nucleicos sobre esferas, geles, superficies poliméricas, fibras tales como fibras ópticas, vidrio o cualquier otro sustrato apropiado, ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,770,358, 5,789,162, 5,708,153, 6,040,193 y 5,800,992, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia para todos los propósitos. Los arreglos pueden ser empaquetados de una manera tal como para permitir los diagnósticos u otra manipulación de un dispositivo todo incluido. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,856,174 y 5,922,591, incorporadas por referencia en la presente. En un procedimiento, el mARN total aislado de la muestra es convertido a cARN marcado y luego hibridado a un arreglo oligonucleotidico . Cada muestra es hibridada a un arreglo separado. Los niveles relativos del transcrito pueden ser calculados por referencia a los controles apropiados presentes sobre el arreglo y en la muestra. Mientras que el cáncer puede ser caracterizado por la sobreexpresión del antigeno neoplásica, la presente solicitud proporciona además un método para tratar el cáncer, que no es considerado como un cáncer que sobreexpresa antigeno neoplásica. Para determinar la expresión del antigeno neoplásico en el cáncer, están disponibles diversos ensayos de diagnóstico/pronóstico. En una modalidad, la sobreexpresión del antigeno neoplásico puede ser analizada mediante IHC. Secciones titulares incrustadas en parafina provenientes de una biopsia neoplásica pueden ser sometidas al ensayo IHC y de acuerdo a los criterios de intensidad de tinción de proteínas antígenos neoplásicas, como sigue: Calificación 0 No se observa tinción o la tinción membranal es observada en menos de 10% de las células neoplásicas.

Calificación 1+ Es detectada una tinción membranal leve/escasamente perceptible en más de 10% de las células neoplásicas. Las células son solo obtenidas en parte de su membrana.

Calificación 2+ Es observada una tinción membranal completa débil a moderada en más de 10% de las células neoplásicas.

Calificación 3+ Es observada una tinción membranal completa moderada a fuerte en más de 10% de las células neoplásicas.' Aquellos tumores con calificaciones de 0 o de 1+ para la evaluación de la sobreexpresión del antigeno neoplásica, pueden ser caracterizadas como no sobreexpresadoras del antigeno neoplásica, mientras que aquellos tumores con calificaciones 2+ o 3+ pueden ser caracterizados como sobreexpresadores del antigeno neoplásica. Alternativa o adicionalmente , los ensayos FISH tales como el INFORMMR (vendido por Ventana, Ariz.) o PATHVISIONMR (Vysis, 111.) pueden ser llevados a cabo sobre tejido neoplásica incrustado en parafina, fijado con formalina, para determinar el grado (si lo hay) de 1 sobreexpresion del antígeno neoplásico en el tumor. Además, la sobreexpresion o amplificación del antigeno neoplásico puede ser evaluada utilizando un ensayo de diagnóstico in vivo, por ejemplo, mediante la administración de una molécula (tal como un anticuerpo) que se enlaza a la molécula que va a ser detectada y está marcada con un marcador detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo) y explorando externamente al paciente para la localización del marcador. En una modalidad preferida, los antigenos neoplásicos son seleccionados para la dirección por comparación del nivel de expresión del antigeno, en comparación con el tejido saludable vecino o con el tejido normal combinado. Los antigenos neoplásicos candidatos, preferidos, incluyen aquellos con al menos 3 veces (300%) de expresión incrementada con relación al tejido normal circunvecino, y en donde este incremento de 3 veces es observado en comparación con una gran parte de las muestras de tejido normales, comercialmente disponibles, combinadas. La selección para antigenos neoplásicos preferidos puede ser llevada a cabo utilizando microscopía de captura con láser para disectar los tejidos cancerígenos de los adyacentes normales, seguido por el análisis de microarreglo expresional utilizando chips estándares comercialmente disponibles tales como el chip estándar U133 de Affimetriz (Cat. # 900370) (ver por ejemplo, Yang et al, (2005) Oncogene, 10-31) . Alternativamente, los chips a la medida que contienen muestras de ácido nucleico derivadas de combinados de muestras tisulares de pacientes, agrupadas por tipo de cáncer, pueden ser elaboradas y sondeadas para analizar los perfiles de expresión (ver por ejemplo Makino et al, Dis Esophagus. 2005; 18(1) : 37-40) . Donde el cáncer que va a ser tratado es cáncer independiente de hormona, la expresión de la hormona (por ejemplo, andrógeno) y/o su receptor cognado en el tumor puede ser evaluado utilizando cualquiera de los diversos ensayos disponibles, por ejemplo, como se describió anteriormente. Alternativamente, o adicionalmente , el paciente puede ser diagnosticado como poseedor del cáncer independiente de hormonas ya que éstos no responden más a la terapia anti-andrógena . En ciertas modalidades, un inmunoconj ugado que comprende el anticuerpo antigeno neoplásico conjugado con un agente citotóxico es administrado al paciente. Preferentemente, el inmunoconj ugado y/o la proteina del antigeno de la célula neoplásica a la cual se enlaza, es o son internalizados por la célula, dando como resultado una eficacia terapéutica incrementada del inmunoconj ugado de la muerte de la célula cancerosa a la cual se enlaza. En una modalidad preferida, el agente citotóxico se dirige a o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Los ejemplos de tales agentes citotóxicos incluyen maytansinoides , caliqueamicinas , ribonucleasas y endonucleasas de AD . Los anticuerpos antigeno de la célula antineoplásica o los inmunocon ugados son administrados a un paciente humano de acuerdo con los métodos conocidos, tal como mediante administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o mediante infusión continua en un periodo de tiempo, mediante las rutas intramuscular, intraperitoneal , intracerebroespinal , subcutánea, int ra-art icular , intrasinovial , intratecal, oral, tópica, o por inhalación. La administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo es la preferida. Otros regímenes terapéuticos pueden ser combinados con la administración del anticuerpo antígeno de la célula neoplásica. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica simple, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferentemente existe un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas (revisión ver Lin et al (2005) Clinical Cáncer Research 11 : 129-138) . En una modalidad, el tratamiento de la presente invención involucra la administración combinada de un anticuerpo antigeno de la célula neoplásica (o anticuerpos) y uno o más agentes quimioterapéut icos o agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo la coadministración de cocteles de diferentes agentes quimioterapéut icos . Los agentes quimioterapéuticos preferidos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina . Los esquemas de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden ser utilizados de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes o como es determinado empíricamente por el experto en la materia. Los esquemas de preparación y dosificación para tal quimioterapia son también descritos en Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992) . El anticuerpo puede ser combinado con un compuesto ant i-hormonal ; por ejemplo, un compuesto ant i-est rógeno tal como tamoxifeno; ant i-progesterona tal como onapristona (ver, Patente Europea EP 616 812) ; o un ant i-andrógeno tal como flutamida, en dosis conocidas para tales moléculas. Donde el cáncer que va a ser tratado es cáncer independiente de las hormonas, el paciente puede haber sido previamente sometido a terapia anti-hormonal y, después de que el cáncer se vuelve independiente de las hormonas, el anticuerpo antígeno de la célula neoplásica (y opcionalmente otros agentes como se describe en la presente) puede ser administrado al paciente.

En una modalidad alternativa, los anticuerpos inmunoconj ugados pueden ser utilizados en combinación con un anticuerpo desnudo, en donde el anticuerpo no conjugado es el mismo anticuerpo, o una variante del anticuerpo, como aquel utilizado en el inmunoconj ugado . El anticuerpo desnudo puede ser administrado primeramente ya sea para enlazar y para bloquear los sitios de enlace de baja afinidad o no específicos. Alternativamente, si el anticuerpo desnudo tiene actividad de ADCC o CDC, éste puede ser administrado para despejar tantas células neoplásicas objetivo como sea posible por una de estas actividades. Luego, el anticuerpo inmunoconj ugado puede ser administrado para matar cualesquiera células neoplásicas remanentes. De esta manera, el inmunoconj ugado puede ser administrado en dosis más pequeñas y puede reducir cualesquiera efectos colaterales que puedan estar asociados con la porción toxina del conjugado. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriormente mencionados, son aquellas actualmente utilizadas y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente y del anticuerpo antígeno de la célula neoplásica. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que va a ser tratada, como se definió anteriormente, la severidad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo es administrado para fines preventivos o terapéuticos, si el anticuerpo está conjugado a un fármaco o a un radioisótopo, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo es adecuadamente administrado al paciente a cualquier tiempo o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 Y^q/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0.1-20 mg/kg) del anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, por ejemplo, ya sea mediante una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 yg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para las administraciones repetidas sobre varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. La dosis preferida del anticuerpo estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. De este modo, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) puede ser administrada al paciente. Tales dosis pueden ser administradas intermitentemente, por ejemplo cada semana, o cada tres semanas (por ejemplo tal que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo antigeno de la célula neoplásica) . Los intervalos de dosis pueden estar en el intervalo de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, o de aproximadamente 7 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el método el tratamiento puede comprender una administración simple de una dosis terapéuticamente efectiva o múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente efectiva. Además una dosis de carga más alta inicial, seguida por una o más dosis más bajas, puede ser administrada. Un régimen de dosificación ejemplar comprende la administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo antigeno de la célula neoplásica. No obstante, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia es fácilmente monitorizado por técnicas y ensayos convencionales.

La presente solicitud contempla un método para distribuir un agente de diagnóstico/detección o terapéutico a una célula diana u objetivo. El agente de diagnóstico/detección puede ser un agente previamente descrito, tal como un agente fotoactivo, un radionúclido o un agente de contraste. El agente terapéutico puede también ser un agente previamente descrito, tal como un radionúclido, un inmunomodulador , una hormona o antagonista hormonal, una enzima o inhibidor de enzima, un agente terapéutico fotoactivo, un agente citotóxico y una combinación de los mismos. El método contempla la provisión de la composición de la invención y la administración de éste a un paciente en necesidad del mismo. Los anticuerpos inmunoconj ugados de la invención pueden ser administrados primeramente, y después de la depuración de la corriente sanguínea, puede ser administrada una molécula portadora que comprende el agente de diagnóstico/detección o terapéutico o la combinación de los mismos, en donde la molécula portadora se enlazará a los anticuerpos de la invención. La molécula portadora puede enlazarse a uno o más sitos sobre los anticuerpos o inmunocon ugados de la invención. Aparte de la administración de la proteína anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo mediante terapia génica. Tal administración del ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, es abarcada por la expresión "administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo". Ver, por ejemplo, WO96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996 concerniente al uso de la terapia génica para generar anticuerpos int racelulares . Existen dos procedimientos mayores para obtener el ácido nucleico ( opcionalmente contenido en un vector) dentro de las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para la distribución in vivo el ácido nucleico es inyectado directamente al paciente, usualmente en el sitio donde el anticuerpo es requerido. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente son removidas, el ácido nucleico es introducido dentro de estas células aisladas y las células modificadas son administradas al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que son implantadas dentro del paciente (ver por ejemplo Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,892,538 y 5,283,187) . Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos dentro de las células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido dentro de las células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del hospedero pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico dentro de las células de mamífero in vitro, incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE- dextrano, método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente utilizado para la distribución ex vivo del gen es un retrovirus. Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo, actualmente preferidas, incluyen la transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus del Herpes simple I, o virus adeno-asociado) y sistemas basados en lípidos (los lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que se dirige a las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana de la superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor sobre la célula objetivo, etc. Donde son empleados liposomas, las proteínas que se enlazan a una proteína de la membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis, pueden ser utilizadas para dirección al objetivo y/o para facilitar la absorción, por ejemplo proteínas de cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en el ciclo, y proteínas que se dirigen a la localización intracelular y aumentan la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por el receptor es descrita, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); y agner et al. Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990) . Para una revisión de los protocolos de marcación de genes y terapia con genes actualmente conocidos, ver Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992) . Ver también O 93/25673 y la referencia citada en la presente.

VIII. Estudios de Seguridad Los anticuerpos de la invención serán examinados para las características de seguridad y toxicológicas . Los lineamientos para este tipo de estudios pueden ser encontrados en el documento expedido por la división CBER de USDA, "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use" (ver http://www.fda.gov/cber/gdlns/ptc_mab.pdf) incorporada por referencia en la presente. En general, los anticuerpos candidatos deben ser seleccionados en estudio preclínicos utilizando un número de muestras de tejidos humanos y/o tipos de células humanas aisladas para evaluar el enlace del tejido no objetivo y la reactividad cruzada. Después de un resultado satisfactorio a partir de estos estudios en tejidos humanos, un panel de muestras de tejidos o células aisladas provenientes de una variedad de especies animales, pueden ser seleccionados para identificar una especie adecuada para el uso en los estudios toxicológicos generales. Si no es identificada ninguna especie animal de reactividad cruzada, otros tipos de modelos pueden ser considerados apropiados. Estos otros modelos pueden incluir estudios tales como modelos de xenoinjerto, donde las células neoplásicas humanas son implantadas en un hospedero roedor, o el uso de un anticuerpo monoclonal sustituto que reconoce el antigeno de célula neoplásica correspondiente en la especie animal elegida para los estudios toxicológicos . Se debe apreciar que los datos provenientes de estos tipos de modelos alternativos serán primeramente aproximaciones y la prosecución hacia especies superiores debe ser realizada con precaución . Para un anticuerpo desnudo candidato, pueden ser realizados estudios que buscan la tolerancia simple. En estos estudios del anticuerpo terapéutico candidato, se realiza un intento para caracterizar el índice terapéutico de la molécula candidata, por la observación de cualesquiera efectos farmacodinámicos dependientes de la dosis. Debe ser utilizada una amplia gama de dosis (por ejemplo desde 0.1 mg/kg hasta 100 mg/kg) . Las diferencias entre el número de antígeno de la célula neoplásica, la afinidad del anticuerpo candidato para el objetivo animal de reactividad cruzada y las diferencias en la respuesta celular después del enlace del anticuerpo, deben ser considerados en la estimación del índice terapéutico. Los estudios farmacodinámicos y farmacocinéticas deben ser también llevados a cabo en un modelo animal apropiado para ayudar a las consideraciones de dosis iniciales en la comunidad cuando el anticuerpo candidato es probado en humanos. Para los inmunoconj ugados candidatos, deben ser realizados estudios de estabilidad del conjugado, in vivo. Óptimamente, los estudios farmacodinámicos y farmacocinéticas deben ser llevados a cabo en los componentes individuales del inmunoconj ugado para determinar las consecuencias de cualesquiera productos de degradación provenientes del inmunoconj ugado candidato. Los estudios farmacodinámicos y farmacocinéticas deben ser llevados a cabo anteriormente en un modelo animal apropiado para ayudar a las consideraciones de dosis inicial en la comunidad. Debe ser dada consideración adicional para satisfacer el diseño del estudio cuando el fármaco será administrado en combinación con el pre-tratamiento con el anticuerpo desnudo. Los estudios de seguridad deben ser llevados a cabo con el anticuerpo desnudo solo, y los estudios deben ser diseñados con el inmunoconj ugado tomando en cuenta que las dosis finales del inmunoconj ugado serán menores en este tipo de régimen de tratamiento . Para los radio-inmunoconj ugados , los estudios de distribución en tejidos animales deben ser llevados a cabo para determinar los datos de biodistribución . Además, debe ser realizada una contabilidad de la degradación metabólica de la dosis total de la radioactividad administrada, con los puntos tempranos y tardíos en el tiempo que deben ser tomados. Los radio-inmunoconj ugados pueden ser probados para la estabilidad in vítro utilizando suero o plasma, y deben ser desarrollados los métodos para medir los porcentajes de radionúclido libre, compuestos no anticuerpos radio-inmunoconj ugados y marcados.

IX. Artículos de Fabricación En otra modalidad más de la invención, un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente, es proporcionado. El artículo de fabricación comprende un receptor y una etiqueta o inserto de envase sobre o asociado con el receptor. Los receptores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, vasos, jeringas, etc. Los receptores pueden ser formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El receptor mantiene una composición que es efectiva para tratar la condición y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo el receptor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo antígeno de la célula neoplásica. La etiqueta o el inserto de envase indica que la composición es utilizada para tratar la condición de elección, tal como el cáncer. En una modalidad, la etiqueta o el inserto de envase indica que la composición que comprende el anticuerpo que enlaza el antigeno de la célula neoplásica, puede ser utilizado para tratar el cáncer que expresa un antigeno de la célula neoplásica. La etiqueta o el inserto de envase puede también indicar que la composición puede ser utilizada para tratar el cáncer, en donde el cáncer no está caracterizado por la sobreexpresión del antigeno de la célula neoplásica. Por ejemplo, mientras el presente inserto de envase para HERCEPTI . RTM indica que el anticuerpo es utilizado para tratar pacientes con cáncer de mama metastático cuyos tumores sobreexpresan la proteina ErbB2, el inserto de envase en la presente puede indicar que el anticuerpo o la composición es utilizada para tratar el cáncer, no obstante el grado de sobreexpresión del antigeno de la célula neoplásica. En otras modalidades, el inserto de envase puede indicar que el anticuerpo o la composición pueden ser utilizados para tratar el cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama metastático) ; cáncer independiente de hormonas; cáncer de próstata (por ejemplo cáncer de próstata independientemente de andrógenos) ; cáncer de pulmón (por ejemplo cáncer pulmonar de células gigantes) ; cáncer de colon, rectal o colorrectal ; o cualquiera de las otras enfermedades o trastornos descritos en la presente. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer receptor con una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un primer anticuerpo que se enlaza al antígeno de la célula neoplásica y que inhibe el crecimiento de las células cancerígenas que sobreexpresan el antígeno de la célula neoplásica; y (b) un segundo receptor con una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un segundo anticuerpo que se enlaza al antígeno de la célula neoplásica. El artículo de fabricación de esta modalidad de la invención puede comprender además un inserto de envase que indica que la primera y segunda composiciones de anticuerpo pueden ser utilizadas para tratar el cáncer. Además, el inserto de envase puede instruir al usuario de la composición (que comprende un anticuerpo que se enlaza al antígeno de célula neoplásica) para combinar la terapia con el anticuerpo y cualquiera de las terapias adjuntas descritas en la sección precedente (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente anti-angiogénico , un compuesto anti-hormonal , y/o una citocina). Alternativamente, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) receptor que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Éste puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

X. Usos No Terapéuticos para el Anticuerpo Antigeno de la Célula Neoplásica Los anticuerpos (por ejemplo los anticuerpos antigeno de la célula antineoplásica ) de la invención tienen aplicaciones no terapéuticas adicionales. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser utilizados como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos son inmovilizados sobre una fase sólida tal como una resina de Sephadex o papel filtro, utilizando métodos bien conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado es puesto en contacto con una muestra que contiene la proteina del antigeno de la célula neoplásica (o fragmento de la misma) que va a ser purificada, y después de esto el soporte es la base con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra, excepto la proteina del antigeno de la célula neoplásica, que es enlazada al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte es lavado con otro solvente adecuado, tal como amortiguador de glicina, pH 5.0, que liberará la proteina del antigeno de la célula neoplásica del anticuerpo. Los anticuerpos antigeno de la célula ant ineoplásica pueden ser también útiles en ensayos de diagnóstico para la proteina de antigeno de la célula neoplásica, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos o sueros específicos. Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo será marcado típicamente con una porción detectable. Numerosos marcadores están disponibles, los cuales pueden en general ser agrupados en las siguientes categorías: (a) Radionúclidos tales como aquellos previamente discutidos. El anticuerpo puede ser marcado con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs . (1991) por ejemplo, y la radioactividad puede ser medida utilizando conteo de cintilación. (b) Marcadores fluorescentes tales como quelatos de las tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, lisamina, ficoeritrina y Rojo Texas está disponibles. Los marcadores fluorescentes pueden ser conjugados al anticuerpo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede ser cuantificada utilizando un fluorímetro. (c) Diversos marcadores enzima-sustrato están disponibles y la Patente de los Estados Unidos No. 4,275,149 proporciona una revisión de algunos de éstos. La enzima en general cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede ser medida utilizando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede ser medido espectrofotométricamente . Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia son descritas anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se vuelve electrónicamente excitado por una reacción química y puede luego emitir luz que puede ser medida (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de los Estados Unidos No. 4, 737, 456), luciferina, 2 , 3-dihidroftalazinodionas , malato-deshidrogenasa , ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO) , fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa , glucoamilasa , lisozima, oxidasas de sacáridos (por ejemplo, glucosa-oxidasa, galactosa-oxidasa , y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa ) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xant ina-oxidasa ) , lactoperoxidasa , microperoxidasa , y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a los anticuerpos son descritas en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay , in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981) . Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano (HRPO) con la hidrógeno-peroxidasa como un sustrato, en donde la hidrógeno-peroxidasa oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) ) ; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenil-fosfato como sustrato cromogénico ; y (iii) beta-D-galactosidasa (beta-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-beta-D-galactosidasa) o el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-beta-D-galactosidasa. Están disponibles otras numerosas combinaciones de enzima-sustrato para aquellos expertos en la materia. Para una revisión general de éstos, ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,275,149 y 4,318,980. Algunas veces, el marcador está indirectamente conjugado con el anticuerpo. El experto en la materia estará enterado de las diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de marcadores mencionados anteriormente pueden ser conjugadas con avidina, o viceversa. La biotina se enlaza selectivamente a la avidina y de este modo, el marcador puede ser conjugado con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo es conjugado con un pequeño hapteno (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados anteriormente es conjugado con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina) . De este modo, la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo puede ser lograda. En otra modalidad más de la invención, el anticuerpo antigeno de la célula neoplásica no necesita ser marcado, y la presencia del mismo puede ser detectada utilizando un anticuerpo marcado que se enlaza al anticuerpo antigeno de la célula neoplásica. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser empleados en cualquier método de ensayo conocido, tal como los ensayos de enlace competitivo, ensayos de emparedado directo e indirecto, y ensayos de inmunoprecipitación . Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987) . Para la inmunohistoquimica , la muestra neoplásica puede ser fresca o congelada, o puede ser incrustada en parafina y fijada con un conservador tal como formalina, por ejemplo.

Los anticuerpos pueden ser también utilizados para ensayos de diagnóstico in vivo. En general, el anticuerpo es marcado con un radionúclido de modo que el tumor pueda ser localizado utilizando inmunoscintiografia . Como un asunto de conveniencia, los anticuerpos de la presente invención pueden ser proporcionados en un kit, por ejemplo, una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Donde el anticuerpo es marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o el fluoróforo detectable). Además, pueden ser incluidos otros aditivos tales como estabilizadores, amortiguadores (por ejemplo, un amortiguador de bloqueo o amortiguador de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden ser variadas ampliamente para proporcionar las concentraciones en solución de los reactivos que sustancialmente optimizan la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden ser proporcionados como polvos secos, usualmente liofilizados , incluyendo excipientes que después de la disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada. Los detalles adicionales de la invención son ilustrados por los siguientes Ejemplos no limitantes. Las descripciones de todas las citas en la especificación son expresamente incorporadas por referencia en la presente.

XI. EJEMPLOS EJEMPLO 1 Selección de los Antigenos Asociados al Tumor, para la dirección al objetivo A. Disección con láser de las células neoplásicas y normales adyacentes y producción de ARN a partir de las células disectadas. Los tejidos normales y cancerosos fueron recolectados de pacientes utilizando microdisección de captura con láser (LCM por sus siglas en inglés), y el ARN fue preparado a partir de estos tejidos, utilizando técnicas que son bien conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Ohyama et al. (2000) Biotechniques 29: 530-6; Curran et al. (2000) Mol. Pathol. 53: 64-8; Suarez-Quian et al. (1999) Biotechniques 26: 328-35; Simone et al. (1998) Trends Gerzet 14: 272-6; Conia et al. (1997) 3. Clin. Lab. Anal. 11: 28-38; Emmert-Buck et al. (1996) Science 274: 998-1001) . Debido a que LCM proporciona el aislamiento de tipos celulares específicos para proporcionar una muestra celular sustancialmente homogénea, ésta proporcionó una muestra de ARN similarmente pura.

B. Análisis de Microarreglo Producción del ADNc: el ARN total producido a partir de las células disectadas fue luego utilizado para producir ADNc utilizando un Kit de Síntesis de ADNc Affymetrix Two-Cycle (Cat. # 900432) . 8 µ? del ARN total fueron utilizados con 1 µ? del cebador T7-(dT) 24 (50 pmol/µ?) en una reacción de 11 µ? que fue calentada a 70°C por 12 minutos. La mezcla fue luego enfriada hasta la temperatura ambiente por cinco minutos. Se agregaron 9 µ? de mezcla maestra (4 µ? de amortiguador de ADNc de la hebra 5x, 2 µ? de DTT 0.1 M, 1 µ? de mezcla de dNTP 10 mM, 2 µ? de Superscript II (600 U/µ?) ) y la mezcla se incubó por 2.5 horas a 42°C (el volumen total de la mezcla fue de 20 µ?) . Después del enfriamiento sobre hielo, la síntesis de la 2a hebra fue completada como sigue: 20 µ? de la mezcla del paso anterior se mezclaron con 130 µ? de la mezcla maestra de segunda hebra (91 µ? de agua, 30 µ? de Amortiguador de Reacción de Segunda Hebra 5x, 3 µ? de mezcla de dNTP 10 mM, 1 µ? de ADN-ligasa de E. coli a 10 ?/µ?, 4 µ? de ADN-polimerasa I de E. coli a 10 U/µ? I, 1 µ? de ARNasa H de E. coli a 2 U/µ?) y se incubó por 2 horas a 16°C por 10 minutos. Después del enfriamiento sobre hielo, el ADNds fue purificado a partir de la mezcla de reacción. Brevemente, se utilizó un Kit de Purificación QiaQuick PCT (Qiagen, Cat. # 28104) , y 5 volúmenes del amortiguador PB a 1 volumen de la mezcla de ADNc. El ADNc fue luego purificado sobre una columna giratoria QIAquick de acuerdo a las instrucciones del fabricante, para producir un volumen final de 60 µ?. Producción de cARN marcado con biotina. El ADNc producido y purificado anteriormente fue luego utilizado para elaborar el ARN marcado con biotina como sigue: 60 µ? de ADNc recuperados de la columna QIAQuick se redujeron a un volumen de 22 µ? en un vacio de velocidad media con calor. Éste se utilizó luego con un Kit de Transcripción de ARN de Alto Rendimiento ENZO BioArray (Cat. # 4265520) . En resumen, una mezcla maestra que contenia 4 µ? del amortiguador de reacción ??? HY, 4 µ? de ribonucleótidos marcados con biotina lOx, 4 µ? de DTT, 4 µ? de la mezcla de inhibidor de ARN, y 2 µ? de la ARN-polimerasa T7 se agregaron a los 22 µ? del ADNc purificado, y se dejaron incubar a 37°C por 4 a 6 horas. La reacción fue luego purificada utilizando un Kit Qiagen RNeasy (Cat. # 74104) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Fragmentación del cARN . 15 a 20 µg del cARN del paso anterior fueron mezclados con 8 µ? del amortiguador de fragmentación 5x (Tris-acetato 200 mM, pH 8.1, acetato de potasio 500 mM, acetato de magnesio 150 mM) y agua hasta un volumen final de 40 µ?. La mezcla se incubó a 94°C por 35 minutos. Típicamente, este protocolo de fragmentación produce una distribución de fragmentos de ARN en el intervalo de tamaño de 35 a 200 bases. La fragmentación fue confirmada utilizando electroforesis en agarosa TAE . Hibridación de Arreglo. El cARN fragmentado del paso anterior fue luego utilizado para elaborar un coctel de hibridación. En resumen, los 40 µ? del paso anterior fueron mezclados con 1 mg/ml de ADN Cot humano, y un oligonucleótido control adecuado. Adicionalmente , se agregaron 3 mg de ADN de esperma de arenque (10 mg/ml) junto con 150 µ? de amortiguador de hibridación 2x (MES 100 raM, NaCl 1 M, EDTA 20 mM, 0.01% de Tween 20) y agua hasta un volumen final de 300 µ? . 200 µ? de esta solución fueron luego cargados sobre el arreglo U133 (Affymetrix Cat . # 900370) e incubados a 45°C con una velocidad constante de 45 rpm toda la noche. El amortiguador de hibridación fue luego retirado y el arreglo fue lavado y teñido con 200 µ? de amortiguador de lavado no estricto (SSPE 6x, 0.01% de Tween-20) y utilizando una Estación 450 de GeneChip Fluidics (Affymetrix, Cat. # 00-0079) de acuerdo al protocolo del fabricante. Exploración del arreglo. El arreglo del paso anterior fue luego explorado utilizando un GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Cat. # 00-0217) de acuerdo al protocolo del fabricante . Selección de los potenciales objetivo de antigeno de la célula neoplásica. Los antigeno neoplásicas fueron seleccionados para la dirección al objetivo por comparación del nivel de expresión del antigeno en las células neoplásicas (ya sea tumores primarios o metástasis) versus el tejido saludable vecino o con tejido normal combinado. Los antigenos neoplásicos seleccionados mostraron al menos un incremento de 3 veces (300%) en la expresión relativa al tejido normal circunvecino, donde este incremento de 3 veces es observado en comparación con una mayor parte de las muestras de tejido normales comercialmente disponibles, combinada (mezcla estándar de referencia o RSM, los combinados son realizados para cada tipo de tejido) . La Tabla 2 siguiente presenta los datos del incremento proporcional a partir del análisis del arreglo para IAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5, donde los números representan el porcentaje de muestras de pacientes analizadas que mostraron un incremento de 2 , 3 ó 5 veces en la expresión en comparación a los tejidos normales. Tabla 2. Resultados del microarreglo para KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75 , GPR160, GPCR41, y SLC1A5: Tabla 2a-FLJ23390 Tipo de Número de Incremento Incremento Incre¬ Paciente pacientes de 2 veces de 3 veces mento de 5 veces Primario de 25 20 4 0 colon versus RSM normal Metástasis de 33 0 0 0 colon versus RSM normal Primaria de 20 100 75 25 mama versus RSM normal Primaria de 22 0 0 0 próstata versus RSM normal Primaria de 17 6 6 0 próstata versus normal Tabla 2b-LOC15378 Tipo de Número de Incremento Incremento Incremento Paciente pacientes de 2 veces de 3 veces de 5 veces Primario de 26 50 23 9 colon versus RSM normal Metástasis de 32 50 44 22 colon versus RSM normal Primaria de 49 24 6 2 mama versus RSM normal Primaria de 21 14 0 0 próstata versus RSM normal Primaria de 15 40 7 0 próstata versus normal Tabla 2c-FLJ20421 Tipo de Número de Incremento Incremento Incremento Paciente pacientes de 2 veces de 3 veces de 5 veces Primario de 26 35 15 0 colon versus RSM normal Metástasis de 33 24 3 0 colon versus RSM normal Primaria de 50 70 40 14 mama versus RSM normal Primaria de 22 14 5 0 próstata versus RSM normal Primaria de 17 24 0 0 próstata versus normal Tabla 2d-DCSD75 Tipo de Número de Incremento Incremento Incremento Paciente pacientes de 2 veces de 3 veces de 5 veces Primaria de 27 52 37 7 colon versus RSM normal Metástasis de 33 76 36 9 colon versus RSM normal Primaria de 49 22 2 0 mama versus RSM normal Primaria de 22 5 0 0 próstata versus RSM normal Primaria de 16 12 0 0 próstata versus normal Tabla 2e-GPR160 Tipo de Número de Incremento Incremento Incremento Paciente pacientes de 2 veces de 3 veces de 5 veces Primario de 26 23 8 0 colon versus RSM normal Metástasis de 33 12 0 0 colon versus RSM normal Primaria de 46 24 9 0 mama versus RSM normal Primaria de 22 36 9 5 próstata versus RSM normal Primaria de 17 59 24 6 próstata versus normal Tabla 2f-GPCR41 Tipo de Número de Incremento Incremento Incremento Paciente pacientes de 2 veces de 3 veces de 5 veces Primario de 23 48 17 4 colon versus RSM normal Metástasis de 30 77 50 13 colon versus RSM normal Primaria de 43 63 40 23 mama versus RSM normal Primaria de 0 0 0 0 próstata versus RSM normal Primaria de 3 33 33 33 próstata versus normal Tabla 2g-SLClA5 EJEMPLO 2. Análisis de expresión del tejido canceroso versus normal El procedimiento de microarreglo utilizado para el Ejemplo 1 fue también utilizado para estimar ampliamente la expresión en un número de tipos de tumores cancerosos y un número de tejidos de muestras normales. La producción de ADNc, ARN y las condiciones de hibridación fueron todas aquellas utilizadas en el Ejemplo 1, con la excepción de que se utilizó un arreglo U133 Plus 2.0 (Affymetrix Cat . # 900470) . El software DecisionSite (Spotfire, Somerville, A) y los protocolos Pipeline Pilot desarrollados domésticamente (SciTegic, San Diego, CA, desarrollador doméstico Josef Ringgenberg) fueron también utilizados para generar descripciones gráficas mostradas en las Figuras 1-6. En las descripciones gráficas, los tipos de tejidos normales y cancerosos son colocados a lo largo del eje horizontal. Los tejidos cancerígenos están marcados con una "c", por ejemplo, "c_mama_ducto" que representa una muestra de tejido de cáncer de mama y los tejidos normales son similarmente representados con una "n". Los tipos de tejido están además marcados con respecto al tipo y subtipo del tejido, si es conocido. Por ejemplo, "c_mama_ducto" es un tejido canceroso proveniente de un cáncer de mama, que se localizó en un ducto de mama. Si el subtipo no era claro durante el retiro quirúrgico o era desconocido, la etiqueta dice "ns" para "no especificado". Cada punto sobre el eje vertical representa una muestra de tejido proveniente de un paciente simple, y la altura de cada punto sobre el eje vertical (basado en log2) representa el nivel de expresión relativo del kit de sonda. Los círculos rellenos representan muestras con niveles de expresión en el intervalo de detección lineal. Los circuios abiertos representan un limite superior sobre la expresión del gen en muestras donde el gen estuvo por debajo del limite de detección del kit de sonda. Los cuadros abiertos representan un limite inferior sobre la expresión del gen en muestras donde el kit de sonda fue saturado. En resumen, antes de realizar un análisis, cada kit de sonda es calibrado por el análisis del comportamiento de sus sondas constituyentes a través de un grupo grande y diverso de muestras. Esta calibración determina la sensibilidad relativa de cada sonda, y la gama de intensidades dentro de la cual la respuesta del grupo de sondas es lineal entre sondas. Las intensidades por debajo de este intervalo son llamadas "no detectadas" mientras que aquellas por arriba de éste son llamadas "saturadas". Debido a la variación en la eficiencia de hibridación y de marcación entre muestras, cada chip es normalizado después de la aplicación de las calibraciones.

EJEMPLO 3. Análisis del dominio extracelular de los antigenos de las células neoplásicas Después de la identificación de los antigenos de las células neoplásicas anteriormente, la topología de las proteínas fue analizada para identificar los dominios extracelulares teóricos. Fueron utilizados dos algoritmos de análisis que predicen los dominios transmembranales y los resultados fueron comparados. La primera fue TMpred (ver K. Hofmann & W. Stoffel (1993) TMbase - A datábase of membrane spanning proteins segments Biol . Chem. Hoppe-Seyler 374,166). Un segundo programa de análisis que fue utilizado fue TMH M (A. Krogh, B. Larsson, G. von Heijne, y E. L. L Sonnhammer. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: Application to complete genomes. Journal of Molecular Biology, 305(3): 567-580, January 2001) . Los resultados para cada uno de los antigenos de células neoplásicas son listados más adelante en la Tabla 3. En general, los resultados provenientes de dos grupos de análisis estuvieron en clara concordancia, aunque en algunos casos los algoritmos no pudieron predecir con certidumbre una orientación topológica sobre la otra. En esos casos, son listadas ambas orientaciones. La Tabla 3 muestra la posición de las hélices transmembranales putativas (hélice TM) asi como las porciones teóricas de las proteínas que están localizadas ya sea sobre la parte externa o sobre la parte interna de la membrana plasmática. Además, se utilizó SignalP 3.0 ( (Bednsten et al, (2004) J Mol. Biol. 2004 Jul 16; 340(4): 783-95) para predecir la presencia de los péptidos de señal y para predecir dónde esos péptidos podrían ser escindidos de la proteína de longitud completa. Las porciones de las proteínas sobre la parte externa de la célula podrían servir como objetivos para la interacción del anticuerpo.

Tabla 3a-KIAA1815: número de acceso NP 079172, 902 aas.

SignalP 3.0 no predijo el péptido de señal Tabla 3b-BC017881: número de acceso NP 919267, 240 aas SignalP 3.0 predijo un péptido de señal de aa 1-48.

Tabla 3c-FLJ20421: número de acceso AAH67814, 359 aas. TMHMM IMpred #1 IMpred #2 Localización Posición Localización Posición Localización Posición interna 1-6 interna 1-9 externa 1-7 Hélice TM 7-29 Hélice TM 10-28 Hélice TM 8-28 Externa 30-359 externa 29-359 interna 29-359 SignalP 3.0 predijo un péptido de señal oe aa 1-50.

Tabla 3d-DSCD75: número de acceso AAF65450, 208 aas SinalP 3.0 predijo un péptido de señal de aa 1-30.

Tabla 3e-GPR160: número de acceso NP 055188, 338 aas TMHMM IMpred Localización Posición Localización Posición Externa 1-21 externa 1-25 Hélice TM 22-44 Hélice TM 26-43 interna 45-56 interna 44-56 Hélice TM 57-79 Hélice TM 57-79 externa 80-93 externa 80-93 Hélice TM 94-116 Hélice TM 94-121 interna 117-136 interna 122-136 Hélice TM 137-156 Hélice TM 137-156 externa 157-175 externa 157-182 Hélice TM 176-198 Hélice TM 183-199 interna 199-239 interna 200-243 Hélice TM 240-262 Hélice TM 244-265 externa 263-276 externa 266-276 Hélice TM 277-294 Hélice TM 277-294 interna 295-338 SignalP 3.0 predijo un péptido de señal de aa 1-38.

Tabla 3f-GPCR41: número de acceso AAH02917, 445 aas TMHMM IMpred Localización Posición Localización Posición interna 1-8 interna 1-8 Hélice TM 9-31 Hélice TM 9-30 externa 32-45 externa 31-49 Hélice TM 46-68 Hélice TM 50-68 interna 69-80 interna 69-111 Hélice TM 81-103 Hélice TM 112-133 externa 104-112 externa 134-145 Hélice TM 113-135 Hélice TM 146-167 interna 136-146 interna 168-194 Hélice TM 147-169 Hélice TM 195-211 externa 170-195 externa 212-270 Hélice TM 196-218 Hélice TM 271-297 interna 219-275 interna 298-311 Hélice TM 276-298 Hélice TM 312-339 externa 299-307 externa 339 Hélice TM 308-330 Hélice TM 335-359 interna 331-336 interna 360-370 Hélice TM 337-359 Hélice TM 371-389 externa 360-368 externa 390-403 Hélice TM 369-391 Hélice TM 404-424 interna 392-403 interna 425-445 Hélice TM 404-426 externa 427-445 SignalP 3.0 predijo un péptido de señal de aa 1-25.

Tabla 3g-SLClA5: número de acceso AAH00062, 541 aas TMHMM IMpred Localización Posición Localización Posición interna 1-52 interna 1-50 Hélice TM 53-75 Hélice TM 51-72 externa 76-94 externa 73-98 Hélice TM 95-117 Hélice TM 99-119 interna 118-129 interna 120-126 Hélice TM 130-152 Hélice TM 127-145 externa 153-227 externa 146-227 Hélice TM 228-245 Hélice TM 228-246 interna 246-264 interna 247-264 Hélice TM 265-287 Hélice TM 265-284 externa 288-301 externa 285-304 Hélice TM 302-324 Hélice TM 305-329 interna 325-336 interna 330-335 Hélice TM 337-359 Hélice TM 336-361 externa 360-378 externa 362-376 Hélice TM 379-401 Hélice TM 377-404 interna 402-413 interna 405-413 Hélice TM 414-436 Hélice TM 414-432 externa 437-541 externa 433-541 SignalP 3.0 predijo un péptido de señal de aa 1-35.

EJEMPLO 4. Producción de anticuerpos monoclonales para KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75 , GPR160, GPCR41, y SLC1A5.

A. Clonación por PCR de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. El ARN será aislado de una población de células de cáncer humano que expresan el antigeno de la célula neoplásica, esencialmente como se describe por Chirgwin et al., Biochemistry (1979) 17: 5294. En resumen, las células serán lavadas dos veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y lisadas en tiocianato de guanidinio 5 M en presencia de 2-mercaptoetanol 0.7 M. El lisado celular será colocado en capas sobre un gradiente de cloruro de cesio discontinuo (Chirgwin et al.) y centrifugado por 16 horas a 26,000 rpm en un rotor Becman SW28. El ARN será recuperado por la disolución del botón en agua tratada con DEPC. El ARN será precipitado con etanol una vez, resuspendido en agua tratada con DEPC, y almacenado a -70°C. El ARN total (10 pg/reacción) será convertido a ADNc utilizando el aprestamiento de hexámero aleatorio en 50 µ? de amortiguador de reacción que contiene 500 unidades de MLV-RT (Bethesda Research Laboratorios, Bethesda, Md.), hexámero aleatorio 5 µ? (Pharmacia, Piscataway, N.J.) , DTT 1 mM, mezcla de dNTP (0.5 mM cada uno), Tris-HCl 10 mM, pH 8.3, KC1 50 mM MgCl2 2.5 mM y 0.1 mg/ml de BSA (albúmina sérica bovina) . Después de la incubación a 37°C por 1 hora, las muestras serán sometidas a ebullición por 3 minutos y almacenadas a -70°C. El ADN que codifica para las moléculas de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5 será generado mediante PCR utilizando cebadores que contienen secuencias que tienen homología para las secuencias conocidas de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75 , GPR160, GPCR41, y SLC1A5, donde los cebadores también codifican para sitios de restricción útiles para la clonación. Estos cebadores estarán basados en las secuencias de codificación del ADNc publicadas para KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5. Todos los cebadores comenzarán con una pinza de C-G en el extremo 5' , seguido por un sitio de restricción para la clonación. Para la amplificación por PCR, 1 µ? de ADNc será mezclado con 1 µ? (10 picomoles) de un cebador delantero, 1 µ? (10 picomoles) de un cebador trasero, y 47 µ? de la mezcla de PCR. La mezcla de PCR consistirá de 1.25 unidades de polimerasa Taq (Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, Conn. ) , mezcla de dNTP (0.2 m cada uno), Tris-HCl 10 mM pH 8.3, KC1 50 mM, MgCl2 2.5 mM y 0.1 mg/ml de BSA. Los 50 µ? de la mezcla de PCR serán colocados con 70 µ? de aceite mineral y sometidos a 25 ciclos de amplificación en un termociclador Perkin-Elmer/Cetus (desnaturalización a 95°C por 30 segundos, recocido del cebador a 55°C por 30 segundos y extensión a 72°C por 1.5 minutos) . Los productos de PCR serán obtenidos después de 25 ciclos de amplificación. Los productos de amplificación serán aislados mediante fraccionamiento por tamaño. Antes de la expresión en baculovirus, la secuencia de ADN de cada fragmento será confirmada mediante análisis secuencial para prevenir la introducción de mutaciones inducidas por PCR. Los fragmentos amplificados serán ligados a un vector de expresión adecuado (por ejemplo el vector pAcC8 para el uso en un sistema de expresión de baculovirus) . Los productos de ligadura serán transformados dentro de la cepa bacteriana DH5a (Gibco/BRL, Gaithersburg Md.) y los vectores de pAcC8 recombinantes serán seleccionados con base en la resistencia a la ampicilina. Los plásmidos recombinantes serán aislados de clones bacterianos (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratories), 1982; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Media, Pa . : John iley and Sons) ) y la presencia del inserto de interés será verificada utilizando las reacciones en cadena de polimerasa (ver arriba) . La preparación de plásmido a gran escala será realizada mediante procedimientos estándares (Ausubel et al.; Maniatis et al.; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratories) , 1989) .

B. Expresión en Baculovirus de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5 Humanos. Las secuencias que codifican para KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5 humanos serán individualmente recombinadas en el baculovirus de Autographa cali fornica (AcNPV) utilizando los vectores de transferencia que comprenden la molécula de ADN de longitud completa, de interés. Los plásmidos serán cotransfectados con el ADN baculoviral de tipo silvestre (2-10 pfu) (AcNPV; Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987) ) dentro de células Sf9 {Spodoptera frugiperda) a una densidad de 106 células/ml (Summers et al.) . Las células Sf9 infectadas con el baculovirus recombinante serán identificadas y clonalmente purificadas (Summers et al.) . Para la expresión en la superficie celular de las proteínas recombinantes , las células serán cosechadas después de 48 horas de cultivo.

C. Inmunización del Animal Hospedero Ratones hembra BALB/c serán inyectados intraperitonealmente en el día 0 y en el día 14 con 5xl06 células Sf9 infectadas con el virus que contiene el gen de interés o un virus control que carece de cualquier inserto. En el día 21, 100 µ? de suero serán obtenidos para probar la presencia de los anticuerpos específicos. Después de un periodo de descanso de al menos dos semanas, los ratones recibirán una inyección final con 5xl06 células Sf9 infectadas con el recombinante o el control. Tres días después de esta última inyección, las células del bazo serán utilizadas para la fusión celular.

D. Generación de Clones Hibridomas Los esplenocitos provenientes de ratones BALB/c inmunizados, serán fusionados con las células de mieloma murina SP2/0 a una proporción de 10:1 utilizando 50% de polietilenglicol como se describió previamente por de Boer et al., J. Immunol. Meth. (1988) 113: 143. Las células fusionadas serán resuspendidas en el medio IMDM completo suplementado con hipoxantina (0.1 m ) , aminopterina (0.01 mM) , timidina (0.016 raM) y 0.5 ng/ml de hIL-6 (Genzyme, Cambridge, Mass.) . Las células fusionadas serán luego distribuidas entre los pozos de placas de cultivo de tejido de 96 pozos, de modo que cada pozo contenga en promedio un hibridoma en crecimiento simple. Después de 10 a 14 días los sobrenadantes de las poblaciones hibridomas serán seleccionados para la producción del anticuerpo especifico. Las células hibridomas positivas serán clonadas tres veces por dilución limitante en IMDM/FBS que contiene 0.5 ng/ml de hIL-6.

E. Uso de visualización de fago o tecnología de animal transgénico Como un procedimiento alternativo al uso de la generación de anticuerpos a través de la tecnología de hibridoma, los anticuerpos de la invención pueden ser generados utilizando la tecnología de visualización o a través del uso de animales t ransgénicos . Existen varios tipos de tecnología de visualización actualmente en uso para la purificación de anticuerpos humanos (ver Hoogenboom (2005) Nature Biotechnology 23(9) : 1105-1116) . La visualización de fago es un tipo específico de tecnología de visualización que puede ser utilizada para generar los anticuerpos humanos de la invención. La primera ronda panorámica puede ser realizada utilizando 1 a 20 pg del antigeno de la célula neoplásica purificado, para recubrir los pozos de una placa de ELISA. Se agrega la biblioteca de fagos (para la metodología asociada con la construcción de una biblioteca de fagos e información más detallada del protocolo, ver por ejemplo P.M. O'Brien y R. Aitken, Antibody Phage Display Humana Press, 2001) en general a una concentración de 1 x 1010 a 1 x 1011 ufp por pozo. Después de la incubación, los pozos son lavados y el fago enlazado es eluido utilizando sal o una solución de glicina de bajo pH . El fago eluido es luego amplificado mediante infección de bacterias, y las partículas fagos amplificadas y purificadas son luego utilizadas para rondas de visualización panorámica subsiguientes. Si se desea, otras técnicas de visualización panorámica pueden ser realizadas tal como la visualización panorámica basada en células contra células que expresan el antígeno de la célula neoplásica. Alternativamente, pueden ser llevados a cabo protocolos de visualización panorámica basados en líquido. A menudo pueden ser utilizadas menores concentraciones del antígeno purificado en las rondas posteriores de visualización panorámica para impulsar la selección de anticuerpos de más alta afinidad. El número de rondas de visualización panorámica que van a ser llevadas a cabo varía de acuerdo al objetivo y a la biblioteca. Las técnicas de visualización panorámica tales como la visualización panorámica sobre fase sólida y visualización panorámica sobre células enteras, pueden ser también utilizadas en rondas alternativas. Una vez que un clon de anticuerpo ha sido identificado el cual produce un anticuerpo con cualidades deseadas, los genes que codifican para ese anticuerpo pueden ser aislados del fago y expresados en una variedad de sistemas de expresión basados en células de bacterias, de hongos o de mamíferos. Para la generación de los anticuerpos humanos utilizando ratones transgénicos , los animales pueden ser inyectados ya sea con el antígeno de la célula neoplásica purificado o con células enteras que expresan ese antígeno. Por ejemplo, los ratones pueden ser administrados con 8 inyecciones en total de la siguiente manera: En el día 0, 107 células que expresan el antígeno de la célula neoplásica de interés son inyectadas dentro de las plantas de las patas de los ratones transgénicos. En los días 3, 7, 10 y 14, a los ratones se les pueden administrar inyecciones de refuerzo, conteniendo cada inyección 107 células que expresan el antígeno de la célula neoplásica de interés más 10 pg de un polinucleótido Cpg . En los días 17, 21 y 27, a los ratones se les pueden administrar inyecciones de refuerzo adicionales que contiene la proteína purificada del antígeno de la célula neoplásica. La sangre entera de los ratones transgénicos suministrados puede ser cosechada en el día 31 y los hibridomas preparados por medio de técnicas estándares. Los sobrenadantes de hibridoma resultantes son seleccionados como se describe anteriormente en "D", F. Humanización/otra modificación Si es deseada la actividad robusta de ADCC o CDC en los anticuerpos de la invención, los anticuerpos deben contener regiones constantes humanas o humanizadas. Los dominios variables provenientes de los anticuerpos de la invención pueden ser fusionados a dominios constantes humanos si los anticuerpos son derivados de una especie no humana. Después de la fusión al dominio constante humano, el dominio variable puede adicionalmente ser humanizado para disminuir la inmunogenicidad potencial. Además, pueden ser realizadas otras modificaciones genéticas o recombinantes en este punto, tal como la construcción de proteínas de fusión, maduración por afinidad, ingeniería de funciones efectoras adicionales, por nombrar unos pocos ejemplos.

G. Purificación de anticuerpos monoclonales Los anticuerpos de interés serán purificados a partir de los cultivos de hibridoma utilizando cromatografía de Proteína A estándar, utilizando técnicas que son bien conocidas en la materia. De acuerdo a los métodos bien conocidos en la materia, el sobrenadante de hibridoma será cosechado y cualesquiera células son retiradas mediante filtración después de la terminación. El filtrado será cargado sobre una columna de Proteina A (en pases múltiples, si es necesario) . La columna será lavada y luego expresada y los polipéptidos de inmunoglobulina secretados serán eluidos de la columna. Para la preparación del producto de anticuerpo, el combinado de Proteina A será mantenido a un bajo pH (pH 3 por un mínimo de 30 minutos y un máximo de una hora) como un paso de inactivación viral. Un paso de intercambio catiónico absortito será enseguida utilizado para purificar adicionalmente el producto. El eluido proveniente de la columna de separación adsortiva será pasado a través de un filtro de retención de virus para proporcionar espacio libre adicional de las partículas virales potenciales. El filtrado será posteriormente purificado mediante el paso a través de una columna de intercambio aniónico en el cual el producto no se enlaza. Finalmente, el proceso de purificación será conducido mediante transferencia del producto en el amortiguador de formulación a través de diafiltración . El retenido será ajustado a una concentración de proteína de al menos 1 mg/ml y se agrega un estabilizador.

H. Caracterización de la afinidad de enlace Los anticuerpos de la invención pueden ser analizados por su afinidad para los objetivos de interés utilizando el análisis de microchip BIACore. Por ejemplo, el analizador BIACore 2000 puede ser utilizado en concierto con un chip sensor CM5 (BIACore; Piscataway, NJ) . La proteina antigénica purificada será inmovilizada a la superficie del chip sensor de acuerdo a las instrucciones del fabricante, utilizando un flujo continuo de amortiguador HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 0.15 M, EDTA 3.4 mM, 0.005% de P-20 pH 7.4) . Los grupos carboxilo sobre la superficie del chip sensor serán activados por la inyección de 60 µ? de una mezcla que contiene N-etil-N' - (dimetilaminopropil ) carbodiimida 0.2 M (EDC) y N-hidroxisuccinimida 0.05 M (NHS) . Las superficies especificas serán obtenidas mediante inyección del antigeno de la célula neoplásica recombinante , diluido en acetato 10 mM, pH 4.5 (BIACore, Inc.; Piscataway, NJ) a una concentración de 10 yg/ml para obtener una densidad superficial moderada de 2, 000 unidades de resonancia (RU) . En ciertas modalidades, pueden ser también utilizadas otras concentraciones del antigeno de la célula neoplásica, tal como 25 g/ml. Los grupos reactivos en exceso sobre las superficies de chip serán desactivadas por la inyección de 60 µ? de etanolamina 1 M. Una superficie de referencia pseudo-acoplada, blanco, será preparada sobre cada chip sensor. Para el pseudo-acoplamiento, los pasos de activación e inactivación son llevados a cabo sin proteina. Los anticuerpos monoclonales candidatos serán diluidos en el amortiguador de muestra (IX PBS + 0.005% de P- + 0.1 mg/ml de BSA (fracción V, libre de IgG; Sigma, Inc.) filtrados y desgasificados) a una concentración de 25 nM e inyectados sobre la superficie del antigeno de la célula neoplásica por 2 minutos a una velocidad de flujo de 80 pU/minuto. Para todos los análisis, el amortiguador de corrida del instrumento será IX PBS (sin cloruro de calcio, sin cloruro de magnesio; Gibco Inc.) + 0.005% de P-20 (filtrado y desgasificado) , y la temperatura es ajustada a 25°C. Las curvas de enlace al anticuerpo son comparadas cualitativamente para la intensidad de la señal de enlace, asi como para las velocidades de disociación.

I. Conjugación Si los anticuerpos de la invención van a ser utilizados como socios en un inmunoconj ugado, los anticuerpos purificados pueden ahora ser conjugados a otra porción más. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado a una enzima activadora de profármaco para el uso en la tecnología ADEPT, a los radionúclidos , a toxinas o a otros agentes inmunomoduladores .

EJEMPLO 5. Selección in vitro de los anticuerpos antígeno de la célula antineoplásica A. Selección para la actividad de ADCC . Ensayo de ADCC In Vitro: Para preparar células objetivo marcadas con cromo 51, las líneas de células neoplásicas serán desarrolladas en placas de cultivo de tejidos y cosechadas utilizando EDTA 10 mM estéril en PBS. Las células desprendidas serán lavadas dos veces con el medio de cultivo celular. Las células (5xl06) serán marcadas con 200 iCi de cromo 51 (New England Nudear /DuPont ) a 37°C por una hora con mezclado ocasional. Las células marcadas serán lavadas tres veces con el medio de cultivo celular, luego serán resuspendidas a una concentración de lxlO5 células/ml . Las células serán utilizadas ya sea sin opsoni zación , o serán opsonizadas antes del ensayo mediante incubación con el anticuerpo de prueba a 100 ng/ml y 1.25 ng/ml en ensayo PMBC o 20 ng/ml y 1 ng/ml en el ensayo NK. Las células mononucleares de sangre periférica serán preparadas mediante la recolección de sangre sobre heparina proveniente de donadores saludables normales y diluida con un volumen igual de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . La sangre será luego colocada en capas sobre LYMPHOCYTE SEPARATION MEDIUM® (LSM: Organon Teknika) y centrifugada de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células mononucleares serán recolectadas de la interfaz LSM-plasma y lavadas tres veces con PBS. Las células efectoras serán suspendidas en el medio de cultivo celular hasta una concentración final de lxlO7 células/ml. Después de la purificación a través de LSM, las células asesinas naturales (NK) serán aisladas de las PMBCs mediante selección negativa utilizando un kit se aislamiento de células NK y una columna magnética ( iltenyl Biotech) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células NK aisladas serán recolectadas, lavadas y resuspendidas en el medio de cultivo celular a una concentración de 2xl06 células/ml. La identidad de las células NK será confirmada mediante análisis citométrico de flujo. Proporciones variantes efectoras : obj etivo serán preparadas mediante dilución en serie de las células efectoras (ya sea PBMC o NK) al doble a lo largo de las hileras de una placa de microtitulación (100 µ? de volumen final) en el medio de cultivo celular. La concentración de las células efectoras está en el intervalo de 1.0xl07/ml a 2.0xl04/mL para PBMC y de 2.0xl06/ml a 3.9xl03/ml para NK. Después de la titulación de las células efectoras, 100 µ? de las células objetivo marcadas con cromo 51 (opsonizadas o no opsonizadas) a lxlO5 células/ml serán agregadas a cada pozo de la placa. Esto da como resultado una proporción inicial efectora/obj etivo de 100:1 para PBMC y 20:1 para las células NK. Todos los ensayos serán corridos por duplicado, y cada placa contiene controles para la lisis espontánea (células no efectoras) y la lisis total (células objetivo más 100 µ? de dodecilsulfato de sodio al 1%, hidróxido de sodio 1 N) . Las placas serán incubadas a 37°C por 18 horas, después de lo cual los sobrenadantes de cultivo serán cosechados utilizando un sistema de recolección del sobrenadante (Skatron Instrument, Inc.) y contadas en un contador gamma Minaxi auto-gamma de la serie 5000 (Packard) por un minuto. Los resultados serán luego expresados como el porcentaje de citotoxicidad utilizando la fórmula: % de citotoxicidad= ( cpm de muestra - lisis espontánea )/( 1 isis total - lisis espontánea) xlOO.

B. Selección para la actividad apoptótica. Este ensayo confia en el hecho de que la anexina V tiene una alta afinidad por la fosfatidilserina (PS), cuya exposición a la parte externa de la célula es una marca notable temprana del proceso apoptótico. Las células que expresan el antigeno de la célula neoplásica serán cultivadas en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (D-MEM) :F-12 de Ham (50:50) suplementado con 10% de FBS inactivado por calor (Hyclone) y L-glutamina 2 mM. Las células neoplásicas que expresan el antigeno neoplásico serán sembradas a una densidad de 3 x 106 por caja en cajas de 100 x 20 mm y se dejan acoplar toda la noche. La PS de la superficie celular será detectada utilizando cualquiera de los reactivos de tinción de anexina V comercialmente disponibles, los cuales pueden estar basados en la alta afinidad de la anexina V por TS. El medio celular será retirado y reemplazado con medio fresco solo o medio que contiene 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal. Después de un periodo de incubación de tres días, las monocapas serán lavadas con PBS y desprendidas mediante tripsinización . Las células serán luego centrifugadas, resuspendidas en amortiguador de enlace de Ca2+ y se reparten en alícuotas dentro de tubos. Los tubos reciben luego la anexina marcada (por ejemplo anexina V-FTIC) (1 pg/ml) . Las muestras pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo FACSCANMR y el software FACSCONVERTMR CellQuest (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de enlace de anexina con relación al control serán seleccionados como anticuerpos inductores de la apoptosis.

EJEMPLO 6. Caracterización in vivo de los anticuerpos de interés Los anticuerpos serán probados in vivo para la habilidad de prevenir la formación y/o crecimiento de tumores, para inhibir el crecimiento o reducir el tamaño de tumores establecidos, para inhibir la metástasis, o tratar las lesiones metastáticas establecidas. Los modelos neoplásicas relevantes para cada antígeno neoplásico serán seleccionados con base en la expresión del antígeno neoplásico en líneas de células neoplásicas, como es evaluado por la expresión del ARN o la proteína. Las líneas de células neoplásicas representativas para los antígenos de células neoplásicas descrito, incluyen, pero no están restringidas a, las siguientes: KIAA1815: mama humana T47D colon humano COLO205 colon humano HT29 colon humano HCT116 LOC157378 : nsclc humano A549 humano FLJ20421 : MDA-MB-435 DSCD7 : colon humano KM12 COLO205 GPR160: mama humana T47D mama humana MCF7 GPCR41 : colon humano COLO205 próstata humana PC3-M-luc mama humana DA-MB-435 SLC1A5 colon humano COLO205 colon humano SW620 A. Formación o crecimiento de tumor Los ratones inmunocompromet idos en edades de 4 a 7 semanas, con peso promedio de 20 g serán utilizados para estos estudios. i) Tratamiento de cáncer colorrectal con los anticuerpos antigeno de la célula antineoplásica Las lineas celulares de cáncer colorrectal humanas tales como COLO205, KM- 12 o SW620 serán implantadas subcutáneamente en ratones desnudos atimicos como se describe en Sheng et al. J. Clin. Invest. 99: 2254-2259 (1997) . Los ratones serán repartidos aleatoriamente en grupos y el tratamiento será iniciado en el día de la implantación del tumor, con 0.1 a 50 mg/kg de anticuerpo monoclonal de interés administrado dos veces semanalmente mediante inyección intravenosa o en la cavidad int raperi toneal . Las mediciones con calibrador de la anchura y la longitud del tumor serán utilizadas para calcular el volumen neoplásica. Se espera que la formación del tumor o el crecimiento del mismo serán inhibidos como resultado del experimento anterior. ii) Tratamiento de cáncer de mama con anticuerpos antigeno de la célula antineoplásica Las lineas celulares de cáncer de mama humana tales como T47D, MCF-7 pr MDA-MB-435 serán implantadas subcutáneamente en ratones desnudos atimicos como se describe en Sheng et al. J. Clin. Invest. 99: 2254-2259 (1997) . Alternativamente, las células serán implantadas ortotópicamente en la almohadilla grasa mamaria mediante inyección directa o implante quirúrgico. Estos modelos neoplásicas son dependientes del estrógeno para el crecimiento de ratones hembra suplementados con estrógeno serán utilizados. Los ratones serán repartidos aleatoriamente en grupos y el tratamiento iniciado en el día de la implantación neoplásica, con 0.1 a 50 mg/kg de anticuerpo monoclonal de interés administrado dos veces semanalmente mediante inyección intravenosa o en la cavidad intraperitoneal . Las mediciones con calibrador de la anchura y longitud del tumor serán utilizadas para calcular el volumen neoplásica. Se espera que la formación o el crecimiento del tumor serán inhibidos como resultado del experimento anterior. iii) Tratamiento contra el cancér pulmonar con anticuerpos antígeno de la célula ant ineoplásica . Las líneas de cáncer pulmonar de células gigantes humanas tales como A549 serán implantadas subcutáneamente en ratones desnudos atímicos como se describe en Sheng et al. J. Clin. Invest. 99: 2254-2259 (1997) . Los ratones serán repartidos aleatoriamente en grupos y el tratamiento será iniciado en el día de la implantación del tumor, con 0.1 a 50 mg/kg de anticuerpo monoclonal de interés administrado dos veces a la semana mediante inyección intravenosa o en la cavidad intraperitoneal . Las mediciones con calibrador de anchura y longitud de tumor tomadas dos veces a la semana, serán utilizadas para calcular el volumen neoplásica. Se espera que la formación o el crecimiento del tumor serán inhibidos como resultado del experimento anterior. iv) Tratamiento de cáncer de próstata con anticuerpos antígeno de la célula antineoplásica El efecto de los anticuerpos de la invención sobre las células de cáncer de próstata humanas, será evaluado contra los modelos neoplásicas de próstata humana PC-3 o PC-M-luc. Las células serán inyectadas subcutáneamente dentro de ratones machos. Los ratones serán repartidos aleatoriamente en grupos (n=10 en cada grupo) y el tratamiento iniciado intravenosa o intraperitonealmente (i.p.) en el día 0 con los anticuerpos de la invención o el MAb control isotipo. Los animales serán tratados dos veces semanalmente . El crecimiento del tumor será monitorizado utilizando mediciones con calibrador de la longitud y anchura del tumor, tomadas dos veces a la semana. Alternativamente, para las células PC-3M luc, el crecimiento neoplásica será monitorizado utilizando formación de imagen bioluminiscente, con el sistema Xenogen IVIS, midiendo la señal de luciferasa en el tumor una o dos veces a la semana.

B. Inhibición de la Metástasis El efecto de los anticuerpos de la invención sobre la metástasis de células de cáncer de próstata humanas y el crecimiento de lesiones metastáticos en el hueso y el tejido suave, serán evaluados utilizando el modelo de tumor PC-M-luc de próstata humana. Las células serán inyectadas vía la ruta int racardiaca dentro de ratones machos. Los ratones serán repartidos aleatoriamente en grupos y el tratamiento inicial intravenosamente o intraperitonealmente (i.p.), en el día 0 con los anticuerpo de la invención o el MAb control isotipo. Los animales serán tratados dos veces a la semana. El crecimiento neoplásica en tejido óseo y suave será monitorizado utilizando formación de imagen bioluminiscente, con el sistema Xenogen IVIS, midiendo la señal de luciferasa en el tumor una vez a la semana. Alternativamente, los animales serán imaginados utilizando el sistema Xenogen IVIS (Xenogen de la serie 100 con el software Living Image 2.5) 1 a 3 semanas después del implante, y repartidos aleatoriamente en grupos con base en la señal de luciferasa antes de iniciar el tratamiento con el anticuerpo. La respuesta del crecimiento neoplásica será evaluada mediante formación de imagen Xenogen IVIS una vez a la semana.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para diagnosticar, detectar o tratar el cáncer en un mamífero, caracterizado porque el cáncer expresa un antígeno de la célula neoplásica que está elevado al menos 3 veces con relación a una muestra de tejido normal adyacente o muestra de tejido normal combinada, que comprende administrarle al mamífero cantidades terapéuticamente efectivas de un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza a ese antígeno de la célula neoplásica, y en donde el antígeno de la célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5.
2. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es humano, humanizado, quimérico o un fragmento del mismo.
3. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento se selecciona del grupo que consiste de Fv, F(ab' ) 2, Fab' y Fab.
4. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza específicamente a un dominio extracelular del antígeno de la célula neoplásica, en donde el antígeno de la célula neoplásica es seleccionado del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5.
5. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a un dominio extracelular de KIAA1815, y en donde el dominio extracelular es elegido del grupo de aminoácidos de aproximadamente las posiciones 1-408, de aproximadamente las posiciones 474-489, de aproximadamente las posiciones 545-581, de aproximadamente las posiciones 603-621, de aproximadamente las posiciones 642-653, y de aproximadamente 674-904.
6. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a un dominio extracelular de BC017881, y en donde el dominio extracelular es elegido del grupo de aminoácidos de aproximadamente las posiciones 1-117, de aproximadamente 140-148, de aproximadamente 165-211, y de aproximadamente 230-240.
7. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a un dominio extracelular de FLJ20421, y en donde el dominio extracelular es proveniente de las posiciones de aminoácidos aproximadamente 30-359.
8. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a un dominio extracelular de DSCD75, y en donde el dominio extracelular es proveniente de las posiciones de aminoácidos aproximadamente 20-208.
9. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a un dominio extracelular de GPR160, y en donde el dominio extracelular es elegido del grupo proveniente de las posiciones de aminoácidos aproximadamente 1-15, de aproximadamente las posiciones 80-93, de aproximadamente las posiciones 157-182, de aproximadamente las posiciones 263-276.
10. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a un dominio extracelular de GPCR41, y en donde el dominio extracelular es elegido del grupo de aminoácidos de aproximadamente las posiciones 31-49, de aproximadamente las posiciones 104-112, de aproximadamente las posiciones 134-145, de aproximadamente las posiciones 170-195, de aproximadamente las posiciones 212-270, de aproximadamente las posiciones 299-307, de aproximadamente las posiciones 360-368, de aproximadamente las posiciones 390-403 y de aproximadamente las posiciones 427-445.
11. El método para diagnosticar, detectar o tratar el cáncer en un mamífero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo es un inmunoconj ugado .
12. El inmunoconj ugado de diagnóstico, detección o terapéutico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende un anticuerpo que incluye un anticuerpo antígeno de la célula antineoplásica o fragmento del mismo, o una proteína de fusión del anticuerpo antígeno de la célula antineoplásica o el fragmento del mismo, en donde el componente de anticuerpo es enlazado al menos a un agente de diagnóstico/detección o al menos un agente terapéutico .
13. El inmunoconj ugado de diagnóstico/detección de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el agente de diagnóstico/detección comprende al menos un agente de diagnóstico/detección fotoactivo en donde el agente de diagnóstico fotoactivo comprende un cromageno o colorante.
14. El inmunoconj ugado de diagnóstico/detección de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el inmunoconj ugado es utilizado en la detección/diagnóstico de tumores intraoperatorios , endoscópicos , o intravasculares .
15. El inmunoconj ugado terapéutico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido , átomos de boro, gadolinio o uranio, un inmunomodulador , una citocina, una hormona, un antagonista de hormona, una enzima, un inhibidor de enzima, un agente terapéutico fotoactivo, un fármaco citotóxico, una toxina, un inhibidor de la angiogénesis , un anticuerpo diferente y una combinación de los mismos.
16. El inmunoconj ugado terapéutico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el fármaco citotóxico es un fármaco, un profármaco, una enzima o una toxina.
17. El inmunoconj ugado terapéutico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el fármaco citotóxico es una caliqueamicina o análogo de caliqueamicina , una maytansina o derivado de maytansina o una auristatina E o derivado de auristatina E.
18. El inmunoconj ugado terapéutico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el fármaco citotóxico es una toxina o fragmento de la misma, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de toxinas vegetales, microbianas, y animales, y una variación sintética de las mismas.
19. El inmunoconj ugado terapéutico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el inmunomodulator se selecciona del grupo que consiste de una citocina, un factor de crecimiento de célula madre, una linfotoxina, un factor hematopoyét ico , un factor estimulador de colonias (CSF) , un interferón (IFN) , un factor de crecimiento de células madre, er itropoyetina , trombopoyet ina , un anticuerpo y una combinación de los mismos.
20. El inmunoconj ugado terapéutico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la enzima es una enzima activadora de profármaco.
21. El inmunoconj ugado terapéutico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la enzima activadora de profármaco se selecciona del grupo de fosfatasa alcalina, arilsulfatasa , citosina-desaminasa , proteasas, D-alanilcarboxipeptidasas , enzimas que rompen carbohidratos tales como beta-galactosidasa y neuraminidasa , beta-lactamasa, penicilina-amidasas ; y anticuerpos con actividad enzimática.
22. Un anticuerpo multivalente , multiespeci ico o un fragmento del mismo, caracterizado porque comprende uno o más sitios de enlace al antigeno que tienen afinidad hacia un antigeno de la célula neoplásica y uno o más sitios de enlace al epitopo que tiene afinidad hacia los epitopos, en donde el antígeno de la célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41 y SLC1A5.
23. El anticuerpo multivalente, multiespecifico o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo mult ivalente , multiespecifico o fragmento del mismo es humano, humanizado o quimérico .
24. El anticuerpo mult ivalente , multiespecif ico o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende además un agente de diagnóstico/detección o terapéutico.
25. Una proteina de fusión de anticuerpo o el fragmento del mismo, caracterizado porque comprende al menos dos anticuerpos antigeno de la célula antineoplásica o fragmentos de los mismos, en donde los anticuerpos o fragmentos de los mismos se seleccionan de los anticuerpos antigeno de la célula antineoplásica o fragmentos de los mismos de conformidad con la reivindicación 1.
26. Un método para tratar el cáncer de un mamífero, caracterizado porque comprende el tratamiento con una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o el fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es formulado en una formulación terapéuticamente aceptable.
27. Un método para diagnosticar/detectar el cáncer en un mamífero, caracterizado porque comprende el paso de administrarle al mamífero una cantidad diagnósticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, formulado en un vehículo farmacéuticamente aceptable .
28. Un método para tratar o diagnosticar/detectar el cáncer en un mamífero, caracterizado porque comprende (i) administrarle a un mamífero en necesidad del mismo, el anticuerpo o los fragmentos del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes; (ii) esperar una cantidad suficiente de tiempo para que una cantidad de la proteína de no enlace se depure de la corriente sanguínea del mamífero; y (iii) administrarle al mamífero una molécula portadora que comprende un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, o una combinación de los mismos, que se enlaza a un sitio de enlace del anticuerpo.
29. Una secuencia de ADN, caracterizada porque comprende un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo antígeno de la célula neoplásica o el fragmento del mismo, o el inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
30. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 29.
31. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 30.
32. Un método para distribuir un agente de diagnóstico/detección o terapéutico, o una combinación de los mismos, a un objetivo, caracterizado porque comprende (i) proporcionar una composición farmacéutica que incluye un inmunoconj ugado que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes y (ii) administrarle a un mamífero en necesidad de la misma, la composición.
33. Un método de tratamiento contra el cancér en un mamífero, caracterizado porque comprende el administrarle a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende al menos dos anticuerpos o fragmentos de los mismos, que comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, formulado en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende además un segundo anticuerpo o fragmento del mismo no de conformidad con la reivindicación 1.
35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende además un segundo anticuerpo o fragmento del mismo, de conformidad con la reivindicación 1.
36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el segundo anticuerpo es conjugado a un agente terapéutico o de diagnóstico/detección.
37. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo antigeno de la célula neoplásica o el fragmento del mismo es administrado antes, en conjunto con o después de un segundo anticuerpo conjugado, reactivo con un segundo anticuerpo de célula neoplásica expresado por la malignidad, es administrado al mamífero.
38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo antígeno de la célula neoplásica es administrado en una dosis de 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del mamífero por dosis.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la dosis es repetidamente administrada.
40. Un método para detectar o diagnosticar un cáncer de mama, próstata o colon en un mamífero, caracterizado porque comprende el uso de los anticuerpos o inmunoconj ugados de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
41. Un método para tratar el cáncer de mama, de próstata o de colon en un mamífero, caracterizado porque comprende el uso de los anticuerpos o inmunocon j ugados de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
42. Un método para .tratar el cáncer de mama, de próstata o de colon en un mamífero, caracterizado porque comprende el uso de los anticuerpos o inmunoconj ugados de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antígeno de célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FLJ20421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5.
43. Un kit para el diagnóstico o detección del cáncer en un mamífero, caracterizado porque el kit comprende: d) un anticuerpo o fragmento del mismo, o un inmunoconj ugado o fragmento del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento es capaz de enlazarse específicamente a un antígeno de célula neoplásica en donde el antígeno de célula neoplásica se selecciona del grupo de KIAA1815, LOC157378, FL320421, DSCD75, GPR160, GPCR41, y SLC1A5; e) un método de detección que hace posible el diagnóstico o la detección del cáncer en el mamífero; y las instrucciones para el uso del kit.