CN110225970A - 具有经修饰的代谢的免疫细胞及其用途 - Google Patents

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安吉拉·斯科特
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Abstract

描述了经修饰的T细胞，其适于过表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体。还描述了这些经修饰的T细胞在治疗疾病特别是癌症中的用途，筛选过表达SLC1A5的经修饰的T细胞的方法，以及用于提供这些经修饰的T细胞的核酸和载体。

Description

具有经修饰的代谢的免疫细胞及其用途
本发明涉及适于在低色氨酸或色氨酸消耗的微环境特别是其中色氨酸分解代谢发生的环境中起作用的T细胞，其中该T细胞已经被修饰，使得它们表达氨基酸转运体(transporter)，合适地为谷氨酰胺和/或色氨酸转运体，例如SLC1A5及其同种型(isoform)。本发明还提供了提供这样的T细胞的方法及其用途。
发明背景
色氨酸降解是一种免疫逃避策略，其被许多肿瘤利用。
吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)是犬尿氨酸(kynurenine)途径的限速酶，它们将必需氨基酸色氨酸转化为犬尿氨酸。
由IDO活性引起的低色氨酸条件(通常<5μM)，诱导了肿瘤细胞的广泛重建、氨基酸代谢、基因表达并且还诱导了氨基酸转运体编码基因诸如SLC7A11、SLC1A4和SLC1A5(包括SLC1A5剪接变体)的表达的上调。
SLC1A5是溶质运载蛋白家族(solute carrier family)的钠依赖性高亲和力谷氨酰胺转运体。SLC1A5(及其剪接变体)表达的上调改善了谷氨酰胺向肿瘤细胞中的摄取。除了增强谷氨酰胺的摄取之外，SLC1A5表达的上调还通过增强大的中性氨基酸转运体(LAT1)的活性来改善色氨酸转运。LAT1是异二聚体膜转运蛋白，其优先转运支链(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)和芳香族(色氨酸、酪氨酸)氨基酸。功能性LAT1转运体包括由两种不同的基因编码的两种蛋白：
1.由SLC3A2基因编码的4F2hc/CD98重亚基蛋白，以及
2.由SLC7A5基因编码的CD98轻亚基蛋白。
作为专性氨基酸交换剂，LAT1活性在很大程度上取决于细胞内谷氨酰胺的交换以摄取支链和芳香族氨基酸。
已经报导IDO和TDO在许多人类癌症中的组成型表达，导致肿瘤微环境中色氨酸分解代谢。有限的色氨酸可用性具有深远的免疫调节影响，导致减少的T细胞增殖和效应物功能。癌细胞通过上调氨基酸转运体而受到这种不利微环境的保护，其给予癌细胞相比肿瘤中的其他细胞的选择性优势。
虽然已经确立色氨酸分解代谢对于T细胞具有免疫抑制作用，但色氨酸分解代谢经由其影响T细胞的机制尚不太了解。
IDO由于它对于T淋巴细胞的免疫抑制作用已经成为近年来关注的焦点，这部分起因于色氨酸消耗，并且部分起因于色氨酸分解代谢物的直接作用。
TDO(色氨酸降解酶)已经被观察到提供免疫抑制作用。
TDO和IDO抑制剂已经被建议用于促进肿瘤样(tumoral)免疫排斥和改善癌症免疫治疗的功效。
发明概述
IDO是胞质酶(cytosolic enzyme)，因此通过IDO的色氨酸降解发生在细胞内。然而，由于色氨酸容易地通过特定的转运体穿过质膜，因此细胞充当色氨酸汇(tryptophansink)，导致肿瘤细胞周围的微环境是低色氨酸的。由吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)介导的色氨酸分解代谢是促成肿瘤微环境中由于色氨酸消耗导致的肿瘤样免疫逃避的外周免疫耐受的重要机制。如果能够提供具有靶向癌细胞的能力并且具有抵抗色氨酸分解代谢发生在其中的免疫调节性肿瘤微环境的能力的T细胞，则将是有益的。
本发明人已经确定了一种方法，通过该方法，T细胞可以被提供具有在暴露于低色氨酸条件，特别是由表达IDO或TDO酶的肿瘤引起的低色氨酸条件后对增殖抑制的抗性，该方法包括提供过表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体的T细胞。
基于T细胞的T细胞受体(TCR)组分，将T细胞划分为两组。TCR异二聚体可以包括α和β链。α和βTCR经由抗原呈递细胞上的MHC分子呈递的肽识别外来抗原。TCR异二聚体可选地可以包括γ和δ链。包括γ和δ链的TCR(γδTCR)是MHC非依赖性的。
导致有效杀死靶细胞的T细胞的完全激活需要富有成效的(productive)信号1和信号2产生。已经从TCR/CD3信号接收到信号1后，信号2由共刺激分子例如CD28提供。
合适地，T细胞可以被认为是表达αβTCR或γδTCR的细胞。合适地，T细胞可以是γδ(gamma delta)Τ细胞，其表达从Vγ(gamma)1至9和Vδ(delta)1至8形成的任何γδTCR对的TCR。γδT细胞可以为Vγ9Vδ2亚型。
因此，本发明的第一方面提供一种T细胞，所述T细胞过表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体。可选的转运体可以包括高亲和力谷氨酸和中性氨基酸转运体家族(high-affinity glutamate and neutral amino acid transporterfamily)(SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7)的其他成员、异二聚体氨基酸转运体的重亚基(heavy subunit)(SLC3A1、SLC3A2)、钠与氯化物依赖性的钠:神经递质同向转运体家族(sodium-and chloride-dependent sodium:neurotransmittersymporter family)(SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20)的成员，或者阳离子氨基酸转运体/糖蛋白相关家族(cationicamino acid transporter/glycoprotein-associated family)(SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14)的成员。
如本领域技术人员将理解的，例如如Timosenko等人，“Nutritional Stressinduced by tryptophan-degrading enzymes results in ATF4-dependentreprogramming of the amino acid transporter profile in tumor cells”，CancerRes.2016 76(21):6193-6204中讨论的，已知SLC1A5作为全长转录物(SLC1A5长型(SLC1A5long；SLC1A5-L))和截短的剪接变体包括SLC1A5中等型(SLC1A5middle；SLC1A5-M)和SLC1A5短型(SLC1A5short；SLC1A5-S)存在。
合适地，所述T细胞可以以在T细胞中通常观察到的表达水平的至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍的水平表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体，任选地，其中所述转运体选自高亲和力谷氨酸和中性氨基酸转运体家族(SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7)；异二聚体氨基酸转运体的重亚基(SLC3A1、SLC3A2)；钠与氯化物依赖性的钠:神经递质同向转运体家族(SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20)的成员，或者阳离子氨基酸转运体/糖蛋白相关家族(SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14)的成员。未经修饰的T细胞中内源性SLC1A5或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体的表达水平可以使用诸如蛋白印迹或流式细胞术的技术来确定，并且将其与经遗传修饰的T细胞中的水平进行比较。
合适地，所述T细胞可以以在激活的T细胞中通常观察到的表达水平的至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍的水平表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体，任选地，其中所述转运体选自高亲和力谷氨酸和中性氨基酸转运体家族(SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7)；异二聚体氨基酸转运体的重亚基(SLC3A1、SLC3A2)；钠与氯化物依赖的钠:神经递质同向转运体家族(SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20)的成员，或者阳离子氨基酸转运体/糖蛋白相关家族(SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14)的成员。
合适地，T细胞可以是γδT细胞。在实施方案中，γδT细胞可以被激活(即当它们增殖更快并且分泌细胞因子时)。T细胞可以是αβT细胞。αβT细胞可以被激活。T细胞可以是γδ或αβT细胞，所述T细胞包含SLC1A5转运体或其同种型和/或谷氨酰胺或色氨酸转运体连同能够结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。合适地，CAR可以是当CAR的细胞外部分结合抗原时提供例如来自CD3ζ结构域的仅信号1应答的CAR，或提供来自例如CD3ζ结构域和共刺激结构域的信号1和信号2应答的CAR。这些CAR对于与αβT细胞一起使用可以是有用的。如WO2016/166544讨论的，CAR可以是共刺激CAR，并且仅提供针对抗原结合的信号2应答。经由例如共刺激结构域提供仅信号2应答的CAR可以有利于与γδT细胞一起使用，其中信号1可以通过γδT细胞上的T细胞受体(TCR)与由TCR识别的抗原的结合来提供。
合适地，T细胞可以是过表达SLC1A5或其同种型和/或谷氨酰胺或色氨酸转运体连同能够特异性结合疾病抗原的嵌合抗原受体(CAR)的αβT细胞或γδT细胞。
合适地，T细胞可以是γδ(gamma delta)T细胞，所述γδT细胞表达从Vγ(gamma)1至9和Vδ(delta)1至8形成的任何γδTCR对的TCR，并且所述γδT细胞表达SLC1A5或其同种型和/或谷氨酰胺或色氨酸转运体连同能够特异性结合疾病抗原的嵌合抗原受体(CAR)。γδT细胞可以为Vγ9Vδ2亚型。
γδT细胞可以包含谷氨酰胺和/或色氨酸转运体诸如SLC1A5以及CAR。合适地，CAR可以是典型的或不可调节的(non-tuneable)CAR(可以提供信号1和信号2的CAR)。典型的CAR包含细胞外抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、一个或更多个共刺激结构域(提供信号2)以及提供信号1的激活结构域例如CD3ζ。在实施方案中，CAR可以是共刺激CAR，该共刺激CAR仅包含共刺激结构域，但不包含提供信号1的激活结构域(使得在结合至CAR后，仅提供共刺激信号(信号2)(即，通过单独的共刺激CAR的激活不提供信号1))。在这些实施方案中，存在于T细胞上的第二受体，诸如T细胞受体(TCR)可以提供信号1，以允许信号1和信号2协同作用以允许T细胞的激活。
SLC1A5可以单独地被过表达，或连同SLC7A5和SLC3A2一起被过表达以形成LAT1转运体，其进一步上调色氨酸通过T细胞的摄取。
合适地，T细胞可以以在T细胞中通常观察到的表达水平的至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍的水平表达SLC1A5和/或谷氨酰胺或色氨酸转运体。
合适地，T细胞可以以在激活的T细胞中通常观察到的表达水平的至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍的水平表达SLC1A5和/或谷氨酰胺或色氨酸转运体。过表达可以通过本领域已知的任何方法/手段所实现。合适地，过表达在功能上允许经修饰的T细胞在低色氨酸微环境中有利地起作用，例如在一些肿瘤细胞周围检测到的低色氨酸微环境中有利地起作用。
适于在色氨酸分解代谢在其中发生的低色氨酸微环境中起作用的经修饰的γδT细胞可以包含嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含具有对疾病抗原的结合特异性的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域，
以及
(i)至少一个共刺激信号传导区(能够提供信号2，但不能够提供信号1)，并且没有提供信号1的信号传导结构域，例如CD3ζ(以提供“共刺激”或“可调节的”CAR)，或
(ii)CD3ζ激活/信号传导结构域(能够提供信号1)，或
(iii)至少一个共刺激信号传导区和CD3ζ(能够提供信号1和信号2的典型的CAR)激活/信号传导结构域。
合适地，当CAR的核酸序列包括CD3ζ结构域时，CAR被认为是“典型的”或“不可调节的”。在其中CAR仅含有共刺激结构域的实施方案中，CAR可以被认为是“共刺激”CAR或“TCR可调节的”CAR。
编码“典型的”或“共刺激”CAR的核酸序列可以包括识别疾病相关抗原或肿瘤抗原或蛋白或碳水化合物或脂质或小分子的单链可变片段(scFv)。
CAR的抗原结合结构域可以呈多种形式，包括(但不限于)源自抗体的单链可变片段(scFv)、纳米体(nanobody)、生长因子序列、基于可溶性因子的合成序列、基于结合受体胞外域的因子的序列、或者细胞表面受体的细胞外结构域，其之后被融合至如以上描述的跨膜和共刺激结构域。
合适地，疾病抗原可以是病毒抗原。
疾病抗原可以是细胞表面靶或在肿瘤、细胞感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染中发现的抗原，或可以是来自这样的病毒的活性或失活的病毒片段、肽、蛋白、抗原区段等。细胞表面靶可以包括肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原。
合适地，细胞外抗原结合结构域可以识别并且结合仅存在于肿瘤/患病细胞上而在任何其他细胞上不存在的肿瘤特异性或疾病相关抗原和/或存在于一些患病细胞上并且也存在于一些正常细胞上的疾病相关抗原。这些疾病相关抗原可以包括，但不限于，CD19、EGFR、EGFRvRIII、ErbB2、GM3、GD2、GD3、CD20、CD22、CD30、CD37、CD38、CD70、CD75、CD79b、CD33、CD138、gp100、NY-ESO-1、MICA、MICB、MART1、AFP、ROR1、ROR2、PSMA、PSCA、突变的Ras、p53、B-Raf、c-met、VEGF、碳酸酐酶IX、WT1、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、MUC-3、上皮肿瘤抗原和MAGE型抗原(包括MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA12、MAGEC2)、BAGE、GAGE、XAGE1B、CTAG2、CTAG1、SSX2、LAGE1或病毒抗原或其组合，或翻译后经修饰的蛋白，其可以包括但不限于氨基甲酰化蛋白和瓜氨酸化蛋白。
细胞表面抗原可以是免疫检查点(checkpoint)配体，例如PD-L1或PD-L2。
CAR的跨膜结构域可以包括CD3或CD4或CD8或CD28的跨膜结构域中的一个或更多个或其部分。
CAR的共刺激信号传导区可以包括例如CD28、CD137(4-1BB)、ICOS、CD27、OX40、LFA1、PD-1、CD150、CD154、CD244、NKG2D、DNAX-激活蛋白(DAP)-10、DAP-12、LIGHT、Fc受体γ链、IL-2公共γ链(IL-2commonγchain)、IL-12受体的提供信号2的细胞内结构域中的一个或更多个。
根据本发明的第二方面，提供一种治疗癌症的方法，所述癌症合适地为哺乳动物的癌症，优选为人的癌症，所述方法包括施用有效量的本发明的第一方面的T细胞。
根据本发明的第三方面，提供一种分离的核酸，所述分离的核酸编码SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体，所述分离的核酸可操作地连接至控制序列，所述控制序列适于允许被所述核酸转化的T细胞能够表达编码的色氨酸或谷氨酰胺转运体例如SLC1A5。
用于表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体的核酸序列可以包括以下元件；
■启动子，例如但不限于CMV、EF1α、MSCV、PGK、CAG、IRES或UBC
■SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体的核酸序列，所述核酸序列合适地包含N末端Kozak序列
■RNA剪接/聚腺苷酸化序列，例如但不限于BGH或SV40。
在其中T细胞包含CAR的实施方案中，SLC1A5序列、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体可以可操作地连接至与CAR的启动子不同的启动子，以产生两个独立的mRNA。合适地，CAR和由转运体编码核酸序列编码的转运体的表达可以通过从共同的双向启动子转录来实现，以产生两个独立的mRNA。可选地，CAR和转运体序列的表达可以通过从单个启动子转录并且通过在两个编码序列之间并入内部核糖体进入位点(IRES)以产生能够翻译为两种蛋白的单个mRNA来实现。合适地，CAR和转运体序列可以通过自切割T2A切割序列来分离，提供由共同启动子驱动的单个mRNA，翻译为单个多肽，该单个多肽将被共翻译地切割以产生两种蛋白。
根据本发明的第四方面，提供一种载体，所述载体包含本发明第三方面的核酸。
可以使用任何合适的载体来引入核酸，所述载体可以允许SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体的核酸序列过表达。载体骨架可以含有细菌复制起点，诸如例如pBR322，和赋予抗生素抗性的选择标记(selectable marker)，诸如但不限于赋予抗生素氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，以允许质粒DNA在细菌宿主中充分增殖。任选地，载体可以包含整合酶诸如phiC31的细菌和噬菌体附着位点(attB和attP)，与内切核酸酶诸如I-SceI的识别位点组合，以允许产生无细菌骨架的微环。载体还将包含编码SLC1A5或其同种型或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体的表达的序列，该序列连接至用于在感兴趣的靶细胞、最优选为T细胞中表达的合适的启动子序列。任选地，载体可以包含抗生素抗性基因，用于哺乳动物细胞中的阳性筛选，并且还可以包含用于鉴定表达的报告基因，诸如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)。另外的报告基因和/或筛选基因表达可以由个体启动子、双向启动子来驱动，或通过使用IRES或自切割T2A序列来实现。
根据本发明的第五方面，提供一种宿主T细胞，所述宿主T细胞用本发明第三方面的核酸或第四方面的载体转化。
对T细胞进行遗传修饰以并入编码SLC1A5或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体的核酸的方法可以包括本领域技术人员已知的任何技术。
合适的方法包括，但不限于，通过病毒例如慢病毒/逆转录病毒/腺病毒的病毒转导，通过电穿孔、核转染、基于脂质的转染试剂、纳米颗粒、基于氯化钙的转染方法或细菌来源的转座子、DNA转座子或逆转录转座子、TALENS或CRISPR/Cas9技术的核酸的细胞转染。
合适地，被提供以修饰T细胞的遗传信息可以呈DNA(cDNA、质粒(线性、游离型(episomal))、微环)、RNA或体外转录(IVT)的RNA的形式。除了编码转运体和/或CAR序列的遗传信息之外，遗传信息还可以编码帮助遗传信息整合至宿主基因组中所需的蛋白/酶/序列。
当慢病毒/逆转录病毒/腺病毒被用于转导时，可以使用如本领域技术人员理解的其纳入将促进该方法的化学试剂。这些包括，例如，但不限于：海地美溴铵(hexadimethrinebromide)(聚凝胺(polybrene))、纤连蛋白、重组人纤连蛋白(诸如RetroNectin-TakaraClontech)、DEAE右旋糖酐和TransPlus病毒转导促进剂(ALSTEM Cell Advancements)。
合适地，可以在培养周期内的任何时间点将编码转运体和/或CAR的核酸的并入引入至T细胞、外周血单核细胞(PBMC)、脐带血单核细胞(CBMC)或组织来源的扩增的T细胞中。
根据本发明的第六方面，提供一种培养宿主T细胞的方法，使得能够表达转运体的第三方面的核酸或第四方面的载体被T细胞表达。任选地，培养宿主细胞的方法的实施方案还包括从细胞培养基中回收T细胞。
根据本发明的另外的方面，提供一种将本发明的T细胞递送至肿瘤细胞的方法，所述T细胞表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者谷氨酰胺或色氨酸转运体，其中肿瘤细胞周围的微环境的色氨酸被消耗。合适地，在实施方案中，色氨酸消耗可以导致比宿主动物中细胞周围的典型细胞微环境中少至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍的色氨酸。为了评估色氨酸消耗，合适的转运体的表达可以使用例如流式细胞术、蛋白印迹、免疫细胞化学、qPCR等及其组合来监测。
根据本发明的另外的方面，提供一种组合物，所述组合物包含本发明的T细胞连同治疗剂，所述治疗剂合适地为抗癌剂。
合适地，治疗剂可以选自由以下组成的组：放射性核苷酸、硼、钆或铀原子、免疫调节剂、免疫缀合物、细胞因子、激素、激素激动剂、酶、酶抑制剂、光活性治疗剂、细胞毒性药物、毒素、血管生成抑制剂、免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、抗体-药物缀合物(ADC)或其组合。
治疗剂可以包括包含细胞毒性药物的免疫缀合物/ADC。合适地，细胞毒性药物可以是药物、前药、酶或毒素。
在实施方案中，治疗受试者，合适地哺乳动物，特别地人的癌症的方法可以包括用治疗有效量的本发明的T细胞治疗受试者。在实施方案中，T细胞可以以每剂量1×104个细胞/kg受试者体重至超过5×108个细胞/kg受试者体重的剂量被提供在治疗有效的T细胞制剂中。
在实施方案中，方法可以包括重复地施用治疗有效的T细胞制剂。
在实施方案中，待被治疗的癌症可以选自(但不限于)肾癌、脑癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、食道癌、结肠直肠癌、皮肤癌、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、骨癌、肝细胞癌、子宫内膜癌、胰腺癌、子宫癌、头颈癌、唾液腺癌、乳腺癌、前列腺癌或结肠癌。
如本文使用的，术语SLC1A5可以指中性氨基酸转运体，具有对两性离子氨基酸的偏好性。合适地，它可以接受底物中性氨基酸，包括谷氨酰胺、天冬酰胺以及支链和芳香族氨基酸。还可以包括甲基化、阴离子和/或阳离子氨基酸。
SLC1A5也可以被称为ASCT2或ATBO，并且可以充当钠依赖性的氨基酸转运体。
在实施方案中，SLC1A5可以是R16、AAAT、NZA1、RDRC、ASCT-T和N7BS1。SLC1A5也可以被称为溶质运载蛋白家族1成员5、溶质运载蛋白家族1(中性氨基酸转运体)成员5、钠依赖性的中性氨基酸转运体2型、RD114/猿猴D型逆转录病毒受体、狒狒M7病毒受体、ATB(0)、ASCT2、M7V1、RDRC、中性氨基酸转运体B(0)、中性氨基酸转运体B、RD114病毒受体、M7VS1、AAAT、ATBO、R16和RDR。
人SLC1A5的核酸序列可以在NIHNCBI序列网站上根据登录号BC000062找到。在实施方案中，氨基酸序列可以由登录号AAH00062.1提供。
SLC1A5变体可以与由AAH00062.1提供的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。如将理解的，这样的变体应编码可以充当转运体的蛋白，特别地以促进色氨酸向经修饰的T细胞中的摄取。如表明的，SLC1A5以截短的同种型存在。因此，提供了为SLC1A5的片段的变体，所述变体可以合适地编码可以充当转运体的蛋白。功能活性筛选可以被用于确定由SLC1A5的片段的这些变体编码的合适的N末端或C末端缺失的蛋白。
合适地，人SLC1A5基因的变体可以由来自另一种动物例如小鼠或大鼠等的同源物提供。合适地，这些同源物可以显示出至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列同源性。
同源性被确定为在比对序列和引入空位(如果有必要)以达到最大百分比同源性之后，本文讨论的变体和SLC1A5之间相同的残基在氨基酸序列或核酸序列中的百分比。
用于比对和进行同源性和序列同一性的方法和计算机程序在本领域中是众所周知的。
如本文使用的，SLC1A5变体可以包括SLC1A5的氨基酸序列修饰，其中变体通过将适当的核苷酸变化引入编码SLC1A5转运体的核酸中来提供。修饰可以包括缺失、插入、取代等。合适地，可以进行氨基酸变化，其中氨基酸变化包括缺失、插入和/或取代，或所述氨基酸变化改变SLC1A5转运体的翻译后修饰过程，例如其上糖基化位点的数量和/或位置。
合适地，诸如丙氨酸扫描诱变的技术可以被用于确定可以进行合适的氨基酸取代的位置。这可以与功能筛选组合使用，以确定取代、缺失或插入的位置以提供变体多肽的适当的功能活性。
变体多肽还可以包括在多肽的C末端或N末端的修饰。如本领域已知的，合适地，可以提供编码氨基酸的核酸的取代或导致保守取代的氨基酸的取代，其中基于共同的侧链性质例如疏水性、中性、亲水性、酸性、碱性、链取向或芳香族残基而类似的氨基酸被认为是保守的。
合适地，编码转运体的氨基酸序列变体的核酸分子可以通过本领域已知的多种方法制备。这些方法可以包括但不限于通过定点诱变、PCR诱变、盒式诱变等来制备。
在实施方案中，“治疗有效”是指有效治疗哺乳动物的疾病或紊乱特别是癌症的T细胞的量。与T细胞和癌症相关的“治疗有效”量可以是减少癌细胞的数量所需的T细胞的数量，例如减小肿瘤尺寸，抑制癌细胞向周围器官的浸润或减缓癌细胞向周围器官浸润的程度或使癌细胞向周围器官的浸润停止，抑制、减缓肿瘤转移或使肿瘤转移停止，抑制、减缓癌症的生长或使癌症的生长停止，和/或抑制、减缓与癌症相关的一种或更多种症状或使与癌症相关的一种或更多种症状停止所需的T细胞的数量。
合适地，施用治疗有效量的T细胞可以阻止存在的癌细胞的生长和/或杀死存在的癌细胞。关于癌症治疗，治疗有效量可以例如通过评估疾病进展时间和/或确定治疗响应率来测量。合适地，除了提供T细胞之外，还可以提供另外的抗癌治疗。
如本文使用的术语“癌症”是指哺乳动物特别是人的以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。
在实施方案中，这可以包括良性、癌前、恶性、转移性、非转移性细胞。癌症的实例包括但不局限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤，以及白血病或淋巴样恶性肿瘤。合适地，癌症可以包括鳞状细胞癌；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌以及肺的鳞状癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃部(gastric)癌或胃(stomach)癌，包括胃肠癌；胰腺癌；胶质母细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌(liver cancer)；膀胱癌；肝细胞瘤；乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；涎腺癌；肾脏(kidney)癌或肾(renal)癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌(hepatic carcinoma)；肛门癌；阴茎癌；以及头颈癌。
合适地，肿瘤响应可以针对肿瘤形态的变化，例如关于肿瘤负荷、肿瘤尺寸等的变化来评估，或使用MRI扫描、x射线扫描、CT扫描、骨成像或活组织检查采样来评估。
本文中，分离的核酸分子可以是从至少一种污染的核酸分子中鉴定和分离的核酸分子，所述污染的核酸分子通常与核酸的天然来源相关。分离的核酸也可以包括处于不同于它们在自然界中被发现的形式或配置(setting)的形式或配置的核酸。
分离的核酸还包括包含在通常表达该核酸的细胞中但在该细胞中的不同位置例如不同的染色体位置提供的核酸分子。如本文使用的控制序列是指用于在宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列的DNA序列。合适地，控制序列适合于允许在T细胞中表达可操作地连接的编码序列。
如本文使用的可操作地连接的核酸描述了这样的核酸，所述核酸被放置为与另一个核酸序列形成功能性关系。例如，如果多肽被表达为前体蛋白，则将分泌性前导序列的DNA可操作地连接至所述多肽的DNA，允许所述多肽的分泌。如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则启动子或增强子被可操作地连接至所述编码序列。
本发明的另外的方面可以包含化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、抗血管生成剂和本发明的T细胞，它们形成组合物，使得所述组合物的组分以对于预期目的有效的量以组合的方式同时、依次或分别地进行提供。
在实施方案中，本发明的组合物可以在测试受试者或从受试者获得的肿瘤细胞以确定肿瘤细胞是否具有在细胞周围的色氨酸消耗的微环境之后提供。
因此，提供了治疗表达IDO或TDO的肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：
-向具有表达升高水平的IDO或TDO的肿瘤细胞的受试者提供本发明的T细胞或组合物；
-任选地，该方法可以包括检测肿瘤细胞中升高的IDO或TDO表达的存在的步骤。
根据另外的方面，提供一种共表达嵌合抗原受体和谷氨酰胺和/或色氨酸转运体的方法，所述嵌合抗原受体例如选自“典型的”或“共刺激CAR”的嵌合抗原受体，该方法包括以下步骤：引入包含在独立的载体/构建体或同一构建体中的编码合适的CAR以及谷氨酰胺和/或色氨酸转运体的遗传信息，所述CAR具有对靶抗原或疾病抗原的结合特异性。SLC1A5序列、SLC1A5序列的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体可以由与CAR的启动子不同的启动子驱动，以产生两个独立的mRNA。CAR和转运体序列的表达可以通过从共同的双向启动子转录来实现，以产生两个独立的mRNA。CAR和转运体序列的表达可以通过从单个启动子转录并且在两个编码序列之间并入IRES来实现，以产生能够翻译为两种蛋白的单个mRNA。CAR和转运体序列可以通过自切割T2A切割序列来分离，提供由共同启动子驱动的单个mRNA，翻译为单个多肽，该单个多肽将被共翻译地切割以产生两种蛋白。
因此，可以提供一种T细胞，所述T细胞表达嵌合抗原受体和谷氨酰胺和/或色氨酸转运体。
合适地，提供了筛选T细胞的方法，所述T细胞能够在低色氨酸和/或谷氨酰胺条件中增殖。筛选方法可以包括以下步骤：在细胞培养生长培养基中使SLC1A5过表达T细胞(或者可选的过表达转运体的T细胞)生长，所述培养基含有次优水平的L-色氨酸，例如，小于5μM的L-色氨酸浓度。表达合适的转运体的细胞也可以通过在细胞培养生长培养基中增殖来富集，所述培养基含有次优水平的L-谷氨酰胺，例如，小于3μM的L-谷氨酰胺浓度。也可以使用含有次优水平的L-色氨酸和L-谷氨酰胺两者的细胞培养生长培养基。可选地，表达转运体的细胞可以通过在细胞培养生长培养基中增殖来富集，所述培养基含有存在的SLC1A5抑制剂诸如O-苄基-L-丝氨酸，以模拟低色氨酸条件。这些生长条件提供了一种方法，通过该方法，可以富集表达基因引入的转运体的T细胞并在细胞培养群体中对其进行筛选，从而相对于未经修饰的T细胞的增殖进行筛选。
在实施方案中，过表达嵌合抗原受体和谷氨酰胺或色氨酸转运体的T细胞可以通过在培养基中培养细胞来筛选，所述培养基含有低浓度的色氨酸和/或低谷氨酰胺，或存在SLC1A5抑制剂，诸如O-苄基-L-丝氨酸。
在实施方案中，具有对谷氨酰胺和/或色氨酸转运体的结合特异性的抗体可以用于筛选能够在低色氨酸和/或谷氨酰胺条件中增殖的T细胞。合适地，抗体可以选自抗SLC1A5、抗SLC7A5、抗LAT1或抗SLC3A2。
在实施方案中，针对经修饰的T细胞(其治疗性地施用至受试者)上过表达的转运体的抗体可以作为安全机制单独地施用至受试者，在对于治疗有不良反应的情况下，通过该安全机制消耗给予的经修饰的T细胞。这些抗体将激发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以消耗经修饰的T细胞。这些治疗抗体可以包括但不限于抗SLC1A5、抗SLC7A5、抗LAT1或抗SLC3A2。
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除非上下文另外要求，否则本发明的每一个方面的优选的特征和实施方案加以必要的细节修改被用于其他方面中的每一个方面。
现在将仅通过参考附图举例来描述本发明的实施方案，在附图中：
图1-示出了本发明提出的核酸构建体，其中SLC1A5基因在EF1α启动子的控制下表达，具有BGH聚腺苷酸化信号以用于mRNA的稳定性。pEF-DEST51载体(Life Technologies)还含有pUC复制起点和赋予抗生素氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因(注释的AmpR)，以允许质粒DNA在细菌宿主中充分增殖。
图2示出了A)未经修饰的T细胞，其中SLC1A5以钠依赖性方式转运谷氨酰胺，这为SLC7A5/SLC3A2(LAT1)逆向转运体复合物提供底物，该复合物在很大程度上取决于细胞内谷氨酰胺的流出(efflux)以输入氨基酸诸如色氨酸。B)经修饰的T细胞，其通过用含有SLC1A5的载体转染或转导T细胞被工程化以过表达SLC1A5，导致SLC1A5的表达，并从而促进谷氨酰胺向细胞中的摄取。这为SLC7A5/SLC3A2(LAT1)逆向转运体复合物提供了另外的底物(谷氨酰胺)，从而增加色氨酸的输入/摄取。
图3提供了提出的过表达SLC1A5的T细胞的作用模式的示例性实例，并且示出了(A)IDO+肿瘤细胞，其产生低色氨酸微环境，这导致细胞毒性T细胞中的细胞周期停滞、减少的激活和细胞凋亡。肿瘤细胞通过上调SLC1A5的表达来补偿低色氨酸条件。(B)通过经由SLC1A5过表达使T细胞配备有与肿瘤细胞相同的补偿机制，T细胞能够在低色氨酸肿瘤微环境中起作用。
图4提供了提出的过表达SLC1A5和共刺激CAR的γδT细胞的作用模式的示例性实例，并且示出了(A)IDO+肿瘤细胞产生低色氨酸微环境，这导致表达嵌合抗原受体的γδT细胞中的细胞周期停滞、减少的激活和细胞凋亡。肿瘤细胞通过上调SLC1A5的表达(其允许更大的色氨酸输入)来补偿低色氨酸条件。(B)通过经由SLC1A5过表达使γδCAR-T细胞配备有与肿瘤细胞相同的补偿机制，γδCAR-T细胞能够在低色氨酸肿瘤微环境中起作用，并且通过经由γδTCR识别磷酸类抗原(phosphoantigen)和经由CAR(或共刺激CAR)识别疾病抗原诱导完全细胞毒性效应物功能；CAR/SLC1A5γδT细胞能够发挥功能并且进行细胞介导的细胞毒性。
图5示出了包含GMCSF-R分泌信号结构域、针对CD19的scFv、CD28铰链、跨膜和激活结构域以及CD137(4-1BB)激活结构域的共刺激CAR构建体。从同一构建体的SLC1A5共表达可以通过在SLC1A5序列前的C末端T2A自切割肽或内部核糖体进入位点(IRES)来实现。
图6示出了在Vδ2γδT细胞中SLC1A5的转导效率和表达水平。PBMC在用唑来膦酸刺激48小时后，用携带SLC1A5-L(登录号NP_005619.1)或SLC1A5-S(登录号NP_001138616.1)和GFP序列的慢病毒载体转导。转导的细胞扩增另外的16天，并且通过流式细胞术测量GFP阳性细胞的百分比。通过GFP阳性细胞测量的转导效率(％)是16.7％(SLC1A5-S)和20％(SLC1A5-L)(A)。细胞还通过固定/透化来进行SLC1A5的细胞内染色，并且通过流式细胞术进行分析。不论转导情况如何，至少97％的γδT细胞表达SLC1A5(C)。然而，相比未转导的γδT细胞，在用SLC1A5-L(约10倍)或SLC1A5-S(约1.5倍)转导的γδT细胞中，SLC1A5的表达水平(通过平均荧光强度MFI测量)更高(B)。这些数据表明，用SLC1A5-L或SLC1A5-S转导的γδT细胞具有更高的转运体表达水平。
图7示出了对SLC1A5抑制剂O-苄基-L-丝氨酸(BenSer)的抗性，以及用含有SLC1A5-L序列的慢病毒转导的Vδ2γδT细胞的所得阳性筛选。PBMC在用唑来膦酸刺激48小时后被转导。细胞在具有或不具有BenSer的ALys培养基中扩增持续长达21天。扩增两周或三周的细胞通过测量活力(使用碘化丙锭)或GFP阳性γδT细胞的流式细胞术进行分析，以确定转导的γδT细胞在选择压力下的存活优势。扩增三周之后，在BenSer的存在下，与扩增早期阶段的γδT细胞相比，发现未转导的γδT细胞的活力降低(从第12天的高于80％降至第23天的低于60％)(A)。然而，用SLC1A5-L同种型转导的γδT细胞并未显示出活力的降低，而是对BenSer产生抗性(A)。此外，相比媒介物对照，在BenSer的存在下扩增两周或三周之后，记录了GFP阳性γδT细胞的增加(分别增加约17％和约14％)(B和C)。因此，这些表明SLC1A5-L的过表达使得γδT细胞对培养基中的BenSer具有抗性，这模拟了低水平的L-色氨酸。
实施例
为了补偿由IDO和TDO的表达引起的色氨酸的缺乏或消耗，其中肿瘤细胞调节包括SLC1A5及其截短的同种型的氨基酸转运体的表达，这转而促进了谷氨酰胺和色氨酸向肿瘤细胞中的摄取，并且在肿瘤细胞周围引起色氨酸消耗的微环境，本发明提供了T细胞，所述T细胞具有包括SLC1A5及其截短的同种型的这些氨基酸转运体的上调的表达，以允许该T细胞在这样的低色氨酸浓度中增殖。
在本文讨论的特定的实施方案中，SLC1A5可以在与嵌合抗原载体构建体相同的载体上共表达，所述嵌合抗原载体构建体由T细胞表达，并且在T细胞上提供。
合适地，SLC1A5可以在启动子的控制下表达，或通过内部核糖体进入位点(IRES)或T2A切割序列与嵌合抗原受体的表达相连接，提供由共同启动子驱动的单个mRNA，翻译为单个多肽，该单个多肽将被共翻译地切割以产生两种蛋白(参见图5)。如本文讨论的，其中提供SLC1A5转运体的载体可以是哺乳动物表达载体，诸如来自Gateway“DEST”系列(LifeTechnologies)的载体，慢病毒载体，诸如来自由System Biosciences提供的pCDH套组，转座子载体或适合用于产生微环的载体。
SLC1A5的共表达提供了若干个优势，其中：
1.表达嵌合抗原受体和SLC1A5的经转染的T细胞具有在低色氨酸和/或谷氨酰胺条件中的生长优势，并且因此这些条件可以用于筛选表达嵌合抗原受体和转运体两者的细胞
2.过表达单独的SLC1A5或SLC1A5连同嵌合抗原受体的T细胞在暴露于由肿瘤表达的IDO或TDO引起的低色氨酸条件后，对于增殖抑制的抗性更强。
3.在过继细胞转移后，通过使用SLC1A5转运体特异性抗体，表达单独的SLC1A5或SLC1A5连同嵌合抗原受体的T细胞可以被选择性地消耗
如本文讨论的，具有在低色氨酸和/或谷氨酰胺条件中的生长优势的T细胞在转染后，可以在细胞培养基中使用低谷氨酰胺和/或色氨酸条件进行筛选。
或者，合适的T细胞可以使用例如能够结合SLC1A5的抗体等来进行阳性筛选。例如，使用磁激活细胞分选(MACS)技术、荧光激活细胞分选(FACS)或本领域技术人员已知的类似技术。
实施例1
允许T细胞转染的载体的产生
从GeneArt(Life Technologies)获得在pDONR221骨架中在attL1和attL2重组位点之间的编码SLC1A5长型(SLC1A5long)同种型的DNA。然后可以使用LR克隆酶II重组酶反应(Life Technologies)将SLC1A5重组至各种Gateway相容的目的载体中。在该实施例中，将SLC1A5重组至含有EF1α启动子和BGH聚腺苷酸化信号的pEF-DEST51中(参见图1)。
实施例2
转染T细胞以提供SLC1A5以一定水平的表达，该水平允许T细胞克服由于色氨酸浓 度降低例如降低至低于5μM而导致的T细胞增殖抑制。
将T细胞通过Nucleofection(Lonza)或Neon电穿孔系统(Thermo Fisher)用实施例1中所描述的载体进行电穿孔。在完全培养基(诸如IMDM)中恢复持续24至48小时后，将T细胞在含有少于5μM L-色氨酸的IMDM培养基中培养。
实施例3
使用慢病毒系统提供SLC1A5长型同种型基因的实例。
将实施例1中的SLC1A5长型同种型基因克隆至pCDH载体骨架(SystemsBioscience)中。使用Purefection转染试剂(System Bioscience)，通过用pCDH载体和表达病毒生产必需的gag、pol、rev和env基因的慢病毒包装载体的混合物共转染HEK293T细胞来产生慢病毒上清液。病毒上清液在转染48小时和72小时后收集，并且使用PEG-it(SystemBioscience)浓缩。将T细胞铺板，并且通过添加慢病毒来感染。
通过慢病毒系统将SLC1A5长型同种型(SLC1A5-L)及其截短的同种型(SLC1A5-S)转导至γδT细胞中，该慢病毒系统含有SLC1A5-L或SLC1A5-S序列，其后为T2A和GFP序列。基于GFP阳性γδT细胞，功能性转导效率是16.7(SLC1A5-S)和20％(SLC1A5-L)(参见图6A)。此外，绝大多数γδT细胞表达SLC1A5，无论它们是否被转导(参见图6B)。然而，相比未转导的γδT细胞，转导的γδT细胞中SLC1A5的表达水平为10倍(SLC1A5-L)或1.5倍(SLC1A5-S)更高(参见图6C)。
实施例4
使用基于转座子的系统提供SLC1A5长型同种型基因的实例。
将实施例1中的SLC1A5长型同种型基因克隆至PB51x载体(System Bioscience)中。将T细胞通过Nucleofection(Lonza)或Neon电穿孔系统(Thermo Fisher)用PB51x载体和‘Super’PiggyBac转座酶表达载体(System Bioscience)共转染。
实施例5
使用SLC1A5作为筛选标记，并且讨论可以被用于允许选择压力环境的培养基。
将T细胞用允许SLC1A5过表达的(诸如实施例1中的)SLC1A5表达构建体(如实施例2和4中的)进行转染或(如实施例3中的)进行转导。在用能够表达SLC1A5的载体转染/转导T细胞后，T细胞被允许在完全培养基诸如ALyS或IMDM中的通常24至48小时的恢复期。在恢复期之后，将T细胞在含有少于5μM L-色氨酸或含有少于4mM L-谷氨酰胺或前述条件的组合的ALyS或IMDM培养基中培养。监测生长，与未经修饰的T细胞进行比较。
由于细胞培养系统中L-色氨酸的实际浓度随时间推移不受控制，这可以影响γδT细胞的应答。因此，将SLC1A5的抑制剂O-苄基-L-丝氨酸(BenSer)添加至培养基中，以产生模拟低L-色氨酸条件的受控的选择压力环境。将用携带SLC1A5-L或SLC1A5-S的慢病毒载体(在用唑来膦酸刺激48小时后)转导的PBMC在具有或不具有BenSer的ALys培养基中培养。在扩增的第二周和第三周期间，γδT细胞通过流式细胞术进行分析，以测量细胞活力和GFP阳性细胞，以确定转导的γδT细胞在选择压力下的存活优势。相比扩增的早期阶段，扩增三周之后，BenSer的存在降低了未转导的γδT细胞的活力(图7A)。然而，用SLC1A5-L同种型转导的γδT细胞并未显示出活力的降低，并因此对于BenSer产生抗性(图7A)。此外，相比媒介物对照，在BenSer的存在下扩增两周和三周之后，GFP阳性γδT细胞的百分比增加(分别增加约17％和约14％，图7B-C)。因此，SLC1A5-L同种型的过表达使得γδT细胞对于模拟低水平的L-色氨酸的培养基中的BenSer具有抗性。
尽管已经参考特定的实施例特别地显示和描述了本发明，但本领域技术人员将理解，可以对其进行形式和细节的各种改变而不偏离本发明的范围。

Claims (26)

1.一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞适于过表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体。
2.如权利要求1所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞适于以在未经修饰的T细胞中观察到的表达水平的至少两倍的水平来表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体。
3.如权利要求1所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞适于以在未经修饰的激活的T细胞中观察到的表达水平的至少两倍的水平来表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体。
4.如权利要求1至3中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞表达以下的至少一种：
(i)γδT细胞受体，
(ii)αβT细胞受体，
(iii)T细胞受体和至少一种嵌合抗原受体(CAR)。
5.如权利要求4所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞表达γδT细胞受体和共刺激嵌合抗原受体(CAR)，其中所述共刺激CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞内信号传导结构域在抗原与细胞外抗原结合结构域结合之后向所述T细胞提供共刺激信号(仅信号2)。
6.如权利要求4所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞表达T细胞受体和嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞内信号传导结构域在抗原与所述抗原结合结构域结合之后向所述T细胞提供仅信号1应答。
7.如权利要求4所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞表达T细胞受体和嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞内信号传导结构域在抗原与所述抗原结合结构域结合之后向所述T细胞提供信号1应答和信号2应答(来自共刺激结构域)。
8.如权利要求5所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞表达γδT细胞受体和嵌合抗原受体(CAR)，其中，在使用中，信号1由γδT细胞上的TCR与TCR识别的细胞结合靶的第一结合事件提供，并且信号2由抗原与所述共刺激CAR的抗原结合结构域的第二结合事件提供，并且组合地，来自第一结合事件和第二结合事件两者的信号1和信号2分别激活所述T细胞。
9.如权利要求1至8中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞表达γδT细胞受体，其中所述γδ(gamma delta)T细胞为Vγ9Vδ2亚型。
10.如任一前述权利要求所述的经修饰的T细胞，其中SLC1A5连同SLC7A5和SLC3A2一起被过表达以形成LAT1转运体。
11.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用有效量的权利要求1至10中任一项所述的经修饰的T细胞。
12.如权利要求1至10中任一项所述的经修饰的T细胞，用于在药物中使用。
13.如权利要求1至10中任一项所述的经修饰的T细胞，用于在癌症或病毒的治疗中使用。
14.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体，所述分离的核酸可操作地连接至控制序列，所述控制序列适于允许被所述核酸转化的T细胞表达编码的SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体，任选地，其中所述色氨酸或谷氨酰胺转运体选自高亲和力谷氨酸和中性氨基酸转运体家族(SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7)；异二聚体氨基酸转运体的重亚基(SLC3A1、SLC3A2)；钠与氯化物依赖性的钠:神经递质同向转运体家族(SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20)的成员；或阳离子氨基酸转运体/糖蛋白相关家族(SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14)的成员。
15.一种载体，所述载体包含权利要求14所述的核酸。
16.一种宿主T细胞，所述宿主T细胞用权利要求14所述的核酸或权利要求15所述的载体转染或转导。
17.一种培养T细胞的方法，所述T细胞表达由权利要求14所述的核酸或权利要求15所述的载体所编码的转运体，其中所述方法包括将根据权利要求14所述的核酸或根据权利要求15所述的载体引入至T细胞中的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述T细胞是从患有待被治疗的疾病的受试者分离出的T细胞。
19.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至10中任一项所述的T细胞以及治疗剂。
20.根据权利要求1至10中任一项所述的经修饰的T细胞在制造用于治疗或预防疾病的药物中的用途。
21.根据权利要求20所述的经修饰的T细胞在制造药物中的用途，其中所述疾病是癌症。
22.一种向受试者提供经修饰的T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供已经从受试者分离出的含T细胞的样品；
b.将所述含T细胞的样品中的T细胞用权利要求14所述的核酸或权利要求15所述的载体转导或转染，以及
c.将来自(b)的细胞施用至所述受试者。
23.一种筛选权利要求1至10中任一项所述的经修饰的T细胞的方法，所述经修饰的T细胞适于过表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体，其中所述方法包括以下步骤：
a.在具有浓度低于5μM的L-色氨酸和浓度低于3μM的L-谷氨酰胺中的至少一种的培养基中或在SLC1A5的抑制剂的存在下在培养基中培养包含经修饰的T细胞的T细胞群体，所述经修饰的T细胞适于过表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体；任选地，其中所述抑制剂为O-苄基-L-丝氨酸；
b.筛选当根据步骤a进行培养时增殖的那些经修饰的T细胞。
24.一种筛选权利要求1至10中任一项所述的经修饰的T细胞的方法，所述经修饰的T细胞适于过表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体，其中所述方法包括：
a.向表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体中的至少一种的T细胞提供结合成员，所述结合成员具有对SLC1A5、SLC1A5的同种型或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体中的至少一种的结合特异性，
b.任选地，检测步骤a中的所述结合成员与所述T细胞的结合，以及
c.筛选所述结合成员与其结合的T细胞。
25.一种分离经修饰的T细胞的方法，所述经修饰的T细胞适于过表达SLC1A5、SLC1A5的同种型或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体，所述方法包括以下步骤：
a.向包含T细胞的培养物提供结合成员，所述结合成员具有对SLC1A5、SLC1A5的同种型或者可选的色氨酸或谷氨酰胺转运体的结合特异性，
b.从所述培养物中分离所述结合成员与其结合的T细胞。
26.如权利要求11所述的治疗癌症的方法，其中所述方法包括在第一时间点向有相应需要的受试者施用有效量的权利要求1至10中任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述方法还包括以下步骤：在之后的第二时间点向所述受试者施用结合成员，所述结合成员具有对SLC1A5、SLC1A5的同种型或者色氨酸或谷氨酰胺转运体的结合特异性，能够结合所述经修饰的T细胞以选择性地结合和减少所述受试者中存在的所述经修饰的T细胞。
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